JP2023536989A - 膵臓癌オルガノイドの製造方法 - Google Patents

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本発明の膵臓癌オルガノイドの製造方法は、癌細胞と内皮細胞との相互作用、すなわち血管ニッチのクロストーク（ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｎｉｃｈｅ）を十分に反映するため、既存の癌オルガノイドと比較して、有機体環境に存在する癌開始細胞（Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ；ＣＩＣｓ）の特性を示すことが可能で、スクリーニングされた薬物の臨床適用度および信頼度などをさらに著しく高めることができる。

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃａｎｌｅｔ．２０２０．１０．０１２ 掲載年月日：２０２０年１１月１２日
本発明は、膵臓癌オルガノイドの製造方法に関し、より具体的には、本発明は、癌開始細胞（Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）を含むことができるように、内皮細胞とともに共培養または内皮細胞培養液を用いて製造された膵臓癌オルガノイドに関する。
２００５年に疾病で死亡した計６５，４７９人のうち、全体死亡者の２６．７％が癌で死亡した。このような癌の中で、特に、膵臓癌は予後が非常に良くなく、韓国国立癌センターによれば、５年生存率が１０％未満に相当する。このような膵臓癌の治療のために外科的切除術を行うことができるが、新しく診断された１５％の患者だけがこのような手術が可能という限界点が存在する。
一方、高齢化によって韓国国内外の癌発生患者数が急激に増加していて、患者個々人に合わせた抗癌治療などにより癌を克服しようとする研究が活発に進められている。特に、標的治療剤の場合には、末期癌患者の抗癌剤に対する治療効率を著しく高められるため、抗癌剤に対する副作用を最小化させることができるだけでなく、治療剤に対する癌細胞の反応性を細胞シグナル伝達により予測できるという面から、その臨床的有用性が非常に高い。
しかし、１次患者標本から作製された癌細胞株の場合、患者サンプルから細胞株を確立することが非常に非効率的な上に、２次元培養に対する適応と選択過程の中で細胞株は遺伝的変異が発生して遺伝的異質性（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が消えることができるという限界点が存在する。さらに、前記癌細胞株の場合、標準として使用できる組織内の他の基質の構成成分が欠乏しているという限界点も存在する。
臨床前段階で患者に癌治療剤の敏感度を検査できるＨＲＤＡ（Ｈｉｓｔｏｃｕｌｔｕｒｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｓｓａｙ）の場合、少量の組織のみを使用するため、多様な抗癌剤に対する敏感度の確認が難しく、テストが１回のみ可能なため、主な癌組織の損失が大きいという限界点が存在する。
また、癌細胞株または癌患者に由来する癌細胞を動物モデルに移植する方法（Ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ、ＰＤＴＸ）の場合、細胞ベースのモデルに比べて腫瘍組織の生物学的な特性をより良く模倣するというメリットが存在するが、費用、時間および資源が多く消耗し、生命倫理の問題点などによる限界点が存在する。それだけでなく、一部の癌オルガノイドの場合には、免疫成分、血管成分または正常上皮細胞を含む癌支持細胞が不足して、臨床結果を十分に裏付けられないという限界点が存在する。
このような限界点を克服するために、幹細胞または臓器細胞から分離された細胞を培養したり組換えて作製されたオルガノイド（生体外組織体構造物）が開発されている。このようなオルガノイドの場合、患者の代わりにオルガノイドに先に試験治療を施し、その結果に基づいて個別患者ごとに有用な治療効果を示す抗癌剤を選択できるというメリットが存在するが、既存の方式はその構造物の製造成功率が非常に低いという限界点が存在する。
本発明の一つの目的は、膵臓癌オルガノイドの製造方法；および前記製造方法により製造された膵臓癌オルガノイドを提供することである。
本発明の他の目的は、本発明による前記膵臓癌オルガノイドを用いて膵臓癌治療剤をスクリーニングする方法を提供することである。
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は以上に言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
本発明の一実施形態では、膵臓癌オルガノイドの製造方法を提供する。
本発明の前記製造方法は、ａ）膵臓癌患者から分離された生物学的試料を解離させ、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）に固定化するステップと、ｂ）前記ａ）ステップでマトリゲルに固定化されたサンプルを培養して膵臓癌オルガノイドを形成するステップと、ｃ）前記ｂ）ステップで形成された膵臓癌オルガノイドを解離させるステップと、ｄ）前記解離した膵臓癌オルガノイドと内皮細胞とを共培養するか；または前記解離した膵臓癌オルガノイドに内皮細胞培養液を入れて培養するステップと、を含む。
