JP2023524602A - Ｔ細胞抗原受容体、その多量体複合体、並びにその製造方法及び使用 - Google Patents
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Abstract
抗体又はその抗原結合断片、Ｔ細胞抗原受容体、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を発現させる免疫細胞、並びにその製造方法及び使用を提供する。前記ＴＣＲは対応するｐＭＨＣ複合体を特異的に認識し、ＴＣＲ Ｔ細胞を活性化し、さらに高レベルの細胞因子ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＴＮＦαを産生し、標的細胞を顕著に殺傷して担がんマウスの寿命を延ばすことができる。【選択図】図２２
Description
本発明は生物医薬の技術分野に関し、具体的には、抗体又はその抗原結合断片、Ｔ細胞抗原受容体、多量体複合体、並びにその製造方法及び使用に関する。
ＥＢウイルス（EBV：Epstein-Barr virus）はEpsteinとBarrにより１９６４年にバーキットリンパ腫（BL：Burkitt’s lymphoma）のサンプルから単離されたγヘルペスウイルスで、初めて認められた腫瘍ウイルスである。ＥＢＶの原発感染症は主にヒトの口腔咽頭部の上皮細胞で発生し、その後にその顕著なＢリンパ球親和性の特性のためにＢ細胞に感染でき、メモリーＢ細胞に長期に潜伏して存在し、感染者は一生キャリアとなり、このため、成人血清中のウイルス抗体の陽性率は９０％を超えている。ＥＢＶ感染は免疫機能が正常なほとんどの人にとって大きな脅威にはならないが、先天性又は後天性免疫不全の人にはＥＢＶは生命に危険を及ぼす様々な疾患を引き起こすことがある。さらに、ＥＢＶ潜伏感染により発現したタンパク質（６核タンパク質ＥＢＮＡ１、２、３Ａ、３Ｂ及び３Ｃ、ＥＢＮＡ－ＬＰと３つの潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、ＬＭＰ２Ｂ）は細胞増殖と転化を刺激でき、ＥＢＶ関連移植後リンパ球増殖性疾患(EBV-PTLD：EBV related post-transplant lymphoproliferative diseases)、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫（HL：Hodgkin’s lymphoma）、鼻咽頭がん（NPC：Nasopharyngeal carcinoma）、胃がん（Gastric cancer）など、さまざまな悪性腫瘍の発生、進展、臨床予後との直接的な関連性が確認されている。これらの疾患における潜伏期タンパク質の発現の違いに基づいて、ＥＢＶの潜伏型はＩ、ＩＩ、ＩＩＩ期に分類する。現在、ＥＢウイルスを標的とした抗ウイルス治療は、薬剤耐性や深刻な副作用などの問題から、多くのＥＢＶ関連疾患を効果的にコントロールすることができない。
Ｐａｐａｄｏｐｏｕｎｄｓらは、健常なＥＢＶキャリアのリンパ球を輸注するとＰＴＬＤ患者を治癒できることを始めて発見し、その後、臨床的には自己ＥＢＶ－ＣＴＬｓ細胞療法が開発された。現在、ＥＢＶ－ＣＴＬｓはＥＢＶ関連リンパ腫と鼻咽頭がんにおいて臨床応用が展開されており、その人体内の安全性が良好で、一定の治療効果があることが発見されたが、インビトロで培養されたＣＴＬｓの多くの不足もその臨床治療効果を制限した。まず、ＣＴＬｓ中の腫瘍関連ＥＢＶ抗原の特異的Ｔ細胞の数が少ない（＜０．０５％）ため、一般的に大投与量（１０１０超）の数回の再輸注（４～６回）を行う必要があり、次に、製造期間が長いため治療までの待ち時間を長くし、それに伴うＴ細胞分化サブセットの変化はさらにその生体内機能を弱め、さらに、製造した細胞は人によって異なるため、治療効果を保証することは難しい。そのため、より特異性で、インビボの腫瘍に対する殺傷能力がより高く、より持続的なＥＢＶ抗原を標的とした、ＥＢＶ関連の鼻咽頭がんやリンパ腫の治療用の細胞免疫療法の開発が急務である。
Ｔ細胞は獲得免疫系の重要な構成要素であり、病原体、自己病変細胞や腫瘍の除去を媒介し、生体の恒常性を維持するための保護力である。Ｔ細胞受容体（TCR:T cell receptor）はＴ細胞のアイデンティティーであり、ＴＣＲは標的細胞の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）及び提示された抗原複合体の認識により、Ｔ細胞の活性化と一連の後発細胞シグナル伝達や他の生理的反応を引き起こし、これにより、抗原特異的なＴ細胞はその標的細胞に対して免疫効果を発揮する。ＴＣＲ－Ｔ細胞療法は腫瘍／ウイルス抗原ペプチドに対して高特異性、高親和性のＴ細胞受容体をクローニングした後、遺伝子導入技術により患者自身のＴ細胞に導入し、自己Ｔ細胞が腫瘍／ウイルスの抗原ポリペプチドを特異的に認識できるようにし、さらに腫瘍や病原体を除去する技術である。ＣＡＲ－Ｔと比較すると、ＴＣＲ－Ｔ療法はより広範な腫瘍抗原（細胞内タンパク質と膜タンパク質）を認識でき、より強化された殺傷作用を示すと同時に低いサイトカインストームを伴い、固形腫瘍の治療に大きな潜在力を持つ。現在、ＴＣＲ－Ｔ療法は肺がん、結腸がん、滑膜細胞肉腫などの様々な固形腫瘍の臨床試験で顕著な治療効果が観察されているが、主な標的の多くはＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＧＡ－Ａ３やＮＹ－ＥＳＯ－１などのような腫瘍関連抗原であるため、オフターゲット効果と毒性や副作用が発見された。ＥＢＶ感染関連悪性疾患に対しては、ＥＢＶ抗原は外来抗原として、強い免疫原性を持ち、かつ、オフターゲット効果が発生しにくく、理想的な潜在的標的である。
ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２Ａは、細胞の増殖、生存及び移動を促進し、上皮間質の転化を支援でき、全てのＩＩ型及びＩＩＩ型疾患／悪性腫瘍に発現するＥＢＶの主要遺伝子の１つである。文献報告によると、再輸注ＥＢＶ－ＣＴＬでは、ＬＭＰ２に特異的なＣＴＬ細胞の割合は臨床効果と密接に関連しており、これらの証拠は、ＬＭＰ２が鼻咽頭がんのようなＥＢＶ感染に関連するＩＩ／ＩＩＩ型疾患の治療の標的となり得ることを示唆している。例えば、特許ＣＮ１５２６０７２Ａは、ＥＢＶ腫瘍関連潜伏期膜タンパク質の細胞外ドメインの同定方法及びそれに反応する抗体試薬の選択方法を開示しており、また、ＥＢＶ ＬＭＰ２細胞外ドメインのアミノ酸配列を具体的に開示した。特許ＣＮ１２６９８０４Ａには多くのＥＢＶのＴ細胞ＣＴＬエピトープが開示されている。特許ＣＮ１０８２８９９５０Ａは、ヒトＨＬＡ提示ＥＢＶ ＬＭＰ２に特異的なＴ細胞受容体様抗体薬剤を開示し、ここで、前記Ｔ細胞受容体が認識する抗原ペプチドエピトープはＣＬＧＧＬＬＴＭＶである。特許ＷＯ２０１７０８５４７１は抗原ペプチドSSCSSCPLSKを特異的に認識するＴＣＲ配列を開示している。さらに、非特許文献Dual non-contiguous peptide occupancy of HLA class I evoke antiviral human CD8 T cell response and form neo-epitopes with self-antigens（Ziwei Xiaoら，Sci Rep，2017）はＨＬＡ－Ａ＊１１０１個体において、７／８の個体が同じＴＲＢＶ４－１断片をＳＳＣの主要な認識特異性として利用していることを開示している。特許ＣＮ１０９３０６００５ＡはＥＢウイルス特異的Ｔ細胞抗原受容体及びその使用を開示している。しかし、全ての従来技術では、本発明の前記ＴＣＲは開示されていない。
本発明は、ＬＭＰ２タンパク質のＨＬＡ－Ａ＊０２０１限制ペプチドＦＬＹＡＬＡＬＬＬ、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１限制ペプチドＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ、及びＨＬＡ－Ａ＊２４０２限制ペプチドＰＹＬＦＷＬＡＡＩ及びＴＹＧＰＶＦＭＳＬ／ＴＹＧＰＶＦＭＣＬが免疫原性の強い抗原エピトープであり、生体内で特異的Ｔリンパ球及び対応する免疫反応の産生を引き起こすことが可能であることを見出し、このため、本発明は、ＥＢＶ潜伏期タンパク質ＬＭＰ２ペプチド（配列ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ、ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ、ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ／ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ、ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫを含む）に特異的に結合し得る多くのＴ細胞抗原受容体及びＥＢＶ関連疾患を治療する医薬組成物の製造におけるその使用を提供する。本発明の前記ＴＣＲは対応するｐＭＨＣ複合体を特異的に認識し、ＴＣＲ Ｔ細胞を活性化し、さらに高レベルの細胞因子ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＴＮＦαを発生させ、標的細胞を顕著に殺傷して、担がんマウスの寿命を延ばすことができる。
具体的には、本発明の第１態様は、配列番号３５～１１７の１種又は２種以上の組み合わせから選ばれるＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を提供する。
好ましくは、前記ＣＤＲはＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及び／又はＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含む。
ここで、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるか、又は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるか、又は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるか、又は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
本発明の１つの特定実施形態では、前記ＣＤＲは以下のいずれか１群から選ばれる。
本発明の第２態様は、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α及び／又はＣＤＲ３αを含むＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２に結合するα鎖ポリペプチドを提供する。
ここで、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるか、又は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
好ましくは、前記α鎖ポリペプチドは以下のＣＤＲ１α～ＣＤＲ３αのいずれか１群を含む。
本発明の第３態様は、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及び／又はＣＤＲ３βを含むＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２に結合するβ鎖ポリペプチドを提供する。
ここで、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるか、又は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるか、又は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
本発明の１つの特定実施形態では、前記β鎖ポリペプチドは以下のＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βのいずれか１群を含む。
本発明の第４態様は、ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２に特異的に結合するＴ細胞抗原受容体を提供する。
好ましくは、結合エピトープは配列番号２９～３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含む。
さらに好ましくは、結合エピトープは配列番号２９、３０、３３又は３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含む。
さらに好ましくは、前記ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２は配列番号２７及び／又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含み、又は配列番号２７及び／又は配列番号２８とは少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
好ましくは、前記Ｔ細胞抗原受容体は主要組織適合性複合体分子（ＭＨＣ）の提示を通じて、ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２由来のペプチドに特異的に結合する。
好ましくは、前記Ｔ細胞抗原受容体は少なくとも１つのα鎖可変領域及び／又はβ鎖可変領域を含む。
好ましくは、前記Ｔ細胞抗原受容体はαβヘテロ二量体である。
好ましくは、前記Ｔ細胞抗原受容体はα鎖のＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及び／又はβ鎖のＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含む。ここで、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるか、又は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるか、又は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるか、又は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
好ましくは、前記ＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及びＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βはそれぞれ、配列番号３５、４５、５５、７４、８５及び９７；又は配列番号３５、４５、５６、７４、８５及び９８；又は配列番号３６、４６、５７、７５、８６及び９９；又は配列番号３７、４７、５８、７６、８７及び１００；又は配列番号３８、４８、５９、７４、８８及び１０１；又は配列番号３９、４９、６０、７７、８９及び１０２；又は配列番号３９、４９、６１、７７、８９及び１０３；又は配列番号４０、５０、６２、７８、９０及び１０４；又は配列番号３７、４７、６３、７９、９１及び１０５；又は配列番号３７、４７、６４、７４、８８及び１０６；又は配列番号４０、５０、６５、７８、９０及び１０７；又は配列番号３９、４９、６０、８０、９２及び１０８；又は配列番号３９、４９、６０、７７、８９及び１０９；又は配列番号３９、４９、６１、７７、８９及び１１０；又は配列番号４０、５０、６６、８１、９３及び１１１；又は配列番号４１、５１、６７、８２、９４及び１１２；又は配列番号３９、４９、６８、７７、８９及び１０２；又は配列番号４２、５２、６９、８３、９５及び１１３；又は配列番号４３、５３、７０、７６、８７及び１１４；又は配列番号４４、５４、７１、７４、８８及び１１５；又は配列番号３７、４７、７２、８４、９６及び１１６；又は配列番号４０、５０、７３、８２、９４及び１１７であってもよい。
本発明の１つの特定実施形態では、前記ＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及びＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βは以下のいずれか１群から選ばれる。
本発明の１つの特定実施形態では、前記Ｔ細胞抗原受容体のアミノ酸配列は配列番号５～２６のいずれか１つから選ばれるか、又は配列番号５～２６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
好ましくは、前記Ｔ細胞抗原受容体のα鎖とβ鎖はｌｉｎｋｅｒ配列を介して連結され、ｌｉｎｋｅｒ配列は好ましくはｆｕｒｉｎ－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａ配列（以下、略語ｆｐ２Ａ）である。
好ましくは、前記連結順序はα鎖、ｆｐ２Ａ、β鎖、又はβ鎖、ｆｐ２Ａ、α鎖であってもよい。
本発明の１つの特定実施形態では、前記連結順序はβ鎖、ｆｐ２Ａ、α鎖である。
好ましくは、前記Ｔ細胞抗原受容体はＭＨＣ又は多量体複合体の提示を通じて、ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２に特異的に結合する。ここで、前記多量体複合体は抗原ペプチドを含み、前記抗原ペプチドは配列番号２９～３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含む。好ましくは、前記多量体複合体は単量体、ビオチン分子、及びストレプトアビジン分子又はアビジン分子をさらに含み、前記単量体はＭＨＣ分子α鎖細胞外領域とβ２ｍ鎖を含み、前記単量体は前記ビオチン分子にカップリングされ、前記ビオチン分子は前記ストレプトアビジン又はアビジン分子に結合される。
本発明の第５態様は、ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
好ましくは、前記ＬＭＰ２の結合エピトープは配列番号２９～３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含む。
さらに好ましくは、前記ＬＭＰ２の結合エピトープは配列番号２９、３０、３３又は３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含む。
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体、二重抗体（ｄＡｂ）又は線状抗体のような断片をさらに含んでもよい。
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体ｓｃＦｖである。
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片はα鎖のＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及び／又はβ鎖のＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含む。本発明の１つの特定実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列は配列番号５～２６のいずれか１つから選ばれるか、又は配列番号５～２６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
本発明の第６態様は、上記の抗体又はその抗原結合断片、又は上記のＴ細胞抗原受容体、又は上記のＣＤＲ、又は上記のα鎖ポリペプチド、又は上記のβ鎖ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
