JP2023534206A - 肺に治療薬を送達するための脂質ナノ粒子 - Google Patents

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Abstract

本発明の特定の実施形態は、肺に核酸治療薬を送達するための脂質ナノ粒子を提供する。【選択図】図７

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年７月１０日に出願された米国出願第６３／０５０，５９４号の優先権の利益を主張するものである。
カチオン性脂質を含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、様々な活性薬剤及び治療剤の送達に使用されてきた。しかしながら、これらの薬剤を体の特定の部位、例えば肺に送達することができるＬＮＰが必要とされている。したがって、治療剤の送達に使用することができる改善されたＬＮＰ製剤が必要とされている。肺の上皮細胞へのこれらの薬剤の送達が特に目的とされる。
本明細書に記載のように、特定のＬＮＰ製剤では、治療薬（例えば、ｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ等の核酸治療薬）を肺組織に送達するのに有効であることが発見されている。また、カチオン性脂質、例えば、ケイ素脂質の組み合わせを含む）これらのＬＮＰ製剤は、非生物分解性脂質を含む製剤と比較して、より急速に肺から排出される。
肺への活性薬剤の送達には、ＬＮＰが軽減できる可能性のあるいくつかの問題がある。気道への送達は、呼吸上皮の粘膜関門が気道への微粒子の導入時に繊毛クリアランスを促進するため、複雑である。さらに、負に荷電した核酸は細胞膜通過することができず、そのため、細胞内送達には援助を必要とする。ＬＮＰは、これらの核酸を標的部位に効率的に封入、保護し、かつ送達することができる。本明細書での新規製剤は、血清安定性を付与し、粘膜での捕捉を低減して、エンドソーム脱出を促進し、構造完全性を提供するよう操作されている。
したがって、本明細書では、核酸－脂質粒子を含む製剤が提供され、核酸－脂質粒子は、
１つ以上の核酸分子と、
約０．１％～約０．９％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、
約４０％～約８０％のカチオン性脂質と、
非カチオン性脂質と、を含み、
製剤は、エアロゾル化された製剤である。
また、
（ａ）１つ以上の核酸分子と、
（ｂ）非カチオン性脂質と、
（ｃ）複合脂質と、
（ｄ）少なくとも２つの式（Ｉ）のカチオン性脂質の組み合わせと、を含む核酸－脂質粒子も提供される。
様々な用量の、Ｘ：６０（１０１／１０２）のｓｉＲＮＡ ＬＮＰによる２４時間のトランスフェクション後にＡ５４９細胞中に残存している相対的ＰＰＩＢを示す（ｎ＝３）。
１０１／１０２の比を様々に変えた、様々な用量の、０．５：６０（１０１／１０２）のｓｉＲＮＡ ＬＮＰによる２４時間のトランスフェクション後にＡ５４９細胞中に残存している相対的ＰＰＩＢを示す（ｎ＝３）。 様々な用量の、０．５：Ｘ（１０１／１０２）のｓｉＲＮＡ ＬＮＰによる２４時間のトランスフェクション後にＡ５４９細胞中に残存している相対的ＰＰＩＢを示す（ｎ＝３）。 １０１と共に使用された様々な量のＰＥＧに関するデータを示す。ＰＥＧ濃度を変えるとルシフェラーゼ発現が影響される。 １０３と比較した１０１及び１０２等が含まれる、本明細書に記載される生物分解性脂質のクリアランス等の肺からの脂質クリアランスに関するデータを示す。 カチオン性脂質１０１及び１０２、ならびに使用したそれらの比の変化に関するデータを示す。脂質及び比を変えるとルシフェラーゼ発現が影響される。 ０．５：Ｘ（１０１／１０２）のｍＲＮＡ ＬＮＰの５μｇにての投与の６時間後の肺でのルシフェラーゼ発現を示す結果を示す（ｎ＝４、Ｂａｌｂ／Ｃマウス）。
本明細書では、核酸－脂質粒子を含む製剤が提供され、核酸－脂質粒子は、
１つ以上の核酸分子と、
約０．１％～約０．９％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、
約４０％～約８０％のカチオン性脂質と、
非カチオン性脂質と、を含み、
製剤は、エアロゾル化された製剤である。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、約０．２％～約０．８％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約４５％～約７５％のカチオン性脂質を含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、約０．２％～約０．７％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約４５％～約７５％のカチオン性脂質を含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、約０．２％～約０．６％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約５０％～約７０％のカチオン性脂質を含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、約０．２％～約０．５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約５５％～約６５％のカチオン性脂質を含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、約０．２％～約０．５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約６０％のカチオン性脂質を含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、約０．２５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約６０％のカチオン性脂質を含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、
０．２５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、
３０％の第１のカチオン性脂質と、
第１のカチオン性脂質と同じ場合も異なる場合もある、３０％の第２のカチオン性脂質と、
２２％～２６％のコレステロールと、
１３％～１７％のＤＳＰＣと、を含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、約０．５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約６０％のカチオン性脂質を含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、
０．５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、
３０％の第１のカチオン性脂質と、
第１のカチオン性脂質と同じ場合も異なる場合もある、３０％の第２のカチオン性脂質と、
２２％～２６％のコレステロールと、
１３％～１７％のＤＳＰＣと、を含む。
特定の実施形態では、製剤は、以下の式（Ｉ）の、少なくとも１つのカチオン性脂質、または第１と第２のカチオン性脂質の組み合わせを含み、
Figure 2023534206000002
 式中、
Ｒ１は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
Ｒ２は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
Ｒ３は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
Ｘは、二価のＣ２－Ｃ８アルキルであり、
Ｒ４は、ＮＲａＲｂであり、かつ
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ、独立して、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルからなる群から選択され、そのメチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルは、任意選択でヒドロキシで置換されるか、またはＲａとＲｂが、それらが結合している窒素と一緒になってアジリジン環、アゼチジン環、プロリン環、ピペリジン環、ピペラジン環、もしくはモルホリン環を形成し、その環は、ヒドロキシル、もしくは任意選択でヒドロキシで置換されるＣ１－Ｃ６アルキルで任意選択で置換される。
特定の実施形態では、カチオン性脂質（複数可）は、独立して、実施例１～２３のいずれか１つに記載のようなカチオン性脂質から選択される。
特定の実施形態では、カチオン性脂質の組み合わせは、実施例２４に記載のような組み合わせを含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、
０．２５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡと、
３０％のカチオン性脂質化合物１０１と、
３０％のカチオン性脂質化合物１０２と、
２２％～２６％のコレステロールと、
１３％～１７％のＤＳＰＣと、を含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、
０．２５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡと、
３０％のカチオン性脂質化合物１０１と、
３０％のカチオン性脂質化合物１０２と、
２４．２％のコレステロールと、
１５．２％のＤＳＰＣと、を含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、
０．５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡと、
３０％のカチオン性脂質化合物１０１と、
３０％のカチオン性脂質化合物１０２と、
２２％～２６％のコレステロールと、
１３％～１７％のＤＳＰＣと、を含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子は、
０．５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡと、
３０％のカチオン性脂質化合物１０１と、
３０％のカチオン性脂質化合物１０２と、
２４．２％のコレステロールと、
１５．２％のＤＳＰＣと、を含む。
特定の実施形態では、核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、自己増幅ＲＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
特定の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡである。
特定の実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡである。
特定の実施形態では、非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体である。
特定の実施形態では、複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートである。
特定の実施形態では、複合脂質は、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡである。
特定の実施形態では、ＰＥＧは、約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、脂質と薬物の比は約１２：１～約２０：１である。
特定の実施形態では、脂質と薬物の比は約２０：１である。
また、細胞に核酸を導入するための方法も提供され、かかる方法は、細胞を本明細書に記載される製剤と接触させることを含む。
また、核酸のｉｎ ｖｉｖｏ送達のための方法も提供され、かかる方法は、哺乳類対象に本明細書に記載される製剤を投与することを含む。
また、疾患または障害を治療することを必要とする哺乳類対象においてそれを行うための方法も提供され、かかる方法は、哺乳類対象に、治療有効量の本明細書に記載される製剤を投与することを含む。
特定の実施形態では、製剤は、吸入により投与されるネブライザー用製剤である。
特定の実施形態では、投与は、鼻腔内または気管内である。
特定の実施形態では、疾患または障害は、肺の疾患または障害である。
また、核酸分子を哺乳類の肺に送達するための、本明細書に記載の製剤または脂質ナノ粒子も提供される。
高含量のＰＥＧ－脂質（例えば、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡが１ｍｏｌ％超）を含有するＬＮＰのエアロゾル化時に、粒子特性の大幅な変化が観察される。多くの場合、これにより粒径の増大及び核酸封入の低減が生じる。規制の観点から、医薬品においては特性の変化は望ましくない。さらに、粒子が大きいほど、粘膜関門に閉じ込められるリスクが高くなり、それにより、気道上皮の標的細胞への送達が制限される。また、ペイロードの封入の喪失は、ペイロードの分解をもたらし、治療可能性が低下する。したがって、ＰＥＧ－脂質含量が比較的低い本明細書に記載されるＬＮＰは、比較的高含量のＰＥＧ－脂質を含有するＬＮＰのエアロゾル化時に観察される粒子特性の変化を示すことがないという利点を有するはずである。
また、本明細書では、特定の実施形態において、
（ａ）１つ以上の核酸分子と、
（ｂ）非カチオン性脂質と、
（ｃ）複合脂質と、
（ｄ）少なくとも２つの式（Ｉ）のカチオン性脂質の組み合わせと、を含む核酸－脂質粒子も提供され、
Figure 2023534206000003
 式中、
Ｒ１は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
Ｒ２は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
Ｒ３は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
Ｘは、二価のＣ２－Ｃ８アルキルであり、
Ｒ４は、ＮＲａＲｂであり、かつ
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ、独立して、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルからなる群から選択され、そのメチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルは、任意選択でヒドロキシで置換されるか、またはＲａとＲｂが、それらが結合している窒素と一緒になってアジリジン環、アゼチジン環、プロリン環、ピペリジン環、ピペラジン環、もしくはモルホリン環を形成し、その環は、ヒドロキシル、もしくは任意選択でヒドロキシで置換されるＣ１－Ｃ６アルキルで任意選択で置換される。
特定の実施形態では、各脂質のＲ１は、独立して、二重結合を１つのみ有するＣ２－Ｃ２０ヒドロカルビル、Ｃ２－Ｃ１５ヒドロカルビル、Ｃ２－Ｃ１０ヒドロカルビル、Ｃ５－Ｃ２０ヒドロカルビル、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキル、（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキニル、または（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニルである。
特定の実施形態では、各脂質のＲ１は、独立して、（Ｚ）－４－デセン－１－イル、１－ノニル、３－ウンデシル、１－デシル、６（Ｚ），１５（Ｚ）－ヘンイコサンジエン－１１－イル、３－ヘキセン－１－イル、９（Ｚ）－オクタデセン－１－イル、または２－ブチルオクタ－１－イル、４－（１－メチルエテニル）シクロヘキセン－１－イルメチルである。
特定の実施形態では、各脂質のＲ２は、独立して、二重結合を１つのみ有するＣ２－Ｃ２０ヒドロカルビル、Ｃ２－Ｃ１５ヒドロカルビル、Ｃ２－Ｃ１０ヒドロカルビル、Ｃ５－Ｃ２０ヒドロカルビル、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキル、（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキニル、または（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニルである。
特定の実施形態では、各脂質のＲ２は、独立して、（Ｚ）－４－デセン－１－イル、１－ノニル、３－ウンデシル、１－デシル、６（Ｚ），１５（Ｚ）－ヘンイコサンジエン－１１－イル、３－ヘキセン－１－イル、９（Ｚ）－オクタデセン－１－イル、または２－ブチルオクタ－１－イル、４－（１－メチルエテニル）シクロヘキセン－１－イルメチルである。
特定の実施形態では、各脂質のＲ３は、独立して、二重結合を１つのみ有するＣ２－Ｃ２０ヒドロカルビル、Ｃ２－Ｃ１５ヒドロカルビル、Ｃ２－Ｃ１０ヒドロカルビル、Ｃ５－Ｃ２０ヒドロカルビル、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ２０）アルケニル、または（Ｃ２－Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキル、（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキニル、または（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニルである。
特定の実施形態では、各脂質のＲ３は、独立して、（Ｚ）－４－デセン－１－イル、１－ノニル、３－ウンデシル、１－デシル、６（Ｚ），１５（Ｚ）－ヘンイコサンジエン－１１－イル、３－ヘキセン－１－イル、９（Ｚ）－オクタデセン－１－イル、アダマントリ（ａｄａｍａｎｔｌｙ）－１－イルメチル、２－ブチルオクタ－１－イル、（Ｚ）－２－（（Ｚ）－デカ－４－エン－１－イル）ドデカ－６－エン－１－イル、または４－（プロパ－１－エン－２－イル）シクロヘキサ－１－エン－１－イル）メチルである。
特定の実施形態では、各脂質のＸは、独立して、二価のＣ２－Ｃ６アルキルである。
特定の実施形態では、各脂質のＸは、独立して、二価のＣ３－Ｃ５アルキルである。
特定の実施形態では、各脂質のＸは、独立して、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
特定の実施形態では、各脂質のＸは、独立して－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
特定の実施形態では、各脂質のＸは、独立して、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
特定の実施形態では、各脂質のＲａ及びＲｂはそれぞれ、独立して、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルからなる群から選択され、そのメチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルは、任意選択でヒドロキシで置換される。
特定の実施形態では、脂質ごとに独立して、ＲａとＲｂは、それらが結合している窒素と一緒になってアジリジン環、アゼチジン環、プロリン環、ピペリジン環、ピペラジン環、またはモルホリン環を形成し、その環は、ヒドロキシル、もしくは任意選択でヒドロキシで置換されるＣ１－Ｃ６アルキルで任意選択で置換される。
特定の実施形態では、各脂質のＲａ及びＲｂはそれぞれ、独立して、メチル及びエチルからなる群から選択される。
特定の実施形態では、各脂質のＲ４は、独立して、ジメチルアミノである。
特定の実施形態では、カチオン性脂質（複数可）は、独立して、実施例１～２３のいずれか１つに記載のようなカチオン性脂質から選択される。
特定の実施形態では、カチオン性脂質の組み合わせは、実施例２４に記載のような組み合わせを含む。
特定の実施形態では、核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、自己増幅ＲＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
特定の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡである。
特定の実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡである。
特定の実施形態では、非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体である。
特定の実施形態では、複合脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートである。
特定の実施形態では、複合脂質は、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡである。
特定の実施形態では、ＰＥＧは、約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。
特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質と総カチオン性脂質のモル比は、約：
０．１～０．９％のＰＥＧ脂質（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９）：及び
４０～８０％の総カチオン性脂質（例えば、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０）である。
特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質と総カチオン性脂質のモル比は、約：
０．２～０．８％のＰＥＧ脂質、及び
４５～７５％の総カチオン性脂質である。
特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質と総カチオン性脂質のモル比は、約：
０．３～０．７％のＰＥＧ脂質、及び
５０～７０％の総カチオン性脂質である。
特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質と総カチオン性脂質のモル比は、約：
０．４～０．６％のＰＥＧ脂質、及び
５５～６５％の総カチオン性脂質である。
特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質と総カチオン性脂質のモル比は、約：
０．５％のＰＥＧ脂質、及び
６０％の総カチオン性脂質である。
特定の実施形態では、総カチオン性脂質は、２つの式（Ｉ）の脂質から選択される２つのカチオン性脂質を含み、２つのカチオン性脂質のモル比は約２５：７５である。
特定の実施形態では、総カチオン性脂質は、２つの式（Ｉ）の脂質から選択される２つのカチオン性脂質を含み、２つのカチオン性脂質のモル比は約５０：５０である。
特定の実施形態では、総カチオン性脂質は、２つの式（Ｉ）の脂質から選択される２つのカチオン性脂質を含み、２つのカチオン性脂質のモル比は約７５：２５である。
特定の実施形態では、脂質と薬物の比は約１２：１～約２０：１である。
特定の実施形態では、脂質と薬物の比は約２０：１である。
また、本明細書では、本明細書に記載される核酸－脂質粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供される。
また、本明細書では、細胞に核酸を導入するための方法も提供され、かかる方法は、細胞を、本明細書に記載される核酸－脂質粒子または組成物と接触させることを含む。
また、本明細書では、核酸のｉｎ ｖｉｖｏ送達のための方法も提供され、かかる方法は、本明細書に記載される核酸－脂質粒子または組成物を哺乳類対象に投与することを含む。
また、本明細書では、疾患または障害を治療することを必要とする哺乳類対象においてそれを行うための方法も提供され、かかる方法は、治療有効量の本明細書に記載される核酸－脂質粒子または組成物を哺乳類対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、核酸－脂質粒子または組成物はエアロゾル製剤（例えば、ネブライザー用製剤）になっており、吸入により投与することができる。
特定の実施形態では、投与は、鼻腔内または気管内である。
特定の実施形態では、疾患または障害は、肺の疾患または障害である。
また、本明細書では、哺乳類の肺に核酸分子を送達するための、本明細書に記載される核酸の脂質粒子または組成物も提供される。
また、本明細書では、哺乳類の肺に核酸分子を送達するための核酸－脂質粒子も提供され、
（ａ）１つ以上の核酸分子と、
（ｂ）非カチオン性脂質と、
（ｃ）複合脂質と、
（ｄ）本明細書に記載される式（Ｉ）の少なくとも１つの第１のカチオン性脂質と、を含み、その核酸－脂質粒子にはまた、式（Ｉ）の少なくとも１つの異なる第２のカチオン性脂質及び／または式（Ｉ）ではない第２のカチオン性脂質も含まれ得る。
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に明記しない限り以下に定める意味を有する。
「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」という用語は、標的とする遺伝子または配列と同じ細胞内に干渉ＲＮＡがある場合に、標的とする遺伝子または配列の発現を（例えば、干渉ＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの分解を仲介するかまたはその翻訳を阻害することにより）低減させるかもしくは阻害する能力がある、一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、またはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ等の二重鎖ＲＮＡ）を指す。したがって、干渉ＲＮＡとは、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な一本鎖ＲＮＡ、または２本の相補鎖によるかもしくは１本の自己相補鎖により形成された二本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的とする遺伝子もしくは配列との実質的もしくは完全な同一性を有する場合もあれば、ミスマッチ領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含む場合もある。干渉ＲＮＡの配列は、全長標的遺伝子またはその部分列に対応し得る。
干渉ＲＮＡには、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、例えば、長さが約１５～６０、１５～５０、または１５～４０（二重鎖）ヌクレオチド、より典型的には長さが約１５～３０、１５～２５、または１９～２５（二重鎖）ヌクレオチド、好ましくは長さが約２０～２４、２１～２２、または２１～２３（二重鎖）ヌクレオチドの干渉ＲＮＡ（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列が、１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５ヌクレオチド長、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３ヌクレオチド長であり、二本鎖ｓｉＲＮＡが、約１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５塩基対の長さ、好ましくは約１８～２２、１９～２０、または１９～２１塩基対の長さである）が含まれる。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１～約４ヌクレオチドまたは約２～約３ヌクレオチドの３’オーバーハング及び５’リン酸末端を含み得る。ｓｉＲＮＡの例には、鎖が別々の２つの分子から構築された二本鎖ポリヌクレオチド分子であって、一方の鎖がセンス鎖であり、他方が相補的アンチセンス鎖であるもの；一本鎖分子から構築された二本鎖ポリヌクレオチド分子であって、センス領域とアンチセンス領域が、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーにより連結されているもの；自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造のある二本鎖ポリヌクレオチド分子；ならびに２つ以上のループ構造及び自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域とを有するステムを有する、環状一本鎖ポリヌクレオチド分子であって、環状ポリヌクレオチドが、活性な二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成するようｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでプロセシングされ得るものが含まれるが、これらに限定されない。
好ましくは、ｓｉＲＮＡは化学合成される。ｓｉＲＮＡはまた、長いｄｓＲＮＡ（例えば、約２５ヌクレオチド長を超えるｄｓＲＮＡ）の、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ ＩＩＩまたはＤｉｃｅｒでの切断によっても生成され得る。これらの酵素は、ｄｓＲＮＡをプロセシングして生物学的に活性なｓｉＲＮＡにする（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：９９４２－９９４７（２００２）、Ｃａｌｅｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３６（２００２）、Ｂｙｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｂｉｏｎ ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ，１０（１）：４－６（２００３）、Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１：９８１－９８７（２００３）、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２２６９－２２７１（２００１）、及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：８２（１９６８）を参照されたい）。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチド長～約１００、２００、３００、４００、または５００のヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡは、１０００、１５００、２０００、５０００のヌクレオチド長、またはそれ以上長い場合がある。ｄｓＲＮＡは、遺伝子転写産物全体または遺伝子転写産物の一部分をコードすることができる。特定の場合では、ｓｉＲＮＡは、プラスミドによってコードされ得る（例えば、ヘアピンループを有する二重鎖に自発的にフォールディングする配列として転写される）。
本明細書で使用される場合、「ミスマッチモチーフ」または「ミスマッチ領域」という用語は、標的とする配列に対して相補性が１００％ではない、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）配列の一部分を指す。干渉ＲＮＡは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のミスマッチ領域を有し得る。ミスマッチ領域は、隣接している場合もあれば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくはそれ以上のヌクレオチドで区切られている場合もある。ミスマッチモチーフまたはミスマッチモ領域は、単一ヌクレオチドを含む場合もあれば、２、３、４、５、またはそれ以上のヌクレオチドを含む場合もある。
核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）等の活性薬剤または治療剤の「有効量」または「治療有効量」は、所望の効果、例えば、干渉ＲＮＡの非存在下で検出された正常発現レベルと比較した標的配列の発現の阻害を生じさせるのに十分な量、またはｍＲＮＡに導かれたある量のタンパク質の発現であって、そのタンパク質が発現される生体内に望ましい生物学的効果を引き起こす発現を生じさせるのに十分な量である。標的遺伝子または標的配列の発現の阻害は、干渉ＲＮＡを用いて得られる値が対照と比べて約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または０％である場合に達成される。他の実施形態では、発現タンパク質は、体内の細胞型で通常発現する活性型のタンパク質であり、ｍＲＮＡの治療有効量は、ある量のコードされたタンパク質を産生させる量であって、健常個体のその細胞型において通常発現するタンパク質量の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）である。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するのに好適なアッセイとしては、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、酵素機能、及び当業者に公知の表現型アッセイ等の当業者に公知の技法を使用する、タンパク質またはＲＮＡのレベルの検査が含まれる。
干渉ＲＮＡによる免疫応答を「低下させる」、「低下させること」、「低減させる」、または「低減させること」とは、所与の干渉ＲＮＡ（例えば、修飾干渉ＲＮＡ）に対する免疫応答の検出可能な低下を意味することが意図される。修飾干渉ＲＮＡによる免疫応答の低下量は、未修飾干渉ＲＮＡの存在下での免疫応答のレベルに対して決定され得る。検出可能な低下は、未修飾干渉ＲＮＡの存在下で検出される免疫応答よりも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上低くなり得る。干渉ＲＮＡに対する免疫応答の低下は、典型的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのレスポンダー細胞によるサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＩＬ－６、またはＩＬ－１２）の低下、または干渉ＲＮＡ投与後の、哺乳類対象の血清中のサイトカイン産生の低下により測定される。
ｍＲＮＡによる免疫応答を「低下させる」、「低下させること」、「低減させる」、または「低減させること」とは、所与のｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）に対する免疫応答の検出可能な低下を意味することが意図される。修飾ｍＲＮＡによる免疫応答の低下量は、未修飾ｍＲＮＡの存在下での免疫応答のレベルに対して決定され得る。検出可能な低下は、未修飾ｍＲＮＡの存在下で検出される免疫応答よりも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上低くなり得る。ｍＲＮＡに対する免疫応答の低下は、典型的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのレスポンダー細胞によるサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＩＬ－６、またはＩＬ－１２）の低下、またはｍＲＮＡの投与後の哺乳類対象の血清中のサイトカイン産生の低下により測定される。
本明細書で使用される場合、「レスポンダー細胞」という用語は、未修飾ｓｉＲＮＡ等の免疫刺激性干渉ＲＮＡと接触した場合に、検出可能な免疫応答を生じる細胞、好ましくは哺乳類細胞を指す。例示的レスポンダー細胞としては、例えば、樹状細胞、マクロファージ、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、脾細胞等が含まれる。検出可能な免疫応答としては、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＴＧＦ、及びそれらの組み合わせ等の、サイトカインまたは増殖因子の産生が含まれる。
「実質的同一性」とは、ストリンジェントな条件下で参照配列にハイブリダイズする配列、または参照配列の特定の領域にわたって特定の同一性パーセントを有する配列を指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、核酸が、典型的には核酸の複合混合物中で、その標的配列にはハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、状況が異なれば条件は異なってくる。長い配列ほど特に高温でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨでの特定の配列の熱融点（ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５～１０℃低くなるよう選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（定義されたイオン強度、ｐＨ及び核濃度（ｎｕｃｌｅｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）での）温度である（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有されている）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の添加で達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベートするか、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄する。ＰＣＲの場合、低ストリンジェンシーの増幅には約３６℃の温度が典型的であるが、アニーリング温度はプライマーの長さに応じて約３２℃～４８℃で変動し得る。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅の場合、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマーの長さ及び特異性に応じて約５０℃～約６５℃の範囲であり得る。高ストリンジェンシー増幅及び低ストリンジェンシー増幅の両方の典型的なサイクル条件には、９０℃～９５℃で３０秒～２分間の変性段階、３０秒～２分間続くアニーリング段階、及び約７２℃で１～２分間の伸長段階が含まれる。低ストリンジェンシー増幅反応及び高ストリンジェンシーの増幅反応についてのプロトコル及びガイドラインは、例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）に記載されている。
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号によって許容される最大限のコドンの縮重を使用して核酸のコピーが生成される場合に生じる。そのような場合、核酸は典型的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ中４５℃での洗浄が含まれる。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替的なハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件を利用して、同様のストリンジェンシー条件を得ることができることを容易に認識するであろう。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するためのさらなるガイドラインは、多数の参照文献、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓに記載されている。
２つ以上の核酸との関連における「実質的に同一」または「実質的同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用するか、もしくは手作業によるアラインメントと目視検査によって測定されるように、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって最大一致度について比較及びアラインメントを行った場合、同じである、または同じヌクレオチドを特定のパーセンテージ（すなわち、特定の領域にわたる少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性）を有する、２つ以上の配列または部分列を指す。この定義は、文脈で示される場合、配列の相補体も同様に指す。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０のヌクレオチド長である領域にわたり存在する。
配列比較の場合、典型的には、１つの配列が参照配列としての役割を果たし、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分列座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することも、また代替的パラメータを指定することもできる。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」には、約５～約６０、通常は約１０～約４５、より一般には約１５～約３０からなる群から選択されるいくつかの隣接位置のうちのいずれか１つのセグメントへの参照が含まれ、そこでは、ある配列と、隣接位置が同数の参照配列とが最適にアラインメントされた後で、その２本の配列が比較され得る。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によるか、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）によるか、または手作業でのアラインメント及び目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）によって行うことができる。
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、それらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。本発明の核酸の配列同一性パーセントを決定するために、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０を本明細書に記載されるパラメータを用いて使用する。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により公的に利用可能である。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の１つは最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然発生する確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、その核酸は参照配列と類似していると見なされる。
本明細書で使用される「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有するポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、予備縮合（ｐｒｅ－ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）ＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体及び組み合わせの形態であり得る。ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、自己増幅ＲＮＡ、及びそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸には、既知のヌクレオチド類似体または修飾骨格の残基または結合を含有する核酸が含まれ、それらは、合成のもの、天然に存在するのもの、及び天然には存在しないものであり、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体の例には、ホスホロチオアート、ホスホロアミダート、メチルホスホナート、キラル－メチルホスホナート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別段に示されていない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に示されている配列と同様に、保存的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１－９８（１９９４））。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介して共に連結されている。「塩基」には、プリン及びピリミジンが含まれ、それにはさらに、天然化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然類似体、ならびにプリン及びピリミジンの合成誘導体が含まれ、それらには、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、及びハロゲン化アルキル等のこれらに限定されない新たな反応性基を配置する修飾が非限定的に含まれる。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの生成に必要な、部分長または全長のコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。
本明細書で使用される場合、「遺伝子産物」とは、ＲＮＡ転写物またはポリペプチド等の遺伝子の産物を指す。
「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルが含まれるがそれに限定されない一群の有機化合物を指し、水に不溶性であるが多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする。それらは通常、（１）油脂及びロウが含まれる「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質が含まれる「複合脂質」、ならびに（３）ステロイド等の「誘導脂質」という少なくとも３つのクラスに分類される。
本明細書で使用される場合、「ＬＮＰ」という用語は、脂質－核酸粒子または核酸－脂質粒子（例えば、安定核酸－脂質粒子）を指す。ＬＮＰは、脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を防ぐ複合脂質）と核酸から作製された粒子であって、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ、またはプラスミド（干渉ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの転写元のプラスミドを含む））が脂質内に封入されている粒子を表す。一実施形態では、核酸は脂質に少なくとも５０％封入されており、一実施形態では、核酸は脂質に少なくとも７５％封入されており、一実施形態では、核酸は脂質に少なくとも９０％封入されており、一実施形態では、核酸は脂質に完全に封入されている。ＬＮＰは典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＬＮＰは、それらが静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に長期の循環寿命を示し得ること、それらが遠位部位（例えば、投与部位から物理的に隔てられた部位）で蓄積することができること、それらがこれら遠位部位において、トランスフェクトされた遺伝子の発現または標的遺伝子発現のサイレンシングを仲介することができることから、全身適用に極めて有用である。ＬＮＰは同様に、それらが核酸ペイロードを生物学的環境での分解から保護すること、また、これらの大きな高電荷分子を細胞膜を通過して標的細胞の細胞質へと輸送することができることから、局所投与に有用である。
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は典型的には、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、または約７０～約９０ｎｍの平均径を有し、実質的に無毒である。さらに、核酸は、本発明の脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許公開第２００４０１４２０２５号及び第２００７００４２０３１号に開示されており、それらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「脂質封入された」とは、核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）等の活性薬剤または治療剤を完全封入、部分封入、またはその両方で提供する脂質粒子を指し得る。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子に完全に封入されている（例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＬＮＰ、または他の核酸－脂質粒子を形成する）。
「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子の凝集を阻害する複合脂質を指す。そのような脂質コンジュゲートとしては、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、等のＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ジアルキルオキシプロピルに結合させたＰＥＧ、ジアシルグリセロールに結合させたＰＥＧ、コレステロールに結合させたＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンに結合させたＰＥＧ、セラミドに結合させたＰＥＧ（例えば、その開示があらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）、カチオン性ＰＥＧ脂質、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＧは、脂質に直接コンジュゲートすることができ、またリンカー部分により脂質に連結される場合もある。ＰＥＧを脂質に結合させるのに好適なリンカー部分を使用することができ、例えば、エステル非含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分が含まれる。特定の実施形態では、エステル非含有リンカー部分が使用される。
