JP2023531123A - 粒子、dna、及びrna - Google Patents

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Abstract

本発明は、ウイルス性感染の治療または予防のための競合的な粒子(例えば、ウイルス様粒子、RNA、及びDNA)、ならびに対象(例えば、ヒトまたは動物)におけるウイルス性感染症(またはその症状)の治療もしくは予防またはそのリスク低減のために、このような粒子を使用する方法を提供する。例えば、本明細書における方法は、動物、例えば、家畜または野生動物(例えば、コウモリ、ラクダ科動物、または有鱗目(例えば、センザンコウ))におけるウイルスの人獣共通感染症集団を低減またはその確立を低減する方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、ウイルス性感染症の治療または予防のための粒子(例えば、ウイルス様粒子(VLP)及び非自己複製性粒子)、ならびに対象(例えば、ヒトまたは動物)におけるウイルス性感染症(またはその症状)の治療もしくは予防またはそのリスク低減のために、このような粒子を使用する方法を提供する。粒子(例えば、VLP)は、宿主細胞内でウイルスと競合することにより、ウイルスの複製または伝播を低減する。例えば、本明細書における方法は、動物、例えば、家畜または野生動物(例えば、コウモリ、ラクダ科動物、または有鱗目(例えば、センザンコウ))におけるウイルスの人獣共通感染症集団を低減またはその確立を低減する方法である。
ニドウイルスの中で最もよく研究されているコロナウイルス及びアルテリウイルスは、不連続RNA転写という、類似性支援コピーチョイス(similarity-assisted copy-choice)RNA組換えに似たプロセスを伴った独自の転写機構を用いる。感染時には、sgマイナス鎖RNA鋳型のミラーセットから複数のサブゲノム(sg)mRNAが転写される。sgmRNAはいずれも、ゲノムRNAの5’末端に由来する短い5’共通リーダー配列(L)を有する。不連続の「リーダー」(TRS-L)及び「本体」(TRS-B)配列の連結は、おそらくはマイナス鎖の合成時に起こると考えられる。全てのニドウイルスでは、最も5’側の3分の2のゲノムがレプリカーゼポリタンパク質遺伝子で占められている。下流には複数のより小さな遺伝子が存在し、これらは、最大8個のsgmRNAの入れ子構造セットから発現する。アルテリウイルス及びコロナウイルスの場合、これらのsgmRNAはキメラであり、ゲノムと3’及び5’末端を共有している。これらは全て、ゲノムRNAの5’末端に由来し転写物の「本体」(すなわち、コード情報を保有する3’末端部分)と融合した、5’共通リーダー配列を有する。コロナウイルスのリーダーが55~92ヌクレオチドであるのに対し、アルテリウイルスのリーダーの長さは約200ヌクレオチドである。リーダー配列及びmRNA本体配列は、各転写単位に先行する短い保存された配列モチーフである転写調節配列(TRS)内で連結している。Snijder及び共同研究者は、アルテリウイルスにおいて、(-)鎖RNAの合成中にリーダー-本体融合が生じるという説得力のある証拠を示し、これは類似性支援コピーチョイスRNA組み換えに似たプロセスを介して生じると考えられる。テンプレートスイッチングは、初期のsg(-)鎖上の抗TRSと最も5’側のゲノムTRSとの塩基対形成によって誘導されると思われる。
重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス(SARS-CoV)は、ゲノムサイズがおよそ29,700ヌクレオチド(nt)の一本鎖プラス鎖RNAウイルスであり、少なくとも14個のオープンリーディングフレーム(ORF)をコードする典型的なコロナウイルスゲノム編成を有する。SARS-CoVゲノムの最初の3分の2は、2つの大きな重複したORF(ORF 1a及びORF 1b)を産生する。残りの12のORFは、ウイルスゲノムの残りの3分の1から生成される。SARS-CoVは、ヒト肺細胞などの宿主細胞に感染した後に、膜融合及びエンドサイトーシスにより、その遺伝子内容物を細胞質内に放出し、ORF 1a及びORF 1bから2つの大きなポリタンパク質pp1aとpp1abを直ちに合成する。これらは、プログラム-1リボソームフレームシフトと呼ばれるプロセスに関与する。続いて、ポリタンパク質pp1a及びpp1abは、16の非構造タンパク質生成のためのタンパク質分解に供される。これらのタンパク質には、ウイルスゲノム複製及びウイルスRNA合成に必須であるタンパク質が含まれる。SARS-CoVゲノムの3’側の1/3に位置する5’→3’方向のORFは、構造タンパク質S(ORF 2)、E(ORF 4)、M(ORF 5)、及びN(ORF 9)をコードする主要な4つの遺伝子をコードする。残りのORFは、他の8つのアクセサリータンパク質をコードする。2つのORF、ORF3a及びORF3bがS遺伝子とE遺伝子との間に位置し、ORF 6、7a、7b、8a、及び8bはM遺伝子とN遺伝子との間にあり、また、N遺伝子は、細胞質と核との間を往復し抗自然免疫応答を誘導する内部ORF 9bタンパク質も含む。
SARS-CoVは、ウイルスレプリカーゼタンパク質が産生されると、プラスゲノムサイズRNAと、不連続転写により55~100ヌクレオチドの同一の5’リーダー配列を有する3’共末端サブゲノムmRNA(sgmRNA)の入れ子構造セットとを生成するために、ウイルスゲノムの転写及び複製を開始することにより、ウイルス性感染の第2段階を経る。マイナス鎖サブゲノムRNAを合成するために、複製-転写複合体(RTC)は、プラスRNAゲノム鋳型に沿ってその3’末端から処理し、各ORFの上流の本体TRS(TRS-B)を減衰シグナルとして読み取り、初期RNAを再配置して、3’リーダーTRS(TRS-L)を認識することによりゲノムリーダー配列をコピーするか、次のTRS-Bに出会うために継続的に転写する。TRSは、可変配列に囲まれた保存された6~7ntコアエレメント配列(CE)を含む。マイナス鎖RNAの産生は、その後のmRNAの合成のための複製鋳型を提供するように機能する。マイナス鎖合成時に、RdRP(RNA依存性RNAポリメラーゼ)は本体内のTRS(TRS-B)を横断すると休止し、鋳型をリーダー内のTRS(TRS-L)に切り替え、その結果リーダー-本体融合が生じる。融合したマイナス鎖中間体から、プラス鎖のmRNAが転写される。短いsgRNAは、保存された構造タンパク質(スパイクタンパク質(S)、エンベロープタンパク質(E)、膜タンパク質(M)、及びヌクレオカプシドタンパク質(N))、63、ならびにいくつかのアクセサリータンパク質をコードする。
SARS-CoV-2は、他のコロナウイルス(ニドビル目コロナウイルス科コロナウイルス亜科)と同様に、約30kbのプラスセンス一本鎖RNAゲノムを有するエンベロープ型ウイルスである。SARS-CoV-2は、SARS-CoV及び中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)とともに、ベータコロナウイルス属に属する(それぞれ80%、39 50%の相同性を有する)。コロナウイルス(CoV)は、主に鳥類及び哺乳類における地方病性感染症を引き起こすと考えられていた。しかし、SARS、MERS、続いてCOVID-19が繰り返し発生したことで、種の壁を越えてヒトの間を伝播するCoVの顕著な能力が示された。SARS-Cov-2は、ヒト細胞上のACE2との結合に依存する感染性を含め、SARS-Covと多くの類似点を共有する。これらのウイルスはコロナウイルスであり、同様の不連続転写を共有すると考えられている。SARS-CoV-2は、8つのゲノムRNAに加えて、全てのコロナウイルスに共通するタイプであるサブゲノムタイプRNAを産生する。SARS-CoV-2は、現在のアノテーション(NCBI65参照配列:NC_045512.2)によると、6つのアクセサリータンパク質(3a、6、7a、7b、8、及び10)を有することが知られている。SARS-CoV-2(旧2019-nCoV)ゲノムは、5’-レプリカーゼ(orf1/ab)-構造タンパク質[スパイク(S)-エンベロープ(E)-膜(M)-ヌクレオカプシド(N)]-3’の順に配置され、系統A β-CoVで特徴的に見られるヘマグルチニン-エステラーゼ遺伝子が欠如している。SARS-CoV-2のスパイク糖タンパク質は、S1サブユニット及びS2サブユニットから構成されている。S1サブユニットは、シグナルペプチド、N末端ドメイン(NTD)、受容体結合ドメイン(RBD)を含み、一方S2サブユニットは、保存された融合ペプチド(FP)、ヘプタッドリピート(HR)1及び2、膜貫通ドメイン(TM)、ならびに細胞質ドメイン(CP)を含む。SARS-CoV-2のS2サブユニットは高度に保存されており、2つのコウモリSARS様CoV(SL-CoV ZXC21及びZC45)ならびにヒトSARS-CoVのものと99%の同一性を共有する。SARS-CoV-2のゲノムは、コウモリSARS関連CoV SL-CoVZXC21(MG772934.1)と全体で89%のヌクレオチド同一性を有し、ヒトSARS-CoV BJ01 2003(AY278488)及びヒトSARS-CoV Tor2(AY274119)と82%のヌクレオチド同一性を有する。
本発明は、ウイルスがその生活環の一部として不連続な転写に関与する、対象におけるウイルス性感染症の治療もしくは予防またはそのリスクの低減に有用である。また、本発明は、ヒトまたは動物におけるこのようなウイルスによる感染の診断方法、ウイルス性核酸の検出方法、及びRNAを含む粒子の産生方法も提供する。
第1の構成において、本発明は、
ヒトまたは動物の対象のウイルスによる感染症の治療またはそのリスクの低減のために、当該対象に投与するための粒子(例えば、ウイルス様粒子(VLP))を提供し、ここで、ウイルスはRNA遺伝子を含み、ウイルスは対象の宿主細胞(例えば、ヒト細胞)に感染可能であり、ウイルスのゲノムはRNA配列(L)を含み、Lは第1の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE1)を含み、ウイルスの複製は第1のサブゲノムRNA(sgRNA1)の転写を含み、sgRNA1は第2の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE2)を含み、TRS-CE1は宿主細胞内のTRS-CE2とハイブリダイズ可能であり、
粒子はRNAを含み、粒子は、粒子RNAの転写のために対象の宿主細胞内に粒子RNAを導入可能であり、粒子RNAまたはその転写物は、TRS-CE(例えば、転写調節配列本体コアエレメント(TRS-B CE))を含み、ウイルス性RNAが粒子RNAまたは転写物とともに宿主細胞内に存在する場合、粒子RNAまたは転写物のTRC-CEが、ウイルスRNAに含まれるTRS-CE(例えば、転写調節配列リーダーコアエレメント(TRS-L CE))とハイブリダイズ可能であり、
粒子RNAまたは転写物のTRS-CE(例えば、TRS-B CE)の、ウイルスRNAに含まれる(例えば、ウイルスRNAゲノムに含まれる)TRS-CE(例えば、TRS-L CE)とのハイブリダイズが、ウイルス複製を低減する。
例えば、ウイルスRNAゲノム及び粒子RNAはいずれも(+)ssRNAである。
第1の構成の1つの態様は、
ウイルスによるヒトまたは動物の対象の感染症の治療またはそのリスクの低減のために当該対象に投与するためのウイルス様粒子(VLP)を提供し、ここで、ウイルスはRNAゲノムを含み、
ウイルスは対象の宿主細胞(例えば、ヒト細胞)に感染可能であり、ウイルスゲノムはRNA配列(L)を含み、Lは第1の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE1)を含み、ウイルスの複製は第1のサブゲノムRNA(sgRNA1)の転写を含み、sgRNA1は第2の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE2)を含み、TRS-CE1は宿主細胞内のTRS-CE2とハイブリダイズ可能であり、
VLPはRNAを含み、VLPは、VLP RNAの転写のために対象の宿主細胞内にVLP RNAを導入可能であり、VLP RNAまたはその転写物は、
(i)(a)TRS-CE1もしくは(b)宿主細胞内でTRS-CE1とハイブリダイズ可能な配列を含む、及び/または
(ii)(a)TRS-CE2もしくは(b)宿主細胞内でTRS-CE2とハイブリダイズ可能な配列を含み、
ウイルスRNAが、VLP RNAまたは転写物とともに宿主細胞内に存在する場合、
(iii)構成要素(i)(a)は、ウイルスRNAによってコードされるsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズする、
(iv)構成要素(i)(b)は、ウイルスRNAに含まれるTRS-CE1とハイブリダイズする、
(v)構成要素(ii)(a)は、ウイルスRNAに含まれるTRS-CE1とハイブリダイズする、及び/または
(vi)構成要素(ii)(b)は、当該ウイルスRNAによってコードされるsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズし、
(iii)~(vi)のいずれかのハイブリダイズがウイルス複製を低減する。
第2の構成において、本発明は、
本発明に従う複数のVLPを含む組成物を提供する。
第3の構成において、本発明は、
ウイルスによるヒトまたは動物の対象の感染症の治療またはそのリスクの低減のための方法も提供され、当該方法は、当該対象に当該組成物を投与することを含む。
第4の構成において、本発明は、
ウイルスによるヒトまたは動物の対象の感染症の症状(例えば、炎症)の治療またはそのリスクの低減のための方法も提供され、当該方法は、当該対象に組成物を投与することを含む。
第5の構成において、本発明は、
宿主細胞におけるウイルスの複製を阻害する方法を提供し、ウイルスが(+)ssRNAゲノムを含み、ウイルスゲノムが、TRS-L CEを含み、かつTRS-B CE(CE2)を含むsgRNA転写物をコードし、当該方法は、
a)宿主細胞を本発明の粒子(または本発明のRNA)に接触させることと、粒子RNA(またはRNA)を宿主細胞内に導入することであって、粒子RNAが、CE2の相補物(例えば、100%または少なくとも80%の相補物)である配列を含む(+)ssRNAである、導入することとを含み、
b)ステップ(a)と同時に、ステップ(a)の後に、またはステップ(a)の前に、ウイルスRNAゲノムが宿主細胞内に導入され、
転写プロセスが行われ、粒子RNAが細胞内で転写されて、CE2またはウイルスTRS-L CEとハイブリダイズ可能な配列を含むRNA転写物を産生し、当該転写物は、ウイルスの(+)ssRNAに含まれるTRS-L CEとハイブリダイズしてRNAハイブリッドを形成し、当該ハイブリッドは、リーダー配列(L)を含むmRNAを産生するのに使用され、当該リーダーは、当該ウイルスの複製、伝播、及び感染性に必要とされるタンパク質のアミノ酸配列(A)をコードするRNA配列に作用可能に結合していない。
第6の構成において、本発明は、
複数の粒子を産生する方法を提供し、当該方法は、複数の粒子(例えば、VLP、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞)を複数のRNAと組み合わせることであって、各RNAが本発明のRNAであり、少なくとも1つのRNAが、複数の粒子のそれぞれの粒子の中及び/または上に組み込まれる、組み合わせることと、任意選択で、ウイルス性感染症の治療または予防のためにヒトまたは動物の対象に投与するための医薬組成物を産生するために、粒子を製剤化することとを含む。
第7の構成において、本発明は、
試料中のウイルスRNAを検出する方法を提供し、ウイルスは、第1のTRS-CE(CE1)及び第2のTRS-CE(CE2)のハイブリダイズを含む不連続RNA転写プロセスを用いて複製し、当該方法は、試料を本発明のRNA(第1のRNA)に接触させることと、第1のRNAと試料に含まれるウイルスRNAとの間で形成されたハイブリッドを検出することとを含む。
第8の構成において、本発明は、
ヒトまたは動物の対象におけるウイルス性感染症を診断するための本発明のRNAの使用を提供し、ここで、ウイルスは不連続RNA転写プロセスを用いて複製する。
第9の構成において、本発明は、
ヒトまたは動物の対象におけるウイルス性感染症を治療または予防する方法を提供し、当該方法は、対象に、本発明の粒子またはRNAを投与することを含む。
本発明は、ウイルスがその生活環の一部として不連続な転写に関与する、対象におけるウイルス性感染症の治療もしくは予防またはそのリスクの低減に有用である。したがって、好ましくは、ウイルスは不連続RNA転写を利用して複製するウイルスである。本明細書では、粒子はVLPによって例示されるが、本明細書内でVLPが記載されている場合、文脈が許す限り、当該記載は、代替的に広く粒子(例えば、医薬的に許容される粒子、その例は当業者には明らかであろう)に必要な変更を加えて適用され得る。
本発明は、ウイルス性感染症の治療または予防のための粒子(例えば、ウイルス様粒子)、ならびに対象(例えば、ヒトまたは動物)におけるウイルス性感染(またはその症状)の治療もしくは予防またはそのリスク低減のために、このような粒子を使用する方法を提供する。例えば、本明細書における方法は、動物、例えば、家畜または野生動物(例えば、コウモリ、ラクダ科動物、または有鱗目(例えば、センザンコウ))におけるウイルスの人獣共通感染症集団を低減またはその確立を低減する方法である。宿主細胞において、VLPは有用に、ウイルスリーダーを含むsgRNAを産生可能である。このようなsgRNAは、細胞の翻訳機構と競合し、細胞内のウイルス核酸によって産生されるsgRNAを遠ざける。VLP由来sgRNAは、オープンリーディングフレーム(ORF)を含まない場合もあれば、ウイルスの複製、伝播、または感染性に必要とされないタンパク質をコードする場合もあり、例えば、このタンパク質は、対象内でのウイルスの生存能力をさらに低減する抗ウイルス性タンパク質ですらあってもよい。sgRNAが産生される際には、転写のレベルでの競合ももたらされる。この例では、sgRNA中間体が粒子またはVLP RNAを用いて転写され、各中間体は、その3’末端に、ウイルスゲノムのTRS配列(TRS-L)のコアエレメント(CE1)とハイブリダイズすることができるコアエレメント(CE2)を有するTRS配列(TRS-B)を含む。これは、例えば、ウイルスが(+)ssRNAウイルスであり、本発明の粒子RNAが(+)ssRNAであり、中間体が(-)ssRNAである場合に有用である。このようにして、このハイブリダイズは、ウイルスTRS-BがTRS-Lとハイブリダイズする必要性と競合するため、後者の事象の発生が低減または排除され、ウイルスmRNAが低減または排除される。したがって、例えば、これが1つ、複数、または全てのウイルス構造タンパク質(例えば、細胞内のM、S、E、及びN)の産生を低減し、このことがウイルスの複製または伝播を低減する。それにより本発明は、ウイルス性感染症またはその症状(例えば、炎症)の治療、予防、またはそのリスク低減に有用である。例えば、粒子またはVLPが、ウイルスにとっての細胞受容体(例えば、ACE2)と同族のリガンド(例えば、スパイクタンパク質)を含む場合、さらなるレベルの競争が存在し得る。このようにして、VLPは、宿主細胞への侵入に関して対象内でウイルスと競合し、これにより、予防レジームにおけるウイルス性感染またはその確立の低減にさらに寄与することができる。例えば、ウイルスがコロナウイルスである場合、そのスパイクタンパク質は、細胞表面のACE2タンパク質に結合することによって、対象の宿主細胞に付着するが、本発明の粒子も表面スパイクタンパク質(例えば、ウイルスが産生するスパイクタンパク質と同一のもの)を含むことで、粒子は、ウイルス粒子と宿主細胞への付着に関して競合し、それにより、対象におけるウイルスの感染性を低減する。
VLP、組成物、または方法が、動物におけるウイルスの感染を治療または予防するためのものである場合、これは、ヒトに伝播性のウイルスの人獣共通感染症集団(このような場合、ウイルスは、ヒトにおけるウイルス性感染または疾患もしくは状態(もしくは死)を引き起こす恐れがある)を低減するために有利である。この点において、動物は、家畜動物、例えば、ブタ、家禽(例えば、ニワトリ、アヒル、もしくはシチメンチョウ)、ヒツジ、ウシ、ヤギ、魚類、または甲殻類とすることができる。一例において、動物は、コウモリ、タヌキ、センザンコウ、イヌ、ネコ、パームシベット、またはラクダ科動物(例えば、ラクダもしくはヒトコブラクダ)である。一例において、動物は鳥類である。
1つの実施形態において、
ウイルスによるヒトまたは動物の対象の感染症の治療またはそのリスクの低減のために当該対象に投与するためのウイルス様粒子(VLP)を提供し、ここで、ウイルスはRNAゲノムを含み、
