JP2023536797A - カゼイン加水分解物の調製方法 - Google Patents

Abstract

要約書本発明は、カゼインの内因性プラスミンでの加水分解によるカゼイン加水分解物の調製方法、及び当該方法によって得られるカゼイン加水分解物に関する。特に、本発明は、有機カゼイン加水分解物が得られるように外因性酵素を添加することなくカゼイン加水分解物を調製する方法に関する。

Description

本発明は、カゼインを内因性プラスミンで加水分解することによって調製されるカゼイン加水分解物の調製方法、及び当該方法によって得ることができるカゼイン加水分解物に関する。特に、本発明は、カゼイン加水分解物の調製方法であって、カゼイン加水分解物を得るために充分なｐＨ、温度、及び時間で、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液を熱処理する方法に関する。カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液は、全固形分の少なくとも８０重量％のカゼインと、全タンパク質含有量の最大１０重量％の量の乳清タンパク質とを含む。

人乳の組成は、乳児栄養の生物学的基準であり、人乳は、その栄養組成と生存及び健全な成長を促進する非栄養的生物活性因子との両方においてヒト乳児に比類なく適している。世界保健機関（ＷＨＯ）は生後６か月の完全母乳育児を推奨しており、世界中の母親において母乳育児の支援・促進に取り組んでいる。しかしながら、母親が母乳で育てられないか又は母乳育児を選択しない場合、調製粉乳などの好適な代替栄養組成物を乳児に与える必要がある。したがって、人乳に近いタンパク質組成を提供する、調製粉乳などのヒト以外の乳児栄養剤を調製する必要がある。

人乳のタンパク質は乳清タンパク質とカゼインタンパク質との二群に分割される。人乳中のタンパク質の約４０％はカゼインであり、６０％は乳清タンパク質である。人乳の主なタンパク質は、ウシベータ－カゼイン、アルファ－ラクトアルブミン、ラクトフェリン、免疫グロブリンＩｇＡ、リゾチーム、及び血清アルブミンに対して相同性であるカゼインタンパク質である。アルファ－ラクトアルブミン、ラクトフェリン及び血清アルブミンは乳清タンパク質である。

人乳及び牛乳のカゼイン組成は、人乳の大部分がベータ及びカッパカゼインで構成され、α－Ｓ１カゼインは人乳でみられるが、微量（３～５００μｇ／ｍＬ）でしか存在せず、したがってアミノ酸源として機能する可能性が低い点で異なる。

人乳は、プラスミン、カテプシン及びエラスターゼなどの様々な内因性酵素も含み、研究によると、人乳中のこれらの酵素のいくつかのタンパク質分解作用の結果、何百ものペプチドが生成することが示されている。

主な胃プロテアーゼ酵素であるペプシンは、２６週までには新生児の胃中に存在し、酸性ｐＨで最適に機能することが知られており、ｐＨ７で変性する。しかしながら、乳児の胃中では酸の産生が少ないため、正期産児では産後数週間、消化後最大１時間は胃のｐＨが５～７であることが判明している。このことから、乳の緩衝能力と相まって、乳児の胃では、アミノ酸の準最適な取り込みをもたらし得るペプシン誘発性タンパク質分解がほとんど起こらないという仮説が導かれた。カゼインに対する内因性乳プロテアーゼの作用は、新生児の胃腸管におけるペプシン活性の不足を補う可能性があり、その結果、機能だけでなく栄養源としてカゼインからアミノ酸を利用可能になる。

したがって、人乳は、加水分解カゼインなどの加水分解された乳タンパク質を含み、そのようなカゼイン加水分解物を調製する方法が当該技術分野で必要とされている。

前述のように、人乳中の内因性プロテアーゼ酵素の作用は乳腺において作用し、これらの酵素のうち、プラスミンが主な寄与因子である。先行技術では、人乳で同定されたペプチドの３２％がβ－カゼインに由来し、１０％がαＳ－１カゼインに由来することが論じられている。さらに、先行技術では、人乳中でペプチドが優勢であるのは、β－カゼインに対するプラスミンの作用に由来することが論じられてきた。先行技術では、人乳が牛乳よりも多くのペプチドを含むことも論じられている（牛乳では１．１９×１０^１１であるのに対して人乳では７．６２×１０^１１という、より高い総イオン強度により示される）。このことは、プラスミン由来のカゼインペプチドの量が多く、したがって人乳でみられるものに近い、改善された調製粉乳が必要とされている事実をより強固なものとする。

カゼインタンパク質の酵素加水分解から調製されるカゼイン加水分解物は当該技術分野では公知であるが、タンパク質加水分解物を酵素により調製するこれらの公知方法はすべて外因性プロテアーゼの添加を使用する。例えば、米国特許出願公開第２０１８／０１６０７１５Ａ１号は、小児用栄養組成物で使用するためのタンパク質加水分解物の調製方法を開示している。米国特許出願公開第２０１８／０１６０７１５Ａ号は、トリプシン（トリプシン様）、キモトリプシン（キモトリプシン様）、ペプシン及び／又はプラスミンなどの外因性プロテアーゼをカゼイン含有スラリーに対して添加することによるカゼインの加水分解を開示している。

しかしながら、外因性プロテアーゼの使用に関連する規制要件を軽減し、有機調製粉乳製品の開発を可能にするために、外因性酵素の使用を回避することが望ましい。

したがって、カゼイン加水分解物の改善された調製方法が有利であり、特に、外因性酵素を添加することなくカゼイン加水分解物を調製する、より効率的な方法が有利である。さらに、人乳に近いペプチドプロファイルを有するカゼイン加水分解物、例えば、人乳に近いペプチドの蓄積を有するカゼイン加水分解物の調製方法も有利である。

したがって、本発明の目的は、外因性プロテアーゼの添加の使用を回避することによってカゼイン加水分解物を調製することに関する。本発明の目的は、保存中、及び少なくとも１年までの保存でカゼイン加水分解物のゲル化、凝集又は沈殿なしに迅速かつ効率的にカゼインが加水分解されるように、内因性プラスミンでカゼインを加水分解することによってカゼイン加水分解物を調製する最適化された方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、人乳に近いペプチドの蓄積を有するカゼイン加水分解物を調製することである。

さらに、本発明の目的は、ペプチドの一部が、例えば抗菌活性やＡＣＥ抑制活性などの実証された生物活性を有するカゼイン加水分解物を提供することである。

本発明者らは驚くべきことに、外因性酵素を使用しないが、内因性プラスミンを使用することによって加水分解が得られる場合に、カゼイン加水分解物を迅速かつ効率的に得ることができることを見出した。驚くべきことに、例えばミセルカゼイン分離物などの多量のカゼインを含む系では、内因性プラスミンは、熱処理中に失活せず、例えば、１２０℃を超える温度で３～５秒間の超高温熱処理などの広範囲の熱処理後でさえも失活しないことが見いだされた。このように、本発明は、固有の微生物のリスク無しに、プラスミン活性に最適なｐＨ及び温度でのミセルカゼイン分離物の下流無菌インキュベーションを可能にするものである。また、ｐＨ、温度、及び加水分解に使用するフィード中に存在する成分（カゼイン、乳清タンパク質及びカルシウムの成分など）などの加水分解パラメータを最適化することによって、外因性酵素を添加することなく、カゼイン加水分解物を迅速かつ効率的に調製することが可能であることも見いだされた。このカゼイン加水分解物の新規調製方法は、さらに、ペプチドの蓄積が母乳に近いという利点を有する。したがって、例えば、ミセルカゼイン分離物（ＭＣＩ）の内因性プラスミンでの加水分解によって得られるカゼイン加水分解物を使用することで、カゼインに由来するペプチドの量が、今日の市販の調製粉乳製品でみられる量よりも人乳で観察される量にはるかに近い調製粉乳製品が得られるであろう。

「ペプチドの蓄積」という用語は、ＨＰＬＣによって与えられる、サンプル中の加水分解の過程にわたるペプチドの相対的ピーク面積の増加を指す。ペプチドの蓄積は、ＨＰＬＣクロマトグラフにおいて１２～１４分、１６．５分及び１７～１８分の領域で観察される。言い換えると、ペプチドの蓄積は、時間とプラスミン活性との関数として起こる。本発明のカゼイン加水分解物中に存在するペプチド中のアミノ酸は、人乳中のペプチドのアミノ酸配列において同一ではないが、ペプチド蓄積の点で人乳をより反映している。インタクトなカゼインタンパク質の付随する損失は、時間の関数としてＨＰＬＣによる所与のカゼインのピーク面積の減少により、同じ方法で算出される。

本発明はまた、ミセルカゼイン分離物などのカゼイン及びプラスミンの液体源が有機物である場合は、有機カゼイン加水分解物の調製を可能にする。

したがって、本発明の一態様は、カゼイン加水分解物を調製する方法であって：
ｉ）カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液を提供する工程であって、前記溶液が全固形分の少なくとも８０重量％のカゼインを含み、前記溶液が乳清タンパク質を全タンパク質含有量の最大１０重量％の量で含む工程と、
ｉｉ）工程ｉ）の溶液のｐＨをｐＨ７．２～９に調節する工程と、
ｉｉｉ）ｐＨ調節済溶液を第一熱処理工程に供して微生物を不活性化する工程と、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の溶液を２５℃～４５℃の温度で少なくとも６時間の第二熱処理に供して、カゼイン加水分解物を得る工程と、
を含む方法に関する。

本発明の別の態様は、本発明による方法により得ることができる天然カゼイン加水分解物に関する。

本発明のさらに別の態様は、天然カゼイン加水分解物であって、添加された外因性酵素を含まないカゼイン加水分解物を提供することである。

本発明のさらに別の態様は、栄養組成物において本発明による天然カゼイン加水分解物を使用することである。

図１は、８％ｗ／ｖのＭＣＩ溶液中のプラスミン由来のペプチドの発生に対する第一熱処理工程の温度の影響を示す。図１は、ＲＰ－ＨＰＬＣで１２．００分～１４．００分に溶出するプラスミン由来のペプチドを示す。 図２は、８％ｗ／ｖのＭＣＩ溶液中のプラスミン由来のペプチドの発生に対する第一熱処理工程の温度の影響を示す。図２は、ＲＰ－ＨＰＬＣで１７．００分～１８．００分に溶出するプラスミン由来のペプチドを示す。 図３は、ＲＰ－ＨＰＬＣによって決定されるインタクトなベータ－カゼインの損失を示す。ｙ軸は、インキュベーション直前のｔ＝０でのベータ－カゼインに対して正規化される。 図４は、ＲＰ－ＨＰＬＣによって決定されるインタクトなアルファ－Ｓ１カゼインの損失を示す。ｙ軸は、インキュベーション直前のｔ＝０でのアルファ－Ｓ１カゼインに対して正規化される。 図５は、１３０℃、１３５℃及び１４０℃の温度で３～４秒間の熱処理によるペプチドの蓄積を示す。プラスミン由来のペプチドは、ＲＰ－ＨＰＬＣで１２．００分～１４．００分に溶出する。熱処理は、処理と同じ日（第１日）又は５℃で２４時間保存した後（第２日）のいずれかであった。ｙ軸は正規化されたピーク面積、すなわちｔ＝０におけるピーク面積であり、ｙ軸上のそれ以降のデータポイントはこれに対する相対値である。 図６は、１３０℃、１３５℃及び１４０℃の温度で３～４秒間の熱処理によるペプチドの蓄積を示す。プラスミン由来のペプチドは、ＲＰ－ＨＰＬＣで１７．００分～１８．００分に溶出する。熱処理は、処理と同じ日（第１日）又は５℃で２４時間保存した後（第２日）のいずれかであった。 図７は、熱処理されたＭＣＩにおける、第１日と第２日、すなわち５℃で２４時間保存した後とのプラスミン活性の変化を示す。 図８は、カゼインのプラスミンで誘導された加水分解の代表的なＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラム（重ね合わせ）を示す。 図９Ａ及び９Ｂは、ＭＣＩの加水分解後のα－Ｓ１－カゼインの同定されたペプチドを示す。 図１０Ａ及び１０Ｂは、ＭＣＩの加水分解後のα－Ｓ２－カゼインの同定されたペプチドを示す。 図１１Ａ及び１１Ｂは、ＭＣＩの加水分解後のβ－カゼインの同定されたペプチドを示す。 図１２は、本発明のカゼイン加水分解物の分子量分布を示す。 図１３Ａは、異なるｐＨ値を有するサンプルについて、ＲＰ－ＨＰＬＣによって決定されるインタクトなアルファ－Ｓ１カゼインの損失を経時的に示す。ｙ軸は、インキュベーション直前のｔ＝０でのアルファ－Ｓ１カゼインに対して正規化される。図１３Ｂは、異なるｐＨ値を有するサンプルについて、ＲＰ－ＨＰＬＣによって決定されるインタクトなベータ－カゼインの損失を経時的に示す。ｙ軸は、インキュベーション直前のｔ＝０でのベータ－カゼインに対して正規化される。

