JP2023522289A - 生物学的に活性な代謝産物の発見および進化 - Google Patents

生物学的に活性な代謝産物の発見および進化 Download PDF

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Abstract

【解決手段】本開示は、酵素機能を調節する小分子を生成する代謝経路の発見と進化のためのシステム、方法、試薬、装置、ベクター、および宿主細胞を提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）にて２０２０年１月８日に出願された米国仮出願第６２／９５８，３６８号の利益を主張するものであり、当該文献は全体における引用によって本明細書に組み込まれる。
政府の支援
本発明は、米国国立科学財団によって与えられた認可番号１７５０２４４号の下、米国政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有している。
本明細書では、酵素機能を調節する小分子を生成する代謝経路の発見と進化のためのシステム、方法、試薬、装置、ベクター、および宿主細胞が開示される。
天然生成物およびその誘導体は、長年にわたって医薬品や医薬製剤の原料として使用されてきた１－３。これらの分子は、おそらく、その生物学的起源のせいか、好ましい薬理学的特性（例えば、生物学的利用能や「代謝産物類似性」など）を示す傾向があり１，４、驚くほど多様な治療効果（例えば、鎮痛、抗ウイルス、抗腫瘍、抗炎症、細胞毒性、免疫抑制、および、免疫刺激）を発揮することができる５－１０。また、合成生物学や代謝工学の近年の進歩により、既知の薬学的に関連する天然生成物の効率的な生合成や機能化のための新しいアプローチが提供されてきた１１－１３。しかしながら、特定の治療的に関連する活性を有する新規化合物の発見や最適化のための補完的な方法は、未だに開発されていない１４。
既存の天然生成物を発見するための戦略は、ほとんどが無指向性であり、また範囲も限られている。例えば、大規模な天然生成物ライブラリのスクリーニング－－時にはコンビナトリアル（バイオ）ケミストリーで増強した－－１５－１７により、重要な薬効成分を有する分子が発見されてきたが１８、これらのスクリーニングは資源を大量に必要とし、ほとんどがセレンディピティに左右されるものであった１９。対照的に、生物情報学的ツールにより、生合成遺伝子クラスターを同定することができ２０、２１、共存した耐性遺伝子が存在している場合、その生成物の生化学的機能を明らかにすることができる２２。しかしながら、薬学的に関連する代謝産物の多くの治療活性は、その本来の機能とは異なり２３、ほとんどの生合成経路は、適切に再構成されると、まったく新しい、そしておそらくより効果的な治療分子を生み出すことができる１２，２４。
微生物系は、培養不可能な生物または低収量生物から天然生成物を生合成するための強力なプラットフォームとして台頭してきた２５，２６。最近の研究では、こうした系は、特定の治療関連活性を持つ代謝経路の発見と進化も可能にすることが示されている（ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／４０８９６）。
本明細書では、酵素機能を調節する小分子を生成する代謝経路の発見と進化のためのシステム、方法、試薬、装置、ベクター、および宿主細胞が開示される。例えば、第１の遺伝的にコードされたシステムが細胞増殖を標的酵素の活性に結びつけ、第２の遺伝的にコードされたシステム（発見されるか、進化することになっている）が標的酵素の活性を調節する代謝産物を生成する微生物が提供される。本開示は、このアプローチを、タンパク質を翻訳後修飾する標的酵素のサブセット、フェニルプロパノイドまたは非リボソームペプチドを生成する代謝経路、および暗号化代謝経路の発見に適用するものである。本開示のいくつかの態様は、酵素活性の特定のモジュレーターを生成する、そのようなモジュレーターの改善された力価（出発経路と比較して）をもたらす、および／または（出発経路と比較して）減少した宿主毒性を示す、特定の再構成されたまたは進化した経路を提供する。特定の阻害効果を有する代謝産物も開示される。
一態様によれば、タンパク質の機能を調節する分子を生成する代謝経路の発見および進化のための方法が提供される。本方法は、目的の酵素などの目的のタンパク質を含む宿主細胞の集団を、異なる代謝経路を含む発現ベクターの集団と接触させる工程であって、宿主細胞が発現ベクターの集団の導入を受け入れることができる、工程と、宿主細胞の集団において代謝経路を発現させる工程であって、宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットは、前記細胞または宿主細胞の集団内の、前記細胞または宿主細胞の集団内の代謝経路が、目的の酵素などの目的のタンパク質を調節する生成物を生成するときに、検出可能な出力を生成する、工程と、宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットにおける検出可能な出力の測定を可能にする条件下で、宿主細胞の集団をスクリーニングする工程と、検出可能な出力を生成する宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットを単離する工程と、参照経路を保有する参照ベクター、例えば、宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットにおいて、目的の酵素などの目的のタンパク質の活性を調節するのに十分な濃度および／または効力を有する分子を生成しない経路をコードするベクターの出力よりも高い（ｐ＜０．０５）検出可能な出力をもたらす発現ベクターを単離する工程と、宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットにおいて、前記参照ベクターの出力よりも高い検出可能な出力をもたらす発現ベクターによってコードされる代謝経路の生成物を特徴づける工程と、を含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は遺伝的にコードされたシステムを含み、ここで、目的の酵素などの目的のタンパク質の活性は、タンパク質複合体の２つ以上の成分のいずれかが有していない活性を有するタンパク質複合体の組み立てを制御し、したがって、形成された複合体の量に比例して検出可能な出力をもたらす。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、最初は解離している２つのタンパク質を共有結合させるか、または非共有結合複合体を形成させる、翻訳後修飾を付加する酵素である。
いくつかの実施形態では、複合体は、ＳＨ２ドメインとそのリン酸化基質との間で形成される複合体の解離定数（Ｋｄ）以下のＫｄを有する２つのタンパク質によって形成される。
いくつかの実施形態では、目的の酵素は、リン酸の付加または除去以外の翻訳後修飾を付加する酵素であり、その修飾は、細胞内部で最初は解離している２つのタンパク質を共有結合させるか、またはＳＨ２ドメインとリン酸化ＳＨ２－基質ドメインとの間で形成される複合体の解離定数（Ｋｄ）以下のＫｄを有する複合体を形成させる（例えば、図１Ａに示すように）。
いくつかの実施形態では、代謝経路は、フェニルプロパノイドまたは非リボソームペプチドを産生する。
いくつかの実施形態では、異なる代謝経路を含む発現ベクターは、出発代謝経路内の１つ以上の遺伝子を変異させることによって生成される経路のライブラリを含む。
いくつかの実施形態では、代謝経路の１つ以上は、未知の生合成能力の遺伝子のセットを含む。
いくつかの実施形態では、参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路の生成物とは異なる生成物を生成する。
いくつかの実施形態では、参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路によって生成される生成物の量よりも多い量の生成物を生成する。
いくつかの実施形態では、参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路よりも低い細胞毒性を示す。
いくつかの実施形態では、代謝経路の生成物は、標準的な分析方法、好ましくは、ガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、および／または核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって特徴づけられる。
いくつかの実施形態では、方法は、生成物を単離する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、好ましくは、ロータリーエバポレーターを使用して、生成物を濃縮する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、目的の酵素などの目的のタンパク質に対する生成物の効果を試験する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、目的の酵素などの目的のタンパク質は、ユビキチンリガーゼ、ＳＵＭＯトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、パルミトイルトランスフェラーゼ、または関連ヒドロラーゼである。
いくつかの実施形態では、同定された生成物または分子（例えば、アモルファジエンおよび誘導体、タキサジエンおよび誘導体、β－ビサボレンおよび誘導体、α－ビサボレンおよび誘導体、ならびにα－ロンギピネンおよび誘導体）は、ＰＴＰが寄与する疾患、例えば、２型糖尿病、ＨＥＲ２陽性乳癌、またはレット症候群の処置のための薬物または薬物リードとして提供されて、そのような処置を必要としている対象に有効量の分子を投与することによってこのような疾患を処置する方法である。
別の態様によれば、目的のタンパク質を含む宿主細胞の集団と、異なる代謝経路を含む発現ベクターの集団とを含む、組成物または系が提供され、宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットは、代謝経路が目的のタンパク質を調節する生成物を生成する際に検出可能な出力を生成し、任意選択で、発現ベクターは、参照経路を保有する参照ベクター、例えば、宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットにおいて、目的のタンパク質の活性を調節するのに十分な濃度および／または効力を有する分子を生成しない経路をコードするベクターの出力よりも高い検出可能な出力をもたらす。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は遺伝的にコードされたシステムを含み、ここで、目的のタンパク質の活性は、タンパク質複合体の２つ以上の成分のいずれかが有していない活性を有するタンパク質複合体の組み立てを制御し、したがって、形成された複合体の量に比例して検出可能な出力をもたらす。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、最初は解離している２つのタンパク質を共有結合させるか、または非共有結合複合体を形成させる、翻訳後修飾を付加する酵素である。
いくつかの実施形態では、複合体は、ＳＨ２ドメインとそのリン酸化基質との間で形成される複合体の解離定数（Ｋｄ）以下のＫｄを有する２つのタンパク質によって形成される。
いくつかの実施形態では、代謝経路は、フェニルプロパノイドまたは非リボソームペプチドを産生する。
いくつかの実施形態では、異なる代謝経路を含む発現ベクターは、出発代謝経路内の１つ以上の遺伝子を変異させることによって生成される経路のライブラリを含む。
いくつかの実施形態では、代謝経路の１つ以上は、未知の生合成能力の遺伝子のセットを含む。
いくつかの実施形態では、参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路の生成物とは異なる生成物を生成する。
いくつかの実施形態では、参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路によって生成される生成物の量よりも多い量の生成物を生成する。
