JP2023532732A - 同種移植片血管障害、モヤモヤ病、モヤモヤ症候群、及び内膜増殖を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

同種移植片血管障害、モヤモヤ病、モヤモヤ症候群、及び内膜増殖を治療するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）剤又はエクトヌクレオチドピロホスファターゼホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）を投与することによって、対象における同種移植片血管障害を治療するための、モヤモヤ病（ＭＭＤ）及びモヤモヤ症候群（ＭＭＳ）を治療するための、望ましくない内膜増殖を治療、阻害、又は予防するための組成物及び方法を提供する。

Description

相互参照
本出願は、以下の仮出願、２０２０年７月２日に出願された米国特許出願第６３／０４７，７９３号、２０２０年７月２日に出願された米国特許出願第６３／０４７，８７７号、２０２０年７月２日に出願された米国特許出願第６３／０４７，８６５号、及び２０２０年７月２日に出願された米国特許出願第６３／０４７，８４８号に対する優先権を主張するものであり、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、血管疾患を治療するための組成物及び方法に関する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年７月２日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、４４２７－１０５０２＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、３４３．９７６バイトのサイズである。
心筋増殖又は心筋過形成は、血管壁の平滑筋細胞の異常な増殖によって特徴付けられる血管系の複雑な病理学的プロセスである。増殖する平滑筋細胞は、内皮下領域に移動し、血管内腔の狭窄及び閉塞を引き起こし得る過形成病変を形成する。
心臓同種移植片血管障害（ＣＡＶ）は、移植片の筋血管に影響を及ぼす加速性線維増殖性障害であり、心臓移植後の罹患率及び死亡率の主要原因である。ＣＡＶは、免疫学的損傷及び内皮の浸潤によって媒介され、血管平滑筋細胞の増殖及びその後の内腔の狭小化をもたらすと考えられる。ＣＡＶの症状には、しばしば免疫介在性血管損傷によって促進される、心外膜動脈及び心筋内動脈の両方における動脈内膜の進行性肥厚が含まれる。ＣＡＶは、移植後３年までの全ての心臓移植レシピエントの少なくとも約３分の１（重症度は異なる）で生じる。ＣＡＶはしばしば、血管平滑筋細胞増殖、炎症性免疫細胞の蓄積、及び脂質沈着によって特徴付けられる。ＣＡＶは、緩徐進行性疾患であるが、急性移植不全、不整脈、梗塞、又は心臓死などの合併症は、移植片除神経による古典的症状（例えば、狭心）なしにしばしば現れる可能性がある。
類似の血管障害は、他の固形臓器同種移植片で生じ、その長期生存を著しく制限する可能性がある。そのような血管障害は、治療が困難であり、同種移植片のほぼ全ての血管に影響を及ぼす可能性があるため、同種移植片レシピエントの有意な罹患率及び死亡率に関連し、反復移植を必要とする場合がある。したがって、心臓同種移植片などの固形臓器同種移植片におけるそのような血管障害の程度を予防又は低減し得る効果的な療法が、緊急に必要とされる。
モヤモヤは、１９５７年に日本で初めて報告された閉塞性脳血管障害であり、脳の基底部における異常な血管網の形成を伴う、内頸動脈（ＩＣＡ）の床突起上部の狭窄によって特徴付けられる。モヤモヤは、頭蓋内内頸動脈に影響を及ぼす２つの異なる状態を説明するために使用される一般的な用語であり、モヤモヤ病（ＭＭＤ）は、東アジア人及び日本の小児及び成人の間でより顕著である両側性動脈症を引き起こす先天性疾患であり、モヤモヤ症候群（ＭＭＳ）は、特発性であり、典型的には、２０～４０歳の範囲の白人の成人の間で見られる。ＭＭＳには既知の遺伝的要素はないが、ＭＭＤにはあるため、しばしば糖尿病、ループス、又は関節リウマチなどの自己免疫性障害に関連する。ＭＭＤ及びＭＭＳの両方の治療選択肢は、毎日のアスピリン使用、脳灌流を最大化するためのライフスタイル改善、及び血流を回復させるための外科的な直接又は間接バイパスを伴ってきた。主に男性（１５～３０％）よりも女性（７０～８５％）に影響を及ぼし、モヤモヤは、複数の民族に及ぶが、東アジア人及び白人において最も広まっている。モヤモヤ病（ＭＭＤ）は、東アジア人集団の間で顕著であり、家族系統を有する小児及び成人の両方において見られる。モヤモヤ症候群（ＭＭＳ）は、２０代／３０代の白人の間で顕著であり、特発性であり、通常、併存症（自己免疫疾患）を呈する。臨床文献はしばしば、ＭＭＤとＭＭＳとを区別しない。
長期血液透析は、腎機能不良を患っている患者にとって一般的な治療である。そのような患者はしばしば、人工動静脈瘻（ＡＶＦ）が通常、患者の非利き腕に作製される外科手術を受ける。ＡＶＦは、血液透析プロセスの持続的な血管アクセスポイントを提供する。ＡＶＦの一般的な合併症は、ＡＶＦの位置又はその近傍におけるＡＶＦ又は血管の閉塞である。そのような閉塞は、例えば、血栓及び内膜過形成を伴う可能性があり、治療しないまま放置した場合、罹患した四肢の永久的な神経損傷又は麻痺をもたらす可能性がある（例えば、Ａｓｉｆ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｌｉｎ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．１：３３２－３３９、Ｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６２：２０７９－９０、及びＳｔｏｌｉｃ（２０１３）Ｍｅｄ Ｐｒｉｃ Ｐｒａｃｔ．２２（３）：２２０－２２８を参照されたい）。
発明の概要
一態様では、本開示は、同種移植片を有する対象における同種移植片血管障害を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植片血管障害を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示は、対象におけるモヤモヤ病に関連する１つ以上の症状を予防又は改善するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって対象におけるモヤモヤ病に関連する１つ以上の症状を予防又は改善するのに十分な量で、対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、モヤモヤ病の治療として外科的介入を受ける予定であるか、又は受けたことがある対象における、脳血管閉塞を阻害又は予防するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって対象における脳血管閉塞を阻害又は予防するのに十分な量で、対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、モヤモヤ病の治療として外科的介入を受ける予定であるか、又は受けたことがある対象における、望ましくない血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって対象における望ましくない血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するのに十分な量で、対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示はまた、対象におけるステージＩ鈴木グレードのＭＭＤからステージＩＩ鈴木グレードのＭＭＤへの進行を阻害するか、又は遅延させるための方法を含み、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象におけるステージＩのＭＭＤからステージＩＩのＭＭＤへの進行を阻害する、及び／又は遅延させることを含む。
別の態様では、本開示はまた、対象におけるステージＩ鈴木グレードのＭＭＤからステージＩＩＩ鈴木グレードのＭＭＤへの進行を阻害するか、又は遅延させるための方法を含み、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象におけるステージＩのＭＭＤからステージＩＩＩのＭＭＤへの進行を阻害する、及び／又は遅延させることを含む。
更に別の態様では、本開示は、モヤモヤ病を発症するリスクがある対象における脳血管閉塞を阻害又は予防するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって対象における脳血管閉塞を阻害又は予防するのに十分な量で、対象に投与することを含む。
更に別の態様では、本開示は、モヤモヤ病を発症するリスクがある対象における望ましくない血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって対象における望ましくない血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するのに十分な量で、対象に投与することを含む。
更に別の態様では、本開示はまた、モヤモヤ病を発症するリスクがある対象を治療するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって対象を治療するのに十分な量で、対象に投与することを含む。
更に別の態様では、本開示は、モヤモヤ病に罹患した対象における脳血管閉塞を阻害又は予防するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって対象における脳血管閉塞を阻害又は予防するのに十分な量で、対象に投与することを含む。本開示は、モヤモヤ病に罹患した対象における望ましくない血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって対象における望ましくない脳血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するのに十分な量で、対象に投与することを含む。
更に別の態様では、本開示は、モヤモヤ病に罹患した対象を治療するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって対象を治療するのに十分な量で、対象に投与することを含む。
更に別の態様では、本開示は、モヤモヤ病を有する対象を治療するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を投与して、それによって当該対象における当該モヤモヤ病を治療することを含む。
更に別の態様では、本開示は、モヤモヤ症候群を有する対象を治療するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を投与して、それによって当該対象における当該モヤモヤ症候群を治療することを含む。
更に別の態様では、本開示は、対象の大脳動脈における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法を含み、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象の当該大脳動脈における当該血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、ステージＩ、ステージＩＩ、又はステージＩＩＩ、グレードＩＶ鈴木グレードのＭＭＤを有する。
更に別の態様では、本開示はまた、対象におけるステージＩ鈴木グレードのＭＭＤからステージＩＩ鈴木グレードのＭＭＤへの進行を阻害するか、又は遅延させるための方法を含み、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象におけるステージＩのＭＭＤからステージＩＩのＭＭＤへの進行を阻害する、及び／又は遅延させることを含む。
別の態様では、本開示は、モヤモヤ病を有する対象を治療するための方法を特徴とし、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における当該末梢動脈疾患を治療する方法を含む。
別の態様では、本開示は、モヤモヤ症候群を有する対象を治療するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を投与して、それによって当該対象における当該モヤモヤ症候群を治療することを含む。
更に別の態様では、本開示は、モヤモヤ病を有する対象の大脳動脈における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法を特徴とし、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象の当該大脳動脈における当該血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
本開示はまた、脳動脈の手術を受ける対象の当該大脳動脈における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における当該大脳動脈の手術部位での当該大脳動脈における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
本開示はまた、脳動脈の手術を受ける対象の当該大脳動脈における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における当該大脳動脈の手術部位での当該大脳動脈における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示は、モヤモヤ病を有する対象を治療するための方法を特徴とし、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における当該末梢動脈疾患を治療する方法を含む。別の態様では、本開示は、モヤモヤ症候群を有する対象を治療するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を投与して、それによって当該対象における当該モヤモヤ症候群を治療することを含む。更に別の態様では、本開示は、モヤモヤ病を有する対象の大脳動脈における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法を特徴とし、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象の当該大脳動脈における当該血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示はまた、動静脈透析シャントが留置されている部位又はその周囲において対象の末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって動静脈透析シャントが留置されている部位又はその周囲において当該末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
一態様では、本開示は、末梢血管の手術を受ける対象の当該末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法を提供し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における当該末梢血管の手術部位での当該末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含み、手術は、動静脈透析シャントの留置を含む。
別の態様では、本開示は、末梢血管の手術を必要とする対象の当該末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、手術は、動静脈透析シャントの留置を含み、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における当該末梢血管の手術部位での当該末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示はまた、末梢血管内のシャント留置を受ける対象の末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法を含み、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示は、末梢血管内のシャント留置を受ける対象の末梢血管における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防するための方法を特徴とし、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって末梢血管における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防することを含む、方法を特徴とする。
別の態様では、本開示は、対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、血管は、動脈である。いくつかの実施形態では、血管は、静脈である。
別の態様では、本開示は、対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、血管は、動脈である。いくつかの実施形態では、血管は、静脈である。
別の態様では、本開示は、対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、血管は、動脈である。いくつかの実施形態では、血管は、静脈である。いくつかの実施形態では、対象は、補体阻害剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けている。いくつかの実施形態では、方法は、補体阻害剤を対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、対象における同種移植された血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植された血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、血管は、動脈である。いくつかの実施形態では、血管は、静脈である。
別の態様では、本開示は、同種移植片を有する対象における同種移植片血管障害（例えば、心臓同種移植片血管障害）を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植片血管障害を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示は、対象における同種移植された血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植された血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、血管は、動脈である。いくつかの実施形態では、血管は、静脈である。
更に別の態様では、本開示は、同種移植片を有し、補体阻害剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けている対象における同種移植片血管障害（例えば、心臓同種移植片血管障害）を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植片血管障害を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、補体阻害剤を対象に投与することを更に含む。
別の態様では、本開示は、同種移植片を有し、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けている対象における同種移植片血管障害（例えば、心臓同種移植片血管障害）を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量の補体阻害剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植片血管障害を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与することを更に含む。
別の態様では、本開示は、同種移植片を有する対象の当該同種移植片の血管系における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって当該対象の当該同種移植片の当該血管系における当該血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示は、同種移植片を有する対象の当該同種移植片の血管系における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、対象は、補体阻害剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けており、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象の当該同種移植片の当該血管系における当該血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、補体阻害剤を対象に投与することを更に含む。
別の態様では、本開示は、同種移植片を有する対象の当該同種移植片の血管系における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、対象は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けており、方法は、有効量の補体阻害剤を対象に投与して、それによって当該対象の当該同種移植片の当該血管系における当該血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与することを更に含む。
更に別の態様では、本開示はまた、固形臓器移植を有し、当該臓器移植の手術を受ける対象における固形臓器移植における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって当該対象の当該固形臓器移植における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
更に別の態様では、本開示はまた、同種移植された血管を有する対象における当該同種移植された血管の不全を遅延させるか、若しくは予防するための、又はそれに対する予防法のための方法を特徴とし、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって対象における同種移植された血管の不全を遅延させるか、予防するか、又はそれに対する予防法を提供することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、補体阻害剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けている。いくつかの実施形態では、方法は、補体阻害剤を対象に投与することを含む。
更に別の態様では、本開示はまた、同種移植された血管を有する対象における当該同種移植された血管の不全を遅延させるか、若しくは予防するための、又はそれに対する予防法のための方法を特徴とし、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって対象における同種移植された血管の不全を遅延させるか、予防するか、又はそれに対する予防法を提供することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、補体阻害剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けている。いくつかの実施形態では、方法は、補体阻害剤を対象に投与することを含む。
更に別の態様では、本開示はまた、固形臓器同種移植片を有する対象における当該固形臓器同種移植片不全を遅延させるための方法を特徴とし、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって対象における固形臓器同種移植片不全を遅延させることを含む。いくつかの実施形態では、同種移植片不全は、少なくとも２か月間（例えば、少なくとも６か月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも５年間、少なくとも７年間、少なくとも１０年間、又は更に１０年間を超えて）遅延し得る。
更に別の態様では、本開示はまた、同種移植された血管片を有する対象における当該同種移植された血管の不全を遅延させるための方法を特徴とし、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって対象における同種移植された血管の不全を遅延させることを含む。いくつかの実施形態では、同種移植片不全は、少なくとも２か月間（例えば、少なくとも６か月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも５年間、少なくとも７年間、少なくとも１０年間、又は更に１０年間を超えて）遅延し得る。
更に別の態様では、本開示はまた、固形臓器同種移植片を有する対象における当該固形臓器同種移植片不全を遅延させるための方法を特徴とし、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって対象における固形臓器同種移植片不全を遅延させることを含む。いくつかの実施形態では、同種移植片不全は、少なくとも２か月間（例えば、少なくとも６か月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも５年間、少なくとも７年間、少なくとも１０年間、又は更に１０年間を超えて）遅延し得る。いくつかの実施形態では、対象は、補体阻害剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けている。いくつかの実施形態では、方法は、補体阻害剤を対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、固形臓器同種移植片を有する対象の固形同種移植片の血管系における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって当該固形臓器同種移植片の当該血管系における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示は、固形臓器同種移植片を有する対象の固形同種移植片の血管系における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び補体阻害剤を対象に投与して、それによって当該固形臓器同種移植片の当該血管系における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、補体阻害剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けている。いくつかの実施形態では、方法は、補体阻害剤を対象に投与することを含む。
更に別の態様では、本開示はまた、固形臓器同種移植片を有する対象における当該固形臓器同種移植片拒絶を遅延させるか、若しくは予防するための、又はそれに対する予防法としての方法を特徴とし、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって対象における固形臓器同種移植片拒絶を遅延させるか、又は予防することを含む。
更に別の態様では、本開示はまた、固形臓器同種移植片を有する対象における当該固形臓器同種移植片拒絶を遅延させるか、若しくは予防するための、又はそれに対する予防法としての方法を特徴とし、対象は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を含む療法を受けているか、又は受けたことがあり、方法は、有効量の補体阻害剤を対象に投与して、それによって対象における固形臓器同種移植片拒絶を遅延させるか、又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、方法はまた、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与することを含み得る。
更に別の態様では、本開示はまた、同種移植された血管を有する対象における当該同種移植された血管の拒絶を遅延させるか、若しくは予防するための、又はそれに対する予防法としての方法を特徴とし、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって対象における当該血管の拒絶を遅延させるか、又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、血管は、動脈である。いくつかの実施形態では、血管は、静脈である。
更に別の態様では、本開示はまた、同種移植された血管を有する対象における当該同種移植された血管の拒絶を遅延させるか、若しくは予防するための、又はそれに対する予防法としての方法を特徴とし、対象は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を含む療法を受けているか、又は受けたことがあり、方法は、有効量の補体阻害剤を対象に投与して、それによって対象における同種移植された血管の拒絶を遅延させるか、又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、方法はまた、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、血管は、動脈である。いくつかの実施形態では、血管は、静脈である。
別の態様では、本開示は、同種移植片を有する対象の当該同種移植片の血管系における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤を対象に投与して、それによって当該対象の当該同種移植片の当該血管系における当該血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示は、固形臓器同種移植片を有する対象の固形同種移植片の血管系における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該固形臓器同種移植片における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示は、固形臓器同種移植片を有する対象における固形臓器同種移植片の生存を延長するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって当該対象における当該固形臓器同種移植片の生存を延長させるのに十分な量で、当該対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、固形臓器同種移植片を有する対象の固形臓器同種移植片における血管障害を阻害又は予防するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、固形臓器同種移植片における血管障害を阻害又は予防するのに十分な量で、当該対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、血管同種移植片を有する対象における同種移植された血管の血管障害を阻害又は予防するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、当該同種移植された血管の血管障害を予防又は阻害するのに十分な量で、対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、血管同種移植片を有する対象における同種移植された血管における血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、当該同種移植された血管における血管平滑筋細胞増殖を予防又は阻害するのに十分な量で、当該対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、血管同種移植片を有する対象における同種移植された血管の生存を延長するための方法に関し、方法は、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって当該同種移植された血管の生存を延長するのに十分な量で、当該対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示はまた、固形臓器移植を有し、当該臓器移植の手術を受ける対象における固形臓器移植における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤を対象に投与して、それによって当該対象の当該固形臓器移植における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示はまた、固形臓器同種移植片を有する対象における当該固形臓器同種移植片不全を予防するための、又はそれに対する予防法のための方法を特徴とし、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって対象における固形臓器同種移植片不全を予防するか、又はそれに対する予防法を提供することを含む。
別の態様では、本開示はまた、固形臓器同種移植片を有する対象における当該固形臓器同種移植片不全を遅延させるための方法を特徴とし、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって対象における固形臓器同種移植片不全を遅延させることを含む。いくつかの実施形態では、同種移植片不全は、少なくとも２か月間（例えば、少なくとも６か月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも５年間、少なくとも７年間、少なくとも１０年間、又は更に１０年間を超えて）遅延し得る。
別の態様では、本開示は、対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、血管は、動脈である。いくつかの実施形態では、血管は、静脈である。
別の態様では、本開示は、対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、血管は、動脈である。いくつかの実施形態では、血管は、静脈である。