次に、本発明を以下でより詳細に説明する。

発明の詳細な説明

定義
本発明をさらに詳細に論じる前に、以下の用語及び表現法をまず定義する。
本発明の単数の特徴又は制限についての言及はすべて、他の指定がない限り、又は言及がなされる文脈によって明確に反対の暗示がない限り、対応する複数の特徴又は制限を包含し、逆もまた同様である。

本明細書中で言及されるすべてのパーセントは、特に断りのない限り、重量パーセントである。また、「乾燥物質重量」及び「乾燥物質基準」という用語は、同じ概念を指し、交換可能に使用される。

例えば、１％ｗ／ｗにおけるような「ｗ／ｗ」という用語は、１重量％の化合物を含む組成物を指す。

「溶液」という用語は、本発明の関連では、少なくとも６０重量％の水分含量、例えば少なくとも７０重量％、好ましくは少なくとも８０重量％の水分含量を有する生成物を意味する。好ましくは、本発明の「溶液」中の水分含量は、８０～９６重量％、特に８５～９５重量％である。

本発明の関連で、溶液中のカゼイン量におけるような「ｗ／ｖ」という用語は、フィード材料の体積当たりのカゼインの重量パーセントを意味する。例えば、溶液中の１％ｗ／ｖのカゼインは、１００ｍｌの溶液あたり１ｇのカゼイン、すなわち、１リットルの溶液あたり１０ｇのカゼインを意味する。

本発明の関連で、「カゼイン加水分解物」又は「加水分解されたタンパク質」という用語は、タンパク質加水分解に供されたカゼインタンパク質を含む組成物を意味する。タンパク質加水分解によって、タンパク質はペプチドと遊離アミノ酸とに切断され、したがって、「加水分解されたタンパク質」はペプチド及び／又は遊離アミノ酸を含む。

内因性プラスミンにおけるような「内因性」という用語は、酵素プラスミンが加水分解に使用されるカゼインタンパク質源において天然に存在することを意味する。「内因性」とは逆に、「外因性」という用語は、酵素が天然に存在せず、個々に添加されることを指す。

本発明の関連で、「固体」という用語は、乳からすべての水分を除去した場合に残るであろう分子に関する。「固体」という用語には、タンパク質、酵素（プラスミン又はプラスミノーゲン）、乳脂肪、炭水化物、ミネラル、ビタミン及び他の水以外の小分子が含まれる。

カゼイン：
カゼインは、カゼインミセルと呼ばれる粒子の懸濁液として乳中に見られる乳タンパク質である。ミセル中のカゼインは、カルシウムイオンと疎水性相互作用とによって結合している。

人乳では、タンパク質の約４０％がカゼインであるが、牛乳中の乳タンパク質の約８０％はカゼインである。

カゼインは、例えば、アルファ－カゼインやベータ－カゼインなど、異なる形態で見られる可能性がある。また、ベータ－カゼインは、変異体Ａ１ベータ－カゼインやＡ２ベータ－カゼインで見られる可能性もある。Ａ１及びＡ２ベータ－カゼインは、一つのアミノ酸が異なるベータ－カゼイン乳タンパク質の遺伝子変異体であり；Ａ２ベータ－カゼインを構成するアミノ酸鎖の６７位にはプロリンが存在するが、Ａ１ベータ－カゼインでは、ヒスチジンがその位置に存在する。ベータ－カゼインが消化器系においてみられる酵素と相互作用する方法のために、Ａ１及びＡ２は、消化酵素によって異なって処理される。しかしながら、本発明では、Ａ１ベータ－カゼインとＡ２ベータ－カゼインとの両方を使用できる。

したがって、本発明の関連で、「カゼイン」という用語は、酸カゼイン、ベータ－カゼイン、ベータ濃縮カゼイン、アルファ－カゼイン、アルファ濃縮カゼイン、カッパ－カゼイン及びカッパ濃縮カゼインなどの任意の種類のカゼインを指す。しかしながら、本発明の一実施形態では、「カゼイン」という用語は、カゼイン塩を対象としない。カゼイン塩はプラスミン活性がほとんどないことが分かっている。

本発明の好ましい実施形態では、カゼインはアルファ－カゼイン及び／又はベータ－カゼインである。

本発明の一実施形態では、工程ｉ）で提供される溶液は、カゼインを少なくとも１％ｗ／ｖの量で含む。

カゼイン加水分解物を調製するためには、充分な量のカゼインが溶液中に存在していなければならない。したがって、本発明の好ましい実施形態では、溶液はカゼインを、少なくとも３．０％ｗ／ｖ、例えば少なくとも４％ｗ／ｖ、さらに好ましくは少なくとも５％ｗ／ｖ、なお一層好ましくは少なくとも６％ｗ／ｖの量で含む。

カゼインの含有量が多いと熱処理中に溶液のゲル化が起こり、溶液が粘稠になり、したがって処理が困難になるため、カゼイン含有量は２０重量％以下でなければならない。

したがって、本発明のさらなる実施形態では、溶液はカゼインを、１％～２０％ｗ／ｖ、例えば３．０％～１７％ｗ／ｖの溶液中カゼイン、好ましくは４％～１５％ｗ／ｖの溶液中カゼインの範囲の量で含む。本発明の好ましい実施形態では、溶液はカゼインを１％～１５％ｗ／ｖの範囲の量で含む。

溶液中のカゼイン含有量は、好ましくは全タンパク質含有量の少なくとも９０重量％、例えば、全タンパク質含有量の少なくとも９３重量％、なお一層好ましくは全タンパク質含有量の少なくとも９５重量％でなければならない。

カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液は、好ましくは乳清タンパク質を含まない。乳清タンパク質が存在する場合、全タンパク質含有量の１０重量％以下の量である。

プラスミンは、乳清タンパク質に対する活性が非常に低く、したがって、乳清タンパク質をペプチドと遊離アミノ酸とに加水分解／切断できない。プラスミンはカゼインに対して活性である。さらに、乳清タンパク質はプラスミンを不活性化する。折りたたまれていない変性乳清タンパク質（主にベータ－ラクトグロブリン）はプラスミンの活性部位の近くでプラスミンと（ジスルフィド結合により）結合し、それによってプラスミンを不活性化する。乳清タンパク質が溶液中に多量に存在する場合、プラスミンのＳ－Ｓ／Ｓ－Ｈ相互作用によってプラスミンの不可逆的変性を引き起こす遊離ＳＨ基を含むβ－ラクトグロブリンとの相互作用によって、ＵＨＴ処理などの広範囲の熱処理後にプラスミン活性は著しく影響を受ける。したがって、本発明で使用される「溶液」中の乳清タンパク質の含有量は、熱処理後に溶液中に有効なレベルのプラスミン活性が残存することを可能にするために充分低くなければならない。

「乳清タンパク質」という用語は、乳清中に見られるタンパク質に関する。乳清タンパク質としては、典型的には、ベータ－ラクトグロブリン、アルファ－ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン及び免疫グロブリン、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ及び乳脂肪球膜タンパク質が挙げられる。さらに、甘性乳清でみられる乳清タンパク質は、典型的には、カゼイノマクロペプチドも含む。

好ましくは、溶液は乳清タンパク質を、全タンパク質含有量の７重量％以下、例えば、全タンパク質含有量の５％以下、なお一層好ましくは、全タンパク質含有量の３重量％以下の量で含む。好ましい実施形態において、カゼインとプラスミンとを含む溶液は、本質的に乳清タンパク質を含まない。

本発明で使用するカゼイン源は、内因性プラスミンも含む任意のカゼイン源である。好ましくは、カゼイン及び内因性プラスミン源は、カゼインタンパク質を含む乳製品のフラクションである。好ましくは、乳製品乳のフラクションは、牛乳の分画によって得られる。

本発明の一実施形態において、カゼイン及び内因性プラスミン源は、ミセルカゼイン分離物（ＭＣＩ）、ミセルカゼイン濃縮物（ＭＣＣ）、ミセルカゼイン保持液（ＭＣＲ）、ベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン分離物、ベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン濃縮物、乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）、又は乳製品の精密ろ過保持液の群から選択される乳製品である。好ましくは、カゼイン及び内因性プラスミン源は、ＭＣＩ、ＭＣＣ、ＭＣＲ、ベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン分離物、ベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン濃縮物、又は乳製品の精密ろ過保持液である。

さらに好ましい実施形態では、ミセルカゼイン濃縮物及び分離物は高含有量のミセルカゼインを有することになるので、カゼイン及び内因性プラスミン源は、ミセルカゼイン濃縮物及びミセルカゼイン分離物の群から選択される。ミセルカゼインの含有量は、ミセルカゼイン分離物ではミセルカゼイン濃縮物よりも高く、このため、ミセルカゼイン分離物を使用することが好ましい。最も好ましくは、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液は、ミセルカゼイン分離物（ＭＣＩ）である。

ミセルカゼイン分離物は、ろ過プロセス、好ましくは、精密ろ過保持液中の高度に濃縮された未変性形態で乳由来のフィードから天然乳カゼインタンパク質を分離する精密ろ過膜での膜ろ過によって生成される。ミセルカゼイン分離物（ＭＣＩ）は、例えば、カゼインを全タンパク質含有量の８５～９５重量％の量で含む。ほとんどの場合、ＭＣＩは全タンパク質含有量の９３～９４％ｗ／ｗカゼインを含む。

ＭＣＩは、例えば、典型的には０．０１～１．０ミクロンの範囲の孔径を有するＭＦ膜（複数可）を用いた精密ろ過に乳由来のフィードを供することによって作製され得る。好ましくは、ＭＦ膜（複数可）の孔径は、０．０５～０．８ミクロンの範囲である。さらに、提供されるＭＦ膜（複数可）は、２００～２０００ｋＤａの範囲の分子量カットオフを有する。ＭＦ膜（複数可）は、例えば、ポリマー膜又はセラミック膜であってよい。