ウイルスは対象の宿主細胞(例えば、ヒト細胞)に感染可能であり、ウイルスゲノムはRNA配列(L)を含み、Lは第1の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE1)を含み、ウイルスの複製は第1のサブゲノムRNA(sgRNA1)の転写を含み、sgRNA1は第2の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE2)を含み、TRS-CE1は宿主細胞内のTRS-CE2とハイブリダイズ可能であり、
VLPはRNAを含み、VLPは、VLP RNAの転写のために対象の宿主細胞内にVLP RNAを導入可能であり、VLP RNAまたはその転写物は、
(i)(a)TRS-CE1もしくは(b)宿主細胞内でTRS-CE1とハイブリダイズ可能な配列を含む、及び/または
(ii)(a)TRS-CE2もしくは(b)宿主細胞内でTRS-CE2とハイブリダイズ可能な配列を含み、
ウイルスRNAが、VLP RNAまたは転写物とともに宿主細胞内に存在する場合、
(iii)構成要素(i)(a)は、ウイルスRNAによってコードされるsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズする、
(iv)構成要素(i)(b)は、ウイルスRNAに含まれるTRS-CE1とハイブリダイズする、
(v)構成要素(ii)(a)は、ウイルスRNAに含まれるTRS-CE1とハイブリダイズする、及び/または
(vi)構成要素(ii)(b)は、当該ウイルスRNAによってコードされるsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズし、
(iii)~(vi)のいずれかのハイブリダイズがウイルス複製を低減する。
当業者は知っているであろうように、ウイルス複製の一部として不連続RNA転写を行うウイルスの場合、TRS-CE1は、mRNA転写物を産生するプロセスにおいて、宿主細胞内のTRS-CE2とハイブリダイズする。転写物の翻訳は、ウイルス複製に必要とされるウイルスタンパク質を発現するために必要である。
1つの実施形態において、VLP RNAは、TRS-CE1及びTRS-CE2またはTRS-CE2の複数のコピーを含む。例えば、VLP RNAは、本明細書に記載のような複数のmRNAを発現可能であり、この複数のmRNAはTRS-CE2を各々含む。
任意選択で、Lは、リーダーペプチド、例えば、2個の連続したアミノ酸を含むか、またはそれらからなるペプチド、例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、または250個以下の連続したヌクレオチドを含むペプチドをコードする。
一例において、sgRNA1は(-)ssRNAであり、粒子RNAは(+)ssRNAであり、ウイルスゲノムは(+)ssRNAである。
さらに、1つの実施形態において、VLP RNAは、
(i)TRS-CE1、及び/または
(ii)宿主細胞内でTRS-CE2とハイブリダイズ可能な配列を含み、
ウイルスRNAが、VLP RNAとともに宿主細胞内に存在する場合、
(iii)構成要素(i)は、ウイルスRNAによってコードされるsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズする、及び/または
(iv)構成要素(ii)の転写物は、ウイルスRNAに含まれるTRS-CE1とハイブリダイズし、
(iii)及び/または(iv)のハイブリダイズがウイルス複製を低減する。
(iii)に加えて、またはその代替として、構成要素(i)は、構成要素(ii)の転写物に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズする。したがって、宿主細胞において、粒子RNAのコピー内のTRS-CE1は、粒子RNAの転写物に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズし、粒子RNAの異なるコピーに含まれるTRS-CE1は、ウイルスゲノムから転写されたsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズすることができる。このように、粒子RNAは、ウイルスの複製または感染性に必要とされるウイルスタンパク質をコードするRNA配列内に転写できないため、第1のハイブリダイズでは、このようなタンパク質の発現において非生産的なハイブリッドが産生され得る。さらに、粒子RNAは、TRS-CE1のすぐ3’側に、(a)停止コドンを含む、及び/あるいはウイルスペプチドではないかまたはウイルスの複製もしくは感染性のための使用には機能しないペプチドをコードする、あるいは(b)抗ウイルス剤である、RNA配列を含むため、第2のハイブリダイズでは、ウイルス複製または感染性に必要とされるウイルスタンパク質の発現において非生産的なハイブリッドが産生され得る。したがって、タンパク質がTRS-CE1を含むリーダーを用いて産生されないか、ウイルスが複製もしくは感染性のために使用できないペプチドが産生されるか、またはタンパク質がウイルス複製もしくは感染性を阻害する。
好ましくは、VLP RNAのCE1は、TRS-L配列、例えば、ウイルスのTRS-L配列と同一または少なくとも90、95、96、97、98、もしくは99%同一のTRS-L配列に含まれる。一例において、ウイルスはCoVウイルス(例えば、SARS-CoV-2)であり、VLP RNAのCE1は、TRS-L配列(例えば、ウイルスまたは異なるCoV(例えば、SARS-CoV)のTRS-L配列に同一または少なくとも90、95、96、97、98、または99%同一であるTRS-L配列)に含まれる。例えば、ウイルスはSARS-CoVであり、異なるウイルスは、SARS-CoV、SARS-Cov2、及びMERS-Covから選択される。例えば、ウイルスはSARS-CoV-2であり、異なるウイルスは、SARS-CoV、SARS-Cov2、及びMERS-Covから選択される。例えば、ウイルスはMERS-CoVであり、異なるウイルスは、SARS-CoV、SARS-Cov2、及びMERS-Covから選択される。
好ましくは、CE2は、TRS-B配列、例えば、ウイルスのTRS-B配列と同一または90、95、96、97、98、もしくは99%同一であるTRS-B配列に含まれる。一例において、ウイルスはCoVウイルス(例えば、SARS-CoV-2)であり、VLP RNAのCE1は、TRS-L配列(例えば、ウイルスまたは異なるCoV(例えば、SARS-CoV)のTRS-L配列に同一または少なくとも90、95、96、97、98、または99%同一であるTRS-L配列)に含まれる。例えば、ウイルスはSARS-CoVであり、異なるウイルスは、SARS-CoV、SARS-Cov2、及びMERS-Covから選択される。例えば、ウイルスはSARS-CoV-2であり、異なるウイルスは、SARS-CoV、SARS-Cov2、及びMERS-Covから選択される。例えば、ウイルスはMERS-CoVであり、異なるウイルスは、SARS-CoV、SARS-Cov2、及びMERS-Covから選択される。
任意選択で、本発明のCE1及びCE2は、それぞれウイルスのCE1及びCE2と同一である。任意選択で、本発明のTRS-L及び/またはTRS-Bは、それぞれウイルスのCE1及び/またはCE2と同一である。
少なくとも、ハイブリダイズの効果は、VLP RNA(またはその転写物)が、ウイルスsgRNAとウイルスリーダーTRS-CE1を巡って競合する、及び/またはウイルスリーダーTRS-CE1とウイルスsgRNA TRS-CE2配列を巡って競合することである。したがって、少なくとも転写レベルでは競争が存在する。さらに、VLP RNAにコードされたまたは含まれるRNA配列を含むmRNAハイブリッドの翻訳は、転写及び翻訳機構の使用を巡って完全ウイルスmRNAと競合するため、細胞の翻訳機構を巡る競合も生じ得る。これがウイルスの複製を低減することになる。
例えば、VLP RNAは、VLP RNAの調節領域の3’側に作用可能に接続しているTRS-L配列の一部としてTRS-CE1を含み、この調節領域は、転写及び/もしくは翻訳の開始に関し欠陥があるか、またはTRS-Lの5’側に作用可能に接続している転写もしくは翻訳開始調節領域がないか、またはTRS-Lはリーダー配列として欠陥がある配列に含まれる。(一例において、この場合、VLP RNAはプラス鎖ssRNAである)。このように、VLP RNAのTRS-CE1がウイルスsgRNAのTRS-CE2とハイブリダイズしてハイブリッドmRNA(例えば、VLP RNAがプラス鎖RNAの場合はプラス鎖ハイブリッドmRNA)が産生されたとしても、ハイブリッドmRNAからの転写及び/または翻訳が生じないため、ウイルス遺伝子産物、例えば、ウイルス構造タンパク質は産生されない。代替形態として、VLP RNAは、リーダー配列として機能しない、TRS-CE1を含む欠陥配列をコードする。例えば、欠陥配列は、ウイルスRNAゲノムのリーダー配列の変異バージョンである。このように、ハイブリッドmRNAが産生されタンパク質に翻訳されたとしても、細胞はこのタンパク質を適切に処理することができない。そのため、これにより、生産的なウイルス複製に利用可能なタンパク質の量が低減される。任意選択で、VLP RNAは、この段落に記載のように、複数のリーダー配列または欠陥配列を含む。任意選択で、VLP RNAは、この段落に記載の複数のリーダー配列または欠陥配列を含み、その転写及び/または翻訳は、VLP RNA内の当該配列の最も5’側の5’に作用可能に接続された共通の調節領域から駆動される。したがって、VLPは、ウイルスによってコードされるsgRNAに含まれるTRS-BのCE2との結合を巡り、ウイルスRNAゲノムの単一のTRS-CE1に打ち勝つことができる。一例において、本発明の各リーダー配列または欠陥配列は、それ自身のプロモーター(例えば、構成的プロモーターまたは強力プロモーター)を用いて転写可能であるが、そのmRNAは翻訳開始については機能せず、それにより、ウイルスゲノムによって産生されるよりもはるかに多くの本発明の欠陥配列の産生が可能となる。一例において、そのまたは各プロモーターはU6プロモーターである。
直前の段落の例に対する追加または代替形態として、VLP RNA(例えば、プラス鎖ssRNA)はTRS-CE2を含むTRS-Bを含む相補物を含むことができ、TRS-CE2の相補物は、ウイルスRNAゲノムのTRS-LのCE1とハイブリダイズ可能なRNA転写物をコードする。このように、転写物は、ウイルスゲノムによってコードされるsgRNAと、ウイルスゲノムによってコードされるTRS-LのCE1への結合を巡って競合し、それにより、転写レベル及び翻訳レベルで競合する。好ましくは、VLP RNAのTRS-BまたはTRS-B相補物は、ウイルスタンパク質(例えば、ウイルスのタンパク質、例えば、ウイルスの構造タンパク質)をコードする配列に作用可能に結合していない。例えば、TRS-BまたはTRS-Bの相補物は、ORFに作用可能に結合していないか、またはウイルスもしくは前述のウイルスのN、S、E、もしくはMタンパク質をコードするORFに作用可能に結合していない。例えば、TRS-BまたはTRS-B相補物は、前述のウイルス(または任意のウイルス)のN、S、7a、3a、8、M、E、6、または7bタンパク質をコードする配列に作用可能に結合していない。任意選択で、ここではウイルスはコロナウイルス、例えばSARS-コロナウイルスである。このように、転写物(すなわち、VLP RNAによってコードされ、これを鋳型として発現した転写物)に含まれるCE2が、ウイルスRNAゲノムのTRS-LのCE1とハイブリダイズし、RNA鎖が伸長してmRNAが産生されたとしても、そのmRNAはこのようなタンパク質への翻訳において生産的でないため、ウイルス複製に有用なタンパク質が作出されず、それにより、ウイルス性感染、伝播、または感染性の低減に寄与することになる。一例において、TRS-BまたはTRS-B相補物は、細胞内で抗ウイルスタンパク質(例えば、インターフェロン、例えば、I型インターフェロンまたはインターフェロン-β)を発現するためのORFに作用可能に結合している。任意選択で、VLP RNAは、この段落に記載の複数の前述のTRS-BまたはTRS-Bの相補配列を含む。このように、VLPに由来するTRS-Bは、CE1との結合を巡って、ウイルスRNAゲノムのTRS-Bに打ち勝つことができる。一例において、本発明の各前述のTRS-B配列またはその相補物は、それ自身のプロモーター(例えば、構成的プロモーターまたは強力プロモーター)を用いて転写可能であり、それにより、ウイルスゲノムによって産生されるよりもはるかに多くの本発明の欠陥配列の産生が可能となる。一例において、そのまたは各プロモーターはU6プロモーターである。
SAR-Covゲノムは、以下の遺伝子構成を含む。
5’-レプリカーゼ(orf1/ab)-[構造タンパク質:スパイク(S)-エンベロープ(E)-膜(M)-ヌクレオカプシド(N)]-3’
1つの実施形態において、VLP RNAは、ウイルスのsgRNA TRS-Bをコードする配列を以下の順序で含む。
5’-[スパイク(S)TRS-Bをコードする配列]-[エンベロープ(E)TRS-Bをコードする配列]-[膜(M)TRS-Bをコードする配列]-[ヌクレオカプシド(N)TRS-Bをコードする配列]-3’
1つの実施形態において、VLP RNAは、ウイルスのRNA[スパイク(S)TRS-Bをコードする配列]を含む。1つの実施形態において、VLP RNAは、ウイルスのRNA[エンベロープ(E)TRS-Bをコードする配列]を含む。1つの実施形態において、VLP RNAは、ウイルスのRNA[膜(M)TRS-Bをコードする配列]を含む。1つの実施形態において、VLP RNAは、ウイルスのRNA[ヌクレオカプシド(N)TRS-Bをコードする配列]を含む。
任意選択で、[スパイク(S)TRS-Bをコードする配列]は、ウイルスの切断された(例えば、C末端切断された)または変異したSをコードするRNA配列のすぐ5’側にある。例えば、RNA配列は、ウイルスRNAゲノムの全体のS ORFに比べて切断されており、ウイルスRNAゲノム内でSをコードする配列の最初の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、または150個の連続したヌクレオチドを含む。これは、宿主細胞内でVLP RNAのこの部分を適切に転写及び/または翻訳するためのネイティブウイルスTRS-B/Sコード配列の接合部を保持するのに有用であり得る。切断または変異した配列は、それに対応して、ウイルスの複製、伝播、または感染性において機能しない変異形態または切断形態のSタンパク質に翻訳され得る。そのため、このような欠陥タンパク質を、細胞によって産生され得る任意のウイルス粒子に組み込み、それにより、細胞から放出されたときの感染性を妨害することができる。これもまた、対象におけるウイルス性感染を低減する方法を提供する。さらに、VLP及びウイルスRNAの組換えにより、ウイルスゲノムに欠陥配列を挿入し、タンパク質の産生において非機能的にすることができる。これもまた、ウイルス性感染の低減に寄与し得る。さらに、任意のウイルス粒子が宿主細胞内でパッケージングされると、一部が欠陥配列をパッケージングし、これらの欠陥粒子が野生型ウイルス粒子と競合して対象内で循環し(cirulcated)、それによりさらなる感染低減の方法を提供することができる。実際に、ウイルス粒子は、VLP RNAのコピーをパッケージ化し、これらの粒子を対象内に伝播させ、それにより、これらの粒子は野生型ウイルス粒子と競合することができる。VLP粒子がそのRNAを宿主細胞内に導入すると、次にこれらの細胞は「免疫」され、本明細書に記載の本発明の競合メカニズムを発現及び関与させることが可能になる。したがって、これもまた、対象におけるウイルス性感染症を低減するように作用し得る。
直前の段落における概念は、[エンベロープ(E)TRS-Bをコードする配列]を使用する場合に必要な変更を加えて適用される。直前の段落における実施形態は、[膜(M)TRS-Bをコードする配列]を使用する場合に必要な変更を加えて適用される。直前の段落における実施形態は、[ヌクレオカプシド(N)TRS-Bをコードする配列]を使用する場合に必要な変更を加えて適用される。1つの実施形態において、この概念は、S、E、M、及びNの各々、ならびに任意選択でウイルスゲノムに見られる1つ以上の他のORFについてVLP RNAで使用される。
任意選択で、[スパイク(S)TRS-Bをコードする配列]は、ウイルスRNAゲノム内のS TRS-Bのすぐ5’側にある配列のサイズの50~150%、または80~120%(好ましくは100%)であるRNA配列のすぐ5’側にある。任意選択で、[エンベロープ(E)TRS-Bをコードする配列]は、ウイルスRNAゲノム内のS TRS-Bのすぐ5’側にある配列のサイズの50~150%、または80~120%(好ましくは100%)であるRNA配列のすぐ5’側にある。任意選択で、[膜(M)TRS-Bをコードする配列]は、ウイルスRNAゲノム内のS TRS-Bのすぐ5’側にある配列の50~150%、または80~120%(好ましくは100%)のサイズであるRNA配列のすぐ5’側にある。任意選択で、[ヌクレオカプシド(N)TRS-Bをコードする配列]は、ウイルスRNAゲノム内のS TRS-Bのすぐ5’側にある配列のサイズの50~150%、または80~120%(好ましくは100%)であるRNA配列のすぐ5’側にある。
任意選択で、VLP RNA内の[スパイク(S)TRS-Bをコードする配列]の5’末端ヌクレオチドからVLP RNA内の[ヌクレオカプシド(N)TRS-B]をコードする配列の3’末端ヌクレオチドまでのサイズは、ウイルスRNAゲノム内の[スパイク(S)TRS-Bをコードする配列]の5’末端ヌクレオチドからウイルスRNAゲノム内の[ヌクレオカプシド(N)TRS-Bをコードする配列]の3’末端ヌクレオチドまでのサイズの80~120%(任意選択で100%)である。
任意選択で、VLP RNA内のTRS-Bをコードする最初の配列の最も5’側のヌクレオチドからTRS-Bをコードする最後の配列の最も3’側の塩基までのサイズは、ウイルスRNAゲノム内の[スパイク(S)TRS-Bをコードする配列]の最も5’側のヌクレオチドからウイルスRNAゲノム内の[ヌクレオカプシド(N)TRS-Bをコードする配列]の最も3’側のヌクレオチドまでのサイズの80~120%(任意選択で100%)である。
1つの実施形態において、ウイルスの複製は、第1及び第2のsgRNA転写物を産生するためのウイルスゲノムRNAの転写を含み、sgRNAは同一の5’配列を共有し、第1のsgRNAは、前述の5’配列の3’側にある第1のTRS-B CEを含み、第2のsgRNAは、前述の5’配列の3’側にある第2のTRS-B CEを含み、第2のsgRNAは第1のsgRNAより長く、ウイルスゲノムRNAはTRS-Lを含み、TRS-LはTRS-B CEの各々と別々にハイブリダイズ可能である。この実施形態の一例において、本発明のRNAは、第1及び第2のRNA転写物を産生するように宿主細胞内で転写可能であり(または転写され)、第1及び第2のRNAは同一の5’配列を共有し、第1のRNAは、前述の5’配列の3’側にある第1のTRS- B CEを含み、第2のRNAは、前述の5’配列の3’側にある第2のTRS-B CEを含み、第2のRNAは第1のRNAよりも長く、RNAの各TRS-B CEは、別々にウイルスゲノムRNAのTRS-Lとハイブリダイズ可能である。一例において、ウイルスゲノムRNA及び本発明のRNAの各々は(+)ssRNAであり、ウイルス及び本発明のRNAの前述の各転写物は(-)ssRNAである。代替的な例において、ウイルスゲノムRNA及び本発明のRNAの各々は(-)ssRNAであり、ウイルス及び本発明のRNAの前述の各転写物は(+)ssRNAである。任意選択で、ウイルスゲノムRNAは、sgRNAのそれぞれ第1及び第2のTRS-B CEをコードする第1及び第2の配列を含み、第1及び第2の配列は、X個の連続したヌクレオチドの配列によって分離され、本発明のRNAは、それぞれ第1及び第2のRNA転写物のTRS-B CEをコードする第3及び第4の配列を含み、第3及び第4の配列は、Y個の連続したヌクレオチドの配列によって分離され、YはXの50~150%、または80~120%(例えば、90~110、または100%)である。例えば、Xは100nt配列であり、Yは80~120nt(例えば、100nt)配列である。したがって、本発明のRNAの使用によって産生される転写物内のTRS-B CE間の間隔を保持することは、ウイルス複製プロセスにおけるTRS-B CE間の間隔を模倣するために重要と考えられ、これは、本発明のRNA転写物の効率的な産生及び/またはその使用(例えば、ウイルスのTRS-Lとのハイブリダイズ)に有利であり得る。任意選択で、転写物の各TRS-B CEは、TRS-B配列、例えば、表1または2に示されるTRSの相補物に含まれる。
