JP2023530078A - 媒質内の粒子の焦点距離を特定するための方法 - Google Patents

Abstract

媒質（Ｍ）中の粒子（Ｐ）の焦点距離（ｄ）を決定するための方法であって、該方法は試料（４）を提供する工程と、前記試料（４）を照射するためにコヒーレント光ビーム（６）を放射し、前記光ビーム（６）の第１の部分が前記粒子（Ｐ）によって散乱される工程と、干渉画像（１１）を記録する工程と、前記干渉画像（１１）からの位置（Ｈ）のセットについて電場（Ｅ１）を計算する工程（Ｓ１）と、前記位置（Ｈ）のそれぞれに対して、前記計算された電場（Ｅ１）から計算された前記コヒーレント光ビーム（６）の強度値（Ｉ）を含む表示（１６）を生成する工程（Ｓ２）と、第１の位置（ＨＰ）が試料（４）にあり、第２の位置（ＨＦ）が前記第１の位置（ＨＰ）の背後または前のビーム方向（９）にある、２つの位置（ＨＰ、ＨＦ）を検出する工程（Ｓ３）と、前記検出された２つの位置（ＨＰ、ＨＦ）から焦点距離（ｄ）をプロセッサ（１２）により特定する工程（Ｓ４）と、を含む。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、媒質内の透明粒子の焦点距離を特定するための方法に関する。

本発明の背景は、例えば、細菌による水の汚染、または尿路感染におけるバクテリア感染の開始を研究するために、媒質中のエマルジョン、細胞培養物およびバクテリアのような、コロイドを観察する分野にある。また、海水中のプラスチック粒子、液体食品または医薬品中の不純物、または体液中の細胞、その細胞小器官等を観察し得る。散乱によって光を集束させる透明粒子が観察される場合、その焦点距離は価値のある情報を提供する。焦点距離は、粒子の他の特性（したがって、大きさ、形状、屈折率、および乾燥質量など）と、バクテリア中の水分または糖類の量などと相関させるために、または媒質中の粒子のクラスおよびサブクラスを区別するために使用することができる。

粒子の光学特性（例えば、その屈折率）を特定するために一般的に使用される方法としては、フローサイトメトリーまたは位相差顕微鏡法がある。フローサイトメトリーは、高い処理量で粒子に関する統計情報を抽出するのに好適である。しかし、単一粒子の光学特性を特定する精度が低く、静止した媒質で粒子を観察することができない。一方、位相差顕微鏡法は限定された処理量および焦点深度においてのみ、高精度で個体粒子を可視化することができる。さらに、屈折率、および必要であれば、粒子の焦点距離を抽出するためには、２次元画像の困難かつ厳しい解釈が要求される。

別の実行可能な方法としては、デジタルホログラフィック顕微鏡法がある。まず、前記粒子を含む試料にコヒーレント光ビームを照射して干渉画像を得る。放射した光線の三次元モデルは、再構成アルゴリズム（例えば、順方向伝播、逆方向伝播、または突起アルゴリズム）を干渉画像に適用することによって、干渉画像から計算される。三次元モデルでは、粒子の位置およびその焦点の位置、ならびにそれらの差として焦点距離を特定することができる。

しかしながら、通常のデジタルホログラフィック顕微鏡法によって得られる三次元モデルは、粒子の焦点距離を確実に特定するためには定性的に不適切であることが多いことが、実験により示されている。一方では、焦点における光ビームの強度が一般に、特に焦点距離が小さい場合は、粒子がその焦点から区別できないように、粒子における強度をはるかに超える。一方で、媒質内で散乱される光の一部、すなわち粒子によってではなく、媒質内の他の（通常はより小さい）物体によって（例えば、ミー散乱によって）発生する、不可避的なバックグラウンド信号が、干渉画像に記録される。このバックグラウンド信号は粒子によって散乱された光と、粒子によって散乱されなかった光との間のコントラストを損なうため、モデルの位置の特定を阻害する。それでも粒子位置を正確に特定するためには、再構成されたモデルと散乱のモデルとの、（例えば、ミー理論を使用した）正確で単調な計算による厳しい比較の実行が必要となる。

