JP2023534210A - 組換え微生物 - Google Patents

Abstract

有機Ｃ１炭素源上で成長することができる代謝的に改変された微生物が本明細書に提供される。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２０年７月１４日に出願された米国仮出願第６３／０５１，６７２号に対する優先権を主張し、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

代謝的に改変された微生物およびそのような生物を生成する方法を提供する。

配列表の参照による組み込み
２０２１年７月１４日に作成され、１１０，９１３バイトのデータを有し、ＩＢＭ－ＰＣ、ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムにおいて機械フォーマットされた、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の配列表を本出願に添付する。配列表は、ここに、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

電子に富み、メタンまたはＣＯ２から誘導可能なメタノールは、微生物のための潜在的に再生可能な１炭素（Ｃ１）フィードストックである。メタノールを資化するためにメチロトローフによって使用されるリブロース一リン酸（ＲｕＭＰ）サイクルは、典型的な糖代謝とは３つの酵素のみが異なるが、非メチロトローフ生物を、高い細胞密度まで成長させる合成メチロトローフに転じることは困難である。

本開示は、単独炭素源としてメタノール上で成長し、約１２時間以下の倍加時間（ＴＤ）を有する、合成メチロトローフ（ＳＭ）を提供する。別の実施形態において、ＳＭは、約１．２Ｍ（例えば、約５０ｍＭ～約１．２Ｍ）のメタノール耐性を有する。一実施形態において、ＳＭは、メタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、ヘキスロース－６－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、３－ヘキスロース－６－リン酸イソメラーゼ（６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼと称される場合がある）活性を有するポリペプチドを発現し、ホスホグルコイソメラーゼ活性を有するポリペプチドの増加した活性を含み、ここで、ＳＭは、最高で約１．２Ｍ（例えば、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、または前述の値の任意の２つの間の値）のメタノール上で成長することができる。別のまたはさらなる実施形態において、ＳＭは、グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼＡポリペプチド、Ｓ－（ヒドロキシメチル）グルタチオンデヒドロゲナーゼＡポリペプチド、ホスホフルクトキナーゼポリペプチド、ヒスチジン含有タンパク質、および／またはｐｒｏＱポリペプチドの発現または活性の欠失または低減を含有する。また別のまたはさらなる実施形態において、ＳＭは、ｙｇｇＥからｙｇｈＯ、ｒｒｓＡからｒｒｌＢ、および／またはｙｇｉＧからｓｍｆの間の２～８５の領域の増加したコピー数多型を有する。さらにまた別のまたはさらなる実施形態において、ＳＭは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、ＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種からなる群から選択される親微生物を操作することによって得られる。さらなる実施形態において、親微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉである。また別のまたはさらなる実施形態において、ＳＭは、リボース－５－リン酸イソメラーゼＡをさらに発現する。別の実施形態において、ＳＭは、ＡＴＣＣ寄託受託番号の遺伝的構成を含む。

本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２６７８３を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＭ１と名付けられた合成メチロトローフを提供する。本開示は、受託番号ＰＴＡ－１２６７８３を有する微生物の後代および培養物をさらに提供する。

本開示は、代謝物を産生するための方法であって、メタノールを含む培地において前述の実施形態のいずれかのＳＭを成長させることを含み、それにより、代謝物が産生される、方法を提供する。さらなる実施形態において、代謝物は、４－炭素化学物質、二酸、３－炭素化学物質、高級カルボン酸、高級カルボン酸のアルコール、カロテノイド、イソプレノイド、カンナビノイド、およびポリヒドロキシアルカノエートからなる群から選択される。

本開示は、Ｃ１炭素源を資化し、Ｍｅｄｈ、Ｈｐｓ、Ｐｈｉ、Ｐｇｉ、ＲｐｉＡ、Ｔｋｔ、Ｔａｌ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される複数の酵素を含む、組換え微生物を提供する。一実施形態において、微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ種の親微生物を操作することによって得られる。さらなる実施形態において、組換え微生物は、ｐｆｋＡ、ｇａｐＡ、ｆｒｍＡ、ｐｔｓＨ、ｐｒｏＱ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子の低減またはノックアウトを含む。前述のいずれかのさらなる実施形態において、組換え微生物は、ゲノムの領域の増加したコピー数を含む。

本開示は、メタノールデヒドロゲナーゼ活性、ヘキスロース－６－リン酸シンターゼ活性、６－ホスホ－３－ヘキスロースイソメラーゼ活性、グルコースリン酸イソメラーゼ活性およびリボースリン酸イソメラーゼＡ活性を有するポリペプチドをコードする１つもしくは複数の異種ポリヌクレオチドを発現するか、または１つもしくは複数の異種ポリヌクレオチドを過剰発現し、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ活性の同時低減または消失、Ｓ－（ヒドロキシメチル）グルタチオンデヒドロゲナーゼ（ＦｒｍＡ）活性の低減または消失、ホスホキャリアタンパク質ＨＰｒ（ヒスチジン含有タンパク質、ＨＰｒおよび／またはＰｔｓＨとも称される）活性の低減または欠失、ならびにＰｒｏＱの低減または消失を提供する組換え微生物であって、メタノール上で成長する、組換え微生物を提供する。

本開示は、メタノール上で成長し、図１Ａの代謝経路を含む組換え微生物も提供する。

本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の記載に示される。他の特性、目的および利点は、記載および図面から、ならびに特許請求の範囲から明白であろう。

本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、本開示の１つまたは複数の実施形態を説明し、詳細な説明と一緒に、本発明の原理および実施を説明するのに役立つ。

図１Ａ～Ｂは、合成メチロトローフＥ．ｃｏｌｉ株の構築および進化を表す。（Ａ）合成メチロトローフＥ．ｃｏｌｉ ＳＭ１に関連する経路および変異。歯車のアイコンは、合理的に設計および操作された遺伝子改変を表す。黒塗りボックスは、上方調節されたか、または高コピー数遺伝子を示す一方で、破線ボックスは、ノックアウトまたは変異した遺伝子を表す。（Ｂ）合成メチロトローフの構築および進化のためのフローチャート。略号は表１において定義する。図８および表２も参照されたい。 特許請求の範囲に係る経路のアンサンブルモデリングのロバスト解析（ＥＭＲＡ）。ｘ軸は、特異的酵素活性の倍数変化を表す一方で、ｙ軸は、特異的撹乱酵素活性でロバストである１００パラメーターセットの比を指す。結果は、ｐｆｋ、ｇａｐＡ、ｐｇｋ、ｇｐｍＭ、ｅｎｏ、およびｐｙｋの高レベル発現が、動的トラップが理由の、系の安定性の問題を引き起こし得ることを示す。この結果は、Ｐｆｋおよび下部解糖系の酵素の高い活性が系に有害であり得ることを示す。Ｅ．ｃｏｌｉが元々高い解糖活性を持つと仮定すると、ｐｆｋＡは、ノックアウトされ、不安定な下部解糖系の最初の遺伝子であるｇａｐＡ遺伝子を、それを機能的ＢＬ２１ ｇａｐＣ遺伝子と置き換えることによってノックダウンした。 単独炭素源としてメタノール上で成長するＥ．ｃｏｌｉの進化の結果および検証。（Ａ）ＣＦＣ５２６．１～２０の進化の軌跡（図１Ｂにおけるステップｉｖ）。培地は、４００ｍＭでメタノールを保ちながら、ＭＯＰＳ中のアミノ酸混合物（ＨＤＡ）の割合を減少させて構成された。最後の継代（紫色の線）はメタノールのみであった（図１Ｂにおけるステップｖ）。太い実線は、培地におけるＨＤＡパーセンテージを表す。他の線は、異なる培地における培養物の成長曲線を表す。（Ｂ）硝酸塩を有するメタノールＭＯＰＳ（ＭＭ）培地における進化全体にわたるＣＦＣ６８０．１～２０の成長曲線。（Ｃ）硝酸塩なしのＭＭにおける連続接種を伴うＣＦＣ６８８．１～２０培養物の進化プロセスを示す成長曲線。（Ｄ）および（Ｅ）ＣＦＣ６８０．８からの酢酸およびギ酸の１３Ｃ標識パターン。赤色の線は、試料を表す一方で、黒色の線は、１３Ｃ標準を示す。図９も参照されたい。 図４Ａ～Ｄは、メチロトローフＥ．ｃｏｌｉ培養物において特定されたＤＮＡ－タンパク質架橋（ＤＰＣ）産物を示す。（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉが静止期でメタノール培地ＭＭにおいて継代培養された場合に見られる誘導期の延長。ＣＦＣ５２６．４０は、時点Ｉ～ＶＩから通過し、さまざまなタイムラグのレベルを示した。時点Ｖから出発すると、株が、メタノール中での成長のために重大な誘導期を経験したことに留意されたい。（Ｂ）フローサイトメトリーに基づく細胞生死判別試験。すべての細胞をＳＹＴＯ－９で染色する一方で、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のみが、細胞膜を透過することができる場合に死細胞を染色する。座標を、健康なＥ．ｃｏｌｉ細胞およびエタノール処理死細胞を含む対照試料によって定義した。（Ｃ）ＣＦＣ５２６．４１の異なる成長段階から抽出されたＤＰＣ産物、およびそれらの未架橋形態のＴＥＭ画像。（Ｄ）ＣＦＣ５２６．４１およびＣＦＣ６８０．２４からの未架橋ＤＰＣ試料からのタンパク質の定量的プロテオミクス解析。６試料のうち、ＣＦＣ５２６．４１＃２、ＣＦＣ６８０．２４＃２およびＣＦＣ６８０．２４＃３を、それらの類似の成長傾向に基づいて解析のために選択した。平均存在量によってランク付けされた６１の共通の上位ヒットのうちの３０を表した。図１０および１１も参照されたい。 メチロトローフＥ．ｃｏｌｉのゲノム解析。（Ａ）実験室進化プロセスに沿ったＣＦＣ５２６の変異のベン図。３０％より高い一塩基多様性（ＳＮＶ）をグラフにおいて報告する。７ｋ、７０ｋ、１３０ｋ、および２４０ｋの表示は、高コピー数を有するそれぞれのサイズに及ぶ領域を指す。上付き数字は、変異の種類を指す。（Ｂ）ＳＭ１のゲノム構造。上側部分は、ＳＭ１のＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑマッピングカバレッジを示す一方で、下側は、ＰａｃｂｉｏおよびＮａｎｏｐｏｒｅシークエンシングに由来するＳＭ１中の７０ｋタンデムリピートを表す。ＲｕＭＰサイクル遺伝子をコードする合成オペロンを含むいくつかの重要な代謝遺伝子を示す。（Ｃ）ＢＢ１のゲノム構造。ｄｄｐオペロンを含む７ｋ領域は、Ｈｉｓｅｑマッピングからのリードカバレッジの約８４倍の増加を示す。（Ｄ）ｒｐｉＡＢライブラリーを有する元の設計プラスミドｐＦＣ１３９、および進化の間に出現した変異プラスミドｐＦＣ１３９Ａ、Ｂ、Ｃの概略図。図１２、１４および表２も参照されたい。 図６Ａ～Ｅは、メチロトローフＥ．ｃｏｌｉにおけるコピー数およびプラスミド多様性を示す。（Ａ）Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ／Ｈｉｓｅｑカバレッジデータに由来する進化プロセス全体にわたる培養物の増倍された７０ｋ遺伝子のコピー数。（Ｂ）進化した培養物における推定されるプラスミド組成の多様性。プラスミドは、以下に分類される：ｐＦＣ１３９Ａ、ｐＦＣ１３９Ｂ、およびｐＦＣ１３９Ｃ、ならびにＲＢＳライブラリーを有する元のｐＦＣ１３９の残り。（Ｃ）７０ｋ領域のコピー数の動態実験。ＳＭ１を、最初にＬＢに４回、その後ＭＭ１に１回通過させ、次いでＬＢプレートにおいて２回画線した。次いで、７コロニーを集め、個々の生物学的リピートと見なした。次いで、コロニーをもう一度ＬＢに接種し、「Ｇｅｎ１」と記録した。次いで、それらを、ＬＢに３回より多く通過させて「Ｇｅｎ４」に、さらに３回通過させて「Ｇｅｎ７」とした。次いで、「Ｇｅｎ１」、「Ｇｅｎ４」および５６６「Ｇｅｎ７」を、ＭＭに接種して、成長速度を算出した。ＬＢにおける７０ｋ領域のコピー数を、デジタルＰＣＲによって決定した。コピー数のエラーバーを、７０ｋ領域における４遺伝子の標本抽出からの平均およびＳＤから算出する。Ｇｅｎ１、Ｇｅｎ４、Ｇｅｎ７間の統計学的有意性を、ｔ検定、ｎ＝４によって決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．１、ｎｓ＝有意性なし。（Ｄ）ＬＢ培養物とそれらのその後のＭＭ培養物との間の７０ｋ領域のコピー数の比較。ｎ＝７。（Ｅ）散布図と重ねた２ｄ－ボックスプロット。ボックスプロット値を、メタノール中での倍加時間およびコピー数の平均値によって算出した。散布ドットにおけるエラーバーを、７０ｋ領域における４遺伝子の標本抽出からの平均およびＳＤから算出する。ｎ＝７。 図７Ａ～Ｇは、ＳＭ１株の特徴付けを示す。（Ａ）ＲＮＡ－ｓｅｑおよびｑＲＴ－ＰＣＴによって測定される４００ｍＭのメタノールＭＯＰＳ培地におけるコアメタノール産生／消費遺伝子転写物比（ＯＤ６００ １．１／０．７）。ＥＤ経路遺伝子のＲＮＡ－ｓｅｑ結果も点付きバーに示す。（Ｂ）ＲＮＡ－ｓｅｑのボルケーノプロット（ＯＤ６００ １．１／０．７、４００ｍＭのメタノールのｌｏｇ２転写物比）。三角：＊＊ｐ＜０．０１、ｌｏｇ２比＞２；菱形：＊＊ｐ＜０．０１、ｌｏｇ２比＜－２；丸：ｐ＞０．０１、ｌｏｇ２比＜２；四角：＊＊＊ｐ＜０．００１でマルチコピー７０ｋ領域に関与する遺伝子。（Ｃ）代謝経路によってソートされたＳＭ１の発現プロファイル。ＴＰＭ（１００万個あたりの転写物）を、対数期成長（ＯＤ６００＝０．７）の間のＳＭ１のＲＮＡ－ｓｅｑによって推測した。（Ｄ）４００ｍＭのメタノール中でｔｐｉ、ｇｌｔＡ、ｐｒｏＱ、ｐｔｓＨ ｐｆｋＡ、ｆｒｍＡ、ｐｔｓＰ、ｐｇｉ、ｇａｐＡを再発現するＳＭ１株の成長表現型。（Ｅ）ＰｇｉおよびＰｇｉ変異体（Ｖ２３６＿Ｈ２４９ｄｅｌ）の比活性。（Ｆ）さまざまなメタノール濃度におけるＳＭ１株の成長。（Ｇ）ＳＭ１の発酵プロファイル。線は、成長（丸）、メタノール消費（菱形）、ギ酸（三角）および酢酸（四角）を表す。すべてのエラーバーは、標準偏差、ｎ＝３として定義する。図１３も参照されたい。 図８Ａ～Ｅは、図１に関するメタノール栄養要求体株の構成概念および進化を示す。（Ａ）メタノール栄養要求性スキーム。（Ｂ）ＣＦＣ３８１．０において組み込まれた２つの合成オペロン。「ＳＳ３」は、ゲノム組み込みのためのセーフスポットを指す。（Ｃ）Ｈｐｓのバイオプロスペクティング。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ Ｈｐｓ以外に、バイオプロスペクティングを、別のＨｐｓに行い、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂｕｒｙａｔｅｎｓｅ ５ＧＢ１Ｓから特定した。比活性を、固定量（２ｍＭ）のホルムアルデヒドまたはＲ５Ｐのいずれかを供給する、ｒｐｉＡとの結合アッセイで試験した。目に見えて、Ｈｐｓ（Ｍｂ）は、ホルムアルデヒドとの反応において悪化するが、低濃度のＲ５Ｐ下でより高い活性を有する。バーは、標準偏差としてエラーバーを伴って、生物学的に独立した３回反復の平均値を表す。（Ｄ）４００ｍＭのメタノールおよび２０ｍＭのキシロースを有するＨＤＡ培地（ＨＭＸ）におけるＣＦＣ３８１の進化を示す成長曲線。（Ｅ）１０世代のＨＭＸにおける進化後の、４００ｍＭのメタノールおよび２０ｍＭのキシロースを有するＭＯＰＳ（ＭＭＸ）におけるＣＦＣ３８１の進化を示す成長曲線。 図９Ａ～Ｂは、図３に関する合成メチロトローフ株の進化を示す。（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉが単独炭素源としてメタノール上で成長するのを可能にする進化プロセス全体の詳細なフローチャート。メチロトローフ株ＳＭ１は別として、非メチロトローフ株ＢＢ１もメタノール上で成長することができる最終混合培養物において単離されたことに留意されたい。（Ｂ）硝酸塩を有する４００ｍＭのメタノール中でのＣＦＣ５２６．２３～５３の進化を示す成長曲線。 図１０Ａ～Ｃは、図４に関するメタノール成長株におけるＤＰＣのさらなる特徴付けを示す。（Ａ）ＤＰＣから抽出されたタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。ＯＤ６００が増加する場合にＤＰＣが蓄積する明確な傾向がある。バンドのパターンは類似するように見えるが、検出されたＤＰＣの量は、試料の中で変わる。（Ｂ）２００ｍＭのメタノール中で成長するＣＦＣ５２６．４１およびその子孫ＣＦＣ５２６．４２の成長曲線。誘導期は、５２６．４２の接種後に観察されなかった。（Ｃ）異なる条件下で成長したＥ．ｃｏｌｉ培養物から抽出されたＤＮＡ／ＤＰＣのＴＥＭ画像。ＬＢ ５２６およびＬＢ ＢＷ２５１１３試料は、実験についての対照である。より低いメタノール濃度（２００ｍＭ）はＤＰＣを軽減したことに留意されたい。 図１１Ａ～Ｂは、図４に関するＤＰＣから抽出されたタンパク質の詳細なプロテオミクスデータを示す。（Ａ）共通の上位６１ヒットの完全ヒートマップ。マップは、静止期での平均タンパク質存在量によってランク付けされる。デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡＳ）エントリーは、ＤＮＡ精製および内部標準のために使用された外部から添加された酵素であることに留意されたい。（Ｂ）個々の上位１００ヒット。ＤＮＡデータを除く。 図１２は、図５に関するメチロトローフＥ．ｃｏｌｉの株の特徴付けを示す。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ／Ｈｉｓｅｑによって配列決定される進化培養物間の関係。ＳＭ１に寄与する変異のみをアノテートした。 図１３Ａ～Ｂは、図７に関するメチロトローフＥ．ｃｏｌｉの成長表現型を示す。（Ａ）ＬＢおよびメタノール培地の切り替えにおけるＳＭ１代謝柔軟性。「Ｌ」（灰色ドット）および「Ｍ」（白色ドット）は、それぞれ、ＬＢ培地およびメタノールＭＯＰＳ培地のデータを表す。株を、０．０５の初期ＯＤ６００で１００ｕｌの接種体積で通過させる。（Ｂ）硝酸塩またはビタミンなしの４００ｍＭのメタノール中で成長するＳＭ１。ＳＭ１は、硝酸塩またはビタミンの任意の供給なしで、単独炭素源としてメタノールを有する最小培地中を安定に通過し得る。株を、初期ＯＤ６００＝１でＯＤ６００＝１に達したときに通過させる。 図１４Ａ～４Ｂは、図５に関するメチロトローフＥ．ｃｏｌｉのロングリードシークエンシングを示す。（Ａ）７０ｋリピート領域のゲノム構造を確立したＰａｃｂｉｏおよびＮａｎｏｐｏｒｅシークエンシング。７０ｋタンデムリピート間でマッピングされたからＰａｃｂｉｏ Ｓｅｑｕｅｌからの最も長いリードは３４ｋである一方で、タンデムリピート間でマッピングされたＮａｎｏｐｏｒｅからの最も長いリードは１１０ｋｂ長である。後者は、最小限の三重複７０ｋタンデムリピートの存在を証明する。（Ｂ）ＳＭ１およびＢＷ２５１１３を比較するＭｕｍｍｅｒプロット。ＳＭ１ゲノムは、Ｐａｃｂｉｏ ｓｅｑｕｅｌデータからのデノボのアセンブリーによって獲得する。主なコンティグは、ＷＴゲノムと非常に相関し、データが信頼できることを示唆する。また、プラスミドおよび興味がある７０ｋ領域を含む２つより多くのコンティグがある。ＳＭ１において組み込まれている合成プロモーターの欠如に起因して、破壊点を有するＢＷ２５１１３において、７０ｋが良く整列することに留意されたい。例外として、プラスミドは、ＷＴ ｒｐｉＡ位置にマッピングした。 図１５Ａ～Ｃは、メチロトローフＥ．ｃｏｌｉの（Ａ）エタノール、（Ｂ）コハク酸および（Ｃ）乳酸の産生を示す。ガスクロマトグラフィー－フレームイオン化検出器および液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析によって検出される、２ｍＭ超の力価を達成した。 図１６Ａ～Ｂは、ＳＭ１によって産生され得る天然発酵産物を示す表を提供する。すべての産物は、液体クロマトグラフィー－オービトラップ質量分析によって検出し、ＭＳ／ＭＳメタボロミクスデータベースで確認した。（Ａ）は、ポジティブモードにおいて検出された産物を示す一方で、（Ｂ）は、ネガティブモードにおける産物を示す。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数の指示対象を含む。そのため、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は、複数のそのようなポリヌクレオチドを含み、「微生物（ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」への言及は、１つまたは複数の微生物への言及を含む。