一例において、本発明のRNAは、宿主細胞内で転写可能であり(または転写され)、複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個)の異なるRNA転写物を産生し、各転写物は、宿主細胞内でウイルスRNAのTRS-Lとハイブリダイズ可能なTRS-B CEを(例えば、その3’末端に)含む。各TRS-B CEは、本明細書で開示するCE配列であってもよく、または本明細書で開示するTRS配列(またはこのようなTRS-Bの相補物)に含まれる。任意選択で、RNA転写物は、本発明のRNAに含まれる共通のプロモーターから転写されるか、または代替手段として、各RNAは、本発明のRNAに含まれるそれぞれのプロモーター(例えば、U6プロモーター)から転写される。このようにして、本発明のRNAは、ウイルス複製で産生されるsgRNAと競合する複数のRNA転写物を産生し、それにより(例えば、対象においてウイルスによる感染を低減または治療もしくは予防するために)ウイルス複製を低減する。任意選択で、転写物の各TRS-B CEは、TRS-B配列、例えば、表1または2に示されるTRSの相補物に含まれる。
別の例において、ウイルスの複製は、TRS-B CEを含む第3のsgRNAの産生を含み、第3のsgRNAは、第1及び第2のsgRNAよりも長く、前述の5’配列を含み、ウイルスゲノムRNA TRS-Lは、第3のsgRNAの各TRS-B CEにハイブリダイズ可能である。この例では、本発明のRNAは、第3のRNA転写物を産生するように宿主細胞内で転写可能であり得(または転写することができ)、第1、第2、及び第3のRNAは同一の5’配列を共有し、第3のRNAは、前述の5’配列の3’側にある第3のTRS-B CEを含み、第3のRNAは第1及び第2のRNAより長く、第1、第2、及び第3のRNAの各TRS-B CEは、別々にウイルスゲノムRNAのTRS-Lとハイブリダイズ可能である。任意選択で、ウイルスゲノムRNAは、第3のsgRNA TRS-B CEをコードする第3の配列を含み、ウイルスゲノムRNAの第2及び第3のTRS-B CEコード配列は、Z個の連続するヌクレオチドの配列によって分離されており、本発明のRNAは、第3のRNA転写物のTRS-B CEをコードする第5の配列を含み、第4及び第5の配列は、W個の連続したヌクレオチドの配列によって分離され、WはZの50~150%、または80~120%(例えば、90~110、または100%)である。例えば、Zは100ntの配列であり、Wは80~120nt(例えば、100nt)の配列である。したがって、本発明のRNAの使用によって産生される転写物内のTRS-B CE間の間隔を保持することは、ウイルス複製プロセスにおけるTRS-B CE間の間隔を模倣するために重要と考えられ、これは、本発明のRNA転写物の効率的な産生及び/またはその使用(例えば、ウイルスのTRS-Lとのハイブリダイズ)に有利であり得る。任意選択で、転写物の各TRS-B CEは、TRS-B配列、例えば、表1または2に示されるTRSの相補物に含まれる。
任意選択で、VLP RNAは、(ウイルスに感染している)宿主細胞内でmRNAを産生可能であり、mRNAはRNA配列のすぐ5’側にあるリーダーを含み、RNA配列は、(i)少なくとも5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000個の連続したヌクレオチドの長さ、(ii)ウイルスのORFと同じ長さ、または5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000個以下の連続したヌクレオチドの長さであるか、または(iii)その5’末端にAUGを含む、もしくはAUGからなる。代替形態において、RNA配列はmRNA内に存在せず、mRNAは、リーダー配列のみとポリAテールからなる。この場合、VLP RNAは、(ウイルスに感染した)宿主細胞内でポリAテールを含む1つ以上のmRNAを産生可能であると考えられ、いずれのmRNAも、ウイルスが複製のために必要とするタンパク質をコードしない。この場合、VLP RNAは、(ウイルスに感染した)宿主細胞内でポリAテールを含む1つ以上のmRNAを産生可能であると考えられ、いずれのmRNAも、ウイルスが感染性のために必要とするタンパク質をコードしない。この場合、VLP RNAは、(ウイルスに感染した)宿主細胞内でポリAテールを含む1つ以上のmRNAを産生可能であると考えられ、いずれのmRNAも、ウイルスの機能的なS、M、N、またはEタンパク質をコードしない。この場合、VLP RNAは、(ウイルスに感染した)宿主細胞内でポリAテールを含む1つ以上のmRNAを産生可能であると考えられ、いずれのmRNAも、ウイルスの機能的構造タンパク質をコードしない。この場合、VLP RNAは、(ウイルスに感染した)宿主細胞内でポリAテールを含む1つ以上のmRNAを産生可能であると考えられ、いずれのmRNAも、RdRpをコードしない。これらの実施形態において、VLP RNAは、ウイルスの複製及び/または感染性において欠陥のあるmRNAを産生し、したがってこれらのmRNAは、ウイルスゲノムによってコードされたmRNAと競合する。競争は、細胞内の転写及び/または翻訳機構の競合であり得る。
一例において、VLP RNAは、ウイルスRNAゲノムの長さの100、110、または120%以下である(好ましくは、RNAは同じ長さまたは実質的に同じ長さである)。一例において、VLP RNAの長さは、ウイルスカプシドのパッケージング容量の100、110、または120%以下である。これらの例は、ウイルス粒子が宿主細胞内で作製される場合に有用であり、このとき、VLP RNAはパッケージングされる可能性があり(ウイルスカプシドのパッケージングサイズ限界を満たし)、それにより、宿主細胞から放出され、VLP RNAで対象内の他の宿主細胞を免疫することができるさらなる粒子が提供される。そのため、この意味において、本発明は、(ウイルスRNAを保有する宿主細胞における感染症の治療に加えて)対象の予防ワクチン接種を提供する。これは、前述のVLP RNAを保有するさらなる粒子が、スパイク(または宿主細胞認識に使用される他のウイルスタンパク質)を介して新たな宿主細胞を認識することができ、それにより、ウイルス粒子によってその後の感染が起こる場合に備えて、VLP RNAが導入され、まだ感染していない宿主細胞内で増幅することができるためである。
VLPがスパイク(またはウイルスが通常用いる宿主細胞認識に使用される他のリガンド)及び/またはウイルスカプシドタンパク質を有する場合、これは、ウイルスに対する防御抗体を生じるために対象の免疫系に抗原エピトープを提示することにより、対象のためのさらなる防御層を提供することができる。同様に、VLP RNAが感染細胞によってパッケージングされて上記のようなさらなる粒子を産生する場合、これらも、粒子が対象内の宿主細胞から放出されるときに、このような抗原エピトープを含み提示することができる。
一例において、VLP RNAは、RNAをウイルスのカプシドにパッケージングするためのパッケージングシグナルを含む。1つの実施形態において、パッケージングシグナルは、ウイルスゲノムに含まれるパッケージングシグナルである。1つの実施形態において、VLP RNAに含まれるパッケージングシグナルは、ウイルスゲノムのパッケージングよりも優先して細胞内で使用される。VLP RNAのパッケージングにとって有益なことに、VLP RNA及びウイルスRNAは同じ極性であってもよく(例えば、各々がプラス鎖RNAである)、任意選択で、VLP RNAのサイズはウイルスRNAゲノムのサイズの80~120%(例えば、100%)である。好適なパッケージングシグナルは、Masters,Paul.(2019).“Coronavirus genomic RNA packaging”,Virology.537.10.1016/j.virol.2019.08.031でコロナウイルスに関し開示されたパッケージングシグナルであり得る(その開示内容(及び明示的に、本発明における可能な使用のためのパッケージングシグナル配列)は、本明細書に援用される)。1つの実施形態において、VLP RNAに含まれるパッケージングシグナルは、これらのパッケージングシグナルまたはそのオルソログもしくはホモログのうちの1つである。
ホモログ:共通の祖先DNAまたはタンパク質配列からの系による第2の遺伝子、ヌクレオチド、またはタンパク質に関連する遺伝子、ヌクレオチド、またはタンパク質配列。このホモログという用語は、遺伝的重複の事象によって分離された遺伝子間の関係、または遺伝的重複の事象によって分離された遺伝子間の関係に適用することができる。
オルソログ:オルソログとは、種分化によって共通の祖先遺伝子、ヌクレオチド、またはタンパク質配列から進化した、異なる種または系統内の遺伝子、ヌクレオチド、またはタンパク質配列のことである。
通常、オルソログは進化の過程で同じ機能を保持する。
一例において、VLPは、単一の当該RNA分子または複数の当該RNA分子を含む。
代替形態において、VLPは、単一のRNAタイプを含むのではなく、複数の異なるRNAを含み、各RNAは、CE2もしくはその相補物を含む当該TRS-Bのうちの少なくとも1つを含み、及び/または、各RNAは、CE1もしくはその相補物を含む当該TRS-Lのうちの少なくとも1つを含む。RNA情報を複数のRNAに分割することにより、ウイルスのカプシドにパッケージングされないRNAを提供することも可能と考えられる(対象内でVLP RNAの拡散を避けるためにそのように所望される場合)。
1つの実施形態において、当該RNAは、前述のウイルスのカプシドにパッケージングするためのパッケージングシグナルを含み、異なるRNAはそれを含まない。
一例において、VLP RNAは、CE1を含む複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)の前述のTRS-L、及び任意選択で、CE2を含む少なくとも1つのTRS-Bの相補物を含む。一例において、VLP RNAは、CE2を含むTRS-Bの複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10)の相補配列、及び任意選択で、CE1を含む前述TRS-Lのうちの少なくとも1つを含む。一例において、VLP RNAは、CE1を含む前述のTRS-Lのうちの少なくとも1つ、及びCE2を含むTRS-Bの少なくとも1つの相補物を含む。
任意選択で、VLP RNAは、ウイルスゲノムの複数のTRS-B配列(例えば、コロナウイルスプラス鎖RNAのTRS-B配列のうちの1つ以上)またはこのようなTRS-Bの複数の相補配列を含む。一例において、VLP RNAは、ウイルスゲノムの全てのエクソン配列を有しないが、VLP RNAは、ウイルスゲノムの1つまたは複数のTRS-B配列(例えば、コロナウイルスプラス鎖RNAのTRS-B配列のうちの1つ以上)またはこのようなTRS-Bの複数の相補配列を含む。このような配列を有しないことにより、VLP RNAとウイルスRNAとの組み換えが発生してVLP RNAがウイルスタンパク質をコードする配列を1つ以上獲得する可能性を最小限に抑えることができる。
VLPは、合成粒子(例えば、リポソームもしくはナノ粒子)または弱毒化ウイルス(例えば、対象に感染するウイルスの弱毒化コピー、例えば、弱毒化コロナウイルス、SARS-CoV、もしくはSARS-CoV-2ウイルス)であってもよい。ここでの弱毒化とは、VLPが、対象内で病原性ウイルス性感染を引き起こすことが可能ではないこと、例えば、VLPが自己複製可能ではないことを意味する。例えば、この粒子は、ウイルスのいかなるORF RNAも有しない。ウイルスの弱毒化形態(例えば、SARS-CoV、SARS-CoV-2、またはMERS-Covなどの弱毒化CoV)は、このような目的に有用であり得る。
1つの実施形態において、「VLP」が言及される場合、粒子は、「非自己複製可能粒子」、例えば、ウイルスのスパイクタンパク質を含む粒子である。任意選択で、VLPは、当該対象の細胞(例えば、ヒト細胞)内で非自己複製性である。「非自己複製性」とは、VLPが宿主細胞内で子孫VLPを産生するための自己複製に必要な全てのタンパク質をコードしないことを意味する。
1つの実施形態において、VLPは、VLP RNAを宿主細胞内に導入するために、例えば、エンドサイトーシスによる宿主細胞との膜融合が可能である。
核酸がある特定のVLPにカプセル化できることが知られている(例えば、Takamura,S.,Niikura,M.,Li,T.et al.DNA vaccine-encapsulated virus-like particles derived from an orally transmissible virus stimulate mucosal and systemic immune response by oral administration.Gene Ther 11,628-635(2004).https://doi.org/10.1038/sj.gt.3302193及びLee,E.B.,Kim,J.,Hur,W.et al.Liver-specific Gene Delivery Using Engineered Virus-Like Particles of Hepatitis E Virus.Sci Rep 9,1616(2019).https://doi.org/10.1038/s41598-019-38533-7を参照(これらの開示内容は参照により本明細書に援用される))。したがって、1つの実施形態において、本発明のRNAはVLPの内部にカプセル化されている。
別の実施形態において、RNAは、粒子(例えば、ナノ粒子)の外側表面に付着している。
当業者が知るように、VLPは、ウイルスの遺伝情報を除いたバージョンのウイルスを模倣することができる(本発明の場合、VLPは、代わりに本発明のVLP RNAを含む)。現在のVLP産生は、細菌、酵母、昆虫、及び哺乳類細胞を含めたいくつかの系を利用することができる。産生プラットフォームの選択は、コスト及び翻訳後修飾(PTM)の必要性(最適な免疫応答の生成に不可欠)を含めたいくつかの要因に依存する。いくつかの感染性疾患を予防するために設計されたいくつかのVLPベースワクチンはすでに承認され市販されており、他の多くのものは臨床試験または研究の段階にある。知られているように、バキュロウイルス発現系(例えば、flashback(商標)バキュロウイルス発現系)はj、ワクチン用VLPの産生に使用されている。ここで、VLPとは、実際の野生型ウイルスの構成を模倣したウイルス構造タンパク質の集合体であるが、ただし、このようなウイルスの完全な遺伝子材料を含まない。従来、ワクチンでは、ヒトにVLPを接種すると、あたかも免疫系に本物の野生型ウイルスが提示されたかのような免疫応答が生じる。しかし、VLPは完全な遺伝材料を含まないため、複製して野生型ウイルスを産生することはできず、そのため、ワクチン接種者に野生型ウイルス性感染の影響をもたらすことはない。実際のウイルスを効果的に模倣した機能性VLPを産生するために、収率が良好な複数のウイルス構造タンパク質が使用される。次に、これらを正しく組み立てて、感染性の野生型ウイルスの外殻(カプシド)の確認を再現した粒子にする。有利なことに、粒子の産生に使用される発現系は、安全であると同時に、小規模(試験用)及び大規模(ワクチン製造用)の両方で複数のタンパク質を産生可能である。VLPワクチンを産生するためのバキュロウイルス発現系の使用に大きな関心が寄せられている。FDAが、バキュロウイルスにより製造されたワクチン(GlaxoSmithKline製Cervarix(登録商標))をHPVに対し保護するためにヒト向けの使用を認可したことに伴い、バキュロウイルス系がより広くVLP産生に使用されるようになった。また、バキュロウイルスシステムを使用して、インフルエンザウイルスに対する免疫化に使用できるVLPを産生することにも大きな関心が寄せられている。
一例において、VLPは、ウイルスカプシドタンパク質及び/またはスパイクタンパク質(例えば、ウイルスのS、E、M、及びNタンパク質)を含み、タンパク質は、細菌、酵母、昆虫、または哺乳類細胞から選択される細胞内での発現によって取得されるかまたは取得可能である。1つの実施形態において、タンパク質は、ヒトの肺(例えば、肺上皮細胞)、腎臓、または心臓の細胞株内での発現によって取得されるかまたは取得可能である。1つの実施形態において、タンパク質は、A549細胞株(ヒト肺細胞株の1つ)内での発現によって取得されるかまたは取得可能である。1つの実施形態において、タンパク質は、HEK(例えば、HEK293)細胞株(ヒト腎臓細胞株の1つ)内での発現によって取得されるかまたは取得可能である。1つの実施形態において、タンパク質は、Vero(例えば、Vero E6)細胞株内での発現によって取得されるかまたは取得可能である。1つの実施形態において、タンパク質は、Vero C1008(ATCC(登録商標)CRL-1586(商標))細胞株内での発現によって取得されるかまたは取得可能である。
代替的な構成では、VLPを使用する代わりに、DNAワクチン接種によって本発明のRNAを対象に導入する(この場合、このDNAは宿主細胞内で本発明のRNAをコードする)。代替形態として、RNAを対象に導入してもよく、例えば、この場合RNAは、mRNA治療薬の保護に使用される従来の技術(例えば、当業者が精通するであろうModerna,Incの技術を参照)を用いて保護される。
宿主細胞(単数または複数)は、対象の肺細胞、対象の腎細胞、対象のGI管細胞、または対象の心臓細胞とすることができる。
好ましくは、VLP RNAは、構成要素(i)(a)及び(ii)(b)を含み、例えば、構成要素(i)(a)は、VLP RNAにおける構成要素(ii)(b)の5’である。
ウイルスはコロナウイルス、例えば、α、β、またはγコロナウイルスとすることができる。例えば、ウイルスは、感染性胃腸炎ウイルス(TGEV)、マウス肝炎ウイルス(MHV)、または感染性気管支炎ウイルス(IBV)である。
CoVゲノムには5’末端CAP及び3’末端ポリ(A)が含まれ、これらは、ウイルス及び細胞のタンパク質によって媒介される5’-3’相互作用も促進し得る。これらの相互作用は、CoVの複製及び転写を制御するタイムリースイッチに関与する可能性がある。これらの活動には、二重層膜(DMV)に関連するマイナス鎖RNAの合成が含まれる。一例において、VLP RNAは、5’末端CAP及び3’末端ポリ(A)(例えば、前述のウイルスの5’末端CAP及び3’末端ポリ(A))を含む。

任意選択で、(例えば、ウイルスがSARS-CoV-2またはSARS-Covなどのコロナウイルスである場合)CE1または本明細書の任意のCEは、ACGAACまたはCUAAACまたはCUAAACGAAC(5’→3’方向に記載)である。追加または代替形態として、(例えば、ウイルスがSARS-CoV-2またはSARS-Covなどのコロナウイルスである場合)CE2は、ACGAACもしくはCUAAACもしくはCUAAACGAAC(5’→3’方向に記載)、またはそれらの相補物である。例えば、粒子RNAがこのような配列を含むか、またはRNAが、このような配列を含むRNAを産生するように宿主細胞内で転写可能である。
一例において、CE2または本明細書の任意のCEは、ウイルスRNAのS、3ab、E、M、N、もしくは7-コード配列のTRSのCEであるか、またはその相補物である。一例において、CE2または本明細書の任意のCEがVLP RNA転写物に含まれ、CE2は、ウイルスRNAのS、3ab、E、M、N、または7-コード配列のTRSのCEであり、CE2は、ウイルスのS、3ab、E、M、N、または7をコードするRNA配列に作用可能に接続していない。例えば、VLP RNAはプラス鎖RNAであり、転写物はマイナス鎖RNAであり、任意選択で、転写物中のCE2は、ウイルスのタンパク質をコードしない、ウイルスの構造タンパク質をコードしない、またはウイルスS、3ab、E、M、N、もしくは7タンパク質をコードしない、またはウイルスのS、3a、E、M、N、もしくは7タンパク質をコードしないRNA配列のすぐ3’側にある。
一例において、CE2の相補物はVLP RNAに含まれ、CE2の相補物はウイルスRNAのS、3ab、E、M、Nまたは7をコードする配列に含まれ、VLP RNAに含まれる相補物は、ウイルスのS、3ab、E、M、Nまたは7をコードするRNA配列に作用可能に接続していない。例えば、VLP RNAはプラス鎖RNAであり、任意選択で、VLP RNA内の前述の相補物は、ウイルスのタンパク質をコードしない、ウイルスの構造タンパク質をコードしない、またはウイルスS、3ab、E、M、N、もしくは7タンパク質をコードしない、またはウイルスのS、3ab、E、M、N、もしくは7タンパク質をコードしないRNA配列のすぐ5’側にある。
任意選択で、Lは、ウイルスのTRS-CE1を含む転写調節配列を含む。
任意選択で、VLP RNAは、TRS-CE1を含むTRS-Lを含む。一例において、VLP RNAの転写物は、TRS-CE2を含むTRS-Bを含む。例えば、TRS-CE1はプラス鎖一本鎖RNAに含まれ、TRS-CE2はマイナス鎖一本鎖RNAに含まれる。したがって、TRS-CE1及びTRS-CE2は互いに100%相補的であってもよい。
一例において、ウイルス複製の低減は、本発明の対象と同じ種及び性別及び年齢の対照対象におけるウイルス複製に比べて、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、または90%であり、このとき、対照対象は、本発明の対象と同じまたは同様の時間の間ウイルスに感染(例えば、同じ量または同様の量で)したが、本発明の対象には前述のVLPが投与され、対照対象はこのようなVLPが全く投与されなかった。
