JP2023534951A - 組織特異的送達のためのコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

本明細書に提供するのは、効率的かつ特異的な組織分布を特徴とし、インビボでのサイレンシング効果が向上した、コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドである。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０２０年７月１６日出願された米国仮特許出願第６３／０５２，８１１号の優先権を主張するものであり、その開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府支援の研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により付与された助成金ＨＤ０８６１１１、ＧＭ１３１８３９、及びＯＤ０２００１２の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。

本開示は、新規な疎水性にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、予想外に高い有効性、取り込み、及び組織分布を達成するように設計される。

ＲＮＡ干渉は、遺伝子の機能を阻害するための簡単で効果的なツールを代表する。しかしながら、一般的な治療戦略としてのＲＮＡ干渉の可能性は、ｉｎ ｖｉｖｏで広範囲の組織に低分子ＲＮＡを送達する能力に依存している。現在、低分子の治療用ＲＮＡは、肝臓にのみ効果的に送達され得る。効率的なＲＩＳＣ侵入、最小限の免疫応答及びオフターゲット効果、製剤化なしでの効率的な細胞取り込み、ならびに効率的かつ特異的な組織分布を特徴とする自己送達型の二本鎖ＲＮＡが必要とされている。

１つの態様では、本明細書に提供するのは、標的器官または組織において、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの標的ＲＮＡのサイレンシング効果を増大させる方法であり、該ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、ここで、（１）該アンチセンス鎖は、少なくとも１６個の連続するヌクレオチド、５’末端、３’末端を含み、標的に対して相補性を有し、（２）該センス鎖は、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、５’末端、３’末端を含み、標的と相同性を有し、（３）該アンチセンス鎖の一部は、該センス鎖の一部に相補的であり、（４）該センス鎖の３’末端は、切断可能なリンカーを介して疎水性部分にコンジュゲートされ、（５）該ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含み、該ｄｓＲＮＡは、切断可能なリンカーを欠くｄｓＲＮＡと比較して、標的器官または組織において増加したｉｎ ｖｉｖｏでの標的ＲＮＡのサイレンシング効果を含む。

実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、２ヌクレオチド～５ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハング（例えば、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、または５ヌクレオチドの一本鎖オーバーハング）を含む。実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、２ヌクレオチの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む。実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、５ヌクレオチの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む。

実施形態では、該オーバーハングは、アンチセンスの３’末端に存在する。

実施形態では、該アンチセンス鎖は、約１５ヌクレオチド～２５ヌクレオチド長を含む。

実施形態では、該センス鎖は、約１５ヌクレオチド～２５ヌクレオチド長を含む。

実施形態では、該アンチセンス鎖は、２０ヌクレオチド長である。実施形態では、該アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長である。実施形態では、該アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチド長である。

実施形態では、該センス鎖は、１５ヌクレオチド長である。実施形態では、該センス鎖は、１６ヌクレオチド長である。実施形態では、該センス鎖は、１８ヌクレオチド長である。実施形態では、該センス鎖は、２０ヌクレオチド長である。

実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、１５塩基対～２０塩基対の二本鎖領域を含む。

実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、１５塩基の二本鎖領域を含む。実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、１６塩基の二本鎖領域を含む。実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、１８塩基の二本鎖領域を含む。実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、２０塩基の二本鎖領域を含む。

実施形態では、該アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。実施形態では、該センス鎖の３’末端から１～２位のヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。実施形態では、該アンチセンス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。実施形態では、該センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している。実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、約６～約１７個のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、約８～約１３個のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。

実施形態では、該切断可能なリンカーは、ホスホジエステル連結、ジスルフィド連結、酸に不安定な連結、または光切断可能な連結を含む。

実施形態では、該切断可能なリンカーは、ホスホジエステルヌクレオチド間連結を有するｄＴｄＴジヌクレオチドを含む。実施形態では、該酸に不安定な連結は、β－チオプロピオネート連結またはカルボキシジメチルマレイン酸無水物（ＣＤＭ）連結を含む。

実施形態では、該疎水性部分は、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド及びヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ならびにビタミンからなる群から選択される。

実施形態では、該疎水性部分は、低密度リポタンパク質及び／または中密度リポタンパク質に対して親和性を有する。実施形態では、該疎水性部分は、３つ未満の二重結合を有する飽和または不飽和部分である。実施形態では、該疎水性部分は、高密度リポタンパク質に対して親和性を有する。実施形態では、該疎水性部分は、３つ以上の二重結合を有する多価不飽和部分である。

実施形態では、該疎水性部分は、コレステロール及びリトコール酸（ＬＣＡ）からなる群から選択されるステロイドである。

実施形態では、該疎水性部分は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びドコサン酸（ＤＣＡ）からなる群から選択される脂肪酸である。

実施形態では、該疎水性部分は、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、及びそれらの誘導体、またはそれらの代謝物からなる群から選択されるビタミンである。

実施形態では、該ビタミンは、レチノイン酸及びコハク酸アルファ－トコフェロールからなる群から選択される。

実施形態では、該切断可能なリンカーは、さらに、さらなる二価または三価のリンカーを含む。

実施形態では、該二価または三価のリンカーは、以下からなる群から選択される：

式中、ｎは、１、２、３、４、または５である。

実施形態では、該リンカーが三価リンカーである場合、該リンカーは、さらに、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体を連結する。

実施形態では、該ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体は、以下からなる群から選択される：

式中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＢＨ_３である。

実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。

実施形態では、該修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基、またはそれらの混合物を含む。

実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの式Ｉの修飾ヌクレオチド間連結を含む：

式中、
Ｂは、塩基対部分であり、
Ｗは、Ｏ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２、及びＣＨからなる群から選択され、
Ｘは、ハロ、ヒドロキシ、及びＣ１－６アルコキシからなる群から選択され、
Ｙは、Ｏ－、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ－、ＮＨ２、Ｓ－、及びＳＨからなる群から選択され、
Ｚは、Ｏ及びＣＨ２からなる群から選択され、
Ｒは、保護基であり、

は、任意的な二重結合である。

実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、少なくとも８０％化学修飾されたヌクレオチドを含む。

実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、完全に化学修飾されている。

実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。

実施形態では、該アンチセンス鎖は、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。

実施形態では、該アンチセンス鎖は、約７０％～９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。

実施形態では、該センス鎖は、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。

実施形態では、該センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。

実施形態では、該アンチセンス鎖は、５’ホスフェート、５’－アルキルホスホネート、５’アルキレンホスホネート、または５’アルケニルホスホネートを含む。

実施形態では、該アンチセンス鎖は、５’ビニルホスホネートを含む。

実施形態では、該アンチセンス鎖は、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む。

実施形態では、該アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない。

実施形態では、該標的器官または組織は、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨格筋、副腎、及び脂肪からなる群から選択される。

該ｄｓＲＮＡの実施形態では、（１）該疎水性部分はＤＣＡであり、（２）該切断可能なリンカーはｄＴｄＴジヌクレオチドであり、（３）該標的器官または組織は、心臓及び骨格筋の一方または両方である。

実施形態では、該ｄｓＲＮＡは、対象に投与される。

実施形態では、該投与は、皮下に施される。

実施形態では、該投与は、静脈内に施される。

ｓｉＲＮＡの化学構造の変形、ホスホロチオエート（ＰＳ）の含有量及びリンカー化学が、ｉｎ ｖｉｖｏでの組織分布及び有効性に与える影響を評価するためのこれら３つの主要な特徴の概略図を示す。 ｓｉＲＮＡ構造及びＰＳで修飾されたオーバーハングの存在が、組織分布及び蓄積プロファイルに与える影響を実証する結果を示す。（Ａ）ホスホロチオエートのオーバーハング長がｓｉＲＮＡの肝外分布及び有効性に与える影響を評価するために使用されるｓｉＲＮＡの化学構造の概略図。（Ｂ）肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、筋肉、及び脂肪におけるＨｔｔ（上）またはＰｐｉｂ（下）ｍＲＮＡを標的とするＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡの蓄積を示す棒グラフ。ＤＣＡ－ｓｉＲＮＡの単回皮下注射の１週間後にＰＮＡハイブリダイゼーションアッセイにより測定されたｓｉＲＮＡ蓄積（２０ｍｇ／ｋｇ、１群あたりｎ＝５～６匹のマウス±ＳＤ）。データ分析：ｔ検定（＊Ｐ＜０．０５）。（Ｃ）Ｈｔｔ（左）またはＰｐｉｂ（右）ｍＲＮＡを標的とする平滑ｓｉＲＮＡに対する非対称または従来のｓｉＲＮＡの組織蓄積比を示す棒グラフ。 ５－または２－ｎｔのＰＳで修飾されたオーバーハングの存在がＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡの肝外活性に与える影響を実証する結果を示す。Ｈｔｔ（左のパネル）またはＰｐｉｂ（右のパネル）ｍＲＮＡを標的とする非対称（Ａ）、従来型（Ｂ）または平滑（Ｃ）ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡの皮下注射（１群あたりｎ＝５～６匹のマウス、２０ｍｇ／ｋｇ）後の肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、副腎、筋肉及び脂肪のサイレンシングパーセント。ｍＲＮＡレベルは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して測定し、ハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ（ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）に対して正規化し、ＰＢＳ対照のパーセントとして表した（平均±ＳＤ）。データ分析：多重比較のためのダネット検定による一元配置分散分析（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．１）。（Ｄ）ＨｔｔまたはＰｐｉｂ ｍＲＮＡを標的とするＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡのＳＣ注入後の様々な組織における非対称（５－ｎｔオーバーハング）、従来型（２－ｎｔオーバーハング）、平滑（０－ｎｔオーバーハング）ｓｉＲＮＡ足場のサイレンシングの間に観察された統計的に有意な差の程度を示すヒートマップ（１群あたりｎ＝５～６匹のマウス、２０ｍｇ／ｋｇ）。データ分析：ｔ検定。オーバーハングの長さではなくその存在が、観察された活性の向上に大きな影響を与える。 ｓｉＲＮＡ構造が、組織蓄積及び有効性の影響に与える影響を実証する結果を示す。（Ａ）Ｈｔｔ及びＰｐｉｂを標的とする非対称、従来型、及び平滑ｓｉＲＮＡに関する組織でのｓｉＲＮＡ組織分布及び有効性を関連付けるグラフ。（Ｂ）すべての組織に関して平滑ｓｉＲＮＡに対する非対称（左のパネル）または従来型（右のパネル）のｍＲＮＡレベルの発現の違いを示すグラフ。分析されたすべての組織及び両方の遺伝子標的が同じグラフにプロットされている。負の差は、平滑化合物と比較して、非対称または従来型ｓｉＲＮＡによるサイレンシングの誘導が良好であることを示す。 オーバーハングを含む構造との関連で、ＰＳ含有量の増加が組織蓄積に与える影響を実証する結果を示す。（Ａ）ｓｉＲＮＡ足場及びＰＳ含有量の変動の概略図。（Ｂ）肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、筋肉、及び脂肪におけるＨｔｔ（上）またはＰｐｉｂ（下）ｍＲＮＡを標的とする高ＰＳ及び低ＰＳ ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡの蓄積を示す棒グラフ。ＤＣＡ ｓｉＲＮＡの単回皮下注射の１週間後にＰＮＡハイブリダイゼーションアッセイにより測定されたｓｉＲＮＡ蓄積（２０ｍｇ／ｋｇ、１群あたりｎ＝５～６匹のマウス±ＳＤ）。データ分析：ｔ検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．１）。（Ｃ）Ｈｔｔ（左）またはＰｐｉｂ（右）ｍＲＮＡを標的とする高ＰＳ（１３ＰＳ）ｓｉＲＮＡの低ＰＳ（８ＰＳ）ｓｉＲＮＡに対する組織蓄積比を示す棒グラフ。図８は、ＤＨＡコンジュゲートｈｓｉＲＮＡの固相合成を示す。 ＰＳ含有量の増加が、組織におけるｓｉＲＮＡの機能的有効性の影響に与える影響を実証する結果を示す。高ＰＳ及び低ＰＳの皮下注射後の肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、副腎、筋肉及び脂肪におけるサイレンシングパーセント。Ｈｔｔ（左のパネル）またはＰｐｉｂ（右のパネル）ｍＲＮＡを標的とする（Ａ）従来型または（Ｂ）平滑ｓｉＲＮＡ（１群あたりｎ＝５～６匹のマウス、２０ｍｇ／ｋｇ）。ｍＲＮＡレベルは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して測定し、ハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔ（ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）に対して正規化し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）対照のパーセントとして表した（平均±ＳＤ）。データ分析：ｔ検定（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．１）。 高ＰＳ含有量がｓｉＲＮＡの有効性に与える影響を実証する結果を示す。（Ａ）Ｈｔｔ（上のパネル）及びＰｐｉｂ（下のパネル）を標的とする従来型の高ＰＳ及び低ＰＳのｓｉＲＮＡならびに平滑高ＰＳ及び低ＰＳのｓｉＲＮＡに関する組織におけるｓｉＲＮＡの組織分布と有効性を関連付けるグラフ。（Ｂ）対応する低ＰＳ含有量のバリアントに対する従来型の高ＰＳ（左のパネル）または平滑高ＰＳ（右のパネル）のｍＲＮＡレベルの発現の違いを示すグラフ。分析されたすべての組織及び両方の遺伝子標的が同じグラフにプロットされている。正の差は、高ＰＳ化合物と比較して、低ＰＳのｓｉＲＮＡによるサイレンシングの誘導が良好であることを示す。 コンジュゲートとｓｉＲＮＡの間の切断可能なリンカーの存在が、ｓｉＲＮＡの組織分布及び蓄積プロファイルに与える影響を実証する結果を示す。（Ａ）ｄＴ－ＰＯ対安定炭素（Ｓｔ）リンカーの分布に対する影響を評価するためのｓｉＲＮＡの化学構造の概略図。（Ｂ）肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、筋肉及び脂肪における、ｄｔ－ＰＯまたは安定炭素（Ｓｔ）リンカーを有する非対称（上）、従来型（中）または平滑（下）ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡの鎖の蓄積を示す棒グラフ。ＤＣＡ－ｓｉＲＮＡの単回皮下注射の１週間後にＰＮＡハイブリダイゼーションアッセイにより測定されたｓｉＲＮＡ蓄積（２０ｍｇ／ｋｇ、１群あたりｎ＝５～６匹のマウス±ＳＤ）。データ分析：ｔ検定（＊Ｐ＜０．１）。（Ｃ）ｓｉＲＮＡに連結された非対称、従来型、及び平滑ｄＴ－ＰＯの、対応するバリアントＳｔ連結ｓｉＲＮＡに対する組織蓄積比を示す棒グラフ。 複数の組織において、切断可能なリンカーの存在が、ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡサイレンシングに与える影響を実証する結果を示す。ＦＶＢ／Ｎマウスに、ｄｔ－ＰＯまたは安定炭素（Ｓｔ）リンカーのいずれかを有する非対称ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡを皮下注射した（２０ｍｇ／ｋｇ、１群あたりｎ＝６）後の肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、副腎、筋肉及び脂肪におけるＨｔｔ（上のパネル）及びＰｐｉｂ（下のパネル）のサイレンシングパーセント。注射の１週間後、組織を採取し、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用してｍＲＮＡレベルを測定し、ハウスキーピング遺伝子であるＨｐｒｔ（ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）に対して正規化し、ＰＢＳ対照のパーセントとして表した（平均±ＳＤ）。データ分析：ｔ検定（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．１）。 リンカーの化学が、組織蓄積及び有効性に与える影響を実証する結果を示す。（Ａ）Ｈｔｔ及びＰｐｉｂを標的とするｄｔ－ＰＯリンカー及び安定炭素（Ｓｔ）リンカーを有する非対称ｓｉＲＮＡに関する組織でのｓｉＲＮＡ組織分布及び有効性を関連付けるグラフ。（Ｂ）安定炭素（Ｓｔ）リンカーを有するｓｉＲＮＡに対するｄＴ－ＰＯリンカーを有する化合物のｍＲＮＡレベルの発現の違いを示すグラフ。分析されたすべての組織及び両方の遺伝子標的が同じグラフにプロットされている。負の差は、ＤＣＡ安定炭素（Ｓｔ）連結化合物と比較して、ＤＣＡ ｄＴ－ＰＯ連結ｓｉＲＮＡによるサイレンシングの誘導が良好であることを示す。 肝外サイレンシングを増強するための脂質コンジュゲートｓｉＲＮＡの最適化された設計の概略図を示す。