いくつかの実施形態では、参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路よりも低い細胞毒性を示す。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ユビキチンリガーゼ、ＳＵＭＯトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、パルミトイルトランスフェラーゼ、または関連ヒドロラーゼである。
別の態様では、本明細書に記載される発現ベクターの集団を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような目的のタンパク質を含む宿主細胞の集団をさらに含む。
本発明の限定の各々は、本発明の様々な実施形態を包含することができる。したがって、任意の１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の限定の各々は、本発明の各態様に含まれ得ることが予想される。本発明は、適用時、構造の詳細、および以下の記載に明記される、または図面で例証される構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の実施形態も可能であり、様々な方法で実施または実行され得る。
ＰＴＰ１Ｂの阻害と抗生物質耐性を結びつけるバクテリア－ツーハイブリッドシステムの開発。リン酸化依存性タンパク質間相互作用を検出するバクテリアツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システム。主な構成要素は、（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼのオメガサブユニットと融合した基質ドメイン（黄色）、（ｉｉ）４３４ファージｃＩリプレッサーと融合したＳＨ２ドメイン（水色）、（ｉｉｉ）４３４ｃＩのオペレーター（深緑）、（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼの結合部位（紫）、（ｖ）Ｓｒｃキナーゼ、および（ｖｉ）ＰＴＰ１Ｂを含んでいる。Ｓｒｃ触媒性の基質ドメインのリン酸化により、目的の遺伝子（ＧＯＩ、黒色）の転写を活性化する、基質とＳＨ２の相互作用が可能になる。ＰＴＰ１Ｂ触媒性の基質ドメインの脱リン酸化は、この相互作用を阻害する。ＰＴＰ１Ｂを阻害すると、再び相互作用が可能になる。 ＰＴＰ１Ｂの阻害と抗生物質耐性を結びつけるバクテリア－ツーハイブリッドシステムの開発。（ｉ）ＰＴＰ１Ｂを欠いており、かつ、（ｉｉ）基質ドメインとしてｐ１３０ｃａｓを、ＧＯＩとしてｌｕｘＡＢを含有する、Ｂ２Ｈシステムの一バージョン。誘導性プラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の特定成分の発現を増大させるために使用された。そのような１つのプラスミドからのＳｒｃの２次誘導は発光を増強した。図１Ｂ～図１Ｄのエラーバーは、ｎ＝３反復での標準誤差を示す。 ＰＴＰ１Ｂの阻害と抗生物質耐性を結びつけるバクテリア－ツーハイブリッドシステムの開発。（ｉ）ＰＴＰ１ＢとＳｒｃを欠き、かつ、（ｉｉ）ホスホペプチドへの親和性を増強したＳＨ２ドメイン（ＳＨ２＊）、可変基質ドメイン、および、ＧＯＩとしてＬｕｘＡＢを含む、Ｂ２Ｈシステムの一バージョン。誘導性プラスミドは、大腸菌中でのＳｒｃの発現を増大させるために使用された。基質ｐ１３０ｃａｓの配列（配列番号：２４）、ＭｉｄＴの配列（配列番号：２５）、ＥＧＦＲの配列（配列番号：２７）、およびＳｈｃＡ（配列番号：２６）の配列を示す。図１Ｂ～図１Ｄのエラーバーは、ｎ＝３反復での標準誤差を示す。 ＰＴＰ１Ｂの阻害と抗生物質耐性を結びつけるバクテリア－ツーハイブリッドシステムの開発。基質としてｐ１３０ｃａｓまたはＭｉｄＴのいずれかを有するｃからのＢ２Ｈシステム。第２のプラスミドを使用して、大腸菌において、（ｉ）ＳｒｃおよびＰＴＰ１Ｂ、または（ｉｉ）ＳｒｃおよびＰＴＰ１Ｂの不活性なバリアント（Ｃ２１５Ｓ）のいずれかを過剰発現させた。右：２つの単一プラスミドＢ２Ｈシステム。図１Ｂ～図１Ｄのエラーバーは、ｎ＝３反復での標準誤差を示す。 ＰＴＰ１Ｂの阻害と抗生物質耐性を結びつけるバクテリア－ツーハイブリッドシステムの開発。最適化されたシステムは、ＳＨ２＊、ｍｉｄＴ基質、最適化されたプロモーター、およびリボソーム結合部位（図１Ｄからのｂｂ０３４）、ならびにＧＯＩとしてＳｐｅｃＲを含む。ＰＴＰ１Ｂの不活性化により、このプラスミド由来の系を保有する大腸菌の株が、高濃度のスペクチノマイシン（＞２５０μｇ／ｍｌ）において生存することが可能となった。 ＰＴＰ１Ｂ阻害テルペノイドの生合成により、細胞の生存が可能になる。テルペノイド生合成のためのプラスミド由来の経路：（ｉ）ｐＭＢＩＳは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのメバロン酸依存性イソプレノイド経路を保有し、メバロン酸をイソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）およびファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）に変換する。（ｉｉ）テルペンシンターゼ（ＴＳ）と、必要に応じてゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）をコードするｐＴＳは、ＩＰＰとＦＰＰをセスキテルペンまたはジテルペンに変換する。 ＰＴＰ１Ｂ阻害テルペノイドの生合成により、細胞の生存が可能になる。４つのテルペンシンターゼ：アモルファジエンシンターゼ（ＡＤＳ）、γ－フムレンシンターゼ（ＧＨＳ）、アビエタジエンシンターゼ（ＡＢＳ）、およびタキサジエンシンターゼ（ＴＸＳ）。 ＰＴＰ１Ｂ阻害テルペノイドの生合成により、細胞の生存が可能になる。（ｉ）バクテリアツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システムと、（ｉｉ）ＴＳ特異的テルペノイド経路の両方を保有する（ｐＴＳは、ＡＢＳまたはＴＸＳが存在するときのみ、ＧＧＰＰＳを含む）の両方を保有する大腸菌の株のスペクチノマイシン耐性。ＡＤＳは、高濃度のスペクチノマイシン存在下での生存を可能にした。注：ＡＢＳＤ４０４Ａ／Ｄ６２１Ａは触媒的に不活性である。Ｂ２Ｈ＊はＰＴＰ１ＢＣ２１５Ｓを含み、これは不活性である。 微生物支援型指向性進化（ＭＡＤＥ）のための戦略。Ａ．代謝経路内の遺伝子のサブセットのエラープローンＰＣＲおよび／または部位飽和突然変異誘発により、代謝経路のライブラリが得られる。Ｂ．各々が（ｉ）Ｂ２Ｈシステムと、（ｉｉ）経路ライブラリのメンバーとを両方保有する微生物が、液体培養で増殖される。注：示された系は、（ｉ）Ｂ２Ｈシステムと、（ｉｉ）変異したテルペノイド経路（すなわち、変異を有するｐＭＢＩＳ＋ｐＴＳ；図２Ａを参照）の両方を保有する大腸菌宿主である。Ｃ．液体培養後、形質転換体を、異なる濃度の抗生物質を含む固体培地上にプレーティングする。ヒットは、野生型経路が成長を許さない抗生物質濃度で成長するコロニーを含む。Ｄ．ヒットの経路が配列決定される。その変異は野生型経路に再導入される。これらの再構築された経路のバリアントは、異なる濃度の抗生物質を含む固体培地上に滴下式プレーティング（１０μＬ）により再スクリーニングされる。この工程は、偽陽性（例えば、標的遺伝子の外側に位置する変異のために生存したコロニー）を除去する。Ｅ．確認されたヒットは、液体培養で増殖される。それらの生成物は、必要に応じてヘキサンオーバーレイで抽出され、ロータリーエバポレーターで濃縮される。Ｆ．ＧＣ／ＭＳは、変異体生成物の同定および定量化を可能にする。ＮＭＲは同定を支援することができる。Ｇ．興味深い代謝産物（購入または培養抽出物から精製）は、標的調節のインビトロ動態測定または細胞研究、および／または標的－代謝産物結合のＩＴＣ分析で特徴付けられる。 翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素の代謝産物媒介性調節を検出する遺伝的にコードされたシステム。酵素Ｅ１および／またはＥ２の代謝産物媒介性の活性化を検出する、遺伝的にコードされたシステム。Ｅ１は、タンパク質Ｐ１にＰＴＭを付加し、Ｐ２への結合を可能にする。新しく形成されたＰ１－Ｐ２複合体は、目的の遺伝子（ＧＯＩ、黒色）の転写を活性化する。Ｅ２はＰ１からＰＴＭを除去し、こうして複合体形成を阻害する。ＧＯＩが適応度の利点を与える場合、Ｅ２の阻害剤またはＥ１の活性化因子は細胞の生存を増強する。ＧＯＩが毒性の場合、Ｅ１の阻害剤またはＥ２の活性化因子は細胞生存を増強する。 翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素の代謝産物媒介性調節を検出する遺伝的にコードされたシステム。代替的な検出システム。Ｅ１は、タンパク質Ｐ１にＰＴＭを付加し、Ｐ２への結合を可能にする。新しく形成されたＰ１－Ｐ２複合体は、スプリットタンパク質（例えば、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、または抗生物質耐性を与える酵素）を組み立てる。Ｅ２はＰ１からＰＴＭを除去し、こうして複合体形成を阻害する。再構成されたスプリットタンパク質が適応度の利点を与える場合、Ｅ２の阻害剤またはＥ１の活性化因子は細胞の生存を増強する。対照的に、再構成されたタンパク質が毒性の場合、Ｅ１の阻害剤またはＥ２の活性化因子は細胞生存を増強する。 翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素の代謝産物媒介性調節を検出する遺伝的にコードされたシステム。タンパク質のライゲーションを制御するＰＴＭ酵素（例えば、ＳＵＭＯトランスフェラーゼ、ユビキチンリガーゼ、または関連ペプチダーゼ）の代謝産物媒介性の活性化を検出する遺伝的にコードされたシステム。Ｅ１はＰ１をＰ２のリジン残基（Ｋ）に結合させ、新たに形成されたＰ１－Ｐ２複合体はＧＯＩの転写を活性化する。Ｅ２はこの複合体を分解する。 翻訳後修飾（ＰＴＭ）酵素の代謝産物媒介性調節を検出する遺伝的にコードされたシステム。代替的な系。Ｅ１はＰ１をＰ２に結合させ、新しく形成されたＰ１－Ｐ２複合体はスプリットタンパク質の組み立てを可能にする。Ｅ２媒介性のタンパク質分解は、この複合体を分解する。 代替的な代謝経路。Ｙｏｕｎｇ－Ｓｏｏ Ｈｏｎｇとその同僚らによって開発されたフェニルプロパノイド経路４５。略語：ＴＡＬ、Ｓ．ｅｓｐａｎａｅｎｓｉｓ由来のアンモニアリアーゼ；Ｓａｍ５，Ｓ．ｅｓｐａｎａｅｎｓｉｓ由来の４－クマル酸 ３－ヒドロキシラーゼ；ＣＯＭ，Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のＯ－メチルトランスフェラーゼ；ＳｃＣＣＬ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のケイ皮酸／４－クマル酸：ＣｏＡリガーゼ；ＣＨＳ、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来のカルコンシンターゼ；ＳＴＳ、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ由来のスチルベンシンターゼ。 代替的な代謝経路。図５Ａからのプラスミドによってコードされる経路。 代替的な代謝経路。Ｋｈｏｓｌａとその同僚によって記載されるような遺伝的にコード可能なエルシニアバクチン（Ｙｂｔ）シンテターゼ４６。Ｙｂｔはポリケチド－非リボソームペプチドである。Ｙｂｔ産生に必要な基質は青で現われる。略語：ＡｒＣＰ、アリール担体タンパク質；Ａ、アデニル化；ＰＣＰ、ペプチジル担体タンパク質；Ｃｙ、環化；ＫＳ、ケトシンターゼ；ＡＣＰ、アシル担体タンパク質；ＡＴ、アシルトランスフェラーゼ；ＫＲ、ＮＡＤＰＨ依存性ケトレダクターゼ；ＭＴ、メチルトランスフェラーゼ；ＳＡＭ、Ｓ－アデノシルメチオニン；ＴＥ、チオエステラーゼ。生合成についての詳細については、テキストを参照する。 暗号化された代謝経路を発見するためのアプローチ。多段階経路の突然変異誘発および／または再編成により、生合成遺伝子が不活性化され、その結果、代謝中間体の蓄積が可能となる。 暗号化された代謝経路を発見するためのアプローチ。多段階経路の突然変異誘発および／または再編成により、抑制遺伝子が不活性化され、その結果、経路遺伝子の発現が可能となる。 テルペノイド阻害剤の微生物進化。（図７Ａ）ＡＤＳおよび（図７Ｂ）ＧＨＳのホモロジーモデルは、部位飽和突然変異誘発（ＳＳＭ）の標的となる残基の位置を示す。