本発明の目的は、従来技術の限界を克服し、媒質内の透明粒子の焦点距離を効率的かつ正確に特定するための方法を提供することである。

この目的は、媒質内の透明粒子の焦点距離を特定するための方法であって：
前記粒子を含む媒質の試料を提供する工程と、
光源を用いて、コヒーレント光ビームを放射し、試料に該光ビームを照射し、光ビームの第一の部分が粒子によって散乱されて、粒子の後方または前方のビーム方向に焦点を有する散乱光ビームを作る工程と、
散乱光ビームと、前記粒子によって散乱されなかった光ビームの第２の部分との干渉画像を、カメラを用いて、記録する工程と、
粒子と焦点とを含む空間内に三次元的に分布する位置のセットのそれぞれについて、干渉画像からの光ビームの最初の部分の電場をプロセッサにより計算する工程と、
前記位置のそれぞれが、その位置における計算された電場から計算されたコヒーレント光ビームの強度値を含み、前記位置をカバーする光ビームの表示を、プロセッサを用いて生成する工程と、
第１の位置が試料にあり、第２の位置が前記第１の位置の背後または前の光線方向にある、２つの位置と、近くの位置についてのそれぞれの強度値よりも大きい強度値を、プロセッサを用いて検出する工程と、
前記検出された２つの位置から焦点距離をプロセッサにより特定する工程と、を含む方法によって達成され、
前記生成する工程では、位置ごとに、強度値が下記式：

（式中、
ｒおよびｚは、位置の座標であり、ｚは、ビーム方向とは反対方向の座標であり、ｒは、前記反対方向に垂直な平面（ｘ、ｙ）内の一対の座標であり、
Ｉ（ｒ，ｚ）は、位置の強度値であり、
Ｉ_１（ｒ，ｚ）は、位置に対する光ビームの第１の部分の強度であり、
Θは、位相シフトパラメータであり、
ｋ、ｌは、合計の指標であり、
Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌは、拡張パラメータであり、
Ｅ_１（ｒ，ｚ）は、位置について計算された電界であり、
ａｒｃｔａｎ２は、４象限逆正接関数である。）
に従って計算される。

光ビームの電場は、一般に複素数値であり、それ故、その実部および虚部によって、またはその振幅および位相によって説明できることに留意されたい。さらに、光ビームは、強度、すなわち単位面積当たりのパワーを有する。単位面積当たりのパワーは、電界の振幅の二乗に比例する。

粒子位置に対応する第１の位置、および焦点位置に対応する第２の位置から、焦点距離をこれらの差として特定することができる。出願人は、各強度値に関する前記計算が、粒子によって散乱された光と、粒子によって散乱されなかった光との間の高いコントラスト、およびその焦点からの粒子の信頼できる区別を達成可能とし、結果として、前記２つの位置を正確に検出できることを見出した。したがって、焦点距離は、光ビームの強度、または電場と散乱のモデルの複雑な比較を不要にする表示から、直接的かつ効率的に特定できる。

さらに、それぞれの強度値を計算するために使用される位相シフトおよび拡大パラメータは、様々な粒子および媒質の大きなセットについて、それぞれの焦点距離の正確な特定を可能にする。例えば、位相シフトおよび拡大パラメータのいずれについても、例えば、類似の試料または測定によって、または事前の知見に基づいて推定することによって、予め特定してもよい。例えば、位相シフトパラメータは、バックグラウンド信号を低減するためにπに設定され得る。一方、これらのパラメータは、例えば、水中の特定のバクテリアの焦点距離を正確に特定するためといった、特定の状況に適合させることができる。この目的のために、特定の実施形態では、生成された表示を最適化するために、例えば、粒子および焦点位置が収束したときに終了し得る、例えば、当技術分野で公知の反復最適化アルゴリズム（Ｑｕａｓｉ－Ｎｅｗｔｏｎアルゴリズムなど）を適用することによって、位相シフトおよび拡大パラメータのうちの１つまたは複数を繰り返し特定することができる。

この実施形態の好ましい態様では、位相シフトおよび拡大パラメータのうちの少なくとも１つは、生成する工程を繰り返すことによって特定され、前記少なくとも１つのパラメータは、表示に含まれるより高い強度値とより低い強度値との間の差を増加させるように変更される。この最適化は、典型的にはより低い強度値によって生じるバックグラウンドの影響を低減し、より顕著なより高い強度値をもたらす。この差は、例えば、全てのより高い強度値の和と全てのより低い強度値の和との間の差、実効値（二乗平均平方根）コントラストなどであり得る。例えば、後者を採用することにより、前記２つの位置を見つける工程において最初に考慮され得る、より顕著な強度値の最大値の数をより少なくできる。

他の、もしくはさらなる態様では、位相シフトおよび拡大パラメータのうちの少なくとも１つは、生成および検出工程を繰り返すことによって特定され、前記少なくとも１つのパラメータは、第１の位置の強度値とその近くの位置のそれぞれの強度値との間の差を増加させるように、および／または第２の位置の強度値とその近くの位置のそれぞれの強度値との間の差を増加させるように、変更される。この特定は、局所的なコントラストが強調されるように、粒子および／または焦点位置のそれぞれの強度値を、それぞれの近くの位置の強度値と比較して、特に強調する。

別の好ましい態様によれば、位相シフトおよび拡大パラメータのうちの少なくとも１つは、生成および検出工程を繰り返すことによって特定され、前記少なくとも１つのパラメータは、第１の位置の強度値と第２の位置の強度値との間の比率を増加させるように変更される。これにより、粒子位置の強度値を、焦点位置、およびその近くの位置のそれぞれの強度値と区別することが容易になる。この位置は、小さな焦点距離を正確に特定するのに特に適している。