他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または等価な方法および材料を、開示される方法および組成物の実施において使用することができるが、例示的な方法、デバイスおよび材料を、本明細書において記載する。

上記および文書全体を通して議論される任意の刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示を単独で提供する。本発明者らが以前の開示のためにそのような開示に先行する権限がないという自白として、本明細書において記載される内容は解釈されるべきではない。

微生物による１炭素（Ｃ１）化合物の資化は、気候変動の低減における有望なアプローチとして出現した。すべてのＣ１化合物のうち、メタノールは、液体形態で最も電子に富み、これは、ガス状のＣ１化合物であるメタンまたはＣＯ２と比較して、拡散障壁を回避する。加えて、メタノールは、現在、最小限の社会基盤変化による生物変換においてすぐに使用できる工業原料の化学物質である。Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓなどの天然メチロトローフにおける自然のメタノールの利用および変換経路は、十分に特徴付けされている。これらの生物は、典型的には、メタノール資化のためにＲｕＭＰサイクルまたはセリン経路を利用する。特に、ＲｕＭＰサイクルに関与する酵素は、３つの酵素（メタノールデヒドロゲナーゼ、Ｍｅｄｈ；ヘキスロース－６－リン酸シンターゼ、Ｈｐｓ；６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼ、Ｐｈｉ）を除いて、典型的な糖代謝（図１Ａおよび表１）において使用されるものとオーバーラップする。そのため、これらの３つの酵素を過剰発現させることによって、科学的および工業的な興味の両方のために、糖従属栄養体をメチロトローフに変換するためのかなりの努力が行われてきた。

表1: 図1に関する代謝物および遺伝子リスト:

メタノールを資化するように糖従属栄養体を操作する初期の成功にもかかわらず、そのような従属栄養体を、単独の炭素源およびエネルギー源として効率的にメタノールを利用するメチロトローフに変換することは可能ではなかった。報告された例は、成長をサポートするために培地中に他の炭素源もしくは栄養素を必要とするか、またはメタノール単独で５５時間の倍加時間および０．２の最大ＯＤ６００での最少の成長を実証した。一見したところ、３つの異種遺伝子の発現の成功は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの非メチロトローフをメチロトローフに変えるのに不十分である。

本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉが単独炭素源としてメタノール中で成長するのを防止するＤＮＡ－タンパク質架橋（ＤＰＣ）、ならびにゲノム編集、コピー数多型、および進化からの変異がこのハードルをどのように克服したかを含む主な問題を特定し、１２時間以下（例えば、１１．８、１１．６、１１．４、１１．２、１１．０、１０．８、１０．６、１０．４、１０．２、１０、９．８、９．６、９．４、９．２、９．０、８．８、８．６、８．４、８．２、８．０、７．８、７．６、７．４、７．２、７．０、６．８、６．６、６．４、６．２、６．０、５．８、５．６、５．４、５．２、５．０、４．８、４．６、４．４、４．２、４．０、３．８、３．６、３．４、３．２、３．０、２．８、２．６、２．４、２．２、２．０時間など、および２つの前述の値のいずれかの間の任意の値）の倍加時間で、効率的に高い光学密度（ＯＤ）まで成長する合成メチロトローフＥ．ｃｏｌｉをもたらす。

本開示は、微生物の向性変化を実証する。ＲｕＭＰサイクルの遺伝子の３つの不足のみで（メタノールデヒドロゲナーゼ、Ｍｅｄｈ；ヘキスロース－６－リン酸シンターゼ、Ｈｐｓ；６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼ、Ｐｈｉ）、代謝の切り替えは、微生物をメチロトローフに変換するために、予想外に複雑であることが分かる。実験は、メタノール資化のための動作経路を確立したメタノール栄養要求性戦略から開始したが、ホルムアルデヒド変換のための共基質であるＲｕ５Ｐの再生を、外部炭素源であるキシロースから供給した。このメタノール栄養要求性株を、メタノールに由来するその炭素の６分の１で非常に良く成長するように進化させた。残る課題は、キシロースを断つこと、およびＲｕＭＰサイクルへの解糖フラックスの部分を転用することによってＲｕ５Ｐを再生することであった。予想外にも、この課題は、非メチロトローフ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉを合成メチロトローフに変換するに際して、困難であり、その上最も明らかであった。メタノール栄養要求性成長のための進化の早期段階において（ＣＦＣ３８１．２０）、ホルムアルデヒド解毒遺伝子であるｆｒｍＡは、フレームシフト変異によって不活性化されて、生産的ＲｕＭＰ経路にホルムアルデヒドフラックスを向かわせた。

本開示は、メタノール上でのメチロトローフ成長が、ＲｕＭＰサイクル、解糖、ペントースリン酸経路およびＥＤ経路の間の適性なバランスを必要とし、これらの経路の間のアンバランスが、ホルムアルデヒド資化のためのＲｕ５Ｐ、ビルディングブロックのためのピルビン酸、または生合成のためのＮＡＤＰＨのいずれかの貯蔵を引き起こすことを実証する。Ｒｕ５Ｐの貯蔵は、ホルムアルデヒド誘導性ＤＰＣ、および次いで細胞死をもたらすであろう。ピルビン酸またはＮＡＤＰＨの貯蔵は、成長を妨害するであろう。ロバスト性解析のためのアンサンブルモデリング（ＥＭＲＡ）を使用する解析（Ｌｅｅら、２０１４；Ｒｉｖｅｒａら、２０１５）を行い、結果は、ＰｆｋおよびＧａｐｄｈが、異なる経路の間での厄介なアンバランスを回避するために下方調節を必要とすることを示唆した。Ｐｆｋは、ＡＴＰ消費に関与する主な代謝ステップを触媒し、解糖および糖新生を調整する一方で、Ｇａｐｄｈは、ＮＡＤＨ生成に関与する重要な代謝ノードであって、解糖、ＲｕＭＰサイクルおよびペントースリン酸経路の間の接合部である。ＥＭＲＡが示唆したゲノム変化を実行した後、細胞は、メタノール中での成長の利点を得て、メチロトローフ成長の方へ進化することができた。本開示によって実証されるこれらのゲノム編集なしでは、細胞は、ＤＰＣによって捕捉され、目的のタイムスケールで進化することができないと思われた。

ＤＰＣの問題は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって可視化され、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細胞をメタノール中で成長するようにする困難さを明確に実証した。ＤＰＣ現象は、静止期において最も重要であった。細胞がメタノール中で成長することができた場合でさえ、ＤＰＣは、静止期において細胞を死滅させる。ＤＰＣが多数のタンパク質において生じたので、タンパク質配列の変異は、実現可能な解決手段ではない。典型的な細菌は、ホルムアルデヒドを、ＣＯ２に酸化することによって解毒するが、この戦略は、生合成の炭素源を無駄にする。メチロトロフィーでは、生物は、ホルムアルデヒド生成およびホルムアルデヒド消費のフラックスの間の細かいバランスを達成することが必要である。天然のメチロトローフは、おそらく、自然の進化を通じて、この細かい調節を達成している。

進化の間全体にわたって、分岐が、ゲノムシークエンシングによって特定された亜集団を作り出した。この分岐を検討すると、メチロトローフＳＭ１株および非メチロトローフＢＢ１株の２つの主な集団が特定された（表２）。ＳＭ１は、メタノール上で成長し、後期成長期において酢酸を産生し、これは成長のためのＢＢ１株を供給し得る。

表2. 株および培養物の遺伝子型 (参照、図1および5):

実験室進化をＤＰＣの問題を解決するために使用された興味深い特性は、コピー数多型（ＣＮＶ）である。ＳＭ１株において、７０ｋリピート領域のコピー数は、進化が進むにつれて増加した。単離されたＳＭ１株は、７０ｋ領域のコピーが、株がＬＢにおいて培養された場合に減少したが、ＬＢからメタノール最小培地に変更する場合に増加したことを示した（図６Ｄ）。この現象は、すべての試験されたコロニーにおいて観察され、これは、混合集団の仮説を嫌った。ＳＭ１は、新しい環境に適合するように動的にＣＮＶを使用すると思われる。共進化した非メチロトローフＢＢ１株は、高コピーの７０ｋ領域を含有しないが、ＩＳに隣接する極めて高（８５）コピーの７ｋ領域を獲得した。ＩＳ媒介ＣＮＶが、困難な環境への適合のために実験室進化において重要な役割を果たすことを意味する。Ｅ．ｃｏｌｉは、環境変化と共に、ＣＮＶを動的に調整した。

また、初期ＣＦＣ５２６．０の７０ｋ領域についてのコピー数は、すでに２であり、このＣＮＶが、メタノール栄養要求性進化以後に生じ得ることを示す。そのため、これは、段階的進化戦略が有効である理由も説明し得る。ゲノムバックグラウンドを調製するためのこの栄養要求体戦略なしでは、７０ｋ領域は、さらなるコピー数増加および最適化のために利用可能にならないことがある。

進化後、最終合成メチロトローフ株は、メタノールのみの条件下、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ＡＭ１（ｔＤ＝４時間（ＮａｙａｋおよびＭａｒｘ、２０１４））、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ＴＫ０００１（ｔＤ＝４～６時間（Ｂｅｌｋｈｅｌｆａら、２０１９））およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｔＤ＝８．２時間（Ｍｏｓｅｒら、２０１７））などの天然メチロトローフと同等の約８．５時間の倍加時間（ｔＤ）およびメタノール耐性（最高で１．２Ｍ）を示す。

本開示は、単独炭素源として効率的にメタノールを利用することができる株を樹立するために、代謝ロバスト性の基準とそれに続く実験室進化を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉなどの初期化された原核微生物を提供する。この「合成メチロトローフ」は、挿入配列（ＩＳ）媒介コピー数多型（ＣＮＶ）および変異による代謝フラックスの釣り合わせによって、これまでに特徴付けされていないハードルであるＤＮＡ－タンパク質架橋（ＤＰＣ）を克服する。合成メチロトローフは、広範囲のメタノール濃度で天然メチロトローフと同等の速度で成長することができ、これらの合成メチロトローフ株は、微生物の向性変化のためのゲノム編集および進化を説明し、生物的Ｃ１変換の範囲を拡張する。本開示は、２つのゲノム編集の導入とそれに続く実験室進化によって、上記の特定された問題に対する解決手段を提供する。

本開示は、メタノールのみの条件下、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ＡＭ１（ｔＤ＝４時間）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ＴＫ０００１（ｔＤ＝４～６時間）およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ｔＤ＝８．２時間）などの天然メチロトローフと同等の１２時間未満（例えば、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間未満など、および前述の２つの値のいずれかの間の任意の値）の倍加時間（ｔＤ）を有する合成メチロトローフ株を提供する。一実施形態において、本開示は、ＲｕＭＰサイクルの酵素を含み、メタノールデヒドロゲナーゼ、ヘキスロース－６－リン酸シンターゼおよびヘキスロース－６－リン酸イソメラーゼをさらに含む、合成メチロトローフを提供する。

「メチロトローフ」、「メチロトローフ微生物」および「メチロトローフ細菌」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、メタンまたはメタノールなどの１炭素化合物（例えば、有機炭素化合物）をその細胞集団、代謝物またはそれらの組み合わせに代謝することができる細菌を指す。

「非メチロトローフ」、「非メチロトローフ微生物」および「非メチロトローフ細菌」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、メタンまたはメタノールなどの１炭素化合物をその細胞集団、代謝物またはそれらの組み合わせに代謝することができない細菌を指す。

「天然に存在しないメチロトローフ」、「天然に存在しないメチロトローフ微生物」および「合成メチロトローフ」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、１つもしくは複数の天然遺伝子を改変すること、および／または１つもしくは複数の非メチロトローフにおける異種遺伝子を発現させること、および／またはそれが親微生物と比較して遺伝子型相違を含むように微生物を合成的に進化させることによって調製されたメチロトローフを指す。言い方を変えれば、「合成メチロトローフ」は、有機Ｃ１炭素源上で効率的に成長する能力または全く増殖する能力を欠く親微生物に由来するが、組換え操作または組換え操作および実験室進化を通して、メタノールなどの有機Ｃ１炭素源上で成長するように設計および適応された、微生物を指す。

合成メチロトローフは、有機Ｃ１炭素源をその細胞集団に利用するように操作された、通性好気性生物、通性嫌気性生物、および嫌気性生物からなる群から選択される組換え微生物である。合成メチロトローフは、ｐｈｙｌａ Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＣｈｌｏｒｏｂｉおよびＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓからなる群から選択される親細菌から操作され得る。いくつかの実施形態において、合成メチロトローフは、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓからなる群から選択される親細菌から操作された細菌である。一実施形態において、合成メチロトローフは、親Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから操作されている。

一実施形態において、本明細書において提供される合成メチロトローフは、親微生物と比較して、ヘキスロース－６－リン酸シンターゼの上昇した発現を含む。この発現は、有機Ｃ１炭素源上で代謝／資化し、成長する代謝経路における他の酵素による発現または過剰発現と組み合わされてもよい。組換え微生物は、ホルムアルデヒドおよびリブロース－５－リン酸から、ヘキスロース－６－リン酸を含む代謝物を産生する。ヘキスロース－６－リン酸シンターゼは、ｈｐｓ遺伝子、そのポリヌクレオチドまたはホモログによってコードされ得る。ｈｐｓ遺伝子またはポリヌクレオチドは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを含むさまざまな微生物に由来し得る。