５－エピ－アリストロケンシンターゼの位置合わせた構造からの基質アナログ（ｐｄｂエントリー５ｅａｔ）は、青色で現れる。 テルペノイド阻害剤の微生物進化。（図７Ａ）ＡＤＳおよび（図７Ｂ）ＧＨＳのホモロジーモデルは、部位飽和突然変異誘発（ＳＳＭ）の標的となる残基の位置を示す。５－エピ－アリストロケンシンターゼの位置合わせた構造からの基質アナログ（ｐｄｂエントリー５ｅａｔ）は、青色で現れる。 テルペノイド阻害剤の微生物進化。（ｃ）ＡＤＳ（ＬＢプレート）および（図７Ｄ）ＧＨＳ（ＴＢプレート）の変異体によって付与されたスペクチノマイシン耐性の測定値。ＡＬＰは、主要な生成物としてα－ロンギピネンを生成するＧＨＳの五重変異体（Ａ３３６Ｃ／Ｔ４４５Ｃ／Ｓ４８４Ｃ／Ｉ５６２Ｌ／Ｍ５６５Ｌ）に相当する。色調はコロニー密度を表す：拡散（１０コロニー超、薄い灰色）、円形拡散（灰色）、および、円形の菌叢（黒色）。 テルペノイド阻害剤の微生物進化。（ｃ）ＡＤＳ（ＬＢプレート）および（図７Ｄ）ＧＨＳ（ＴＢプレート）の変異体によって付与されたスペクチノマイシン耐性の測定値。ＡＬＰは、主要な生成物としてα－ロンギピネンを生成するＧＨＳの五重変異体（Ａ３３６Ｃ／Ｔ４４５Ｃ／Ｓ４８４Ｃ／Ｉ５６２Ｌ／Ｍ５６５Ｌ）に相当する。色調はコロニー密度を表す：拡散（１０コロニー超、薄い灰色）、円形拡散（灰色）、および、円形の菌叢（黒色）。 テルペノイド阻害剤の微生物進化。野生型酵素よりも高い抗生物質濃度での増殖を可能にするＡＤＳの変異体の生成物プロファイル。 テルペノイド阻害剤の微生物進化。ＡＤＳＧ４３Ｓ／Ｋ５１ＮとＡＤＳは、液体培養での同様のアモルファジエン力価をもたらす。図７Ｆおよび図７Ｉのエラーバーは、ｎ＝３の生物学的反復による標準偏差を示す。 テルペノイド阻害剤の微生物進化。ＡＤＳＧ４３Ｓ／Ｋ５１Ｎは、不活性Ｂ２Ｈシステム（Ｂ２Ｈｘ）の存在下で、野生型酵素よりも高いコロニー密度をもたらす。これらの密度は、ＡＤＳＧ４３Ｓ／Ｋ５１ＮがＡＤＳよりも毒性が低いことを示唆している。 テルペノイド阻害剤の微生物進化。野生型ＧＨＳ、および、増強された抗生物質耐性をもたらす複数のＧＨＳ変異体の生成物プロファイル；これらの変異体のプロファイル間の不一致は、増強された抗生物質耐性を生じさせるかもしれない細胞内テルペノイドの組成の相違を示唆している。 テルペノイド阻害剤の微生物進化。ＧＨＳＡ３１９Ｑは、ＧＨＳよりも高いテルペノイド力価をもたらす。図７Ｆおよび図７Ｉのエラーバーは、ｎ＝３の生物学的反復による標準偏差を示す。 進化した変異体の分析。ＡＤＳの変異体によって付与される抗生物質耐性の分析。画像は、液体培養物の液滴（１０μＬ）から播種したＬＢプレート上の大腸菌の増殖を示す。各変異体は、選択実験で同定された変異（すなわち、ヒット）を開始時のＡＤＳプラスミドに導入するために、部位指向的な突然変異誘発を用いることにより調製された。色調はコロニー密度を表す：拡散（１０コロニー超、薄い灰色）、円形拡散（灰色）、および、円形の菌叢（黒色）。図８Ａ～図８Ｄにおいて、青色のハイライトは、２回の生物学的反復において野生型酵素よりも高濃度のスペクチノマイシンでの増殖を可能にした変異体を示す（すなわち、これらの変異体は図３のＣおよび図３のＤに表示される）。 進化した変異体の分析。図８Ａに記載される実験の反復。図８Ａ～図８Ｄにおいて、青色のハイライトは、２回の生物学的反復において野生型酵素よりも高濃度のスペクチノマイシンでの増殖を可能にした変異体を示す（すなわち、これらの変異体は図３のＣおよび図３のＤに表示される）。 進化した変異体の分析。ＧＨＳの変異体によって付与される抗生物質耐性の分析。画像は、液体培養物の液滴（１０μＬ）から播種したＴＢプレート上の大腸菌の増殖を示す。図８Ａ～図８Ｄにおいて、青色のハイライトは、２回の生物学的反復において野生型酵素よりも高濃度のスペクチノマイシンでの増殖を可能にした変異体を示す（すなわち、これらの変異体は図３のＣおよび図３のＤに表示される）。 進化した変異体の分析。図８Ｃに記載された実験の反復。図８Ａ～図８Ｄにおいて、青色のハイライトは、２回の生物学的反復において野生型酵素よりも高濃度のスペクチノマイシンでの増殖を可能にした変異体を示す（すなわち、これらの変異体は図３のＣおよび図３のＤに表示される）。 様々なテルペンシンターゼの生成物の分析。Ｂ２Ｈシステムの非存在下（上）および存在下（下）にて各ＴＳ特異的な菌株によって生成された支配的なテルペノイド（すなわち、アモルファジエン、γ－フムレン、タキサジエン、またはアビエタジエン）の力価。同様の力価は、Ｂ２Ｈシステムがテルペノイド生合成を妨害しないことを示す。図９Ａのエラーバーは、ｎ≧３の生物学的反復についての標準誤差を示す。 様々なテルペンシンターゼの生成物の分析。Ｂ２Ｈシステムの非存在下（上）および存在下（下）において各菌株によって生成されたテルペノイドのＧＣ／ＭＳクロマトグラム（ｍ／ｚ＝２０４）。同様のプロファイルは、Ｂ２Ｈシステムが生成物の分布を変化させないことを示唆している。 様々なテルペンシンターゼの生成物の分析。様々な菌株の死滅と生存に対する（ｉ）ＴＳ活性または（ｉｉ）Ｂ２Ｈ機能のいずれかの寄与の分析。ＧＨＳの不活性化は、ＧＨＳ株の生存率を向上させないが、これは、この酵素が成長阻害性のテルペノイドを生成しないことを示している。対照的に、ＡＤＳまたはＢ２Ｈシステムのいずれかを不活性化すると、ＡＤＳ株の抗生物質耐性が弱まるが、これは、最大限の耐性がテルペノイドの生成とＢ２Ｈの活性化の両方を必要とすることを示している。標識は以下の対照を示す：ＧＨＳＤ／Ａ、不活性なＧＨＳ；ＡＤＳＤ／Ａ、不活性なＡＤＳ；Ｂ２Ｈ＊、構成的に活性なＢ２Ｈ；Ｂ２Ｈｘ、不活性なＢ２Ｈ。注：左と右の画像は、２回の生物学的反復からの液体培養物の液滴（１０μＬ）から播種されたＬＢプレートを示す。 様々なテルペノイドの生成物の分析。クロマトグラムは、図２Ｃ（Ｂ２Ｈシステムが存在する）からの各ＴＳ特異的な菌株について予想される支配的な生成物（＊）を示す。 様々なテルペノイドの生成物の分析。ＡＤＳおよびＴＸＳによって生成される主要な生成物の力価。図１０Ｂのエラーバーは、ｎ＝３の生物学的反復を用いた標準誤差を示す。 様々なテルペノイドの生成物の分析。増加する濃度のアモルファジエンおよびタキサジエンの存在下でのＰＴＰ１Ｂ触媒性のｐＮＰＰの加水分解の初期速度。線は、非競合的阻害（アモルファジエン）と混合阻害（タキサジエン）の証拠を提供する、ミカエリス－メンテンモデルへの適合を示している。図１０Ｃのエラーバーは、ｎ≧３測定での標準誤差を示す。 様々なテルペノイドの生成物の分析。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞の描写。インスリンは、膜結合型インスリン受容体（ＩＲ）のリン酸化を刺激する。ＰＴＰ１ＢはＩＲを脱リン酸化させ、ＰＴＰ１Ｂの阻害はリン酸化を回復させる。 様々なテルペノイドの生成物の分析。３％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ｎ＝２）、９３０μＭアモルファジエン（ＡＤ、３％ＤＭＳＯ中、ｎ＝３）、および４０５μＭのα－ビザボレン（Ａｖｉｓ、３％ＤＭＳＯ、ｎ＝１）に１０分間曝露した飢餓野生型ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞中のＩＲリン酸化のＥＬＩＳＡベースの測定値。結果は、アモルファジエンおよびα－ビサボレンの両方が、細胞膜を通過し、細胞内ＰＴＰ１Ｂを阻害し、したがって、ＩＲリン酸化を増加させ得ることを示す。図１０Ｅのエラーバーは、示されたｎ値での標準誤差を示す（注：これらの測定について、我々は、溶解バッファのみによって生じた参照シグナルを差し引いた。ｎ＝３）。 代替的なテルペンシンターゼの分析。（ｉ）活性または不活性なバクテリアツーハイブリッドシステム（図１、２、および７－９と同様に、それぞれＢ２ＨとＢ２Ｈｘ）、および（ｉｉ）以下のテルペンシンターゼ：アメリカオオモミ由来のγ－フムレンシンターゼ（ＧＨＳ）、ショウガ由来のβ－ビサボレンシンターゼ（ＺｏＢＢＡ）、ビャクダン由来のβ－ビサボレンシンターゼ（ＳａＢＢＡ）、およびアメリカオオモミ由来のα－ビサボレンシンターゼ（ＡＢＢ）とともに図２からのテルペノイド経路を保有する大腸菌の菌株のスペクトロマイシン耐性。ＳａＢＢＡ、および最も顕著には、ＡＢＢは、高濃度のスペクチノマイシンでの生存を可能にする。 代替的なテルペンシンターゼの分析。（ｉ）活性または不活性なバクテリアツーハイブリッドシステム（図１、２、および７－９と同様に、それぞれＢ２ＨとＢ２Ｈｘ）、および（ｉｉ）以下のテルペンシンターゼ：アメリカオオモミ由来のγ－フムレンシンターゼ（ＧＨＳ）、ショウガ由来のβ－ビサボレンシンターゼ（ＺｏＢＢＡ）、ビャクダン由来のβ－ビサボレンシンターゼ（ＳａＢＢＡ）、およびアメリカオオモミ由来のα－ビサボレンシンターゼ（ＡＢＢ）とともに図２からのテルペノイド経路を保有する大腸菌の菌株のスペクトロマイシン耐性。ＳａＢＢＡ、および最も顕著には、ＡＢＢは、高濃度のスペクチノマイシンでの生存を可能にする。 代替的なテルペンシンターゼの分析。β－ビサボレンおよびα－ビサボレンの化学構造。 代替的なテルペンシンターゼの分析。培養抽出物から精製した、増加する濃度のα－ビサボレン（アモルファジエン同等物として測定される）の存在下でのｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）上のＰＴＰ１Ｂ活性の分析。線はミハエリス－メンテンモデルへの適合を示す。 ＰＴＰ１Ｂの選択的阻害剤の分析。増加する濃度のアモルファジエンの存在下でのＰＴＰ１Ｂ３２１、ＴＣＰＴＰ２９２、およびＰＴＰ１Ｂ２８２によるｐＮＰＰ加水分解の初期速度。線は阻害のモデルへの適合を示す。第１と第２のプロット（または、より具体的には、プロットしたデータから算出したＩＣ５０のもの）の比較は、アモルファジエンが、（配列同一性により）ヒトゲノム中の最も密接に関連するＰＴＰであるＴＣＰＴＰ２９２よりも約５倍以上効力のあるＰＴＰ１Ｂ３２１の阻害剤であることを示している。この選択性は、アモルファジエンがＰＴＰ１Ｂの活性部位の外側に結合することを示唆している。第２と第３のプロットの比較は、アモルファジエンがＰＴＰ１Ｂ３２１よりも約４分の一未満の効力でＰＴＰ１Ｂ２８２を阻害することを示している。この矛盾は、ＰＴＰ１Ｂ３２１には存在するが、ＰＴＰ１Ｂ２８２にはない（かつ、ＰＴＰ１Ｂの既知のアロステリック結合部位の近位にある）α７ヘリックスが、ＰＴＰ１Ｂ３２１－アモルファジエンの相互作用に関与していることを示唆している。 ＰＴＰ１Ｂの選択的阻害剤の分析。アモルファジエンの化学構造。 ＰＴＰ１Ｂの選択的阻害剤の分析。アモルファジエンに結合したＰＴＰ１Ｂの予備的な結晶構造。 ＰＴＰ１Ｂの選択的阻害剤の分析。図１２Ｃの構造を解くために使用されるデータは、ＰＴＰ１Ｂのアロステリック部位付近の電子密度を示す（Ｆ２８０はこの画像の左側に現れる）。この密度は、アモルファジエンの構造と一致する。 ＰＴＰ１Ｂの選択的阻害剤の分析。α－ビサボレンの構造アナログであるα－ビサボロールの化学構造。 ＰＴＰ１Ｂの選択的阻害剤の分析。α－ビサボロールに結合したＰＴＰ１Ｂの予備的な結晶構造。 ＰＴＰ１Ｂの選択的阻害剤の分析。図１２Ｆの構造を解くために使用されるデータは、ＰＴＰ１Ｂのアロステリック部位付近の電子密度を示す（Ｆ２８０は、この画像の左上に現れる）。この密度は、α－ビサボロールの構造と一致する。 バクテリア－２ハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システムの最適化。様々な遺伝要素の強度を調整することによってＢ２Ｈシステムの転写反応を最適化した。３つの連続する段階において、（１）Ｓｒｃ／ＣＤＣ３７のプロモーター、（２）Ｓｒｃ／ＣＤＣ３７のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、（３）およびＰＴＰ１ＢのＲＢＳを変更した。第１段階および第２段階では、野生型（ＷＴ、ＥＰＱＹＥＥＩＰＹＬ（配列番号：１））またはリン酸化不可能な（Ｍｕｔ、ＥＰＱＦＥＥＩＰＹＬ（配列番号：２））の基質ドメインを有するＰＴＰ１Ｂ欠損系を使用した。ここで、「何もなし」とは、追加のプロモーターがないことを示す。標識された「Ｐｒｏ１」とは、その左側にある５つの遺伝子すべての転写を制御している。第３段階では、ＰＴＰ１Ｂの野生型（ＷＴ）または触媒的に不活性な（Ｃ２１５Ｓ、Ｍｕｔ）バリアントのいずれかを有する完全なＢ２Ｈシステムを使用した。各段階の残りのＢ２Ｈ構成要素については、表２に詳細を示す。