別の態様では、本開示は、対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植された血管の血管障害を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、血管は、動脈である。いくつかの実施形態では、血管は、静脈である。いくつかの実施形態では、対象は、補体阻害剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けている。いくつかの実施形態では、方法は、補体阻害剤を対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、対象における同種移植された血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植された血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、血管は、動脈である。いくつかの実施形態では、血管は、静脈である。いくつかの実施形態では、対象は、補体阻害剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けている。いくつかの実施形態では、方法は、補体阻害剤を対象に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、同種移植片を有する対象における同種移植片血管障害（例えば、心臓同種移植片血管障害）を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量の（ｉ）ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤及び（ｉｉ）補体阻害剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植片血管障害を低減及び／又は予防することを含む。
更に別の態様では、本開示は、同種移植片を有し、補体阻害剤を含む療法を受けたことがあるか、又は受けている対象における同種移植片血管障害（例えば、心臓同種移植片血管障害）を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における同種移植片血管障害を低減及び／又は予防することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、補体阻害剤を対象に投与することを更に含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、薬剤は、当該手術の前、その間、及び／又はその後に投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、薬剤は、シャント留置の前、その間、及び／又はその後に投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、手術及び／又はシャント留置は、透析カテーテルの対象への導入を更に含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のうちのいずれかは、抗凝固薬、抗生物質、及び降圧薬のうちの１つ以上を対象に投与することを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のうちのいずれかは、血栓などのシャントの閉塞について対象をモニタリングすることを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のうちのいずれかは、１つ以上の免疫抑制薬を患者に投与することを更に含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１薬剤は、酵素活性を保持するＥＮＰＰ１バリアントを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３薬剤は、酵素活性を保持するＥＮＰＰ３バリアントを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、抗凝固薬、抗生物質、及び降圧薬のうちの１つ以上を受けているか、又は受けたことがある対象である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、１つ以上の免疫抑制薬など、固形臓器同種移植と併せた免疫抑制療法を受けたことがある、及び／又は受けている。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、スタチン薬物、血管拡張薬、抗凝固薬（例えば、アスピリン）、及び免疫抑制薬のうちの１つ以上を、固形臓器同種移植片移植と併せて受けたことがある、及び／又は受けている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のうちのいずれかは、スタチン薬物、血管拡張薬、抗凝固薬（例えば、アスピリン）、及び免疫抑制薬のうちの１つ以上を患者に投与することを更に含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のうちのいずれかは、固形臓器同種移植片に血行再建術を行うことを更に含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、固形臓器同種移植片の血行再建術を受ける予定であるか、受けたことがあるか、又は受けている。
いくつかの実施形態では、血行再建術は、血管形成、バイパス移植、及び／又はステント留置を含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、薬剤は、当該手術の前、その間、及び／又はその後に投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、手術は、バルーン血管形成及び／又はステントの留置を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、手術を行うことを更に含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１薬剤は、ＥＮＰＰ１ポリペプチドを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１薬剤は、ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸を含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１薬剤は、ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１の細胞外ドメインを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１の触媒ドメインを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸９９～９２５を含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、異種タンパク質を含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、異種タンパク質は、哺乳動物におけるＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期を増加させる。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、異種タンパク質は、イムノグロブリン分子のＦｃ領域である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、イムノグロブリン分子は、ＩｇＧ１分子である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、異種タンパク質は、アルブミン分子である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ＥＮＰＰ１ポリペプチドのカルボキシ末端である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１薬剤は、リンカーを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドと異種タンパク質を分離する。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、以下のアミノ酸配列：（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ｎは、１～１０の整数である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１薬剤は、対象に皮下投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１薬剤は、対象に静脈内投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、タバコ使用者であるか、高血圧症を有するか、コレステロール値若しくはトリグリセリド値の上昇を有するか、糖尿病であるか、腎疾患を有するか、又は肥満である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、ステージＩ、ステージＩＩ、又はステージＩＩＩ、鈴木グレードのＭＭＤを有する。別の態様では、本開示は、対象におけるステージＩ鈴木グレードのＭＭＤ末梢動脈疾患からステージＩＩＩ鈴木グレードのＭＭＤへの進行を阻害するか、又は遅延させるための方法を特徴とし、方法は、有効量のＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象におけるステージＩ鈴木グレードのＭＭＤからステージＩＩＩ鈴木グレードのＭＭＤへの進行を阻害する、及び／又は遅延させることを含む。
別の態様では、本開示は、大脳動脈の手術を必要とする対象の当該大脳動脈における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法を特徴とし、対象は、モヤモヤ病を有し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における当該大脳動脈の手術部位での当該大脳動脈における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、大脳動脈は、外頸動脈（ＥＣＡ）、内頸動脈（ＩＣＡ）、中大脳動脈（ＭＣＡ）、及び前大脳動脈（ＡＣＡ）のうちの１つ以上である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３薬剤は、ステント留置の前、その間、及び／又はその後に投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、固形臓器同種移植片は、心臓同種移植片である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、固形臓器同種移植片は、肺同種移植片、肝臓同種移植片、又は腎臓同種移植片である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、補体阻害剤は、抗Ｃ５抗体などの補体成分Ｃ５阻害剤、例えば、エクリズマブ又はラブリズマブ－ｃｗｖｚである。
いくつかの実施形態では、補体阻害剤は、そのような補体成分のうちのいずれか１つに結合し、その機能を阻害する抗体など、補体成分Ｃ１（Ｃ１ｓ及びＣ１ｑを含む）、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、並びに／又はＣ９の阻害剤である。
いくつかの実施形態では、補体阻害剤は、コンプスタチン又はその類似体である。
いくつかの実施形態では、補体阻害剤は、Ｃ５ａ阻害剤、Ｃ５ａＲ阻害剤、Ｃ３阻害剤、因子Ｄ阻害剤、因子Ｂ阻害剤、Ｃ４阻害剤、Ｃｌｑ阻害剤、Ｃ１ｓ阻害剤、又はそれらの任意の組み合わせである。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、補体阻害剤は、抗ＭＡＳＰ２抗体（例えば、ＯＭＳ７２１）などのレクチン経路阻害剤である。
別の態様では、本開示は、固形臓器同種移植片を有する対象の固形同種移植片の血管系における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ１薬剤を対象に投与して、それによって当該固形臓器同種移植片の当該血管系における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示は、同種移植片血管障害を有する対象における同種移植片の血管障害を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象における当該同種移植片血管障害を治療することを含む。
別の態様では、本開示は、同種移植片を有する対象の当該同種移植片の血管系における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象の当該同種移植片の当該血管系における当該血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
別の態様では、本開示はまた、固形臓器移植を有し、当該臓器移植の手術を受ける対象における固形臓器移植における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該対象の当該固形臓器移植における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、薬剤は、当該手術の前、その間、及び／又はその後に投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、手術は、バルーン血管形成及び／又はステントの留置を含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、ＥＮＰＰ１の欠乏を有しない。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３薬剤は、ＥＮＰＰ３ポリペプチドを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３薬剤は、ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸を含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３薬剤は、ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、ＥＮＰＰ３の細胞外ドメインを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、ＥＮＰＰ３の触媒ドメインを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸４９～８７５を含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、異種タンパク質を含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、異種タンパク質は、哺乳動物におけるＥＮＰＰ３ポリペプチドの循環半減期を増加させる。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、異種タンパク質は、イムノグロブリン分子のＦｃ領域である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、イムノグロブリン分子は、ＩｇＧ１分子である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、異種タンパク質は、アルブミン分子である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、異種タンパク質は、ＥＮＰＰ３ポリペプチドのカルボキシ末端である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３薬剤は、リンカーを含む。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、ＥＮＰＰ３ポリペプチドと異種タンパク質を分離する。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、リンカーは、以下のアミノ酸配列：（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ｎは、１～１０の整数である。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３薬剤は、対象に皮下投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３薬剤は、対象に静脈内投与される。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、タバコ使用者であるか、高血圧症を有するか、コレステロール値若しくはトリグリセリド値の上昇を有するか、糖尿病であるか、腎疾患を有するか、又は肥満である。本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、大脳動脈閉塞を有する。
別の態様では、本開示は、固形臓器同種移植片を有する対象の固形同種移植片の血管系における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防するための方法に関し、方法は、有効量のＥＮＰＰ３薬剤を対象に投与して、それによって当該固形臓器同種移植片における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防することを含む。
本開示の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び特許請求の範囲から明らかであろう。
移植前及び後の対照マウス及び実験マウスの予防的処置レジメンの概略図を示す。実験マウスは、大動脈移植の７日前に、毎日皮下注射によって、１０ｍｇ／ｋｇ体重の例示的な投与量でのＥＮＰＰ１－Ｆｃを用いて処置される。対照コホートは、ｐＨ７．４のトリス緩衝生理食塩水を含有するビヒクルを注射される。次いで、全てのマウスは、移植後２８日目に解剖され、マウスは、約１０週齢である。 マウスにおける心臓移植の概略図を示す。また、移植された大動脈の５μｍ切片の形態計測学的測定値も示す。各切片の中膜面積、内膜面積、及び内膜／中膜比（Ｉ／Ｍ比）が計算される。 異所性心臓移植のブタモデルの概略型を示す。３（Ａ）は、冷たい心停止液（Ｐｌｅｇｉｓｏｌ）を使用することによって達成された心臓停止後に、ドナー心臓が採取されることを示す。３（Ｂ）は、移植片が氷－生理食塩水スラリー中に維持され、心房中隔欠損を生じさせ、僧帽弁を機能停止させて、左室萎縮及び腔内血栓形成を最小限に抑えることによって、移植の準備ができていることを示す。３（Ｃ）は、レシピエントの下大静脈（ＩＶＣ）及び腎動脈下大動脈が単離されたことを示す。３（Ｄ）は、ドナーの肺動脈をレシピエントのＩＶＣに、及びドナーの上行大動脈をレシピエントの腹部大動脈に吻合することによって、移植片心臓が移植されることを示す。移植片機能は、（Ｅ）心電図（ＥＣＧ）及び（Ｆ）心エコー検査（ＵＣＧ）を使用することによってモニタリングされた。矢印は、異所性心臓同種移植片に起因する電気的スパイクを示す。（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１８ Ｄｅｃ；１０２（１２）：２００２－２０１１。） ステント埋め込み後１４日目及び４２日目に血管造影によって捕捉された代表的な深動脈画像の一連の写真である。２つの対照画像は、１４日目の血管の形態に対して、４２日目の内膜増殖に起因する深動脈の狭小化を例証する。対照的に、ＥＮＰＰ１－Ｆｃで治療された動物では、深動脈形態の可視的な変化が１４日目～４２日目にほとんど観察されなかった。血管内のステントの上方及び下方境界は、各写真内で長方形によって識別される。 ステント埋め込み後１４日目及び４２日目に光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって捕捉された代表的な深動脈画像の一連の写真である。２つの対照画像は、１４日目の血管の形態に対して、４２日目の深動脈内の顕著な内膜肥厚を例証する。対照的に、ＥＮＰＰ１－Ｆｃで治療された動物では、可視的な内膜肥厚が１４日目～４２日目にほとんど観察されなかった。狭窄の程度は、４２日目の写真で強調されている。 ＯＣＴによって測定される、ＥＮＰＰ１－Ｆｃで治療されたブタ（治療）又はビヒクル対照を与えられたブタ（対照）の深動脈における１４日目及び４２日目の狭窄の面積率を描写する、棒グラフである。 ＭＭＤを誘導するための脳手術の前及び後の対照マウス及び実験マウスの予防的処置レジメンの概略図を示す。実験マウスは、手術の７日前に、毎日皮下注射によって、１０ｍｇ／ｋｇ体重の例示的な投与量でのＥＮＰＰ１－Ｆｃを用いて処置される。対照コホートは、ｐＨ７．４のトリス緩衝生理食塩水を含有するビヒクルを注射される。次いで、全てのマウスは、移植後２８日目に解剖され、マウスは、約１０週齢である。 内頸動脈狭窄によってＭＭＤモデルを作製するプロセスを示す。８Ａ）は、外科処置中のマウスの配向を示す。頭部（歯）、前足、及び尾が拘束され、首の正中線（赤い破線）で切開される。白いボックスは、後に続く画像の領域を示す。８Ｂ）は、気管、胸鎖乳突筋（ＳＣＭ）、及び二腹筋（ＰＢＤ）の後腹を露出する頸部領域の開口部を示す。８Ｃ）は、ＳＣＭ及びＰＢＤを収縮させて、総頸動脈、内頸動脈、及び外頸動脈（ＣＣＡ、ＩＣＡ、ＥＣＡ）を露出する縫合（Ｓ１－２）留置を示す。８Ｄ）は、後頭動脈（ＯＡ）、迷走神経（ＶＮ）及びＩＣＡの識別を示す。８Ｅ）は、ＯＡの縫合結紮、及びＩＣＡをよりよく露出するための切断を示す破線を示す。８Ｆ）は、６±０縫合を使用してＩＣＡが露出及び単離された、切断されたＯＡを示す。８Ｇ）は、ＥＣＡの深部（Ｈに見られるような）のＩＣＡ上のマイクロコイル留置を示す。（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｍｏｙａｍｏｙａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１８；１３（１）：ｅ０１９１３１２。） 透析シャントを含有する対象の腕から、圧力モニター、血液ポンプ、及び凝固を防止するヘパリンポンプを通過して、管内への血液透析血流の図である。血液は、透析装置又はフィルターに入る前に、別の圧力モニターを通過して流れる。濾過された血液は続いて、静脈圧モニター、空気トラップ及び空気検出器、並びに空気検出器クランプを通過して、対象の腕に戻る。 対象の右上胸部領域１００に位置付けられた移植可能なシャント２の図である。移植可能な透析シャント２は、移植可能な透析シャント２と使用するために、典型的には６～８ｍｍの中サイズの動脈に十分近接して移植される限り、身体の他の領域に移植されてもよい。移植可能な透析シャントは、好ましくは、単一構造で互いに接続された動脈ポート４及び静脈ポート６を含む。他の実施形態では、ポート４、６は、それらの互いへの取り付けを可能にする特徴を含み得る別個の構造であってもよい。動脈移植片１２が概して、動脈ポート４を通って延在する一方で、静脈移植片１８は、静脈ポート６から延在する。移植プロセス中、動脈移植片１２が好ましくは、その端部の各々で動脈２６の側壁に接続される一方で、静脈移植片１８の端部は、静脈３４に接続される。他の実施形態では、動脈移植片１２は、一対の端々吻合（ｅｎｄ－ｔｏ－ｅｎｄ ａｎａｓｏｍｏｓｅｓ）によって動脈２６に接続されてもよい。加えて、静脈移植片１８は、中心静脈系に入ることができるように、静脈３４に挿入される静脈カテーテルの形態をとってもよい。透析は、動脈ポート４に動脈カテーテル１０２を、及び静脈ポートに静脈カテーテル１０４を取り付けることによって実施され得る。動脈カテーテル及び静脈カテーテル１０２、１０４の各々は、透析装置に接続される。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等である任意の方法及び材料を、本開示の実践又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載される。
明確にするために、「ＮＰＰ１」及び「ＥＮＰＰ１」は、同じタンパク質を指し、本明細書では同義的に使用される。本明細書で使用される場合、「ＥＮＰＰ１タンパク質」又は「ＥＮＰＰ１ポリペプチド」という用語は、ＡＴＰを切断してＰＰｉを生成することが可能であり、また、軟部組織における異所性石灰化も低減する、ＥＮＰＰ１遺伝子によってコードされるエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１タンパク質を指す。
ＥＮＰＰ１タンパク質は、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、ヌクレオチド及びヌクレオチド糖のホスホジエステル結合、並びにヌクレオチド及びヌクレオチド糖のピロホスファート結合を含む、様々な基質を切断する。ＥＮＰＰ１タンパク質は、膜貫通ドメイン及び可溶性細胞外ドメインを有する。細胞外ドメインは、ソマトメジンＢドメイン、触媒ドメイン、及びヌクレアーゼドメインに更に細分される。野生型ＥＮＰＰ１の配列及び構造は、Ｂｒａｄｄｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．のＰＣＴ出願公開第２０１４／１２６９６５号で詳細に説明され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合のＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１酵素活性を呈するポリペプチド、ＥＮＰＰ１酵素活性を保持するＥＮＰＰ１の変異体、ＥＮＰＰ１の断片、又はＥＮＰＰ１酵素活性を呈する欠失バリアントを含むＥＮＰＰ１のバリアントを包含する。ＥＮＰＰ１酵素活性は、以下に記述されるように、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を血漿ピロホスファート（ＰＰｉ）に切断するＥＮＰＰ１ポリペプチドの能力を指す。
本明細書で使用される場合のＥＮＰＰ３ポリペプチドは、ＡＴＰ切断酵素活性を呈するポリペプチド、ＡＴＰ切断酵素活性を保持するＥＮＰＰ３の変異体、ＡＴＰ切断酵素活性を呈する欠失バリアントを含むＥＮＰＰ３の断片又はＥＮＰＰ３のバリアントを包含する。ＡＴＰ切断酵素活性は、以下に記述されるように、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を血漿ピロホスファート（ＰＰｉ）に切断するＥＮＰＰ３ポリペプチドの能力を指す。
ＥＮＰＰ１及びＥＮＰＰ３ポリペプチド、変異体、又はその変異体断片のいくつかの例は、国際ＰＣＴ出願公開第２０１４／１２６９６５－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、同第２０１６／１８７４０８－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、同第２０１７／０８７９３６－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、及び同第２０１８／０２７０２４－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．で以前に開示されており、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ＥＮＰＰ１ポリペプチド又はＥＮＰＰ３ポリペプチドに関する酵素的に活性」は、ＡＴＰ加水分解活性をＡＭＰ及びＰＰｉに処理すること、並びに／又はＡＤＰ及びＡＭＰへのＡＰ３ａ加水分解として定義される。ＮＰＰ１及びＮＰＰ３は、ＡＴＰをＡＭＰ及びＰＰｉに容易に加水分解する。ＮＰＰ１の定常状態のミカエリス－メンテン酵素定数は、ＡＴＰを基質として使用して決定される。ＮＰＰ１は、酵素反応のＨＰＬＣ分析によってＡＴＰを切断することが示され得、反応の基質及び生成物の同一性は、ＡＴＰ、ＡＭＰ、及びＡＤＰ標準を使用して確認される。ＡＴＰ基質は、ＮＰＰ１の存在下で経時的に分解し、酵素産物ＡＭＰの蓄積を伴う。ＡＴＰ基質の様々な濃度を使用して、ＮＰＰ１の初期速度の速度は、ＡＴＰの存在下で導出され、データは、酵素速度定数を導出するために曲線に適合される。生理学的ｐＨでは、ＮＰＰ１の運動速度定数は、Ｋｍ＝１４４μＭ及びｋｃａｔｔ＝７．８ｓ－１である。
本明細書で使用される場合、「ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質」という用語は、ＥＮＰＰ１ Ｎ末端にそのシグナルペプチド配列を有するＥＮＰＰ１ポリペプチドを指す。タンパク質分解時に、シグナル配列は、ＥＮＰＰ１から切断され、ＥＮＰＰ１タンパク質を提供する。本開示内で有用なシグナルペプチド配列としては、これらに限定されないが、アルブミンシグナル配列、アズロシジンシグナル配列、ＥＮＰＰ１シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ２シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ７シグナルペプチド配列、及び／又はＥＮＰＰ５シグナルペプチド配列が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ＥＮＰＰ３前駆体タンパク質」という用語は、ＥＮＰＰ３ Ｎ末端にそのシグナルペプチド配列を有するＥＮＰＰ３を指す。タンパク質分解時に、シグナル配列は、ＥＮＰＰ３から切断され、ＥＮＰＰ３タンパク質を提供する。本開示内で有用なシグナルペプチド配列としては、これらに限定されないが、アルブミンシグナルペプチド配列、アズロシジンシグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ１シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ２シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ７シグナルペプチド配列、及び／又はＥＮＰＰ５シグナルペプチド配列が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「アズロシジンシグナルペプチド配列」という用語は、ヒトアズロシジンに由来するシグナルペプチドを指す。カチオン性抗微生物タンパク質ＣＡＰ３７又はヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）としても知られるアズロシジンは、ヒトにおいてＡＺＵ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。アズロシンシグナルペプチドＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号４２）をコードするヌクレオチド配列は、コードされると、ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質又はＥＮＰＰ３前駆体タンパク質を生成する、ＮＰＰ１又はＮＰＰ３遺伝子のヌクレオチド配列と融合される。（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，Ｋｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１３ Ａｐｒ；１１０（４）：１１６４－７３）
本明細書で使用される場合、「ＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物」という用語は、ＩｇＧ分子（好ましくは、ヒトＩｇＧ）のＦｃＲ結合ドメインに（共有結合及び非共有結合の両方を含む）組換え融合及び／又は化学的にコンジュゲートされたＥＮＰＰ１（例えば、ＥＮＰＰ１の細胞外ドメイン）を指す。ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１のＣ末端は、ＦｃＲ結合ドメインのＮ末端に融合又はコンジュゲートされる。
本明細書で使用される場合、「ＥＮＰＰ３－Ｆｃ構築物」という用語は、ＩｇＧ分子（好ましくは、ヒトＩｇＧ）のＦｃＲ結合ドメインに（共有結合及び非共有結合の両方を含む）組換え融合及び／又は化学的にコンジュゲートされたＥＮＰＰ３を指す。ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１のＣ末端は、ＦｃＲ結合ドメインのＮ末端に融合又はコンジュゲートされる。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ」という用語は、ヒトＩｇＧ（イムノグロブリン）Ｆｃドメインを指す。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４などのＩｇＧのサブタイプは、Ｆｃドメインとして使用するために企図される。「Ｆｃ領域又はＦｃポリペプチド」は、ＩｇＧ分子のパパイン消化により得られた結晶性断片と相関するＩｇＧ分子の部分である。Ｆｃ領域は、ジスルフィド結合によって連結されるＩｇＧ分子の２つの重鎖のＣ末端の半分を含む。抗原結合活性はないが、ＦｃＲｎ受容体を含む相補体及びＦｃ受容体の炭水化物部分及び結合部位を含む。Ｆｃ断片は、第２の定常ドメインＣＨ２全体（ＫａｂａｔナンバリングシステムによるヒトＩｇＧ１の残基２３１～３４０）及び第３の定常ドメインＣＨ３（残基３４１～４４７）を含む。「ＩｇＧヒンジ－Ｆｃ領域」又は「ヒンジ－Ｆｃ断片」という用語は、Ｆｃ領域（残基２３１～４４７）及びＦｃ領域のＮ末端から延びるヒンジ領域（残基２１６～２３０）からなるＩｇＧ分子の領域を指す。「定常ドメイン」という用語は、イムノグロブリンの他の部分、抗原結合部位を含む可変ドメインに対して、より保存されたアミノ酸配列を有するイムノグロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン、並びに軽鎖のＣＨＬドメインを含む。
本明細書で使用される場合、「機能的等価バリアント」という用語は、本明細書で使用される場合、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３（上記で定義される）の配列に対して実質的に相同であり、かつそれぞれＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３の酵素及び生物学的活性を保持するポリペプチドに関する。バリアントが天然のＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３の生物学的活性を保持するかどうかを決定する方法は、当業者に広く知られており、当該出願の実験部分で使用されるアッセイのうちのいずれかを含む。特に、ウイルスベクターによって送達されるＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３の機能的等価バリアントは、本開示によって包含される。
ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３の機能的等価バリアントは、それぞれ天然のＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３に対して実質的に相同であるポリペプチドである。「実質的に相同」という表現は、当該タンパク質配列が、それぞれ、上記に記載されるＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３配列に関して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性の程度を有し、ＡＴＰ切断に関して野生型ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３タンパク質の少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の活性を依然として保持している、タンパク質配列に関する。
２つのポリペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズム及び方法を使用して決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を使用することによって決定されるが、他の類似のアルゴリズムも使用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０は、本明細書に記載されるパラメータを用いて、配列同一性パーセントを決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センターを通じて公開されている。
ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３の機能的等価バリアントは、それぞれ、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３を産生するために使用される宿主細胞中のコドン選好を説明するポリヌクレオチド内のヌクレオチドを置き換えることによって得ることができる。そのような「コドン最適化」は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって提供されるコドン選好の「Ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」などのコドン出現頻度表を組み込むコンピュータアルゴリズムを介して決定され得る。ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドのバリアントは、ＡＴＰ切断に関して野生型ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３タンパク質の少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の活性を保持することが予期される。
本明細書で使用される場合、「ＥＮＰＰ１断片」という用語は、タンパク質形態で、又はそれをコードする核酸の形態で投与される少なくともＥＮＰＰ１触媒ドメインを有する、ＥＮＰＰ１タンパク質の断片若しくは一部、又は完全長ＮＰＰ１の活性部分配列を指す。
本明細書で使用される場合、「ＥＮＰＰ１薬剤」という用語は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の切断により血漿ピロホスファート（Ｐｐｉ）を産生することが可能な少なくとも触媒ドメインを含むＥＮＰＰ１ポリペプチド若しくは融合タンパク質若しくはＥＮＰＰ１断片、又はＡＴＰ若しくはそれをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターなどのベクターの酵素切断によりＰＰｉを産生することが可能な少なくとも触媒ドメインを含むＥＮＰＰ１融合タンパク質若しくはＥＮＰＰ１断片をコードするｃＤＮＡ若しくはＲＮＡなどのポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、天然発生型起源から単離された遺伝子又は遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団で最も頻繁に観察され、したがって、ヒトＮＰＰ１遺伝子又はＮＰＰ３遺伝子の「正常」又は「野生型」形態を任意に設計される。対照的に、「機能的等価」という用語は、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較すると、配列及び／又は機能的特性（すなわち、改変された特性）の修飾を示す、ＮＰＰ１若しくはＮＰＰ３遺伝子又は遺伝子産物を指す。天然発生型変異体を単離することができ、これらは、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較すると、改変した特徴（改変した核酸配列を含む）を有するという事実によって識別される。
本明細書で使用される場合の「約」は、量、時間的期間、及び同等物などの測定可能な値を指すときに、指定された値からの＋２０％又は＋１０％、より好ましくは＋５％、更により好ましくは＋１％、なおもより好ましくは＋０．１％の変動を包含するように意図されており、そのような変動は、開示される方法を実施するために適切である。
本明細書で定義されるように、「部分」という用語は、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドに共有結合又は非共有結合され、かつそれが付着しているタンパク質に所望の特性を付与する能力を有する、化学成分又は生体分子を指す。例えば、部分という用語は、ポリアスパラギン酸若しくはポリグルタミン酸（４～２０個の連続的なａｓｐ又はｇｌｕ残基）などの骨標的化ペプチド、又はＥＮＰＰ１若しくはＥＮＰＰ３ポリペプチドの半減期を延長する分子を指すことができる。部分のいくつかの他の例には、Ｆｃ、アルブミン、トランスフェリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ホモ－アミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリン－アラニン－セリンポリマー（ＰＡＳ）、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）、及びゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）が含まれる。
本明細書で定義されるように、「対象」、「個体」、又は「患者」という用語は、好ましくは、乳児全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、２型常染色体劣性低リン血症性くる病（ＡＲＨＲ２）、乳児特発性動脈石灰化（ＩＩＡＣ）、後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）、低リン血症性くる病、変形性関節炎、アテローム性動脈硬化性プラークの石灰化、遺伝型及び非遺伝型の変形性関節炎、強直性脊椎炎、老化に伴って生じる動脈の硬化、末期腎疾患及び早老症から生じるカルシフィラキシスなどの病理学的石灰化及び病理学的骨化をもたらす機能喪失変異などのＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異を保有していないヒトを指す。そのような患者は、健康な対象における正常なレベルの血漿ピロホスファート（ＰＰｉ）を維持するために必要とされるＮＰＰ１タンパク質の量を指す、血清中の正常なレベルのＮＰＰ１を有するであろう。正常なレベルのＰＰｉは、２～３μＭに対応する。
本明細書で使用される場合、「血漿ピロホスファート（ＰＰｉ）レベル」という用語は、動物の血漿中に存在するピロリン酸塩の量を指す。ある特定の実施形態では、動物には、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ヒト、ウシ、及びウマが含まれる。ＰＰｉを測定するにはいくつかの方法があり、そのうちの１つは、修飾を伴うウリジン－ジホスホグルコース（ＵＤＰＧ）ピロホスホリラーゼ（Ｌｕｓｔ ＆ Ｓｅｅｇｍｉｌｌｅｒ，１９７６，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ６６：２４１－２４９、Ｃｈｅｕｎｇ ＆ Ｓｕｈａｄｏｌｎｉｋ，１９７７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３：６１－６３）を使用した酵素アッセイによるものである。
典型的には、健康なヒト対象における血漿ＰＰｉレベルは、約１μｍ～約３μＭの範囲であり、いくつかの場合では、１～２μｍである。ＥＮＰＰ１発現欠損を有する対象は、正常なレベルより少なくとも１０％下回る、正常なレベルより少なくとも２０％下回る、正常なレベルより少なくとも３０％下回る、正常なレベルより少なくとも４０％下回る、正常なレベルより少なくとも５０％下回る、正常なレベルより少なくとも６０％下回る、正常なレベルより少なくとも７０％下回る、正常なレベルより少なくとも８０％下回る、及びそれらの組み合わせの範囲である、低ｐｐｉレベルを呈する傾向がある。乳児全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）に罹患した患者では、ｐｐｉレベルは、１μｍ未満であることが見出され、いくつかの場合では、検出レベルを下回る。弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）に罹患した患者では、ｐｐｉレベルは、０．５μｍを下回る。（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０１４ Ｓｅｐ；３４（９）：１９８５－９、Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５；６：１０００６。）
本明細書で使用される場合、「ＰＰｉ」という用語は、無機ピロリン酸塩を指す。
「低レベルのＰＰｉ」は、対象が、正常なレベルの血漿ピロホスファート（ＰＰｉ）の２％～５％未満の０．１％～０．９９％を有する状態を指す。健康なヒト対象における正常なレベルの血漿ＰＰｉは、１．８～２．６μＭ＋／－０．１μＭの範囲内である（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．８（Ａｕｇｕｓｔ １９７９））
本明細書で使用される場合、「非外科的組織損傷」という用語は、鈍力又はナイフなどの鋭利な物体の使用を伴う暴行、高所からの落下などの機械的損傷、重機による労働災害、又は自動車事故などの車両による損傷を含むがこれらに限定されない、外傷事象中に組織又は血管に負った損傷を指す。
本明細書で使用される場合、「心筋梗塞」という用語は、動脈の内壁内のプラークの形成に起因して生じ、心臓への血流の低減をもたらし、酸素供給の不足により心筋を損傷する、心筋への永久的な損傷を指す。ＭＩの症状には、左腕から首まで移動する胸痛、息切れ、発汗、悪心、嘔吐、異常な心臓の鼓動、不安、疲労、脱力、ストレス、うつ病、及び他の要因が含まれる。
本明細書で使用される場合、「モヤモヤ病」又は「モヤモヤ症候群」という用語は、ウィリスの輪の周囲の動脈狭窄及び閉塞を引き起こす内膜過形成を伴う平滑筋細胞増殖を伴う、大脳動脈の狭窄閉塞性疾患を指す。これは、皮質下領域における「煙のパフ」（「モヤモヤ」）に似た新しい血管の発生を伴う。ＭＭＤは、５～１０歳頃、及び３０代～５０代に第２のピークの２つのピークを伴って小児及び成人において生じる。一般的な症状には、頭痛又はめまい、四肢又は身体の片側の脱力又は麻痺、言語障害（言葉を発する又は起想することができないこと）、感覚又は認知障害、不随意運動、発作又は意識消失、視力障害、脳卒中、及び脳出血が含まれる。ＭＭＤ症例の８０％は、ＲＮＦ２１３及び／又はＲ４８１０Ｋ変異の保因者である。ＭＭＤ及びＭＭＳの両方の治療選択肢は、毎日のアスピリン使用、脳灌流を最大化するためのライフスタイル改善、及び血流を回復させるための外科的な直接又は間接バイパスを伴う。
確定的なＭＭＤの診断基準は、脳の基底部に異常な血管網を伴う頸動脈終末部狭窄（ＩＣＡ）の両側性及び片側性の両方の提示を有する患者を含むように改訂された。ＭＭＤには、患者集団を等級分けする鈴木システムが使用されてきた。ＭＭＤの確定診断には、片側性の症例においてはカテーテル血管造影が必要であるが、両側性の症例は、カテーテル血管造影又は磁気共鳴画像／血管造影（ＭＲＩ／ＭＲＡ）のいずれかによって速やかに診断され得る。
本明細書で使用される場合、「脳血管閉塞」という語句は、脳内の血管の一時的又は永久的な遮断を指す。血流の制限は、血管の狭小化（狭窄）、凝血塊形成（血栓）、遮断（塞栓）、又は血管破裂（出血）から生じ得る。十分な血流の不足（虚血）は、脳組織に影響を及ぼし、脳卒中を引き起こす可能性がある。
本明細書で使用される場合、「鈴木分類システム」という用語は、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｓｕｚｕｋｉ Ｊ，Ｔａｋａｋｕ Ａ．Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ“ｍｏｙａｍｏｙａ”ｄｉｓｅａｓｅ．Ｄｉｓｅａｓｅ ｓｈｏｗｉｎｇ ａｂｎｏｒｍａｌ ｎｅｔ－ｌｉｋｅ ｖｅｓｓｅｌｓ ｉｎ ｂａｓｅ ｏｆ ｂｒａｉｎ．Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．１９６９；２０（３）：２８８±９９．）によって開発された分類システムを指す。この分類システムは、患者の臨床提示を４つのステージに等級分けする。患者の大多数は、鈴木ステージの一部又は全てを通して進行するが、進行は、異なる速度で生じる可能性があり、青年又は成人よりも小児においてより急速に生じるように見える。システムは、従来の血管造影のみに基づいており、以下の表に示すとおりである。
Figure 2023532732000001
本明細書で使用される場合、「内頸動脈（ＩＣＡ）」という用語は、首の内側に位置し、脳及び眼に血液を供給する動脈を指す。
本明細書で使用される場合、「外頸動脈（ＥＣＡ）」という用語は、頭頸部の主要動脈を指す。これは、外頸動脈及び内頸動脈に分かれるときに総頸動脈から発生する。ＥＣＡは、顔、頭皮、頭蓋骨、及び髄膜に血液を供給する。本明細書で使用される場合、「前大脳動脈（ＡＣＡ）」という用語は、前頭葉及び内側上頭頂葉のほとんどの正中部分に酸素化血液を供給する脳上の動脈を指す。一対の前大脳動脈は、内頸動脈から発生、ウィリスの輪の一部である。
本明細書で使用される場合、「中大脳動脈（ＭＣＡ）」という用語は、大脳に血液を供給する３つの主要な対の動脈のうちの１つを指す。ＭＣＡは、内頸動脈から発生し、外側溝に続き、次いで、外側大脳皮質の多くの部分に分岐及び突出する。また、前側頭葉及び島皮質に血液を供給する。
本明細書で使用される場合、「従来の血管造影」という用語は、血管造影又は動脈造影が、動脈、静脈、及び心腔に特に関心を示して、身体の血管及び臓器の内部又は内腔を可視化するために使用される医用画像技術であることを指す。これは従来、Ｘ線不透過性造影剤を血管に注射し、蛍光透視などのＸ線ベースの技術を使用して撮像することによって行われる。
本明細書で使用される場合、「カテーテル血管造影」という用語は、動脈瘤などの異常及びアテローム性動脈硬化症（プラーク）などの疾患について、脳又は心臓などの身体の重要領域内の血管を検査するためのカテーテル、Ｘ線画像ガイダンス、及び造影材料の注射である医療処置を指す。
本明細書で使用される場合、「磁気共鳴血管造影（ＭＲＡ）」という語句は、磁気共鳴画像スキャナーが、静脈内注射針で投与される造影剤を用いて、脳、肺、及び心臓などの重要領域の血管の遮断を可視化するために使用される医療プロセスを指す。これは、血管の遮断又は閉塞を診断する非侵襲的方法である。
本明細書で使用される場合、「手術を必要とする対象」という用語は、ＥＮＰＰ１欠乏ではなく、大腿動脈、大腿膝窩動脈、又は脛骨腓骨動脈などの末梢動脈に動脈閉塞を有する患者を指す。
本明細書で使用される場合、「手術部位」という用語は、血管外傷又は偶発的外傷のいずれかに起因して組織損傷が生じた動脈の領域を指す。
本明細書で使用される場合、「脳石灰化」（ＢＣ）という用語は、血管壁及び実質組織におけるカルシウム及び他のミネラルの沈着が生じ、神経細胞死及び神経膠症につながる、非特異的神経病理学を指す。脳石灰化は、しばしば、ダウン症候群、レビー小体病、アルツハイマー病、パーキンソン病、血管性認知症、脳腫瘍、及び様々な内分泌状態を含む、様々な慢性及び急性脳障害に関連し、心臓組織の石灰化は、大動脈組織及び冠動脈組織などの心臓組織におけるカルシウムの沈着物（他のミネラルを含む可能性がある）の蓄積を指す。
透析シャントの使用に関して本明細書で使用される場合、狭窄は、ＡＶ瘻を通る血流を遅延させ、かつ低減し、透析治療の質、穿刺後の長時間の出血、又は瘻の痛みの問題を引き起こす。狭窄はまた、アクセスの遮断又は凝固につながる可能性がある。
本明細書で使用される場合、「メス切開」という用語は、外科的処置中にメスなどの鋭利な物体を使用して組織に行われた切開を指す。切開は、外科的処置を実施することができるように、下層組織、骨、又は臓器を露出させるために身体の組織に行われた切断である。
本明細書で使用される場合、「手術部位」という用語は、血管外傷又は偶発的外傷のいずれかに起因して組織損傷が生じた動脈の領域を指す。
「動静脈シャント」、又は「ＡＶシャント」、又は単に「シャント」という用語は、動脈及び静脈に取り付けられる管を含む埋め込み型デバイスを指す。シャントは、動脈カニューレ及び静脈カニューレを接続し、有効な血液透析のために通常よりも大きい血流量を提供する。シャントは、身体の任意の部分に位置することができ、腕、脚、又は右鎖骨下の胸部領域に位置することが最も多い。
本明細書で使用される場合、「コーティングシャント」という用語は、治療化合物又はＥＮＰＰ１若しくはＥＮＰＰ３などのポリペプチドをゆっくりと溶出して、典型的には動脈の遮断を除去するために実施される手術の部位での血管平滑筋細胞増殖の量を低減することができるシャントを指す。
本明細書で使用される場合、「血液透析」という用語は、異常な腎機能を補うために必要とされる治療を指し、老廃物及び水が血液から濾過され、濾過されたよりきれいな血液が身体に戻される。血液透析は、血圧を制御し、対象の血液中のカリウム、ナトリウム、及びカルシウムなどの重要なミネラルのバランスをとるのに役立つ。
本明細書で使用される場合、「瘻」という用語は、中空若しくは管状の臓器及び体表面、又は２つの中空若しくは管状の臓器間の異常な、又は外科的に作製された通路を指す。
「ステント」という用語は、治癒を助けるか、又は閉塞を緩和するために、血管、管、又は導管の内側に留置された管状支持体を指す。
「血管」という用語は、組織及び臓器を通して血液を運ぶ管状構造である静脈、動脈、又は毛細血管を指す。
本明細書で使用される場合、「補体阻害剤」という用語は、Ｃ３ａの形成若しくはＣ３ａ受容体を介したシグナル伝達、Ｃ５ａ若しくはＣ５ａ受容体を介したシグナル伝達、又は終末補体の形成をもたらす、補体カスケードの活性化及び／又は伝播を防止又は低減する分子（例えば、タンパク質（抗体など）、小分子、又はペプチド）を指す。補体阻害剤は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｚｉｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：２１６６に記載されている。また例えば、米国特許第５，６７９，３４５号も参照されたく、その開示は、参照によりその全体が組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「改変」、「欠陥」、「変動」、又は「変異」という用語は、ミスセンス及びナンセンス変異、挿入、欠失、フレームシフト、並びに未成熟終止を含む、それがコードするポリペプチドの機能、活性、発現（転写若しくは翻訳）、又は立体配座に影響を及ぼす、細胞内の遺伝子の変異を指す。
本明細書で定義されるように、「中膜面積」という語句は、動脈の外弾性板と内弾性板との間の面積である。
本明細書で定義されるように、「内膜面積」という用語及び当該内膜面積は、当該内弾性板と動脈の内腔との間の面積である。
本明細書で定義されるように、「外弾性板」という語句は、動脈の中膜の平滑筋のすぐ外側に横たわる弾性結合組織の層を指す。
本明細書で定義されるように、「内弾性板」という語句は、血管の内膜の最も外側の部分を形成する弾性組織の層を指す。
本明細書で定義されるように、「内腔」という語句は、血流が生じる動脈、静脈、又は毛細血管の中央腔などの血管の内部を指す。
本明細書で定義されるように、「血管障害」という語句は、血管系の疾患を指す。「血管系」は、身体、又は固形臓器移植などの臓器、又は身体部分における血管の配置を指す。「血管」は、対象の体内又は対象の固形臓器同種移植片の動脈、細動脈、毛細血管、及び静脈のうちの１つ以上を指す。「血管炎」は、静脈、動脈、毛細血管、又はリンパ管の炎症を指す。「血管新生化移植片」は、レシピエントの血管系が移植片内の血管に接続された後の移植片を指す。
本明細書で定義されるように、「心臓同種移植片血管障害（ＣＡＶ）」という語句は、同種移植片又は心臓などの固形臓器移植の血管合併症を指し、移植された心臓に供給する血管が徐々に狭小化し、その血流を制限し、その後、心筋の障害又は突然死につながる。ＣＡＶの診断は、疾患の早期徴候についての心臓などの移植された臓器の定期的なフォローアップ及びモニタリングによる。これには、冠動脈造影及び血管内超音波を含む侵襲的診断、並びにドブタミン負荷心エコー検査、陽電子放出断層撮影、コンピュータ断層撮影血管造影（ＣＴ血管造影）、及びＣ反応性タンパク質、血清脳性ナトリウム利尿ペプチド、トロポニン、及び血清ｍｉｃｒｏＲＮＡ ６２８－５ｐなどの様々なバイオマーカーの値を含む非侵襲的調査が含まれる。
本明細書で定義されるように、「同種移植片」は、ドナーから同じ種のレシピエントへの臓器又は組織の移植を指す。同種移植片は、死体ドナー、生体血縁ドナー、及び生体非血縁ドナーからのものを含む、多くのヒト臓器及び組織移植からなる。
本明細書で定義されるように、「固形臓器同種移植片」は、固形臓器の同種移植片を指す。「固形臓器」は、安定した組織の一貫性を有し、中空（消化管の臓器など）でも液体（血液など）でもない内臓である。固形臓器には、腎臓、肝臓、角膜、腸、心臓、肺、及び膵臓が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で定義されるように、「移植片拒絶」又は「移植拒絶」という語句は、移植された臓器又は組織がレシピエントの免疫系によって拒絶され、それにより同種移植片が破壊され、移植された組織血管の線維症を介して移植された臓器における長期的な機能の喪失をもたらす状態を指す。
本明細書で定義されるように、「同種移植片の生存を延長させる」という語句は、レシピエント免疫系による移植されたドナー臓器又は組織の拒絶の防止、及び移植された臓器の寿命の改善を指す。同種移植片の生存は、治療なしの同種移植片の生存と比較して、少なくとも１２か月、１８か月、２年、３年、４年、５年、８年、１０年、又はそれ以上延長し得る。
本明細書で定義されるように、「心臓同種移植片」という語句は、レシピエントに移植されたドナー心臓を含む固形臓器移植、又はレシピエントの心臓への１つ以上のドナー動脈若しくは静脈の移植を指す。心臓同種移植片における移植片拒絶は一般に、心内膜心筋生検を行うことによって診断される。
本明細書で定義されるように、「腎臓同種移植片」という語句は、レシピエントに移植されたドナー腎臓を含む固形臓器移植、又はレシピエントの腎臓への１つ以上のドナー動脈若しくは静脈の移植を指す。腎臓同種移植片における移植片拒絶は一般に、総タンパク質対クレアチニン比、アルブミン対クレアチニン比、血清クレアチニン値、及び糸球体濾過量などの尿タンパク質値をモニタリングすることによって診断される。
本明細書で定義されるように、「肝臓同種移植片」という語句は、レシピエントに移植されたドナー肝臓を含む固形臓器移植、又はレシピエントの肝臓への１つ以上のドナー動脈若しくは静脈の移植を指す。肝臓同種移植片における移植片拒絶は、トランスアミナーゼ、ビリルビン、及びアルカリホスファターゼ値をモニタリングすることによって診断される。
本明細書で定義されるように、「肺同種移植片」という語句は、レシピエントに移植されたドナー肺を含む固形臓器移植、又はレシピエントの肺への１つ以上のドナー動脈若しくは静脈の移植を指すことを指す。肺同種移植片における移植片拒絶は、経気管支生検を用いた気管支鏡検査及び肺機能検査によって診断される。
本明細書で定義されるように、「同種移植された血管」又は「同種移植された血管系」という語句は、動脈、静脈、毛細血管、及び／又は細動脈などの１つ以上のドナー血管のレシピエントへの移植を指す。
本明細書に定義されるように、「同種移植された動脈」という語句は、１つ以上のドナー動脈のレシピエントへの移植を指す。
本明細書に定義されるように、「同種移植された静脈」という語句は、１つ以上のドナー静脈のレシピエントへの移植を指す。
本明細書で定義されるように、「心内膜心筋生検」という語句は、診断、治療、及び研究目的のために少量の心筋組織を経皮的に取得する手順を指す。これは主に、（１）心筋拒絶について移植された心臓を観察する、（２）特定の炎症性、浸潤性、又は家族性心筋障害を診断する、及び（３）未知の心筋量をサンプリングするために使用される。
本明細書に定義されるように、「経気管支肺生検」という用語は、内視鏡的に誘導された鉗子によって取得された肺からの生検を指し、これは、気管支血管束に沿って、かつ中央肺領域内に分布する移植の病変の評価に有用である。
本明細書で定義されるように、「手術」という語句は、メス切開又は高周波アブレーション又は冷凍アブレーション又はレーザーアブレーションによって組織損傷をもたらす血管介入を伴う、侵襲的医療処置を指す。
本明細書で定義されるように、「組織損傷」という語句は、ステント留置又は血管形成術などの経皮的血管介入後に再狭窄をもたらす動脈壁の肥厚及び動脈内腔空間の減少を最終的にもたらす、血管平滑筋の増殖又は増殖及び移動の発生を指す。
本明細書で定義されるように、語句「ＮＰＰ１が欠乏している」又は「ＥＮＰＰ１欠乏」は、ＮＰＰ１タンパク質の正常な血清レベル又はＮＰＰ１の正常な活性に対するＮＰＰ１タンパク質の量又はＮＰＰ１活性の減少を指し、そのような低減は、病理学的石灰化及び／又は病理学的骨化の疾患若しくは障害をもたらす。そのような病理学的疾患は、ＧＡＣＩ及びＡＲＨＲ２を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合のＥＮＰＰ１欠乏は、病理学的石灰化及び／又は病理学的骨化の疾患若しくは障害をもたらさない、ＮＰＰ１タンパク質の量及び／又はＮＰＰ１活性のわずかな低減を指さない。
本明細書で定義されるように、「再狭窄」という語句は、狭窄の再発を指す。狭窄は、制限された血流をもたらす、血管の狭小化を指す。再狭窄は通常、狭小化し、閉塞を除去する治療を受けており、後に再狭小化する、動脈又は他の大血管に関連する。再狭窄は、超音波、Ｘ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、核撮像、光学的撮像若しくは造影画像、又は免疫組織化学的検出のうちの１つ以上を使用することによって一般的に検出される。本明細書で定義されるように、「筋内膜増殖」という語句は、個体の動脈壁の内膜で生じる血管平滑筋細胞の増殖を指す。
本明細書で使用される場合、「筋内膜の増殖を低減又は予防する」という語句は、組織損傷部位での増殖血管平滑筋細胞のレベルを低減して、それによって動脈壁の肥厚を低減し、動脈の再狭窄の発生を予防するか、又はそのレベルを低減する、投与時の可溶性ＮＰＰ１の能力を指す。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」という用語は、患者への可溶性ＮＰＰ１（単独又は別の医薬品と組み合わせた）の適用若しくは投与、又は疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状、又は疾患若しくは障害を発症する可能性を有する患者からの（例えば、診断又はエクスビボ適用のための）単離された組織若しくは細胞株への治療剤の適用若しくは投与として定義され、疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状、又は疾患若しくは障害を発症する可能性を治す、治癒する、軽減する、緩和する、改変する、是正する、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、改善する（ｉｍｐｒｏｖｅ）、又はそれに影響を及ぼす目的を伴う。そのような治療は、薬理ゲノミクスの分野から得られた知識に基づいて、特異的に調整又は修正され得る。
本明細書で使用される場合、「予防する」若しくは「予防」又は「低減する」という用語は、何も生じなかった場合に障害若しくは疾患の発生がないこと、又は障害若しくは疾患の発症が既にあった場合に更なる障害若しくは疾患の発生がないことを意味する。また、障害又は疾患に関連する症状のうちのいくつか又は全てを予防する能力も考慮される。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、そのような量を受けていない対応する対象と比較して、状態、障害、疾患の改善を提供するか、又は状態、障害、若しくは疾患の進行若しくは進展の減少を提供するために十分な薬剤（例えば、ＮＰＰｌ融合又はＮＰＰ３融合ポリペプチド）の量を指す。有効量はまた、状態、疾患、又は障害を治療、治癒、予防、又は改善することをもたらし得る。この用語はまた、正常な生理学的機能を強化するのに有効な量もその範囲内に含む。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基、関連する天然発生型構造バリアント、及びペプチド結合を介して連結されたその合成非天然発生型類似体から構成されるポリマーを指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、天然状態から改変又は除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸又はポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はポリペプチドは、「単離されて」いる。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができるか、又は例えば、宿主細胞などの非天然環境中に存在することができる。
本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」は、他の構成成分を本質的に含まないことを指す。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは、通常その天然発生型状態で会合している他の構成成分から分離されているポリペプチドである。非限定的な実施形態には、９５％の純度、９９％の純度、９９．５％の純度、９９．９％の純度、及び１００％の純度が含まれる。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも２個、ある特定の実施形態では、少なくとも８、１５、又は２５個のヌクレオチドの長さの範囲の核酸であるが、最大５０、１００、１０００、若しくは５０００個のヌクレオチドの長さ、又はポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物であり得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」又は「組成物」という用語は、薬学的に許容される担体との本開示内で有用な少なくとも１つの化合物の混合物を指す。薬学的組成物は、患者への化合物の投与を容易にする。これらに限定されないが、皮下、静脈内、経口、エアロゾル、吸入、直腸、膣、経皮、鼻腔内、頬側、舌下、非経口、髄腔内、胃内、眼、肺、及び局所投与を含む、化合物を投与する複数の技術が、当該技術分野に存在する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性又は特性を破壊せず、比較的非毒性である、担体又は希釈剤などの材料を指し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又は含まれる組成物の構成成分のうちのいずれか、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と有害な様式で相互作用することなく、個体に投与され得る。
本明細書で使用される場合、「病理学的石灰化」という用語は、軟部組織、分泌物、及び排泄経路におけるカルシウム塩の異常な沈着を指し、それが硬化する原因となる。２つの種類があり、それは、細胞及び組織の恒常性能力を超える、死滅する組織及び死滅した組織で生じる異栄養性石灰化と、カルシウムの細胞外レベルを上昇させた転移性石灰化（高カルシウム血症）である。石灰化には、細胞、並びに基底膜のコラーゲン及び動脈壁の弾性線維などの細胞外マトリックス成分も関与し得る。石灰化しやすい組織のいくつかの例としては、以下が挙げられる：胃粘膜－胃の内部上皮内層、腎臓及び肺、角膜、心臓弁、全身動脈、並びに肺静脈。
本明細書で使用される場合、「病理学的骨化」という用語は、骨系にない組織、及び通常は骨形成特性を現わさない結合組織において骨が発生する、病理学的状態を指す。骨化は、罹患している組織の性質に応じて３つの種類に分類され、軟骨内骨化は、軟骨内で生じ、かつ軟骨に置き換わる骨化である。膜内骨化は、結合組織で生じ、かつ結合組織に置き換わる骨化である。変形骨化は、通常軟質の身体構造における骨質物質の発生であり、異所性骨化とも呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「石灰化の低減」は、Ｘ線、マイクロＣＴ、及びＭＲＩのような非侵襲的方法を使用することにより観察される。９９ｍＴｃ－ピロホスファート（９９ｍＰＹＰ）取り込みを用いる無線撮像を使用することによって、石灰化の低減も推測される。マウスにおける石灰化の存在は、Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．によって確立されたプロトコル（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ ６，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１０００６（２０１５））に従うことによって、マイクロコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、並びにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ及びＥ）並びにアリザリンレッドなどの染料を使用した心臓、大動脈、及び腎臓から採取された組織学的切片による検死を介して評価される。
本明細書で使用される場合、「異所性石灰化」という用語は、組織におけるカルシウム塩の病理学的沈着、又は軟部組織における骨成長によって特徴付けられる状態を指す。
本明細書で使用される場合、「軟部組織の異所性石灰化」という用語は、典型的には、軟部組織の硬化の喪失につながる、軟部組織で生じるリン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、シュウ酸カルシウム、及びリン酸八カルシウムからなる不適切な生体石灰化を指す。「動脈石灰化」は、動脈の硬化及び／又は狭小化につながる、動脈及び心臓弁に生じる異所性石灰化を指す。動脈の石灰化は、アテローム性プラークの負荷、並びに心筋梗塞のリスクの増加、末梢血管疾患における虚血性エピソードの増加、及び血管形成術後の解離のリスクの増加と相関する。