前述に加えて、「ヘキスロース－６－リン酸シンターゼ」または「Ｈｐｓ」という用語は、ホルムアルデヒドおよびリブロース－５－リン酸からのヘキスロース－６－リン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、これは、配列番号２に対して、デフォルトパラメーターを使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって算出される、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくはそれよりも大きい配列同一性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくそれよりも大きい配列類似性を共有する。

別のまたはさらなる実施形態において、本明細書において提供される合成メチロトローフは、親微生物と比較して、ヘキスロース－６－リン酸イソメラーゼの上昇した発現を含む。この発現は、有機Ｃ１炭素源上で代謝／資化し、成長する代謝経路における他の酵素による発現または過剰発現と組み合わされてもよい。組換え微生物は、ヘキスロース－６－リン酸から、フルクトース－６－リン酸を含む代謝物を産生する。ヘキスロース－６－リン酸イソメラーゼは、ｈｐｉ遺伝子、そのポリヌクレオチドまたはホモログによってコードされ得る。ｈｐｉ遺伝子またはポリヌクレオチドは、Ｍ．Ｆｌａｇｅｔｔｕｓを含むさまざまな微生物に由来し得る。

前述に加えて、「ヘキスロース－６－リン酸イソメラーゼ」または「Ｐｈｉ」という用語は、ヘキスロース－６－リン酸からのフルクトース－６－リン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、これは、配列番号４に対して、デフォルトパラメーターを使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって算出される、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくはそれよりも大きい配列同一性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくそれよりも大きい配列類似性を共有する。

別のまたはさらなる実施形態において、本明細書において提供される組換え微生物は、親微生物と比較して、メタノールデヒドロゲナーゼ（Ｍｄｈ、Ｍｅｄｈとも称される）の上昇した発現を含む。この発現は、有機Ｃ１炭素源上で代謝／資化し、成長する経路における他の酵素による発現または過剰発現と組み合わされてもよい。組換え微生物は、メタノールを含む基質から、ホルムアルデヒドを含む代謝物を産生する。メタノールデヒドロゲナーゼは、ｍｅｄｈ遺伝子、そのポリヌクレオチドまたはホモログによってコードされ得る。ｍｅｄｈ遺伝子またＭｅｄｈポリヌクレオチドは、Ｂ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓを含むさまざまな微生物に由来し得る。

前述に加えて、「メタノールデヒドロゲナーゼ」または「Ｍｄｈ」または「Ｍｅｄｈ」という用語は、メタノールからのホルムアルデヒドの形成を触媒することができるタンパク質を指し、これは、配列番号６に対して、デフォルトパラメーターを使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって算出される、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくはそれよりも大きい配列同一性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくはそれよりも大きい配列類似性を共有する。

別の実施形態において、本明細書において提供される組換え微生物は、親微生物と比較して、トランスアルドラーゼの上昇した発現を含む。この発現は、有機Ｃ１炭素源上で代謝／資化し、成長する代謝経路における他の酵素による発現または過剰発現と組み合わされてもよい。組換え微生物は、エリトロース－４－リン酸およびフルクトース－６－リン酸を含む基質から、セドヘプツロース－７－リン酸を含む代謝物を産生する。トランスアルドラーゼは、ｔａｌ遺伝子、そのポリヌクレオチドまたはホモログによってコードされ得る。ｔａｌ遺伝子またはポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉを含むさまざまな微生物に由来し得る。

前述に加えて、「トランスアルドラーゼ」または「Ｔａｌ」という用語は、エリトロース－４－リン酸およびフルクトース－６－リン酸からのセドヘプツロース－７－リン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、これは、配列番号１７に対して、デフォルトパラメーターを使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって算出される、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくはそれよりも大きい配列同一性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくそれよりも大きい配列類似性を共有する。追加のホモログとしては、配列番号１７に対して３０％の同一性を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＤＳＭ ２０２１３ ＺＰ＿０６５９６１６７．１；配列番号１７に対して６７％の同一性を有するＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＡＡＣ５１１５１．１；配列番号１７に対して５７％の同一性を有するＣｙａｎｏｔｈｅｃｅ種ＣＣＹ０１１０ ＺＰ＿０１７３１１３７．１；配列番号１７に対して５７％の同一性を有するＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＪＭＰ１３４ ＹＰ＿２９６２７７．２；および配列番号１７に対して５９％の同一性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＥＳＴ７６１３ ＮＰ＿４４０１３２．１が挙げられる。前述の受託番号に関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。

別の実施形態において、本明細書において提供される組換え微生物は、親微生物と比較して、トランスケトラーゼの上昇した発現を含む。この発現は、メタノールなどの有機Ｃ１炭素源上で代謝／資化し、成長する経路における他の酵素による発現または過剰発現と組み合わされてもよい。組換え微生物は、（ｉ）セドヘプツロース－７－リン酸およびグリセルアルデヒド－３－リン酸から、リボース－５－リン酸およびキシルロース－５－リン酸を含む代謝物、ならびに／または（ｉｉ）キシルロース－５－リン酸およびエリトロース－４－リン酸から、グリセルアルデヒド－３－リン酸およびフルクトース－６－リン酸を含む代謝物を産生する。トランスケトラーゼは、ｔｋｔ遺伝子、そのポリヌクレオチドまたはホモログによってコードされ得る。ｔｋｔ遺伝子またはポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉを含むさまざまな微生物に由来し得る。

前述に加えて、「トランスケトラーゼ」または「Ｔｋｔ」という用語は、（ｉ）セドヘプツロース－７－リン酸およびグリセルアルデヒド－３－リン酸からリボース－５－リン酸およびキシルロース－５－リン酸、ならびに／または（ｉｉ）キシルロース－５－リン酸およびエリトロース－４－リン酸からグリセルアルデヒド－３－リン酸およびフルクトース－６－リン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、これは、配列番号１９に対して、デフォルトパラメーターを使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって算出される、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくはそれよりも大きい配列同一性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくそれよりも大きい配列類似性を共有する。追加のホモログとしては、配列番号１９に対して６５％の同一性を有するＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｍ１３３９９ ＺＰ＿１１６１２１１２．１；配列番号１９に対して４１％の同一性を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＤＳＭ ２０２１３ ＺＰ＿０６５９６１６８．１；配列番号１９に対して６６％の同一性を有するＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＪＭＰ１３４ ＹＰ＿２９７０４６．１；配列番号１９に対して５６％の同一性を有するＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ６３０１ ＹＰ＿１７１６９３．１；および配列番号１９に対して５４％の同一性を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＥＳＴ７６１３ ＮＰ＿４４０６３０．１が挙げられる。前述の受託番号に関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。

別の実施形態において、本明細書において提供される組換え微生物は、親微生物と比較して、フルクトース１，６二リン酸アルドラーゼの上昇した発現を含む。この発現は、メタノールなどの有機Ｃ１炭素源上で代謝／資化し、成長する経路における他の酵素による発現または過剰発現と組み合わされてもよい。組換え微生物は、ジヒドロキシアセトンリン酸およびグリセルアルデヒド－３－リン酸を含む基質から、フルクトース１，６－二リン酸を含む代謝物を産生する。フルクトース１，６二リン酸アルドラーゼは、ｆｂａ遺伝子、そのポリヌクレオチドまたはホモログによってコードされ得る。ｆｂａ遺伝子またはポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉを含むさまざまな微生物に由来し得る。

前述に加えて、「フルクトース１，６二リン酸アルドラーゼ」または「Ｆｂａ」という用語は、ジヒドロキシアセトンリン酸およびグリセルアルデヒド－３－リン酸を含む基質からフルクトース１，６－二リン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、これは、配列番号２１に対して、デフォルトパラメーターを使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって算出される、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくはそれよりも大きい配列同一性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくそれよりも大きい配列類似性を共有する。追加のホモログとしては、配列番号２０に対して２６％の同一性を有するＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ６３０１ ＹＰ＿１７０８２３．１；配列番号２０に対して８０％の同一性を有するＶｉｂｒｉｏ ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏ ＡＴＣＣ ２７０４３ ＺＰ＿０８７３２２９８．１；配列番号２０に対して７６％の同一性を有するＭｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｂｕｍ ＢＧ８ ＺＰ＿０９８６５１２８．１；配列番号２０に対して２５％の同一性を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ０－１ ＹＰ＿３５０９９０．１；および配列番号２０に対して２４％の同一性を有するＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ ＯＲＳ ２０６０ ＹＰ＿００２５０２３２５．１が挙げられる。前述の受託番号に関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。

別の実施形態において、本明細書に提供される系または組換え微生物は、ホスホグリセリン酸キナーゼを含む。この酵素は、メタノールなどの有機Ｃ１炭素源上で代謝／資化し、成長する経路における他の酵素による発現または過剰発現と組み合わされてもよい。酵素は、１，３－ビスホスホグリセリン酸およびＡＤＰから３－ホスホグリセリン酸を含む代謝物を産生する。ホスホグリセリン酸キナーゼは、ｐｇｋ遺伝子、そのポリヌクレオチドまたはホモログによってコードされ得る。ｐｇｋ遺伝子またはポリヌクレオチドは、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含むさまざまな微生物に由来し得る。

前述に加えて、「ホスホグリセリン酸キナーゼ」または「Ｐｇｋ」という用語は、１，３－ビスホスホグリセリン酸およびＡＤＰから３－ホスホグリセリン酸の形成を触媒することができるタンパク質を指し、これは、配列番号２２に対して、デフォルトパラメーターを使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって算出される、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくはそれよりも大きい配列同一性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくそれよりも大きい配列類似性を共有する。

酵素の３－ヘキスロース－６－リン酸シンターゼ（ＨＰＳ）および６－ホスホ－３－ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ）によって触媒されたフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）は、次いで、主な代謝細胞経路：解糖（ＥＭＰ経路）、Ｅｎｔｎｅｒ－Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ（ＥＤ）経路、またはペントースリン酸経路（ＰＰＰ）を介して代謝され得る。

また別のまたはさらなる実施形態において、本開示の合成メチロトローフは、他の組換え操作プロセスおよび遺伝子から利益を得ることもできる。例えば、一実施形態において、合成メチロトローフは、ホスホグルコイソメラーゼ（グルコースリン酸イソメラーゼ）発現または活性の過剰な発現または活性から利益を得ることができる。この発現は、有機Ｃ１炭素源上で代謝／資化し、成長する経路における他の酵素による発現または過剰発現と組み合わされてもよい。グルコースリン酸イソメラーゼは、ｐｇｉ遺伝子、そのポリヌクレオチドまたはホモログによってコードされ得る。ｐｇｉ遺伝子またはポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉを含むさまざまな微生物に由来し得る。

前述に加えて、「ホスホグルコースイソメラーゼ」または「グルコースリン酸イソメラーゼ」または「Ｐｇｉ」という用語は、グルコース－６リン酸およびフルクトース－６－リン酸の可逆的異性化を触媒することができるタンパク質を指し、これは、配列番号８に対して、デフォルトパラメーターを使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって算出される、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくはそれよりも大きい配列同一性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくそれよりも大きい配列類似性を共有する。一実施形態において、Ｐｇｉは、配列番号１０およびそれに対して少なくとも９５％～１００％同一である配列のＰｇｉポリペプチドを生じさせる、コード配列中に１２ｂｐの欠失を含む変異体Ｐｇｉである。例えば、本開示は、Ｐｇｉにおける１２ｂｐの欠失などの他の変異がその活性を増加させることを実証する（図７Ｄ）。Ｐｇｉ活性が、酸化的ペントースリン酸経路のフラックスの一部を転用し、成長のためのＮＡＤＰＨを生成することは疑わしい。次いで、炭素フラックスは、ＥＤ経路に供給されて、成長のためのピルビン酸およびＲｕＭＰ経路のためのＧ３Ｐを生成する（図１Ａ）。

別の実施形態において、組換え微生物は、リボース－５－リン酸イソメラーゼまたはそのホモログもしくはバリアントの増加した活性または発現を有する。いくつかの実施形態において、リボース－５－リン酸イソメラーゼは、リボース－５－リン酸イソメラーゼＡである。いくつかの実施形態において、リボース－５－リン酸イソメラーゼＡは、アルカリ誘導性である。リボース－５－リン酸イソメラーゼＡの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｒｐｉＡである。リボース－５－リン酸イソメラーゼは、リボース５－リン酸およびリブロース５－リン酸を相互変換する。この反応は、ペントースリン酸経路からのリボースの合成を可能にし、炭水化物の再利用のための系を表す。ＲｐｉＡは、非常に保存されており、ほぼすべての生物に存在する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、酵素は、構成的に発現される。

前述に加えて、「リボース－５－リン酸イソメラーゼ」または「ｒｐｉＡ」という用語は、リボース５－リン酸およびリブロース５－リン酸を相互変換できるタンパク質を指し、これは、配列番号１４に対して、デフォルトパラメーターを使用して、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴによって算出される、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくはそれよりも大きい配列同一性、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（または前述の値のいずれか２つの間の値）もしくそれよりも大きい配列類似性を共有する。

一実施形態において、本開示は、親微生物と比較して少なくとも１つの標的酵素の上昇した発現を含むか、または親微生物において見出されない酵素をコードする、組換え微生物を提供する。例えば、組換え微生物（例えば、合成メチロトローフ）は、Ｍｅｄｈ、Ｈｐｓ、Ｐｈｉ、Ｔｋｔ、ＴａｌおよびＰｇｉからなる群から選択される１つまたは複数の酵素を発現または過剰発現するように操作することができる。さらなる実施形態において、組換え微生物は、ｒｐｉＡを発現または過剰発現することができ、増加したＲｐｉＡ活性を有する。一実施形態において、組換え微生物は、Ｍｅｄｈ、Ｈｐｓ、Ｐｈｉおよび変異体Ｐｇｉを発現するように操作される。

別のまたはさらなる実施形態において、微生物は、酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の低減、破壊またはノックアウトを含む。一実施形態において、組換え微生物は、ホスホキャリアタンパク質ＨＰｒ（ヒスチジン含有タンパク質、ＨＰｒおよび／またはｐｔｓＨとも称される）のノックアウトまたは破壊を含む。さらなる実施形態において、ｐｔｓＨポリペプチドは、配列番号１１に対して少なくとも９５％～１００％同一である配列を有する。ｐｔｓＨをコードするポリヌクレオチド配列は、周知のコドン表および遺伝コードの縮重を使用することによって、配列番号１１から誘導／特定することができる。別のまたはさらなる実施形態において、組換え微生物は、ｐｒｏＱ遺伝子におけるノックアウトもしくは破壊を含むか、またはそれをさらに含む。ｐｒｏＱ遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも９５％～１００％同一である配列を有するポリペプチドをコードする。配列番号１２のポリペプチドをコードする遺伝子／ポリヌクレオチドは、周知のコドン表および遺伝コードの縮重を使用することによって、誘導／特定することができる。

また別のまたはさらなる実施形態において、組換え微生物（例えば、合成メチロトローフ）は、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｆｒｍａ）の発現の低減もしくはノックアウト、またはホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｆｒｍＡ）の活性の消失もしくは低減を含む。さまざまなｆｒｍＡおよびそれらのホモログは、公知であり、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｆｒｍＡ）は、受託番号ＨＧ７３８８６７を有する。ｆｒｍａＡのホモログ、例えば、受託番号ＣＰ００５９７６を有するＰ．ｐｕｔｉｄａ由来の、または受託番号Ｄ１６１７２を有するＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の、または受託番号ＣＰ００１６５４を有するＤ．ｄａｄａｎｔｉｉ由来の、または受託番号ＣＰ００３６７７からのＰ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼが公知である（特定された受託番号の配列は、参照により本明細書に組み込まれる）。

前述のいずれかのまた別のまたはさらなる実施形態において、微生物は、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡまたはそのホモログ）の欠失（ノックアウト）を含むことができる。別の実施形態において、組換え微生物は、弱まったｇａｐＡ活性を含む。さらなる実施形態において、微生物は、野生型活性におけるｇａｐＡ活性の約４０％（例えば、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％）であるｇａｐＣ活性を含む。「グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼＡ」および「ＧａｐＡ」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、グリセルアルデヒド３－リン酸＋リン酸＋ＮＡＤ＋の３－ホスホ－Ｄ－グリセロイル－リン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈへの変換を触媒することができる酵素活性を有するタンパク質を指す。典型的なグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼは、ＥＣ１．２．１．１２によって特徴付けられる。グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてｇａｐＡによってコードされる。別の実施形態において、ｇａｐＡは、ｇａｐＣと置き換えられる。ＧａｐＣは、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼであり、配列番号１５に対して少なくとも９２％、９５％、９８％（または前述の値のいずれか２つの間の任意の値）、または１００％の配列同一性の配列を有し得る。

