JP2023529054A

JP2023529054A - Ａａｖキャプシドバリアントおよびその使用

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Publication number: JP2023529054A
Application number: JP2022559694A
Authority: JP
Inventors: グアンピンガオ，; グアンチャオシュー，; フィリップタイ，; ユーチュアンウェイ，; リールオ，
Original assignee: ユニバーシティオブマサチューセッツ; スーチュワンユニバーシティ
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2023-07-07
Also published as: KR20230113689A; US20230138766A1; IL296765A; TW202204377A; AU2021248577A1; AR122404A1; CO2022015313A2; CA3177182A1; EP4126911A1; CN115698039A; WO2021202494A1; MX2022012279A; BR112022019304A2

Abstract

本開示の態様は、導入遺伝子（例えば、１つまたは複数の遺伝子産物をコードする導入遺伝子）を標的細胞に送達するための組成物および方法に関する。本開示は、部分的に、ある特定の細胞型（例えば、ニューロン、筋肉細胞、骨細胞、心臓細胞など）に対する向性によって特徴付けられるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質バリアントに基づく。一部の実施形態では、キャプシドタンパク質バリアント（例えば、ＡＡＶｖ６６、配列番号１）を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ある特定の野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶよりも効率的にパッケージングされる。ＡＡＶキャプシドタンパク質バリアントを含むｒＡＡＶを送達する方法も、本開示によって記載されている。

Description

背景
組換えＡＡＶアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、顕著な毒性および宿主免疫原性を伴わずに、標的組織において安定かつ持続的な導入遺伝子の発現を駆動することが可能である。よって、ｒＡＡＶは、長期的な治療用遺伝子発現のための有望な送達ビヒクルである。しかしながら、現在利用可能なｒＡＡＶベクターによる低い形質導入効率および限定された組織向性により、実現可能かつ有効な治療法としてのそれらの適用が制限される可能性がある。加えて、非ヒト組織に由来する主要な治療用ＡＡＶ血清型の信頼できる臨床移行は、懸念となっている。したがって、遺伝子送達のための新規ＡＡＶベクターに対するニーズが依然として存在する。

概要
本開示の態様は、導入遺伝子（例えば、１つまたは複数の遺伝子産物をコードする導入遺伝子）を標的細胞に送達するための組成物および方法に関する。本開示は、部分的に、ある特定の細胞型（例えば、ニューロン、筋肉細胞、骨細胞、心臓細胞など）に対する向性によって特徴付けられるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質バリアントに基づく。一部の実施形態では、キャプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ある特定の野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶよりも効率的にパッケージングされる。ＡＡＶキャプシドタンパク質バリアントを含むｒＡＡＶを送達する方法も、本開示によって記載されている。

一部の態様では、本開示は、導入遺伝子を対象の標的細胞に送達するための方法であって、目的の１つまたは複数の遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む単離された核酸；および配列番号１に示される配列を有するアデノ随伴酸（adeno-associated acid）（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に頭蓋内投与するステップを含む、方法を提供する。

一部の実施形態では、頭蓋内投与は、海馬内注射を含む。

一部の実施形態では、標的細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞である。一部の実施形態では、ＣＮＳ細胞は、ニューロン、乏突起膠細胞、星状細胞、またはミクログリア細胞である。

一部の実施形態では、対象は、哺乳動物である。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、抗ＡＡＶ２抗体の産生によって特徴付けられる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶの投与は、対象によるｒＡＡＶに対する中和免疫応答をもたらさない。

一部の実施形態では、単離された核酸は、導入遺伝子に隣接するＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子産物をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子産物は、タンパク質または阻害性核酸を含む。

一部の態様では、本開示は、導入遺伝子を対象の標的細胞に送達するための方法であって、目的の１つまたは複数の遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む単離された核酸；および配列番号１に示される配列を有するアデノ随伴酸（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に静脈内投与するステップを含み、投与の結果、ｒＡＡＶが対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する、方法を提供する。

一部の実施形態では、単離された核酸は、導入遺伝子に隣接したＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子産物をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子産物は、タンパク質または阻害性核酸を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載のキャプシドタンパク質バリアント（例えば、ＡＡＶｖ６６、配列番号１）を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ある特定の野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質、配列番号２）を有するｒＡＡＶよりも効率的にパッケージングされる（例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、またはそれより高い倍率）。

図１Ａ～１Ｄは、ヒト外科手術試料由来の新規プロウイルスＡＡＶキャプシド配列の同定を示す。図１Ａは、ＡＡＶキャプシドプロウイルス配列が、ＡＡＶＣａｐＯＲＦに隣接するプライマーを使用して、ヒト外科手術試料から最初にＰＣＲによって増幅されたことを示す。アンプリコンを一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシングに供し、得られたリードを、ＰＣＲまたはＳＭＲＴのシーケンシングエラーに関連する挿入／欠失を除去するための現代のＡＡＶ血清型配列に対するＢＷＡ－ＭＥＭアラインメント、ＩｎＤｅｌＦｉｘｅｒ、および高い配列類似性のリードをクラスター化するためのｄｅｎｏｖｏアセンブリーによって分析した。図１Ｂは、バリアントＡＡＶｖ６６のｃａｐ配列が、分析において最も豊富に存在する（４５％）ことが見いだされたことを示す。図１Ｃは、ＡＡＶ２とは異なるＡＡＶｖ６６キャプシド配列中の１３個の固有の残基の概要を示す。（ｄ）ＡＡＶ２バリアント（ＡＡＶｖ６６を含む）および現代の血清型の系統樹。同上。図２Ａ～２Ｄは、海馬内注射後のｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶｖ６６の形質導入の広がりを示す。図２Ａは、片側海馬内投与によるｒＡＡＶ２－ＣＢ６－ＥｇｆｐまたはｒＡＡＶｖ６６－ＣＢ６－Ｅｇｆｐ注射後のネイティブのＥＧＦＰ発現を示す。スケールバー＝７００μｍ。図２Ｂは、ＤＡＰＩ陽性表面に対して正規化したＥＧＦＰ陽性表面の定量化を示す。データは、平均±ＳＤとして表す；ｎ＝３。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。図２Ｃは、対側と同側の半球の両方における目的の解剖下領域(sub-anatomical region)を描写する冠状脳の概略図を示す。アンモン角（ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＣＡ４）、歯状回（ＤＧ）、脳梁（ＣＣ）、および皮質（ＣＴＸ）。図２Ｃは、ｒＡＡＶｖ６６が形質導入された解剖下領域の高倍率画像を示す。スケールバー＝５０μｍ。同上。図３Ａ～３Ｐは、ｒＡＡＶｖ６６による脳の主要な細胞型の形質導入を示す。図３Ａ、３Ｅ、３Ｉ、および３Ｍは、ｒＡＡＶｖ６６－ＣＢ６－Ｅｇｆｐにより形質導入されたマウスの脳の冠状切片を示す。ＮＥＵＮ（図３Ａ、ニューロン）、ＧＦＡＰ（図３Ｅ、星状細胞）、ＩＢＡ１（図３Ｉ、ミクログリア）、またはＯＬＩＧ２（図３Ｍ、乏突起膠細胞）に対する抗体によるＩＦ染色切片は、脳にわたる細胞型の分布を示す。ＩＦ染色と共局在化するネイティブのＥＧＦＰ発現は、陽性に形質導入された細胞型を示す。スケールバー＝７００μｍ。図３Ｂ、３Ｆ、３Ｊ、および３Ｎは、冠状切片図内の破線の長方形ボックスからの単一の代表的フレームの解剖下領域の３Ｄレンダリング（上のパネル）と、破線の正方形ボックスによって画定された視野からの単一細胞の表示（下の３つのパネル）を示す。左のパネルは、ＥＧＦＰと細胞マーカーＩＦ染色の全面積；中央のパネルは、細胞マーカーＩＦ染色全体と共局在化したＥＧＦＰ；右のパネルは、共局在化したＥＧＦＰと細胞マーカーＩＦ染色。スケールバー＝５０μｍ（上のパネル）、５μｍ（下の３つのパネル）。図３Ｃ、３Ｇ、３Ｋ、および３Ｏは、ＤＡＰＩシグナルに対して正規化した、示した海馬領域（ｘ軸）にわたる細胞型特異的ＩＦ染色の定量化を示す。図３Ｄ、３Ｈ、３Ｌ、および３Ｐは、細胞型ＩＦおよびＤＡＰＩシグナルの全体に対して正規化した、示した領域にわたる細胞型特異的形質導入の定量化を示す。データは、平均±ＳＤとして表す；ｎ＝３。アンモン角（ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＣＡ４）、歯状回（ＤＧ）、脳梁（ＣＣ）、および皮質（ＣＴＸ）。同上。同上。同上。同上。同上。図４Ａ～４Ｅは、ＡＡＶｖ６６の生物物理学的分析を示す。ｐＨ７、６、５、および４におけるキャプシドタンパク質のアンフォールディング（脱殻）（図４Ａ）およびＤＮＡアクセシビリティ（ベクターゲノムの排出）（図４Ｂ）を問い合わせるための示差走査蛍光定量（differential scanning fluorimetry）（ＤＳＦ）分析のヒートマップ表示。ＡＡＶｖ６６の各規定のアミノ酸残基を部位特異的変異誘発によってＡＡＶ２のものに変換し、ｐＨ７におけるパッケージング収率（図４Ｃ）、キャプシド安定性（図４Ｄ）、およびゲノム放出（図４Ｄ）の変化について調査した。値は、平均±ＳＤを表す。ｐ値は、一元ＡＮＯＶＡによって決定した。＊ｐ＜０．０５、＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｎ^３３。同上。同上。図５Ａ～５Ｅは、ＡＡＶｖ６６のｃｒｙｏ－ＥＭプライマリメトリクス(primary metrics)、マップ再構築、およびモデル生成を示す。図５Ａは、ＡＡＶｖ６６の密度マップを示す。グレースケールスキームは、中心からのトポロジー距離（Å）を画定する。図５Ｂは、精密化したＡＡＶｖ６６キャプシドモノマーのリボン構造を示す。ＡＡＶ２を区別するアミノ酸を強調している。２回対称（楕円形）、３回対称（三角形）、および５回対称（五角形）に注釈をつけた。ＡＡＶｖ６６の電子密度の一部（濃灰色のメッシュ）および残基を、（図５Ｃ）Ｌ５８３、Ｒ４８７、Ｙ５３３、およびＫ５３２、（図５Ｄ）Ｓ４４６、Ｄ４９９、およびＳ５０１、ならびに（図５Ｅ）Ｎ４０７～Ｔ４１４に近い領域について示す。同上。図６は、ＡＡＶｖ６６とＡＡＶ２の間の構造的差異を示す。中央は、ＡＡＶｖ６６６０ｍｅｒの構造（灰色）である。ＡＡＶｖ６６に固有のアミノ酸残基を、緑色で強調し、一方、ＡＡＶ２と共通する単一モノマーのアミノ酸残基を色付けしている。ＡＡＶｖ６６とＡＡＶ２の間に実質的な差異を有する選択領域の残基側鎖を示す原子モデル。ＡＡＶ２（１ｌｐ３）とＡＡＶｖ６６のモノマーを使用してアラインメントを作製し、隣接する残基に由来するモデル化した側鎖を灰色で表示した。示したアミノ酸の注釈は、ＡＡＶｖ６６、位置番号、その後にＡＡＶ２に属するものとして示す。図７Ａ～７Ｃは、ＡＡＶ２とＡＡＶｖ６６の間の差次的なキャプシド表面静電学を示す。図７Ａは、ＡＡＶ２およびＡＡＶｖ６６の６０ｍｅｒ、トリマー（３回対称）、およびペンタマー（５回対称の外側および内側）の構造について、表面の正電荷および負電荷が表示されていることを示す。ＡＡＶ２６０ｍｅｒおよびトリマー構造における黒色矢印は、単一の３回転突出部（3-fold protrusion）におけるＲ５８５およびＲ５８８のおおよその位置を示す。図７Ｂは、ＡＡＶ２およびＡＡＶｖ６６の５８５～５８８におけるアミノ酸残基の拡大図を示す。図７Ｃは、ゼータサイザーによって測定した精製ベクターのゼータ電位の棒グラフを示す。値は、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。同上。図８は、ＡＡＶ２に対して変異が与えられたＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を示す。ＡＡＶ２とＡＡＶｖ６６の間のアミノ酸差異を強調している。可変領域（ＶＲ）の残基を、短いバーで示している。ａＨドメインを、点線バーで区切り、ｂ－シートを形成する残基を黒色矢印でマークしている。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の開始位置を大なり記号（＞）でマークしている。ＶＰ１内のＰＬＡドメインをバーで示している。図９は、ＡＡＶｖ６６がＡＡＶ２よりも高いベクター収量を生じることを示す。粗溶解物のＰＣＲアッセイを、培地ならびにｐＡＡＶおよびＡＡＶ２またはＡＡＶｖ６６のパッケージングプラスミドの三重トランスフェクションを受けたＨＥＫ２３９細胞の細胞溶解物に関して実施した。値は、平均ゲノムコピー±ＳＤ、ｎ＝３を表す。図１０は、ＡＡＶｖ６６が、強いヘパリン結合を欠くことを示す。漸増量のヘパリン（ｘ軸）存在下でのＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ２－ＣＢ６－ＦＬｕｃおよびＡＡＶｖ６６－ＣＢ６－ＦＬｕｃの形質導入効率を示すヘパリン競合アッセイ。ルミネセンス値は、ヘパリンを欠くウェルで得られた値に調整し、１と設定した（ｙ軸）。値は、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。＊＊、二元ＡＮＯＶＡによるｐ＜０．０１。図１１は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、およびＡＡＶｖ６６のｉｎｖｉｔｒｏ感染効率を示す。ベクターを、ＣＢ６－ＦＬｕｃでパッケージングした。ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ、相対発光量）の検出によりベクターの感染力を評価するために、細胞を感染の４８時間後に溶解させた。データを対数スケールで表示する。値は、平均±ＳＤを表し、一元ＡＮＯＶＡによる＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ＝３。図１２Ａ～１２Ｄは、ＡＡＶｖ６６ベクターの静脈内投与が肝臓の形質導入を示すことを示す。ＡＡＶｖ６６－ＣＢ６－Ｆｌｕｃの全身注射により、肝臓の形質導入がもたらされた。ｒＡＡＶ２－ＣＢ６－ＦｌｕｃまたはＡＡＶｖ６６－ＣＢ６－Ｆｌｕｃ（１．０Ｅ１１ＧＣ／マウス）を尾静脈投与によりマウスへと注射した。１４日後に、マウスに、ルシフェリン基質を腹腔内注射し、画像化した（図１２Ａ）。ルシフェラーゼ活性の全身の生体バイオルミネセンスの定量化により、ＡＡＶｖ６６－ＣＢ６－ＦｌｕｃとＡＡＶ２－ＣＢ６－Ｆｌｕｃの間の肝臓の形質導入における有意差は認められなかったが、肝臓組織の単離およびルシフェラーゼ活性の定量化およびｑＰＣＲによるベクターゲノムコピーの検出により、ＡＡＶｖ６６がＡＡＶ２よりも有意に弱い肝臓の形質導入因子であることが示された。獲得した画像における腹部の総フラックスを記録した（図１２Ｂ）。組織を回収し、ルシフェラーゼ活性（図１２Ｃ）およびｑＰＣＲによるベクターゲノム存在量（図１２Ｄ）についてアッセイした。値は、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。＊、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５。同上。同上。図１３Ａ～１３Ｄは、ＡＡＶｖ６６ベクターの筋肉内投与が筋肉の形質導入を示すことを示す。ＡＡＶｖ６６の前脛骨筋への筋肉内注射は、ＡＡＶ２の形質導入と比較した場合、形質導入能力にほとんど差を生じなかった。ＡＡＶ２－ＣＢ６－ＦＬｕｃまたはＡＡＶｖ６６－ＣＢ６－ＦＬｕｃ（４．０Ｅ１０ＧＣ／マウス）を一方の後肢（前脛骨筋）への筋肉内投与によりマウスに注射した。１４日後に、マウスにルシフェリン基質を腹腔内投与し、画像化した（図１３Ａ）。獲得した画像における注射された後肢の総フラックスを記録した（図１３Ｂ）。組織を回収し、ルシフェラーゼ活性（図１３Ｃ）およびｑＰＣＲによるベクターゲノム存在量（図１３Ｄ）についてアッセイした。値は、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。＊、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５。同上。図１４Ａ～１４Ｄは、ＡＡＶｖ６６の免疫学的特徴付けを示す。マウスにＡＡＶ２－ＣＢ６－Ｅｇｆｐベクターを筋肉内投与した（１Ｅ１１ＧＣ／マウス）。投与の４週間後に、ＡＡＶ２またはＡＡＶｖ６６感染に対する中和抗体（ＮＡｂ）力価を試験するために血清を採取した。ＡＡＶ２（図１４Ａ）およびＡＡＶｖ６６（図１４Ｂ）についてのＮＡｂ５０値は、ＬａｃＺレポーター遺伝子でパッケージングされたベクターによって達成可能な全形質導入の５０％を遮断することができる力価希釈として定義される。左は、試験した個々の動物のＮＡｂの総括表。右は、形質導入効率を様々な血清希釈に対してプロットした。値は、平均±ＳＤを表す。破線は、平均ＮＡｂ５０血清力価を示す。４週間の期間後に、ＡＡＶ２－ｈＡ１ＡＴまたはＡＡＶｖ６６－ｈＡ１ＡＴ（１Ｅ１１ＧＣ／マウス）をマウスの対側後肢に筋肉内投与した。血清Ａ１ＡＴレベルを、５、６、７、および８週目にＥＬＩＳＡによって測定した（図１４Ｃ）。値は、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。ｎ．ｓ．は、有意ではない；横断的データ点に関する二元ＡＮＯＶＡによる＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；および＊＊＊、ｐ＜０．００１。図１４Ｄは、ウサギ抗ＡＡＶ血清の交差反応性を示す。ＡＡＶ血清型に対して上昇したウサギ抗血清を、相対的な交差反応性を評価するために、ＡＡＶｖ６６に対するＮＡｂについて、同種のＡＡＶ血清型に対して試験した。ｌｏｇ２値は、形質導入の５０％阻害を達成するための最高抗体希釈を表す。同上。図１５Ａ～１５Ｂは、ＡＡＶｖ６６のｃｒｙｏ－ＥＭプライマリメトリクス、マップ再構築、およびモデル生成を示す。図１５Ａは、ＡＡＶｖ６６のｃｒｙｏ－電子顕微鏡写真を示す。スケールバーは、１００Åを表す。図１５Ｂは、ＡＡＶｖ６６に関する偶数粒子と奇数粒子のフーリエシェル相関（ＦＳＣ＿ｐａｒｔ）を示す。図１６は、ＡＡＶｖ６６をＡＡＶ２またはＡＡＶ３ｂと比較するＲＭＳＤ（Å）統計値を示す。ＰｙＭＯＬ内のｒｍｓ＿ｃｕｒ関数によって計算した、示したすべてのアルファ－炭素対（ＡＡＶ２番号付け）にわたって測定した、ＡＡＶｖ６６とＡＡＶ２（１ＬＰ３）またはＡＡＶ３ｂ（３ＫＩＣ）の間の総ＲＭＳＤおよび領域ＲＭＳＤ（Å）の概要。ＡＡＶ２、３ｂ、およびＡＡＶｖ６６の完全なキャプシド構造は、ＡＡＶｖ６６のｃｒｙｏ－ＥＭ密度マップ内で最適化フィットによりアラインメントさせた。ＰｙＭＯＬ内のカスタムスクリプトを使用して、ＡＡＶ２（上）またはＡＡＶ３ｂ（下）のいずれかに関する個々のアルファ－炭素対間の距離値（Å）を定量的に変換し、ＡＡＶｖ６６の対応する残基の色と半径厚さとして表現した。