「両親媒性脂質」という用語は、一部には、脂質物質の疎水性部分が疎水性相に配向し、親水性部分は水相へと配向する、任意の好適な物質を指す。親水性の特性は、炭水化物、リン酸、カルボキシル、スルファート、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシル及び他の同様の基等の極性基または荷電基の存在に由来する。疎水性は、飽和及び不飽和の長鎖脂肪族炭化水素基、ならびにそのような基が１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式の基（複数可）により置換されているもの等を含め、これらに限定されない無極性基を含めることによって付与され得る。両親媒性化合物の例としては、リン脂質、アミノ脂質、及びスフィンゴ脂質が含まれるが、これらに限定されない。
リン脂質の代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、及びジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及びβ－アシルオキシ酸等のリンを欠く他の化合物もまた、両親媒性脂質とされる群に入る。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロール等の他の脂質と混合することができる。
「中性脂質」という用語は、選択ｐＨにて非荷電または中性の双性イオン形態のいずれかで存在するいくつかの脂質種のうちのいずれかを指す。生理的ｐＨにおいては、そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが含まれる。
「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質及び任意の他の中性脂質またはアニオン性脂質を指す。
「アニオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に荷電した任意の脂質を指す。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に連結している他のアニオン性修飾基が含まれるが、これらに限定されない。
「カチオン性脂質」という用語は、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨが約７．０）等の選択ｐＨにて実効正電荷を持ついくつかの脂質種のうちのいずれかを指す。驚くべきことに、不飽和の部位が複数、例えば、少なくとも２つまたは３つの不飽和部位があるアルキル鎖を含むカチオン性脂質が、膜流動性の高い脂質粒子を形成するのに特に有用であることが見出された。本発明においても有用ないくつかのカチオン性脂質及び関連類似体が米国特許公開第２００６００８３７８０号及び同第２００６０２４０５５４号；米国特許第５，２０８，０３６号；同第５，２６４，６１８号；同第５，２７９，８３３号；同第５，２８３，１８５号；同第５，７５３，６１３号；及び同第５，７８５，９９２号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０３９０号または第ＷＯ２０１３／１２６８０３号もしくは第ＷＯ２０１０／１４４７４０号に記載されており、それらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。カチオン性脂質の非限定的な例は、本明細書に詳述されている。場合によっては、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能）頭部基、Ｃ１８アルキル鎖、頭部基とアルキル鎖間のエーテル結合、及び０～３の二重結合を含む。そのような脂質としては、例えば、ＤＳＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、及びＤＯＤＭＡが含まれる。
カチオン性脂質は、例えば、以下、すなわち、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキサン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル（ｄｉｏｌｅｙｌｃａｒｂａｍｙｌ）－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、またはそれらの混合物、のうちの１つ以上を含み得る。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（「ＸＴＣ２」）、またはそれらの混合物である。
ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（「ＸＴＣ２」）、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、２００８年１０月９日に出願された米国仮出願第６１／１０４，２１２号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ、ＤＬｉｎ－ＤＡＣ、ＤＬｉｎ－ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ－ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、及びＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、２００８年１２月３１日に出願されたＰＣＴ出願第号ＰＣＴ／ＵＳ０８／８８６７６に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣＬｉｎＤＭＡ等のカチオン性脂質、ならびにさらなるカチオン性脂質の合成は、米国特許公開第２００６０２４０５５４号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
「カチオン性脂質」という用語は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物を指し得る。
「疎水性脂質」という用語は、飽和及び不飽和の長鎖脂肪族炭化水素基、ならびにそのような基が１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式の基（複数可）により任意選択で置換されているもの等を含め、これらに限定されない無極性基を有する化合物を指す。好適な例としては、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ－Ｎ－ジアルキルアミノ、１，２－ジアシルオキシ－３－アミノプロパン、及び１，２－ジアルキル－３－アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
「膜融合性」という用語は、ＬＮＰ等の脂質粒子が細胞の膜と融合する能力を指す。膜は、形質膜または細胞小器官、例えばエンドソーム、核等を取り囲む膜のいずれかであり得る。
本明細書で使用される場合、「水溶液」という用語は、水の全部または一部を構成する組成物を指す。
「有機脂質溶液」という用語は、脂質を有する有機溶媒の全部または一部を構成する組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「遠位部位」とは、物理的に隔てられた部位を指し、隣接する毛細血管床に限られるわけではなく、生体全体に広く分布する部位を含む。
ＬＮＰ等の核酸－脂質粒子に関連する「血清安定性」とは、遊離のＤＮＡまたはＲＮＡを著しく分解するような血清アッセイまたはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に、粒子が著しく分解されることがないことを意味する。好適なアッセイとしては、例えば、標準的な血清アッセイ、ＤＮＡｓｅアッセイ、またはＲＮＡｓｅアッセイが含まれる。
本明細書で使用される場合、「全身送達」とは、生体内での干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ等の活性薬剤または治療剤の広い生体内分布をもたらす、脂質粒子の送達を指す。ある特定の薬剤の全身送達をもたらすことができる投与技術もあれば、そうではない投与技術もある。全身送達とは、有用な量、好ましくは治療量の薬剤が体の大部分に曝露されることを意味する。広い生体内分布を得るには一般に、薬剤が投与部位から遠位の疾患部位に到達する前に、（初回通過器官（肝臓、肺等）または急速な非特異的細胞結合等により）急速に分解または排出されないような血中寿命が必要とされる。脂質粒子の全身送達は、例えば、静脈内、皮下、及び腹腔内等の当該技術分野で公知の任意の手段によるものであり得る。特定の実施形態では、脂質粒子の全身送達は、静脈内送達によるものである。
本明細書で使用される場合、「局所送達」とは、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ等の活性薬剤または治療剤を、肺等の生体内の標的部位に直接送達することを指す。
「哺乳類」という用語は、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜等の任意の哺乳類を指す。
「がん」という用語は、異常細胞の制御されない増殖を特徴とする疾患クラスの任意のメンバーを指す。この用語には、特徴が悪性、良性、軟部組織または固形であるかを問わない、あらゆる既知のがん及び腫瘍性疾患、ならびに転移前及び転移後を含め、あらゆる病期及びグレードのがんが含まれる。異なる種類のがんの例としては、肺癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ）ｃａｎｃｅｒ）、食道癌；胆嚢癌、肝癌、膵癌、虫垂癌、乳癌、卵巣癌；子宮頸癌、前立腺癌、腎癌（例えば、腎細胞癌）、中枢神経系のがん、神経膠芽腫、皮膚癌、リンパ腫、絨毛癌、頭頸部癌、骨原性肉腫、及び血液癌が含まれるが、これらに限定されない。特定の型の肝癌の非限定的な例としては、肝細胞癌（ＨＣＣ）、続発性肝癌（例えば、他のいくつかの非肝癌細胞型の転移に起因するもの）、及び肝芽腫が含まれる。本明細書で使用される場合、「腫瘍」は、１つ以上のがん性細胞を含む。
「アニオン前駆体基」という用語には、生理的ｐＨでイオンを形成する能力がある基が含まれる。例えば、この用語には、－ＣＯ２Ｈ、－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２、－ＯＳ（＝Ｏ）２（ＯＨ）、－Ｏ－Ｓ（＝Ｏ）（ＯＨ）、及び－Ｂ（ＯＨ）２という基が含まれる。一実施形態では、アニオン前駆体は、－ＣＯ２Ｈである。
特定の実施形態の説明
特定の実施形態では、本発明は、１つ以上の活性薬剤または治療剤を含む血清で安定な脂質粒子、その脂質粒子を作製する方法、ならびにその脂質粒子を（例えば、疾患または障害の治療のために）送達及び／または投与する方法、ならびにそれを含む組成物を提供する。
一態様では、本発明は、（ａ）１つ以上の活性薬剤または治療剤、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％を構成する１つ以上のカチオン性脂質、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％を構成する１つ以上の非カチオン性脂質、及び（ｄ）粒子中に存在する総脂質の０．１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質、を含む脂質粒子を提供する。
一態様では、本発明は、（ａ）１つ以上の活性薬剤または治療剤、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％を構成する１つ以上のカチオン性脂質、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％を構成する１つ以上の非カチオン性脂質、及び（ｄ）粒子中に存在する総脂質の０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する１つ以上の複合脂質、を含む脂質粒子を提供する。
特定の実施形態では、活性薬剤または治療剤は、脂質粒子中の活性薬剤または治療剤が水溶液中で、例えばヌクレアーゼまたはプロテアーゼによる、酵素による分解に耐性であるように、脂質粒子の脂質部分内に完全に封入される。他の特定の実施形態では、脂質粒子は、ヒト等の哺乳類に対して実質的に無毒である。
いくつかの実施形態では、活性薬剤または治療剤は、核酸を含む。特定の場合では、核酸は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはそれらの混合物等の干渉ＲＮＡ分子を含む。他の特定の場合には、核酸は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、またはそれらの混合物等の、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。特定の場合では、核酸は、ｍＲＮＡ分子を含む。
他の実施形態では、活性薬剤または治療剤は、ペプチドまたはポリペプチドを含む。特定の場合では、ペプチドまたはポリペプチドは、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片；ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商標）抗体、またはそれらの混合物等の抗体を含む。他の特定の場合には、ペプチドまたはポリペプチドは、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体、リガンド、ホルモン、小分子（例えば、有機小分子または化合物）、またはそれらの混合物を含む。
一実施形態では、活性薬剤または治療剤は、ｓｉＲＮＡを含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５～約６０ヌクレオチド長（例えば、約１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、もしくは１９～２５のヌクレオチド長、または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５のヌクレオチド長）の二本鎖領域を含む。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで標的配列の発現をサイレンシングする能力がある。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖領域に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の場合では、ｓｉＲＮＡは、二本鎖領域に約１％～約１００％（例えば、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）の修飾ヌクレオチドを含む。実施形態では、二本鎖領域の約２５％未満（例えば、約２５％、２０％、１５％、１０％、または５％未満）または約１％～約２５％（例えば、約１％～２５％、５％～２５％、１０％～２５％、１５％～２５％、２０％～２５％、または１０％～２０％）のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドを含み、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’Ｆ）ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－アデノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチド、及びそれらの混合物等の、２’ＯＭｅヌクレオチド（例えば、２’ＯＭｅプリンヌクレオチド及び／または２’ＯＭｅピリミジンヌクレオチド）を含む。特定の場合では、ｓｉＲＮＡは、２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチドを含まない。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ヘアピンループ構造を含む。
ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ分子の二本鎖領域の一方の鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス）または両鎖に修飾ヌクレオチドを含み得る。好ましくは、ウリジンヌクレオチド及び／またはグアノシンヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域での選択的位置にて修飾される。ウリジンヌクレオチド修飾に関して、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の少なくとも１、２、３、４、５、６またはそれ以上のウリジンヌクレオチドが、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド等の修飾ウリジンヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖のすべてのウリジンヌクレオチドが、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチドである。グアノシンヌクレオチド修飾に関して、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の少なくとも１、２、３、４、５、６またはそれ以上のグアノシンヌクレオチドが、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド等の修飾グアノシンヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖のすべてのグアノシンヌクレオチドが、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチドである。
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ配列中の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれ以上の５’－ＧＵ－３’モチーフを、例えば、５’－ＧＵ－３’モチーフが除去されるようミスマッチを導入すること、及び／または２’ＯＭｅヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドを導入することによって、修飾し得る。５’－ＧＵ－３’モチーフは、ｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖中、アンチセンス鎖中、または両鎖にあり得る。５’－ＧＵ－３’モチーフは、互いに隣接する場合もあれば、別法として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のヌクレオチドで区切られている場合もある。
いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、対応する未修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫刺激が少ない。そのような実施形態では、低免疫刺激の特性を持つ修飾ｓｉＲＮＡ分子は、標的配列に対するＲＮＡｉ活性を有利に保持する。別の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子の免疫刺激特性と、それが標的遺伝子発現をサイレンシングする能力とは、例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域等のｓｉＲＮＡ配列内に最小限かつ選択的な２’ＯＭｅ修飾を導入することによってバランスをとり、かつ最適化することができる。特定の場合では、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する未修飾ｓｉＲＮＡよりも免疫刺激が少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％少ない。修飾ｓｉＲＮＡ分子及び対応する未修飾ｓｉＲＮＡ分子の免疫刺激特性を、例えば、脂質を用いる適切な送達システム（本明細書に開示されるＬＮＰ送達システム等）を使用して、哺乳類での全身投与または哺乳類のレスポンダー細胞のトランスフェクションの約２～約１２時間後にＩＮＦ－α及び／またはＩＬ－６レベルを測定することによって決定することができることは、当業者には容易に明らかとなるであろう。
特定の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、ＩＣ５０（すなわち、半数阻害濃度）が、対応する未修飾ｓｉＲＮＡのそれの１０分の１以下である（すなわち、修飾ｓｉＲＮＡは、ＩＣ５０が、対応する未修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０の１０分の１以下である）。他の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、ＩＣ５０が、対応する未修飾ｓｉＲＮＡ配列のそれの３分の１以下である。さらに別の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、ＩＣ５０が、対応する未修飾ｓｉＲＮＡのそれの２分の１以下である。当業者に公知の方法を使用して、用量反応曲線を生成することができ、また修飾ｓｉＲＮＡ及び対応する未修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値を容易に決定することができることは、当業者には容易に明らかとなるであろう。
さらに別の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、対応する未修飾ｓｉＲＮＡ配列と比べて、標的配列の発現の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％をサイレンシングする能力がある。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、例えば、二本鎖領域のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖に、リン酸骨格修飾を含まない。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、二本鎖領域のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖に、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリン酸骨格修飾を含む。実施形態では、ｓｉＲＮＡは、リン酸骨格修飾を含まない。
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、二本鎖領域のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖に、２’－デオキシヌクレオチドを含まない。よりさらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、二本鎖領域のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖に、１、２、３、４、またはそれ以上の２’－デオキシヌクレオチドを含む。実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２’－デオキシヌクレオチドを含まない。
特定の場合では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の二本鎖領域の３’末端のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。他の特定の場合には、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の二本鎖領域の３’末端近傍（例えば、３’末端から１、２、３または４ヌクレオチド以内）のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。
本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖領域の片側または両側に１、２、３、４、またはそれ以上のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する場合もあれば、二本鎖領域の片側または両側にオーバーハングを欠く（すなわち、平滑末端を有する）場合もある。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、二本鎖領域のいずれの側にも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。特定の場合では、アンチセンス鎖上の３’オーバーハングは、標的配列に対する相補性を有し、センス鎖上の３’オーバーハングは、標的配列の相補鎖に対する相補性を有する。別法として、３’オーバーハングは、標的配列に対しても、その相補鎖に対しても相補性がない。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１、２、３、４、またはそれ以上の、２’－デオキシ（２’Ｈ）ヌクレオチド等のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、３’オーバーハングは、デオキシチミジン（ｄＴ）及び／またはウリジンヌクレオチドを含む。他の実施形態では、二本鎖領域の片側または両側の３’オーバーハング内のヌクレオチドのうちの１つ以上は、修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は前述されており、２’ＯＭｅヌクレオチド、２’－デオキシ－２’Ｆヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－２－ＭＯＥヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、及びそれらの混合物が含まれる。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖上の及び／またはアンチセンス鎖に存在する３’オーバーハングの１、２、３、４、またはそれ以上のヌクレオチドは、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－アデノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチド、及びそれらの混合物等の、２’ＯＭｅヌクレオチド（例えば、２’ＯＭｅプリンヌクレオチド及び／または２’ＯＭｅピリミジンヌクレオチド）を含む。
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子発現をサイレンシングする、未修飾及び／または修飾ｓｉＲＮＡ配列のうちの少なくとも１つかもしくはカクテル（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ、またはそれ以上）を含み得る。ｓｉＲＮＡのカクテルは、１つ以上の標的遺伝子の、同じ領域もしくはドメイン（例えば、「ホットスポット」）及び／または異なる領域もしくはドメインを対象とする配列を含み得る。特定の場合では、標的遺伝子発現をサイレンシングする１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ、またはそれ以上）の修飾ｓｉＲＮＡが、カクテル中に存在する。他の特定の場合には、標的遺伝子発現をサイレンシングする１つ以上の（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上）の未修飾ｓｉＲＮＡ配列が、カクテル中に存在する。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、標的配列またはその一部分に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的な配列を含むかまたはそれからなる。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、標的配列またはその一部分に１００％相補的な配列を含むかまたはそれからなる。さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、標的配列またはその一部分に特異的にハイブリダイズする配列を含むかまたはそれからなる。
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、標的配列またはその一部分と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列を含むかまたはそれからなる。追加の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、標的配列またはその一部分と１００％同一な配列を含むかまたはそれからなる。
本発明の脂質ナノ粒子では、カチオン性脂質は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物から選択され得る。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、または約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成し得る。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約４０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成し得る。
他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５５ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、または約５５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％を構成し得る。
さらに別の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約６０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約６０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約６０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約６０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、または約６０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％を構成し得る。
なおさらなる他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約６５ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約６５ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約６５ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、または約６５ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％を構成し得る。
さらなる実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約７０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約７０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約７０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約７５ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約７５ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、または約８０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を構成し得る。
追加の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の（少なくとも）約３０、３５、４０、４５、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を構成し得る。
本発明の脂質粒子では、非カチオン性脂質は、例えば、１つ以上のアニオン性脂質及び／または中性脂質を含み得る。特定の実施形態では、非カチオン性脂質は、以下の中性脂質成分、すなわち、（１）コレステロールまたはその誘導体、（２）リン脂質、または（３）リン脂質と、コレステロールもしくはその誘導体との混合物、のうちの１つを含む。
コレステロール誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテルの合成は、本明細書に記載されている。
リン脂質は、中性脂質であり得、これには、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレイオル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、リン脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、またはそれらの混合物である。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質（例えば、１つ以上のリン脂質及び／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％または約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成し得る。非カチオン性脂質がリン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物である場合、混合物は、粒子中に存在する総脂質の最大約４０、５０、または６０ｍｏｌ％を構成し得る。
他の実施形態では、非カチオン性脂質（例えば、１つ以上のリン脂質及び／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％を構成し得る。
さらに別の実施形態では、非カチオン性脂質（例えば、１つ以上のリン脂質及び／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％を構成し得る。
なおさらなる他の実施形態では、非カチオン性脂質（例えば、１つ以上のリン脂質及び／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、または約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成し得る。
さらなる実施形態では、非カチオン性脂質（例えば、１つ以上のリン脂質及び／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、または約２５ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％を構成し得る。
よりさらなる実施形態では、非カチオン性脂質（例えば、１つ以上のリン脂質及び／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、または約１５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％を構成し得る。
追加の実施形態では、非カチオン性脂質（例えば、１つ以上のリン脂質及び／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の（少なくとも）約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を構成し得る。
特定の実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約３１．５ｍｏｌ％～約４２．５ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体を含む。非限定的な例として、本発明のリン脂質不含脂質粒子は、粒子中に存在する総脂質のコレステロールまたはその誘導体を約３７ｍｏｌ％にて含み得る。他の実施形態では、本発明のリン脂質不含脂質粒子は、粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％～約４２ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％～約４２ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、または約３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４もしくは４５ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）のコレステロールまたはその誘導体を含み得る。
他の特定の実施形態では、非カチオン性脂質は、（ｉ）粒子中に存在する総脂質の約４ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％のリン脂質、及び（ｉｉ）粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体、の混合物を含む。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールの混合物を含む脂質粒子は、粒子中に存在する総脂質のうち、ＤＰＰＣを約７ｍｏｌ％で、またコレステロールを約３４ｍｏｌ％で含み得る。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、（ｉ）粒子中に存在する総脂質の約３ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、または約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）のリン脂質、及び（ｉｉ）粒子中に存在する総脂質の約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２８ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約２８ｍｏｌ％～約３８ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３８ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％～約３６ｍｏｌ％、または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、もしくは４５ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）のコレステロールまたはその誘導体、の混合物を含む。
さらなる実施形態では、非カチオン性脂質は、（ｉ）粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％のリン脂質、及び（ｉｉ）粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％のコレステロールまたはその誘導体、の混合物を含む。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールの混合物を含む脂質粒子は、粒子中に存在する総脂質のうち、ＤＰＰＣを約２０ｍｏｌ％で、またコレステロールを約２０ｍｏｌ％で含み得る。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、（ｉ）粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、約１２ｍｏｌ％～約２８ｍｏｌ％、約１４ｍｏｌ％～約２６ｍｏｌ％、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）のリン脂質、及び（ｉｉ）粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、約１２ｍｏｌ％～約２８ｍｏｌ％、約１４ｍｏｌ％～約２６ｍｏｌ％、または約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）のコレステロールまたはその誘導体、の混合物を含む。
複合脂質
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ、例えば、ｓｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡ、またはｍＲＮＡを含むもの）では、複合脂質は、例えば、以下、すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド（ＡＴＴＡ）－脂質コンジュゲート、またはそれらの混合物、のうちの１つ以上を含み得る。一実施形態では、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートまたはＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートのいずれかを含む。複合脂質は、例えば、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物等の、ＰＥＧ－脂質を含み得る。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）、またはそれらの混合物であり得る。
本発明での使用に好適な追加のＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、ｍＰＥＧ２０００－１，２－ジ－Ｏ－アルキル－ｓｎ３－カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）が含まれるが、これに限定されない。ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧの合成は、２００８年１２月３１日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／８８６７６号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適なさらに追加のＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、限定することなく、１－［８’－（１，２－ジミリストイル－３－プロパノキシ）－カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－ｗ－メチル－ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ－ＤＭＧ）が含まれる。２ＫＰＥＧ－ＤＭＧの合成は、米国特許第７，４０４，９６９号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分は、約５５０ダルトン～約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を構成し得る。特定の場合では、ＰＥＧ部分は、約７５０ダルトン～約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン～約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約２，０００ダルトン等）の平均分子量を有する。特定の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
特定の場合では、複合脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子中に存在する総脂質の約０．１～約１０％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を構成し得る。特定の場合では、複合脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）は、粒子中に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２ｍｏｌ％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）を構成し得る。
特定の実施形態では、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡが使用され、以下の構造
Figure 2023534206000004
 を有し、ここで、ｎは、約１０００～約３０００の分子量を有するポリマー鎖が得られるよう選択される。別の実施形態では、ｎは、約２０００の分子量を有するポリマー鎖が得られるよう選択される。ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡは、Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）－ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２００６による記載、及び米国特許第８，９３６，９４２号での記載のように調製することができる。
本発明の脂質粒子では、活性薬剤または治療剤は、粒子の脂質部分内に完全に封入され、それにより活性薬剤または治療剤が酵素による分解から保護され得る。特定の実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡ等の核酸を含むＬＮＰは、粒子の脂質部分内に完全に封入され、それにより核酸がヌクレアーゼによる分解から保護される。特定の場合では、ＬＮＰ中の核酸は、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５または６０分間のヌクレアーゼへの粒子の曝露後、実質的に分解されていない。他の特定の場合には、ＬＮＰ中の核酸は、３７℃で少なくとも約３０、４５、もしくは６０分間、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４もしくは３６時間の血清中での粒子のインキュベーション後、実質的に分解されていない。他の実施形態では、活性薬剤または治療剤（例えば、ｓｉＲＮＡ等の核酸）は、粒子の脂質部分と複合体を形成している。本発明の製剤の利点の１つは、脂質粒子組成物が、ヒト等の哺乳類に対して実質的に無毒であることである。
「完全に封入された」という用語は、脂質粒子中の活性薬剤または治療剤が、遊離のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質が著しく分解され得る血清またはヌクレアーゼもしくはプロテアーゼのアッセイへの曝露後に、著しく分解されないことを示す。完全に封入された系では、通常なら遊離の活性薬剤または治療剤の１００％を分解する処理において、好ましくは粒子中の活性薬剤または治療剤の約２５％未満が分解され、より好ましくは粒子中の活性薬剤または治療剤の約１０％未満、最も好ましくは約５％未満が分解される。核酸治療剤との関連において、完全な封入は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより決定され得る。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチド及び一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを定量化するための超高感度蛍光核酸染色剤である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）。「完全に封入された」とはまた、脂質粒子が血清で安定であること、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ投与時にそれらがその構成成分に急速に分解されないことも示す。
別の態様では、本発明は、複数の脂質粒子を含む脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）組成物を提供する。特定の実施形態では、活性薬剤または治療剤（例えば、核酸）は、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の脂質部分内に完全に封入され、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約３０％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、％、約７０％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、または少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）が、その中に封入された活性薬剤または治療剤を有する。
典型的には、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、脂質：活性薬剤（例えば、脂質：核酸）の比（質量｜質量比）が約１～約１００である。場合によっては、脂質：活性薬剤（例えば、脂質：核酸）の比（質量｜質量比）が約１～約５０、約２～約２５、約３～約２０、約４～約１５、または約５～約１０の範囲である。特定の実施形態では、本発明の脂質粒子は、脂質：活性薬剤（例えば、脂質：核酸）の比（質量｜質量比）が約５～約１５、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）である。