例えば、ＭＣＩは、約０．１４ミクロンの孔径を有するセラミック膜（Ｉｎｓｉｄｅ Ｃｅｒａｍ（商標）、Ｔａｍｉ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、仏国ニヨン）又は約８００ｋＤａ（ＰＶＤＦ ８００ｋＤａ；Ｓｙｎｄｅｒ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、米国）の分子量カットオフを有するポリマーＦＲ膜を用いた精密ろ過によって作製できる。

ミセルカゼイン分離物を生成するためのスキムミルクなどの乳由来のフィードの精密ろ過は、文献でよく記載されており、当業者には周知の既存の商業的単位操作である。精密ろ過は、限定されるものではないが渦巻き型膜又はセラミック膜を使用して達成することができ、１０℃以下の温度での低温膜ろ過又は約５０℃、例えば４５～５５℃の温度での加熱条件など、広範囲の温度で実施することができる。

ベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン分離物及びベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン濃縮物は、国際公開第２０１４／１１４７０９Ａ２号に記載の方法により、前記特許の方法によって得られる精密ろ過からの第二保持液として得ることができる。

ＭＣＩ、ＭＣＣ、ＭＣＲ、ベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン分離物及びベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン濃縮物を調製するための乳由来のフィードは、全乳、スキムミルク、無脂肪乳、ローファット乳、高脂肪乳及び濃縮乳を含んでいてもよいし、さらにはこれらからなるものであってもよい。乳フィードは、通常、反芻動物乳由来である。「濃縮乳」という用語は、蒸発によるか、又は限外ろ過、ナノろ過及び／若しくは逆浸透によって濃縮された乳に関する。濃縮乳が、濃縮された非蒸発（ｎｏｎ－ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ）乳、すなわち、ろ過によって濃縮された乳であることが特に好ましい。

本発明の一実施形態において、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液は、有機ＭＣＩの溶液であってよい。有機ＭＣＩを使用する場合、ＭＣＩを調製するために使用する乳由来のフィードは有機物である。

本発明の関連で、「有機乳」という用語は、以下に従って飼育された哺乳動物、例えば、ウシによって産生された乳に関するものである：哺乳動物は、全放牧シーズン中、有機認証を受けた牧草に自由にアクセスできなければならない。この期間は、農場の地理的な気候に特異的であるが、年間少なくとも１２０日、好ましくは少なくとも１５０日でなければならない。天候、季節、又は気候により、放牧シーズンは連続的であってもよいし、そうでなくてもよい。ウシ用有機飼料は有機認証を受けた牧草からの乾燥物質を（平均で）少なくとも３０パーセント含まなければならない。乾燥物質摂取量（ＤＭＩ）は、動物が一日あたり消費する無水基準のフィード量である。干し草、穀物、及び他の農産物をはじめとする飼料の残りも、有機認証を受けたものでなければならない。家畜は、抗生物質、追加された成長ホルモン、哺乳動物若しくは鳥類副産物、又は他の禁止されているフィード成分（例えば、尿素又はひ素化合物）を使用せずに管理されなければならない。

内因性プラスミン：
プラスミンは乳中に天然に存在する酵素であり、「内因性」という用語は、本発明の方法で使用されるプラスミンが乳製品中に天然に存在するプラスミンであることを意味する。したがって、プラスミンは、使用されるカゼイン源中に天然に存在する。例えば、ミセルカゼイン分離物はプラスミンを含む。

プラスミンは、圧倒的にカゼインタンパク質に対して活性であり、乳清タンパク質に対しては活性ではない。これらのカゼインタンパク質は、プラスミンによって認識されるリジン－アルギニンモチーフを含むため、プラスミンは、特にアルファ－カゼイン及びベータ－カゼインに対して活性である。

本発明の関連で、方法は外因性酵素の添加を含まず、特に、方法は外因性プラスミン又はトリプシンの添加を含まない。本発明で提供される加水分解は、カゼイン加水分解物を調製するためのカゼイン源として使用される溶液／フィード中に天然に存在する内因性プラスミンの使用によってのみ実施される。トリプシンは、プラスミンに類似した効果を有するが、トリプシンは乳中で内因的に見られない。

したがって、本発明の好ましい実施形態では、方法は、外因性プラスミン又はトリプシンの添加を除外するなど、外因性酵素の添加を除外する。

本発明の関連で、溶液が内因性プラスミンを含むことに言及する場合、溶液が、プラスミン及び関連する内因性酵素、例えば、ミディ－プラスミン、ミニ－プラスミン、マイクロ－プラスミン並びにプラスミンの自己分解に由来するプラスミン様活性を示す酵素を含むことを対象とする。したがって、「プラスミン」という用語は、本発明の関連では、プラスミン様酵素、例えば、ミディ－プラスミン、ミニ－プラスミン、マイクロ－プラスミン、及びプラスミンに変換できるプラスミノーゲンを対象とする。したがって、本発明に使用される溶液は、必ずしも最初からプラスミンを含む必要はなく、代わりに、プラスミンに変換されるプラスミノーゲンを含んでもよい。

本発明の一実施形態では、「プラスミン」という用語は、ＥＣ３．４．２１．７に分類される酵素を対象とする。

プラスミン系は、プラスミン（ＰＬ）とプラスミン様酵素、プラスミノーゲン（ＰＧ）、プラスミン活性化因子（ＰＡ）、プラスミン活性化因子阻害物質（ＰＡＩ）及びプラスミン阻害物質（ＰＩ）を含み、非常に複雑である。ＰＩ及びＰＡＩは主に乳清でみられ、一方、ＰＧ、ＰＬ及びＰＡはカゼインミセルに結合している。したがって、カゼインミセルをＭＣＩ、ＭＣＣ又はＭＣＲとして精密ろ過によって単離することで、ＰＩ及びＰＡＩが除去され、ＰＧ及びＰＬがＰＡと共に濃縮されることにより、ＰＧからＰＬへの変換が促進されることが期待される。ＰＩ及びＰＡＩはまた、幾分熱不安定性であり、穏やかな熱処理によってこれらの種が不活性化され、これによってもＰＧからＰＬへの変換が増加することが予想される。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎらは、乳を３７℃で最大８０時間インキュベートすると、ＰＬが増加し、ＰＧが減少することを観察した。

本発明者らは、商業的低温殺菌条件（７５Ｃで１５秒）がＰＡＩを不活性化し、実際、ＰＡはＰＧ及びＰＬよりも耐熱性であることを見出した。このことは、ＭＣＩの製造に使用されるスキムミルクも不活性化されたＰＡＩを含み、乳清タンパク質から分離すると、ＰＧからＰＬへの変換の準備が整うことを意味する。

溶液：
本発明の関連で、「溶液」という用語は、液体化合物と固体化合物又は半固体粒子、例えばタンパク質粒子との組み合わせを含む組成物を包含する。したがって、「溶液」は懸濁液であってもよいし、さらにはスラリーであってもよい。しかしながら、「溶液」は好ましくはポンプ圧送可能であり、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液中の液体の量は、好ましくは７０～９９％、さらに好ましくは８０～９６％である。溶液に使用される液体は、典型的には水である。

前述のように、本発明にかかるカゼインと内因性プラスミンとを含む溶液は、典型的には、カゼインを溶液の１重量％以上の量で含む。

本発明の一実施形態において、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液は、
ａ）カゼインと内因性プラスミンとを含む乳由来のフィードのフラクション、又はｂ）カゼインと内因性プラスミンとを含む乳由来のフィードの濃縮フラクション、又はｃ）水などの液体中に希釈されたカゼインと内因性プラスミンとを含む乳由来のフィードのフラクション、又はｄ）水などの液体中に希釈された乳由来のフィードの濃縮フラクションの溶液であってよい。

例えば、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液は、全タンパク質含有量のうち高含有量のカゼインを有する乳由来のフィードのフラクションを含む。

カゼインと内因性プラスミン、プラスミノーゲン、ミディ－プラスミン、ミニ－プラスミン、及びマイクロ－プラスミンのいずれかとを含む任意の種類の乳フラクションを使用してもよい。

本発明の関連で、「乳フラクション」という用語は、乳由来のフィードから得られるフラクションであると理解される。乳フラクションは、乳由来のフィードの幕ろ過処理によって得ることができるが、他の分画処理によって得ることもできる。

カゼインと内因性プラスミンとを含む乳フラクションは、ミセルカゼイン分離物（ＭＣＩ）、ミセルカゼイン濃縮物（ＭＣＣ）、ミセルカゼイン保持液（ＭＣＲ）、乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）、ベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン分離物、ベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン濃縮物又は乳製品の精密ろ過保持液の群から選択することができる。好ましくは、乳フラクションは、ミセルカゼイン分離物（ＭＣＩ）、ミセルカゼイン濃縮物（ＭＣＣ）、及びミセルカゼイン保持液（ＭＣＲ）の群から選択される。最も好ましくは、乳フラクションはＭＣＩである。

ＭＣＩ、ＭＣＣ及びＭＣＲでは、プラスミン阻害物質及びプラスミノーゲン活性化因子阻害物質は存在しない。しかしながら、例えば乳自体（例えば、スキムミルク）では、プラスミン阻害物質及びプラスミノーゲン活性化因子阻害物質が存在する。プラスミン阻害物質は、プラスミンの活性を阻害し、したがって、カゼインとプラスミンとを含む溶液では望ましくない。プラスミノーゲン活性化因子阻害物質は、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換を阻害し、したがってこれもまた望ましくない。したがって、乳自体は、カゼインとプラスミンとを含む溶液として適していない。本発明の一実施形態では、カゼインとプラスミンとを含む溶液は、プラスミン阻害物質もしくはプラスミノーゲン活性化因子阻害物質を含まないか、又は少なくとも必須量のプラスミン阻害物質若しくは及びプラスミノーゲン活性化因子阻害物質を含まない。

ミセルカゼイン分離物（ＭＣＩ）は、例えば、内因性プラスミンを含む以外に、カゼインも全固形分の８５～９５重量％の量で含む。ＭＣＩは、天然乳カゼインタンパク質を高度に濃縮された未変性形態で分離するろ過プロセスによって生成される。

ミセルカゼイン又はミセルカゼイン保持液若しくは濃縮物などの、カゼインとプラスミンとを含む乳由来のフィードのフラクションを、所望の量のカゼインを得るための量で水中に分散させる。

乳由来のフィードは、ウシ、バッファロー、ヤギ、ヒツジ、ヤク、ブタ、ラクダ、ウマ、雌ヒツジ、雌ウマなどの哺乳動物の乳又はそれらの混合物に基づくものであってよい。本発明の好ましい実施形態では、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液は、牛乳由来の乳フラクションを含む。

カゼイン含有量の高いフラクションを得るために使用できる乳由来のフィードは、たとえば、全乳、ローファット乳、低脂肪乳、半脱脂乳、スキムミルク、バターミルク、還元乳粉末、熱処理乳（例えば、パスチャライズド乳、殺菌乳、コンデンスミルク、エバミルク及びＵＨＴ乳）、無濾過生乳、及び均質化乳であってよい。