本発明の１つの特定実施形態では、前記コード抗体又はその抗原結合断片、又はＴ細胞抗原受容体のヌクレオチド配列は配列番号１２２～１４３のいずれか１つから選ばれるか、又は配列番号１２２～１４３のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
好ましくは、前記ヌクレオチド配列はコドンによって最適化されたものであってもよい。さらに好ましくは、前記コドン最適化はウイルスなどを大量の希少コドンで対応する哺乳動物コドンにする、及び／又はｍＲＮＡ不安定モチーフ及び／又は隠れたスプライス部位を除去することを含む。
本発明の第７態様は、上記の核酸を含む発現ベクターを提供する。
好ましくは、前記発現ベクターはインビボ、インビトロ又はエクソボの条件下で発現可能である。さらに好ましくは、前記発現ベクターは生体内細胞で持続的に高レベルで発現する。
好ましくは、前記発現ベクターは原核発現ベクター又はレンチウイルス発現ベクターである。
さらに好ましくは、前記原核発現ベクターは大腸菌シリーズである。本発明の１つの特定実施形態では、前記発現ベクターはｐＥＴ－２６ｂ又はｐＥＴ２８ａ＋である。
本発明の１つの特定実施形態では、前記発現ベクターはｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰである。
さらに好ましくは、前記発現ベクターにおいて、β鎖、α鎖が骨格ベクターに連結する順序はプロモータ、β鎖、ｆｕｒｉｎ－ｐ２Ａ、α鎖、ＩＲＥＳ及びＲＦＰ配列である。
本発明の第８態様は、上記の核酸又は上記の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
好ましくは、前記宿主細胞は真核又は原核のものであってもよい。より好ましくは、前記宿主細胞は酵母細胞、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌などである。
本発明の１つの特定実施形態では、前記宿主細胞はＳｔｂｌ３、ＢＬ２１又はｔｒａｎｓｅｔｔａである。
本発明の第９態様は、上記のＣＤＲ、上記のα鎖ポリペプチド、上記のβ鎖ポリペプチド、上記の抗体又はその抗原結合断片、又は上記のＴ細胞抗原受容体を発現させる免疫細胞を提供する。
好ましくは、前記免疫細胞はリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞を含む）を含むが、これに限定さない。さらに、前記免疫細胞はＢ細胞であり、前記Ｂ細胞は上記の抗体又はその抗原結合断片を発現させる。前記免疫細胞はＴ細胞であり、前記Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体構造は以上に限定された通りである。
本発明の第１０態様は、上記ＣＤＲ、上記のα鎖ポリペプチド、上記のβ鎖ポリペプチド、上記の抗体又はその抗原結合断片、又は前記Ｔ細胞抗原受容体をコードする核酸配列を免疫細胞にトランスフェクションして発現させることにより、免疫細胞を得ることを含む免疫細胞の製造方法を提供する。
好ましくは、前記免疫細胞はリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞を含む）を含むが、これに限定されない。さらに、前記免疫細胞はＢ細胞であり、前記Ｂ細胞は上記の抗体又はその抗原結合断片を発現させる。前記免疫細胞はＴ細胞であり、前記Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体構造は以上に限定された通りである。
好ましくは、細胞の内因性ＴＣＲをノックアウトするステップをさらに含む。具体的には、内因性ＴＣＲを標的としたガイドをレンチウイルスベクターに構築し、パッケージングプラスミド、トランスフェクション試薬とＴ細胞に共トランスフェクションしてもよい。
本発明の第１１態様は、
陽性Ｔ細胞から上記のＴ細胞抗原受容体をコードする核酸配列をクローニングするステップ１）と、
初代Ｔ細胞を単離、培養するステップ２）と、
ステップ１）で得られた核酸配列をステップ２）の前記初代Ｔ細胞に送達し、上記ＣＤＲ、上記α鎖ポリペプチド、上記β鎖ポリペプチド又はＴ細胞抗原受容体を発現させる組換えＴ細胞を得るステップ３）と、を含む組換えＴ細胞の製造方法を提供する。
陽性Ｔ細胞から上記のＴ細胞抗原受容体をコードする核酸配列をクローニングするステップ１）と、
初代Ｔ細胞を単離、培養するステップ２）と、
ステップ１）で得られた核酸配列をステップ２）の前記初代Ｔ細胞に送達し、上記ＣＤＲ、上記α鎖ポリペプチド、上記β鎖ポリペプチド又はＴ細胞抗原受容体を発現させる組換えＴ細胞を得るステップ３）と、を含む組換えＴ細胞の製造方法を提供する。
好ましくは、前記Ｔ細胞は造血幹細胞又は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）由来Ｔ細胞から選ばれる。
本発明の第１２態様は、
陽性Ｔ細胞から上記抗体又はその抗原結合断片、又は上記のＴ細胞抗原受容体をコードする核酸配列をクローニングして得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた核酸配列をベクター骨格に連結し、発現ベクターを得るステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた発現ベクターを宿主細胞に形質転換し、次に、その発現を誘導するステップ（３）と、
抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体を得るステップ（４）と、を含む抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体の製造方法を提供する。
陽性Ｔ細胞から上記抗体又はその抗原結合断片、又は上記のＴ細胞抗原受容体をコードする核酸配列をクローニングして得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた核酸配列をベクター骨格に連結し、発現ベクターを得るステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた発現ベクターを宿主細胞に形質転換し、次に、その発現を誘導するステップ（３）と、
抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体を得るステップ（４）と、を含む抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体の製造方法を提供する。
好ましくは、前記陽性Ｔ細胞はＭＨＣにより提示されたＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２ペプチドに特異的に結合する。さらに好ましくは、前記ＭＨＣにより提示されたＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２ペプチドは単量体又は多量体複合体である。
本発明の第１３態様は、上記のいずれか一項に記載のＴ細胞抗原受容体を含む多量体複合体を提供する。
好ましくは、単量体、ビオチン分子、及び蛍光標識ストレプトアビジン分子又はアビジン分子をさらに含み、前記単量体は抗原ペプチド、ＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖を含み、前記単量体は前記ビオチン分子にカップリングされ、前記ビオチン分子は前記ストレプトアビジン又はアビジン分子に結合される。
好ましくは、前記ＭＨＣ分子α鎖細胞外領域のＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結される。
好ましくは、前記ＭＨＣ分子α鎖細胞外領域はシグナルペプチド配列を含まない。成熟ペプチド配列の前にＭアミノ酸が追加される。
好ましくは、前記β２ｍ鎖はシグナルペプチド配列を含まない。成熟ペプチド配列の前にＭ及びＡの２つのアミノ酸が追加される。
本発明の１つの特定実施形態では、前記β２ｍ鎖はシグナルペプチドを含まず、成熟ペプチド配列の前に２つのアミノ酸、好ましくはＭ、Ａが追加される。
好ましくは、前記抗原ペプチドは配列番号２９～３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含む。
さらに好ましくは、前記抗原ペプチドは配列番号２９、３０、３３又は３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含む。
本発明の１つの特定実施形態では、前記多量体複合体は、
（１）好ましくは配列番号５～２６のいずれか１つに示されるか、又は配列番号５～２６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するＴ細胞抗原受容体と、
（３）抗原ペプチド、Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びシグナルペプチドを含まないβ２ｍ鎖を含み、前記抗原ペプチドは配列番号２９～３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせから選ばれる単量体と、
（４）ビオチン分子と、
（５）ストレプトアビジン分子又はアビジン分子であって、前記単量体は前記ビオチン分子にカップリングされ、前記ビオチン分子は前記ストレプトアビジン又はアビジンに結合されるストレプトアビジン分子又はアビジン分子と、を含む。
（１）好ましくは配列番号５～２６のいずれか１つに示されるか、又は配列番号５～２６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するＴ細胞抗原受容体と、
（３）抗原ペプチド、Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びシグナルペプチドを含まないβ２ｍ鎖を含み、前記抗原ペプチドは配列番号２９～３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせから選ばれる単量体と、
（４）ビオチン分子と、
（５）ストレプトアビジン分子又はアビジン分子であって、前記単量体は前記ビオチン分子にカップリングされ、前記ビオチン分子は前記ストレプトアビジン又はアビジンに結合されるストレプトアビジン分子又はアビジン分子と、を含む。
好ましくは、前記ＭＨＣ分子はＭＨＣ Ｉクラス分子又はＭＨＣ ＩＩクラス分子である。より好ましくは、前記ＭＨＣ分子はＭＨＣ Ｉクラス分子である。
好ましくは、前記ＭＨＣ分子はＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２及びＨＬＡ－Ａ＊１１０１から選ばれる。
本発明の１つの特定実施形態では、前記ＭＨＣ分子α鎖のアミノ酸配列は配列番号１～３のいずれか１つに示されるか、又は配列番号１～３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
本発明の１つの特定実施形態では、前記ＭＨＣ分子のβ２ｍ鎖は配列番号４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
抗原ペプチド－ＭＨＣ４量体とＴ細胞抗原受容体との結合の特異性を向上させるために、前記単量体は少なくとも１つのアミノ酸の化学的修飾、突然変異、挿入及び／又は欠失をさらに含む。
好ましくは、前記ＭＨＣ分子α鎖細胞外領域とβ２ｍ鎖は非共有結合である。
好ましくは、前記多量体複合体は少なくとも１つの単量体を含む。
好ましくは、単量体はそれぞれ少なくとも１つのビオチン分子にカップリングされる。
本発明の第１４態様は、
Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖を発現して精製するステップＩ）と、
抗原ペプチド、ステップＩ）で得られたＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖をリフォールディングし、単量体を製造するステップＩＩ）と、
ステップＩＩ）で製造された単量体をビオチン化し、ビオチン化単量体を得るＩＩＩ）と、
ステップＩＩＩ）で得られたビオチン化単量体と蛍光標識ストレプトアビジン又はアビジンとを反応させ、抗原ペプチド－ＭＨＣ４量体を製造するステップＩＶ）と、
ステップＩＶ）で得られた抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体とＴ細胞を共インキュベートし、Ｔ細胞抗原受容体と抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体の複合体を形成し、特異的Ｔ細胞抗原受容体を抽出するステップＶ）と、を含む上記の多量体複合体の製造方法を提供する。
Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖を発現して精製するステップＩ）と、
抗原ペプチド、ステップＩ）で得られたＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖をリフォールディングし、単量体を製造するステップＩＩ）と、
ステップＩＩ）で製造された単量体をビオチン化し、ビオチン化単量体を得るＩＩＩ）と、
ステップＩＩＩ）で得られたビオチン化単量体と蛍光標識ストレプトアビジン又はアビジンとを反応させ、抗原ペプチド－ＭＨＣ４量体を製造するステップＩＶ）と、
ステップＩＶ）で得られた抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体とＴ細胞を共インキュベートし、Ｔ細胞抗原受容体と抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体の複合体を形成し、特異的Ｔ細胞抗原受容体を抽出するステップＶ）と、を含む上記の多量体複合体の製造方法を提供する。
好ましくは、前記ステップＩ）では、Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域をコードするヌクレオチド配列及びＭＨＣ分子β２ｍ鎖のヌクレオチド配列をそれぞれクローニングし、ベクターに連結した後、発現菌に形質転換して培養し、誘導剤を加えて、封入体を抽出することを含む。
さらに好ましくは、前記発現菌はＯＤ６００値が０．２～０．４となるまで培養される。
さらに好ましくは、前記誘導剤を加えた後の最終モル濃度は０．５～１ｍＭである。
好ましくは、誘導発現は４～６時間行われる。
好ましくは、前記ステップＩＩ）は、β２ｍ鎖のリフォールディング、すなわち、抗原ペプチド、ＭＨＣ分子β２ｍ鎖、Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域を希釈緩衝液に順次加えて、遮光下水浴処理することを含み、前記β２ｍ鎖のリフォールディングは、封入体を変性し、プロテアーゼ阻害剤を加えた後透析することを含む。
好ましくは、前記抗原ペプチド、シグナルペプチドを含まないβ２ｍ鎖及びＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたα鎖のモル比は（３０～５０）：（２～２．５）：１。さらに好ましくは４０：２：１である。
好ましくは、前記ステップＩＩ）では、単量体を精製するステップをさらに含む。
好ましくは、前記ステップＩＩＩ）のビオチン化はＢｉｒＡ酵素の触媒の下で、単量体とＢｉｏｍｉｘＡ、ＢｉｏｍｉｘＢに結合することである。
好ましくは、前記ステップＩＩＩ）では、ビオチン化単量体を精製するステップをさらに含む。
好ましくは、前記ステップＩＶ）では、単量体とストレプトアビジンの反応におけるモル比が（４～７）：１である。
本発明の第１５態様は、本発明の前記抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体の製造、スクリーニング又は検出における上記多量体複合体の使用を提供する。
本発明の第１６態様は、上記のＣＤＲ、上記のα鎖ポリペプチド、上記のβ鎖ポリペプチド、上記の抗体又はその抗原結合断片、上記のＴ細胞抗原受容体、上記の核酸、上記の発現ベクター、上記の宿主細胞、上記の免疫細胞又は上記の多量体複合体の、ＥＢＶ関連疾患を診断又は治療する製品の製造における使用を提供する。
好ましくは、前記ＥＢＶ関連疾患は伝染性単球症、連鎖リンパ球増殖症候群、ウイルス性血球貪食症候群、口腔毛状白板症、ウイルス性髄膜炎、末梢神経炎、ウイルス性肺炎、ウイルス性心筋炎、鼻咽頭がん、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、胃がん、肝細胞がん、リンパ上皮様肉腫、唾液腺腫瘍、乳がん、胸腺腫、原発性滲出性リンパ腫及びＢ／Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫から選ばれる。
本発明の第１７態様は、上記のＣＤＲ、上記のα鎖ポリペプチド、上記のβ鎖ポリペプチド、上記の抗体又はその抗原結合断片、上記のＴ細胞抗原受容体、上記の核酸、上記の発現ベクター、上記の宿主細胞、上記の免疫細胞又は上記の多量体複合体の、Ｔ細胞標識、検出、細胞選別又は活性化における使用を提供する。
本発明の第１８態様は、以下のいずれか１群を含む医薬組成物を提供する。
ｉ）本発明の前記ＣＤＲ
ｉｉ）本発明の前記α鎖ポリペプチド
ｉｉｉ）本発明の前記β鎖ポリペプチド
ｉｖ）本発明の前記抗体又はその抗原結合断片
ｖ）本発明の前記Ｔ細胞抗原受容体
ｖｉ）本発明の前記核酸
ｖｉｉ）本発明の前記発現ベクター
ｖｉｉｉ）本発明の前記宿主細胞
ｉｘ）本発明の前記免疫細胞又は
ｘ）本発明の前記多量体複合体
ｉ）本発明の前記ＣＤＲ
ｉｉ）本発明の前記α鎖ポリペプチド
ｉｉｉ）本発明の前記β鎖ポリペプチド
ｉｖ）本発明の前記抗体又はその抗原結合断片
ｖ）本発明の前記Ｔ細胞抗原受容体
ｖｉ）本発明の前記核酸
ｖｉｉ）本発明の前記発現ベクター
ｖｉｉｉ）本発明の前記宿主細胞
ｉｘ）本発明の前記免疫細胞又は
ｘ）本発明の前記多量体複合体
好ましくは、前記医薬組成物は薬学的に許容される添加剤をさらに含んでもよい。
好ましくは、前記医薬組成物は他の治療剤と併用してもよい。さらに好ましくは、前記治療剤は免疫調整剤であってもよい。
本発明の第１９態様は、以下のいずれか１群を含むキットを提供する。
ｉ）本発明の前記ＣＤＲ
ｉｉ）本発明の前記α鎖ポリペプチド
ｉｉｉ）本発明の前記β鎖ポリペプチド
ｉｖ）本発明の前記抗体又はその抗原結合断片
ｖ）本発明の前記Ｔ細胞抗原受容体
ｖｉ）本発明の前記核酸
ｖｉｉ）本発明の前記発現ベクター
ｖｉｉｉ）本発明の前記宿主細胞
ｉｘ）本発明の前記免疫細胞又は
ｘ）本発明の前記多量体複合体
ｉ）本発明の前記ＣＤＲ
ｉｉ）本発明の前記α鎖ポリペプチド
ｉｉｉ）本発明の前記β鎖ポリペプチド
ｉｖ）本発明の前記抗体又はその抗原結合断片
ｖ）本発明の前記Ｔ細胞抗原受容体
ｖｉ）本発明の前記核酸
ｖｉｉ）本発明の前記発現ベクター
ｖｉｉｉ）本発明の前記宿主細胞
ｉｘ）本発明の前記免疫細胞又は
ｘ）本発明の前記多量体複合体
本発明の第２０態様は、被検出サンプルを本発明の前記抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体と接触させ、次に、ＥＢＶ ＬＭＰ２と抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体とで形成される複合体を検出することを含むＥＢＶ ＬＭＰ２の検出方法に関する。
好ましくは、前記ＥＢＶ ＬＭＰ２の検出はＥＢＶ ＬＭＰ２の存在又は含有量の検出である。前記存在は有無を表し、前記含有量は発現量又はタンパク質濃度などであってもよい。
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体は検出可能なマーカーを含む。