本明細書で使用される場合、「静脈石灰化」という用語は、静脈の弾性を低減し、かつ血流を制限し、次いで、血圧及び冠動脈欠損の増加につながり得る、静脈に生じる異所性石灰化を指す。
本明細書で使用される場合、「血管石灰化」という用語は、血管系におけるミネラルの病理学的沈着を指す。これは、内膜石灰化及び中膜石灰化を含む様々な形態を有するが、心臓の弁にも見出され得る。血管石灰化は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、ある特定の遺伝状態、及び腎臓疾患、特にＣＫＤと関連している。血管石灰化を有する患者は、有害な心血管事象のリスクがより高い。血管石灰化は、多種多様な患者に影響を与える。特発性乳児動脈石灰化は、新生児の動脈が石灰化する、まれな形態の血管石灰化である。
「アデノ随伴ウイルスベクター」、「ＡＡＶベクター」、「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」「ＡＡＶウイルス粒子」及び「ＡＡＶ粒子」という用語は、本明細書で同義的に使用される場合、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは、特定のＡＡＶ血清型の全カプシドタンパク質による）と、カプシド形成された組換えウイルスゲノムとからなるウイルス粒子を指す。粒子は、ヒトＥＮＰＰ１若しくはヒトＥＮＰＰ３又はその機能的等価バリアント）をコードする配列、及びＡＡＶ逆位末端反復に隣接したプロモーターを少なくとも含む転写調節領域を含む異種ポリヌクレオチドを有する組換えウイルスゲノムを含む。粒子は、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」又は「ＡＡＶベクター」と称される。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、すなわち、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る円形二重鎖ＤＮＡループである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり、追加のヌクレオチド配列は、ウイルスゲノム内にライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、導入される宿主細胞（例えば、複製の細菌起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）において、自律複製することができる。他の実施形態では、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノム内に統合されることによって、宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある特定のベクター（発現ベクター）は、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。
本明細書で使用される場合、「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、本明細書で使用される場合、外因性核酸及び／又は組換えベクターが導入されている細胞を意味する。「組換え宿主細胞」及び「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も意味することが理解されるべきである。変異又は環境の影響のいずれかに起因して、ある特定の修飾が後続する世代で生じ得るため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書で使用されるように、依然として「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
本明細書で使用される場合、「組換えウイルスゲノム」という用語は、少なくとも１つの外来性発現カセットポリヌクレオチドが天然発生型ＡＡＶゲノムに挿入されるＡＡＶゲノムを指す。本開示によるＡＡＶのゲノムは、典型的には、シス作用５’及び３’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）及び発現カセットを含む。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、標的細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え又は合成で生成された核酸構築物を指す。本開示によるＡＡＶベクターの組換えウイルスゲノムの発現カセットは、ＥＮＰＰ１若しくはＥＮＰＰ３又はその機能的等価バリアントをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節領域を含む。
本明細書で使用される場合、「転写調節領域」という用語は、１つ以上の遺伝子の発現を調節することができる核酸断片を指す。本開示による転写制御領域は、プロモーター、及び任意選択的にエンハンサーを含む。
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の上流に位置する、１つ以上のポリヌクレオチドの転写を制御する働きをする核酸断片を指し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、並びにこれらに限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー、及び活性化因子タンパク質結合部位を含む任意の他のＤＮＡ配列、並びに当該技術分野で既知のヌクレオチドの任意の他の配列の存在によって構造的に識別され、プロモーターからの転写量を調節するために直接的又は間接的に作用する。誘導性プロモーター、構成的プロモーター、及び組織特異的プロモーターを含む任意の種類のプロモーターが、本開示で使用され得る。
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、転写因子が結合して遺伝子転写を増加させるＤＮＡ配列エレメントを指す。エンハンサーの例としては、制限されるものではないが、ＲＳＶエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ＨＣＲエンハンサーなどが挙げられる。別の実施形態では、エンハンサーは、肝臓特異的エンハンサー、より好ましくは肝臓制御領域エンハンサー（ＨＣＲ）である。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、目的のポリヌクレオチドに関するプロモーター配列の機能的関係及び位置を指す（例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される）。概して、作動可能に連結されたプロモーターは、目的の配列に連続している。しかしながら、エンハンサーは、その発現を制御するために、目的の配列に連続する必要はない。別の実施形態では、プロモーター、及びＥＮＰＰ１若しくはＥＮＰＰ３、又はその機能的等価バリアントをコードするヌクレオチド配列。
「有効量」という用語は、非毒性であるが、所望の生物学的結果を提供するために十分な量のＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３をコードするウイルスベクターを指す。その結果は、疾患の兆候、症状、若しくは原因の低減及び／又は軽減、又は生物学的系の任意の他の所望の改変であり得る。
本明細書で使用される場合、「Ｃａｐタンパク質」という用語は、天然ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。Ｃａｐタンパク質の機能的活性の例としては、カプシドの形成を誘導する、一本鎖ＤＮＡの蓄積を促進する、カプシドへのＡＡＶ ＤＮＡパッケージングを促進する（すなわち、カプシド形成）、細胞受容体に結合する、及びビリオンの宿主細胞への侵入を促進する能力が挙げられる。原則的に、任意のＣａｐタンパク質を本開示の状況で使用することができる。
本明細書で使用される場合、「カプシド」という用語は、ウイルスゲノムがパッケージングされる構造を指す。カプシドは、タンパク質から作製されたいくつかのオリゴマー構造サブユニットからなる。例えば、ＡＡＶは、３つのカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の相互作用によって形成される正二十面体型カプシドを有する。
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐタンパク質」という用語は、天然ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。Ｒｅｐタンパク質の「機能的活性」は、認識、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起源の結合及びニッキング、並びにＤＮＡヘリカーゼ活性を介してＤＮＡの複製を促進することを含む、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性である。
本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルスＩＴＲ」又は「ＡＡＶ ＩＴＲ」という用語は、アデノ随伴ウイルスのゲノムのＤＮＡ鎖の両端に存在する逆位末端反復を指す。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要とされる。これらの配列の別の特性は、ヘアピンを形成するそれらの能力である。この特性は、第２のＤＮＡ鎖のプリマーゼ非依存性合成を可能にするその自己プライミングに寄与する。これらのＩＴＲ配列を修飾するための手順は、当該技術分野で既知である（Ｂｒｏｗｎ Ｔ，“Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＧＢ，１９９５、Ｗａｔｓｏｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，２ｎｄ Ｅｄ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳ，１９９２、Ａｌｂｅｒｔｓ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ”，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳ，２００８、Ｉｎｎｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳ，１９９０、及びＳｃｈｌｅｅｆ Ｍ，Ｅｄ．，“Ｐｌａｓｍｉｄ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ”，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｄｅｌ．，２００１）。
「組織特異的」プロモーターという用語は、特定の種類の分化細胞又は組織でのみ活性である。典型的には、組織特異的プロモーター中の下流遺伝子は、他のどのプロモーターよりも特異的である組織においてはるかに高い程度に活性であるものである。この場合、特異的である組織以外の任意の組織において、プロモーターの活性がほとんど又は実質的にない場合がある。
本明細書で使用される場合、「誘導性プロモーター」という用語は、例えば、化学誘導剤の適用によって、生理学的又は発生学的に制御されるプロモーターを指す。例えば、それは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ミフェプリストン（ＲＵ－４８６）誘導性プロモーターなどであり得る。
本明細書で使用される場合、「構成的プロモーター」という用語は、その活性が、生物の全ての細胞において、又はほとんどの発達段階の間に、細胞環境条件をほとんど又は全く考慮せずに、比較的一定のレベルで維持されるプロモーターを指す。別の実施形態では、転写調節領域は、ＥＮＰＰ１の構成的発現を可能にする。構成的プロモーターの例としては、限定されるものでないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを含む）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１ａプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９８５；４１：５２１－５３０）。
本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化シグナル」という用語は、ｍＲＮＡの３’末端へのポリアデニンストレッチの結合を媒介する核酸配列に関する。好適なポリアデニル化シグナルには、限定されるものではないが、ＳＶ４０早期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５ ＥＩｂポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ヒトバリアント成長ホルモンポリアデニル化シグナルなどが含まれる。
本明細書で使用される場合、「シグナルペプチド」という用語は、タンパク質翻訳中に目的の新生タンパク質のアミノ末端で結合されたアミノ酸残基（１０～３０残基の長さの範囲）の配列を指す。シグナルペプチドは、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）によって認識され、小胞体での輸送後にシグナルペプチダーゼによって切断される。（Ｌｏｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」又は「免疫反応」という用語は、侵入（感染）病原性生物における抗原、又は外来タンパク質の導入若しくは発現に対する宿主の免疫系を指す。免疫応答は、概して、液性かつ局所的であり、Ｂ細胞によって産生される抗体は、抗原－抗体複合体中の抗原と組み合わさって、抗原を不活化又は中和する。ヒトタンパク質をマウスモデル系に注射すると、免疫応答が観察されることが多い。一般的に、マウスモデル系は、外来抗原の導入前に免疫抑制薬を注射して、より良好な生存率を確実にすることにより、免疫寛容になる。
本明細書で使用される場合、「免疫抑制」という用語は、外来タンパク質、臓器移植、骨髄及び組織移植などの外来抗原に対する免疫寛容を促進するために免疫抑制薬を使用する、宿主免疫系の活性化又は有効性の意図的な低減である。免疫抑制薬の非限定的な例としては、抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）抗体、シクロホスファミド、アザチオプリン（イムラン）、ミコフェノール酸モフェチル（セルセプト）、シクロスポリン（ネオーラル、サンディミュン、ゲングラフ）、メトトレキサート（リウマトレックス）、レフルノミド（アラバ）、シクロホスファミド（シトキサン）、及びクロラムブシル（ロイケラン）が挙げられる。
範囲：本開示の全体を通して、本開示の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式の記載は、単に利便性及び簡潔性のためであり、本開示の範囲に対する非柔軟な制限として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の説明は、その範囲内の全ての可能な部分範囲並びに個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など、並びにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６など、具体的に開示された部分範囲を有するとみなされるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
治療方法
本開示は、対象にｓＮＰＰ１及びｓＮＰＰ３ポリペプチド並びにその融合タンパク質を投与することを含む、ＰＡＤを治療するためのＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３薬剤の投与、及びそのようなポリペプチドをコードする核酸の投与に関する。そのようなポリペプチドの配列には、限定されるものではないが、以下が含まれる。
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ＥＮＰＰ１及びＥＮＰＰ３融合ポリペプチドのクローニング及び発現
ＥＮＰＰ１、又はＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＵＳ２０１５／０３５９８５８Ａｌに記載されるように調製され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＥＮＰＰ１は、別個の膜内ドメインを有する細胞表面に局在化された膜貫通タンパク質である。ＥＮＰＰ１を可溶性細胞外タンパク質として発現させるために、ＥＮＰＰ１の膜貫通ドメインを、ＥＮＰＰ２の膜貫通ドメイン、又はアズロシジンなどのシグナルペプチド配列と交換してもよく、それはバキュロウイルス培養物の細胞外液中に可溶性の組換えＥＮＰＰ１の蓄積をもたらす。イムノグロブリンカッパ及びラムダ軽鎖タンパク質のシグナル配列などであるがこれに限定されない、分泌のためにＥＮＰＰ１の細胞外ドメインを標的とするための任意の他の既知のタンパク質のシグナル配列が使用され得る。更に、本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドに限定されると解釈されるべきではないが、ＥＮＰＰ１細胞外ドメインの任意の酵素的に活性な切断を含むポリペプチドも含む。
ＥＮＰＰ１は、膜貫通ドメインを省略することによって可溶性にされる。ヒトＥＮＰＰ１（配列番号１）は、その膜貫通領域（例えば、残基７７～９８）を、ヒトＥＮＰＰ２（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ ００１１２４３３ ５、例えば、残基１２～３０）又はアズロシジンシグナル配列（配列番号４２）の対応するサブドメインで置き換えることによって、可溶性の組換えタンパク質を発現するように修飾された。
修飾されたＥＮＰＰ１配列は、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位、続いて、Ｃ末端９－Ｆ ｌＩＳタグを保有する修飾ｐＦａｓｔｂａｃ ＦＩＴベクターにクローニングされ、昆虫細胞においてクローニング及び発現され、両方のタンパク質は、以前に記載されたようにバキュロウイルス系で発現され（Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｂｌｏｏｄ １２０：４４３２－４４４０、Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８：９９４－１００４、Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７：３３５２－３３６２）、細胞外液中に可溶性の組換えタンパク質の蓄積をもたらす。
ＥＮＰＰ３は、細胞表面へ乏しく輸出される。可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、ＥＮＰＰ３のシグナル配列を、他のＥＮＰＰ若しくはアズロシジンの天然シグナル配列又は好適なシグナル配列と置き換えることによって構築される。ＥＮＰＰ３融合構築物のいくつかの例は、ＷＯ２０１７／０８７９３６に開示されている。可溶性ＥＮＰＰ３構築物は、これらに限定されないが、ＥＮＰＰ７及び／又はＥＮＰＰ５などの他のＥＮＰＰ酵素のシグナル輸出シグナル配列を使用することによって調製される。可溶性ＥＮＰＰ３構築物は、ＥＮＰＰ１及びＥＮＰＰ２のシグナル配列の組み合わせ（以下、「ＥＮＰＰ１－２－１」又は「ＥＮＰＰ１２１」）からなるシグナル配列を使用して調製される。イムノグロブリンカッパ及びラムダ軽鎖タンパク質のシグナル配列などであるがこれに限定されない、分泌のためにＥＮＰＰ３の細胞外ドメインを標的とするための任意の他の既知のタンパク質のシグナル配列が使用され得る。更に、本開示は、本明細書に記載される構築物に限定されると解釈されるべきではないが、ＥＮＰＰ３細胞外ドメインの任意の酵素的に活性な切断を含む構築物も含む。
ある特定の実施形態では、ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、可溶性である。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＥＮＰＰ３膜貫通ドメインを欠くＥＮＰＰ３ポリペプチドを含む。別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＥＮＰＰ３ポリペプチドを含み、ＥＮＰＰ３膜貫通ドメインは、除去され、非限定的な例として、ＥＮＰＰ２、ＥＮＰＰＳ、若しくはＥＮＰＰ７又はアズロシジンシグナル配列などの別のポリペプチドの膜貫通ドメインで置き換えられている。
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のポリペプチドは、アルブミンドメインを含む。他の実施形態では、アルブミンドメインは、ＥＮＰＰ３ポリペプチドのＣ末端領域に位置する。更に他の実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃドメインは、ＥＮＰＰ３ポリペプチドのＣ末端領域に位置する。更に他の実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃドメイン又はアルブミンドメインの存在は、半減期、可溶性を改善し、免疫原性を低減し、ＥＮＰＰ３ポリペプチドの活性を増加させる。
ある特定の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＥＮＰＰ３ポリペプチドの前駆体の分泌をもたらすシグナルペプチドを含み、これは、ＥＮＰＰ３ポリペプチドをもたらすタンパク質分解プロセシングを経る。他の実施形態では、シグナルペプチドは、ＥＮＰＰ２、ＥＮＰＰ５、及びＥＮＰＰ７のシグナルペプチドからなる群から選択される。更に他の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３６～４２からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃドメイン又はアルブミンドメインは、リンカー領域によってＥＮＰＰ３ポリペプチドのＣ末端領域に接続される。他の実施形態では、リンカーは、配列番号４３～７５から選択され、ｎは、１～２０の範囲の整数である。
ＥＮＰＰ１及びＥＮＰＰ３融合ポリペプチドの産生及び精製
インビトロ使用のための可溶性の組換えＥＮＰＰ１ポリペプチドを産生するために、ＥＮＰＰ１（ヒトＮＰＰ１（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９））の細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＩｇＧのＦｃドメインに融合され（「ＥＮＰＰ１－Ｆｃ」と称される）、安定したＣＨＯ細胞株で発現された。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９の残基９６～９２５をコードするＥＮＰＰ１ポリヌクレオチドは、Ｆｃドメインに融合され、ＥＮＰＰ１ポリペプチドを生成した。
代替的に、ＥＮＰＰ１ポリペプチドはまた、好適なベクターを使用して、ＨＥＫ２９３細胞、バキュロウイルス昆虫細胞系、又はＣＨＯ細胞若しくは酵母ピキア発現系から発現され得る。ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、接着細胞又は懸濁細胞のいずれかで産生され得る。好ましくは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞で発現される。安定した細胞株を確立するために、ＥＮＰＰ１構築物をコードする核酸配列は、大規模なタンパク質産生のための適切なベクターにクローニングされる。
ＥＮＰＰ３は、ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３哺乳動物細胞のいずれかに安定したトランスフェクションを確立することによって産生される。ＥＮＰＰ３をコードするＥＮＰＰ３ポリヌクレオチド（ヒトＮＰＰ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｏ１４６３８．２）は、ＩｇＧのＦｃドメインに融合され（「ＥＮＰＰ３－Ｆｃ」と称される）、安定したＣＨＯ細胞株で発現された。いくつかの実施形態では、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｏ１４６３８．２の残基４９～８７５をコードするＥＮＰＰ３ポリヌクレオチドは、Ｆｃドメインに融合されて、ＥＮＰＰ３ポリペプチドを生成した。ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、接着細胞又は懸濁細胞のいずれかで産生され得る。安定した細胞株を確立するために、大規模なタンパク質産生のための適切なベクターへの本開示のＮＰＰ３融合ポリペプチドをコードする核酸配列。市販の供給源から入手可能な様々なこれらのベクターがあり、それらのうちのいずれかを使用することができる。ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、ＷＯ２０１７／０８７９３６で確立されたプロトコルに従って産生され、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．６：１０００６で確立されたプロトコルに従って産生され、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３の所望のポリペプチド構築物を含む好適なプラスミドは、エレクトロポレーション又はリポフェクタミンなどの確立された技術を使用して、発現プラスミドに安定的にトランスフェクトされ得、細胞は、抗生物質選択下で増殖されて、安定的にトランスフェクトされた細胞に対して強化することができる。次いで、単一の安定的にトランスフェクトされた細胞のクローンが確立され、所望の融合タンパク質の高発現クローンについてスクリーニングされる。ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチド発現のための単一細胞クローンのスクリーニングは、以前に記載される合成酵素基質ｐＮＰ－ＴＭＰを使用して、９６ウェルプレートでハイスループット様式で達成され得る（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ，２００８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ．７（１０）：３３５２－６２、Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．６：１０００６）。
スクリーニングを介してＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ１ポリペプチドの高発現クローンが同定されると、ＥＮＰＰ１について以前に記載される振盪フラスコ又はバイオリアクターにおいてタンパク質産生を達成することができる（Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．６：１０００６）。ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ１ポリペプチドの精製は、当該技術分野で既知の標準的な精製技術の組み合わせを使用して達成することができる。これらの技術は、当該技術分野で周知であり、カラムクロマトグラフィー、超遠心分離、濾過、及び沈殿などの技術から選択される。カラムクロマトグラフィー精製は、プロテインＡ及びプロテインＧ樹脂などのアフィニティクロマトグラフィー、ニッケル又は銅などの金属アフィニティ樹脂、疎水性交換クロマトグラフィー、並びにＣ８－Ｃ１４樹脂を使用する逆相高圧クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して達成される。Ｑ－セファロース（アニオン交換）及びＳＰ－セファロース（カチオン交換）、青色セファロース樹脂及び青色セファデックス樹脂、並びにヒドロキシアパタイト樹脂などの市販の樹脂を使用するアニオン及びカチオン交換クロマトグラフィーなどのイオン交換も採用され得る。当該技術分野で既知であるように、市販のＳ－７５及びＳ２００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ樹脂を使用するサイズ排除クロマトグラフィーも採用され得る。タンパク質を可溶化して、上述のクロマトグラフィーステップ用の選択培地を提供するために使用される緩衝液は、当該技術分野の実践者及びタンパク質化学の科学に既知の標準的な生物学的緩衝液である。
調製に使用される緩衝液のいくつかの例としては、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、トリス（ヒドロキシメミル）アミノメタン、生理食塩水緩衝液、グリシン－ＨＣＬ緩衝液、カコジル酸緩衝液、及びバルビタールナトリウム緩衝液が挙げられ、これらは当該技術分野で周知である。単一の精製ステップの後、単一の技術、又は組み合わせの一連の技術、及び適切な緩衝系を用いて、クマシー染色されたポリアクリルアミドゲル上で、ＥＮＰＰ３及び粗出発物質を並行して精製した。次いで、ＥＮＰＰ３タンパク質は、加えて、上述の追加の技術及び／又はクロマトグラフィーステップを使用して精製され、適切なｐＨに調整された約９９％の純度などの実質的により高い純度に到達することができ、記載されるＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを、粗物質から９９％を超える純度まで精製することができる。
精製後、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ又はＥＮＰＰ３－Ｆｃを、５～７ｍｇ／ｍｌに濃縮されたＺｎ２＋及びＭｇ２＋（ＰＢＳｐｌｕｓ）を補充したＰＢＳに透析し、－８０℃で２００～５００μｌのアリコート中で凍結した。アリコートを、使用直前に解凍し、溶液の比活性を、ＰＢＳｐｌｕｓ中で希釈することによって３１．２５ａｕ／ｍｌ（又は調製物に応じて約０．７ｍｇ／ｍｌ）に調整した。
投与量及び投与方法
別の実施形態では、ｈｓＮＰＰ１又はｈｓＮＰＰ３は、それぞれ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇのＮＰＰ１又は約１．０ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇのＮＰＰ３を含む１つ以上の用量で投与される。別の実施形態では、ｈｓＮＰＰ１又はｈｓＮＰＰ３は、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１０．０ｍｇ／ｋｇのＮＰＰ１又は約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１０．０ｍｇ／ｋｇのＮＰＰ３を含む１つ以上の用量で投与される。
ｈｓＮＰＰ１又はｈｓＮＰＰ３の用量間の期間は、少なくとも２日であり、例えば、少なくとも３日、少なくとも１週間、２週間、又は１か月とより長くてもよい。一実施形態では、投与は、毎週、隔週、又は毎月である。
組換えｈｓＮＰＰ１又はｈｓＮＰＰ３は、静脈内、皮下、又は腹腔内など、任意の好適な方法で投与され得る。
組換えｈｓＮＰＰ１又はｈｓＮＰＰ３は、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与され得る。例示的な治療剤としては、ビスホスホネート、スタチン、フィブレート、ナイアシン、アスピリン、クロピドグレル、及びワーファリンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、組換えｈｓＮＰＰ１又はｈｓＮＰＰ３及び追加の治療剤は、別々に投与され、同時に又は逐次的に投与される。いくつかの実施形態では、組換えｈｓＮＰＰ１又はｈｓＮＰＰ３は、追加の治療剤の投与の前に投与される。いくつかの実施形態では、組換えｈｓＮＰＰ１又はｈｓＮＰＰ３は、追加の治療剤の投与の後に投与される。他の実施形態では、組換えｈｓＮＰＰ１又はｈｓＮＰＰ３及び追加の治療剤は、一緒に投与される。
核酸投与及び治療法
ＥＮＰＰ１及びＥＮＰＰ３のインビボ発現のためのウイルスベクター
本開示内で有用なポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で企図される疾患又は障害の治療のための遺伝子療法プロトコルで使用され得る。ポリペプチドをコードする改善された構築物は、目的の疾患又は障害を治療又は予防するために、適切な遺伝子療法ベクターに挿入され、患者に投与され得る。
ウイルスベクターなどのベクターは、先行技術において、多種多様な異なる標的細胞に遺伝子を導入するために使用されてきた。典型的には、ベクターは、所望のポリペプチド（例えば、受容体）の発現から有用な治療又は予防効果を提供するために十分な割合の細胞で形質転換が行われ得るように、標的細胞に曝露される。トランスフェクトされた核酸は、標的細胞の各々のゲノムに永久的に組み込まれ、長く続く効果を提供し得るか、又は代替的に、治療は、周期的に繰り返される必要あり得る。ある特定の実施形態では、（ウイルス）ベクターは、本開示のポリペプチドをコードする遺伝物質をインビボで肝細胞にトランスフェクトする。
様々なベクター、ウイルスベクター及びプラスミドベクターの両方が当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第５，２５２，４７９号及びＷＯ９３／０７２８２を参照されたい）。特に、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、ＨＳＶ及びＥＢＶを含むヘルペスウイルス、並びにレトロウイルスなどのパポバウイルスを含む、遺伝子導入ベクターとしていくつかのウイルスが使用されてきた。先行技術における多くの遺伝子療法プロトコルは、無効化されたネズミレトロウイルスを採用してきた。最近発行されたいくつかの特許は、遺伝子療法を行うための方法及び組成物を対象とする（例えば、米国特許第６，１６８，９１６号、同第６，１３５，９７６号、同第５，９６５，５４１号、及び同第６，１２９，７０５号を参照されたい）。前述の特許の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、ＮＰＰ１又はＮＰＰ３配列を含むポリヌクレオチドなどの遺伝物質は、ＶＳＭＣ増殖を治療するために哺乳動物に導入され得る。
ある特定の修飾ウイルスは、哺乳動物への投与後、ウイルスが細胞に感染し、コードされたタンパク質を発現するため、コード配列を担持するためのベクターとしてしばしば使用される。本開示による有用な修飾ウイルスは、例えば、以下：パルボウイルス、ピコルナウイルス、仮性狂犬病ウイルス、Ａ型、Ｂ型、又はＣ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（ポリオーマ及びＳＶ４０など）又はヘルペスウイルス（エプスタイン－バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、帯状疱疹及び単純ヘルペスウイルス１型及び２型）、ＲＮＡウイルス、又はモロニーマウス白血病ウイルス若しくはレンチウイルスなどのレトロウイルス（すなわち、ヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルスなど）を含むウイルスに由来する。本開示による有用なＤＮＡウイルスには、以下がある：アデノ随伴ウイルスアデノウイルス、アルファウイルス、及びレンチウイルス。