本発明の溶液は、カゼインを全固形分の少なくとも８０重量％、好ましくは全固形分の少なくとも９０重量％の量で含む。また、溶液中のカゼインの含有量は、総タンパク質含有量の少なくとも９０重量％、例えば、全タンパク質含有量の少なくとも９３重量％でなければならない。さらに、溶液中の乳清タンパク質の量は、最低レベルでなければならない。溶液は、乳清タンパク質を、全タンパク質含有量の最大１０重量％、好ましくは全タンパク質含有量の最大７重量％の量で含む。

乳自体と比較してカゼイン含有量が高く、乳清タンパク質含有量が低い乳由来の乳フラクションを使用する場合、外因性酵素を添加しないが、乳フラクション中に存在する内因性プラスミンを使用してカゼインを加水分解して、カゼイン加水分解物を調製することが可能であったことは、本発明者らにとっては驚くべきことであった。本発明者らは、内因性プラスミンを使用することによってカゼインを加水分解できるようになった理由の一つは、加水分解に使用した溶液中の乳清タンパク質含有量が低かったからであると考えている。いかなる理論によっても拘束されるものではないが、本発明者らは、低含有量の乳清タンパク質（少量の乳清タンパク質）は、熱処理工程中にプラスミンが変性するのをより良好に保護すると考えている。乳清タンパク質は、存在する場合、プラスミンと相互作用するので、カゼインの加水分解におけるプラスミン効率を低下させる。したがって、カゼインの効率的な加水分解を提供するために、溶液中に少量の乳清タンパク質が存在するのが望ましい。

さらに、いかなる理論によっても拘束されるものではないが、本発明者らは、乳清タンパク質が乳製品のゲル化の原因であり、したがって、例えば、数カ月保存した後のＵＨＴ処理乳のゲル化の原因となると考えている。したがって、乳自体（スキムミルクを含む）と比較して有意な量の乳清タンパク質が除去された、カゼインとプラスミンとを含む溶液を使用して、得られるカゼイン加水分解物は少なくとも１２カ月の保存にわたってゲル化しない。

例えば牛乳では、カゼインと乳清タンパク質との比は、典型的には８０：２０であるが、プラスミンがカゼインを効率よく加水分解し、生成物がゲル化しないようにするためには、乳清タンパク質の含有量を全タンパク質含有量の１０重量％より低くなるように減少させる必要がある。

乳をそのまま使用することでカゼイン加水分解物は得られないので、乳製品は、そのままでは、カゼインとプラスミンとを含む溶液として適さないことが、本発明者らによって見いだされた。高含有量の乳清タンパク質はプラスミンの活性を阻害し、保存中にゲル化を引き起こすので、乳はそのままではカゼイン加水分解物を調製するのに適した出発物質ではない。乳がカゼイン加水分解物の調製に適さないもう一つの理由は、乳がプラスミン阻害物質とプラスミノーゲン活性化因子阻害物質とを含み、このことによってもプラスミンの活性が制限されるからである。ＭＣＩ、ＭＣＣ、ＭＣＲ、ベータ－カゼイン枯渇ＭＣＩ及びベータ－カゼイン枯渇ＭＣＣが典型的にカゼイン加水分解物の調製に使用される本発明では、プラスミン阻害物質及びプラスミノーゲン活性化因子阻害物質は、ＭＣＩ、ＭＣＣ、ＭＣＲ、ベータ－カゼイン枯渇ＭＣＩ及びベータ－カゼイン枯渇ＭＣＣの調製中の血清相において除去されているので、存在しない。

したがって、カゼインと内因性プラスミンとを含む液体組成物は、好ましい実施形態では、プラスミン阻害物質及びプラスミノーゲン活性化因子阻害物質を本質的に含まない。「本質的に含まない」という用語は、本発明の内容では、化合物が無視できる量でのみ存在することを意味する。

本発明者らはまた、カゼイン加水分解物を効率的かつ迅速に得るためには、他のプロセスパラメータを好ましくは最適化しなければならないこと、すなわち、７．２～９．０の範囲内のｐＨを使用し、２５℃～４５℃の加水分解工程中の温度を使用しなければならないことも見出した。

工程ｉ）で提供されるカゼインと内因性プラスミンとを含む溶液の温度は、加水分解プロセスの開始前に、好ましくは１℃～４５℃、さらに好ましくは１℃～２０℃、なお一層好ましくは５℃～１０℃の温度でなければならない。これは、微生物学を制御するため、すなわち、微生物の成長を回避するためである。広範囲の温度（１～４５℃）は、溶液が使用前に保存される時間の依存性によるものである。微生物の不活性化及び内因性プラスミンでの酵素加水分解前の保存時間が短い場合、プロセス開始前の溶液の温度は高くても許容される。しかしながら、微生物の不活性化及び加水分解を開始する前に、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液を一晩保存する場合、保存温度は低くなければならず、好ましくは１０℃未満でなければならない。したがって、本発明の好ましい実施形態では、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液は、本発明の加水分解プロセスでの使用前に１℃～１０℃の温度を有する。

ＰＨ調節
本発明の工程ｉｉ）では、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液をｐＨ調節に供して、工程ｉ）における溶液のｐＨを７．２～９の範囲のｐＨに調節する。好ましくは、溶液のｐＨを７．５～８．７の範囲内のｐＨ、例えば７．５～８．５、なお一層好ましくは７．５～８．２の範囲内のｐＨに調節する。乳のｐＨは、典型的には、６．７～６．８のｐＨを有するが、プラスミンの最適ｐＨは約７．５～８．０である。ｐＨは７．２超でなければならない。ｐＨ６．７～６．８でのプラスミンの活性は、７．２超のｐＨと比較して、ｐＨ６．７～６．８でははるかに低い。７．２より低いｐＨでは内因性プラスミンによってカゼインを加水分解するのに数週間かかるので、加水分解中のｐＨはしたがって７．２より高くなければならない。逆に、加水分解中に７．２～９．０のｐＨを使用して、７２時間未満でカゼイン加水分解物が得られる。

溶液のｐＨは前記の７．２～９のｐＨを有していなければならない。なぜなら、内因性プラスミンの活性はこれらのｐＨ値で最適であるからである。７．２より低いｐＨでは、プラスミン活性は著しく低下する。

第一熱処理：
本発明の一態様では、ｐＨ調節済溶液を第一熱処理工程に供する。第一熱処理を、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液に適用して、溶液中の微生物数を減少させ、さらなる処理の前に、得られた生成物をより長く保存できるようにする。したがって、第一熱処理工程を実施して微生物を不活性化し、したがって微生物を制御する。第一熱処理工程は、加水分解物中の望ましくない微生物を回避するために必要であり、微生物を不活性化する熱処理工程にカゼイン及び内因性プラスミンの溶液を供する場合、内因性プラスミンは不活性化されないことを、本発明者らは驚くべきことに見出した。特に、熱処理が広範囲であっても、プラスミンは不活性されないことが意外にも判明した。広範囲の熱処理とは、本発明の関連では、全ての微生物が不活性化されるか、又は全ての微生物がさらに成長できなくなるような温度及び時間での熱処理を意味する。

本発明の関連で、「微生物」という用語は、例えば、細菌胞子、酵母、カビ及び真菌胞子に関する。

第一熱処理工程の広範性は、最終製品の品質だけでなく、保存可能期間にも影響するであろう。熱処理の広範性を増大させること、すなわち、熱処理の温度を上げることで、製品の腐敗の割合を減少させることができる。しかしながら、これは、最終製品の化学的、物理的、感覚的及び栄養的な変化の増大ともバランスをとらなければならない。

本発明の方法で使用される第一熱処理工程は、８５℃～１８０℃の温度であり得る。第一熱処理工程の期間は温度に依存し、したがって、０．１～３０秒であり得る。温度が８５～１１０℃と低い場合、熱処理工程の時間は１５～３０秒でなければならない。しかしながら、１２０～１８０℃などのさらに高い温度を使用する場合、保持時間は０．１～１０秒でなければならない。

本発明の好ましい実施形態では、第一熱処理工程は、１２０℃以上の温度で０．１～１０秒間である。さらなる実施形態では、第一熱処理工程は、１２０℃～１８０℃の温度で１～１０秒であった。

また、第一熱処理は、一実施形態では、例えば、まず温度を８５℃～１００℃に１～１５秒間上昇させ、その後、温度を１２０℃超に０．１～１０秒間上昇させることによる逐次熱処理であってもよい。

全ての微生物を不活性化するためには１２０℃以上の温度を使用することが好ましい。本発明者らは、第一熱処理の温度が１２０℃より低い場合は、全ての微生物が不活性化されるわけではないことを見出した。

好ましくは、第一熱処理工程は、０．１～１０秒の保持時間で１２５℃を超える温度まで加熱することを含み、さらに好ましくは、第一熱処理工程は、０．１～１０秒の保持時間で１３０℃を超える温度まで加熱することを含む熱処理である。

また、本発明の一実施形態では、第一熱処理工程は、１２０℃～１８０℃の温度で０．１～１０秒間加熱することを含む。例えば、第一熱処理工程は、１２５℃～１７０℃の温度に０．１～１０秒間、さらに好ましくは１２５℃～１６０℃に０．１～１０秒間、なお一層好ましくは１３０℃～１５０℃に０．１～１０秒間加熱することを含む。

第一熱処理工程の保持時間は、１２０℃以上の温度が使用される場合は０．１～１０秒であり得る。しかしながら、本発明者らは、１２０℃を超える温度を使用する場合、保持時間は、微生物を完全に不活性化するためには、好ましくは１秒以上の保持時間でなければならないことを見出した。１２０℃の温度で１～１０秒間の熱処理は、広範囲の熱処理とみなされる。驚くべきことに、広範囲の熱処理（１２０℃を超える温度で１～１０秒間）での第一熱処理工程ではプラスミンは不活性化されないことが判明した。

本発明のさらなる実施形態では、第一熱処理工程は、１～５秒、さらに好ましくは２～４秒の保持時間を有している。

本発明の好ましい実施形態では、第一熱処理工程は、１２０℃～１８０℃の温度で１～１０秒間、例えば、１２５°～１７０℃で１～１０秒間、好ましくは１３０°～１５０℃で１～１０秒間であった。

本発明の特に好ましい実施形態では、第一熱処理工程は、１２５℃～１６０℃の温度に１～５秒加熱し、好ましくは１３０℃～１４５℃の温度を３～５秒間使用することを含む。

本発明の一実施形態では、工程ｉｉ）からのｐＨ調節済溶液の第一熱処理は、超高温（ＵＨＴ）熱処理、高圧殺菌などの使用による。

ＵＨＴ処理は、ＵＨＴ処理に供した液体を高温に加熱し、急速に冷却して、保持時間を短くするプロセスとして当該技術分野で周知である。ＵＨＴ熱処理は、例えば、直接ＵＨＴ、インフュージョンベースのＵＨＴ又は間接ＵＨＴによるものであってよい。「ＵＨＴ」という用語は、本発明の関連では、超高温（例えば１２０°超の温度）にて短い保持時間で熱処理して、室温で保存できる市販の無菌製品を製造することを意味する。このプロセスは、すべての微生物を殺滅することを目的とし、残存する微生物は通常の保存条件下では腐敗を起こしにくい。

直接ＵＨＴ系、すなわち、直接スチームインジェクションＵＨＴでは、約１２０℃～１８０℃の温度を有する高圧蒸気を液体に注入することによって、ｐＨ調節済溶液を瞬時に加熱し、保持管中に２～５秒間保持する。その後、液体を直ちに冷却して、凝縮蒸気を除去する。スチームインジェクションによって高速加熱及び冷却が可能になる。