本発明の１つの特定実施形態では、前記マーカーはＨｉｓ及び／又はＨＡであってもよい。
本発明の前記ＥＢＶ ＬＭＰ２の検出方法は疾患の診断方法ではない。まず、被検出サンプルは非生物体又はその摘出組織や細胞ではなく、次に、生物体にＥＢＶ ＬＭＰ２が存在するか、又は所定の濃度若しくは発現レベルのＥＢＶ ＬＭＰ２が含まれていても、疾患であると判定するわけではなく、あくまでも可能性に過ぎない。
本発明の第２１態様は、本発明の前記抗体又はその抗原結合断片、前記Ｔ細胞抗原受容体、前記核酸、前記発現ベクター、前記宿主細胞、前記免疫細胞又は前記医薬組成物の有効量を個体に投与することを含むＥＢＶ関連疾患の治療方法に関する。
好ましくは、前記ＥＢＶ関連疾患の治療方法は、本発明の前記Ｔ細胞抗原受容体をＥＢＶ関連疾患（好ましくは腫瘍又は転移性腫瘍）の近くに局在化することで、毒素又は免疫刺激剤の効果を向上させることを含む。
さらに、前記ＥＢＶ関連疾患は伝染性単球症、連鎖リンパ球増殖症候群、ウイルス性血球貪食症候群、口腔毛状白板症、ウイルス性髄膜炎、末梢神経炎、ウイルス性肺炎、ウイルス性心筋炎、鼻咽頭がん、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、胃がん、肝細胞がん、リンパ上皮様肉腫、唾液腺腫瘍、乳がん、胸腺腫、原発性滲出性リンパ腫及びＢ／Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫から選ばれる。
本発明の第２２態様は、サンプルを採取して、サンプルを本発明の前記抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体と接触させ、次に、ＥＢＶ ＬＭＰ２と抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体とで形成される複合体を検出するＥＢＶ関連疾患の診断方法に関する。好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体は検出可能なマーカーを含む。
本発明の前記ＴＣＲは、対応するＥＢＶ ＬＭＰ２抗原ペプチド又はｐＭＨＣ複合体を特異的に認識し、ＴＣＲ Ｔ細胞を活性化し、さらに高レベルのサイトカインＩＦＮγ、ＩＬ２、ＴＮＦαを産生し、標的細胞を顕著に殺傷して、担がんマウスの寿命を延ばすことができる。
本発明の前記「抗原結合断片」は、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１領域を有するＦａｂ断片；ＣＨ１領域のＣ末端に１つ又は複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；ＶＨ及びＣＨ１領域を有するＦｄ断片；ＶＨ及びＣＨ１領域と、ＣＨ１領域のＣ末端における１つ又は複数のシステイン残基とを有するＦｄ’断片；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨ領域を有するＦｖ断片；ＶＨ領域又はＶＬ領域からなるｄＡｂ断片；単離されたＣＤＲ領域；ヒンジ領域におけるジスルフィドブリッジによって連結された２つのＦａｂ’断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；一本鎖抗体分子（例えば、一本鎖Ｆｖ、ｓｃＦｖ）；２つの抗原結合部位を有する「二重抗体」であって、同一ポリペプチド鎖において軽鎖可変領域（ＶＬ）に結合した重鎖可変領域（ＶＨ）を含むもの；相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む「線状抗体」；抗原結合活性を保持する前記物質の任意の修飾形態を含むが、これらに限定されない。
本発明の前記「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）又はＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の短い断片であり、抗原エピトープに単独で又は他のＣＤＲと組み合わせて結合する。前記免疫グロブリンは抗体であってもよく、この場合、ＣＤＲは抗体の可変配列内の相補性決定領域に対応する。各可変領域は、重鎖及び軽鎖の各可変領域に、それぞれ重鎖又は軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲがある。前記Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）において、ＣＤＲはα鎖又はβ鎖に存在し、α鎖又はβ鎖には、それぞれα鎖又はβ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲが存在する。これらのＣＤＲの正確な境界は、システムによって異なって定義されている。Ｋａｂａｔらが(Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)和(1991))に記載するシステムは、抗体の可変領域に適した明確な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを限定する残基境界も提供する。これらのＣＤＲをＫａｂａｔ ＣＤＲと呼ぶことができる。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔによって定義されるような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基を含んでもよい。Ｃｈｏｔｈｉａら(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol, 196:901-917 (1987)及びChothia et al., Nature 342:877-883 (－1989))は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内の一部のサブ部分が、アミノ酸配列のレベルでは大きな多様性があるものの、ほぼ同じペプチド骨格構成をとることを見出した。これらのサブ部分は、それぞれＬ１、Ｌ２、Ｌ３、又はＨ１、Ｈ２、Ｈ３と呼ばれ、ここで、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ軽鎖領域及び重鎖領域を表す。これらの領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重なり合う境界を有するＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと呼ぶことができる。また、他のＣＤＲ境界定義は、上記のシステムのうちの１つに厳密に従わなくてもよいが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップし、本明細書で使用される方法は、好ましい実施形態ではＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲを使用するが、これらのシステムのいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用してもよい。ＴＣＲにおける前記ＣＤＲの残基境界は上記と同じである。前記「抗体可変領域」とは、抗体分子の軽鎖及び重鎖のうち、相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含むアミノ酸配列の一部をいう。ＶＨは重鎖の可変領域である。ＶＬは軽鎖の可変領域である。
本発明の前記「ＬＭＰ２」は、ＬＭＰ２Ａ及びＬＭＰ２Ｂを含む。ＬＭＰ２ＡとＬＰＭ２Ｂの違いは、ＬＭＰ２Ａに付加的なＮ－末端１１９アミノ酸の細胞質ドメインが１つ存在することであり、それ以外に、ＬＭＰ２ＡとＬＰＭ２Ｂの構造はすべて同じである。また、ＬＭＰ２Ａ及びＬＭＰ２Ｂのいずれも、本発明の前記Ｔ細胞抗原受容体又は抗体結合抗原ペプチド領域を含む。
本発明の前記「相同性」とはアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の使用において、当業者が元の配列の主要な構造又は機能を変えずに、使用する配列が本発明の前記具体的な配列と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する（これらを含むが、限定されない）ように実際の作業ニーズに応じて調整してもよいことを意味する。例えば、本発明の前記「配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する」とは、即ち、ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２ペプチドエピトープ：ＭＨＣ複合体との結合機能を保持したまま、実際の作業ニーズに応じて、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３又は４４を調整し、例えば１つ又は複数のアミノ酸などを置換、欠失及び／又は挿入できることである。ここで、前記少なくとも８０％は８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を含むが、これらに限定されない。
本発明の前記「個体」は、ヒト又は非ヒト哺乳動物を含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、前記非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、サル、ブタやウサギなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の前記「有効量」とは、単一又は複数の用量で患者又は臓器に投与された後に所望の治療又は予防を提供する本発明の前記製品の量又は用量を意味する。
本発明の前記「診断」とは、患者が過去、診断時又は将来疾患又は障害に罹患しているか否かを明らかにすること、又は疾患の進行又は将来の可能性のある進行を明らかにすること、又は治療に対する患者の反応を評価することを意味する。
本発明の前記「治療」とは、徴候、症状、失調、障害、又は疾患の進行や重篤度を遅延、中断、阻止、制御、停止、軽減、又は逆転することを意味するが、必ずしも疾患に関連する全ての徴候、症状、障害や失調の完全な除去に関わるわけではなく、しかも、疾患がすでに発展し始めた後に疾患又は病理状態の徴候、症状などを改善する治療干渉を指す。
本発明の前記「製品」は、本発明の前記抗体又はその抗原結合断片、前記Ｔ細胞抗原受容体、前記核酸、前記発現ベクター、前記宿主細胞、前記免疫細胞、又は前記多量体複合体、及び上記製品と相乗的又は補助的な他の試薬を含むが、これらに限定されない。
本発明の前記「製品」は、キット、チップ、抗体コンジュゲート又は多機能抗体などの医薬組成物であってもよい。
本発明の前記「及び／又は」は、リストされた項目のいずれか１つと、項目の任意の数の組み合わせとを含む。
本発明の前記「含む」は、記載された特定の成分又はステップ、及び技術的効果に実質的に影響を及ぼさない他の特定の成分又はステップを含むオープンな説明である。
本発明の前記「ＴＲＢＶ」はＴ細胞受容体β可変領域を示し、「ＴＲＢＣ」はＴ細胞受容体β定常領域を示す。
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。
単量体のＳＤＳ ＰＡＧＥ測定結果であり、Ｍはタンパク質Ｍａｒｋｅｒ、バンド１、２は単量体である。
４量体染色結果であり、図２ＡはＡ０２０１－ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ－４量体、Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体染色結果、図２ＢはＡ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ－４量体の体積勾配測定実験における市販４量体との比較である。
４量体染色結果であり、図３ＡはＡ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ－４量体及びＡ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ－４量体染色結果、図３ＢはＡ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体すなわちＡ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ－４量体の染色結果、図３ＣはＡ２４０２－ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ－４量体染色結果である。
ｐＨＡＧＥベクターにおけるＴＣＲ β鎖及びα鎖の連結の概略図であり、その連結順序は順次プロモータ、β鎖、ｆｕｒｉｎ－ｐ２Ａ、α鎖、ＩＲＥＳ、及びＲＦＰ配列である。
ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０２０１ ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ特異的ＴＣＲ（Ｅ２３、Ｅ２４０）、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２ ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ／ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ特異的ＴＣＲ（Ｅ４４）及びＰＹＬＦＷＬＡＡＩ特異的ＴＣＲ（Ｅ２９、Ｅ１８０－１）の膜表面発現のフローサイトメトリー検出であり、ＢＶ４２１はフルオレセインシリーズの一種で、ＢＶのフルネームはＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔである。
ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０２０１ ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ特異的ＴＣＲ（Ｅ２３、Ｅ２４０）、ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２ ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ／ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ特異的ＴＣＲ（Ｅ４４）及びＰＹＬＦＷＬＡＡＩ特異的ＴＣＲ（Ｅ２９、Ｅ１８０－１）とＥＢＶ ＬＭＰ２４量体プローブとの結合の親和性のフローサイトメトリー検出である。
ＨＬＡ－Ａ＊１１０１エピトープＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ（ＬＳＫ）とＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ（ＬＴＫ）特異的ＴＣＲと４量体プローブとの結合のフローサイトメトリー検出である。
各濃度のＬＳＫペプチドセグメント刺激下でのＪＣ５－ＴＣＲ細胞のＩＬ－２産生量である。
ＬＳＫエピトープ特異的ＴＣＲのＥＣ５０統計結果であり、ｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲはＣＤＲ３モチーフ保存的ＴＣＲを表し、ｐｒｉｖａｔｅ ＴＣＲはＣＤＲ３領域の保存配列を持たないＴＣＲを表す。
各濃度のＬＴＫペプチドセグメント刺激下でのＪＣ５－ＴＣＲ細胞のＩＬ－２産生量である。
ＬＴＫエピトープ特異的ＴＣＲのＥＣ５０統計結果であり、ｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲはＣＤＲ３モチーフ保存的ＴＣＲを表し、ｐｒｉｖａｔｅ ＴＣＲはＣＤＲ３領域の保存配列を持たないＴＣＲを表す。
ＬＳＫ特異的ＴＣＲ Ｔ細胞とＥＢＶ－ＬＣＬ細胞のインキュベート後のＩＬ２放出レベルである。
ＬＳＫ特異的ＴＣＲ Ｔ細胞とＥＢＶ－ＬＣＬ細胞のインキュベート後のＩＦＮγ放出レベルである。
インビトロ過剰標的細胞の長期刺激下でのＴＣＲ Ｔ細胞の増殖結果図である。
インビトロ過剰標的細胞の長期刺激下でのＴＣＲ Ｔ細胞の殺傷能力の検出図である。
Ｅ２３－ＴＣＲＴ、Ｅ２４０－ＴＣＲＴサイトカインＩＬ２、ＴＮＦα及びＩＦＮγの放出レベル及び標的細胞のルシフェラーゼレベルの検出結果図であり、Ｅ２３、Ｅ２４０は実施例２で製造されたＴＣＲを表し、ＮＥは空白対照群を表し、ＮＴはＴ細胞単独群を表し、ＣｔｒｌはＬＭＰ２をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞を表し、０．５：１、１：１、２：１はエフェクター／ターゲット比である。
Ｅ２９－ＴＣＲＴ、Ｅ１８０－１－ＴＣＲＴサイトカインＩＬ２、ＴＮＦα及びＩＦＮγの放出レベルの検出結果であり、Ｅ２９、Ｅ１８０－１は実施例２で製造されたＴＣＲを表し、１Ｇ４は抗原ＥＹ－ＥＳＯ－１を認識できる対照ＴＣＲを表し、ＮＥは空白対照群を表し、ＮＴはＴ細胞単独群を表す。
Ｅ４４－ＴＣＲＴサイトカインＩＬ２、ＴＮＦα及びＩＦＮγの放出レベルの検出結果であり、Ｅ４４は実施例２で製造されたＴＣＲを表し、Ｅ９は抗原ＬＭＰ２を認識できる陽性対照ＴＣＲを表し、ＲＦＰは陰性対照群を表し、ＮＥは空白対照群を表し、ＮＴはＴ細胞単独群を表す。
ＢＦＰ法によるｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲの構造親和性の測定結果図である。
Ａｌａｎｉｎｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ法によるＥ１４１－ＴＣＲ ＣＤＲ３領域の各アミノ酸が抗原を認識し標的細胞を殺傷する能力への貢献の分析である。
Ａｌａｎｉｎｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ法によるＥ１４１－ＴＣＲ ＣＤＲ３領域の各アミノ酸が抗原を認識しＴ細胞を活性化する能力への貢献の分析である。
リンパ腫動物モデルでＥ２３－ＴＣＲ、Ｅ２４０－ＴＣＲがマウスの体内で腫瘍の成長を抑制することを評価する。
リンパ腫動物モデルでＥ２９－ＴＣＲ、Ｅ４４－ＴＣＲがマウスの体内で腫瘍の成長を抑制することを評価する。
リンパ腫動物モデルでＥ１４１－ＴＣＲがマウスの体内で腫瘍の成長を抑制することを評価する。
固形腫瘍動物モデルでＥ１４１－ＴＣＲがマウスの体内で腫瘍の成長を抑制することを評価する。
固形腫瘍モデル、Ｔ細胞非注射群（ＰＢＳ）、対照ＴＣＲ－Ｔ細胞注射群（ＴＣＲ－１Ｇ４）、及びＥＢＶ ＴＣＲ－Ｔ注射群（Ｅ１４１－ＴＣＲ）のマウスの腫瘍成長の統計結果である。
固形腫瘍モデル、Ｔ細胞非注射群（ＰＢＳ）、対照ＴＣＲ－Ｔ細胞注射群（ＴＣＲ－１Ｇ４）、及びＥＢＶ ＴＣＲ－Ｔ注射群（Ｅ１４１－ＴＣＲ）のマウスの体内のＴＣＲ Ｔ細胞特異的増殖の統計結果である。
以下、本発明の実施例の技術的解決手段について、本発明の実施例の図面を参照して明確かつ完全に説明するが、明らかに、説明される実施例は本発明の一部の実施例にすぎず、全ての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、当業者が創造的な労働を行わずに取得する他の全ての実施例は、本発明の保護範囲に属する。
実施例１：ＥＢＶ抗原エピトープ４量体の構築と効果検出
一、ＥＢＶ抗原エピトープ４量体の構築