前述のいずれかのまた別のまたはさらなる実施形態において、微生物は、６－ホスホフルクトキナーゼ１（ＰｆｋＡまたはそのホモログ）の低減または欠失（ノックアウト）を含むことができる。別の実施形態において、組換え微生物は、弱まったＰｆｋＡ活性を含む。さらなる実施形態において、微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＰｆｋ活性全体の約５％（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％）であるＰｆｋＢ活性を含む。「６－ホスホフルクトキナーゼ１」および「ＰｆｋＡ」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、ＡＴＰ＋β－Ｄ－フルクトース６－リン酸のＡＤＰ＋β－Ｄ－フルクトース１，６－二リン酸＋Ｈ＋への変換を触媒することができる酵素活性を有するタンパク質を指す。典型的なホスホフルクトキナーゼは、ＥＣ２．７．１．１１によって特徴付けられる。６－ホスホフルクトキナーゼ１は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＰｆｋＡによってコードされる。ｐｆｋＡヌクレオチド配列は、配列番号４１に対して少なくとも７０～１００％同一である配列を含むことができ、ＡＴＰ＋β－Ｄ－フルクトース６－リン酸のＡＤＰ＋β－Ｄ－フルクトース１，６－二リン酸＋Ｈ＋への変換を触媒するポリペプチドをコードする。別の実施形態において、ＰｆｋＡは、配列番号４２に対して少なくとも７０～１００％同一である配列を含み、ＡＴＰ＋β－Ｄ－フルクトース６－リン酸のＡＤＰ＋β－Ｄ－フルクトース１，６－二リン酸＋Ｈ＋への変換を触媒する。

別の実施形態において、ＰｆｋＡの低減またはノックアウトを含む微生物は、ＰｆｋＢの発現によって代償される。ＰｆｋＢは、６－ホスホフルクトキナーゼ２であり、配列番号４４に対して少なくとも９２％、９５％、９８％、または１００％（または前述の値のいずれか２つの間の任意の値）同一である配列を有し得る。

さらに別のまたはさらなる実施形態において、本開示の組換え微生物（例えば、合成メチロトローフ）は、２超のコピー数を有するゲノムの領域を含む。例えば、一実施形態において、組換え微生物は、ｙｇｇＥからｙｇｈＯ、ｒｒｓＡからｒｒｉＢ、および／またはｙｇｉＧからｓｍｆからなる群から選択される領域の２超（例えば、３、４、５、６、７、８～８５倍）のコピー数を有する。一実施形態において、組換え微生物は、７０ｋのｙｇｇＥからｙｇｈＯ領域の２、３、４以上のコピー数多型を含む。ある特定の実施形態において、コピー数は、２超かつ９０未満の固定値である（およびあたかも本明細書に明示的にリストされるように、それらの間の任意の値を含む）。

本明細書において使用される場合、「代謝的に操作された」または「代謝的に操作している」という用語は、特定の基質の所望の代謝物の産生または代謝のための、合理的な経路設計、ならびに生合成遺伝子、オペロンに関連する遺伝子、およびそのようなポリヌクレオチドの制御エレメントのアセンブリーを含む。「代謝的に操作された」は、所望の経路に至る中間体と競合する競合代謝経路の低減、破壊またはノックアウトを含む、遺伝子操作および適切な培養条件を使用した、転写、翻訳、タンパク質安定性およびタンパク質機能性の調節および最適化による代謝フラックスの最適化をさらに含むことができる。生合成遺伝子は、宿主に対して外来性であるか、または変異誘発、組換えおよび／もしくは内因性宿主細胞における異種発現制御配列との関連によって改変されているという理由のいずれかによって、宿主微生物に対して異種であり得る。一実施形態において、ポリヌクレオチドが宿主生物に対して異種遺伝性である場合、ポリヌクレオチドは、コドン最適化することができる。

「代謝経路」とも称される「生合成経路」という用語は、ある化学種を別の化学種に変換する（変容させる）ための一連の同化または異化生化学反応を指す。同じ「代謝経路」に属する遺伝子産物は、それらが平行してまたは順次に同じ基質に対して作用する場合、同じ産物を産生するか、または同じ基質と代謝最終産物との間の代謝中間体（すなわち、代謝物）に対して作用するか、もしくはそれを産生する。

「基質」または「好適な基質」という用語は、酵素の作用によって、別の化合物に変換されるか、または変換されることを意味する任意の物質または化合物を指す。この用語は、単一化合物だけでなく、化合物の組み合わせ、例えば、溶液、混合物、および少なくとも１つの基質またはその誘導体を含有する他の材料も含む。さらに、「基質」という用語は、Ｃ１炭素源（例えば、メタノール）などの出発材料としての使用のために好適な炭素源を提供する化合物だけでなく、本明細書において記載される代謝的に操作された微生物に関連する経路において使用される中間体および最終産物代謝物も包含する。

本明細書において提供される組換え微生物は、基質としてのＣ１炭素源（例えば、メタノール）の使用に関与する複数の標的酵素を発現することができる。複数の酵素は、Ｍｅｄｈ、Ｈｐｓ、Ｐｈｉ、Ｐｇｉ、ｒｐｉＡ、Ｔｋｔ、Ｔａｌ、およびそれらの任意の組み合わせ（組換え微生物に対して異種であるか、または非天然レベルで発現されるものの少なくとも１つ）からなる群から選択される。さらなる実施形態において、組換え微生物は、ｐｆｋＡ、ｇａｐＡ、ｆｒｍＡ、ｐｔｓＨ、ｐｒｏＱ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子の低減またはノックアウトを含む。またさらなる実施形態において、組換え微生物は、ゲノムの増幅（例えば、高コピー数（２、３、４、５～８５））領域を含む。組換え微生物は、メタノールなどのＣ１炭素源上で成長することができる。

したがって、代謝的に「操作された」または「改変された」微生物は、選択された宿主または親微生物への遺伝子材料の導入を介して生成され、それによって、微生物の細胞の生理学および生化学を改変または変更する。遺伝子材料の導入により、親微生物は、新しい性質、例えば、新しいもしくはより多くの量の中間代謝物を産生する能力、または成長し、微生物に対して天然ではない基質をおよび代謝する能力を獲得する。親微生物に導入される遺伝子材料は、細胞集団への組み込みのためにＣ１炭素源を使用するための生合成経路に関与する酵素の１つまたは複数をコードする、遺伝子または遺伝子の部分を含有する。

操作されたまたは改変された微生物は、宿主もしくは親微生物への遺伝子材料の導入の代わりにまたはそれに加えて、微生物の細胞の生理学および生化学を変更する遺伝子またはポリヌクレオチドの破壊、欠失またなノックアウトを含むこともできる。遺伝子またはポリヌクレオチドの低減、破壊またはノックアウトにより、微生物は、新しいまたは改善された性質（例えば、新しいもしくはより多くの量の細胞間代謝物を産生する能力、所望の経路を下る代謝物のフラックスを改善する能力、および／または望ましくない副産物の産生を低減する能力）を獲得する。

本開示は、メタノールデヒドロゲナーゼ活性、ヘキスロース－６－リン酸シンターゼ活性、６－ホスホ－３－ヘキスロースイソメラーゼ活性、グルコースリン酸イソメラーゼ活性およびリボースリン酸イソメラーゼＡ活性を有するポリペプチドをコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドの発現または１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドの過剰発現が、ホスホフルクトキナーゼ活性の同時低減または消失、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ活性の低減または消失、Ｓ－（ヒドロキシメチル）グルタチオンデヒドロゲナーゼ（ｆｒｍＡ）活性の低減または消失、ホスホキャリアタンパク質ＨＰｒ（ヒスチジン含有タンパク質、ＨＰｒおよび／またはＰｔｓＨとも称される）活性の低減または欠失、ならびにｐｒｏＱの低減または消失とともに、メタノール上で成長する能力を有する微生物を提供することを実証する。

本明細書において提供される微生物は、親微生物において利用可能ではない量で代謝物を産生するように改変される。「代謝物」は、代謝によって産生される任意の物質、または特定の代謝プロセスのために必要なもしくはそれに関与する物質を指す。代謝物は、代謝の出発材料（例えば、メタノール）、中間体（例えば、グルコース－６－リン酸）または最終産物である有機化合物であり得る。代謝物は、より複雑な分子を構築するために使用することができ、またはそれらは、より単純なものに分解することができる。中間代謝物は、他の代謝物から合成されてもよく、おそらく、より複雑な物質を作製するために使用されてもよく、または多くの場合に化学エネルギーの放出を伴って、より単純な化合物に分解されてもよい。

本開示は、本開示の方法、組成物および生物において有用な特異的な遺伝子を特定するが、しかしながら、そのような遺伝子への絶対的な同一性は必要ではないことが認識される。例えば、ポリペプチドまたは酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子またはポリヌクレオチドにおける変化を行うことができ、活性についてスクリーニングすることができる。典型的には、そのような変化は、保存的変異およびサイレント変異を含む。そのような改変されたまたは変異したポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を使用して、機能的酵素活性の発現についてスクリーニングすることができる。

遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じまたは機能的に等価なポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドを使用して、そのような酵素をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、発現させることもできる。

当業者によって理解されるように、特定の宿主におけるその発現を増強するためにコード配列を改変することは有利であり得る。遺伝コードは、６４の可能なコドンで重複するが、ほとんどの生物は、典型的には、これらのコドンのサブセットを使用する。種においてほとんどの場合に利用されるコドンは、最適コドンと呼ばれ、あまり頻繁に利用されないものは、稀なまたは使用頻度が低いコドンとして分類される。コドンを置換して、宿主の好ましいコドン使用頻度を反映することができ、プロセスは、「コドン最適化」または「種コドンバイアスについての制御」と呼ばれる場合がある。

特定の原核宿主または真核宿主に好ましいコドンを含有する最適化されたコード配列（Ｍｕｒｒａｙら（１９８９） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７～５０８も参照されたい）を調製して、例えば、翻訳の割合を増加させることができ、または非最適化配列から産生された転写物と比較してより長い半減期などの所望の性質を有する組換えＲＮＡ転写物を産生することができる。翻訳終止コドンを改変して、宿主の優先度を反映することもできる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物についての典型的な終止コドンは、それぞれ、ＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物についての典型的な終止コドンは、ＵＧＡであるが、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは、終止コドンとしてＵＡＡを共通して使用する（Ｄａｌｐｈｉｎら（１９９６） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：２１６～２１８）。植物における発現のためにヌクレオチド配列を最適化するための方法論は、例えば、米国特許第６，０１５，８９１号およびそこに引用される参考文献に提供されている。

当業者は、遺伝コードの変性した特質に起因して、それらのヌクレオチド配列において異なる各種のＤＮＡ化合物を、本開示の所与の酵素をコードするために使用することができることを認識するであろう。本明細書において記載される生合成酵素をコードする天然ＤＮＡ配列は、本開示の実施形態を単に説明するために言及され、本開示は、本開示の方法において利用される酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のＤＮＡ化合物を含む。類似の様式において、ポリペプチドは、典型的には、所望の活性の喪失または著しい喪失なく、そのアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失および挿入に耐えることができる。本開示は、ポリペプチドが、改変されるか、またはバリアントポリペプチドが、参照ポリペプチドの酵素的同化または異化活性を有する限り、本明細書において記載される特定のタンパク質と異なるアミノ酸配列を有するそのようなポリペプチドを含む。さらにまた、本明細書において示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、本開示の実施形態を単に説明する。

加えて、代謝物を生成するために有用な酵素のホモログは、本明細書において提供される微生物および方法に包含される。第１のファミリーまたは種の元の酵素または遺伝子に関して使用される「ホモログ」という用語は、第２のファミリーまたは種の別個の酵素または遺伝子を指し、これは、第１のファミリーまたは種の元の酵素または遺伝子に対応する第２のファミリーまたは種の酵素または遺伝子であることが機能的、構造的または遺伝的解析によって決定される。ほとんどの場合、ホモログは、機能的、構造的または遺伝的な類似性を有する。酵素または遺伝子のホモログを、遺伝子プローブおよびＰＣＲを使用して容易にクローニングすることができる技法が公知である。ホモログとしてのクローニング配列の特定は、機能アッセイを使用しておよび／または遺伝子のゲノムマッピングによって、確認することができる。

タンパク質は、タンパク質をコードする核酸配列が第２のタンパク質をコードする核酸配列に対して類似する配列を有する場合、第２のタンパク質に対して、「相同性」を有するか、または「相同」である。あるいは、タンパク質は、２つのタンパク質が「類似する」アミノ酸配列を有する場合、第２のタンパク質に対して相同性を有する（そのため、「相同タンパク質」という用語は、２つのタンパク質が類似するアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。

本明細書において使用される場合、２つのタンパク質（またはタンパク質の領域）は、アミノ酸配列が、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する場合、実質的に相同である。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップを、最適な整列のために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができ、非相同配列を、比較の目的のために、無視することができる）。一実施形態において、比較の目的のために整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、典型的には少なくとも４０％、より典型的には少なくとも５０％、さらにより典型的には少なくとも６０％、さらにより典型的には少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子は、その位置で同一である（本明細書において使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列のために導入することが必要であるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一位置の数の関数である。本明細書においてリストされる遺伝子およびポリペプチド／酵素のそれぞれについての配列は、ワールド－ワイド－ウェブにおいて利用可能なデータベース（例えば、ｈｔｔｐ：（／／）ｅｅｃｏｌｉ．ｋａｉｓｔ．ａｃ．ｋｒ／ｍａｉｎ．ｈｔｍｌを参照されたい）を使用して容易に特定することができる。加えて、アミノ酸配列および核酸配列は、当技術分野において一般に使用されるアルゴリズムを使用して、特定のために容易に比較することができる。

「相同」がタンパク質またはペプチドへの言及において使用される場合、同一ではない残基位置が、多くの場合に保存的アミノ酸置換によって異なることが認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されることである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変化させない。２以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合において、配列同一性パーセントまたは相同性の程度は、置換の保存的特質について補正するように上方に調整されてもよい。この調整を行うための方法は、当業者に周知である（例えば、ここに、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎら、１９９４を参照されたい）。

以下の６つの群は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

配列同一性パーセントとも称されるポリペプチドについての配列相同性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５の配列解析ソフトウェアパッケージを参照されたい。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含むさまざまな置換、欠失および他の改変に割り当てられる相同性の尺度を使用して、類似する配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含み、これは、デフォルトパラメーターで使用して、生物の異なる種からのまたは野生型タンパク質とそのムテインの間の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。

分子配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較するのに使用される典型的なアルゴリズムは、コンピュータープログラムのＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０；Ｇｉｓｈ、１９９３；Ｍａｄｄｅｎ、１９９６；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９７；Ｚｈａｎｇ、１９９７）、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９７）である。ＢＬＡＳＴｐのための典型的なパラメーターは以下である：期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップオープンのためのコスト：１１（デフォルト）；ギャップ伸長のためのコスト：１（デフォルト）；最大整列：１００（デフォルト）；ワードサイズ：１１（デフォルト）；説明の数：１００（デフォルト）；ペナルティマトリックス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２。

多数の異なる生物由来の配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが典型的である。アミノ酸配列を使用するデータベース検索は、当技術分野において公知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列を、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリ配列と検索配列との間の最もオーバーラップする領域の整列および配列同一性パーセントを提供する（ここに、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ、１９９０）。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性パーセントを、ここに、参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧバージョン６．１において提供されるＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメーター（ワードサイズ２およびＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）で使用して決定することができる。

本開示は、本明細書において記載される組換え微生物の生成において有用なさまざまな遺伝子、ホモログおよびバリアントについての受託番号を提供する。本明細書において記載されるホモログおよびバリアントは、例示的および非限定的であることが理解されるべきである。追加のホモログ、バリアントおよび配列は、例えば、ワールド－ワイド－ウェブにおいて利用可能である全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）アクセスを含むさまざまなデータベースを使用して、当業者に利用可能である。

本開示は、寄託微生物も提供する。寄託微生物は、単に例示的なものであり、本開示に基づいて、当業者は、異なる種または遺伝子型の追加の親生物を改変して、Ｃ１基質を細胞集団に組み入れることができる本開示の微生物に到達することができる。

本開示は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉ ＳＭ１と名付けられ、２０２０年６月１９日にＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０、Ｕ．Ｓ．Ａ．）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２６７８３を有する組換え微生物を提供する。本開示は、混合培養物を含むＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２６７８３の微生物の集団を含む微生物の培養物を含む。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２６７８３に由来するポリヌクレオチド断片も提供し、これは、炭素源としてメタノール上で生存することができる微生物の調製において有用である。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２６７８３を有する微生物の集団を含むバイオリアクターも含む。当業者は、寄託微生物を使用して、ノックアウトまたは遺伝子破壊の場所を含んで、本明細書において記載される遺伝子およびポリヌクレオチドのいずれかをコードする寄託生物またはその断片の配列を容易に決定することができる。また、本開示は、改善された活性および産物の産生を有する子供株の開発における寄託微生物の使用を企図する。例えば、本開示の微生物を使用して、さまざまな化学物質およびアルコールの産生のために炭素源としてメタノールを使用する微生物を操作することができる。

寄託株を含む本開示の合成メチロトローフは、メタン、ギ酸または二酸化炭素の処理のためのバイオリアクター系において使用することができ、ここで、メタンは、本開示の組換え微生物（すなわち、合成メチロトローフ）が培養されて、より複雑な化学物質および／またはアルコールを産生し得る際にメタノールに変換される。

「原核生物」という用語は、当技術分野において認識されており、核も他の細胞小器官も含有しない細胞を指す。原核生物は、一般に、細菌および古細菌の２つのドメインの１つに分類される。古細菌および細菌ドメインの生物間の決定的な相違は、１６ＳリボソームＲＮＡ中のヌクレオチド塩基配列の基本的な相違に基づく。

「古細菌」という用語は、典型的には普通でない環境において見出され、リボソームタンパク質の数および細胞壁中のムラミン酸の欠如を含むいくつかの基準によって残りの原核生物と区別されるＭｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物の分類を指す。ｓｓｒＲＮＡ解析に基づいて、古細菌は、２つの系統的に別個の群：ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａからなる。それらの生理学に基づいて、古細菌は、３つの種類：メタン生成菌（メタンを産生する原核生物）；高度好塩菌（非常に高い塩（ＮａＣｌ）の濃度で生存する原核生物）；および高度（超）好熱性菌（非常に高温で生存する原核生物）に整理することができる。細菌からそれらを区別する一元的な古細菌の特性（すなわち、細胞壁中にムレインがない、エステル連結膜脂質など）に加えて、これらの原核生物は、それらの特定の生息地にそれらを適合させる固有の構造的なまたは生化学的な属性を示す。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、超好熱性硫黄依存性原核生物から主に構成され、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。