ＵＨＴ処理はまた、溶液が比較的低濃度の高圧蒸気と共にチャンバー中にノズルを通してポンプ圧送され、大きな表面接触面積を提供するインフュージョンベースであってもよい。スチームインフュージョンは、通常、１５０℃の温度を０．１～０．３秒間使用している。これは、全ての微生物を不活性化するのには充分でない。

あるいは、ＵＨＴ熱処理は、間接熱処理を使用すること、例えば、液体を加熱し冷却するための固体熱交換器を使用することによるものであってよい。

本発明の工程ｉｉｉ）における第一熱処理は、高圧殺菌（ＨＰＰ）を使用することによるものであってもよい。

フラッシュ冷却と組み合わせたスチームインフュージョン又はインジェクションによるＵＨＴを殺菌のために使用してもよい。フラッシュ冷却は、真空により熱を急速に除去する。フラッシュ冷却を伴うＵＨＴは、熱処理の保持時間が非常に短い、すなわち０．１～０．２秒である。本発明の一実施形態において、充分な量の微生物が除去されないため、保持時間が非常に短いＵＨＴは望ましくない。

本発明の特定の実施形態では、第一熱処理工程は、１２０℃～１８０℃の温度で０．１～５秒間の直接スチームインジェクションＵＨＴの使用によるものである。

ＨＰＰは、熱の有無にかかわらず食品を高圧に曝露して、微生物を不活性化する食品加工法である。ＨＰＰはまた、高静水圧加工（ＨＰＰ）や超高圧加工（ＵＨＰ）としても知られる。ＨＰＰは加熱又は非加熱加工であってよい。例えば、ＨＰＰは、水によって伝達される５０～１０００ＭＰａの圧力を溶液にかける低温殺菌技術であってよい。熱処理と比較しての高圧殺菌の利点は、微生物を不活性化しつつ、タンパク質の変性や機能性の変化が回避されることである。さらに、高圧を使用して、凍結、解凍、及び抽出などのいくつかの加工操作を強化して、新しい加工オプションを提供することができる。

本発明の方法における第一熱処理は、カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液中に存在する微生物の少なくとも９０％を不活性化するが、プラスミンの活性を維持しなければならない。好ましくは、微生物の少なくとも９５％が不活性化されなければならず、なお一層好ましくは微生物の少なくとも９９が不活性化されなければならない。

本発明の一実施形態において、カゼイン及び内因性プラスミンのｐＨ調節済及び加熱処理済溶液を１０℃以下の温度で加水分解工程前に少なくとも１０時間保存する。低温貯蔵によりプラスミン活性が増大する。さらに、ベータ－カゼインは低温でカゼインミセルから解離し、高温で会合してカゼインミセルになる。したがって、カゼイン及び内因性プラスミンの溶液を低温で保存する場合、カゼインミセルから乳清へより多くのベータ－カゼインが放出される。

好ましくは、第一熱処理工程前の低温貯蔵は８℃以下、例えば５℃以下である。低温貯蔵は、１°～１０℃、例えば２℃～８℃であってよい。低温貯蔵は、好ましくは少なくとも１０時間、好ましくは少なくとも２０時間、より好ましくは少なくとも２４時間である。また、低温貯蔵は１０時間～７２時間、例えば２０時間～６０時間、最も好ましくは１～２日間である。しかしながら、低温貯蔵の制限時間は、発明の限定因子とみなされるべきではなく、１～１０℃の温度で１０時間を超える低温貯蔵の結果、プラスミンの効果が増大するであろう。

加水分解／第二熱処理：
本発明の一態様では、カゼイン加水分解物は、カゼインと内因性プラスミンとを含むｐＨ調節済溶液の加水分解によって得られ、前記溶液は全固形分の少なくとも８０重量％のカゼインを含み、前記溶液は乳清タンパク質を全タンパク質含有量の最大１０重量％の量で含む。加水分解は、工程ｉｉｉ）における溶液の２５℃～４５℃の温度で少なくとも６時間の第二熱処理工程によって得られる。これにより、内因性プラスミンはカゼインを加水分解し、カゼイン加水分解物が得られる。

２５℃より低い温度では、内因性プラスミンの活性は著しく減少し、加水分解の速度が非常に遅くなるので、２５℃より高い温度であることが重要である。したがって、加水分解工程中の温度は少なくとも２５℃でなければならない。また、内因性プラスミンの活性を得るために、加水分解中の温度は４５℃以下であることが望まれる。本発明の一実施形態において、工程ｉｖ）における熱処理は、３０℃～４２℃、例えば３５℃～４０℃の温度である。

加水分解の時間は制限とみなされるべきではなく、原則として、加水分解は、内因性プラスミンがカゼインを加水分解し、したがってカゼイン加水分解物を得るために充分な時間実施することができる。加水分解の程度は、加水分解の時間に依存し、したがって、加水分解時間が短いほど加水分解の程度が低くなるが、加水分解時間が長いほど加水分解の程度が高くなる。加水分解の時間は、好ましくは少なくとも６時間、たとえば少なくとも８時間、さらに好ましくは少なくとも１０時間である。しばらくした後のプラスミンは自己分解（自己加水分解）するので、原則として、加水分解時間の上限は重要ではない。しかしながら、加水分解の時間の一例は、６時間～１０日間、例えば６時間～５日間、さらに好ましくは６時間～７２時間である。少なくとも６時間の加水分解時間は、実質的な量の加水分解カゼインを得るために充分な加水分解を提供することであるが、２４ｈ及び４８ｈも提案された用途に許容できるレベルの加水分解を提供する。プラスミンは自己分解することが知られており、理論によって拘束されることなく、この理由並びに容量の限界及び長い加工時間が加工ラインに与える保存で発生するコストのために、長いインキュベーション時間は望ましくない可能性があることが予想される。

最も好ましくは、加水分解は、３０℃～４５℃の温度で６時間～１０日間、さらに好ましくは３０℃～４２℃で６時間～１０日間、なお一層好ましくは３５℃～４２℃で６時間～５日間実施される。

加水分解は、好ましい実施形態では、３５℃～４２℃で６時間～７２時間行うこともできる。

加水分解の結果、内因性プラスミンがベータ－及びアルファＳ１－カゼインをペプチドに切断し、これらの二つのタンパク質からペプチドが蓄積することになる。内因性プラスミンでの加水分解の間、カッパカゼインは本質的にインタクトで残っていることが観察された。

発明の第一の態様によるカゼイン加水分解物を調製する本発明は、カゼインの加水分解を最適化することに重点を置いた最適化されたプロセスである。本発明の最も好ましい実施形態では、加水分解前にＭＣＩを５℃で２４時間保存し、ｐＨ７．５～８．０、３８℃の温度でＭＣＩの８％ｗ／ｗ溶液を加水分解すると、加水分解の４８時間後に、約８５％ベータ－カゼインが加水分解された、すなわち、残存するインタクトなベータ－カゼインが１５％だけである（ＨＰＬＣピーク面積に基づく）カゼイン加水分解物が得られた。さらに、前記の最適化された方法の結果、４８時間加水分解した後にａ－Ｓ１カゼインの５７％が加水分解された。逆に、ＵＨＴ処理乳を保存すると、例えば加水分解に数カ月かかり、保存中にゲル化する。本発明のカゼイン加水分解物のゲル化は望ましくない。本発明のカゼイン加水分解物を６か月間保存すると、製品は外観が乳白色から半透明に変化する。しかしながら、製品は保存中ゲル化したり沈殿したりすることはない。これは、例えば、数カ月の保存期間にわたってゲル化が起こるＵＨＴ処理乳とは異なる。

本発明の一実施形態において、所望の加水分解度のカゼイン加水分解物が得られる場合、内因性プラスミンの活性が不活性化されるか、又は活性が著しく減少する。プラスミンを不活性化又は活性を低下させると、加水分解が停止するか、又は少なくとも遅くなる。内因性プラスミンは異なる方法で不活性化又は減少させることができ、本発明は、内因性プラスミンを不活性化させ、したがって加水分解を停止させるいかなる方法にも限定されるべきではない。プラスミン不活性化／活性減少の工程は、好ましくは、プラスミン、プラスミン様酵素及びプロ酵素プラスミノーゲンの両方の活性を制御しなければならない。

プラスミンの不活性化／活性減少工程は、好ましくは、処理液体のプラスミン、プラスミン様酵素及びプラスミノーゲンの合計活性を、未処理液体の活性に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％制御しなければならない。

しかしながら、例として、内因性プラスミンは、以下のプロセス工程の一つ以上によって制御することができる：
ｉ）ｐＨを６．０未満に調節する
ｉｉ）温度を１０℃以下に低下させる
ｉｉｉ）得られたカゼイン加水分解物を乾燥させる
ｉｖ）変性乳清タンパク質を添加する
ｖ）プラスミン阻害物質及び／又はプラスミン活性阻害物質を添加する
ｖｉ）システインを添加する
ｖｉｉ）温度を６５℃以上に上昇させる
プラスミンは６．８以下のｐＨ値で活性が減少する。
ｐＨを６．８未満に調節する場合、加水分解を有意に遅くすることができる。

さらに、プラスミンの活性は、２０℃より低い温度及び５５℃より高い温度で制御することができる。したがって、溶液の温度を例えば１０℃以下又は６５℃以上に調節する場合、プラスミンの活性は有意に減少し、加水分解プロセスは有意ではない。

また、プラスミン活性の制御は、得られたカゼイン加水分解物を乾燥工程に供することによっても行うことができる。乾燥工程はプラスミンを不活性化し、さらなる加水分解を防止する。乾燥は、例えば、噴霧乾燥又は凍結乾燥によるものであり得るが、本発明は任意の乾燥工程に限定されるべきではない。

さらに、内因性プラスミンの活性の制御は、変性乳清タンパク質をカゼイン加水分解物に添加することによるものであり得る。乳清タンパク質はプラスミンの活性部位に近いプラスミンと結合し、それによってプラスミンの活性を制限する。さらに、内因性プラスミンの活性の制御は、プラスミン阻害物質（ＰＩ）及び／又はプラスミン活性阻害物質（ＰＡＩ）を添加することによるものであり得る。

内因性プラスミンの不活性化は、システインを添加することによるものでもあり得る。システインは、乳清タンパク質と同様に、活性部位に近いプラスミンと結合する。システイン中の遊離チオールは、チオールジスルフィド交換によってプラスミンと結合し、プラスミンが不活性になる。

カゼインの加水分解は、例えば、工程ｉｉｉ）のｐＨ調節済微生物不活性化溶液を滅菌ボトル中に入れることによって実施できる。充填されたボトルを次いで、２５℃～４５℃の温度で、カゼインを加水分解してカゼイン加水分解物を得るために充分な時間、例えば６時間～１０日間、熱処理に供することができる。

しかしながら、加水分解工程は、微生物を不活性化するための第一熱処理ユニットの下流の滅菌保持タンクにｐＨ調節済微生物不活性化溶液を移すことによっても可能である。保持規模は、より大規模な生産で好ましく使用されるのに対して、ボトル中での加水分解は小規模生産で使用される。

本発明による方法によって得られたカゼイン加水分解物の形態は、限定とみなすべきではなく、カゼイン加水分解物は、任意の形態、例えば液体形態であり得るか、又は濃縮物、粉末、若しくは顆粒であり得る。しかしながら、一実施形態では、本発明の工程ｉｖ）で得られたカゼイン加水分解物を乾燥して粉末にする。乾燥プロセスは、例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥であってよい。

均質化：
本発明の一実施形態では、（工程ｉｉの）カゼインと内因性プラスミンとを含むｐＨ調節済溶液を、均質化工程に供した後、微生物の不活性化のための第一熱処理工程に供する。

均質化は、乳中の脂肪球のサイズの減少と数及び総表面積の増加とをもたらす機械的処理である。これによって、乳が表面でクリームを形成する傾向が減少し、容器と接触する際の安定性を増強し、消費者にとって口当たりを良くする。さらに、均質化により、第一熱処理工程前の溶液中のカゼインミセルの均一な分布が確実になる。

カゼイン加水分解物：
本発明の一態様は、本発明による方法によって得ることができる天然カゼイン加水分解物に関する。

本発明による方法によって作製される天然カゼイン加水分解物は、任意の添加された外因性酵素を使用することなく調製されるという利点を有し、したがって完全に天然である。これは、規制上の問題を回避できるので利点である。さらに、添加された外因性プラスミンを使用するのと比較して、内因性プラスミンの使用によって得られるカゼイン加水分解物中のペプチドの蓄積は、より人乳のものと似ている。本発明のカゼイン加水分解物中に存在するペプチドのアミノ酸配列は、人乳中のペプチドにおけるアミノ酸配列と類似していないが、ペプチドの蓄積は類似している。カゼイン加水分解物のペプチドは、酵素を添加した加水分解によって得られるカゼイン加水分解物よりも高い人乳のペプチドに対して最大５０％のアミノ酸配列類似性を有する。これによって、カゼインペプチドが外因性ペプチドの使用によって得られる場合よりも人乳を反映する調製粉乳製品中に配合できるカゼインペプチド源が可能になる。さらに、ベータカゼインの場合、プラスミンによって生成する主なペプチドの一部であるガンマカゼインは、非アレルギー性であると考えられ、このことは、乳タンパク質耐性に関して問題がある乳児にとって特に有益である。

したがって、一実施形態では、本発明の天然カゼイン加水分解物は、添加された外因性酵素を含まない。

本発明のカゼイン加水分解物は、総固形分の少なくとも８０重量％のカゼインを含む。さらに、本発明のカゼイン加水分解物は、乳清タンパク質を、全タンパク質含有量の最大１０重量％の量で含む。本願のカゼイン加水分解物の調製方法に関する項で開示するカゼイン加水分解物のさらなる詳細は、カゼイン加水分解物にも適用される。

本発明のカゼイン加水分解物は天然の産物である。

本発明の関連で、「天然」という用語は、乳又は乳フラクション又は水中に希釈された乳フラクション中に天然に存在しない成分を含まない生成物と理解すべきである。例えば、プラスミンなどの外因性酵素の添加は、「天然に」という用語には該当しない。

本発明のカゼイン加水分解物は、ペプチドを含み、このペプチドの少なくとも５０％は１０００～３０００Ｄａの分子量を有し、このペプチドの１％未満は５０００Ｄａ以上の分子量を有する。さらに、このペプチドの１０％以下は、１０００Ｄａ未満の分子量を有する。

本発明のカゼイン加水分解物中に存在するペプチドは、市販の加水分解物中では見られない免疫刺激などの機能的効果を示す。

本発明のカゼイン加水分解物を含む栄養組成物：
さらなる態様では、本発明は、栄養組成物における本発明によるカゼイン加水分解物の使用に関する。栄養組成物は、例えば、小児用栄養製品、例えば、調製粉乳（満期産児及び未熟児の両方）、フォローオンフォーミュラ又はフォローアップフォーミュラであってよい。栄養組成物は、意図された消費者、例えば、０～６か月の乳児若しくは６～１２カ月の乳児にとって栄養的に完全であり得るか、又は栄養補助食品であり得る。栄養組成物は、液体製品、濃縮液体製品、ペースト又は粉末の形態であってよい。

本発明の態様の一つの文脈で記載される実施形態及び特徴は、本発明の他の態様にも適用されることに留意されたい。

次の本発明を以下の非限定的な実施例でさらに詳細に説明する。

実施例１ 試験方法
実施例１．１ サンプル中のカゼインを分析するためのＨＰＬＣ－Ｃ１８
装置及び材料
クロマトグラフィーシステム：
ＵＶ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム。

カラム：
第一カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＳＢ－Ｃ１８、２．１×５ｍｍ、２．７ミクロン（Ｐ．Ｎ．８２１７２５～９１２）
第二カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＳＢ－Ｃ１８、２．１×１５０ｍｍ、２．７ミクロン（Ｐ．Ｎ．６８３７７５～９０２）
サンプルをまず第一カラムにかけて不純物を除去し、次にペプチド分離のための第二カラムにかける。

溶液及び調製物：
ＡＣＮ２５％：２５０ｍｌのＡＣＮを７５０ｍｌのＭＱを混合する
還元緩衝液：
・６Ｍ尿素
・０．１Ｍ クエン酸ナトリウム
・０．０２Ｍ ＤＴＴ
溶離液Ａ（ＭＱ水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））：
・１ｍｌのＴＦＡを、１０００ｍｌの容量フラスコ中の９９０ｍｌのＭＱ水に（非常に揮発性であるので表面下に）添加し、水でいっぱいにする。
・混合し、青色のキャップのボトルに移す
・２０分間脱気する
溶離液Ｂ（ＡＣＮ中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））：
・１ｍｌのＴＦＡを、１０００ｍｌの容量フラスコ中の９９０ｍｌのＡＣＮに（非常に揮発性であるので表面下に）添加し、ＣＡＮでいっぱいにする
・混合し、青色のキャップのボトルに移す
・２０分間脱気する。

溶離液Ａ及び溶離液Ｂは、表１に記載するような以下の設定でクロマトグラフィーにおいて使用した：

流量は０．３５ｍｌ／分（開始条件で予想される圧力：４１００ｐｓｉ）であり、カラムの温度は４２℃であった。オートサンプラー温度は１２℃であった。注入体積はすべてのサンプルについて５μｌであった。ＵＶ検出は２１４ｎｍであった。各サンプルの注入後、ＨＰＬＣシステムを２２分間（時間１９．５～４１．５）洗浄した。

実施例１．２ プラスミン活性を検出するためのアッセイ
材料：
０．４Ｍクエン酸三ナトリウム緩衝液、ＮａＯＨでｐＨ８．９
アッセイ緩衝液１：
０．１Ｍ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
８ｍＭ ＥＡＣＡ（ε－アミノカプロン酸）
０．４Ｍ ＮａＣｌ
ＮａＯＨでｐＨ８
基質Ｓ－２２５１：
アッセイ緩衝液１中４ｍＭ

商業的プラスミン標準：
安定化するための、４ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含むアッセイ緩衝液中参照番号０．５ＵのＲｏｃｈｅ製のウシプラスミンのストック溶液。
１５μＵ／ｍｌ～１ｍＵ／ｍｌの範囲で直線的

手順：
１ｍｌのサンプル溶液を２５０μＬの０．４Ｍクエン酸三ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．９と混合し、１５分間振盪してカゼインミセルを解離させた。

クエン酸処理したサンプルをアッセイ緩衝液１で１：１に希釈し、１５分間振盪して、プラスミン及びプラスミノーゲンをカゼインから解離させた。

吸光度を４０５ｎｍ及び４９０ｎｍで３７℃にて、プレートリーダーを用い、５分間隔で１２０分間読み取った。

濁りについて補正するために、４９０ｎｍのバックグラウンド吸光度値を４０５ｎｍの吸光度値から差し引いた。

時間の関数としてΔＡ_{４０５ｎｍ－４９０ｎｍ}として示される吸光度の増加を、標準曲線を使用してプラスミン単位に変換した。

実施例１．３：乳清タンパク質加水分解物におけるペプチド分布を決定する方法
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、カゼイン加水分解物におけるペプチドの分子量分布を分析した。ＳＥＣを使用して、ポリマータイプの分子をサイズによって分離する。異なるサイズの成分の混合物、ここではペプチドは、ＳＥＣによって分離できる。溶出時間は分子のサイズに依存する。分子が小さいほど溶出時間は長くなる。

サンプルを移動相中０．５％ｗ／ｖの濃度になるように溶解させた。注入前に、サンプルを０．４５μｍフィルターでろ過した。クロマトグラフィー分離を、直列に結合させた三つのＴＳＫ Ｇ２０００ＳＷＸＬ（１２５Ａ、５μｍ、７．５ｍｍ×３００ｍｍ）カラムで実施した。０．０３７５Ｍリン酸塩緩衝液、０．３７５Ｍ塩化アンモニウム、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及び２５％アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）の緩衝液を毎分０．７ｍＬの流量で移動相として使用した。ペプチドの検出は、２１４ｎｍで測定するＵＶ検出器を用いて実施した。

保持時間に基づいて、ペプチドの分布をサイズにしたがって分割し、相対量は分子量にしたがって与えられる。

実施例２ 精密ろ過されたスキムミルク（ＭＣＩ）の保持液におけるプラスミン活性
ミセルカゼイン分離物は、低温殺菌されたスキムミルクを精密ろ過してミセルカゼイン分離物を生成することによって調製した。

ミセルカゼイン分離物は、５２℃に予熱した、１２００ｋｇの低温殺菌（７３℃／１５秒）された有機濃縮スキムミルクを提供することによって、精密ろ過されたスキムミルクの保持液として調製した。スキムミルクのｐＨは６．７である。スキムミルクは、６．４％（ｗ／ｗ）タンパク質、４．７％（ｗ／ｗ）ラクトース及び０．１％（ｗ／ｗ）脂肪並びに１２．５％（ｗ／ｗ）全固形分を含んでいた。

予熱したスキムミルクを、バッチモードで、８００ｋＤＡの孔径を有するＳｙｎｄｅｒ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＵＳＡ）製のポリマーＦＲ膜上、５０℃にて０．４５ｂａｒの膜間圧力差（ＴＭＰ）で精密ろ過（ＭＦ）に供する。７２０リットルのろ過生成物を集めた後、逆浸透（ＲＯ）ろ過した水道水を保持液にＭＦろ過生成物の流量と同じ流量で添加することによって透析ろ過を開始する。３，０００リットルのＲＯろ過された水道水を添加すると、ろ過は終了する。４８０ｋｇのＭＦ保持液及び３，７２０ｋｇのＭＦろ過生成物を集める。スキムミルクからの９８％のラクトース及び７９％の乳清タンパク質がＭＦろ過生成物中に集められ、スキムミルクからの９７％のミセルカゼインはＭＦ保持液中に集められる。

熱処理されたＭＦ保持液（ＭＣＩ）におけるプラスミンの残存を、実施例１．２に記載の方法にしたがって分析した。サンプルは、１０％ＫＯＨでｐＨ７．５に調節した８％ｗ／ｗＭＣＩ溶液を用いて作製した。サンプルを１３０℃、１３５℃及び１４０℃の温度で３～４秒間熱処理し、プラスミン活性を分析した。プラスミン活性を下記表２に示す。