本開示は、絶対的に安定な、完全に活性であるコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチド（例えば、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ）の組織分布及び細胞取り込みを促進する化学的及び生物学的特性を特定するために、これらのオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡ）を疎水性部分であるＤＣＡにコンジュゲートさせた。アンチセンス一本鎖テール長、全ホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間連結修飾、及びコンジュゲートリンカーの化学的性質（切断可能または安定）を含めた、いくつかのｄｓＲＮＡの特徴を最適化した。最適化したｄｓＲＮＡコンジュゲートは、２～５ヌクレオチドの一本鎖テール、合計約６～１８個のＰＳ修飾、及び切断可能なリンカーを含む。驚くべきことに、切断可能なリンカーを使用すると、組織／器官蓄積を犠牲にすることなく、コンジュゲートされたｄｓＲＮＡのサイレンシング効果が高まることが発見された。得られたコンジュゲートｄｓＲＮＡは、脂肪組織、骨格筋、脾臓、肺、副腎、心臓、肝臓及び腎臓を含めた様々な組織に選択的に送達され得る。

本明細書に記載の組成物は、オリゴヌクレオチド（例えば、代謝的に安定なｓｉＲＮＡ）の単純で効率的な非毒性送達を促進し、ｉｎ ｖｉｖｏで様々な組織における治療標的の強力なサイレンシングを促進する。本明細書に提供するのは、肝臓におけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートの性能及び臨床的影響に適合する他の組織を標的とするための化学プラットフォームである。いくつかの生理活性ステロイド、内在性カンナビノイド様、生理活性脂質コンジュゲート及びビタミンベースのコンジュゲートをスクリーニングし、同定した。これらの化合物は、胸腺、膀胱、腸、皮膚、骨髄、胎盤、脂肪組織、筋肉、脾臓、膵臓、肺、卵管、副腎、心臓、肝臓及び腎臓を含めたいくつかの組織において、かつてない分布、ニューロンへの取り込み、有効性、及び無毒性を示す。

特定の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、（１）完全に代謝的に安定な足場（ＲＮＡが残らない）を提供すること、（２）細胞内に内在化することが生物学的に既知の化合物を選択すること及び効率的な組織分布を可能にする疎水性の範囲を特定すること、（３）これらの疎水性化合物を該代謝的に安定なｓｉＲＮＡにコンジュゲートすること、及び（４）ｉｎ ｖｉｖｏで分布、有効性、及び毒性をスクリーニングすることを含むプロセスを介して特定された。疎水性の最適な範囲の発見は、有効であると期待される化学的足場の範囲を決める。低疎水性（コルチゾールのような）では、良好な組織保持を確保するのに十分ではないが、疎水性が高すぎる（例えば、コレステロール）と、注射部位からの分布が最小限に抑えられることが分かった。

定義

本明細書で特に定義しない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。潜在的なあらゆるあいまいさがある場合は、本明細書に提供する定義があらゆる辞書または外部の定義よりも優先される。別段文脈によって要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。「または」の使用は、特に明記しない限り、「及び／または」を意味する。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」等の他の形態の使用は、限定的ではない。

本発明がより容易に理解され得るように、特定の用語を最初に定義する。

「ヌクレオシド」という用語は、リボースまたはデオキシリボース糖に共有結合により連結されたプリンまたはピリミジン塩基を有する分子を指す。例示的ヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、及びチミジンが挙げられる。さらなる例示的ヌクレオシドとしては、イノシン、１－メチルイノシン、プシュードウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ－メチルグアノシン及びＮ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン（「希少」ヌクレオシドとも呼ばれる）が挙げられる。「ヌクレオチド」という用語は、エステル連結内で糖部分に結合された１つ以上のリン酸基を有するヌクレオシドを指す。例示的ヌクレオチドとしては、ヌクレオシド一リン酸、二リン酸、及び三リン酸が挙げられる。「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、５’及び３’炭素原子間のホスホジエステルまたはホスホロチオエート連結によって一緒に結合されたヌクレオチドのポリマーを指す。

「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド（例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のリボヌクレオチド）のポリマーを指す。「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」または「デオキシリボ核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡ及びＲＮＡは、自然に合成され得る（例えば、それぞれＤＮＡの複製またはＤＮＡの転写によって）。ＲＮＡは、転写後に修飾され得る。ＤＮＡ及びＲＮＡも化学的に合成され得る。ＤＮＡ及びＲＮＡは、一本鎖（すなわち、それぞれｓｓＲＮＡ及びｓｓＤＮＡ）または多重鎖（例えば、二本鎖、すなわち、それぞれｄｓＲＮＡ及びｄｓＤＮＡ）であり得る。「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」は、１つ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を特定する一本鎖ＲＮＡである。この情報は、リボソームがｍＲＮＡに結合するときに、タンパク質合成中に翻訳される。

本明細書で使用される用語「低分子干渉ＲＮＡ」（「ｓｉＲＮＡ」）（当技術分野では「短鎖干渉ＲＮＡ」とも呼ばれる）は、約１０～５０のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ（またはＲＮＡ類似体）を指し、ＲＮＡ干渉を指示または媒介できる。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１５～３０のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、または約１６～２５のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、または約１８～２３のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、または約１９～２２のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）（例えば、１９、２０、２１または２２のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）を含む。「短い」ｓｉＲＮＡという用語は、約２１ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、例えば、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。「長い」ｓｉＲＮＡという用語は、約２４～２５ヌクレオチド、例えば、２３、２４、２５または２６ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。短いｓｉＲＮＡは、場合によっては、短いｓｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力を保持するという条件で、１９未満のヌクレオチド、例えば、１６、１７または１８ヌクレオチドを含み得る。同様に、長いｓｉＲＮＡは、場合によっては、より長いｓｉＲＮＡが、短いｓｉＲＮＡへのさらなるプロセシング、例えば酵素プロセシングなく、ＲＮＡｉを媒介する能力を保持するという条件で、２６を超えるヌクレオチドを含み得る。

「ヌクレオチド類似体」または「改変ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」という用語は、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド等、非標準ヌクレオチドを指す。例示的ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの特定の化学的性質を改変させるが、その意図された機能を実行するヌクレオチド類似体の能力を保持するように、任意の位置で修飾される。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例としては、５位、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン、５－プロピンウリジン、５－プロペニルウリジン、６位、例えば６－（２－アミノ）プロピルウリジン、及びアデノシン及び／またはグアノシンの８位、例えば、８－ブロモグアノシン、８－クロログアノシン、８－フルオログアノシンが挙げられる。また、ヌクレオチド類似体としては、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン、Ｏ－及びＮ－修飾（例えば、アルキル化、例えばＮ６－メチルアデノシン、または当技術分野で知られているもの）ヌクレオチド、及び他の複素環修飾ヌクレオチド類似体、例えば、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，２０００ Ａｕｇ．１０（４）：２９７－３１０に記載のものが挙げられる。

ヌクレオチド類似体はまた、ヌクレオチドの糖部分への修飾を含み得る。例えば、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、またはＣＯＯＲから選択される基によって置換されてもよく、ここでＲは、置換または非置換のＣ_１－Ｃ_６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール等である。他の考えられる修飾は、米国特許第５，８５８，９８８号及び同第６，２９１，４３８号に記載されているものが挙げられる。

ヌクレオチドのリン酸基はまた、例えば、リン酸基の酸素の１つ以上を硫黄（例えば、ホスホロチオエート）で置換することによって、またはヌクレオチドがその意図された機能を実行できるように、他の置換を行うことによって、修飾され得る。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２０００ Ａｐｒ．１０（２）：１１７－２１，Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２０００ Ｏｃｔ．１０（５）：３３３－４５，Ｓｔｅｉｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２００１ Ｏｃｔ．１１（５）：３１７－２５，Ｖｏｒｏｂｊｅｖ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．２００１ Ａｐｒ．１１（２）：７７－８５、及び米国特許第５，６８４，１４３号に記載されている。上で参照した特定の修飾（例えば、リン酸基修飾）は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、類似体を含むポリヌクレオチドの加水分解速度を低下させる。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体の短いポリマーを指す。

「ＲＮＡ類似体」という用語は、対応する未改変または未修飾のＲＮＡと比較して、少なくとも１つの改変または修飾されたヌクレオチドを有するが、対応する未改変または未修飾のＲＮＡと同じまたは類似の性質または機能を保持するポリヌクレオチド（例えば、化学的に合成されたポリヌクレオチド）を指す。上述のとおり、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル連結を有するＲＮＡ分子と比較して、結果としてＲＮＡ類似体の加水分解速度を低下させる連結により連結され得る。例えば、類似体のヌクレオチドは、メチレンジオール、エチレンジオール、オキシメチルチオ、オキシエチルチオ、オキシカルボニルオキシ、ホスホロジアミデート、ホスホロアミデート、及び／またはホスホロチオエート連結を含み得る。一部のＲＮＡ類似体には、糖及び／または骨格修飾リボヌクレオチド及び／またはデオキシリボヌクレオチドが含まれる。そのような改変または修飾は、ＲＮＡの末端（複数可）または内部（ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチド）等への非ヌクレオチド物質の付加をさらに含むことができる。ＲＮＡ類似体は、ＲＮＡ干渉を媒介する能力を有する天然のＲＮＡと十分に類似していることのみを必要とする。

本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉」（「ＲＮＡｉ」）という用語は、ＲＮＡの選択的な細胞内分解を指す。ＲＮＡｉは、細胞内で自然に発生し、外来ＲＮＡ（例えば、ウイルスＲＮＡ等）を除去する。天然のＲＮＡｉは、遊離ｄｓＲＮＡから切断された断片を介して進行し、分解機構を他の同様のＲＮＡ配列に向ける。あるいは、例えば標的遺伝子の発現をサイレンシングするために、ヒトの手によって、ＲＮＡｉを開始させ得る。

「標的特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を指示するために、標的ｍＲＮＡ配列に十分に相補的な配列」である鎖を有するＲＮＡｉ剤、例えば、ＲＮＡサイレンシング剤は、その鎖が、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによる標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分な配列を有することを意味する。

本明細書で使用される「単離ＲＮＡ」（例えば、「単離ｓｉＲＮＡ」または「単離ｓｉＲＮＡ前駆体」）は、組換え技術によって産生された場合は、実質的に他の細胞材料または培養培地を含まないＲＮＡ分子を指し、化学合成された場合は、実質的に化学前駆体または他の化学物質を含まない。

本明細書で使用される「ＲＮＡサイレンシング」という用語は、ＲＮＡ分子によって媒介される配列特異的調節機構（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエルリング、共抑制、及び翻訳抑制）の一群を指し、これらは、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または「サイレンシング」をもたらす。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物、及び菌類等、多くの種類の生物で観察されている。

「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、例えば精製された試薬または抽出物、例えば細胞抽出物を含む、その技術分野で認識されている意味を有する。「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語はまた、例えば、生きている細胞、例えば、不死化細胞、一次細胞、細胞株、及び／または生物内の細胞を含む、当業者によって認識されている意味を有する。

本明細書で使用される「標的遺伝子」という用語は、その発現が実質的に阻害されるか、または「サイレンシング」される遺伝子である。同様に、「標的ＲＮＡ」は、本開示の二本鎖ＲＮＡによる阻害のための標的となり得る遺伝子産物である。このサイレンシングは、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡの切断または標的遺伝子の翻訳抑制によるＲＮＡのサイレンシングによって達成することができる。「非標的遺伝子」という用語は、その発現が実質的にサイレンシングを受けない遺伝子である。一実施形態では、標的遺伝子及び非標的遺伝子のポリヌクレオチド配列（例えば、標的遺伝子及び非標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ）は、１つ以上のヌクレオチドが異なり得る。別の実施形態では、標的及び非標的遺伝子は、１つ以上の多型（例えば、一塩基多型またはＳＮＰ）によって異なり得る。別の実施形態では、標的及び非標的遺伝子は、１００％未満の配列同一性を共有できる。別の実施形態では、非標的遺伝子は、標的遺伝子の相同体（例えばオルソログまたはパラログ）であってもよい。

本明細書で使用される、ＲＮＡサイレンシング剤、例えばｓｉＲＮＡまたはＲＮＡサイレンシング剤の「アンチセンス鎖」という用語は、サイレンシングのために標的化された遺伝子のｍＲＮＡの約１０～５０ヌクレオチド、例えば約１５～３０、１６～２５、１８～２３または１９～２２ヌクレオチドのセクションに実質的に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖または第１の鎖は、標的特異的サイレンシングを指示するために、所望の標的ｍＲＮＡ配列に対して十分に相補的である、例えば、ＲＮＡｉの機構またはプロセス（ＲＮＡｉ干渉）によって所望の標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分に相補的である、または所望の標的ｍＲＮＡの翻訳抑制を引き起こすのに十分に相補的である配列を有する。

ＲＮＡサイレンシング剤、例えばｓｉＲＮＡまたはＲＮＡサイレンシング剤の「センス鎖」または「第２の鎖」という用語は、アンチセンス鎖または第１の鎖に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖及びセンス鎖はまた、第１の鎖または第２の鎖と称することができ、第１の鎖または第２の鎖は、標的配列に対して相補性を有し、それぞれの第２の鎖または第１の鎖は、第１の鎖または第２の鎖に対して相補性を有する。ｍｉＲＮＡ二本鎖中間体またはｓｉＲＮＡ様二本鎖には、サイレンシングの標的とされる遺伝子のｍＲＮＡの約１０～５０のヌクレオチドのセクションに十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ鎖、及びｍｉＲＮＡ鎖と二本鎖を形成するのに十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ＊鎖が含まれる。

本明細書で使用される用語「ガイド鎖」は、ＲＩＳＣ複合体に入り、標的ｍＲＮＡの切断を指示する、ＲＮＡサイレンシング剤の鎖、例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖またはｓｉＲＮＡ配列のアンチセンス鎖を指す。

本明細書で使用される「５’末端」は、アンチセンス鎖の５’末端のように、５’末端ヌクレオチド、例えば、アンチセンス鎖の５’末端の１～約５ヌクレオチドの間を指す。本明細書で使用される「３’末端」は、センス鎖の３’末端のように、相補的なアンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドに相補的な領域、例えば、１～約５ヌクレオチドの領域を指す。

本明細書で使用される「塩基対」という用語は、オリゴヌクレオチド二重鎖（例えば、ＲＮＡサイレンシング剤の鎖及び標的ｍＲＮＡ配列によって形成される二重鎖）の対向する鎖上のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）の対間の、主に、ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間のＨ結合、ファンデルワールス相互作用等による相互作用を指す。本明細書で使用される「結合強度」または「塩基対強度」という用語は、塩基対の強度を指す。

安定性が向上したＲＮＡサイレンシング剤
本出願のＲＮＡサイレンシング剤（例えば、二本鎖ＲＮＡ）は、血清中または細胞培養用の成長培地中での安定性を改善するために修飾され得る。安定性を向上させるために、３’－残基を分解に対して安定化させてよく、例えば、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチド等のプリンヌクレオチドからなるように選択され得る。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’－デオキシチミジンによるウリジンの置換は許容され、ＲＮＡ干渉の効率に影響を与えない。