「細菌」、または「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は、以下の少なくとも１１の別個の群を含む：（１）グラム陽性（グラム＋）細菌、これには２つの主な亜門：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）、（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）がある；（２）Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、紫色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（ほとんどの「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、酸素発生型光合成生物；（４）Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓおよび関連種；（５）Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）Ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉおよび関連物；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ好熱性菌。

「グラム陰性細菌」は、球菌、非腸内桿菌、および腸内桿菌を含む。グラム陰性細菌の属としては、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｉｒｉｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが挙げられる。

「グラム陽性細菌」は、球菌、非芽胞性桿菌、および芽胞性桿菌を含む。グラム陽性細菌の属としては、例えば、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。

「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、内因性ポリヌクレオチドを発現もしくは過剰発現するように、またはベクターに含まれるもの、もしくは内因性遺伝子の発現の低減を有するものなどの非内因性配列を発現するように遺伝子改変されている微生物を指す。ポリヌクレオチドは、一般に、上記に記載される所望の代謝物を産生するための代謝経路に関与する標的酵素をコードする。したがって、本明細書において記載される組換え微生物は、親微生物によって以前に発現または過剰発現されていない標的酵素を発現または過剰発現するように遺伝子操作されている。「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、特定の組換え微生物だけでなく、そのような微生物の後代または潜在的な後代も指すことが理解される。

「親微生物」は、組換え微生物を生成するために使用される細胞を指す。「親微生物」という用語は、天然に存在する細胞、すなわち、遺伝子改変されていない「野生型」細胞を記載する。「親微生物」という用語は、遺伝子改変されている細胞も記載する。例えば、野生型微生物は、第１の標的酵素を発現または過剰発現するように遺伝子改変することができる。この微生物は、第２の標的酵素などを発現または過剰発現するように改変された微生物の生成において親微生物の役目を果たすことができる。したがって、親微生物は、連続する遺伝子改変事象のための参照細胞として機能する。それぞれの改変事象は、参照細胞に核酸分子を導入することによって達成することができる。導入は、標的酵素の発現または過剰発現を促進する。「促進する」という用語が、例えば、親微生物におけるプロモーター配列の遺伝子改変による標的酵素をコードする内因性ポリヌクレオチドの活性化を包含することが理解される。「促進する」という用語が、親微生物への標的酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドの導入を包含することがさらに理解される。

「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、アミノ酸と呼ばれる化学的ビルディングブロックの１つまたは複数の鎖を含み、これは、ペプチド結合と呼ばれる化学結合によって一緒に連結される。「酵素」は、１つまたは複数の化学反応または生化学反応を、より特異的にまたはあまり特異的ではなく、触媒または促進する、全体にまたは大部分がタンパク質で構成される任意の物質を意味する。「酵素」という用語は、触媒的ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指すこともできる。「天然」または「野生型」のタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞は、天然に存在するタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞を意味する。

上記に記載されるポリヌクレオチドが「遺伝子」を含むこと、および上記に記載される核酸分子が「ベクター」または「プラスミド」を含むことが理解される。例えば、メタノールデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、ｍｅｄｈ遺伝子またはそのホモログによってコードされ得る。したがって、「構造遺伝子」とも呼ばれる「遺伝子」という用語は、アミノ酸の特定の配列をコードするポリヌクレオチドを指し、これは、１つまたは複数のタンパク質または酵素のすべてまたは部分を含み、そして、例えば、遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列などの調節性（非転写）ＤＮＡ配列を含んでいてもよい。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’－ＵＴＲを含む非翻訳領域、ならびにコード配列を含んでいてもよい。「核酸」または「組換え核酸」という用語は、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および適切な場合はリボ核酸（ＲＮＡ）を指す。遺伝子配列に関する「発現」という用語は、遺伝子の転写、および必要に応じて、得られたｍＲＮＡ転写物からタンパク質への翻訳を指す。そのため、文脈から明らかであるように、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム配列の転写および翻訳から生じる。

「オペロン」という用語は、共通プロモーターから単一の転写単位として転写される２つ以上の遺伝子を指す。いくつかの実施形態において、オペロンを含む遺伝子は、隣接遺伝子である。オペロン全体の転写を、共通プロモーターを改変することによって、改変（すなわち、増加、減少、または排除）することができることが理解される。あるいは、オペロン中の任意の遺伝子または遺伝子の組み合わせを改変して、コードされるポリペプチドの機能または活性を変更することができる。改変は、コードされるポリペプチドの活性の増加をもたらすことができる。さらに、改変は、コードされるポリペプチドに対して新しい活性を付与することができる。例示的な新しい活性としては、代替基質の使用および／または代替の環境条件下で機能する能力が挙げられる。

「ベクター」は、核酸を、生物、細胞、または細胞構成要素の間で伝播および／または移動させることができる任意の手段である。ベクターとしては、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、および人工染色体、例えば、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、およびＰＬＡＣ（植物人工染色体）などが挙げられ、これは、「エピソーム」である、すなわち、自律的に複製するか、または宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。ベクターはまた、事実上エピソーム性ではない、ネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同一鎖内のＤＮＡおよびＲＮＡの両方で構成されるポリヌクレオチド、ポリリジンがコンジュゲートされたＤＮＡもしくはＲＮＡ、ペプチドがコンジュゲートされたＤＮＡもしくはＲＮＡ、リポソームがコンジュゲートされたＤＮＡなどであり得るか、またはこれは、１つまたは複数の上記ポリヌクレオチド構築物を含む生物、例えば、アグロバクテリウムまたは細菌であり得る。本開示は、表５にいくつかのベクター（プラスミド）を提供する。

「形質転換」は、ベクターが宿主細胞に導入されるプロセスを指す。形質転換（または形質導入、またはトランスフェクション）は、電気穿孔、マイクロインジェクション、遺伝子銃（または微粒子銃媒介送達）、またはアグロバクテリウム媒介形質転換を含む多くの手段のいずれか１つによって達成することができる。

本開示は、下記でより詳細に記載されるように、１つまたは複数の標的酵素をコードする組換えＤＮＡ発現ベクターまたはプラスミドの形態の核酸分子を提供する。一般に、そのようなベクターは、宿主微生物の細胞質において複製し得るか、または宿主微生物の染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。いずれかの場合において、ベクターは、安定なベクターであり得る（すなわち、ベクターは、選択圧によるだけであっても、多くの細胞分裂にわたって存在したままである）か、または一過性ベクターであり得る（すなわち、ベクターは、細胞分裂の数が増加すると、宿主微生物によって徐々に失われる）。本開示は、単離された（すなわち、純粋ではないが、天然に見出されない存在量および／または濃度で調製物中に存在する）および精製された（すなわち、混入する材料を実質的に含まないか、または対応するＤＮＡが天然に見出されないであろう材料を実質的に含まない）形態のＤＮＡ分子を提供する。

発現ベクターという用語は、宿主微生物または無細胞の転写および翻訳系に導入され得る核酸を指す。発現ベクターは、微生物中の染色体もしくは他のＤＮＡの部分として、または任意の細胞コンパートメント中に、例えば、細胞質中の複製ベクター中にかかわらず、微生物中で恒久的にまたは一過的に維持され得る。発現ベクターは、ＲＮＡの発現を駆動するプロモーターも含み、これは、典型的には、微生物または細胞抽出物中でポリペプチドに翻訳される。ＲＮＡからタンパク質への効率的な翻訳のために、発現ベクターはまた、典型的には、発現される遺伝子のコード配列の開始コドンの上流に位置するリボソーム結合部位配列を含有する。エンハンサー、分泌シグナル配列、転写終結配列、ならびにベクターを含有する宿主微生物を特定および／または選択することができる１つまたは複数のマーカー遺伝子などの他のエレメントも、発現ベクター中に存在していてもよい。選択マーカー、すなわち、抗生物質耐性または感受性を付与する遺伝子を使用し、細胞が適切な選択培地において成長する場合に、形質転換細胞において選択可能な表現型を付与する。

発現ベクターのさまざまな構成要素は、ベクターの意図される使用、およびベクターが複製または発現を駆動することを意図する宿主細胞に応じて、広く変わり得る。Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよび他の一般に使用される細胞における遺伝子の発現およびベクターの維持に好適な発現ベクターの構成要素は、広く公知であり、市販されている。例えば、本開示の発現ベクターへの包含のために好適なプロモーターとしては、真核宿主微生物または原核宿主微生物において機能するものが挙げられる。プロモーターは、宿主微生物の成長に関連して発現の調節を可能にするか、または化学的もしくは物理的刺激に応答して遺伝子の発現のオンまたはオフを引き起こす、調節配列を含み得る。Ｅ．ｃｏｌｉおよびある特定の他の細菌宿主細胞のためには、生合成酵素、抗生物質耐性付与酵素、およびファージタンパク質についての遺伝子に由来するプロモーターを使用することができ、例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）、マルトース、トリプトファン（ｔｒｐ）、ベータ－ラクタマーゼ（ｂｌａ）、バクテリオファージラムダＰＬ、およびＴ５プロモーターが挙げられる。加えて、ｔａｃプロモーター（米国特許第４，５５１，４３３号）などの合成プロモーターを使用することもできる。Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターのためには、ｐＵＣ、ｐ１Ｐ、ｐ１、およびｐＢＲ由来などのＥ．ｃｏｌｉ複製起点を含めることが有用である。

そのため、組換え発現ベクターは、少なくとも１つの発現系を含有し、これは次に、適合性宿主細胞においてコード配列の発現を生じさせるように作動するプロモーターおよび任意選択で終結配列に作動可能に連結されたＰＫＳおよび／または他の生合成遺伝子のコード配列の少なくとも一部分から構成される。宿主細胞は、本開示の組換えＤＮＡ発現ベクターによる形質転換によって改変されて、染色体外エレメントとして、または染色体に組み込まれた、発現系配列を含有する。

本開示の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法および下記の実施例セクションにおいて記載される手順に従って、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または代替的にゲノムＤＮＡを鋳型として、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、増幅することができる。そのように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けることができる。さらにまた、ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準的な合成技法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成機を使用して調製することができる。

特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入して、その結果、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードされるタンパク質に導入することによって、本明細書において記載される酵素に相同なポリペプチドをコードする単離された核酸分子を作出することができることも理解される。変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準的な技法によってポリヌクレオチドに導入することができる。非保存的アミノ酸置換を行うことが望ましくあり得る位置（上記を参照されたい）とは対照的に、いくつかの位置において、保存的アミノ酸置換を行うことが好ましい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。

以前に議論されたように、ベクター、プロモーター、および多くの他の関連トピックスの使用を含む本発明において有用な分子生物学的技法を記載する一般的なテキストとしては、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２巻、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）（「Ｂｅｒｇｅｒ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１～３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．のジョイントベンチャー（１９９９まで増補）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。例えば本開示の相同核酸の産生のための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ－レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技法（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含むインビトロ増幅方法を通して、当業者を指示するために十分なプロトコールの例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）の米国特許第４，６８３，２０２号；Ｉｎｎｉｓら編（１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）（「Ｉｎｎｉｓ」）；Ａｒｎｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日） Ｃ＆ＥＮ ３６～４７；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１） ３：８１～９４；Ｋｗｏｈら（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ ３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７～１０８０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２９１～２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９） Ｇｅｎｅ ４：５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０） Ｇｅｎｅ ８９：１１７；ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３～５６４に見出される。インビトロで増幅された核酸のクローニングのための改善された方法は、Ｗａｌｌａｃｅらの米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。ＰＣＲによって大きな核酸を増幅するための改善された方法は、最高で４０ｋｂのＰＣＲアンプリコンが生成されるＣｈｅｎｇら（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６８４～６８５およびそこで引用された参考文献にまとめられている。本質的に任意のＲＮＡを、逆転写酵素およびポリメラーゼを使用して、制限消化、ＰＣＲ拡張およびシークエンシングに好適な二本鎖ＤＮＡに変換することができることを当業者は認識するであろう。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ、すべて上記を参照されたい。

適切な培養条件は、宿主微生物による、すなわち、微生物の代謝作用による化合物の産生を可能にする、培養培地の条件であるｐＨ、イオン強度、栄養素含有量など；温度；酸素／ＣＯ２／窒素含有量；湿度；および他の培養条件である。適切な培養条件は、宿主細胞としての機能を果たすことができる微生物について周知である。

本開示を、以下の実施例において説明し、これは、説明の手段として提供され、限定することを意図するものではない。

本開示の例示的な微生物は、ブタペスト条約の下、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０、Ｕ．Ｓ．Ａ．に、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２６７８３（命名Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ｃｏｌｉ ＳＭ１）として２０２０年６月１９日に寄託された。この寄託物は、試料のリリースのため最新の要求が寄託機関によって受領された後少なくとも５年の期間、寄託の日後少なくとも３０年の期間、または関連する特許の有効期間の間のいずれかの最も長い期間、万一の変異、生存不能、または破壊の場合にも、認可された寄託機関において維持および交換される。これらの細胞株の公衆への利用に対するすべての制限は、本出願からの特許の発行の際に決定的に除去されるであろう。

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＢＷ２５１１３を、実験モデルとして使用した。

培地および成長条件。すべての株は、他に明記されない限り、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｎｏｖａ ４４において、３７℃、２５０ｒｐｍで成長させた。ＬＢ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、クローニングの目的、および富栄養培地が必要であった場合に優先培地のために使用した。抗生物質を、必要な場合に、カルベニシリンについて１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシンについて３０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコールについて５０ｍｇ／Ｌ、またはスペクチノマイシンについて２５０ｍｇ／Ｌの最終濃度で使用した。Ｈｉ Ｄｅｆ ａｚｕｒｅ培地（ＨＤＡ、Ｔｅｋｎｏｖａ）を、制限された栄養素による適応進化のための予備段階培地として使用した。ＭＯＰＳ ＥＺ緩衝液（ＭＯＰＳ、Ｔｅｋｎｏｖａ）を、最小培地として改変および利用し、これは、４０ｍＭのＭＯＰＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ、９．５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、０．５２５ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのトリシン、１．３２ｍＭのＫ２ＰＯ４、０．２７６ｍＭのＫ２ＳＯ４、０．０１ｍＭのＦｅＳＯ４、０．５ μＭのＣａＣｌ２、４０ｎＭのＨ３ＢＯ３、８．０８ｎＭのＭｎＣｌ２、３．０２ｎＭのＣｏＣｌ２、０．９６２ｎＭのＣｕＳＯ４、０．９７４ｎＭのＺｎＳＯ４、および０．２９２ｎＭの（ＮＨ４）２ＭｏＯ４で構成された。ＯＤ６００を、Ｇ３０分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってモニターした。

株の構築およびメタノール栄養要求性株の適応進化。この研究において使用した株を表２にまとめる。初期栄養要求性株のＣＦＣ３８１．０を、Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂａｂａら、２００６）に含まれるΔｒｐｉＡ株から構築し、それに続いて、ＦＬＰリコンビナーゼ（ＣｈｅｒｅｐａｎｏｖおよびＷａｃｋｅｒｎａｇｅｌ、１９９５）をコードするｐＣＰ２０プラスミドによりカナマイシンカセットを除去した。その後、ｒｐｉＢ除去、ならびにＳＳ３部位（ｏｍｐＷとｙｃｉＥとの間）のＰＬｌａｃＯ１：：ｍｅｄｈ－ｈｐｓ（Ｍｂ）－ｐｈｉ（Ｂａｓｓａｌｏら、２０１６）およびｎｕｐＧ部位のＰＬｌａｃＯ１：：ｍｅｄｈ－ｔｋｔ（Ｍｂ）－ｔａｌ（Ｋｐ）－ｈｐｓ（Ｍｂ）－ｐｈｉの２つのオペロンの挿入を、Ｊｉａｎｇら（Ｊｉａｎｇら、２０１５）からの改変Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９系によって行った。ｐＣａｓ９形質転換株を、終夜成長させ、初期ＯＤ＝０．１で再接種し、ＬＢおよび１００ｍＭのアラビノースで、３０℃のシェーカーにおいて４時間成長させた。次いで、株を、ｐＴａｒｇｅｔプラスミドで電気穿孔し、ＬＢプレートに３０℃で終夜蒔く。成功した遺伝子編集標的を、コロニーＰＣＲで確認した。次いで、ｐＴａｒｇｅｔプラスミドを、０．１ｍＭのＩＰＴＧを有するＬＢ上で細胞を成長させることによって除去した一方で、ｐＣａｓ９は、ＬＢ中、３７℃でバリアントを成長させること、および拡張スクリーニングによって、ほぼ最後に除去した。すべてのＥ．ｃｏｌｉ株は、蒸発を防止するために密閉される蓋を有する３ｍｌのＰＰチューブ中で成長させ、ＯＤ６００が１．２を超えたか、または静止期に達したときに、次の継代に移した。株は、典型的には、０．０５～０．２の初期ＯＤ６００で接種する。したがって、移動の間のボトルネックでの集団サイズは、およそ細胞１．５～６×１０８個である。そのため、実際上、約３～４世代が、継代ごとに経過する。進化していないΔｒｐｉＡＢ株のＣＦＣ３８１を、２０ｍＭのリボースおよび２０ｍＭのキシロースを有するＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ、Ｓｉｇｍａ）において最初に接種した。株は、２日で飽和まで成長し、次いで、別々に、１ｍＭのＩＰＴＧによって誘導された４００ｍＭのメタノールおよび２０ｍＭのキシロースの両方を有するＨＤＡおよびＭＯＰＳ（それぞれ、ＨＭＸおよびＭＭＸという名称の培地）に通過させた。継代２から継代１０まで、細胞を、ＨＭＸからＨＭＸに通過させた。継代１１から開始して、細胞を、継代２１（ＣＦＣ３８１．２０）までＭＭＸに通過させ、ここで、株を、理論算出から示唆される結果を組み入れた後（ＥＭＲＡの詳細を参照されたい）、さらなる遺伝子改変に付した。