ウイルスベクターは、一般的に注射により投与され、最も頻繁には、静脈内（ＩＶ）で体に直接、又は特定の組織に直接投与され、そこでは個々の細胞によって取り込まれる。代替的に、ウイルスベクターは、エクスビボでウイルスベクターを患者の細胞の試料と接触させることによって投与されてもよく、それによってウイルスベクターが細胞を感染させることを可能にし、次いでベクターを含む細胞が患者に戻される。ウイルスベクターが送達されると、コード配列が発現され、機能性タンパク質がもたらされる。概して、ウイルスベクターによる細胞の感染及び形質導入は、ウイルスカプシドの標的細胞表面上の受容体との相互作用、エンドサイトーシスによる内在化、エンドサイトーシス／プロテアソーム区画を通した細胞内輸送、エンドソーム脱出、核輸入、ビリオン脱殻、並びに組換えコード配列対象の転写及び発現につながるウイルスＤＮＡ二重鎖変換という一連の連続的な事象によって生じる。（Ｃｏｌｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１７ Ｄｅｃ １；８：８７－１０４．）。
本開示によるアデノ随伴ウイルスベクター
ＡＡＶは、パルボウイルス科のデパノウイルス属に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベースの長さであり、ポジティブ又はネガティブセンスのいずれかであり得る直鎖一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆位末端反復（ＩＴＲ）、並びに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ及びｃａｐを含む。ｒｅｐフレームは、ＡＡＶライフサイクルに必要な非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする４つの重複遺伝子から作製されている。ｃａｐフレームは、構造ＶＰカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の重複ヌクレオチド配列を含み、それらは一緒に相互作用して、正二十面体型カプシドを形成する。
末端１４５ヌクレオチドは、自己相補的であり、Ｔ字形状のヘアピンを形成する、エネルギー的に安定した分子内二本鎖が形成され得るように組織化される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起源として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとしての役目を果たす。哺乳動物細胞における野生型ＡＡＶ感染に続いて、ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２）は、それぞれ、Ｐ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現され、両方のＲｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製において機能を有する。ｒｅｐ ＯＲＦにおけるスプライシング事象は、実際には４つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかしながら、哺乳動物細胞におけるＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードする非スプライシングｍＲＮＡは、ＡＡＶベクター生産に十分であることが示されている。また、昆虫細胞では、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質はＡＡＶベクター生産に十分である。
ＡＡＶは、ヘルパー依存性ウイルスであり、すなわち、機能的に完全なＡＡＶビリオンを形成するために、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス）との同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスとの同時感染がない場合、ＡＡＶは、ウイルスゲノムが宿主細胞染色体に挿入されるか、又はエピソーム形態で存在するが、感染性ビリオンは産生されない潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによるその後の感染は、統合されたゲノムを「救済する」ものであり、ウイルスカプシドに複製及びパッケージングされることを可能にし、それによって感染性ビリオンを再構成する。ＡＡＶは、異なる種由来の細胞に感染し得るが、ヘルパーウイルスは、宿主細胞と同じ種でなければならない。したがって、例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスに同時感染したイヌ細胞において複製される。
異種核酸配列を含む感染性組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生するために、好適な宿主細胞株は、異種核酸配列を含むがＡＡＶヘルパー機能遺伝子であるｒｅｐ及びｃａｐを欠いているＡＡＶベクターでトランスフェクトされ得る。次いで、ＡＡＶヘルパー機能遺伝子は、別個のベクター上に提供され得る。また、複製コンピテントヘルパーウイルス（アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアなど）を提供するのではなく、ＡＡＶ産生に必要なヘルパーウイルス遺伝子（すなわち、アクセサリー機能遺伝子）のみがベクター上に提供され得る。
集合的に、ＡＡＶヘルパー機能遺伝子（すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐ）及びアクセサリー機能遺伝子は、１つ以上のベクター上に提供され得る。ヘルパー及びアクセサリー機能遺伝子産物は、次いで、宿主細胞中で発現され、そこで異種核酸配列を含むｒＡＡＶベクター上でトランスに作用する。次いで、異種核酸配列を含むｒＡＡＶベクターは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶゲノムであるかのように複製及びパッケージングされ、組換えビリオンを形成する。患者の細胞が、得られたｒＡＡＶビリオンに感染すると、異種核酸配列が患者の細胞に侵入し、発現される。
患者の細胞は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにアクセサリー機能遺伝子を欠いているため、ｒＡＡＶは、それらのゲノムを更に複製及びパッケージングすることができない。更に、５つのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子源がなければ、ｗｔＡＡＶは、患者の細胞内に形成されることができない。
ＡＡＶベクターは、典型的にはｒｅｐ及びｃａｐフレームを欠いている。そのようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされている宿主細胞中に存在する場合、複製及び感染性ウイルス粒子中にパッケージングされてもよく、宿主細胞は、アデノウイルスオープンリーディングフレームＥ４ｏｒｆ６からタンパク質をコード及び発現するベクターでトランスフェクトされている。
哺乳動物の細胞への目的のタンパク質の送達は、まず、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含むＡＡＶベクターを生成し、次いで、ベクターを哺乳動物に投与することによって達成される。したがって、本開示は、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＡＡＶベクターを含むと解釈されるべきである。本開示を持ち合わせると、この／これらのポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＡＡＶベクターの生成は、当業者に明らかとなるであろう。
一実施形態では、本開示は、哺乳動物ＥＮＰＰ１又は哺乳動物ＥＮＰＰ３をコードする配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現ベクターに関し、哺乳動物に投与すると、ベクターは、細胞内のＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３前駆体を発現し、前駆体は、そのカルボキシ末端でＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３のアミノ末端に融合されたアズロシジンシグナルペプチドを含む。ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３前駆体は、ＩｇＧ Ｆｃ領域又はヒトアルブミンなどの安定化ドメインを含み得る。細胞から前駆体が分泌されると、シグナルペプチドは、切断され、酵素的に活性な可溶性哺乳動物ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３は、細胞外に提供される。
ＡＡＶ発現ベクターは、アズロシジンシグナルペプチド配列及びエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ（ＥＮＰＰ１）ポリペプチド配列を含むポリペプチドをコードする組換え核酸配列に作動可能に連結された転写調節領域を含むヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節領域を含む発現カセットを含み得る。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、プロモーター及びエンハンサー、コザック配列ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ、哺乳動物ＮＰＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列又は哺乳動物ＮＰＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列、他の好適な調節エレメント、並びにポリアデニル化シグナルを含む。
いくつかの実施形態では、本開示によるＡＡＶベクターのＡＡＶ組換えゲノムは、ｒｅｐオープンリーディングフレーム及び／又はｃａｐオープンリーディングフレームを欠く。
本開示によるＡＡＶベクターは、任意の血清型に由来するカプシドを含む。一般に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで顕著な相同性のゲノム配列を有し、同一の遺伝的機能のセットを提供し、実質的に同一の機序を介して複製及びアセンブリする。特に、本開示のＡＡＶは、ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（タイプ３Ａ及び３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、又はヒツジＡＡＶの血清型１に属し得る。
異なるＡＡＶ血清型のゲノムの配列の例は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースで見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ７）、ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ８）、ＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）、及びＡＸ７５３３６２．１（ＡＡＶ１０）。
いくつかの実施形態では、本開示によるアデノ関連ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群から選択される血清型に由来するカプシドを含む。別の実施形態では、ＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ８である。ウイルスベクターがカプシドタンパク質をコードする配列を含む場合、これらは、ＡＡＶを１つ若しくは複数の特定の細胞型に配向するために、又は標的ベクターの細胞への送達の効率を増加させるために、又はＡＡＶの精製若しくは検出を促進するために、又は宿主応答を低減するために、外因性配列を含むように修飾され得る。
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクターは、いくつかの必須ＤＮＡエレメントを含む。ある特定の実施形態では、これらのＤＮＡエレメントは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列の少なくとも２つのコピー、プロモーター／エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、目的のタンパク質をコードするＤＮＡに隣接する任意の必要な５’若しくは３’非翻訳領域、又はその生物学的に活性な断片を含む。本開示のｒＡＡＶベクターはまた、目的のタンパク質のイントロンの一部を含み得る。また、任意選択的に、本開示のｒＡＡＶベクターは、目的の変異ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
ある特定の実施形態では、ベクターは、多くの異なる細胞型において異種遺伝子の発現を高レベルに駆動することができる無差別的なプロモーターを含む、プロモーター／調節配列を含む。そのようなプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルスプロモーター／エンハンサー配列などが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクター中のプロモーター／調節配列は、ＣＭＶ即時早期プロモーター／エンハンサーである。しかしながら、異種遺伝子の発現を駆動するために使用されるプロモーター配列は、例えば、これらに限定されないが、ステロイド誘導性プロモーターを含む誘導性プロモーターであり得るか、又はこれらに限定されないが、筋組織特異的である骨格ａ－アクチンプロモーター及び筋クレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサーなどの組織特異的プロモーターであり得る。
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクターは、転写終結シグナルを含む。任意の転写終結シグナルが、本開示のベクターに含まれ得る一方で、ある特定の実施形態では、転写終結シグナルは、ＳＶ４０転写終結シグナルである。
ある特定の実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクターは、目的のポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ５、又は目的のポリペプチドの生物学的に活性な断片を含む。本開示は、既知又は未知のいずれかの目的のポリペプチドの任意の哺乳動物配列を含むと解釈されるべきである。したがって、本開示は、ポリペプチドがヒトポリペプチドと実質的に同様の様式で機能する、ヒト以外の哺乳動物由来の遺伝子を含むと解釈されるべきである。好ましくは、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列は、目的のポリペプチドをコードする遺伝子に対して、約５０％相同、より好ましくは約７０％相同、更により好ましくは約８０％相同、及び最も好ましくは約９０％相同である。
更に、本開示は、野生型タンパク質配列の天然発生型バリアント又は組換え由来変異体を含むと解釈されるべきであり、そのバリアント又は変異体は、それによりコードされるポリペプチドを、本開示の遺伝子療法方法において完全長ポリペプチドとして治療的に有効であるか、又は完全長ポリペプチドよりも更に治療的に有効であるようにさせる。
本開示はまた、ポリペプチドの生物学的活性を保持するバリアントをコードするＤＮＡを含むと解釈されるべきである。そのようなバリアントには、組換えＤＮＡ技術を使用して修飾された、又は修飾され得るタンパク質又はポリペプチドが含まれ、その結果、タンパク質又はポリペプチドは、本明細書に記載される方法における使用のためのその適合性を強化する追加の特性、例えば、これらに限定されないが、血漿中のタンパク質に対する安定性の強化及びタンパク質の比活性の強化をもたらすバリアントを有する。類似体は、保存的アミノ酸配列の違いによって、又は配列に影響を与えない修飾によって、又はその両方によって、天然発生型タンパク質又はペプチドとは異なり得る。例えば、保存的アミノ酸変化がなされてもよく、それらはタンパク質又はペプチドの一次配列を改変するが、通常、その機能を改変しない。
本開示は、実験的実施例に例示される特定のｒＡＡＶベクターに限定されず、むしろ、本開示は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、及びＡＡＶ－６などに基づくベクターを含むがこれに限定されない、任意の好適なＡＡＶベクターを含むと解釈されるべきである。また、本開示には、治療効果を提供するために有効な量で、疾患又は障害を有する哺乳動物を治療する方法も含まれる。
方法は、目的のポリペプチドをコードするｒＡＡＶベクターを哺乳動物に投与することを含む。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。典型的には、単回注射で投与されるウイルスベクターゲノム／哺乳動物の数は、約１×１０８～約５×１０１６の範囲である。好ましくは、単回注射で投与されるウイルスベクターゲノム／哺乳動物の数は、約ｌ×１０１０～約ｌ×１０１５であり、より好ましくは、単回注射で投与されるウイルスベクターゲノム／哺乳動物の数は、約５×１０１０～約５×１０１５であり、最も好ましくは、単回注射で哺乳動物に投与されるウイルスベクターゲノムの数は、約５×１０１０～約５×１０１４である。
本開示の方法が、複数部位の同時注射、又は数時間（例えば、約１時間未満～約２時間又は約３時間）の期間にわたる異なる部位への注射を含む数回の複数部位の注射を含む場合、投与されるウイルスベクターゲノムの総数は、同一であってもよく、又はその分数若しくはその倍数、１５～単一部位注射法に列挙されるものであってもよい。
単一部位注射における本開示のｒＡＡＶベクターの投与について、ある特定の実施形態では、ウイルスを含む組成物は、対象の器官（これらに限定されないが、対象の肝臓など）に直接注射される。
哺乳動物への投与について、ｒＡＡＶベクターは、薬学的に許容される担体、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に約７．８のｐＨで懸濁されてもよい。他の有用な薬学的に許容される担体には、これらに限定されないが、グリセロール、水、生理食塩水、エタノール、並びに有機酸のリン酸塩及び塩などの他の薬学的に許容される塩溶液が含まれる。これら及び他の薬学的に許容される担体の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９１，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）に記載されている。本開示のｒＡＡＶベクターはまた、キットの形態で提供されてもよく、キットは、例えば、乾燥塩製剤中のベクターの凍結乾燥調製物と、ベクター／塩組成物の懸濁液用の滅菌水と、ベクターの懸濁液及び哺乳動物へのその投与の説明書とを含む。
公開された出願、ＵＳ２０１７／０２９０９２６－Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）は、ＡＡＶベクターが生成、送達、及び投与されるプロセスを詳細に説明している。
ＥＮＰＰ１及びＥＮＰＰ３ポリペプチドのＲＮＡベースのインビボ発現
本開示は、本明細書に記載される組換え二本鎖ＲＮＡ分子（ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡの産生及び送達のための組成物及び方法を提供する。二本鎖ＲＮＡ粒子（ｄｓＲＰ）は、カプシド又はコートタンパク質に封入されたｄｓＲＮＡ分子を含み得る。ｄｓＲＮＡ分子は、ウイルスゲノム、又は野生型ウイルスゲノムに由来し得るゲノムの一部であり得る。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）及びカプシド又はコートタンパク質の少なくとも一部を形成するポリタンパク質をコードし得る。ＲＮＡ分子はまた、宿主細胞の細胞構成成分によって翻訳されるＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードするＲＮＡサブ配列を含み得る。ｄｓＲＰが宿主細胞にトランスフェクトされると、サブ配列は、宿主細胞の細胞機構によって翻訳されて、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを産生することができる。
別の態様では、本開示は、宿主細胞中でタンパク質産物を産生する方法を提供する。方法は、組換え二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）及びカプシド又はコートタンパク質を有するｄｓＲＰで宿主細胞をトランスフェクトすることを含む。ＲＮＡ分子は、カプシド又はコートタンパク質の少なくとも一部を形成するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ及びポリタンパク質をコードすることができ、ｄｓＲＰは、宿主細胞内で複製することができる。ＲＮＡ分子は、宿主細胞の細胞構成成分によって翻訳されるＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする少なくとも１つのＲＮＡサブ配列を有する。
別の態様では、本開示は、宿主細胞によって翻訳可能なＲＮＡ分子を提供する。ＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする任意のＲＮＡ分子であり得る。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｄｓＲＰのカプシド又はコートタンパク質の少なくとも一部を形成するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ及びポリタンパク質をコードし、任意選択的に、追加のタンパク質産物をコードするＲＮＡの少なくとも１つのサブ配列を有することができる。
ｄｓＲＰの産生
本開示のｄｓＲＰはまた、本開示のｄｓＲＰをコードするか、又はｄｓＲＰの遺伝子をコードするプラスミド又は他のＤＮＡ分子を宿主細胞に提示することによっても産生され得る。次いで、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドなどの所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミド又はＤＮＡ分子は、宿主細胞にトランスフェクトされ、宿主細胞は、本開示のｄｓＲＰの産生を開始する。ｄｓＲＰはまた、ｄｓＲＰの遺伝子をコードするＲＮＡ分子を宿主細胞に提示することによって、宿主細胞中で産生され得る。ＲＮＡ分子は、（＋）鎖ＲＮＡであり得る。
本開示のｄｓＲＰが宿主細胞（又は本開示のｄｓＲＰの遺伝子をコードするプラスミド、又はｄｓＲＰの遺伝子をコードするＲＮＡ分子）に提示されると、ｄｓＲＰは、宿主細胞の細胞構成成分を使用して宿主細胞内で産生される。したがって、本開示のｄｓＲＰは、宿主細胞内で自立しており、宿主細胞内で増殖する。宿主細胞は、例えば、真核細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、細菌細胞、昆虫細胞、又は酵母細胞などの任意の好適な宿主細胞であり得る。宿主細胞は、本開示の組換えｄｓＲＮＡ分子、又は本開示のｄｓＲＰをコードするＤＮＡ分子が宿主細胞に提示され、宿主細胞によって取り込まれた後、組換えｄｓＲＰを増殖させることができる。
ｄｓＲＮＡウイルス又はｄｓＲＰを産生する方法
本開示はまた、本開示のｄｓＲＰを産生する方法を提供する。二本鎖又は一本鎖ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子は、宿主細胞に提示され得る。宿主細胞中のｄｓＲＮＡ分子の増幅は、多くの種類の宿主細胞（例えば、酵母）に既に存在する天然の産生及びアセンブリプロセスを利用する。したがって、本開示は、宿主細胞に、本開示の一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子を提示することによって適用することができ、これは宿主細胞によって取り込まれ、宿主細胞の細胞構成成分を使用して、ＲＮＡサブ配列によってコードされる組換えｄｓＲＰ及びタンパク質又はペプチドを産生するために利用される。本開示はまた、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする１つ以上の配列、ｄｓＲＰのカプシド又はコートタンパク質の少なくとも一部を形成するポリタンパク質、及び本明細書に開示されるようなＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドなどの目的のタンパク質をコードするサブ配列を含む、直鎖又は円形のＤＮＡ分子（例えば、プラスミド又はベクター）を宿主細胞に提供することによって適用することができる。
本開示のｄｓＲＮＡ又はｓｓＲＮＡ分子の提示は、例えば、本開示のＲＮＡ分子を、宿主細胞に、例えば、「ネイキッド」又は非修飾一本鎖若しくは二本鎖ＲＮＡとして直接提示することによって、任意の好適な方法で行われ得る。ＲＮＡ分子は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムへの宿主細胞の曝露、又は細胞膜と融合し、内部にウイルス配列を堆積させるリポソームの産生など、任意の好適な方法によって、酵母、細菌、又は哺乳動物宿主細胞にトランスフェクト（又は形質転換）され得る。それは、キラーウイルス又は異種ｄｓＲＮＡからの宿主細胞へのｄｓＲＮＡの直接導入の特定の機序によっても行われ得る。このステップは、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などのレポーター系を使用して、又は宿主細胞ゲノム内の特定の構成的遺伝子転写物を標的化することによって最適化され得る。これは、明白な表現型を有する標的を使用することによって、又は定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）によってモニタリングすることによって行われ得る。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子（例えば、プラスミド又は他のベクター）は、宿主細胞に導入される。ＤＮＡ分子は、本開示のｄｓＲＰのＲＮＡ分子をコードする配列を含み得る。ＤＮＡ分子は、ｄｓＲＰのゲノム全体、又はその一部をコードすることができる。ＤＮＡ分子は、追加の（異種）タンパク質産物を産生するＲＮＡの少なくとも１つのサブ配列を更にコードすることができる。ＤＮＡ配列はまた、ｇａｇタンパク質又はｇａｇ－ｐｏｌタンパク質、並びに任意の必要な若しくは望ましいプロモーター、又は分子の発現及び目的を支持する他の配列をコードすることができる。ＤＮＡ分子は、直鎖ＤＮＡ、円形ＤＮＡ、プラスミド、酵母人工染色体であり得るか、又は特定の用途に好都合な別の形態を取ってもよい。
一実施形態では、ＤＮＡ分子は、コンカタマー及びヘアピン構造を産生するためのＴ７末端を更に含むことができ、したがって宿主細胞中のウイルス又はｄｓＲＰ配列の増殖を可能にする。ＤＮＡ分子は、宿主細胞にトランスフェクト又は形質転換され、次いで、宿主細胞機構を使用して転写され、したがって少なくとも１つのＲＮＡのサブ配列を有するｄｓＲＮＡ分子を宿主細胞に提供することができる。次いで、宿主細胞は、コードされた所望のＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドを産生することができる。ｄｓＲＮＡは、宿主細胞の代謝プロセス及び機構を使用して、野生型ウイルスと同じ様式でパッケージングされ得る。ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドはまた、宿主細胞の代謝プロセス及び細胞構成成分を使用して産生される。
Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．による特許ＵＳ１０２６６８３４（その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）は、ポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡ粒子が生成、送達、及び投与されるプロセスを詳細に説明している。
薬学的組成物及び製剤
本開示は、本明細書に記載される方法内の本開示のポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。そのような薬学的組成物は、対象への投与に好適な形態であるか、又は薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、１つ以上の追加の成分、若しくはこれらのいくつかの組み合わせを更に含み得る。薬学的組成物の様々な構成要素は、当技術分野で周知であるように、生理学的に許容されるカチオン又はアニオンとの組み合わせなどの、生理学的に許容される塩の形態で存在し得る。
一実施形態では、本開示の方法を実施するのに有用な薬学的組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するために投与され得る。他の実施形態では、本開示を実施するのに有用な薬学的組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日～５００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達するために投与され得る。
本開示の薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、及び任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、及び状態に応じて、及び更に組成物が投与される経路に応じて異なる。一例として、組成物は、約０．１％～約１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
本開示の方法に有用な薬学的組成物は、吸入、経口、直腸、膣、非経口、局所、経皮、肺、鼻腔内、頬側、眼、髄腔内、静脈内、又は別の投与経路に対して好適に開発され得る。他の企図される製剤には、投影されたナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含む再封鎖赤血球、及び免疫学的に基づく製剤が含まれる。投与経路は、当業者にとって容易に明らかであり、治療されている疾患の種類及び重症度、獣医又は治療されているヒト患者の種類及び年齢などを含む、任意の数の要因に依存する。
本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野で既知であるか又は今後開発される任意の方法によって調製され得る。概して、そのような調製方法は、活性成分を担体又は１つ以上の他の副成分と組み合わせ、次いで、必要であるか又は望ましい場合、所望の単回又は複数回用量ユニットに生成物を成形又はパッケージングするステップを含む。
本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別の量である。活性成分の量は、概して、対象に投与されるであろう活性成分の投与量、又は例えば、そのような投与量の２分の１若しくは３分の１などのそのような投与量の便宜的な分数に等しい。単位剤形は、単回１日用量又は複数回１日用量（例えば、１日当たり約１～４回以上）のうちの１つのためのものであり得る。複数回１日用量が使用される場合、単位剤形は、各用量に対して同一であるか、又は異なり得る。
投与レジメンは、有効量を構成するものに影響を与え得る。例えば、いくつかの分割された投与量、並びに時差投与量は、毎日若しくは逐次的に投与されてもよく、又は用量は、連続的に注入されてもよく、又はボーラス注射であってもよい。更に、治療製剤の投与量は、治療的又は予防的状況の緊急性によって示されるように、比例的に増加又は減少され得る。ある特定の実施形態では、対象への本開示の化合物の投与は、対象の血漿ＰＰｉを、哺乳動物における正常レベルのＰＰｉが１～３μＭである正常に近いレベルまで上昇させる。「正常に近い」とは、０～１．２μＭ又は正常より０～４０％下回る若しくは上回る、３０ｎＭ～０．９μＭ又は正常より１～３０％ １５下回る若しくは上回る、０～０．６μＭ又は正常より０～２０％下回る若しくは上回る、あるいは０～０．３μＭ又は正常より０～１０％下回る若しくは上回ることを意味する。
ヒトなどの哺乳動物などの患者への本開示の組成物の投与は、既知の手順を使用して、患者の疾患又は障害を治療するために有効な用量で、及び期間にわたって実施され得る。治療効果を達成するために必要な有効量の治療用化合物は、採用される特定の化合物の活性、投与の時間、化合物の排泄速度、治療の期間、化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び材料、治療されている患者の疾患又は障害の状態、年齢、性別、体重、状態、一般健康、及び既往歴、並びに医学分野で周知の同様の要因などの要因に従って変化し得る。投与量レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整されてもよい。投与量は、治療用化合物の生物学的活性に基づいて決定され、これは次に、治療用化合物曲線の半減期及び血漿時間下面積に依存する。本開示によるポリペプチドは、正常（１～３μＭ）レベルに近いか、又は正常レベルより上回る（３０～５０％より高い）のＰＰｉのいずれかである、連続的なレベルの血漿ＰＰｉを達成するために、２日毎、又は４日毎、又は毎週、又は毎月の適切な時間間隔で投与される。本開示のポリペプチドの治療投与量はまた、半減期又は治療用ポリペプチドが体外に排出される速度に基づいて決定されてもよい。本開示によるポリペプチドは、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ３ポリペプチドの酵素活性の一定レベルを達成するために、２日毎、又は４日毎、毎週、又は毎月のいずれかの適切な時間間隔で投与される。