エラーバーは、ｎ≧３の生物学的反復による標準誤差を示す。 様々な選択条件の分析。ＰＴＰ１Ｂについて異なるＲＢＳを有するＢ２Ｈシステムによって付与される抗生物質耐性の比較（各システムの残りの構成要素については表２を参照）。画像は、各条件について２回の生物学的反復で液体培養物（１０μＬ）の液滴から播種した寒天プレート（ＬＢ）上の大腸菌の増殖を示す。ＲＢＳ ｂｂ０３４は、寒天プレート上でスペクチノマイシンに対してより高い感受性を付与する。対照的に、液体培養中のスペクチノマイシンの濃度は、細菌の増殖に強い影響を及ぼさない。この分析に基づき、ｂｂ０３４を我々の「最適化された」Ｂ２Ｈシステムに組み込み、液体培養物へのスペクチノマイシンの添加を中止した。 純粋なアモルファジエン（Ａｍｂｅｅｄから購入）のＧＣクロマトグラム。 図１５Ａの示されたピークの質量スペクトル。 γ－フムレン産生のＧＣ／ＭＳ分析。ＧＣクロマトグラムは、それ（つまり、ｐＭＢＩＳ＋ｐＧＨＳ）を生成するように操作された大腸菌の菌株によるγ－フムレンの産生を示す。 γ－フムレン産生のＧＣ／ＭＳ分析。図１６Ａの示されたピークの質量スペクトル。 補足的な図４｜アビエタジエン産生のＧＣ／ＭＳ分析。ＧＣクロマトグラムは、それ（つまり、ｐＭＢＩＳ＋ｐＡＢＳ）を生成するように操作された大腸菌の菌株によるアビエタジエンの産生を示す。 補足的な図４｜アビエタジエン産生のＧＣ／ＭＳ分析。図１７Ａの示されたピークの質量スペクトル。 タキサジエン産生のＧＣ／ＭＳ分析。ＧＣクロマトグラムは、純粋なタキサジエン（Ｐｈｉｌ Ｂａｒａｎの親切な贈り物）の産生を示す。 タキサジエン産生のＧＣ／ＭＳ分析。図１８Ａの示されたピークの質量スペクトル。 β－ビサボレン産生のＧＣ／ＭＳ分析。ＧＣクロマトグラムは、それ（つまり、ｐＭＢＩＳ＋ｐＧＨＳＬ４５０Ｇ）を生成するように操作された大腸菌の菌株によるβ－ビサボレンの産生を示す。 β－ビサボレン産生のＧＣ／ＭＳ分析。図１９Ａの示されたピークの質量スペクトル。 ｐＮＰＰアッセイの標準曲線。この標準曲線は、様々な濃度のｐ－ニトロフェノール（ｐ－ＮＰ）を１００μＬの水に溶解させ、プレートリーダーで吸光度を測定することにより、作成された。我々のｐＮＰＰ動態解析で収集した吸光度測定値は、この曲線を用いて濃度に変換された。 ＰＴＰ１Ｂの阻害と抗生物質耐性を結びつけるバクテリア－ツーハイブリッドシステムの開発。この図は、遺伝子の配向を含めることにより、図１について詳述する。リン酸化依存性タンパク質間相互作用が、目的の遺伝子（ＧＯＩ、黒色）の転写を調節する、バクテリアツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システム。主な構成要素は、（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼのオメガサブユニットと融合した基質ドメイン（黄色）、（ｉｉ）４３４ファージｃＩリプレッサーと融合したＳＨ２ドメイン（水色）、（ｉｉｉ）ＳｒｃキナーゼとＰＴＰ１Ｂ、（ｉｖ）４３４ｃＩのオペレーター（深緑）、（ｖ）ＲＮＡポリメラーゼの結合部位（紫）、および（ｖｉ）目的の遺伝子（ＧＯＩ、黒色）を含んでいる。 ＰＴＰ１Ｂの阻害と抗生物質耐性を結びつけるバクテリア－ツーハイブリッドシステムの開発。この図は、遺伝子の配向を含めることにより、図１について詳述する。ｐ１３０ｃａｓ基質、ＧＯＩとしてＬｕｘＡＢを有し、およびＰＴＰ１Ｂを含まない、Ｂ２Ｈシステムによって生成された発光。特定の成分の発現を増加させるために、誘導性プラスミドを使用した。図２１Ｂ－Ｄのエラーバーは、ｎ＝３の生物学的反復を用いた標準誤差を示す。 ＰＴＰ１Ｂの阻害と抗生物質耐性を結びつけるバクテリア－ツーハイブリッドシステムの開発。この図は、遺伝子の配向を含めることにより、図１について詳述する。ホスホペプチドに対して増強された親和性を示すＳＨ２ドメイン（ＳＨ２＊）、４つの基質ドメインのうちの１つ、ＧＯＩとしてのＬｕｘＡＢを有し、およびＳｒｃまたはＰＴＰ１Ｂを有していないＢ２Ｈシステムによって生成される発光。Ｓｒｃの発現を制御するために誘導可能なプラスミドを使用した。基質ｐ１３０ｃａｓの配列（配列番号：２４）、ＭｉｄＴの配列（配列番号：２５）、ＥＧＦＲの配列（配列番号：２７）、およびＳｈｃＡの配列（配列番号：２６）を示す。図２１Ｂ－Ｄのエラーバーは、ｎ＝３の生物学的反復を用いた標準誤差を示す。 ＰＴＰ１Ｂの阻害と抗生物質耐性を結びつけるバクテリア－ツーハイブリッドシステムの開発。この図は、遺伝子の配向を含めることにより、図１について詳述する。ｐ１３０ｃａｓまたはＭｉｄＴのいずれかを有するｃからのＢ２Ｈシステム。Ｓｒｃの発現、およびＰＴＰ１Ｂの活性または不活性な（Ｃ２１５）バリアントを制御するために、第２のプラスミドを使用した。右：２つの最適化された単一プラスミドシステム。図２１Ｂ－Ｄのエラーバーは、ｎ＝３の生物学的反復を用いた標準誤差を示す。 ＰＴＰ１Ｂの阻害と抗生物質耐性を結びつけるバクテリア－ツーハイブリッドシステムの開発。この図は、遺伝子の配向を含めることにより、図１について詳述する。最終的なＢ２Ｈシステム。ＰＴＰ１Ｂの不活性化により、この系を保有する大腸菌の株が、高濃度のスペクチノマイシン（＞２５０μｇ／ｍｌ）において存在することが可能となった。 ＰＴＰ１Ｂ阻害テルペノイドの生合成により、細胞の生存が可能になる。この図は図２と１０について詳述する。テルペノイド生合成のためのプラスミド由来の経路：（ｉ）ｐＭＢＩＳＣｍＲは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのメバロン酸依存性イソプレノイド経路を保有し、メバロン酸をイソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）およびファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）に変換する。（ｉｉ）テルペンシンターゼ（ＴＳ）と、必要に応じてゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）をコードするｐＴＳは、ＩＰＰとＦＰＰをセスキテルペンまたはジテルペンに変換する。 ＰＴＰ１Ｂ阻害テルペノイドの生合成により、細胞の生存が可能になる。この図は図２と１０について詳述する。本研究で調べた５つのテルペンシンターゼ：アモルファジエンシンターゼ（ＡＤＳ）、γ－フムレンシンターゼ（ＧＨＳ）、α－ビサボレンシンターゼ（ＡＢＡ）、アビエタジエンシンターゼ（ＡＢＳ）、およびタキサジエンシンターゼ（ＴＸＳ）。 ＰＴＰ１Ｂ阻害テルペノイドの生合成により、細胞の生存が可能になる。この図は図２と１０について詳述する。（ｉ）バクテリアツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システムと、（ｉｉ）ＴＳ特異的テルペノイド経路の両方を保有する大腸菌の株のスペクチノマイシン耐性。注：陽性対照であるＡＢＳ＊は、構成的に活性なＢ２Ｈ（つまり、それはＰＴＰ１ＢＣ２１５Ｓを含む）を有する。 ＰＴＰ１Ｂ阻害テルペノイドの生合成により、細胞の生存が可能になる。この図は図２と１０について詳述する。クロマトグラムは、Ｂ２Ｈシステムの存在下でのｃからの各ＴＳ特異的な株について予想される主要な生成物（すなわち、同名物；＊）を示す。値は、所定の試料内の最大のピークに正規化されている。 ＰＴＰ１Ｂ阻害テルペノイドの生合成により、細胞の生存が可能になる。この図は図２と１０について詳述する。増加する濃度の（ＡＤ）アモルファジエンまたは（ＡＢ）α－ビサボレンの存在下での、ＰＴＰ１Ｂ触媒性のｐＮＰＰの加水分解の初期速度。線は、阻害の最も適合した動態学的モデルを示す（表１２）。エラーバーは、ｎ≧３の独立した測定についての（図２２Ｅ）標準誤差および（図２２Ｆ）９５％信頼区間、ならびにｎ＝３の生物学的反復についての（図２２Ｇ）標準偏差を示す。 ＰＴＰ１Ｂ阻害テルペノイドの生合成により、細胞の生存が可能になる。この図は図２と１０について詳述する。推定されたＩＣ５０値である。エラーバーは、ｎ≧３の独立した測定についての（図２２Ｅ）標準誤差および（図２２Ｆ）９５％信頼区間、ならびにｎ＝３の生物学的反復についての（図２２Ｇ）標準偏差を示す。 ＰＴＰ１Ｂ阻害テルペノイドの生合成により、細胞の生存が可能になる。この図は図２と１０について詳述する。ＡＤＳおよびＡＢＡによって生成された主要生成物の力価。エラーバーは、ｎ≧３の独立した測定についての（図２２Ｅ）標準誤差および（図２２Ｆ）９５％信頼区間、ならびにｎ＝３の生物学的反復についての（図２２Ｇ）標準偏差を示す。 テルペノイド媒介性の阻害の生物物理学的分析。この図は、さらなる動態測定を含むことにより、図１２を構築する。競合阻害剤であるＴＣＳ４０１（黄色のタンパク質、オレンジ色のハイライト、および緑色の球体；ｐｄｂエントリー５ｋ９ｗ）、およびアロステリック阻害剤であるＢＢＲ（灰色のタンパク質、青色のハイライト、および水色の球体；ｐｄｂエントリー１ｔ４ｊ）に結合したＰＴＰ１Ｂの位置合わせしたＸ線結晶構造。 テルペノイド媒介性の阻害の生物物理学的分析。この図は、さらなる動態測定を含むことにより、図１２を構築する。ＢＢＲ（白色タンパク質および水色リガンド）およびアモルファジエン（シアンタンパク質および濃紺リガンド、ｐｄｂエントリー６Ｗ３０）に結合したＰＴＰ１Ｂの位置合わせした構造。 テルペノイド媒介性の阻害の生物物理学的分析。この図は、さらなる動態測定を含むことにより、図１２を構築する。疎水性クレフトへの結合を乱す可能性が高いカルボキシル基を有するアモルファジエンの構造的アナログである、ジヒドロアルテミシン酸（ＤＨＡ）。 テルペノイド媒介性の阻害の生物物理学的分析。この図は、さらなる動態測定を含むことにより、図１２を構築する。ＤＨＡは、アモルファジエンよりも効力が８倍低い。線は、阻害の最も適合した動態学的モデルを示す（表１２）。エラーバーは、ＩＣ５０の９５％信頼区間を有するｎ＝３の独立した測定値の標準誤差を示す。図２３Ｄ－Ｆのエラーバーは、ｎ＝３－１２の生物学的反復についての標準誤差を示す。 テルペノイド媒介性の阻害の生物物理学的分析。この図は、さらなる動態測定を含むことにより、図１２を構築する。ＡＤ（黒、青、紫のマーカー）の様々な濃度でのＶｏ －１対［ＴＣＳ４０１］を示すディクソンプロット。平行線は、ＴＣＳ４０１とＡＤが同時に結合できないことを示す。図２３Ｄ－Ｆのエラーバーは、ｎ＝３－１２の生物学的反復についての標準誤差を示す。 テルペノイド媒介性の阻害の生物物理学的分析。この図は、さらなる動態測定を含むことにより、図１２を構築する。様々な濃度のＡＤ（黒、青、紫のマーカー）におけるＶｏ －１対［オルトバナジン酸］を示すディクソンプロット。交差する線は、オルトバナジン酸とＡＤが同時に結合し得ることを示す。図２３Ｄ－Ｆのエラーバーは、ｎ＝３－１２の生物学的反復についての標準誤差を示す。 テルペノイド媒介性の阻害の生物物理学的分析。この図は、さらなる動態測定を含むことにより、図１２を構築する。アモルファジエンおよびα－ビサボレンの両方は、ＴＣ－ＰＴＰよりもはるかに高い効力でＰＴＰ１Ｂを阻害する。両酵素からα７ヘリックス（または同等物）を除去すると、ＡＤの選択性が低下するが、ＡＢの選択性は低下しない。エラーバーは、各条件でのｎ≧３の独立した測定値から推定される伝播された９５％の信頼区間を示す。図２３Ｇのエラーバーは、ｎ≧３の独立した測定値に関する伝播された９５％の信頼区間を示す。 テルペノイド媒介性の阻害の生物物理学的分析。この図は、さらなる動態測定を含むことにより、図１２を構築する。アモルファジエン（９３０μＭ）とα－ビサボレン（４０５μＭ）は、ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞においてＩＲリン酸化を刺激する。同じ濃度において、ジヒドロアルテミシン酸（ＤＨＡ）とα－ビサボロール（ＡＢＯＬ）は、それらの減少した効力と一致する減少したシグナルを示す（＃：ｐ＜０．０５、陰性対照と比較して、＊：ｐ＜０．０５）。すべての阻害剤を３％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ；陰性対照）に溶解させる。図２３Ｈのエラーバーは、バッファのみの対照（ｎ＝３の生物学的反復）から伝播された標準誤差を示す。 特徴づけられていないテルペンシンターゼ遺伝子の分析。テルペンシンターゼのバイオインフォマティクス分析。最大のテルペンシンターゼファミリー（ＰＦ０３９３６）の４，４６４のメンバーの分岐図を組み立て、機能データでそれに注釈をつけた。