１つの態様では、本出願は、第１及び第２の鎖を含むＲＮＡサイレンシング剤を特徴とし、第２の鎖及び／または第１の鎖は、対応する非修飾ＲＮＡサイレンシング剤と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性が向上するように、内部ヌクレオチドを修飾ヌクレオチドで置換することによって、修飾される。本明細書で定義されるように、「内部」ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端以外の任意の位置に存在するものである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子内にあっても、二本鎖もしくは二本鎖分子の鎖内にあってもよい。一実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、少なくとも１つの内部ヌクレオチドの置換によって修飾される。別の実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上の内部ヌクレオチドの置換によって修飾される。別の実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の内部ヌクレオチドの置換によって修飾される。さらに別の実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドのすべての置換によって修飾される。

１つの態様では、本出願は、少なくとも８０％が化学修飾されたＲＮＡサイレンシング剤を特徴とする。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、完全に化学修飾されていてよく、すなわち、ヌクレオチドの１００％が化学修飾されている。別の態様では、本出願は、少なくとも８０％が化学修飾された２’－ＯＨリボース基を含むＲＮＡサイレンシング剤を特徴とする。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％化学修飾されている２’－ＯＨリボース基を含む。

特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド類似体を含み得る。ヌクレオチド類似体は、標的特異的サイレンシング活性、例えばＲＮＡｉ媒介活性または翻訳抑制活性が、実質的に影響を受けない位置、例えばｓｉＲＮＡ分子の５’末端及び／または３’末端にある領域に配置され得る。さらに、修飾ヌクレオチド類似体を組み込むことによって、末端を安定化させ得る。

例示的なヌクレオチド類似体としては、糖－及び／または骨格修飾リボヌクレオチド（すなわち、リン酸糖骨格への修飾を含む）。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル連結は、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含むように修飾され得る。例示的な骨格修飾リボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドに結合するリン酸エステル基は、例えばホスホチオエート基の修飾基によって置換される。例示的な糖修飾リボヌクレオチドでは、２’ＯＨ－基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２またはＯＮから選択される基で置き換えられ、式中、Ｒは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。

特定の実施形態では、修飾は、２’－フルオロ、２’－アミノ、及び／または２’－チオ修飾である。修飾としては、２’－フルオロ－シチジン、２’－フルオロ－ウリジン、２’－フルオロ－アデノシン、２’－フルオロ－グアノシン、２’－アミノ－シチジン、２’－アミノ－ウリジン、２’－アミノ－アデノシン、２’－アミノ－グアノシン、２，６－ジアミノプリン、４－チオ－ウリジン、及び／または５－アミノ－アリル－ウリジンが挙げられる。特定の実施形態では、２’－フルオロリボヌクレオチドは、すべてのウリジン及びシチジンである。追加の例示的な修飾としては、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－メチル－シチジン、リボ－チミジン、２－アミノプリン、２’－アミノ－ブチリル－ピレン－ウリジン、５－フルオロ－シチジン、及び５－フルオロウリジンが挙げられる。２’－デオキシ－ヌクレオチド及び２’－Ｏｍｅヌクレオチドも、本発明の修飾ＲＮＡサイレンシング剤部分内で使用することができる。追加の修飾残基としては、デオキシ脱塩基、イノシン、Ｎ３－メチル－ウリジン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチル－アデノシン、シュードウリジン、プリンリボヌクレオシド、及びリバビリンが挙げられる。特定の実施形態では、連結部分が２’－Ｏ－メチルオリゴヌクレオチドであるように、２’部分がメチル基である。

特定の実施形態では、本出願のＲＮＡサイレンシング剤は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ＬＮＡは、ヌクレアーゼ活性に抵抗する（高度に安定である）糖修飾ヌクレオチドを含み、ｍＲＮＡについて単一ヌクレオチド識別を有する（Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，（２００５），３３（１）：４３９－４４７；Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：７９６７－７９７５，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１：７４－８１）。これらの分子は、２’－デオキシ－２’’－フルオロウリジン等、修飾が可能な２’－Ｏ、４’－Ｃ－エチレン架橋核酸を有する。さらに、ＬＮＡは、糖部分を３’－エンドコンフォメーションに拘束することによってオリゴヌクレオチドの特異性を増大し、それによって塩基対合形成のためにヌクレオチドを事前に組織化し、オリゴヌクレオチドの融解温度を１塩基あたり１０℃ほど上昇させる。

別の例示的な実施形態では、本出願のＲＮＡサイレンシング剤は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ＰＮＡは、ヌクレオチドの糖－リン酸部分が、ポリアミド骨格を形成できる中性の２－アミノエチルグリシン部分で置換され、ヌクレアーゼ消化に対して高い抵抗性があり、分子に対して、改善された結合特異性を付与する修飾ヌクレオチドを含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２００１），２５４：１４９７－１５００）。

天然に存在する核酸塩基の代わりに、少なくとも１つの天然に存在しない核酸塩基を含有する核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチドも企図される。アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するために、塩基を修飾することができる。修飾核酸塩基の例としては、これらに限定されないが、５位で修飾されたウリジン及び／またはシチジン、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン、８位で修飾されたアデノシン及び／またはグアノシン、例えば８－ブロモグアノシン、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン、Ｏ－及びＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６－メチルアデノシンが挙げられ、好適である。上記の修飾を組み合わせてもよいことに留意されたい。

他の実施形態では、架橋を使用して、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態を変化させ、例えば、身体内での半減期を延長することができる。従って、本出願は、核酸の２つの相補鎖を有するＲＮＡサイレンシング剤を含み、２つの鎖は、架橋されている。本出願は、別の部分（例えば、ペプチド等の非核酸部分）または有機化合物（例えば、染料）等に対して（例えば、その３’末端において）コンジュゲートされているかまたはコンジュゲートされていないＲＮＡサイレンシング剤も含む。このようにｓｉＲＮＡ誘導体を修飾することにより、対応するｓｉＲＮＡと比較して、細胞への取込みを改善する、または得られたｓｉＲＮＡ誘導体の細胞標的活性を向上させることができ、ｓｉＲＮＡ誘導体を細胞内で追跡する、または対応するｓｉＲＮＡと比較して、ｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を改善するのに有用である。

他の例示的な修飾としては、以下が挙げられる：（ａ）２’の修飾、例えば、センスまたはアンチセンス鎖における、特にセンス鎖における、Ｕ上の２’ＯＭｅ部分の提供、または、３’オーバーハング中、例えば、３’末端での２’ＯＭｅ部分の提供（３’末端は、分子の３’原子または最大３’部分、例えば、文脈によって示されるように、最も３’のＰまたは２’の位置を意味する）、（ｂ）リン酸骨格における、例えばＯのＳによる置換による骨格の修飾、例えば、特にアンチセンス鎖におけるＵまたはＡまたは両方へのホスホロチオエート修飾の提供、例えば、ＯのＳによる置換による、（ｃ）ＵのＣ５アミノリンカーでの置換、（ｄ）ＡのＧによる置換（配列変化は、特定の実施形態では、アンチセンス鎖ではなくセンス鎖に配置され得る）、及び（ｄ）２’、６’、７’、または８’位での修飾。例示的な実施形態は、これらの修飾の１つ以上がセンス上に存在するが、アンチセンス鎖には存在しない実施形態、またはアンチセンス鎖が、そのような修飾をほとんど有さない実施形態である。さらに他の例示的な修飾としては、３’オーバーハング中、例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用；２’修飾の組み合わせ、例えば２’ＯＭｅ部分の提供と骨格の修飾、例えばＯのＳによる置換、例えばホスホロチオエート修飾の提供、または３’オーバーハング中、例えば３’末端でのメチル化Ｐの使用、３’アルキルによる修飾；３’オーバーハング中、例えば３’末端での脱塩基ピロリドンによる修飾、ナプロキセン、イブプロフェン、または３’末端での分解を阻害する他の部分による修飾が挙げられる。

高度に修飾されたＲＮＡサイレンシング剤
特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、少なくとも８０％の化学修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、完全に化学修飾されており、すなわち、ヌクレオチドの１００％が化学修飾されている。

特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、２’－Ｏ－メチルリッチである、すなわち、５０％を超える２’－Ｏ－メチル含有量を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド含有量を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、少なくとも約７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、約７０％～約９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含むｄｓＲＮＡである。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも約７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、約７０％～約９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、少なくとも約７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、約７０％～約９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、１００％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む。

２’－Ｏ－メチルリッチＲＮＡサイレンシング剤及び特定の化学修飾パターンについては、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１６／５５０，０７６（２０１９年８月２３日に出願）及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／８９１，１８５（２０１９年８月２３日に出願）にさらに記載され、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。

ヌクレオチド間連結修飾
特定の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチド間連結、サブユニット間連結、またはヌクレオチド骨格が、ＲＮＡサイレンシング剤中で修飾される。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤中のヌクレオチド間連結のすべてが修飾される。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、４～１６のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、８～１３のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含むｄｓＲＮＡであり、それぞれ５’末端及び３’末端を含む。特定の実施形態では、センス鎖の５’末端から１位及び２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。特定の実施形態では、センス鎖の３’末端から１位及び２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端から１位及び２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～８位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端から１～２位、１～３位、１～４位、１～５位、１～６位、１～７位、または１～８位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して隣接するリボヌクレオチドに結合される。

１つの態様では、本開示は、修飾オリゴヌクレオチドを提供し、オリゴヌクレオチドは標的に相補的な５’末端、３’末端を有し、オリゴヌクレオチドは、センス及びアンチセンス鎖、及び少なくとも１つの式（Ｉ）の修飾されたサブユニット間連結を含む：

式中、
Ｂは、塩基対部分であり；
Ｗは、Ｏ、ＯＣＨ_２、ＯＣＨ、ＣＨ_２、及びＣＨからなる群から選択され、
Ｘは、ハロ、ヒドロキシ、及びＣ_１－６アルコキシからなる群から選択され、
Ｙは、Ｏ^－、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ^－、ＮＨ_２、Ｓ^－、及びＳＨからなる群から選択され、
Ｚは、Ｏ及びＣＨ_２からなる群から選択され；
Ｒは、保護基であり、

は、任意的な二重結合である。

式（Ｉ）の実施形態では、ＷがＣＨである場合、

は、二重結合である。

式（Ｉ）の実施形態では、ＷがＯ、ＯＣＨ_２、ＯＣＨ、ＣＨ_２からなる群から選択される場合、

は、単結合である。

式（Ｉ）の実施形態では、Ｙが、Ｏ^－である場合、ＺまたはＷのどちらか一方は、Ｏではない。

式（Ｉ）の実施形態では、Ｚは、ＣＨ_２であり、Ｗは、ＣＨ_２である。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結である：

式（Ｉ）の一実施形態では、Ｚは、ＣＨ_２であり、ＷはＯである。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＩＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結である：

式（Ｉ）の実施形態では、Ｚは、Ｏであり、Ｗは、ＣＨ_２である。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＩＶ）の修飾されたサブユニット間連結である：

式（Ｉ）の一実施形態では、Ｚは、Ｏであり、Ｗは、ＣＨである。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾されたサブユニット間連結は、式Ｖの修飾されたサブユニット間連結である：

式（Ｉ）の実施形態では、Ｚは、Ｏであり、Ｗは、ＯＣＨ_２である。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾されたサブユニット間連結は、式ＶＩの修飾されたサブユニット間連結である：

式（Ｉ）の一実施形態では、Ｚは、ＣＨ_２であり、Ｗは、ＣＨである。別の実施形態では、式（Ｉ）の修飾されたサブユニット間連結は、式ＶＩＩの修飾されたサブユニット間連結である：

式（Ｉ）の実施形態では、塩基対部分Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルからなる群から選択される。

一実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡに組み込まれ、修飾ｓｉＲＮＡは、標的に相補的な５’末端、３’末端を有し、標的に対して、相補性であり、ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖、ならびに式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、または式（ＶＩＩ）のうちのいずれか１つ以上の少なくとも１つの修飾されたサブユニット間連結を含む。

一実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡに組み込まれ、修飾ｓｉＲＮＡは、５’末端、３’末端を有し、標的に相補的であり、センス及びアンチセンス鎖を含み、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾されたサブユニット間連結を含み、式ＶＩＩＩである：

式中、
Ｄは、Ｏ、ＯＣＨ_２、ＯＣＨ、ＣＨ２、及びＣＨからなる群から選択され；
Ｃは、Ｏ^－、ＯＨ、ＯＲ^１、ＮＨ^－、ＮＨ_２、Ｓ^－、及びＳＨからなる群から選択され、
Ａは、Ｏ及びＣＨ_２からなる群から選択され；
Ｒ^１は、保護基であり；

は、任意的な二重結合であり；
サブユニット間は、任意に修飾された２つのヌクレオシドを架橋している。

一実施形態では、ＣがＯ^－である場合、ＡまたはＤのどちらか一方はＯではない。

一実施形態では、Ｄは、ＣＨ_２である。別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間連結は、式（ＩＸ）の修飾されたサブユニット間連結である：

一実施形態では、Ｄは、Ｏである。別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間連結は、式（Ｘ）の修飾されたサブユニット間連結である：

一実施形態では、Ｄは、ＣＨ_２である。別の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＸＩ）の修飾されたサブユニット間連結である：

一実施形態では、Ｄは、ＣＨである。別の実施形態では、式ＶＩＩＩの修飾されたサブユニット間連結は、式（ＸＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結である：

別の実施形態では、式（ＶＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＸＩＶ）の修飾されたサブユニット間連結である：

一実施形態では、Ｄは、ＯＣＨ_２である。別の実施形態では、式（ＶＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＸＩＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結である：

別の実施形態では、式（ＶＩＩ）の修飾されたサブユニット間連結は、式（ＸＸａ）の修飾されたサブユニット間連結である：

修飾ｓｉＲＮＡ連結の一実施形態では、任意に修飾された各ヌクレオシドは、出現ごとに独立して、アデノシン、グアノシン、シチジン、及びウリジンからなる群から選択される。

式（Ｉ）の特定の例示的な実施形態では、Ｗは、Ｏである。別の実施形態では、Ｗは、ＣＨ_２である。さらに別の実施形態では、Ｗは、ＣＨである。

式（Ｉ）の特定の例示的な実施形態では、Ｘは、ＯＨである。別の実施形態では、Ｘは、ＯＣＨ_３である。さらに別の実施形態では、Ｘは、ハロである。

式（Ｉ）の特定の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、２’－フルオロ置換基を含まない。

式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、Ｏ^－である。別の実施形態では、Ｙは、ＯＨである。さらに別の実施形態では、Ｙは、ＯＲである。さらに別の実施形態では、Ｙは、ＮＨ^－である。一実施形態では、Ｙは、ＮＨ_２である。別の実施形態では、Ｙは、Ｓ^－である。さらに別の実施形態では、Ｙは、ＳＨである。

式（Ｉ）の一実施形態では、Ｚは、Ｏである。別の実施形態では、Ｚは、ＣＨ_２である。

一実施形態では、修飾されたサブユニット間連結は、アンチセンス鎖の１位～２位に挿入される。別の実施形態では、修飾されたサブユニット間連結は、アンチセンス鎖の６位～７位に挿入される。さらに別の実施形態では、修飾されたサブユニット間連結は、アンチセンス鎖の１０位～１１位に挿入される。さらに別の実施形態では、修飾されたサブユニット間連結は、アンチセンス鎖の１９位～２０位に挿入される。一実施形態では、修飾されたサブユニット間連結は、アンチセンス鎖の５位～６位及び１８位～１９位に挿入される。

式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の例示的な実施形態では、Ｃは、Ｏ^－である。別の実施形態では、Ｃは、ＯＨである。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＯＲ^１である。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＮＨ^－である。一実施形態では、Ｃは、ＮＨ_２である。別の実施形態では、Ｃは、Ｓ^－である。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＳＨである。

式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の例示的な実施形態では、Ａは、Ｏである。別の実施形態では、Ａは、ＣＨ_２である。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＯＲ^１である。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＮＨ^－である。一実施形態では、Ｃは、ＮＨ_２である。別の実施形態では、Ｃは、Ｓ^－である。さらに別の実施形態では、Ｃは、ＳＨである。