本発明の前記「膵臓癌」は、外分泌腫瘍と神経内分泌腫瘍とに分けられ、大多数の類型は外分泌腫瘍型であって、膵臓管腺癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ；ＰＤＡＣ）に相当する。このようなＰＤＡＣ患者の癌細胞または組織は、ＣＤ４４（＋）ＣＤ２４（＋）およびＣＤ４４（＋）ＣＤ２４（＋）ＥｐＣＡＭ（＋）の表現型を有する癌開始細胞（Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）である耐薬品性、自己再生性および差別化された能力を有する下位集団を有するため、前記ＰＤＡＣ患者の癌細胞は大部分転移し、化学療法、放射線療法、免疫療法のような古典的な治療法に対して耐性が非常に強いという特徴が存在する。特に、ＣＤ４４（＋）ＣＤ２４（＋）表現型を有する細胞が存在する患者の場合には、そうでない患者と比較して、予後が非常に良くない。本発明の目的上、前記膵臓癌は、膵臓管腺癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の膵臓癌患者の場合、癌組織において内皮細胞が重要な比率を占め、前記内皮細胞の場合には、腫瘍微細環境（Ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）でノッチ（Ｎｏｔｃｈ）、ＴＧＦ－β、硝酸化物（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ；ＮＯ）、ソニックヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ；ＳＨＨ）、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）およびＷｎｔ細胞シグナル伝達経路により癌開始細胞の自己再生およびメンテナンスを支援することができる。
本発明の前記膵臓癌オルガノイドは、癌細胞と内皮細胞との相互作用、すなわち血管ニッチのクロストーク（ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｎｉｃｈｅ）を十分に反映するため、既存の膵臓癌オルガノイドと比較して、有機体環境に存在する癌開始細胞（Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ；ＣＩＣｓ）の特性を示すことが可能で、膵臓癌の発達、薬物に対する耐性などを研究するのに非常に効果的に使用できる。さらに、このようなオルガノイドを用いる場合には、スクリーニングされた薬物の臨床適用度および信頼度などをさらに著しく高めることができる。
本発明の前記生物学的試料は、膵臓癌患者である個体から得られるか、個体に由来する任意の物質、生物学的体液、組織または細胞を意味するもので、例えば、全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）、白血球のバフィーコート（ｂｕｆｆｙ ｃｏａｔ）、血漿（ｐｌａｓｍａ）および血清（ｓｅｒｕｍ）を含む血液、喀痰（ｓｐｕｔｕｍ）、涙（ｔｅａｒｓ）、粘液（ｍｕｃｕｓ）、鼻うがい（ｎａｓａｌ ｗａｓｈｅｓ）、鼻腔吸引物（ｎａｓａｌ ａｓｐｉｒａｔｅ）、呼吸（ｂｒｅａｔｈ）、小便（ｕｒｉｎｅ）、精液（ｓｅｍｅｎ）、唾（ｓａｌｉｖａ）、腹腔洗浄液（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｗａｓｈｉｎｇｓ）、骨盤内流体液（ｐｅｌｖｉｃ ｆｌｕｉｄｓ）、嚢胞液（ｃｙｓｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、脳脊髄膜液（ｍｅｎｉｎｇｅａｌ ｆｌｕｉｄ）、羊水（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、腺液（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）、膵臓液（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、リンパ液（ｌｙｍｐｈ ｆｌｕｉｄ）、胸水（ｐｌｅｕｒａｌ ｆｌｕｉｄ）、乳頭吸引物（ｎｉｐｐｌｅ ａｓｐｉｒａｔｅ）、気管支吸引物（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ａｓｐｉｒａｔｅ）、滑液（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｌｕｉｄ）、関節吸引物（ｊｏｉｎｔ ａｓｐｉｒａｔｅ）、器官分泌物（ｏｒｇａｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ）、細胞（ｃｅｌｌ）、細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ）または脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）を含むことができるが、これに限定されるものではない。本発明の目的上、前記生物学的試料は、膵臓癌患者から分離された組織または膵臓癌細胞株であってもよく、例えば、膵臓癌患者から分離された組織であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記膵臓癌オルガノイドは、患者から組織を得た後、癌組織から解離した癌細胞を用いて１次培養を行わないため、このような過程によって発生しうる癌細胞の遺伝的変形や、試験管内で表現型的特性が消える現象を非常に効果的に防止することができる。
本発明の目的上、前記膵臓癌は、膵臓管腺癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）であってもよいが、これに限定されるものではない。前記膵臓管腺癌患者から得られた組織の場合、他の種類の癌と比較して、癌の起源を確認するための突然変異の分析なくても、元の癌組織に対して類似の組織学的特徴を試験管内でも非常に効果的に維持することができる。
本発明の前記ｄ）ステップの内皮細胞は、血管内皮細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）であってもよく、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣｓ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記ｄ）ステップにおいて、膵臓癌オルガノイドと内皮細胞とは、１：１～１：６の比率で混合するものであってもよく、例えば、１：４の比率で混合するものであってもよいが、これに限定されるものではない。このように１：１～１：６の比率で混合して内皮細胞を含む膵臓癌オルガノイドを製造する場合には、腫瘍微細環境で内皮細胞と膵臓癌細胞との間の相互作用を十分に反映して癌開始細胞の特性をさらに効果的によく示すことができる。
本発明の前記ｄ）ステップの培養液とは、細胞を公知の液体培地または固体培地で培養させて得た産物を意味し、細胞が含まれていない概念である。