任意選択で、VLP RNAは、タンパク質翻訳のための作用可能な調節エレメントを含み、調節エレメントは、構成要素(i)(a)もしくは(ii)(b)の5’側(または構成要素(i)もしくは(ii)に対し5’側)に作用可能に結合している。例えば、構成要素は、リーダー配列をコードするRNA配列に含まれ、任意選択で、リーダーはウイルスのリーダー配列を含む。
任意選択で、VLP RNA(例えば、(+)ssRNA)は、構成要素(i)または(ii)(例えば、構成要素(i)(a)または(ii)(b))を含み、VLP RNAは、当該構成要素の3’側にあり、かつ当該ウイルスの複製、伝播、または感染性に必要とされるタンパク質のアミノ酸配列(A)を産生するように発現可能であるRNA配列を有しない。
一例において、VLP RNAのCE1または本明細書の任意のCEは、


から選択される配列(5’→3’方向に記載)により含まれている(下線はコアエレメント(CE)を示す)。代替形態として、VLP RNAは、このような配列を含むRNAを産生するように宿主細胞内で転写可能である(もしくは転写される)か、またはVLP RNAの相補物(例えば、100%相補物)がこのような配列を含む。任意選択で、ここでのウイルスとはCoV、例えば、SARS-CoVまたはSARS-Cov2ウイルスである。
任意選択で、CE1は、5’→3’方向にACGAACであり、及び/またはCE2は、5’→3’方向にGUUCGUである。
任意選択で、VLP RNAは、宿主細胞内のTRS-CE1と各々ハイブリダイズ可能なTRS-CE相補物の複数のコピーを含み、当該コピーのいずれも、ウイルスの複製または伝播(例えば、宿主細胞からの放出または宿主細胞の感染)に必須のタンパク質をコードするVLP RNAのRNA配列に作用可能に接続していない。
任意選択で、VLP RNAは、宿主またはウイルスのレプリカーゼを用いて宿主細胞内で複製可能である。
任意選択で、VLP RNAは、ウイルスゲノムによってコードされるRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)による認識及び結合に必要とされる調節エレメントを含み、任意選択で、調節エレメントは、ウイルスゲノムに含まれる調節エレメントと同一である。
任意選択で、VLP RNAは、VLP RNAを宿主細胞に感染可能なウイルスカプシドにパッケージングするためのウイルスパッケージングマシンによって認識されることが可能なパッケージングシグナルを含む。任意選択で、パッケージングシグナルは、ウイルスのパッケージングシグナルである。任意選択で、パッケージングシグナルは、ループモチーフ5’-UUUCGU’3’を含むか、またはこれをコードする。一例において、パッケージングシグナルは、Virology.2019 Nov;537:198-207.doi:10.1016/j.virol.2019.08.031.Epub 2019 Aug 30,“Coronavirus genomic RNA packaging”,Masters PS(例えば、図2に開示)で開示されている任意のパッケージングシグナル、またはその任意のホモログである。この参考文献内の全ての配列は、本発明で使用するために、参照により本明細書に援用される。一例において、本発明のウイルスはこの参考文献で開示されているウイルスであり、パッケージングシグナルは、このウイルスのパッケージングシグナルである。
任意選択で、VLP RNAは、宿主細胞内で、作用可能な1つ以上(例えば、1つまたは2つ)の核局在化シグナルを含む。例えば、NLSはVLP RNAのリーダーまたはCE1をコードする配列の5’側にあり、及び/またはNLSはCE2と相補的なVLP RNAの配列の3’側にある。
任意選択で、(iii)~(vi)のいずれかによって産生されたRNAハイブリッドのVLP RNAは、RNA産物を産生するように宿主細胞によって3’伸長されることが可能であり、RNA産物は、細胞内で、ウイルスの複製、伝播、または感染性に必要とされるタンパク質の発現において非生産的である。
任意選択で、VLPは、ウイルスが宿主細胞との結合に使用する受容体またはリガンドと同一である宿主細胞の受容体またはリガンドを含み、任意選択で、リガンドはウイルススパイク糖タンパク質である、及び/あるいは、リガンドは、宿主細胞の表面のACE2タンパク質(例えば、ウイルスがSARS-CoVもしくはSARS-CoV-2ウイルスである場合)または宿主細胞の表面のDPP4タンパク質(例えば、ウイルスがMERS-CoVウイルスである場合)に結合可能である。一例において、リガンドは、VLPのカプシドまたは(VLPが脂質エンベロープを含む場合)VLPの脂質エンベロープに含まれる、VLP表面露出リガンドである。
任意選択で、ウイルスの複製は、第1及び第2のサブゲノムRNA(sgRNA)の転写を含み、各sgRNAは第2の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE)を含み、sgRNAの各TRS-CEは、宿主細胞内のVLP RNA TRS-CE1の配列とハイブリダイズ可能である。
任意選択で、ウイルスのRNAゲノムはプラス鎖RNAゲノムであり、VLP RNAはプラス鎖RNAである。例えば、ウイルスのRNAゲノムは、一本鎖プラスセンスRNAである。代替形態において、RNAゲノムはプラスセンスRNAゲノムである。任意選択で、ウイルスのRNA及びVLPの両方がプラス鎖一本鎖RNAである。
例えば、VLP RNAは、そのマイナス鎖相補RNAを産生するように宿主細胞内で複製可能である。例えば、VLP RNAはプラス鎖一本鎖RNAであり、VLP RNAは、マイナス鎖一本鎖RNAを産生するように宿主細胞内で複製可能である。
任意選択で、TRS-CE1は6~12個の連続したヌクレオチドである、及び/またはTRS-CE2は6~12個の連続したヌクレオチドである。好ましくは、TRS-CE1は6個の連続したヌクレオチドである、及び/またはTRS-CE2は6個の連続したヌクレオチドである。好ましくは、TRS-CE1は、6、7、8、9、10、11または12個の連続したヌクレオチドである。好ましくは、TRS-CE2は、6、7、8、9、10、11または12個の連続したヌクレオチドである。
任意選択で、VLP RNAは、CE2に100%相補的なRNA配列を含み、このとき、当該RNA配列はウイルスのCE1と同一である。
任意選択で、CE2の配列はCE1に100%相補的であるか、または、CE2は、CE2の1、2、もしくは3ヌクレオチドを除く全てのヌクレオチドにわたりCE1に相補的である。
任意選択で、TRS-CE1は、8~30個(例えば、8~25個)の連続したヌクレオチドのウイルス転写調節配列(TRS1)に含まれる、及び/またはTRS-CE2は、8~30個の連続したヌクレオチドのウイルスTRS(TRS2)に含まれる。例えば、TRS1は、13、15、18、または26個の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。例えば、TRS1は、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26個の連続したヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
任意選択で、TRS1または本明細書の任意の他のTRSは、5’→3’方向に、配列NNN-CE1(すなわち、CE1の最後のntはTRS1の最後のntである)またはNNN-CE1-NNNを含み、各NはA、U、C、及びGから選択される任意のヌクレオチドであり、任意選択で、CE1は、5’→3’方向にACGAACである。
任意選択で、TRS1または本明細書の任意の他のTRSは、5’→3’方向に、UAA-CE1、UCUCUAA-CE1、AGU-CE1、またはUGAGU-CE1を含む。
任意選択で、TRS1または本明細書の任意の他のTRSは、5’→3’方向に、CE1-UU、CE1-UUU、CE1-UAA、CE1-UAACU、CE1-UAAAU、またはCE1-UU(すなわち、最後のUはTRS1の最後のntである)を含む。
任意選択で、TRS1または本明細書の任意の他のTRSは、5’→3’方向に、UAA-CE1-UU、UAA-CE1-UUU、UCUCUAA-CE1-UUU、GGUCUAA-CE1-UAACU、GGUCUAA-CE1-UAAAU、AGU-CE1-UU、またはUGAGU-CE1-UUを含む。
任意選択で、TRS2または本明細書の任意の他のTRSは、5’→3’方向に、配列NNN-CE2(すなわち、CE2の最後のntはTRS2の最後のnt)またはNNN-CE2-NNNを含み、各NはA、U、C、及びGから選択される任意のヌクレオチドであり、任意選択で、CE2は、5’→3’方向にACGAACである。
任意選択で、TRS2または本明細書の任意の他のTRSは、5’→3’方向に、UAA-CE2、UCUCUAA-CE2、AGU-CE2、またはUGAGU-CE2を含む。
任意選択で、TRS2または本明細書の任意の他のTRSは、5’→3’方向に、CE2-UU、CE2-UUU、CE2-UAA、CE2-UAACU、CE2-UAAAU、またはCE2-UU(すなわち、最後のUはTRS2の最後のntである)を含む。
任意選択で、TRS2または本明細書の任意の他のTRSは、5’→3’方向に、UAA-CE2-UU、UAA-CE2-UUU、UCUCUAA-CE2-UUU、GGUCUAA-CE2-UAACU、GGUCUAA-CE2-UAAAU、AGU-CE2-UU、またはUGAGU-CE2-UUを含む。
任意選択で、ウイルスは、不連続RNA転写プロセスを用いて複製する。したがって、本発明におけるウイルスは、第1のウイルスRNAと第2のウイルスRNAとのハイブリダイズを含む不連続RNA転写プロセスを用いて複製することができ、第1のRNAは、第1のコアエレメント(CE1)を含むTRS-Lを含み、第2のRNAは、第2のコアエレメント(CE2)を含むTRS-Bを含み、当該ハイブリダイズは、CE1とCE2とのハイブリダイズを含む。任意選択で、第1のRNAは(+)ssRNAであり、第2のRNAは(-)ssRNAであり、RNAの(+)RNA鎖ハイブリッドは、プロセス中に5’→3’方向に伸長して、ウイルス複製及び感染性に必要とされるウイルスタンパク質をコードするmRNAを産生する。
任意選択で、ウイルスは、ニドウイルス;Coronaviridaeウイルス;Coronavirinae、Arterivirus、Okavirus、もしくはTorovirinaeウイルス、好ましくはCoronavirinae;SARSもしくはMERSウイルス;またはSARS-CoV、SARS-CoV-2、もしくはMERS-CoVウイルスである。
任意選択で、ウイルスは、EAV、ウマ動脈炎ウイルス;IBV(感染性気管支炎ウイルス);MERS-CoV(中東呼吸器症候群コロナウイルス);MHV(マウス肝炎ウイルス);PRRSV(ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス);SARS-CoV(重症急性呼吸器症候群)コロナウイルス;またはTGEV(感染性胃腸炎ウイルス)である。
任意選択で、ウイルスは、コロナウイルス、例えば、SARS-Cov、SARS-Cov-2、SARS関連コロナウイルス(SARSr-Cov)、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-229Eである。一例において、ウイルスは、SARS-CoV ZXC21、ZC45、RaTG13、CUHK-W1、Urbani、GZ02、A031、A022、WIV16、WIV1、Rp3、Rs672、またはHKU4である。一例において、ウイルスは、SARS-CoV-2(YP_009724390.1)、SARSr-CoV RaTG13(QHR63300.2)、SARS-CoV Urbani(AAP13441.1)、SARS-CoV CUHK-W1(AAP13567.1)、SARS-CoV GZ02(AAS00003.1)、SARS-CoV A031(AAV97988.1)、SARS-CoV A022(AAV91631.1)、WIV-16(ALK02457.1)、WIV-1(AGZ48828.1)、SARSr-CoV ZXC21(AVP78042.1)、SARSr-CoV ZC45(AVP78031.1)、SARSr-CoV Rp3(Q3I5J5.1)、SARSr-CoV Rs672(ACU31032.1)から選択される。アクセッション番号を括弧内に示す。それらの配列は、本発明での使用のために参照により本明細書に明示的に援用される。
任意選択で、ウイルスは、(-)ssRNAウイルス、例えば、NegarnaviricotaまたはDeltavirusウイルス、例えばD型肝炎ウイルスであり、1つの実施形態において、本発明の粒子RNAは(-)ssRNAである。一例において、ウイルスは、Arenaviridae、Orthomyxoviridae、Paramyxoviridae、Pneumoviridae、Bunyaviridae、Rhabdoviridae、またはTenuivirusウイルスである。任意選択で、例えば、対象がヒトである場合、ウイルスは、マールブルグウイルス、エボラウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、狂犬病ウイルス、またはインフルエンザウイルスである。
代替形態として、対象は、脊椎動物、節足動物、または植物であってもよい。
また、
複数の粒子またはVLPを含む組成物も提供される。
任意選択で、当該組成物は、ウイルスによるヒトもしくは動物の対象の感染症の治療もしくはそのリスクの低減のため、またはウイルスによる当該対象の感染症の症状の治療もしくはそのリスクの低減のために、ヒトまたは動物の対象に投与するために用いられる。例えば、当該症状は、対象のウイルスに対する炎症応答である。例えば、当該症状は、対象における炎症である。任意選択で、当該組成物は、当該ウイルスの複製、伝播、または感染を低減するように機能するステロイド及び/またはさらなる抗ウイルス剤を含む。
任意選択で、組成物は、吸入器またはネブライザーに含まれる。
また、
ウイルスによるヒトまたは動物の対象の感染症の治療またはそのリスクの低減のための方法も提供され、当該方法は、当該対象に当該組成物を投与することを含む。
また、
ウイルスによるヒトまたは動物の対象の感染症の症状(例えば、炎症)の治療またはそのリスクの低減のための方法も提供され、当該方法は、当該対象に組成物を投与することを含む。
また、
宿主細胞におけるウイルスの複製を阻害する方法(例えば、in vitroまたは対象においてin vivo)も提供され、ウイルスはRNAゲノムを含む、当該方法は、
a)当該宿主細胞を本明細書に記載のVLPに接触させることと、当該VLP RNAを当該宿主細胞内に導入することとを含み、
b)ステップ(a)と同時に、ステップ(a)の後に、またはステップ(a)の前に、当該ウイルスRNAゲノムが当該宿主細胞内に導入され、
当該VLP RNAがTRS-CE2を含む転写物を産生するように転写される転写プロセスが行われ、当該VLP RNA(またはそのコピー)は、TRS-CE2とハイブリダイズするTRS-CE1を含み、当該プロセスは、配列(L)(任意選択でリーダーペプチドをコード)を含むmRNAを産生し、LはTRS-CE1を含み、リーダーは、アミノ酸配列(A)をコードするRNA配列に作用可能に結合し、Aは、当該ウイルスの複製、伝播、または感染性に必要とされるタンパク質のアミノ酸である。
任意選択で、転写物中のTRS-CE2は、当該ウイルスの複製、伝播、もしくは感染性に必要とされないタンパク質をコードするRNA配列のすぐ3’側にあるか、または転写物は、オープンリーディングフレーム(ORF)をコードしないRNA配列のすぐ3’側にある。
任意選択で、転写物はマイナス鎖一本鎖RNAであり、ウイルスRNAはプラス鎖一本鎖RNAである。
SARS-CoVウイルスのゲノムリーダーコード配列は、以下に示すGenBankアクセッション番号から入手することができる:GZ02、AY390556;HZS2-Bb、AY395004;ZS-C、AY395003;CUHK-LC5,AY395002;CUHK-LC4、AY395001;CUHK-LC3、AY395000;CUHK-LC2、AY394999;ZS-A、AY394997;ZS-B、AY394996;HSZ-Cc、AY394995;HSZ-Bc、AY394994;HGZ8L2、AY394993;HZS2-C、AY394992;HZS2-Fc、AY394991;HZS2-E、AY394990;HZS2-D、AY394989;JMD、AY394988;HZS2-Fb、AY394987;HSZ-Cb、AY394986;TW3、AY502926;BJ04、AY279354;HGZ8L1-A、AY394981;HGZ8L1-B、AY394982;ZS-C、AY395003;HSZ2-A、AY394983;GZ-C、AY394979;Tor2、NC_004718;BJ01、AY539954;WHU、AY394850;NS-1、AY508724;TW10、AY502923;TW2、AY502925;ShanghaiQXC1、AY463059;ZJ01、AY286320;ShanghaiQXC2、AY463060;GD69、AY313906;FRA、AY310120;SoD、AY461660;Sino1-11、AY485277;CUHK-AG03、AY345988;CUHK-AG02、AY345987;CUHK-AG01、AY345986;CUHK-Su10、AY282752;PUMC03、AY357076;PUMC02、AY357075;PUMC01、AY350750;GZ50、AY304495;SZ16、AY304488;SZ3、AY304486;AS、AY427439;HSR 1、AY323977;Sin2774、AY283798;HKU-39849、AY278491;GD01、AY278489;TWC2、AY362698;Sin2748、AY283797;Sin2679、AY283796;Urbani、AY278741;ZMY 1、AY351680;TWY、AP006561;TWS、AP006560;CUHK-W1、AY278554;TC3、AY348314;TC2、AY338175;TC1、AY338174;TWC、AY321118;Frankfurt 1、AY291315;Sino3-11、AY485278;BJ03、AY278490;BJ02、AY278487;ZJ01、AY297028;TW1、AY291451(これらの配列及びそのリーダー、これらのTRS及びTRS-CE配列は、本発明での使用のために、参照により本明細書に明示的に援用される)。
VLPは、RNAの1実施例1つの設計(例えば、実施例1の設計1)、または2、3、もしくはそれ以上の設計(例えば、各VLPが1つのタイプのRNA設計を含む)をカプセル化して産生することができる。この場合、異なるVLPの混合物が産生され、これは、対象、または広くヒトまたは動物の集団において、RNAに対しウイルスが生じる任意の耐性を回避するのに有用であり得る。
1つの実施形態において、第1のVLPは、ちょうど1つの設計のRNA(例えば、設計1)をカプセル化して産生することができ、第2のVLPは、第1のVLPに使用された設計とは異なるちょうど1つの設計のRNA(例えば、設計2)をカプセル化して産生することができる。第1のVLPは、第2のVLPと同時にまたは連続して、CoV(例えば、SARS-CoV2またはSARS-Cov)感染症に罹患しているかまたはそのリスクがある対象に投与することができる。投与は、肺への投与であり得る。
一例において、本発明の各CEは、下記の表3に示されるTRS配列に含まれる。一例において、VLP RNAは、それぞれのmRNAをコードするための1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、またはそれ以上の配列を含み、各配列は、本明細書で開示するTRS、例えば、表3に示されるTRS配列を含む。例えば、粒子RNAがこのような配列を含むか、または粒子RNAの相補物(例えば、100%相補物)がこのような配列を含むか、または粒子RNAは、このような配列を含む転写物を産生するために宿主細胞内で転写可能である(または転写される)。任意選択で、各配列は、宿主細胞内で配列を発現するためにそれぞれのプロモーターに作用可能に接続されている。任意選択で、プロモーターの1つ以上または全てがU6プロモーターである。