１）配列が最適化されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１（そのアミノ酸配列は配列番号１、ヌクレオチド配列は配列番号１１８に示される）、ＨＬＡ－Ａ＊２４２（そのアミノ酸配列は配列番号２、ヌクレオチド配列は配列番号１１９に示される）、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１（そのアミノ酸配列は配列番号３、ヌクレオチド配列は配列番号１２０に示される）のα鎖及びβ２ｍ鎖（そのアミノ酸配列は配列番号４、ヌクレオチド配列は配列番号１２１に示される）を発現させた。ここで、α鎖の構造は対応するＨＬＡ型α鎖の細胞外領域配列にＡｖｉ－ｔａｇ配列が連結され、ＢａｍＨＩ酵素切断部位で隔てられ、それによりビオチン化部位を提供するものである。β２ｍ鎖はシグナルペプチド配列を取り除き、成熟ペプチド配列の前に２つのアミノ酸（ＭとＡ）を付加した。発現ベクターはＰＥＴ２８ａ＋であり、発現菌はｔｒａｎｓｅｔｔａ又はＢＬ２１である。ＩＰＴＧ濃度は０．５ｍＭで、誘導発現は４時間であった。α鎖及びβ２ｍ鎖タンパク質の封入体を抽出した。
２）ＥＢＶ抗原エピトープ（抗原ペプチド）の選択：ＨＬＡ－Ａ＊０２０１型は抗原エピトープＦＬＹＡＬＡＬＬＬ（配列番号２９）、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２型は抗原エピトープＰＹＬＦＷＬＡＡＩ（配列番号３０）、ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ（配列番号３１）、ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ（配列番号３２）、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１型は抗原エピトープＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ（配列番号３３）、ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ（配列番号３４）に対応する。
３）ｐＭＨＣ Ｉ単量体のフォールディング及び精製：ステップ２）の前記抗原ペプチド、対応するステップ１）の前記β２ｍ鎖リフォールディングタンパク質及びα鎖タンパク質をモル比４０：２：１の割合で還元系に順に加え、７２時間フォールディング反応させた。得られた産物をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬカラムで精製した。精製産物を収集してａｖｉｄｉｔｙキットでビオチン化し、再度精製してビオチン化単量体を得、ゲル電気泳動により単量体純度を検出した。
４）ステップ３）の前記ビオチン化単量体とＡＰＣ標識ストレプトアビジンとの結合反応により、対応する４量体を得、それぞれＡ０２０１－ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ－４量体、Ａ２４０２－ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ－４量体、Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体及びＡ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ－４量体と命名した。
二．ＥＢＶ抗原エピトープ４量体の効果検出
１．ヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、細胞密度１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を製造した。
２．細胞を３０００ｒｐｍで５分遠心分離した。上清を除去し、１％血清を含むＰＢＳ ５０μｌで重懸濁させた。
３．４量体２μｌを加えて室温で３０分インキュベートした。
４．ＣＤ８抗体２μｌを加え、氷上で２０分インキュベートした。
５．ＰＢＳ １ｍｌを加えて、３０００ｒｐｍで５分処理した。
６．上清を除去し、ＰＢＳ １ｍｌを加えて、３０００ｒｐｍで５分処理した。
７．上清を除去し、４％パラホルムアルデヒド５００μｌで細胞を再懸濁させ、細胞懸濁液をろ過膜でろ過した。
８．フローサイトメータで陽性細胞を検出した。
三、実験結果
単量体のＳＤＳ ＰＡＧＥ検出結果を図１に示す。図に示すように、リフォールディングとＨＰＬＣ精製により得られた単量体は重鎖（Ｃ末端にＡｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたα鎖の細胞外領域）と軽鎖（シグナルペプチド領域を除去したβ２ｍ鎖）に対応する大きさのタンパク質を明確に示し、純度が高い。
構築した４量体をそれぞれ対応するＨＬＡ型ＴＣＲに感染した細胞と共インキュベートした。一例として、構築されたＡ０２０１－ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ－４量体、Ａ２４０２－ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ－４量体、Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ－４量体、Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体は、それぞれ対応するＨＬＡ型ＴＣＲに感染した細胞と共インキュベートした（ＬＬＬ４量体はＴＣＲ Ｅ２３、ＡＡＩ４量体はＴＣＲ Ｅ２９、ＭＳＬ／ＭＣＬ４量体はＴＣＲ Ｅ４４、ＬＳＫ／ＬＴＫ ４量体はＴＣＲ Ｅ１４１に対応する）、図２Ａに示すように、ＭＢＬ社が市販した４量体と比較して、Ａ０２０１－ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ－４量体で検出された陽性細胞の割合は７０．５％で、市販したＦＬＹＡＬＡＬＬＬ－４量体（５９．７％）を大きく上回り、Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体で検出された陽性細胞の割合は２０．３％で、市販したＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体（１８．１％）を明らかに上回っている。本発明の４量体が、細胞陽性率の検出において高い特異性と染色効果を示すことが十分に示されている。更なる体積勾配検出実験において、独自に開発したＡ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ４量体の特異的結合効果が市販４量体よりはるかに高いことを発見した（図２Ｂ参照）。
本発明により構築された４量体で抽出されたＴＣＲは、野生型抗原エピトープと突然変異型抗原エピトープとを同時に認識し、免疫逃避を防止することができる。図３－Ａに示すように、Ａ２４０２ ＨＬＡ型野生型エピトープ（ＭＣＬ）と突然変異型エピトープ（ＭＳＬ）４量体はいずれもＭＳＬ４量体で抽出されたＴＣＲ Ｅ４４で認識され得る。図３－Ｂに示すように、Ａ１１０１ ＨＬＡ型野生型エピトープ（ＬＳＫ）と突然変異型エピトープ（ＬＴＫ）４量体は、いずれもＬＳＫ４量体で抽出されたＴＣＲ Ｅ１４１で認識され得る。同一ＨＬＡ型の異なる抗原エピトープ４量体について対応する特異的ＴＣＲを抽出すると、図３－Ｃに示すように、ＡＡＩ４量体では、対応するＴＣＲ Ｅ２９陽性細胞が検出され得。
一、ＥＢＶ抗原エピトープ４量体の構築
１）配列が最適化されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１（そのアミノ酸配列は配列番号１、ヌクレオチド配列は配列番号１１８に示される）、ＨＬＡ－Ａ＊２４２（そのアミノ酸配列は配列番号２、ヌクレオチド配列は配列番号１１９に示される）、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１（そのアミノ酸配列は配列番号３、ヌクレオチド配列は配列番号１２０に示される）のα鎖及びβ２ｍ鎖（そのアミノ酸配列は配列番号４、ヌクレオチド配列は配列番号１２１に示される）を発現させた。ここで、α鎖の構造は対応するＨＬＡ型α鎖の細胞外領域配列にＡｖｉ－ｔａｇ配列が連結され、ＢａｍＨＩ酵素切断部位で隔てられ、それによりビオチン化部位を提供するものである。β２ｍ鎖はシグナルペプチド配列を取り除き、成熟ペプチド配列の前に２つのアミノ酸（ＭとＡ）を付加した。発現ベクターはＰＥＴ２８ａ＋であり、発現菌はｔｒａｎｓｅｔｔａ又はＢＬ２１である。ＩＰＴＧ濃度は０．５ｍＭで、誘導発現は４時間であった。α鎖及びβ２ｍ鎖タンパク質の封入体を抽出した。
２）ＥＢＶ抗原エピトープ（抗原ペプチド）の選択：ＨＬＡ－Ａ＊０２０１型は抗原エピトープＦＬＹＡＬＡＬＬＬ（配列番号２９）、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２型は抗原エピトープＰＹＬＦＷＬＡＡＩ（配列番号３０）、ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ（配列番号３１）、ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ（配列番号３２）、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１型は抗原エピトープＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ（配列番号３３）、ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ（配列番号３４）に対応する。
３）ｐＭＨＣ Ｉ単量体のフォールディング及び精製：ステップ２）の前記抗原ペプチド、対応するステップ１）の前記β２ｍ鎖リフォールディングタンパク質及びα鎖タンパク質をモル比４０：２：１の割合で還元系に順に加え、７２時間フォールディング反応させた。得られた産物をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬカラムで精製した。精製産物を収集してａｖｉｄｉｔｙキットでビオチン化し、再度精製してビオチン化単量体を得、ゲル電気泳動により単量体純度を検出した。
４）ステップ３）の前記ビオチン化単量体とＡＰＣ標識ストレプトアビジンとの結合反応により、対応する４量体を得、それぞれＡ０２０１－ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ－４量体、Ａ２４０２－ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ－４量体、Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体及びＡ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ－４量体と命名した。
二．ＥＢＶ抗原エピトープ４量体の効果検出
１．ヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、細胞密度１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を製造した。
２．細胞を３０００ｒｐｍで５分遠心分離した。上清を除去し、１％血清を含むＰＢＳ ５０μｌで重懸濁させた。
３．４量体２μｌを加えて室温で３０分インキュベートした。
４．ＣＤ８抗体２μｌを加え、氷上で２０分インキュベートした。
５．ＰＢＳ １ｍｌを加えて、３０００ｒｐｍで５分処理した。
６．上清を除去し、ＰＢＳ １ｍｌを加えて、３０００ｒｐｍで５分処理した。
７．上清を除去し、４％パラホルムアルデヒド５００μｌで細胞を再懸濁させ、細胞懸濁液をろ過膜でろ過した。
８．フローサイトメータで陽性細胞を検出した。
三、実験結果
単量体のＳＤＳ ＰＡＧＥ検出結果を図１に示す。図に示すように、リフォールディングとＨＰＬＣ精製により得られた単量体は重鎖（Ｃ末端にＡｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたα鎖の細胞外領域）と軽鎖（シグナルペプチド領域を除去したβ２ｍ鎖）に対応する大きさのタンパク質を明確に示し、純度が高い。
構築した４量体をそれぞれ対応するＨＬＡ型ＴＣＲに感染した細胞と共インキュベートした。一例として、構築されたＡ０２０１－ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ－４量体、Ａ２４０２－ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ－４量体、Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ－４量体、Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体は、それぞれ対応するＨＬＡ型ＴＣＲに感染した細胞と共インキュベートした（ＬＬＬ４量体はＴＣＲ Ｅ２３、ＡＡＩ４量体はＴＣＲ Ｅ２９、ＭＳＬ／ＭＣＬ４量体はＴＣＲ Ｅ４４、ＬＳＫ／ＬＴＫ ４量体はＴＣＲ Ｅ１４１に対応する）、図２Ａに示すように、ＭＢＬ社が市販した４量体と比較して、Ａ０２０１－ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ－４量体で検出された陽性細胞の割合は７０．５％で、市販したＦＬＹＡＬＡＬＬＬ－４量体（５９．７％）を大きく上回り、Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体で検出された陽性細胞の割合は２０．３％で、市販したＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体（１８．１％）を明らかに上回っている。本発明の４量体が、細胞陽性率の検出において高い特異性と染色効果を示すことが十分に示されている。更なる体積勾配検出実験において、独自に開発したＡ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ４量体の特異的結合効果が市販４量体よりはるかに高いことを発見した（図２Ｂ参照）。
本発明により構築された４量体で抽出されたＴＣＲは、野生型抗原エピトープと突然変異型抗原エピトープとを同時に認識し、免疫逃避を防止することができる。図３－Ａに示すように、Ａ２４０２ ＨＬＡ型野生型エピトープ（ＭＣＬ）と突然変異型エピトープ（ＭＳＬ）４量体はいずれもＭＳＬ４量体で抽出されたＴＣＲ Ｅ４４で認識され得る。図３－Ｂに示すように、Ａ１１０１ ＨＬＡ型野生型エピトープ（ＬＳＫ）と突然変異型エピトープ（ＬＴＫ）４量体は、いずれもＬＳＫ４量体で抽出されたＴＣＲ Ｅ１４１で認識され得る。同一ＨＬＡ型の異なる抗原エピトープ４量体について対応する特異的ＴＣＲを抽出すると、図３－Ｃに示すように、ＡＡＩ４量体では、対応するＴＣＲ Ｅ２９陽性細胞が検出され得。
実施例２：ｐＨＡＧＥ－ＴＣＲ－ＲＦＰベクターの構築
一、ＥＢＶ ＬＭＰ２エピトープ特異的ＴＣＲのβとα遺伝子断片の取得
１）実施例１で製造されたＡ０２０１－ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ－４量体、Ａ２４０２－ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ－４量体、Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体及Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ－４量体を末梢血とともに染色し、４量体染色陽性のＴ細胞をフローサイトメトリーにより選別し、逆転写してｃＤＮＡ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ登録商標ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を得た。多重ＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）原理により、２回のＰＣＲ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）によりＴＣＲβ遺伝子の可変領域断片を増幅した。
逆転写プライマー：TRBC1-TCAGGCAGTATCTGGAGTCATTG（配列番号144）
ＰＣＲ増幅用プライマー：
上流プライマー1：TRBV_F1 (配列番号147～185及び366参照)
上流プライマー2：TRBV_F2 (配列番号186～225参照)
下流プライマー1：TRBC2-GCACCTCCTTCCCATTCACC（配列番号145）
下流プライマー2：TRBC3-GCTTCTGATGGCTCAAACACAG（配列番号146）
具体的には、ＰＣＲポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏの製品取扱書によると、１回目のＰＣＲ系は２０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。１回目のＰＣＲ反応の産物１μＬを取り、２回目のＰＣＲのテンプレートとし、２回目のＰＣＲ系は３０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。次に、２回目のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、対応する大きさのバンドについてゲルをカットして回収し（QIAGEN社のゲル回収キット）、シーケンシングに送り、シーケンシングプライマーは下流プライマー２である。ＴＣＲβ遺伝子配列を得、具体的には、Ｅ２３、Ｅ２４０、Ｅ２９、Ｅ１８０－１、Ｅ４４、Ｅ１４１、Ｅ１４９、Ｅ１６８、Ｅ１７０、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４、Ｅ３０５、Ｅ３０７、Ｅ３１４、Ｅ３１５、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８、Ｅ３２０のＴＣＲβ遺伝子配列はそれぞれ配列番号１２２～１４３の「二重下線」で示したヌクレオチド配列である。
２）以上のように、４量体染色陽性Ｔ細胞を逆転写してｃＤＮＡ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を得た。取扱説明書に基づき、ＴＣＲα遺伝子断片を、２回ＰＣＲ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）により増幅した。
逆転写プライマー：TRAC1-CGACCAGCTTGACATCACAG（配列番号226）
ＰＣＲ増幅用プライマー：
上流プライマー3：TRAV_F1 (配列番号229-273)
上流プライマー4：TRAV_F2 (配列番号274-315)
下流プライマー3：TRAC2-GTTGCTCTTGAAGTCCATAGACCTC（配列番号227）
下流プライマー4：TRAC3-CAGGGTCAGGGTTCTGGATA（配列番号228）
具体的には、ＰＣＲポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏの製品取扱書によると、１回目のＰＣＲ系は２０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。１回目のＰＣＲ反応の産物１μＬを取り、２回目のＰＣＲのテンプレートとし、２回目のＰＣＲ系は３０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。次に、２回目のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、対応するサイズのバンドについてゲルをカットして回収し（QIAGEN社のゲル回収キット）、シーケンシングに送り、シーケンシングプライマーは下流プライマー４である。ＴＣＲα遺伝子配列を得、具体的には、Ｅ２３、Ｅ２４０、Ｅ２９、Ｅ１８０－１、Ｅ４４、Ｅ１４１、Ｅ１４９、Ｅ１６８、Ｅ１７０、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４、Ｅ３０５、Ｅ３０７、Ｅ３１４、Ｅ３１５、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８、Ｅ３２０のＴＣＲα遺伝子配列はそれぞれ配列番号１２２～１４３の「波下線」で示したヌクレオチド配列である。