実施例３：熱処理後のＭＣＩのプラスミン由来加水分解の程度に対するインキュベーション温度の効果
サンプルは、１０％ＫＯＨでｐＨ７．５に調節した８％ｗ／ｗＭＣＩ溶液を用いて作製した。サンプルを１３０℃、１３５℃及び１４０℃の温度で３～４秒間熱処理し、無菌充填により異なるボトルに入れた。ボトルをそれぞれ２０℃及び３８℃で２４時間インキュベートした。各温度（１３０℃、１３５℃及び１４０℃）の４バッチのＭＣＩを作製した。すなわち、４つのボトルをそれぞれ１３０℃、１３５℃及び１４０℃で熱処理した。次に、４つのボトルのうち２つを３８℃でインキュベートし、他の２つのボトルは２０℃でインキュベートした。

０、３、６、２４時間後にサンプルをインキュベータから取り出し、ＨＰＬＣ分析を実施するまで直ちに凍結した（実施例１．１にしたがう）。還元緩衝液中で８倍体積に希釈することによってサンプルを調製し、室温で１時間放置した。希釈されたサンプルを０．２２μｍ酢酸セルロースフィルター（ＶＷＲ＃５１４～００６０）でろ過した後、ＨＰＬＣにかけた。

インキュベーション前のサンプルにおけるプラスミン活性は、実施例１．２に記載の方法を用いて測定した。結果を図１及び２に示す。

図１は、ＲＰ－ＨＰＬＣで１２．００～１４．００分に溶出するプラスミン由来のペプチドを示す。図２は、ＲＰ－ＨＰＬＣで１７．００～１８．００分に溶出するプラスミン由来のペプチドを示す。

図１及び２から、３８℃の温度でのインキュベーションにより、２０℃でのインキュベーションと比較して、インタクトなα－Ｓ１－カゼイン及びβ－カゼインの損失の増加とペプチドの蓄積の増加をもたらすことがわかり、両ペプチドはＨＰＬＣ－ＲＰで１３分及び１７分に観察される。

インタクトなα－Ｓ１－カゼイン及びβ－カゼインの損失は、２０℃よりも３８℃を使用する場合に約２０～２５％多く、ペプチドの増加は約４倍である。したがって、加水分解は、２０℃よりも３８℃でより効率的であり、これは、２０℃よりも３８の方が、プラスミン活性が改善されているためであると考えられる。

また、図１及び２は、１３０℃、１３５℃及び１４０℃の温度に３～４秒間殺菌後にプラスミン活性を維持することが可能であることを示す。

実施例４：プラスミン活性及びカゼインの加水分解に対するＭＣＩの熱処理前の低温貯蔵の影響
この実施例は、プラスミン活性及び加水分解の程度に対する低温貯蔵の影響を示す。

サンプルは、１０％ＮａＯＨでｐＨ７．５に調節した８％（ｗ／ｗ）ＭＣＩ溶液を用いて作製した。

ＭＣＩの熱処理（第一加熱工程）を、２４時間の時間差を設けて、４～５℃での保存条件下で、異なる２日で実施した。これにより、プラスミン活性及び加水分解に対する影響が５℃で２４時間保存した後に示される。異なる２日からのサンプルを以下では第１日及び第２日と称する。毎日、ＭＣＩを１３０℃、１３５℃及び１４０℃の温度で３～４秒間熱処理に供し、１００ｍｌボトル中に無菌充填した。

熱処理の直後に、ボトル詰めされたサンプルを３７～４０℃で２４時間インキュベートし、０、３、６及び２４時間のインキュベーション時間でサンプルを採取し、ＨＰＬＣ－ＲＰによる分析まで直ちに凍結した（ＨＰＬＣ用サンプルは実施例３においてと同様に調製した）。プラスミン活性は、実施例１．２の方法による熱処理の５日後に測定し、サンプルは分析まで４℃で保存する。

インタクトなα－Ｓ１－カゼインβ－カゼインの損失は、各ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムによって得られたこれらのタンパク質のピーク面積を比較することによって算出された。ピーク面積は、ｔ＝０、つまりインキュベーション直前での所与のタンパク質のピーク面積に対して正規化した。

異なるサンプルのインタクトなβ－カゼインの損失を図３に示す。

異なるサンプルのインタクトなα－Ｓ１－カゼインの損失を図４に示す。

異なるサンプルにおけるペプチドの蓄積を同じ方法で定量し、乳中に天然に存在し、精密ろ過後にＭＣＩ中に保持されるプラスミン由来のペプチドの初期レベルに対して正規化した。

したがって、ＨＰＬＣクロマトグラフの１２～１４分、及び１７～１８分の領域におけるペプチドの蓄積をそれぞれ図５及び６に示す。

各々の図から、ＭＣＩにおけるプラスミン活性、ひいてはインタクトなカゼインタンパク質の加水分解の程度は、熱処理前の４～５℃での２４時間の保存によって影響を受け、プラスミンは、それらが１３０、１３５又は１４０℃で３～４秒間熱処理したか否かによらず全てのサンプルにおいて保持されることは明らかである。

２４時間のインキュベーションにわたってカゼインペプチドの有意な蓄積が起こることは明らかである。特に、熱処理前に５℃で２４時間保存されたサンプルについて、ｔ＝０と比較して１．８～４のファクター、熱処理に関係なく約６４％のインタクトなβ－カゼインの付随する損失、及び１３０℃で３～４秒間の熱処理での３４％～５４％のα－Ｓ１－カゼインの損失の結果、インタクトなα－Ｓ１－カゼインの損失がより大きくなった。第１日に熱処理したサンプルについて、３４％～５４％のインタクトなβ－カゼインの損失が見られた一方で、１５～２５％のインタクトなα－Ｓ１－カゼインの損失が見られた。

プラスミン活性を第１日及び第２日から熱処理されたＭＣＩの実施例２．１にしたがって測定した。図７を参照。第１日サンプルと第２日サンプルとの間のカゼインの加水分解の程度の差は、図７に示すように、全ての条件で熱処理前に２４時間低温貯蔵した後のプラスミン活性の増加によって説明することができる。この２４時間中、プラスミノーゲンはプラスミンに変換し、したがってプラスミン活性を増加させる。

要約すると、インタクトなα－Ｓ１－カゼイン及びβ－カゼインの実質的な加水分解並びに内因性プラスミンの作用の結果としてのカゼインペプチドの蓄積を可能にすることは明らかである。これは、２４時間のインキュベーションにわたりＲＰ－ＨＰＬＣによるこれら２つのタンパク質の損失ピーク面積（＞５０％）によって証明される。重ね合わせた（図８）代表的ＨＰＬＣトレースから、カッパカゼイン（保持時間８及び９．２５分）は２４時間のインキュベーション期間の後もインタクトなままであることも明らかであり、このことは、アルファ及びベータカゼインに対するプラスミンの選択性を記載する文献とよく一致する。

実施例５：方法論
微生物が熱処理（第一熱処理工程）プロセス後に不活性化されたことを示すために実施例をおこなった。

サンプルは、１０％ＫＯＨでｐＨ７．５に調節した８％ｗ／ｗＭＣＩ溶液を用いて作製した。サンプルは、１３０℃、１３５℃及び１４０℃の温度に３～４秒間のＵＨＴ熱処理を使用することによって第一熱処理工程に供し、無菌的に異なるボトルに入れた。ボトルは３７℃で１０日間保存した後、微生物分析に回した。すべての温度をボトルごとに分析した。結果を以下の表３に示す。

表３中の次の用語は以下を意味する：
Ｂ．Ｃ．ＳＰ：セレウス菌胞子
ＣＬＯ．ＳＰ：クロストリジウム胞子
ＴＨＦ：好熱性細菌
ＴＰＣ：総プレート数
ＣＬＯ．ＳＰ－１：１０倍に希釈したサンプル
ＣＬＯ．ＳＰ：サンプルを希釈しない
ＴＨＦ－１：サンプルを１０倍に希釈する
ＴＰＣ－１：サンプルを１０倍に希釈する

表３に示すように、３７℃で１０日間保存したすべてのサンプルは、微生物含有量が１０ｃｆｕ／ｍＬ未満となった。このことにより、１３０℃～１４０℃の温度での第一熱処理は無菌であったことが確認される。この実施例における加水分解は２４時間しか進行しないため、結果は、適切な滅菌保持タンク中でのＵＨＴ処理後に安全な加水分解を実行できることを強固に示している。

実施例６ カゼイン加水分解物のＬＣＭＳ／ＭＳ及びプロテオミック特性決定
本発明の方法にしたがって加水分解したＭＣＩのサンプルの高分解能ＬＣＭＳ／ＭＳを実施して、加水分解物においてみられるペプチドの大部分の蓄積をもたらすのはアルファ及びベータカゼインに対するプラスミンの作用であることを確認した。さらに、ペプチドを、オープンアクセスデータベースを使用して既知生物活性ペプチドとマッチングさせた。

適用範囲を広くし、できるだけ多くのプラスミン由来のペプチドを同定するために、二つの方法（超遠心分離法及び１０ＫＤａＭＷＣＯカラム法）を使用して、加水分解したＭＣＩサンプルからペプチドを抽出した。この二つの方法を簡単に説明すると以下のようになる：

本発明にしたがって加水分解したＭＣＩサンプル（１００ｍｌ）のボトル１本を－８０℃から取り出し、室温で解凍した。超遠心分離法では、約２５ｍｌを取り出してｐＨを４．６に調節し、１１０００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離した。次いで、１０ｍｌの上清を５０ｍｌチューブに取り、－２０℃で凍結（１×遠心分離）し、さらに１０ｍｌの上清を１３２００ｘｇ、５℃で１０分間遠心分離する（２×遠心分離）。主にカゼインペプチドを含む二回目の遠心分離からの上清を新しいチューブに移した。二回目の遠心分離サンプルからの上清合計１ｍＬを３０μＬの１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）で１時間２５℃にて還元し、７０μＬの１００ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で５０分間２５℃、暗所にてアルキル化した。

１０ＫＤａＭＷＣＯカラム法では、所定のタンパク質濃度に基づいて、本発明にしたがって加水分解した１ｍＬのＭＣＩサンプルを６Ｍ尿素緩衝液で１０ｍｇ・ｍＬ^－１の最終濃度に希釈し、よく混合し、タンパク質を緩衝液中に溶解させた。次いで、１００μＬのサンプル溶液（１ｍｇのタンパク質）を３０μＬの１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）で１時間２５℃にて還元し、７０μＬの１００ｍＭヨードアセトアミド中、５０分間２５℃、暗所にてアルキル化し、最終体積１ｍＬ（１ｍｇ／ｍＬ）になるまで８００の５０ｍＭ ＴＥＡＢ緩衝液をサンプルに添加した。調製したサンプル溶液を１４０００ｇで２０分間遠心分離することにより１０ＫＤａＭＷカットオフカラムフィルター（Ｍｅｒｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、独国）でろ過し、１４０００ＲＰＭで２０分間遠心分離することによって０．５ｍＬの５０ｍＭ ＴＥＡＢ緩衝液でさらに洗浄し、ろ過したペプチドをろ過したチューブ中に集め、内因性ペプチドのさらなる分析に使用した。