式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の特定の実施形態では、任意に修飾されたヌクレオシドは、アデノシンである。式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の別の実施形態では、任意に修飾されたヌクレオシドは、グアノシンである。式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の別の実施形態では、任意に修飾されたヌクレオシドは、シチジンである。式（ＶＩＩＩ）の修飾ｓｉＲＮＡ連結の別の実施形態では、任意に修飾されたヌクレオシドは、ウリジンである。

修飾されたｓｉＲＮＡ連結の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１～２位に挿入される。別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の６～７位に挿入される。さらなる別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１０～１１位に挿入される。さらに別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１９～２０位に挿入される。一実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の５位～６位及び１８位～１９位に挿入される。

式（Ｉ）の特定の実施形態では、塩基対部分Ｂは、アデニンである。式（Ｉ）の特定の実施形態では、塩基対部分Ｂは、グアニンである。式（Ｉ）の特定の実施形態では、塩基対部分Ｂは、シトシンである。式（Ｉ）の特定の実施形態では、塩基対部分Ｂは、ウラシルである。

式（Ｉ）の一実施形態では、Ｗは、Ｏである。式（Ｉ）の一実施形態では、Ｗは、ＣＨ_２である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｗは、ＣＨである。

式（Ｉ）の実施形態では、Ｘは、ＯＨである。式（Ｉ）の実施形態では、Ｘは、ＯＣＨ_３である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｘは、ハロである。

式（Ｉ）の例示的な実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、２’－フルオロ置換基を含まない。

式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、Ｏ^－である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、ＯＨである。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、ＯＲである。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、ＮＨ^－である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、ＮＨ_２である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、Ｓ^－である。式（Ｉ）の実施形態では、Ｙは、ＳＨである。

式（Ｉ）の実施形態では、Ｚは、Ｏである。式（Ｉ）の一実施形態では、Ｚは、ＣＨ_２である。

式（Ｉ）の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１～２位に挿入される。式（Ｉ）の別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の６～７位に挿入される。式（Ｉ）のさらなる別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１０～１１位に挿入される。式（Ｉ）のさらなる別の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の１９～２０位に挿入される。式（Ｉ）の実施形態では、連結は、アンチセンス鎖の５位～６位及び１８位～１９位に挿入される。

修飾されたサブユニット間連結は、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／８２４，１３６（２０１９年３月２６日に出願）、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／８２６，４５４（２０１９年３月２９日に出願）、及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／８６４，７９２（２０１９年６月２１日に出願）でさらに説明され、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる。

コンジュゲートされた機能部分
他の実施形態では、ＲＮＡサイレンシング剤は、１つ以上の機能部分で修飾され得る。機能部分は、ＲＮＡサイレンシング剤に１つ以上の追加の活性を付与する分子である。特定の実施形態では、機能部分は、標的細胞（例えば神経細胞）による細胞取り込みを向上させる。従って、本発明は、他の部分（例えば、ペプチド等の非核酸部分）または有機化合物（例えば、染料）等に対して、（例えば、その５’及び／または３’末端において）コンジュゲートされているまたはコンジュゲートされていないＲＮＡサイレンシング剤を含む。コンジュゲーションは、例えば、本技術で知られている方法、以下の方法を用いて、達成することができる。Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．：４７（１），９９－１１２（２００１）（ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）ナノ粒子に付加された核酸について記載）、Ｆａｔｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ５３（１－３）：１３７－４３（１９９８）（ナノ粒子に結合した核酸について記載）、Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．５ Ｓｕｐｐｌ．４：５５－８（１９９４）（インターカレーション剤、疎水性基、ポリカチオンまたはＰＡＣＡナノ粒子と連結した核酸について記載）、及びＧｏｄａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２（２）：４０４－１０（１９９５）（ナノ粒子に連結した核酸について記載）。

特定の実施形態では、機能部分は、疎水性部分である。特定の実施形態では、疎水性部分は、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド及びヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ならびにビタミンからなる群から選択される。特定の実施形態では、ステロイドは、コレステロール及びリトコール酸（ＬＣＡ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、脂肪酸は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びドコサン酸（ＤＣＡ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、ビタミンは、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、及びそれらの誘導体、またはそれらの代謝物からなる群から選択される。特定の実施形態では、ビタミンは、レチノイン酸及びコハク酸アルファ－トコフェロールからなる群から選択される。

特定の実施形態では、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、親油性部分にコンジュゲートされる。１つの実施形態では、親油性部分は、カチオン基を含むリガンドである。別の実施形態では、親油性部分は、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖に付着している。例示的な実施形態では、親油性部分は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の一端に付着している。別の例示的な実施形態では、親油性部分は、センス鎖の３’末端に付着している。特定の実施形態では、親油性部分は、コレステロール、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＡ、葉酸、カチオン色素（例えば、Ｃｙ３）からなる群から選択される。例示的な実施形態では、親油性部分は、コレステロールである。他の親油性部分としては、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが挙げられる。

特定の実施形態では、機能部分は、例えばエンドサイトーシス依存性機序または非依存性機序による、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織または細胞型へのターゲティング、または細胞透過性を改善するために、ＲＮＡサイレンシング剤に繋留された１つ以上のリガンドを含んでもよい。リガンド及び関連する修飾は、配列の特異性を高め、その結果、オフサイトターゲティングを減少させることもできる。繋留因子リガンドは、インターカレーターとして機能できる１つ以上の修飾塩基または糖を含むことができる。これらは、ＲＮＡサイレンシング剤／標的二重鎖のバルジ内等の内部領域内に位置することもできる。インターカレーターは、芳香族、例えば、多環式芳香族または複素環式芳香族化合物であり得る。多環式インターカレーターは、スタッキング能力を有し得、２つ、３つ、または４つの縮合環を有する系を含むことができる。本明細書に記載のユニバーサル塩基は、リガンドに含めることができる。一実施形態では、リガンドは、標的核酸の切断による標的遺伝子の阻害に寄与する切断基を含むことができる。切断基は、例えば、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシン－Ａ５、ブレオマイシン－Ａ２、またはブレオマイシン－Ｂ２）、ピレン、フェナントロリン（例えば、Ｏ－フェナントロリン）、ポリアミン、トリペプチド（例えば、ｌｙｓ－ｔｙｒ－ｌｙｓトリペプチド）、または金属イオンキレート基であり得る。金属イオンキレート基としては、例えば、Ｌｕ（ＩＩＩ）またはＥＵ（ＩＩＩ）大環状錯体、Ｚｎ（ＩＩ）２，９－ジメチルフェナントロリン誘導体、Ｃｕ（ＩＩ）テルピリジン、またはアクリジンを挙げることができ、これらは、Ｌｕ（ＩＩＩ）等の遊離金属イオンによるバルジ部位での標的ＲＮＡの選択的切断を促進することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリガンドは、例えばバルジ領域で、標的ＲＮＡの切断を促進するためにＲＮＡサイレンシング剤に繋留することができる。例えば、１，８－ジメチル－１，３，６，８，１０，１３－ヘキサアザシクロテトラデカン（サイクラム）は、標的ＲＮＡ切断を促進するために（例えば、アミノ酸誘導体によって）ペプチドにコンジュゲートすることができる。繋留リガンドは、アミノグリコシドリガンドであり得、これは、ＲＮＡサイレンシング剤に改善されたハイブリダイゼーション特性または改善された配列特異性を持たせることができる。例示的なアミノグリコシドとしては、グリコシル化ポリリジン、ガラクトシル化ポリリジン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡ、及びアミノグリコシドのアクリジンコンジュゲート、例えば、Ｎｅｏ－Ｎ－アクリジン、Ｎｅｏ－Ｓ－アクリジン、Ｎｅｏ－Ｃ－アクリジン、Ｔｏｂｒａ－Ｎ－アクリジン、及びＫａｎａＡ－Ｎ－アクリジンが挙げられる。アクリジン類似体の使用により、配列の特異性を高めることができる。例えば、ネオマイシンＢは、ＤＮＡと比較して、ＲＮＡに対して高い親和性を有するが、配列特異性は低くなる。アクリジン類似体であるネオ－５－アクリジンは、ＨＩＶ Ｒｅｖ－応答エレメント（ＲＲＥ）に対する親和性が高くなる。いくつかの実施形態では、アミノグリコシドリガンドのグアニジン類似体（グアニジノグリコシド）は、ＲＮＡサイレンシング剤に繋留されている。グアニジノグリコシド内では、アミノ酸上のアミン基がグアニジン基に交換されている。グアニジン類似体が付着することにより、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞透過性が増大し得る。繋留リガンドは、オリゴヌクレオチド剤の細胞取り込みを増大することができるポリアルギニンペプチド、ペプトイドまたはペプチド模倣体であり得る。

例示的なリガンドは、直接、または介在繋留因子を介して間接的に、リガンドコンジュゲート担体にカップリングされる。特定の実施形態では、カップリングは、共有結合を介する。特定の実施形態では、リガンドは、介在繋留因子を介して担体に付着している。特定の実施形態では、リガンドにより、それが組み込まれるＲＮＡサイレンシング剤の分布、標的化または寿命が変化する。特定の実施形態では、リガンドは、そのようなリガンドが存在しない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞型、コンパートメント、例えば、細胞または器官コンパートメント、身体の組織、器官または領域に対して、例えば、より高い親和性を提供する。

例示的なリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、及び特異性特性を改善することができ、結果として得られる天然のまたは修飾されたＲＮＡサイレンシング剤、または本明細書に記載のモノマーの任意の組み合わせを含むポリマー分子及び／または天然または修飾リボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性も改善し得る。リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増大するための治療修飾因子、例えば、分布を監視するための診断用化合物またはレポーター基、架橋剤、ヌクレアーゼ耐性付与部分、及び天然または異常な核酸塩基を含むことができる。一般的な例としては、親油性物質、脂質、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、及びペプチド模倣物が挙げられる。リガンドとしては、天然に存在する物質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、アミノ酸、または脂質を挙げることができる。リガンドはまた、組換え分子または合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）であるポリアミノ酸、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコール化）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファらせんペプチドが挙げられる。

リガンドはまた、腎臓細胞等の特定の細胞型に結合する標的基、例えば細胞または組織標的剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば抗体を挙げることができる。標的基はまた、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはその誘導体、Ｎ－アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。リガンドの他の例としては、色素、インターカレーション剤（例えば、アクリジン及び置換アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン）、ｌｙｓ－ｔｙｒ－ｌｙｓトリペプチド、アミノグリコシド、グアニジウムアミノグリコジ（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｄｉｅｓ）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール（及びそのチオ類似体）、コール酸、コラン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール（例えば、エステル（例えば、モノ、ビス、またはトリス脂肪酸エステル、例えば、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２、Ｃ_１３、Ｃ_１４、Ｃ_１５、Ｃ_１６、Ｃ_１７、Ｃ_１８、Ｃ_１９またはＣ_２０脂肪酸）及びそのエーテル、例えば、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２、Ｃ_１３、Ｃ_１４、Ｃ_１５、Ｃ_１６、Ｃ_１７、Ｃ_１８、Ｃ_１９、またはＣ_２０アルキル、例えば、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、１，３－ビス－Ｏ（オクタデシル）グリセロール）、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸（例えば、ジステアリン酸グリセリル）、オレイン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）及びペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ナプロキセン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ^３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰが挙げられる。特定の実施形態では、リガンドは、ＧａｌＮＡｃまたはその誘導体である。

リガンドは、糖タンパク質等のタンパク質、またはコリガンドに対して特異的親和性を有する分子等のペプチド、またはがん細胞、内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体等の抗体であり得る。リガンドとしては、ホルモン及びホルモン受容体を挙げることもできる。それらはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースを含むことができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのアクチベーター、またはＮＦ－ｋＢのアクチベーターであり得る。

リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することにより、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、及び／または中間フィラメントを破壊することにより、細胞へのＲＮＡサイレンシング剤の取り込みを増加させることができる物質、例えば薬物であり得る。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ、ラトランキュリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することにより、細胞へのＲＮＡサイレンシング剤の取り込みを増加させることができる。そのような効果を有する例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ□）、インターロイキン－１ベータ、またはガンマインターフェロンが挙げられる。１つの態様では、リガンドは、脂質または脂質系分子である。かかる脂質または脂質系分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合することができる。ＨＳＡ結合リガンドでは、標的組織、例えば身体の非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布が可能になる。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含めた肝臓であり得る。ＨＳＡに結合することができる他の分子もまたリガンドとして使用することができる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）コンジュゲートの耐分解性を向上させること、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増加させること、及び／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調節するために使用することができる。脂質系リガンドは、コンジュゲートの標的組織への結合を調節、例えば、制御するために使用することができる。例えば、より強固にＨＳＡに結合する脂質または脂質系リガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、それ故、体内から排出される可能性が低い。ＨＳＡにあまり強固に結合しない脂質または脂質系リガンドは、コンジュゲートを腎臓に標的化するために使用することができる。特定の実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡに結合する。脂質系リガンドは、コンジュゲートが腎臓以外の組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡに結合することができる。しかし、ＨＳＡ－リガンド結合を逆転させることができないほど親和性は強くないことが企図される。別の実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、全く結合しないため、本コンジュゲートは、腎臓に分布する。脂質系リガンドの代わりに、またはそれに加えて、腎臓細胞を標的とする他の部分もまた使用することができる。

別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖性細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、望ましくない細胞増殖、例えば、悪性または非悪性型の、例えば、がん細胞を特徴とする障害の治療に特に有用であり得る。代表的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫが挙げられる。他のビタミンの例としては、ビタミンＢ、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または他のビタミンもしくはがん細胞によって取り込まれる栄養素が挙げられる。同様に含まれるのは、ＨＳＡ及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）である。

別の態様では、リガンドは、らせん細胞透過剤等の細胞透過剤である。特定の実施形態では、該薬剤は、両親媒性である。例示的な薬剤は、ｔａｔまたはａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ等のペプチドである。該薬剤がペプチドの場合、それはペプチジル模倣、逆転異性体、非ペプチドまたはシュードペプチド結合、及びＤ－アミノ酸の使用を含め、修飾されていてもよい。らせん剤は、親油性相及び疎油性相を有し得るアルファらせん剤であり得る。

リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）とは、天然のペプチドと同様の一定の三次元構造に折りたたむことが可能な分子である。オリゴヌクレオチド剤へのペプチド及びペプチド模倣体の付着は、細胞の認識及び吸収を向上させること等によって、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態分布に影響を与えることができる。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド、または架橋ペプチドであり得る。ペプチド部分は、Ｌ－ペプチドまたはＤ－ペプチドであり得る。別の代替では、ペプチド部分は、疎水性膜トランスロケーション配列（ＭＴＳ）を含むことができる。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージ提示ライブラリ、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリから同定されたペプチド等のランダムなＤＮＡ配列によってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２－８４，１９９１）。例示的な実施形態では、組み込まれたモノマーユニットを介してＲＮＡサイレンシング剤に繋留されたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤミミック等の細胞標的ペプチドである。あるペプチド部分は、長さが約５アミノ酸から約４０アミノ酸に及び得る。ペプチド部分は、例えば、安定性を向上させるまたは配座性を指示する等の構造修飾を有することができる。以下に記載される構造修飾のいずれかを使用することができる。

特定の実施形態では、機能部分は、本開示のＲＮＡサイレンシング剤の５’末端及び／または３’末端に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、本開示のＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖の５’末端及び／または３’末端に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、本開示のＲＮＡサイレンシング剤のセンス鎖の５’末端及び／または３’末端に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、本開示のＲＮＡサイレンシング剤のセンス鎖の３’末端に連結されている。

特定の実施形態では、機能部分は、リンカーによってＲＮＡサイレンシング剤に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、リンカーにより、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖に連結されている。特定の実施形態では、機能部分は、リンカーにより、センス鎖の３’末端に連結されている。特定の実施形態では、リンカーは、二価または三価のリンカーを含む。特定の実施形態では、リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、アミド、カルバメート、またはそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、二価または三価のリンカーは、以下から選択される：