典型的には、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍの平均径を有する。特定の実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、約４０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約１２０ｎｍ、１１０ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、もしくは８０ｎｍ未満（またはその任意の端数もしくはその中の範囲）の平均径を有する。
本発明の特定の一実施形態では、ＬＮＰは、（ａ）１つ以上の未修飾及び／または修飾核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の、標的遺伝子発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡ、または標的タンパク質発現をもたらすｍＲＮＡ）、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５６．５ｍｏｌ％～約６６．５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３１．５ｍｏｌ％～約４２．５ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質、及び（ｄ）粒子中に存在する総脂質の０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する複合脂質、を含む。ＬＮＰのこの特定の実施形態は、本明細書では全般的に「０．５：６０」製剤と称される。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、本出願に開示されるカチオン性脂質であり、非カチオン性脂質はコレステロールであり、複合脂質はＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートである。さらに、非カチオン性脂質は、リン脂質（ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等）とコレステロールの混合物であり、ここで、リン脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１４ｍｏｌ％～約１６ｍｏｌ％（例えば、約１５．２ｍｏｌ％）を構成し、コレステロール（またはコレステロール誘導体）は、粒子中に存在する総脂質の約２３ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％（例えば、約２４．２ｍｏｌ％）を構成し、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＡＡ（例えば、ＰＥＧ－ｃＤＭＡまたはＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ）である。これは、０．５：６０製剤の特定の実施形態であるが、当業者は、他のカチオン性脂質、非カチオン性脂質（他のコレステロール誘導体を含む）、及び複合脂質を本明細書に記載の０．５：６０製剤に使用できることを理解するであろう。
本発明の別の特定の実施形態、ＬＮＰは、（ａ）１つ以上の未修飾及び／または修飾核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の、標的遺伝子発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡ、または標的タンパク質発現をもたらすｍＲＮＡ）、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５６．５ｍｏｌ％～約６６．５ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３１．５ｍｏｌ％～約４２．５ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質、及び（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する複合脂質、を含む。ＬＮＰのこの特定の実施形態は、本明細書では全般的に「１：６２」製剤と称される。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、本明細書に記載の脂質であり、非カチオン性脂質はコレステロールであり、複合脂質はＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートである。これらは、１：６２製剤の特定の実施形態であるが、当業者は、他のカチオン性脂質、非カチオン性脂質（他のコレステロール誘導体を含む）、及び複合脂質を、本明細書に記載の１：６２製剤に使用できることを理解するであろう。
本発明の別の特定の実施形態、ＬＮＰは、（ａ）１つ以上の未修飾及び／または修飾核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の、標的遺伝子発現をサイレンシングする干渉ＲＮＡ、または標的タンパク質発現をもたらすｍＲＮＡ）、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約５２ｍｏｌ％～約６２ｍｏｌ％を構成するカチオン性脂質、（ｃ）粒子中に存在する総脂質の約３６ｍｏｌ％～約４７ｍｏｌ％を構成する非カチオン性脂質、及び（ｄ）粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％を構成する、粒子の凝集を阻害する複合脂質、を含む。ＬＮＰのこの特定の実施形態は、本明細書では全般的に「１：５７」製剤と称される。一実施形態では、カチオン性脂質は、本明細書に記載の脂質であり、非カチオン性脂質は、リン脂質（ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等）とコレステロールの混合物であり、ここで、リン脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％（例えば、約７．１ｍｏｌ％）を構成し、コレステロール（またはコレステロール誘導体）は、粒子中に存在する総脂質の約３２ｍｏｌ％～約３７ｍｏｌ％（例えば、約３４．３ｍｏｌ％）を構成し、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＡＡ（例えば、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ）である。別の実施形態では、カチオン性脂質は、本明細書に記載の脂質であり、非カチオン性脂質は、リン脂質（ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等）とコレステロールの混合物であり、ここで、リン脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％（例えば、約２０ｍｏｌ％）を構成し、コレステロール（またはコレステロール誘導体）は、粒子中に存在する総脂質の約１５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％（例えば、約２０ｍｏｌ％）を構成し、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＡＡ（例えば、ＰＥＧ－ｃＤＭＡまたはＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ）である。これらは、１：５７製剤の実施形態であるが、当業者は、他のカチオン性脂質、非カチオン性脂質（他のリン脂質及び他のコレステロール誘導体を含む）、及び複合脂質を、本明細書に記載の１：５７製剤に使用できることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、１：５７ＬＮＰ及び０．５：６０ＬＮＰの製剤は、４成分系である。例えば、０．５：６０のＬＮＰ製剤は、約０．５～１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、約５８ｍｏｌ％～約６１ｍｏｌ％の総カチオン性脂質（約０～６１ｍｏｌ％の１０１及び約０～６１ｍｏｌ％の１０２を含む）、約１５～１６ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、及び約２４～２５ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む。さらなる例では、１：５７ＬＮＰ製剤は、約１．４ｍｏｌ％のＰＥＧ－ｃＤＭＡ（またはＰＥＧ－ｃＤＳＡ）、約５７．１ｍｏｌ％の本明細書に記載の脂質、約２０ｍｏｌ％のＤＰＰＣ、及び約２０ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む、４成分系である。さらに別の実施形態では、１：６２ＬＮＰ製剤は、リン脂質不含、かつ、約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ－ｃＤＭＡ（またはＰＥＧ－ＩＤＳＡ）、約６１．５ｍｏｌ％の本明細書に記載の脂質、及び約３６．９ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む、３成分系である。他の実施形態では、１：５７ＬＮＰ製剤は、約１．４ｍｏｌ％のＰＥＧ－ｃＤＭＡ（またはＰＥＧ－ｃＤＳＡ）、約５７．１ｍｏｌ％の本明細書に記載の脂質、約７．１ｍｏｌ％のＤＰＰＣ、及び約３４．３ｍｏｌ％のコレステロール（またはその誘導体）を含む、４成分系である。これらのＬＮＰ製剤が目標とする製剤であること、ならびにＬＮＰ製剤中での存在する脂質（カチオン性及び非カチオン性の両方）の量及び存在する脂質コンジュゲートの量は変動し得ることを理解されたい。
本発明はまた、本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、１つ以上の活性薬剤または治療剤（例えば、核酸）を細胞に導入するための方法を提供し、細胞を、本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）と接触させることを含む。一実施形態では、細胞は哺乳類にあり、哺乳類はヒトである。別の実施形態では、本発明は、１つ以上の活性薬剤または治療剤（例えば、核酸）をｉｎ ｖｉｖｏ送達するための方法を提供し、本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を哺乳類対象に投与することを含む。特定の実施形態では、投与様式には、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、及び皮内が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、哺乳類対象は、ヒトである。
一実施形態では、注射の約８時間、１２時間、２４時間、３６時間、または４８時間後、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の総注射量の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％が血漿中に存在している。他の実施形態では、注射の約８時間、１２時間、２４時間、３６時間、または４８時間後、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の総注射用量の約２０％超、３０％超、４０％超、及び約６０％、７０％または８０％と同程度が血漿中に存在している。特定の場合では、投与の約１時間後、複数の粒子の約１０％超が哺乳類の血漿中に存在している。他の特定の場合には、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の存在は、粒子の投与の少なくとも約１時間後に検出可能である。特定の実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡ等の活性薬剤または治療剤の存在は、投与の約８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２または９６時間後に細胞内で検出可能である（例えば、肺、肝臓、腫瘍、または炎症部位）。他の実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の活性薬剤または治療剤による標的配列の発現の下方制御は、投与の約８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２または９６時間後に検出可能である。さらに別の実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の活性薬剤または治療剤による標的配列の発現の下方制御は、腫瘍細胞内、または炎症部位の細胞内で選択的に生じる。さらなる実施形態では、投与部位から近位もしくは遠位の部位の細胞内または肺、肝臓、もしくは腫瘍の細胞内での、ｍＲＮＡもしくは干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）等の活性薬剤または治療剤の存在または効果は、投与の約１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、もしくは９６時間後、または約６日、８日、１０日、１２日、１４日、１６日、１８日、１９日、２０日、２２日、２４日、２６日、もしくは２８日後に検出可能である。他の実施形態では、ｍＲＮＡもしくは自己増幅ＲＮＡ等の活性薬剤または治療剤による標的配列の発現の上方制御は、投与の約８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２または９６時間後に検出可能である。さらに別の実施形態では、ｍＲＮＡもしくは自己増幅ＲＮＡ等の活性薬剤または治療剤による標的配列の発現の上方制御は、腫瘍細胞内、または炎症部位の細胞内で選択的に生じる。さらなる実施形態では、投与部位から近位もしくは遠位の部位の細胞内または肺、肝臓、もしくは腫瘍の細胞内でのｍＲＮＡもしくは自己複製ＲＮＡ等の活性薬剤または治療剤の存在または効果は、投与の約１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、もしくは９６時間後、または約６日、８日、１０日、１２日、１４日、１６日、１８日、１９日、２０日、２２日、２４日、２６日、もしくは２８日後に検出可能である。追加の実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、非経口投与または腹腔内投与される。
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、干渉ＲＮＡ配列（例えばｓｉＲＮＡ）を含む１つ以上の核酸の治療的送達のための方法において特に有用である。特に、１つ以上の、目的とする標的核酸配列もしくは遺伝子の転写及び／または翻訳を下方制御またはサイレンシングすることによって、哺乳類（例えば、マウス等のげっ歯類またはヒト、チンパンジー、もしくはサル等の霊長類）における疾患または障害の治療のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法及びｉｎ ｖｉｖｏ法を提供することが、本発明の目的である。非限定的な例として、本発明の方法は、哺乳類対象の肺へのｍＲＮＡまたは干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のｉｎ ｖｉｖｏ送達に有用である。特定の実施形態では、疾患または障害は、遺伝子の発現及び／または過剰発現と関連しており、遺伝子の発現または過剰発現は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって低減される。他の特定の実施形態では、治療有効量の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を、哺乳類に投与し得る。場合によっては、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をＬＮＰに製剤化し、この粒子を、そのような治療を必要とする患者に投与する。他の場合には、細胞を患者から取り出し、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、本明細書に記載のＬＮＰを使用して）送達し、その細胞を患者に再注入する。
追加の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現をサイレンシングする非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）分子を含む脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）、及びそのような粒子を使用して標的遺伝子の発現をサイレンシングする方法を提供する。
一実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、約１０～約２５（塩基対）ヌクレオチド長の二本鎖（二重鎖）領域を含み、ａｉＲＮＡ分子は５’及び３’オーバーハングを含むアンチセンス鎖を含み、ａｉＲＮＡ分子は標的遺伝子発現をサイレンシングする能力がある。
特定の場合ではａｉＲＮＡ分子は、約１２～２０、１２～１９、１２～１８、１３～１７、または１４～１７（塩基対）のヌクレオチド長、より典型的には、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０（塩基対）のヌクレオチド長の二本鎖（二重鎖）領域を含む。他の特定の場合には、アンチセンス鎖上の５’及び３’のオーバーハングは標的ＲＮＡ配列に相補的である配列を含み、任意選択で、非標的配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖上の５’及び３’のオーバーハングの各々は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくはそれ以上のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
他の実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチド、２’Ｆヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、及びそれらの混合物からなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチドを含む。非限定的な例として、２’ＯＭｅヌクレオチドは、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、及びそれらの混合物からなる群から選択され得る。
関連態様では、本発明は、標的遺伝子の発現をサイレンシングするマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を含む脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）、及びそのような組成物を使用して標的遺伝子発現をサイレンシングする方法を提供する。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、約１５～約６０ヌクレオチド長を構成し、ｍｉＲＮＡ分子は標的遺伝子の発現をサイレンシングする能力がある。
特定の場合では、ｍｉＲＮＡ分子は、約１５～５０、１５～４０、または１５～３０のヌクレオチド長、より典型的には約１５～２５または１９～２５のヌクレオチド長、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３のヌクレオチド長を構成する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、目的ＲＮＡ配列を標的とする成熟ｍｉＲＮＡ分子である。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチド、２’Ｆヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、及びそれらの混合物からなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチドを含む。非限定的な例として、２’ＯＭｅヌクレオチドは、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、及びそれらの混合物からなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、１つ以上のｍＲＮＡ分子の治療的送達のための方法において有用である。特に、１つ以上の標的タンパク質の発現を介して哺乳類（例えば、マウス等のげっ歯類またはヒト、チンパンジー、もしくはサル等の霊長類）における疾患または障害の治療のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法及びｉｎ ｖｉｖｏ法を提供することが、本発明の１つの目的である。非限定的な例として、本発明の方法は、哺乳類対象への１つ以上のｍＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏ送達に有用である。他の特定の実施形態では、治療有効量の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を哺乳類に投与し得る。場合によっては、１つ以上のｍＲＮＡ分子をＬＮＰに製剤化し、この粒子を、そのような治療を必要とする患者に投与する。他の場合には、細胞を患者から取り出し、１つ以上のｍＲＮＡ分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、本明細書に記載のＬＮＰを使用して）送達し、その細胞を患者に再注入する。
他の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチド、２’Ｆヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、及びそれらの混合物からなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む。関連態様では、本発明は、標的遺伝子の発現をサイレンシングするマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を含む脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）、及びそのような組成物を使用して標的遺伝子発現をサイレンシングする方法を提供する。
したがって、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、これらが循環血中で安定していること、血管外部位へのアクセスをもたらす薬力学的挙動に必要とされるサイズであること、及び標的細胞集団に到達する能力があることから、対象（例えば、ヒト等の哺乳類）に対する、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、及び／またはｍｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡ、あるいはｍＲＮＡ）等の活性薬剤または治療剤の投与で使用するのに好都合かつ好適である。
活性薬剤
活性薬剤（例えば、治療剤）には、細胞、組織、器官、もしくは対象で所望の効果を示す能力がある任意の分子または化合物が含まれる。そのような効果は、例えば、生物学的、生理学的、及び／または美容的な効果であり得る。活性薬剤は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、小分子、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない、任意の種類の分子または化合物であり得る。核酸の非限定的な例としては、干渉ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ、プラスミド、リボザイム、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、及びそれらの混合物が含まれる。ペプチドまたはポリペプチドの例には、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片；ヒト化抗体、組換え型抗体、組換え型ヒト抗体、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商標）抗体）、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体とそれらのリガンド、ホルモン、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。小分子の例としては、当業者に公知の従来の任意の薬剤もしくは薬物等の有機小分子または化合物が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、活性薬剤は、治療剤、またはその塩もしくは誘導体である。治療剤誘導体は、それ自体が治療活性である場合もあれば、さらに修飾されると活性となるプロドラッグである場合もある。したがって、一実施形態では、治療剤誘導体は、未修飾薬剤と比較して治療活性の一部または全部を保持しており、また別の実施形態では、治療剤誘導体は、治療活性を欠くがさらに修飾されると活性となるプロドラッグである。
核酸
特定の実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸と会合し、核酸－脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）となる。いくつかの実施形態では、核酸は、脂質粒子に完全に封入される。本明細書で使用される場合、「核酸」という用語には、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが含まれ、最大６０ヌクレオチドを含有する断片は一般にオリゴヌクレオチドと称され、より長い断片はポリヌクレオチドと称される。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、約１５～約６０ヌクレオチド長である。核酸は、本発明の脂質粒子で単独で投与される場合もあれば、ペプチド、ポリペプチド、もしくは従来の薬物等の小分子を含む本発明の脂質粒子と組み合わせて投与（例えば、併用投与）される場合もある。
本発明との関連において、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなる、ヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語にはまた、同様に機能する天然には存在しないモノマーを含むポリマーもしくはオリゴマー、またはその部分も含まれる。そのような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞内への取り込みの向上、免疫原性の低減、及びヌクレアーゼ存在下での安定性の増大等の特性故に、天然型よりも好ましいことが多い。
オリゴヌクレオチドは一般に、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドに分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、デオキシリボースと呼ばれる５炭糖が、この糖の５’及び３’の炭素でリン酸に共有結合で結合し、非分枝の交互ポリマーを形成してなる。リボオリゴヌクレオチドは、５炭糖がリボースである類似の繰り返し構造からなる。
本発明による脂質－核酸粒子中に存在する核酸には、既知である任意の形態の核酸が含まれる。本明細書で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＤＮＡの例は本明細書に記載されており、例えば、構造遺伝子、制御及び終結領域を含む遺伝子、ならびにウイルスＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ等の自己複製系が含まれる。二本鎖ＲＮＡの例は本明細書に記載されており、例えば、ｓｉＲＮＡ、ならびにａｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ等の他のＲＮＡｉ剤が含まれる。一本鎖核酸には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、成熟ｍｉＲＮＡ、及び三重鎖形成性オリゴヌクレオチドが含まれる。
本発明の核酸は、様々な長さであり得、概して核酸の特定の形態に応じて異なる。例えば、特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子は、約１，０００～約１００，０００のヌクレオチド残基の長さであり得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１０～約１００ヌクレオチド長の範囲であり得る。様々な関連実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、及び三本鎖のいずれも、長さが約１０～約６０ヌクレオチド長、約１５～約６０ヌクレオチド長、約２０～約５０ヌクレオチド長、約１５～約３０ヌクレオチド長、または約２０～約３０ヌクレオチド長の範囲であり得る。
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするか、またはそれに相補的である。本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」という用語は、標的のＤＮＡまたはＲＮＡとオリゴヌクレオチドとの間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性を示す。特異的にハイブリダイズ可能であるために、オリゴヌクレオチドがその標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はないことを理解されたい。特定の実施形態では、標的配列へのオリゴヌクレオチドの結合が標的配列の正常な機能を妨げて標的配列からの有用性または発現の喪失を引き起こし、かつ、特異的結合が所望される条件下、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイもしくは治療的処置の場合は生理学的条件下で、またｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合はそのアッセイが行われる条件下で、非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合、そのオリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。したがって、オリゴヌクレオチドには、それが指向または特異的にハイブリダイズする遺伝子またはｍＲＮＡ配列の領域と比較して、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の塩基置換が含まれ得る。
ｓｉＲＮＡ
本発明の核酸－脂質粒子のｓｉＲＮＡ成分は、目的の標的遺伝子の発現をサイレンシングする能力がある。ｓｉＲＮＡ二重鎖の各鎖は典型的に、約１５～約６０ヌクレオチド長、好ましくは約１５～約３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。修飾ｓｉＲＮＡは一般に、対応する未修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫刺激が少なく、目的の標的遺伝子に対するＲＮＡｉ活性を保持している。いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’ＯＭｅプリンヌクレオチドまたは２’ＯＭｅピリミジンヌクレオチド、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－アデノシンヌクレオチド、及び／または２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、ウリジン及び／またはグアノシンヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾されている。修飾ヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡの一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に存在し得る。ｓｉＲＮＡ配列は、オーバーハング（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５：１８８（２００１）またはＮｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７：３０９（２００１）に記載のような３’または５’のオーバーハング）を有する場合もあれば、オーバーハングを欠く（すなわち、平滑末端を有する）場合もある。
修飾ｓｉＲＮＡは一般に、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域に約１％～約１００％（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上が、修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域内のヌクレオチドの約２５％未満（例えば、約２５％未満、約２４％未満、約２３％未満、約２２％未満、約２１％未満、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満）が、修飾ヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域内のヌクレオチドの約１％～約２５％（例えば、約１％～２５％、２％～２５％、３％～２５％、４％～２５％、５％～２５％、６％～２５％、７％～２５％、８％～２５％、９％～２５％、１０％～２５％、１１％～２５％、１２％～２５％、１３％～２５％、１４％～２５％、１５％～２５％、１６％～２５％、１７％～２５％、１８％～２５％、１９％～２５％、２０％～２５％、２１％～２５％、２２％～２５％、２３％～２５％、２４％～２５％等）または約１％～約２０％（例えば、約１％～２０％、２％～２０％、３％～２０％、４％～２０％、５％～２０％、６％～２０％、７％～２０％、８％～２０％、９％～２０％、１０％～２０％、１１％～２０％、１２％～２０％、１３％～２０％、１４％～２０％、１５％～２０％、１６％～２０％、１７％～２０％、１８％～２０％、１９％～２０％、１％～１９％、２％～１９％、３％～１９％、４％～１９％、５％～１９％、６％～１９％、７％～１９％、８％～１９％、９％～１９％、１０％～１９％、１１％～１９％、１２％～１９％、１３％～１９％、１４％～１９％、１５％～１９％、１６％～１９％、１７％～１９％、１８％～１９％、１％～１８％、２％～１８％、３％～１８％、４％～１８％、５％～１８％、６％～１８％、７％～１８％、８％～１８％、９％～１８％、１０％～１８％、１１％～１８％、１２％～１８％、１３％～１８％、１４％～１８％、１５％～１８％、１６％～１８％、１７％～１８％、１％～１７％、２％～１７％、３％～１７％、４％～１７％、５％～１７％、６％～１７％、７％～１７％、８％～１７％、９％～１７％、１０％～１７％、１１％～１７％、１２％～１７％、１３％～１７％、１４％～１７％、１５％～１７％、１６％～１７％、１％～１６％、２％～１６％、３％～１６％、４％～１６％、５％～１６％、６％～１６％、７％～１６％、８％～１６％、９％～１６％、１０％～１６％、１１％～１６％、１２％～１６％、１３％～１６％、１４％～１６％、１５％～１６％、１％～１５％、２％～１５％、３％～１５％、４％～１５％、５％～１５％、６％～１５％、７％～１５％、８％～１５％、９％～１５％、１０％～１５％、１１％～１５％、１２％～１５％、１３％～１５％、１４％～１５％等）が、修飾ヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態では、例えば、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖がウリジン及び／またはグアノシンヌクレオチドにおいて選択的に修飾される場合、生じる修飾ｓｉＲＮＡは、約３０％未満の修飾ヌクレオチド（例えば、約３０％未満、約２９％未満、約２８％未満、約２７％未満、約２６％未満、約２５％未満、約２４％未満、約２３％未満、約２２％未満、約２１％未満、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、もしくは約１％未満の修飾ヌクレオチド）、または約１％～約３０％の修飾ヌクレオチド（例えば、約１％～３０％、２％～３０％、３％～３０％、４％～３０％、５％～３０％、６％～３０％、７％～３０％、８％～３０％、９％～３０％、１０％～３０％、１１％～３０％、１２％～３０％、１３％～３０％、１４％～３０％、１５％～３０％、１６％～３０％、１７％～３０％、１８％～３０％、１９％～３０％、２０％～３０％、２１％～３０％、２２％～３０％、２３％～３０％、２４％～３０％、２５％～３０％、２６％～３０％、２７％～３０％、２８％～３０％、もしくは２９％～３０％の修飾ヌクレオチド）を含むことができる。
ｓｉＲＮＡ配列の選択
好適なｓｉＲＮＡ配列は、当該技術分野で公知の任意の手段を使用して同定することができる。典型的には、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４－４９８（２００１）及びＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７－６８８８（２００１）に記載されている方法を、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２（３）：３２６－３３０（２００４）に記載の合理的設計規則と組み合わせる。
一般に、目的の標的遺伝子からの転写物のＡＵＧ開始コドンのヌクレオチド配列３’を、ジヌクレオチド配列（例えば、ＡＡ、ＮＡ、ＣＣ、ＧＧ、またはＵＵ（Ｎ＝Ｃ、ＧもしくはＵ））についてスキャンする（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７－６８８８（２００１）を参照されたい）。ジヌクレオチド配列の３’に隣接するヌクレオチドを、潜在的ｓｉＲＮＡ配列（すなわち、標的配列またはセンス鎖配列）として同定する。典型的には、ジヌクレオチド配列の３’に隣接する１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５またはそれ以上のヌクレオチドを、潜在的ｓｉＲＮＡ配列として同定する。いくつかの実施形態では、ジヌクレオチド配列はＡＡまたはＮＡ配列であり、ＡＡまたはＮＡジヌクレオチドの３’に隣接する１９個のヌクレオチドを潜在的ｓｉＲＮＡ配列として同定する。ｓｉＲＮＡ配列は通常、標的遺伝子の長さに沿って異なる位置で間隔を空けて配置される。ｓｉＲＮＡ配列のサイレンシング効率をさらに高めるために、潜在的ｓｉＲＮＡ配列を分析して、例えば標的細胞または生物における、他のコード配列との相同領域を含まない部位を同定してよい。例えば、約２１塩基対の好適なｓｉＲＮＡ配列は典型的に、標的細胞または生物におけるコード配列に対して相同である連続塩基対を１６～１７を超えて有しない。ｓｉＲＮＡ配列をＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターから発現させる場合、４超の連続するＡまたはＴを欠くｓｉＲＮＡ配列が選択される。
潜在的ｓｉＲＮＡ配列が同定されたら、相補配列（すなわち、アンチセンス鎖配列）を設計することができる。潜在的ｓｉＲＮＡ配列はまた、当該技術分野で公知の様々な基準を使用して分析することができる。例えば、それらのサイレンシング効率を高めるために、ｓｉＲＮＡ配列を合理的設計アルゴリズムによって分析して、以下の特徴のうち１つ以上を有する配列を同定してよい：（１）Ｇ／Ｃ含量が約２５％～約６０％であるＧ／Ｃ、（２）センス鎖の１５～１９位における少なくとも３つのＡ／Ｕ、（３）内部リピートなし、（４）センス鎖の１９位がＡ、（５）センス鎖の３位がＡ、（６）センス鎖の１０位がＵ、（７）センス鎖の１９位がＧ／Ｃではない、及び（８）センス鎖の１３位がＧではない。これらの特徴の各々の適切な値を割り当て、ｓｉＲＮＡの選択に有用なアルゴリズムを組み込んだｓｉＲＮＡ設計ツールは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚ０９４．ｕｓｔ．ｈｋ／ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡに見出すことができる。当業者は、前述の特性のうちの１つ以上を有する配列が、潜在的ｓｉＲＮＡ配列としてさらなる分析及び試験のために選択され得ることを理解するであろう。
さらに、以下の基準のうちの１つ以上を有する潜在的ｓｉＲＮＡ配列は、多くの場合ｓｉＲＮＡとしては除外され得る：（１）同じ塩基が４つ以上並んだ領域を含む配列、（２）Ｇのホモポリマーを含む配列（すなわち、これらのポリマーの構造的特性に起因する非特異的作用の可能性を低減するため）、（３）三重塩基モチーフ（例えば、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＡＡＡ、またはＴＴＴ）を含む配列、（４）Ｇ／Ｃが７つ以上並んだ領域を含む配列、及び（５）候補内に４つ以上の塩基のダイレクトリピートを含み内部フォールドバック構造をもたらす配列。しかしながら、当業者は、前述の特徴のうちの１つ以上を有する配列が、潜在的ｓｉＲＮＡ配列としてさらなる分析及び試験のために依然として選択され得ることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、潜在的なｓｉＲＮＡ配列は、例えば、Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１５：２０９－２１６（２００３）、及びＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１５：１９９－２０８（２００３）に記載されているように、ｓｉＲＮＡ二重鎖非対称に基づいてさらに分析され得る。他の実施形態では、潜在的なｓｉＲＮＡ配列は、例えば、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１８：３０３－３１０（２００４）に記載されているように、標的部位での二次構造に基づいてさらに分析され得る
。例えば、標的部位での二次構造を、Ｍｆｏｌｄアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｒｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉで入手可能）を使用してモデル化し、塩基対合の形態の二次構造が少なくステムループが存在する、標的部位での接近可能性に有利なｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。
潜在的なｓｉＲＮＡ配列が同定された後で、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカインアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルを使用して、任意の免疫刺激特性の存在について配列を分析することができる。ｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖内のモチーフ、例えばＧＵリッチモチーフ（例えば、５’－ＧＵ－３’、５’－ＵＧＵ－３’、５’－ＧＵＧＵ－３’、５’－ＵＧＵＧＵ－３’等）もまた、配列が免疫刺激性であり得るか否かの指標を提供し得る。ｓｉＲＮＡ分子が免疫刺激性であることが判明したら、次に、本明細書に記載のとおりに、その免疫刺激性が低下するようｓｉＲＮＡ分子を修飾することができる。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡが免疫刺激性ｓｉＲＮＡであるのか、または非免疫刺激性ｓｉＲＮＡであるのかを決定するために、細胞が検出可能な免疫応答を生じるような条件下で、ｓｉＲＮＡ配列を哺乳類のレスポンダー細胞と接触させることができる。哺乳類のレスポンダー細胞は、ナイーブな哺乳類（すなわち、以前にｓｉＲＮＡ配列の遺伝子産物と接触したことのない哺乳類）からのものであり得る。哺乳類のレスポンダー細胞は、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、マクロファージ等であり得る。検出可能な免疫応答は、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、及びその組み合わせ等の、サイトカインまたは増殖因子の産生を含み得る。免疫刺激性であると同定されたｓｉＲＮＡ分子はその後、その免疫刺激特性を低下させるよう、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖のヌクレオチドのうちの少なくとも１つを修飾ヌクレオチドで置換することによって修飾することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域内のヌクレオチドの約３０％未満（例えば、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満）を、２’ＯＭｅヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドで置換することができる。次いで、修飾ｓｉＲＮＡを、前述のように哺乳類のレスポンダー細胞と接触させて、その免疫刺激特性が低減または抑制されていることを確認することができる。
免疫応答を検出するための好適なｉｎ ｖｉｔｒｏとしては、Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．の二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法（米国特許第４，３７６，１１０号）、モノクローナル－ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Ｗｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｋｉｒｋｈａｍ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，ｅｄｓ．，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ（１９７０））、Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．の「ウエスタンブロット」法（米国特許第４，４５２，９０１号）、標識リガンドの免疫沈降（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：４９８０－４９８３（１９８０））、例えばＲａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：５１５４－５１６０（１９８２）により記載されている酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学法（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９：４７７（１９８０））、及び活性の中和（Ｂｏｗｅｎ－Ｐｏｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：２３９６－２４００（１９８４））が含まれるが、これらに限定されない。上記のイムノアッセイに加え、米国特許第３，８１７，８２７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、及び同第４，０９８，８７６号に記載のものを含め、他のいくつかのイムノアッセイが利用可能である。これらの参照文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
免疫応答を検出するためのｉｎ ｖｉｖｏモデルの非限定的な例には、例えば、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３：４９４－５０５（２００６）に記載されているｉｎ ｖｉｖｏマウスサイトカイン誘導アッセイが含まれる。特定の実施形態では、実施可能なアッセイは以下のとおりである：（１）ｓｉＲＮＡを、標準的な静脈内注射により外側尾静脈に投与することができる、（２）投与の約６時間後に心臓穿刺により採血して、サイトカイン分析用の血漿として処理することができる、及び（３）サンドイッチＥＬＩＳＡキットを製造業者の指示に従って使用してサイトカインを定量化することができる（例えば、マウス及びヒトのＩＦＮ－α（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、ヒトＩＬ－６及びＴＮＦ－α（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びマウスＩＬ－６、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮ－γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））。