例えば、いくつかの分割された用量は、毎日投与されてもよく、又は用量は、治療状況の緊急性によって示されるように比例的に低減されてもよい。本開示の治療用化合物の有効用量範囲の非限定的な例は、１日当たり約０．０１及び５０ｍｇ／体重ｋｇである。ある特定の実施形態では、本開示の治療用化合物の有効用量範囲は、約５０ｎｇ～５００ｎｇ／体重ｋｇ、好ましくは１００ｎｇ～３００ｎｇ／体重ｋｇである。当業者であれば、関連する因子を試験し、過度の実験なしで、治療用化合物の有効量に関する決定を行うことができるであろう。
化合物は、１日数回の頻度で患者に投与されることができ、又は１日１回、１週間に１回、２週間に１回、１か月に１回、若しくは更にはより少ない頻度など、例えば数か月に１回又は１年に１回以下など、より少ない頻度で投与され得る。非限定的な例では、１日当たりに投与される化合物の量は、毎日、隔日、２日毎、３日毎、４日毎、又は５日毎に投与され得る。例えば、隔日投与では、１日当たり５ｍｇの用量を月曜日に開始し、水曜日に第１の後続の１日当たり５ｍｇの用量、金曜日に第２の後続の１日当たり５ｍｇの用量、などとしてもよい。用量の頻度は、当業者にとって容易に明らかであり、これらに限定されないが、治療されている疾患の種類及び重症度、並びに患者の種類及び年齢などの任意の数の要因に依存する。本開示の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性であることなく、特定の患者、組成物、及び投与様式について望ましい治療応答を達成するために有効な活性成分の量を得るために変化させられてもよい。
当該技術分野における通常の技術を有する医師、例えば、内科医は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定し、処方してもよい。例えば、内科医又は獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルで、薬学的組成物に採用される本開示の化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる。
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、１日当たり１回～５回又はそれ以上の範囲の投与量で患者に投与される。他の実施形態では、本開示の組成物は、これらに限定されないが、１日１回、２日毎に１回、３日毎に１回～週に１回、及び２週間毎に１回を含む投与量の範囲で患者に投与される。本開示の様々な併用組成物の投与頻度は、これらに限定されないが、年齢、治療される疾患又は障害、性別、全体的な健康、及び他の要因を含む多くの要因に応じて、対象によって変化する。したがって、本開示は、任意の特定の投与量レジームに限定されると解釈されるべきではなく、任意の患者に投与される正確な投与量及び組成物は、患者に関する他の全ての因子を考慮して、主治医によって決定されることになる。
ある特定の実施形態では、本開示は、単独で、又は第２の薬学的剤と組み合わせて、本開示の化合物の治療有効量の化合物を保持する容器、並びに患者の疾患又は障害の１つ以上の症状を治療、予防、又は低減するために化合物を使用するための説明書を含む、パッケージングされた薬学的組成物を対象とする。
投与経路
本開示の組成物のうちのいずれかの投与経路には、吸入、経口、鼻腔、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬側、（経）尿道、膣（例えば、経膣及び膣周囲）、（経）鼻、及び（経）直腸）、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、髄腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、及び局所投与が含まれる。
好適な組成物及び剤形としては、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、丸剤、ゲルキャップ、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、シロップ、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ゲル、粉末、ペレット、泥膏、ロゼンジ、クリーム、ペースト、膏薬、ローション、ディスク、坐剤、鼻又は経口投与のための液体スプレー、吸入のための乾燥粉末又はエアロゾル製剤、及び膀胱内投与のための製剤などが挙げられる。本開示で有用となる製剤及び組成物は、本明細書に説明される特定の製剤及び組成物に限定されない。
薬学的組成物の「非経口投与」は、対象の組織の物理的侵害によって特徴付けられる投与及び組織における侵害を通した薬学的組成物の投与の任意の投与経路を含む。したがって、非経口投与は、これらに限定されないが、組成物の注射による、外科手術切開を通した組成物の適用による、組織膜透過型非外科的創傷を通した組成物の適用などによる、薬学的組成物の投与を含む。特に、非経口投与は、これらに限定されないが、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射、及び腎透析注入技術を含むことが企図される。
本開示は、以下の実施例によって更に例示される。実施例は、例示のみを目的としており、いかなる様式でも本開示を制限するものとして意図されることも、そのように解釈されるべきでもない。
実施例１：マウス大動脈同種移植片におけるＥＮＰＰ１及びＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質の有効性
同種移植片血管障害は、長期移植片生存を妨げる主な合併症のうちの１つであり、したがって固形臓器移植に供される患者における死亡率の主なリスク因子を表している。実施例の目的は、大動脈同種移植片のマウスモデルにおけるＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質又はＥＮＰＰ１タンパク質の有効性を評価することである。ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果を、固形臓器移植後の狭窄を阻害する能力に関して評価する。
５～６週齢のメスＤＢＡ／２（Ｈ－２ｄ）及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｈ－２ｂ）マウスを、それぞれドナーマウス及びレシピエントマウスとして使用する。（Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｎａｌ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ：ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，４８２１－４８２７）。ＤＢＡ／２マウスの下行胸部大動脈を、既に記載したように、腎動脈下位置でＣ５７ＣＬ／６マウスに移植する。（Ｓｅｐｐｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎ Ｍａｒｆａｎ Ｍｉｃｅ（ｍｇＲ／ｍｇＲ）Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｓｅｖｅｒｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１６，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １１，ｅ０１４８０１２。）
ドナーマウスをＣＯ２で安楽死させる。胸腔を開き、左室を穿刺し、動脈循環系を５ｍＬのＮａＣｌ（４℃、０．９％）で灌流させる。下行大動脈を採取し、レシピエントマウスに移植して、大動脈同種移植片のモデルを作製する。あるいは、図２に示されるように、ドナーマウスの心臓全体を採取し、レシピエントマウスに移植して、固形臓器移植マウスモデルを作製することができる。
レシピエントＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、５％イソフルランの吸入によって麻酔する。Ｎｏｖａｌｇｉｎ（５００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｋｇ体重）及びＣａｒｐｒｉｅｖｅ（５０ｍｇ／ｍＬのカルプロフェン、５ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射する。レシピエントマウスの腹腔を開き、腎動脈下大動脈を解剖する。チタンクリップを適用し、大動脈を切断する。移植片を、２つの端々吻合でレシピエント大動脈に接続する（Ｐｒｏｌｅｎｅ １１－０、ナイロンブラック、Ｓ＆Ｔ、Ｎｅｕｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。クリップを除去した後、移植片を再灌流させた。（Ｒｅｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ．１５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１９）。
移植した大動脈を含有するレシピエントマウスの対照サブセット（ｎ＝５）を、トリス緩衝生理食塩水で処置し、移植した大動脈を有するレシピエントマウスの実験サブセット（ｎ＝５）を、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処理して、同種移植片における血管平滑筋細胞増殖に対するＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃの効果を決定する。ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃ処置（ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃを１０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日皮下注射）を、実験マウス群において大動脈移植後に開始し、移植した大動脈を採取するまで２８日間継続する。同様に、対照マウス群を大動脈移植後に、移植した大動脈を採取するまで２８日間継続して毎日、皮下注射によってトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４で処置する。次いで、形態学的分析のために、動脈をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定する。
連続切片（各々５μｍの切片）を採取する。５μｍの厚さの凍結大動脈切片（Ｍｉｃｒｏｔｏｍ、ＨＭ ５００ Ｏ）を、移植した移植片全体にわたって様々な間隔から無作為に選択し、エラスチカ・ワンギーソン染色（Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して染色する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、外弾性板、内弾性板、及び内腔の境界の周囲を測定する。その後、ＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉバージョン１．５１ｐ、ＮＩＨ、ＵＳＡ）を使用して、新生内膜面積及び中膜面積を測定し、２人の治験責任医師を治療レジメンに関して盲検化する。２つの分析したパラメータの比率を、内腔閉塞の尺度として使用する。中膜面積、内膜面積、及び内膜／中膜比（Ｉ／Ｍ比）を計算した。
統計分析を、スチューデントのｔ検定（平均については対応のない２標本検定）を使用して行う。一元配置分散分析、続いてボンフェローニの事後検定を使用した複数の群の比較を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン７で行う。ｐ＜０．０５の確率値を有意であるとみなす。形態計測学的分析は、対照の非処置マウスが、高度の血管内腔閉塞を伴う血管病変及び強いリモデリングを生じさせたことを示す。
移植後にＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置した実験マウスにおいて、内膜過形成の程度を、ＥＮＰＰ１もＥＮＰＰ１－Ｆｃも受けなかった対照マウスと比較する。未処置対照マウスからの移植した大動脈の連続切片の定量分析は、新生内膜増殖の有意な増加を示すことが予想され、これを移植後２８日目以降に、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置されたマウスとも比較する。対照マウスは、動脈内膜の肥厚を示すことが予想され、これを処置マウスと比較する。それに応じて、対照マウスと処置マウスのＩ／Ｍ比を比較する。
実施例２：ＥＮＰＰ１－Ｆｃの予防効果
実施例１に記載されるのと同じ実験を、図１に示されるように、大動脈移植の１週間前に実験群にＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃを投与することによって、同種移植片血管障害の予防又は低減におけるＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃの予防効果を決定するように改変する。同様に、対照群に、大動脈移植の１週間前にトリス緩衝生理食塩水を投与する。次いで、１０ｍｇ／ｋｇの投与量のＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置した移植後の実験群、及び移植後にトリス緩衝生理食塩水で処置した対照群を用いて、上記のようにプロセスを繰り返す。形態学的分析は、皮下ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃを受けている実験マウスの内膜面積が、対照マウスと比較して有意に低減されることが予期され、一方で外板と内板との間の中膜面積が、一定のままであることを示すことが予想される。Ｉ／Ｍ比は、ビヒクルで処置された対照マウスと比較して、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置された実験マウスにおいて統計的に有意な減少を示し、大動脈移植前のＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃの予防的処置が、ＶＳＭＣ増殖のレベルを低下させることによって保護効果を示すことを示している。
実施例３：大動脈同種移植片のラットモデル
実施例１に記載されるのと同じ実験を、マウスモデルの代わりにラットモデルを使用して行うことができる。移植のためのラットモデルは、Ｂｏｇｏｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｔｈｅｒ ３４（４）：１８３に記載されている。大動脈同種移植片を有するＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置されたラット及び対照ラット（トリス緩衝生理食塩水を受けている）を、移植手術後２８日目に比較する。
実施例４：ブタ心臓移植モデルにおける心臓同種移植片血管障害（ＣＡＶ）におけるＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質の有効性
ドナー－レシピエント対の選択は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）による主要組織適合性複合体の不適合性に基づいている。刺激指数（ＳＩ）を、以下の式を通して計算する：（同種ＭＬＲの平均ｃｐｍ）／（自己ＭＬＲの平均ｃｐｍ）。ドナー心臓を、腎動脈下同種移植によってレシピエントブタ腹部に異所性に移植する。選択した移植ドナー及びレシピエントを、Ｚｏｌｅｔｉｌ（チレタミン及びゾラゼパム、５ｍｇ／ｋｇ）、スクシニルコリン（１．１ｍｇ／ｋｇ）、及びアトロピン（０．６ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔し、それらを、挿管後に人工呼吸器を介して投与するイソフルラン（３％／１．５Ｌ／分）を使用して麻酔下で維持する。レシピエントを左側臥位に置き、免疫抑制薬の投与のために血管アクセスを確立した。
右脇腹を切開し、後腹膜アプローチを通して、腎動脈下大動脈と下大静脈を分離する（図３を参照されたい）。次に、ドナーをヘパリン化し（３００ＩＵ／ｋｇの静脈内注射（ｉ．ｖ．））、冷たい（４℃）心停止液を使用して心臓停止が達成された後、ドナー心臓を採取する。各ドナー心臓に心房中隔欠損を生じさせ、僧帽弁を機能停止させて、左室萎縮及び腔内血栓形成を最小限に抑える。レシピエントをヘパリン化し（３００ＩＵ／ｋｇ ｉ．ｖ．）、ドナー肺動脈を、連続的な５－０ポリプロピレン縫合を用いて、下大静脈における１～２ｃｍの静脈切開に端側吻合する。その後、ドナー心臓の上行大動脈を、同様の様式でレシピエントの腹部大動脈に吻合し、続いて、出血を止めるためにプロタミン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を投与する。（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１８ Ｄｅｃ；１０２（１２）：２００２－２０１１。）
心臓同種移植片の拍動数を触診により毎日モニタリングし、心電図検査を１週間当たり２回行う。同種移植片の拍動数が低下した場合、心エコー検査を行って収縮機能を評価する。フォローアップを、同種移植片停止又は研究終了日（１５０日）まで継続する。
移植した心臓を含有するレシピエントブタの対照サブセット（ｎ＝１２）を、トリス緩衝生理食塩水で処置し、移植した心臓を有するレシピエントブタの実験サブセット（ｎ＝１２）を、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処理して、固形臓器移植片における血管平滑筋細胞増殖に対するＥＮＰＰ１の効果を決定する。ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃ処置（ＥＮＰＰ１－Ｆｃ又はＥＮＰＰ１を１０ｍｇ／ｋｇ体重で４日毎に皮下注射）を、実験ブタ群において心臓移植後に開始し、移植した心臓を採取するまで１５０日間継続する。同様に、対照ブタ群を心臓移植後に、移植した心臓を採取するまで１５０日間継続して４日毎に、腹腔内注射によってトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４で処置する。
ホルマリン固定心臓標本を、パラフィンに包埋し、切断し、脱パラフィンし、再水和し、次いで、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）又はオルセイン染色に供する。血管移植片の内膜過形成を、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を使用して検査し、オルセイン染色した断面のコンピュータ画像から決定する。内弾性板によって包囲された面積（ＩＥＬＡ）及び内腔面積（ＬＡ）を、画像分析プログラム（Ｉｍａｇｅ Ｊ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １．４６ｒ，ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ）を使用して計算する。内膜過形成の重症度を、以下の式を使用して計算する：［（ＩＥＬＡ－ＬＡ）／ＩＥＬＡ］×１００％。計算後、各移植片の内膜過形成の重症度を、盲検化した様式で５つの断面について、冠動脈切片当たり３つの無作為に選択した範囲で評価し、評価した重症度レベルを統計分析のために平均化する。
統計分析を、スチューデントのｔ検定（平均については対応のない２標本検定）を使用して行う。一元配置分散分析、続いてボンフェローニの事後検定を使用した複数の群の比較を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン７で行う。ｐ＜０．０５の確率値を有意であるとみなす。形態計測学的分析は、対照の非処置ブタが、高度の血管内腔閉塞を伴う血管病変及び強いリモデリングを生じさせたことを示す。
移植後にＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置した実験ブタにおいて、内膜過形成の程度を、連続切片の定量分析及び定性分析を行うことによって、対照ブタ及びＥＮＰＰ１ブタ又はＥＮＰＰ１で処置されたブタについて決定する。対照ブタは、移植後１５０日目に、有意に増加した新生内膜増殖を示すことが予想される。対照ブタは、動脈内膜の肥厚を示すことが予想され、処置ブタを対照と比較する。それに応じて、対照ブタと処置ブタのＩ／Ｍ比を比較する。生存時間中央値も、対照群及びＥＮＰＰ１群又はＥＮＰＰ１で処置された群について決定する。移植片生存時間も、対照群及びＥＮＰＰ１群又はＥＮＰＰ１で処置された群について決定する。
実施例５：マウス大動脈同種移植片におけるＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質の有効性
５～６週齢のメスＤＢＡ／２（Ｈ－２ｄ）及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｈ－２ｂ）マウスを、それぞれドナーマウス及びレシピエントマウスとして使用する。（Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｎａｌ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ：ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，４８２１－４８２７）。ＤＢＡ／２マウスの下行胸部大動脈を、既に記載したように、腎動脈下位置でＣ５７ＣＬ／６マウスに移植する。（Ｓｅｐｐｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｓｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｂａｒｒｉｅｒ ｉｎ Ｍａｒｆａｎ Ｍｉｃｅ（ｍｇＲ／ｍｇＲ）Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｓｅｖｅｒｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１６，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １１，ｅ０１４８０１２。）
ドナーマウスをＣＯ２で安楽死させる。胸腔を開き、左室を穿刺し、動脈循環系を５ｍＬのＮａＣｌ（４℃、０．９％）で灌流させる。下行大動脈を採取し、レシピエントマウスに移植して、大動脈同種移植片のモデルを作製する。あるいは、図２に示されるように、ドナーマウスの心臓全体を採取し、レシピエントマウスに移植して、固形臓器移植マウスモデルを作製することができる。
レシピエントＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、５％イソフルランの吸入によって麻酔する。Ｎｏｖａｌｇｉｎ（５００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｋｇ体重）及びＣａｒｐｒｉｅｖｅ（５０ｍｇ／ｍＬのカルプロフェン、５ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射する。レシピエントマウスの腹腔を開き、腎動脈下大動脈を解剖する。チタンクリップを適用し、大動脈を切断する。移植片を、２つの端々吻合でレシピエント大動脈に接続する（Ｐｒｏｌｅｎｅ １１－０、ナイロンブラック、Ｓ＆Ｔ、Ｎｅｕｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。クリップを除去した後、移植片を再灌流させた。（Ｒｅｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｖｏｌ．１５ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１９）。
移植した大動脈を含有するレシピエントマウスの対照サブセット（ｎ＝５）を、トリス緩衝生理食塩水で処置し、移植した大動脈を有するレシピエントマウスの実験サブセット（ｎ＝５）を、ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処理して、同種移植片における血管平滑筋細胞増殖に対するＥＮＰＰ３の効果を決定する。ＥＮＰＰ３－Ｆｃ処置（ＥＮＰＰ３－Ｆｃを１０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日皮下注射）を、実験マウス群において大動脈移植後に開始し、移植した大動脈を採取するまで２８日間継続する。同様に、対照マウス群を大動脈移植後に、移植した大動脈を採取するまで２８日間継続して毎日、皮下注射によってトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４で処置する。次いで、形態学的分析のために、動脈をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定する。
連続切片（各々５μｍの切片）を採取する。５μｍの厚さの凍結大動脈切片（Ｍｉｃｒｏｔｏｍ、ＨＭ ５００ Ｏ）を、移植した移植片全体にわたって様々な間隔から無作為に選択し、エラスチカ・ワンギーソン染色（Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して染色する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、外弾性板、内弾性板、及び内腔の境界の周囲を測定する。その後、ＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉバージョン１．５１ｐ、ＮＩＨ、ＵＳＡ）を使用して、新生内膜面積及び中膜面積を測定し、２人の治験責任医師を治療レジメンに関して盲検化する。２つの分析したパラメータの比率を、内腔閉塞の尺度として使用する。中膜面積、内膜面積、及び内膜／中膜比（Ｉ／Ｍ比）を計算した。
統計分析を、スチューデントのｔ検定（平均については対応のない２標本検定）を使用して行う。一元配置分散分析、続いてボンフェローニの事後検定を使用した複数の群の比較を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン７で行う。ｐ＜０．０５の確率値を有意であるとみなす。形態計測学的分析は、対照の非処置マウスが、高度の血管内腔閉塞を伴う血管病変及び強いリモデリングを生じさせたことを示す。
移植後にＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処置した実験マウスにおいて、内膜過形成の程度を、ＥＮＰＰ３もＥＮＰＰ３－Ｆｃも受けなかった対照マウスと比較する。未処置対照マウスからの移植した大動脈の連続切片の定量分析は、新生内膜増殖の有意な増加を示すことが予想され、これを移植後２８日目以降に、ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処置されたマウスとも比較する。対照マウスは、動脈内膜の肥厚を示すことが予想され、これを処置マウスと比較する。それに応じて、対照マウスと処置マウスのＩ／Ｍ比を比較する。
実施例６：ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃの予防効果
実施例５に記載されるのと同じ実験を、図１に示されるように、大動脈移植の１週間前に実験群にＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃを投与することによって、同種移植片血管障害の予防又は低減におけるＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃの予防効果を決定するように改変する。同様に、対照群に、大動脈移植の１週間前にトリス緩衝生理食塩水を投与する。次いで、１０ｍｇ／ｋｇの投与量のＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処置した移植後の実験群、及び移植後にトリス緩衝生理食塩水で処置した対照群を用いて、上記のようにプロセスを繰り返す。形態学的分析は、皮下ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃを受けている実験マウスの内膜面積が、対照マウスと比較して有意に低減されることが予期され、一方で外板と内板との間の中膜面積が、一定のままであることを示すことが予想される。Ｉ／Ｍ比は、ビヒクルで処置された対照マウスと比較して、ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処置された実験マウスにおいて統計的に有意な減少を示し、大動脈移植前のＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃの予防的処置が、ＶＳＭＣ増殖のレベルを低下させることによって保護効果を示すことを示している。
実施例７：大動脈同種移植片のラットモデル
実施例５に記載されるのと同じ実験を、マウスモデルの代わりにラットモデルを使用して行うことができる。移植のためのラットモデルは、Ｂｏｇｏｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｔｈｅｒ ３４（４）：１８３に記載されている。大動脈同種移植片を有するＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処置されたラット及び対照ラット（トリス緩衝生理食塩水を受けている）を、移植手術後２８日目に比較する。
実施例８：ブタ心臓移植モデルにおける心臓同種移植片血管障害（ＣＡＶ）におけるＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質の有効性
ＣＡＶは、移植後１年間、同種移植片不全の主な原因であり続けている。心臓同種移植片血管障害は、従来の固有の冠動脈疾患（ＣＡＤ）とは異なる病因を有する、加速性びまん性冠動脈硬化症として現れる。ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質の有効性を、臓器移植片の大型動物モデル、特に、家畜（ヨークシャー）ブタの心臓移植片で評価する。ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果を、ヨークシャーブタにおける心臓移植後の狭窄を阻害する能力に関して評価した。
ドナー－レシピエント対の選択は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）による主要組織適合性複合体の不適合性に基づいている。刺激指数（ＳＩ）を、以下の式を通して計算する：（同種ＭＬＲの平均ｃｐｍ）／（自己ＭＬＲの平均ｃｐｍ）。ドナー心臓を、腎動脈下同種移植によってレシピエントブタ腹部に異所性に移植する。選択した移植ドナー及びレシピエントを、Ｚｏｌｅｔｉｌ（チレタミン及びゾラゼパム、５ｍｇ／ｋｇ）、スクシニルコリン（１．１ｍｇ／ｋｇ）、及びアトロピン（０．６ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔し、それらを、挿管後に人工呼吸器を介して投与するイソフルラン（３％／１．５Ｌ／分）を使用して麻酔下で維持する。レシピエントを左側臥位に置き、免疫抑制薬の投与のために血管アクセスを確立した。
右脇腹を切開し、後腹膜アプローチを通して、腎動脈下大動脈と下大静脈を分離する（図３を参照されたい）。次に、ドナーをヘパリン化し（３００ＩＵ／ｋｇの静脈内注射（ｉ．ｖ．））、冷たい（４℃）心停止液を使用して心臓停止が達成された後、ドナー心臓を採取する。各ドナー心臓に心房中隔欠損を生じさせ、僧帽弁を機能停止させて、左室萎縮及び腔内血栓形成を最小限に抑える。レシピエントをヘパリン化し（３００ＩＵ／ｋｇ ｉ．ｖ．）、ドナー肺動脈を、連続的な５－０ポリプロピレン縫合を用いて、下大静脈における１～２ｃｍの静脈切開に端側吻合する。その後、ドナー心臓の上行大動脈を、同様の様式でレシピエントの腹部大動脈に吻合し、続いて、出血を止めるためにプロタミン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を投与する。（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１８ Ｄｅｃ；１０２（１２）：２００２－２０１１。）
心臓同種移植片の拍動数を触診により毎日モニタリングし、心電図検査を１週間当たり２回行う。同種移植片の拍動数が低下した場合、心エコー検査を行って収縮機能を評価する。フォローアップを、同種移植片停止又は研究終了日（１５０日）まで継続する。
移植した心臓を含有するレシピエントブタの対照サブセット（ｎ＝１２）を、トリス緩衝生理食塩水で処置し、移植した心臓を有するレシピエントブタの実験サブセット（ｎ＝１２）を、ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処理して、固形臓器移植片における血管平滑筋細胞増殖に対するＥＮＰＰ３ポリペプチドの効果を決定する。ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃ処置（ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃを１０ｍｇ／ｋｇ体重で４日毎に皮下注射）を、実験ブタ群において心臓移植後に開始し、移植した心臓を採取するまで１５０日間継続する。同様に、対照ブタ群を心臓移植後に、移植した心臓を採取するまで１５０日間継続して４日毎に、腹腔内注射によってトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４で処置する。
ホルマリン固定心臓標本を、パラフィンに包埋し、切断し、脱パラフィンし、再水和し、次いで、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）又はオルセイン染色に供する。血管移植片の内膜過形成を、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を使用して検査し、オルセイン染色した断面のコンピュータ画像から決定する。内弾性板によって包囲された面積（ＩＥＬＡ）及び内腔面積（ＬＡ）を、画像分析プログラム（Ｉｍａｇｅ Ｊ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １．４６ｒ，ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ）を使用して計算する。内膜過形成の重症度を、以下の式を使用して計算する：［（ＩＥＬＡ－ＬＡ）／ＩＥＬＡ］×１００％。計算後、各移植片の内膜過形成の重症度を、盲検化した様式で５つの断面について、冠動脈切片当たり３つの無作為に選択した範囲で評価し、評価した重症度レベルを統計分析のために平均化する。
統計分析を、スチューデントのｔ検定（平均については対応のない２標本検定）を使用して行う。一元配置分散分析、続いてボンフェローニの事後検定を使用した複数の群の比較を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン７で行う。ｐ＜０．０５の確率値を有意であるとみなす。形態計測学的分析は、対照の非処置ブタが、高度の血管内腔閉塞を伴う血管病変及び強いリモデリングを生じさせたことを示す。