式中、ｎは、１、２、３、４または５である。

特定の実施形態では、リンカーは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体をさらに含む。特定の実施形態では、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体は、以下からなる群から選択される：

本開示の様々な機能部分及びそれらをＲＮＡサイレンシング剤にコンジュゲートするための手段は、ＷＯ２０１７／０３０９７３Ａ１及びＷＯ２０１８／０３１９３３Ａ２にさらに詳細に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。

材料及び方法
オリゴヌクレオチドの合成

ＭｅｒＭａｄｅ１２合成装置を使用して、標準的なプロトコルに従ってオリゴヌクレオチドを合成した。ＤＣＡコンジュゲートセンス鎖は、カスタム合成されたＤＣＡ官能化コントロールドポアグラス（ＣＰＧ）支持体上で１０μモルスケールで合成した（Ｂｉｓｃａｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，４７，１０８２－１０９６）。アンチセンス鎖は、Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ（登録商標）（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）で官能化したＣＰＧ上で１０μモルスケールで合成した。すべてのホスホルアミダイトは、０．１５Ｍの乾燥アセトニトリル溶液として調製し、活性化剤として０．２５Ｍの５－（ベンジルチオ）－１Ｈテトラゾール（ＢＴＴ）を含むアセトニトリルを２５０秒間使用してカップリングさせた。トリチル基を、３％ジクロロ酢酸を含むジクロロメタンを８０秒間使用して除去した。成長するオリゴヌクレオチド鎖の未反応の５つのヒドロキシルを、１６％Ｎメチルイミダゾールを含むテトラヒドロフラン（ＣＡＰ Ｂ）及び８０：１０：１０（ｖ／ｖ／ｖ）テトラヒドロフラン：無水酢酸：２，６－ルチジン（ＣＡＰ Ａ）で１５秒間キャップした。０．１Ｍの３－［（ジメチルアミノメチレン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＤＤＴＴ）のアセトニトリル溶液を用いて３分間硫化を行った。０．０２Ｍのヨウ素を含むテトラヒドロフラン：ピリジン：水（７０：２０：１０、ｖ／ｖ／ｖ）で８０秒間酸化を行った。

オリゴヌクレオチドの脱保護及び精製

センス鎖を切断し、４０％メチルアミン水溶液を使用して４５℃で１時間またはアンモニア－メチルアミン（ＡＭＡ）を使用して室温で２時間脱保護した。アンチセンス鎖は、最初に（Ｅ）－ビニルホスホネート脱保護のため、ブロモトリメチルシラン：ピリジン（３：２、ｖ／ｖ）のジクロロメタン（５ｍｌ）溶液で脱保護し、その後切断し、４０％メチルアミン水溶液で４５℃にて１時間またはＡＭＡで室温にて２時間脱保護した。真空下（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）終夜乾燥した後、得られたオリゴヌクレオチドペレットを水に懸濁し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｓｔａｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して精製した。センス鎖を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＨｘＳｉｌ Ｃ１８カラムにて、酢酸ナトリウムの連続勾配で、すなわち、９０％緩衝液Ａ１（５０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む５％アセトニトリル）及び１０％緩衝液Ｂ１（アセトニトリル）から１０％緩衝液Ａ１及び９０％緩衝液Ｂ１まで、流速３０ｍｌ／分で６０℃にて１８分間精製した。アンチセンス鎖は、イオン交換カラム（ＧＥ Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ ｍｅｄｉａ）にて、過塩素酸ナトリウムの連続勾配、すなわち、１００％緩衝液Ａ２（１０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む２０％アセトニトリル）から６０％緩衝液Ａ２及び４０％緩衝液Ｂ２（１Ｍの過塩素酸ナトリウムを含む２０％アセトニトリル）まで、流速３０ｍｌ／分で６０℃にて３０分間精製した。精製したオリゴヌクレオチドを、サイズ排除クロマトグラフィーで脱塩し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５３０精密質量Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）での液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）で特性化した。

コンジュゲートされたｓｉＲＮＡのマウスへの注射

動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ、プロトコル番号Ａ－２４１１）の動物管理倫理承認及びガイドラインに従って行った。６～７週齢のメスのＦＶＢ／ＮＪマウス（１群あたりｎ＝５）に、ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）、非標的化対照（Ｎｔｃ）ｓｉＲＮＡ（２０ｍｇ／ｋｇ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を皮下注射した。

ペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションアッセイ

注射後１週間で、組織中のｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の量を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ハイブリダイゼーションアッセイを記載の通り（３７、３８）に用いて測定した。簡潔には、組織（１５ｍｇ）を、０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む３００μｌのＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ組織溶解溶液（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）中で溶解した。ドデシル硫酸ナトリウムを、２０μｌの３Ｍ塩化カリウムを添加することによって溶解物から沈殿させ、５０００×ｇで１５分間遠心分離することによってペレット化した。透明な上清中のＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡを、アンチセンス鎖に完全に相補的なＣｙ３標識ＰＮＡプローブ（ＰＮＡＢｉｏ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）にハイブリダイズした。ＤＮＡＰａｃ ＰＡ１００陰イオン交換カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）によってサンプルを分析した。Ｃｙ３の蛍光を観察し、ピークを統合した。最終濃度を検量線を使用して確定した。

ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡサイレンシング実験

注射後１週間で組織を回収し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ）中に４℃で終夜保存した。ｍＲＮＡを次いでＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０アッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して定量化した。簡潔には、組織のパンチを、０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む３００μｌのＨｏｍｏｇｅｎｉｚｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）中で溶解した。Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（３９）に記載される通りに、希釈した溶解物及びプローブのセット（マウスＨｔｔ、マウスＰｐｉｂ、またはマウスＨｐｒｔ）をｂＤＮＡ捕捉プレートに加え、シグナルを増幅し、検出した。発光をＴｅｃａｎ Ｍ１０００（Ｔｅｃａｎ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ，ＵＳＡ）で検出した。

統計分析

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．１．２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してデータを分析した。マウスでの独立した実験ごとに、サイレンシングのレベルをＰＢＳ対照群の平均値に対して正規化した。データは、多重比較のためのダネット検定によるノンパラメトリック一元配置分散分析を使用して分析し、有意性をＰＢＳ対照と比較して計算した。２群間の比較にはｔ検定を使用した。

実施例１：ホスホロチオエートで修飾された２－または５－ｎｔオーバーハングがｓｉＲＮＡの組織蓄積及びサイレンシング効果に与える影響。

ｓｉＲＮＡの化学構造の設計。

５～７個の核酸塩基のオーバーハングを有する非対称ｓｉＲＮＡ（１５、３３～３５）、２つの核酸塩基のオーバーハングを有する従来型のｓｉＲＮＡ（１７、４０）、平滑化合物（４１）、及びＤｉｃｅｒ基質（４２、４３）を含めた多種多様なｓｉＲＮＡ構造が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで活性であることが示されている。しかしながら、これらの構造が、ｓｉＲＮＡの肝外分布及び有効性に与える影響は、体系的には特定されていない。

ｓｉＲＮＡの構造が分布及び有効性に与える影響を評価するために、３つの異なるｓｉＲＮＡ足場を選択した（図２Ａ）。すべての化合物について、末端ＰＳ連結を安定化した交互の２－Ｏメチル及び２－フルオロ修飾パターンを使用した（１８、２１～２２）。さらに、アンチセンス鎖を、ＲＩＳＣによる認識を促進し（２３、２４）、ホスファターゼ及びエキソヌクレアーゼに対する安定性を提供する（２５、２６）ために、アンチセンス鎖の５－リン酸を模倣する５－（Ｅ）－ビニルホスホネート（Ｅ－ＶＰ）基で修飾した。広範囲の組織、すなわち、肝臓、心臓、肺、脂肪、筋肉、副腎及び脾臓（１３、１４）における広範な分布及びサイレンシングを支持するために、ドコサン酸（ＤＣＡ）コンジュゲートをセンス鎖の３末端に、２つのチミジン間の２つのホスホジエステル結合（ｄＴ－ＰＯリンカー）を介して取り付けた（７、４４～４５）。最終的に、３つのｓｉＲＮＡバリアントはすべて、９つのＰＳ修飾を含む同じ２０塩基のアンチセンス鎖の化学構造を有していた。

ｓｉＲＮＡ足場の唯一の変化は、センス鎖の長さであり、これが一本鎖ＰＳオーバーハングの長さを決定した。具体的には、１５塩基のセンス鎖を使用して、５ヌクレオチド（ｎｔ）のＰＳオーバーハング（非対称ｓｉＲＮＡ）を有する化合物、１８塩基のセンス鎖を使用して、２－ｎｔのＰＳオーバーハング（従来型ｓｉＲＮＡ）を生成し、及び２０塩基のセンス鎖を使用して、０－ｎｔのＰＳオーバーハング（平滑ｓｉＲＮＡ）を生成した（図２Ａ）。

ｓｉＲＮＡの構造は、化合物の組織蓄積に影響を与えない。

ｓｉＲＮＡの構造が組織分布に与える影響を評価するために、マウスにこれら３つの異なるｓｉＲＮＡ足場の１つを単回皮下（ＳＣ）注射を介して注射した（２０ｍｇ／ｋｇ）。注射後１週間で、ＰＮＡハイブリダイゼーションアッセイ（３７、３８）を使用して、組織におけるアンチセンス鎖の蓄積を測定した。この試験では、ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡのサイレンシングが以前に観察された組織（１３）に焦点を当てたため、肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、筋肉及び脂肪を選択した。すべてのｓｉＲＮＡ足場について、２つのｓｉＲＮＡ配列、すなわち、ハンチンチン（Ｈｔｔ）（４６）及びシクロフィリンＢ（Ｐｐｉｂ）（４７）を使用して、ｓｉＲＮＡの核酸塩基組成が分布プロファイル与える相対的な影響を評価した。

２つの配列間で一次及び二次組織蓄積プロファイルに有意差は観察されず（図２Ｂ）、核酸塩基組成がＤＣＡを介した組織分布に大きな影響を与えないことが示された。非コンジュゲート化合物（１３）とは対照的に、ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡは、定量的に保持され（注射用量のほぼ１００％）、広範囲の組織に分布し、肝臓で最も高い蓄積が観察された。驚くべきことに、ＰＳオーバーハングの長さは、脂肪を除いて、肝外組織にわたってＤＣＡが媒介する分布に有意な影響を与えなかった（図２Ｂ及びＣ）が、脂肪では、平滑（０－ｎｔオーバーハング）ｓｉＲＮＡは、非対称（５－ｎｔオーバーハング）及び従来型ｓｉＲＮＡ（２－ｎｔオーバーハング）化合物より有意に多く（２倍、Ｐ＜０．０５）蓄積した（図２Ｃ）。これらの知見は、組織への蓄積が主にコンジュゲートにより促進され、ｓｉＲＮＡの配列及び構造からの寄与は最小限であることを示唆している。

ｓｉＲＮＡの構造は有効性に大きく影響する。

同様のレベルの組織蓄積が、ｓｉＲＮＡの構造ごとに同様のサイレンシング効果につながるかどうかを評価するために、マウスに単回用量（１群あたりｎ＝５～６、２０ｍｇ／ｋｇ）のＨｔｔ（４６）またはＰｐｉｂ（４７）のいずれかを標的とする各ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡバリアントをＳＣ注射した。どちらの標的も検証済みのｓｉＲＮＡ配列が利用可能であり、幅広い組織で様々なレベル（Ｈｔｔ低、Ｐｐｉｂ高）で発現される。対照マウスは、非標的化対照（Ｎｔｃ）ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳのいずれかで処理した。注射後１週間で、肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、副腎、筋肉及び脂肪において、Ｈｔｔ、Ｐｐｉｂ及びＨｐｒｔ（ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ハウスキーピング遺伝子）のｍＲＮＡレベルの測定を行った。図３は、各組織における各化合物のサイレンシング効果を示す（ＰＢＳと比較、一元配置分散分析）。次に、図３Ｄのヒートマップに示すように、異なる足場間でサイレンシングに統計的に有意な差があるかどうかを判断した。Ｎｔｃは、標的遺伝子発現に有意な減少を示さず、観察されたサイレンシングが配列特異的効果によるものであることが示された（図３）。全体として、ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡの機能的有効性は、ＨｔｔとＰｐｉｂ間で類似した。両標的について、ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡは、肝臓で最大７０％ならびに心臓、副腎、筋肉及び脂肪で最大５０～６０％のサイレンシングを可能にした。しかしながら、サイレンシングの正確な程度は、調べた２つの標的間でわずかに異なった。これは、細胞型固有の発現及び各ｍＲＮＡの核保持の程度の違いによるものと思われる。

すべての足場は、肝臓で有意なサイレンシングを示した（約５０～７０％）。これは、この組織への蓄積が多いためであると思われる（図３Ａ－Ｃ）。驚くべきことに、肝外蓄積の程度はすべてのｓｉＲＮＡ足場で類似している（図２Ｂ）にもかかわらず、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ構造が肝外遺伝子サイレンシングに与える重大な影響を観察した。平滑構造の場合、サイレンシング効果は、脂肪組織で最も高く（図３Ｃ）、その蓄積の向上と相関した（図２Ｂ）。しかしながら、平滑ｓｉＲＮＡは、他の肝外組織（６つのうち）の２つ（Ｈｔｔを標的とする場合、肺と心臓、Ｐｐｉｂを標的とする場合、心臓と副腎）のみで統計的に有意なサイレンシングを達成した（図３Ｃ）。脂肪を除くと、平滑ｓｉＲＮＡは、肝外組織で３６％の最大サイレンシングを示したのみであり、非対称（６１％の最大サイレンシング）及び従来型（５５％の最大サイレンシング）ｓｉＲＮＡのものよりはるかに低かった（それぞれ、図３Ａ及び３Ｂ）。実際、非対称ｓｉＲＮＡは、Ｈｔｔを標的とする場合の６つの肝外組織（腎臓、脾臓、肺、心臓、副腎及び筋肉）ならびにＰｐｉｂを標的とする場合の５つの組織（腎臓、脾臓、肺、副腎及び筋肉）において、平滑構造と比較して、有意に良好なサイレンシング（１１～５９％のサイレンシングの増加）を示した（図４）。従来型のｓｉＲＮＡは、脾臓、心臓、副腎及び筋肉（Ｈｔｔを標的とする場合）、ならびに腎臓、脾臓、副腎及び筋肉（Ｐｐｉｂを標的とする場合、図４）において、平滑ｓｉＲＮＡよりも高いサイレンシングを達成した（１２～３８％のサイレンシングの増加）。

非対称ｓｉＲＮＡは、全体的に最高の肝外効果を示し、すべての組織でサイレンシングが観察された（１１～６１％で異なる）（図３Ａ）。従来型のｓｉＲＮＡはわずかに低い（がほとんど同等の）活性を示し、８組織中７組織でサイレンシングが観察された（１７～５５％で異なる）（図３Ｂ）。非対称のｓｉＲＮＡは、４つの肝外組織（Ｈｔｔを標的とする場合）、及び２つの肝外組織（Ｐｐｉｂを標的とする場合、図３Ｄ）で従来型のｓｉＲＮＡと比較してわずかに効力が高かった。ｓｉＲＮＡの組織蓄積と有効性を相関させた場合（図４Ａ）、平滑に対して、非対称及び従来型のｓｉＲＮＡで観察されたサイレンシングの向上は、蓄積の変化とは関係がないことがすぐに明らかになる。一般に、Ｐｐｉｂを標的とするｓｉＲＮＡは、Ｈｔｔを標的とする化合物よりもすべての組織及びすべての構造でわずかに多く蓄積したが、有効性の相対的な向上は２つの標的間で一貫したままであった。図４Ｂは、平滑ｓｉＲＮＡと比較した非対称ｓｉＲＮＡ（左のパネル）及び従来型のｓｉＲＮＡ（右のパネル）のサイレンシングと蓄積の変化を示す。分析されたすべての組織及び標的が同じグラフにプロットされている。この可視化ツールは、大部分の組織においてオーバーハングを含む化合物の活性の全体的な増加を明確に示す（最大マイナス５０～６０％）（図４Ｂ）。