サイトカイン及び増殖因子に特異的に結合するモノクローナル抗体は、複数の供給源から市販されており、当該技術分野で公知の方法を使用して作製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６： ４９５－４９７（１９７５）及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照されたい）。モノクローナル抗体の作製は以前に記載されており、当該技術分野で公知の任意の手段により行うことができる（Ｂｕｈｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１，ｐｐ．７７－７８（１９９１））。いくつかの方法では、モノクローナル抗体は、検出を容易にするために（例えば、分光学的、光化学的、生化学的、電気的、光学的、または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物で）標識される。
ｓｉＲＮＡ分子の作製
ｓｉＲＮＡは、いくつかの形態で提供され得、例えば、１つ以上の単離された小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖としての形態か、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）としての形態か、またはＤＮＡプラスミド中の転写カセットから転写されたｓｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡとしての形態が含まれる。ｓｉＲＮＡ配列は、オーバーハング（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５：１８８（２００１）またはＮｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７：３０９（２００１）に記載のような３’または５’のオーバーハング）を有する場合もあれば、オーバーハングを欠く（すなわち、平滑末端を有する）場合もある。
ＲＮＡ集団を使用して長い前駆体ＲＮＡを得ることができ、または選択した標的配列に対して実質的もしくは完全な同一性を有する長い前駆体ＲＮＡを使用してｓｉＲＮＡを作製することができる。ＲＮＡは、当業者に周知の方法に従って細胞または組織から単離し、合成し、及び／またはクローン化することができる。ＲＮＡは、（細胞もしくは組織から得られる、ｃＤＮＡから転写される、サブトラクトされる、選択される等の）混合集団であり得、または単一の標的配列を表し得る。ＲＮＡは、天然に存在する（例えば、組織または細胞試料から分離される）か、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、Ｔ７もしくはＳＰ６ポリメラーゼ及びＰＣＲ産物またはクローニングされたｃＤＮＡを使用）合成されるか、または化学合成され得る。
長いｄｓＲＮＡを形成するために、合成ＲＮＡの場合、相補体もｉｎ ｖｉｔｒｏで転写させ、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成する。天然に存在するＲＮＡ集団を使用する場合、例えば、ＲＮＡ集団に対応するｃＤＮＡを転写させるか、またはＲＮＡポリメラーゼを使用することによって、ＲＮＡ相補体もまた（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ ＩＩＩまたはダイサーに消化されるためのｄｓＲＮＡを形成するために）提供される。その後、前駆体ＲＮＡをハイブリダイズさせて、消化用の二本鎖ＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡは、対象に直接投与することも、または投与前にｉｎ ｖｉｔｒｏで消化させることもできる。
ＲＮＡの単離、ＲＮＡの合成、核酸のハイブリダイズ、ｃＤＮＡライブラリーの作成及びスクリーニング、ならびにＰＣＲの実施のための方法は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３－２６９（１９８３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上掲）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（上掲）を参照されたい）、ＰＣＲ法も同様である（米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照されたい）。発現ライブラリーもまた、当業者に周知である。本発明における一般的な使用方法を開示するさらなる基本的な文書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）が含まれる。これらの参照文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
好ましくは、ｓｉＲＮＡは化学合成される。本発明のｓｉＲＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチドは、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：７８４５（１９８７）、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：５４３３（１９９０）、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３：２６７７－２６８４（１９９５）、及びＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４：５９（１９９７）に記載のもの等の、当該技術分野で公知の様々な技術のいずれかを使用して合成することができる。オリゴヌクレオチドの合成は、５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホロアミダイト等の一般的な核酸保護基及びカップリング基を使用する。非限定的な例として、スモールスケールの合成は、０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ合成装置で実施することができる。別法として、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）の９６ウェルプレート合成装置で実施することができる。ただし、より大規模または小規模のスケールの合成もまた、本発明の範囲内である。オリゴヌクレオチド合成のための好適な試薬、ＲＮＡ脱保護のための方法、及びＲＮＡ精製のための方法は、当業者に公知である。
ｓｉＲＮＡ分子はまた、タンデム合成技術により合成することもでき、ここで、両鎖とも、切断可能なリンカーによって区切られた単一の連続オリゴヌクレオチドの断片または鎖として合成され、リンカーがその後切断されて別個の断片または鎖が得ら、これらがハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非－ヌクレオチドリンカーであり得る。ｓｉＲＮＡのタンデム合成は、マルチウェル／マルチプレート合成プラットフォーム、及びバッチ反応器、合成カラム等を用いるラージスケール合成プラットフォームの両方に容易に適応させることができる。別法として、ｓｉＲＮＡ分子を２つの別個のオリゴヌクレオチドから構築することができ、ここで、一方のオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み、他方がアンチセンス鎖を含む。例えば、各鎖を別々に合成し、合成及び／または脱保護の後にハイブリダイゼーションまたはライゲーションによって共に連結させることができる。他の特定の場合には、ｓｉＲＮＡ分子は、連続するオリゴヌクレオチドの単一断片として合成することができ、ここで、自己相補的センス領域とアンチセンス領域がハイブリダイズして、ヘアピン二次構造を有するｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。
ｓｉＲＮＡ配列の修飾
特定の態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、２本の鎖と、二本鎖領域に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドとを有する二重鎖を含み、ここで、各鎖は、約１５～約６０ヌクレオチド長である。有利なことに、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する未修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫刺激が少ないが、標的配列の発現をサイレンシングする能力を保持している。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子に導入される化学修飾の程度は、ｓｉＲＮＡの免疫刺激特性の低減または抑制と、ＲＮＡｉ活性の保持との間のバランスをとる。非限定的な例として、目的遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子は、それが標的遺伝子発現をサイレンシングする能力を保持しながらｓｉＲＮＡによって生じる免疫応答が排除されるように、ｓｉＲＮＡ二重鎖内の選択的なウリジン及び／またはグアノシンヌクレオチドにおいて最小限に修飾され得る（例えば、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満修飾される）。
本発明での使用に好適な修飾ヌクレオチドの例としては、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’Ｆ）、２’－デオキシ、５－Ｃ－メチル、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、４’－チオ、２’－アミノ、または２’－Ｃ－アリル基を有するリボヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ノーザンコンホメーションを有する修飾ヌクレオチド、例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｅｄ．（１９８４）に記載されているもの等もまた、ｓｉＲＮＡ分子での使用に好適である。そのような修飾ヌクレオチドには、限定することなく、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－（Ｄ－リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’－メチル－チオ－エチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’Ｆ）ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－クロロ（２’Ｃｌ）ヌクレオチド、及び２’－アジドヌクレオチドが含まれる。特定の場合では、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ分子には、１つ以上のＧ－クランプヌクレオチドが含まれる。Ｇ－クランプヌクレオチドは、修飾シトシン類似体であって、その修飾が、二重鎖内の相補的なグアニンヌクレオチドのワトソン－クリック面及びフーグスティーン面の両方に水素結合する能力を付与する類似体を指す（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０：８５３１－８５３２（１９９８）を参照されたい）。さらに、ヌクレオチド塩基類似体、例えば、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチル等、他の芳香族誘導体、イノシン、アゾール カルボキサミド、ならびにニトロアゾール誘導体、例えば、３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール、及び６－ニトロインドール、を有するヌクレオチド（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２４３７－２４４７（２００１）を参照されたい）をｓｉＲＮＡ分子に組み込むことができる。
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子はさらに、１つ以上の化学修飾、例えば、末端キャップ部分、リン酸骨格修飾等を含み得る。末端キャップ部分の例には、逆位デオキシ脱塩基残基、グリセリル修飾、４’，５’－メチレンヌクレオチド、１－（β－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、α－ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ－ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’－セコヌクレオチド、非環式３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５－ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’－逆位ヌクレオチド部分、３’－３’－逆位脱塩基部分、３’－２’－逆位ヌクレオチド部分、３’－２’－逆位脱塩基部分、５’－５’－逆位ヌクレオチド部分、５’－５’－逆位脱塩基部分、３’－５’－逆位デオキシ脱塩基部分、５’－アミノ－アルキルホスファート、１，３－ジアミノ－２－プロピルホスファート、３－アミノプロピルホスファート、６－アミノヘキシルホスファート、１，２－アミノドデシルホスファート、ヒドロキシプロピルホスファート、１，４－ブタンジオールホスファート、３’－ホスホロアミダート、５’－ホスホロアミダート、ヘキシルホスファート、アミノヘキシルホスファート、３’－ホスファート、５’－アミノ、３’－ホスホロチオアート、５’－ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、及び架橋もしくは非架橋メチルホスホナートまたは５’－メルカプト部分が含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第５，９９８，２０３号、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９：１９２５（１９９３）を参照されたい）。リン酸骨格修飾（すなわち、修飾されたヌクレオチド間結合をもたらす）の非限定的な例としては、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミダート、カルバマート、カルボキシメチル、アセトアミダート、ポリアミド、スルホナート、スルホンアミド、スルファマート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、及びアルキルシリル置換が含まれる（例えば、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１－４１７（１９９５）、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４－３９（１９９４）を参照されたい）。そのような化学修飾は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の５’末端及び／または３’末端で出現し得る。これらの参照文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖はさらに、約１つ～約４つ（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）の２’－デオキシリボヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチドと未修飾ヌクレオチドの任意の組み合わせを有する３’末端オーバーハングを含むことができる。ｓｉＲＮＡ分子に導入することができる修飾ヌクレオチド及び化学修飾の種類のさらなる例は、例えば、英国特許第ＧＢ２，３９７，８１８Ｂ号ならびに米国特許公開第２００４０１９２６２６号、同第２００５０２８２１８８号、及び同第２００７０１３５３７２号に記載されており、これらの開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子は、任意選択で、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖に１つ以上の非ヌクレオチドを含むことができる。本明細書で使用される場合、「非ヌクレオチド」という用語は、糖及び／またはリン酸置換を含め、１つ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に組み込まれることができ、残りの塩基がそれらの活性を示すことを可能にする、任意の基または化合物を指す。この基または化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミン等の一般的に認識されているヌクレオチド塩基を含有せず、そのため、１’位に塩基を欠いているという点で脱塩基性である。
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡの化学修飾は、ｓｉＲＮＡ分子にコンジュゲートを結合させることを含む。コンジュゲートは、共有結合、例えば、生物分解性リンカー等を介してｓｉＲＮＡのセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端及び／または３’末端に結合させることができる。コンジュゲートはまた、ｓｉＲＮＡに、例えば、カルバマート基または他の連結基を介して結合させることができる（例えば、米国特許公開第２００５００７４７７１号、同第２００５００４３２１９号、及び同第２００５０１５８７２７号を参照されたい）。特定の場合では、コンジュゲートは、細胞へのｓｉＲＮＡの送達を容易にする分子である。ｓｉＲＮＡへの結合に好適なコンジュゲート分子の例には、コレステロール等のステロイド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のグリコール、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、脂肪酸、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、葉酸塩（例えば、葉酸、葉酸塩類似体及びその誘導体）、糖（例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、グルコース、マンノース、フルクトース、フコース等）、リン脂質、ペプチド、細胞取り込みを媒介する能力がある細胞受容体のリガンド、及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許公開第２００３０１３０１８６号、同第２００４０１１０２９６号、及び同第２００４０２４９１７８号、米国特許第６，７５３，４２３号を参照されたい）。他の例としては、米国特許出願公開第２００５０１１９４７０号及び同第２００５０１０７３２５号に記載されている、親油性部分、ビタミン、ポリマー、ペプチド、タンパク質、核酸、小分子、オリゴ糖、炭水化物クラスター、インターカレーター、副溝結合剤、切断剤、及び架橋剤コンジュゲート分子が含まれる。さらに他の例としては、米国特許出願公開第２００５０１５３３３７号に記載されている、２’－Ｏ－アルキルアミン、２’－β－アルコキシアルキルアミン、ポリアミン、Ｃ５－カチオン性修飾ピリミジン、カチオン性ペプチド、グアニジウム基、アミジニニウム（ａｍｉｄｉｎｉｎｉｕｍ）基、カチオン性アミノ酸コンジュゲート分子が含まれる。追加の例としては、米国特許出願公開第２００４０１６７０９０号に記載されている、疎水性基、膜活性化合物、細胞透過性化合物、細胞標的化シグナル、相互作用修飾因子、及び立体安定剤コンジュゲート分子が含まれる。さらなる例としては、米国特許出願公開第２００５０２３９７３９号に記載されているコンジュゲート分子が含まれる。使用するコンジュゲートの種類及びｓｉＲＮＡ分子とのコンジュゲーションの程度を、ＲＮＡｉ活性を保持しつつ、改善されたｓｉＲＮＡの薬物動態プロファイル、バイオアベイラビリティ、及び／または安定性について、評価することができる。したがって、当業者は、様々な周知のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物またはｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルのいずれかを使用して、種々のコンジュゲートを結合させたｓｉＲＮＡ分子をスクリーニングし、改善された特性及び完全なＲＮＡｉ活性を有するものを同定することができる。上記の特許文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
標的遺伝子
特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸－脂質粒子の核酸成分（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、目的遺伝子の翻訳（すなわち、発現）を下方制御またはサイレンシングすることができる。目的遺伝子としては、ウイルスの感染及び生存に関連する遺伝子、代謝性疾患及び障害（例えば、肺疾患及び肺障害）に関連する遺伝子、腫瘍形成及び細胞形質転換（例えば、がん）に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症応答及び自己免疫応答に関連するもの等の免疫調節遺伝子、リガンド受容体遺伝子、ならびに神経変性障害に関連する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、目的遺伝子は、肝細胞に発現する。
ウイルスの感染及び生存に関連する遺伝子には、細胞と結合して、侵入し、細胞内で複製するためにウイルスによって発現される遺伝子が含まれる。特に対象となるものは、慢性ウイルス疾患に関連するウイルス配列である。特に対象となるウイルス配列としては、エボラウイルス及びマールブルグウイルス等のフィロウイルス（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９３：１６５０－１６５７（２００６）を参照されたい）、ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、及びサビアウイルス等のアレナウイルス（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ：ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｋｎｉｐｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（２００１））、インフルエンザＡ、Ｂ、及びＣウイルス等のインフルエンザウイルス（例えば、Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．，３６：３０５－３３２（２００２）、及びＮｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，８３：２６３５－２６６２（２００２）を参照されたい）、肝炎ウイルス（例えば、Ｈａｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５４３：５１（２００３）、Ｙｏｋｏｔａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．，４：６０２（２００３）、Ｓｃｈｌｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３７：７６４（２００３）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：２７８３（２００３）、Ｋａｐａｄｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：２０１４（２００３）、及びＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｋｎｉｐｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（２００１）を参照されたい）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｎｅｒｊｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８：６２（２００３）、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：７１７４（２００３）、Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，ＪＡＭＡ，２８９：１４９４（２００３）、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１８３（２００３））、ヘルペスウイルス（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：３３０１（２００３））、ならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：６０６６（２００３）、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：６０４１（２００２））の配列が含まれる。
サイレンシングすることができる例示的なフィロウイルス核酸配列には、構造タンパク質（例えば、ＶＰ３０、ＶＰ３５、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼタンパク質（Ｌ－ｐｏｌ））、及び膜結合タンパク質（例えば、ＶＰ４０、糖タンパク質（ＧＰ）、ＶＰ２４）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。エボラウイルスの完全なゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２５４９、ＡＹ７６９３６２、ＮＣ＿００６４３２、ＮＣ＿００４１６１、ＡＹ７２９６５４、ＡＹ３５４４５８、ＡＹ１４２９６０、ＡＢ０５０９３６、ＡＦ５２２８７４、ＡＦ４９９１０１、ＡＦ２７２００１、及びＡＦ０８６８３３に記載されている。エボラウイルスＶＰ２４の配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ７７３８５及びＡＹ０５８８９７に記載されている。エボラウイルスＬ－ｐｏｌの配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６７１１０に記載されている。エボラウイルスＶＰ４０の配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ０５８８９６に記載されている。エボラウイルスＮＰの配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ０５８８９５に記載されている。エボラウイルスＧＰの配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ０５８８９８、Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，２９：２１５－２４０（１９９３）、Ｗｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：１２０３－１２１０（１９９３）、Ｖｏｌｃｈｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３０５：１８１－１８４（１９９２）、及び米国特許第６，７１３，０６９号に記載されている。さらなるエボラウイルス配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ１１３６５及びＸ６１２７４に記載されている。マールブルグウイルスの完全なゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１６０８、ＡＹ４３０３６５、ＡＹ４３０３６６、及びＡＹ３５８０２５に記載されている。マールブルグウイルスＧＰの配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００５７３４、ＡＦ００５７３３、及びＡＦ００５７３２に記載されている。マールブルグウイルスＶＰ３５の配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００５７３１及びＡＦ００５７３０に記載されている。さらなるマールブルグウイルス配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６４４０６、Ｚ２９３３７、ＡＦ００５７３５、及びＺ１２１３２に記載されている。エボラウイルス及びマールブルグウイルスの核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、開示が、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００７０１３５３７０号に記載のものが含まれる。
サイレンシングすることができる例示的なインフルエンザウイルス核酸配列としては、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）、非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ならびにヘマグルチニン（ＨＡ）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。インフルエンザＡ型のＮＰ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００４５２２、ＡＹ８１８１３８、ＡＢ１６６８６３、ＡＢ１８８８１７、ＡＢ１８９０４６、ＡＢ１８９０５４、ＡＢ１８９０６２、ＡＹ６４６１６９、ＡＹ６４６１７７、ＡＹ６５１４８６、ＡＹ６５１４９３、ＡＹ６５１４９４、ＡＹ６５１４９５、ＡＹ６５１４９６、ＡＹ６５１４９７、ＡＹ６５１４９８、ＡＹ６５１４９９、ＡＹ６５１５００、ＡＹ６５１５０１、ＡＹ６５１５０２、ＡＹ６５１５０３、ＡＹ６５１５０４、ＡＹ６５１５０５、ＡＹ６５１５０６、ＡＹ６５１５０７、ＡＹ６５１５０９、ＡＹ６５１５２８、ＡＹ７７０９９６、ＡＹ７９０３０８、ＡＹ８１８１３８、及びＡＹ８１８１４０に記載されている。インフルエンザＡ型のＰＡ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ８１８１３２、ＡＹ７９０２８０、ＡＹ６４６１７１、ＡＹ８１８１３２、ＡＹ８１８１３３、ＡＹ６４６１７９、ＡＹ８１８１３４、ＡＹ５５１９３４、ＡＹ６５１６１３、ＡＹ６５１６１０、ＡＹ６５１６２０、ＡＹ６５１６１７、ＡＹ６５１６００、ＡＹ６５１６１１、ＡＹ６５１６０６、ＡＹ６５１６１８、ＡＹ６５１６０８、ＡＹ６５１６０７、ＡＹ６５１６０５、ＡＹ６５１６０９、ＡＹ６５１６１５、ＡＹ６５１６１６、ＡＹ６５１６４０、ＡＹ６５１６１４、ＡＹ６５１６１２、ＡＹ６５１６２１、ＡＹ６５１６１９、ＡＹ７７０９９５、及びＡＹ７２４７８６に記載されている。インフルエンザウイルスの核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、開示が、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００７０２１８１２２号に記載のものが含まれる。
サイレンシングすることができる例示的な肝炎ウイルスの核酸配列としては、転写及び翻訳に関与する核酸配列（例えば、Ｅｎ１、Ｅｎ２、Ｘ、Ｐ）、ならびに構造タンパク質（例えば、Ｃタンパク質及びＣ関連タンパク質を含むコアタンパク質、Ｓ、Ｍ、及び／またはＬタンパク質を含むカプシド及びエンベロープタンパク質、またはそれらの断片）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ（上掲）を参照されたい）。サイレンシングすることができる例示的なＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の核酸配列としては、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、ポリタンパク質翻訳開始コドン領域、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列、及び／またはコアタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及び／またはＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。ＨＣＶのゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００４１０２（ＨＣＶ遺伝子型１ａ）、ＡＪ２３８７９９（ＨＣＶ遺伝子型１ｂ）、ＮＣ＿００９８２３（ＨＣＶ遺伝子型２）、ＮＣ＿００９８２４（ＨＣＶ遺伝子型３）、ＮＣ＿００９８２５（ＨＣＶ遺伝子型４）、ＮＣ＿００９８２６（ＨＣＶ遺伝子型５）、及びＮＣ＿００９８２７（ＨＣＶ遺伝子型６）に記載されている。Ａ型肝炎のウイルス核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４８９に記載されており、Ｂ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３９７７に記載されており、Ｄ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１６５３に記載されており、Ｅ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４３４に記載されており、Ｇ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１７１０に記載されている。ウイルスの感染及び生存に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、ウイルス性の状態を治療するために使用される従来の薬剤の投与と組み合わせて好都合に使用することができる。肝炎ウイルス核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、開示が、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００６０２８１１７５号、同第２００５００５８９８２号、及び同第２００７０１４９４７０号、米国特許第７，３４８，３１４号、ならびに２００９年３月２０日に出願された米国仮出願第６１／１６２，１２７号に記載されているものが含まれる。
腫瘍形成及び細胞形質転換（例えば、がんまたは他の新生物形成）に関連する遺伝子配列の例としては、Ｅｇ５（ＫＳＰ、ＫＩＦ１１；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４５２３）等の有糸分裂キネシン；ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ－１）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５０３０、Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：４２９－４４０（２００４））等のセリン／スレオニンキナーゼ；ＷＥＥ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３３９０及びＮＭ＿００１１４３９７６）等のチロシンキナーゼ；ＸＩＡＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１６７）等のアポトーシス阻害因子；ＣＳＮ１、ＣＳＮ２、ＣＳＮ３、ＣＳＮ４、ＣＳＮ５（ＪＡＢ１；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６８３７）、ＣＳＮ６、ＣＳＮ７Ａ、ＣＳＮ７Ｂ及びＣＳＮ８等のＣＯＰ９シグナロソームサブユニット；ＣＯＰ１（ＲＦＷＤ２；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２２４５７及びＮＭ＿００１００１７４０）等のユビキチンリガーゼ；ならびにＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５２７）、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９等のヒストンデアセチラーゼ等が含まれる。Ｅｇ５及びＸＩＡＰ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、開示が、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２００７年５月２９日に出願された米国特許出願第１１／８０７，８７２号に記載されているものが含まれる。ＰＬＫ－１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、米国特許出願公開第２００５０１０７３１６号及び同第２００７０２６５４３８号、ならびに２００８年１２月２３日に出願された米国特許出願第１２／３４３，３４２号に記載されているものが含まれ、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣＳＮ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、２００８年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／０４５，２５１号に記載されているものが含まれ、この開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
腫瘍形成及び細胞形質転換に関連する遺伝子配列のさらなる例としては、転座配列、例えば、ＭＬＬ融合遺伝子、ＢＣＲ－ＡＢＬ（Ｗｉｌｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：５７１６（２００２）、Ｓｃｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：１５６６（２００３））、ＴＥＬ－ＡＭＬ１、ＥＷＳ－ＦＬＩ１、ＴＬＳ－ＦＵＳ、ＰＡＸ３－ＦＫＨＲ、ＢＣＬ－２、ＡＭＬ１－ＥＴＯ、及びＡＭＬ１－ＭＴＧ８（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：３１５７（２００３））；過剰発現配列、例えば、多剤耐性遺伝子（Ｎｉｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５４５：１４４（２００３）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：１５１５（２００３））、サイクリン（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：３５９３（２００３）、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１６：２９２３（２００２））、ベータ－カテニン（Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９：１２９１（２００３））、テロメラーゼ遺伝子（Ｋｏｓｃｉｏｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２：２０９（２００３））、ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、ＢＣＬ－２、増殖因子受容体（例えば、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２２８、ＮＭ＿２０１２８２、ＮＭ＿２０１２８３、及びＮＭ＿２０１２８４、またＮａｇｙ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２８５：３９－４９（２００３）も参照されたい）、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ－２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４４８及びＮＭ＿００１００５８６２）、ＥｒｂＢ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９８２及びＮＭ＿００１００５９１５）、ならびにＥｒｂＢ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５２３５及びＮＭ＿００１０４２５９９））；ならびにＲＡＳ（Ｔｕｓｃｈｌ ａｎｄ Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ，Ｍｏｌ．Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ，２：１５８（２００２）に概説されている）等の突然変異配列が含まれる。ＥＧＦＲ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、開示が、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２００７年５月２９日に出願された米国特許出願第１１／８０７，８７２号に記載のものが含まれる。
ＤＮＡ修復酵素をコードする配列のサイレンシングは、化学療法剤の投与と組み合わせて使用される（Ｃｏｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：１５５０（２００３））。腫瘍遊走に関連するタンパク質をコードする遺伝子はまた、目的標的配列、例えば、インテグリン、セレクチン、及びメタロプロテイナーゼである。前述の例は排他的なものではない。当業者は、腫瘍形成もしくは細胞形質転換、腫瘍増殖、または腫瘍遊走を促進するかまたは推進する、いかなる全体的または部分的な遺伝子配列も、鋳型配列として含まれ得ることを理解するであろう。
血管新生遺伝子は、新たな血管の形成を促進することができる。特に対象となるのは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．，９：２１０（２００３））またはＶＥＧＦＲである。ＶＥＧＦＲを標的とするｓｉＲＮＡ配列は、例えば、ＧＢ２３９６８６４、米国特許出願公開第２００４０１４２８９５号、及びＣＡ２４５６４４４に記載されており、それらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
抗血管新生遺伝子は、新血管新生を阻害することができる。これらの遺伝子は、血管新生が疾患の病理学的発生における役割を担うがんの治療に特に有用である。抗血管新生遺伝子の例としては、限定されないが、エンドスタチン（例えば、米国特許第６，１７４，８６１号を参照されたい）、アンジオスタチン（例えば、米国特許第５，６３９，７２５号を参照されたい）、及びＶＥＧＦＲ２（例えば、Ｄｅｃａｕｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１８８：３６９－３７７（１９９９）を参照されたい）が含まれ、それらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
免疫調節遺伝子は、１つ以上の免疫応答を調節する遺伝子である。免疫調節遺伝子の例としては、増殖因子（例えば、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦ等）、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：６９１（２００３））、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２０等）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ等）及びＴＮＦ等のサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。Ｆａｓ及びＦａｓリガンド遺伝子もまた、目的の免疫調節標的配列である（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：３４７（２００３））。造血細胞及びリンパ系細胞において二次シグナル伝達分子をコードする遺伝子、例えば、ブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）（Ｈｅｉｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５２７：２７４（２００２））等のＴｅｃファミリーキナーゼもまた、本発明に含まれる。
細胞受容体リガンドには、細胞表面受容体（例えば、インスリン受容体、ＥＰＯ受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、チロシンキナーゼ活性を有する受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体等）に結合して、その受容体が関与する生理学的経路（例えば、グルコースレベルの調節、血球発生、有糸分裂生起等）を調節（例えば、阻害、活性化等）することができるリガンドが含まれる。細胞受容体リガンドの例としては、サイトカイン、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、グルカゴン、Ｇタンパク質共役型受容体リガンド等が含まれる、これらに限定されない。トリヌクレオチドリピート（例えば、ＣＡＧリピート）の伸長をコードする鋳型は、球脊髄性筋萎縮症及びハンチントン病（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１：１７５（２００２））等のトリヌクレオチドリピートの伸長に起因する神経変性障害における病原性配列のサイレンシングに使用される。
遺伝子の発現を下方制御またはサイレンシングするために核酸によって（例えば、ｓｉＲＮＡによって）標的化され得る他の特定の標的遺伝子としては、大動脈平滑筋アルファ２アクチン（ＡＣＴＡ２）、アルコール脱水素酵素１Ａ（ＡＤＨ１Ａ）、アルコール脱水素酵素４（ＡＤＨ４）、アルコール脱水素酵素６（ＡＤＨ６）、アファミン（Ａｆａｍｉｎ）（ＡＦＭ）、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）、セリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）、アルファ－２－ＨＳ－糖タンパク質（ＡＨＳＧ）、アルド－ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ４（ＡＫＲ１Ｃ４）、血清アルブミン（ＡＬＢ）、アルファ－１－ミクログロブリン／ビクニン前駆体（ＡＭＢＰ）、アンジオポエチン関連タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）、血清アミロイドＰ成分（ＡＰＣＳ）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ（ＡＰＯＡ２）、アポリポタンパク質Ｂ－１００（ＡＰＯＢ）、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＶ（ＡＰＯＣ４）、アポリポタンパク質Ｆ（ＡＰＯＦ）、ベータ－２－糖タンパク質１（ＡＰＯＨ）、アクアポリン－９（ＡＱＰ９）、胆汁酸－ＣｏＡ：アミノ酸Ｎ－アシルトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、Ｃ４ｂ結合タンパク質ベータ鎖（Ｃ４ＢＰＢ）、ＬＩＮＣ０１５５４（Ｃ５ｏｒｆ２７）によりコードされる性質不明の推定タンパク質、補体第３因子（Ｃ３）、補数第５因子（Ｃ５）、補体成分Ｃ６（Ｃ６）、補体成分Ｃ８アルファ鎖（Ｃ８Ａ）、補体成分Ｃ８ベータ鎖（Ｃ８Ｂ）、補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８Ｇ）、補体成分Ｃ９（Ｃ９）、カルモジュリン結合転写活性化因子１（ＣＡＭＴＡ１）、ＣＤ３８（ＣＤ３８）、補体因子Ｂ（ＣＦＢ）、補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）、補体因子Ｈ関連タンパク質２（ＣＦＨＲ２）、補体因子Ｈ関連タンパク質３（ＣＦＨＲ３）、カンナビノイド受容体１（ＣＮＲ１）、セルロプラスミン（ＣＰ）、カルボキシペプチダーゼＢ２（ＣＰＢ２）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン２（ＣＸＣＬ２）、シトクロムＰ４５０ １Ａ２（ＣＹＰ１Ａ２）、シトクロムＰ４５０ ２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６）、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）、シトクロムＰ４５０ファミリー２サブファミリーＤメンバー６（ＣＹＰ２Ｄ６）、シトクロムＰ４５０ ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）、フィロキノンオメガ－ヒドロキシラーゼＣＹＰ４Ｆ２（ＣＹＰ４Ｆ２）、７－アルファ－ヒドロキシコレスト－４－エン－３－オン１２－アルファ－ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ８Ｂ１）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、凝固第１２因子（Ｆ１２）、凝固第ＩＩ因子（トロンビン）（Ｆ２）、凝固第ＩＸ因子（Ｆ９）、フィブリノーゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）、フィブリノーゲンベータ鎖（ＦＧＢ）、フィブリノーゲンガンマ鎖（ＦＧＧ）、フィブリノーゲン様１（ＦＧＬ１）、フラビン含有モノオキシゲナーゼ３（ＦＭＯ３）、フラビン含有モノオキシゲナーゼ５（ＦＭＯ５）、グループスペシフィックコンポーネント（ビタミンＤ結合タンパク質）（ＧＣ）、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、グリシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、ヘプシジン抗菌ペプチド（ＨＡＭＰ）、ヒドロキシ酸オキシダーゼ（グリコール酸オキシダーゼ）１（ＨＡＯ１）、ＨＧＦ活性化因子（ＨＧＦＡＣ）、ハプトグロビン関連タンパク質；ハプトグロビン（ＨＰＲ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧ）、ヒドロキシステロイド（１１－ベータ）デヒドロゲナーゼ１（ＨＳＤ１１Ｂ１）、ヒドロキシステロイド（１７－ベータ）デヒドロゲナーゼ１３（ＨＳＤ１７Ｂ１３）、インターアルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１（ＩＴＩＨ１）、インターアルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２（ＩＴＩＨ２）、インターアルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ３（ＩＴＩＨ３）、インターアルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）、プレカリクレイン（ＫＬＫＢ１）、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）、肝臓発現抗菌ペプチド２（ＬＥＡＰ２）、白血球細胞由来ケモタキシン２（ＬＥＣＴ２）、リポタンパク質（ａ）（ＬＰＡ）、マンナン結合レクチンセリンペプチダーゼ２（ＭＡＳＰ２）、Ｓ－アデノシルメチオニン合成酵素アイソフォーム１型（ＭＡＴ１Ａ）、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ４（ＮＯＸ４）、ポリ［ＡＤＰ－リボース］ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）、パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）、パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）、ビタミンＫ依存性プロテインＣ（ＰＲＯＣ）、レチノールデヒドロゲナーゼ１６（ＲＤＨ１６）、構成的血清アミロイドＡ４（ＳＡＡ４）、セリンデヒドラターゼ（ＳＤＳ）、セルピンファミリーＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１），セルピンＡ１１（ＳＥＲＰＩＮＡ１１），カリスタチン（ＳＥＲＰＩＮＡ４）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＳＥＲＰＩＮＡ６）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＳＥＲＰＩＮＣ１）、ヘパリン補因子２（ＳＥＲＰＩＮＤ１）、セルピンファミリーＨメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＨ１），溶質キャリアファミリー５メンバー２（ＳＬＣ５Ａ２）、ナトリウム／胆汁酸共輸送体（ＳＬＣ１０Ａ１）、溶質キャリアファミリー１３メンバー５（ＳＬＣ１３Ａ５）、溶質キャリアファミリー２２メンバー１（ＳＬＣ２２Ａ１）、溶質キャリアファミリー２５メンバー４７（ＳＬＣ２５Ａ４７）、溶質キャリアファミリー２促進性グルコース輸送体メンバー２（ＳＬＣ２Ａ２）、ナトリウム共役型中性アミノ酸輸送体４（ＳＬＣ３８Ａ４）、溶質キャリア有機アニオン輸送体ファミリーメンバー１Ｂ１（ＳＬＣＯ１Ｂ１）、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（ＳＭＰＤ１）、胆汁酸塩スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ２Ａ１）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ２ファミリーポリペプチドＢ１０（ＵＧＴ２Ｂ１０）、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ２ファミリーポリペプチドＢ１５（ＵＧＴ２Ｂ１５）、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ２ファミリーポリペプチドＢ４（ＵＧＴ２Ｂ４）、及びビトロネクチン（ＶＴＮ）が含まれるが、これらに限定されない。