本発明の前記ａ）ステップにおいて、解離させるステップは、コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を用いるものであってもよく、例えば、コラゲナーゼＤ（コラゲナーゼＩＶ型）を用いるものであってもよいが、これに限定されるものではない。前記コラゲナーゼＤは、トリプシン活性が低くて、組織を細胞単位に解離させる過程で細胞の損傷を最小化することができる。
本発明の前記内皮細胞を含む膵臓癌オルガノイドは、癌開始細胞が含まれたものであってもよい。本発明の目的上、前記膵臓癌オルガノイドは、癌開始細胞を維持させることができる別の成長因子を追加しない場合にも、内皮細胞との相互作用または内皮細胞の上澄液に含まれている物質によって癌開始細胞の自己再生およびメンテナンスを持続させることができる。
本発明の前記ｂ）ステップにおいて、オルガノイドを形成するステップは、抗生剤、グルタミン、Ｂ２７、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、成長因子、ガストリン、細胞シグナル伝達抑制剤、ＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２）および添加剤から構成された群より選択される１種以上をさらに含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において、前記ａ）ステップの解離したサンプルを培養する過程により行われるものであってもよい。本発明の目的上、このような培地を用いる場合には、組織から解離した細胞を１次培養する過程なくても非常に効果的に細胞を癌オルガノイド化することができる。
本発明の前記「抗生剤」は、膵臓癌オルガノイドを培養する過程で、バクテリア、カビ、マイクロプラズマおよび酵素などによる汚染を防止するためのものであって、例えば、アンピシリン、ペニシリン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、ネオマイシンなどであってもよく、ペニシリンおよびストレプトマイシンであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「グルタミン」は、細胞培養時にエネルギーを提供する必須の成分であって、例えば、アラニルグルタミンまたはグルタミンジペプチドなどであってもよく、例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（グルタマックス）であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「Ｂ２７」は、細胞の成長または生存力を助けるのに最適化された無血清補充剤に相当する。
本発明の前記「成長因子」は、細胞成長、増殖、治癒および細胞分化を刺激できるタンパク質またはステロイドホルモンであって、例えば、ノギン組換えタンパク質（Ｎｏｇｇｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）および線維芽細胞成長因子１０（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １０）であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「細胞シグナル伝達抑制剤」は、細胞内部のシグナル伝達経路の活性化を抑制するために、成長因子が受容体に結合することを妨げたり、受容体の活性化を遮断するなどの機能をするものを意味する。本発明の目的上、前記細胞シグナル伝達抑制剤は、ＡＫ抑制剤およびｐ３８ ＭＡＰＫ抑制剤であってもよく、例えば、Ａ８３－０１（ＣＡＳ Ｎｏ．９０９９１０－４３－６）およびＳＢ２０２１９０（ＣＡＳ Ｎｏ．１５２１２１－３０－７）であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「添加剤」は、Ｗｎｔ３ａ－条件化培地、ＲＳＰＯ１－条件化培地およびニコチンアミドであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の他の実施形態では、本発明の前記製造方法により製造された膵臓癌オルガノイドを提供する。
本発明の前記膵臓癌オルガノイドは、本発明の前記製造方法により製造されるため、膵臓癌の発達、薬物に対する耐性などを研究するのに非常に効果的に使用できる。さらに、このようなオルガノイドを用いる場合には、スクリーニングされた薬物の臨床適用度および信頼度などをさらに著しく高めることができる。
本発明の膵臓癌オルガノイドにおいて、膵臓癌、内皮細胞、培養液、比率、コラゲナーゼなどに関連する内容は、前記膵臓癌オルガノイドの製造方法に記載されるものと同一で、本明細書の過度の複雑性を回避するために省略する。
本発明のさらに他の実施形態では、膵臓癌治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
本発明の前記スクリーニングする方法は、ａ）本発明による前記膵臓癌オルガノイドに候補物質を処理するステップと、ｂ）候補物質の処理の有無によって膵臓癌オルガノイドに含まれた癌細胞を観察するステップとを含む、膵臓癌治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法の前記ｂ）ステップにおいて、癌細胞の大きさが減少または維持されるか、癌開始細胞の数が減少する場合に、前記候補物質を膵臓癌治療剤として選別することができる。
本発明の前記「スクリーニング」とは、多様な物質からなる候補群から目的とする特定の性質を有する物質のみを特異的に選別することを意味する。
本発明の前記「候補物質」とは、癌組織の成長または転移に対して抑制活性を有するか、癌開始細胞の死滅を誘導できると予想される未知の物質を意味する。前記候補物質は、化合物、ペプチド、タンパク質、抗体および天然抽出物などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記候補物質は、合成または天然化合物のライブラリー、生物学的ライブラリー、空間アドレッサブルパラレル固相または液相ライブラリー（Ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）などにより得ることができる。