まとめると、これらの結果により、ＰＳオーバーハングの存在（長さではなく）が、おそらくは内在化メカニズム及び／またはエンドソーム脱出の程度に影響を与えることによって、活性を有意に高めることが示唆される。

実施例２：全ホスホロチオエート含有量がｓｉＲＮＡの組織蓄積及びサイレンシング効果に与える影響。

ＰＳ含有量は、従来型のｓｉＲＮＡの中で、ｓｉＲＮＡの分布プロファイルに影響を与える。

ＡＳＯの場合、ＰＳ修飾が相対的な肝臓／腎臓分布を決める。完全なＰＳ ＡＳＯは、血清タンパク質との結合が強いため、優先的に肝臓に分布する。ＡＳＯのＰＳ含有量を減らすと、血清の結合親和性が低下し、蓄積が腎臓近位上皮にシフトし、これにより、クリアランスの過程でＡＳＯの一部が保持される（２１、４８～４９）。ＰＳ修飾の程度がｓｉＲＮＡの肝外分布に影響を与えるかどうかを判断するために、本発明者らは、従来型（２－ｎｔオーバーハング）及び平滑（０－ｎｔオーバーハング）ｓｉＲＮＡ構造の中で、ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡの分布プロファイルを８つの末端ＰＳ修飾（各末端に２つ、「低ＰＳ」）及び１３のＰＳ修飾（「高ＰＳ」）で比較した（図５Ａ）。アンチセンス鎖の蓄積レベルを、ＨｔｔまたはＰｐｉｂのいずれかを標的とするＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡのＳＣ注射の１週間後に、肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、筋肉及び脂肪で測定した（図５Ｂ）。

平滑ＤＣＡコンジュゲートｓｉＲＮＡの中では、ＰＳ含有量の変化が組織分布プロファイルに与える影響は最小限であった（図５）。しかしながら、従来型のｓｉＲＮＡでは、ＰＳ含有量の変化は、組織蓄積に有意に影響を与えた。具体的には、低ＰＳ化合物は、ほとんどの組織でより低い蓄積を示し、肝臓では、約３～３．５倍、腎臓では、約１．５～３倍、脾臓では、約２～４倍、肺では約２倍、心臓及び筋肉では、約０～２倍ならびに脂肪では、約０～３倍であった（図５Ｃ）。これらの観察結果は、一部には、従来型のｓｉＲＮＡにおいて、「高ＰＳ」オーバーハングと比較して「低ＰＳ」オーバーハングの安定性が低いことによって説明され得る。まとめると、これらの結果により、ＰＳ修飾がｓｉＲＮＡの分解を防ぎ、クリアランス速度を変更することにより、組織におけるｓｉＲＮＡの蓄積及び保持を促進する可能性が高いことが示唆される。

高ＰＳ含有量は、ｓｉＲＮＡ活性にマイナスの影響を与える。

蓄積がサイレンシングと相関するかどうかを評価するために、Ｈｔｔ及びＰｐｉｂを標的とする低ＰＳ及び高ＰＳの平滑及び従来型のｓｉＲＮＡ足場を注入した後、標的ｍＲＮＡレベルを組織で測定した。各組織における各化合物のサイレンシング効率（ＰＢＳと比較、一元配置分散分析）を図６に示す。驚くべきことに、高ＰＳの従来型ｓｉＲＮＡで観察された組織蓄積の向上にもかかわらず、ＰＳ含有量の増加は活性に対して全体的にマイナスの影響を与える（図６）。従来型のｓｉＲＮＡでは、高ＰＳ化合物によって脂肪及び脾臓のサイレンシングがわずかに増加した（それぞれ、１５及び３０％）が、Ｐｐｉｂを標的とするｍＲＮＡでは観察されず、Ｈｔｔを標的とするｍＲＮＡでのみ観察された。逆に、肝臓では、ＰＳ含有量の増加が有効性に与える明確なマイナスの影響及び蓄積との逆相関が観察され得る（図６Ａ）。高ＰＳ化合物による蓄積の約３倍の増加（高ＰＳのｓｉＲＮＡでは５２～６５ｐｍｏｌ／ｍｇに対して低ＰＳのｓｉＲＮＡでは１４～２９ｐｍｏｌ／ｍｇ、図５）にもかかわらず、観察された肝臓のサイレンシングのレベルは、Ｈｔｔで７３から４７％に減少し（Ｐ＜０．０１）、Ｐｐｉｂでは２２から１１％に減少した（Ｐ＜０．０１）（図６Ａ）。ｓｉＲＮＡの組織蓄積と有効性を相関させた場合（図７Ａ）、特筆すべきは、従来型のｓｉＲＮＡ（ピンク及び赤のドット、図７Ａ）では、高ＰＳのバリアントが低ＰＳのｓｉＲＮＡと比較して１４組織中１２組織でより多く蓄積しても、高ＰＳ化合物は、１４組織中２組織（Ｈｔｔを標的とする場合の脂肪及び脾臓）でのみで統計的に有意に優れたサイレンシングを誘導したことである（図６Ａ及び７Ｂ）。まとめると、これらの結果により、ＰＳ含有量の増加は、従来型のｓｉＲＮＡの安定性を高めて組織蓄積を増加させるが、観察された機能活性に重大なマイナスの影響を与えることが示唆される。ＰＳ含有量の増加がサイレンシングに与えるマイナスの影響は、平滑ｓｉＲＮＡの中ではでさらに顕著であった。実際、低ＰＳの平滑ｓｉＲＮＡは、８つの組織のうちの５つにおいて、両方の標的に関して、それらの高ＰＳ対応物よりも優れたサイレンシング（１７～３０％のサイレンシングの増加）を誘導した（図６Ｂ）。この効果は副腎で特に顕著であり、高ＰＳのｓｉＲＮＡは、サイレンシングを最小限にしかまたは全く誘導せず、低ＰＳ化合物はＨｔｔとＰｐｉｂの両方の発現に５５％超の減少を示した。ｓｉＲＮＡの組織蓄積と有効性の相関関係により、平滑構造（明紫色の点と暗紫色の点、図７Ａ）の場合、ＰＳの数は蓄積レベルに有意な影響を与えなかったが、活性には影響を与え、低ＰＳのｓｉＲＮＡ（明紫色の点、図７Ａ）は、高ＰＳ化合物（暗紫色の点、図７Ａ）よりも良好なサイレンシングを誘導したことが明確に示される。高ＰＳのｓｉＲＮＡ（図７Ｂ、右のパネル）の標的ｍＲＮＡレベルと低ＰＳ化合物の標的ｍＲＮＡレベルの差（すべての組織及び標的が同じグラフにプロットされている）は、大部分の組織に関して正の残存ｍＲＮＡ発現（最大でプラス５０％）となり、低ＰＳのｓｉＲＮＡは、高ＰＳのバリアントよりも強力であることが示される。これらの結果により、同様の安定性及び分布の平滑ｓｉＲＮＡの場合、多数のＰＳ修飾が細胞内のタンパク質結合を変化させ、ｓｉＲＮＡ輸送、エンドソーム脱出、及び機能的サイレンシングの程度に影響を与える可能性があることが示唆される（２７～２９、５０）。

実施例３：コンジュゲートリンカーの化学組成がｓｉＲＮＡの組織蓄積及びサイレンシング効果に与える影響。

様々なリンカー、すなわち、例えば、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）（１５）、ジスルフィド（５１）及び炭素鎖（１３）がコンジュゲートされたｓｉＲＮＡ及びＡＳＯに使用されている。さらに、コンジュゲートとオリゴヌクレオチド間への切断可能なホスホジエステル結合の導入により、コレステロールコンジュゲートＡＳＯの肝臓サイレンシングが改善されることが示されている（３６）。しかしながら、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡリンカーの化学がｉｎ ｖｉｖｏでの肝外活性及び分布に与える影響の体系的な評価は行われていない。これまでに記載したすべての実験（図１～７）では、ｓｉＲＮＡは、２つのチミジン間の２つのホスホジエステル結合（ｄＴ－ＰＯ）を介してＤＣＡコンジュゲートに接続されていた。

このホスホジエステルＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの安定性は限られており、初期の組織分布を支持するのには十分であるが、細胞に取り込まれると迅速に分解される（５２）。リンカーの安定性がＤＣＡ－ｓｉＲＮＡの組織蓄積に与える影響を評価するために、非対称（５－ｎｔオーバーハング）、従来型（２－ｎｔオーバーハング）及び平滑（０－ｎｔオーバーハング）ｓｉＲＮＡを、切断可能なｄＴ－ＰＯリンカーまたは安定炭素（Ｓｔ）リンカーのいずれかで合成した（図８Ａ）。

リンカーの性質は、いずれのｓｉＲＮＡ化学構造の組織分布及び蓄積プロファイルにも有意な影響を与えず（図８Ｂ及びＣ）、ｄＴ－ＰＯが、ＤＣＡによる分布の促進を可能にするのに十分な血清安定性を有することが示された。対照的に、リンカーの化学組成は、組織のサイレンシングレベルに大きな影響を与えた（図９）。具体的には、切断可能なリンカーの存在により、Ｈｔｔ ｍＲＮＡのサイレンシングは、脾臓（２３％、Ｐ＜０．００１）、心臓（１４％、Ｐ＜０．００１）、副腎（２１％、Ｐ＜０．００１）及び脂肪（２１％、Ｐ＜０．１）で有意に改善され、Ｐｐｉｂ ｍＲＮＡのサイレンシングは、肝臓（２４％、Ｐ＜０．０１）、腎臓（２０％、Ｐ＜０．１）、肺（２２％、Ｐ＜０．１）、心臓（２５％、Ｐ＜０．０００１）及び脂肪（１４％、Ｐ＜０．１）で有意に改善された（図９）。ｓｉＲＮＡの組織蓄積と有効性の相関関係（図１０Ａ）により、リンカーの性質（ｄＴ－ＰＯ対Ｓｔ）は、ｓｉＲＮＡの組織分布に大きな影響を与えなかった（ｘ軸、図１０Ａ）が、効果には劇的な影響を与えた（ｙ軸、図１０Ａ）ことが明確に示される。ＤＣＡ ｄＴ－ＰＯ連結ｓｉＲＮＡは、両方の標的に関して及びすべての組織において、ＤＣＡ Ｓｔ連結化合物よりも良好にサイレンシングを誘導した（サイレンシングが両方の化合物で類似していたＰｐｉｂを標的とする場合の脾臓を除く）。ＤＣＡ ｄＴ－ＰＯ ｓｉＲＮＡとＤＣＡ Ｓｔ化合物の標的ｍＲＮＡレベルの差により、大部分の組織及び両標的に関して残存ｍＲＮＡ発現がマイナスになり（最大－３０％）（図１０Ｂ）、ｄＴ－ＰＯリンカーの存在がｓｉＲＮＡの効果を高めたことが示される。これらの結果により、ｄＴ－ＰＯのような切断可能なリンカーの使用が組織のサイレンシングを促進することが示唆される。

考察

様々な化学物質へのオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションにより、バイオアベイラビリティ、組織曝露、及び場合によっては細胞型特異的送達の調節が可能になる（７～８、１１、５３）。最近、完全に化学的に安定化されたＧａｌＮＡｃ ｓｉＲＮＡであるＧｉｖｏｓｉｒａｎが承認されたことは、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡが遺伝病を治療する大きな可能性を実証する（５４）。三価のＧａｌＮＡｃは、肝細胞への特異的な送達を可能にする（１～３、５５）が、脂質のコンジュゲーションは、肝臓以外の様々な組織への機能的送達を可能にする（１３、１４）。オリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティ、組織分布、クリアランスの速度及び安全性に影響を与える親油性コンジュゲート（１０、１３～１４、３７、５６－５７）の中で、本発明者らは、ＤＣＡを、幅広い肝外分布を支持するコンジュゲートとして特定した（１３、１４）。しかしながら、肝外組織におけるＤＣＡ－ｓｉＲＮＡの蓄積及びサイレンシングの程度は、肝臓におけるＧａｌＮＡｃコンジュゲートで一般的に観察されるものよりも少ない。実際、肝臓は、ｓｉＲＮＡを含めた薬物を自然に蓄積する。これは、肝臓が高い血流量と中断された有窓上皮を備えた一次濾過組織であり（５８）、ひいてはあらゆる薬物の標的化にとって特有の非常に有利な組織を代表しているためである。化合物を他の組織に送達するには、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡをさらに最適化する必要がある。ここでは、本発明者らは、ｓｉＲＮＡの構造、化学組成、及びコンジュゲートの間の相互作用、ならびにそれが生産的な肝外サイレンシングにどのように影響するかを明らかにする。かかる知見は、これらのクラスの分子を将来の治療用途に使用する道を開く。ＰＳで修飾されたオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質結合及び細胞取り込みを高め（２８、３０）、ひいては、オリゴヌクレオチドの薬物動態／薬力学を決める主な要因である（２１、４８、５９）。しかし、ＰＳ修飾が加えられる構造的状況（例えば、一本鎖と二本鎖、コンジュゲートの性質）の影響は、ＰＳが誘導するタンパク質相互作用に影響を与える可能性がある（６０）。ＤＣＡコンジュゲートという状況では、本発明者らは、非対称及び従来型のｓｉＲＮＡにおける５－ｎｔまたは２－ｎｔ（それぞれ）のＰＳオーバーハングの存在は、組織蓄積プロファイルに測定可能な影響を与えないことを見出した。これは、高疎水性部分であるＤＣＡが、血清タンパク質に非常に強く結合する（１４）ため、ＰＳの相対的な寄与があまり重要でなくなるためであると考えられる（９～１０、１３～１４、５７）。全体的な組織蓄積に影響を与えていないにもかかわらず、ＰＳで修飾された一本鎖領域の存在は活性に影響を与えた。非対称ｓｉＲＮＡ（５－ｎｔオーバーハング）は、調べたすべての組織（１６のうち１６）で統計的に有意なサイレンシングを誘導したが、同一のガイド鎖を有する平滑ｓｉＲＮＡは組織の５０％でのみ活性であった。構造変化（非対称対平滑）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、選択された配列の活性に与えた影響は最小限であった（１５）が、ここで提示されたデータは、２つの標的のみに限定される。従って、他の標的配列、すなわち、平滑構造で最適に機能するように選択された配列が、異なる結果を生成し得る可能性がある。さらに、オーバーハングの存在は、ＰＡＺドメインの相互作用及びＲＩＳＣのローディングを向上させる可能性がある（６１～６３）が、これら２つの化学構造はｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が非常に似ている（１５）ため、この説明は考えにくい。これらの構造はほぼ同一の組織蓄積を示すため、観察された機能の違いは、ＰＳテールが細胞内局在化（２８）、輸送（２９）、及びオリゴヌクレオチド活性の律速段階である可能性があるエンドソーム脱出の程度（５８）に与える影響に起因する可能性が高い。興味深いことに、オーバーハングの長さは活性への影響が少なく、５－ｎｔオーバーハングは、２－ｎｔオーバーハングｓｉＲＮＡと比較して、約３０％の組織で若干良好なサイレンシングを誘導した。両ｓｉＲＮＡにおける一本鎖ＰＳ領域は、ＡＳＯの挙動を模倣するのに十分である可能性があり、ひいては、輸送を変更するとともに、効率的なサイレンシングを支持する（３２～３５）。まとめると、蓄積のレベルと機能的有効性の間にはずれがあり（以前に様々な脂質コンジュゲートｓｉＲＮＡで観察された（１３））、これにより、ｓｉＲＮＡの構造的状況とコンジュゲートの実体の両方が細胞内挙動に寄与し、累積的に活性に影響を与えることが示される。構造的状況に加えて、オリゴヌクレオチドにおけるＰＳ修飾の程度は、それらが安定性（６４）、血清タンパク質結合（２１、３１、４８～４９）、細胞受容体結合（６５）、細胞輸送（２８）及び核局在化（２７～２９）に与える影響に影響を与え得る。結果として生じるＰＳ含有量がＡＳＯの分布及び有効性に与える影響は周知であるが、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡの肝外分布に対する影響は不明確である。ここで、本発明者らは、ＰＳ含有量が減少すると、おそらくは一本鎖オーバーハングの安定性の低下に起因して、非対称ｓｉＲＮＡ及び従来型のｓｉＲＮＡの組織蓄積が減少することを見出した。平滑化合物の蓄積は、これらの化合物（ＰＳオーバーハングなし）がコンジュゲートのみに依存して組織蓄積を決めるために影響を受けなかった。驚くべきことに、ＰＳ含有量の増加は、すべての構造的状況であるが、特に平滑化合物のサイレンシングにマイナスの影響を与えた。高ＰＳ含有量のｓｉＲＮＡは、細胞内でタンパク質との結合が強すぎる可能性、または多種多様なタンパク質と結合する可能性があり、これにより、輸送、エンドソーム脱出が変更される可能性及びＲＩＳＣローディングに利用可能な化合物の割合が減少する可能性がある（２８～２９、５０）。正確なメカニズムはさらに調査する必要があるが、本発明者らの結果は、ＰＳ含有量の不要な増加が有害である可能性があることを示唆している。従って、特定のバランスのホスホジエステル及びホスホロチオエート（ＰＯ／ＰＳ）含有量の最適化は、脂質コンジュゲートｓｉＲＮＡが肝外組織で最大のサイレンシングを達成するために重要である。実際に、トリシクロＤＮＡ ＡＳＯ（デュシェンヌ型筋ジストロフィーモデルにおいて）に関する（６６）、及び中枢神経系におけるオリゴヌクレオチドに関するＰＯ／ＰＳ含有量の最適化はすでに行われており、今や最適な有効性、安定性、安全性を達成するために広く使用されている戦略である（６７）。肝外遺伝子サイレンシングを改善するための別の戦略は、ＰＳ部分を、ｓｉＲＮＡを安定化し、細胞タンパク質結合を低減し、ＲＩＳＣによって認識されてＲＮＡｉを誘導する能力を維持する他の化学物質に置き換えることである。