治療目的で上述の遺伝子のいずれかの発現をサイレンシングするその有用性に加えて、本明細書に記載の特定の核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）はまた、研究及び開発用途、ならびに診断的、予防的、予後診断的、臨床的、及び他の健康管理用途においても有用である。非限定的な例として、特定の核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）を、目的遺伝子が治療標的である可能性があるか否かを試験することを目的とした標的検証試験において使用することができる。特定の核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）はまた、潜在的な治療標的としての遺伝子を見出すことを目的とした標的同定試験にも使用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ
標的化ゲノム編集は、ニッチ技術から多くの生物学研究者が使用する方法へと進化した。この進化は、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）技術の出現により大いに促進された（例えば、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（２０１４）を含むＳａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（４），３４７－３５５、国際公開第ＷＯ２０１６／１９７１３２号及び同第ＷＯ２０１６／１９７１３３号を参照されたい）。したがって、本明細書では、ＨＢＶ等の疾患を治療するためにＣＲＩＳＰＲ技術と組み合わせて使用することができる改善物（例えば、脂質ナノ粒子及びその製剤）を提供する。ＣＲＩＳＰＲを使用するための標的に関して、ＣＲＩＳＰＲ技術で利用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、特異的に同定された配列、例えば、標的遺伝子（例えばＨＢＶゲノムの標的遺伝子）を標的とするように設計することができる。そのような標的配列の例は、国際公開第ＷＯ２０１６／１９７１３２号に示されている。さらに、国際公開第ＷＯ２０１３／１５１６６５号（例えば、表６を参照されたい。この文書は、表６及び付随する配列表を特に含めて、具体的に参照により組み込まれる）は、ｍＲＮＡ発現コンストラクトに関連して特許請求された約３５，０００のｍＲＮＡ配列を記載している。本発明の特定の実施形態は、これらの配列のいずれかの発現を標的とするためにＣＲＩＳＰＲ技術を利用する。本発明の特定の実施形態はまた、本明細書で論じられる標的遺伝子の発現を標的とするためにＣＲＩＳＰＲ技術を利用し得る。
ａｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡと同様に、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を動員し、アンチセンス鎖の５’末端に対するヌクレオチド１０と１１の間で標的配列の配列特異的切断を媒介することによって、哺乳類細胞における種々の遺伝子の効果的なサイレンシングをもたらすことができる（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６：１３７９－１３８２（２００８））。典型的には、ａｉＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する短いＲＮＡ二重鎖を含み、この二重鎖は、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端にオーバーハングを含有する。ａｉＲＮＡは一般に、センス鎖が、相補的アンチセンス鎖と比較して両末端で短いため、非対称である。いくつかの態様では、ａｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子に使用されるものと類似の条件下で、設計、合成、及びアニーリングされ得る。非限定的な例として、ａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列を選択するための上述の方法を使用して、選択及び作製され得る。
別の実施形態では、目的のｍＲＮＡを標的とするよう、様々な長さ（例えば、約１０～２５、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１３～１７、または１４～１７塩基対、より典型的には１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または塩基対）のａｉＲＮＡ二重鎖が、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端にオーバーハングを含めて設計され得る。特定の場合では、ａｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、約１０～２５、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１３～１７、または１４～１７のヌクレオチド長、より典型的には、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のヌクレオチド長である。他の特定の場合には、ａｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、約１５～６０、１５～５０、または１５～４０のヌクレオチド長、より典型的には約１５～３０、１５～２５または１９～２５のヌクレオチド長、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３のヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、５’アンチセンスオーバーハングは、１、２、３、４、またはそれ以上の非標的ヌクレオチド（例えば、「ＡＡ」、「ＵＵ」、「ｄＴｄＴ」等）を含有する。他の実施形態では、３’アンチセンスオーバーハングは、１、２、３、４、またはそれ以上の非標的ヌクレオチド（例えば、「ＡＡ」、「ＵＵ」、「ｄＴｄＴ」等）を含有する。特定の態様では、本明細書に記載のａｉＲＮＡ分子は、例えば、二本鎖（二重鎖）領域に、及び／またはアンチセンスオーバーハングに、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。非限定的な例として、ａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列について上述した修飾ヌクレオチドのうちの１つ以上を含み得る。特定の実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド等の２’ＯＭｅヌクレオチド、またはそれらの混合物を含む。
特定の実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖に対応するアンチセンス鎖、例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子のうちの１つを含み得る。他の実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、上述の標的遺伝子のいずれか、例えば、ウイルスの感染及び生存に関連する遺伝子、代謝性疾患及び障害に関連する遺伝子、腫瘍形成及び細胞形質転換に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症応答及び自己免疫応答に関連するもの等の免疫調節遺伝子、リガンド受容体遺伝子、ならびに神経変性疾患に関連する遺伝子等の発現をサイレンシングするために使用され得る。
ｍｉＲＮＡ
一般に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を制御する約２１～２３ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、それらの転写元のＤＮＡの遺伝子によってコードされるが、ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されず（非コードＲＮＡ）、代わりに、各一次転写物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）が、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと称される短いステムループ構造にプロセシングされ、最終的に機能的な成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に部分的に相補的であるかまたは完全に相補的であるかのいずれかであり、それらの主要な機能は、遺伝子発現を下方制御することである。ｍｉＲＮＡ分子の同定は、例えば、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５３－８５８、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５８－８６２、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８６２－８６４に記載されている。
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、プロセシングされた成熟ｍｉＲＮＡ分子よりもはるかに長い。ｍｉＲＮＡは、まず、キャップ及びポリＡテールを有する一次転写産物またはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして転写され、細胞核において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとして知られる約７０ヌクレオチドの短いステムループ構造にプロセシングされる。このプロセシングは、動物では、ヌクレアーゼＤｒｏｓｈａ及び二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質Ｐａｓｈａからなるマイクロプロセッサー複合体として知られるタンパク質複合体によって行われる（Ｄｅｎｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：２３１－２３５（２００４））。次に、これらのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒとの相互作用により細胞質内で成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされ、これはまた、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成を開始させる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３－３６６（２００１）。ＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが、ｍｉＲＮＡを生じさせるための鋳型として機能することができる。
Ｄｉｃｅｒがｐｒｅ－ｍｉＲＮＡステムループを切断すると、２つの相補的な短いＲＮＡ分子が形成されるが、その１つのみがＲＩＳＣ複合体に組み込まれる。この鎖は、ガイド鎖として知られており、５’末端の安定性に基づいて、ＲＩＳＣ複合体中の触媒的に活性なＲＮａｓｅであるアルゴノートタンパク質によって選択される（Ｐｒｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１６：５３０－５３５（２００６））。アンチガイドまたはパッセンジャー鎖として知られる残りの鎖は、ＲＩＳＣ複合体基質として分解される（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２３：６３１－６４０（２００５））。活性ＲＩＳＣ複合体に組み込まれた後、ｍｉＲＮＡは、それらの相補的ｍＲＮＡ分子と塩基対合し、標的ｍＲＮＡの分解及び／または翻訳のサイレンシングを誘導する。
哺乳類のｍｉＲＮＡ分子は通常、標的ｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲ内の部位に相補的である。特定の場合では、ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡへのアニーリングは、タンパク質の翻訳機序を遮断することによりタンパク質の翻訳を阻害する。他の特定の場合には、ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡへのアニーリングは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と類似のプロセスを通じて、標的ｍＲＮＡの切断及び分解を促進する。ｍｉＲＮＡはまた、標的化ｍＲＮＡに対応するゲノム部位のメチル化を標的とし得る。一般に、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＰと総称されるタンパク質の補体と関連して機能する。
特定の態様では、本明細書に記載のｍｉＲＮＡ分子は、約１５～１００、１５～９０、１５～８０、１５～７５、１５～７０、１５～６０、１５～５０、または１５～４０のヌクレオチド長、より典型的には約１５～３０、１５～２５または１９～２５のヌクレオチド長、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３のヌクレオチド長である。特定の他の態様では、ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列について上述した修飾ヌクレオチドのうちの１つ以上を含み得る。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド等の２’ＯＭｅヌクレオチド、またはそれらの混合物を含む。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、上述の標的遺伝子、例えば、ウイルスの感染及び生存に関連する遺伝子、代謝性疾患及び障害に関連する遺伝子、腫瘍形成及び細胞形質転換に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症応答及び自己免疫応答に関連するもの等の免疫調節遺伝子、リガンド受容体遺伝子、ならびに神経変性疾患に関連する遺伝子等のいずれかの発現をサイレンシングするために使用され得る。
他の実施形態では、目的のｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡの活性を遮断する１つ以上の薬剤は、本発明の脂質粒子（例えば、核酸－脂質粒子）を使用して投与される。遮断剤の例としては、立体遮断オリゴヌクレオチド、ロックド核酸オリゴヌクレオチド、及びモルフォリノオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。そのような遮断剤は、ｍｉＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ結合部位に直接結合し得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態では、核酸は、目的の標的遺伝子または配列を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」という用語は、標的とするポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンスヌクレオチドは、選択された配列に相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖である。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡ鎖の翻訳を、そのＲＮＡに結合することによって阻止する。アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、特定の相補的（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的とすることができる。結合が生じると、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、酵素ＲＮａｓｅ Ｈによって分解され得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０～約６０のヌクレオチド、より好ましくは約１５～約３０のヌクレオチドを含む。この用語はまた、所望の標的遺伝子に厳密に相補的ではない可能性のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、本発明は、標的非特異的活性がアンチセンスに見られる場合、または標的配列との１つ以上のミスマッチを含有するアンチセンス配列が特定の使用に最も好ましい場合に、利用可能である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の有効かつ標的化された阻害因子であることが示されており、したがって、標的とする遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害するために使用することができる。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクツロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）及びムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、それらのそれぞれのｍＲＮＡ配列を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号及び同第５，７５９，８２９号を参照されたい）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＩＣＡＭ－１、Ｅ－セレクチン、ＳＴＫ－１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体、及びヒトＥＧＦで示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１５４４－６（１９８８）、Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．，１：２２５－３２（１９８９）、Ｐｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１５；５７：３１０－２０（１９９８）、ならびに米国特許第５，８０１，１５４号、同第５，７８９，５７３号、同第５，７１８，７０９号、及び同第５，６１０，２８８号を参照されたい）。さらに、様々な異常細胞増殖、例えばがんを阻害し、それを治療するために使用することができるアンチセンスコンストラクトも記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号、同第５，５９１，３１７号、及び同第５，７８３，６８３号を参照されたい）。これらの参照文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成する方法は当該技術分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するように容易に適合させることができる。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択された標的配列の分析、ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、及び相対的安定性の判定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞内で標的ｍＲＮＡへの特異的結合を低減させるかまたは阻止する、それらの二量体、ヘアピン、または他の二次構造の形成の相対的不能性に基づいて選択され得る。ｍＲＮＡの極めて好ましい標的領域には、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその近傍の領域、及びｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列が含まれる。これらの二次構造分析及び標的部位選択の考察は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）及び／またはＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－４０２（１９９７））を使用して実施することができる。
リボザイム
本発明の別の実施形態によれば、核酸－脂質粒子はリボザイムと会合している。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するＲＮＡ－タンパク質複合体である（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４：８７８８－９２（１９８７）、及びＦｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４９：２１１－２０（１９８７）を参照されたい）。例えば、多くのリボザイムは、高度な特異性でリン酸エステル転移反応を促進させ、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質内のいくつかのリン酸エステルのうちの１つのみを切断する（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２７：４８７－９６（１９８１）、Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１６：５８５－６１０（１９９０）、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ－Ｈｕｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：１７３－６（１９９２）を参照されたい）。この特異性は、基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に対し、特異的な塩基対合相互作用を介して結合するという要件に起因している。
現在、天然に存在する酵素ＲＮＡ分子の少なくとも６つの基本的な種類が知られている。それぞれが、生理学的条件下でＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解をトランスで触媒することができる（したがって、他のＲＮＡ分子を切断することができる）。一般に、酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡに結合することによって作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。したがって、酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次に相補的塩基対合を介してそれに結合し、正しい部位に結合すると、標的ＲＮＡを切断するように酵素的に作用する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされたタンパク質の合成を指示するその能力を消失させる。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合してそれを切断した後、その酵素的核酸は、そのＲＮＡから放出されて別の標的を探し、そして新しい標的に繰り返し結合し、それを切断することができる。
酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎δウイルス、Ｉ群イントロンもしくはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と会合）またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡモチーフで形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの具体的な例は、例えば、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：４５５９－６５（１９９２）に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、例えば、ＥＰ０３６０２５７、Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８：４９２９－３３（１９８９）、Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：２９９－３０４（１９９０）、及び米国特許第５，６３１，３５９号に記載されている。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、例えば、Ｐｅｒｒｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：１１８４３－５２（１９９２）に記載されている。ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、例えば、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ－Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３５：８４９－５７（１９８３）に記載されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフの例は、例えば、Ｓａｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６１：６８５－９６（１９９０）、Ｓａｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８８２６－３０（１９９１）、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：２７９５－９（１９９３）に記載されている。Ｉ群イントロンの例は、例えば、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明に従って使用される酵素的核酸分子の重要な特徴は、それらが標的遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡ領域のうちの１つ以上に相補的な特異的基質結合部位を有すること、及びそれらが、その基質結合部位内またはその周囲に、ＲＮＡ切断活性を分子に付与するヌクレオチド配列を有することである。したがって、リボザイムコンストラクトは、必ずしも本明細書において言及される特定のモチーフに限定されない。これらの参照文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
任意のポリヌクレオチド配列を標的とするリボザイムの生成方法は、当該技術分野で公知である。リボザイムを、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２３５６９号及び同第ＷＯ９４／０２５９５号に記載されているように設計し、それらに記載されているようにｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで試験するために合成してよい。これらのＰＣＴ公開の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変化させることによって、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を阻止する修飾（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０７０６５号、同第ＷＯ９３／１５１８７号、同第ＷＯ９１／０３１６２号、及び同第ＷＯ９４／１３６８８号、ＥＰ９２１１０２９８．４号、ならびに米国特許第５，３３４，７１１号を参照されたい。これらは、酵素ＲＮＡ分子の糖部分に行うことができる種々の化学修飾について記載しており、これらの開示は、それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、細胞内でのそれらの有効性を高める修飾、ならびにＲＮＡ合成時間の短縮及び化学的要件の低減のためのステムＩＩ塩基の除去、を有するリボザイムを化学合成することによって、最適化することができる。
免疫刺激性オリゴヌクレオチド
本発明の脂質粒子に会合する核酸は、ヒト等の哺乳類であり得る対象に投与されたときに免疫応答を誘導することができる免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ；一本鎖または二本鎖）を含む、免疫刺激性であり得る。ＩＳＳには、例えば、ヘアピン二次構造をもたらす特定の回文構造（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：４０７２－６（１９９２）を参照されたい）、またはＣｐＧモチーフ、及び他の公知のＩＳＳの特徴（例えば、多重Ｇドメイン。開示が、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１１２６６号を参照されたい）が含まれる。
免疫刺激性核酸は、それらが、免疫応答を誘発するために、標的配列に特異的に結合してその発現を低減させる必要がない場合、配列非特異的と見なされる。したがって、特定の免疫刺激性核酸は、天然に存在する遺伝子またはｍＲＮＡの領域に対応する配列を含み得るが、それらは依然として配列非特異的免疫刺激性核酸と見なされ得る。
一実施形態では、免疫刺激性核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたはＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていなくても、またはメチル化されていてもよい。別の実施形態では、免疫刺激性核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。一実施形態では、核酸は、単一のＣｐＧジヌクレオチドを含み、このＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンは、メチル化されている。代替的実施形態では、核酸は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、このＣｐＧジヌクレオチド中の少なくとも１つのシトシンは、メチル化されている。さらなる実施形態では、配列内に存在するＣｐＧジヌクレオチド中の各シトシンは、メチル化されている。別の実施形態では、核酸は、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、このＣｐＧジヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、メチル化シトシンを含む。本発明の組成物及び方法における使用に好適な免疫刺激性オリゴヌクレオチドの例は、２００８年１２月３１日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／８８６７６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０６９３６９号、及び同第ＷＯ０１／１５７２６号、米国特許第６，４０６，７０５号、ならびにＲａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．，２９８：１１８５－９２（２００１）に記載されており、それらの開示はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法に使用されるオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル（「ＰＯ」）骨格もしくはホスホロチオエート（「ＰＳ」）骨格、及び／またはＣｐＧモチーフ内の少なくとも１つのメチル化シトシン残基を有する。
ｍＲＮＡ
特定の実施形態では、核酸は、１つ以上のｍＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子のカクテル）である。
ｍＲＮＡに対する修飾
本発明の実施において使用されるｍＲＮＡは、１つ、２つ、または２つより多いヌクレオシド修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、対応する非修飾ｍＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡが導入される細胞において分解の低減を示す。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドには、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、ｌ－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル１－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル１－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル１－シュードウリジン、１－メチル１－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル１－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドには、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジンが含まれる。
他の実施形態では、修飾ヌクレオシドには、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンが含まれる。
特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５’－Ｏ－（１－チオホスファート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスファート）－シチジン、５’－Ｏ－（１－チオホスファート）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスファート）－ウリジンまたは５’－Ｏ－（１－チオホスファート）－シュードウリジンである。α－チオ置換されたリン酸部分は、非天然ホスホロチオアート骨格結合を介してＲＮＡポリマーに安定性を付与するために提供される。ホスホロチオアートＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性が増加し、次いで細胞環境における半減期が長くなる。ホスホロチオアート結合核酸は、細胞の自然免疫分子の比較的弱い結合／活性化を通じて、自然免疫応答を低減させることも予期される。
特定の実施形態では、例えば、タンパク質産生の正確なタイミングが望まれる場合、細胞に導入された修飾核酸を細胞内で分解することが望ましい。したがって、本発明は、細胞内で指示された方法で作用することができる分解ドメインを含有する修飾核酸を提供する。
他の実施形態では、修飾ヌクレオシドには、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンが含まれる。
修飾核酸の任意選択成分
さらなる実施形態では、修飾核酸は、いくつかの実施形態において有益であり得る、他の任意成分を含み得る。これらの任意成分には、非翻訳領域、コザック配列、イントロンヌクレオチド配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、キャップ、及びポリＡテールが含まれるが、これらに限定されない。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲを提供することができ、これらのいずれかまたは両方は独立して１つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含み得る。そのような実施形態では、ヌクレオシド修飾はまた、翻訳可能領域にも存在し得る。コザック配列を含有する核酸も提供される。
さらに、核酸から切り取ることができる１つ以上のイントロンヌクレオチド配列を含有する核酸が提供される。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが翻訳はされない。５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり開始コドンまで続くが、開始コドンは含まない。一方、３’ＵＴＲは終止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳に関してＵＴＲが果たす調節的役割についてのエビデンスが増えつつある。分子の安定性を増加させるために、ＵＴＲの調節機能を本発明で使用されるｍＲＮＡに組み込むことができる。特定の機能を組み込んで、望ましくない器官部位に誤って誘導された場合に、転写物の下方制御を確実に制御することもできる。
５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を増加させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を通じて細胞内のｍＲＮＡの安定性及び翻訳能力に関与して、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシングの際に５’近位イントロンの除去を補助する。
内因性ｍＲＮＡ分子は５’末端がキャッピングされ、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端の転写されたセンスヌクレオチドとの間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を生じ得る。次に、この５’－グアニル酸キャップはメチル化され、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生じ得る。ｍＲＮＡの５’末端及び／または末端前の転写されたヌクレオチドのリボース糖もまた、任意選択で２’－Ｏ－メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による５’－キャップ除去は、分解のために、ｍＲＮＡ分子等の核酸分子を標的にし得る。
ＩＲＥＳ配列
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有するｍＲＮＡもまた、本発明の実施に有用である。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として機能する場合もあれば、ｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして機能する場合もある。２つ以上の機能的なリボソーム結合部位を含有するｍＲＮＡは、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（「マルチシストロン性ｍＲＮＡ」）。ｍＲＮＡがＩＲＥＳと共に提供される場合、さらに任意選択で、第２の翻訳可能領域が提供される。本発明に従って使用できるＩＲＥＳ配列の例には、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（Ｓ１Ｖ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが含まれるが、これらに限定されない。
ポリＡテール
ＲＮＡプロセシング中に、安定性を増加させるために、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）がｍＲＮＡ分子等のポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後に、転写物の３’末端が切断され、３’ヒドロキシルが遊離し得る。次に、ポリＡポリメラーゼがＲＮＡにアデニンヌクレオチドの鎖を付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスでは、１００～２５０残基長であり得るポリＡテールが付加される。
一般に、ポリＡテールの長さは３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、ポリＡテールは、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１２０以上、１４０以上、１６０以上、１８０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、１０００以上、１１００以上、１２００以上、１３００以上、１４００以上、１５００以上、１６００以上、１７００以上、１８００以上、１９００以上、２，０００以上、２，５００以上、及び３，０００以上のヌクレオチド）。
この状況において、ポリＡテールは、修飾ｍＲＮＡよりも長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長くなり得る。ポリＡテールはまた、それが属する修飾核酸の部分として設計され得る。この状況において、ポリＡテールは、修飾ｍＲＮＡの全長または修飾ｍＲＮＡの全長からポリＡテールを引いたものの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、またはそれ以上であり得る。
ｍＲＮＡ分子の作製
ＲＮＡの単離、ＲＮＡの合成、核酸のハイブリダイズ、ｃＤＮＡライブラリーの作成及びスクリーニング、ならびにＰＣＲの実施のための方法は、ＰＣＲ法（米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照されたい）と同様に、当該技術分野において周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３－２６９（１９８３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）を参照されたい）。発現ライブラリーもまた、当業者に周知である。本発明における一般的な使用方法を開示するさらなる基本的な文書には、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）が含まれる。これらの参照文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
コードされるポリペプチド
本明細書に記載の核酸－脂質粒子のｍＲＮＡ成分を使用して、目的ポリペプチドを発現させることができる。ヒトにおける特定の疾患は、機能性タンパク質の、そのタンパク質が通常存在しかつ活性である細胞タイプにおける欠如または障害によって引き起こされる。機能性タンパク質は、例えば、コード化遺伝子の転写不活性に起因して、またはタンパク質を完全にもしくは部分的に非機能的にする突然変異がコード化遺伝子に存在していることに起因して、完全にまたは部分的に欠如する可能性がある。タンパク質の完全または部分的な不活性化によって引き起こされるヒトの疾患の例には、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ）及び副腎白質ジストロフィー（Ｘ－ＡＬＤ）が含まれる。Ｘ－ＳＣＩＤは、免疫系内のＢ細胞及びＴ細胞の発生及び成熟に関与するいくつかのインターロイキンの受容体の成分である、共通ガンマ鎖タンパク質をコードする遺伝子の１つ以上の突然変異によって引き起こされる。Ｘ－ＡＬＤは、ＡＢＣＤ１と呼ばれるペルオキシソーム膜輸送体タンパク質遺伝子の１つ以上の突然変異によって引き起こされる。Ｘ－ＡＬＤに罹患している個体は、全身の組織に極めて高レベルの長鎖脂肪酸を有し、これが、精神障害または死に至るおそれのある様々な症状を引き起こす場合がある。
機能性タンパク質の、そのタンパク質が通常存在しかつ活性である細胞タイプにおける欠如または障害によって引き起こされるいくつかの疾患を治療するために、遺伝子療法を用いる試みがなされてきた。遺伝子療法は、通常、罹患タンパク質の機能的形態をコードする遺伝子を含むベクターの罹患者への導入、及び疾患を治療するための機能的タンパク質の発現を伴う。これまでのところ、遺伝子療法における成功は限られている。さらに、ＬＮＰを使用してｍＲＮＡを送達する特定の態様が、例えば、国際公開第ＷＯ２０１８／００６０５２号及び同第ＷＯ２０１５／０１１６３３号で説明されてきた。
このため、機能性タンパク質の完全または部分的な欠如によって引き起こされる疾患に罹患しているヒト内でタンパク質の機能的形態を発現するための改善が引き続き必要とされており、かつ、例えば、療法に対する免疫応答の誘発をより低減させることができる方法及び組成物を介した核酸（例えば、ｍＲＮＡ）送達の改善が必要とされている。本発明の特定の実施形態は、この文脈において有用である。したがって、特定の実施形態では、ポリペプチドの発現は、疾患または障害の１つ以上の症状を改善する。本発明の特定の組成物及び方法は、人体内の機能的ポリペプチドの欠如またはレベルの低減によって引き起こされるヒトの疾患の治療に有用であり得る。他の実施形態では、本発明の特定の組成物及び方法は、例えば、がんを治療するための、例えば、ワクチン抗原を発現させるための、ワクチンとしての使用に有用であり得る。
自己増幅ＲＮＡ
特定の実施形態では、核酸は、１つ以上の自己増幅ＲＮＡ分子である。自己増幅ＲＮＡ（ｓａ－ＲＮＡ）はまた、自己複製ＲＮＡ、複製可能ＲＮＡ、レプリコン、またはＲｅｐＲＮＡと称されることもある。自己増幅ｍＲＮＡと称されるＲｅｐＲＮＡは、プラス鎖ウイルスに由来する場合、少なくとも１つの構造遺伝子を欠くウイルスゲノムから生成され、ＲｅｐＲＮＡは、感染性の子孫ウイルスを生成することなく、翻訳及び複製（したがって「自己増幅」）することができる。特定の実施形態では、ＲｅｐＲＮＡ技術は、所望の目的抗原をコードする遺伝子カセットを挿入するために使用され得る。例えば、アルファウイルスゲノムは２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に分割されており、第１のＯＲＦはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）のタンパク質をコードし、第２のＯＲＦは構造タンパク質をコードする。ｓａ－ＲＮＡワクチンコンストラクトでは、ウイルス構造タンパク質をコードするＯＲＦは、任意の選択した抗原に置き換えられ得るが、ウイルスレプリカーゼは依然としてワクチンの不可欠な部分であり、免疫化後のＲＮＡの細胞内増幅を促進する。