特に好ましい実施形態では、位相シフトおよび拡大パラメータのうちの少なくとも１つは、
生成する工程においてシミュレートされた表示を得るための、提供する工程、放射する工程、記録する工程、計算する工程および生成する工程のシミュレーション、および前記シミュレートされた表示によりカバーされる位置ごとにおける、シミュレートされた光ビームの強度、ならびに
前記生成する工程のシミュレーションを繰り返すことによって特定され、
前記少なくとも１つのパラメータは、前記シミュレートされた表示によって含まれる強度値と、前記それぞれの位置における前記シミュレートされた光ビームの強度との間の差異を低減するように変更される。

媒質、媒質中の追加の散乱体、粒子の周囲、その形状、大きさ、方位、屈折率などは、別々にシミュレートすることができ、必要に応じて調整することができる。このように、位相シフトおよび拡大パラメータのうちの少なくとも１つは、例えば、様々な局所的環境を有するいくつかの粒子を含む、試料のシミュレーションを実行することによって、特定の試料について、またはより一般的な例について、容易に特定することができる。さらに、すなわち、この実施形態は、前記パラメータのうちの少なくとも１つを予め特定するため、および／または前記パラメータのうちの少なくとも１つを、前記態様のうちの１つに従って、繰り返し使用されるべき初期値に設定するために使用される。

別の好適な実施形態では、位相シフトおよび拡大パラメータのうちの少なくとも１つは前記表示における位置に依存する。これは、それぞれの位置の強度値を計算するときに、前記少なくとも１つのパラメータを異なるように予め決定しておく、または特定することによって、異なる局所的環境、すなわち、特に粒子位置および焦点位置の近くの位置をそれぞれ考慮することを可能にする。これにより、粒子および焦点位置の両方、ひいては焦点距離を特定する際の精度を向上させることができる。

粒子によって散乱される光と、粒子によって散乱されない光との間の区別を容易にするために、検出する工程において、強度値が所定の閾値よりも大きい位置のみが考慮される場合が有利である。より容易な区別とは別に、これにより、考慮されるべきデータの量が低減されるため、前記２つの位置のより速い検出が可能となる。この実施形態は、強度閾値が当業者に公知の方法によって計算され、例えば、（一般的、典型的に、期待される、または現在特定されている）最高強度値の所定の割合、いくつかの位置における強度値の平均、表示のすべての強度値の全体平均等として、計算され得る。

添付の図面を参照し、好ましい例示的な実施形態に基づいて、本発明の詳細を以下に説明される：
図１は、本発明の方法に使用されるインライン干渉計の側面の模式図である；
図２は、図１の干渉計によって記録された、本発明による干渉画像からの焦点距離の特定を示すフローチャートである；
図３は、図１および図２に示された方法に従って特定された光ビームの強度値を、光ビームの方向から反対の方向までグラフとして示す。

図１は、光源２およびカメラ３を備えるインライン干渉計１を示す。インライン干渉計１は媒質Ｍにおける（微細な）透明粒子Ｐの焦点距離ｄを特定するために使用される。焦点距離ｄを特定するために、粒子Ｐ（またはいくつかの粒子Ｐ）を含む媒質Ｍの試料４が、光源２とカメラ３との間の光の通路５に設けられる。粒子Ｐは細胞、バクテリア、荷電粒子、微小塑性粒子、オルガネラ等であり、媒質Ｍは、水分、オイル、体液（例えば、血）、液剤等である。一般に、媒質Ｍにおける光線を集束させる任意の透明粒子Ｐの焦点距離ｄが特定され得る。

このために、光源２は、提供された試料４を照射するためのコヒーレント光ビーム６を放射する。光源２は、例えば、レーザーダイオードのようなコヒーレント光ビーム６を放射することができる任意の種類であってもよい。

試料４では、光ビーム６の第１の部分が粒子Ｐによって散乱されることによって、図１に示す例では粒子Ｐの後方のビーム方向９、すなわち、粒子Ｐの後方の焦点距離ｄに対応する距離に、焦点８を有する散乱光ビーム７を生成する。他の場合では、粒子Ｐが発散レンズとして作用する場合、焦点はビーム方向９（図示せず）で見たとき、粒子Ｐの前方にある。

しかしながら、光ビーム６の第２の部分は、粒子Ｐによって散乱されず、散乱されていない光ビーム１０として試料４を横断する。本明細書の文脈において、散乱光ビーム７は媒質Ｍにおける粒子Ｐによる散乱に関し、一方、非散乱光ビーム１０は、媒質Ｍにおける粒子Ｐによって散乱されていない。