８つのクレード（湾曲したボックス）：特徴づけられた遺伝子（すなわち、既知の機能を有する遺伝子）を有していない６つと、特徴づけられた遺伝子を有していない２つのそれぞれから３つの遺伝子を選択した。 特徴づけられていないテルペンシンターゼ遺伝子の分析。ｐＭＢＩＳＣｍＲおよびｐＢ２Ｈｏｐｔと並んで選択した遺伝子によって付与されたスペクチノマイシン耐性。４００ｕｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを超えて強固に増殖するヒットは、青色で表示される。「ｎ．ｍ．」は、その条件が測定されなかったことを示す。 特徴づけられていないテルペンシンターゼ遺伝子の分析。Ａ０Ａ０Ｃ９ＶＳＬ７は、支配的な生成物として（＋）－１（１０），４－カジナジエンを産生する（ｍ／ｚ＝２０４）。 特徴づけられていないテルペンシンターゼ遺伝子の分析。（＋）－１（１０），４－カジナジエンの構造。 特徴づけられていないテルペンシンターゼ遺伝子の分析。（＋）－１（１０），４－カジナジエン（８５％純度、１０％ＤＭＳＯ）によるＰＴＰ１Ｂの阻害。線は、阻害の最も適合した動態学的モデルを示す（表１２）。 他の疾患関連ＰＴＰへの拡張。異なる疾患関連ＰＴＰの不活性化を検出するように改変されたＢ２Ｈシステムを保有する株のスペクチノマイシン耐性。不活性化変異８６－８８は、高濃度の抗生物質での生存を与える。 他の疾患関連ＰＴＰへの拡張。アモルファジエンおよびα－ビサボレンの代謝経路（すなわち、ｐＭＢＩＳＣｍＲ＋ＡＤＳまたはＡＢＡ）の存在下で、ＰＴＰ１Ｂ－特異的、およびＴＣ－ＰＴＰ特異的Ｂ２Ｈシステムによって付与される耐性の比較。ＰＴＰ１Ｂ特異的システムは顕著な生存優位性を示し、この酵素に対する両方のテルペノイドの選択性と一致する発見である。 他の疾患関連ＰＴＰへの拡張。Ｂ２Ｈシステムと関連する代謝経路の両方を保有する株におけるＡＤおよびＡＢの力価は、株間で区別することができない。 様々なテルペンシンターゼの生成物の分析。この図は、さらなる測定値を含むことにより、図９を構築する。Ｂ２Ｈシステムの非存在下（赤）および存在下（青）での、各ＴＳ特異的な株によって生成された総テルペン力価。これらの結果は、Ｂ２Ｈシステムがテルペノイドの生合成を妨害しないことを示す。図２６Ａのエラーバーは、ｎ≧３の生物学的反復についての標準偏差を示す。 様々なテルペンシンターゼの生成物の分析。この図は、さらなる測定値を含むことにより、図９を構築する。Ｂ２Ｈシステムの非存在下（上）および存在下（下）における、ジテルペンシンターゼによって生成されたテルペノイドのＧＣ／ＭＳクロマトグラム（ｍ／ｚ＝２７２）。図２６Ｂおよび図２６Ｃにおける同様のプロファイルは、Ｂ２Ｈシステムが生成物の分布を変化させないことを示す。 様々なテルペンシンターゼの生成物の分析。この図は、さらなる測定値を含むことにより、図９を構築する。Ｂ２Ｈシステムの非存在下（上）および存在下（下）における、セスキテルペンシンターゼによって生成されるテルペノイドのＧＣ／ＭＳクロマトグラム（ｍ／ｚ＝２０４）。図２６Ｂおよび図２６Ｃにおける同様のプロファイルは、Ｂ２Ｈシステムが生成物の分布を変化させないことを示す。 様々なテルペンシンターゼの生成物の分析。この図は、さらなる測定値を含むことにより、図９を構築する。ＧＨＳ、ＡＤＳ、およびＡＢＡの菌株の死滅および生存に対する、（ｉ）ＴＳ活性または（ｉｉ）Ｂ２Ｈ機能のいずれかの寄与の分析。ＧＨＳの不活性化は、生存率を向上させないが、これは、この酵素が成長阻害性のテルペノイドを生成しないことを示している。対照的に、ＡＤＳ、ＡＢＡ、またはＢ２Ｈシステムのいずれかを不活性化すると、ＡＤＳ菌株とＡＢＡ菌株の抗生物質耐性が弱まる。したがって、最大限の耐性には、テルペノイドの産生とＢ２Ｈの活性化の両方が必要である。標識は以下の対照を示す：Ｄ／Ａ、不活性なテルペンシンターゼ（触媒性のアスパラギン酸にＤ／Ａ突然変異を含有し、テルペン環化の最初の金属結合ステップを阻害する）；＊、構成的に活性なＢ２Ｈ（ＰＴＰ１ＢＣ２１５Ｓを含み、脱リン酸化を阻害する）；Ｘ、不活性なＢ２Ｈ（Ｙ／Ｆ突然変異を有する基質ドメインを含有し、リン酸化を阻害し、したがって、ＳＨ２ドメインとの結合を阻害する）。画像は、２つの生物学的反復から得た液体培養物（１０μＬ）の液滴を播種したＬＢプレートを示す。表２は、これらの分析に使用したＢ２Ｈシステムを詳述する。 テルペンシンターゼの注釈をつけた分岐図。ＰＦ０３９３６ファミリーのこの分岐図は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースから４．２．３．＃の形式（テルペン環化反応を含む）の既知のＥＣ番号の存在／非存在を示すヒートマップによって囲まれている。８つのクレード：特徴的な遺伝子を有していない６つ（赤）と、特徴的な遺伝子を有している２つ（青）のそれぞれから３つの遺伝子を選択した。表１は遺伝子をまとめたものである。 選択した遺伝子の分析。ＦＰＰ経路（すなわち、ｐＭＢＩＳ）と並ぶ２４の特徴づけられていない遺伝子のそれぞれをスクリーニングすることにより、ＰＴＰ１Ｂのセスキテルペン阻害剤を探索した。これらの写真は、各遺伝子によって付与される抗生物質耐性を示している。４００μｇ／ｍｌを超える抗生物質耐性を持つ株をヒット（青色）として選択した。重要なことに、これらの遺伝子について、Ｂ２Ｈｘ対照の生存率の低下は、耐性の増強にはＢ２Ｈシステムの活性化が必要であることを示している。上の図において、ｎ．ｍ．は、測定されなかった条件を示している。 選択した遺伝子の分析。ＦＰＰ経路（すなわち、ｐＭＢＩＳ）と並ぶ２４の特徴づけられていない遺伝子のそれぞれをスクリーニングすることにより、ＰＴＰ１Ｂのセスキテルペン阻害剤を探索した。これらの写真は、各遺伝子によって付与される抗生物質耐性を示している。４００μｇ／ｍｌを超える抗生物質耐性を持つ株をヒット（青色）として選択した。重要なことに、これらの遺伝子について、Ｂ２Ｈｘ対照の生存率の低下は、耐性の増強にはＢ２Ｈシステムの活性化が必要であることを示している。上の図において、ｎ．ｍ．は、測定されなかった条件を示している。 選択した遺伝子の分析。ＦＰＰ経路（すなわち、ｐＭＢＩＳ）と並ぶ２４の特徴づけられていない遺伝子のそれぞれをスクリーニングすることにより、ＰＴＰ１Ｂのセスキテルペン阻害剤を探索した。これらの写真は、各遺伝子によって付与される抗生物質耐性を示している。４００μｇ／ｍｌを超える抗生物質耐性を持つ株をヒット（青色）として選択した。重要なことに、これらの遺伝子について、Ｂ２Ｈｘ対照の生存率の低下は、耐性の増強にはＢ２Ｈシステムの活性化が必要であることを示している。上の図において、ｎ．ｍ．は、測定されなかった条件を示している。 選択した遺伝子の分析。ＦＰＰ経路（すなわち、ｐＭＢＩＳ）と並ぶ２４の特徴づけられていない遺伝子のそれぞれをスクリーニングすることにより、ＰＴＰ１Ｂのセスキテルペン阻害剤を探索した。これらの写真は、各遺伝子によって付与される抗生物質耐性を示している。４００μｇ／ｍｌを超える抗生物質耐性を持つ株をヒット（青色）として選択した。重要なことに、これらの遺伝子について、Ｂ２Ｈｘ対照の生存率の低下は、耐性の増強にはＢ２Ｈシステムの活性化が必要であることを示している。上の図において、ｎ．ｍ．は、測定されなかった条件を示している。 選択されたヒットの生成物プロファイル。選択したヒットの生成物プロファイル（抽出されたイオンクロマトグラム、ｍ／ｚ＝２０４）。簡単に言えば、我々は７２時間の液体培養でヒット（すなわち、ｐＢ２Ｈｏｐｔ、ｐＭＢＩＳＣｍＲ、およびｐＴＳ）を成長させた。Ａ０Ａ０Ｇ２ＺＳＬ３を除き、すべてのヒットを１０ｍＬの２％ＴＢで培養した。Ａ０Ａ０Ｇ２ＺＳＬ３は２％ＴＢの４ｍＬ培養物中で増殖させた。注目すべきは、Ａ０Ａ０Ｃ９ＶＳＬ７とＡ０Ａ２Ｈ３ＤＫＵ３の両方が、１つの支配的な生成物、（＋）－１（１０），４－カジナジエンとβ－ファルネセンをそれぞれ生成する。（＋）－１（１０），４－カジナジエンが、最初のスクリーニングで同定した阻害剤であるアモルファジエンの構造的アナログであるため、我々はＡ０Ａ０Ｃ９ＶＳＬ７に注目した。 ＡＤに結合したＰＴＰ１Ｂの結晶学的解析。ＡＤの存在下（左）またはＡＤの非存在下（右）で集めたＰＴＰ１Ｂの結晶構造。解像度：２．１０Å（ＰＴＰ１Ｂ－ＡＤ）および１．９４Å（ＰＴＰ１Ｂ）。これらの構造を、（上）ＰＴＰ１Ｂ－ＡＤ複合体、または（下）アポ型ＰＴＰ１Ｂのモデル化により精密化した。ＡＤに浸したＰＴＰ１Ｂ（左）では、１．０σ２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度がＡＤのモデル化位置を裏付けているが、複数の立体構造があることを示唆している。この密度は、ＡＤをモデルから除外した場合でも現れる。アポＰＴＰ１Ｂ（右）では、１．０σ２Ｆｏ－Ｆｃ電子は、結合したＡＤ分子を裏付けていない。説明されていない小さな密度領域は、水分子か、α７ヘリックスの部分的な占有を反映していることもある１５。 ＡＢｏｌと結合したＰＴＰ１Ｂの結晶構造解析。ＡＢｏｌの存在下（左）または非存在下（右）で収集したＰＴＰ１Ｂの結晶構造。解像度：２．１１Å（ＰＴＰ１Ｂ－ＡＢｏｌ）および１．９４Å（ＰＴＰ１Ｂ）。これらの構造を、（上）ＰＴＰ１Ｂ－ＡＢｏｌ複合体、または（中／下）アポ型ＰＴＰ１Ｂのモデル化によって精密化した。ＡＢｏｌに浸したＰＴＰ１Ｂ（左）では、０．９０σ２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度は、ＡＢｏｌのモデル化位置と一致しているが、ＡＢｏｌをモデルから除外すると顕著でなくなる。ＰＴＰ１Ｂのアポ型（右）は、両方のモデルでも同じような密度を示している。データセット間の０．９０σ２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度の形状のわずかな差は、この密度が異なる起源（例えば、リガンド対α７ヘリックスの部分占有）を持つ可能性があることを示唆している。α－ビサボロールの結合部位を明確に決定するには、さらなるデータが必要となる。 複数の結合立体構造の証拠。アモルファジエン（ＡＤ）に結合したＰＴＰ１Ｂの分子動力学（ＭＤ）シミュレーションのスナップショット。矢印はリガンドのクラスターを示す。 複数の結合立体構造の証拠。ＡＤに結合したＰＴＰ１Ｂの結晶構造は、高頻度に接触する残基を強調している。ここでは、接触は残基－リガンド間距離＜４Åであり、高頻度はＭＤシミュレーションのすべてのスナップショットの１０％を超える。 複数の結合立体構造の証拠。ＭＤシミュレーションにわたる完全システム（ＰＬ）、タンパク質（Ｐ）、タンパク質コア（Ｐｃｏｒｅ；残基１－２８７）、タンパク質の無秩序領域（Ｐｔａｉｌ；残基２８８－３２１）、およびリガンド（Ｌ）の平均二乗平均平方根（ＲＭＳＤ）の推定は、ＡＤとタンパク質の無秩序領域の両方が可動性があるが（前者よりも後者）、タンパク質コアは固定されたままであることを示唆している。（ｉ）回転変動と振動変動の指標であるリガンド再中心（ｒｅ－ｃｅｎｔｅｒｅｄ ｌｉｇａｎｄ）（Ｉｎｔ）と、（ｉｉ）位置変動の指標であるリガンドの質量中心（ＣＯＭ）との平均ＲＭＳＤは大きく、リガンドが複数の結合立体構造および／または位置をとりうることを示唆している。 動態解析の概要。ＰＴＰ１Ｂ（灰色、ｐｄｂエントリー５ｋ９ｗ）およびＴＣ－ＰＴＰ（青色、ｐｄｂエントリー１ｌ８ｋ）の位置合わせした結晶構造。ＰＴＰ１Ｂ上のハイライト：競合阻害剤（オレンジ）、α７ヘリックス（赤）、および速度論的研究に使用した切断点（２８１と２８３、ＴＣ－ＰＴＰの２８１相当）。 動態解析の概要。ＰＴＰ１Ｂ（配列番号：１４０）とＴＣ－ＰＴＰ（配列番号：１４１）のα６／７領域の配列アラインメント。我々の動態解析で使用された切断点。 動態解析の概要。ＢＢＲ（灰色、ｐｄｂエントリー１ｔ４ｊ）およびアモルファジエン（青色）の結合部位の位置合わせした構造。 動態解析の概要。増加する濃度の（図３３Ｄ～図３３Ｇ）アモルファジエン、（図３３Ｈ～図３３Ｋ）α－ビサボレン、（図３３Ｌ）ジヒドロアルチメシン酸、および（図３３Ｍ）α－ビサボロールの阻害の存在下での様々なＰＴＰによるｐＮＰＰ加水分解の初期速度。すべての図において、線は、阻害の最も適合したモデルを示す（表１２）。図３３Ｄ～図３３Ｍにおけるエラーバーは、少なくとも３つの測定値の標準誤差を表す。ＩＣ５０の誤差は、阻害のモデルへの適合から決定された９５％の信頼区間を表す（表１２）。 動態解析の概要。増加する濃度の（図３３Ｄ～図３３Ｇ）アモルファジエン、（図３３Ｈ～図３３Ｋ）α－ビサボレン、（図３３Ｌ）ジヒドロアルチメシン酸、および（図３３Ｍ）α－ビサボロールの阻害の存在下での様々なＰＴＰによるｐＮＰＰ加水分解の初期速度。