他の活性薬剤
特定の実施形態では、本発明の脂質粒子と会合する活性薬剤は、１つ以上の治療用タンパク質、ポリペプチド、または有機低分子もしくは化合物を含み得る。そのような治療上有効な薬剤または薬物の非限定的な例には、腫瘍薬（例えば、化学療法薬、ホルモン療法剤、免疫療法剤、放射線療法剤等）、脂質低下剤、抗ウイルス薬、抗炎症化合物、抗うつ薬、刺激薬、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱薬、血管拡張薬、抗血管新生薬、細胞血管剤（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅｎｔ）、シグナル伝達阻害薬、抗不整脈剤等の心血管薬、ホルモン、血管収縮薬、及びステロイドが含まれる。これらの活性薬剤は、本発明の脂質粒子で単独で投与されか、または干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ等の核酸を含む本発明の脂質粒子と組み合わせて投与（例えば、併用投与）され得る。
化学療法薬の非限定的な例には、白金系薬物（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、サトラプラチン等）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソウレア等）、代謝拮抗薬（例えば、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、アザチオプリン、メトトレキサート、ロイコボリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド等）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル等）、トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、イリノテカン（ＣＰＴ－１１、カンプトサール）、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、リン酸エトポシド、テニポシド等）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン等）、チロシンキナーゼ阻害薬（例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）、ＯＳＩ－１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６、ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ ４３－９００６）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、ＳＴＩ５７１）、ダサチニブ（ＢＭＳ－３５４８２５）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（Ｚａｃｔｉｍａ（商標）、ＺＤ６４７４）等）、これらの薬学的に許容可能な塩、これらの立体異性体、これらの誘導体、これらの類似体、及びこれらの組み合わせが含まれる。
従来のホルモン療法剤の例には、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、フィナステリド、アロマターゼ阻害薬、タモキシフェン、及びゴセレリン、ならびに他のゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）が含まれるが、これらに限定されない。
従来の免疫療法剤の例には、免疫賦活薬（例えば、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）、レバミゾール、インターロイキン－２、アルファ－インターフェロン等）、モノクローナル抗体（例えば、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＨＬＡ－ＤＲ、及び抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体）、免疫毒素（例えば、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体－カリケアマイシンコンジュゲート、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体－シュードモナス外毒素コンジュゲート等）、ならびに放射免疫療法（例えば、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、または１３１Ｉ等にコンジュゲートされた抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）が含まれるが、これらに限定されない。
従来の放射線療法剤の例には、任意選択で腫瘍抗原を対象とする抗体にコンジュゲートされている、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８６Ｙ、８７Ｙ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、及び２１２Ｂｉ等の放射性核種が含まれるが、これらに限定されない。
本発明に従って使用され得るさらなる腫瘍薬には、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ａｒａＣ、三酸化ヒ素、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シトシンアラビノシド、シトキサン、デクスラゾキサン、ＤＴＩＣ、エストラムスチン、エキセメスタン、ＦＫ５０６、ゲムツズマブ－オゾガマイシン、ハイドレア、ヒドロキシウレア、イダルビシン、インターフェロン、レトロゾール、ロイスタチン、ロイプロリド、リトレチノイン（ｌｉｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、メガストロール（ｍｅｇａｓｔｒｏｌ）、Ｌ－ＰＡＭ、メスナ、メトキサレン、ミトラマイシン、ナイトロジェンマスタード、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ－５７１、タキソテール、テモゾラミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、ＶＭ－２６、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、及びベルバンが含まれるが、これらに限定されない。本発明に従って使用され得る腫瘍薬の他の例は、エリプチシン及びエリプチシン類似体または誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害薬、ならびにカンプトテシンである。
トリグリセリド、コレステロール、及び／またはグルコースの上昇に関連する脂質疾患または障害を治療するための脂質低下剤の非限定的な例には、スタチン、フィブラート、エゼチミブ、チアゾリジンジオン、ナイアシン、ベータ遮断薬、ニトログリセリン、カルシウムアンタゴニスト、魚油、及びこれらの混合物が含まれる。
抗ウイルス薬の例には、アバカビル、アシクロビル（ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、シドフォビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、侵入阻害薬、ファムシクロビル、固定用量配合剤、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、融合阻害薬、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル（ｉｍｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害薬、ＩＩＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、及びＩＦＮ－λ３等のＩＦＮ－λ分子）、ＩＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－γ）、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＰＥＧ化ＩＦＮ－α等のＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－δ、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－τ、ＩＦＮ－ω、及びＩＦＮ－ζ）、インターフェロン、ラミブシン、ロピナビル、ロビリド、ＭＫ－０５１８、マラビロク、モロキシジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル（ｎｅｘａｖｉｒ）、ヌクレオシド類似体、オセルタミビル、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害薬、逆転写酵素阻害薬、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、相乗的増強剤（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｒ）、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、ジドブジン、これらの薬学的に許容可能な塩、これらの立体異性体、これらの誘導体、これらの類似体、ならびにこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
脂質粒子
本発明の脂質粒子は、典型的には、活性薬剤または治療剤、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を阻害する複合脂質を含む。いくつかの実施形態では、活性薬剤または治療剤は、脂質粒子中の活性薬剤または治療剤が水溶液中で、例えばヌクレアーゼまたはプロテアーゼによる、酵素による分解に耐性であるように、脂質粒子の脂質部分内に完全に封入される。他の実施形態では、本明細書に記載の脂質粒子は、ヒト等の哺乳類に対して実質的に無毒性である。本発明の脂質粒子は、典型的には、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、または約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有する。
特定の実施形態では、本発明の脂質粒子は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、及び／またはｍｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡ等の１つ以上の核酸分子、カチオン性脂質（例えば、式Ｉ、ＩＩ及び／またはＩＩＩのカチオン性脂質）、非カチオン性脂質（例えば、コレステロール単独または１つ以上のリン脂質とコレステロールとの混合物）、ならびに粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、１つ以上のＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含む、血清安定性核酸－脂質粒子（ＬＮＰ）である。ＬＮＰは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個またはそれ以上の非修飾及び／または修飾核酸分子を含み得る。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，７５３，６１３号、同第５，７８５，９９２号、同第５，７０５，３８５号、同第５，９７６，５６７号、同第５，９８１，５０１号、同第６，１１０，７４５号、及び同第６，３２０，０１７号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０９６４号に記載されており、それらの開示はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
カチオン性脂質
特定の実施形態では、脂質ナノ粒子において、カチオン性脂質（複数可）は、式（Ｉ）の化合物から選択され得、
Figure 2023534206000005
 式中、
Ｒ１は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
Ｒ２は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
Ｒ３は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
Ｘは、二価のＣ２－Ｃ８アルキルであり、
Ｒ４は、ＮＲａＲｂであり、かつ
Ｒａ及びＲｂはそれぞれ、独立して、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルからなる群から選択され、そのメチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルは、任意選択でヒドロキシで置換されるか、またはＲａとＲｂが、それらが結合している窒素と一緒になってアジリジン環、アゼチジン環、プロリン環、ピペリジン環、ピペラジン環、もしくはモルホリン環を形成し、その環は、ヒドロキシル、もしくは任意選択でヒドロキシで置換されるＣ１－Ｃ６アルキルで任意選択で置換される。
一実施形態では、Ｒ１は、Ｃ２－Ｃ２０ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ１は、Ｃ２－Ｃ１５ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ１は、Ｃ２－Ｃ１０ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５－Ｃ２０ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ１は、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ２０）アルケニル、または（Ｃ２－Ｃ２０）アルキニルである。
一実施形態では、Ｒ１は、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキルである。
一実施形態では、Ｒ１は、（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニルである。
一実施形態では、Ｒ１は、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキニルである。
一実施形態では、Ｒ１は、二重結合を１つのみ有する（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニルである。
一実施形態では、Ｒ１は、（Ｚ）－４－デセン－１－イル、１－ノニル、３－ウンデシル、１－デシル、６（Ｚ），１５（Ｚ）－ヘニコサンジエン（ｈｅｎｉｃｏｓａｎｄｉｅｎｅ）－１１－イル、３－ヘキセン－１－イル、９（Ｚ）－オクタデセン－１－イル、または２－ブチルオクト－１－イル、４－（１－メチルエテニル）シクロヘキセン－１－イルメチルである。
一実施形態では、Ｒ２は、Ｃ２－Ｃ２０ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ２は、Ｃ２－Ｃ１５ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ２は、Ｃ２－Ｃ１０ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ２は、Ｃ５－Ｃ２０ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ２は、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ２０）アルケニル、または（Ｃ２－Ｃ２０）アルキニルである。
一実施形態では、Ｒ２は、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキルである。
一実施形態では、Ｒ２は、（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニルである。
一実施形態では、Ｒ２は、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキニルである。
一実施形態では、Ｒ２は、二重結合を１つのみ有する（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニルである。
一実施形態では、Ｒ２は、（Ｚ）－４－デセン－１－イル、１－ノニル、３－ウンデシル、１－デシル、６（Ｚ），１５（Ｚ）－ヘニコサンジエン－１１－イル、３－ヘキセン－１－イル、９（Ｚ）－オクタデセン－１－イル、または２－ブチルオクト－１－イル、４－（１－メチルエテニル）シクロヘキセン－１－イルメチルである。
一実施形態では、Ｒ３は、Ｃ２－Ｃ２０ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ３は、Ｃ２－Ｃ１５ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ３は、Ｃ２－Ｃ１０ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ３は、Ｃ５－Ｃ２０ヒドロカルビルである。
一実施形態では、Ｒ３は、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ２０）アルケニル、または（Ｃ２－Ｃ２０）アルキニルである。
一実施形態では、Ｒ３は、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキルである。
一実施形態では、Ｒ３は、（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニルである。
一実施形態では、Ｒ３は、（Ｃ８－Ｃ２０）アルキニルである。
一実施形態では、Ｒ３は、二重結合を１つのみ有する（Ｃ８－Ｃ２０）アルケニルである。
一実施形態では、Ｒ３は、（Ｚ）－４－デセン－１－イル、１－ノニル、３－ウンデシル、１－デシル、６（Ｚ），１５（Ｚ）－ヘニコサンジエン－１１－イル、３－ヘキセン－１－イル、９（Ｚ）－オクタデセン－１－イル、アダマントリ（ａｄａｍａｎｔｌｙ）－１－イルメチル、２－ブチルオクト－１－イル、（Ｚ）－２－（（Ｚ）－デカ－４－エン－１－イル）ドデカ－６－エン－１－イル、または４－（プロプ－１－エン－２－イル）シクロヘキセ－１－エン－１－イル）メチルである。
一実施形態では、Ｘは、二価のＣ２－Ｃ６アルキルである。
一実施形態では、Ｘは、二価のＣ３－Ｃ５アルキルである。
一実施形態では、Ｘは、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
一実施形態では、Ｘは、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
一実施形態では、Ｘは、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
一実施形態では、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ、独立して、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルからなる群から選択され、そのメチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルは、任意選択でヒドロキシで置換される。
一実施形態では、ＲａとＲｂが、それらが結合している窒素と一緒になってアジリジン環、アゼチジン環、プロリン環、ピペリジン環、ピペラジン環、またはモルホリン環を形成し、その環は、ヒドロキシル、もしくは任意選択でヒドロキシで置換されるＣ１－Ｃ６アルキルで任意選択で置換される。
一実施形態では、Ｒａ及びＲｂはそれぞれ、独立して、メチル及びエチルからなる群から選択される。
一実施形態では、Ｒ４は、ジメチルアミノである。
非カチオン性脂質
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）に使用される非カチオン性脂質は、安定複合体を生成することができる任意の様々な中性非荷電性、双性イオン性、またはアニオン性脂質であり得る。
非カチオン性脂質の非限定的な例としては、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスファート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレイオル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシラート］（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びそれらの混合物等の、リン脂質が含まれる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用することができる。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０－Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。
非カチオン性脂質のさらなる例には、コレステロール等のステロール、及びその誘導体、例えば、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、ならびにこれらの混合物が含まれる。
いくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えば、リン脂質不含の脂質粒子製剤を含むか、またはそれからなる。他の実施形態では、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、１つ以上のリン脂質、例えば、コレステロール不含の脂質粒子製剤を含むか、またはそれからなる。さらなる実施形態では、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、１つ以上のリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含むか、またはそれからなる。
本発明での使用に好適な非カチオン性脂質の他の例には、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレエート、ヘキサデシルステアラート（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｓｔｅｒｅａｔｅ）、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン－ラウリルスルフェート、アルキル－アリールスルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリン等のようなリン不含の脂質が含まれる。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、または約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成する。
特定の実施形態では、リン脂質不含脂質粒子中に存在するコレステロールは、粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成する。非限定的な例として、リン脂質不含脂質粒子は、粒子中に存在する総脂質の約３７ｍｏｌ％のコレステロールを含み得る。
特定の他の実施形態では、リン脂質とコレステロールとの混合物を含有する脂質粒子中に存在するコレステロールは、粒子中に存在する総脂質の約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％を構成する。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む脂質粒子は、粒子中に存在する総脂質の約３４ｍｏｌ％のコレステロールを含み得る。
さらなる実施形態では、リン脂質とコレステロールとの混合物を含有する脂質粒子中に存在するコレステロールは、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、または約１７ｍｏｌ％～約２３ｍｏｌ％を構成する。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む脂質粒子は、粒子中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％のコレステロールを含み得る。
脂質粒子がリン脂質とコレステロールまたはコレステロール誘導体との混合物を含有する実施形態では、その混合物は、粒子中に存在する総脂質の最大約４０、４５、５０、５５、または６０ｍｏｌ％を構成し得る。特定の場合では、混合物中のリン脂質成分は、粒子中に存在する総脂質の約２ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、または約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％を構成し得る。非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む脂質粒子は、粒子中に存在する総脂質の約７ｍｏｌ％のＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質を（例えば、約３４ｍｏｌ％のコレステロールとの混合物中に）含み得る。他の特定の場合では、混合物中のリン脂質成分は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％、または約１７ｍｏｌ％～約２３ｍｏｌ％を構成し得る。別の非限定的な例として、リン脂質とコレステロールとの混合物を含む脂質粒子は、粒子中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％のＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ等のリン脂質を（例えば、約２０ｍｏｌ％のコレステロールとの混合物中に）含み得る。
脂質コンジュゲート
カチオン性及び非カチオン性脂質に加えて、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、脂質コンジュゲートを含む。複合脂質は、粒子の凝集を阻害する点で有用である。好適な複合脂質には、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー－脂質コンジュゲート（ＣＰＬ）、及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、粒子は、ＣＰＬと共にＰＥＧ－脂質コンジュゲートまたはＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートのいずれかを含む。
特定の実施形態では、脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ－脂質である。ＰＥＧ－脂質の例には、例えばＰＣＴ公開第０５／０２６３７２号に記載されているジアルキルオキシプロピルにカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＡ）、例えば米国特許出願公開第２００３００７７８２９号及び同第２００５００８６８９号に記載されているジアシルグリセロールにカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質にカップリングしたＰＥＧ（ＰＥＧ－ＰＥ）、例えば米国特許第５，８８５，６１３号に記載されているセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ、コレステロールまたはその誘導体にコンジュゲートしたＰＥＧ、ならびにこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。これらの特許文書の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらなるＰＥＧ－脂質には、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ、２ＫＰＥＧ－ＤＭＧ、及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
ＰＥＧは、２つの末端ヒドロキシル基を有するエチレンＰＥＧ繰り返し単位の直鎖水溶性ポリマーである。ＰＥＧは、その分子量によって分類され、例えば、ＰＥＧ２０００は約２，０００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ５０００は約５，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．及び他の会社から市販されており、例えば以下のもの、すなわち、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭｅＰＥＧ－ＯＨ）、モノメトキシポリエチレングリコール－スクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ）、モノメトキシポリエチレングリコール－スクシンイミジルスクシネート（ＭｅＰＥＧ－Ｓ－ＮＨＳ）、モノメトキシポリエチレングリコール－アミン（ＭｅＰＥＧ－ＮＨ２）、モノメトキシポリエチレングリコール－トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）（ＭｅＰＥＧ－ＴＲＥＳ）、及びモノメトキシポリエチレングリコール－イミダゾリル－カルボニル（ＭｅＰＥＧ－ＩＭ）を含む。米国特許第６，７７４，１８０号及び同第７，０５３，１５０号に記載されているもの等の他のＰＥＧ（例えば、ｍＰＥＧ（２０ＫＤａ）アミン）もまた、本発明のＰＥＧ－脂質コンジュゲートの調製に有用である。これらの特許の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、モノメトキシポリエチレングリコール酢酸（ＭｅＰＥＧ－ＣＨ２ＣＯＯＨ）は、例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートを含むＰＥＧ－脂質コンジュゲートの調製に特に有用である。
本明細書に記載のＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分は、約５５０ダルトン～約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を構成し得る。特定の場合では、ＰＥＧ部分は、約７５０ダルトン～約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン～約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約２，０００ダルトン等）の平均分子量を有する。特定の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
特定の場合では、ＰＥＧは、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、またはアリール基によって任意選択で置換され得る。ＰＥＧは、脂質に直接コンジュゲートすることができ、またリンカー部分により脂質に連結される場合もある。ＰＥＧを脂質に結合させるのに好適なリンカー部分を使用することができ、例えば、エステル非含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分が含まれる。特定の実施形態では、リンカー部分は、エステル非含有リンカー部分である。本明細書で使用される場合、「エステル不含のリンカー部分」という用語は、カルボン酸エステル結合（－ＯＣ（Ｏ）－）を含有しないリンカー部分を指す。好適なエステル不含のリンカー部分には、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、アミノ（－ＮＲ－）、カルボニル（－Ｃ（Ｏ）－）、カルバマート（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－）、ジスルフィド（－Ｓ－Ｓ－）、エーテル（－Ｏ－）、スクシニル（－（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－）、スクシンアミジル（－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、エーテル、ジスルフィド、及びこれらの組み合わせ（例えば、カルバマートリンカー部分とアミドリンカー部分の両方を含有するリンカー）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、カルバマートリンカーは、ＰＥＧを脂質に結合させるために使用される。
他の実施形態では、エステル含有リンカー部分は、ＰＥＧを脂質に結合させるために使用される。好適なエステル含有リンカー部分には、例えば、カーボネート（－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－）、スクシノイル、リン酸エステル（－Ｏ－（Ｏ）ＰＯＨ－Ｏ－）、スルホン酸エステル、及びこれらの組み合わせが含まれる。
本発明での使用に好適なさらなるＰＥＧ－脂質コンジュゲートには、限定するわけではないが、以下の式の化合物
Ａ－Ｂ－Ｃ
またはその塩が含まれ、式中、
Ａは、（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２－Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルキルチオ、もしくは（Ｃ２－Ｃ６）アルカノイルオキシであり、ここで、任意の（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２－Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルキルチオ、及び（Ｃ２－Ｃ６）アルカノイルオキシは、１つ以上のアニオン前駆体基で置換されており、かつここで、任意の（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２－Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルキルチオ、及び（Ｃ２－Ｃ６）アルカノイルオキシは、任意選択で、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１－Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１－Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１－Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１－Ｃ３）アルキルチオ、もしくは（Ｃ２－Ｃ３）アルカノイルオキシからなる群から独立して選択される１つ以上の基で置換されており、
Ｂは、約５５０ダルトン～約１０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコール鎖であり、
Ｃは、－Ｌ－Ｒａであり、
Ｌは、直接結合、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲｂ－、－ＮＲｂ－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲｂＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＲｂＣ（Ｏ）ＮＲｂ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｏ－、－（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－、及び－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ－からなる群から選択され、
Ｒａは、分枝状（Ｃ１０－Ｃ５０）アルキルもしくは分枝状（Ｃ１０－Ｃ５０）アルケニルであり、ここで、前記分枝状（Ｃ１０－Ｃ５０）アルキルもしくは分枝状（Ｃ１０－Ｃ５０）アルケニルの１つ以上の炭素原子は、－Ｏ－で置換されており、
Ｒｂはそれぞれ、独立して、Ｈもしくは（Ｃ１－Ｃ６）アルキルである。
複合脂質は、例えば、式Ａ－ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ａ－ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、Ａ－ＰＥＧ－リン脂質、Ａ－ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）の化合物またはこれらの混合物を含むＰＥＧ－脂質を含み得、式中、Ａは、（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２－Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルキルチオ、または（Ｃ２－Ｃ６）アルカノイルオキシであり、ここで、任意の（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２－Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルキルチオ、及び（Ｃ２－Ｃ６）アルカノイルオキシは、１つ以上のアニオン前駆体基で置換されており、かつここで、任意の（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ３－Ｃ８）シクロアルキル（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ２－Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシカルボニル、（Ｃ１－Ｃ６）アルキルチオ、及び（Ｃ２－Ｃ６）アルカノイルオキシは、任意選択で、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ１－Ｃ３）アルコキシ、（Ｃ１－Ｃ６）アルカノイル、（Ｃ１－Ｃ３）アルコキシカルボニル、（Ｃ１－Ｃ３）アルキルチオ、または（Ｃ２－Ｃ３）アルカノイルオキシからなる群から独立して選択される１つ以上の基で置換されている。Ａ－ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、Ａ－ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、Ａ－ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、Ａ－ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、もしくはＡ－ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）、またはこれらの混合物であり得る。
様々な鎖長及び飽和度の種々のアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンをＰＥＧにコンジュゲートして、脂質コンジュゲートを形成することができる。そのようなホスファチジルエタノールアミンは、市販されているか、または、当業者に公知の従来技術を使用して単離もしくは合成することができる。Ｃ１０－Ｃ２０の範囲の炭素鎖長を有する飽和または不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンが好ましい。モノまたはジ不飽和脂肪酸、及び飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との混合物を有するホスファチジルエタノールアミンもまた、使用することができる。好適なホスファチジルエタノールアミンには、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、及びジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
「ＡＴＴＲ」または「ポリアミド」という用語は、非限定的に、米国特許第６，３２０，０１７号及び同第６，５８６，５５９号（これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている化合物を指す。これらの化合物には、式
Figure 2023534206000006
 を有する化合物が含まれ、式中、Ｒは、水素、アルキル及びアシルからなる群から選択されるメンバーであり、Ｒ１は、水素及びアルキルからなる群から選択されるメンバーであるか、または任意選択で、Ｒ及びＲ１ならびにそれらが結合する窒素はアジド部分を形成し、Ｒ２は、水素、任意選択で置換されたアルキル、任意選択で置換されたアリール、及びアミノ酸側鎖から選択される群のメンバーであり、Ｒ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノならびにＮＲ４Ｒ５からなる群から選択されるメンバーであり、ここで、Ｒ４及びＲ５は独立して水素またはアルキルであり、ｎは、４～８０であり、ｍは、２～６であり、ｐは、１～４であり、ｑは、０または１である。当業者には、他のポリアミドを本発明の化合物に使用することができることが明らかであろう。
「ジアシルグリセロール」という用語は、２本の脂肪アシル鎖であるＲ１及びＲ２を有する化合物を指し、これらは両方とも独立して、エステル結合によりグリセロールの１位及び２位に結合している２～３０個の炭素を有する。アシル基は、飽和していてもよく、または様々な不飽和度を有していてもよい。好適なアシル基には、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）、及びイコシル（Ｃ２０）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｒ１及びＲ２は同じであり、すなわち、Ｒ１及びＲ２はいずれもミリスチル（すなわちジミリスチル）である、Ｒ１及びＲ２はいずれもステアリル（すなわちジステアリル）である、等である。ジアシルグリセロールは、以下の一般式を有する。
Figure 2023534206000007
「ジアルキルオキシプロピル」という用語は、２本のアルキル鎖であるＲ１及びＲ２を有する化合物を指し、これらは両方とも独立して、２～３０個の炭素を有する。アルキル基は、飽和していてもよく、または様々な不飽和度を有していてもよい。ジアルキルオキシプロピルは、以下の一般式を有する。
Figure 2023534206000008
特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、以下の式を有するＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートであり、
Figure 2023534206000009
 式中、Ｒ１及びＲ２は独立して選択され、約１０～約２２個の炭素原子を有する長鎖アルキル基であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり、Ｌは、上述のエステル不含のリンカー部分またはエステル含有リンカー部分である。
長鎖アルキル基は、飽和または不飽和であり得る。好適なアルキル基には、ラウリル（Ｃ１２）、ミリスチル（Ｃ１４）、パルミチル（Ｃ１６）、ステアリル（Ｃ１８）、及びイコシル（Ｃ２０）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｒ１及びＲ２は同じであり、すなわち、Ｒ１及びＲ２はいずれもミリスチル（すなわちジミリスチル）である、Ｒ１及びＲ２はいずれもステアリル（すなわちジステアリル）である、等である。
上記式ＶＩＩにおいて、ＰＥＧは、約５５０ダルトン～約１０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を有する。特定の場合では、ＰＥＧ部分は、約５００ダルトン～約５，０００ダルトン（例えば、約１，０００ダルトン～約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約３，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約２，０００ダルトン等）の平均分子量を有する。特定の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約２，０００ダルトンまたは約７５０ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧは、任意選択で、アルキル、アルコキシ、アシル、またはアリールで置換され得る。特定の実施形態では、末端ヒドロキシル基は、メトキシ基またはメチル基で置換されている。
特定の実施形態では、「Ｌ」は、エステル不含のリンカー部分である。好適なエステル不含のリンカーには、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバマートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分、及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、エステル不含のリンカー部分は、カルバマートリンカー部分である（すなわち、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＡＡコンジュゲート）。別の実施形態では、エステル不含のリンカー部分は、アミドリンカー部分（すなわち、ＰＥＧ－Ａ－ＤＡＡコンジュゲート）である。さらに別の実施形態では、エステル不含のリンカー部分は、スクシンアミジルリンカー部分（すなわち、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＡコンジュゲート）である。
特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、以下から選択される。
Figure 2023534206000010
 一実施形態では、ｎは、約２０００の分子量を有するポリマー鎖が得られるよう選択される。
ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、当業者に公知の標準的な技術及び試薬を使用して合成される。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、様々なアミド結合、アミン結合、エーテル結合、チオ結合、カルバマート結合、及び尿素結合を含有することが認識されるであろう。当業者は、これらの結合を形成するための方法及び試薬が周知であり、容易に入手可能であることを認識するであろう。例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（Ｗｉｌｅｙ １９９２）、Ｌａｒｏｃｋ，ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ ＯＲＧＡＮＩＣ ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮＳ（ＶＣＨ １９８９）、及びＦｕｒｎｉｓｓ，ＶＯＧＥＬ’Ｓ ＴＥＸＴＢＯＯＫ ＯＦ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，５ｔｈ ｅｄ．（Ｌｏｎｇｍａｎ １９８９）を参照されたい。存在する任意の官能基は、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートの合成における様々な時点で保護及び脱保護を必要とし得ることも理解されよう。当業者は、そのような技術が周知であることを認識するであろう。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｗｉｌｅｙ １９９１）を参照されたい。
好ましくは、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）－ＰＥＧコンジュゲート、ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）－ＰＥＧコンジュゲート、ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）－ＰＥＧコンジュゲート、またはジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）－ＰＥＧコンジュゲートである。当業者は、他のジアルキルオキシプロピルを本発明のＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートに使用できることを容易に理解するであろう。
上述に加えて、ＰＥＧの代わりに他の親水性ポリマーを使用できることが、当業者には容易に明らかになるであろう。ＰＥＧの代わりに使用することのできる好適なポリマーの例には、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド及びポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロース等の誘導体化セルロースが含まれるが、これらに限定されない。
ポリカチオン性部分の電荷は、粒子部分全体にわたり分布し得るか、またはその代わりに、粒子部分のある特定の領域における異なる濃度の電荷密度、例えば、電荷スパイクであり得るかのいずれかである。電荷密度が粒子上に分布している場合、電荷密度は、均一に分布し得るかまたは不均一に分布し得る。ポリカチオン性部分の電荷分布のすべての変形が、本発明に包含される。