詳細な説明
本開示の態様は、導入遺伝子（例えば、１つまたは複数の遺伝子産物をコードする導入遺伝子）を標的細胞に送達するための組成物および方法に関する。本開示は、部分的に、ある特定の細胞型（例えば、ニューロン、筋肉細胞、骨細胞、心臓細胞など）に対する向性によって特徴付けられるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質バリアントに基づく。一部の実施形態では、キャプシドタンパク質バリアントを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ある特定の野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶよりも効率的にパッケージングされる。ＡＡＶキャプシドタンパク質バリアントを含むｒＡＡＶを送達する方法も、本開示によって記載されている。

ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質
一部の態様では、本開示は、導入遺伝子を対象の標的細胞（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）の標的細胞）に送達するための方法であって、目的の１つまたは複数の遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む単離された核酸；およびＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質またはＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質に対して実質的な相同性を有するキャプシドタンパク質を含むアデノ随伴酸（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に（例えば、頭蓋内または静脈内）投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質は、以下からなる群より選択されるＡＡＶ２に対する変異を含む：Ｋ３９Ｑ、Ｖ１５１Ａ、Ｒ４４７Ｋ、Ｔ４５０Ａ、Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９Ｄ、Ｆ５３３Ｙ、Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８Ｇ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ、およびＡ５９３Ｔ。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２に対して以下の各変異を含む：Ｋ３９Ｑ、Ｖ１５１Ａ、Ｒ４４７Ｋ、Ｔ４５０Ａ、Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９Ｄ、Ｆ５３３Ｙ、Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８Ｇ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ、およびＡ５９３Ｔ。一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質に対して実質的な相同性を有するキャプシドタンパク質は、以下からなる群より選択されるＡＡＶ２に対する１つまたは複数の変異を含む：Ｋ３９Ｑ、Ｖ１５１Ａ、Ｒ４４７Ｋ、Ｔ４５０Ａ、Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９Ｄ、Ｆ５３３Ｙ、Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８Ｇ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ、およびＡ５９３Ｔ。一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質またはＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質に対して実質的な相同性を有するキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２に対して、そのＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３領域における１つまたは複数の変異を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質またはＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質に対して実質的な相同性を有するキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２に対して、可変領域（ＶＲ）－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩ、ＶＴ－ＶＩＩ、および／またはＶＲ－ＶＩＩＩにおける１つまたは複数の変異を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質またはＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質に対して実質的な相同性を有するキャプシドタンパク質は、図１Ｃに示されているように、ＡＡＶ２に対して、１つまたは複数の変異を含む。

「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド部分間の同一性パーセントを指す。「実質的な相同性」という用語は、核酸、またはその断片に言及する場合、別の核酸（またはその相補鎖）と適当なヌクレオチドの挿入または欠失と共に最適にアラインメントされる場合、アラインメントされた配列の約９０～１００％においてヌクレオチド配列の同一性が存在することを示す。ポリペプチド、またはその断片に言及する場合、「実質的な相同性」という用語は、別のポリペプチドと適当なギャップ、挿入または欠失と共に最適にアラインメントされる場合、アラインメントされた配列の約９０～１００％においてヌクレオチド配列の同一性が存在することを示す。「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％を超える同一性を意味する。一部の場合には、高度に保存されたとは、１００％の同一性を指してもよい。同一性は、例えば、当業者に公知のアルゴリズムおよびコンピュータープログラムの使用によって、当業者によって容易に決定される。

本明細書に記載されているように、核酸またはポリペプチドの配列間のアラインメントは、インターネット上のウェブサーバーを介してアクセス可能な「ＣｌｕｓｔａｌＷ」などの公的にまたは商業的に入手可能な種々の多重配列アラインメントプログラムのいずれかを使用して実施される。あるいは、ベクターＮＴＩユーティリティーも使用することができる。上記のプログラムに含有されるものを含む、ヌクレオチド配列の同一性を測定するために使用することができる、当技術分野で公知のいくつかのアルゴリズムも存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＢＬＡＳＴＮを使用して比較されてもよく、これは、クエリー配列と検索配列の間の最良の重複の領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する。同様のプログラムは、アミノ酸配列の比較のために利用可能であり、例えば、「ＣｌｕｓｔａｌＸ」プログラム、ＢＬＡＳＴＰがある。典型的には、これらのプログラムのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者であれば必要に応じてこれらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照されたアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性またはアラインメントを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用することができる。アラインメントは、２つのタンパク質間またはペプチド間の対応するアミノ酸を特定するために使用されてもよい。「対応するアミノ酸」は、別のタンパク質またはペプチド配列のアミノ酸とアラインメントされたタンパク質またはペプチド配列のアミノ酸である。対応するアミノ酸は、同一であっても非同一であってもよい。非同一アミノ酸である対応するアミノ酸は、バリアントアミノ酸と呼ばれることがある。

一部の態様では、本開示は、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質をコードする単離された核酸、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）など）、またはＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質に対して実質的な相同性を有するキャプシドタンパク質に関する。一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質に対して実質的な相同性を有するキャプシドタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一である。一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質に対して実質的な相同性を有するキャプシドタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質に対して実質的な相同性を有するキャプシドタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、５０個を超えるアミノ酸の置換、挿入、または欠失を含む。

本開示は、一部の態様では、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶが、ある特定の他のＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質、ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質など）を有するｒＡＡＶに対して、哺乳動物細胞系（例えば、ＨＥＫ－２９３細胞）においてより多量に産生され得るという驚くべき発見に関する。一部の実施形態では、形質導入された哺乳動物（例えば、ＨＥＫ）産生細胞は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質を形質導入された哺乳動物（例えば、ＨＥＫ）産生細胞よりも約１．５倍～約５倍（例えば、１．５、２、３、４、５倍）多いＡＡＶｖ６６キャプシドを有するｒＡＡＶを生じる。一部の実施形態では、形質導入された哺乳動物（例えば、ＨＥＫ）産生細胞は、ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質を形質導入された哺乳動物（例えば、ＨＥＫ）産生細胞よりも約５％～約５０％の間（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％など）多いＡＡＶｖ６６キャプシドを有するｒＡＡＶを生じる。

本開示の態様は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶに対して、予期せず改善された、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ）の中枢神経系（ＣＮＳ）細胞の形質導入効率に関する。一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６を含有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２を含有するｒＡＡＶよりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、５００％、１０００％、またはそれを超えて効率的に、ＣＮＳ細胞に形質導入する。一部の実施形態では、ＣＮＳ細胞は、ニューロン、乏突起膠細胞、星状細胞、またはミクログリア細胞を含む。

本開示の態様は、他のＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０など）と血清学的に別個である、ある特定のＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質）に関する。いずれの特定の理論にも拘束されることを望まないが、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶは、ある特定の他のＡＡＶキャプシドに対する抗体に対して血清陽性である対象における中和抗体反応の対象とはならない。したがって、一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶは、以前にＡＡＶ治療を投与されたか、またはある特定のＡＡＶキャプシド中和抗体に対して血清陽性である対象への導入遺伝子の送達に関する第二選択治療として有用であり得る。

一部の態様では、本開示は、ある特定の野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質）に対して増加した熱安定性を呈するｒＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質）に関する。一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質は、約ｐＨ４～約ｐＨ７の範囲に及ぶｐＨで、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質よりも熱安定性が高い。一部の実施形態では、熱安定性は、キャプシドタンパク質の融解温度を計算することによって決定される。一部の実施形態では、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質は、所与のｐＨ（例えば、ｐＨ４～ｐＨ７の間）で、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質の融解温度を約５℃～約１０℃の間で超える融解温度によって特徴付けられる。

単離された核酸
一部の態様では、本開示は、ある特定のＡＡＶキャプシドタンパク質バリアント（例えば、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質）をコードする単離された核酸に関する。「核酸」配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を指す。一部の実施形態では、核酸という用語は、以下に限定されないが、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシル－メチル）ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチル－アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュード－ウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチル－グアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチル－シトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシ－アミノ－メチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン、２－チオシトシンと２，６－ジアミノプリンなどのＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列をとらえる。

一部の実施形態では、本開示のタンパク質および核酸は、単離されている。本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、人工的に得られたか、または産生されたことを意味する。核酸に関して本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、概して：（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｉｎｖｉｔｒｏで増幅された；（ｉｉ）クローニングによって組換えによって産生された；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離などによって精製された；または（ｉｖ）例えば、化学合成によって合成されたことを意味する。単離された核酸は、当技術分野で周知のＤＮＡ組換え技法によって容易に操作可能である核酸である。よって、５’および３’制限部位が公知であるか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマー配列が開示されているベクター内に含有されるヌクレオチド配列は、単離されたと考えられるが、その天然の宿主中にネイティブの状態で存在する核酸配列は単離されていない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、そうである必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内で単離された核酸は、それが存在する細胞内の物質のごくわずかのパーセンテージしか構成しない場合がある点で、純粋ではない。しかし、このような核酸は、当業者にとって公知の標準的技法によって容易に操作可能であるため、この用語が本明細書で使用される場合、単離されている。タンパク質またはペプチドに関して本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、概して、人工的に得られたか、または産生された（例えば、化学合成によって、組換えＤＮＡ技術によってなど）タンパク質またはペプチドを指す。

キャプシドタンパク質の機能的に等価なバリアントまたはホモログを提供するために、保存的アミノ酸置換がなされ得ることが認識されるべきである。一部の態様では、本開示は、保存的アミノ酸置換をもたらす配列変更を包含する。本明細書で使用される場合、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的な電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。バリアントは、当業者にとって公知のポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製することができ、このような方法は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkのような方法を編集する参照文献において見られる。アミノ酸の保存的置換には、以下の群におけるアミノ酸間でなされる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。したがって、本明細書で開示されるタンパク質およびポリペプチドのアミノ酸配列に対して保存的なアミノ酸置換がなされ得る。

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）
一部の態様では、本開示は、単離されたＡＡＶを提供する。ＡＡＶに関して本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、人工的に得られたかまたは生成されたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組換え方法を使用して生成されてもよい。このようなＡＡＶは、本明細書において、「組換えＡＡＶ」と称される。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ｒＡＡＶの導入遺伝子が、１つまたは複数の所定の組織に特異的に送達されるように、組織特異的標的化能力を有することが好ましい。ＡＡＶキャプシドは、これらの組織特異的標的化能力を決定する際に重要なエレメントである。よって、標的とされる組織にとって適切なキャプシドを有するｒＡＡＶを選択することができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む。

所望のキャプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶを得るための方法は、当技術分野で周知である。（例えば、その内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００３／０１３８７７２を参照されたい。）典型的には、本方法は、ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする核酸配列（例えば、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドをコードする核酸）またはその断片；機能的ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および導入遺伝子から構成される組換えＡＡＶベクター；ならびに組換えＡＡＶベクターのＡＡＶキャプシドタンパク質中へのパッケージングを可能にする十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することに関与する。一部の実施形態では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子によってコードされる構造タンパク質である。一部の実施形態では、ＡＡＶは、３つのキャプシドタンパク質、ビリオンタンパク質１～３（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３という名称）を含み、これらはすべて単一のｃａｐ遺伝子から発現され得る。したがって、一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質は、共通のコア配列を共有する。一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の分子量は、それぞれ、約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａおよび約６２ｋＤａである。一部の実施形態では、翻訳の際に、キャプシドタンパク質は、ウイルスゲノムの周囲に球状の６０ｍｅｒのタンパク質シェルを形成する。一部の実施形態では、タンパク質シェルは、ＶＰ３キャプシドタンパク質から主に構成されている。一部の実施形態では、キャプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護し、ゲノムを送達し、宿主と相互作用することである。一部の態様では、キャプシドタンパク質は、ウイルスゲノムを組織特異的に宿主に送達する。一部の実施形態では、ＶＰ１および／またはＶＰ２キャプシドタンパク質は、パッケージングされたＡＡＶの組織向性に寄与し得る。一部の実施形態では、パッケージングされたＡＡＶの組織向性は、ＶＰ３キャプシドタンパク質によって決定される。一部の実施形態では、ＡＡＶの組織向性は、キャプシドタンパク質中で生じる変異によって増強されるか、または変化する。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶバリアントは、ＡＡＶ２のバリアントである。ＡＡＶ２は、ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）組織、腎臓組織、眼組織（例えば、光受容細胞および網膜色素上皮（ＲＰＥ））、および他の組織を効率的に形質導入することが知られている。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ２バリアントは、ＣＮＳ組織、腎臓組織、または眼組織に遺伝子治療を送達するのに有用であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質は、他の組織、例えば筋肉組織、肝臓組織、または心臓組織を標的とするのに有用である。一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶｖ６６キャプシドタンパク質）は、静脈内または全身に注射して送達される場合に、対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を横断することが可能である。