株の構築およびメタノール成長株の適応進化。メタノール栄養要求体を適応進化から達成した後、ｐｆｋＡのさらなるノックアウトおよびｇａｐＡのｇａｐＣによる置き換えを、ＥＭＲＡ結果を考慮して、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９によって実行した。Ｃｒｉｓｐｒプロトコールは、以前のセクションにおけるものと同一である。ＲＢＳライブラリーを有するｒｐｉＡからなるプラスミドｐＦＣ１３９を、電気穿孔によって株に形質転換した。適応進化を、４０ｍＭのメタノールを有するＨＤＡおよびＭＯＰＳの比を混合することによって行った。加えて、ビタミンミックスを、ＭＯＰＳおよびＨＤＡ培地の比にかかわらず添加し、ここで、以下の最終濃度に達する：４０．９４μＭのニコチンアミド、１４．８２μＭのチアミン塩酸塩、１３．２９μＭのリボフラビン、１０．４９μＭのパントテン酸カルシウム、８．１９μＭのビオチン、４．５３μＭの葉酸、０．０７μＭのビタミンＢ１２。また、１０ｍＭのＮａＮＯ３を組み入れ、１ｍＭのＩＰＴＧを、接種のポイントで、誘導のために使用した。進化を、１００：０のＨＤＡ：ＭＯＰＳ培地で開始した（メタノールおよびすべての補充ビタミンを添加した後、実際のＨＤＡ培地の比を９５．２％に希釈した）。継代２（ＣＦＣ５２６．２）で、ＨＤＡ：ＭＯＰＳを、５０％に調整した。継代３（ＣＦＣ５２６．３）から継代１６（ＣＦＣ５２６．１６）まで、ＨＤＡを、３０％まで低減し、ＨＤＡ比を、継代１７（ＣＦＣ５２６．１７）から１９（ＣＦＣ５２６．１９）まで、および継代１９（ＣＦＣ５２６．１９）から２０（ＣＦＣ５２６．２０）まで、それぞれ、２０％および１０％にさらに低減した。最後に、ＭＯＰＳを継代２１において使用した場合に、ＨＤＡを完全に排除し、これをＣＦＣ６８０．１と改名した。次いで、ＣＦＣ６８０．１を、ＭＯＰＳおよび４００ｍＭのメタノールのみにおいて、ＣＦＣ６８０．３１まで３１継代の間、さらに進化させた。ＣＦＣ６８８．２を、硝酸塩なしで、ＭＯＰＳおよび４００ｍＭのメタノールを用いて、ＣＦＣ６８０．１から同時に成長させ、次いで、ＣＦＣ６８８．３２まで３０継代の間、進化させた。さらに、ＣＦＣ５２６．２０で、より遅いＨＤＡアプローチを行った。具体的には、１０％および５％のＨＤＡ補充を、それぞれ、継代２１（ＣＦＣ５２６．２１）および継代２２（ＣＦＣ５２６．２２）まで提供した。ＨＤＡは、継代２３（ＣＦＣ５２６．２３）で完全に除かれた。次いで、ＣＦＣ５２６．２３を、ＣＦＣ５２６．５３まで３０継代の間、進化させた。

株ＳＭ１の最終の単一コロニーを、ＭＯＰＳと４００ｍＭのメタノールの寒天プレートにおいて、最初にＣＦＣ５２６．５３を画線することによって得た。次いで、単一コロニーを、ＭＯＰＳと４００ｍＭのメタノールの液体培養に再度接種し、それに続いて、嫌気性条件下で、ＬＢプレートに画線した。ＳＭ１を、最終的に、コロニーＰＣＲ確認を用いて、ＬＢにおいて単一コロニーを成長させることによって回収した 他の単一コロニー株ＢＢ１を、ＬＢ液およびＬＢプレートにおいてＣＦＣ５２６．５３を成長させることによって簡単に単離した。

プラスミド構築。すべてのプラスミドを、供給源の表にまとめる。プラスミドはすべて、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙによって構築された一方で、ＤＮＡ断片は、ＫＯＤｏｎｅ（Ｔｏｙｏｂｏ）によって増幅された。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５アルファを、クローニング宿主として使用した。

最終ＳＭ１株を、４００ｍＭのＭｅＯＨ、以前に言及したビタミンミックス、１ｍＭのＩＰＴＧおよび５０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールと共に１×ＭＯＰＳ ＥＺ培地（カタログ番号Ｍ２１０１、Ｔｅｋｎｏｖａからの１０×ストック）中で成長させる。クロラムフェニコールが、純メタノールに同様に溶解したこと、および１０００×ストックによって培地に添加されたことに留意されたい。

供給源の表

表3. 株リスト

表4. プライマーリスト

表5. プラスミドリスト

ＥＭＲＡによるＲｕＭＰ－ＥＭＰ－ＴＣＡサイクルのロバスト性。ＥＭＲＡは、酵素発現における撹乱、および定常状態の不安定性を引き起こす動態の尤度を決定するために開発された算出方法である。経路全体についての参照定常状態をプリセット後、次いで、合計で１００パラメーターセットを生成し、それぞれの酵素について、０．１倍から１０倍まで無作為に撹乱させた。結果を、系のロバスト性の指標として報告し、ここで、ＹＲ，Ｍは、それぞれのポイントでロバストである１００パラメーターセットの比を指す。

１３Ｃ標識実験。１３Ｃ標識された酢酸およびギ酸の定量的分析を、５９７７Ｂ質量分析計と併せたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ７８９０ガスクロマトグラフィーによって実施した。試料を、１５０００ｒｐｍで３分間の遠心分離後、培養物の上清をアリコートすることによって調製した。０．５ｕｌの試料を、ＧＣに注入した。ＤＢ－ＦＦＡＰカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０．３２ｍｍ×３０ｍ×０．２５μｍ）を、一定圧力の７．０６３３ｐｓｉのヘリウムガス供給と共に利用した。熱サイクルを、４０℃で２分間の初期温度、それに続いて、６０℃まで１０℃／分、および２４０℃まで１００℃／分のランプ速度、併せて最後の２分間の保持で行った。

細胞生死判別試験。細胞生死判別アッセイを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）をそのプロトコールに従って使用することによって行った。次いで、細胞の蛍光を、２０１８ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）によって検出した。青色レーザー（励起波長４８８ｎｍ）およびＢＬ１フィルター（放射フィルター５３０±３０ｎｍ）を、ＳＹＴＯ－９検出のために選択した一方で、黄色レーザー（励起波長５６１ｎｍ）およびＹＬ２フィルター（放射フィルター６２０±１５ｎｍ）を、ヨウ化プロピジウム検出のために使用した。

ＤＰＣ複合体の単離。抽出プロトコールを、Ｑｉｕら（ＱｉｕおよびＷａｎｇ、２００９ｂ）およびＢａｒｋｅｒら（Ｂａｒｋｅｒら、２００５）によって報告されたものから改変した。２ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ（ＣＦＣ５２６．４１およびＣＦＣ６８０．２４）を、最初に、５０００ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、次いで、２．０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する１００μｌの１０ｍＭのＭＯＰＳ緩衝液に再懸濁させ、３７℃で３０分インキュベーションした。次いで、５００μｌのＤＮＡｚｏｌ試薬を、添加し、５分間混合し、それに続いて、１２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。次いで、上清を、新しいチューブに移し、３００μｌの氷冷された１００％のエタノールを、ＤＮＡ沈殿のために添加した。次いで、試料を－８０℃で少なくとも１時間貯蔵した。その後、１２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離による上清の除去後、ＤＮＡペレットを、１９０μｌの８ｍＭのＮａＯＨに再溶解した。その後、１０μｌの１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加し、さらに、タンパク質変性およびタンパク質のＤＮＡへの非特異的結合の解離のために、尿素およびＳＤＳをそれぞれ８Ｍおよび２％ｗ／ｖの最終濃度まで、同様に添加した。全混合物を、３７℃で３０分間、穏やかに振とうした。次いで、タンパク質を、等体積の５ＭのＮａＣｌを添加することによって塩析し、３７℃で３０分間の穏やかな振とうに付した。１２０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離の後、上清を、３ｋＤａカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４ｍＬ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、１００００の最終希釈係数まで、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４で３回洗浄した。体積が４５０μｌまで最終的に濃縮されたら、５０μｌの３Ｍの酢酸カリウムおよび１ｍｌの氷冷された１００％のエタノールを添加し、－８０℃で１時間、もう一度貯蔵した。１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間の遠心分離の後、ＤＮＡペレットを、維持し、１ｍｌの７０％のエタノールで洗浄した。次いで、ペレットを、典型的には１００μｌの、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで溶解した。次いで、ＤＮＡを、２６０ｎｍのＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって定量化した。

透過型電子顕微鏡法。およそ５００ｎｇのＤＮＡのスケールの精製ＤＰＣ複合体を、室温で１分間、炭素安定化ホルムバール（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）でコーティングされた活性化３００メッシュ銅グリッドに載せた。濾紙吸い取り法による液体除去後、試料を、２．５％の酢酸ウラニルで１分間染色した。過剰の染料の除去後、試料を、室温で風乾した。透過型電子顕微鏡法を、Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ Ｓｐｉｒｉｔ Ｂｉｏ ＴＷＩＮ（ＦＥＩ Ｃｏ．）で行い、さらに、画像を、Ｋ３ Ｂａｓｅ ＩＳ ＣＣＤカメラ（Ｇａｔａｎ）を用いて、２７００×～１５０００×の拡大比で記録した。

ＤＰＣタンパク質部分の精製。ＤＮＡの脱架橋を、７０℃で１時間のインキュベーション、それに続くそれぞれ１ｕｌのＤＮＡａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）およびＳ１ヌクレアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ）処理によって行った。次いで、小さい消化ＤＮＡ断片を、３ｋＤａカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心分離フィルターを使用することによって除去し、最終体積を、５０μｌまで低減した。次いで、試料濃度を、２８０ｎｍのＮａｎｏｄｒｏｐによって推定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、１２％のプレキャストゲル（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて迅速分析のために実行し、さらに、染色を、Ｐｉｅｒｃｅ銀染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。

定量的プロテオミクスおよびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のためのタンパク質試料調製。タンパク質を、４Ｍの最終濃度まで尿素を添加し、それに続いて１０ｍＭのジチオエリトリトールによる３７℃で４５分間の還元、および２５ｍＭのヨードアセトアミドによる室温で暗所で１時間のシステインのアルキル化によって変性した。タンパク質試料を、ＬｙｓＣプロテアーゼおよびトリプシンを使用して、１：５０（ｗ／ｗ）の酵素と基質の比で、３７℃で終夜消化した。トリプシン消化の後、ペプチドを、Ｃ１８ ＳｔａｇｅＴｉｐによって直接脱塩した。試料を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続されたＥＡＳＹ－ｎＬＣＴＭ １２００システムにおいて行った。データ解析を、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ）に組み込まれたＳＥＱＵＥＳＴ ＨＴアルゴリズムを使用して行った。ＭＳ／ＭＳスキャンを、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２データベース（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ ２０１９＿１０リリース）に対してマッチさせた。

データを、同じ試料の異なる時点内の同じ値に対して、内部標準ＤＮａｓｅの存在量を最初に正規化することによって解析した。次いで、正規化されたそれぞれの試料の存在量を、それらのＤＮＡ濃度によって割った。最後に、ヒートマップを、タンパク質存在量によってランク付けされた上位１００ヒットをリストし、個々の試料の最終時点の平均存在量に基づく降順で、ｌｏｇスケールで可視化するために共通ヒットを取ることによってプロットした。

ＤＮＡ次世代シークエンシング。ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。配列決定されたすべての株を、表２にまとめる。適応進化全体にわたって収集された試料を、２×１５０ｂｐのペアエンドフォーマットで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉｓｅｑまたはＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ Ｒａｐｉｄ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のいずれかによって配列決定した。適応進化の中ほどの試料が、ＳＮＰからのシークエンシングエラーを識別するために少なくとも６０のカバレッジを有することをすべて確認した。次いで、データを、ＢＢｄｕｋでトリミングすることにより、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ １１ソフトウェア（Ｇｅｎｅｉｏｕｓ）によって処理し、次いで、ソフトウェア生来のマッパーによって参照に対してマッピングした。ＳＮＰバリアントを、基準を２５％の頻度にセットすることによってコールした。

次いで、最終株を、Ｐａｃｂｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＮａｎｏｐｏｒｅシークエンシング（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって配列決定した。Ｐａｃｂｉｏ Ｓｅｑｕｅｌのために、２５ｋｂのＳＭＲＴｂｅｌｌライブラリー（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を準備し、その品質を、断片アナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって評価した。次いで、ライブラリーを、ＣＬＲ ２０－ｈｒ拡散モードで実行した。リードを、ＨＧＡＰ４によってアセンブルした。Ｎａｎｏｐｏｒｅ試料調製およびシークエンシングを、Ｈｅａｌｔｈ ＧｅｎｅＴｅｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｔａｉｗａｎによって実施した。

デジタルＰＣＲ。ＣＮＶを、ＱＸ２００ＴＭ ｄｄＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、標準プロトコールによるドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって検出した。ゲノムＤＮＡを、ＮＧＳ実験において行ったようにして、最初に抽出した。次いで、０．５μｇのＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩで１時間消化した。ＰＣＲ反応を、２５ｐｇの消化されたＤＮＡをロードした後、「ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ」キット（Ｂｉｏ－ｒａｄ）によって行った。データを、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏソフトウェアによって解析した。

コピー数多型動態。ＳＭ１を、ＬＢプレートに画線し、ここで、単一コロニーを集め、ＬＢに接種した。次いで、ＬＢ培養物を、３回より多くＬＢ培養物に通過させ、それに続いてＭＭ培養物接種を行った。次いで、ＭＭ培養物を、ＬＢプレートに２回画線し、次いで７コロニーを、ＬＢにもう一度接種した。本明細書に示されるデータは、このポイントから開始する。次いで、株を、ＬＢに７回通過させた。１回目、４回目および７回目の通過（「Ｐａｓ１」、「Ｐａｓ４」、「Ｐａｓ７」としてアノテート）の培養物を、メタノール成長を試験するために、ＭＭ培養に通過させた。ＬＢ培養物およびその後のＭＭ培養物のゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｕｒｅｇｅｎｅキットによって抽出し、コピー数を、デジタルＰＣＲによって試験した。

ｑＲＴ－ＰＣＲ解析。Ｅ．ｃｏｌｉの総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製し、ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって逆転写した。ｃＤＮＡレベルの検出を、ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して行った。すべての試料を、ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ハードシェル９６ウェルＰＣＲプレートにおいて、３回反復で測定した。発現の倍数変化を、Ｅ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡに対して正規化されたΔΔＣｔ値によって解析した。過剰発現した異種遺伝子を、ホルムアルデヒド消費において分類し、遺伝子データセットを生成した。データセットを、データが正規分布しているかを試験するために、最初にＳｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ試験によって試験し、これは事実であった。両側のＦ検定を行って、同等の不等分散を用いるｔ検定を使用しなければならないかを評価した。最後に、ｔ検定を行って、ホルムアルデヒド消費および遺伝子生成の倍数変化が、互いに実質的に異なるかを評価した。

ＲＮＡ－ｓｅｑ解析。Ｅ．ｃｏｌｉの総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって抽出した。ｒＲＮＡを、Ｒｉｂｏ－Ｚｅｒｏ（Ｂａｃｔｅｒｉａ）キットによって準備した。次いで、データを、ＣＬＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ２０によって処理した。ＴＰＭを算出し、以下の代謝経路は、ＴＰＭ分布を算出した場合に、以下の遺伝子を含む。ＴＣＡは、ａｓｐＡ、ｆｄｒＡ、ｆｄｒＢ、ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢ、ｆｕｍＣ、ｇｌｔＡ、ｉｃｄ、ｍｄｈ、ｍｑｏ、ｐｐｃ、ｐｒｐＣ、ｐｒｐＤ、ｓｄｈＡ、ｓｄｈＢ、ｓｄｈＣ、ｓｄｈＤ、ｓｕｃＡ、ｓｕｃＢ、ｓｕｃＣ、ｓｕｃＤ、ｙａｈＦおよびｙｂｈＪを含み；ＥＭＰ（解糖）は、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｃｒａ、ｅｎｏ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、ｇｐｍＡ、ｇｐｍＭ、ｌｐｄ、ｐｆｋＢ、ｐｇｊ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｔｐｉＡおよびｇａｐＣを含み；ＥＤは、ｐｇｉ、ｚｗｆ、ｐｇｌ、ｅｄｄおよびｅｄａを含み；ＲｕＭＰは、ｍｅｄｈ、ｈｐｓ、ｐｈｉ、ｔａｌ、ｔｋｔ、ｒｐｅ、およびｒｐｉＡを含む。代謝経路によってソートされたＴＰＭセットを、それらが、ｑＲＴ－ＰＣＲセクションにおいて言及された方法論によって他のものから実質的に異なるかを評価した。