1つの実施形態において、当該方法の粒子または組成物は、異なるウイルスの複製を低減可能である。例えば、ウイルスは同じCE(例えば、TRS-L CE及び/またはTRS-B CE)を含むウイルスである。例えば、ウイルスはCoVウイルスであり、例えば、第1のウイルスはSARS-CoVであり、もう1つのウイルスはSARS-Cov-2である。この目的において、有利には、粒子RNAは、実施例1の表2に示されるTRS配列(または2、3、4、またはそれ以上のこのような配列)を含むことができる。代替形態として、この目的のために有利には、粒子RNAは、表2に示される配列(または2、3、4またはそれ以上のそのような配列)を含むRNAを産生するために宿主細胞において転写可能(または転写されてもよい)であってもよい。実施例1に示されるように、1つを除く全ての場合において、TRS配列の比較は、各ORFに関連するSARS-Cov及びSARS-Cov-2のTRS間で著しく同一性を示し、例外の場合には、1つの位置を除いて同一性が見られた。したがって、本発明者は、これらのいずれかのウイルスの複製を低減することができる粒子もしくは組成物または方法をもたらすための本発明のRNAにおけるこれらの配列の有用性を理解した。したがって、別の例では、この目的において有利に、粒子RNAは、5’-ACGAAC-3’及び5’-GUUCGU-3’から選択される配列(または2、3、4、もしくはそれ以上のこのような配列)を含むRNAを含むか、またはこれを産生するように宿主細胞内で転写可能である(もしくは転写される)ことができる。例えば、粒子RNAは、5’-ACGAAC-3’を各々含む1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の配列を含む(+)ssRNAであり、任意選択で、ウイルスは、そのRNAゲノムが1つ以上の5’-ACGAAC-3’配列を含む(+)ssRNA(例えば、CoV)である。例えば、粒子RNAは、5’-ACGAAC-3’を各々含む1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の配列を含む(+)ssRNAを産生するように宿主細胞内で転写可能であり(または転写され)、任意選択で、ウイルスは、そのRNAゲノムが1つ以上の5’-ACGAAC-3’配列を含む(+)ssRNA(例えば、CoV)である。例えば、粒子RNAは、5’-GUUCGU-3’を各々含む1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の配列を含む(-)ssRNAを産生するように宿主細胞内で転写可能であり(または転写され)、任意選択で、ウイルスは、そのRNAゲノムが1つ以上の5’-ACGAAC-3’配列を含む(+)ssRNA(例えば、CoV)である。例えば、粒子RNAは、5’-GUUCGU-3’を各々含む1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の配列を含む(-)ssRNAであり、任意選択で、ウイルスは、そのRNAゲノムが1つ以上の5’-ACGAAC-3’配列を含む(+)ssRNA(例えば、CoV)である。5’-ACGAAC-3’は、表1または表2に開示されているTRS配列に含まれてもよい。5’-GUUCGU-3’は、表1または表2に開示されているTRS配列の100%相補物に含まれてもよい。また、本発明は、以下に説明するように、粒子に含まれるか否かにかかわらず、RNAそれ自体も提供する。このようなRNAは、この段落中で、または本明細書でVLP RNAに関連して開示されている任意のRNAによるものであり得る。
一例において、VLP RNAは、ウイルスのRNAゲノムのサイズの50~150または80~120%(好ましくは90~110%)または100%であり、VLP RNAは、ウイルスRNAの各ORFの配列の一部または全部を、VLP RNAが置き換えるORF配列のサイズの50~150または80~120%(好ましくは90~110%)または100%のRNA配列で置き換えることによって取得されるかまたは取得可能であり、ウイルスの各ORFは非機能的にされるが、ウイルスRNAのTRS配列はVLP RNA内で保持される。代替形態において、S、M、E、N遺伝子のORFだけをRNA配列に置き換える。ORFを置換するために使用されるRNA配列は、非ウイルス配列であってもよく、ウイルスの複製、伝播、または感染を阻害するのに有用なタンパク質(例えば、抗ウイルス剤、例えば、インターフェロン)をコードしてもよい。
RNA、DNA、及び組成物
1つの構成において、本発明のRNA、またはその相補物もしくは転写物であるRNA(VLPまたは他の粒子に含まれても含まれなくてもよい)が提供される。例えば、RNAは、本発明の粒子に含まれるRNAのRNA転写物であってもよい。例えば、ウイルスゲノムRNAはssRNAであり、本発明のRNAは、ウイルスゲノムssRNAのセンスと同じセンス(プラスまたはマイナス)のssRNAである。
一例において、本発明のRNAの100%相補物である配列を含むRNAが提供される(すなわち、相補物の配列は、その長さに沿った各位置で他方のRNAに相補的である)。一例において、本発明のRNAと、その長さに沿って80、90、95、96、97、98、または99%以上の位置で相補的な配列を含むRNAが提供される。
一例において、本発明のRNAの配列の100%相補物である配列(すなわち、相補物の配列は、その長さに沿った各位置で他方のRNA配列に相補的である)を含むRNAが提供され、本発明のRNAの配列は、前述のCEもしくはTRS(またはその相補物)を含む。一例において、本発明のRNAのRNA配列に、その長さに沿って80、90、95、96、97、98、または99%以上の位置で相補的な配列を含むRNAが提供され、本発明のRNAの配列は、前述のCEもしくはTRS(またはその相補物)を含む。
一例において、本明細書のRNAは(+)ssRNAまたは(-)ssRNAである。一例において、本明細書のRNAは、対象におけるウイルス性感染症を治療または予防するためにヒトまたは動物の対象に投与するための(+)ssRNAであり、ウイルスは(+)ssRNAウイルスである。一例において、本明細書のRNAは、対象におけるウイルス性感染症を治療または予防するためにヒトまたは動物の対象に投与するための(-)ssRNAであり、ウイルスは(-)ssRNAウイルスである。
別の構成では、本明細書に記載のRNAをコードするDNAが提供される。任意選択で、DNAは、DNAを細胞内に導入して細胞内でその転写を行って、そのRNA転写物、例えば本発明のRNAを産生可能なVLPまたは他の粒子、例えば、ナノ粒子またはリポソームに含まれる。例えば、RNA転写物は、本明細書で開示する任意のRNA、例えば、本明細書に記載の(+)ssRNAである。一例において、DNAは一本鎖DNAまたは二本鎖DNAである。一例において、DNAは、本明細書に記載のRNA(例えば、(+)ssRNAまたは(-)ssRNA)のssDNA相補物(例えば、少なくとも80、90、56、または99%の相補物、または100%の相補物)である。一例において、DNAは、本明細書に記載のRNA(例えば、(+)ssRNAまたは(-)ssRNA)をコードするssDNAのssDNA相補物(例えば、少なくとも80、90、56、または99%の相補物、または100%の相補物)である。一例において、DNAは、(+)ssRNAまたは(-)ssRNAをコードする。一例において、DNAは、対象におけるウイルス性感染症を治療または予防するためにヒトまたは動物の対象に投与するための(+)ssRNAをコードし、ウイルスは(+)ssRNAウイルスである。一例において、DNAは、対象におけるウイルス性感染を治療または予防するためにヒトまたは動物の対象に投与するための(-)ssRNAをコードし、ウイルスは(-)ssRNAウイルスである。任意選択で、本明細書のRNAまたはDNAは、例えば、遺伝子銃を用いて、患者へのRNAまたはDNA注入により、ヒトまたは動物対象にそれぞれ投与される(または投与のために用いられる)。
本明細書の任意のDNAまたはRNAの対象への投与は、例えば、リポソーム、粒子、エクソソーム、微小胞、及びウイルスベクターから選択される送達ビヒクルを対象に投与することによって行われる。例えば、WO2016165825A1では、好適な粒子及び製造方法の例について言及されており、この記載内容は、本発明での使用のために本明細書に援用される。
本発明のDNAは、発現ベクターに含まれてもよく、当該ベクターは、DNAを転写してそのRNA転写物を産生させるためのプロモーターを含む。このような転写は、本発明のRNAを産生するために、対象の宿主細胞(例えば、ヒト細胞、例えば、肺、腎臓、または心臓細胞)内で行われ得る。代替形態において、このような転写は、産生用細胞株(例えば、ヒト細胞株、例えば、肺、腎臓、または心臓の細胞株)で行われてもよく、このとき、産生用細胞株は複数の本発明のRNAを産生する。
一例において、本発明は、複数の粒子を産生する方法を提供し、当該方法は、複数の粒子(例えば、VLP、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞)を複数の本発明のRNA(例えば、RNAは同一である)と組み合わせることであって、少なくとも1つのRNAが、当該複数の粒子のそれぞれの粒子の中及び/または上に組み込まれる、組み合わせることと、任意選択で、ウイルス性感染症の治療または予防のためにヒトまたは動物の対象に投与するための医薬組成物を産生するために、当該粒子を製剤化することとを含む。一例において、本発明は、1つ以上のタイプのタンパク質(例えば、ウイルスの構造タンパク質、例えば、ウイルスカプシド及び/またはスパイクタンパク質、例えば、S、M、及びE(及び任意選択でN)タンパク質)から形成される複数の粒子を製造する方法を提供し、当該方法は、本発明の複数のRNAの存在下で(例えば、RNAは同一である)、当該タンパク質を複数の粒子(例えば、VLP、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞)に形成することであって、少なくとも1つのRNAが、当該複数の粒子のそれぞれの粒子の中及び/または上に取り込まれる、形成することと、任意選択で、ウイルス性感染症の治療または予防のためにヒトまたは動物の対象に投与するための医薬組成物を産生するために、当該粒子を製剤化することとを含む。
任意選択で、当該方法によって取得されるか、または取得可能なこのような組成物が提供される。代替の組成物は、本明細書に記載の複数のDNAまたはRNA、例えば、遺伝子銃を用いて対象への投与に用いる裸のDNAまたはRNAを含む。代替形態において、本明細書に記載のDNAがRNAの代わりに当該方法で使用される。
例えば、組成物は、医薬投与デバイスまたは容器、例えば、吸入器、IVバッグ、シリンジ、または注射ペンに含まれる。一例において、組成物は、希釈剤、賦形剤、または担体を含む。例示的な担体は吸入用担体であり、このとき、組成物は、ウイルス性感染の治療または予防のために吸入によって対象に投与するために用いられる。一例において、組成物はさらに、ステロイドを含む。一例において、組成物はさらに、抗炎症剤(例えば、コルチコステロイドなどのNSAID)を含む。一例において、組成物はさらに、抗ウイルス剤、例えば、インターフェロン(例えば、アルファまたはベータインターフェロン)を含む。
一例において、抗ウイルス剤は、以下から選択される。

また、本発明は試料中のウイルスRNAを検出する方法も提供し、ウイルスは、第1のTRS-CE(例えば、CE1)及び第2のTRS-CE(例えば、CE2)のハイブリダイズを含む不連続RNA転写プロセスを用いて複製し、当該方法は、試料を本発明のRNAに接触させることと、本発明のRNAと試料に含まれるウイルスRNAとの間で形成されたハイブリッドを検出することとを含む。任意選択で、当該方法は、本発明のRNAとウイルスの(+)ssRNAゲノム、ウイルスのmRNA、ウイルスのsgRNA、またはウイルスの(-)ssRNAとのハイブリッドの存在を検出することを含む。任意選択で、当該方法は、対象の試料(例えば、血液試料)を用いて、本明細書に記載の検出方法を行うことを含む。
一例において、当該方法は、試料が取得されたヒトまたは動物の対象におけるウイルスの感染を診断するための方法である。
本発明は、ヒトまたは動物の対象におけるウイルス感染症を診断するための、本明細書に記載の任意の本発明のRNAの使用を提供し、ここで、ウイルスは不連続RNA転写プロセスを用いて複製する。任意選択で、当該使用は、本発明のRNAとウイルスのRNA(例えば、ウイルスの(+)ssRNAゲノム、ウイルスのmRNA、ウイルスのsgRNA、またはウイルスの(-)ssRNA)とのハイブリッドの存在を検出することを含む。任意選択で、当該使用は、対象の試料(例えば、血液試料)を用いて、本明細書に記載の検出方法を行うことを含む。
検出は、本発明のRNAに含まれる、またはそれに付着する標識を検出することにより行うことができる。本発明のRNAは、試験またはアッセイの知識を有する当業者は熟知しているであろうように、固体支持体(例えば、プレートまたはビーズ(例えば、磁気ビーズ))上で固定化することができる。また、当業者は、好適な標識及びタグ、例えば、蛍光タグ、RNAタグ(例えば、RNAバーコード)、化学標識、放射性アイソタイプ標識、または他の標識についても熟知しているであろう。一例において、検出方法はELISAアッセイである。標識(例えば、蛍光標識)の検出は、試料中の標識の量を決定することを含んでもよく、及び/または試料中の標識の量を、同じ標識で標識された本発明のRNAとハイブリダイズしたウイルスRNAを含む陽性対照を用いて決定した参照量と比較することを含んでもよい。
好適な試料は、ヒトまたは動物の対象から得られた細胞、例えば、血液、口腔、膣、鼻、肺、腎臓、もしくは心臓の細胞、または対象の上皮または粘膜の細胞を含む試料であり得る。好ましくは、細胞は、ヒトの上皮または粘膜の細胞、例えば、(例えば、スワブを用いて得られる)ヒトの口または喉の細胞である。一例において、試料は、血液、血清、喀痰、または唾液の試料である。例えば、ウイルスはコロナウイルスであり、試料は喀痰試料である。例えば、ウイルスはコロナウイルスであり、試料は肺細胞試料である。例えば、ウイルスはコロナウイルスであり、試料は口腔細胞試料である。例えば、ウイルスはコロナウイルスであり、試料は口の細胞試料である。例えば、ウイルスはコロナウイルスであり、試料は咽頭細胞試料である。方法または使用は、例えば試料に含まれる宿主細胞を溶解することにより、試料からウイルスRNAを取得することを含んでもよく、これは、試料を本発明の標識化またはタグ付けされたRNAに接触する前に実施してもよい。
本発明の方法または使用において、本発明のRNAをウイルスRNAとハイブリダイズさせる代わりに、本発明のDNAをウイルスRNAとハイブリダイズさせてもよく、例えば、DNAは固体支持体に固定化される。一例において、ウイルスRNAは(+)ssRNAであり、DNAは(-)ssDNAである。別の例では、ウイルスRNAは(-)ssRNAであり、DNAは(+)ssDNAである。
(+)ssRNA
また、本発明は、本明細書で開示する粒子またはVLP RNAと同一である単離RNAも提供する。また、複数のこのようなRNAも提供され、このときRNAは同一である。
代替形態として、複数のものは、互いに異なる第1及び第2のこのようなRNAを含む。複数のRNAは、組成物、例えば、本明細書で開示する医薬組成物、または診断もしくは検出の方法もしくは使用で使用するための組成物に含まれてもよい。
本発明の構成は、
プラス鎖一本鎖RNA((+)ssRNA)を提供し、RNAは、1つ以上の(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、またはこれ以上の)配列を含み、その各々が、(i)(+)ssRNAゲノムを有するウイルス(例えば、本明細書で開示する任意のこのようなウイルス、例えばCoV)の転写調節配列コアエレメント(TRS-L CE)配列、または(ii)ウイルスのTRS-B CEの相補配列(CS)であり、RNAは、ウイルスのオープンリーディングフレーム(ORF)配列またはそれらの相補配列のうちの1つ、複数、または全てを有しない。
一例において、(i)の各CEは、TRS-L配列に含まれる。一例において、(ii)の各CSは、TRS-B配列の相補物に含まれる。一例において、当該配列の最も5’側の配列はTRS-L配列であり、他の配列の各々はウイルスのTRS-B配列の相補物である。
宿主細胞内では、例えば上記のように、(i)のCEは、(-)ssRNAのTRS-B CEとハイブリダイズ可能である。このTRS-Bが、ウイルスの生活環で産生される(-)ssRNA相補鎖に含まれる場合、本発明のRNAに含まれる場合の(i)のCEは、上記のように転写及び/または翻訳の開始において非機能的であり得、それにより、ウイルスの複製に必要とされるウイルスタンパク質の発現において非機能的となる。そのため、上記で説明したように、マイナス鎖、転写、及び翻訳を巡ってウイルスとの競合がもたらされる。したがって、ウイルス複製は低減される。
宿主細胞内では、例えば上記のように、本発明の(+)ssRNAのCSは、ウイルスの(+)ssRNAのTRL-CEとハイブリダイズ可能なCEを含む(-)ssRNA転写物内で転写されることが可能である。このハイブリッドは、ウイルスのORFタンパク質産物の産生において非機能的と考えられる。そのため、上記で説明したように、プラス鎖、転写、及び翻訳を巡ってウイルスとの競合がもたらされる。さらに、ウイルスタンパク質の任意の発現した切断バージョンまたは別の点で欠陥を有するバージョンは、野生型ウイルスタンパク質と競合し、宿主細胞内で欠陥のあるまたは非生産的なウイルス産生をもたらし得る。したがって、ウイルス複製は低減される。
別の構成は、
ウイルスのTRS-B CEの相補配列(CS)を各々含む複数の配列を含む(+)ssRNA(任意選択で、直前の段落に記載のRNA)を提供し、当該RNAは、ウイルスのオープンリーディングフレーム(ORF)配列のうちの1つ、複数、または全てを有しない。
ここで、ウイルスは(+)ssRNAゲノムウイルスであり、各CSは(+)ssRNAウイルスゲノムに相補的な(-)ssRNAに含まれるTRS-B CEの相補物である。一例において、本発明のRNAの各CS間の相補性は、CE TRS-B CEの連続したヌクレオチド数にわたって比較される(例えば、少なくとも6個の連続したヌクレオチドの同一の長さ、例えば、6、7、または8個の連続したヌクレオチドにわたって比較される)。
任意選択で、各CSは、ウイルスのTRS-B CE配列と100%相補的であるか、または1、2、または3つ(好ましくは1つ)のヌクレオチド位置を除いて100%相補的である。
ウイルスの(+)ssRNAゲノムはTRSリーダー(TRS-L)配列を含み、TRS-LはCEを含み、ウイルスは、TRS-L CEが第2のCEとハイブリダイズするプロセスでmRNAを産生する転写を含む生活環を有し、第2のCEはTRS本体(TRS-B)配列に含まれ、TRS-Bはウイルスの(+)ssRNAの相補物である(-)ssRNAに含まれ、各mRNAはORFを含む。当業者は知っているように、ORFはタンパク質産物をコードする。
好ましくは、本発明の(+)ssRNAの各CEまたはCSは、ウイルスの(+)ssRNAの切断された(例えば、C末端切断された)または変異したORFをコードするRNA配列のすぐ5’側にある。例えば、RNA配列は、ウイルス(+)ssRNAの対応するORF全体に比べて切断されており、(a)ウイルス(+)ssRNA内のORFの最初の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、もしくは150個の連続したヌクレオチド(すなわち、最も5’側のヌクレオチド)、または(ii)ウイルス(+)ssRNAのORF配列の連続したヌクレオチドの70、60、50、40、30 30、もしくは10%以下を含む。例えば、RNA配列は、ウイルスRNAゲノムのS ORF全体に比べて切断されており、(a)ウイルス(+)ssRNA内のORFの最初の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、もしくは150個の連続したヌクレオチド、または(ii)ウイルス(+)ssRNAのORF配列の連続したヌクレオチドの70、60、50、40、30 30、もしくは10%以下を含む。例えば、RNA配列は、ウイルスRNAゲノムのE ORF全体に比べて切断されており、(a)ウイルス(+)ssRNA内のORFの最初の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、もしくは150個の連続したヌクレオチド、または(ii)ウイルス(+)ssRNAのORF配列の連続したヌクレオチドの70、60、50、40、30 30、もしくは10%以下を含む。例えば、RNA配列は、ウイルスRNAゲノムのM ORF全体に比べて切断されており、(a)ウイルス(+)ssRNA内のORFの最初の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、もしくは150個の連続したヌクレオチド、または(ii)ウイルス(+)ssRNAのORF配列の連続したヌクレオチドの70、60、50、40、30 30、または10%以下を含む。例えば、RNA配列は、ウイルスRNAゲノムのN ORF全体に比べて切断されており、(a)ウイルス(+)ssRNA内のORFの最初の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、もしくは150個の連続したヌクレオチド、または(ii)ウイルス(+)ssRNAのORF配列の連続したヌクレオチドの70、60、50、40、30 30、もしくは10%以下を含む。特徴(a)は、例えば細胞内で本発明のRNAのこの部分を適切に転写及び/または翻訳するために、ネイティブなウイルスTRS/ORF配列の連結部を保存するのに有用であろう。切断されたまたは変異した配列は、ウイルスのORFによってコードされるタンパク質の対応して変異したまたは切断された形態に翻訳され得(例えば、切断されたまたは変異したS、E、M、またはNを形成する)、これはウイルス複製、伝播、または感染において非機能的である。このように、本発明のRNAは、ウイルスを形成するように宿主細胞内で自己複製可能ではない。これは、ウイルス粒子の産生が不可能であるように封じ込める目的に有用であり得る。