本発明の膵臓癌オルガノイドの製造方法は、癌細胞と内皮細胞との相互作用、すなわち血管ニッチのクロストーク（ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｎｉｃｈｅ）を十分に反映するため、既存の癌オルガノイドと比較して、有機体環境に存在する癌開始細胞（Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ；ＣＩＣｓ）の特性を示すことが可能で、スクリーニングされた薬物の臨床適用度および信頼度などをさらに著しく高めることができる。
（Ａ）および（Ｂ）は、本発明の一実施例による膵臓癌オルガノイドの外形および細胞表現型を顕微鏡またはフローサイトメトリー分析により確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるフローサイトメトリー分析により確認された膵臓癌オルガノイドにおいて細胞の表現型別に存在する比率をグラフで示す図である。 本発明の一実施例による膵臓癌オルガノイドの３次元構造を共焦点顕微鏡により確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による成長因子が除かれた時、膵臓癌オルガノイドに存在する癌開始細胞の細胞形態および表現型を顕微鏡またはフローサイトメトリー分析により確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるヒト由来膵臓癌オルガノイドに存在する表現型別の細胞株を分離し、１１日間培養してオルガノイドシステムを製造する方法に関する模式図である。 本発明の一実施例によるヒト由来膵臓癌オルガノイドから分離されたＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（－）またはＣＤ２４（－／ｌｏｗ）ＣＤ４４（－）細胞のオルガノイド形成能をフローサイトメトリー分析により確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（－）またはＣＤ２４（－／ｌｏｗ）ＣＤ４４（－）細胞のオルガノイド形成能を蛍光顕微鏡分析により確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣｓ）を含む膵臓癌オルガノイドである膵臓癌オルガノイドシステムを製造する方法に関する模式図である。 本発明の一実施例による膵臓癌オルガノイドおよびＨＵＶＥＣｓが含まれた膵臓癌オルガノイドであるオルガノイドシステムの形態を蛍光顕微鏡により確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＨＵＶＥＣｓが含まれた膵臓癌オルガノイドであるオルガノイドシステムに存在する癌開始細胞の細胞形態をフローサイトメトリー分析により確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による膵臓癌オルガノイドとＨＵＶＥＣｓが含まれた膵臓癌オルガノイドである膵臓癌オルガノイドシステムそれぞれに存在する癌開始細胞の数を比較した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＨＵＶＥＣｓが含まれた膵臓癌オルガノイドであるオルガノイドシステムに存在する癌開始細胞の細胞形態をフローサイトメトリー分析により確認した結果を示す図である。 （Ａ）および（Ｂ）は、本発明の一実施例によるＷｎｔまたはノッチ（Ｎｏｔｃｈ）細胞シグナル伝達抑制時、ＨＵＶＥＣｓが含まれた膵臓癌オルガノイドの形成抑制結果を顕微鏡により確認し、癌開始細胞の表現型をフローサイトメトリー分析により確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例によるＷｎｔまたはノッチ（Ｎｏｔｃｈ）細胞シグナル伝達抑制時、ＨＵＶＥＣｓが含まれた膵臓癌オルガノイドに存在する癌開始細胞の表現型を有する細胞の数を比較した結果を示す図である。 本発明の一実施例による対照群細胞またはＨＵＶＥＣｓ細胞の培養液に相当するコンディショニング培地（ＣＭ）を用いて膵臓癌オルガノイドを培養し、膵臓癌オルガノイドの細胞形態および表現型を顕微鏡およびフローサイトメトリー分析により確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による細胞またはＨＵＶＥＣｓ細胞の培養液に相当するコンディショニング培地（ＣＭ）を用いて培養された膵臓癌オルガノイドにおいてＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）表現型を有する細胞の比率をフローサイトメトリー分析により確認した結果を示す図である。
本発明の一実施形態では、ａ）膵臓癌患者から分離された生物学的試料を解離させ、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）に固定化するステップと、ｂ）前記ａ）ステップでマトリゲルに固定化されたサンプルを培養して膵臓癌オルガノイドを形成するステップと、ｃ）前記ｂ）ステップで形成された膵臓癌オルガノイドを解離させるステップと、ｄ）前記解離した膵臓癌オルガノイドと内皮細胞とを共培養するか；または前記解離した膵臓癌オルガノイドに内皮細胞培養液を入れて培養するステップと、を含む、膵臓癌オルガノイドの製造方法を提供する。
本発明の他の実施形態では、本発明による前記製造方法により製造された膵臓癌オルガノイドを提供する。
本発明のさらに他の実施形態では、本発明による前記膵臓癌オルガノイドに候補物質を処理するステップと、ｂ）候補物質の処理の有無によって内皮細胞を含む膵臓癌オルガノイドに含まれた癌細胞を観察するステップとを含む、膵臓癌治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
●実験方法
●［実験方法１］膵臓管腺癌患者サンプル
膵臓管腺癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＰＤＡＣ）組織と内視鏡超音波誘導微細針吸引（Ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｆｉｎｅ Ｎｅｅｄｌｅ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ；ＥＵＳ－ＦＮＡ）サンプルは韓国の延世大学医科大学セブランス病院から入手した。本出願に関連するすべての人体実験はセブランス病院機関審査委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ；ＩＲＢ）の承認を受け、ＩＲＢの事前同意指針により供与者である膵臓癌患者の同意を予め得た。