散乱光ビーム７と非散乱光ビーム１０とは互いに干渉する。光の通路５の終わりに、カメラ３は、散乱光ビーム７および非散乱光ビーム１０の干渉画像１１（図２）を記録する。カメラ３は、この目的のために、例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）または電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージセンサを有する任意のアナログまたはデジタルカメラとすることができる。

しかしながら、前記散乱光ビーム７および前記非散乱光ビーム１０の両方の一部は、例えば、他の（通常はより小さい）物体（例えば、チンダル効果を介して）によって媒質Ｍに散乱されてもよく、非散乱光ビーム１０のこの部分は、ビーム方向９からわずかに逸脱することに留意されたい。干渉画像１１において、散乱光ビーム７および非散乱光ビーム１０の前記部分は、不可避的かつ望ましくないバックグラウンド信号を生じ、該バックグラウンド信号は、焦点距離ｄの特定を阻害する。

干渉計１は、ホログラフィック顕微鏡の技術分野で知られているような１つ以上のさらなる光学装置、例えば、シグナル対ノイズ比を改善するための減衰器環、顕微鏡対物レンズ、位相板、１つ以上のレンズなどを備えてもよい。さらに、干渉計１は、例えば、ビームスプリッタを利用する干渉計１等のインライン干渉計とは異なる種類の干渉計であってもよい。

カメラ３によって記録された干渉画像１１は、インタフェース１３を介してプロセッサ１２に転送される。任意選択で、プロセッサ１２は、例えば、収差を数値的に補正するために、当技術分野で知られているように、干渉画像１１を前処理することができる。続いて、プロセッサ１２は、図２および図３を参照して説明するように、干渉画像１１を処理して、そこから焦点距離ｄを特定する。

カメラ３は、干渉画像１１を純粋な２次元画像として記録し、この干渉画像１１は光ビーム６の強度および位相情報の両方をエンコードする。この情報により、プロセッサ１２は光ビーム６を三次元的に「再構成」することができる。

第１の工程Ｓ_１では、プロセッサ１２が干渉画像１１からの１組の位置Ｈのそれぞれについて、光ビーム６の第１の部分、すなわち散乱光ビーム７の電場Ｅ_１を計算する。位置Ｈは、粒子Ｐと焦点８とを含む空間Ｒに三次元的に分布している。図１～図３に示す例では、焦点８が粒子Ｐの後ろ（ビーム９方向）にあることが知られているか、または予想されるため、空間Ｒは試料４内からカメラ３に及ぶ。別の実施形態では焦点８が粒子Ｐの前（ビーム方向９）にあることが知られているか、または予測されるとき、空間Ｒは試料４内から光源２まで（またはそれをさらに超える）の範囲である。さらに別の実施形態では、空間Ｒが例えば、カメラ３から光源２まで（またはそれを超える）に及ぶ。

図２に示す例では、位置Ｈがいくつかの仮想平面１４_１、１４_２、・・・、一般に１４_ｉにあり、いくつかの仮想平面１４は、散乱されていない光ビーム１０の光ビーム９に垂直である。この例では、位置Ｈがそれぞれの仮想平面１４_ｉにおいて同一に配置されるが、これは任意である。他の例では、位置Ｈが空間Ｒにおいて、例えば、隣接する立方体領域を表す規則的なグリッド配列において、または隣接する任意に形成された空間領域を表す不規則なグリッド配列において、異なるように分布してもよい。

散乱光ビーム７の電界Ｅ_１を計算するために、プロセッサ１２は位置Ｈのセットごとに、再構成アルゴリズムを干渉画像１１に適用する。位置Ｈごとの散乱光ビーム７の電界Ｅ_１は複素数であるため、その実数部および虚数部、または位相φ_１および振幅がそれぞれ算出される。この例では、ビーム方向９とは逆の方向１５において、プロセッサ１２が平面単位で再構成アルゴリズムを適用する。ただし、これは任意である。そのような再構成アルゴリズムの様々な例としては、当技術分野で公知の、例えば、逆ラドン変換、フーリエ領域再構成アルゴリズム、反復再構成アルゴリズムなどの、順方向または逆方向伝播または射影アルゴリズム等が挙げられる。

続く第２工程Ｓ_２では、すべての位置Ｈをカバーし、各位置Ｈについて、その位置Ｈにおける光ビーム６の強度を表すそれぞれの強度値Ｉ（図３）を備える、試料４の表示１６を、プロセッサ１２が生成する。電場Ｅ_１と、その位置Ｈについて計算された散乱光ビーム７の強度Ｉ_１とから、例えば、電場Ｅ_１の振幅の二乗として、各位置Ｈについての強度値Ｉが、下記式：