これまで、コンジュゲートされたｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性に対するリンカー化学の相対的な寄与は、一部には、リンカーが多くの場合、化学構造の不活性部分と見なされているため、ほとんど知られていなかった。しかしながら、本発明者らの知見により、ＤＣＡ－ｓｉＲＮＡの中では、切断可能なリンカー（ｄｔ－ＰＯ）の使用が、サイレンシングの程度に大きな影響を与えたことが実証される。本発明者らは以前、ｄＴ－ＰＯが切断可能なリンカーの最も単純な合成バリアントであること、ならびにモノｄＴ及びｒＵリンカーと比較して、最適な範囲の安定性を有することを発見した（未発表データ）。実際、ｄＴ－ＰＯ（切断可能）及び安定炭素（非切断可能）リンカーのＤＣＡ ｓｉＲＮＡは、同様の組織蓄積プロファイルを示し、ｄＴ－ＰＯが化合物クリアランスの初期段階で血清中で十分に安定していることが確認された。しかしながら、ｄＴ－ＰＯは、おそらくは細胞内でのその切断によるｓｉＲＮＡのエンドソーム脱出の向上に起因して、いくつかの組織で活性を大幅に増加させた。切断可能なリンカーがエンドソーム脱出及び有効性に与える正の影響は、コレステロールコンジュゲートＡＳＯ（約３５％の活性の増加）（３６）、及び肝臓でのｓｉＲＮＡ活性を阻害するために使用されるＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯ（Ｒｅｖｅｒｓｉｒ）（６８）で観察されている。Ｉｎｃｌｉｓｉｒａｎ等の他の臨床ＧａｌＮＡｃ化合物は、切断可能なリンカーを有さず、高活性であるが、切断可能なリンカーの使用は、脂質コンジュゲートｓｉＲＮＡの中では、機能的に重要である可能性が高い。例えば、エンドサイトーシスを介した内在化（３０）後、脂質コンジュゲートは特に膜結合しやすく、ｓｉＲＮＡのサイトゾル放出を制限する可能性がある。切断可能なリンカーは、この問題を克服するのに役立ち得る。全体として、ｄＴ－ＰＯは合成が容易で、特別な前駆体を必要とせず、無毒性であり、生分解性であるが、さらなる研究により、ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性に対する多様なリンカー化学をより体系的に評価する必要がある。

本発明者らの知見は、化学構造を最適化することの重要性を強調しているが、肝外効果に影響を与える可能性のある多くの他の修飾がｓｉＲＮＡに存在する。例えば、本発明者らは、交互の２－Ｏ－メチル及び２－フルオロの化学修飾パターン（Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．によって最初に記載された）を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでのコンジュゲート媒介ｓｉＲＮＡ送達を可能にした（１８）。この修飾パターンは全体的に非常に効率的であるが、Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．は、ＡＳＯ内の２－フルオロ修飾が細胞内のタンパク質結合を増加させ、サイレンシングの減少とＡＳＯ毒性の増加をもたらすことを実証した（６９、７０）。従って、この修飾パターンをさらに最適化すると、ｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの効力及び効果の持続時間に大きな影響を与える可能性があり（１７）、ひいては、肝外サイレンシングの向上のための考慮に値する。現在、ここに記載する最適化された設計の交互の２－Ｏ－メチル及び２－フルオロ化合物が、より多くの２－ＯＭｅリッチｓｉＲＮＡに適用できるかどうかを評価するために、さらなる研究が進行中である。

要約すると、本発明者らのデータにより、オリゴヌクレオチドの化学的足場及び構造が、ｓｉＲＮＡの肝外活性を最適化するために考慮すべき主な要因であることが明確に示される。構造の非対称性（例えば、５－または２－ｎｔオーバーハング対平滑末端）及びリンカー化学（切断可能対非切断可能）を変更する操作戦略を使用して、腎臓、脾臓、心臓、肺、筋肉及び副腎におけるｓｉＲＮＡ活性を組織分布に影響を与えることなく微調整することができる。さらに、ＰＳ対ＰＯ含有量を慎重にバランスさせる操作戦略を使用して、組織の機能的有効性を損なうことなくｓｉＲＮＡの安定性を最適化することができる。全体として、オーバーハング、切断可能なリンカー、及び最小限のＰＳ含有量を備えたｓｉＲＮＡの設計（図１１）は、肝外サイレンシングの向上を支持するはずである。本発明者らの知見は、最適な治療プロファイルを備えたコンジュゲートされたｓｉＲＮＡの将来の設計を導くであろう。

参考文献
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１７．Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｈａｉｋｈ，Ｓ．，Ｔｒａｐｐ，Ｃ．，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．，Ｑｉａｎ，Ｋ．，Ｓｅｈｇａｌ，Ａ．，Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．，Ｊａｄｈａｖ，Ｖ．，Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｍｐｒｏｖｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ＧａｌＮＡｃ－ｓｉＲＮＡ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２６，７０８－７１７．

１８．Ａｌｌｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｉｏｕｆｉ，Ｎ．，Ｊａｒｒｅｓ，Ｒ．，Ｐｒａｋａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｎａｉｋ，Ｎ．，Ｂｅｒｄｅｊａ，Ａ．，Ｗａｎｄｅｒｓ，Ｌ．，Ｇｒｉｆｆｅｙ，Ｒ．Ｈ．，Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．ａｎｄ Ｂｈａｔ，Ｂ．（２００５）Ｆｕｌｌｙ ２ －ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４８，９０１－９０４．

１９．Ｎａｌｌａｇａｔｌａ，Ｓ．Ｒ．ａｎｄ Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ，Ｐ．Ｃ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＰＫＲ ｉｎ ａｎ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍａｎｎｅｒ．ＲＮＡ，１４，１２０１－１２１３．

２０．Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，Ｂｕｒｃｈａｒｄ，Ｊ．，Ｌｅａｋｅ，Ｄ．，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ａ．，Ｓｃｈｅｌｔｅｒ，Ｊ．，Ｇｕｏ，Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｉｍ，Ｌ．，Ｋａｒｐｉｌｏｗ，Ｊ．，Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ ｒｅｄｕｃｅｓ “ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ” ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．ＲＮＡ，１２，１１９７－１２０５．

２１．Ｇｅａｒｙ，Ｒ．Ｓ．，Ｎｏｒｒｉｓ，Ｄ．，Ｙｕ，Ｒ．ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃ．Ｆ．（２０１５）Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，８７，４６－５１．

２２．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ＲＮＡ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｖｉｅｗ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，８４，８４１－８４８．

２３．Ｍａ，Ｊ．Ｂ．，Ｙｕａｎ，Ｙ．Ｒ．，Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ｇ．，Ｐｅｉ，Ｙ．，Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．（２００５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ５ －ｅｎｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｂｙ ｔｈｅ Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ Ｐｉｗｉ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ，４３４，６６６－６７０．

２４．Ｆｒａｎｋ，Ｆ．，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ Ｎａｇａｒ，Ｂ．（２０１０）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ５ －ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂａｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｂｙ ｈｕｍａｎ ＡＧＯ２．Ｎａｔｕｒｅ，４６５，８１８－８２２．

２５．Ｈａｒａｓｚｔｉ，Ｒ．Ａ．，Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｃｏｌｅｓ，Ａ．Ｈ．，Ｔｕｒａｎｏｖ，Ａ．Ａ．，Ａｌｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｄ．，Ｇｏｄｉｎｈｏ，Ｂ．Ｍ．，Ａｒｏｎｉｎ，Ｎ．ａｎｄ Ｋｈｖｏｒｏｖａ，Ａ．（２０１７）５ －Ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｉｓｓｕｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４５，７５８１－７５９２．

２６．Ｐａｒｍａｒ，Ｒ．，Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．Ｌ．Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｂ．，Ｔｈｅｉｌｅ，Ｃ．Ｓ．，Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．，Ａｋｉｎｃ，Ａ．，Ｇｕｉｄｒｙ，Ｅ．，Ｐｅｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）５ －（Ｅ）－Ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ： ａ ｓｔａｂｌｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｉｍｉｃ ｃａｎ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ＲＮＡｉ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，１７，９８７－９８９．

２７．Ｓｈｅｎ，Ｗ．，Ｄｅ Ｈｏｙｏｓ，Ｃ．，Ｍｉｇａｗａ，Ｍ．，Ｖｉｃｋｅｒｓ，Ｔ．，Ｓｕｎ，Ｈ．，Ｌｏｗ，Ａ．，Ｂｅｌｌ，Ｔ．，Ｒａｈｄａｒ，Ｍ．，Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｓ．，Ｈａｒｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＳ－ＡＳＯ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｅｘ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３７，６４０－６５０．

２８．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｖｉｃｋｅｒｓ，Ｔ．Ａ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ．ａｎｄ Ｌｉａｎｇ，Ｘ．－Ｈ．（２０１７）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，２３０－２３７．

２９．Ｌｉａｎｇ，Ｘ．Ｈ．，Ｓｕｎ，Ｈ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ．ａｎｄ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．（２０１５）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，４３，２９２７－２９４５．

３０．Ｌｙ，Ｓ．，Ｎａｖａｒｏｌｉ，Ｄ．Ｍ．，Ｄｉｄｉｏｔ，Ｍ．Ｃ．，Ｃａｒｄｉａ，Ｊ．，Ｐａｎｄａｒｉｎａｔｈａｎ，Ｌ．，Ａｌｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｆｏｇａｒｔｙ，Ｋ．，Ｓｔａｎｄｌｅｙ，Ｃ．，Ｌｉｆｓｈｉｔｚ，Ｌ．Ｍ．，Ｂｅｌｌｖｅ，Ｋ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ－ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，４５，１５－２５．

３１．Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ａ．，Ｋａｎｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ＤｅＤｉｏｎｉｓｉｏ，Ｌ．，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，Ｏ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｘ．ａｎｄ Ｎｅｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｉ．（１９９４）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２６８０１－２６８０５．

３２．Ｃｈｕ，Ｃ．－Ｙ．ａｎｄ Ｒａｎａ，Ｔ．Ｍ．（２００８）Ｐｏｔｅｎｔ ＲＮＡｉ ｂｙ ｓｈｏｒｔ ＲＮＡ ｔｒｉｇｇｅｒｓ．ＲＮＡ，１４，１７１４－１７１９．

３３．Ｓｕｎ，Ｘ．，Ｒｏｇｏｆｆ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌｉ，Ｃ．Ｊ．（２００８）Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｍｅｄｉａｔｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６，１３７９－１３８２．

３４．Ｃｈａｎｇ，Ｃ．，Ｙｏｏ，Ｊ．Ｗ．，Ｈｏｎｇ，Ｓ．Ｗ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｅ．，Ｋａｎｇ，Ｈ．Ｓ．，Ｓｕｎ，Ｘ．，Ｒｏｇｏｆｆ，Ｈ．Ａ．，Ｂａｎ，Ｃ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｌｉ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｈｏｒｔｅｒ－ｄｕｐｌｅｘ ｓｉＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｒｉｇｇｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１７，７２５－７３２．

３５．Ｂｙｒｎｅ，Ｍ．，Ｔｚｅｋｏｖ，Ｒ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ａ．，Ｃａｒｄｉａ，Ｊ．，Ｆｏｒｄ，Ｇ．，Ｈｏｌｔｏｎ，Ｋ．，Ｐａｎｄａｒｉｎａｔｈａｎ，Ｌ．，Ｌａｐｉｅｒｒｅ，Ｊ．，Ｓｔａｎｎｅｙ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｏｖｅｌ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＲＮＡｉ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ （ｓｄ－ｒｘＲＮＡ）ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｒｏｂｕｓｔ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｔｈｅ ｅｙｅ．Ｊ Ｏｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２９，８５５－８６４．

３６．Ｗａｄａ，Ｓ．，Ｙａｓｕｈａｒａ，Ｈ．，Ｗａｄａ，Ｆ．，Ｓａｗａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｗａｋｉ，Ｒ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｈａｒａｄａ－Ｓｈｉｂ ａｎｄ Ｏｂｉｋ，Ｓ．（２０１６）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｎｋｅｒｓ ｏｎ ｈｅｐａｔｉｃ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｓ，ｃｅｌｌ ｔｒｏｐｉｓｍ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２２６，５７－６５．

３７．Ｇｏｄｉｎｈｏ，Ｂ．Ｍ．Ｄ．Ｃ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｈａｒａｓｚｔｉ，Ｒ．Ａ．，Ｃｏｌｅｓ，Ａ．Ｈ．，Ｂｉｓｃａｎｓ，Ａ．，Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｎｉｋａｎ，Ｍ．，Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｄ．，Ｈａｓｓｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｋｈｖｏｒｏｖａ，Ａ．（２０１７）Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｕｐｏｎ ｓｅｒｉａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｉｃｒｏｓａｍｐｌｉｎｇ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．，２７，３２３－３３４．

３８．Ｒｏｅｈｌ，Ｉ．，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｅｉｆｆｅｒｔ，Ｓ．（２０１１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．米国特許第ＵＳ２０１１０２０１００６Ａ１号、１－９．

３９．Ｃｏｌｅｓ，Ａ．Ｈ．，Ｏｓｂｏｒｎ，Ｍ．Ｆ．，Ａｌｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｔｕｒａｎｏｖ，Ａ．Ａ．，Ｇｏｄｉｎｈｏ，Ｂ．Ｍ．，Ｋｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｌ．，Ｃｈａｓｅ，Ｋ．，Ａｒｏｎｉｎ，Ｎ．ａｎｄ Ｋｈｖｏｒｏｖａ，Ａ．（２０１６）Ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．，２６，８６－９２．

４０．Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．ａｎｄ Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００１）ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ２１－ ａｎｄ ２２－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＲＮＡｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８－２００．