脂質「Ａ」及び非免疫原性ポリマー「Ｗ」は、様々な方法によって、好ましくは共有結合によって結合され得る。当業者に公知の方法を、「Ａ」と「Ｗ」との共有結合に使用することができる。好適な結合には、アミド結合、アミン結合、カルボキシル結合、カーボネート結合、カルバマート結合、エステル結合、及びヒドラゾン結合が含まれるが、これらに限定されない。結合をもたらすために「Ａ」及び「Ｗ」が相補的官能基を有さなければならないことは、当業者には明らかであろう。一方は脂質上、他方はポリマー上でのこれらの２つの基の反応により、所望の結合がもたらされる。例えば、脂質がジアシルグリセロールであり、末端ヒドロキシルが例えばＮＨＳ及びＤＣＣで活性化されて活性エステルを形成し、次いでこの脂質がポリアミド等のアミノ基を含有するポリマーと反応する場合（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号及び同第６，５８６，５５９号を参照されたい。これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、アミド結合が、２つの基の間に形成される。
特定の場合では、ポリカチオン性部分には、標的化リガンドまたはカルシウムを錯化するためのキレート化部分等のリガンドが結合され得る。好ましくは、リガンドが結合した後、カチオン性部分は正電荷を維持する。特定の場合では、結合されたリガンドは正電荷を有する。好適なリガンドには、反応性官能基を有する化合物またはデバイスが含まれるがこれらに限定されず、脂質、両親媒性脂質、キャリア化合物、生体親和性化合物、生体材料、バイオポリマー、医用デバイス、分析的に検出可能な化合物、治療的に活性な化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激薬、放射標識、蛍光発生物質、ビオチン、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖類、リポソーム、ビロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、他の標的化部分、または毒素が含まれる。
脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質）は、通常、粒子中に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約０．９ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、または約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％を構成する。
当業者は、用いられる脂質コンジュゲート、及び核酸－脂質粒子が膜融合性となる速度に応じて、脂質コンジュゲートの濃度を変化させることができることを理解するであろう。
脂質コンジュゲートの組成及び濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが核酸－脂質粒子の外側と入れ替わる速度、及び次に、核酸－脂質粒子が膜融合性となる速度を制御することができる。例えば、ＰＥＧ－ホスファチジルエタノールアミンコンジュゲートまたはＰＥＧ－セラミドコンジュゲートを脂質コンジュゲートとして使用する場合、核酸－脂質粒子が膜融合性となる速度を、例えば、脂質コンジュゲートの濃度を変化させることによって、ＰＥＧの分子量を変化させることによって、またはホスファチジルエタノールアミンもしくはセラミド上のアシル鎖基の鎖長及び飽和度を変化させることによって、変化させることができる。さらに、例えば、ｐＨ、温度、イオン強度等を含む他の変数を使用して、核酸－脂質粒子が膜融合性となる速度を変化させる及び／または制御することができる。核酸－脂質粒子が膜融合性となる速度を制御するために使用することができる他の方法は、本開示を読むことで当業者には明らかとなるであろう。
脂質粒子の調製
核酸分子等の活性薬剤または治療剤が脂質二重層中に封入されており分解から保護される本発明の脂質粒子、例えばＬＮＰは、連続混合法または直接希釈プロセスを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の任意の方法により形成することができる。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉの脂質、またはその組み合わせである。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジパルミトイル－ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、１４：０ ＰＥ（１，２－ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ））、１６：０ ＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ））、１８：０ ＰＥ（１，２－ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ））、１８：１ ＰＥ（１，２－ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ））、１８：１トランスＰＥ（１，２－ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ））、１８：０－１８：１ ＰＥ（１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ））、１６：０－１８：１ ＰＥ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ））、ポリエチレングリコール系ポリマー（例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、もしくはＰＥＧ修飾ジアルキルオキシプロピル）、コレステロール、またはそれらの組み合わせである。
特定の実施形態では、本発明は、連続混合方法、例えば、第１のリザーバに干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ等の核酸を含む水溶液を供給すること、第２のリザーバに有機脂質溶液を供給すること、及び核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を封入するリポソームを実質的に瞬時に生成するように有機脂質溶液が水溶液と混合するように、水溶液を有機脂質溶液と混合することを含むプロセスにより生成されるＬＮＰを提供する。このプロセス及びこのプロセスを実施するための装置は、米国特許出願公開第２００４０１４２０２５号に詳細に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
脂質及び緩衝溶液を混合チャンバ内等の混合環境に連続的に導入する操作により、緩衝溶液による脂質溶液の連続希釈が生じ、これにより、混合すると実質的に瞬時にリポソームが生成される。本明細書で使用される場合、「脂質溶液を緩衝溶液で連続的に希釈する」という語句（及び変形）は、一般に、脂質溶液が水和プロセスにおいて小胞の生成をもたらすのに十分な力で十分に迅速に希釈されることを意味する。核酸を含む水溶液を有機脂質溶液と混合することにより、有機脂質溶液は、緩衝溶液（すなわち水溶液）の存在下で連続的な段階希釈を受けて、核酸－脂質粒子を生成する。
連続混合法を使用して形成されたＬＮＰは、通常、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、または約７０ｎｍ～約９０ｎｍのサイズを有する。このように形成された粒子は凝集せず、均一な粒子径を得るために任意選択でサイジングされる。
別の実施形態では、本発明は、リポソーム溶液を形成すること、及び制御された量の希釈緩衝液が入っている収集容器にリポソーム溶液を直ちに直接導入することを含む、直接希釈プロセスにより生成されるＬＮＰを提供する。特定の態様では、収集容器は、希釈を促進するために収集容器の内容物を撹拌するように構成された１つ以上の構成要素を含む。一態様では、収集容器中に存在する希釈緩衝液の量は、その中に導入されるリポソーム溶液の体積に実質的に等しい。非限定的な例として、４５％エタノール中のリポソーム溶液は、等体積の希釈緩衝液が入っている収集容器中に導入される場合、有利なことに、より小さな粒子をもたらすであろう。
さらに別の実施形態では、本発明は、希釈緩衝液が入っている第３のリザーバを第２の混合領域に流体連結する、直接希釈プロセスにより生成されるＬＮＰを提供する。本実施形態では、第１の混合領域中で形成されたリポソーム溶液が、第２の混合領域中で希釈緩衝液と直ちに直接混合される。特定の態様では、第２の混合領域は、リポソーム溶液及び希釈緩衝液の流れが、１８０°対向する流れとして合流するように配置されたＴ－コネクタを含むが、より浅い角度、例えば約２７°～約１８０°をもたらすコネクタを使用することができる。ポンプ機構は、第２の混合領域に制御可能な緩衝液流を送達する。一態様では、第２の混合領域に供給される希釈緩衝液の流速は、第１の混合領域からそこに導入されるリポソーム溶液の流速と実質的に等しくなるように制御される。この実施形態は、有利なことに、第２の混合領域中でリポソーム溶液と混合している希釈緩衝液の流れ、したがってまた、第２の混合プロセス全体にわたる緩衝液中のリポソーム溶液の濃度の、さらなる制御を可能にする。そのような希釈緩衝液の流速の制御により、有利なことに、低減された濃度での小粒子径の形成が可能となる。
これらのプロセス及びこれらの直接希釈プロセスを実施するための装置は、米国特許出願公開第２００７００４２０３１号に詳細に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
直接希釈プロセスを使用して形成されたＬＮＰは、通常、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、または約７０ｎｍ～約９０ｎｍのサイズを有する。このように形成された粒子は凝集せず、均一な粒子径を得るために任意選択でサイジングされる。
必要であれば、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を、リポソームをサイジングするために利用可能な任意の方法によりサイジングすることができる。サイジングは、所望のサイズ範囲及び比較的狭い粒子径分布が得られるよう実施され得る。
所望のサイズに粒子をサイジングするためのいくつかの技術が利用可能である。リポソームのために使用され、本発明の粒子に等しく適用可能な１つのサイジング方法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。槽内超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかにより粒子懸濁液を超音波処理することで、約５０ｎｍ未満のサイズの粒子までサイズを漸減させる。ホモジナイゼーションは、より大きな粒子をより小さな粒子に断片化するための剪断エネルギーに依存する、別の方法である。典型的なホモジナイゼーション手順では、選択された粒子径（典型的には約６０～約８０ｎｍ）が観察されるまで、標準的なエマルションホモジナイザーを通じて粒子を再循環させる。両方の方法において、従来のレーザー光粒子径識別またはＱＥＬＳにより、粒子径分布をモニタリングすることができる。
細孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通した粒子の押出しもまた、比較的明確なサイズ分布へと粒子径を低減させるための有効な方法である。通常、所望の粒子径分布が得られるまで、懸濁液を膜を通して１回以上循環させる。粒子は、サイズを段階的に縮小するために、順次、孔のより小さい膜に通過させて押し出され得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ中の核酸は、例えば、米国特許出願第０９／７４４，１０３号（その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように予め濃縮される。
他の実施形態では、方法は、本発明の組成物を使用して細胞のリポフェクションに影響を与えるために有用な非脂質性ポリカチオンを添加することをさらに含む。好適な非脂質性ポリカチオンの例には、臭化ヘキサジメトリン（ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）の商品名でＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡから販売されている）またはヘキサジメトリンの他の塩が含まれる。他の好適なポリカチオンには、例えば、ポリ－Ｌ－オルニチン、ポリ－Ｌ－アルギニン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ポリアリルアミン、及びポリエチレンイミンの塩が含まれる。これらの塩を添加するのは、好ましくは粒子が形成された後である。
いくつかの実施形態では、形成されたＬＮＰ中の核酸対脂質比（質量／質量比）は、約０．０１～約０．２、約０．０２～約０．１、約０．０３～約０．１、または約０．０１～約０．０８の範囲である。出発物質の比もまた、この範囲内に入る。他の実施形態では、ＬＮＰ調製物は、総脂質１０ｍｇあたり約４００μｇの核酸を使用するか、または約０．０１～約０．０８の、より好ましくは核酸５０μｇあたり１．２５ｍｇの総脂質に対応する約０．０４の核酸対脂質質量比を使用する。他の実施形態では、粒子は、約０．０８の核酸：脂質質量比を有する。
他の実施形態では、形成されたＬＮＰ中の脂質対核酸比（質量／質量比）は、約１（１：１）～約１００（１００：１）、約５（５：１）～約１００（１００：１）、約１（１：１）～約５０（５０：１）、約２（２：１）～約５０（５０：１）、約３（３：１）～約５０（５０：１）、約４（４：１）～約５０（５０：１）、約５（５：１）～約５０（５０：１）、約１（１：１）～約２５（２５：１）、約２（２：１）～約２５（２５：１）、約３（３：１）～約２５（２５：１）、約４（４：１）～約２５（２５：１）、約５（５：１）～約２５（２５：１）、約５（５：１）～約２０（２０：１）、約５（５：１）～約１５（１５：１）、約５（５：１）～約１０（１０：１）、約５（５：１）、６（６：１）、７（７：１）、８（８：１）、９（９：１）、（１０：１）、１１（１１：１）、１２（１２：１）、１３（１３：１）、１４（１４：１）、１５（１５：１）、１６（１６：１）、１７（１７：１）、１８（１８：１）、１９（１９：１）、２０（２０：１）、２１（２１：１）、２２（２２：１）、２３（２３：１）、２４（２４：１）、２５（２５：１）、２６（２６：１）、２７（２７：１）、２８（２８：１）、２９（２９：１）または３０（３０：１）の範囲である。出発物質の比もまた、通常この範囲内に入る。
上述のように、複合脂質は、ＣＰＬをさらに含み得る。ＬＮＰ－ＣＰＬ（ＣＰＬ含有ＬＮＰ）を作製するための様々な一般的方法が本明細書で論じられる。２つの一般的技法には、「ポストインサーション」技法、すなわち、例えば予め形成されたＬＮＰへのＣＰＬの挿入と、例えば、ＬＮＰ形成工程の際にＣＰＬを脂質混合物中に含ませる「標準」技法とが含まれる。ポストインサーション技法は、主にＬＮＰ二重層膜の外面にＣＰＬを有するＬＮＰを生じさせ、一方で、標準技法は、内面及び外面の両方にＣＰＬを有するＬＮＰをもたらす。この方法は、リン脂質（コレステロールを含有し得る）から作製された小胞に特に有用であり、また、ＰＥＧ－脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡ及びＰＥＧ－ＤＡＧ）を含有する小胞にも有用である。ＬＮＰ－ＣＰＬを作製する方法は、例えば、米国特許第５，７０５，３８５号、同第６，５８６，４１０号、同第５，９８１，５０１号、同第６，５３４，４８４号、及び同第６，８５２，３３４号、米国特許出願公開第２００２００７２１２１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ００／６２８１３号に教示されており、それらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰを作製するための他の方法は、例えば、米国特許第９，００５，６５４号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０１２１９１号に見出され得、それらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
キット
本発明はまた、キット形態の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を提供する。キットは、脂質粒子の様々な構成要素（例えば、核酸等の活性薬剤または治療剤、及び粒子の個々の脂質成分）を保持するように区画化された容器を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、エンドソーム膜不安定化剤（例えば、カルシウムイオン）をさらに含み得る。キットは典型的に、本発明の脂質粒子組成物を、好ましくは脱水形態で、その再水和及び投与のための説明書と共に含む。
他の特定の場合では、粒子の標的化をさらに向上させるために、脂質粒子の表面に結合した標的化部分を有することが望ましい場合がある。標的化部分（例えば、抗体、タンパク質等）を脂質（本発明の粒子に使用されるもの等）に結合させる方法は、当業者に公知である。
脂質粒子の投与
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、形成された後、活性薬剤または治療剤（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ等の核酸）の細胞への導入に有用である。したがって、本発明はまた、核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）等の活性薬剤または治療剤を細胞に導入するための方法も提供する。この方法は、まず上述のように粒子を形成し、次に、活性薬剤または治療剤の細胞への送達が生じるのに十分な一定時間、その粒子を細胞に接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施される。
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、それらと混合させるかまたは接触させるほぼすべての細胞タイプに吸着させることができる。粒子は、一旦吸着させると細胞の一部によりエンドサイトーシスされるか、脂質を細胞膜と交換するか、または細胞と融合するかのいずれかであり得る。粒子の活性薬剤または治療剤（例えば、核酸）部分の導入または組み込みは、これらの経路のいずれか１つを介して生じ得る。特に、融合が生じると、粒子膜は細胞膜に組み込まれ、粒子の内容物は細胞内液と混ざる。
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、単独で、または投与経路及び標準的な薬務に従って選択される薬学的に許容可能な担体（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液）との混合物のいずれかで、投与することができる。一般に、緩衝生理食塩水（例えば１３５～１５０ｍＭ ＮａＣｌ）が薬学的に許容可能な担体として用いられるであろう。他の好適な担体には、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の安定性増強のための糖タンパク質を含む、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン等が含まれる。さらなる好適な担体は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に記載されている。本明細書で使用される場合、「担体」には、あらゆるすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等が含まれる。「薬学的に許容可能」という語句は、ヒトに投与したときにアレルギー性または類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
薬学的に許容可能な担体は、一般に、脂質粒子の形成後に添加される。したがって、粒子の形成後に、生理緩衝食塩水等の薬学的に許容可能な担体中に粒子を希釈することができる。
医薬製剤中の粒子の濃度は大幅に、すなわち約０．０５重量％未満、通常は約２～５重量％から、約１０～９０重量％もの高さまで変動し得、選択された特定の投与様式に従って、主として流体体積、粘度等により選択されることになる。例えば、治療に伴う流体負荷を低下させるために、濃度を増加させてよい。これは、アテローム性動脈硬化症に関連するうっ血性心不全または重度の高血圧症を有する患者に特に望ましい場合がある。あるいは、投与部位の炎症を軽減するために、刺激性脂質から構成される粒子を低濃度に希釈してもよい。
本発明の医薬組成物を、従来の周知の滅菌技術により滅菌してもよい。水溶液は、使用のためにパッケージ化してもよく、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥し、その凍結乾燥調製物を投与前に無菌水溶液と混合してもよい。組成物は、生理学的条件に近似させるために必要とされる、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤等の薬学的に許容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウムを含有してもよい。さらに、粒子懸濁液は、貯蔵時のフリーラジカル及び脂質過酸化による損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。アルファトコフェロール等の親油性フリーラジカルクエンチャー及びフェリオキサミン等の水溶性鉄特異的キレート剤が好適である。
Ｉｎ Ｖｉｖｏ投与
ｉｎ ｖｉｖｏ療法のための全身送達、例えば、循環等の身体系を介した遠位標的細胞への治療用核酸の送達は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／００７１９６号、同第ＷＯ０５／１２１３４８号、同第ＷＯ０５／１２０１５２号、及び同第ＷＯ０４／００２４５３号（これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているもの等の核酸－脂質粒子を使用して実現されている。本発明はまた、血清中でヌクレアーゼ分解から核酸を保護し、非免疫原性でありサイズが小さく反復投薬に好適である、完全に封入された脂質粒子を提供する。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与の場合、投与は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、気管内、噴霧、注射、経口投与、吸入（例えば、鼻腔内または気管内）、経皮適用、または直腸投与によるものであり得る。投与は、単回用量または分割用量により行うことができる。医薬組成物は、非経口的、すなわち、関節内に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、または筋肉内に投与することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注射により静脈内または腹腔内投与される（例えば、米国特許第５，２８６，６３４号を参照されたい）。細胞内核酸送達はまた、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１：５１２（１９８３）、Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）、Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．，６：２３９（１９８９）、及びＢｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２６：２７４（１９９３）で論じられている。脂質ベースの治療薬を投与するさらなる他の方法は、例えば、米国特許第３，９９３，７５４号、同第４，１４５，４１０号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２２４，１７９号、同第４，５２２，８０３号、及び同第４，５８８，５７８号に記載されている。脂質粒子は、疾患部位での直接注射により、または疾患部位から遠位の部位での注射により投与することができる（例えば、Ｃｕｌｖｅｒ，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０－７１（１９９４）を参照されたい）。上述の参照文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の組成物は、吸入（例えば、鼻腔内または気管内）を介して投与するために、単独で、または他の好適な成分と組み合わせてのいずれかで、エアロゾル製剤に作製することができる（すなわち、それらを「噴霧する」ことができる）（Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８（１９８９）を参照されたい）。エアロゾル製剤を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容可能な噴射剤中に入れることができる。
特定の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、及び／または他のエアロゾル送達ビヒクルにより送達され得る。核酸組成物を経鼻エアロゾルスプレーにより肺に直接送達するための方法は、例えば米国特許第５，７５６，３５３号及び同第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂及びリゾホスファチジル－グリセロール化合物を使用した薬物送達（米国特許第５，７２５，８７１号）もまた、薬学的分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載されている。上述の特許の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の実施において、組成物は、最も好ましくは、例えば、気管内または霧化により投与され、好ましくは、静脈内注入、経口、局所、腹腔内、脳室内、または髄腔内に投与される。
例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路等による非経口投与に好適な製剤には、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張無菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液が含まれる。
一般に、静脈内投与する場合、脂質粒子製剤を好適な医薬担体を用いて製剤化する。多くの薬学的に許容可能な担体が、本発明の組成物及び方法で用いられ得る。本発明における使用に好適な製剤は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見出される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン等を使用してよく、それらの水性担体は、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の安定性増強のための糖タンパク質を含み得る。一般に、薬学的に許容可能な担体として緩衝生理食塩水（１３５～１５０ｍＭ ＮａＣｌ）が用いられるが、他の好適な担体でも十分であろう。これらの組成物は、濾過等の従来のリポソーム滅菌技術により滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近似させるために必要とされる、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤等の薬学的に許容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含有してもよい。これらの組成物は、上述の技術を使用して滅菌することができ、また、別法として、滅菌条件下で生成することもできる。得られた水溶液は、使用のためにパッケージ化してもよく、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥し、その凍結乾燥調製物を投与前に無菌水溶液と混合してもよい。
ある特定の用途では、本明細書に開示される脂質粒子は、経口投与により個体に送達され得る。粒子を賦形剤に組み込み、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、ロゼンジ、エリキシル剤、洗口剤、懸濁液、口腔スプレー剤、シロップ剤、オブラート等の形態で使用することができる（例えば、米国特許第５，６４１，５１５号、同第５，５８０，５７９号、及び同第５，７９２，４５１を参照されたい。これらの開示はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの経口剤形はまた、以下、すなわち結合剤、ゼラチン；賦形剤、滑沢剤、及び／または香味剤を含有し得る。単位剤形がカプセルの場合、その剤形は、上述の物質に加えて液体担体を含有してよい。様々な他の物質が、コーティング剤として、またはその他の方法で投薬単位の物理的形態を変更するために、存在してもよい。当然ながら、任意の単位剤形の調製に使用される任意の物質は、薬学的に純粋であり、用いられる量で実質的に無毒性であるべきである。
通常、これらの経口製剤は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い脂質粒子を含有し得るが、粒子のパーセンテージは当然ながら変動してもよく、好都合には製剤の総重量または総体積の約１％もしくは２％～約６０％もしくは７０％またはそれより多くてもよい。必然的に、治療的に有用な各組成物中の粒子の量は、好適な投薬量が化合物の任意の所与の単位用量で得られるような方式で調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、生成物の有効期間、及び他の薬理学的考慮事項等の要因が、そのような医薬製剤を調製する当業者によって企図され、したがって、様々な投薬量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
経口投与に好適な製剤は以下、すなわち、（ａ）液体溶液、例えば、水、食塩水、またはＰＥＧ４００等の希釈剤中に懸濁した、核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）等の有効量のパッケージ化された治療剤、（ｂ）所定量の核酸（例えば干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）等の治療剤を液体、固体、顆粒、またはゼラチンとしてそれぞれ含有する、カプセル剤、サシェ、または錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁液、及び（ｄ）好適なエマルションから構成され得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、色素、崩壊剤、ならびに薬学的に適合可能な担体のうちの１つ以上を含み得る。ロゼンジ形態は、香料、例えば、スクロース中の核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）等の治療剤、ならびに治療剤に加えて当該技術分野で公知の担体を含有するゼラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアラビアゴムエマルション、ゲル等の不活性基剤中に治療剤を含む香錠を含み得る。
それらの別の使用例では、脂質粒子を広範な局所剤形に組み込むことができる。例えば、ＬＮＰ等の核酸－脂質粒子を含有する懸濁液は、ゲル、油、エマルション、局所クリーム、ペースト、軟膏、ローション、泡、ムース等として製剤化及び投与することができる。
本発明の脂質粒子の医薬調製物を調製する場合、空の粒子または核酸等の治療剤が外表面と会合した粒子を低減または除去するために精製された、多量の粒子を使用することが好ましい。
本発明の方法は、様々な宿主において実施され得る。特定の宿主には、霊長類（例えば、ヒト及びチンパンジーならびに他の非ヒト霊長類）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類（例えば、ラット及びマウス）、ウサギ、ならびにブタ等の哺乳動物が含まれる。
投与される粒子の量は、治療剤（例えば、核酸）対脂質の比、使用される特定の治療剤（例えば、核酸）、治療される疾患または障害、患者の年齢、体重、及び状態、ならびに臨床医の判断に依存するが、一般に、約０．０１～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１～約５ｍｇ／ｋｇ体重、または投与（例えば、注射）１回あたり約１０８～１０１０粒子であろう。
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ投与
ｉｎ ｖｉｔｒｏ用途の場合、核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）等の治療剤の送達は、植物起源であるか動物起源であるか、脊椎動物であるか無脊椎動物であるか、及びいずれの組織またはタイプであるかを問わず、培養で増殖させた任意の細胞に対して行うことができる。特定の実施形態では、細胞は、動物細胞、より好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる場合、細胞と脂質粒子との間の接触は、生物学的に適合する媒体中で起こる。粒子の濃度は、特定の用途に応じて広く変動するが、一般的には約１μｍｏｌ～約１０ｍｍｏｌである。脂質粒子を用いた細胞の処置は、一般に、生理学的温度（約３７℃）で、約１～４８時間、好ましくは約２～４時間の期間にわたって実施される。
ある一群の実施形態では、脂質粒子懸濁液を、約１０３～約１０５細胞／ｍｌ、より好ましくは約２×１０４細胞／ｍｌの細胞密度を有する、６０～８０％コンフルエントでプレーティングした細胞に添加する。細胞に添加される懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１～０．２μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１μｇ／ｍｌである。
エンドソーム放出パラメータ（Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ）（ＥＲＰ）アッセイを使用して、本発明のＬＮＰまたは他の脂質粒子の送達効率を最適化することができる。ＥＲＰアッセイは、米国特許出願公開第２００３００７７８２９号に詳細に記載されており、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。より詳細には、ＥＲＰアッセイの目的は、ＬＮＰの様々なカチオン性脂質及びヘルパー脂質成分の作用を、エンドソーム膜の結合／取り込みまたはエンドソーム膜との融合／その不安定化に対するそれらの相対的作用に基づいて判別することである。このアッセイにより、ＬＮＰまたは他の脂質粒子の各成分が送達効率にどのように影響を及ぼすかを定量的に決定し、それにより、ＬＮＰまたは他の脂質粒子を最適化することが可能となる。通常、ＥＲＰアッセイは、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等）の発現を測定する。場合によっては、発現プラスミドに対して最適化されたＬＮＰ製剤はまた、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡを封入するのに適している。他の場合では、ＥＲＰアッセイを、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の存在下または非存在下で標的配列の転写または翻訳の下方制御を測定するために適合させることができる。他の場合では、ＥＲＰアッセイを、ｍＲＮＡの存在下または非存在下で標的タンパク質の発現を測定するために適合させることができる。様々なＬＮＰまたは他の脂質粒子の各々についてのＥＲＰを比較することにより、最適化された系、例えば、細胞内に最も多く取り込まれるＬＮＰまたは他の脂質粒子を容易に決定することができる。
脂質粒子の送達のための細胞
本発明の組成物及び方法は、多種多様な細胞タイプをｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで治療するために使用される。好適な細胞には、例えば、肺細胞、造血前駆（幹）細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、肝細胞、内皮細胞、骨格筋及び平滑筋細胞、骨芽細胞、神経細胞、静止リンパ球、最終分化細胞、周期が遅いまたは周期が停止した（ｎｏｎｃｙｃｌｉｎｇ）初代細胞、実質細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、骨細胞等が含まれる。特定の実施形態では、１つ以上の核酸分子（例えば、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡ）等の活性薬剤または治療剤は、例えば、肺癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肛門癌細胞、胆管癌細胞、小腸癌細胞、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ））細胞、食道癌細胞、胆嚢癌細胞、肝癌細胞、膵癌細胞、虫垂癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、前立腺癌細胞、腎癌細胞、中枢神経系の癌細胞、神経膠芽腫腫瘍細胞、皮膚癌細胞、リンパ腫細胞、絨毛癌腫瘍細胞、頭頸部癌細胞、骨原性肉腫腫瘍細胞、及び血液癌細胞等のがん細胞に送達される。
１つ以上の核酸分子（例えば、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡ）を封入しているＬＮＰ等の脂質粒子のｉｎ ｖｉｖｏ送達は、任意の細胞タイプの細胞を標的とするのに適している。本方法及び組成物は、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、及びモルモット）、ウサギ、ブタ、ならびに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、及びヒト）等の哺乳類を含む、多種多様な脊椎動物の細胞で用いることができる。
必要とされ得る範囲内で、細胞の組織培養は当該技術分野において周知である。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、Ｋｕｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｏｗｄｅｎ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓ，Ｉｎｃ．（１９７７）及びこれらに引用された参照文献は、細胞培養への一般的な手引きを提供する。培養細胞系は、多くの場合単層細胞の形態であるが、細胞懸濁液も使用される。
脂質粒子の検出
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、約１、２、３、４、５、６、７、８時間またはそれ以上の時点で、対象において検出可能である。他の実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、粒子の投与から約８、１２、２４、４８、６０、７２、もしくは９６時間後、または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２２、２４、２５、もしくは２８日後に対象において検出可能である。粒子の存在は、対象由来の細胞、組織、または他の生体試料から検出することができる。粒子は、例えば、粒子の直接検出により、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）もしくはｍＲＮＡ配列等の治療用核酸の検出により、目的標的配列の検出により（すなわち目的配列の発現もしくは発現の低減を検出することにより）、またはそれらの組み合わせにより、検出され得る。
粒子の検出
ＬＮＰ等の本発明の脂質粒子は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して検出することができる。例えば、当該技術分野で周知の方法を使用して、脂質粒子の成分に標識を直接または間接的にカップリングさせることができる。必要とされる感度、脂質粒子成分とのコンジュゲーションの容易さ、安定性要件、ならびに利用可能な計測手段及び使い捨て設備（ｄｉｓｐｏｓａｌ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）に応じて標識を選択して、多種多様な標識を使用することができる。好適な標識には、蛍光色素（例えば、フルオレセインならびにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）等の誘導体；ローダミン及びテキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の誘導体、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅ（商標）等）等の分光標識；３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ等の放射標識；西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素；コロイド状金または着色ガラスまたはポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等のプラスチックビーズ等の分光比色標識が含まれるが、これらに限定されない。標識は、当該技術分野で公知の任意の手段を使用して検出することができる。
核酸の検出
核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）は、本明細書において当業者に周知の任意のいくつかの手段により検出及び定量される。核酸の検出は、サザン分析、ノーザン分析、ゲル電気泳動、ＰＣＲ、放射標識、シンチレーション計数、及びアフィニティークロマトグラフィー等の周知の方法により行われ得る。分光光度法、Ｘ線撮影法、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及び高拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー等のさらなる分析的な生化学的方法もまた、用いられ得る。
核酸ハイブリダイゼーション形式の選択は、重要ではない。様々な核酸ハイブリダイゼーション形式が、当業者に公知である。例えば、一般的な形式には、サンドイッチアッセイ及び競合または置換アッセイが含まれる。ハイブリダイゼーション技術は、概して、例えば“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｅｄｓ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）に記載されている。
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増加させる核酸増幅系の使用を通じて向上され得る。分子プローブとして使用するための配列の増幅、またはその後のサブクローニングのための核酸フラグメントの生成に好適なｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅技術が知られている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ－レプリカーゼ増幅、及び他のＲＮＡポリメラーゼ媒介性技術（例えば、ＮＡＳＢＡ（商標））を含む、そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法を介して当事者を導くのに十分な技術の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）、ならびに米国特許第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）、Ａｒｎｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔ．１，１９９０），Ｃ＆ＥＮ ３６；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３：８１（１９９１）、Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９）、Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０）、Ｌｏｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７（１９８８）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２９１（１９９０）、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｅ，４：５６０（１９８９）、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０）、及びＳｏｏｋｎａｎａｎ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５６３（１９９５）に見出される。増幅された核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏでクローニングする改善された方法は、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。当該技術分野で説明されている他の方法は、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ（商標）、Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）及びＱβ－レプリカーゼ系である。これらの系は、選択した配列が存在する場合のみＰＣＲまたはＬＣＲプライマーが伸長またはライゲートするように設計した場合、突然変異体を直接同定するために使用することができる。あるいは、選択した配列を、一般に、例えば非特異的ＰＣＲプライマーを使用して増幅することができ、その後、突然変異を示す特定の配列について、増幅された標的領域を探索することができる。上述の参照文献の開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法におけるプローブとしての使用のための、遺伝子プローブとしての使用のための、または阻害物質成分としての核酸は、通常、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．，２２：１８５９ １８６２（１９８１）により記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：６１５９（１９８４）に記載されている自動合成装置を使用して化学合成される。必要な場合、ポリヌクレオチドの精製は通常、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，２５５：１３７ １４９（１９８３）に記載されているアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかにより実施される。合成ポリヌクレオチドの配列は、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８０）ｉｎ Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｌｄａｖｅ（ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９の化学分解法を使用して検証することができる。
転写レベルを測定するための代替的手段は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、概して、Ａｎｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：６４９（１９８７）に記載されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞を固体支持体、通常はスライドガラスに固定する。ＤＮＡを探索する場合、熱またはアルカリで細胞を変性させる。次に、細胞を中程度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させ、標識した特異的プローブをアニーリングさせる。プローブを、好ましくは放射性同位体または蛍光レポーターで標識する。
本発明を、具体的な実施例によってより詳細に説明する。以下の実施例は例示目的のみに提供され、いかなる方法によっても本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本質的に同じ結果をもたらすように変更または修正することができる、様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
以下のケイ素含有脂質は、本発明の実施形態の実施に有用な脂質の例である。そのような脂質は、ＷＯ２０２０／０９７５２０にも記載されている。
実施例１．
Figure 2023534206000011
 （３－クロロプロピル）トリス（デカン－３－イルオキシ）シラン（０．７５ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）、ジメチルアミン（１２．１ｍｍｏｌ（ＴＨＦ中の２．０Ｍの６．０５ｍｌ）及びＭｅＣＮを、密閉反応容器中で１０分間、マイクロ波で１５０℃で加熱した。冷却後、反応物をＥｔＯＡｃと飽和ＮａＨＣＯ３との間で分配した。有機層を水及びブラインで洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残留物を自動カラムクロマトグラフィー（０～１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製し、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（トリス（デカン－３－イルオキシ）シリル）プロパン－１－アミン（０．１６ｇ、２１．６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ ＣＤＣｌ３ δ ３．８５ （ｍ， ３Ｈ）， ２．２３ （ｍ， ８Ｈ）， １．５ （ｍ １５Ｈ）， １．２８ （ｍ， ３４Ｈ）， ０．８７ （ｍ， １９Ｈ）， ０．５５ （ｍ， ２Ｈ）。