（式中、
ｒ、ｚは、位置Ｈにおける座標であり、ｚは、ビーム方向９と反対方向１５の座標であり、ｒは、前記反対方向１５に垂直な平面ｘ、ｙにおける一対の座標であり、
Ｉ（ｒ，ｚ）は、位置Ｈの強度値であり、
Ｉ_１（ｒ，ｚ）は、位置Ｈに対する光ビーム６の第１の部分の強度であり、
Θは、予め特定されたまたは以下に示すように特定される位相シフトパラメータであり、
ｋ、ｌは、それぞれ、値の集合Ｋ、Ｌにわたって繰り返される総和の指数であり、
Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌは、拡張パラメータであり、予め決められているか、または以下に示すように特定されるかのいずれかであり、
Ｅ_１（ｒ，ｚ）は、位置Ｈについて計算された電界であり
ａｒｃｔａｎ２は、４象限逆正接関数を表す。）
によって計算される。

総和は、全ての膨張パラメータＣ_ｋ、Ｄ_ｌが０であり、ａｒｃｔａｎ２のみが散乱光ビーム７の電界Ｅ_１の位相φ_１を生じる、自明な場合が除外されることを理解されたい。さらに、総和の指数ｋ、ｌは整数に制限される必要はなく、すなわち、セットＫ、Ｌの各々は例えば、実数値を含んでもよい。

工程Ｓ_２に続く、第３の工程Ｓ_３において、プロセッサ１２は２つの位置Ｈ_Ｐ、Ｈ_Ｆを検出する。Ｈ_Ｐは試料４内に位置し、かつ粒子位置である第１の位置であり、Ｈ_Ｐは焦点位置であり、かつ、ビーム方向９で見たときに粒子位置の後ろに位置する（または他の場合にはその前に位置する）第２の位置である。これらの点は、試料４内、または試料４とカメラ３との間のいずれか（前記他の場合には試料４内または試料４と光源２との間のいずれか、またはさらにはそれを超える）に存在する。２つの位置Ｈ_ＰおよびＨ_Ｆは以下の基準に従って検出される：これらの２つの位置Ｈ_Ｐ、Ｈ_Ｆのそれぞれについて、それぞれの強度値Ｉ_Ｐ、Ｉ_Ｆは極大であり、そのためそれぞれの強度値Ｉ_Ｐ、Ｉ_Ｆは、近くの位置Ｈ_ＮＰ、Ｈ_ＮＦについてのそれぞれの強度値Ｉ_ＮＰ、Ｉ_ＮＦよりも大きい（図３）。位置Ｈ_ＮＰは例えば、粒子位置Ｈ_Ｐを中心とした球体または箱体の近くに位置する位置Ｈである。これは、焦点位置Ｈ_Ｆの近くの位置Ｈ_ＮＦにも同様に当てはまる。

２つの位置を検出するために、プロセッサ１２は任意の検出アルゴリズムを適用することができる。例えば、ビーム方向９において互いに離れた２つの位置Ｈ_Ｐ、Ｈ_Ｆを検出するために、最初に、局所的な最大値を示す全ての強度値Ｉを特定し、次いで、それぞれの位置Ｈを比較することができる。第１の位置Ｈ_Ｐ、および第２の位置Ｈ_Ｆのいくつかのペアがこの選択基準を満たす場合、いくつかの粒子Ｐが試料４（図１）中に存在するか、そうでない場合、追加の選択基準として例えば、焦点位置Ｈ_Ｆとして最も高い強度値Ｉを有する位置Ｈを取得するか、または粒子位置Ｈ_Ｐとして既知の粒子散乱分布（例えばミー散乱理論から導出された分布）を示す強度値Ｉの分布をその周りに有する位置Ｈをとるなどの基準を任意で選択できる。

最後の工程Ｓ_４では、プロセッサ１２が工程Ｓ_３で検出された２つの位置Ｈ_Ｐ、Ｈ_Ｆから、例えば、与えられた座標系１８（図３）におけるそれぞれの座標ｘ、ｙ、ｚから計算された相互距離として、媒質Ｍにおける粒子Ｐの焦点距離ｄを特定できる。

次に、工程Ｓ_２において強度値Ｉを計算する様々な実施形態を、図３を用いて説明する。

図３の例示的なグラフは、方向１５に沿って計算され、実線１７によって表される強度値Ｉを示す。第１の例では、位相シフトおよび拡大パラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌのうちの少なくとも１つ、すなわち、位相シフトパラメータΘ、第１の展開パラメータＣ_ｋのうちの１つまたは複数、および／または第２の展開パラメータＤ_ｌのうちの１つまたは複数は例えば、類似の試料または測定により予め特定されるか、または事前の知見に基づいて特定される。例えば、位相シフトパラメータΘはπに設定されてもよく、位相シフトパラメータは一般に、バックグラウンド信号を低減する。

他の、もしくはさらなる実施形態では、位相シフトおよび拡大パラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌのうちの少なくとも１つは、試料４の記録された妨害像１１について繰り返し特定される。