一部の態様では、本明細書に記載のＡＡＶバリアントは、ＣＮＳ関連障害の処置に有用であり得る。本明細書で使用される場合、「ＣＮＳ関連障害」は、中枢神経系の疾患または状態である。ＣＮＳ関連障害は、脊髄（例えば、脊髄症）、脳（例えば、脳症）または脳および脊髄を取り囲む組織に影響を与え得る。ＣＮＳ関連障害は、遺伝されるかまたは体細胞変異を介して獲得される遺伝的起源によるものであり得る。ＣＮＳ関連障害は、例えば、注意欠陥多動性障害、自閉症スペクトラム障害、気分障害、統合失調症、うつ病、レット症候群などの心理的状態または障害であり得る。ＣＮＳ関連障害は、自己免疫障害であり得る。ＣＮＳ関連障害はまた、ＣＮＳのがん、例えば、脳がんであり得る。がんであるＣＮＳ関連障害は、ＣＮＳの原発がん、例えば、星状細胞腫、神経膠芽腫などであってもよく、ＣＮＳ組織に転移したがん、例えば、脳に転移した肺がんであってもよい。ＣＮＳ関連障害のさらなる非限定的な例としては、パーキンソン病、リソソーム蓄積症、虚血、神経障害性疼痛、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、およびカナバン病（ＣＤ）が挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶバリアントは、肝臓組織を標的とし得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶバリアントは、肝疾患の処置に有用であり得る。本明細書で使用される場合、「肝疾患」は、肝臓の疾患または状態である。肝疾患は、遺伝されるかまたは体細胞変異を介して獲得される遺伝的起源によるものであり得る。肝疾患は、肝細胞癌（ＨＣＣ）、線維層板型癌（ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管癌、血管肉腫および肝芽腫を含むがこれらに限定されない、肝臓のがんであってもよい。肺疾患のさらなる非限定的な例としては、アラジール症候群、アルファ１抗トリプシン欠損症、自己免疫性肝炎、胆道閉鎖症、肝硬変、肝臓の嚢胞性疾患、脂肪性肝疾患、ガラクトース血症、胆石、ギルバート症候群、ヘモクロマトーシス、妊娠性肝疾患（liver disease in pregnancy）、新生児肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン症、レイ症候群、サルコイドーシス、中毒性肝炎、１型糖原病、チロシン血症、ウイルス性Ａ、Ｂ、Ｃ型肝炎、ウイルソン病、および住血吸虫病が挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶバリアントは、遺伝子治療を眼組織（例えば、眼の組織または細胞）に送達するのに有用であり得る。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶバリアントは、眼障害の処置に有用であり得る。本明細書で使用される場合、「眼障害」は、眼の疾患または状態である。眼疾患は、眼、強膜、角膜、前眼房、後眼房、虹彩、瞳孔、水晶体、硝子体液、網膜、または視神経に影響を及ぼす可能性がある。眼障害は、遺伝されるかまたは体細胞変異を介して獲得される遺伝的起源によるものであり得る。眼疾患および障害の非限定的な例としては、加齢黄斑変性症、網膜症、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、緑内障、網膜色素変性および眼のがんが挙げられるが、これらに限定されない。

ＡＡＶキャプシドにｒＡＡＶベクターをパッケージングするために宿主細胞内で培養される構成成分は、トランスで宿主細胞に提供されてもよい。あるいは、必要とされる構成成分（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）のいずれか１つまたは複数は、当業者にとって公知の方法を使用して、必要とされる構成成分の１つまたは複数を含有するように操作された安定した宿主細胞によって提供されてもよい。最も好適には、このような安定した宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で必要とされる構成成分を含有することになる。しかし、必要とされる構成成分は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。好適な誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの例は、導入遺伝子と共に使用するのに好適な調節エレメントの議論において、本明細書において提供される。また別の代替法では、選択された安定した宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下で、選択された構成成分、および１つまたは複数の誘導性プロモーターの制御下で、他の選択された構成成分を含有し得る。例えば、２９３細胞に由来するが（構成的プロモーターの制御下で、Ｅ１ヘルパー機能を含有する）、誘導性プロモーターの制御下で、ｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する安定した宿主細胞が生成され得る。また他の安定した宿主細胞も、当業者によって生成され得る。

本開示のｒＡＡＶを生成するために必要とされる組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、任意の好適な遺伝子エレメント（ベクター）を使用して、パッケージング宿主細胞に送達され得る。一部の実施形態では、３つすべてのキャプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）をコードする単一の核酸は、単一のベクターにおいて、パッケージング宿主細胞中に送達される。一部の実施形態では、キャプシドタンパク質をコードする核酸は、２つのベクターによってパッケージング宿主細胞中に送達され；第１のベクターは、２つのキャプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１およびＶＰ２）をコードする第１の核酸を含み、第２のベクターは、単一のキャプシドタンパク質（例えば、ＶＰ３）をコードする第２の核酸を含む。一部の実施形態では、それぞれ異なるキャプシドタンパク質をコードする核酸を含む３つのベクターは、パッケージング宿主細胞中に送達される。選択された遺伝子エレメントは、本明細書に記載のものを含む任意の好適な方法によって送達されてもよい。本開示のいずれかの実施形態を構築するために使用される方法は、核酸操作における当業者にとって公知であり、これらには、遺伝子操作、組換え操作、および合成技法が含まれる。例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法も周知であり、好適な方法の選択は本開示の制限ではない。例えば、K. Fisher et al, J. Virol., 70:520-532 (1993)および米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。

一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、三重トランスフェクション法（米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載されている）を使用して生成されてもよい。典型的には、組換えＡＡＶは、宿主細胞を、ＡＡＶ粒子中にパッケージングされる組換えＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、およびアクセサリー機能ベクターでトランスフェクトすることによって生成される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的なＡＡＶ複製およびキャプシド形成のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（例えば、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、いかなる検出可能な野生型のＡＡＶビリオン（例えば、機能的なｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）も生成せずに、効率的なＡＡＶベクター生成をサポートする。本開示と共に使用するのに好適なベクターの非限定的な例には、米国特許第６，００１，６５０号に記載されているｐＨＬＰ１９、米国特許第６，１５６，３０３号に記載されているｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクター（両方の全体は参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。アクセサリー機能ベクターは、複製に関してＡＡＶが依存する非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞の機能（例えば、「アクセサリー機能」）に関するヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能には、ＡＡＶ遺伝子の転写の活性化、段階特異的ＡＡＶｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶのＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシドアセンブリー関与するこれらの部分を含むが、これに限定されない、ＡＡＶ複製に必要とされるこれらの機能が含まれる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスなどの公知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。

一部の態様では、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取込みを指すために使用され、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞の内側に導入された場合（例えば、細胞膜を横切って）、「トランスフェクトされ」ている。いくつかのトランスフェクション技法は、一般に、当技術分野で公知である。例えば、Graham et al. (1973) Virology, 52:456、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、およびChu et al. (1981) Gene 13:197を参照されたい。このような技法を使用して、１つまたは複数の外因性核酸、例えばヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子を、好適な宿主細胞中に導入することができる。

「宿主細胞」は、目的の物質を保有するか、または保有することが可能である任意の細胞を指す。多くの場合、宿主細胞は哺乳動物細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、アクセサリー機能ベクター、または組換えＡＡＶの生成に関連する他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用されてもよい。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。よって、「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞を指し得る。単一の親細胞の子孫が、自然の、偶発的な、または故意の変異により、元の親と形態、またはゲノムもしくはＤＮＡ全体の相補性において、必ずしも完全に同一であるとは限らないことが理解される。

本明細書で使用される場合、「細胞系」という用語は、ｉｎｖｉｔｒｏでの連続的または長期的な増殖および分裂が可能な細胞の集団を指す。多くの場合、細胞系は、単一の前駆細胞から派生したクローン集団である。さらに、このようなクローン集団の保存または移動中に、核型に自発的または誘導的な変化が起こり得ることは、当技術分野で公知である。したがって、言及される細胞系に由来する細胞は祖先の細胞または培養物と正確に同一でない場合があり、言及される細胞系はこのようなバリアントを含む。

本明細書で使用される場合、「組換え細胞」という用語は、外因性のＤＮＡセグメント、例えば生物学的に活性なポリペプチドの転写または生物学的に活性な核酸、例えばＲＮＡの生成をもたらすＤＮＡセグメントが導入された細胞を指す。

細胞は、ヘルパー機能をＡＡＶに与えるベクター（例えば、ヘルパーベクター）でトランスフェクトされてもよい。ヘルパー機能を与えるベクターは、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、およびＥ４ＯＲＦ６を含むアデノウイルス機能を与え得る。これらの機能を与えるアデノウイルス遺伝子の配列は、任意の公知のアデノウイルス血清型、例えば、血清型２、３、４、７、１２および４０から得ることができ、当技術分野で公知の現在同定されたヒト型のいずれかをさらに含んでもよい。よって、一部の実施形態では、本方法は、ＡＡＶ複製、ＡＡＶ遺伝子の転写、および／またはＡＡＶパッケージングに必要な１つまたは複数の遺伝子を発現するベクターで細胞をトランスフェクトすることに関与する。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどのように、適当な制御エレメントと関連する場合に複製が可能であり、細胞間で遺伝子配列を移入することができる任意の遺伝子エレメントを含む。よって、この用語は、ウイルスベクターと同様に、クローニングおよび発現ビヒクルを含む。一部の実施形態では、有用なベクターは、転写される核酸セグメント（例えば、核酸配列）がプロモーターの転写制御下に配置されているこれらのベクターであることが企図される。「プロモーター」は、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識され、遺伝子の特定の転写を開始するために必要とされるＤＮＡ配列を指す。語句「作動可能に配置された」、「制御下」または「転写制御下」は、プロモーターが、核酸との関係で正しい位置および向きにあり、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御することを意味する。「発現ベクターまたは構築物」という用語は、核酸をコードする配列の一部または全部が転写可能である核酸を含有する任意の種類の遺伝子構築物を意味する。一部の実施形態では、発現は、例えば、転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物または阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）を生成するための、核酸の転写を含む。

一部の実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＢ６）プロモーターである。

一部の場合には、単離されたキャプシド遺伝子を使用して、当技術分野で周知の方法を使用して組換えＡＡＶを構築およびパッケージングし、遺伝子によってコードされたキャプシドタンパク質に関連する機能的特徴を決定することができる。例えば、単離されたキャプシド遺伝子を使用して、レポーター遺伝子（例えば、Ｂ－ガラクトシダーゼ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼなど）を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を構築およびパッケージングすることができる。次いで、ｒＡＡＶは動物（例えば、マウス）に送達されてもよく、その動物の様々な組織（例えば、心臓、肝臓、腎臓）におけるレポーター遺伝子の発現を調査することによって、新規の単離されたキャプシド遺伝子の組織標的特性が決定されてもよい。新規の単離されたキャプシド遺伝子を特徴付けるための方法は、本明細書に開示されており、また他のものは当技術分野で周知である。

所望のＡＡＶキャプシド内に組換えベクターをパッケージングして、本開示のｒＡＡＶを生成するための前記方法は限定的であることを意味するものではなく、他の好適な方法は当業者にとって明らかであろう。

ｒＡＡＶベクター
本開示の「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的には、最低限、導入遺伝子とその調節配列、ならびに５’および３’ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）から構成される。キャプシドタンパク質内にパッケージングされ、選択された標的細胞に送達されるのは、この組換えＡＡＶベクターである。一部の実施形態では、導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能的ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）または他の遺伝子産物をコードする、ベクターの配列とは異種の核酸配列である。核酸をコードする配列は、標的組織の細胞内で導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にするように、調節構成成分に作動可能に連結されている。

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用型５’および３’逆位末端反復配列を含む（例えば、B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、実質的に、ＩＴＲをコードする配列全体を分子中で使用するが、これらの配列のある程度の小規模な改変は許容される。これらのＩＴＲ配列を改変する能力は、当技術分野の技術の範囲内である。（例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；およびK. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)などのテキストを参照されたい）。本開示において用いられるこのような分子の例は、導入遺伝子を含有する「シス作用型」プラスミドであり、ここで、選択された導入遺伝子の配列および関連する調節エレメントは、５’および３’ＡＡＶＩＴＲ配列が隣接している。ＡＡＶＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物ＡＡＶ型を含む任意の公知のＡＡＶから得ることができる。

一部の実施形態では、本開示は、自己相補的ＡＡＶベクターを提供する。本明細書で使用される場合、「自己相補的ＡＡＶベクター」（ｓｃＡＡＶ）という用語は、ＡＡＶのＩＴＲのうちの１つから、末端分離部位（ＴＲ）の非存在によって生じた二本鎖ベクターゲノムを含有するベクターを指す。ＴＲの非存在により、ＴＲが存在しないベクター末端での複製の開始が妨げられる。一般に、ｓｃＡＡＶベクターは、両末端に野生型（ｗｔ）ＡＡＶＴＲ、中間に変異型ＴＲ（ｍＴＲ）を有する、一本鎖の逆位反復配列ゲノムを生成する。

一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶは、シュードタイプｒＡＡＶである。シュードタイピングは、外来ウイルスエンベロープタンパク質と組み合わせて、ウイルスまたはウイルスベクターを生成するプロセスである。結果は、シュードタイプのウイルス粒子である。この方法では、宿主の向性またはウイルス粒子の安定性の増加／減少を変更するために、外来ウイルスエンベロープタンパク質を使用することができる。一部の態様では、シュードタイプのｒＡＡＶは、２つまたはそれより多い異なるＡＡＶからの核酸を含み、１つのＡＡＶからの核酸はキャプシドタンパク質をコードし、少なくとも１つの他のＡＡＶの核酸は他のウイルスタンパク質および／またはウイルスゲノムをコードする。一部の実施形態では、シュードタイプのｒＡＡＶは、１つのＡＡＶ血清型の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および異なるＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含むＡＡＶを指す。例えば、Ｙのタンパク質でキャプシド形成される血清型ＸのＩＴＲを含有するシュードタイプのＡＡＶベクターは、ＡＡＶＸ／Ｙと示されることになる（例えば、ＡＡＶ２／１は、ＡＡＶ２のＩＴＲおよびＡＡＶ１のキャプシドを有する）。一部の実施形態では、シュードタイプのｒＡＡＶは、１つのＡＡＶ血清型からのキャプシドタンパク質の組織特異的標的化能力を別のＡＡＶ血清型からのウイルスＤＮＡと組み合わせるのに有用であり、それによって、標的組織への導入遺伝子の標的化送達を可能にし得る。

組換えＡＡＶベクターに関して上記で特定した主要なエレメントに加えて、ベクターは、プラスミドベクターでトランスフェクトされたか、または本開示によって生成されたウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳および／または発現を可能にするように、導入遺伝子に作動可能に連結した必要な従来の制御エレメントも含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスまたは一定距離で作用する発現制御配列の両方を含む。

発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに所望の場合、コードされた産物の分泌を増強する配列を含む。ネイティブ、構成的、誘導性および／または組織特異的であるプロモーターを含む、多数の発現制御配列が当技術分野で公知であり、利用され得る。

本明細書で使用される場合、核酸配列（例えば、コード配列）および調節配列は、それらが、核酸配列の発現または転写を調節配列の影響または制御下に置くような方法で共有結合により連結されている場合、「作動可能に」連結されていると言われる。核酸配列が機能的タンパク質へと翻訳されることが望ましい場合、５’調節配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、かつ２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさない、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力を妨害しない、または（３）タンパク質へと翻訳される対応するＲＮＡ転写物の能力を妨害しない場合、２つのＤＮＡ配列は作動可能に連結されていると言われる。よって、プロモーター領域が、結果として生じる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドへと翻訳されるように、そのＤＮＡ配列の転写をもたらすことが可能である場合、プロモーター領域は核酸配列に作動可能に連結されていることになる。同様に、２つまたはそれより多いコード領域は、共通のプロモーターからのそれらの転写が、フレーム内で翻訳された２つまたはそれより多いタンパク質の発現をもたらすような方法で連結されている場合、作動可能に連結されている。一部の実施形態では、作動可能に連結されたコード配列は、融合タンパク質をもたらす。一部の実施形態では、作動可能に連結されたコード配列は、機能的ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）をもたらす。