すべての図において、線は、阻害の最も適合したモデルを示す（表１２）。図３３Ｄ～図３３Ｍにおけるエラーバーは、少なくとも３つの測定値の標準誤差を表す。ＩＣ５０の誤差は、阻害のモデルへの適合から決定された９５％の信頼区間を表す（表１２）。 動態解析の概要。増加する濃度の（図３３Ｄ～図３３Ｇ）アモルファジエン、（図３３Ｈ～図３３Ｋ）α－ビサボレン、（図３３Ｌ）ジヒドロアルチメシン酸、および（図３３Ｍ）α－ビサボロールの阻害の存在下での様々なＰＴＰによるｐＮＰＰ加水分解の初期速度。すべての図において、線は、阻害の最も適合したモデルを示す（表１２）。図３３Ｄ～図３３Ｍにおけるエラーバーは、少なくとも３つの測定値の標準誤差を表す。ＩＣ５０の誤差は、阻害のモデルへの適合から決定された９５％の信頼区間を表す（表１２）。 動態解析の概要。増加する濃度の（図３３Ｄ～図３３Ｇ）アモルファジエン、（図３３Ｈ～図３３Ｋ）α－ビサボレン、（図３３Ｌ）ジヒドロアルチメシン酸、および（図３３Ｍ）α－ビサボロールの阻害の存在下での様々なＰＴＰによるｐＮＰＰ加水分解の初期速度。すべての図において、線は、阻害の最も適合したモデルを示す（表１２）。図３３Ｄ～図３３Ｍにおけるエラーバーは、少なくとも３つの測定値の標準誤差を表す。ＩＣ５０の誤差は、阻害のモデルへの適合から決定された９５％の信頼区間を表す（表１２）。 動態解析の概要。増加する濃度の（図３３Ｄ～図３３Ｇ）アモルファジエン、（図３３Ｈ～図３３Ｋ）α－ビサボレン、（図３３Ｌ）ジヒドロアルチメシン酸、および（図３３Ｍ）α－ビサボロールの阻害の存在下での様々なＰＴＰによるｐＮＰＰ加水分解の初期速度。すべての図において、線は、阻害の最も適合したモデルを示す（表１２）。図３３Ｄ～図３３Ｍにおけるエラーバーは、少なくとも３つの測定値の標準誤差を表す。ＩＣ５０の誤差は、阻害のモデルへの適合から決定された９５％の信頼区間を表す（表１２）。 動態解析の概要。増加する濃度の（図３３Ｄ～図３３Ｇ）アモルファジエン、（図３３Ｈ～図３３Ｋ）α－ビサボレン、（図３３Ｌ）ジヒドロアルチメシン酸、および（図３３Ｍ）α－ビサボロールの阻害の存在下での様々なＰＴＰによるｐＮＰＰ加水分解の初期速度。すべての図において、線は、阻害の最も適合したモデルを示す（表１２）。図３３Ｄ～図３３Ｍにおけるエラーバーは、少なくとも３つの測定値の標準誤差を表す。ＩＣ５０の誤差は、阻害のモデルへの適合から決定された９５％の信頼区間を表す（表１２）。 動態解析の概要。増加する濃度の（図３３Ｄ～図３３Ｇ）アモルファジエン、（図３３Ｈ～図３３Ｋ）α－ビサボレン、（図３３Ｌ）ジヒドロアルチメシン酸、および（図３３Ｍ）α－ビサボロールの阻害の存在下での様々なＰＴＰによるｐＮＰＰ加水分解の初期速度。すべての図において、線は、阻害の最も適合したモデルを示す（表１２）。図３３Ｄ～図３３Ｍにおけるエラーバーは、少なくとも３つの測定値の標準誤差を表す。ＩＣ５０の誤差は、阻害のモデルへの適合から決定された９５％の信頼区間を表す（表１２）。 動態解析の概要。増加する濃度の（図３３Ｄ～図３３Ｇ）アモルファジエン、（図３３Ｈ～図３３Ｋ）α－ビサボレン、（図３３Ｌ）ジヒドロアルチメシン酸、および（図３３Ｍ）α－ビサボロールの阻害の存在下での様々なＰＴＰによるｐＮＰＰ加水分解の初期速度。すべての図において、線は、阻害の最も適合したモデルを示す（表１２）。図３３Ｄ～図３３Ｍにおけるエラーバーは、少なくとも３つの測定値の標準誤差を表す。ＩＣ５０の誤差は、阻害のモデルへの適合から決定された９５％の信頼区間を表す（表１２）。 動態解析の概要。増加する濃度の（図３３Ｄ～図３３Ｇ）アモルファジエン、（図３３Ｈ～図３３Ｋ）α－ビサボレン、（図３３Ｌ）ジヒドロアルチメシン酸、および（図３３Ｍ）α－ビサボロールの阻害の存在下での様々なＰＴＰによるｐＮＰＰ加水分解の初期速度。すべての図において、線は、阻害の最も適合したモデルを示す（表１２）。図３３Ｄ～図３３Ｍにおけるエラーバーは、少なくとも３つの測定値の標準誤差を表す。ＩＣ５０の誤差は、阻害のモデルへの適合から決定された９５％の信頼区間を表す（表１２）。 動態解析の概要。増加する濃度の（図３３Ｄ～図３３Ｇ）アモルファジエン、（図３３Ｈ～図３３Ｋ）α－ビサボレン、（図３３Ｌ）ジヒドロアルチメシン酸、および（図３３Ｍ）α－ビサボロールの阻害の存在下での様々なＰＴＰによるｐＮＰＰ加水分解の初期速度。すべての図において、線は、阻害の最も適合したモデルを示す（表１２）。図３３Ｄ～図３３Ｍにおけるエラーバーは、少なくとも３つの測定値の標準誤差を表す。ＩＣ５０の誤差は、阻害のモデルへの適合から決定された９５％の信頼区間を表す（表１２）。 選択性の拡張分析。ＳＨＰ１のＡＤ阻害の初期速度データ。下パネルは、２つの異なる基質濃度におけるポイントのサブセットに対する％阻害として同じデータを示す（白丸対黒丸）。図３４Ａ、図３４Ｃ、および図３４Ｄにおいて、ＡＤの溶解限度で＞２５％の阻害（下パネル）を測定できないことは、４－メチルウンベリフェリルリン酸（４－ＭＵＰ）に対する高いＫｍと組み合わせて、正確な阻害モデル適合、ＫＩ、およびＩＣ５０決定を妨げた。しかし、観察された弱い阻害は、ＡＤ／ＡＢがＰＴＰ１Ｂよりも効力の低いこれらの酵素の阻害剤であることを示唆している。すべてのパネルで、エラーバーはｎ＝３生物学的反復の標準誤差を示し、線は非競合的阻害モデルへの適合を示す。 選択性の拡張分析。ＳＨＰ２のＡＤ阻害のための初期速度データ。下パネルは、２つの異なる基質濃度におけるポイントのサブセットに対する％阻害として同じデータを示す（白丸対黒丸）。 選択性の拡張分析。ＳＨＰ１のＡＢ阻害のための初期速度データ。下パネルは、２つの異なる基質濃度におけるポイントのサブセットに対する％阻害として同じデータを示す（白丸対黒丸）。図３４Ａ、図３４Ｃ、および図３４Ｄにおいて、ＡＤの溶解限度で＞２５％の阻害（下パネル）を測定できないことは、４－メチルウンベリフェリルリン酸（４－ＭＵＰ）に対する高いＫｍと組み合わせて、正確な阻害モデル適合、ＫＩ、およびＩＣ５０決定を妨げた。しかし、観察された弱い阻害は、ＡＤ／ＡＢがＰＴＰ１Ｂよりも効力の低いこれらの酵素の阻害剤であることを示唆している。すべてのパネルで、エラーバーはｎ＝３生物学的反復の標準誤差を示し、線は非競合的阻害モデルへの適合を示す。 選択性の拡張分析。ＳＨＰ２のＡＢ阻害のための初期速度データ。下パネルは、２つの異なる基質濃度におけるポイントのサブセットに対する％阻害として同じデータを示す（白丸対黒丸）。図３４Ａ、図３４Ｃ、および図３４Ｄにおいて、ＡＤの溶解限度で＞２５％の阻害（下パネル）を測定できないことは、４－メチルウンベリフェリルリン酸（４－ＭＵＰ）に対する高いＫｍと組み合わせて、正確な阻害モデル適合、ＫＩ、およびＩＣ５０決定を妨げた。しかし、観察された弱い阻害は、ＡＤ／ＡＢがＰＴＰ１Ｂよりも効力の低いこれらの酵素の阻害剤であることを示唆している。すべてのパネルで、エラーバーはｎ＝３生物学的反復の標準誤差を示し、線は非競合的阻害モデルへの適合を示す。 ＰＴＰ１Ｂ媒介性のＩＲ脱リン酸化の分析。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞におけるインスリンシグナル伝達の描写。細胞外のインスリンは、膜貫通型インスリン受容体（ＩＲ）に結合して、その細胞内ドメインのリン酸化を誘発する。ＰＴＰ１Ｂは哺乳動物細胞の小胞体（ＥＲ）に局在化し、このドメインを脱リン酸化して下流のシグナル伝達経路を制御する。飢餓状態の細胞では、外因的に供給された阻害剤は細胞膜を透過して、ＩＲのＰＴＰ１Ｂ媒介性の脱リン酸化を阻害することができる。 ＰＴＰ１Ｂ媒介性のＩＲ脱リン酸化の分析。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のための阻害剤濃度のスクリーニング。様々な濃度のアモルファジエン、α－ビサボレン、およびそれらの構造的アナログとともにインキュベートしたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞におけるＩＲリン酸化の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。このスクリーニングを使用して、生物学的に活性な濃度のアモルファジエンとα－ビサボレンを同定して、さらに研究した。 ＰＴＰ１Ｂ媒介性のＩＲ脱リン酸化の分析。アモルファジエン（ＡＤ）、α－ビサボレン（ＡＢ）、ジヒドロアルテミシン酸（ｄｉｈｙｄｒｏａｒｔｉｍｅｓｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＨＡ）、およびα－ビサボロール（ＡＢＯＬ）とともにインキュベートしたＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞におけるＩＲリン酸化のＥＬＩＳＡベースの測定値。曲線は、４パラメータロジスティック方程式：ｙ＝ｄ＋（ａ－ｄ）／（１＋（ｘ／ｃ）＾ｂ）（式中、ｙは４５０ｎｍの吸光度、ｘは試料の希釈率である（例えば、１は無希釈を示し、０．５は２倍希釈を示すなど））への適合を示す。これらのシグナルは、アモルファジエンおよびα－ビサボレンが、陰性対照（３％ＤＭＳＯ）およびそれらの阻害性の低いアナログよりもＩＲリン酸化を増加させることができることを示している。エラーバーは、ｎ≧３の生物学的反復による標準誤差を示す。 Ｂ２Ｈ媒介性の抗生物質耐性の全データセット。図３６Ａ、図２２Ｃの生物学的反復。 Ｂ２Ｈ媒介性の抗生物質耐性の全データセット。図３６Ａ、図２５Ａの生物学的反復。 Ｂ２Ｈ媒介性の抗生物質耐性の全データセット。図３６Ｃ、図２５Ｂの生物学的反復。オレンジ色のハイライトは、図２Ｃと図５Ａ－Ｂに表示されたデータに対応する。 α－ビサボレン産生のＧＣ／ＭＳ分析。図３７Ａ、ＧＣ／ＭＳクロマトグラムは、それ（つまり、ｐＭＢＩＳ＋ｐＡＢＡ）を生成するように操作された大腸菌の菌株によるα－ビサボレンの産生を示す。 α－ビサボレン産生のＧＣ／ＭＳ分析。図３７Ｂ、図３７Ａの示されたピークの質量スペクトル。 補足的な図２０｜（＋）－１（１０），４－カジナジエンのＧＣ／ＭＳ分析。図３８Ａ、ＧＣ／ＭＳクロマトグラムは、それ（つまり、ｐＭＢＩＳ＋ｐＡ０Ａ０Ｃ９ＶＳＬ７）を生成するように操作された大腸菌の菌株による（＋）－１（１０），４－カジナジエンの産生を示す。 補足的な図２０｜（＋）－１（１０），４－カジナジエンのＧＣ／ＭＳ分析。図３８Ｂ、図３８Ａの示されたピークの質量スペクトル。 ｐ－ニトロフェノール（ｐ－ＮＰ）の標準曲線。この図は、さらなる測定値を含むことにより、図２０について詳述する。図３９Ａ、我々は、異なる量のｐ－ニトロフェノール（ｐ－ＮＰ）を１００μＬのバッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．３）に溶解し、得られた溶液の吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２プレートリーダーで測定した。この曲線への線形適合により、動態アッセイ中に得られた吸光度測定値（ｐＮＰＰ）をｐ－ＮＰ濃度に変換することができた。 ｐ－ニトロフェノール（ｐ－ＮＰ）の標準曲線。この図は、さらなる測定値を含むことにより、図２０について詳述する。図３９Ｂ、我々は、異なる量の４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）を１００μＬのバッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．３）に溶解し、得られた溶液の蛍光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２プレートリーダーで測定した。この曲線への線形適合により、動態アッセイ中に得られた吸光度測定値（４－ＭＵＰ）を４－ＭＵ濃度に変換することができた。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、テルペノイドの産生のための貴重なプラットフォームである２７－２９。本発明者らは、ヒトの薬物標的の不活性化を検出するようにプログラムされた大腸菌の株が、その標的を阻害するテルペノイドを迅速に発見し生合成できるかもしれないという仮説を立てた。このような菌株をプログラムするために、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ（ホモサピエンス）由来のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）とタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）が遺伝子発現を制御するバクテリアツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システムが組み立てられた。ＰＴＫは３０超のＦＤＡ承認薬の標的となっている３０。ＰＴＰは、臨床的に承認された阻害剤を欠くものの、膨大な数の疾患に寄与している３１，３２。最初の概念実証システムは、２型糖尿病、肥満、および乳癌の処置のためのとらえどころのない治療標的であるタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の阻害剤を検出するように特別に設計されている（図１Ａ）３１－３５。このシステムでは、Ｓｒｃキナーゼは基質ドメインをリン酸化し、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の転写を活性化するタンパク質間相互作用を可能にする。ＰＴＰ１Ｂは基質ドメインを脱リン酸化して、その相互作用を妨げ、ＰＴＰ１Ｂを不活性化することで再び相互作用を可能にする。大腸菌はこの検出システムにとって特に優れた宿主である。なぜなら、そのプロテオームはＨ．ｓａｐｉｅｎｓのプロテオームと十分に直交しており、ＳｒｃとＰＴＰ１Ｂ３６の制御活性に起因し得る標的外増殖欠陥を最小限に抑えられるためである。