その第１の態様では、工程Ｓ_２が何度も繰り返され（図２の破線の分岐ｂ_１）、前記少なくとも１つのパラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌは、表示１６によって構成されるより高い強度値Ｉとより低い強度値Ｉとの間の差異を増大させるために、繰り返しごとに変更される。例えば、前記のより高い強度値Ｉは平均強度値Ｉ_ａｖｇよりも高く、強度閾値Ｉ_ｔｈよりも高く、例えば、最も高い強度値Ｉの特定の割合（ここではＩ_Ｆ）であってもよく、または表示１６などによって構成される計算された強度値Ｉの極大値の固定値（例えば、１０）であってもよい。同様に、前記のより低い強度値Ｉは、上述の（または別の）強度閾値Ｉ_ｔｈ、前記平均強度値Ｉ_ａｖｇなどよりも低くてもよい。

この例では、より高い強度値Ｉとより低い強度値Ｉとの間の差がそれぞれの強度値Ｉと平均強度値Ｉ_ａｖｇとの間の絶対偏差ΔＩ_ａｖｇの合計として計算され、その結果、表示１６に含まれるすべての強度値Ｉの分散が増加される。あるいは、他の差、例えば、より高い全ての和とより低い全ての強度値Ｉの和との間の差等が用いられてもよい。

図３の例では、前記少なくとも１つのパラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌの繰り返しの特定の結果は、実線１７によって記号化され、一方、破線１７’は、最初の強度値Ｉ’、すなわち、工程Ｓ_２を繰り返す前に計算された強度値を記号化する。この例に示されるように、実線１７は点線１７’よりも顕著な最大値Ｉ_Ｐ、Ｉ_Ｆを有し、それに加えて、様々な粒子および焦点位置Ｈ’_Ｐ、Ｈ’_Ｆにおける強度値Ｉ’_Ｐ、Ｉ’_Ｆの最大値を示す。

図３は、方向１５における、すなわちｚ方向における強度値Ｉを示し、一方で、前記少なくとも１つのパラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌの変化は一般に、３次元すべてにおいて表示１６に影響を及ぼすことに留意されたい。拡張パラメータＣ_ｋ、Ｄ_ｌの特定は、それぞれのセットＫ、Ｌの特定を含み、すなわち、セットＫ、Ｌは予め特定されてもよいし、拡張パラメータＣ_ｋ、Ｄ_ｌは繰り返し特定されてもよいし、またはセットＫ、Ｌも、繰り返し特定されてもよいことにさらに留意されたい。

第２の態様では、工程Ｓ_２およびＳ_３が繰り返され（図２の破線の分岐ｂ_２）る。また、前記少なくとも１つのパラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌは、粒子位置Ｈ_Ｐの強度値Ｉ_Ｐと、その近くの位置Ｈ_ＮＰのそれぞれの強度値Ｉ_ＮＰとの間の差ΔＩ_Ｐ－ＮＰを増大させるように変更され、前記近くの位置Ｈ_ＮＰの強度値Ｉ_ＮＰは、任意選択で平均強度値Ｉ_{ＮＰ，ａｖｇ}に平均化される。他には、強度値Ｉ_Ｐ、および近くの強度値Ｉ_ＮＰの任意の他の組み合わせとの間の差は、例えば、強度値Ｉ_ＮＰの加重和が採用され得る。同様に、前記少なくとも１つのパラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌは他に、もしくはさらに、焦点位置Ｈ_Ｆの強度値Ｉ_Ｆと、焦点位置Ｈ_Ｆの近くの位置Ｈ_ＮＦのそれぞれの強度値Ｉ_ＮＦ、例えば、それらの平均Ｉ_{ＮＦ，ａｖｇ}との間の差ΔＩ_Ｆ－ＮＦを増大させるように変更される。

第３の態様では、工程Ｓ_２およびＳ_３が繰り返され、前記少なくとも１つのパラメータΘ，Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌは、前記粒子位置Ｈ_Ｐの強度値Ｉ_Ｐと前記焦点位置Ｈ_Ｆの強度値Ｉ_Ｆとの間の比率を増大させるように変更される。

さらなる追加の、もしくは他の実施形態では、試料を照射する光ビーム、その散乱、および干渉画像に記録されたその強度を、プロセッサ１２がシミュレートする。このシミュレーションは、例えば、当技術分野で公知のフィールドトレーシング法を使用して、想定される特定の試料またはより一般的な試料のいずれかについて、実行することができ、それぞれの試料が１つまたは複数の粒子を含む。このシミュレートされた干渉画像から、シミュレートされた表示を得るために、上記で例示した工程Ｓ_１およびＳ_２を実行することによって、位置Ｈのセットとは異なっているかまたは等しい、位置のさらなるセットについて強度値Ｉは計算される。したがって、提供する工程、記録する工程、放射する工程、計算する工程、および生成する工程がシミュレートされる。次に、生成する工程Ｓ_２の繰り返しについて、シミュレーションが実行され、ここで、前記少なくとも１つのパラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌは、シミュレートされた表示によって構成される強度値と、それぞれの位置におけるシミュレートされた光ビームの強度との間の差異を低減するように変更される。当然ながら、シミュレーションは任意選択で、異なる媒質の異なる粒子に対して実行されてもよく、得られたパラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌは、例えば、平均化されて、粒子Ｐと媒質Ｍとの多種多様に適用可能となるように組み合わされてもよい。