タンパク質をコードする核酸について、ポリアデニル化配列は、一般に、導入遺伝子配列の後、かつ３’ＡＡＶＩＴＲ配列の前に挿入される。本開示において有用なｒＡＡＶ構築物は、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子の間に位置するイントロンを含有してもよい。１つの可能なイントロン配列は、ＳＶ－４０に由来し、ＳＶ－４０Ｔイントロン配列と称される。使用することができる別のベクターエレメントは、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写物から２つ以上のポリペプチドを産生するために使用される。ＩＲＥＳ配列は、２つ以上のポリペプチド鎖を含有するタンパク質を産生するために使用されることになる。これらのおよび他の一般的なベクターエレメントの選択は従来通りであり、多くのこのような配列は利用可能である［例えば、Sambrook et al、およびその中で引用される参照文献、例えば３．１８３．２６および１６．１７１６．２７頁、ならびにAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989を参照されたい］。一部の実施形態では、口蹄疫ウイルス２Ａの配列はポリタンパク質内に含まれ；これは、ポリタンパク質の切断を媒介することが示されている小さなペプチド（およそ１８アミノ酸長）である（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミドおよび遺伝子治療ベクター（ＡＡＶおよびレトロウイルス）を含む人工の系において以前に実証されている（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459；de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208；de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.；およびKlump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817）。

宿主細胞における遺伝子発現に必要とされる調節配列の正確な性質は、種、組織または細胞型の間で変化し得るが、一般に、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写配列および５’非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、エンハンサーエレメントなどを含むことになる。特に、このような５’非転写調節配列は、作動可能に接合した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むことになる。調節配列は、所望の場合、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含んでもよい。本開示のベクターは、必要に応じて、５’リーダー配列またはシグナル配列を含み得る。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。

構成的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（必要に応じて、ＣＭＶエンハンサーを伴う）［例えば、Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられる。

誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給された化合物、温度などの環境因子、または特定の生理状態、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の存在、または複製細胞においてのみ調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含むがこれらに限定されない種々の商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）、テトラサイクリン抑制系（Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導性の系（Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995)、Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)も参照されたい）、ＲＵ４８６－誘導性の系（Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)およびWang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)）およびラパマイシン誘導性の系（Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）が挙げられる。この文脈において有用であり得る誘導性プロモーターのまた他の種類は、特定の生理学的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製細胞においてのみ調節されるプロモーターである。

別の実施形態では、導入遺伝子のネイティブのプロモーターが使用されることになる。導入遺伝子の発現がネイティブの発現を模倣することが望ましい場合に、ネイティブのプロモーターが好ましい場合がある。導入遺伝子の発現が一時的にもしくは発生的に、または組織特異的に、または特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合、ネイティブのプロモーターを使用してもよい。さらなる実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列などの他のネイティブの発現制御エレメントは、ネイティブの発現を模倣するために使用することもできる。

一部の実施形態では、調節配列は、組織特異的な遺伝子発現能を付与する。一部の場合には、組織特異的な調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。このような組織特異的な調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は、当技術分野で周知である。例示的な組織特異的配列としては、以下の組織特異的なプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない：肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）プロモーター、消化管特異的ムチン－２プロモーター、眼特異的レチノスキシンプロモーター、眼特異的Ｋ１２プロモーター、呼吸器組織特異的ＣＣ１０プロモーター、呼吸器組織特異的サーファクタントプロテインＣ（ＳＰ－Ｃ）プロモーター、乳房組織特異的ＰＲＣ１プロモーター、乳房組織特異的ＲＲＭ２プロモーター、尿路組織特異的ウロプラキン２（ＵＰＩＩ）プロモーター、子宮組織特異的ラクトフェリンプロモーター、または心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター。他の例示的なプロモーターとしては、当業者にとって明らかであるもののうち、ベータ－アクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)、骨オステオカルシンプロモーター（Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）；骨シアロタンパク質プロモーター（Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）、ＣＤ２プロモーター（Hansal et al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)）；免疫グロブリン重鎖プロモーター；Ｔ細胞受容体α－鎖プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）などのニューロン性（Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)）が挙げられる。

一部の実施形態では、組織特異的調節配列は、ＣＮＳ特異的プロモーターである。ＣＮＳ特異的プロモーターの例としては、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995)）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＣＮＳ特異的プロモーターは、グリア線維酸性タンパク質プロモーターなどの星状細胞特異的プロモーターである。一部の実施形態では、ＣＮＳ特異的プロモーターは、シナプシン（Ｓｙｎ）プロモーターなどのニューロンプロモーターである。一部の実施形態では、ＣＮＳ特異的プロモーターは、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、大腸腺腫症（ＡＰＣ）、およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ－１）から選択される遺伝子のプロモーターである。一部の実施形態では、ＣＮＳ特異的プロモーターは、Kuegler S. (2016)に記載されているように、ＣＮＳにおける組織特異的プロモーターである。Manfredsson F. (eds) Gene Therapy for Neurological Disorders. Methods in Molecular Biology, vol 1382. Humana Press, New York, NYにおいて。

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡのうちの１つまたは複数に関する１つまたは複数の結合部位は、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子内に組み込まれて、導入遺伝子を保有する対象の１つまたは複数の組織において、導入遺伝子の発現を阻害する（例えば、細胞型特異的に導入遺伝子の発現を脱標的化する(detargeting)）。当業者は、結合部位が組織特異的に導入遺伝子の発現を制御するために選択されてもよいことを認識するであろう。例えば、肝臓に特異的なｍｉＲ－１２２に関する結合部位は、導入遺伝子中に組み込まれて、肝臓においてこの導入遺伝子の発現を阻害し得る。ｍＲＮＡにおける標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはコード領域中であってもよい。典型的には、標的部位は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中に存在する。さらに、導入遺伝子は、複数のｍｉＲＮＡが同一または複数の部位を認識することによって、ｍＲＮＡを調節するように設計されてもよい。複数のｍｉＲＮＡ結合部位の存在によって、複数のＲＩＳＣの協調的作用がもたらされ、高効率の発現阻害がもたらされ得る。標的部位の配列は、合計５～１００個、１０～６０個、またはそれより多いヌクレオチドを含んでもよい。標的部位の配列は、標的遺伝子結合部位の配列のうち少なくとも５個のヌクレオチドを含んでもよい。

一部の実施形態では、導入遺伝子は、免疫細胞（例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージ、樹状突起などの）から導入遺伝子の発現を脱標的化する１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、またはそれより多い）のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。免疫に関連するｍｉＲＮＡに関するｍｉＲＮＡ結合部位の組込みは、例えばＵＳ２０１８／００６６２７９（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗原提示細胞から導入遺伝子の発現を脱標的化し、よって、導入遺伝子の産物に対して対象において生じる免疫応答（細胞性および／または体液性）を低減または排除し得る。一部の実施形態では、免疫に関連するｍｉＲＮＡは、以下から選択される：ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１６－１、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２９ａ／ｂ／ｃ、ｍｉＲ－３０ｂ、ｍｉＲ－３１、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－９２ａ－１、ｍｉＲ－１０６ａ、ｍｉＲ－１２５ａ／ｂ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１８１ａ、ｍｉＲ－２２３およびｍｉＲ－４２４、ｍｉＲ－２２１、ｍｉＲ－２２２、ｌｅｔ－７ｉ、ｍｉＲ－１４８、およびｍｉＲ－１５２。

ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子の配列の組成は、得られるベクターが置かれる使用に応じて変化する。例えば、導入遺伝子の配列の１種は、発現の際に検出可能なシグナルを生じるレポーター配列を含む。別の例では、導入遺伝子は、治療用タンパク質または治療用機能的ＲＮＡをコードする。別の例では、導入遺伝子は、研究目的で、例えば、導入遺伝子を保有する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産物の機能を研究するために使用されることを意図するタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることを意図するタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。適切な導入遺伝子をコードする配列は、当業者にとって明らかであろう。

導入遺伝子において提供され得るレポーター配列には、限定されないが、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当技術分野で周知の他のものをコードするＤＮＡ配列が含まれる。それらの発現を駆動する調節エレメントと関連する場合、レポーター配列は、酵素、放射線、比色、蛍光または他の分光アッセイ、蛍光活性化細胞分取アッセイ、ならびに酵素連結免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを含む従来の手段によって検出可能なシグナルを生じる。例えば、マーカー配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを有するベクターの存在は、β－ガラクトシダーゼ活性に関するアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを有するベクターは、ルミノメーターにおける色または光生成によって視覚的に測定することができる。このようなレポーターは、例えば、ｒＡＡＶの組織特異的標的化能力および組織特異的プロモーター調節活性を検証するのに有用であり得る。

一部の態様では、本開示は、例えば、哺乳動物におけるポリペプチド欠乏またはポリペプチド過剰などの、哺乳動物における１つまたは複数の遺伝的欠損または機能不全を防止または処置する方法、特に、細胞および組織におけるこのようなポリペプチドの欠乏に関連する障害の１つまたは複数を症状発現するヒトにおける欠損の重症度または程度を処置または低減するための方法において使用するためのｒＡＡＶベクターを提供する。この方法は、薬学的に許容される担体中の、１つまたは複数の治療用ペプチド、ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチドなどをコードするｒＡＡＶベクターの、このような障害に罹患する対象における欠損または障害を処置するのに十分な量および期間での、対象への投与に関与する。

よって、本開示は、哺乳動物対象における疾患状態の処置または防止に有用である１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするｒＡＡＶベクターの送達を包含する。例示的な治療用タンパク質には、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、サイトカイン、抗糖尿病因子、抗アポトーシス剤、凝固因子、抗腫瘍因子からなる群より選択される１つまたは複数のポリペプチドが含まれる。治療用タンパク質の他の非限定的な例としては、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ－ＳＣＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ゴナドトロピン、ＩＦＮ、ＩＦＧ－１、Ｍ－ＣＳＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＥＤＦ、ＴＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－Ｂ２、ＴＮＦ、プロラクチン、ソマトトロピン、ＸＩＡＰ１、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０（１８７Ａ）、ウイルス性ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６ＩＬ－１７、およびＩＬ－１８が挙げられる。

ｒＡＡＶベクターは、遺伝子の発現低下、発現の欠如または機能不全に関連する疾患を処置するために、対象に移入される遺伝子を含んでもよい。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、中枢神経系に関連する疾患を処置するために使用される。例示的な遺伝子および関連する疾患状態は、以下を含むがこれらに限定されない：グリコーゲン貯蔵欠乏１Ａ型と関連する、グルコース－６－ホスファターゼ；Ｐｅｐｃｋ欠損と関連する、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ：ガラクトース血症と関連する、ガラクトース－１リン酸ウリジルトランスフェラーゼ；フェニルケトン尿症と関連する、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ；カエデシロップ尿病と関連する、分枝鎖アルファ－ケト酸デヒドロゲナーゼ；チロシン血症１型と関連する、フマリルアセト酢酸加水分解酵素；メチルマロン酸血症と関連する、メチルマロニル－ＣｏＡムターゼ；中鎖アセチルＣｏＡ欠乏と関連する、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏と関連する、オルニチントランスカルバミラーゼ；シトルリン血症と関連する、アルギニノコハク酸合成酵素；家族性高コレステロール血症と関連する、低密度リポタンパク質受容体タンパク質；クリグラー－ナジャー病と関連する、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ；重症複合型免疫欠乏症と関連する、アデノシンデアミナーゼ；痛風およびレッシュ－ナイハン症候群と関連する、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；ビオチニダーゼ欠乏と関連する、ビオチニダーゼ；ゴーシェ病と関連する、ベータ－グルコセレブロシダーゼ；スライ症候群と関連する、ベータ－グルクロニダーゼ；ツェルヴェーガー症候群と関連する、ペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ；急性間欠性ポルフィリン症と関連する、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ；アルファ－１抗トリプシン欠乏症（気腫）の処置のための、アルファ－１抗トリプシン；サラセミアまたは腎不全による貧血の処置のためのエリスロポエチン；虚血性疾患の処置のための血管内皮増殖因子、アンジオポエチン－１、および線維芽細胞増殖因子；例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、または塞栓症において見られる閉塞した血管の処置のためのトロンボモジュリンおよび組織因子経路阻害剤；パーキンソン病の処置のための芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）；うっ血性心不全の処置のためのベータアドレナリン受容体、ホスホランバンに対するアンチセンスまたはその変異体形態、筋小胞体（小胞体）アデノシントリホスファターゼ－２（ＳＥＲＣＡ２）、および心臓アデニリルシクラーゼ；様々ながんの処置のためのｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子；炎症性障害および免疫障害ならびにがんの処置のための様々なインターロイキンのうちの１つなどのサイトカイン；筋ジストロフィーの処置のためのジストロフィンまたはミニジストロフィンおよびユトロフィンまたはミニユトロフィン；ならびに糖尿病の処置のためのインスリン。

当業者は、タンパク質またはポリペプチドをコードする導入遺伝子の場合には、タンパク質またはポリペプチドの機能的に等価なバリアント、またはホモログを提供するために、保存的アミノ酸置換をもたらす変異が導入遺伝子においてなされ得ることも理解するであろう。一部の態様では、本開示は、導入遺伝子の保存的アミノ酸置換をもたらす配列変更を包含する。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ドミナントネガティブ変異を有する遺伝子を含む。例えば、導入遺伝子は、野生型タンパク質と同じエレメントと相互作用し、それによって、野生型タンパク質の機能の一部の態様を遮断する変異体タンパク質を発現し得る。

有用な導入遺伝子産物は、ｍｉＲＮＡも含む。ｍｉＲＮＡおよび他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡの転写物の切断／分解または標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制により遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的に１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物としてネイティブに発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用によって、それらの活性を呈する。内因的に発現したこれらのｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し、その後、ｍｉＲＮＡ二重鎖へと、さらに「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子へとプロセシングされる。この成熟ｍｉＲＮＡは、多重タンパク質複合体であるｍｉＲＩＳＣをガイドし、成熟型ｍｉＲＮＡとのそれらの相補性に基づいて、標的ｍＲＮＡの標的部位、例えば３’ＵＴＲ領域を特定する。

以下のｍｉＲＮＡ遺伝子、およびそのホモログの非限定的なリストは、本方法のある特定の実施形態では、導入遺伝子として、または導入遺伝子によってコードされる低分子干渉核酸（例えば、ｍｉＲＮＡスポンジ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴｕＤＲＮＡ）に対する標的として有用である：ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１７９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１９７、
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ｈｓａ－ｍｉＲ－３００、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｃ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｄ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｆ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４６、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６３、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６３＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７３、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７３＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７７＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７９＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８０＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８４、
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ｈｓａ－ｍｉＲ－５００、ｈｓａ－ｍｉＲ－５００＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１６ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｃ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｅ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｆ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｆ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｅ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｆ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｇ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｈ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２６ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｆ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｇ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｈ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｉ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｊ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｋ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｌ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｍ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｎ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｏ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５１ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８９＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９３＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９９、
ｈｓａ－ｍｉＲ－６００、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２４＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２５＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２９＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６４＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５、
ｈｓａ－ｍｉＲ－７、ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７２０、ｈｓａ－ｍｉＲ－７４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－７４４＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６０、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７７０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７３、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７４、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７７、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７７＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８７、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８８＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９２ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９、ｈｓａ－ｍｉＲ－９＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２０、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３６、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３９、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４２、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－９６＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ＊。

ｍｉＲＮＡは、それが標的とするｍＲＮＡの機能を阻害し、結果として、そのｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を阻害する。よって、ｍｉＲＮＡの活性を（部分的または全体的に）遮断する（例えば、ｍｉＲＮＡをサイレンシングする）ことにより、発現が阻害されるポリペプチドの発現を効果的に誘導、または回復する（ポリペプチドの抑制を解除する）ことができる。一実施形態では、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的によってコードされるポリペプチドの抑制解除は、種々の方法のうちのいずれか１つによって、細胞内のｍｉＲＮＡ活性を阻害することによって達成される。例えば、ｍｉＲＮＡの活性を遮断することは、ｍｉＲＮＡに対して相補的であるか、または実質的に相補的である低分子干渉核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡスポンジ、ＴｕＤＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションによって達成され、それによって、ｍｉＲＮＡの、その標的ｍＲＮＡとの相互作用を遮断することができる。本明細書で使用される場合、ｍｉＲＮＡに対して実質的に相補的である低分子干渉核酸は、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし、ｍｉＲＮＡの活性を遮断することができるものである。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡに対して実質的に相補的である低分子干渉核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８塩基以外のすべてにおいて、ｍｉＲＮＡに対して相補的である低分子干渉核酸である。一部の実施形態では、低分子干渉核酸配列は、ｍｉＲＮＡに対して実質的に相補的であるか、または少なくとも１つの塩基でｍｉＲＮＡに対して相補的である低分子干渉核酸配列である。