本発明のRNAの一例において、第1(最も5’側の)CSは、ウイルスのTRS-リーダー(TRS-L)配列に含まれるCEの相補物(例えば、100%相補物)である。代替形態として、第1のCSは、ウイルスのTRS本体(TRS-B)配列に含まれるCEの相補物である。
好ましくは、本明細書の相補物は他の配列の100%相補物であってもよい。代替形態において、相補物は、1、2、または3ヌクレオチド位置を除いて他の配列(例えば、他のCE)に完全に相補的であってもよい、例えば、CE配列5’-ACGAAC-3’は、配列5’-GUUCGU-3’に100%相補的であり、一方5’-ACGAAC-3’は、配列5’-UUUCGU-3’(例えば、ヒト細胞などの宿主細胞内の場合)に相補的だが配列は互いに100%相補的ではない。
一例において、
(a)本発明の(+)ssRNAは、5’→3’方向に、第1のCS及び第2のCSを含み、第1のCSはウイルスのTRS-Lに含まれるCEであり、第2のCSはウイルスの第1のTRS-Bに含まれるCEの相補物であり、ウイルスは(+)ssRNAウイルスであり、任意選択で、本発明の(+)ssRNAは、ウイルスの第2のTRS-Bに含まれるCEの相補物である第3のCEを含む;
(b)本発明の(+)ssRNAは、5’→3’方向に、第1のCS及び第2のCSを含み、第2のCSはウイルスの第1のTRS-Bに含まれるCEの相補物であり、第1のCSはウイルスの第2のTRS-Bに含まれるCEの相補物であり、ウイルスは(+)ssRNAウイルスであり、任意選択で、本発明の(+)ssRNAは、ウイルスのさらなるTRS-Bに含まれるCEの相補物である第3のCSを含む;または
(c)本発明の(+)ssRNAは、5’→3’方向に、ウイルスのTRS-Lに含まれるCE及びウイルスの第1のTRS-Bに含まれるCEの相補物である第1のCSを含み、ウイルスは、(+)ssRNAウイルスであり、任意選択で、本発明の(+)ssRNAは、ウイルスの第2のTRS-Bに含まれるCEの相補物である第2のCSを含む。
ここで、「ウイルスのTRS-L」とは、ウイルス(+)ssRNAのTRS-Lを指すものと理解されるであろう。ここで、「ウイルスのTRS-B」とは、ウイルス(+)ssRNAの相補物のTRS-Bを指すものと理解されるであろう。このとき、相補物はマイナス鎖一本鎖RNA((-)ssRNA)である。このような(-)ssRNAは、(+)ssRNAウイルスに典型的であり、当業者には明らかであろうように、ウイルスの複製中に通常作製される鎖であり得る。
第1及び第2のCSは、互いに同一であってもよい。第2及び第3のCSは、互いに同一であってもよい。全てのCSは、互いに同一であってもよい。CS(及び任意選択でCE)は、同じヌクレオチド長(例えば、6、7、または8個の連続したヌクレオチド)であってもよい。任意選択で、第1のCSは、第1のTRS-BのCEの100%相補物であってもよい。100%相補物とは、第1のCSの配列がCEに対しその全長にわたって相補的であることを指し、すなわち、第1のCSの各ヌクレオチドは、CEの対応するヌクレオチドの相補物であり、その結果、第1のCSの最も5’側のヌクレオチドがCEの最も3’側のヌクレオチドの相補物、などとなる。
一例において、本発明のRNAまたはその相補物は、ウイルスのオープンリーディングフレーム(ORF)配列の1つ、複数、または全てを有さず、前述の各ORFは、ORF1a、ORF1b、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8a、ORF8b、ORF10、タンパク質SをコードするORF、タンパク質EをコードするORF、タンパク質MをコードするORF、及びタンパク質NをコードするORFから選択されるCoV ORFである。任意選択で、本発明のRNAまたはその相補物は、タンパク質SをコードするORF、タンパク質EをコードするORF、タンパク質MをコードするORF、及びタンパク質NをコードするORFのうちの1、2、3つ、または全てを有しない。例えば、本発明のRNAまたはその相補物は、タンパク質SをコードするORFを有しない。例えば、本発明のRNAまたはその相補物は、タンパク質EをコードするORFを有しない。例えば、本発明のRNAまたはその相補物は、タンパク質MをコードするORFを有しない。例えば、本発明のRNAまたはその相補物は、タンパク質NをコードするORFを有しない。例えば、ウイルスは、SARS-またはMERS-CoV(例えば、SARS-CoVまたはSARS-Cov-2)である。
1つの実施形態において、(+)ssRNAはmRNAである。例えば、RNAは、その相補物RNAを産生するように宿主細胞(例えば、本明細書で開示する任意の宿主細胞)内で転写可能であり、相補物は、ネガティブ鎖一本鎖RNA((-)ssRNA)である。任意選択で、相補物RNAは、(+)ssRNAの(または各)TRS-CEの相補物を含む。例えば、(-)ssRNAに含まれる各TRS-CE相補物は、それぞれのTRS本体(TRS-B)配列に含まれる。
任意選択で、RNAは5’メチル化キャップ及び3’ポリAテール配列を含む。
本発明のRNAは、組換えまたは単離RNAとすることができる。単離RNAは、細胞性物質もしくは粒子を含まないRNA、または相補的RNAもしくは相補的DNAに結合していないRNAとすることができる。代替形態において、RNAは相補的RNAまたは相補的DNAと結合することができる。
一例において、(+)ssRNAはDNAとの混合物中に存在しない。一例において、(+)ssRNAは、相補的なDNA(すなわち、例えばRNAがヒト宿主細胞などの宿主細胞中に存在するときにRNAとハイブリダイズ可能なDNA)との混合物中に存在しない。一例において、(+)ssRNAは、相補的なRNA(すなわち、例えばRNAがヒト宿主細胞などの宿主細胞中に存在するときにRNAとハイブリダイズ可能なRNA)との混合物中に存在しない。
また、本発明の複数の(+)ssRNAを含む組成物も提供される。一例において、RNAは同一である。別の例では、組成物は、本発明の異なる(+)ssRNAを含む(例えば、TRS-B相補物を含む配列が異なり、任意選択で、TRS-Bが共通のCE配列を含み、CE配列がウイルス(+)ssRNAゲノムに含まれるTRS-CE配列と100%同一である)。
(-)ssRNA及びDNA
また、本発明は、本明細書で開示する粒子またはVLP RNAまたはその相補物と同一である(-)ssRNAも提供する。また、複数のこのようなRNAも提供され、このときRNAは同一である。代替形態として、この複数のRNAは、互いに異なる第1及び第2のこのようなRNAを含む。複数のRNAは、組成物、例えば、本明細書で開示する医薬組成物、または診断もしくは検出の方法もしくは使用で使用するための組成物に含まれてもよい。
本発明の構成は、
マイナス鎖一本鎖RNA((-)ssRNA)を提供し、RNAは、1つ以上の(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、またはこれ以上の)配列を含み、その各々が、(i)(+)ssRNAゲノムを有するウイルス(例えば、本明細書で開示する任意のこのようなウイルス、例えばCoV)の転写調節配列コアエレメント(TRS-L CE)配列の相補配列(CS)、または(ii)ウイルスのTRS-B CEであり、RNAは、ウイルスのオープンリーディングフレーム(ORF)配列またはそれらの相補配列のうちの1つ、複数、または全てを有しない。
一例において、(i)の各CSは、TRS-L配列の相補物に含まれる。一例において、(ii)の各CEは、TRS-B配列に含まれる。一例において、当該配列の最も3’側の配列はTRS-L配列の相補物であり、他の配列の各々はウイルスのTRS-B配列である。
宿主細胞内では、例えば上記のように、(i)のCSは(+)ssRNAのTRS-L CEとハイブリダイズ可能である。このTRS-Lが、ウイルスの生活環で産生される(+)ssRNA鎖に含まれる場合、本発明のRNAに含まれる場合の(i)のCSは、転写及び/または翻訳の開始において(+)ssRNAを非機能的にすることができ、それにより、ウイルスの複製に必要とされるウイルスタンパク質の発現において非機能的となる。そのため、上記で説明したように、プラス鎖、転写、及び翻訳を巡ってウイルスとの競合がもたらされる。したがって、ウイルス複製は低減される。
宿主細胞内では、例えば上記のように、本発明の(-)ssRNAの各CEは、ウイルスの(+)ssRNAのTRL-CEとハイブリダイズ可能である。このハイブリッドは、ウイルスのORFタンパク質産物の産生において非機能的と考えられる。そのため、上記で説明したように、プラス鎖、転写、及び翻訳を巡ってウイルスとの競合がもたらされる。さらに、ウイルスタンパク質の任意の発現した切断バージョンまたは別の点で欠陥を有するバージョンは、野生型ウイルスタンパク質と競合し、宿主細胞内で欠陥のあるまたは非生産的なウイルス産生をもたらし得る。したがって、ウイルス複製は低減される。
別の構成は、
ウイルスのTRS-B CEを各々含む複数の配列を含む(-)ssRNA(任意選択で、直前の段落に記載のRNA)であって、当該RNAが、ウイルスのオープンリーディングフレーム(ORF)配列またはそれらの相補配列のうちの1つ、複数、または全てを有しない、(-)ssRNA。
任意選択で、各CEは、ウイルスのTRS-B CE配列と100%同一であるか、または1、2、または3つ(好ましくは1つ)のヌクレオチド位置を除いて100%同一である。
好ましくは、本発明の(-)ssRNAの各CEまたはCSは、ウイルスの(+)ssRNAの切断された(例えば、C末端切断された)または変異したORFをコードするRNA配列の相補物のすぐ3’側にある。例えば、RNA配列は、ウイルス(+)ssRNAの対応するORF全体に比べて切断されており、(a)ウイルス(+)ssRNA内のORFの最初の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、もしくは150個の連続したヌクレオチド(すなわち、最も5’側のヌクレオチド)、または(ii)ウイルス(+)ssRNAのORF配列の連続したヌクレオチドの70、60、50、40、30 30、もしくは10%以下を含む。例えば、RNA配列は、ウイルスRNAゲノムのS ORF全体に比べて切断されており、(a)ウイルス(+)ssRNA内のORFの最初の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、もしくは150個の連続したヌクレオチド、または(ii)ウイルス(+)ssRNAのORF配列の連続したヌクレオチドの70、60、50、40、30 30、もしくは10%以下を含む。例えば、RNA配列は、ウイルスRNAゲノムのE ORF全体に比べて切断されており、(a)ウイルス(+)ssRNA内のORFの最初の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、もしくは150個の連続したヌクレオチド、または(ii)ウイルス(+)ssRNAのORF配列の連続したヌクレオチドの70、60、50、40、30 30、もしくは10%以下を含む。例えば、RNA配列は、ウイルスRNAゲノムのM ORF全体に比べて切断されており、(a)ウイルス(+)ssRNA内のORFの最初の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、もしくは150個の連続したヌクレオチド、または(ii)ウイルス(+)ssRNAのORF配列の連続したヌクレオチドの70、60、50、40、30 30、または10%以下を含む。例えば、RNA配列は、ウイルスRNAゲノムのN ORF全体に比べて切断されており、(a)ウイルス(+)ssRNA内のORFの最初の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、80、100、もしくは150個の連続したヌクレオチド、または(ii)ウイルス(+)ssRNAのORF配列の連続したヌクレオチドの70、60、50、40、30 30、もしくは10%以下を含む。特徴(a)は、例えば細胞内で本発明のRNAのこの部分を適切に転写及び/または翻訳するために、ネイティブなウイルスTRS/ORF配列の連結部を保存するのに有用であろう。切断されたまたは変異した配列は、ウイルスのORFによってコードされるタンパク質の対応して変異したまたは切断された形態に翻訳され得(例えば、切断されたまたは変異したS、E、M、またはNを形成する)、これはウイルス複製、伝播、または感染において非機能的である。このように、本発明のRNAは、ウイルスを形成するように宿主細胞内で自己複製可能ではない。これは、ウイルス粒子の産生が不可能であるように封じ込める目的に有用であり得る。
本発明の(-)ssRNAの一例において、最後の(最も3’側の)CSは、ウイルスの(+)ssRNAのTRSリーダー(TRS-L)配列に含まれるCEの相補物(例えば、100%相補物)である。代替または追加形態として、第1のCEは、ウイルスのTRS本体(TRS-B)CE配列である。
一例において、
(a)本発明の(-)ssRNAは、3’→5’方向に、第1のCS及び第2のCSを含み、第1のCSは、ウイルスのTRS-Lに含まれるCEの相補物であり、第2のCSは、ウイルスの第1のTRS-Lに含まれるCEの相補物であり、ウイルスは(+)ssRNAウイルスであり、任意選択で、本発明の(-)ssRNAは、ウイルスのTRS-Lに含まれるCEの相補物である第3のCSを含む、または
(b)本発明の(-)ssRNAは、3’→5’方向に、第1のCE及び第2のCEを含み、第2のCEは、ウイルスの第1のTRS-Bに含まれるCEであり、第1のCEは、ウイルスの第2のTRS-Bに含まれるCEであり、ウイルスは(+)ssRNAウイルスであり、任意選択で、本発明の(-)ssRNAはウイルスのさらなるTRS-Bに含まれるCEである第3のCEを含む。
ここで、「ウイルスのTRS-L」とは、ウイルス(+)ssRNAのTRS-Lを指すものと理解されるであろう。ここで、「ウイルスのTRS-B」とは、ウイルス(+)ssRNAの相補物のTRS-Bを指すものと理解されるであろう。このとき、相補物はマイナス鎖一本鎖RNA((-)ssRNA)である。このような(-)ssRNAは、(+)ssRNAウイルスに典型的であり、当業者には明らかであろうように、ウイルスの複製中に通常作製される鎖であり得る。
第1及び第2のCSは、互いに同一であってもよい。第1及び第2のCEは、互いに同一であってもよい。第2及び第3のCEは、互いに同一であってもよい。全てのCSは、互いに同一であってもよい。全てのCEは、互いに同一であってもよい。CE(及び任意選択でCS)は、同じヌクレオチド長(例えば、6、7、または8個の連続したヌクレオチド)であってもよい。任意選択で、第1のCEは、第1のTRS-BのCEと100%同一であってもよい。
本発明の(-)ssRNAは、組換えRNAであっても単離RNAであってもよい。単離RNAは、細胞性物質もしくは粒子を含まないRNA、または相補的RNAもしくは相補的DNAに結合していないRNAとすることができる。代替形態において、RNAは相補的RNAまたは相補的DNAと結合することができる。
一例において、(-)ssRNAはDNAとの混合物中に存在しない。一例において、(-)ssRNAは、相補的なDNA(すなわち、例えばRNAがヒト宿主細胞などの宿主細胞中に存在するときにRNAとハイブリダイズ可能なDNA)との混合物中に存在しない。一例において、(-)ssRNAは、相補的なRNA(すなわち、例えばRNAがヒト宿主細胞などの宿主細胞中に存在するときにRNAとハイブリダイズ可能なRNA)との混合物中に存在しない。
また、本発明の複数の(-)ssRNAを含む組成物も提供される。一例において、RNAは同一である。別の例では、組成物は、本発明の異なる(-)ssRNAを含む(例えば、TRS-Bを含む配列が異なり、任意選択で、TRS-Bが共通のCE配列を含み、CE配列がウイルス(+)ssRNAゲノムに含まれるTRS-CE配列と100%同一である)。
また、本発明は、本発明の(+)鎖RNAのRNA配列に相補的(例えば、100%相補的)なDNA配列を含むか、またはそれからなる(-)鎖DNAも提供する。任意選択で、DNA配列は、DNAを鋳型として用いてRNAを転写するためのプロモーターに作用可能に接続している。プロモーターは、従来、DNA鎖内のDNA配列の5’側に存在する。転写は、産生用細胞(例えば、真核生物、原核生物、哺乳類、酵母、ヒト、昆虫、または齧歯類の細胞)で行うことができる。例えば、産生用細胞はHEK293細胞である。例えば、産生用細胞はCOS細胞である。例えば、産生用細胞はCHO細胞である。
したがって、1つの構成において、
本発明の複数のRNAの産生方法が提供され、当該方法は、RNAをコードする産生用細胞の核酸を用いて産生用細胞内でRNAを発現させることと、任意選択で、細胞から複数のRNAを単離することとを含む。
一例において、産生用細胞核酸は本発明の(-)鎖DNAであり、別の例では、産生用細胞核酸は本発明の(-)鎖RNAであり、任意選択で、ウイルスは(+)ssRNAウイルスである。したがって、ウイルスが(+)ssRNAウイルスである本明細書の検出または診断の方法または使用で使用することができる複数の(+)ssRNAが産生される。代替形態として、本明細書に記載のように(+)ssRNAウイルスと競合し、その複製を低減するために、ウイルスによる細胞の感染の前、後、または同時に宿主細胞内に導入することができる複数の(+)ssRNAが産生される。そのため、一例において、
本発明の粒子(例えば、VLP)を産生する方法が提供され、当該方法は、当該複数のRNAをウイルスの複数の構造タンパク質またはカプシドタンパク質と組み合わせることであって、それにより、RNAのうちの1つ以上を各々含む粒子が形成される、組み合わせることと、任意選択で、(例えば、粒子が非粒子関連RNAと混合されていない組成物を産生するために)粒子を分離することとを含む。任意選択で、組成物は、本明細書に記載のような医薬組成物である。
概念:
以下の概念を示す。これらは請求項として解釈しないようにされたい(本明細書の請求項はこれより後に記載され、「特許請求の範囲」という表題で始まるものである)。
1.ウイルスによるヒトまたは動物の対象の感染症の治療またはそのリスクの低減のために当該対象に投与するための粒子であって、当該ウイルスがRNAゲノムを含み、
(A)当該ウイルスが、当該対象の宿主細胞に感染可能であり、当該ウイルスゲノムがRNA配列(L)を含み、Lが第1の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE1)を含み、当該ウイルスの複製が第1のサブゲノムRNA(sgRNA1)の転写を含み、(B)sgRNA1が第2の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE2)を含み、TRS-CE1が当該宿主細胞内のTRS-CE2とハイブリダイズ可能であり、(C)当該粒子がRNAを含み、当該粒子が、当該粒子RNAの転写のために当該対象の宿主細胞内に導入可能であり、当該粒子RNAまたはその転写物が、TRS-CEを含み、
(D)当該ウイルスRNAが当該粒子RNAまたは当該転写物とともに宿主細胞内に存在する場合、当該粒子RNAまたは転写物の当該TRC-CEが、当該ウイルスRNAに含まれるTRS-CEとハイブリダイズし、当該ハイブリダイズがウイルス複製を低減する、粒子。
代替形態において、概念1は、以下を提供する。
ウイルスによるヒトまたは動物の対象の感染症の治療またはそのリスクの低減のために、当該対象に投与するための粒子(例えば、ウイルス様粒子(VLP))であって、当該ウイルスがRNAゲノムを含み、当該ウイルスが対象の宿主細胞(例えば、ヒト細胞)に感染可能であり、当該ウイルスゲノムがRNA配列(L)を含み、Lが第1の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE1)を含み、ウイルスの複製が第1のサブゲノムRNA(sgRNA1)の転写を含み、sgRNA1が第2の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE2)を含み、TRS-CE1が宿主細胞のTRS-CE2とハイブリダイズ可能であり、当該ウイルスがRNAゲノムを含み、当該粒子がRNAを含み、当該粒子が、当該粒子RNAの転写のために当該粒子RNAを当該対象の当該宿主細胞内に導入可能であり、当該粒子RNAまたはその転写物が、
(i)(a)TRS-CE1もしくは(b)宿主細胞内でTRS-CE1とハイブリダイズ可能な配列を含む、及び/または