中間体（３－クロロプロピル）トリス（デカン－３－イルオキシ）シランを以下のように調製した。
ａ．（３－クロロプロピル）トリス（デカン－３－イルオキシ）シランの調製。
Figure 2023534206000012
 トリクロロ（３－クロロプロピル）シラン（１．７２ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を室温でＥｔ２Ｏ中で撹拌した。Ｅｔ２Ｏ中のウンデカン－３－オール（４．１９ｇ、２４．３ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（３．１５ｇ、２４．３４ｍｍｏｌ）の混合物を室温で滴加した。反応物を室温で１６時間撹拌した。得られた沈殿物を濾過により取り出し、追加のＥｔ２Ｏで洗浄した。有機層を、ＮａＨＣＯ３、水及びブラインで順次洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。残留物を自動フラッシュクロマトグラフィー（２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製し、（３－クロロプロピル）トリス（デカン－３－イルオキシ）シラン（２．４８ｇ、４９．３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ ＣＤＣｌ３ δ ３．８５ （ｐ， ３Ｈ）， ３．５３ （ｔ， ２Ｈ）， １．８９ （ｍ， ２Ｈ）， １．４７ （ｍ， １３Ｈ）， １．２８ （ｍ， ３５Ｈ）， ０．９ （ｍ， １８Ｈ）， ０．７ （ｍ， ２Ｈ）
Figure 2023534206000013
 ステップ２：Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（トリス（デカン－３－イルオキシ）シリル）プロパン－１－アミン（４）の合成
実施例２～２３
実施例１に記載の手順と同様の手順を使用して、以下の化合物（実施例２～２３）を調製した。
実施例２
Figure 2023534206000014
 実施例３
Figure 2023534206000015
 実施例４
Figure 2023534206000016
 実施例５
Figure 2023534206000017
 実施例６
Figure 2023534206000018
 実施例７
Figure 2023534206000019
 実施例８
Figure 2023534206000020
 実施例９
Figure 2023534206000021
 実施例１０
Figure 2023534206000022
 実施例１１
Figure 2023534206000023
 実施例１２
Figure 2023534206000024
 実施例１３
Figure 2023534206000025
 実施例１４
Figure 2023534206000026
 実施例１５
Figure 2023534206000027
 実施例１６
Figure 2023534206000028
 実施例１７
Figure 2023534206000029
 実施例１８
Figure 2023534206000030
 実施例１９
Figure 2023534206000031
 実施例２０
Figure 2023534206000032
 実施例２１
Figure 2023534206000033
 実施例２２
Figure 2023534206000034
 実施例２３
Figure 2023534206000035
実施例２４．脂質の組み合わせ
本発明の特定の実施形態では、脂質（例えば、実施例１～２３に記載のもの）のうちの少なくとも２つの組み合わせ（例えば、第１のカチオン性脂質と第２のカチオン性脂質）を使用することができる。これらの２重にクロスさせた組み合わせは下表に示され、各実施例番号が交差する部分が各実施例で示されている脂質の組み合わせを表す。これらの組み合わせの場合、第１のカチオン性脂質と第２のカチオン性脂質の比を等しくすることができ、また一方のカチオン性脂質が他方のカチオン性脂質よりも高量で存在してもよい。例えば、比が、１：１、２：１、１：２、３：１、１：３、４：１または１：４等であり得る。特定の実施形態では、製剤中のカチオン性脂質の総モルパーセントは、例えば、約４０～７５％、例えば、約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または約７５％であり得る。
Figure 2023534206000036
以下の実施例において、以下の脂質の構造は以下のとおりである。
１０１（また、ＷＯ２０２０／０９７５２０及び本明細書の実施例４を参照されたい）
Figure 2023534206000037
 １０２（また、ＷＯ２０２０／０９７５２０及び本明細書の実施例８を参照されたい）
Figure 2023534206000038
 １０３（また、ＷＯ２０１３／１２６８０３を参照されたい）
Figure 2023534206000039
実施例２５．ＰＥＧの滴定
方法：
ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ製剤：
脂質溶液には、以下の５成分が含有された：ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、２つのイオン性脂質（１０１及び１０２）、コレステロール、及びリン脂質（ＤＳＰＣ）、各モル比は、０．１：３０：３０：２４：１５ｍｏｌ％、０．２５：３０：３０：２４：１５ｍｏｌ％、０．５：３０：３０：２４：１５ｍｏｌ％、１．６：３０：３０：２４：１５ｍｏｌ％、及び３．０：２９：２９：２４：１５ｍｏｌ％。
脂質ストックを、記載されている脂質の同一性とモル比を使用して９０％エタノールで調製し、混合中、Ｎ／Ｐ（カチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ）モル比６．８を得た。ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＰＩＢ；ＩＤＴ）を、ＥＤＴＡ（ｐＨ４．５）緩衝液及びヌクレアーゼ不含水で希釈し、目標濃度である０．３０４ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡの２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ４．５）溶液を得た。等体積の脂質溶液と核酸溶液をＴ字コネクターにより４００ｍＬ／分の流量で混合し、ｐＨ７．４のＰＢＳで直接希釈した。製剤をＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析チューブ（ＭＷＣＯ １２～１４，０００）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れ、１００容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）に対して一晩透析した。透析後、試料をＶｉｖａＳｐｉｎ－６（ＭＷＣＯ １００，０００）ユニットを使用して約０．３ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで、０．２μｍシリンジフィルター（ＰＥＳ膜）に通して無菌濾過した。核酸濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイにより決定した。
Ａ５４９細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション：
Ａ５４９細胞（ヒト肺上皮性腺癌細胞）を、組織培養用処理済みフラスコＴ７５の完全培地中に５％ＣＯ２で３７℃にて維持した（１０％ウシ胎児血清、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ－グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１００ＩＵ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ）。トランスフェクション前に、組織培養用処理済み９６ウェルプレートの完全培地に細胞を５０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２で３７℃にて１６～２４時間増殖させた。トランスフェクション当日、細胞に新鮮な完全培地を添加した。試料を、三連で、ＰＢＳで２５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ及び０．０２５μｇ／ｍＬに希釈し、細胞に２．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．０２５μｇ／ｍＬ及び０．００２５μｇ／ｍＬで添加した。細胞に２４時間トランスフェクトし、その時点で培地を除去し、細胞を溶解させ、ライセートを処理して、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ２．０分析によりｍＲＮＡのレベルを決定した。
Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ２．０アッセイを使用したｍＲＮＡ分析：
Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ２．０（分岐ＤＮＡ）アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造者の推奨手順を使用して用いて細胞溶解物中のヒトのＰＰＩＢ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＰＩＢ ｍＲＮＡの相対レベルとハウスキーピングＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの相対レベルのレベル比を計算した。この値から、この値と、ＰＢＳ処理細胞のライセートで取得されたＰＰＩＢ／ＧＡＰＤＨ比とを関連付けることによって細胞中に残存するＰＰＩＢ ｍＲＮＡのパーセンテージを決定した。
結果及び結論：
本実施例の結果を下表及び図１に示す。これらの結果は、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ含有量が０．２５～１．６ｍｏｌ％の場合に最適有効性が達成されることを示している。含有量を３ｍｏｌ％に増加させても、製剤の有効性はわずかに低下するだけである。ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ含有量をさらに０．１ｍｏｌ％に減らすと、有効性の劇的な低下が観察される。
Figure 2023534206000040
実施例２６．カチオン性脂質の同一性及び滴定
方法：
ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ製剤：
脂質溶液には、以下の５成分が含有された：ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、２つのイオン性脂質（１０１及び１０２）、コレステロール、及びリン脂質（ＤＳＰＣ）、各モル比は、０．５：１５：４５：２４：１５ｍｏｌ％、０．５：３０：３０：２４：１５ｍｏｌ％、及び０．５：４５：１５：２４：１５ｍｏｌ％。
脂質ストックを、記載されている脂質の同一性とモル比を使用して９０％エタノールで調製し、混合中、Ｎ／Ｐ（カチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ）モル比６．８を得た。ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＰＩＢ；ＩＤＴ）を、ＥＤＴＡ（ｐＨ４．５）緩衝液及びヌクレアーゼ不含水で希釈し、目標濃度である０．３０４ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡの２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ４．５）溶液を得た。等体積の脂質溶液と核酸溶液をＴ字コネクターにより４００ｍＬ／分の流量で混合し、ｐＨ７．４のＰＢＳで直接希釈した。製剤をＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析チューブ（ＭＷＣＯ １２～１４，０００）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れ、１００容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）に対して一晩透析した。透析後、試料をＶｉｖａＳｐｉｎ－６（ＭＷＣＯ １００，０００）ユニットを使用して約０．３ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで、０．２μｍシリンジフィルター（ＰＥＳ膜）に通して無菌濾過した。核酸濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイにより決定した。
Ａ５４９細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション：
Ａ５４９細胞（ヒト肺上皮性腺癌細胞）を、組織培養用処理済みフラスコＴ７５の完全培地中に５％ＣＯ２で３７℃にて維持した（１０％ウシ胎児血清、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ－グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１００ＩＵ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ）。トランスフェクション前に、組織培養用処理済み９６ウェルプレートの完全培地に細胞を５０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２で３７℃にて１６～２４時間増殖させた。トランスフェクション当日、細胞に新鮮な完全培地を添加した。試料を、三連で、ＰＢＳで２５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ及び０．０２５μｇ／ｍＬに希釈し、細胞に２．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．０２５μｇ／ｍＬ及び０．００２５μｇ／ｍＬで添加した。細胞に２４時間トランスフェクトし、その時点で培地を除去し、細胞を溶解させ、ライセートを処理して、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ２．０分析によりｍＲＮＡのレベルを決定した。
Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ２．０アッセイを使用したｍＲＮＡ分析：
Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ２．０（分岐ＤＮＡ）アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造者の推奨手順を使用して用いて細胞溶解物中のヒトのＰＰＩＢ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＰＩＢ ｍＲＮＡの相対レベルとハウスキーピングＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの相対レベルのレベル比を計算した。この値から、この値と、ＰＢＳ処理細胞のライセートで取得されたＰＰＩＢ／ＧＡＰＤＨ比とを関連付けることによって細胞中に残存するＰＰＩＢ ｍＲＮＡのパーセンテージを決定した。
結果及び結論：
本実施例の結果を下表及び図２に示す。これらの結果は、１０１／１０２の比が２５：７５～５０：５０の場合に最適有効性が達成されることを示している。組み合わせにおいて１０１を７５：２５にさらに増加させた場合、有効性のほんのわずかな低下が観察される。
Figure 2023534206000041
実施例２７．カクテルカチオン性脂質の滴定
方法：
ｓｉＲＮＡ－ＬＮＰ製剤：
脂質溶液には、以下の５成分が含有された：ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、２つのイオン性脂質（１０１及び１０２）、コレステロール、及びリン脂質（ＤＳＰＣ）、各モル比は、０．５：２２．５：２２．５：３４：２１ｍｏｌ％、０．５：２５：２５：３０：１９ｍｏｌ％、０．５：３０：３０：２４：１５ｍｏｌ％、０．５：３５：３５：１８：１１ｍｏｌ％、及び０．５：４０：４０：１２：７ｍｏｌ％。
脂質ストックを、記載されている脂質の同一性とモル比を使用して９０％エタノールで調製し、混合中、Ｎ／Ｐ（カチオン性脂質／ｓｉＲＮＡ）モル比６．８を得た。ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＰＩＢ；ＩＤＴ）を、ＥＤＴＡ（ｐＨ４．５）緩衝液及びヌクレアーゼ不含水で希釈し、目標濃度である０．３０４ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡの２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ４．５）溶液を得た。等体積の脂質溶液と核酸溶液をＴ字コネクターにより４００ｍＬ／分の流量で混合し、ｐＨ７．４のＰＢＳで直接希釈した。製剤をＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析チューブ（ＭＷＣＯ １２～１４，０００）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れ、１００容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）に対して一晩透析した。透析後、試料をＶｉｖａＳｐｉｎ－６（ＭＷＣＯ １００，０００）ユニットを使用して約０．３ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで、０．２μｍシリンジフィルター（ＰＥＳ膜）に通して無菌濾過した。核酸濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイにより決定した。
Ａ５４９細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション：
Ａ５４９細胞（ヒト肺上皮性腺癌細胞）を、組織培養用処理済みフラスコＴ７５の完全培地中に５％ＣＯ２で３７℃にて維持した（１０％ウシ胎児血清、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ－グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ１００ＩＵ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ）。トランスフェクション前に、組織培養用処理済み９６ウェルプレートの完全培地に細胞を５０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２で３７℃にて１６～２４時間増殖させた。トランスフェクション当日、細胞に新鮮な完全培地を添加した。試料を、三連で、ＰＢＳで２５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ及び０．０２５μｇ／ｍＬに希釈し、細胞に２．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．０２５μｇ／ｍＬ及び０．００２５μｇ／ｍＬで添加した。細胞に２４時間トランスフェクトし、その時点で培地を除去し、細胞を溶解させ、ライセートを処理して、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ２．０分析によりｍＲＮＡのレベルを決定した。
Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ２．０アッセイを使用したｍＲＮＡ分析：
Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ２．０（分岐ＤＮＡ）アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造者の推奨手順を使用して用いて細胞溶解物中のヒトのＰＰＩＢ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＰＩＢ ｍＲＮＡの相対レベルとハウスキーピングＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの相対レベルのレベル比を計算した。この値から、この値と、ＰＢＳ処理細胞のライセートで取得されたＰＰＩＢ／ＧＡＰＤＨ比とを関連付けることによって細胞中に残存するＰＰＩＢ ｍＲＮＡのパーセンテージを決定した。
結果及び結論：
本実施例の結果を下表及び図３に示す。これらの結果は、１０１／１０２（５０：５０）含有量が６０～８０ｍｏｌ％の場合に最適有効性が達成されることを示している。含有量を４５ｍｏｌ％及び５０ｍｏｌ％に減らすと、製剤の有効性が低下し、５０ｍｏｌ％の場合、４５ｍｏｌ％製剤よりもわずかに有効である。
Figure 2023534206000042
実施例２８．ＰＥＧ滴定
使用された様々な量のＰＥＧに関するデータを示す下表及び図４に示されるように、ＰＥＧ濃度を変えるとルシフェラーゼ発現が影響される。
方法：
ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤：
脂質溶液には、以下の４成分が含有された：ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、イオン性脂質（１０１）、コレステロール、及びリン脂質（ＤＳＰＣ）、各モル比は、０．２５：６０：２４：１５ｍｏｌ％、０．５：６０：２４：１５ｍｏｌ％、１．６：５９：２４：１５ｍｏｌ％、及び３．０：５９：２４：１５ｍｏｌ％。
脂質ストックを、記載されている脂質の同一性とモル比を使用してエタノールで調製し、混合中、Ｎ／Ｐ（カチオン性脂質／ｍＲＮＡ）モル比６．８を得た。ｍＲＮＡ（ホタルルシフェラーゼ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ－７２０２）を、酢酸塩（ｐＨ５）緩衝液及びヌクレアーゼ不含水で希釈し、目標濃度である０．３６６ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡの１００ｍＭ酢酸塩溶液（ｐＨ５）を得た。等体積の脂質溶液と核酸溶液をＴ字コネクターにより４００ｍＬ／分の流量で混合し、ｐＨ７．４のＰＢＳで直接希釈した。製剤を、３ｍＬ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（ＭＷＣＯ １０，０００）透析ユニット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に入れ、１００容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）に対して一晩透析した。透析後、試料をＶｉｖａＳｐｉｎ－６（ＭＷＣＯ １００，０００）ユニットを使用して約０．３ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで、０．２μｍシリンジフィルター（ＰＥＳ膜）に通して無菌濾過した。核酸濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイにより決定した。
ｍＲＮＡ－ＬＮＰ ＩＴ投与：
投与当日、ＬＮＰ製剤をＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、その溶液を、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ装置を使用して（製造者の推奨手順を使用して）麻酔したＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝４）の気管に５０μＬ（５μｇ）にて投与した。投与後６時間目に、動物を致死量のケタミン／キシラジンで安楽死させ、肺を切除して約１００ｍｇの切片に切断した。これらを、ＦａｓｔＰｒｅｐチューブに入れ、液体Ｎ２で急速冷凍し、ルシフェラーゼアッセイ分析まで－８０℃で保存した。
ルシフェラーゼアッセイ分析：
肺の約１００ｍｇのアリコートをＦａｓｔ Ｐｒｅｐホモジナイザーを使用して１ｍＬの１×ＣＣＬＲ（細胞培養溶解試薬）にホモジナイズし、その際、４．５ｍ／ｓの速度で１５秒サイクルを２回行った。その後、ホモジネートを４℃で１０分間、１６，０００ＲＰＭの遠心分離にかけた。２０ｕＬの上清を９６ウェル白色プレートにロードし、ＢｉｏＴｅｋプレートルミノメーターを使用してルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍより）をプレートのウェルに注入した後、発光を測定した。ホモジナイズした試料の発光とルシフェラーゼタンパク質標準（標準曲線はこれについて生成されている）の発光との比較によってルシフェラーゼ活性を決定した。肺ホモジネートでの成分による発光の消光を考慮するため、既知量のルシフェラーゼを未処置動物の肺ホモジネートに加え、得られた発光を測定した。得られた消光因子を全試料に適用して、補正ルシフェラーゼ活性を取得し、次いで、それを、分析される組織の質量について正規化した。
結果及び結論：
本実施例の結果を下表及び図４に示す。これらの結果は、製剤中のＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡが０．２５～０．５ｍｏｌ％の場合に、エアロゾル投与後の肺での最適有効性が達成されることを示している。製剤中のＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡをさらに１．６ｍｏｌ％及び３ｍｏｌ％まで増加させた場合、有効性は劇的に低下する。
Figure 2023534206000043
実施例２９：脂質クリアランス
肺からの脂質クリアランスに関するデータを示す下表及び図５に示されるように、ケイ素脂質（１０１及び１０２；左の棒）は、既存のカチオン性脂質１０３（右の棒）と比較して生物分解性である。
方法
ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤：
０．５：６０（１０１／１０２）の脂質溶液には、以下の５成分が含有された：ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、２つのイオン性脂質（１０１及び１０２）、コレステロール、及びリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）。成分のモル比は、０．５：３０：３０：２４：１５ｍｏｌ％であった。０．５：６０ １０３の脂質溶液には、以下の４成分が含有された：ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、イオン性脂質（１０３）、コレステロール、及びリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）。成分のモル比は、０．５：６０：２４：１５ｍｏｌ％であった。
脂質ストックを、記載されている脂質の同一性とモル比を使用してエタノールで調製し、混合中、Ｎ／Ｐ（カチオン性脂質／ｍＲＮＡ）モル比６．８を得た。ｍＲＮＡ（ホタルルシフェラーゼ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ－７２０２）を、酢酸塩（ｐＨ５）緩衝液及びヌクレアーゼ不含水で希釈し、目標濃度である０．３６６ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡの１００ｍＭ酢酸塩溶液（ｐＨ５）を得た。等体積の脂質溶液と核酸溶液をＴ字コネクターにより４００ｍＬ／分の流量で混合し、ｐＨ７．４のＰＢＳで直接希釈した。製剤を接線流限外濾過（ＭＷＣＯ ５００，０００）にかけ、最終保存用バッファーに約３ｍｇ／ｍＬに濃縮し、次いで、０．２μｍシリンジフィルター（ＰＥＳ膜）に通して無菌濾過した。核酸濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイにより決定した。最終製剤を無菌マイクロチューブに分注し、使用まで－２０℃で保存した。
ｍＲＮＡ－ＬＮＰ噴霧化：
投与当日、ＬＮＰ製剤をＰＢＳで１．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、これらの溶液の１．２５ｍＬ（１．５ｍｇ用量）を、カーボンフィルターが備え付けられた寸法９’’×４’’×５’’（長×幅×高）のマウスチャンバーに取り付けられたハウジング内に置かれる、Ａｅｒｏｇｅｎ Ｓｏｌｏネブライザーユニットに入れる。６匹のＢａｌｂ／Ｃマウスは、チャンバー内で一度に投与される。１．５Ｌ／分の気流をネブライザーハウジングユニットに強制的に通し、ネブライザーの電源を入れた。噴霧時、ＬＮＰの一部はネブライザーから凝結し、これを回収し、ネブライザーに戻し入れた。これを、凝結物が回収されなくなるまで継続した。噴霧が乾燥した際、ＬＮＰ蒸気が消散するまでさらに１～２分間マウスをチャンバー内に置いた。ＬＮＰの完全な噴霧化には典型的には約１５分を要した。０．２５時間（噴霧直後）、１時間、６時間及び２４時間の各時点で、製剤あたり３匹の動物を致死量のケタミン／キシラジンで安楽死させ、肺を切除して約１００ｍｇの切片に切断した。これらを、ＦａｓｔＰｒｅｐチューブに入れ、液体Ｎ２で急速冷凍し、ＬＣ－ＭＳ分析まで－８０℃で保存した。
ＬＣ－ＭＳ分析：
肺切片に５容量のＰＢＳを加えた（例えば、５０ｍｇの肺には２５０μＬのＰＢＳ加える）。その後、これらを、ＦａｓｔＰｒｅｐ装置を使用して、５．０ｍ／ｓの速度で１５秒サイクルを３回行ってホモジナイズし、低速で遠心分離にかけた。ＰＢＳを投与されたマウスの肺ホモジネートを使用して、各カチオン性脂質（１０３、１０１及び１０２）について添加済み肺ホモジネート標準を調製した。各カチオン性脂質につき、１０の標準を調製し、その際、１２，５００ｎｇ／ｍＬの最高濃度標準を２４．４ｎｇ／ｍＬまで１／２で段階希釈した。２０μＬのホモジネート（試料及び標準）を、９６ウェルプレートの２２５μＬのＩＳＳ（１００ｎｇ／ｍＬの１－Ｂ１１内部標準含有ＩＰＡ）に加えた。ピペットを上下に操作してプレートを混合し、２５００ｒｐｍで１５分間、遠心分離にかけた。これらの抽出物からの上清をＬＣ－ＭＳで分析した。各試料について取得されたシグナルと、各カチオン性脂質（１０３、１０１及び１０２）の適切な標準曲線とを比較することにより、各ホモジネート中のカチオン性脂質のｎｇ／ｍＬを決定した。その後、これらの値を、分析した肺組織の計算精密質量に合わせて正規化した。非生物分解性カチオン性脂質の場合、得られた平均（ｎ＝３）ｎｇ（１０３）／ｇ（肺）の値をそれ以上操作せずにプロットした。加水分解性カチオン性脂質の場合、１０１及び１０２の両方の各時点でのｎｇ／ｇ肺の値を統合して、平均（ｎ＝３）ｎｇ（カチオン性脂質）／ｇ（肺）の値を得た。
結果及び結論：
本実施例の結果を下表及び図５に示す。これらの結果は、本実施例で使用された２つのケイ素脂質（１０１及び１０２）が生物分解性であり、投与後６時間までに脂質の約５０％が肺から消失し、２４時間までには脂質がほぼ完全に加水分解されることを示している。一方、既存の脂質１０３は、本実施例では２４時間ほぼ完全に肺に留まった。
Figure 2023534206000044
実施例３０．カチオン性脂質の同一性及び滴定
カチオン性脂質及び使用したそれらの比に関するデータを示す下表及び図６に示されるように、脂質及び比を変えるとルシフェラーゼ発現が影響される。
方法：
ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤：
脂質溶液は、４成分または５成分を含有した。２つの４成分系は、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、イオン性脂質（１０１または１０２）、コレステロール、及びリン脂質（ＤＳＰＣ）を０．５：６０：２４：１５ｍｏｌ％のモル比で含有する。３つの５成分系は、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、２つのイオン性脂質（１０１及び１０２）、コレステロール、及びリン脂質（ＤＳＰＣ）を、０．５：１５：４５：２４：１５ｍｏｌ％、０．５：３０：３０：２４：１５ｍｏｌ％、及び０．５：４５：１５：２４：１５ｍｏｌ％のモル比で含有する。
脂質ストックを、記載されている脂質の同一性とモル比を使用してエタノールで調製し、混合中、Ｎ／Ｐ（カチオン性脂質／ｍＲＮＡ）モル比６．８を得た。ｍＲＮＡ（ホタルルシフェラーゼ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ－７２０２）を、酢酸塩（ｐＨ５）緩衝液及びヌクレアーゼ不含水で希釈し、目標濃度である０．３６６ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡの１００ｍＭ酢酸塩溶液（ｐＨ５）を得た。等体積の脂質溶液と核酸溶液をＴ字コネクターにより４００ｍＬ／分の流量で混合し、ｐＨ７．４のＰＢＳで直接希釈した。製剤を、３ｍＬ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（ＭＷＣＯ １０，０００）透析ユニット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に入れ、１００容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）に対して一晩透析した。透析後、試料をＶｉｖａＳｐｉｎ－６（ＭＷＣＯ １００，０００）ユニットを使用して約０．３ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで、０．２μｍシリンジフィルター（ＰＥＳ膜）に通して無菌濾過した。核酸濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイにより決定した。
ｍＲＮＡ－ＬＮＰ ＩＴ投与：
投与当日、ＬＮＰ製剤をＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、その溶液を、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ装置を使用して（製造者の推奨手順を使用して）麻酔したＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝４）の気管に５０μＬ（５μｇ）にて投与した。投与後６時間目に、動物を致死量のケタミン／キシラジンで安楽死させ、肺を切除して約１００ｍｇの切片に切断した。これらを、ＦａｓｔＰｒｅｐチューブに入れ、液体Ｎ２で急速冷凍し、ルシフェラーゼアッセイ分析まで－８０℃で保存した。
ルシフェラーゼアッセイ分析：
肺の約１００ｍｇのアリコートをＦａｓｔ Ｐｒｅｐホモジナイザーを使用して１ｍＬの１×ＣＣＬＲ（細胞培養溶解試薬）にホモジナイズし、その際、４．５ｍ／ｓの速度で１５秒サイクルを２回行った。その後、ホモジネートを４℃で１０分間、１６，０００ＲＰＭの遠心分離にかけた。２０ｕＬの上清を９６ウェル白色プレートにロードし、ＢｉｏＴｅｋプレートルミノメーターを使用してルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍより）をプレートのウェルに注入した後、発光を測定した。ホモジナイズした試料の発光とルシフェラーゼタンパク質標準（標準曲線はこれについて生成されている）の発光との比較によってルシフェラーゼ活性を決定した。肺ホモジネートでの成分による発光の消光を考慮するため、既知量のルシフェラーゼを未処置動物の肺ホモジネートに加え、得られた発光を測定した。得られた消光因子を全試料に適用して、補正ルシフェラーゼ活性を取得し、次いで、それを、分析される組織の質量について正規化した。
結果及び結論：
本実施例の結果を下表及び図６に示す。これらの結果は、２つのケイ素脂質（１０１及び１０２）の比が５０：５０の場合にエアロゾル投与後の肺での最適有効性が達成されること、及び比を２５：７５及び７５：２５に変化させた場合、有効性はほんのわずか低下することを示している。これらの２つの脂質が製剤中に単独で存在している場合、有効性の２～３倍の低下が観察された。
Figure 2023534206000045
実施例３１．カクテルカチオン性脂質の滴定
ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤：
脂質溶液は、以下の５成分を含有する：ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、２つのイオン性脂質（１０１及び１０２）、コレステロール、及びリン脂質（ＤＳＰＣ）、各モル比は、０．５：２５：２５：３０：１９ｍｏｌ％、０．５：３０：３０：２４：１５ｍｏｌ％、０．５：３５：３５：１８：１１ｍｏｌ％、及び０．５：４０：４０：１２：７ｍｏｌ％。
脂質ストックを、記載されている脂質の同一性とモル比を使用してエタノールで調製し、混合中、Ｎ／Ｐ（カチオン性脂質／ｍＲＮＡ）モル比５．７、６．８、７．９、及び９．０をそれぞれ得た。ｍＲＮＡ（ホタルルシフェラーゼ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ－７２０２）を、酢酸塩（ｐＨ５）緩衝液及びヌクレアーゼ不含水で希釈し、目標濃度である０．３６６ｍｇ／ｍＬのｍＲＮＡの１００ｍＭ酢酸塩溶液（ｐＨ５）を得た。等体積の脂質溶液と核酸溶液をＴ字コネクターにより４００ｍＬ／分の流量で混合し、ｐＨ７．４のＰＢＳで直接希釈した。製剤を、３ｍＬ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（ＭＷＣＯ １０，０００）透析ユニット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に入れ、１００容量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）に対して一晩透析した。透析後、試料をＶｉｖａＳｐｉｎ－６（ＭＷＣＯ １００，０００）ユニットを使用して約０．３ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで、０．２μｍシリンジフィルター（ＰＥＳ膜）に通して無菌濾過した。核酸濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイにより決定した。
ｍＲＮＡ－ＬＮＰ ＩＴ投与：
投与当日、ＬＮＰ製剤をＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、その溶液を、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ装置を使用して（製造者の推奨手順を使用して）麻酔したＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝４）の気管に５０μＬ（５μｇ）にて投与した。投与後６時間目に、動物を致死量のケタミン／キシラジンで安楽死させ、肺を切除して約１００ｍｇの切片に切断した。組織試料を液体Ｎ２で瞬間凍結し、－８０℃で保存した。
ルシフェラーゼアッセイ分析：
肺の約１００ｍｇのアリコートをＦａｓｔ Ｐｒｅｐホモジナイザーを使用して１ｍＬの１×ＣＣＬＲ（細胞培養溶解試薬）にホモジナイズし、その際、４．５ｍ／ｓの速度で１５秒サイクルを２回行った。その後、ホモジネートを４℃で１０分間、１６，０００ＲＰＭの遠心分離にかけた。２０ｕＬの上清を９６ウェル白色プレートにロードし、ＢｉｏＴｅｋプレートルミノメーターを使用してルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍより）をプレートのウェルに注入した後、発光を測定した。ホモジナイズした試料の発光とルシフェラーゼタンパク質標準（標準曲線はこれについて生成されている）の発光との比較によってルシフェラーゼ活性を決定した。肺ホモジネートでの成分による発光の消光を考慮するため、既知量のルシフェラーゼを未処置動物の肺ホモジネートに加え、得られた発光を測定した。得られた消光因子を全試料に適用して、補正ルシフェラーゼ活性を取得し、次いで、それを、分析される組織の質量について正規化した。
結果及び結論：
本実施例の結果を下表及び図７に示す。肺での最適有効性は０．５：６０（１０１／１０２）の製剤で達成された。試験した他の製剤でも著しい標的タンパク質発現が得られた。
Figure 2023534206000046

Claims (33)

  1. 核酸－脂質粒子を含む製剤であって、核酸－脂質粒子が、
    １つ以上の核酸分子と、
    約０．１％～約０．９％のＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、
    約４０％～約８０％のカチオン性脂質と、
    非カチオン性脂質と、を含み、
    エアロゾル化された製剤である、前記製剤。
  2. 前記核酸－脂質粒子が、約０．２％～約０．８％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約４５％～約７５％のカチオン性脂質を含む、請求項１に記載の製剤。
  3. 前記核酸－脂質粒子が、約０．２％～約０．７％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約４５％～約７５％のカチオン性脂質を含む、請求項２に記載の製剤。
  4. 前記核酸－脂質粒子が、約０．２％～約０．６％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約５０％～約７０％のカチオン性脂質を含む、請求項３に記載の製剤。
  5. 前記核酸－脂質粒子が、約０．２％～約０．５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約５５％～約６５％のカチオン性脂質を含む、請求項４に記載の製剤。
  6. 前記核酸－脂質粒子が、約０．２％～約０．５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約６０％のカチオン性脂質を含む、請求項５に記載の製剤。
  7. 前記核酸－脂質粒子が、約０．２５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約６０％のカチオン性脂質を含む、請求項６に記載の製剤。
  8. 前記核酸－脂質粒子が、
    ０．２５％の前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、
    ３０％の第１のカチオン性脂質と、
    前記第１のカチオン性脂質と同じ場合も異なる場合もある、３０％の第２のカチオン性脂質と、
    ２２％～２６％のコレステロールと、
    １３％～１７％のＤＳＰＣと、
    を含む、請求項７に記載の製剤。
  9. 前記核酸－脂質粒子が、約０．５％のＰＥＧ－脂質コンジュゲート及び約６０％のカチオン性脂質を含む、請求項６に記載の製剤。
  10. 前記核酸－脂質粒子が、
    ０．５％の前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートと、
    ３０％の第１のカチオン性脂質と、
    前記第１のカチオン性脂質と同じ場合も異なる場合もある、３０％の第２のカチオン性脂質と、
    ２２％～２６％のコレステロールと、
    １３％～１７％のＤＳＰＣと、
    を含む、請求項９に記載の製剤。
  11. 式（Ｉ）
    Figure 2023534206000047
     ［式中、
    Ｒ１は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
    Ｒ２は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
    Ｒ３は、Ｃ２－Ｃ３０ヒドロカルビルであり、
    Ｘは、二価のＣ２－Ｃ８アルキルであり、
    Ｒ４は、ＮＲａＲｂであり、かつ
    Ｒａ及びＲｂはそれぞれ、独立して、メチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルからなる群から選択され、そのメチル、エチル、プロピル、シクロプロピル、及びブチルは、任意選択でヒドロキシで置換されるか、またはＲａとＲｂが、それらが結合している窒素と一緒になってアジリジン環、アゼチジン環、プロリン環、ピペリジン環、ピペラジン環、もしくはモルホリン環を形成し、その環は、ヒドロキシル、もしくは任意選択でヒドロキシで置換されるＣ１－Ｃ６アルキルで任意選択で置換される］
    の少なくとも１つのカチオン性脂質または第１と第２のカチオン性脂質の組み合わせを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の製剤。
  12. 前記カチオン性脂質（複数可）が、独立して、実施例１～２３のいずれか１つに記載のようなカチオン性脂質から選択される、請求項１１に記載の製剤。
  13. 前記カチオン性脂質の組み合わせが、実施例２４に記載のような組み合わせを含む、請求項１１または１２に記載の製剤。
  14. 前記核酸－脂質粒子が、
    ０．２５％の前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡと、
    ３０％の前記カチオン性脂質化合物１０１と、
    ３０％の前記カチオン性脂質化合物１０２と、
    ２２％～２６％のコレステロールと、
    １３％～１７％のＤＳＰＣと、
    を含む、請求項１１に記載の製剤。
  15. 前記核酸－脂質粒子が、
    ０．２５％の前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡと、
    ３０％の前記カチオン性脂質化合物１０１と、
    ３０％の前記カチオン性脂質化合物１０２と、
    ２４．２％のコレステロールと、
    １５．２％のＤＳＰＣと、
    を含む、請求項１４に記載の製剤。
  16. 前記核酸－脂質粒子が、
    ０．５％の前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡと、
    ３０％の前記カチオン性脂質化合物１０１と、
    ３０％の前記カチオン性脂質化合物１０２と、
    ２２％～２６％のコレステロールと、
    １３％～１７％のＤＳＰＣと、
    を含む、請求項１１に記載の製剤。
  17. 前記核酸－脂質粒子が、
    ０．５％の前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡと、
    ３０％の前記カチオン性脂質化合物１０１と、
    ３０％の前記カチオン性脂質化合物１０２と、
    ２４．２％のコレステロールと、
    １５．２％のＤＳＰＣと、
    を含む、請求項１６に記載の製剤。
  18. 前記核酸が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、自己増幅ＲＮＡ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の製剤。
  19. 前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１８に記載の製剤。
  20. 前記核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１８に記載の製剤。
  21. 前記非カチオン性脂質が、コレステロールまたはその誘導体である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の製剤。
  22. 前記複合脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の製剤。
  23. 前記複合脂質がＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡである、請求項２２に記載の製剤。
  24. 前記ＰＥＧが、約２，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項２２または２３に記載の製剤。
  25. 前記脂質と薬物の比が約１２：１～約２０：１である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の製剤。
  26. 前記脂質と薬物の比が約２０：１である、請求項２５に記載の製剤。
  27. 細胞に核酸を導入するための方法であって、前記細胞を、請求項１～２６のいずれか一項に記載の製剤と接触させることを含む、前記方法。
  28. 核酸のｉｎ ｖｉｖｏ送達のための方法であって、哺乳類対象に請求項１～２６のいずれか一項に記載の製剤を投与することを含む、前記方法。
  29. 疾患または障害を治療することを必要とする哺乳類対象においてそれを行うための方法であって、前記哺乳類対象に、治療有効量の請求項１～２６のいずれか一項に記載の製剤を投与することを含む、前記方法。
  30. 前記製剤が、吸入により投与されるネブライザー用製剤である、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 前記投与が、鼻腔内または気管内である、請求項２８または２９に記載の方法。
  32. 前記疾患または障害が、肺の疾患または障害である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 哺乳類の肺に核酸分子を送達するための、請求項１～２６のいずれか一項に記載の製剤。
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