「ｍｉＲＮＡ阻害剤」は、ｍｉＲＮＡの機能、発現および／またはプロセシングを遮断する薬剤である。例えば、これらの分子には、ｍｉｃｒｏＲＮＡ特異的アンチセンス、ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジ、タフデコイ（tough decoy）ＲＮＡ（ＴｕＤＲＮＡ）およびｍｉＲＮＡのＤｒｏｓｈａ複合体との相互作用を阻害するｍｉｃｒｏＲＮＡオリゴヌクレオチド（二本鎖、ヘアピン、短いオリゴヌクレオチド）が含まれるがこれらに限定されない。ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤は、上記で議論したように、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子から、細胞において発現され得る。ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジは、相補的なヘプタマーシード配列（Ebert, M.S. Nature Methods, Epub August, 12, 2007）によってｍｉＲＮＡを特異的に阻害する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡのファミリー全体が、単一のスポンジ配列を使用してサイレンシングされ得る。ＴｕＤＲＮＡは、哺乳動物細胞において、特定のｍｉＲＮＡの効率的かつ長期的な抑制を達成する（例えば、ＴｕＤＲＮＡに関するその内容が参照により本明細書に組み込まれる、Takeshi Haraguchi, et al., Nucleic Acids Research, 2009, Vol. 37, No. 6 e43を参照されたい）。細胞内でｍｉＲＮＡ機能をサイレンシングする（ｍｉＲＮＡ標的の抑制解除）ための他の方法は、当業者にとって明らかであろう。

一部の実施形態では、組換えＲＮＡベクターのクローニング能力は所望のコード配列を限定する場合があり、ウイルスの４．８キロベースのゲノムの完全な置換えを必要とする場合がある。したがって、大きな遺伝子は、一部の場合には、標準的な組換えＡＡＶベクターにおいて使用するのに好適ではない場合がある。当業者は、当技術分野において、限定されたコード能力を克服するための選択肢が利用可能であることを認識するであろう。例えば、２つのゲノムのＡＡＶＩＴＲがアニーリングしてヘッドトゥーテールコンカテマーを形成し、ベクターの能力をほぼ２倍にすることができる。スプライス部位の挿入によって、転写物からのＩＴＲの除去が可能になる。限定されたクローニング能力を克服するための選択肢は、当業者にとって明らかであろう。

投与
ｒＡＡＶは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって、組成物中で対象に送達されてもよい。好ましくは生理学的に適合する担体中に（例えば、組成物中に）懸濁させたｒＡＡＶは、対象、例えばヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または非ヒト霊長類（例えば、マカク）などの宿主動物に投与されてもよい。一部の実施形態では、宿主動物は、ヒトを含まない。

ｒＡＡＶの哺乳動物対象への送達は、例えば、筋肉内注射、または哺乳動物対象の血流中への投与によるものであってもよい。血流中への投与は、静脈、動脈、または任意の他の血管導管への注射によるものであってもよい。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、外科技術分野で周知の技法である分離式肢灌流によって血流中に投与され、この方法によって、当業者は、ｒＡＡＶビリオンの投与前に、体循環から肢を分離することが基本的に可能になる。米国特許第６，１７７，４０３号に記載されている分離式肢灌流技法の変形が、ビリオンを分離された肢の血管系へと投与し、筋肉細胞または組織中への形質導入を潜在的に増強するために、当業者によって用いられてもよい。さらに、ある特定の事例では、ビリオンを対象のＣＮＳに送達するのが望ましい場合がある。「ＣＮＳ」によって、脊椎動物の脳および脊髄の細胞および組織のすべてが意味される。よって、この用語は、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質空間、骨、軟骨などを含むがこれらに限定されない。組換えＡＡＶは、例えば、脳室領域、ならびに線条体（例えば、線条体の尾状核または被殻）、脊髄および神経筋接合部、または小脳葉への、針、カテーテルまたは関連するデバイスによる注射によって、当技術分野で公知の神経外科技術、例えば定位注射によって、ＣＮＳまたは脳へ直接的に送達されてもよい（例えば、Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999；Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000；Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993；およびAlisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000を参照されたい）。

本開示の組成物は、単独で、または１つもしくは複数の他のウイルス（例えば、１つまたは複数の異なる導入遺伝子をコードするかまたは有する第２のｒＡＡＶ）と組み合わせて、ｒＡＡＶを含んでもよい。一部の実施形態では、組成物は、それぞれが１つまたは複数の異なる導入遺伝子を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い異なるｒＡＡＶを含む。

好適な担体は、ｒＡＡＶが対象とする適用を鑑みて、当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体として、食塩水が挙げられ、これは、種々の緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）と共に製剤化されてもよい。他の例示的な担体としては、滅菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ラッカセイ油、ゴマ油、および水が挙げられる。担体の選択は、本開示の制限ではない。

必要に応じて、本開示の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、他の従来の医薬成分、例えば防腐剤、または化学的安定剤を含有してもよい。好適な例示的防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが挙げられる。好適な化学的安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。

ｒＡＡＶは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、かつ過度な有害効果なしに十分なレベルの遺伝子の移入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、選択された臓器への直接的送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、頭蓋内（例えば、海馬内）、および他の非経口的投与経路が挙げられるがこれらに限定されない。投与経路は、所望の場合、組み合わされてもよい。

特定の「治療効果」を達成するために必要とされるｒＡＡＶビリオンの用量、例えば、体重１キログラム当たりのゲノムコピーの用量の単位（ＧＣ／ｋｇ）は、ｒＡＡＶビリオンの投与経路、治療効果を達成するために必要とされる遺伝子またはＲＮＡの発現レベル、処置される特定の疾患または障害、および遺伝子またはＲＮＡの産物の安定性を含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に基づいて変化する。当業者は、前述の要因、および当技術分野で周知である他の要因に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を処置するために、ｒＡＡＶビリオンの用量範囲を容易に決定することができる。

ｒＡＡＶの有効量は、動物を標的とするかまたは感染させ、所望の組織を標的とするのに十分な量である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶの有効量は、安定な体細胞トランスジェニック動物モデルを生成するのに十分な量である。有効量は、主に、対象の種、年齢、体重、健康、および標的とされる組織などの要因に応じて変化し、よって、動物間または組織間で変化し得る。例えば、ｒＡＡＶの有効量は、一般に、約１０^９～１０^１６個のゲノムコピーを含有する溶液約１ｍｌ～約１００ｍｌの範囲内である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、対象当たり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５個のゲノムコピーの用量で投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、１ｋｇ当たり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、または１０^１４個のゲノムコピーの用量で投与される。一部の場合には、約１０^１１～１０^１２個の間のｒＡＡＶゲノムコピーの投薬量が適切である。ある特定の実施形態では、１０^１２個のｒＡＡＶゲノムコピーが、心臓、肝臓、および膵臓の組織を標的とするのに有効である。一部の場合には、安定なトランスジェニック動物は、多回用量のｒＡＡＶによって生成される。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、特に高濃度（例えば、約１０^１３ＧＣ／ｍｌまたはそれより高い濃度）のｒＡＡＶが存在する場合、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を低減するように製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を低減するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整などを含む（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178を参照されたい）。

薬学的に許容される賦形剤および担体の溶液の製剤は当業者に周知であり、本明細書に記載の特定の組成物を種々の処置レジメンで使用するのに好適な投与および処置のレジメンの開発も同様である。

典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％の活性化合物またはそれより多くを含有してもよいが、有効成分のパーセンテージは、当然のことながら、変更されてもよく、便宜的に製剤全体の重量または体積の約１または２％～約７０％もしくは８０％またはそれより高い割合の間であってもよい。当然、各治療上有用な組成物における活性化合物の量は、化合物のいずれかの所与の単位用量において好適な投薬量が得られるように調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命などの要因、および他の薬理学的検討事項も、このような医薬製剤を調製する当業者によって企図されることになり、そういうものとして、種々の投与および処置のレジメンが望ましい場合がある。

ある特定の状況下では、本明細書に開示される好適に製剤化された医薬組成物中のｒＡＡＶベースの治療用構築物を、皮下に、膵臓内に、鼻内に、非経口的に、静脈内に、頭蓋内に（例えば、海馬内に）、筋肉内に、髄腔内に、または経口的に、腹腔内に、または吸入によってのいずれかで、送達するのが望ましいことになる。一部の実施形態では、米国特許第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号（それぞれが参照によりその全体として本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されている投与モダリティが、ｒＡＡＶを送達するために使用されてもよい。一部の実施形態では、好ましい投与方式は、門脈注射によるものである。

注射可能な使用に好適な医薬形態としては、無菌の水性溶液または分散物、および無菌の注射可能な溶液または分散物を即時調製するための無菌粉末が挙げられる。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製されてもよい。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有する。多くの場合には、形態は、容易な注射可能性（syringability）が存在する程度まで、無菌かつ流動的である。形態は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の夾雑作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物、ならびに／または植物油を含有する溶媒もしくは分散媒であってもよい。適当な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合には、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能な組成物の延長された吸収は、組成物中で、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらされ得る。

注射可能な水性溶液の投与では、例えば、溶液は、必要な場合には、好適に緩衝されてもよく、液体希釈剤は、最初に十分な食塩水またはグルコースで等張にされてもよい。これらの特定の水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に好適である。これに関連して、用いられ得る滅菌水性媒体は当業者に公知であろう。例えば、１回の投薬量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解させ、１０００ｍｌの皮下点滴液に添加するか、または提案される注入部位に注射されてもよい（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照されたい）。投薬量におけるある程度の変動が宿主の状態に応じて必然的に生じる。投与責任者は、いかなる事象においても、個々の宿主に適切な用量を決定することになる。

無菌の注射可能な溶液は、本明細書で列挙した様々な他の成分と共に、適切な溶媒中で必要とされる量の活性なｒＡＡＶを組み込み、必要であれば、その後に濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、基本分散媒および上に列挙したものから必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に、様々な滅菌された有効成分を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、その予め無菌濾過した溶液から、有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥技法である。

本明細書に開示されるｒＡＡＶ組成物は、中性または塩の形態で製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が含まれ、これは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することも可能である。製剤化されると、溶液は、投与製剤に適合する様式で、かつ治療上有効な量で投与されることになる。製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの種々の剤形において容易に投与される。

本明細書で使用される場合、「担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁物、コロイドなどが含まれる。医薬活性物質に対するこのような媒体および作用物質の使用は当技術分野で周知である。補足的活性成分も組成物中に組み込まれ得る。語句「薬学的に許容される」は、宿主に投与された場合に、アレルギー反応も類似する有害反応も生じない分子実体および組成物を指す。

リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、ベシクルなどのような送達ビヒクルは、本開示の組成物の好適な宿主細胞への導入のために使用されてもよい。特に、ｒＡＡＶベクターにより送達される導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかの中に封入されて、送達用に製剤化されてもよい。

このような製剤は、本明細書に開示される核酸またはｒＡＡＶ構築物の薬学的に許容される製剤の導入にとって好ましい場合がある。リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に公知である。最近、血清中での安定性および循環半減期が改善したリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物についての様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号；同第５，５５２，１５７号；同第５，５６５，２１３号；同第５，７３８，８６８号および同第５，７９５，５８７号）。

通常、他の手順によるトランスフェクションに耐性であるいくつかの細胞型に関して、リポソームは成功裏に使用されている。加えて、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的であるＤＮＡの長さについての制約がない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射性治療剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを、種々の培養細胞系および動物へと導入するために効果的に使用されている。加えて、リポソームに媒介される薬物送達の有効性を調査するいくつかの臨床試験の完了に成功している。

リポソームは、水性媒体中に分散され、多重層同心性二重層ベシクル（多重層ベシクル（ＭＬＶ）とも称される）を自然に形成するリン脂質から形成されている。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ～４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理によって、コアに水性溶液を含有する２００～５００．ＡＮＧ．の範囲の直径を有する小さい単層ベシクル（ＳＵＶ）の形成がもたらされる。

あるいは、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤が使用されてもよい。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方法で物質を捕捉することができる。細胞内でのポリマー過負荷による副作用を回避するために、このような超微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、ｉｎｖｉｖｏで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。この要件に合致する生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が使用に関して企図されている。

上記送達方法に加えて、ｒＡＡＶ組成物を宿主に送達する代替方法として、以下の技法も企図されている。ソノフォレーシス（すなわち、超音波）が使用され、循環系への、および循環系を介する薬物浸透の速度および効力を増強するためのデバイスとして、米国特許第５，６５６，０１６号に記載されている。企図される他の薬物送達の代替法は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、眼科製剤（Bourlais et al., 1998）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号および同第５，７８３，２０８号）およびフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号）である。

（実施例１）
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、安全かつ信頼性の高い遺伝子送達ビヒクルとして、近年、ヒトの遺伝子治療分野で多くの注目を集めている。現在、前臨床および臨床研究において、ＡＡＶ２が最も一般的に使用されている。しかし、ＡＡＶ２ベースの薬物であるＬｕｘｔｕｒｎａは、ＦＤＡに承認された唯一のウイルスベースのバイオ治療薬であり、よって、ＡＡＶの医薬特性を改善することが非常に重要である。

ＡＡＶ２は、ベクター生成において「生産性が低く」、多くの組織および細胞型で「性能が低い」ことが知られている。特性の改良されたウイルスバリアントを単離した。

ＡＡＶｖ６６という名称のバリアントを、臨床膵臓新生物の試料において最も豊富に存在するプロウイルスキャプシドバリアントとして同定した。ＡＡＶｖ６６キャプシドは、ＡＡＶ２と異なる１３の残基を保有する（Ｋ３９Ｑ、Ｖ１５１Ａ、Ｒ４４７Ｋ、Ｔ４５０Ａ、Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９Ｄ、Ｆ５３３Ｙ、Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８Ｇ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ、およびＡ５９３Ｔを含むＡＡＶ２に対する変異）。このバリアントは、頭蓋内（例えば、頭蓋下）注射後、ＣＮＳにおいて好ましい向性を呈する。さらに、ＡＡＶｖ６６は、プロトタイプのＡＡＶ２よりも良好なパッケージング効率を実証する。示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を使用して、ＡＡＶｖ６６の融解温度が、ｐＨ４～ｐＨ７に及ぶ範囲のｐＨにわたって、ＡＡＶ２よりも約６℃高いことが観察された。さらに、ＤＳＦ分析は、ｐＨ４では、ＡＡＶｖ６６はＡＡＶ２よりも高い温度でそのベクターＤＮＡを破壊する（expunge）ことを示す。

ＡＡＶｖ６６は、ＡＡＶ２と比較して優れたＣＮＳ形質導入を付与することも確認された。２．９Åの分解能でのｃｒｙｏ－ＥＭ構造から、３回転突出部および５回対称軸の界面でのＡＡＶ２とＡＡＶｖ６６の間の構造的差異が明らかになり、これらの位置での残基がベクター形質導入のための安定性および機能の改善を付与することを示す。

（実施例２）
ＡＡＶは、有効かつ証明された遺伝子治療のベクターとして最近注目を集めている。現行の分類のＡＡＶは、安定で、長期に及ぶ遺伝子発現を付与し、広範囲に及ぶ組織向性を有し、かつ比較的低い病原性を呈する。現在までに、３つの血清型キャプシド（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、およびＡＡＶ９）が、患者への商業的使用について規制当局の承認を得ている。あいにく、特定の組織または細胞型を標的とするのに必要なある特定の臨床適用では、現行の発見および操作されたＡＡＶキャプシドのライブラリーでは不十分である。さらに、患者は、治療有効性を制限することになる、中和抗体によるベクターへの既存の免疫を有している場合がある。さらに、ある特定のキャプシドは、標準的な生産スキームでは、治療用量を満たすのに必要とされる高収率力価をもたらすのに問題があることが知られている。これらの欠点に応じて、より良好なベクター収率を呈し、自然免疫から逃れることができ、かつ固有の向性プロファイルを有する新規キャプシドの発見および開発が必要とされる。

この実施例は、ハイスループット一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシングによって同定され、その特性が、配列類似性が高い（９８％）にもかかわらず、ＡＡＶ２のものと実質的に異なるキャプシドタンパク質バリアント、ＡＡＶｖ６６（配列番号１）について説明する。第１に、ＡＡＶｖ６６は、より良好なベクター収率を呈し、プロトタイプのＡＡＶ２よりもより熱安定性が高い。第２に、ＡＡＶｖ６６は、頭蓋内注射によって投与された場合、脳組織内でより広範囲の分布を有する。最後に、ＡＡＶｖ６６は、ＡＡＶ２と抗原的に別個である。