Ｂ２Ｈ開発は複数の工程で行なわれた。まず、Ｓｒｃが基質ホモロジー２（ＳＨ２）ドメインへの基質ドメインの結合を調節する、発光「ベース」のシステムが組み立てられた。このシステムは、タンパク質間結合がＧＯＩの発現を制御する従来の設計に基づいていた３７。しかし、この最初のシステムはリン酸化依存性の転写反応をもたらさなかったため、それぞれ異なるシステム構成要素を保有する誘導性プラスミドで補完することで、最適以下の活性を示すこともあるタンパク質を同定した。注目すべきは、Ｓｒｃの二次誘導が発光を増加させたことであり、これは、基質の不十分なリン酸化がベースのシステムではＧＯＩの発現を低下させたことを示している（図１Ｂ）。そこで、異なる基質ドメインに交換することによって、ホスホペプチドへの親和性を増強する突然変異をＳＨ２ドメインに加えることによって３８、および、Ｓｒｃの遺伝子を取り除くことによって、このシステムを改良した。この構成では、第２のプラスミドからＳｒｃを誘導することで、ＭｉｄＴ基質に対する発光が最も顕著に増加させた（図１Ｃ）。一方で、ＳｒｃとＰＴＰ１Ｂを同時に導入すると、増加が抑制された（図１Ｄ）。ＭｉｄＴシステムは、ＳｒｃとＰＴＰ１Ｂの遺伝子を統合することによって、プロモーターとリボソーム結合部位を調整して転写反応をさらに増幅することによって（図１Ｄ、１３、および１４）、ならびにＧＯＩとしてスペクチノマイシン耐性（ＳｐｅｃＲ）の遺伝子を加えることで、最終的に完成した。最終的なプラスミド由来の検出システムは、高い抗生物質濃度での生育を可能にするためにＰＴＰ１Ｂを不活性化する必要があった（図１Ｅ）。
Ｂ２Ｈシステムを用いて、大腸菌でそのような分子を生成する可能性のある代謝経路と結合させることで、新しいＰＴＰ１Ｂの阻害剤を同定した。これまでの植物抽出物のスクリーニングにより、ＰＴＰ１Ｂを阻害する構造的に複雑なテルペノイドが同定されてきた３９。そこで、確立された阻害効果を欠く複数のより単純なテルペノイド足場：アモルファジエン、γ－フムレン、アビエタジエン、およびタキサジエンのために、経路が構築された。アビエタジエンは、ＰＴＰ１Ｂの弱い阻害剤の代謝的前駆体であり４０。他の３つのテルペノイドは、構造的に多様な分子のセットを表す。各経路は、２つのプラスミド由来のモジュール：（ｉ）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス・セレビシエ）由来のメバロン酸依存性イソプレノイド経路４１、および、（ｉｉ）ジテルペノイド産生に必要な場合、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼで補充したテルペンシンターゼからなっていた（図２Ａ）。これらのモジュールにより、大腸菌で０．５－１００μＭのテルペノイド力価を得ることができた（図９）。
各経路は、目的の経路とＢ２Ｈシステムの両方を保有するプラスミドで大腸菌を形質転換することによって、ＰＴＰ１Ｂの阻害剤を生成する能力についてスクリーニングされた。ＧＣ－ＭＳの痕跡から、すべての経路がＢ２Ｈシステムの存在下でテルペノイドを生成していることが確認された（図２Ｄ）。驚いたことに、アモルファジエン経路は、高濃度の抗生物質でも生存を可能にした。重要なことに、最大耐性は機能的なＢ２Ｈシステムを必要とした（図９Ｃ）。この結果は、アモルファジエン経路はＰＴＰ１Ｂの阻害剤を生成することを示唆している。
微生物支援定方向進化（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｙ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（ＭＡＤＥ）とは、治療関連酵素標的の阻害剤または活性化因子を生成する代謝経路を発見および進化させるために、微生物システムを用いる本明細書に記載されるアプローチを指し、ここで、代謝経路と標的酵素の両方は、例えば、大腸菌などの宿主細胞内に存在する（図３）。このアプローチのいくつかの態様は、宿主細胞内の標的酵素の活性を検出する遺伝的にコードされたシステム、例えば、標的酵素の活性の変化を、宿主細胞の抗生物質耐性の変化に結びつけるシステムを構築するための方法を提供する（図１）。
以前の研究は、（ｉ）プロテインキナーゼとプロテインホスファターゼの活性を抗生物質耐性に結びつける検出システムの組み立て（図１）と、（ｉｉ）ＭＡＤＥを組み合わせてそのシステムを使用することによってタンパク質ホスファターゼの阻害剤を発見することを（図２）実証した。これらの結果は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／４０８９６に詳述されている。
ＭＡＤＥの能力の範囲を拡大し、以前に記載された進化実験のニーズに対処するための戦略、システム、方法、および試薬が本明細書に記載されている。本明細書のＭＡＤＥ法は、以下のうちの１つ以上を利用する：１）リン酸基を付加または除去する以外の手法で、タンパク質を翻訳後修飾する標的酵素（ＰＴＭ酵素）、２）フェニルプロパノイドまたは非リボソームペプチドを生成する代謝経路、３）想定される天然生成物をコードする潜在遺伝子クラスター、および、４）特異的な阻害効果を有する天然生成物。
いくつかの実施形態では、ＰＴＭ酵素の阻害剤または活性化因子を生成する代謝経路を発見および進化させるためにＭＡＤＥを使用する方法が提供され（図３）、前記ＰＴＭ酵素は、検出可能な出力を制御するタンパク質間相互作用を調節し、ＰＴＭ酵素と検出可能な出力の両方が、少なくとも１つのプラスミドまたは１つのゲノムによってコードされ、天然生成物を生成する代謝経路は、少なくとも１つのプラスミドまたは１つのゲノムによってコードされ、前記プラスミドとゲノムは同じ宿主細胞内に存在する。いくつかの実施形態では、それぞれが異なる代謝経路を含む前記宿主細胞のプールは、検出可能な出力についてスクリーニングされ、最も高い検出可能な出力をもたらす細胞が、ヒットとして選択される。これらのヒットは、以下のステップで分析される：１）その代謝経路が出発経路から再度組み立てられる。２）再度組み立てられた経路が宿主細胞で再スクリーニングされる（確認工程）。３）最大の検出可能な出力が得られる細胞が、再度、ヒットとして選択される。４）これらの選択された細胞が液体培養中で増殖される。５）前記液体培養中で生成された生成物は、標準的な分析方法、例えば、ガスクロマトグラフィー－質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）で同定および定量化される。６）液体培養中で生成された生成物は、ロータリーエバポレーターで濃縮される。７）濃縮された生成物の調節効果を、精製されたＰＴＭ酵素で試験される（図３）。
いくつかの実施形態では、標的ＰＴＭ酵素は、宿主細胞、例えば、異種発現キナーゼが細胞増殖を遅らせるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の増殖を自然に阻害する。
いくつかの実施形態では、ＰＴＭ酵素は、ユビキチンリガーゼ、ＳＵＭＯトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、パルミトイルトランスフェラーゼ、および／または関連ヒドロラーゼである。いくつかの実施形態では、バクテリアツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システムは、１つ以上のＰＴＭ酵素の活性を、目的遺伝子（ＧＯＩ；図４Ａ）の転写に結びつける。いくつかの実施形態では、ＰＴＭ酵素は、例えば、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、または抗生物質耐性を付与する酵素などのスプリットタンパク質の組み立てを調節する（図４Ｂ）。いくつかの実施形態では、標的酵素は、２つのタンパク質を共有結合またはタンパク質分解し、これらのタンパク質の組み立ては、目的の遺伝子の転写を活性化し（図４Ｃ）、またはスプリットタンパク質を再度組み立てる（図４Ｄ）。
いくつかの実施形態では、標的酵素を阻害または活性化するフェニルプロパノイドまたは非リボソームペプチドの発見および進化のための方法が提供され、フェニルプロパノイドまたは非リボソームペプチドを生成する代謝経路は、少なくとも１つのプラスミドまたは１つのゲノムによってコードされ（図５）、前記プラスミドおよび前記ゲノムは宿主細胞内に存在し、前記代謝経路の突然変異誘発および／または改変により、標的酵素の阻害剤または活性化因子の産生が可能となり、ＭＡＤＥは、このように変異および／または再構成された経路の同定を可能にする。
いくつかの実施形態では、標的酵素の阻害剤または活性化因子を生成する潜在代謝経路の発見および進化のための方法が提供され、前記潜在代謝経路は、未知の、または十分に特徴づけられていない生成物を有する遺伝子のセットを含み、あるいは、前記潜在代謝経路は、１つの遺伝子が重要な生成物の生合成を阻害する遺伝子のセットを含み、その後の前記経路の突然変異誘発および／または再構成により、それにその生成物をより多く生成させ、ＭＡＤＥは、このように変異および／または再構成された経路の発見を可能にする。例えば、生合成遺伝子を除去すると、標的酵素の活性を調節する代謝中間体の蓄積が可能となることがある（図６Ａ）。あるいは、転写抑制因子の遺伝子を除去すると、代謝経路全体を活性化することができる（図６Ｂ）。
いくつかの実施形態では、より高い力価および／またはより低い毒性を有する代謝経路の発見および進化のための方法が提供され、出発経路は、経路のライブラリを作成するために変異および／または再構成され、前記経路のライブラリは、（ｉ）出発経路よりも高い量の阻害剤または活性化因子を生成し、および／または、（ｉｉ）出発経路よりも低い毒性を示す経路を同定するためにＭＡＤＥを用いてスクリーニングされる（図７）。例えば、突然変異誘発されたおよび／または再構成された経路は、野生型酵素よりも高い活性を示す変異酵素、例えば、テルペンシンターゼの遺伝子を含有することができ、あるいは、突然変異誘発されたおよび／または再構成された経路は、野生型酵素よりも可溶性であるか、さもなければ毒性が低い、変異型テルペンシンターゼの遺伝子を含有することができる。
本開示のいくつかの態様は、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ；図９および図１０）を阻害する分子を提供する。例としては、アモルファジエンおよび誘導体、タキサジエンおよび誘導体、β－ビサボレンおよび誘導体、α－ビサボレンおよび誘導体、ならびにα－ロンギピネンおよび誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、これらの分子は、ＰＴＰが寄与する疾患、例えば、２型糖尿病４２、ＨＥＲ２陽性乳癌４３、またはレット症候群４４の処置のための薬物または薬物リードとして提供され、そのような治療を必要としている対照に有効量の分子を投与することによる、その疾患の処置の方法である。