ペプチドサンプルを脱塩し、親水性親油性バランス固相抽出（ＯＡＳＩＳ ＨＬＢ－ＳＰＥ）（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）カートリッジカラムで精製した。
簡単に説明すると、カラムを１ｍＬの１００％アセトニトリル（ＡＣＮ）で２回、１ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で２回洗浄し、次いでペプチドサンプルをカラムにロードし、１ｍＬの０．１％ＴＦＡで２回洗浄し、次いでペプチドを０．１％ＴＦＡ、２９．９％ＭＱ水及び７０％ＡＣＮを含む１ｍＬの溶出緩衝液で溶出させた。溶出したペプチドを真空遠心分離によって凍結乾燥し、その後、さらなるＬＣＭＳ分析のために１０００ｕＬの０．１％ギ酸（ＦＡ）緩衝液中に再懸濁させた。

ペプチドサンプルをタンパク質及びペプチド同定のためにＬＣ－ＭＳによって分析した。各サンプルを３回の技術的再現で分析し、分析ごとに５ｕｌのペプチドサンプルを注入した。ペプチドを自動的に注入し、Ｄｉｏｎｅｘ３０００ ＵＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施される逆相クロマトグラフィーによりＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（１３０Ａ、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）にロードした。移動相は緩衝液Ｂ（９９．９％ＡＣＮ／０．１％ギ酸）及び緩衝液Ａ（０．１％ギ酸）であった。８００ｂａｒの最大圧力でインテリジェントフローコントロールを使用してサンプルをロードした。以下のプロフィールで３００ｕＬ／分にてＬＣ勾配を実施した：０～３０％緩衝液Ｂで１８分間、３０～５０％緩衝液Ｂで５分間、５０～１００％緩衝液Ｂで２分及び３分間１００％Ｂ、その後、再平衡化のために緩衝液Ａに戻す。ＵＰＬＣを、陽イオンモードで操作し、データ依存取得を使用するＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にオンライン接続した。Ｏｒｂｉｔｒａｐは１ｅ６イオンの自動利得制御（ＡＧＣ）ターゲット値及び１００ミリ秒の最大充填時間で完全ＭＳスキャンを取得した。各ＭＳスキャンは、４００～３０００の範囲のＯｒｂｉｔｒａｐにおいてｍ／ｚ ２００にて高分解能７０，０００半値全幅（ＦＷＨＭ）で取得された。Ｏｒｂｉｔｒａｐでの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）ＭＳ２フラグメンテーション（正常化衝突エネルギー：２８Ｖ）のために、多いペプチドの上から２０位をＭＳから選択した。フラグメンテーションは、２ｅ４のターゲット及び１５０ミリ秒の最大注入時間に対し、１．５ｍ／ｚの分離ウィンドウ及び選択された前駆体の周囲で１０ｐｐｍの許容範囲で１５秒の動的排除期間を使用して、高分解能（１７５００ＦＷＨＭ）で実施した。＋２、＋３、＋４及び＋５の電荷状態を有する前駆体のみをＭＳ２のためにサンプリングした。生データはＸｃａｌｉｂｕｒ ｖ２．０．７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で表示された。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ生データは、以下の基準で組込みＳｅｑｕｅｓｔ ＨＴサーバーを用いてペプチド及びタンパク質同定のためにプロテオーム Ｄｉｓｃｏｖｅｒ ２．１で処理した：データベース、ＵｎｉＰｒｏｔウシ非冗長プロテオームデータベース（１５～１１～２０１９バージョン）；酵素、特異的酵素は選択されなかった；最大喪失切断、２；可変修飾には酸化（Ｍｅｔ）、システインのカルバミドメチル、アセチル（タンパク質Ｎ末端及びリジン（Ｋ））、Ａｓｎ及びＧｌｎの脱アミド化、リン酸化（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＴｙｒ）が含まれていた。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ結果は、１０ｐｐｍの前駆体質量許容差と０．０５ＤａのＭＳ／ＭＳ質量許容差で検索した。結果は、統合Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒアルゴリズムａｌｇｏｒｉｔｈｍを使用してＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒでフィルターをかけ、０．０１未満の偽発見率（ＦＤＲ）を確実にした。Ｓｅｑｕｅｓｔ ＨＴについてのデフォルトスコア対電荷状態に合格したペプチドの実が許容された。

各サンプルから同定されたペプチドをエクセルシートにエクスポートし、さらに手作業で処理し、分析した。処理したデータをさらに可視化して、タンパク質配列局在化及び量を、オンラインソフトウェアＰｅｐｔｉｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗａｒｅ．ｕｃｄ．ｉｅ／ｐｅｐｔｉｇｒａｍ／）を用いて表示した。

同定されたペプチドはまた、ウシ及び人乳生物活性ペプチドデータベース（ＢＩＯＰＥＰ生物活性ペプチドデータベース）に対して検索して、潜在的な内因性生物活性ペプチドを探索し、発見した。

ＬＣＭＳ／ＭＳワークフロー、ペプチドミクス解析及びデータベース検索の結果を図９Ａ、９Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ及び１１Ｂに示す。

図９Ａ及び９Ｂは、α－Ｓ１－カゼインの同定されたペプチドを示し、図中、点線はプラスミン切断部位を表す。

図１０Ａ及び１０Ｂは、α－Ｓ２－カゼインの同定されたペプチドを示し、ここでも点線はプラスミン切断部位を表す。

図１１Ａ及び１１Ｂは、β－カゼインの同定されたペプチドを示し、図中、点線はプラスミン切断部位を表す。

図９Ａ、９Ｂ、１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ及び１１Ｂから、圧倒的多数のペプチドがβ－カゼイン、α－Ｓ１－カゼイン及びα－Ｓ２－カゼイン上のプラスミン又はプラスミン関連酵素によって切断されることは明らかである。さらに、生物活性が実証された３３のペプチドを、前記データベースに対するマッチングによって同定した。これらの生理活性ペプチドは、α－Ｓ１－カゼイン、α－Ｓ２－カゼイン、β－カゼイン、及びカッパ－カゼイン由来である。前記データベースにおいて、これらの生理活性ペプチドのうち、１５のペプチドがＡＣＥ抑制活性でアノテートされ、１６のペプチドが抗菌活性でアノテートされた。下記表４では、α－Ｓ１－カゼイン、α－Ｓ２－カゼイン、β－カゼイン、及びカッパ－カゼインから同定されたペプチドと生物活性を列挙する。

実施例７ 分子量分布の決定
実施例１．３に記載した方法により分子量分布を決定することによって、本発明にしたがって調製したカゼイン加水分解物を存在するペプチドのサイズに関して分析した。

結果を図１２に示す。図１２は、本発明のカゼイン加水分解物の同定されたペプチドの５０％超は１０００～３０００Ｄａの範囲内の分子量を有し、５０００Ｄａを上回る分子量を有するペプチドは１％未満であることを示す。

実施例８ ｐＨの影響
熱処理されたＭＦ保持液（ＭＣＩ）中のプラスミンに対するｐＨの影響を分析した。

それぞれＮａＯＨ及び０．０５％ＮａＮ３でそれぞれｐＨ６．８、７．８及び８．２に調節した８％ｗ／ｗのＭＣＩ溶液を用いてサンプルを作製した。サンプルは、ＵＨＴ熱処理には供さず、３８℃で加水分解した。ベータ－カゼイン（ベータ－ＣＮ）及びアルファ－Ｓ１－カゼイン（アルファ－Ｓ１－ＣＮ）の量は、加水分解の開始時（時間＝０時間）で、そして２４時間及び４８時間後に再度、ＨＰＬＣによって測定した。使用したＨＰＬＣ法は、使用したカラムがＷａｔｅｒｓ ＢｉｏＳｕｉｔｅ Ｃ１８ ＰＡ－Ｂ ３．５μｍ、２．１×２５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ ＃１８６００２４３６）であり、各サンプルの注入間の洗浄時間が６．５分であったことを除いて、実施例１．１で記載したとおりであった。

図１３Ａにはアルファ－Ｓ１－カゼインの加水分解に対するｐＨの効果を示し、ベータ－カゼインの加水分解に対する効果は図１３Ｂに示す。図１３Ａ及び１３Ｂは、カゼイン（ベータ－カゼインとアルファ－Ｓ１－カゼインとの両方）を加水分解することに対する内因性プラスミンの効果が７．５～８．２で最適であり、ｐＨが天然乳のｐＨである６．８である場合は効率が低いことを明らかに示す。４８時間の加水分解後、インタクトなアルファ－Ｓ１－カゼインの量はｐＨが７．８～８．２である場合は４０～５０％であるのに対して、４８時間の加水分解後のアルファ－Ｓ１－カゼインの量は、ｐＨが６．８である場合は約６８％である。同様に、４８時間の加水分解後のベータ－カゼインの量は、ｐＨ７．８～８．２を使用する場合は、ｐＨ６．８よりも低い。

Claims (16)

1. カゼイン加水分解物を調製する方法であって：
   ｉ）カゼインと内因性プラスミンとを含む溶液を提供する工程であって、前記溶液が全固形分の少なくとも８０重量％のカゼインを含み、前記溶液が全タンパク質含有量の最大１０重量％の量の乳清タンパク質を含む、工程と、
   ｉｉ）工程ｉ）の前記溶液のｐＨをｐＨ７．２～９に調節する工程と、
   ｉｉｉ）前記ｐＨ調節済溶液を第一熱処理に供して微生物を不活性化する工程と、
   ｉｖ）工程ｉｉｉ）の前記溶液を２５℃～４５℃の温度で少なくとも６時間の第二熱処理に供してカゼイン加水分解物を得る工程と
   を含む、方法。
2. 外因性酵素の添加を除外する、請求項１に記載の方法。
3. 工程ｉｉ）の前記ｐＨ調節済溶液を均質化する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 工程ｉｉｉ）における前記第一熱処理が、１２０℃超の温度に０．１～１０秒の期間加熱することを含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
5. 工程ｉｉｉ）における前記第一熱処理が、１２０℃～１８０℃の温度に０．１～１０秒加熱することを含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記第一熱処理が、超高温（ＵＨＴ）熱処理及び高圧殺菌から選択される、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
7. カゼインと内因性プラスミンとを含む前記溶液が牛乳からの乳フラクションを含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
8. カゼインと内因性プラスミンとを含む前記溶液が、カゼインと内因性プラスミンとを含む乳由来フィードのフラクションを含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
9. カゼインと内因性プラスミンとを含む乳由来フィードの前記フラクションが、ミセルカゼイン分離物（ＭＣＩ）、ミセルカゼイン濃縮物（ＭＣＣ）、ミセルカゼイン保持液（ＭＣＲ）、ベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン分離物、ベータ－カゼイン枯渇ミセルカゼイン濃縮物、乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）、及び乳製品の精密ろ過保持液の群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 工程ｉ）で提供される前記溶液が、カゼインを少なくとも１％ｗ／ｖの量で含む、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
11. 工程ｉ）で提供される前記溶液が、カゼインを１％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖの量で含む、請求項１１に記載の方法。
12. 前記溶液が、カゼインを前記全タンパク質含有量の少なくとも９０％の量で含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
13. 請求項１～１２のいずれかに記載の方法により得ることができる天然カゼイン加水分解物。
14. 前記カゼイン加水分解物が追加の外因性酵素を含まない、請求項１３に記載の天然カゼイン加水分解物。
15. 前記カゼイン加水分解物がペプチドを含み、前記ペプチドの少なくとも５０％が１０００～３０００Ｄａの分子量を有し、前記ペプチドの１％未満が５０００Ｄａ以上の分子量を有する、請求項１３又は１４に記載の天然カゼイン加水分解物。
16. 栄養組成物における請求項１３～１５のいずれかに記載の天然カゼイン加水分解物の使用。