●［実験方法２］ヒト由来膵臓癌オルガノイドの作製
前記［実験方法１］で得られた組織試料を切断し、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号：１１０８８８６６００１）および１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培地に前記切断された組織試料を入れて、３７℃で９０分間培養する過程により十分に粉砕および分解させた。その後、前記分解された組織を１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）が含まれたＤＰＢＳ（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、成長因子減少（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅ；ＧＦＲ）マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号：３５６２３１）に埋め込んだ（ｅｍｂｅｄ）。ここで、ＥＵＳ－ＦＮＡ（ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ－ｇｕｉｄｅｄ ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）サンプルの場合には、少量の細胞物質を１０分間４００×ｇで遠心分離する過程により収集し、ＲＢＣ溶解緩衝液（ＱＩＡＧｅｎ、カタログ番号：１５８９０４）を用いてＥＵＳ－ＦＮＡサンプルを溶解させ、ａｄＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２回洗った。
以後、１０分間培養器で培養する過程によりマトリックスを重合化（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ）した後、ａｄＤＭＥＭ／Ｆ１２に下記表１に記載の成分が追加的に含まれている膵臓癌オルガノイド培養培地（培地１）を追加的に入れて、オルガノイドが形成されるまで培養した。その後、オルガノイドの形成が現れた時に、前記膵臓癌オルガノイド培養培地からＰＧＥ２が除かれた培地（培地２）に入れ替え、２回の継代が行われた後に、以下に記載のオルガノイドの特徴などを確認する実験を行った。
前記膵臓癌オルガノイドの継代のために、ＴｒｙｐＬＥエクスプレス（インビトロジェン、カタログ番号：１２６０４０１３）を用いてオルガノイドを分離し、ａｄＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いてトリプシンが残らないように洗浄した。最終的に、膵臓癌オルガノイドの断片がＧＦＲマトリゲルに埋め込まれているようにし、表１に記載されている膵臓癌オルガノイド培養培地（培地１）に１０μＭのＹ－２７６３２（トクリス）を追加的に添加した。以下、このように作製されたオルガノイドを、ヒト由来膵臓癌オルガノイドという。
●［実験方法３］細胞株の培養方法
ＨＵＶＥＣｓ（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を１％ゼラチンがコーティングされた培養皿に分注し、１×ＥＧＭ－２ＭＶシングルクォート補充パック（ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｐａｃｋ；カタログ番号：ＣＣ－４１４７）が含まれたＥＢＭ－２ベースの培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号：ＣＣ－３１５６）を用いて培養した。この時、前記培地は２日または３日の周期で入れ替えた。
また、ヒト膵臓管腺癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ；ＰＤＡＣ）細胞株に相当するＡｓＰＣ１、Ｍｉａ ＰＡＣＡ２およびＰＡＮＣ１細胞株を韓国細胞株銀行から購入した。前記ＡｓＰＣ１細胞株は１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０を用いて培養し、Ｍｉａ ＰＡＣＡ２およびＰＡＮＣ１は１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いて培養した。
●［実験方法４］膵臓癌オルガノイドおよびＨＵＶＥＣｓの共培養方法
図４に示されるように、ヒト由来膵臓癌オルガノイドとＨＵＶＥＣｓとを共培養して、ＨＵＶＥＣｓが含まれた膵臓癌オルガノイド（以下、「ヒト由来膵臓癌オルガノイドシステム」という）を構築した。具体的には、前記［実験方法２］で製造された膵臓癌オルガノイドをＴｙｐＬＥエクスプレスを用いて解離させた後、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒブルーＣＭＡＣ染料を用いて染色し、製造会社のプロトコルによりＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてＨＵＶＥＣｓを染色した。その後、前記ヒト由来膵臓癌オルガノイドとＨＵＶＥＣｓとを１：４の比率（５×１０５の細胞数：２×１０６の細胞数）で混合した。以後、前記細胞混合物を丸底超低圧付着プレート（ｒｏｕｎｄ－ｂｏｔｔｏｍ ｕｌｔｒａ－ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｌａｔｅｓ；ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れて、１０％マトリゲルが含まれた培地１を入れた後に、１００×ｇで３分間遠心分離し、１日間追加的に培養して凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成した。
前記凝集体をＧＦＲマトリゲルに埋め込み、十分に凝固された時、前記凝集体を基礎培地を用いて洗浄した後に、グルタマックスおよび５％のＦＢＳが含まれたａｄＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で３日間培養する過程により第１ヒト由来膵臓癌オルガノイドシステムを構築した。