二、ｐＨＡＧＥ－ＴＣＲベクターの構築
ＴＣＲβ、ｆｐ２Ａ、ＴＣＲαを長いプライマー（ｆｐ２Ａ配列を含む）ｏｖｅｒｌａｐ－ＰＣＲ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）により増幅し、ＴＣＲβ－ｆｐ２Ａ－ＴＣＲα断片を得、それぞれＥ２３、Ｅ２４０、Ｅ２９、Ｅ１８０－１、Ｅ４４、Ｅ１４１，Ｅ１４９、Ｅ１６８、Ｅ１７０、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４、Ｅ３０５、Ｅ３０７、Ｅ３１４、Ｅ３１５、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８、Ｅ３２０のｐＨＡＧＥ－ＴＣＲプラスミドと命名した。
増幅用プライマー：
上流プライマー５を表１に示す。
下流プライマー５：TCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCGCTccgtttccgccgGAAATCCTTTCTCTTGACCATG（配列番号338）
上流プライマー６を表２に示す。
下流プライマー６：agggatcctctagactcgagctagcTCAGCTGGACCACAGCCGCA（配列番号361）
具体的には、プライマー５とプライマー６でＴＣＲβとＴＣＲαをそれぞれ増幅し、ＰＣＲ系は５０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけて、ゲルを回収し（QIAGEN社のゲル回収キット）、産物１μＬをそれぞれ回収してテンプレートとし、上流プライマー５と下流プライマー６を用いてｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを行い、ＰＣＲ系は５０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。アガロースゲル電気泳動を行って、約１８００ｂｐのバンドを得、ゲルをカットして回収した。
レンチウイルスベクターｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰをＮｏｔＩとＮｈｅＩで二重酵素切断した。酵素切断系は４０μＬであり、ＮｏｔＩとＮｈｅＩをそれぞれ１．５μＬ、プラスミド２～３μｇを含み、３７℃で酵素切断６時間後、系にアルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）１μＬを加え、１時間処理してプラスミドの自己結合を減少させ、酵素切断後のプラスミドをアガロースゲル電気泳動にかけて回収し、ｎａｎｏｄｒｏｐで濃度を測定し、骨格としてプラスミド構築に用いた。
Ｃｌｏｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔの製品取扱書によると、ｏｖｅｒｌａｐで酵素切断後線形化したｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターにＴＣＲを連結し（図４参照）、Ｓｔｂｌ３菌株に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレート上で１２～１６時間培養し、単クローン菌を選んでシークエンシングを行い、シークエンシングプライマーはｐＨＡＧＥベクター上のプライマーｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｆとｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｒ、及び下流プライマー４を用いた。それぞれＥ２３、Ｅ２４０、Ｅ２９、Ｅ１８０－１、Ｅ４４、Ｅ１４１，Ｅ１４９、Ｅ１６８、Ｅ１７０、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４、Ｅ３０５、Ｅ３０７、Ｅ３１４、Ｅ３１５、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８、Ｅ３２０と略称される対応するＴＣＲを得た。
一、ＥＢＶ ＬＭＰ２エピトープ特異的ＴＣＲのβとα遺伝子断片の取得
１）実施例１で製造されたＡ０２０１－ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ－４量体、Ａ２４０２－ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ－４量体、Ａ２４０２－ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ－４量体、Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ－４量体及Ａ１１０１－ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ－４量体を末梢血とともに染色し、４量体染色陽性のＴ細胞をフローサイトメトリーにより選別し、逆転写してｃＤＮＡ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ登録商標ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を得た。多重ＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）原理により、２回のＰＣＲ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）によりＴＣＲβ遺伝子の可変領域断片を増幅した。
逆転写プライマー：TRBC1-TCAGGCAGTATCTGGAGTCATTG（配列番号144）
ＰＣＲ増幅用プライマー：
上流プライマー1：TRBV_F1 (配列番号147～185及び366参照)
上流プライマー2：TRBV_F2 (配列番号186～225参照)
下流プライマー1：TRBC2-GCACCTCCTTCCCATTCACC（配列番号145）
下流プライマー2：TRBC3-GCTTCTGATGGCTCAAACACAG（配列番号146）
具体的には、ＰＣＲポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏの製品取扱書によると、１回目のＰＣＲ系は２０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。１回目のＰＣＲ反応の産物１μＬを取り、２回目のＰＣＲのテンプレートとし、２回目のＰＣＲ系は３０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。次に、２回目のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、対応する大きさのバンドについてゲルをカットして回収し（QIAGEN社のゲル回収キット）、シーケンシングに送り、シーケンシングプライマーは下流プライマー２である。ＴＣＲβ遺伝子配列を得、具体的には、Ｅ２３、Ｅ２４０、Ｅ２９、Ｅ１８０－１、Ｅ４４、Ｅ１４１、Ｅ１４９、Ｅ１６８、Ｅ１７０、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４、Ｅ３０５、Ｅ３０７、Ｅ３１４、Ｅ３１５、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８、Ｅ３２０のＴＣＲβ遺伝子配列はそれぞれ配列番号１２２～１４３の「二重下線」で示したヌクレオチド配列である。
２）以上のように、４量体染色陽性Ｔ細胞を逆転写してｃＤＮＡ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を得た。取扱説明書に基づき、ＴＣＲα遺伝子断片を、２回ＰＣＲ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）により増幅した。
逆転写プライマー：TRAC1-CGACCAGCTTGACATCACAG（配列番号226）
ＰＣＲ増幅用プライマー：
上流プライマー3：TRAV_F1 (配列番号229-273)
上流プライマー4：TRAV_F2 (配列番号274-315)
下流プライマー3：TRAC2-GTTGCTCTTGAAGTCCATAGACCTC（配列番号227）
下流プライマー4：TRAC3-CAGGGTCAGGGTTCTGGATA（配列番号228）
具体的には、ＰＣＲポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏの製品取扱書によると、１回目のＰＣＲ系は２０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。１回目のＰＣＲ反応の産物１μＬを取り、２回目のＰＣＲのテンプレートとし、２回目のＰＣＲ系は３０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。次に、２回目のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、対応するサイズのバンドについてゲルをカットして回収し（QIAGEN社のゲル回収キット）、シーケンシングに送り、シーケンシングプライマーは下流プライマー４である。ＴＣＲα遺伝子配列を得、具体的には、Ｅ２３、Ｅ２４０、Ｅ２９、Ｅ１８０－１、Ｅ４４、Ｅ１４１、Ｅ１４９、Ｅ１６８、Ｅ１７０、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４、Ｅ３０５、Ｅ３０７、Ｅ３１４、Ｅ３１５、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８、Ｅ３２０のＴＣＲα遺伝子配列はそれぞれ配列番号１２２～１４３の「波下線」で示したヌクレオチド配列である。
二、ｐＨＡＧＥ－ＴＣＲベクターの構築
ＴＣＲβ、ｆｐ２Ａ、ＴＣＲαを長いプライマー（ｆｐ２Ａ配列を含む）ｏｖｅｒｌａｐ－ＰＣＲ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）により増幅し、ＴＣＲβ－ｆｐ２Ａ－ＴＣＲα断片を得、それぞれＥ２３、Ｅ２４０、Ｅ２９、Ｅ１８０－１、Ｅ４４、Ｅ１４１，Ｅ１４９、Ｅ１６８、Ｅ１７０、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４、Ｅ３０５、Ｅ３０７、Ｅ３１４、Ｅ３１５、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８、Ｅ３２０のｐＨＡＧＥ－ＴＣＲプラスミドと命名した。
増幅用プライマー：
上流プライマー５を表１に示す。
上流プライマー６を表２に示す。
具体的には、プライマー５とプライマー６でＴＣＲβとＴＣＲαをそれぞれ増幅し、ＰＣＲ系は５０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけて、ゲルを回収し（QIAGEN社のゲル回収キット）、産物１μＬをそれぞれ回収してテンプレートとし、上流プライマー５と下流プライマー６を用いてｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを行い、ＰＣＲ系は５０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルであった。アガロースゲル電気泳動を行って、約１８００ｂｐのバンドを得、ゲルをカットして回収した。
レンチウイルスベクターｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰをＮｏｔＩとＮｈｅＩで二重酵素切断した。酵素切断系は４０μＬであり、ＮｏｔＩとＮｈｅＩをそれぞれ１．５μＬ、プラスミド２～３μｇを含み、３７℃で酵素切断６時間後、系にアルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）１μＬを加え、１時間処理してプラスミドの自己結合を減少させ、酵素切断後のプラスミドをアガロースゲル電気泳動にかけて回収し、ｎａｎｏｄｒｏｐで濃度を測定し、骨格としてプラスミド構築に用いた。
Ｃｌｏｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔの製品取扱書によると、ｏｖｅｒｌａｐで酵素切断後線形化したｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターにＴＣＲを連結し（図４参照）、Ｓｔｂｌ３菌株に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレート上で１２～１６時間培養し、単クローン菌を選んでシークエンシングを行い、シークエンシングプライマーはｐＨＡＧＥベクター上のプライマーｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｆとｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｒ、及び下流プライマー４を用いた。それぞれＥ２３、Ｅ２４０、Ｅ２９、Ｅ１８０－１、Ｅ４４、Ｅ１４１，Ｅ１４９、Ｅ１６８、Ｅ１７０、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４、Ｅ３０５、Ｅ３０７、Ｅ３１４、Ｅ３１５、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８、Ｅ３２０と略称される対応するＴＣＲを得た。
実施例３：ｐＭＨＣ４量体の染色法によるＴＣＲの膜発現と親和性の検出
１、内因性ＴＣＲノックアウトＪｕｒｋａｔＴ細胞株の構築
Ｊｕｒｋａｔ細胞ＴＣＲの配列特徴に基づき、α鎖とβ鎖の定常領域にｇｕｉｄｅ配列(TRA_oligo1-CACCGTCTCTCAGCTGGTACACGGC（配列番号362）、TRA_oligo2-AAACGCCGTGTACCAGCTGAGAGAC（配列番号363）、TRB_oligo1-CACCGGGCTCAAACACAGCGACCTC（配列番号364）、TRB_oligo2-AAACGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCC)（配列番号365）を設計した。
合成したα鎖とβ鎖のｇｕｉｄｅ配列をそれぞれｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ｐｕｒｏとｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ＢＳＤレンチウイルスベクターに構築し、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ及びＰＥＩトランスフェクション試薬と一定の割合で２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションし、４８時間と７２時間の細胞培養上清を採取し、濃縮した２つのウイルスを同時にヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞株に感染した。感染４８時間後、適切な濃度のピューロマイシンとブラストサイジンで殺滅し、２つの薬物のそれぞれの対照群の細胞を全て死亡させた。生存している細胞について単細胞をフローサイトメトリーにより選別し、９６ウェルプレートに入れて培養した。得られたモノクローナル細胞株に対して、ＴＣＲα鎖とβ鎖の抗体を用いて発現をそれぞれ同定し、両鎖が欠損した細胞株は内因性ＴＣＲノックアウトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とし、ＪＣ５と命名した。
２、ＥＢＶ ＴＣＲを安定に組み込んだＪＣ５細胞株の構築
実施例２で構築した上記のＥ２３、Ｅ２４０などのｐＨＡＧＥ－ＴＣＲプラスミドをそれぞれパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ及びトランスフェクション試薬ＰＥＩと一定の割合で混合し、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。４８時間と７２時間の細胞培養上清を採取し、濃縮した後に対数成長期のＪＣ５細胞（ＭＯＩ＝０．３）に感染した。感染３日後、抗ヒトＣＤ３と抗ヒトＴＣＲαβフロー抗体を用いて細胞を染色し、同じＴＣＲ発現レベルの細胞を選別して培養したものをＪＣ５－ＴＣＲ細胞株とした。
３、ＴＣＲの細胞膜への形成及び親和性の検出
１×１０６ＪＣ５－ＴＣＲ細胞を取り、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１商標ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＴＣＲαβ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び対応するＥＢＶ ＬＭＰ２ ｐＭＨＣ４量体－ＡＰＣ（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＡＰＣ）で染色した後、フローサイトメトリー分析を行った。
図５、６より、製造されたＥＢＶ ＬＭＰ２ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０２０１ ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ特異的Ｅ２３－ＴＣＲ、Ｅ２４０－ＴＣＲ、ＥＢＶ ＬＭＰ２ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２ ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ特異的Ｅ２９－ＴＣＲ、Ｅ１８０－１－ＴＣＲ及びＥＢＶ ＬＭＰ２ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２ ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ／ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ特異的Ｅ４４－ＴＣＲはいずれも正しく発現し、細胞膜外に表示され、対応する４量体プローブとの一定の親和性があることが分かった。
図７より、製造したＥＢＶ ＬＭＰ２ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ１１０１ ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ特異的ＴＣＲのうち、Ｅ２４４－ＴＣＲとＥ３０７－ＴＣＲを除いて、他の構築したＴＣＲはいずれもＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫエピトープによく結合していることが分かった。この結果は、自作４量体が特異的に結合するＴ細胞の同定への適用に成功しただけでなく、得られたＴＣＲが良好な親和性を有することを示している。
１、内因性ＴＣＲノックアウトＪｕｒｋａｔＴ細胞株の構築