欠失遺伝子の復帰およびそれらの表現型効果の評価。ｐｆｋＡ、ｆｒｍＡ、ｇａｐＡの天然オペロンを、ＡｍｐＲ選択マーカーを有するＢＡＣ（細菌人工染色体）にクローニングし、もとのＳＭ１株に形質転換した。次いで、ｐｆｋＡ、ｆｒｍＡ、ｇａｐＡ、またはｐｆｋＡおよびｇａｐＡの両方を再発現するＳＭ１株を、４００ｍＭのメタノール培地に再接種した。成長曲線を記録し、空ＢＡＣで形質転換されたＳＭ１株と比較した。

メタノール消費および発酵産物分析。試料を、１５０００ｒｐｍで３分間の遠心分離後、培養物の上清をアリコートすることによって調製し、次いで、０．２２フィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。メタノール濃度を、フレームイオン化検出器を有するＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ７８９０ガスクロマトグラフィーによって決定した。一定圧力の１９．０８２ｐｓｉの窒素ガスを、ＤＢ－６２４ＵＩカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０．３２ｍｍ×３０ｍ×０．２５μｍ）を通して、以下の段階からなる熱サイクル：最初４５℃で１分、１５０℃まで２０℃／分、および２４０℃まで４５℃／分のランプ速度と、最後の１分間の保持で、流した。

酢酸およびギ酸と名付けられた発酵産物を、Ｈｉ－ｐｌｅｘ Ｈカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３００×６．５ｍｍ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＵＰＬＣによって測定した。実行は、３０ｍＭの硫酸を含有する移動相を用い、０．６ｍＬ／分の流速で、３０分間行った。

定量化および統計分析。統計分析の詳細は、図の凡例または方法において見ることができる。すべてのデータは、他に明記されない限り、標準偏差を示すエラーバーを伴って、平均として表す。算出は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ、Ｒ、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ２０、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ２０２０およびＭａｔｌａｂ ２０１９ｂによってコンピューター計算した。

出発点としてのメタノール栄養要求性。合成メチロトローフを開発するために、ＲｕＭＰサイクルに基づくメタノール栄養要求性戦略を使用した（図１Ｂおよび図８Ａ）。これは、ｒｐｉＡＢ遺伝子を欠失させること、および遺伝子（ｍｅｄｈ、ｈｐｓ、ｐｈｉ）を利用してメタノールをインストールすることによって、ペントースリン酸経路の破壊を予言し、その結果、細胞は、キシロース単独ではないが、最小培地においてメタノールとキシロース上で成長することができる。そのため、メタノール資化を、進化の間の選択圧として使用することができる。以前に樹立されたＢＬ２１株の代わりに、ゲノム操作のより高い成功率に主に起因する栄養要求性Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ ΔｒｐｉＡＢ株を再構築する戦略を使用した。したがって、２つの合成オペロンを、安定発現のために組み込み（図８Ｂ）、ＣＦＣ３８１．０と名付けた。第１のオペロンは、ｍｅｄｈ（ＣＴ４－１、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒから操作）、ｈｐｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ由来）およびｐｈｉ（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ由来）の３つの異種遺伝子からなる。第２のオペロンは、ｔｋｔ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来のトランスケトラーゼをコードする）およびｔａｌ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のトランスアルドラーゼをコードする）と共に、同じｍｅｄｈおよびｐｈｉを含むが、異なるｈｐｓ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｂｕｒｙａｔｅｎｓｅ ５ＧＢ１Ｓ由来）を含む（図８Ｃ）。異なる生物由来の酵素は、Ｋｍまたは最適な基質濃度が異なり、さまざまな同一機能性酵素が同時に発現されて、代謝フラックスのバランスの柔軟性を最大化した。２０の液体移動サイクルまたは「継代」後、進化した株ＣＦＣ３８１．２０は、４００ｍＭのメタノールおよび２０ｍＭのキシロースを含有する最小培地において、４８時間で、０．１のＯＤ６００から１．０のＯＤ６００まで成長することができたが（図８Ｄおよび８Ｅ）、メタノールなしでは成長することができなかった。そのため、ＣＦＣ３８１．２０は、所望のメタノール栄養要求体表現型を実証した。

ＣＦＣ３８１．２０の全ゲノムシークエンシング（表２）は、ｆｒｍＡ遺伝子における４ｂｐの挿入を明らかにした。これは、ホルムアルデヒドフラックスが、効率的なメタノール依存性成長のための生合成経路に向かわなければならないことを示唆する。他の著しい変異は、ｇｎｄ（６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、Ｇｎｄをコードする）の短縮およびｆｄｏＧ（ギ酸デヒドロゲナーゼをコードする）のフレームシフトを含んでいた。Ｇｎｄは、ホルムアルデヒドをＣＯ２およびＮＡＤＰＨに変換する正味の反応により、Ｈｐｓ、Ｐｈｉ、Ｐｇｉ、およびＺｗｆと非生産的サイクルを形成する。同様に、ｆｒｍＡおよびｆｄｏＧは、過剰のＮＡＤＨを産生しながら、ホルムアルデヒドをＣＯ２まで排出させる。これらの変異は、進化を通して、メタノール要求性株が、効率的な生合成およびバイオマス蓄積のための生産的ＲｕＭＰサイクルから離れて競合するフラックスを低減したことを示した。このメタノール要求体株は、ＲｕＭＰサイクルのメタノール資化分岐が機能的であったことを実証した。しかしながら、リブロース－５－リン酸（Ｒｕ５Ｐ）の補充は、再生経路がｒｐｉＡＢ欠失によって破壊されたので、キシロースによって依然として供給された。

合成メチロトローフを作出するための合理的設計および進化。次に、ＣＦＣ３８１．２０が単独炭素源としてメタノールを利用することができるように、ｒｐｉＡを発現するＲＢＳライブラリーを持つプラスミド（ｐＦＣ１３９）を形質転換することによってＲｕＭＰサイクルを閉じるために実験を行った。残念ながら、株は、アミノ酸またはキシロースなどの限定的な栄養素を供給する間のメタノールの存在下での一連の進化後、限定的な成長の利益のみを獲得することができた。ＲｕＭＰサイクルにおける動的トラップが、メタノール資化の間にフラックスを削減したと仮定した。それらを特定するために、異なる動的パラメーターを有する多数のモデルを調べ、発現レベルに対して大部分が比例する酵素のＶｍａｘを変えることによってそれらを撹乱する、ロバスト性解析のためのアンサンブルモデリング（ＥＭＲＡ）（Ｌｅｅら、２０１４；Ｒｉｖｅｒａら、２０１５）を使用した。これは、次いで、撹乱後に不安定になるモデルを検出し、Ｖｍａｘの増加または減少後に安定なモデルのパーセンテージを報告する。ある特定の酵素が、小さな撹乱後に急に不安定になる場合、これは、動的トラップに関与し得る。この解析は、系において所望の代謝フラックス分布を促進するために、上方調節または下方調節が必要な酵素を示唆する定性的方法を提供する。

結果は、ホスホフルクトキナーゼ（Ｐｆｋ）およびグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）の高い活性が、ＲｕＭＰサイクルから離れてフラックスを転用すること（図２）およびサイクルの中間体の補充を防止することによって系を不安定化する傾向があることを明らかにした。したがって、これらの酵素活性は、Ｐｆｋ活性の９０％を占めるｐｆｋＡをノックアウトすること、およびＫ１２ ＢＷ２５１１３ ＧａｐＡ活性の約４０％を持つＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１由来のｇａｐＣ遺伝子でｇａｐＡ遺伝子を置き換えることによって低減された。次いで、得られた株のＣＦＣ５２６．０を、栄養素離脱の異なる戦略を用いる実験室進化に付した（図１Ｂ）。

具体的には、ＣＦＣ５２６．０を、メタノール、および既定の半最小培地であるアミノ酸を含有するＨｉ－Ｄｅｆ ａｚｕｒｅ（ＨＤＡ）を含有する培地において成長させた。ＨＤＡ量を、培養物が単独炭素源としてメタノール上で成長することができるまで、順次、低減し、メタノールＭＯＰＳ（ＭＭ）最小培地によって置き換えた。余分なビタミンを、より良好な細胞代謝のために提供した。メタノールが、電子に富む基質であり、酸素移動が、振とうフラスコ中で制限され得るので、栄養素も、酸素に加えて、余分な電子受容体として供給した。約１８０日および２１反復の後、培養物は、最終的に、任意のアミノ酸補充なしで、メタノール上で成長することができた（図３Ａおよび図９Ａ）。メタノール上で単独で成長するこの初期メチロトローフ培養物ＣＦＣ６８０．１は、ＯＤ６００＝１での飽和まで成長するのに２０日が必要であった。２０より多くの継代後、ＣＦＣ６８０．２０は、４１時間以内にＯＤ６００＝１まで成長した（図３Ｂ）。培養物は、同様に、硝酸塩を供給することなく進化し、硝酸塩なしで成長して、類似の成長速度に達することができる培養物ＣＦＣ６８８．２０を生じた（図３Ｃ）。独立して、別のメタノール成長性株のＣＦＣ５２６．２３は、より遅い栄養素低減戦略を用いることによって得られ、これを進化させて、ＣＦＣ５２６．５３を得た（図９Ｂ）。

すべての代謝産物がメタノールから誘導されたことを確実にするために、１３Ｃ標識実験を行った。ＣＦＣ６８０．８を、すべての同位体が定常状態に達するまで、１３Ｃメタノールを有するＭＭに６回通過させた。予想通り、酢酸は二重に標識されたが、ギ酸は、単一で標識された（図３Ｄおよび３Ｅ）。ｆｒｍＡが短縮されるにもかかわらず、テトラヒドロ葉酸媒介代謝または他の未知の経路のいずれかによっておそらく産生されたギ酸が依然として検出された。同位体標識実験は、メタノールが成長のための単独炭素源であったことの確かな証拠を提供した。

ＤＮＡ－タンパク質架橋の問題。これらのメチロトローフ培養物の１つの顕著な表現型は、培養物が対数期からではなく静止期（図４Ａ）から接種された場合の極めて長い誘導期（最高で２０日）であった。同様に、メタノール最小培地プレート上のコロニーは、液体最小培地において増殖することができなかった。微生物は、静止期培養物から接種された場合に誘導期を示すが、これらの合成メチロトローフＥ．ｃｏｌｉ培養物は、現れた極めて長い誘導期を超えて、「ノーリターンのポイント」を通り抜けたと思われた。フローサイトメトリーによる静止期での細胞の生存率のモニタリング後、データは、最高で細胞の１０％が死亡したことを示した（図４Ｂ）。死細胞を、ヨウ化プロピジウムで染色し、細胞膜の完全性が損傷を受けたことを示した。また、７％の細胞が、細胞選別のゲート領域により、著しい形状の変形を有していた。株が、主にホルムアルデヒド蓄積に起因する可能性がある、中間代謝物からの毒性を経験し得ると推測された。これは、ホルムアルデヒド解毒化経路全体を妨げる栄養要求性株から遺伝したｆｒｍＡの不活性化として予測された。

ホルムアルデヒド反応に感受性の広範囲の生体分子を調べると、ＤＮＡ－タンパク質架橋（ＤＰＣ）が、多分、ＤＮＡの複製、転写、翻訳およびタンパク質機能の破壊をもたらし得る細胞死の原因であったと仮定した（ＳｔｉｎｇｅｌｅおよびＪｅｎｔｓｃｈ、２０１５）。仮定を試験するために、ＤＰＣ産物を、改変ＤＮＡ抽出方法（ＱｉｕおよびＷａｎｇ、２００９ｂ）によって、メタノール成長性培養物から精製した。抽出物を脱架橋した後、タンパク質部分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。結果は、ＤＰＣが、培養物が静止期に達するにつれて起こったことを示唆した（図１０Ａ）。次いで、単離されたＤＰＣ産物を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して画像化し、ホルムアルデヒド架橋の重大度を明らかにした（図４Ｃ）。典型的には、ＤＮＡストリングが、ＴＥＭ観察のために細すぎるので、ＤＮＡは、チトクロムＣなどのタンパク質によるコーティングなしの陰性染色で見ることができなかった。

予想通り、対数期の間、多分、脱塩プロセスの間のタンパク質の残りに起因して、遊離タンパク質粒子のみが観察された。対照的に、培養物が静止期（１．２のＯＤ６００）に達したら、ＤＰＣレベルが増加し、タンパク質がホルムアルデヒド架橋に起因してＤＮＡを覆うにつれて、ＤＮＡストリング全体の可視化を引き起こした。また、タンパク質凝集を、ＤＮＡストリングに沿って観察することができた。１．５のＯＤ６００で、ホルムアルデヒド誘導性架橋は、極めて重大になり、ここで、ＤＮＡは、ＤＮＡ－タンパク質－ＤＮＡ架橋によって、またはさらにＤＮＡ－ＤＮＡ架橋によって、クモの巣様構造を形成し始めた。著しくは、加熱され、ＤＰＣが脱架橋されると、ＤＮＡストリングは消滅し、ＤＮＡ－タンパク質の非特異的結合または画像のオーバーラップの可能性を除外した。ＤＰＣは、細胞がより低いメタノール濃度で成長した場合、あまり重大ではなかった（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。

次いで、定量的プロテオミクスを実施して、５００超のタンパク質がＤＮＡと架橋したことを明らかにした。次いで、３つの独立した試料から最も高い存在量の１００タンパク質の共通する６１ヒットを、ヒートマップにより可視化した（図４Ｄおよび図１１）。培養物が静止期に入るにつれて、架橋タンパク質が増加する傾向があり、同じ培養物中のＤＰＣ産物のタンパク質存在量は、対数期と後期静止期との間で最大で７桁異なった。また、６１タンパク質の遺伝子オントロジー解析は、ＤＰＣが、リボソームおよび外膜タンパク質を主に構成したことを示唆したが、いくつかの代謝酵素、例えば、Ｍｅｄｈ、Ｔｋｔ、Ｔａｌ、ＡｃｅＡ、Ｅｎｏ、Ｐｙｋも特定された。これらのタンパク質の機能不全は、外膜ポーリン誘導性プログラム細胞死または代謝フラックスのアンバランスに起因して細胞死を引き起こし得る。また、リボソームの強固な存在も、転写および翻訳が、同様にＤＰＣによって大いに影響を受けたことを示唆した。ＤＰＣの蓄積は、静止期培養物から接種された場合に培養物が極めて長い誘導期を示す理由を説明することができ、単独炭素源としてメタノール上で成長するように、メタノールを利用しない細菌を進化させることの困難さも明らかにし得る。

進化した培養物における亜集団を明らかにするゲノムシークエンシング。特定された別の現象は、最初は、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）富栄養培地を通過した後、同じ培地で成長することができなかったように、培養物が、単独炭素源としてメタノール上で成長するように進化したことであった。この観察は、亜集団が進化の間に出現し、異なる培地中で富化されたことを意味した。ＣＦＣ５２６．０がメタノール中で成長するようにどのように進化したかを決定するために、進化した培養物を、進化プロセスに沿って配列決定した（図５Ａおよび図１２）。結果は、いくつかの変異が現れたが、次いで少ない継代内で消滅したことを示した。進化ラインに沿って、挿入配列エレメント２（ＩＳ２）が、オープンリーディングフレームから離れてそれらのプロモーターを遠ざける、ｇｌｔＡおよびｐｔｓＨの２つの遺伝子の上流に挿入された。したがって、ＴＣＡサイクルの活性は、妨げられ得るが、Ｈｐｒタンパク質をコードするｐｔｓＨは、不十分に発現され得、ｐｔｓ系の破壊を引き起こす。他の変異としては、ｐｇｉにおける１２ｂｐのインフレーム欠失、ならびに短縮されたｐｔｓＰおよびｐｒｏＱが挙げられる。興味深いことに、ｎｕｐＧおよびＳＳ３部位に組み込まれた２つのオペロンの内容物は、ｍｅｄｈ、ｈｐｓ、ｐｈｉ、ｔｋｔ、およびｔａｌを含み、未変化のままであった。

進化した混合培養物は、それらの染色体においてＩＳエレメントに隣接する３つの高カバレッジ領域を有していた：ＲｕＭＰ経路において多くの解糖系遺伝子および合成オペロンＰＬｌａｃＯ１：：ｍｅｄｈ－ｔｋｔ－ｔａｌ－ｈｐｓ－ｐｈｉを含有するｙｇｇＥからｙｇｈＯに及ぶ７０ｋ領域（図５Ｂ）、ジペプチドトランスポーターオペロン（ｄｄｐ）をコードする７ｋ領域（図５Ｃ）、およびいくつかの１６Ｓ ＲＮＡを含有するｒｒｓＡからｒｒｌＢまでの１３０ｋ領域。高カバレッジは、細胞がそれらの領域において遺伝子の発現を増加させ得ることを意味する。

プラスミド配列は、３つの異なるバージョンも示した（図５Ｄ）：ライブラリーからの特異的ＲＢＳを含有するもの（ｐＦＣ１３９Ａ）；ｒｐｉＡに対して上流の三重複非翻訳領域（ＵＴＲ）、ならびにｐ１５Ａ複製起点とｃａｔ遺伝子との間にＩＳ２挿入物を含有するもの（ｐＦＣ１３９Ｂ）；ｐＦＣ１３９Ａとして同じＲＢＳ、およびｃａｔ遺伝子のプロモーターの前に追加で挿入されたＩＳ２を含有するまた別のもの（ｐＦＣ１３９Ｃ）。