ここで、ＷｎｔおよびＮｏｔｃｈ細胞シグナル伝達体系の抑制を確認するための実験の場合には、前記凝集体をＧＦＲマトリゲルに埋め込む時に、細胞シグナル伝達抑制剤である１００ｎＭのＷｎｔ－Ｃ５９または２００μＭのＤＡＰＴを追加的に含ませて３日間培養した。また、細胞の表現型を確認するためには、ＴｒｙｐＬＥエクスプレスを用いて前記ヒト由来膵臓癌オルガノイドシステムの凝集体を十分に細胞単一化させた後に、下記の［５－１］に記載のフローサイトメトリー分析により分析した。
●［実験方法５］ＨＵＶＥＣｓ培養液を用いたヒト由来膵臓癌オルガノイドの培養
ＨＵＶＥＣｓをＧＭ－２ＭＶに分注した後、９５％コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到達するまで培養した。前記ＨＵＶＥＣｓを２回洗浄し、培地を５％ウシ胎児血清およびグルタマックスが含まれたａｄＤＭＥＭ／Ｆ１２に入れ替えた後に、３日間３７℃の培養器で培養した。
一方、対照群の場合、細胞（ＨＵＶＥＣｓ）が含まれていないプレートに５％ウシ胎児血清およびグルタマックスが含まれたａｄＤＭＥＭ／Ｆ１２を３日間３７℃の培養器に置いた。
このように得られた培養液を４℃で遠心分離した後、上層液を集めて０．２２μｍのフィルタにより濾過して、上澄液に相当する培養液を得た。Ｗｎｔ－Ｃ５９およびＤＡＰＴを前処理するＨＵＶＥＣコンディショニング培地（ＣＭ）の場合、ＨＵＶＥＣ細胞をＷｎｔ－Ｃ５９およびＤＡＰＴ処理後、１日間培養し、細胞を洗浄した後に２回洗浄後、５％ウシ胎児血清およびグルタマックスが含まれたａｄＤＭＥＭ／Ｆ１２に入れ替え、３日間培養した。その後、先に記載されたものと同様の方法で上澄液に相当する培養液を得た。
前記得られた培養液を［実験方法２］で製造された膵臓癌オルガノイドに入れる過程により第２ヒト由来膵臓癌オルガノイドシステムを製造した。
●［実験方法６］測定、染色および分析方法
●［６－１］フローサイトメトリー分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
細胞表面染色のために、前記［実験方法４］の凝集体から単一化された細胞を１％のＦＢＳおよび０．１％ＢＳＡ（ＭＰ ｂｉｏ）が含まれたＦＡＣＳ緩衝液（ｄＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）に集めた後、Ｆｃ受容体ブロッカー（Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｌｏｃｋｅｒ、Ｍｉｌｔｅｎｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて遮断した。その後、ＣＤ４４－ＡＰＣｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２４－Ｐｅｃｙ７、およびＥｐＣＡＭ－ＰｅｒＣＰｃｙ５．５を用いて前記細胞を染色した後に、ＬＳＲ ＩＩを用いてフローサイトメトリー分析を行い、ＦｌｏｗＪｏとＤＩＶＡソフトウェアにより分析した。
●［６－２］免疫蛍光染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
前記ヒト由来膵臓癌オルガノイドまたはヒト由来または細胞株由来膵臓癌オルガノイドシステムをＰＢＳ（０．１％グルタルアルデヒド（Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）が含まれた１％のパラホルムアルデヒド（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に入れて、１０分間培養する過程により固定化した。その後、１０ｍＭ ＮａＢＨ４が含まれたＰＢＳを用いて少なくとも３回以上洗浄した。すべてのサンプルは１時間常温で１％のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を用いて遮断させ、ＣＤ４４抗体で染色された膵臓癌オルガノイドまたは膵臓癌オルガノイドシステムの場合、ＰＢＳで３回洗浄した。
以後、前記ヒト由来膵臓癌オルガノイドまたはヒト由来または細胞株由来膵臓癌オルガノイドシステムに二次抗体およびＤＡＰＩ（４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を入れて１時間培養し、ＰＢＳを用いて３回洗浄した後に、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０レーザスキャンコンフォーカルローカル顕微鏡を用いて観察した。
●［６－３］統計分析
実験の結果値は平均±ＳＥＭ値で提示されるように計算した。互いに異なる２つの標本に対する統計的比較のためにＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いており、多数の標本を比較して統計的有意性を評価するためにＤｕｎｎｅｔｔの多重比較テストを用いた。統計的に有意な値は０．０５未満に設定し、統計パッケージＳＰＳＳバージョン２５（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）とグラフパッドプリズム８を用いて統計テストを行った。
●［実験方法７］ウィント活性分析（Ｗｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ）
ＨＥＫ ２９３ ＳＴＦ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２４９）を白色の９６－ウェルプレートに分注し、１０％ＦＢＳおよび２００μｇ／ｍｌのＧ－４１８が含まれたＤＭＥＭで培養した。その後、５０％コンディショニングされた培地および対照群培地とともに４８時間培養した。
製造業者が提供する指針によりＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼシグナルを測定した。
●実験結果
●［実験結果１］癌開始細胞の濃縮の確認
●［１－１］ヒト由来膵臓癌オルガノイドの表現型および外形の確認