(ii)(a)TRS-CE2もしくは(b)宿主細胞内でTRS-CE2とハイブリダイズ可能な配列を含み、
当該ウイルスRNAが粒子RNAまたは転写物とともに宿主細胞内に存在する場合、
(iii)構成要素(i)(a)が、当該ウイルスRNAによってコードされるsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズする、
(iv)構成要素(i)(b)が、当該ウイルスRNAに含まれるTRS-CE1とハイブリダイズする、
(v)構成要素(ii)(a)が、当該ウイルスRNAに含まれるTRS-CE1とハイブリダイズする、及び/または
(vi)構成要素(ii)(b)が、当該ウイルスRNAによってコードされるsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズし、
(iii)~(vi)のいずれかのハイブリダイズがウイルス複製を低減する、粒子。
2.(A)当該粒子RNA(例えば、(+)ssRNA)が、タンパク質翻訳のために作用可能な調節要素を含み、当該調節要素が、構成要素(i)(a)もしくは(ii)(b)の5’側に作用可能に結合し、
(B)当該粒子RNA(、(+)ssRNA)が、構成要素(i)(a)もしくは(ii)(b)を含み、当該粒子RNAが、当該構成要素の3’側にあり、かつ当該ウイルスの複製、伝播、または感染性に必要とされるタンパク質のアミノ酸配列(A)を産生するように発現可能であるRNA配列を有さず、
(C)当該粒子RNA(例えば、(-)ssRNA)が、構成要素(i)(b)もしくは(ii)(a)を含み、当該粒子RNAが、当該構成要素の5’側にあり、かつ当該ウイルスの複製、伝播、または感染性に必要とされるタンパク質のアミノ酸配列をコードするRNA配列を産生するように発現可能であるRNA配列を有しない、
概念1に記載の粒子。
3.当該粒子RNA(例えば、(-)ssRNA)またはその転写物(例えば、(-)ssRNA転写物)が、宿主細胞内のTRS-CE1と各々ハイブリダイズ可能なTRS-CEの複数のコピーを含み、TRS-CEの当該コピーのいずれも、当該ウイルスの複製または伝播に必須であるタンパク質をコードするRNA配列を産生するように発現可能であるRNA配列に作用可能に接続していない、概念1~2のいずれかに記載の粒子。
4.宿主細胞内で複製可能な粒子RNAである、概念1~3のいずれかに記載の粒子。
5.当該粒子RNAが、当該ウイルスゲノムによってコードされるRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)による認識及び結合に必要とされる調節エレメントを含み、任意選択で、当該調節エレメントが、当該ウイルスゲノムに含まれる調節エレメントと同一である、概念1~4のいずれかに記載の粒子。
6.当該粒子RNAが、粒子RNAを宿主細胞に感染可能なウイルスカプシドにパッケージングするようにウイルスパッケージング機構によって認識されることが可能なパッケージングシグナルを含む、概念1~5のいずれかに記載の粒子。
7.(iii)~(vi)のいずれかによって産生されたRNAハイブリッドが、RNA産物を産生するように当該宿主細胞によって3’伸長されることが可能であり、当該RNA産物が、当該細胞内で、当該ウイルスの複製、伝播、または感染性に必要とされるタンパク質の発現において非生産的である、概念1~6のいずれかに記載の粒子。
8.当該粒子が、当該ウイルスが当該宿主細胞との結合に使用する受容体またはリガンドと同一である当該宿主細胞の受容体またはリガンドを含み、任意選択で、当該リガンドがウイルススパイク糖タンパク質である、及び/あるいは、当該リガンドが、当該宿主細胞の表面のACE2タンパク質(例えば、当該ウイルスがSARS-CoVもしくはSARS-CoV-2ウイルスである場合)または当該宿主細胞の表面のDPP4タンパク質(例えば、当該ウイルスがMERS-CoVウイルスである場合)に結合可能である、概念1~7のいずれかに記載の粒子。
9.(A)当該ウイルスの複製が、第1及び第2のサブゲノムRNA(sgRNA)の転写を含み、各sgRNAが転写調節配列コアエレメント(TRS-CE)を含み、当該sgRNAの各TRS-CEが、宿主細胞内の当該粒子RNAに含まれるTRS-CE1の配列とハイブリダイズ可能である、または
(B)当該粒子RNAの転写が、第1及び第2のサブゲノムRNA(sgRNA)を産生し、各sgRNAが転写調節配列本体コアエレメント(TRS-B CE)を含み、当該sgRNAの各TRS-CEが、宿主細胞内の当該ウイルスRNAに含まれるTRS-L CE1との配列とハイブリダイズ可能である、
概念1~8のいずれかに記載の粒子。
10.当該粒子が、当該対象の細胞(例えば、ヒト細胞)内で非自己複製的である、概念1~9のいずれかに記載の粒子。
11.当該ウイルスの当該RNAゲノムがプラス鎖RNAゲノムであり、当該粒子RNAがプラス鎖RNAである、概念1~10のいずれかに記載の粒子。
12.TRS-CE1が6~12個の連続したヌクレオチドである、及び/またはTRS-CE2が6~12個の連続したヌクレオチドである、概念1~11のいずれかに記載の粒子。
13.CE1が5’→3’方向にACGAACである、及び/またはCE2が5’→3’方向にGUUCGUである、概念1~12のいずれかに記載の粒子。
14.当該粒子RNAがCE2と100%相補的なRNA配列を含み、当該RNA配列がCE1と同一である、概念1~13のいずれかに記載の粒子。
15.CE2の配列がCE1に100%相補的であり、またはCE2が、CE2の1、2、もしくは3ヌクレオチドを除く全てのヌクレオチドにわたりCE1に相補的である、概念1~14のいずれかに記載の粒子。
16.TRS-CE1が、8~25個の連続したヌクレオチドのウイルス転写調節配列(TRS1)に含まれる、及び/またはTRS-CE2が8~30個の連続したヌクレオチドのウイルスTRS(TRS2)に含まれる、概念1~15のいずれかに記載の粒子。
17.TRS1が、5’→3’方向に、配列NNN-CE1(配列中、CE1はTRS1の3’末端にある)またはNNN-CE1-NNN(配列中、各NはA、U、C、及びGから選択される任意のヌクレオチドである)を含み、任意選択で、CE1が5’→3’方向にACGAACである、概念16に記載の粒子。
18.TRS1が、5’→3’方向に、
(A)UAA-CE1、UCUCUAA-CE1、AGU-CE1、もしくはUGAGU-CE1、
(B)CE1-UU、CE1-UUU、CE1-UAA、CE1-UAACU、CE1-UAAAU、もしくはCE1-UU、
(C)UAA-CE1-UU、UAA-CE1-UUU、UCUCUAA-CE1-UUU、GGUCUAA-CE1-UAACU、GGUCUAA-CE1-UAAAU、AGU-CE1-UU、もしくはUGAGU-CE1-UU、または
(D)CUAA-CE1、UAA-CE1、もしくはUCUAA-CE1
を含む、概念16または17に記載の粒子。
19.TRS2が、5’→3’方向に、配列NNN-CE2(配列中、CE2はTRS2の3’末端にある)またはNNN-CE2-NNN(配列中、各NはA、U、C、及びGから選択される任意のヌクレオチドである)を含み、任意選択で、CE2が5’→3’方向にACGAACである、概念16~18のいずれか1つに記載の粒子。
20.TRS2が、5’→3’方向に、
(A)UAA-CE2、UCUCUAA-CE2、AGU-CE2、もしくはUGAGU-CE2、
(B)CE2-UU、CE2-UU、CE2-UAA、CE2-UAACU、CE2-UAAAU、もしくはCE2-UU、または
(C)UAA-CE2-UU、UAA-CE2-UUU、UCUCUAA-CE2-UUU、GGUCUAA-CE2-UAACU、GGUCUAA-CE2-UAAAU、AGU-CE2-UU、もしくはUGAGU-CE2-UU
を含む、概念16~19のいずれか1つに記載の粒子。
21.前記ウイルスが、ニドウイルス、Coronavirinaeウイルス、Torovirinaeウイルス、SARSもしくはMERSウイルス、またはSARS-CoV、SARS-CoV-2、もしくはMERS-CoVウイルスから選択される、概念1~20のいずれかに記載の粒子。
22.sgRNA1が(-)ssRNAであり、当該粒子RNAが(+)ssRNAであり、当該ウイルスゲノムが(+)ssRNAである、概念1~21のいずれかに記載の粒子。
23.当該粒子RNAが、
(i)TRS-CE1、及び/または
(ii)宿主細胞内でTRS-CE2とハイブリダイズ可能な配列を含み、
当該ウイルスRNAが、当該粒子RNAとともに宿主細胞内に存在する場合、
(iii)構成要素(i)が、当該ウイルスRNAによってコードされるsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズする、及び/または
(iv)構成要素(ii)の相補物が、当該ウイルスRNAに含まれるTRS-CE1とハイブリダイズし、
(iii)及び/または(iv)のハイブリダイズがウイルス複製を低減する、
概念1~22のいずれかに記載の粒子。
24.(A)当該粒子RNAまたは当該粒子の構成要素(ii)(b)のCE1が、TRS-L配列(例えば、当該ウイルスのTRS-L配列と同一または少なくとも90、95、96、97、98、もしくは99%同一であるTRS-L配列)に含まれる;及び/あるいは
(B)当該粒子RNAまたは当該粒子の構成要素(i)(b)のCE2が、TRS-B配列(例えば、当該ウイルスのTRS-B配列と同一または少なくとも90、95、96、97、98、もしくは99%同一であるTRS-B配列)に含まれる、
概念1~23のいずれかに記載の粒子。
25.当該粒子RNAの長さが、当該ウイルスRNAゲノムの長さの120%以下である、概念1~24のいずれかに記載の粒子。
26.当該粒子RNAが、当該ウイルスRNAゲノムの各オープンリーディングフレーム(ORF)の配列の一部または全部を、当該粒子RNAが置き換える前記ORF配列のサイズの120%以下(好ましくは100%)であるRNA配列で置き換えることによって取得可能であり、当該ウイルスの各ORFが非機能的にされるが、当該ウイルスRNAの当該TRS配列が当該粒子RNA内で保持されている、概念1~25のいずれかに記載の粒子。
27.(+)ssRNA(任意選択で、概念1~26のいずれかに記載のRNA)であって、ヒトまたは動物の対象の宿主細胞に感染するウイルスによって産生されるsgRNAのTRS-B CEの相補配列(CS)を各々含む複数の配列を含み、当該(+)ssRNAが、当該ウイルスの1つ、複数、または全てのオープンリーディングフレーム(ORF)配列を有さず、TRS-B CEを各々含む1つ以上の転写物を産生するように宿主細胞内で転写可能であり、各TRS-B CEが、当該ウイルスのTRS-L CEとハイブリダイズ可能であり、それにより、各転写物が1つ以上のウイルスORFタンパク質産物の発現を阻害可能である、(+)ssRNA。
28.当該ウイルスが、不連続RNA転写を用いて複製するタイプの(+)ssRNAウイルスである、概念27に記載のRNA。
29.各TRS-B CEがそれぞれの転写物のTRS-Bに含まれ、任意選択で、当該TRS-Bが、概念19または20に記載のTRS2配列を含む、概念27または28に記載のRNA。
30.概念1~29のいずれかに記載の複数の粒子またはRNAを含む、組成物。
31.ウイルスによるヒトもしくは動物の対象の感染症の治療もしくはそのリスクの低減のため、またはウイルスによる当該対象の感染症の症状の治療もしくはそのリスクの低減のために、ヒトまたは動物の対象に投与するために用いられる、概念30に記載の組成物。
32.当該組成物が、吸入器もしくはネブライザーに含まれる、または遺伝子銃などの核酸注入デバイスに含まれる、概念30または31に記載の組成物。
33.ウイルスによるヒトまたは動物の対象の感染症の治療またはそのリスクの低減のための方法であって、当該対象に概念30、31、または32に記載の組成物を投与することを含む、方法。
34.ウイルスによるヒトまたは動物の対象の感染症の症状(例えば、炎症)の治療またはそのリスクの低減のための方法であって、当該対象に概念30、31、または32に記載の組成物を投与することを含む、方法。
35.宿主細胞におけるウイルスの複製を阻害する方法であって、当該ウイルスが(+)ssRNAゲノムを含み、当該ウイルスゲノムが、TRS-L CEを含み、かつTRS-B CE(CE2)を含むsgRNA転写物をコードし、当該方法が、
a)当該宿主細胞を本発明の粒子またはRNAに接触させることと、本発明のRNA(例えば、粒子RNA)(以下、第1のRNA)を当該宿主細胞内に導入することとを含み、当該第1のRNAが、当該CE2の相補物(例えば、100%または少なくとも80%の相補物)である配列を含む(+)ssRNAであり、
b)ステップ(a)と同時に、ステップ(a)の後に、またはステップ(a)の前に、当該ウイルスRNAゲノムが当該宿主細胞内に導入され、
当該第1のRNAが、CE2またはウイルスTRS-L CEとハイブリダイズ可能な配列を含むRNA転写物を産生するように細胞内で転写される転写プロセスが行われ、当該転写物が、当該ウイルスの(+)ssRNAに含まれるTRS-L CEとハイブリダイズしてRNAハイブリッドを形成し、当該ハイブリッドが、リーダー配列(L)を含むmRNAを産生するのに使用され、当該リーダーが、当該ウイルスの複製、伝播、及び感染性に必要とされるタンパク質のアミノ酸配列(A)をコードするRNA配列に作用可能に結合しておらず、
任意選択で、当該ハイブリッドが5’→3’方向で伸長されて(例えば、1、2、3またはそれ以上のコドン、任意選択で150コドン以下)mRNAを産生する、方法。
36.当該転写物中のCES2、またはウイルスTRS-L CEとハイブリダイズ可能な当該配列が、
(A)当該ウイルスの複製、伝播、もしくは感染性に必要とされないタンパク質を産生するように当該宿主細胞内で発現可能なmRNA配列をコードするRNA配列、または
(B)オープンリーディングフレーム(ORF)の相補物を含まないRNA配列、または
(C)当該ウイルスのオープンリーディングフレーム(ORF)の相補物を含まないRNA配列
のすぐ3’側にある、概念35に記載の方法。
37.複数の粒子を産生する方法であって、複数の粒子(例えば、VLP、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞)を複数のRNAと組み合わせることであって、各RNAが本発明のRNAであり、少なくとも1つのRNAが、当該複数の粒子のそれぞれの粒子の中及び/または上に組み込まれる、組み合わせることと、任意選択で、ウイルス性感染症の治療または予防のためにヒトまたは動物の対象に投与するための医薬組成物を産生するために、当該粒子を製剤化することとを含む、方法。
38.試料中のウイルスRNAを検出する方法であって、当該ウイルスが、第1のTRS-CE(CE1)及び第2のTRS-CE(CE2)のハイブリダイズを含む不連続RNA転写プロセスを用いて複製し、当該方法が、当該試料を本発明のRNA(第1のRNA)に接触させることと、第1のRNAと当該試料に含まれるウイルスRNAとの間で形成されたハイブリッドを検出することとを含む、方法。
39.本発明のRNAの相補物であるDNA配列を含むDNAであって、任意選択で、当該DNA配列が、宿主細胞内でRNAを転写するためのプロモーターに作用可能に結合している、DNA。
40.ヒトまたは動物の対象におけるウイルス性感染症を診断するための本発明のRNAまたはDNAの使用であって、当該ウイルスが不連続RNA転写プロセスを用いて複製する、使用。
41.ヒトまたは動物の対象におけるウイルス性感染症を治療または予防する方法であって、当該対象に、本発明の粒子またはRNAを投与することを含む、方法。
本明細書に記載の特定の実施形態が例として示されており、本発明の限定として示されていないことは理解されるであろう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態で用いることができる。当業者は、本明細書に記載の特定の手順に対する多くの等価物を認識するか、または単なる通例的試験を用いてこのような等価物を確認することができるであろう。このような等価物は、本発明の範囲に含まれるとみなされ、請求項によって網羅される。本明細書で言及されている全ての刊行物及び特許出願は、この発明が属する技術分野の当業者の技術水準を示すものである。全ての刊行物及び特許出願(言及された全ての特許出願及び特許の米国の等価物を含む)は、個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により援用されると示されている場合と同じ程度において、参照により本明細書に援用される。「1つの(a)」または「1つの(an)」という語の使用は、請求項及び/または明細書内で「含む(comprising)」という用語とともに使用する際には「1つ(one)」を意味し得るが、「1つ以上」、「少なくとも1つ」、及び「1つまたは2つ以上」という意味とも整合する。請求項における「または」という用語の使用は、明示的に代替形態のみを指すように示されない限り、または代替形態が相互に排他的でない限り、「及び/または」を意味するものとして用いられるが、本開示は、代替形態のみ及び「及び/または」を指す定義を支持している。本出願全体において、「約」という用語は、ある値が、デバイスにおける誤差の固有のばらつき、その値を決定するために用いられる方法、または試験対象間に存在するばらつきを含むことを示すために使用される。
本明細書及び請求項で使用する場合、「含む(comprising)」(ならびに「含む(comprise)」及び「含む(comprises)などの、含むの任意形態)、「有する(having)」(ならびに「有する(have)」及び「有する(has)」などの、有するの任意形態)、「含む(including)」(ならびに「含む(includes)」及び「含む(include)」などの、含むの任意形態)または「含む(containing)」(ならびに「含む(contains)」及び「含む(contain)」などの、含むの任意形態)といった単語は、包括的または無制限的であり、追加の列挙されていない要素も方法ステップも除外しない。
本明細書で使用する場合、「またはその組合せ」という用語は、当該用語のすぐ前の項目の全ての順列及び組合せを指す。例えば、「A、B、C、またはそれらの組合せ」は、A、B、C、AB、AC、BC、またはABCのうちの少なくとも1つを含むことが意図されており、特定の文脈において順序が重要な場合は、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、またはCABも含む。この例を続けると、1つ以上の項目または用語の繰返しを含む組合せ、例えば、BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBは明示的に含まれる。当業者であれば、文脈から別の内容が明らかでない限り、典型的には、項目または用語の数が任意の組合せにおいて制限が存在しないことを理解するであろう。
本開示のいかなる部分も、文脈から別の内容が明らかでない限り、本開示の任意の他の部分と組み合わせて読むことができる。
本明細書で開示及び請求されている全ての組成物及び/または方法は、本開示に照らして過度の実験をせずに作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点から説明しているが、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、この組成物及び/または方法、ならびに本明細書に記載の方法のステップまたはステップの順序にバリエーションを適用することができることは、当業者には明らかであろう。当業者にとって明白であるこのような同様の代用及び変更は全て、添付の請求項によって定義される本発明の趣旨、範囲、及び概念内にあるものとみなされる。
実施例1:RNAの設計
SARS-CoVウイルス及びSARS-CoV-2ウイルス(下記表2のWuhan)のゲノム配列間で解析を実施した。ウイルスの様々なORFに関連するTRS配列をアラインメントしたところ、表2に示すような顕著な類似性が明らかになり、下記で詳述するRNA設計が可能となった。


以下のTRS配列を含むRNAが産生される(ポジティブストランドssRNA上の5’→3’方向に表示)。