ＡＡＶｖ６６がＡＡＶ２とどのように異なるのかをよりよく理解するために、低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）を実施して、ＡＡＶｖ６６を規定する構造的かつ機能的特徴を探索した。本発明者らによるＡＡＶｖ６６キャプシドの２．５Å分解能での構造は、ＡＡＶ２の構造との差異を明らかにし、キャプシドの機能的特性についての洞察を与える。まとめると、これらの観察は、ＡＡＶｖ６６の機構的特性を説明するものである。

材料および方法
ＤＮＡ抽出
７１歳の女性患者から、腫瘍摘出、ならびに凍結切片の調査および術中凍結切片診断による組織病理の後に、膵臓新生物の試料を得た。ＤＮＡ抽出まで、試料を液体窒素中で保存した。ＡＡＶのＤＮＡ相互夾雑を避けるために、ＤＮＡ抽出、およびＰＣＲ手順は、無菌のＵＶ照射されたバイオセイフティーキャビネット中で実施した。すべての表面および器具にＤＮＡ－ＥｘｉｔｕｓＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、カタログ番号Ａ７０８９）をスプレーし、１５分後にミリＱ水できれいに拭き取った。次いで、凍結した組織を室温で解凍し、使い捨てメスで約２５ｍｇの組織を素早く切断し、２ｍＬのチューブに入れた。組織からのＤＮＡ抽出は、製造業者に推奨された手順によって、ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、番号５１３０６）を使用して実施した。

ＳＭＲＴシーケンシング
標準的ＰＣＲ手順によって、ゲノムＤＮＡからアンプリコンライブラリーを作成した。ＡＡＶゲノムを増幅させるために、以下のサイクル条件でＰｌａｔｉｎｕｍ（商標）ＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲを実施した：９７℃で１分間；９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、および６８℃で２分３０秒間を４６サイクル；ならびに６８℃で１０分間。正しいサイズのＰＣＲ産物をＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてゲル精製し、バーコード化のための２回目の１５サイクルのＰＣＲに使用した。使用したプライマー対は：
１回目のプライマー：ＣａｐＦ５’－ＧＡＣＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＴＧＡ－３’（配列番号３）およびＣａｐＲ５’－ＧＡＡＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣＣＧＧＴＴＴＡＴＴＧＡＴＴＡＡ－３’（配列番号４）
２回目のプライマー：ＥＦ５’－ＣＡＴＣＡＣＴＡＣＧＣＴＡＧＡＴＧＡＣＴＧＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＴＧＡ－３’（配列番号５）およびＥＲ５’－ＴＡＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧＡＣＴＣＧＡＡＡＣＧＡＡＴＴＡＡＣＣＧＧＴＴＴＡＴＴＧＡＴＴＡＡ－３’（配列番号６）

キャプシドバリアントのＯＲＦを表すアンプリコンを標準的なＳＭＲＴシーケンシングライブラリー作成に供した。ＲＳＩＩプラットフォームでシーケンシングを実施した。ＳＭＲＴシーケンシングにより、ＢＷＡ－ＭＥＭアルゴリズムを使用してＡＡＶ２ＣａｐＯＲＦにマッピングされた１７，７２７のＤＮＡリードが返された。次いで、アーチファクトの配列を除外するために、リードをフィルタリングし、長さが１，８００ｎｔより短い配列および２，５００ｎｔより長い配列を除外し、次いで、リードの質（Ｐｈｒｅｄスコア＞３０）に関してフィルタリングした。このフィルタリングにより、リードは１４，５００個まで減少した。最後に、リードをＩｎＤｅｌＦｉｘｅｒで処理し、エラーを起こしやすいＰＣＲまたはシーケンシングエラーから生じる可能性のある単一ヌクレオチドの挿入および欠失を除去した。固有のキャプシド配列のみを考慮し、信頼性の低いバリアントを除外するために、ｄｅｎｏｖｏアセンブリ（ＧｅｎｅｉｏｕｓＲ９）をフィルタリングしたリードに関して実施し、９９％の配列類似性を有するリードをクラスタリングした。少なくとも１０個のリードによって表されるリードのクラスターのみを、固有のＤＮＡキャプシド配列とみなした。次いで、ＤＮＡ配列をアミノ酸配列へと翻訳し、固有のＡＡＶキャプシドの最終リストを規定した。

現代のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ２／３に使用されるｈｕ．２）由来の完全なＡＡＶＣａｐＯＲＦをＮＣＢＩから入手し、予測されるアミノ酸配列を、ＭＵＳＣＬＥアルゴリズムを使用して、収束が達成されるまで反復してアラインメントさせた。次いで、ＰｈｙＭＬを使用して、ＳｅａＶｉｅｗ５５内からデフォルトパラメーターを使用して系統樹を作成し、次いで、ＩｎｔｅｒａｃｔｉｖｅＴｒｅｅｏｆＬｉｆｅオンラインツールによって可視化した。

ウイルスベクター生成
ＨＥＫ２９３細胞中で、三重トランスフェクション法を使用してウイルスを生成し、ＣｓＣｌ勾配遠心分離によって精製した。記載されたすべてのベクターを、増強型緑色蛍光タンパク質を発現する自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ－ＣＢ６－ＥＧＦＰ）、ホタルルシフェラーゼを発現する一本鎖ベクター（ｓｓＡＡＶ－ＣＢ６－Ｆｌｕｃ）、分泌型ヒトアルファ１－抗トリプシンを発現する一本鎖ベクター（ｓｓＡＡＶ－ＣＢ６－ｈＡ１ＡＴ）、またはＬａｃＺを発現する一本鎖ベクターのいずれかでパッケージングした。すべての導入遺伝子は、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＢ６）遍在性プロモーターによって駆動される。

動物
６～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、試験ベクターを静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、または頭蓋内投与した。ＩＶ注射に供したマウスに、ｓｓＡＡＶ－ＣＢ６－Ｆｌｕｃ導入遺伝子をパッケージングしたベクター（１．０Ｅ１１ｖｇ／マウス）を投与し、注射の１４日後にマウスを屠殺した。ＴＡ筋のＩＭ注射に供したマウスに、ｓｓＡＡＶ－ＣＢ６－Ｆｌｕｃ導入遺伝子をパッケージングしたベクター（４．０Ｅ１０ｖｇ／マウス）を投与し、注射の２８日後にマウスを屠殺した。屠殺までの１週間ごと、および屠殺時に、動物にＤ－ルシフェリン基質を腹腔内注射し、イソフルランで鎮静させ、１分の露出でＩＶＩＳＳｐｅｃｔｒｕｍＣＴイメージングプラットフォームを使用してルシフェラーゼ活性を定量化した。ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアを使用して、イメージ取得を実施した。海馬内注射に供したマウスに、ｓｃＡＡＶ－ＣＢ６－Ｅｇｆｐ導入遺伝子をパッケージングしたベクターを投与した（３．６Ｅ９ｖｇ／マウス）。定位固定フレーム（ＳｔｏｅｌｔｉｎｇＣｏ．ＷｏｏｄＤａｌｅ、ＩＬ）、ＨａｍｉｌｔｏｎＳｙｒｉｎｇｅ（１２０７Ｋ９５、ＴｈｏｍａｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＨａｍｉｌｔｏｎＮｅｅｄｌｅ（７７６０２－０６、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用して、右半球に片側注射を実施した。すべての海馬内注射には、以下の相対座標を使用した：ｘ：－１．５ｍｍ、ｙ：－２ｍｍ、ｚ：－２ｍｍ。

免疫染色
注射の４週間後に、動物を１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、それに続いて４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心的に灌流した。脳を抽出し、次に、４％のＰＦＡで４℃にて一晩固定した。次いで、スクロース混合物中で平衡化するまで、脳を、４℃で、３０％のスクロース（１×ＰＢＳ中で調製した）中に浸漬させた。脳を１：２のＯＣＴ（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）と３０％のスクロースとの混合物中に包埋し、４０μｍで凍結切片とした（ＣｒｙｏｓｔａｒＮＸ７０、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。切片を、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００で１時間透過処理し、５％のヤギ血清（１０％の正常ヤギ血清、５００６２Ｚ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１時間ブロッキングし、次いで、一次抗体（抗ＮｅｕＮ、１：１０００、ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭＡＢ３７７；抗Ｇｆａｐ、１：５００、ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭＡＢ３６０；抗Ｏｌｉｇ２、１：２００、Ａｂｃａｍａｂ１０９１８６；抗Ｉｂａ１、１：１０００、ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓＮＣ９２８８３６４）中４℃で一晩インキュベートした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体（抗マウス、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＡ３２７４４；または抗ウサギ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＡ３２７４０）中、室温で１時間インキュベートした。切片を１×ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）によりマウントした。

顕微鏡法
ＬｅｉｃａＳＰ８ＬｉｇｈｔｎｉｎｇＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＣｏｎｆｏｃａｌ（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で脳切片画像を得た。脳全体の画像（１０×のタイル状脳切片）および高倍率の画像（６３×の領域特異的面積）を、それぞれの各倍率に対して同じ強度と露出閾値で収集した。高倍率画像では、０．２９ｚ－ｓｉｚｅで４０－５０ｚ－ｓｔａｃｋｓｔｅｐを収集した。Ｉｍａｒｉｓ９．３Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｉｔｐｌａｎｅＩｎｃ．、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して分析を実施した。各画像を３Ｄレンダリングし、閾値を手動で確立した。一貫性を確実するために、ＤＡＰＩ体積と共局在化した解剖下の全ＥＧＦＰ体積のバイアスのない３Ｄレンダリングと、細胞型特異的染色とを、細胞計数および陽性に形質導入された細胞の数のプロキシとして使用した。各同側の解剖下領域内の異なる細胞型のパーセント定量化、その後に、各細胞型のパーセント定量化を行った。形質導入のパーセンテージは、共局在化したＥＧＦＰの体積を、各領域内の細胞型特異的染色の総体積に対して正規化することによって決定した。細胞特異的染色あたり、ｎ＝３のマウスを分析した。図２Ｂに関する統計計算は、Ｐｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）で行い、分析は、スチューデントの対応のないｔ検定を使用して実施した。

ＤＳＦ分析
キャプシドの安定性実験のために、５μＬのＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅ５０００Ｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を４９５μＬのＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で希釈し、５０×ストックを作製した。４５μＬのウイルスを５μＬの５０×ＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅと混合した（ＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅの最終濃度は５×である）。ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲ機器（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、以下のパラメーターを用いて蛍光を定量化した：試料を、２５℃で２分間、続いて温度勾配（ステップごとに０．４℃で、各ステップで２分間保持して、２５℃～９９℃）にてインキュベートした。各温度ステップでＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅの蛍光をモニターするために、受動参照なしのＲＯＸフィルターを使用した。ＡＡＶベクターの融解温度に対するｐＨの影響を調査するために、ウイルスベクター５μＬ、５０×ＳＹＢＲＯｒａｎｇｅ５μＬ、ｐＨ７～ｐＨ４にｐＨ調整した０．６Ｍの酢酸緩衝液４０μＬを混合した。本研究で報告したＴｍ値は、２５～９５℃の間で検出した最大Ｄｓｉｇｎａｌ／Ｄｔｅｍｐとして定義される。ベクターゲノムの放出を調査するために、ＳＹＢＲＯＯｒａｎｇｅ色素をＳＹＢＲＧｏｌｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に切り替えた。

部位特異的変異誘発
ＡＡＶｖ６６キャプシドのＯＲＦにおいて点変異を生じるために、Ｑ５部位特異的変異誘発キット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）および以下の変異誘発プライマーの対を使用した：

ｃｒｙｏ－ＥＭ
ＡＡＶｖ６６を、レーシーカーボン支持フィルム付きグリッド（０１８２４Ｇ、ＴｅｄＰｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）上でｃｒｙｏ－ＥＭのために調製した。最初に、グリッドを酢酸アセチルで洗浄し、一晩乾燥させた。次に、ＰＥＬＣＯｅａｓｉＧｌｏｗグロー放電ユニットを用いて、グリッドを負極性の２０ｍＡの電流で６０秒間グロー放電させた。緩衝液（ＰＢＳ中の５％のソルビトール、０．００１％プルロニック（登録商標）酸Ｆ６８）中１Ｅ１３ｖｇ／ｍＬのＡＡＶｖ６６－ＣＢ６－Ｅｇｆｐベクター３μＬを、ＶｉｔｒｏｂｏｔＭａｒｋＩＶ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）ｃｒｙｏ－ＥＭプランジング装置に載せたグリッド上に配置した。液体エタン中で急速凍結する前に、１０℃および相対湿度９５％で、Ｗｈａｔｍａｎの番号１のフィルターペーパーで、グリッドを６～６．５秒間ブロッティングした。

３００ｋＶで作動し、ＧａｔａｎＩｍａｇｅＦｉｌｔｅｒ（ＧＩＦ）およびＫ２Ｓｕｍｍｉｔ直接電子検出器（ＧａｔａｎＩｎｃ．）を装備したＴｉｔａｎＫｒｉｏｓ電子顕微鏡（ＦＥＩ）上のＳｅｒｉａｌＥＭを使用し、０．５～２．２μｍのアンダーフォーカス（underfocus）を使用して、２，０３３本の動画からなるデータセットを収集した。１動画当たり５０フレームを収集し、１フレーム当たり１．４３ｅ－／Å２、試料への総線量４８．６２ｅ－／Å２で、３４フレームを使用した。ピクセルサイズは、試料に関して１．０５８８Åであった。動画をｃｉｓＴＥＭにインポートし、線量フィルタリングによりアラインメントし、ＣＴＦパラメーターを決定した。次に、ｃｉｓＴＥＭ内で、合計５２，８７４個の粒子を自動的にピックアップした（特徴的な半径と最大半径：１３０Åと１４０Å）。ベクター導入遺伝子を封入する粒子と、パーセンテージの低い空のキャプシドの両方が、最終的な構造の決定に使用されたことに、本発明者らは注目している。ｃｉｓＴＥＭでは、Ａｂｉｎｉｔｉｏ３Ｄ再構築機能を使用して、すべての粒子から、アラインメントのための初期参照を作成した。この参照とすべての粒子をオートリファインを使用して反復的に精密化させ、ＦＳＣ＿ｐａｒｔのカットオフ０．１４３から決定した２．９５Å分解能のマップを得た。手動モードでの１回の粒子ごとのＣＴＦ精密化によって、マップの分解能が２．６２Åまで改善された。最後に、１回のビームチルト精密化（beam tilt refinement）と再構築により、マップの分解能が２．４６Åまで改善された。３Ｄ分類ではマップは改善されなかった。最終的なマップは、ＰＨＥＮＩＸのオートシャープ化機能を使用して、Ｂファクター－３２．９２Å２を適用することによって、Ｂファクターでシャープ化された。

ＡＡＶ２（ＰＤＢＩＤ：１ＬＰ３）のｃｒｙｏ－ＥＭ構造を、構造精密化のための出発モデルとして使用した。ＰｙＭＯＬ（ＴｈｅＰｙＭＯＬＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒａｐｈｉｃｓＳｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．）を使用して、バリアントの残基をモデル化した。６０コピーのＶＰ３を含有する、得られたＡＡＶｖ６６モデルを、ｃｒｙｏ－ＥＭマップに対してＰＨＥＮＩＸ５９を使用して精密化した。ＰＨＥＮＩＸの実空間でシミュレートしたアニーリングとＢファクターによる精密化により、立体化学的に最適なモデルが得られた。精密化の結果を表２にまとめる。このモデルを検査し、ＰｙＭＯＬを使用して図を作成した。

ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳシステム（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して、ゼータ電位分析のために、ベクターを約１．０Ｅ９ｖｇ／ｍＬの濃度に希釈した。５００μＬの試料をユニバーサルディップセル（Ｍａｌｖｅｒｎ）に添加した。測定前に、システムを２分間安定化させた。各試料について３回の測定値を記録した。