Ｊｕｒｋａｔ細胞ＴＣＲの配列特徴に基づき、α鎖とβ鎖の定常領域にｇｕｉｄｅ配列(TRA_oligo1-CACCGTCTCTCAGCTGGTACACGGC（配列番号362）、TRA_oligo2-AAACGCCGTGTACCAGCTGAGAGAC（配列番号363）、TRB_oligo1-CACCGGGCTCAAACACAGCGACCTC（配列番号364）、TRB_oligo2-AAACGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCC)（配列番号365）を設計した。
合成したα鎖とβ鎖のｇｕｉｄｅ配列をそれぞれｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ｐｕｒｏとｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ＢＳＤレンチウイルスベクターに構築し、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ及びＰＥＩトランスフェクション試薬と一定の割合で２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションし、４８時間と７２時間の細胞培養上清を採取し、濃縮した２つのウイルスを同時にヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞株に感染した。感染４８時間後、適切な濃度のピューロマイシンとブラストサイジンで殺滅し、２つの薬物のそれぞれの対照群の細胞を全て死亡させた。生存している細胞について単細胞をフローサイトメトリーにより選別し、９６ウェルプレートに入れて培養した。得られたモノクローナル細胞株に対して、ＴＣＲα鎖とβ鎖の抗体を用いて発現をそれぞれ同定し、両鎖が欠損した細胞株は内因性ＴＣＲノックアウトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とし、ＪＣ５と命名した。
２、ＥＢＶ ＴＣＲを安定に組み込んだＪＣ５細胞株の構築
実施例２で構築した上記のＥ２３、Ｅ２４０などのｐＨＡＧＥ－ＴＣＲプラスミドをそれぞれパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ及びトランスフェクション試薬ＰＥＩと一定の割合で混合し、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。４８時間と７２時間の細胞培養上清を採取し、濃縮した後に対数成長期のＪＣ５細胞（ＭＯＩ＝０．３）に感染した。感染３日後、抗ヒトＣＤ３と抗ヒトＴＣＲαβフロー抗体を用いて細胞を染色し、同じＴＣＲ発現レベルの細胞を選別して培養したものをＪＣ５－ＴＣＲ細胞株とした。
３、ＴＣＲの細胞膜への形成及び親和性の検出
１×１０６ＪＣ５－ＴＣＲ細胞を取り、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１商標ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＴＣＲαβ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び対応するＥＢＶ ＬＭＰ２ ｐＭＨＣ４量体－ＡＰＣ（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＡＰＣ）で染色した後、フローサイトメトリー分析を行った。
図５、６より、製造されたＥＢＶ ＬＭＰ２ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０２０１ ＦＬＹＡＬＡＬＬＬ特異的Ｅ２３－ＴＣＲ、Ｅ２４０－ＴＣＲ、ＥＢＶ ＬＭＰ２ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２ ＰＹＬＦＷＬＡＡＩ特異的Ｅ２９－ＴＣＲ、Ｅ１８０－１－ＴＣＲ及びＥＢＶ ＬＭＰ２ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２ ＴＹＧＰＶＦＭＳＬ／ＴＹＧＰＶＦＭＣＬ特異的Ｅ４４－ＴＣＲはいずれも正しく発現し、細胞膜外に表示され、対応する４量体プローブとの一定の親和性があることが分かった。
図７より、製造したＥＢＶ ＬＭＰ２ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ１１０１ ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫ特異的ＴＣＲのうち、Ｅ２４４－ＴＣＲとＥ３０７－ＴＣＲを除いて、他の構築したＴＣＲはいずれもＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫエピトープによく結合していることが分かった。この結果は、自作４量体が特異的に結合するＴ細胞の同定への適用に成功しただけでなく、得られたＴＣＲが良好な親和性を有することを示している。
実施例４：ＴＣＲ機能活性とＥＣ５０
実施例３のｐＭＨＣ４量体についてはＴＣＲの構造親和性を検出し、４量体はＪＣ５表面のＴＣＲに４価結合していることを考慮して、ＴＣＲの活性をさらに同定するために、Ｔ２細胞にＨＬＡ－Ａ＊１１０１分子を安定的に組み込み、ＴＣＲの半最大効果抗原濃度（ＥＣ５０）定量に用いるＴ２－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１細胞株を構築し、ＴＣＲの機能活性を比較した。
１．ＨＬＡ－Ａ＊１１０１を安定に組み込んだＴ２細胞株の構築
ＨＬＡ－Ａ＊１１０１分子とβ２ｍ分子（ヒト由来）をクローニングし、ｆｐ２Ａで連結した後、ｐＨＡＧＥ－ＢＳＤベクターに構築し、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ ２．Ｇ及びＰＥＩトランスフェクション試薬と一定の割合で２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションし、ウイルスをパッケージングし、Ｔ２細胞系の感染に用いた。感染４８時間後のＴ２細胞を、対照組の細胞が全て死亡するまで、適切な濃度のブラストサイジンで殺滅し、Ｔ２－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１細胞株を得た。
２、ＴＣＲ機能活性及びＥＣ５０の測定
合成したＬＭＰ２抗原エピトープをＤＭＳＯ溶媒で４ｍｇ／ｍＬのストック濃度に希釈した。その後、完全培地を用いてエピトープペプチドセグメントを連続的に勾配希釈し、２×１０－８～２×１０－４ＭのＬＳＫとＬＴＫのペプチドセグメント溶液を得、１：１００の体積で１×１０６細胞／ｍＬのＴ２－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１細胞懸濁液に添加し、均一に混合した後、細胞を９６ウェルプレートに１孔あたり１００μＬ敷き、また、濃度１×１０６細胞／ｍＬのＪＣ５－ＴＣＲ細胞１００μＬを加え、均一に混合すると、ペプチドセグメント濃度が１×１０－１０～１×１０－６ＭのＴ２インキュベーション系となった。２４時間共培養した後、培地の上清を収集し、ＥＬＩＳＡキットでＩＬ２生産量を検出した。実験を３回繰り返した。図８及び図１０は、それぞれ異なる濃度のＬＳＫ及びＬＴＫペプチドセグメント刺激下でのＪＣ５－ＴＣＲ細胞のＩＬ２産生量を示している。対応するＥＣ５０値はｐｒｉｓｍ計算により得られ、３回繰り返したＥＣ５０値は具体的には図９と図１１に示される。図８～１１より、合成したＬＳＫ抗原エピトープに対しては、ＴＣＲ Ｅ１４９、Ｅ３０４、Ｅ１７０、Ｅ３１５が優れた機能活性を示し、ＬＴＫエピトープに対しては、Ｅ１４９、Ｅ２５４、Ｅ１７０、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８がいずれも良好な機能活性を示したことが分かった。Ｅ２４４とＥ３０７の結果は４量体染色と一致し、いずれもＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫエピトープに対する認識能力が弱かった。
実施例３のｐＭＨＣ４量体についてはＴＣＲの構造親和性を検出し、４量体はＪＣ５表面のＴＣＲに４価結合していることを考慮して、ＴＣＲの活性をさらに同定するために、Ｔ２細胞にＨＬＡ－Ａ＊１１０１分子を安定的に組み込み、ＴＣＲの半最大効果抗原濃度（ＥＣ５０）定量に用いるＴ２－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１細胞株を構築し、ＴＣＲの機能活性を比較した。
１．ＨＬＡ－Ａ＊１１０１を安定に組み込んだＴ２細胞株の構築
ＨＬＡ－Ａ＊１１０１分子とβ２ｍ分子（ヒト由来）をクローニングし、ｆｐ２Ａで連結した後、ｐＨＡＧＥ－ＢＳＤベクターに構築し、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ ２．Ｇ及びＰＥＩトランスフェクション試薬と一定の割合で２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションし、ウイルスをパッケージングし、Ｔ２細胞系の感染に用いた。感染４８時間後のＴ２細胞を、対照組の細胞が全て死亡するまで、適切な濃度のブラストサイジンで殺滅し、Ｔ２－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１細胞株を得た。
２、ＴＣＲ機能活性及びＥＣ５０の測定
合成したＬＭＰ２抗原エピトープをＤＭＳＯ溶媒で４ｍｇ／ｍＬのストック濃度に希釈した。その後、完全培地を用いてエピトープペプチドセグメントを連続的に勾配希釈し、２×１０－８～２×１０－４ＭのＬＳＫとＬＴＫのペプチドセグメント溶液を得、１：１００の体積で１×１０６細胞／ｍＬのＴ２－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１細胞懸濁液に添加し、均一に混合した後、細胞を９６ウェルプレートに１孔あたり１００μＬ敷き、また、濃度１×１０６細胞／ｍＬのＪＣ５－ＴＣＲ細胞１００μＬを加え、均一に混合すると、ペプチドセグメント濃度が１×１０－１０～１×１０－６ＭのＴ２インキュベーション系となった。２４時間共培養した後、培地の上清を収集し、ＥＬＩＳＡキットでＩＬ２生産量を検出した。実験を３回繰り返した。図８及び図１０は、それぞれ異なる濃度のＬＳＫ及びＬＴＫペプチドセグメント刺激下でのＪＣ５－ＴＣＲ細胞のＩＬ２産生量を示している。対応するＥＣ５０値はｐｒｉｓｍ計算により得られ、３回繰り返したＥＣ５０値は具体的には図９と図１１に示される。図８～１１より、合成したＬＳＫ抗原エピトープに対しては、ＴＣＲ Ｅ１４９、Ｅ３０４、Ｅ１７０、Ｅ３１５が優れた機能活性を示し、ＬＴＫエピトープに対しては、Ｅ１４９、Ｅ２５４、Ｅ１７０、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８がいずれも良好な機能活性を示したことが分かった。Ｅ２４４とＥ３０７の結果は４量体染色と一致し、いずれもＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫエピトープに対する認識能力が弱かった。
実施例５：ヒト初代ＴＣＲ Ｔ細胞の構築及びインビトロ機能検出
１、ヒト初代Ｔ細胞の単離、培養及びレンチウイルス感染
スクリーニングされたＴＣＲのＥＢＶ ＬＭＰ２抗原に対する認識と殺傷機能をさらに検証するために、リンパ球単離液Ｆｉｃｏｌｌを用いてボランティアの末梢血から単核球（ＰＢＭＣ）を単離して得た後、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の製品取扱書に従って、ＰＢＭＣから陰性選別法によりＴ細胞を取得し、１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ２を含む１６４０完全培地で細胞を１×１０６細胞／ｍＬに再懸濁させ、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆された培養皿で培養して活性化した。活性化４８時間後、ＴＣＲをロードしたウイルス顆粒（実施例３で製造）をレンチウイルス系でＴ細胞に感染させ、感染方法は３２℃、１５００ｒｐｍで２時間遠心分離し、取り出した後３７℃細胞インキュベータで１０時間培養し、その後、培地の交換により感染を停止し、３７℃細胞インキュベータで培養を続けることである。感染３日後、フローサイトメータでＴＣＲ陽性細胞を選別し、ＴＣＲＴ細胞（上記Ｅ２３、Ｅ２４０、Ｅ２９、Ｅ１８０－１、Ｅ４４、Ｅ１４１，Ｅ１４９、Ｅ１６８、Ｅ１７０、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４、Ｅ３０５、Ｅ３０７、Ｅ３１４、Ｅ３１５、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８、Ｅ３２０を含む）を得た。
２、標的細胞の構築
ＬＭＰ２－ＲＦＰ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－ＢＳＤ／ＨＬＡ－Ａ＊２４０２－ＢＳＤ／ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＢＳＤ及びＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰをそれぞれロードしたウイルス顆粒をレンチウイルス系で対数成長期のＲａｊｉ細胞に感染させた。薬物スクリーニング及びフローサイトメトリー選別により、ＬＭＰ２、ＨＬＡ－Ａ分子及びＬｕｃｉｆｅｒａｓ－ＧＦＰを同時に安定に発現させたＲａｊｉ細胞を得、Ｒａｊｉ－ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０２０１／２４０２／１１０１－ＬＭＰ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと命名した。また、対数成長期のＥＢＶ－ＬＣＬ細胞にＨＬＡ－Ａ＊０２０１－ＢＳＤ／ＨＬＡ－Ａ＊２４０２－ＢＳＤ／ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＢＳＤのウイルス粒子を感染させた。薬物スクリーニングにより、ＨＬＡ－Ａ分子を安定に発現させたＥＢＶ－ＬＣＬ細胞を得、それぞれＥＢＶ－ＬＣＬ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＥＢＶ－ＬＣＬ－ＨＬＡ－Ａ＊２４０２、ＥＢＶ－ＬＣＬ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１細胞と命名した。
３、ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲのインビトロ機能検証
１）内在性レベルの抗原エピトープに対するＴＣＲ認識能力の検証
ＥＢＶ－ＬＣＬは、即ち、ＥＢウイルスに感染された後不死化したヒトＢ細胞であり、生体内腫瘍細胞中の抗原レベルをリアルにシミュレーションした。そこで、ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫエピトープを認識するＴＣＲ Ｔ細胞とＥＢＶ－ＬＣＬ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１細胞をエフェクター／ターゲット比８：１、４：１、２：１、１：１、０．５：１、０．２５：１で共培養し、ここで、標的細胞は１×１０５細胞に一定させた。２４時間インキュベートした後、上清を収集して、分泌したサイトカインＩＬ２（図１２）とＩＦＮ－γ（図１３）を検出することに用いた。サイトカイン放出レベルから見ると、ＴＣＲ：Ｅ１４１、Ｅ１７０、Ｅ２５４及びＥ３１５が内因性レベルのＬＳＫに結合すると、Ｔ細胞を顕著に活性化できた。特に、Ｅ３１５ ＴＣＲ Ｔ細胞は、それぞれのエフェクター／ターゲット比の濃度で最高のＩＦＮ－γレベルを示しただけでなく、対応するＩＬ２値も高く、その結果から、本発明により製造されたＴＣＲが腫瘍内因性抗原の認識を効果的に媒介できることを示した。
２）ＴＣＲ Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する長期殺傷能力の検証
ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫエピトープを認識するＴＣＲ Ｔ細胞とＲａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞をエフェクター／ターゲット比１：３から開始して共培養し、０日目とし、その後、それぞれ１日目、３日目、５日目に細胞を採取してフローサイトメトリー分析を行った。ここで、使用した培地はＩＬ２を含まない１６４０完全培地であり、最初のＴＣＲ Ｔ細胞は１×１０５細胞であり、各時点のサンプルは独立してインキュベートし、残りの共インキュベートサンプルはそれぞれ２日目、４日目に、液体を半分交換し、標的細胞を補充した。フローサイトメトリーに用いた細胞をまず抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、投入時に指定体積の細胞を収集して記録し、換算して系内のＴ細胞の数を把握した（図１４参照）。絶対Ｔ細胞数の増殖曲線から、Ｅ３１５－ＴＣＲ Ｔ細胞は２つの抗原エピトープを認識した後に最も活性化し増殖したことがわかった。さらに、さらに系内のエフェクター／ターゲット比を分析すると（図１５参照）、増殖結果と同様に、Ｅ３１５－ＴＣＲ Ｔ細胞は最も強い腫瘍除去能力を示した。
３）ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲのインビトロ機能検証
Ｒａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－ＬＭＰ２、ＬＭＰ２をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞、Ｅ２３－ＴＣＲＴ、Ｅ２４０－ＴＣＲＴ細胞及び１Ｇ４ Ｔ細胞を１：０．５、１：１、１：２の数量の比で共培養し、共培養２４時間後、細胞と上清をそれぞれ収集し、Ｅ２３－ＴＣＲＴとＥ２４０－ＴＣＲＴ細胞の活性化と標的細胞の死亡を予備的に検出した。細胞外サイトカインＴＮＦα、ＩＬ２及びＩＦＮγ（図１６参照）の放出レベルから見ると、Ｅ２４０－ＴＣＲＴとＥ２３－ＴＣＲＴは標的細胞との共培養後、対照群１Ｇ４ Ｔと比べ、Ｔ細胞の活性化を顕著に引き起こすことができる。そして、標的細胞の分解後に放出されたルシフェラーゼの量は標的細胞の死亡状況を反映することができる（図１６参照）。実験の結果、本発明の実施例により構築されたＥ２３－ＴＣＲＴ及びＥ２４０－ＴＣＲＴ細胞が、ＥＢＶ ＬＭＰ２抗原ペプチド提示細胞によって特異的に活性化され、標的細胞を著しく殺傷できることが証明された。
Ｒａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊２４０２－抗原ペプチド、抗原ペプチドをトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞、抗原ペプチドを添加しているＴ２－ＨＬＡ２４０２細胞、及び抗原ペプチドを添加していないＴ２－ＨＬＡ２４０２細胞をそれぞれＥ２９－ＴＣＲＴ、Ｅ１８０－１－ＴＣＲＴ細胞、１Ｇ４ Ｔ細胞と１：３の数量の比で共培養し、共培養２４時間後、細胞と上清をそれぞれ収集し、Ｅ２９－ＴＣＲ Ｔ及び１８０－１－ＴＣＲＴ細胞の活性化を予備的に検出した。細胞外サイトカインＩＬ２及びＩＦＮγ（図１７参照）の放出レベルから見ると、Ｅ２９－ＴＣＲＴ及び１８０－１－ＴＣＲＴ細胞は標的細胞との共培養後、対照群１Ｇ４ Ｔと比べ、Ｔ細胞の活性化を顕著に引き起こすことができる。そして、細胞外サイトカイン（図１８参照）の放出レベルから見ると、Ｅ４４－ＴＣＲＴ細胞は標的細胞との共培養後、対照群ＲＦＰ Ｔと比べ、同じくＴ細胞の活性化を顕著に引き起こすことができる。実験の結果、本発明の実施例により構築されたＥ２９－ＴＣＲＴ、Ｅ１８０－１－ＴＣＲＴ及びＥ４４－ＴＣＲＴ細胞が、ＥＢＶ ＬＭＰ２抗原ペプチド提示細胞により特異的に活性化され、標的細胞を著しく殺傷できることが証明された。