前記［実験方法２］のヒト由来膵臓癌オルガノイドにおいてＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）およびＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）ＥＳＡ（＋）に相当する表現型を確認して、その結果を図１の（Ａ）および（Ｂ）、図２および図３に示した。
図１の（Ａ）および（Ｂ）に示すように、顕微鏡観察（Ａ）およびフローサイトメトリー分析（Ｂ）ともにおいて、ヒト由来膵臓癌オルガノイド中にＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）表現型を有する細胞が７３．３％に相当し、ＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）表現型を有する細胞中にＥＳＡ（＋）表現型である細胞が９９．５％に相当した。
図２に示すように、ヒト由来膵臓癌オルガノイドにおいてＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）に相当する癌開始細胞（ＣＩＣ）は計６９．２±３．５％であり、ＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）細胞の９９．５±０．３％がＥＳＡ（＋）細胞であることを確認した。
図３に示すように、ヒト由来膵臓癌オルガノイドにおいてＣＤ４４が非常に高い水準に発現し、前記オルガノイドを構成している細胞は中心の空いている３次元円形（ルーメン構造）形態で構成されていることを確認した。
前記結果を通して、ヒト由来膵臓癌オルガノイドにおいてＣＤ２４（－）ＣＤ４４（－）細胞より、ＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）およびＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）ＥＳＡ（＋）細胞の方が高い水準に濃縮されていることが分かる。
●［１－２］膵臓癌オルガノイドの癌開始細胞の維持確認
人工的な幹細胞支援因子によって癌開始細胞が維持されるか否かを確認するために、前記［実験方法２］のヒト由来膵臓癌オルガノイドを５％のＦＢＳおよびグルタマックスが含まれたａｄＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である基礎培地で培養し、細胞数および表現型を観察して、その結果を図４に示した。
図４に示すように、基礎培地で３日間培養した時、癌開始細胞の数が減少した。
前記結果を通して、Ｗｎｔ、ＥＧＦおよびＦＧＦのような因子によって膵臓癌オルガノイドの癌開始細胞が拡大できることが分かる。
●［実験結果２］オルガノイド形成可能性評価
ヒト由来膵臓癌オルガノイドから分離されたＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（－）またはＣＤ２４（－／ｌｏｗ）ＣＤ４４（－）細胞のオルガノイド形成能を評価した。
具体的には、図５に図式化されたように、前記ヒト由来膵臓癌オルガノイドからＣＤ２４（－ｌｏｗ）ＣＤ４４（－）、ＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（－）およびＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）細胞をそれぞれフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）により分離し、１１日間前記培地１および２を用いて培養した。その後、フローサイトメトリー分析および蛍光顕微鏡分析を行って、その結果を図６および７に示した。
図６および図７に示すように、ＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（－）およびＣＤ２４（－／ｌｏｗ）ＣＤ４４（－）を培養して製造されたオルガノイドもＣＤ４４を発現し（図６）、ＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（－）およびＣＤ２４（－／ｌｏｗ）ＣＤ４４（－）細胞だけでなく、ＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）細胞も円形と真ん中の空いているルーメン構造に再構成された（図７）。
前記結果を通して、Ｗｎｔ、ＥＧＦおよびＦＧＦを含むオルガノイド培養培地は、ＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）癌開始細胞およびＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）ＥＳＡ（＋）癌開始細胞の拡張を誘導することができ、ＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（－）およびＣＤ２４（－／ｌｏｗ）ＣＤ４４（－）細胞はＣＤ４４（＋）である癌開始細胞に再プログラミングできることが分かる。
●［実験結果３］内皮細胞と癌開始細胞との相互作用の確認
内皮細胞によって癌開始細胞の自己再生およびメンテナンスが維持されるかを確認するために、前記［実験方法４］の第１ヒト由来膵臓癌オルガノイドシステムおよびヒト由来膵臓癌オルガノイドを成長因子が除かれた環境で培養した後、細胞形態および表現型を観察して、その結果を図９～図１２に示した。
図９に示すように、ヒト由来膵臓癌オルガノイドと比較して、第１ヒト由来膵臓癌オルガノイドシステムにおいてオルガノイド自体の大きさが著しく大きいことを確認した。
また、図１０～１２に示すように、ヒト由来膵臓癌オルガノイドと比較して、第１ヒト由来膵臓癌オルガノイドシステムにおいて癌開始細胞の表現型に相当するＣＤ２４（＋）ＣＤ４４（＋）が多数存在し（図１０および図１１）、このような表現型を有する１００％の細胞がＥＳＡ陽性細胞であることを確認（図１２）した。
●［実験結果４］内皮細胞と癌開始細胞との相互作用で関与する細胞シグナル伝達の確認
第１ヒト由来膵臓癌オルガノイドシステムにおいて細胞シグナル伝達を抑制した時、オルガノイドの形成過程を確認して、その結果を図１３の（Ａ）および（Ｂ）と図１４に示した。
図１３の（Ａ）および（Ｂ）と、図１４に示すように、ウィント（Ｗｎｔ）またはノッチ（Ｎｏｔｃｈ）細胞シグナル伝達を抑制する場合、オルガノイドシステムにおいてオルガノイドの形成が抑制された（図１３の（Ａ））。さらに、オルガノイドシステムに含まれた癌開始細胞もその数が著しく減少することを確認した（図１３の（Ｂ）および図１４）。