移植後にＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処置した実験ブタにおいて、内膜過形成の程度を、連続切片の定量分析及び定性分析を行うことによって、対照ブタ及びＥＮＰＰ３で処置されたブタについて決定する。対照ブタは、移植後１５０日目に、有意に増加した新生内膜増殖を示すことが予想される。対照ブタは、動脈内膜の肥厚を示すことが予想され、処置ブタを対照と比較する。それに応じて、対照ブタと処置ブタのＩ／Ｍ比を比較する。生存時間中央値も、対照群及びＥＮＰＰ３で処置された群について決定する。移植片生存時間も、対照群及びＥＮＰＰ３で処置された群について決定する。
実施例９：ステント内再狭窄モデルにおけるＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質の有効性
ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質の有効性を、末梢血管損傷の大型動物モデル、特に、家畜（ヨークシャー）ブタの末梢血管系におけるステント内再狭窄病変で評価した。ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果を、ヨークシャーブタの前もって損傷及びステント留置された末梢動脈における血管形成術後の狭窄を阻害する能力に関して評価した。
４つの末梢動脈部位を、各動物において新生内膜応答の誘導のために作製し、１つの部位を、４つの動脈（両側深及び浅大腿動脈）のそれぞれで選択した。
全ての標的部位が、ステント内再狭窄モデルを作製するために０日目に、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ又はビヒクルのみの対照の最初の用量の１０日前、及び反復損傷の１４日前に損傷された。治療部位及び正しいサイズのバルーン及びステントを選択するために、定量的血管造影（ＱＶＡ）を使用して、４つの末梢動脈部位をマッピングした。損傷は、標的の１３０％過剰伸張において標準的な血管形成術バルーンカテーテルを用いた動脈の過剰伸張によって作製され、３回の膨張が実施された。損傷の直後に、ベアメタルステントを展開した。末梢ステントは、自己拡張可能であり、約１２０％過剰伸張を標的とした。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃ治療は、１０日目に開始して全身的に生じ、終了まで４日毎に皮下投与された。１４日目に、全ての血管を血管造影及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって評価した。次いで、前もって損傷及びステント留置された動脈部位は、元の事前ステント損傷が行われたのと同じ圧力／直径における標準的な血管形成術バルーンカテーテルの単一の膨張による、動脈の過剰伸張からなる再損傷事象を受けた（基準参照直径の１３０％）。再損傷介入後、最終的な処置後の血管造影及びＯＣＴが、選択的末梢部位について記録した。
１４日目の再損傷事象から４週間後、動脈は、血管造影及び血管内撮像（ＯＣＴ）による反復撮像を受けた。治療された末梢区分を外植し、１０％中性緩衝ホルマリン中に保存した。
図４に示されるように、血管造影は、ビヒクル対照を与えられた動物における１４日目の血管の形態に対して４２日目に深動脈の顕著な狭小化を明らかにした。対照的に、ＥＮＰＰ１－Ｆｃで治療された動物では、深動脈形態の可視的な変化が１４日目～４２日目にほとんど観察されなかった。同様に、ＯＣＴによって測定されると、顕著な内膜肥厚が、ビヒクル対照で治療された動物における１４日目の血管の形態に対して４２日目に深動脈内で観察された。対照的に、ＥＮＰＰ１－Ｆｃで治療された動物の深動脈では、可視的な内膜肥厚が１４日目～４２日目にほとんど観察されなかった（図５）。
表１及び表２（以下）は、治療群別に全ての深動脈における平均ＯＣＴ値を要約する。
Figure 2023532732000080
表に記載されるように、ＥＮＰＰ１－Ｆｃで治療された動物の深動脈は、ビヒクル対照群と比較して４２日目により大きい内腔面積を有していた。ステント面積は、両群間で類似していた。新生内膜厚及び新生内膜面積も、ビヒクル対照動物に対してＥＮＰＰ１－Ｆｃで治療された動物では４２日目に低減した。加えて、ＥＮＰＰ１－Ｆｃで治療された動物は、ビヒクル対照群と比較して、顕著により低い狭窄の面積％を有していた（図６を参照されたい）。これらのデータは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、とりわけ、末梢血管の損傷及び／又は末梢血管への損傷に関連する内膜の肥厚を阻害するために有用であることを示す。
実施例１０：ステント内再狭窄モデルにおけるＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質の有効性
ＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質の有効性が、末梢血管損傷の大型動物モデル、特に、家畜（ヨークシャー）ブタの末梢血管系におけるステント内再狭窄病変で評価される。ＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果が、ヨークシャーブタの前もって損傷及びステント留置された末梢動脈における血管形成術後の狭窄を阻害する能力に関して評価される。
４つの末梢動脈部位を、各動物において新生内膜応答の誘導のために作製し、１つの部位を、４つの動脈（両側深及び浅大腿動脈）の各々で選択する。
全ての標的部位が、ステント内再狭窄モデルを作製するために０日目に、ＥＮＰＰ３－Ｆｃ又はビヒクルのみの対照の最初の用量の１０日前、及び反復損傷の１４日前に損傷された。４つの末梢動脈部位は、治療部位及び正しいサイズのバルーン及びステントを選択するために、定量的血管造影（ＱＶＡ）を使用してマッピングされる。損傷は、標的の１３０％過剰伸張において標準的な血管形成術バルーンカテーテルを用いた動脈の過剰伸張によって作製され、３回の膨張が実施される。損傷の直後に、ベアメタルステントが展開される。末梢ステントは、自己拡張可能であり、約１２０％過剰伸張を標的とする。
ＥＮＰＰ３－Ｆｃ治療は、１０日目に開始して全身的に開始され、終了まで４日毎に皮下投与される。１４日目に、全ての血管が、血管造影及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって評価される。次いで、前もって損傷及びステント留置された動脈部位は、元の事前ステント損傷と同じ圧力／直径における標準的な血管形成術バルーンカテーテルの単一の膨張による、動脈の過剰伸張からなる再損傷事象を受ける（基準参照直径の１３０％）。再損傷介入後、最終的な処置後の血管造影及びＯＣＴを、選択的末梢部位について記録する。
１４日目の再損傷事象から４週間後、動脈は、血管造影及び血管内撮像（ＯＣＴ）による反復撮像に供される。治療された末梢区分は、外植され、１０％中性緩衝ホルマリン中に保存される。
実施例１１：ＭＭＤマウスモデルにおけるＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質の有効性
モヤモヤは、出血性脳卒中及び虚血性脳卒中の両方をもたらす頭蓋内内頸動脈の進行性狭窄によって特徴付けられる脳血管障害である。ＩＣＡを通る血流の制限は、皮質下領域における「煙のパフ」（日本語ではモヤモヤ）に似た新しい血管の最終的な発生につながる。実施例の目的は、ＭＭＤのマウスモデルにおける治療のためのＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質又はＥＮＰＰ１の有効性を評価することである。ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質又はＥＮＰＰ１の治療効果を、ＭＭＤにおける血管平滑筋細胞増殖を阻害する能力、及び脳閉塞を低減又は予防する能力に関して評価する。
ＭＭＤ表現型の生成
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得したＣ５７Ｂｌ／６オスマウス（５～６週齢）を、重量ベースの比を使用してケタミン及びキシラジンのカクテルで麻酔する。マウスが麻酔されると、それらの頸部領域を剃り、マウスを頭部、前足、及び尾が拘束された状態で仰臥位に置いた（図８）。マウスを仰臥位にして、剃った領域をアルコール及びベタジンで消毒した。下顎の角度から胸骨に正中切開し、気管、総頸動脈（ＣＣＡ）、並びに内頸動脈及び外頸動脈（ＩＣＡ／ＥＣＡ）へのＣＣＡの分岐を露出する。開創器を使用して、皮膚及び分離した唾液腺を、外科手術領域を妨げないように保持した。視野を増加させるために、胸鎖乳突筋（ＳＣＭ）筋、及び二腹筋（ＰＢＤ）の後腹をそれぞれ下方及び上方に露出する。一対の湾曲鉗子の先端を、内側から外側へとＳＣＭの下にそっと置き、１本の長さの４±０の縫合を下に移す。縫合はＳＣＭの周囲で輪になり、テープを使用して固定される。この手順をＰＢＤで反復する。
ＩＣＡが単離されると、６±０の縫合をコイル留意のアンカーとして使用する。先端の細い鉗子を使用して、一端でコイルを把持し、血管がコイルの最後の段に挿入されるようにＩＣＡに対してある角度で留置する。コイルの最後の段に血管が入ると、コイルをＩＣＡに平行になるように反転させる。血管の長さがコイルの各段に配置されるように、６±０の縫合を使用して、血管をコイルの周囲でそっと回転させる。血管留置を、それが段を飛ばしていないことを確認するために評価し、飛ばしている場合は、血管を解き、コイルが完全に血管を包含するまで再配置する。したがって、マウスの対照サブセット及び実験サブセットの両方におけるＭＭＤ表現型を、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｍｏｙａｍｏｙａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１８；１３（１）：ｅ０１９１３１２）で考察される手順に従うことによって誘導する。
ＭＭＤモデルマウスの対照サブセット（ｎ＝５）を、トリス緩衝生理食塩水で処置し、ＭＭＤマウスの実験サブセット（ｎ＝５）を、ＭＭＤ表現型の誘導後にＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置して、ＭＭＤマウスの脳における血管平滑筋細胞増殖及び脳閉塞に対するＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃの効果を決定する。ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃ処置（ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃを１０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日皮下注射）を、実験マウス群における上記のような手術によるＭＭＤ表現型の誘導後に開始し、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃ投与を、大脳動脈を採取するまで２８日間継続する。
同様に、対照マウス群を、上記のような手術によるＭＭＤ表現型の誘導後にトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４で処置し、トリス緩衝生理食塩水を、毎日皮下注射を介して投与し、大脳動脈を採取するまで２８日間継続する。次いで、形態学的分析のために、ＭＭＤを有する対照マウス及び実験群マウスの両方の動脈を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定する。
脳血管系の可視化
脳血管系を可視化するために、各群からの全ての動物を、蛍光染料Ｄｉ Ｉで灌流させた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅ ＤｉＩ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００８；３（１１）：１７０３±８）。マウスを、灌流ポンプ（１ｍｌ／分に設定）を使用した経心腔的灌流に供して、５ｍｌのＰＢＳ、その直後に１０ｍｌのＤｉ Ｉ希釈標準溶液、次いで１０ｍｌの１０％緩衝ホルマリンを灌流させる（室温）。脳を頭蓋骨から注意深く取り除き、輪のウィリス（ＣｏＷ）が無傷のままであったことを確実にする。
次いで、抽出した脳を、１０％緩衝ホルマリンを用いて４℃で一晩事後固定する。次いで、脳を４℃での長期保存のためにＰＢＳに移し、光から保護する。蛍光標識した脳を、１Ｘ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００／Ｎｉｋｏｎ ＤＳ－Ｒｉｌ）を使用して撮像した。皮質血管系の画像を撮影して吻合を検査し、ＣｏＷの画像を使用して血管直径を測定する。Ｎｉｋｏｎ ＮＥＳ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して画像分析を行って、血管直径（μｍ）を測定する。
内頸動脈床突起上部の分岐、中大脳動脈のＭ１セグメント及び前大脳動脈のＡ１セグメントから約２０μｍで直径を測定する。同側半球及び対側半球の両方のＡＣＡとＭＣＡとの間の吻合（拡大画像上の各接続点上に配置された円）の数をカウントすることによって、吻合分析を行う。ＩＣＡ、ＡＣＡ、及びＭＣＡ血管の直径を、同側及び対側の両方の分岐点付近の各血管の幅を測定することによって検査して、実験群と対照群との間にサイズの差があったかを判定する。
形態学的分析
ＭＣＡ、ＡＣＡ、及びＩＣＡなどの大脳動脈の連続切片（各５μｍのセクション）を、対照群及び実験群の両方について採取する。５μｍの厚さの凍結大動脈切片（Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ、ＨＭ ５００ Ｏ）を、エラスチカ・ワンギーソン染色（Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して染色する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、外弾性板、内弾性板、及び内腔の境界の周囲を測定する。その後、ＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉバージョン１．５１ｐ、ＮＩＨ、ＵＳＡ）を使用して、新生内膜面積及び中膜面積を測定し、２人の治験責任医師を治療レジメンに関して盲検化する。２つの分析したパラメータの比率を、内腔閉塞の尺度として使用する。中膜面積、内膜面積、及び内膜／中膜比（Ｉ／Ｍ比）を計算した。（図２を参照されたい）。
統計分析を、スチューデントのｔ検定（平均については対応のない２標本検定）を使用して行う。一元配置分散分析、続いてボンフェローニの事後検定を使用した複数の群の比較を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン７で行う。ｐ＜０．０５の確率値を有意であるとみなす。形態計測学的分析は、ＭＭＤ表現型を有する対照非処置マウスが、高度の血管内腔閉塞を伴う血管病変、閉塞、及び狭小化を生じさせることを示す。
ＭＭＤ表現型の誘導後にＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置した実験マウスにおいて、内膜過形成の程度を、ＥＮＰＰ１もＥＮＰＰ１－Ｆｃも受けなかった対照マウスと比較する。ＭＭＤ表現型を有する未処置対照マウスからの大脳動脈の定量分析は、新生内膜増殖の有意な増加を示すことが予想され、これを手術後２８日目以降に、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置されたマウスとも比較する。対照マウスは、動脈内膜の肥厚を示すことが予想され、これを処置マウスと比較する。それに応じて、対照マウスと処置マウスのＩ／Ｍ比も比較する。
実施例１２：ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃの予防効果
実施例１１に記載されるのと同じ実験を、図７に示されるように、ＭＭＤ表現型の誘導の１週間前に実験群にＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃを投与することによって、血管平滑筋増殖及び脳閉塞の予防又は低減におけるＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃの予防効果を決定するように改変する。同様に、対照群に、ＭＭＤ表現型の誘導の１週間前にトリス緩衝生理食塩水を投与する。次いで、１０ｍｇ／ｋｇの投与量のＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置した手術後の実験群、及び手術後にトリス緩衝生理食塩水で処置した対照群を用いて、上記のようにプロセスを繰り返す。
形態学的分析は、皮下ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃを受けている、ＭＭＤ表現を有する実験マウスの内膜面積が、対照マウスと比較して有意に低減されることが予期され、一方で外板と内板との間の中膜面積が、一定のままであることを示すことが予想される。Ｉ／Ｍ比は、ビヒクルで処置された対照マウスと比較して、ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置された実験マウスで減少することが予想される。ＭＭＤ表現型の誘導前のＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃの予防的処置は、ＶＳＭＣ増殖のレベルを低下させることによって保護効果をもたらすことが予想される。
実施例１３：ＭＭＤのマウスモデルにおけるＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質の有効性
モヤモヤは、出血性脳卒中及び虚血性脳卒中の両方をもたらす頭蓋内内頸動脈の進行性狭窄によって特徴付けられる脳血管障害である。ＩＣＡを通る血流の制限は、皮質下領域における「煙のパフ」（日本語ではモヤモヤ）に似た新しい血管の最終的な発生につながる。実施例の目的は、ＭＭＤのマウスモデルにおける治療のためのＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質又はＥＮＰＰ３の有効性を評価することである。ＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質又はＥＮＰＰ３の治療効果を、ＭＭＤにおける血管平滑筋細胞増殖を阻害する能力、及び脳閉塞を低減又は予防する能力に関して評価する。
ＭＭＤ表現型の生成
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得したＣ５７Ｂｌ／６オスマウス（５～６週齢）を、重量ベースの比を使用してケタミン及びキシラジンのカクテルで麻酔する。マウスが麻酔されると、それらの頸部領域を剃り、マウスを頭部、前足、及び尾が拘束された状態で仰臥位に置いた（図８）。マウスを仰臥位にして、剃った領域をアルコール及びベタジンで消毒した。下顎の角度から胸骨に正中切開し、気管、総頸動脈（ＣＣＡ）、並びに内頸動脈及び外頸動脈（ＩＣＡ／ＥＣＡ）へのＣＣＡの分岐を露出する。開創器を使用して、皮膚及び分離した唾液腺を、外科手術領域を妨げないように保持した。視野を増加させるために、胸鎖乳突筋（ＳＣＭ）筋、及び二腹筋（ＰＢＤ）の後腹をそれぞれ下方及び上方に露出する。一対の湾曲鉗子の先端を、内側から外側へとＳＣＭの下にそっと置き、１本の長さの４±０の縫合を下に移す。縫合はＳＣＭの周囲で輪になり、テープを使用して固定される。この手順をＰＢＤで反復する。
ＩＣＡが単離されると、６±０の縫合をコイル留意のアンカーとして使用する。先端の細い鉗子を使用して、一端でコイルを把持し、血管がコイルの最後の段に挿入されるようにＩＣＡに対してある角度で留置する。コイルの最後の段に血管が入ると、コイルをＩＣＡに平行になるように反転させる。血管の長さがコイルの各段に配置されるように、６±０の縫合を使用して、血管をコイルの周囲でそっと回転させる。血管留置を、それが段を飛ばしていないことを確認するために評価し、飛ばしている場合は、血管を解き、コイルが完全に血管を包含するまで再配置する。したがって、マウスの対照サブセット及び実験サブセットの両方におけるＭＭＤ表現型を、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｓｔｅｎｏｓｉｓ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｍｏｙａｍｏｙａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１８；１３（１）：ｅ０１９１３１２）で考察される手順に従うことによって誘導する。
ＭＭＤモデルマウスの対照サブセット（ｎ＝５）を、トリス緩衝生理食塩水で処置し、ＭＭＤマウスの実験サブセット（ｎ＝５）を、ＭＭＤ表現型の誘導後にＥＮＰＰ３－Ｆｃ又はＥＮＰＰ３で処置して、ＭＭＤマウスの脳における血管平滑筋細胞増殖及び脳閉塞に対するＥＮＰＰ３－Ｆｃ又はＥＮＰＰ３の効果を決定する。ＥＮＰＰ３－Ｆｃ処置（ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃを１０ｍｇ／ｋｇ体重で毎日皮下注射）を、実験マウス群における上記のような手術によるＭＭＤ表現型の誘導後に開始し、ＥＮＰＰ３－Ｆｃ又はＥＮＰＰ３投与を、大脳動脈を採取するまで２８日間継続する。
同様に、対照マウス群を、上記のような手術によるＭＭＤ表現型の誘導後にトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４で処置し、トリス緩衝生理食塩水を、毎日皮下注射を介して投与し、大脳動脈を採取するまで２８日間継続する。次いで、形態学的分析のために、ＭＭＤを有する対照マウス及び実験群マウスの両方の動脈を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定する。
脳血管系の可視化
脳血管系を可視化するために、各群からの全ての動物を、蛍光染料Ｄｉ Ｉで灌流させた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅ ＤｉＩ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００８；３（１１）：１７０３±８）。マウスを、灌流ポンプ（１ｍｌ／分に設定）を使用した経心腔的灌流に供して、５ｍｌのＰＢＳ、その直後に１０ｍｌのＤｉ Ｉ希釈標準溶液、次いで１０ｍｌの１０％緩衝ホルマリンを灌流させる（室温）。脳を頭蓋骨から注意深く取り除き、輪のウィリス（ＣｏＷ）が無傷のままであったことを確実にする。
次いで、抽出した脳を、１０％緩衝ホルマリンを用いて４℃で一晩事後固定する。次いで、脳を４℃での長期保存のためにＰＢＳに移し、光から保護する。蛍光標識した脳を、１Ｘ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００／Ｎｉｋｏｎ ＤＳ－Ｒｉｌ）を使用して撮像した。皮質血管系の画像を撮影して吻合を検査し、ＣｏＷの画像を使用して血管直径を測定する。Ｎｉｋｏｎ ＮＥＳ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して画像分析を行って、血管直径（μｍ）を測定する。
内頸動脈床突起上部の分岐、中大脳動脈のＭ１セグメント及び前大脳動脈のＡ１セグメントから約２０μｍで直径を測定する。同側半球及び対側半球の両方のＡＣＡとＭＣＡとの間の吻合（拡大画像上の各接続点上に配置された円）の数をカウントすることによって、吻合分析を行う。ＩＣＡ、ＡＣＡ、及びＭＣＡ血管の直径を、同側及び対側の両方の分岐点付近の各血管の幅を測定することによって検査して、実験群と対照群との間にサイズの差があったかを判定する。
ＭＭＤ表現型を有する対照マウスにおける遠位ＩＣＡ及び近位ＡＣＡの測定値は、手術後に血管直径の重度の狭小化を示すことが予想され、これを、ＭＭＤ表現型を有するＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処置されたマウスの血管直径と比較する。
形態学的分析
ＭＣＡ、ＡＣＡ、及びＩＣＡなどの大脳動脈の連続切片（各５μｍのセクション）を、対照群及び実験群の両方について採取する。５μｍの厚さの凍結大動脈切片（Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ、ＨＭ ５００ Ｏ）を、エラスチカ・ワンギーソン染色（Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して染色する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、外弾性板、内弾性板、及び内腔の境界の周囲を測定する。その後、ＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉバージョン１．５１ｐ、ＮＩＨ、ＵＳＡ）を使用して、新生内膜面積及び中膜面積を測定し、２人の治験責任医師を治療レジメンに関して盲検化する。２つの分析したパラメータの比率を、内腔閉塞の尺度として使用する。中膜面積、内膜面積、及び内膜／中膜比（Ｉ／Ｍ比）を計算した。（図２を参照されたい）。
統計分析を、スチューデントのｔ検定（平均については対応のない２標本検定）を使用して行う。一元配置分散分析、続いてボンフェローニの事後検定を使用した複数の群の比較を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン７で行う。ｐ＜０．０５の確率値を有意であるとみなす。形態計測学的分析は、ＭＭＤ表現型を有する対照非処置マウスが、高度の血管内腔閉塞を伴う血管病変、閉塞、及び狭小化を生じさせることを示す。
ＭＭＤ表現型の誘導後にＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処置した実験マウスにおいて、内膜過形成の程度を、ＥＮＰＰ３もＥＮＰＰ３－Ｆｃも受けなかった対照マウスと比較する。ＭＭＤ表現型を有する未処置対照マウスからの大脳動脈の定量分析は、新生内膜増殖の有意な増加を示すことが予想され、これを手術後２８日目以降に、ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処置されたマウスとも比較する。対照マウスは、動脈内膜の肥厚を示すことが予想され、これを処置マウスと比較する。それに応じて、対照マウスと処置マウスのＩ／Ｍ比も比較する。
実施例１４：ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃの予防効果
実施例１３に記載されるのと同じ実験を、図７に示されるように、ＭＭＤ表現型の誘導の１週間前に実験群にＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃを投与することによって、血管平滑筋増殖及び脳閉塞の予防又は低減におけるＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃの予防効果を決定するように改変する。同様に、対照群に、ＭＭＤ表現型の誘導の１週間前にトリス緩衝生理食塩水を投与する。次いで、１０ｍｇ／ｋｇの投与量のＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処置した手術後の実験群、及び手術後にトリス緩衝生理食塩水で処置した対照群を用いて、上記のようにプロセスを繰り返す。
形態学的分析は、皮下ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃを受けている、ＭＭＤ表現を有する実験マウスの内膜面積が、対照マウスと比較して有意に低減されることが予期され、一方で外板と内板との間の中膜面積が、一定のままであることを示すことが予想される。Ｉ／Ｍ比は、ビヒクルで処置された対照マウスと比較して、ＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃで処置された実験マウスで減少することが予想される。ＭＭＤ表現型の誘導前のＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃの予防的処置は、ＶＳＭＣ増殖のレベルを低下させることによって保護効果をもたらすことが予想される。
実施例１５：ＡＶ瘻不全のマウスモデルにおけるＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質の有効性
ＥＮＰＰ１又はＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質の有効性を、例えば、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ ５９：１９２－２０１に記載されるように、動静脈瘻不全のマウスモデルにおいて評価する。オスＣ５７ｂｌ６マウスにおいて、外頸静脈と総頸動脈との間に片側性ＡＶＦを作製する。マウスを４つのコホートに分ける：（１）ＡＶＦを作製する前及び後にＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質又はＥＮＰＰ１を用いた長期皮下処置を受けるマウス、（２）ＡＶＦを作製する前及び後に皮下にビヒクル対照処置を受けるマウス、（３）ＡＶＦ作製後にＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質又はＥＮＰＰ１を用いた長期皮下処置を開始するマウス、及び（４）ＡＶＦ作製後に皮下にビヒクル対照処置を受けるマウス。
マウスを経時的に追跡し、様々な時点（例えば、ＡＶＦ作製の１週間後、２週間後、及び／又は３週間後など）で安楽死させる。組織学的分析を、ＡＶＦの部位における又はその近位の血管の切片に対して行う。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質で処置したマウスのＡＶＦ隣接血管における内膜過形成の程度が、ビヒクル対照を受けているマウスと比較して著しく低減されることが予期される。
実施例１６：ＡＶ瘻不全のマウスモデルにおけるＥＮＰＰ３又はＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質の有効性
ＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質又はＥＮＰＰ３の有効性を、例えば、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ ５９：１９２－２０１に記載されるように、動静脈瘻不全のマウスモデルにおいて評価する。オスＣ５７ｂｌ６マウスにおいて、外頸静脈と総頸動脈との間に片側性ＡＶＦを作製する。マウスを４つのコホートに分ける：（１）ＡＶＦを作製する前及び後にＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質又はＥＮＰＰ３を用いた長期皮下処置を受けるマウス、（２）ＡＶＦを作製する前及び後に皮下にビヒクル対照処置を受けるマウス、（３）ＡＶＦ作製後にＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質又はＥＮＰＰ３を用いた長期皮下処置を開始するマウス、及び（４）ＡＶＦ作製後に皮下にビヒクル対照処置を受けるマウス。
マウスを経時的に追跡し、様々な時点（例えば、ＡＶＦ作製の１週間後、２週間後、及び／又は３週間後など）で安楽死させる。組織学的分析を、ＡＶＦの部位における又はその近位の血管の切片に対して行う。
ＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合タンパク質で処置したマウスのＡＶＦ隣接血管における内膜過形成の程度が、ビヒクル対照を受けているマウスと比較して著しく低減されることが予期される。
実施例１７：心臓同種移植片血管障害に罹患しているヒト心臓移植患者の治療
ヒト成人心臓同種移植片レシピエントは、ＣＡＶを有するとして医師によって識別される。レシピエントは、Ｆｃ領域に融合された可溶形態のＥＮＰＰ１を含む融合タンパク質を含む医薬組成物を長期的に投与するか、又は投与される。医療専門家は、同種移植された心臓の１つ以上の血管における望ましくない内膜増殖の停止、及び／又は同種移植された心臓における血管閉塞の経時的な部分的若しくは完全な消散について、経時的にレシピエントをモニタリングする。融合タンパク質を用いた治療は、同種移植された心臓の１つ以上の血管における望ましくない内膜増殖を停止させるか、若しくは大幅に低減すること、及び／又は同種移植された心臓における血管閉塞を経時的に部分的若しくは完全に消散させることが予想される。
別の例では、Ｆｃ領域に融合された可溶形態のＥＮＰＰ１を含む融合タンパク質を含む医薬組成物を、移植時又はその前後に開始して、心臓同種移植片のレシピエントに長期的に投与して、同種移植された心臓の１つ以上の血管における望ましくない内膜増殖を予防するか、その発生の可能性を低下させるか、又はその程度を低減する。医療専門家は、同種移植された心臓の１つ以上の血管における望ましくない内膜増殖の存在及び／又はレベルについて、経時的にレシピエントをモニタリングする。融合タンパク質を用いた治療は、同種移植された心臓の１つ以上の血管における望ましくない内膜増殖を停止させるか、又は大幅に低減することが予想される。
実施例１８：モヤモヤ病に罹患しているヒトの治療
ヒト成人患者は、モヤモヤ病を有すると医師によって識別される。レシピエントは、Ｆｃ領域に融合された可溶形態のＥＮＰＰ１を含む融合タンパク質を含む医薬組成物を長期的に投与するか、又は投与される。医療専門家は、脳に供給する１つ以上の血管における望ましくない内膜増殖の停止、及び／又はそのような血管の閉塞の経時的な部分的若しくは完全な消散について、経時的にレシピエントをモニタリングする。融合タンパク質を用いた治療は、１つ以上の血管における望ましくない内膜増殖を停止させるか、若しくは大幅に低減すること、及び／又は血管閉塞を経時的に部分的若しくは完全に消散させることが予想される。
実施例１９：血液透析シャントを受けた透析患者の治療
Ｆｃ領域に融合された可溶形態のＥＮＰＰ１を含む融合タンパク質を含む医薬組成物を、血液透析シャントが対象内に留置されたとき、又はその前後に長期的に投与して、それによってシャントに接続された、又はシャントに関与する１つ以上の血管における望ましくない内膜増殖を予防するか、その発生の可能性を低下させるか、又はその程度を低減する。医療専門家は、血管のうちの１つ以上における望ましくない内膜増殖の存在及び／又はレベルについて、経時的にレシピエントをモニタリングする。融合タンパク質を用いた治療は、血管うちの１つ以上における望ましくない内膜増殖を停止させるか、又は大幅に低減することが予想される。
参照による組み込み
本明細書で参照されるありとあらゆる米国特許及び外国特許並びに係属中の特許出願及び刊行物の開示は、配列表及び図の内容と同様に、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
等価物