免疫学的研究
１．０Ｅ１１ｖｇ／マウスのｓｃＡＡＶ－ＣＢ６－ＥｇｆｐをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの左／右の前脛骨筋に筋肉内投与した。４週間後に、ｓｓＡＡＶｖ６６－ＣＢ６－ｈＡ１ＡＴまたはｓｓＡＡＶ２－ＣＢ６－ｈＡ１ＡＴを１．０Ｅ１１ｖｇ／マウスで対側の肢に送達させた。４、５、６、７、および８週目に、顔面静脈放血により血清を採取し、ＥＬＩＳＡによって中和抗体力価およびＡ１ＡＴレベルを評価した。

Ｈｕｈ－７．５（５．０Ｅ４個の細胞／ウェル）を、形質導入の２４時間前に、３７℃で、９６ウェルプレートに播種した。次いで、Ａｄヘルパーウイルスを、１００：１の感染多重度（ＭＯＩ）で細胞単層に添加し、少なくとも１時間インキュベートした。血清とｓｓＡＡＶ２－ＬａｃＺまたはｓｓＡＡＶｖ６６－ＬａｃＺとの混合溶液の連続希釈物を、Ｖ底９６ウェルプレート中に調製し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、血清－ＡＡＶ混合溶液を細胞に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を溶解させ、Ｇａｌａｃｔｏ－ＳｔａｒＯｎｅ－ＳｔｅｐＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ベータ－ガラクトシダーゼ基質で処理した。ルミネセンスシグナルを、ＳｙｎｅｒｇｙＨＴマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で検出した。

Ａ１ＡＴＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレートを、抗Ａ１ＡＴ抗体で４℃にて一晩、最初にコーティングし、ウェルを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ緩衝液中１％の無脂肪乳と０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０）を用いて室温で１時間インキュベートした。１／２０、１／２００および１／２，０００血清希釈を、陽性対照（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５ｎｇ／ｍＬのＡ１ＡＴ）と一緒に、９６ウェルプレート中の試料緩衝液（ＰＢＳ緩衝液中０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０）を使用して実施した。プレートを３回洗浄した後、血清を各ウェル中に添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを３回洗浄し、ヤギ抗トリプシン－ＨＲＰ抗体（試料緩衝液中１：５，５００希釈）と共に２時間インキュベートした。基質と反応させる前に、プレートを６回洗浄し、残留タンパク質をすべて除去した。最後に、ＡＢＴＳ基質をウェル中に添加し、ＳｙｎｅｒｇｙＨＴマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）でシグナルを読み取った。

ロングリードシーケンシングによるヒト組織試料中の新規ＡＡＶバリアントの同定
ヒト組織からの新規全長キャプシド配列を同定するために、キャプシドのオープンリーディングフレーム全体にわたる長いＤＮＡリードを得るために、ＳＭＲＴシーケンシングを実施した（図１Ａ）。この方法は、ショートリードシーケンシングアプローチで必要とされる配列アセンブリーを必要とせずに、長いＤＮＡ断片の配列を解明することができる。このようにして、点変異と組換え事象の両方によって規定されるキャプシドの多様性を、キャプシドＯＲＦ全体にわたる個々のインタクト分子で評価することができる。ＡＡＶの多様性を調査するために、約８００のヒトの外科手術試料から単一の組織を選択した。既知の血清型にわたり保存された配列においてキャプシドＯＲＦに隣接するプライマーを使用して、ＳＭＲＴシーケンシング分析のための標的ＰＣＲアンプリコンを生成した。単一の組織から同定した全配列の約４５％を構成する１つのキャプシド配列を単離した（図１Ｂ）。この優勢なキャプシドは、「バリアント６６」（ＡＡＶｖ６６）と名付けられ、ＡＡＶ２に最も近い相同性を呈する（９８％の配列類似性；図１Ｃ～１Ｄ）。ＡＡＶｖ６６は、ＡＡＶ２とは異なる１３個のアミノ酸残基を含有することが観察され（図１Ｃおよび図８）：ＶＰ１ｕ領域内に１個（Ｋ３９Ｑ）、ＶＰ２ドメイン内に１個（Ｖ１５１Ａ）、およびＶＰ３内に１１個（Ｒ４４７Ｋ、Ｔ４５０Ａ、Ｑ４５７Ｍ、Ｓ４９２Ａ、Ｅ４９９Ｄ、Ｆ５３３Ｙ、Ｇ５４６Ｄ、Ｅ５４８Ｇ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８ＴおよびＡ５９３Ｔ）であった。注目すべきは、ＶＰ３内の固有のアミノ酸残基はすべて、可変領域ＶＲ－ＩＶからＶＲ－ＶＩＩＩ内またはその近傍に存在する。

ＡＡＶｖ６６のＶＰ３領域を、他の現代のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ９）のものと比較した。最も顕著な差異は、ＡＡＶ血清型間で高度に保存されている４つの位置（４９９、５３３、５８５、および５８８）で生じる（図８）。４９９位では、ほとんどの血清型はアスパラギンを保有しているが、ＡＡＶｖ６６、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、およびＡＡＶ９は、負に荷電したアスパラギン酸またはグルタミン酸を有する。５３３位の高度に保存されたフェニルアラニンは、ＡＡＶｖ６６ではチロシンである（また、ＡＡＶ５におけるＴ５３３）。最後に、５８５位と５８８２３位でヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）と結合するＡＡＶ２の能力を規定する正に荷電したアルギニン残基を保有するＡＡＶ２とは異なり、ＡＡＶｖ６６は、Ｓ５８５とＴ５８８を含有する（ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ６と同一）。

ＡＡＶｖ６６ベクターの生成と細胞感染力はＡＡＶ２のものとは異なる
ＡＡＶ２のヘパリンに対する強い親和性とその結果として生じる強い細胞表面との会合は、ウイルスの比較的低いパッケージング力価につながると提唱されている。ＡＡＶ２による制限されたベクター収率は、生産中のベクター粒子によるパッケージング細胞の非生産的な結合と再感染に起因すると考えられている。ＡＡＶｖ６６のベクター生産および細胞感染力を、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３ｂのものと比較した。注目すべきは、ＡＡＶ３ｂは、ＡＡＶ２に最も近い別個の同類（８９％の配列類似性）であるが、３回転突出部の異なる静電表面電荷を使用してヘパリンと弱く結合する。ＡＡＶ３ｂとＡＡＶ２の間のこの差異は、おそらくＨＥＫ産生細胞の形質導入によって生じるＡＡＶ３ｂのパッケージング力価の増加を説明するものである。

ＡＡＶｖ６６のパッケージングプロファイルを、細胞溶解物中のキャプシド形成されたベクターゲノムの収率を測定することによって、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３ｂのものと比較した。この目的のために、ＡＡＶｖ６６キャプシドのＯＲＦを合成し、ＡＡＶ２ｐ５プロモーターの下でＡＡＶ２Ｒｅｐを発現するトランスプラスミド（ｐＡＡＶ２／ｖ６６）中にクローニングした。ＡＡＶｖ６６、ＡＡＶ２、およびＡＡＶ３ｂの小規模ベクター調製物を使用して、遍在性ニワトリ－ベータアクチンプロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼ導入遺伝子からなる一本鎖ベクター（ＡＡＶ－ＣＢ６－Ｆｌｕｃ）をパッケージングした。粗溶解物ｑＰＣＲ２９によるウイルスベクター収率の定量化により、ＡＡＶｖ６６ベクターのキャプシド形成された、ＤＮａｓｅ耐性ゲノムの収率は、ＡＡＶ２の収率よりも約２．４倍高く、ＡＡＶ３ｂの収率よりも約３０％高いことが明らかになった（図９、「組合せ」の試料）。

粗溶解物中のＡＡＶｖ６６の高い存在量がパッケージング細胞への粒子の非生産的結合によるものかどうかは、細胞溶解物画分ではなく培地中のＡＡＶｖ６６粒子の優勢によって顕在化され、次にこのことを調査した。ＰＣＲ分析により、培地内のＡＡＶｖ６６のキャプシド形成されたゲノムは、細胞溶解物よりも約３倍豊富であることが明らかとなった（図９）。対照的に、パッケージング細胞の培地中では、ＡＡＶ２粒子はほとんど検出されなかった。より多くのＤＮａｓｅ耐性ゲノムを生成するＡＡＶｖ６６の能力が、ＨＳＰＧ結合が乏しいことに起因して、パッケージング細胞の再感染力を弱めることに関連するかどうかを試験するために、ヘパリン競合アッセイを実施した（図１０）。この目的のために、再びＣＢ６－Ｆｌｕｃをパッケージングする大規模なＡＡＶｖ６６およびＡＡＶ２ベクターを、標準的な塩化セシウム精製プロトコールを使用して生成した。ＡＡＶｖ６６の形質導入は、ヘパリンの存在に影響されないが、一方、１．２５μｇ／ウェルのヘパリンは、ＡＡＶ２の形質導入を５０％遮断し、５μｇ／ウェルのヘパリンは形質導入を完全に消失させた。これらの結果は、ＡＡＶｖ６６の改善された生産効率が、少なくとも部分的に、乏しいヘパリン結合に起因することを示す。

ＡＡＶｖ６６のヘパリンに対する低い親和性が、ＡＡＶ２と比較して低下した細胞形質導入と一致するかどうかを決定するために、精製したＡＡＶｖ６６、ＡＡＶ２、およびＡＡＶ３ｂベクターを使用して、ＨＥＫ２９３細胞を感染させた。データは、ＡＡＶ２が、ＡＡＶｖ６６（約６５倍）およびＡＡＶ３ｂ（約７．５倍）よりも高い形質導入を呈することを示す（図１１）。ベクター化されたＡＡＶｖ６６プロウイルスキャプシド配列は、ｉｎｖｉｔｒｏで効率的に細胞を形質導入することができるが、そのベクター生成および細胞感染力の特性は、その最も近い血清型近縁種であるＡＡＶ２とは別個である。

ＡＡＶｖ６６は、ＡＡＶ２のものとは別個であるＣＮＳ形質導入を呈する
ＡＡＶｖ６６を、異なる投与経路を介して選択した標的組織に形質転換するその能力について試験した。この目的のために、ＡＡＶｖ６６の生体内分布を、複数の送達経路を介してマウスにおいて評価した（図１２Ａ～１３Ｄ）。試験したすべての経路の中で、最も顕著なのは、中枢神経系（ＣＮＳ）の標的細胞への頭蓋内送達後のＡＡＶｖ６６の形質導入プロファイルであった（図２Ａ～２Ｄ）。ＡＡＶｖ６６が、ＡＡＶ２のものと比較して、ＣＮＳにおいて増加した向性を有するかどうかを決定するために、遍在性ニワトリ－ベータアクチンプロモーターによって駆動されるＥｇｆｐ導入遺伝子を、ＡＡＶｖ６６およびＡＡＶ２キャプシドにパッケージングした。ベクターを、３．６Ｅ９ｖｇ／動物の用量で海馬の右半球に片側注射した。注射の４週間後に、処理した脳の凍結切片は、ＡＡＶ２が注射部位に局在化したままである傾向があった一方で、ＡＡＶｖ６６が、組織全体にわたる強化された拡散によって実証されるように、ＡＡＶ２よりも約１３倍多いＣＮＳの細胞に形質導入したことを示した（図２Ａ～２Ｂ）。注射部位に対して対側領域の高倍率画像化は、脳のすべての解剖下領域（アンモン角［ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、およびＣＡ４］、歯状回、および脳梁、図２Ｃ）が、検出可能なレベルのＥＧＦＰ発現を呈することを示し（図２Ｄ）、ＡＡＶｖ６６が海馬半球全体に効率的に広がる可能性があることを示す。

ＡＡＶｖ６６によって形質導入される特定の細胞型について調査した。抗体染色を、細胞型特異的マーカー；抗ＮＥＵＮ（ニューロン）、抗ＧＦＡＰ（星状細胞）、抗ＩＢＡ１（ミクログリア）、および抗ＯＬＩＧ２（乏突起膠細胞）を用いて実施した（図３Ａ、３Ｅ、３Ｉ、および３Ｍ）。解剖下のＣＮＳ領域の３Ｄ－ボリューム再構築は、ＥＧＦＰ発現が調査した各細胞型と共局在化したことを実証する（図３Ｂ、図３Ｊ、図３Ｆ、図３Ｎ）。ニューロンは、皮質およびＣＡ１領域に見られる優勢な細胞型であった（図３Ｃ）。興味深いことに、ＣＡ２～４の領域と歯状回が最も高い形質導入を呈した（約２０～４０％）。星状細胞とミクログリアは、同様の分布パターンを共有し、歯状回で最も高い濃縮を示した（図３Ｇおよび図３Ｋ）。星状細胞は、すべての領域にわたっておよそ１～７％の形質導入を示したが（図３Ｈ）、ミクログリアは、わずかに高い形質導入効率（２～１２％）を呈した（図３Ｌ）。乏突起膠細胞は、脳梁において濃縮され（図３Ｏ）、すべての領域にわたってＡＡＶｖ６６によりおよそ１～７％の形質導入を有した（図３Ｐ）。これらのデータは、ＡＡＶｖ６６が、海馬内注射後にＣＮＳのすべての主要な細胞型を形質転換し得ることを示す。

ＡＡＶｖ６６はＡＡＶ２とは血清学的に別個である
ＡＡＶの宿主免疫系による中和は、ＡＡＶベクターの形質導入効率を制限する主な要因である。治療用ベクターにおいてキャプシドとして使用されるＡＡＶ血清型に対する既存の抗体を保有する個体は、有害効果および効果のない処置のリスクが高まる。さらに、ＡＡＶ遺伝子治療の反復投与が必要な患者は、形質導入効率がより乏しくなり、免疫反応が強くなり、代替ベクターが必要となるリスクを有する。

ＡＡＶｖ６６の形質導入が、ＡＡＶ２による事前免疫化によって遮断され得るかどうかという疑問について調査した。循環中の既存の抗ＡＡＶ２抗体を作成するために、ＡＡＶ２－Ｅｇｆｐベクター（１Ｅ１１ｖｇ／マウス）をマウスに筋肉内送達させた。４週間後に血清を採取し、ｉｎｖｉｔｒｏで中和抗体（ＮＡｂ）力価を評価した（図１３Ａ～１３Ｄおよび図１４Ａ～１４Ｂ）。Ｈｕｈ－７．５細胞においてＡＡＶ２感染の５０％中和（ＮＡｂ５０）を達成するために低いＮＡｂ力価が必要とされ（１／１，２８０～１／２，５６０）、ＡＡＶ２事前免疫化から生じた抗体がＡＡＶ２形質導入を阻害するのに十分であることが示された。対照的に、ＡＡＶ２で処置したマウスの血清によるＡＡＶｖ６６感染に関するＮＡｂ５０は１／２０～１／４０であり、ＡＡＶｖ６６は、ＡＡＶ２に対して生じたＮＡｂの存在にもかかわらず、細胞に感染できることを示した。

ｉｎｖｉｖｏで分泌された治療用導入遺伝子の産物に関するこれらの知見を試験するために、本発明者らは、ＡＡＶ２で免疫化したマウスに、アルファ－１抗トリプシン導入遺伝子をパッケージングしたＡＡＶ２またはＡＡＶｖ６６（ＡＡＶ２－Ａ１ＡＴまたはＡＡＶｖ６６－Ａ１ＡＴ）を再投与した。血清を５、６、７、および８週目に採取し、分泌されたＡ１ＡＴレベルをＥＬＩＳＡ３１で定量化した（図１４Ｃ）。低いＡ１ＡＴ発現は、第１のベクター投与から生じたＮＡｂが第２のベクター投与の形質導入を妨げていたことを示唆するであろう。「最大」Ａ１ＡＴ発現のベースラインを確立するために、ナイーブマウスも同じ様式で処置した。６および７週目に、ＡＡＶ２－Ｅｇｆｐおよび次いでＡＡＶｖ６６－Ａ１ＡＴで処置したマウスにおけるＡ１ＡＴ発現は、ナイーブマウスと比較して、約９０％のＡ１ＡＴ発現に達したが、ＡＡＶ２－Ａ１ＡＴを再投与したマウスは、ナイーブレベルの約４０％にしか達しなかった（図１４Ｃ）。これらの結果は、ＡＡＶ２キャプシドで事前免疫化したマウス由来の血清の存在下で、ＡＡＶｖ６６による堅固な感染力のｉｎｖｉｔｒｏでの観察と一致している。