１、ヒト初代Ｔ細胞の単離、培養及びレンチウイルス感染
スクリーニングされたＴＣＲのＥＢＶ ＬＭＰ２抗原に対する認識と殺傷機能をさらに検証するために、リンパ球単離液Ｆｉｃｏｌｌを用いてボランティアの末梢血から単核球（ＰＢＭＣ）を単離して得た後、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の製品取扱書に従って、ＰＢＭＣから陰性選別法によりＴ細胞を取得し、１００Ｕ／ｍＬ ＩＬ２を含む１６４０完全培地で細胞を１×１０６細胞／ｍＬに再懸濁させ、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆された培養皿で培養して活性化した。活性化４８時間後、ＴＣＲをロードしたウイルス顆粒（実施例３で製造）をレンチウイルス系でＴ細胞に感染させ、感染方法は３２℃、１５００ｒｐｍで２時間遠心分離し、取り出した後３７℃細胞インキュベータで１０時間培養し、その後、培地の交換により感染を停止し、３７℃細胞インキュベータで培養を続けることである。感染３日後、フローサイトメータでＴＣＲ陽性細胞を選別し、ＴＣＲＴ細胞（上記Ｅ２３、Ｅ２４０、Ｅ２９、Ｅ１８０－１、Ｅ４４、Ｅ１４１，Ｅ１４９、Ｅ１６８、Ｅ１７０、Ｅ２４４、Ｅ２４５、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４、Ｅ３０５、Ｅ３０７、Ｅ３１４、Ｅ３１５、Ｅ３１６、Ｅ３１７、Ｅ３１８、Ｅ３２０を含む）を得た。
２、標的細胞の構築
ＬＭＰ２－ＲＦＰ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－ＢＳＤ／ＨＬＡ－Ａ＊２４０２－ＢＳＤ／ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＢＳＤ及びＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＧＦＰをそれぞれロードしたウイルス顆粒をレンチウイルス系で対数成長期のＲａｊｉ細胞に感染させた。薬物スクリーニング及びフローサイトメトリー選別により、ＬＭＰ２、ＨＬＡ－Ａ分子及びＬｕｃｉｆｅｒａｓ－ＧＦＰを同時に安定に発現させたＲａｊｉ細胞を得、Ｒａｊｉ－ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０２０１／２４０２／１１０１－ＬＭＰ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅと命名した。また、対数成長期のＥＢＶ－ＬＣＬ細胞にＨＬＡ－Ａ＊０２０１－ＢＳＤ／ＨＬＡ－Ａ＊２４０２－ＢＳＤ／ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＢＳＤのウイルス粒子を感染させた。薬物スクリーニングにより、ＨＬＡ－Ａ分子を安定に発現させたＥＢＶ－ＬＣＬ細胞を得、それぞれＥＢＶ－ＬＣＬ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＥＢＶ－ＬＣＬ－ＨＬＡ－Ａ＊２４０２、ＥＢＶ－ＬＣＬ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１細胞と命名した。
３、ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲのインビトロ機能検証
１）内在性レベルの抗原エピトープに対するＴＣＲ認識能力の検証
ＥＢＶ－ＬＣＬは、即ち、ＥＢウイルスに感染された後不死化したヒトＢ細胞であり、生体内腫瘍細胞中の抗原レベルをリアルにシミュレーションした。そこで、ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫエピトープを認識するＴＣＲ Ｔ細胞とＥＢＶ－ＬＣＬ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１細胞をエフェクター／ターゲット比８：１、４：１、２：１、１：１、０．５：１、０．２５：１で共培養し、ここで、標的細胞は１×１０５細胞に一定させた。２４時間インキュベートした後、上清を収集して、分泌したサイトカインＩＬ２（図１２）とＩＦＮ－γ（図１３）を検出することに用いた。サイトカイン放出レベルから見ると、ＴＣＲ：Ｅ１４１、Ｅ１７０、Ｅ２５４及びＥ３１５が内因性レベルのＬＳＫに結合すると、Ｔ細胞を顕著に活性化できた。特に、Ｅ３１５ ＴＣＲ Ｔ細胞は、それぞれのエフェクター／ターゲット比の濃度で最高のＩＦＮ－γレベルを示しただけでなく、対応するＩＬ２値も高く、その結果から、本発明により製造されたＴＣＲが腫瘍内因性抗原の認識を効果的に媒介できることを示した。
２）ＴＣＲ Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する長期殺傷能力の検証
ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫエピトープを認識するＴＣＲ Ｔ細胞とＲａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞をエフェクター／ターゲット比１：３から開始して共培養し、０日目とし、その後、それぞれ１日目、３日目、５日目に細胞を採取してフローサイトメトリー分析を行った。ここで、使用した培地はＩＬ２を含まない１６４０完全培地であり、最初のＴＣＲ Ｔ細胞は１×１０５細胞であり、各時点のサンプルは独立してインキュベートし、残りの共インキュベートサンプルはそれぞれ２日目、４日目に、液体を半分交換し、標的細胞を補充した。フローサイトメトリーに用いた細胞をまず抗ヒトＣＤ３抗体で染色し、投入時に指定体積の細胞を収集して記録し、換算して系内のＴ細胞の数を把握した（図１４参照）。絶対Ｔ細胞数の増殖曲線から、Ｅ３１５－ＴＣＲ Ｔ細胞は２つの抗原エピトープを認識した後に最も活性化し増殖したことがわかった。さらに、さらに系内のエフェクター／ターゲット比を分析すると（図１５参照）、増殖結果と同様に、Ｅ３１５－ＴＣＲ Ｔ細胞は最も強い腫瘍除去能力を示した。
３）ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲのインビトロ機能検証
Ｒａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－ＬＭＰ２、ＬＭＰ２をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞、Ｅ２３－ＴＣＲＴ、Ｅ２４０－ＴＣＲＴ細胞及び１Ｇ４ Ｔ細胞を１：０．５、１：１、１：２の数量の比で共培養し、共培養２４時間後、細胞と上清をそれぞれ収集し、Ｅ２３－ＴＣＲＴとＥ２４０－ＴＣＲＴ細胞の活性化と標的細胞の死亡を予備的に検出した。細胞外サイトカインＴＮＦα、ＩＬ２及びＩＦＮγ（図１６参照）の放出レベルから見ると、Ｅ２４０－ＴＣＲＴとＥ２３－ＴＣＲＴは標的細胞との共培養後、対照群１Ｇ４ Ｔと比べ、Ｔ細胞の活性化を顕著に引き起こすことができる。そして、標的細胞の分解後に放出されたルシフェラーゼの量は標的細胞の死亡状況を反映することができる（図１６参照）。実験の結果、本発明の実施例により構築されたＥ２３－ＴＣＲＴ及びＥ２４０－ＴＣＲＴ細胞が、ＥＢＶ ＬＭＰ２抗原ペプチド提示細胞によって特異的に活性化され、標的細胞を著しく殺傷できることが証明された。
Ｒａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊２４０２－抗原ペプチド、抗原ペプチドをトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞、抗原ペプチドを添加しているＴ２－ＨＬＡ２４０２細胞、及び抗原ペプチドを添加していないＴ２－ＨＬＡ２４０２細胞をそれぞれＥ２９－ＴＣＲＴ、Ｅ１８０－１－ＴＣＲＴ細胞、１Ｇ４ Ｔ細胞と１：３の数量の比で共培養し、共培養２４時間後、細胞と上清をそれぞれ収集し、Ｅ２９－ＴＣＲ Ｔ及び１８０－１－ＴＣＲＴ細胞の活性化を予備的に検出した。細胞外サイトカインＩＬ２及びＩＦＮγ（図１７参照）の放出レベルから見ると、Ｅ２９－ＴＣＲＴ及び１８０－１－ＴＣＲＴ細胞は標的細胞との共培養後、対照群１Ｇ４ Ｔと比べ、Ｔ細胞の活性化を顕著に引き起こすことができる。そして、細胞外サイトカイン（図１８参照）の放出レベルから見ると、Ｅ４４－ＴＣＲＴ細胞は標的細胞との共培養後、対照群ＲＦＰ Ｔと比べ、同じくＴ細胞の活性化を顕著に引き起こすことができる。実験の結果、本発明の実施例により構築されたＥ２９－ＴＣＲＴ、Ｅ１８０－１－ＴＣＲＴ及びＥ４４－ＴＣＲＴ細胞が、ＥＢＶ ＬＭＰ２抗原ペプチド提示細胞により特異的に活性化され、標的細胞を著しく殺傷できることが証明された。
実施例６：ＣＤＲ３モチーフを共有するＴＣＲ機能の比較
ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫエピトープを認識するＥ１４１、Ｅ１４９、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４及びＥ３１４はＴＣＲα鎖とβ鎖のＣＤＲ３高度可変領域で全て非常に保存的であると同定したため、配列は１つのアミノ酸が異なるほど高度に類似しているが、機能的には大きく異なっている（図９及び図１１）。なぜなら、これらの保存的ＣＤＲ３モチーフを有するＴＣＲはｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲと定義され、これらの保存配列を有しないＴＣＲはｐｒｉｖａｔｅ ＴＣＲと定義されるからである。この実施例では、ｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲの構造的親和性及び機能が分析された。
１、ＢＦＰ法によるｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲの構造親和性の測定
赤血球を片側の微量吸液管に固定し、ｐＭＨＣ分子が特異的に埋め込まれたビーズを赤血球の表面に吸着させ、極高感受性のバイオフィルム力学プローブ（ＢＦＰ）を形成し、それとともに、ＪＣＲ－ＴＣＲ細胞を反対側の微量吸液管に固定し、圧電式センサにより両者の接触を制御し、１サイクル当たりの接触時に印加圧力１０ｐＮ、接触時間０．１ｓとし、次に、１０００ｐＮ／ｓの速度で分離し、次のサイクルを開始した。過程全体にわたって顕微鏡で赤血球－ビーズ表面のひずみを記録し、結合形成の有無と持続時間を判定した。図１９の結合形成持続時間から分かるように、ｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲ間では、ＬＳＫエピトープへの構造的親和性にばらつきがあるが、その中で、Ｅ３０４は良好な機能を有し、Ｔ２の結果と一致している（図９）。
２．Ａｌａｎｉｎｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ法による保存的ＣＤＲ３モチーフの機能の分析
ＴＣＲ Ｅ１４１ α鎖とβ鎖のＣＤＲ３領域の先頭よりも後のアミノ酸を順次アラニンに突然変異し、ａ２－ａ９及びｂ２－ｂ１１と命名し、ｐＨＡＧＥレンチウイルスベクターに構築し、ウイルスをパッケージングした後、ヒト初代Ｔ細胞（ＭＯＩ＝１０）に感染し、感染３日後、フローサイトメトリーでＴＣＲ陽性細胞を選別できた。選別したＴＣＲ Ｔ細胞とＲａｊｉ－ＬＭＰ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞を１：１のエフェクター／ターゲット比で共培養し、ここで、Ｔ細胞は１×１０５細胞であった。２４時間共インキュベート後、細胞と上清をそれぞれ収集し、細胞は沈殿分解後、生存している標的細胞から放出されたルシフェラーゼ量の測定に用い（図２０）、上清はＴＣＲ Ｔ細胞から分泌されたサイトカインＩＬ２の測定に用いた（図２１）。図２０及び図２１より、ＨＬＡ ｕｎｍａｔｃｈｅｄ－Ｒａｊｉ細胞、又はＴＣＲ－Ｔ細胞無添加ＬＡ ｍａｔｃｈｅｄ－Ｒａｊｉ及びＴＣＲ未トランスフェクションｐａｎ－Ｔ細胞添加ＨＬＡ ｍａｔｃｈｅｄ－Ｒａｊｉの対照群のバックグラウンド値と比較して、突然変異のないＥ１４１はＨＬＡ ｍａｔｃｈｅｄ－Ｒａｊｉに遭遇すると標的細胞を効果的に除去し、多くのサイトカインＩＬ２を特異的に産生していることが分かった。しかし、ａ３、ａ５、ａ６及びｂ６、ｂ７、ｂ８の部位では、個々のアミノ酸の突然変異がＴＣＲ Ｔ細胞を完全に不活性化させるのに十分であった。これらの実験結果から、これらのｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲが同じ保存的モチーフを共有しているにもかかわらず、１つのアミノ酸の違いによって相互の機能が大きく異なっている可能性があることを共に示唆している。
ＳＳＣＳＳＣＰＬＳＫ／ＳＳＣＳＳＣＰＬＴＫエピトープを認識するＥ１４１、Ｅ１４９、Ｅ２５４、Ｅ３０１、Ｅ３０４及びＥ３１４はＴＣＲα鎖とβ鎖のＣＤＲ３高度可変領域で全て非常に保存的であると同定したため、配列は１つのアミノ酸が異なるほど高度に類似しているが、機能的には大きく異なっている（図９及び図１１）。なぜなら、これらの保存的ＣＤＲ３モチーフを有するＴＣＲはｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲと定義され、これらの保存配列を有しないＴＣＲはｐｒｉｖａｔｅ ＴＣＲと定義されるからである。この実施例では、ｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲの構造的親和性及び機能が分析された。
１、ＢＦＰ法によるｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲの構造親和性の測定
赤血球を片側の微量吸液管に固定し、ｐＭＨＣ分子が特異的に埋め込まれたビーズを赤血球の表面に吸着させ、極高感受性のバイオフィルム力学プローブ（ＢＦＰ）を形成し、それとともに、ＪＣＲ－ＴＣＲ細胞を反対側の微量吸液管に固定し、圧電式センサにより両者の接触を制御し、１サイクル当たりの接触時に印加圧力１０ｐＮ、接触時間０．１ｓとし、次に、１０００ｐＮ／ｓの速度で分離し、次のサイクルを開始した。過程全体にわたって顕微鏡で赤血球－ビーズ表面のひずみを記録し、結合形成の有無と持続時間を判定した。図１９の結合形成持続時間から分かるように、ｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲ間では、ＬＳＫエピトープへの構造的親和性にばらつきがあるが、その中で、Ｅ３０４は良好な機能を有し、Ｔ２の結果と一致している（図９）。
２．Ａｌａｎｉｎｅ Ｓｃａｎｎｉｎｇ法による保存的ＣＤＲ３モチーフの機能の分析
ＴＣＲ Ｅ１４１ α鎖とβ鎖のＣＤＲ３領域の先頭よりも後のアミノ酸を順次アラニンに突然変異し、ａ２－ａ９及びｂ２－ｂ１１と命名し、ｐＨＡＧＥレンチウイルスベクターに構築し、ウイルスをパッケージングした後、ヒト初代Ｔ細胞（ＭＯＩ＝１０）に感染し、感染３日後、フローサイトメトリーでＴＣＲ陽性細胞を選別できた。選別したＴＣＲ Ｔ細胞とＲａｊｉ－ＬＭＰ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ標的細胞を１：１のエフェクター／ターゲット比で共培養し、ここで、Ｔ細胞は１×１０５細胞であった。２４時間共インキュベート後、細胞と上清をそれぞれ収集し、細胞は沈殿分解後、生存している標的細胞から放出されたルシフェラーゼ量の測定に用い（図２０）、上清はＴＣＲ Ｔ細胞から分泌されたサイトカインＩＬ２の測定に用いた（図２１）。図２０及び図２１より、ＨＬＡ ｕｎｍａｔｃｈｅｄ－Ｒａｊｉ細胞、又はＴＣＲ－Ｔ細胞無添加ＬＡ ｍａｔｃｈｅｄ－Ｒａｊｉ及びＴＣＲ未トランスフェクションｐａｎ－Ｔ細胞添加ＨＬＡ ｍａｔｃｈｅｄ－Ｒａｊｉの対照群のバックグラウンド値と比較して、突然変異のないＥ１４１はＨＬＡ ｍａｔｃｈｅｄ－Ｒａｊｉに遭遇すると標的細胞を効果的に除去し、多くのサイトカインＩＬ２を特異的に産生していることが分かった。しかし、ａ３、ａ５、ａ６及びｂ６、ｂ７、ｂ８の部位では、個々のアミノ酸の突然変異がＴＣＲ Ｔ細胞を完全に不活性化させるのに十分であった。これらの実験結果から、これらのｐｕｂｌｉｃ ＴＣＲが同じ保存的モチーフを共有しているにもかかわらず、１つのアミノ酸の違いによって相互の機能が大きく異なっている可能性があることを共に示唆している。
実施例７：動物モデルの構築及びＥＢＶ ＴＣＲＴの生体内機能の検出
ＥＢウイルスは主に鼻咽頭上皮細胞とＢ細胞に感染し、鼻咽頭がんと多種のＢ細胞リンパ腫の発生、発展と密接に関連している。本実施例では、同定されたＴＣＲの生体内機能を検証するために、Ｂ細胞リンパ腫マウスモデル及び鼻咽頭がん固形腫瘍モデルをそれぞれ構築した。
１．リンパ腫モデル及びＴＣＲＴの生体内機能の検出
３×１０５ Ｒａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１／０２０１／２４０２－ＬＭＰ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ腫瘍細胞を５～６週齢のＮＯＤ／Ｓｃｉｄ ＩＬ－２Ｒγ ｎｕｌｌ （ＮＣＧ）雌マウスに尾静脈を通して接種し、リンパ腫モデルを構築し（図２２、２３、２４参照）、これを１日目とし、５日目に、マウスを、Ａ：ＰＢＳ注射群（等体積ＰＢＳ注射）、Ｂ：対照ＴＣＲＴ細胞注射群（ＴＣＲ－１Ｇ４ Ｔ細胞）、Ｃ：ＥＢＶ ＴＣＲＴ注射群（Ｅ１４１－ＴＣＲＴ細胞）の３群に分け、Ｂ／Ｃ群マウスは５×１０６ ＴＣＲ Ｔ細胞を尾静脈注射し、Ａ群は等体積２００μＬのＰＢＳを注射した。８日目に、二次注射を行い、具体的な操作は５日目と一致した。他のＴＣＲ Ｔ細胞の具体的な再輸注量と再輸注時間を図２２、２３に示す。その後の数週間で、マウス体内の腫瘍細胞の成長状況、Ｔ細胞の生体内増殖状況、及びマウスの生存状況をモニタリングした。図２４に示すように、本発明の実施例で構築されたＥＢＶ特異的Ｅ１４１－ＴＣＲＴ細胞は、対照群と比較して、マウスの体内腫瘍細胞を顕著に殺傷し、マウスの生存率を向上させることができる。さらに、図２２、２３に示すように、本発明の実施例で構築されたＥＢＶ特異的Ｅ２３－ＴＣＲＴ、Ｅ２４０－ＴＣＲＴ、Ｅ２９－ＴＣＲＴ、Ｅ４４－ＴＣＲＴ細胞は、対照群と比較して、同じくマウスの体内腫瘍細胞を顕著に殺傷し、マウスの生存率を向上させることができる。
２、固形腫瘍モデル
１×１０６Ｃ６６６－１－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ腫瘍細胞を５～６週齢のＮＣＧ雌マウスに皮下接種し、鼻咽頭がん固形腫瘍モデルを構築し（図２５参照）、これを０日目とし、７日後、マウスを、Ａ：ＰＢＳ注射群（等体積ＰＢＳ注射）、Ｂ：対照ＴＣＲ－Ｔ細胞注射群（ＴＣＲ－１Ｇ４ Ｔ細胞）、Ｃ：ＥＢＶ ＴＣＲ－Ｔ注射群（Ｅ１４１－ＴＣＲＴ細胞）の３群に分け、Ｂ／Ｃ群マウスは３×１０６Ｔ細胞を尾静脈注射し、Ａ群は等体積２００μＬのＰＢＳを注射した。その後の数週間で、マウスの体内腫瘍細胞の成長状況、Ｔ細胞の体内増殖状況、及びマウスの生存状況をモニタリングした。図２５、図２６、及び図２７に示すように、本発明の実施例で構築されたＥＢＶ特異的Ｅ１４１－ＴＣＲＴ細胞は、対照群と比較して、マウスの腫瘍細胞を顕著に殺傷でき（図２５、図２６）、再輸注されたＴＣＲ Ｔ細胞はインビボで特異的に増殖する（図２７）。