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載される特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、又は確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。任意の複数の従属請求項又は実施例に開示される実施形態の任意の組み合わせは、本開示の範囲内であることが企図される。
他の実施形態
前述の説明から、本開示に従う範囲内である病理学的石灰化又は骨化の存在によって特徴付けられるあらゆる疾患を治療するための、当該技術分野で既知の異なるプロモーター若しくはエンハンサー、又は異なる細胞型を有する異なるウイルスベクターにおける、ＥＮＰＰ１若しくはＥＮＰＰ３又はそれらの組み合わせの機能的バリアントを発現する異なるシグナル配列の使用を含む、様々な使用及び条件にそれを採用するために、本明細書に記載される開示に変形及び修正がなされ得ることは明らかであろう。本開示による他の実施形態は、以下の請求項の範囲内である。
本明細書の変数の任意の定義における要素の一覧の列挙は、任意の単一の要素又は列挙された要素の組み合わせ（又は部分的組み合わせ）としてのその変数の定義を含む。本明細書の実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、又は任意の他の実施形態若しくはその一部と組み合わせたその実施形態を含む。
本明細書で言及される全ての刊行物及び特許出願は、本開示が関連する当業者の技術レベルを示すものである。全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示唆された場合と同じ程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態は、以下の請求項の範囲内である。

Claims (155)

  1. 同種移植片を有する対象における同種移植片血管障害を低減及び／又は予防するための方法であって、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を前記対象に投与して、それによって前記対象における同種移植片血管障害を低減及び／又は予防することを含む、方法。
  2. 同種移植片を有する対象の前記同種移植片の血管系における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法であって、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を前記対象に投与して、それによって前記対象の前記同種移植片の前記血管系における前記血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む、方法。
  3. 固形臓器同種移植片を有し、前記臓器同種移植片の手術を受ける対象の固形臓器同種移植片における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法であって、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を前記対象に投与して、それによって前記対象の前記固形臓器同種移植片における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む、方法。
  4. 固形臓器同種移植片を有する対象の固形同種移植片の血管系における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防するための方法であって、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を前記対象に投与して、それによって前記固形臓器同種移植片の前記血管系における狭窄又は再狭窄を低減及び／又は予防することを含む、方法。
  5. 固形臓器同種移植片を有する対象における固形臓器同種移植片の生存を延長するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって前記対象における前記固形臓器同種移植片の生存を延長させるのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  6. 固形臓器同種移植片を有する対象の固形臓器同種移植片における血管障害を阻害又は予防するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、前記固形臓器同種移植片における血管障害を阻害又は予防するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  7. 前記固形臓器同種移植片が、心臓同種移植片である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記固形臓器同種移植片が、腎臓同種移植片、肝臓同種移植片、又は肺同種移植片である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記対象は、心臓同種移植片血管障害を発症するリスクがある、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記対象が、心臓同種移植片血管障害を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  11. 血管同種移植片を有する対象における同種移植された血管の血管障害を阻害又は予防するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、前記同種移植された血管の血管障害を予防又は阻害するのに十分な量で、対象に投与することを含む、方法。
  12. 血管同種移植片を有する対象における同種移植された血管における血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、前記同種移植された血管における血管平滑筋細胞増殖を予防又は阻害するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  13. 血管同種移植片を有する対象における同種移植された血管の生存を延長するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって前記同種移植された血管の生存を延長するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  14. 前記同種移植された血管が、同種移植された動脈である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記同種移植された血管が、同種移植された静脈である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ＥＮＰＰ１薬剤又は前記ＥＮＰＰ３薬剤が、前記固形臓器又は血管の移植前に前記対象に投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ＥＮＰＰ１薬剤又は前記ＥＮＰＰ３薬剤が、前記固形臓器又は血管の移植と同時に前記対象に投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ＥＮＰＰ１薬剤又は前記ＥＮＰＰ３薬剤が、前記固形臓器又は血管の移植後に前記対象に投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＥＮＰＰ１薬剤又は前記ＥＮＰＰ３薬剤が、前記固形臓器若しくは血管の移植前に、前記固形臓器若しくは血管の移植と同時に、及び／又は前記固形臓器若しくは血管の移植後に、前記対象に投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  20. スタチン、血管拡張薬、免疫抑制薬、又は抗凝固薬を前記対象に投与することを更に含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１の細胞外ドメインを含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１の触媒ドメインを含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸９９～９２５を含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、異種タンパク質を含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記異種タンパク質が、哺乳動物における前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期を増加させる、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記異種タンパク質が、イムノグロブリン分子のＦｃ領域である、請求項２７又は２８に記載の方法。
  30. 前記イムノグロブリン分子が、ＩｇＧ１分子である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記異種タンパク質が、アルブミン分子である、請求項２７又は２８に記載の方法。
  32. 前記異種タンパク質が、前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドのカルボキシ末端である、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、リンカーを含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記リンカーが、前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドと前記異種タンパク質を分離する、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記リンカーが、以下のアミノ酸配列：（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ｎが、１～１０の整数である、請求項３３又は３４に記載の方法。
  36. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、前記対象に皮下投与される、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、前記対象に静脈内投与される、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、ＥＮＰＰ３ポリペプチドを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む、請求項３５～４５のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３の細胞外ドメインを含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３の触媒ドメインを含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸４９～８７５を含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、異種タンパク質を含む、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記異種タンパク質が、哺乳動物における前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドの循環半減期を増加させる、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記異種タンパク質が、イムノグロブリン分子のＦｃ領域である、請求項４４又は４５に記載の方法。
  47. 前記イムノグロブリン分子が、ＩｇＧ１分子である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記異種タンパク質が、アルブミン分子である、請求項４４又は４５に記載の方法。
  49. 前記異種タンパク質が、前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドのカルボキシ末端である、請求項４４～４２のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、リンカーを含む、請求項４４～４８のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記リンカーが、前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドと前記異種タンパク質を分離する、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記リンカーが、以下のアミノ酸配列：（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ｎが、１～１０の整数である、請求項５０又は５１に記載の方法。
  53. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、前記対象に皮下投与される、請求項３８～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、前記対象に静脈内投与される、請求項３８～５２のいずれか一項に記載の方法。
  55. 補体阻害剤を前記対象に投与することを更に含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記補体阻害剤が、Ｃ５阻害剤である、請求項５５に記載の方法。
  57. モヤモヤ病を発症するリスクがある対象における脳血管閉塞を阻害又は予防するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって前記対象における脳血管閉塞を阻害又は予防するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  58. モヤモヤ病を発症するリスクがある対象における望ましくない血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって前記対象における望ましくない血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  59. モヤモヤ病を発症するリスクがある対象を治療するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって前記対象を治療するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  60. モヤモヤ病に罹患した対象における脳血管閉塞を阻害又は予防するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって前記対象における脳血管閉塞を阻害又は予防するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  61. モヤモヤ病に罹患した対象における望ましくない血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって前記対象における望ましくない脳血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  62. モヤモヤ病に罹患した対象を治療するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって前記対象を治療するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  63. 対象におけるモヤモヤ病に関連する１つ以上の症状を予防又は改善するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって前記対象におけるモヤモヤ病に関連する１つ以上の症状を予防又は改善するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  64. モヤモヤ病の治療として外科的介入を受ける予定であるか、又は受けたことがある対象における、脳血管閉塞を阻害又は予防するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって前記対象における脳血管閉塞を阻害又は予防するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  65. モヤモヤ病の治療として外科的介入を受ける予定であるか、又は受けたことがある対象における、望ましくない血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するための方法であって、ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を、それによって前記対象における望ましくない血管平滑筋細胞増殖を阻害又は予防するのに十分な量で、前記対象に投与することを含む、方法。
  66. 前記対象が、ＲＮＦ２１３ Ｒ４８１０Ｋ変異を有する、請求項５７～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記対象が、モヤモヤ病の家族歴を有する、請求項５７～６５のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記対象が、脳における狭窄、血栓、塞栓、及び／又は出血を経験する、請求項６２～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記外科的介入が、血管バイパス移植である、請求項６６又は６７に記載の方法。
  70. 前記外科的介入が、脳血行再建である、請求項６６又は６７に記載の方法。
  71. 前記ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤が、前記外科的介入前に前記対象に投与される、請求項６４～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤が、前記外科的介入と同時に前記対象に投与される、請求項６４～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記ＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤が、前記外科的介入後に前記対象に投与される、請求項６４～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記ＥＮＰＰ１薬剤又は前記ＥＮＰＰ３薬剤が、前記外科的介入前に、前記外科的介入と同時に、及び／又は前記外科的介入の移植後に、前記対象に投与される、請求項６４～７０のいずれか一項に記載の方法。
  75. 降圧薬及び抗凝固薬のうちの一方又は両方を前記対象に投与することを更に含む、請求項５７～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドを含む、請求項５７～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項５７～７５のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む、請求項５７～７５のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１の細胞外ドメインを含む、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１の触媒ドメインを含む、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸９９～９２５を含む、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、異種タンパク質を含む、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記異種タンパク質が、哺乳動物における前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期を増加させる、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記異種タンパク質が、イムノグロブリン分子のＦｃ領域である、請求項８２又は８３に記載の方法。
  85. 前記イムノグロブリン分子が、ＩｇＧ１分子である、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記異種タンパク質が、アルブミン分子である、請求項８２又は８３に記載の方法。
  87. 前記異種タンパク質が、前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドのカルボキシ末端である、請求項８２～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、リンカーを含む、請求項８２～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記リンカーが、前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドと前記異種タンパク質を分離する、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記リンカーが、以下のアミノ酸配列：（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ｎが、１～１０の整数である、請求項８８又は８９に記載の方法。
  91. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、前記対象に皮下投与される、請求項５７～９０のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、前記対象に静脈内投与される、請求項５７～９０のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、ＥＮＰＰ３ポリペプチドを含む、請求項５７～７５のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項５７～７５のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む、請求項９０～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３の細胞外ドメインを含む、請求項９３～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３の触媒ドメインを含む、請求項９３～９５のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸４９～８７５を含む、請求項９３～９５のいずれか一項に記載の方法。
  99. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、異種タンパク質を含む、請求項９３～９５のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記異種タンパク質が、哺乳動物における前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドの循環半減期を増加させる、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記異種タンパク質が、イムノグロブリン分子のＦｃ領域である、請求項９９又は１００に記載の方法。
  102. 前記イムノグロブリン分子が、ＩｇＧ１分子である、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記異種タンパク質が、アルブミン分子である、請求項９９又は１００に記載の方法。
  104. 前記異種タンパク質が、前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドのカルボキシ末端である、請求項９９～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、リンカーを含む、請求項９９～１０３のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記リンカーが、前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドと前記異種タンパク質を分離する、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記リンカーが、以下のアミノ酸配列：（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ｎが、１～１０の整数である、請求項１０５又は１０６に記載の方法。
  108. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、前記対象に皮下投与される、請求項９３～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、前記対象に静脈内投与される、請求項９３～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  110. 末梢血管の手術を必要とする対象の前記末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法であって、前記手術が、動静脈透析シャントの留置を含み、前記方法が、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を前記対象に投与して、それによって前記対象における前記末梢血管の手術部位での前記末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む、方法。
  111. 動静脈透析シャントが留置されている部位又はその周囲において対象の末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防するための方法であって、有効量のＥＮＰＰ１薬剤又はＥＮＰＰ３薬剤を前記対象に投与して、それによって前記動静脈透析シャントが留置されている前記部位又はその周囲において前記末梢血管における血管平滑筋細胞増殖の進行を低減及び／又は予防することを含む、方法。
  112. 前記薬剤が、前記手術又は前記シャント留置の前、その間、及び／又はその後に投与される、請求項１１０に記載の方法。
  113. 前記対象が、ＥＮＰＰ１の欠乏を有しない、請求項１１０～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドを含む、請求項１１０～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１１０～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  116. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む、請求項１１０～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  117. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１の細胞外ドメインを含む、請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１の触媒ドメインを含む、請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸９９～９２５を含む、請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドが、異種タンパク質を含む、請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  121. 前記異種タンパク質が、哺乳動物における前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期を増加させる、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記異種タンパク質が、イムノグロブリン分子のＦｃ領域である、請求項１２０又は１２１に記載の方法。
  123. 前記イムノグロブリン分子が、ＩｇＧ１分子である、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記異種タンパク質が、アルブミン分子である、請求項１２０又は１２１に記載の方法。
  125. 前記異種タンパク質が、前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドのカルボキシ末端である、請求項１２０～１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、リンカーを含む、請求項１１４～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記リンカーが、前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドと前記異種タンパク質を分離する、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記リンカーが、以下のアミノ酸配列：（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ｎが、１～１０の整数である、請求項１２６又は１２７に記載の方法。
  129. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、前記対象に皮下投与される、請求項１１０～１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、前記対象に静脈内投与される、請求項１１０～１２８のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、ＥＮＰＰ３ポリペプチドを含む、請求項１１０～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１１０～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む、請求項１１０～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３の細胞外ドメインを含む、請求項１３１～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、ＥＮＰＰ３の触媒ドメインを含む、請求項１３１～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸４９～８７５を含む、請求項１３１～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドが、異種タンパク質を含む、請求項１３１～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  138. 前記異種タンパク質が、哺乳動物における前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドの循環半減期を増加させる、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記異種タンパク質が、イムノグロブリン分子のＦｃ領域である、請求項１３７又は１３８に記載の方法。
  140. 前記イムノグロブリン分子が、ＩｇＧ１分子である、請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記異種タンパク質が、アルブミン分子である、請求項１３７又は１３８に記載の方法。
  142. 前記異種タンパク質が、前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドのカルボキシ末端である、請求項１３７～１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、リンカーを含む、請求項１１０～１１３又は１３１～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 前記リンカーが、前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドと前記異種タンパク質を分離する、請求項１４３に記載の方法。
  145. 前記リンカーが、以下のアミノ酸配列：（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ｎが、１～１０の整数である、請求項１４３又は１４４に記載の方法。
  146. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、前記対象に皮下投与される、請求項１１０～１１３又は１３１～１４５のいずれか一項に記載の方法。
  147. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、前記対象に静脈内投与される、請求項１１０～１１３又は１３１～１４５のいずれか一項に記載の方法。
  148. 前記対象が、タバコ使用者であるか、高血圧症を有するか、コレステロール値若しくはトリグリセリド値の上昇を有するか、糖尿病であるか、腎疾患を有するか、又は肥満である、請求項１１０～１４７のいずれか一項に記載の方法。
  149. 前記手術を行うことを更に含む、請求項１１０～１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 前記手術及び／又はシャント留置が、透析カテーテルの前記対象への導入を更に含む、請求項１１０～１４９のいずれか一項に記載の方法。
  151. 前記対象が、抗凝固薬、抗生物質、及び降圧薬のうちの１つ以上を受けているか、又は受けたことがある、請求項１１０～１５０のいずれか一項に記載の方法。
  152. 抗凝固薬、抗生物質、及び降圧薬のうちの１つ以上を前記対象に投与することを更に含む、請求項１１０～１５１のいずれか一項に記載の方法。
  153. 前記シャントの閉塞について前記対象をモニタリングすることを更に含む、請求項１１０～１５２のいずれか一項に記載の方法。
  154. 前記ＥＮＰＰ１薬剤が、酵素活性を保持するＥＮＰＰ１バリアントを含む、請求項１～１５３のいずれか一項に記載の方法。
  155. 前記ＥＮＰＰ３薬剤が、酵素活性を保持するＥＮＰＰ３バリアントを含む、請求項１～１５４のいずれか一項に記載の方法。
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