RNA設計1:配列B、D、H、J(S、E、及びMのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計2:配列D、H、J(各配列は、配列の転写及び翻訳のための調節領域のすぐ3’側にある)(S、E、及びMのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計3:配列B、D、D、D(Sのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計4:配列B、H、H、H(Eのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計5:配列B、J、J、J(Mのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計6:配列B、D、D、J、J(SまたはMのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計7:配列D、D、D(各配列は、配列の転写及び翻訳のための調節領域のすぐ3’側にある)(Sのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計8:配列B、H、H、H(各配列は、配列の転写及び翻訳のための調節領域のすぐ3’側にある)(Eのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計9:配列B、J、J、J(各配列は、配列の転写及び翻訳のための調節領域のすぐ3’側にある)(Mのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計10:配列B、D、D、J、J(各配列は、配列の転写及び翻訳のための調節領域のすぐ3’側にある)(SまたはMのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計11:配列A、C、G、I(S、E、及びMのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計12:配列C、G、I(各配列は、配列の転写及び翻訳のための調節領域のすぐ3’側にある)(S、E、及びMのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計13:配列A、C、C、C(Sのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計14:配列A、G、G、G(Eのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計15:配列A、I、I、I(Mのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計16:配列A、C、C、I、I(SまたはMのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計17:配列C、C、C(各配列は、配列の転写及び翻訳のための調節領域のすぐ3’側にある)(Sのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計18:配列A、G、G、G(各配列は、配列の転写及び翻訳のための調節領域のすぐ3’側にある)(Eのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計19:配列A、I、I、I(各配列は、配列の転写及び翻訳のための調節領域のすぐ3’側にある)(Mのコード配列はRNA内に存在しない)
RNA設計20:配列A、C、C、I、I(各配列は、配列の転写及び翻訳のための調節領域のすぐ3’側にある)(SまたはMのコード配列はRNA内に存在しない)
VLPは、RNAの1つの設計(例えば、設計1)、または2、3、もしくはそれ以上の設計(例えば、各VLPが1つのタイプのRNA設計を含む)をカプセル化して産生することができる。代替形態において、第1のVLPは、ちょうど1つの設計のRNA(例えば、設計1)をカプセル化して産生することができ、第2のVLPは、第1のVLPに使用された設計とは異なるちょうど1つの設計のRNA(例えば、設計2)をカプセル化して産生することができる。第1のVLPは、第2のVLPと同時にまたは連続して、CoV(例えば、SARS-CoV2またはSARS-Cov)感染症に罹患しているかまたはそのリスクがある対象に投与することができる。投与は、肺への投与であり得る。
実施例2:VLPの産生及びウイルス性感染症の治療
各々の長さが10%以内のサイズ(例えば、SARS-CoV-2またはSARS-CoVウイルスのRNAゲノムの100%)のプラス鎖RNAを産生する。各RNAは、ウイルスの野生型ゲノムに含まれる複数のTRS-Bを含む(そして任意選択で、野生型ウイルスゲノムのリーダーも含む)。例えば、各RNAは、実施例1におけるいずれかの設計のRNAである。各TRS-Bは、ウイルスタンパク質をコードしない配列のすぐ5’側にあり、各RNAは、ウイルスゲノムRNAの5’キャップ及び3’ポリAテールを含む。したがって、このRNAはいかなるウイルスタンパク質も産生するように発現することができない。1つの実施形態において、コロナウイルスパッケージングシグナルが各RNAに組み込まれる。各RNAは、ウイルスのRdRPに認識及び複製されることが可能である。
SARS-CoV-2またはSARS-CoVウイルスのカプシド及びスパイクタンパク質を含むVLPが産生される。産生プロセスにおいて、この実施例のRNAはVLPにカプセル化される。
VLPを含む吸入可能な医薬製剤を生産し、肺への送達用にネブライザーまたは吸入器によってヒト患者に送達する。患者は、ウイルスの感染症に罹患している。VLPは、ウイルスに感染している宿主細胞に実施例のRNAを送達し、肺内の非感染細胞にRNAを送達することができる。この治療は、患者における感染を低減するか、感染または拡大の進行を遅らせる。代替形態では、VLPを患者に全身的に(例えば静脈内投与によって)投与する。別の代替形態では、鼻腔内投与を使用する。VLPに加えて、ステロイドまたはインターフェロンを投与する場合がある。

Claims (25)

  1. ウイルスによるヒトまたは動物の対象の感染症の治療またはそのリスクの低減のために前記対象に投与するための粒子であって、前記ウイルスがRNAゲノムを含み、
    (A)前記ウイルスが前記対象の宿主細胞に感染可能であり、前記ウイルスゲノムがRNA配列(L)を含み、Lが第1の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE1)を含み、前記ウイルスの複製が第1のサブゲノムRNA(sgRNA1)の転写を含み、
    (B)sgRNA1が第2の転写調節配列コアエレメント(TRS-CE2)を含み、TRS-CE1が前記宿主細胞内のTRS-CE2とハイブリダイズ可能であり、
    (C)前記粒子がRNAを含み、前記粒子が、前記粒子RNAを転写するために前記粒子RNAを前記対象の宿主細胞内に導入可能であり、前記粒子RNAまたはその転写物がTRS-CEを含み、
    (D)前記ウイルスRNAが前記粒子RNAまたは前記転写物とともに宿主細胞内に存在する場合、前記粒子RNAまたは転写物の前記TRC-CEが、前記ウイルスRNAに含まれるTRS-CEとハイブリダイズすることができ、前記ハイブリダイズがウイルス複製を低減する、粒子。
  2. 前記粒子RNAまたはその転写物が、
    (i)(a)TRS-CE1もしくは(b)前記宿主細胞内でTRS-CE1とハイブリダイズ可能な配列を含む;及び/または
    (ii)(a)TRS-CE2もしくは(b)前記宿主細胞内でTRS-CE2とハイブリダイズ可能な配列を含み、
    前記ウイルスRNAが、前記粒子RNAまたは前記転写物とともに宿主細胞内に存在する場合、
    (iii)構成要素(i)(a)が、前記ウイルスRNAによってコードされるsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズする、
    (iv)構成要素(i)(b)が、前記ウイルスRNAに含まれるTRS-CE1とハイブリダイズする、
    (v)構成要素(ii)(a)が、前記ウイルスRNAに含まれるTRS-CE1とハイブリダイズする、及び/または
    (vi)構成要素(ii)(b)が、前記ウイルスRNAによってコードされるsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズし、
    (iii)~(vi)のいずれかのハイブリダイズがウイルス複製を低減する、請求項1に記載の粒子。
  3. (A)前記粒子RNA(任意選択で(+)ssRNA)が、タンパク質翻訳のために作用可能な調節要素を含み、前記調節要素が、構成要素(i)(a)もしくは(ii)(b)の5’側に作用可能に結合し、
    (B)前記粒子RNA(任意選択で(+)ssRNA)が、構成要素(i)(a)もしくは(ii)(b)を含み、前記粒子RNAが、前記構成要素の3’側にあり、かつ前記ウイルスの複製、伝播、または感染性に必要とされるタンパク質のアミノ酸配列を産生するように発現可能であるRNA配列を有しない;または
    (C)前記粒子RNA(任意選択で(-)ssRNA)が、構成要素(i)(b)もしくは(ii)(a)を含み、前記粒子RNAが、前記構成要素の5’側にあり、かつ前記ウイルスの複製、伝播、または感染性に必要とされるタンパク質のアミノ酸配列をコードするRNA配列を産生するように発現可能であるRNA配列を有しない、
    請求項2に記載の粒子。
  4. 前記粒子RNA(任意選択で(-)ssRNA)またはその転写物が、宿主細胞内のTRS-CE1と各々ハイブリダイズ可能なTRS-CEの複数のコピーを含み、TRS-CEの前記コピーのいずれも、前記ウイルスの複製または伝播に必須であるタンパク質をコードするRNA配列を産生するように発現可能であるRNA配列に作用可能に接続していない、請求項1~3のいずれかに記載の粒子。
  5. 前記粒子RNAが、
    (A)ウイルスゲノムによってコードされるRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)による認識及び結合に必要とされる調節エレメント(任意選択で、前記調節エレメントは、前記ウイルスゲノムに含まれる調節エレメントと同一である);及び/または
    (B)粒子RNAを宿主細胞に感染可能なウイルスカプシドにパッケージングするためのウイルスパッケージングマシンによって認識されることが可能なパッケージングシグナル
    を含む、請求項1~4のいずれかに記載の粒子。
  6. (iii)~(vi)のいずれかによって産生されたRNAハイブリッドが、RNA産物を産生するように前記宿主細胞によって3’伸長されることが可能であり、前記RNA産物が、前記細胞内で、前記ウイルスの複製、伝播、または感染性に必要とされるタンパク質の発現において非生産的である、請求項2~5のいずれかに記載の粒子。
  7. 前記粒子が、前記ウイルスが前記宿主細胞に結合するのに使用する受容体またはリガンドと同一である前記宿主細胞の前記受容体または前記リガンドを含み、任意選択で、前記リガンドがウイルススパイク糖タンパク質である、及び/または前記リガンドが、前記宿主細胞の表面のACE2タンパク質もしくは前記宿主細胞の表面のDPP4タンパク質に結合可能である、請求項1~6のいずれかに記載の粒子。
  8. (A)前記ウイルスの複製が、第1及び第2のサブゲノムRNA(sgRNA)の転写を含み、各sgRNAが転写調節配列コアエレメント(TRS-CE)を含み、前記sgRNAの各TRS-CEが、宿主細胞内の前記粒子RNAに含まれるTRS-CE1の配列とハイブリダイズ可能である、または
    (B)前記粒子RNAの転写が、第1及び第2のサブゲノムRNA(sgRNA)を産生し、各sgRNAが転写調節配列本体コアエレメント(TRS-B CE)を含み、前記sgRNAの各TRS-CEが、宿主細胞内の前記ウイルスRNAに含まれる転写調節配列リーダーコアエレメント(TRS-L CE)の配列とハイブリダイズ可能である、
    請求項1~7のいずれかに記載の粒子。
  9. 前記ウイルスの前記RNAゲノムがプラス鎖RNAゲノムであり、前記粒子RNAがプラス鎖RNAである、請求項1~8のいずれかに記載の粒子。
  10. (A)前記粒子RNAが、5’-ACGAAC-3’を各々含む1つ以上の配列を含む(+)ssRNAであり、前記ウイルスが、そのRNAゲノムが1つ以上の5’-ACGAAC-3’配列を含む(+)ssRNA(例えば、CoV)である、
    (B)前記粒子RNAが、5’-ACGAAC-3’を各々含む1つ以上の配列を含む(+)ssRNAを産生するように宿主細胞内で転写可能であり、前記ウイルスが、そのRNAゲノムが1つ以上の5’-ACGAAC-3’配列を含む(+)ssRNA(例えば、CoV)である、
    (C)前記粒子RNAが、5’-GUUCGU-3’を各々含む1つ以上の配列を含む(-)ssRNAを産生するように宿主細胞内で転写可能であり、前記ウイルスが、そのRNAゲノムが1つ以上の5’-ACGAAC-3’配列を含む(+)ssRNA(例えば、CoV)である、または
    (D)前記粒子RNAが、5’-GUUCGU-3’を各々含む1つ以上の配列を含む(-)ssRNAであり、前記ウイルスが、そのRNAゲノムが1つ以上の5’-ACGAAC-3’配列を含む(+)ssRNA(例えば、CoV)である、
    請求項1~9のいずれかに記載の粒子。
  11. TRS-CE1が、8~25個の連続したヌクレオチドの第1のウイルス転写調節配列(TRS1)に含まれ、TRS1が、5’→3’方向に、UAA-CE1、UCUCUAA-CE1、AGU-CE1、UGAGU-CE1、CE1-UU、CE1-UUU、CE1-UAA、CE1-UAACU、CE1-UAAAU、CE1-UU、UAA-CE1-UU、UAA-CE1-UUU、UCUCUAA-CE1-UUU、GGUCUAA-CE1-UAACU、GGUCUAA-CE1-UAAAU、AGU-CE1-UU、UGAGU-CE1-UU、CUAA-CE1、UAA-CE1、もしくはUCUAA-CE1を含む、
    及び/または
    TRS-CE2が、8~30個の連続したヌクレオチドの第2のウイルスTRS(TRS2)に含まれ、TRS2が、5’→3’方向に、UAA-CE2、UCUCUAA-CE2、AGU-CE2、UGAGU-CE2、CE2-UU、CE2-UUU、CE2-UAA、CE2-UAACU、CE2-UAAAU、CE2-UU、UAA-CE2-UU、UAA-CE2-UUU、UCUCUAA-CE2-UUU、GGUCUAA-CE2-UAACU、GGUCUAA-CE2-UAAAU、AGU-CE2-UU、もしくはUGAGU-CE2-UUを含む、
    請求項1~10のいずれかに記載の粒子。
  12. 前記ウイルスが、ニドウイルス、CoronavirinaeもしくはTorovirinaeウイルス、SARSもしくはMERSウイルス、またはSARS-CoV、SARS-CoV-2、もしくはMERS-CoVウイルスから選択される、請求項1~11のいずれかに記載の粒子。
  13. 前記粒子RNAが、
    (i)TRS-CE1、及び/または
    (ii)宿主細胞内でTRS-CE2とハイブリダイズ可能な配列を含み、
    前記ウイルスRNAが、前記粒子RNAとともに宿主細胞内に存在する場合、
    (iii)構成要素(i)が、前記ウイルスRNAによってコードされるsgRNA1に含まれるTRS-CE2とハイブリダイズ可能である、及び/または
    (iv)構成要素(ii)の相補物が、前記ウイルスRNAに含まれるTRS-CE1とハイブリダイズ可能であり、
    (iii)及び/または(iv)のハイブリダイズがウイルス複製を低減する、請求項1~12のいずれかに記載の粒子。
  14. (A)前記粒子RNAまたは前記粒子の構成要素(ii)(b)のCE1が、TRS-L配列(例えば、前記ウイルスのTRS-L配列と同一または少なくとも90、95、96、97、98、もしくは99%同一であるTRS-L配列)に含まれる;及び/あるいは
    (B)前記粒子RNAまたは前記粒子の構成要素(i)(b)のCE2が、TRS-B配列(例えば、前記ウイルスのTRS-B配列と同一または少なくとも90、95、96、97、98、もしくは99%同一であるTRS-B配列)に含まれる、
    請求項2~13のいずれかに記載の粒子。
  15. 前記粒子RNAの長さが、前記ウイルスRNAゲノムの長さの120%以下である、請求項1~14のいずれかに記載の粒子。
  16. 前記粒子RNAが、前記ウイルスRNAゲノムの各オープンリーディングフレーム(ORF)の配列の一部または全部を、前記粒子RNAが置き換える前記ORF配列のサイズの120%以下(好ましくは100%)であるRNA配列で置き換えることによって取得可能であり、前記ウイルスの各ORFが非機能的にされるが、前記ウイルスRNAの前記TRS配列が前記粒子RNA内で保持されている、請求項1~15のいずれかに記載の粒子。
  17. 請求項1~16のいずれかに記載の粒子で使用するための(+)ssRNAであって、前記RNAが、ヒトまたは動物の対象の宿主細胞に感染するウイルスによって産生されるsgRNAのTRS-B CEの相補配列(CS)を各々含む複数の配列を含み、前記(+)ssRNAが、前記ウイルスの1つ、複数、または全てのオープンリーディングフレーム(ORF)配列を有さず、TRS-B CEを各々含む1つ以上の転写物を産生するように宿主細胞内で転写可能であり、各TRS-B CEが、前記ウイルスのTRS-L CEとハイブリダイズ可能であり、それにより、各転写物が1つ以上のウイルスORFタンパク質産物の発現を阻害可能である、(+)ssRNA。
  18. 前記ウイルスが、不連続RNA転写を用いて複製するタイプの(+)ssRNAウイルスである、請求項17に記載のRNA。
  19. 請求項1~18のいずれかに記載の複数の粒子またはRNAを含む組成物であって、任意選択で、前記組成物が、前記ウイルスによるヒトもしくは動物の対象の感染症の治療もしくはそのリスク低減のために、または前記ウイルスによる前記対象の感染の症状の治療もしくはそのリスク低減のために、前記対象に投与するために用いられる、組成物。
  20. 宿主細胞内のウイルスの複製を阻害するin vitroの方法であって、前記ウイルスが(+)ssRNAゲノムを含み、前記ウイルスゲノムが、TRS-L CEを含み、かつTRS-B CE(CE2)を含むsgRNA転写物をコードし、前記方法が、
    a)前記宿主細胞を、請求項1~16のいずれかに記載の粒子または請求項17及び18のいずれか1項に記載のRNAに接触させることと、前記粒子RNAまたは請求項17及び18のいずれか1項に記載のRNA(第1のRNA)を宿主細胞内に導入することとを含み、前記第1のRNAが、前記CE2の相補物(任意選択で、少なくとも80%の相補物)である配列を含む(+)ssRNAであり、
    b)ステップ(a)と同時に、ステップ(a)の後に、またはステップ(a)の前に、前記ウイルスRNAゲノムが前記宿主細胞内に導入され、
    c)前記第1のRNAが、CE2またはウイルスTRS-L CEとハイブリダイズ可能な配列を含むRNA転写物を産生するように細胞内で転写される転写プロセスが行われ、前記転写物が、前記ウイルスの(+)ssRNAに含まれるTRS-L CEとハイブリダイズしてRNAハイブリッドを形成し、前記ハイブリッドが、リーダー配列(L)を含むmRNAを産生するのに使用され、前記リーダーが、前記ウイルスの複製、伝播、及び感染性に必要とされるタンパク質のアミノ酸配列(A)をコードするRNA配列に作用可能に結合していない、方法。
  21. 前記転写物中のCES2、またはウイルスTRS-L CEとハイブリダイズ可能な前記配列が、
    (A)前記ウイルスの複製、伝播、もしくは感染性に必要とされないタンパク質を産生するように前記宿主細胞内で発現可能なmRNA配列をコードするRNA配列、または
    (B)オープンリーディングフレーム(ORF)の相補物を含まないRNA配列、または
    (C)ウイルスのオープンリーディングフレーム(ORF)の相補物を含まないRNA配列
    のすぐ3’側にある、請求項20に記載の方法。
  22. 複数の粒子を産生する方法であって、複数の粒子(任意選択で、ウイルス様粒子(VLP)、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞)を複数のRNAと組み合わせることであって、各RNAが請求項1~18のいずれかに記載のRNAであり、少なくとも1つのRNAが、前記複数の粒子のそれぞれの粒子の中及び/または上に組み込まれる、組み合わせることと、任意選択で、ウイルス性感染症の治療または予防のためにヒトまたは動物の対象に投与するための医薬組成物を産生するために、前記粒子を製剤化することとを含む、方法。
  23. 試料中のウイルスRNAを検出する方法であって、前記ウイルスが、第1のTRS-CE(CE1)及び第2のTRS-CE(CE2)のハイブリダイズを含む不連続RNA転写プロセスを用いて複製し、前記方法が、前記試料を請求項1~18のいずれかに記載のRNA(第1のRNA)に接触させることと、第1のRNAと前記試料に含まれるウイルスRNAとの間で形成されたハイブリッドを検出することとを含む、方法。
  24. DNAであって、請求項1~18のいずれか1項に記載のRNAの相補物であるDNA配列を含み、任意選択で、前記DNA配列が、宿主細胞内で前記RNAを転写するためのプロモーターに作用可能に結合している、DNA。
  25. ヒトまたは動物の対象におけるウイルス性感染症を診断するための、請求項1~18のいずれか1項に記載のRNAまたは請求項24に記載のDNAの使用であって、前記ウイルスが不連続RNA転写プロセスを用いて複製される、使用。
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