任意選択で、位相シフトおよび拡大パラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌのうちの少なくとも１つは表示１６内の位置Ｈに依存し、その結果、異なる位置Ｈに対する強度値Ｉは前記少なくとも１つのパラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌの異なる値を使用して計算される。例えば、前記少なくとも１つのパラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌ、例えば、Ｃ_２の値は、粒子位置Ｈ_Ｐおよびその近くの位置Ｈ_ＮＰが焦点位置Ｈ_Ｆおよびその近くの位置Ｈ_ＮＦのＣ_ｋ、Ｄ_ｌの同じ少なくとも１つのパラメータΘの値とは異なっているように、予め決められてもよく、または特定されてもよい。

上述の例および態様のいずれも、例えば、粒子および焦点位置Ｈ_Ｐ、Ｈ_Ｆが収束されるときに停止する準ニュートンアルゴリズムなど、当技術分野で公知の停止基準を伴う最適化アルゴリズムを使用して実行され得る。さらに、上述の実施形態および態様は、前記パラメータΘ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌのそれぞれのうちの異なる１つまたは異なる１つを最適化しながら組み合わせることができる。

任意の実施形態では、強度閾値Ｉ_ｔｈがプロセッサの工程Ｓ_３の前に導入される。そこで、特定された強度値Ｉが計算された強度閾値Ｉ_ｔｈよりも小さい位置Ｈは、工程Ｓ_３において考慮され、使用されないものとする。強度閾値Ｉ_ｔｈは例えば、推定されてもよいし、または表示１６に含まれる最大強度値Ｉ（図３のＩ_Ｆ）、移動平均、２つ以上の平均、またはさらには全ての強度値Ｉの割合であってもよい。

さらなる任意の実施形態では、粒子Ｐによって散乱されていない、つまり散乱されていない光ビーム１０に関する、コヒーレント光ビーム６の基準画像１９が生成される。それに基づいて、当該技術分野で知られているような計算の前記工程Ｓ_１の前に、プロセッサ１２により干渉画像１１を正規化し、正規化された計算電場Ｅ_１が工程Ｓ_１で計算され、後に続く工程Ｓ_２で電場Ｅ_１として使用されるようにすることができる。

なお、本方法は例えば、粒子Ｐの異なる照射角度および／または分散からの焦点距離を調べるために、異なる周波数および／または複数の光源で複数の光ビームを用いられることは言うまでもない。また、例えば、粒子Ｐを試料４中の他の粒子から特徴付けまたは識別するために、焦点距離ｄに加えて、粒子および焦点位置Ｈ_Ｐ、Ｈ_Ｆでの強度Ｉ_Ｐ、Ｉ_Ｆを用いてもよい。

本発明は、上述した特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲内の全ての変形、修正、およびそれらの組み合わせを包含する。

図１は、本発明の方法に使用されるインライン干渉計の側面の模式図である。 図２は、図１の干渉計によって記録された、本発明による干渉画像からの焦点距離の特定を示すフローチャートである。 図３は、図１および図２に示された方法に従って特定された光ビームの強度値を、光ビームの方向から反対の方向までグラフとして示す。

Claims (7)