進化によるゲノム多様性を評価するために、７０ｋ領域のコピー数が、最大で５．６コピーまで徐々に増加したことを発見した（図６Ａ）。その一方で、プラスミドｐＦＣ１３９ＡおよびｐＦＣ１３９Ｂは、進化の早期段階で優位であったが、ｐＦＣ１３９Ｃは、進化の最後に、最終的に優位であった（図６Ｂ）。興味深いことに、コピー数は、ｐＦＣ１３９Ｂ存在量の増加と一致して、ＣＦＣ５２６．１７およびＣＦＣ５２６．２３において低下する（図６Ａおよび６Ｂ）。他方で、７０ｋおよび１３０ｋリピート、以前に言及した一塩基多様性（ＳＮＶ）およびｐＦＣ１３９Ｃは、培養物をＭＭからＬＢに接種した後に消滅した。代わりに、７ｋリピート領域およびｐＦＣ１３９Ｂを、培養物がＬＢにおいて成長した場合に選択した。

いくつかのＳＮＰと共にマルチコピー７０ｋ領域およびｐＦＣ１３９Ｃにおける干渉性の増加は、進化したＣＦＣ５２６およびＣＦＣ６８０培養物系列に２つの主な亜集団が存在することを意味する：ｐＦＣ１３９Ｃおよび７０ｋマルチコピー領域を含有する１つの実在合成メチロトローフ株（ＳＭ１）（図５Ｂ）、ならびにｐＦＣ１３９Ｂおよび７ｋマルチコピー領域を含有するが、７０ｋリピート領域を含有しない他の非メチロトローフ株（ＢＢ１）（図５Ｃ）。

純粋な合成メチロトローフ株の単離および特徴付け。いくつかの試みの後、ＳＭ１およびＢＢ１の単一コロニーを、単離し、ＳＭ１におけるｐｇｉ １２ｂｐ欠失などの固有の変異のコロニーＰＣＲ検査によって特定した。言及したように、ＳＭ１株の単離前に、進化した培養物は、ＬＢ中を通過した後、メタノール中で成長するそれらの能力を失った。これは、ＳＭ１からＢＢ１への突然の集団シフトによって説明することができ、ここで、後者は、単離された場合に、メタノール中で全く成長することができなかった。最終ＳＭ１株は、ＬＢにおける培養後でさえ、メタノール上で成長するその能力を維持する（図１３Ａ）。また、株は、任意の硝酸塩またはビタミン補充なしで成長することもできる（図１３Ｂ）。

ＳＭ１のＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑシークエンシングは、コピー数多型（ＣＮＶ）ランドスケープのいくつかが変化したことを除いて、最後の配列決定された混合培養物であるＣＦＣ５２６．３０と比較して、増加した頻度（１００％に近い）で類似のＳＮＶを示した（図６Ａ）。７０ｋおよび１３０ｋマルチコピー領域は残ったが、別の２４０ｋ重複が、ＳＭ１に現れた（図５Ｂ）。対照的に、高カバレッジの７ｋ領域は消滅し、これは、後に、ＢＢ１株の固有の特性として特定された（図５Ｃ）。

ゲノム構造を決定するために、ＳＭ１およびＢＢ１を、Ｐａｃｂｉｏ ＳｅｑｕｅｌおよびＮａｎｏｐｏｒｅシークエンシングで配列決定して、より長いリードを探索した。これらの長いリードのシークエンシングからのデノボのアセンブリーおよびマッピングの結果は、ゲノム構造を決定し、ゲノム配列を完成させるために役立った。Ｈｉｓｅｑシークエンシングからのいくつかの以前に特定された低頻度ＳＮＶは、実際に、ＩＳ挿入物であった（表２）。これらの長いシークエンシングリード（図１４Ａ）も、ＩＳ５隣接７０ｋ領域が、タンデムリピートから構成されたことを明らかにした（図５Ｂ）。特に、３つのタンデムリピートに及ぶＮａｎｏｐｏｒｅシークエンシングからのいくつかの極端に長いマッピングリード（１００～１３０ｋｂ）が現れた（図１４Ａ）。ＳＭ１および野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３を比較すると、いくつかのゲノム構造多様性が、挿入配列およびＣＮＶに起因して観察された（図１４Ｂ）。

有益なＩＳ媒介コピー数多型。進化の間に、７０ｋタンデムリピートのコピー数が増加し、単離されたＳＭ１株において４コピーをもたらした（図６Ａ）。ＣＮＶの細かい調整は、７０ｋタンデムリピートが、ｆｂａＡ、ｐｇｋおよびｙｇｇＦ（フルクトース－二リン酸アイソザイム）などの解糖および糖新生遺伝子も含有しながら、人工的に組み込まれたオペロンであるＰＬｌａｃＯ１：： ｍｅｄｈ－ｔｋｔ－ｔａｌ－ｈｐｓ－ｐｈｉの１つの役目を果たすので、それらが、合成メチロトロフィーにおいて役割を果たし得ることを意味する（図５Ｂ）。ＲｕＭＰ経路の酵素の上方調節は、メタノール資化の効率を増強し得る。ｙｇｇＦコピー数の増加は、Ｐｆｋフラックスをさらに減少させ得、これは、ＥＭＲＡ予測と一致する。ＳＭ１における７０ｋタンデムリピートのコピー数を、デジタルＰＣＲ、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング、および長いリードのシークエンシングカバレッジデータによって確認し、これは、類似の結果を示した。著しくは、７０ｋのコピー数は、株がＬＢにおいて成長した場合に、３に低減された。他方で、２４０ｋおよび１３０ｋの重複領域のコピー数は、進化経路の間に変わらなかった。

メタノール成長および７０ｋのＣＮＶの間の相関、ならびにＳＭ１株におけるＣＮＶの動態をさらに調べるために、ＳＭ１株の単一コロニーを集め、ＬＢに４回、次いでメタノール最小培地（ＭＭ）に通過させて、可能性があるＣＮＶを生成した。次いで、いくつかの単離された単一コロニーを、ＬＢ曝露後のそれらの７０ｋのＣＮＶおよびそれらのメタノール成長能力を追跡しながら、ＬＢにおける追加の一連の継代により、最後のＭＭ培養物から通過させた。７０ｋ領域のコピー数は、株がＬＢにより曝露されるにつれて、減少した（図６Ｃ）。興味深いことに、株をＭＭに戻して通過させた後、株は、そのコピー数を戻して増加した（図６Ｄ）。ＬＢおよびその後のＭＭにおける培養の間の７０ｋ領域のコピー数の相違は、すべての培養が、４．５超のコピー数に回復して戻るように管理されたので、一定ではなかった。また、それらのメタノール成長能力は、同様に影響を受け、メタノール成長速度および７０ｋコピー数の間に明確な相関があることを示した（図６Ｅ）。また、同じ継代で個々の生物学的リピートにわたるコピー数減少の速度は、一定であるように見え、この現象を内在する非確率プロセスが存在する可能性があることを示唆する。

他方で、ＢＢ株に固有の７ｋマルチコピー領域は、顕著な８５倍のカバレッジを特性化した（図５Ｃ）。この領域は、推定上のジペプチド輸送および利用であるｄｄｐオペロンの役目を果たし、ＢＢ１が、細胞死後のＳＭ１のデブリに由来するジペプチドを利用する目的のために共進化し得ることを示唆する。ＭＭ培地において静止期に入るか、またはＬＢを通過した後、この株は、迅速に引き継がれ、培養物を支配した。これは、株がＬＢプレートから直接単離された場合に、進化した混合培養物からＳＭ１を単離する際に経験した困難さを説明した。

ホルムアルデヒドフラックスの釣り合わせ。ホルムアルデヒドフラックスの釣り合わせは、ＤＰＣを回避するために有用である。この課題は、細胞が、メタノールのみの培地においてホルムアルデヒドと反応するためにＲｕ５Ｐを補充することが必要である場合に、特に困難である。ＳＭ１は、対数期においてこの課題を成し遂げたが、それが静止期に入ったら、失敗した。ＭＭ培地におけるＳＭ１のＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行い、１．１のＯＤ６００～０．７のＯＤ６００のｍＲＮＡ転写レベルを比較した。実際に、ＲｕＭＰ経路におけるｍＲＮＡプロファイルは、静止期において著しく変更された（図７Ａ）。ホルムアルデヒドと反応するＲｕ５Ｐの再生に関与するほとんどのＲｕＭＰ遺伝子の転写レベルは、劇的に減少したが、ホルムアルデヒド形成遺伝子（ｍｅｄｈ）は、あまり下方調節されなかった。その結果として、フラックスのアンバランスは、ホルムアルデヒドの蓄積を引き起こした。ｑＲＴ－ＰＣＲ法を使用して、発現の変化が、ＲＮＡ－ｓｅｑの結果と一致したことを検証した（図７Ａ）。ホルムアルデヒド形成およびホルムアルデヒド消費のフラックスの間の細かいバランスは、細胞がそれらのトランスクリプトームにおいて非常に大きな変化を伴って静止期に進む場合に極めて重要であったと思われた（図７Ｂ）。Ｅｎｔｎｅｒ－Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路（ＥＤ）が、細胞において機能的であったが、その転写物はＥＭＰ経路よりも大幅に低いことに留意されたい。ＥＤ経路は、Ｒｕ５Ｐを再生するＲｕＭＰ経路に入るための別のルートを提供し、このようにして、ホルムアルデヒドを消費するフラックスに同様に寄与する。興味深いことに、ＥＤ経路遺伝子も、ホルムアルデヒド生成遺伝子であるｍｅｄｈよりも下方調節され、静止期においてＤＰＣ形成に寄与した。

合成メチロトロフィーのための有益な変異。ＳＭ１の進化における成功についての重要な理由は、ｐｆｋＡおよびｇａｐＡの欠失、ならびにｇａｐＣの発現を含むＥＭＲＡによって導かれた合理的な設計であった。これらのゲノム変化を、ホルムアルデヒドを資化するために、Ｒｕ５Ｐを補充するより多くのフラックスを向かわせるように設計した。実験室進化の間に導入された他の変異と共にこれらのゲノム編集の重要性を検証するために、ある特定の変化が、ＳＭ１において明らかにされ、それらの表現型を試験した。ｆｒｍＡ、ｐｆｋＡ、ｇａｐＡ、ｐｇｉ、ｇｌｔＡ、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＰおよびｐｒｏＱを、細菌の天然プロモーター下で、細菌人工染色体（ｐＢＡＣ）にクローニングした。結果は、これらの遺伝子の野生型バージョンの再インストールがすべて、メタノール成長に対して負の効果を引き起こしたことを示した（図７Ｃ）。具体的には、ｆｒｍＡ、ｇａｐＡ、ｐｇｉおよびｐｔｓＰが、最も著しい効果を示し、これらの変異が、ＳＭ１成長に対して特に有益であったことを示した。また、ｐｆｋＡおよびｇａｐＡの両方が、同時に再導入された場合、株は、成長をほとんど停止し、１のＯＤ６００に戻して成長を回復するのに７日が必要であった。したがって、合理的に設計されたｐｆｋＡおよびｇａｐＡゲノム編集は、メタノール中での効率的な成長に向けたゲノム進化のための経路を効率的に作出した。

以前に言及されたように、ｇｌｔＡのプロモーター領域におけるＩＳ２挿入を特定した。ｐＢＡＣにおけるｇｌｔＡのコピーの再発現は、成長速度をわずかに低減し、ＩＳ２挿入がＳＭ１成長において役割を果たしたことを示唆した。また、ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、ＴＣＡサイクルの遺伝子の１００万個あたりの転写物（ＴＰＭ）が、ＳＭ１における解糖およびＲｕＭＰサイクルなどの他の主な代謝経路よりも非常に低かったことを示した。

ＳＭ１における１２ｂｐ欠失ｐｇｉ遺伝子によってコードされたＰｇｉバリアントが発現され、Ｈｉｓタグ化した。興味深いことに、このＰｇｉバリアントは、より高い比活性をもたらし、おそらく、成長のためのＮＡＤＰＨを産生するＺｗｆを通してフラックスを増加させた（図７Ｄ）。野生型Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＮＡＤＰＨは、主に３つの起源に由来する：ＴＣＡサイクルにおけるＩｃｄ、酸化的ペントースリン酸経路におけるＧｎｄおよびＺｗｆ。Ｇｎｄが欠失し、ＴＣＡサイクルの活性が、ＲＮＡ－ｓｅｑデータから推定されるように低いので、Ｚｗｆは、成長のための主なＮＡＤＰＨ起源になり得る。加えて、Ｚｗｆを通るフラックスは、Ｇ３Ｐを生成するＥＤ経路に直接入り、これは、メチロトローフ成長のためにＲｕ５Ｐを再生するＲｕＭＰ経路において再利用のためのＲｕ５Ｐを生成するために使用することができる。

ＳＭ１株の成長の特徴付け。この株は、単独炭素源として５０ｍＭから１．２Ｍまでの広い濃度範囲のメタノール中で、硝酸塩を含まずに、成長することができた（図７Ｅ）。株が、８時間の倍加時間で、０．１から１．０のＯＤ６００まで３０時間で成長し、およそ１２０ｍＭのメタノールを消費して、１．９の最終Ｄ６００に達したので、最適な成長は、およそ４００ｍＭのメタノールで観察された。ギ酸および酢酸は、主な産物であった（図７Ｆ）。

本発明のいくつかの実施形態を記載した。それにもかかわらず、さまざまな改変を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行い得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。

Claims (19)

1. 単独炭素源としてメタノール上で成長し、１２時間未満の倍加時間（ＴＤ）を有する、合成メチロトローフ（ＳＭ）。
2. メタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、
   ヘキスロース－６－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
   ３－ヘキスロース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチド
   を発現し、
   ホスホグルコイソメラーゼ活性を有するポリペプチドの増加した活性を含み、
   単独炭素源としてメタノール上で成長することができる、請求項１に記載のＳＭ。
3. グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼポリペプチド、ホスホフルクトキナーゼポリペプチド、Ｓ－（ヒドロキシメチル）グルタチオンデヒドロゲナーゼポリペプチド、ヒスチジン含有タンパク質、および／またはＰｒｏＱポリペプチドのうちの１つまたは複数の発現または活性の欠失または低減を含有する、請求項１または２に記載のＳＭ。
4. ＳＭのゲノム内の任意の領域の増加したコピー数多型を有する、請求項１、２または３に記載のＳＭ。
5. ｙｇｇＥからｙｇｈＯ、ｒｒｓＡからｒｒｌＢ、および／またはｙｇｉＧからｓｍｆ、および／またはｏｓｍＣからｄｏｓＰの間の２～８５の領域の１つまたは複数のコピー数多型の増加を有する、請求項１、２、３または４に記載のＳＭ。
6. Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、ＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種からなる群から選択される親微生物を操作することによって得られる、請求項１～５のいずれか一項に記載のＳＭ。
7. 親微生物が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項６に記載のＳＭ。
8. リボース－５－リン酸イソメラーゼＡをさらに発現する、前述の請求項のいずれか一項に記載のＳＭ。
9. メタノール上で成長した場合に、ＡＴＣＣ寄託受託番号ＰＴＡ－１２６７８３の倍加時間および産物プロファイルを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載のＳＭ。
10. ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２６７８３を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＭ１と名付けられた合成メチロトローフ。
11. 代謝物を産生するための方法であって、メタノールを含む培地中で請求項１～１０のいずれか一項に記載のＳＭを成長させることを含み、メタノールが、ＳＭ細菌のための唯一の炭素源であり、それにより、代謝物が産生される、方法。
12. 代謝物が、４－炭素化学物質、二酸、３－炭素化学物質、高級カルボン酸、高級カルボン酸のアルコール、カロテノイド、カンナビノイド、イソプレノイド、およびポリヒドロキシアルカノエートからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 代謝物が、コハク酸、エタノール、およびｎ－ブタノールからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
14. メタノール上で成長し、
    メタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、
    ヘキスロース－６－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、
    ヘキスロース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチド
    を発現し、
    ホスホグルコイソメラーゼ活性を有するポリペプチドの増加した活性を含む、組換え微生物。
15. Ｃ１炭素源を資化し、Ｍｅｄｈ、Ｈｐｓ、Ｐｈｉ、Ｐｇｉ、ＲｐｉＡ、Ｔｋｔ、Ｔａｌ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される複数の酵素を含む、組換え微生物。
16. Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１５に記載の組換え微生物。
17. ｐｆｋＡ、ｇａｐＡ、ｆｒｍＡ、ｐｔｓＨ、ｐｒｏＱ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子の低減またはノックアウトをさらに含む、請求項１５に記載の組換え微生物。
18. 遺伝子の増幅領域をさらに含む、請求項１５に記載の組換え微生物。
19. メタノールデヒドロゲナーゼ活性、ヘキスロース－６－リン酸シンターゼ活性、６－ホスホ－３－ヘキスロースイソメラーゼ活性、グルコースリン酸イソメラーゼ活性およびリボースリン酸イソメラーゼＡ活性を有するポリペプチドをコードする１つもしくは複数の異種ポリヌクレオチドを発現するか、または１つもしくは複数の異種ポリヌクレオチドを過剰発現し、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ活性の同時低減または消失、Ｓ－（ヒドロキシメチル）グルタチオンデヒドロゲナーゼ（ＦｒｍＡ）活性の低減または消失、ホスホキャリアタンパク質ＨＰｒ（ヒスチジン含有タンパク質、ＨＰｒおよび／またはＰｔｓＨとも称される）活性の低減または欠失、ならびにＰｒｏＱの低減または消失を提供する組換え微生物であって、メタノール上で成長する、組換え微生物。