ＥＢウイルスは主に鼻咽頭上皮細胞とＢ細胞に感染し、鼻咽頭がんと多種のＢ細胞リンパ腫の発生、発展と密接に関連している。本実施例では、同定されたＴＣＲの生体内機能を検証するために、Ｂ細胞リンパ腫マウスモデル及び鼻咽頭がん固形腫瘍モデルをそれぞれ構築した。
１．リンパ腫モデル及びＴＣＲＴの生体内機能の検出
３×１０５ Ｒａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１／０２０１／２４０２－ＬＭＰ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ腫瘍細胞を５～６週齢のＮＯＤ／Ｓｃｉｄ ＩＬ－２Ｒγ ｎｕｌｌ （ＮＣＧ）雌マウスに尾静脈を通して接種し、リンパ腫モデルを構築し（図２２、２３、２４参照）、これを１日目とし、５日目に、マウスを、Ａ：ＰＢＳ注射群（等体積ＰＢＳ注射）、Ｂ：対照ＴＣＲＴ細胞注射群（ＴＣＲ－１Ｇ４ Ｔ細胞）、Ｃ：ＥＢＶ ＴＣＲＴ注射群（Ｅ１４１－ＴＣＲＴ細胞）の３群に分け、Ｂ／Ｃ群マウスは５×１０６ ＴＣＲ Ｔ細胞を尾静脈注射し、Ａ群は等体積２００μＬのＰＢＳを注射した。８日目に、二次注射を行い、具体的な操作は５日目と一致した。他のＴＣＲ Ｔ細胞の具体的な再輸注量と再輸注時間を図２２、２３に示す。その後の数週間で、マウス体内の腫瘍細胞の成長状況、Ｔ細胞の生体内増殖状況、及びマウスの生存状況をモニタリングした。図２４に示すように、本発明の実施例で構築されたＥＢＶ特異的Ｅ１４１－ＴＣＲＴ細胞は、対照群と比較して、マウスの体内腫瘍細胞を顕著に殺傷し、マウスの生存率を向上させることができる。さらに、図２２、２３に示すように、本発明の実施例で構築されたＥＢＶ特異的Ｅ２３－ＴＣＲＴ、Ｅ２４０－ＴＣＲＴ、Ｅ２９－ＴＣＲＴ、Ｅ４４－ＴＣＲＴ細胞は、対照群と比較して、同じくマウスの体内腫瘍細胞を顕著に殺傷し、マウスの生存率を向上させることができる。
２、固形腫瘍モデル
１×１０６Ｃ６６６－１－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＬＭＰ２－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ腫瘍細胞を５～６週齢のＮＣＧ雌マウスに皮下接種し、鼻咽頭がん固形腫瘍モデルを構築し（図２５参照）、これを０日目とし、７日後、マウスを、Ａ：ＰＢＳ注射群（等体積ＰＢＳ注射）、Ｂ：対照ＴＣＲ－Ｔ細胞注射群（ＴＣＲ－１Ｇ４ Ｔ細胞）、Ｃ：ＥＢＶ ＴＣＲ－Ｔ注射群（Ｅ１４１－ＴＣＲＴ細胞）の３群に分け、Ｂ／Ｃ群マウスは３×１０６Ｔ細胞を尾静脈注射し、Ａ群は等体積２００μＬのＰＢＳを注射した。その後の数週間で、マウスの体内腫瘍細胞の成長状況、Ｔ細胞の体内増殖状況、及びマウスの生存状況をモニタリングした。図２５、図２６、及び図２７に示すように、本発明の実施例で構築されたＥＢＶ特異的Ｅ１４１－ＴＣＲＴ細胞は、対照群と比較して、マウスの腫瘍細胞を顕著に殺傷でき（図２５、図２６）、再輸注されたＴＣＲ Ｔ細胞はインビボで特異的に増殖する（図２７）。
以上、本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態の詳細に限定されるものではなく、本発明の技術的発想の範囲内において、本発明の技術的解決手段について各種の簡単な変形を行うことができ、これらの簡単な変形は全て本発明の保護範囲に属する。
なお、上記した特定実施形態に記載された各具体的な技術的特徴は、矛盾しない限り、任意の適切な方法で組み合わせてもよく、不必要な重複を避けるために、本発明は種々の可能な組み合わせの方法については別途説明しない。
本発明の１つの特定実施形態では、前記ＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及びＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βは以下のいずれか１群から選ばれる。
Claims (32)
- ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、
前記ＣＤＲは配列番号３５～１１７の１種又は２種以上の組み合わせから選ばれることを特徴とする相補性決定領域（ＣＤＲ）。 - ＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及び／又はＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含み、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるか、又は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるか、又は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるか、又は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする請求項１に記載のＣＤＲ。
- 以下のいずれか１群から選ばれることを特徴とする請求項１又は２に記載のＣＤＲ。
- ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２に結合するα鎖ポリペプチドであって、
ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α及び／又はＣＤＲ３αを含み、
ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるか、又は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とするα鎖ポリペプチド。 - 以下のＣＤＲ１α～ＣＤＲ３αのいずれか１群を含むことを特徴とする請求項４前記α鎖ポリペプチド。
- ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２に結合するβ鎖ポリペプチドであって、
ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及び／又はＣＤＲ３βを含み、
ＣＤＲ１βのアミノ酸配列は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるか、又は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるか、又は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とするβ鎖ポリペプチド。 - 以下のＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βのいずれか１群を含むことを特徴とする請求項６に記載のβ鎖ポリペプチド。
- ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２に特異的に結合し、
α鎖のＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及び／又はβ鎖のＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含み、
ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるか、又は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるか、又は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるか、又は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。 - 前記ＬＭＰ２の結合エピトープは配列番号２９～３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含むことを特徴とする請求項８に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記ＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及びＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βは以下のいずれか１群から選ばれることを特徴とする請求項８又は９に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体ｓｃＦｖであることを特徴とする請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- アミノ酸配列が配列番号５～２６のいずれか１つから選ばれるか、又は配列番号５～２６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする請求項８～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- ＥＢＶ潜伏期膜タンパク質ＬＭＰ２に特異的に結合し、
α鎖のＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及び／又はβ鎖のＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含み、
ＣＤＲ１αのアミノ酸配列は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号３５～４４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号４５～５４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるか、又は配列番号５５～７３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるか、又は配列番号７４～８４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるか、又は配列番号８５～９６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるか、又は配列番号９７～１１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とするＴ細胞抗原受容体。 - 前記ＬＭＰ２の結合エピトープは配列番号２９～３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含むことを特徴とする請求項１３に記載のＴ細胞抗原受容体。
- 前記ＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及びＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βは以下のいずれか１群から選ばれることを特徴とする請求項１３又は１４に記載のＴ細胞抗原受容体。
- アミノ酸配列が配列番号５～２６のいずれか１つから選ばれるか、又は配列番号５～２６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有することを特徴とする請求項１３～１５のいずれか一項に記載のＴ細胞抗原受容体。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤＲ、請求項４～５のいずれか一項に記載のα鎖ポリペプチド、請求項６～７のいずれか一項に記載のβ鎖ポリペプチド、請求項８～１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＴ細胞抗原受容体をコードすることを特徴とする核酸。
- 請求項１７に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
- 請求項１７に記載の核酸又は請求項１８に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤＲ、請求項４～５のいずれか一項に記載のα鎖ポリペプチド、請求項６～７のいずれか一項に記載のβ鎖ポリペプチド、請求項８～１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＴ細胞抗原受容体を発現させることを特徴とする免疫細胞。
- 陽性Ｔ細胞から請求項１７に記載の核酸配列をクローニングして得るステップ１）と、
初代Ｔ細胞を単離、培養するステップ２）と、
ステップ１）で得られた核酸配列をステップ２）の前記初代Ｔ細胞に送達し、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤＲ、請求項４～５のいずれか一項に記載のα鎖ポリペプチド、請求項６～７のいずれか一項に記載のβ鎖ポリペプチド又は請求項１３～１６のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体を発現させる組換えＴ細胞を得るステップ３）と、を含むことを特徴とする組換えＴ細胞の製造方法。 - 陽性Ｔ細胞から請求項１７に記載の核酸配列をクローニングして得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた核酸配列をベクター骨格に連結し、発現ベクターを得るステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた発現ベクターを宿主細胞に形質転換し、次に、その発現を誘導するステップ（３）と、
抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体を得るステップ（４）と、を含むことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体の製造方法。 - 請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＴ細胞抗原受容体を含むことを特徴とする多量体複合体。
- 単量体、ビオチン分子、及びストレプトアビジン分子又はアビジン分子をさらに含み、
前記単量体はＭＨＣ分子α鎖細胞外領域と、β２ｍ鎖と、抗原ペプチドと、を含み、前記単量体は前記ビオチン分子にカップリングされ、前記ビオチン分子は前記ストレプトアビジン又はアビジン分子に結合されることを特徴とする請求項２３に記載の多量体複合体。 - 前記抗原ペプチドは配列番号２９～３４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含むことを特徴とする請求項２４に記載の多量体複合体。
- 前記ＭＨＣ分子はＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２及びＨＬＡ－Ａ＊１１０１から選ばれることを特徴とする請求項２４又は２５に記載の多量体複合体。
- Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖を発現して精製するステップＩ）と、
抗原ペプチド、ステップＩ）で得られたＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖をリフォールディングして、単量体を製造するステップＩＩ）と、
ステップＩＩ）で製造された単量体をビオチン化し、ビオチン化単量体を得るステップＩＩＩ）と、
ステップＩＩＩ）で得られたビオチン化単量体と蛍光標識付きのストレプトアビジン又はアビジンとを反応させ、抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体を製造するステップＩＶ）と、
ステップＩＶ）で得られた抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体とＴ細胞とを共インキュベートし、Ｔ細胞抗原受容体と抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体の複合体を形成し、特異的Ｔ細胞抗原受容体を抽出するステップＶ）と、を含むことを特徴とする請求項２３～２６のいずれか一項に記載の多量体複合体の製造方法。 - 請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤＲ、請求項４～５のいずれか一項に記載のα鎖ポリペプチド、請求項６～７のいずれか一項に記載のβ鎖ポリペプチド、請求項８～１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＴ細胞抗原受容体、請求項１７に記載の核酸、請求項１８に記載の発現ベクター、請求項１９に記載の宿主細胞、請求項２０に記載の免疫細胞又は請求項２３～２６のいずれか一項に記載の多量体複合体の、ＥＢＶ関連疾患を診断又は治療する製品の製造における使用。
- 前記ＥＢＶ関連疾患は、伝染性単球症、連鎖リンパ球増殖症候群、ウイルス性血球貪食症候群、口腔毛状白板症、ウイルス性髄膜炎、末梢神経炎、ウイルス性肺炎、ウイルス性心筋炎、鼻咽頭がん、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、胃がん、肝細胞がん、リンパ上皮様肉腫、唾液腺腫瘍、乳がん、胸腺腫、原発性滲出性リンパ腫及びＢ／Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫から選ばれることを特徴とする請求項２８に記載の使用。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤＲ、請求項４～５のいずれか一項に記載のα鎖ポリペプチド、請求項６～７のいずれか一項に記載のβ鎖ポリペプチド、請求項８～１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＴ細胞抗原受容体、請求項１７に記載の核酸、請求項１８に記載の発現ベクター、請求項１９に記載の宿主細胞、請求項２０に記載の免疫細胞又は請求項２３～２６のいずれか一項に記載の多量体複合体の、Ｔ細胞標識、検出、細胞選別又は活性化における使用。
- 以下の、
ｉ）請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤＲ
ｉｉ）請求項４～５のいずれか一項に記載のα鎖ポリペプチド
ｉｉｉ）請求項６～７のいずれか一項に記載のβ鎖ポリペプチド
ｉｖ）請求項８～１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片
ｖ）請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＴ細胞抗原受容体
ｖｉ）請求項１７に記載の核酸
ｖｉｉ）請求項１８に記載の発現ベクター
ｖｉｉｉ）請求項１９に記載の宿主細胞
ｉｘ）請求項２０に記載の免疫細胞又は
ｘ）請求項２３～２６のいずれか一項に記載の多量体複合体
いずれか１群を含む医薬組成物。 - 以下の
ｉ）請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＤＲ
ｉｉ）請求項４～５のいずれか一項に記載のα鎖ポリペプチド
ｉｉｉ）請求項６～７のいずれか一項に記載のβ鎖ポリペプチド
ｉｖ）請求項８～１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片
ｖ）請求項１３～１６のいずれか一項に記載のＴ細胞抗原受容体
ｖｉ）請求項１７に記載の核酸
ｖｉｉ）請求項１８に記載の発現ベクター
ｖｉｉｉ）請求項１９に記載の宿主細胞
ｉｘ）請求項２０に記載の免疫細胞又は
ｘ）請求項２３～２６のいずれか一項に記載の多量体複合体
いずれか１群を含むキット。
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