1. 媒質（Ｍ）における透明粒子（Ｐ）の焦点距離（ｄ）を特定するための方法であって、
   前記粒子（Ｐ）を含む媒質（Ｍ）の試料（４）を提供する工程と、
   光源（２）を用いて、コヒーレント光ビーム（６）を放射し、試料（４）に該光ビーム（６）を照射し、光ビーム（６）の第一の部分が粒子（Ｐ）によって散乱されて、粒子（Ｐ）の後方または前方のビーム方向（９）に焦点（８）を有する散乱光ビーム（７）を作る工程と、
   散乱光ビーム（７）と、前記粒子（Ｐ）によって散乱されなかった光ビーム（６）の第２の部分との干渉画像（１１）を、カメラ（３）を用いて、記録する工程と、
   粒子（Ｐ）と焦点（８）とを含む空間（Ｓ）内に三次元的に分布する位置（Ｈ）のセットのそれぞれについて、干渉画像（１１）からの光ビーム（６）の最初の部分の電場（Ｅ_１）をプロセッサ（１２）により計算する工程（Ｓ_１）と、
   前記位置（Ｈ）のそれぞれが、その位置（Ｈ）における計算された電場（Ｅ_１）から計算されたコヒーレント光ビーム（６）の強度値（Ｉ）を含み、前記位置（Ｈ）をカバーする光ビーム（６）の表示（１６）を、プロセッサ（１２）を用いて生成する工程（Ｓ_２）と、
   第１の位置（Ｈ_Ｐ）が試料（４）にあり、第２の位置（Ｈ_Ｆ）が前記第１の位置（Ｈ_Ｐ）の背後または前のビーム方向（９）にある、２つの位置（Ｈ_Ｐ、Ｈ_Ｆ）と、近くの位置（Ｈ_ＮＰ、Ｈ_ＮＦ）についてのそれぞれの強度値（Ｉ_ＮＰ、Ｉ_ＮＦ）よりも大きい強度値（Ｉ_Ｐ、Ｉ_Ｆ）を、プロセッサ（１２）を用いて検出する工程（Ｓ_３）と、
   前記検出された２つの位置（Ｈ_Ｐ、Ｈ_Ｆ）から焦点距離（ｄ）をプロセッサ（１２）により特定する工程（Ｓ_４）と、を含み、
   前記生成する工程（Ｓ_２）では、位置（Ｈ）ごとに、強度値（Ｉ）が下記式：
   

   

   
   （式中、
   ｒおよびｚは、位置（Ｈ）の座標であり、ｚは、ビーム方向（９）とは反対方向（１５）の座標であり、ｒは、前記反対方向（１５）に垂直な平面（ｘ、ｙ）内の一対の座標であり、
   Ｉ（ｒ，ｚ）は、位置（Ｈ）の強度値であり、
   Ｉ_１（ｒ，ｚ）は、位置（Ｈ）に対する光ビーム（６）の第１の部分の強度であり、
   Θは、位相シフトパラメータであり、
   ｋ、ｌは、合計の指標であり、
   Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌは、拡張パラメータであり、
   Ｅ_１（ｒ，ｚ）は、位置（Ｈ）について計算された電界であり、
   ａｒｃｔａｎ２は、４象限逆正接関数を表す。）
   に従って計算される、方法。
2. 前記位相シフトおよび拡大パラメータ（Θ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌ）の少なくとも１つは、前記生成する工程（Ｓ_２）を繰り返すことによって特定され、前記少なくとも１つのパラメータ（Θ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌ）は、前記表示（１６）に含まれるより高い強度値（Ｉ）とより低い強度値（Ｉ）との間の差異を増大させるように変更される、請求項１に記載の方法。
3. 前記位相偏移および拡大パラメータ（Θ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌ）の少なくとも１つは、生成（Ｓ_２）および検出（Ｓ_３）の工程を繰り返すことによって特定され、前記少なくとも１つのパラメータ（Θ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌ）は、前記第１の位置（Ｈ_Ｐ）の強度値（Ｉ_Ｐ）と、その近くの位置（Ｈ_ＮＰ）のそれぞれの強度値（Ｉ_ＮＰ）との間の差（ΔＩ_Ｐ－ＮＰ）を増加させるように、および／または前記第２の位置（Ｈ_Ｆ）の強度値（Ｉ_Ｆ）と、その近くの位置（Ｈ_ＮＦ）のそれぞれの強度値（Ｉ_ＮＦ）との間の差（ΔＩ_Ｆ－ＮＦ）を増加させるように変更される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記位相シフトおよび拡大パラメータ（Θ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌ）の少なくとも１つは、前記生成工程（Ｓ_２）および検出工程（Ｓ_３）を繰り返すことによって特定され、前記少なくとも１つのパラメータ（Θ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌ）は、前記第１の位置（Ｈ_Ｐ）についての強度値（Ｉ_Ｐ）と前記第２の位置（Ｈ_Ｆ）についての強度値（Ｉ_Ｆ）との間の比率を増大させるように変更される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記位相シフトおよび拡大パラメータ（Θ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌ）のうち、少なくとも１つは、
   生成する工程においてシミュレートされた表示を得るための、提供する工程、放射する工程、記録する工程、計算する工程および生成する工程のシミュレーション、および前記シミュレートされた表示によりカバーされる位置ごとにおける、シミュレートされた光ビームの強度、ならびに
   前記生成する工程のシミュレーションを繰り返すことによって特定され、
   前記少なくとも１つのパラメータ（Θ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌ）は、前記シミュレートされた表示によって含まれる強度値と、前記それぞれの位置における前記シミュレートされた光ビームの強度との間の差異を低減するように変更される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記位相シフトおよび拡大パラメータ（Θ、Ｃ_ｋ、Ｄ_ｌ）のうちの少なくとも１つが、前記表示（１６）における前記位置（Ｈ）に依存する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記検出する工程（Ｓ３）において、所定の閾値（Ｉｔｈ）よりも大きい前記強度値（Ｉ）の位置（Ｈ）のみが考慮される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

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