前記結果を通して、膵臓癌オルガノイドシステムに存在する癌開始細胞は、内皮細胞との相互作用によって自己再生およびメンテナンスされ、このような現象はウィントおよびノッチ細胞シグナル伝達によって起こるものであることが分かる。
●［実験結果５］ＨＵＶＥＣｓの上澄液を用いたヒト由来オルガノイドシステムの特徴の確認
癌開始細胞のメンテナンスにおいて内皮細胞のウィントおよびノッチリガンドのような分泌タンパク質の役割を評価するために、膵臓癌オルガノイドを５％ウシ胎児血清を含むＨＵＶＥＣｓ細胞のコンディショニング培地（ＣＭ）とともにａｄＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養し、その形態を顕微鏡により確認し、細胞の表現型をフローサイトメトリー分析により確認して、その結果を図１５および図１６に示した。ここで、前記［実験方法５］に記載されたように、対照群は細胞（ＨＵＶＥＣｓ）なしに培養液のみを単独で３７℃の培養器で培養したものを使用した。
図１５および図１６に示すように、癌開始細胞の表現型を有するＣＤ４４＋細胞が対照群コンディショニング培地（ｃｏｎｔｒｏｌ ＣＭ）を用いて培養した場合と比較して、ＨＵＶＥＣｓ細胞のコンディショニング培地（ＨＥＶＥＣ ＣＭ）を用いて培養した場合に著しく増加していることを確認した。
以上、本発明の特定部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な技術は単に好ましい実施形態に過ぎず、よって、本発明の範囲が制限されるわけではない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物によって定義される。
本発明の膵臓癌オルガノイドの製造方法は、癌細胞と内皮細胞との相互作用、すなわち血管ニッチのクロストーク（ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｎｉｃｈｅ）を十分に反映するため、既存の癌オルガノイドと比較して、有機体環境に存在する癌開始細胞（Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ；ＣＩＣｓ）の特性を示すことが可能で、スクリーニングされた薬物の臨床適用度および信頼度などをさらに著しく高めることができる。

Claims (12)

  1. ａ）膵臓癌患者から分離された生物学的試料を解離させ、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）に固定化するステップと、
    ｂ）前記ａ）ステップでマトリゲルに固定化されたサンプルを培養して膵臓癌オルガノイドを形成するステップと、
    ｃ）前記ｂ）ステップで形成された膵臓癌オルガノイドを解離させるステップと、
    ｄ）前記解離した膵臓癌オルガノイドと内皮細胞とを共培養するか；または前記解離した膵臓癌オルガノイドに内皮細胞培養液を入れて培養するステップと、を含む、膵臓癌オルガノイドの製造方法。
  2. 前記ｄ）ステップの内皮細胞は、血管内皮細胞（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）である、請求項１に記載の膵臓癌オルガノイドの製造方法。
  3. 前記ｄ）ステップにおいて、前記共培養は、膵臓癌オルガノイドと内皮細胞とを１：１～１：６の比率で混合して培養するものである、請求項１に記載の膵臓癌オルガノイドの製造方法。
  4. 前記ａ）ステップにおいて、解離させるステップは、コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を用いるものである、請求項１に記載の膵臓癌オルガノイドの製造方法。
  5. 前記内皮細胞を含む膵臓癌オルガノイドは、癌開始細胞（Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ；ＣＩＣｓ）が含まれたものである、請求項１に記載の膵臓癌オルガノイドの製造方法。
  6. 前記ｄ）ステップにおいて、前記共培養または培養液を入れて培養するステップは、内皮細胞によって膵臓癌オルガノイドに含まれた癌開始細胞の自己再生およびメンテナンスが誘導されるものである、請求項１に記載の膵臓癌オルガノイドの製造方法。
  7. 前記膵臓癌は、膵臓管腺癌（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）である、請求項１に記載の膵臓癌オルガノイドの製造方法。
  8. 前記ｂ）ステップのオルガノイドを形成するステップは、抗生剤、グルタミン、Ｂ２７、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、成長因子、ガストリン、細胞シグナル伝達抑制剤およびＰＧＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２）から構成された群より選択される１種以上をさらに含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において、前記ａ）ステップの解離したサンプルを培養する過程により行われるものである、請求項１に記載の膵臓癌オルガノイドの製造方法。
  9. 請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法により製造された膵臓癌オルガノイド。
  10. ａ）請求項９に記載の膵臓癌オルガノイドに候補物質を処理するステップと、
    ｂ）候補物質の処理の有無によって内皮細胞を含む膵臓癌オルガノイドに含まれた癌細胞を観察するステップとを含む、膵臓癌治療剤をスクリーニングする方法。
  11. 前記ｂ）ステップにおいて、癌細胞の大きさが減少または維持されるか、癌開始細胞の数が減少する場合に、前記候補物質を膵臓癌治療剤として選別するものである、請求項１０に記載の膵臓癌治療剤をスクリーニングする方法。
  12. 前記膵臓癌は、膵臓管腺癌である、請求項１０に記載の膵臓癌治療剤をスクリーニングする方法。

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