４１．Ｃｚａｕｄｅｒｎａ，Ｆ．，Ｆｅｃｈｔｎｅｒ，Ｍ．，Ｄａｍｅｓ，Ｓ．，Ａｙｇ¨ ｕｎ，Ｈ．，Ｋｌｉｐｐｅｌ，Ａ．，Ｐｒｏｎｋ，Ｇ．Ｊ．，Ｇｉｅｓｅ，Ｋ．ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｊ．（２００３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｓｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｉＲＮＡｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３１，２７０５－２７１６．

４２．Ｋｕｂｏ，Ｔ．，Ｚｈｅｌｅｖ，Ｚ．，Ｏｈｂａ，Ｈ．ａｎｄ Ｂａｋａｌｏｖａ，Ｒ．（２００７）Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ２７－ｎｔ ｄｓＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ＲＮＡｉ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１７，４４５－４６４．

４３．Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ，Ｍ．ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．（２００８）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｄｉｃｅｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （Ｄ－ｓｉＲＮＡ）ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４４２，３－１０．

４４．Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｄ．Ｖ．，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｋ．，Ｓｈａｗ，Ｌ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｋ．，Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ａ．，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂ．，ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，Ｊ．Ａ．，Ｖａｒｇｅｅｓｅ，Ｃ．，Ｂｏｗｍａｎ，Ｋ．，Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４１，１３４９－１３５６．

４５．Ｈａｒｂｏｒｔ，Ｊ．，Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ，Ｋ．，Ｈ．，Ｍ．，Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．ａｎｄ Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２００３）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ａｎｄ ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１３，８３－１０５．

４６．Ａｌｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｈａｌｌ，Ｌ．Ｍ．，Ｃｏｌｅｓ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｓｓｌｅｒ，Ｍ．Ｒ．，Ｄｉｄｉｏｔ，Ｍ．－Ｃ．，Ｃｈａｓｅ，Ｋ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｓｏｔｔｏｓａｎｔｉ，Ｅ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．，Ｓａｐｐ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡｓ ｓｉｌｅｎｃｅ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｍＲＮＡ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，４，ｅ２６６．

４７．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ａ．，Ｌｅａｋｅ，Ｄ．，Ｂｏｅｓｅ，Ｑ．，Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｗ．Ｓ．ａｎｄ Ｋｈｖｏｒｏｖａ，Ａ．（２００４）Ｒａｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２，３２６－３３０．

４８．Ｏｂｅｒｂａｕｅｒ，Ｒ．，Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒ，Ｇ．Ｆ．ａｎｄ Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．Ｗ．（１９９５）Ｒｅｎａｌ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ａｎ １８－ｍｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，４８，１２２６－１２３２．

４９．Ｇｅａｒｙ，Ｒ．Ｓ．（２００９）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，５，３８１－３９１．

５０．Ｖｉｃｋｅｒｓ，Ｔ．Ａ．ａｎｄ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．（２０１６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＢＲＥＴ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１１，ｅ０１６１９３０．

５１．Ａｍｍａｌａ，Ｃ．，Ｄｒｕｒｙ，Ｗ．，Ｋｎｅｒｒ，Ｌ．，Ａｈｌｓｔｅｄｔ，Ｉ．，Ｓｔｉｌｌｅｍａｒｋ－Ｂｉｌｌｔｏｎ，Ｐ．，Ｗｅｎｎｂｅｒｇ－Ｈｕｌｄｔ，Ｃ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｅ．，Ｖａｌｅｕｒ，Ｅ．，Ｊａｎｓｓｏｎ－Ｌｏｆｍａｒｋ，Ｒ．，Ｊａｎｚ´ ｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｂ－ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ．Ａｄｖ．，４，ｅａａｔ３３８６．

５２．Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ，Ｅ．（１９８６）Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｘｔｒａｃｔｓ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１３，９７－１０２．

５３．Ｔｕｒａｎｏｖ，Ａ．Ａ．，Ｌｏ，Ａ．，Ｈａｓｓｌｅｒ，Ｍ．Ｒ．，Ｍａｋｒｉｓ，Ａ．，Ａｓｈａｒ－Ｐａｔｅｌ，Ａ．，Ａｌｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｃｏｌｅｓ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｒａｓｚｔｉ，Ｒ．Ａ．，Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｇｏｄｉｎｈｏ，Ｂ．Ｍ．Ｄ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＲＮＡｉ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｓＦＬＴ１ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６ １１６４－１１７３

５４．Ａｋｉｎｃ，Ａ．，Ｍａｉｅｒ，Ｍ．，Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．，Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．，Ｂａｒｒｏｓ，Ｓ．，Ａｎｓｅｌｌ，Ｓ．，Ｄｕ，Ｘ．，Ｈｏｐｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｔｈｅ Ｏｎｐａｔｔｒｏ ｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇｓ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，１０８４－１０８７．

５５．Ｓｅｔｔｅｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ Ｈａｎ，Ｓ．Ｐ．（２０１９）Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＲＮＡｉ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，１８，４２１－４４６．

５６．Ｂｉｓｃａｎｓ，Ａ．，Ｃｏｌｅｓ，Ａ．，Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｄ．ａｎｄ Ｋｈｖｏｒｏｖａ，Ａ．（２０１９）Ｔｈｅ ｖａｌｅｎｃｙ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｍｐａｃｔｓ ｓｉＲＮＡ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，３０２，１１６－１２５．

５７．Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ａ．Ｅ．，Ｇａｕｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｂｅｒｄｅｊａ，Ａ．，Ｇｕｐｔａ，Ｒ．，Ｊｏ，Ｍ．，Ｐｒａｋａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｏｅｓｔｅｒｇａａｒｄ，Ｍ．，Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｐ．Ｐ．（２０２０）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，４８，４３８２－４３９５．

５８．Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．（２０１７）Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，２２２－２２９．

５９．Ｂｅｈｌｋｅ，Ｍ．Ａ．（２００８）Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉＲＮＡｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｅ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１８，３０５－３２０．

６０．Ｇａｕｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｇｕｐｔａ，Ｒ．，Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ａ．Ｅ．，Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｐ．Ｐ．（２０１９）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，４７，１１１０－１１２２．

６１．Ｅｇｌｉ，Ｍ．ａｎｄ Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．（２０１９）Ｒｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，５２，１０３６－１０４７．

６２．Ａｌａｇｉａ，Ａ．，Ｊｏｒｇｅ，Ａ．Ｆ．，Ａｖｉｎｏ，Ａ．，Ｃｏｖａ，Ｔ．Ｆ．Ｇ．Ｇ．，Ｃｒｅｈｕｅｔ，Ｒ．，Ｇｒｉｊａｌｖｏ，Ｓ．，Ｐａｉｓ，Ａ．Ａ．Ｃ．Ｃ．ａｎｄ Ｅｒｉｔｊａ，Ｒ．（２０１８）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ＰＡＺ／３ －ｏｖｅｒｈａｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｓｉＲＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｔｕｄｙ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，９，２０７４－２０８６．

６３．Ｍａ，Ｊ．Ｂ．，Ｙｅ，Ｋ．ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．（２００４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒｏｖｅｒｈａｎｇ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＰＡＺ ｄｏｍａｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ，４２９，３１８－３２２．

６４．Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｓｕｂａｓｉｎｇｈｅ，Ｃ．，Ｓｈｉｎｏｚｕｋａ，Ｋ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．（１９８８）Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１６，３２０９－３２２１．

６５．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｔａｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．，Ｄｏｎｎｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｐｒａｋａｓｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｐ．Ｐ．（２０１８）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．，２８，１１９－１２７．

６６．Ｅｃｈｅｖａｒｒｉａ，Ｌ．，Ａｕｐｙ，Ｐ．，Ｒｅｌｉｚａｎｉ，Ｋ．，Ｂｅｓｔｅｔｔｉ，Ｔ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｇ．，Ｂｌａｎｄｅｌ，Ｆ．，Ｋｏｍｉｓａｒｓｋｉ，Ｍ．，Ｈａｅｂｅｒｌｉ，Ａ．，Ｓｖｉｎａｒｔｃｈｏｕｋ，Ｆ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ Ｔｒｉｃｙｃｌｏ－ＤＮＡ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ａ ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．，２９，１４８－１６０．

６７．Ｓｃｈｏｃｈ，Ｋ．Ｍ．ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ｍ．（２０１７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎｅｕｒｏｎ，９４，１０５６－１０７０．

６８．Ｚｌａｔｅｖ，Ｉ．，Ｃａｓｔｏｒｅｎｏ，Ａ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｑｉｎ，Ｊ．，Ｗａｌｄｒｏｎ，Ｓ．，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｍ．Ｋ．，Ｄｅｇａｏｎｋａｒ，Ｒ．，Ｓｈｕｌｇａ－Ｍｏｒｓｋａｙａ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｈ．，Ｇｕｐｔａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｓｉＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，５０９－５１１．

６９．Ｓｈｅｎ，Ｗ．，Ｄｅ Ｈｏｙｏｓ，Ｃ．，Ｓｕｎ，Ｈ．，Ｖｉｃｋｅｒｓ，Ｔ．，Ｌｉａｎｇ，Ｘ．ａｎｄ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．（２０１８）Ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ２ ｆｌｕｏｒｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ５－１０－５ ｇａｐｍｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ＤＢＨＳ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，４６，２２０４－２２１７．

７０．Ｓｈｅｎ，Ｗ．，Ｌｉａｎｇ，Ｘ．Ｈ．，Ｓｕｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．（２０１５）２ －Ｆｌｕｏｒｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃａｎ ｃａｕｓｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ５４ｎｒｂ ａｎｄ ＰＳＦ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，４３，４５６９－４５７８．

Claims (60)

1. 標的器官または組織における二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの標的ＲＮＡのサイレンシング効果を増大させる方法であって、前記ｄｓＲＮＡが、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む前記方法であり、
   （１）前記アンチセンス鎖は、少なくとも１６個の連続するヌクレオチド、５’末端、３’末端を含み、標的に対して相補性を有し、
   （２）前記センス鎖は、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、５’末端、３’末端を含み、標的と相同性を有し、
   （３）前記アンチセンス鎖の一部は、前記センス鎖の一部に相補的であり、
   （４）前記センス鎖の３’末端は、切断可能なリンカーを介して疎水性部分にコンジュゲートされ、
   （５）前記ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む前記方法であり、
   前記ｄｓＲＮＡは、切断可能なリンカーを欠くｄｓＲＮＡと比較して、標的器官または組織において増加したｉｎ ｖｉｖｏでの標的ＲＮＡのサイレンシング効果を含む、前記方法。
2. 前記ｄｓＲＮＡが、２ヌクレオチド～５ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ｄｓＲＮＡが、２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記ｄｓＲＮＡが、５ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
5. オーバーハングが、前記アンチセンスの３’末端に存在する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記アンチセンス鎖が、約１５ヌクレオチド～２５ヌクレオチド長を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記センス鎖が、約１５ヌクレオチド～２５ヌクレオチド長を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記アンチセンス鎖が、２０ヌクレオチド長である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記アンチセンス鎖が、２１ヌクレオチド長である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記アンチセンス鎖が、２２ヌクレオチド長である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記センス鎖が、１５ヌクレオチド長である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記センス鎖が、１６ヌクレオチド長である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記センス鎖が、１８ヌクレオチド長である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記センス鎖が、２０ヌクレオチド長である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
15. １５塩基対～２０塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. １５塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. １６塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
18. １８塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
19. ２０塩基対の二本鎖領域を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記アンチセンス鎖の３’末端から１～２位から１～７位のヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記センス鎖の３’末端から１～２位のヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記アンチセンス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記センス鎖の５’末端から１～２位のヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を介して互いに結合している、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記ｄｓＲＮＡが、約６～約１７個のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記ｄｓＲＮＡが、約８～約１３個のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記切断可能なリンカーが、ホスホジエステル連結、ジスルフィド連結、酸に不安定な連結、または光切断可能な連結を含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記切断可能なリンカーが、ホスホジエステルヌクレオチド間連結を有するｄＴｄＴジヌクレオチドを含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記酸に不安定な連結が、β－チオプロピオネート連結またはカルボキシジメチルマレイン酸無水物（ＣＤＭ）連結を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記疎水性部分が、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド及びヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ならびにビタミンからなる群から選択される、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記疎水性部分が、低密度リポタンパク質及び／または中密度リポタンパク質に対して親和性を有する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記疎水性部分が、３つ未満の二重結合を有する飽和または不飽和部分である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記疎水性部分が、高密度リポタンパク質に対して親和性を有する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記疎水性部分が、３つ以上の二重結合を有する多価不飽和部分である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記疎水性部分が、コレステロール及びリトコール酸（ＬＣＡ）からなる群から選択されるステロイドである、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記疎水性部分が、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びドコサン酸（ＤＣＡ）からなる群から選択される脂肪酸である、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記疎水性部分が、コリン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、及びそれらの誘導体、またはそれらの代謝物からなる群から選択されるビタミンである、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記ビタミンが、レチノイン酸及びコハク酸アルファ－トコフェロールからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
38. 前記切断可能なリンカーが、さらに、さらなる二価または三価のリンカーを含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 前記二価または三価のリンカーが、以下からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法：
    

    

    式中、ｎは、１、２、３、４、または５である。
40. 前記リンカーが三価リンカーである場合、前記リンカーは、さらに、ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体を連結する、請求項３８または３９に記載の方法。
41. 前記ホスホジエステルまたはホスホジエステル誘導体が、以下からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法：
    

    

    式中、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＢＨ_３である。
42. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基、またはそれらの混合物を含む、請求項４２に記載の方法。
44. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの式Ｉの修飾ヌクレオチド間連結を含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法：
    

    

    式中、
    Ｂは、塩基対部分であり、
    Ｗは、Ｏ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２、及びＣＨからなる群から選択され、
    Ｘは、ハロ、ヒドロキシ、及びＣ１－６アルコキシからなる群から選択され、
    Ｙは、Ｏ－、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨ－、ＮＨ２、Ｓ－、及びＳＨからなる群から選択され、
    Ｚは、Ｏ及びＣＨ２からなる群から選択され、
    Ｒは、保護基であり、
    

    

    は、任意的な二重結合である。
45. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも８０％化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記ｄｓＲＮＡが、完全に化学修飾されている、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。
48. 前記アンチセンス鎖が、少なくとも７０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。
49. 前記アンチセンス鎖が、約７０％～９０％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項４８に記載の方法。
50. 前記センス鎖が、少なくとも６５％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。
51. 前記センス鎖が、１００％の２’－Ｏ－メチルヌクレオチド修飾を含む、請求項５０に記載の方法。
52. 前記アンチセンス鎖が、５’ホスフェート、５’－アルキルホスホネート、５’アルキレンホスホネート、または５’アルケニルホスホネートを含む、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記アンチセンス鎖が、５’ビニルホスホネートを含む、請求項５２に記載の方法。
54. 前記アンチセンス鎖が、２’－メトキシ－リボヌクレオチド及び２’－フルオロ－リボヌクレオチドを交互に含む、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。
55. 前記アンチセンス鎖の５’末端から２位及び１４位のヌクレオチドが、２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない、請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法。
56. 前記標的器官または組織が、腎臓、脾臓、肺、心臓、骨格筋、副腎、及び脂肪からなる群から選択される、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。
57. 請求項１～５６のいずれか１項に記載の方法であって、
    （１）前記疎水性部分がＤＣＡであり、
    （２）前記切断可能なリンカーがｄＴｄＴジヌクレオチドであり、
    （３）前記標的器官または組織が、心臓及び骨格筋の一方または両方である、前記方法。
58. 前記ｄｓＲＮＡが、対象に投与される、請求項１～５６のいずれか１項に記載の方法。
59. 前記投与が、皮下に施される、請求項５８に記載の方法。
60. 前記投与が、静脈内に施される、請求項５８に記載の方法。

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