また、広範なＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶｒｈ．８、およびＡＡＶｒｈ．１０）が、ＡＡＶｖ６６ベクターの形質導入を損ない得るかどうかを調査するために、事前免疫（ｐｒｅ－ｉｍｍｕｎｉｔｙ）も検査した。８種類の血清型で別々に事前免疫化したウサギの抗血清を、ＡＡＶｖ６６ベクターの中和についてスクリーニングした。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３ｂ、およびＡＡＶ－ＤＪが、ＡＡＶｖ６６と比較して、ＮＡｂ５０力価に約１桁の差を呈し、一方、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．８およびＡＡＶｒｈ．１０が２桁の差を呈し、ＡＡＶ９が３桁の差を有することが観察された（図１４Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＡＡＶｖ６６が、ＡＡＶ２および他のいくつかの現代のＡＡＶキャプシドと血清学的に異なることを示す。

ＡＡＶｖ６６キャプシドは一定範囲のｐＨにわたりＡＡＶ２よりも熱安定性が高い
キャプシドの効率的な形成および構造的安定性は、ウイルスベクターの生成、精製および保存に不可欠である。さらに、産生性感染が起こるためにはまた、ベクター粒子は侵入プロセスを通して安定性を維持し、ゲノムペイロードの送達が細胞の形質導入をもたらすことができる条件下でのみ脱殻しなければならない。ＡＡＶベクターは広く研究され、一定範囲の組織でそれらの強力な形質導入プロファイルを利用されているが、細胞内輸送、エンドソーム脱出、核へのキャプシドの輸送のプロセスは完全には理解されていない。キャプシドの動態に依存するＡＡＶの細胞内輸送および形質導入に影響を与える推定される細胞内チェックポイントのうち、エンドソーム脱出は最もよく理解されている。このプロセスは、ｐＨに依存したキャプシドの構造変化によって誘発されると考えられている。エンドソーム内腔の酸性化によって、ＶＰ１ドメインのコンフォメーション変化およびＶＰ１内のＰＬＡ２ドメインの露出がもたらされ、これがエンドソーム区画からの脱出を誘発する。原則として、細胞内輸送を通して安定性を保持することができるベクターキャプシドが望ましく、高い形質導入能を呈し得る。

ＡＡＶｖ６６キャプシドの全体的な安定性を決定するために、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）分析を使用して、一定範囲の生理学的ｐＨ（ｐＨ７～ｐＨ４）にわたってＡＡＶｖ６６キャプシドの熱安定性を測定した（図４）。この範囲には、後期エンドソームとリソソームの内腔で観察されるｐＨ４．５が含まれる。このアッセイでは、ベクター粒子を、タンパク質の疎水性残基と結合して蛍光を発するＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅ色素に懸濁させる。よって、蛍光シグナルのピークは、タンパク質のアンフォールディングの際に露出する最大限に結合した疎水性領域の間接的な読み出しとなる。ＡＡＶｖ６６の融解温度（最大傾斜値［Ｄｓｉｇｎａｌ／Ｄｔｅｍｐ］、Ｔｍ）は、試験したすべてのｐＨ条件にわたり、ＡＡＶ２に関するものよりも５度を超えて高い。最も極端な差異はｐＨ７で観察され、ＡＡＶｖ６６のＴｍ（７５．２９±０．３４℃）は、ＡＡＶ２のＴｍ（６５．８５±０．１８℃）よりもほぼ１０度高い（図４Ａ）。よって、ＡＡＶｖ６６キャプシドは、ＡＡＶ２よりも熱的に安定であり、ｐＨに対して耐性がある。

ＡＡＶｖ６６キャプシドの安定性がベクターゲノム放出に及ぼす影響について調査した。温度範囲の関数としてのベクターゲノム放出の測定を、核小体環境によって発揮される圧力によって駆動されるＤＮＡ排出に関するプロキシとして使用した。ＡＡＶｖ６６のゲノム放出の温度依存性を、異なるｐＨの下でＡＡＶ２のものと比較した。この目的のために、ＤＮＡと結合すると蛍光を発するＳＹＢＲＧｏｌｄ染料によるＤＳＦ分析を用いた。蛍光ピークは、キャプシド形成されたゲノムの色素溶液への最大アクセシビリティの間接的尺度である。ｐＨ７でのベクターゲノムの放出は、キャプシド安定性に付随して観察され、ＡＡＶ２では約６５℃、ＡＡＶｖ６６では約７４℃にシグナルのピークを示した。しかし、より低いｐＨでは、色素にアクセス可能なＤＮＡのピーク蛍光は、アンフォールドしたキャプシドタンパク質のピーク蛍光よりも低い温度で検出された（図４Ｂ）。さらに、ＡＡＶｖ６６に対するＤＮＡのアクセシビリティは、ＡＡＶ２に対するものよりも明らかであり、ＡＡＶ２に対するｐＨ５および４でのＤＮＡのアクセシビリティのピークは、それぞれ約５３℃および約４２℃で生じ；ＡＡＶｖ６６は、２５℃でピークシグナルを呈した。この驚くべき観察は、ＡＡＶｖ６６キャプシドのＤＮＡが、室温でも低いｐＨ（４～５）で特にアクセス可能であることを示す。

次いで、ＡＡＶｖ６６特異的アミノ酸残基が、ＡＡＶｖ６６とＡＡＶ２の間で観察される構造的および機能的差異に寄与しているかどうかという疑問について調査した。１３個のＡＡＶｖ６６を規定するアミノ酸残基をＡＡＶ２のものに変異させ、ＨＥＫ２９３細胞での産生中のベクターゲノムのパッケージングへのそれらの影響を試験した（図４Ｃ）。さらに、熱キャプシド安定性およびベクターゲノム放出を、変異体のキャプシドについて評価した（図４Ｄおよび図４Ｅ）。４つの変異（Ａ１５１Ｖ、Ｋ４４７Ｒ、Ｙ５３３Ｆ、およびＳ５８５Ｒ）を除くすべては、ＡＡＶ２のものと同様であるかまたはそれよりも低い、より低い収率のＤＮａｓｅ耐性ゲノムをもたらした（図４Ｃ）。驚くべきことに、電荷の変化に関与しない比較的保存的な変異Ｄ４９９Ｅは、パッケージング収率をＡＡＶ２収率の約５％まで低下させた。Ｄ４９９Ｅが、Ｓ５８５ＲおよびＳ５８５Ｒ／Ｔ５８８Ｒ二重変異と一緒に、Ｔｍをそれぞれ、５．９℃、３．８℃、および５．４℃低下させるため、改変はキャプシド安定性にも影響を及ぼしたが（図４Ｄ）、一方、他の変異はＴｍに１～２℃しか影響を及ぼさなかった。同じアミノ酸変異のベクターゲノムアクセシビリティは、低下したピークシグナル温度を呈するが、他の変異はほとんどまたは全く変化をもたらさなかった（図４Ｅ）。注目すべきは、精製したベクターの全体的力価に劇的には影響を与えなかったことである（表３）。よって、ＡＡＶｖ６６のパッケージング収率は、キャプシドの安定性に部分的にしか依存せず、ゲノム放出を促進するには、部分的なキャプシドの不安定化で十分であり得ることが示唆される。残基Ｄ４９９のみがパッケージングとキャプシド安定性の両方に劇的に影響を及ぼす。

ＡＡＶｖ６６とＡＡＶ２の間のキャプシドの差異についてのｃｒｙｏ－ＥＭ構造分析
ＡＡＶｖ６６の構造特性を特徴付けるために、ＡＡＶ２ｖ６６－Ｅｇｆｐベクターをｃｒｙｏ－ＥＭ分析用に精製した。５２，８７４個の粒子画像を得て、２．５Åの分解能のｃｒｙｏ－ＥＭマップを得て（図５Ｅおよび図１６）、最適な実空間フィットおよび立体化学パラメーターを有する構造モデルを得た（表２）。全体として、ＡＡＶｖ６６の構造はＡＡＶ２に類似している（原子座標の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）＝０．４５６Å）（図１６）。よって、ＡＡＶｖ６６は、２回転軸の窪み、３回転突出部によって規定される３回対称、およびＲｅｐ結合のための界面と孔を形成する５つのモノマーから構成される５回転の孔を含むＡＡＶキャプシドの特徴的特性を呈する（図５Ａ）。注目すべきは、ＶＰ１ｕドメインおよびＶＰ２ドメインはそれぞれ、各粒子についてＶＰ３ドメインのおよそ１２分の１で表され、以前の他のＡＡＶ構造と同様に、本発明者らの対称化したｃｒｙｏ－ＥＭマップでは解明されなかったことである。したがって、１３個のＡＡＶｖ６６を規定する残基のうちの１１個を含む残基２１９～７３６のみが、ｃｒｙｏ－ＥＭマップ内で決定的に解明される（図５Ｂ）。

ＡＡＶｖ６６の構造をＡＡＶ２の構造と比較することにより、ＤＮＡパッケージングおよび／またはキャプシド安定性の改善に寄与し得るいくつかの構造上の差異が明らかになる。重要な差異は、３回転軸周辺の突出部のＶＰ３のモノマー間の界面に生じる。より長いグルタミン酸残基への変異がベクターゲノムパッケージングにおける劇的な欠陥をもたらした（図４Ｃ）Ｄ４９９は、Ｓ５０１と静電相互作用および／または水素結合を形成する（図５Ｄ）。この領域は、隣接するＶＰ３モノマーに対して密に充填されている（図５Ｄ）。ここで、Ｄ４９９およびＳ５０１の骨格原子は、それぞれ対称性に関連するＮ４４９およびＴ４４８の側鎖と相互作用し、一方、Ｓ５０１のヒドロキシル基は、対称性に関連するＳ４４６の骨格カルボニルと水素結合する。したがって、Ｄ４９９変異の強い影響は、おそらくＶＰ３モノマー間の界面の崩壊に起因し、キャプシドの不安定化をもたらす。同じ領域では、隣接するモノマーの残基Ｋ４４７およびＡ４５０は、対応するＡＡＶ２－Ｒ４４７およびＴ４５０側鎖間の静電的相互作用の可能性を排除する（図６Ｄ）。アミノ酸Ｍ４５７は、可変領域ＩＶにおけるＡＡＶｖ６６の３回転突出部に位置し、側鎖は溶媒に対して平衡を保っている（図６Ｅ）。興味深いことに、このメチオニンは、他の血清型の間で固有の特徴であり（図８）、細胞受容体、宿主因子、または抗体との固有のキャプシド相互作用の可能性を示唆している。ＡＡＶｖ６６－Ｙ５３３（ＡＡＶ２－Ｆ５３３）の極性ヒドロキシル基は、おそらくＲ４８７とＫ５３２の側鎖間の極性環境を安定化させ、対称性に関連するモノマーのＬ５８３との相互作用に寄与する可能性がある（図６Ａ）。ＡＡＶｖ６６－Ｄ５４６およびＧ５４８は、ＡＡＶ２－Ｇ５４６およびＥ５４８によって付与された表面電荷を再分配し（図６Ｂ）、ＡＡＶｖ６６を規定するさらに別の特徴である。

ＡＡＶ２の重要な機能的領域は、５８５位と５８８位の正に荷電したアルギニン残基を含む。これらの残基は、３回転突出部の表面にあり、多くの細胞型における付着と侵入に不可欠なＨＳＰＧ受容体とキャプシドの相互作用を支配する。対照的に、ＡＡＶｖ６６キャプシドのＳ５８５およびＴ５８８は、ＡＡＶ３ｂのＳ５８６およびＴ５８９（図８）に類似する中性荷電極性残基（図５Ｄおよび図６）である。ＡＡＶ３ｂのＨＳＰＧとの物理的および機能的な相互作用は、残基Ｒ４４７およびＲ５９４（ＡＡＶ２におけるＲ４４７およびＡ５９３）７によって与えられる静電相互作用に依存するが、ＡＡＶｖ６６はこれらのアルギニン残基も欠く（Ｋ４４７およびＴ５９３）。ＡＡＶ２およびＡＡＶ３ｂとのこれらの差異は、ＡＡＶｖ６６がヘパリン結合を欠くという本発明者らの発見と一致して、ＡＡＶクレードＢおよびＣキャプシドによって通常利用される標準的な細胞表面受容体と異なって会合することを示唆する。

ＡＡＶ２およびＡＡＶｖ６６は表面電荷の差異を示す
ウイルスの静電特性は、キャプシド－受容体相互作用７，４３に重要であるため、ＡＡＶ２と関連するＡＡＶｖ６６キャプシドの正電荷の正味の喪失が、キャプシドの静電特性にどのように影響を及ぼすのかを調査した。最初に、ＡＡＶ２およびＡＡＶｖ６６の構造に関して計算した静電ポテンシャルの値を比較した（図７Ａ）。ＡＡＶｖ６６の表面の静電ポテンシャルの分布は、ＡＡＶ２のものと異なる。最も顕著な差異は、３回転突出部におけるものであり、ＡＡＶ２のＲ５８５とＲ５８８によって付与される正電荷が、ＡＡＶｖ６６のＳ５８５とＴ５８８によって劇的に低下している（図７Ｂ）。

次いで、ＡＡＶｖ６６の明確な構造および表面静電学が、キャプシドの電荷依存性粒子移動（ゼータ電位）に影響を及ぼすかどうかを調査した（図７Ｃ）。ＡＡＶｖ６６のゼータ電位（－１０ｍＶ）は、ＡＡＶ２のもの（－３．５ｍＶ）と著しく異なり、キャプシド間の静電電位の差異と一致する。個々の置換の寄与を試験するために、残基をＡＡＶ２の対応する残基に変換する単一アミノ酸置換を保有するＡＡＶｖ６６の粒子移動を測定した（図７Ｃ）。単一の変異Ｓ５８５ＲおよびＴ５８８Ｒは、ゼータ電位の最も劇的な変化をもたらし（それぞれ約３ｍＶだけ）、ゼータ電位をＡＡＶ２のものに近付けた（図７Ｃ）。これらの観察により、ＡＡＶｖ６６の静電特性がＡＡＶ２のものと異なり、その差異は主に５８５位と５８８位の置換に起因することが示される。よって、キャプシドＡＡＶｖ６６の、受容体、抗体および他のタンパク質との相互作用は、おそらく他の近縁のキャプシドのものと実質的に異なる。

Claims

導入遺伝子を対象の標的細胞に送達するための方法であって、
（ｉ）目的の１つまたは複数の遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む単離された核酸；および
（ｉｉ）配列番号１に示される配列を有するアデノ随伴酸（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質
を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を前記対象に頭蓋内投与するステップを含む、方法。
前記頭蓋内投与が、海馬内注射を含む、請求項１に記載の方法。
前記標的細胞が、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞である、請求項１または２に記載の方法。
前記ＣＮＳ細胞が、ニューロン、乏突起膠細胞、星状細胞、またはミクログリア細胞である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が哺乳動物であり、必要に応じて前記哺乳動物がヒトである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、抗ＡＡＶ２抗体の産生によって特徴付けられる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
前記ｒＡＡＶの投与後に、前記対象が、前記ｒＡＡＶに対する中和免疫応答を誘発しない、請求項６に記載の方法。
前記単離された核酸が、前記導入遺伝子に隣接するＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の遺伝子産物をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結している、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、タンパク質または阻害性核酸を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
導入遺伝子を対象の標的細胞に送達するための方法であって、
（ｉ）目的の１つまたは複数の遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む単離された核酸；および
（ｉｉ）配列番号１に示される配列を有するアデノ随伴酸（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質
を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を前記対象に静脈内投与するステップを含み、
前記投与の結果、前記ｒＡＡＶが前記対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する、方法。
前記標的細胞が、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞である、請求項１１に記載の方法。
前記ＣＮＳ細胞が、ニューロン、乏突起膠細胞、星状細胞、またはミクログリア細胞である、請求項１２に記載の方法。
前記投与の結果、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶの投与に比べて、肝臓細胞の形質導入が低下する、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が哺乳動物であり、必要に応じて前記哺乳動物がヒトである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、抗ＡＡＶ２抗体の産生によって特徴付けられる、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の方法。
前記ｒＡＡＶの投与後に、前記対象が、前記ｒＡＡＶに対する中和免疫応答を誘発しない、請求項１６に記載の方法。
前記単離された核酸が、前記導入遺伝子に隣接するＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の遺伝子産物をコードする核酸配列が、プロモーターに作動可能に連結している、請求項１１から１８のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の遺伝子産物が、タンパク質または阻害性核酸を含む、請求項１１から１９のいずれか一項に記載の方法。