目的のタンパク質を含む宿主細胞の集団と、異なる代謝経路を含む発現ベクターの集団とを含む、組成物またはシステムも提供され、宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットは、代謝経路が目的のタンパク質を調節する生成物を生成する際に検出可能な出力を生成し、任意選択で、発現ベクターは参照経路を保有する参照ベクターの出力よりも高い検出可能な出力をもたらし、例えば、細胞または宿主細胞の集団のサブセットにおいて、目的のタンパク質の活性を調節するのに十分な濃度および／または効力を有する分子を生成しない経路をコードするベクターである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は遺伝的にコードされたシステムを含み、ここで、目的のタンパク質の活性は、タンパク質複合体の２つ以上の成分のいずれかが有していない活性を有するタンパク質複合体の組み立てを制御し、したがって、形成された複合体の量に比例して検出可能な出力をもたらす。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、最初は解離している２つのタンパク質を共有結合させるか、または非共有結合複合体を形成させる、翻訳後修飾を付加する酵素である。いくつかの実施形態では、複合体は、ＳＨ２ドメインとそのリン酸化基質との間で形成される複合体の解離定数（Ｋｄ）以下のＫｄを有する２つのタンパク質によって形成される。
いくつかの実施形態では、発現ベクターによってコードされた代謝経路は、フェニルプロパノイドまたは非リボソームペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、異なる代謝経路を含む発現ベクターは、出発代謝経路内の１つ以上の遺伝子を変異させることによって生成される経路のライブラリを含む。いくつかの実施形態では、代謝経路の１つ以上は、未知の生合成能力の遺伝子のセットを含む。
いくつかの実施形態では、参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路の生成物とは異なる生成物を生成する。いくつかの実施形態では、参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路によって生成される生成物の量よりも多い量の生成物を生成する。いくつかの実施形態では、参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路よりも低い細胞毒性を示す。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、ユビキチンリガーゼ、ＳＵＭＯトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、パルミトイルトランスフェラーゼ、または関連ヒドロラーゼである。
本明細書に記載されるような発現ベクターの集団を含むキットも本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるような目的のタンパク質を含む宿主細胞の集団をさらに含む。
上記の要約は、本明細書に記載された技術の実施形態、利点、特徴、および用途のいくつかを非限定的に例示することを意図している。本明細書に開示される技術の他の実施形態、利点、特徴、および用途は、詳細な説明、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
定義
「代謝経路」という用語は、本明細書で使用されるように、代謝産物の合成を可能にする遺伝子の集合体を指す。
「代謝産物」という用語は、本明細書で使用されるように、生物系で組み立てられた有機分子を指す。
「低分子」という用語は、本明細書で使用されるように、９００ダルトン未満の分子量を有する分子を指す。
「フェニルプロパノイド」という用語は、本明細書で使用されるように、アミノ酸フェニルアラニンおよび／またはチロシンから合成される有機化合物を指す。
「非リボソームペプチド」という用語は、本明細書で使用されるように、メッセンジャーＲＮＡを用いずに合成されたペプチドを指す。例えば、非リボソームペプチドシンターゼから合成されるペプチドが挙げられる。
「調節因子」という用語は、本明細書で使用されるように、別の分子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または実体の活性を変化させる、分子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または実体を指す。
「阻害剤」という用語は、本明細書で使用されるように、酵素の活性を低下させる小分子を指す。
「活性化因子」という用語は、本明細書で使用されるように、酵素の活性を増加させる低分子を指す。
「天然生成物」という用語は、本明細書で使用されるように、生物によって生成される化学化合物または物質を指す。
「検出システム」という用語は、本明細書で使用されるように、標的酵素の活性を検出可能な出力に結びつけるシステムを指す。
「バクテリアツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システム」という用語は、本明細書で使用されるように、タンパク質間相互作用を検出可能な出力に結びつける、遺伝的にコードされたシステムを指す。
「検出可能な出力」という用語は、本明細書で使用されるように、標準的な分析機器で検出することができる出力を指す。例としては、蛍光、発光、抗生物質耐性、または微生物増殖が挙げられる。
「スプリットタンパク質」という用語は、本明細書で使用されるように、２つの別々の半分として存在し、再構成の際にはタンパク質の機能を回復させるタンパク質を指す。
「基質ドメイン」という用語は、本明細書で使用されるように、目的のタンパク質によって作用されるペプチド断片またはタンパク質成分を含むタンパク質を指す。例えば、基質ドメインは、目的のキナーゼまたはホスファターゼによって標的とされる受容体タンパク質のペプチド断片を含むことができる。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用されるように、外来遺伝物質を細胞内に人工的に運ぶためのビヒクルとして用いられるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を指す。
「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用されるように、ＭＡＤＥに必要なベクターまたはゲノム上の遺伝的にコードされたシステムを宿主とすることができる細胞を指す。例えば、宿主細胞が（ｉ）標的酵素の活性を検出可能な出力に結びつける遺伝的にコードされた検出システム、および（ｉｉ）前記標的酵素を阻害するまたはしない可能性のある分子を合成することができる代謝経路の両方をコードするプラスミドを含んでもよい。
実施例１
これまでの研究では、大腸菌の菌株は、２つの遺伝的にコードされたモジュール－－ＰＴＰ１Ｂの阻害と抗生物質耐性に関する遺伝子の発現を結びつけるＢ２Ｈシステムと、アモルファジエンの産生に関する代謝経路－－で生成されたが、異なる代謝経路を持つ類似株よりも高い抗生物質耐性を示した（図２）。最近の研究では、この結果をさらに詳しく調べている。まず、それによると、最大の耐性には活性なアモルファジエンシンターゼ（ＡＤＳ）の活性と機能的なＢ２Ｈシステムの両方が必要であることが示された（図９）。次に、ＡＤＳの主要生成物であるアモルファジエンの阻害効果を、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ；図１０Ｃ）のＰＴＰ１Ｂ触媒性の加水分解への影響を測定することで確認した。初期速度は、非競合的または不競合的な阻害の特徴的な飽和挙動を示した。最も重要なことは、アモルファジエンのＩＣ５０は約５３μＭであり、液体培養で生成した７２μＭよりも低い濃度であったことである。比較のために、タキサジエンのＩＣ５０は１１９μＭであり、液体培養での力価よりもはるかに低い濃度であった。したがって、インビトロの試験の結果は、アモルファジエンはＰＴＰ１Ｂを阻害することによって抗生物質耐性を付与することを示している。最後に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、アモルファジエンがＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞内でＰＴＰ１Ｂを阻害する能力を実証した（図１０Ｄ～図１０Ｅ）。
微生物系は、代謝経路がどのように進化して機能分子を生成するのかを探る興味深い機会を提供する。ＰＴＰ１Ｂの阻害剤を生成する能力を向上させる、進化的にアクセス可能なＡＤＳとＧＨＳの活性の変化を調べるために、両酵素の変異体が調製された。ＡＤＳについては、保存性の低い残基のエラープローンＰＣＲと部位飽和突然変異誘発法が用いられた。ＧＨＳについては、野生型酵素の部位飽和突然変異誘発を、特徴的な生成物プロファイルを持ついくつかの以前に開発された変異体のスクリーニングと対にした４７（図７Ａ、７Ｂ）。各ライブラリから少なくとも１つの変異体が、野生型酵素よりも高い濃度の抗生物質で一貫して生存していた（図７Ｃ、７Ｄ）。
ＡＤＳのＧ３４Ｓ／Ｋ５１Ｎ変異体は、他の変異体よりも抗生物質耐性を向上させたが、その変異残基は活性部位の外側に位置しており、生成物プロファイルも力価も変化しないため、特に興味深い（図７Ｅ、Ｆ）。これらの変異は、異種ＡＤＳ発現によって引き起こされる軽微な成長欠損を減少させる可能性がある（例えば、封入体の形成を減少させる可能性がある）と仮定された。この仮説を検証するために、不活性なＢ２Ｈシステム存在下で野生型株と変異型株によって付与される生存を比較した。変異株は、高濃度の抗生物質でより強固に増殖した（図７Ｇ）。これらの結果は、操作した菌株が毒性の低い酵素変異体を選択し、他のストレスの存在下で、阻害性代謝産物の産生を改善する可能性があることを示唆している。
興味深いことに、（野生型酵素に対して）抗生物質耐性を増強したＧＨＳの変異体は、生成物のプロファイルおよび／または力価を変化させた（図７Ｈおよび図７Ｉ）。２つの例としては、主にα－ロンギピネンを生成するＧＨＳＡ３３６Ｃ／Ｔ４４５Ｃ／Ｓ４８４Ｃ／Ｉ５６２Ｌ／Ｍ５６５Ｌ（またはＡＬＰ）と、テルペノイド力価を１０倍程度増強するＧＨＳＡ３１９Ｑとが挙げられる。このように、ＧＨＳ変異体は、出発野生型酵素とは異なる生成物および／または出発野生型酵素よりも高い力価を生成する酵素変異体を選択することが可能であることを示している。
試験を拡張するために、さらに、β－ビサボレンとα－ビサボレンを主に生成するテルペンシンターゼによって付与される生存率を調べた。これらの酵素は両方とも抗生物質耐性を増強した。特に、培養上清から精製したα－ビサボレンの動態研究から、この分子が特に効力が強いことがわかった（すなわち、１０％ＤＭＳＯ中でＩＣ５０は約２０μＭ；図１１）。
テルペンシンターゼの分析結果から、アモルファジエンおよび誘導体、タキサジエンおよび誘導体、α－ロンギピネンおよび誘導体、β－ビサボレンおよび誘導体、ならびにα－ビサボレンおよび誘導体は、医薬的に関連するＰＴＰ阻害剤の重要な供給源をもたらし得ることが示唆されている。
方法
バクテリア菌株。大腸菌ＤＨ１０Ｂ、ケミカルコンピテントＮＥＢＴｕｒｂｏ、またはエレクトロコンピテントＯｎｅＳｈｏｔＴｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、分子クローニングを実施してテルペノイド産生の予備解析を行った。大腸菌ＢＬ２－ＤＥ３１は、インビトロ研究のためのタンパク質の発現に使用され、大腸菌ｓ１０３０４８は、発光研究とテルペノイド媒介性の増殖（すなわち、進化研究）を含むすべての実験に使用された。
すべての株について、以下の工程を実施することにより、ケミカルコンピテントセルを生成した：（ｉ）各菌株を、必要な抗生物質とともにＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。（ｉｉ）各菌株の１つのコロニーを用いて、ガラス製の培養チューブに１ｍＬのＬＢ培地（表２に列挙した適切な抗生物質を含む２５ｇ／ＬＬＢ）を播種し、この培養物を一晩成長させた（３７℃、２２５ＲＰＭ）。（ｉｉｉ）１ｍＬ培養物を用いて、ガラス製振とうフラスコに１００～３００ｍＬのＬＢ培地（上記）を播種し、この培養液を数時間成長させた（３７℃、２２５ＲＰＭ）。（ｉｖ）培養物が０．３－０．６のＯＤに達した時点で、細胞を遠心分離（４，０００ｘｇ、４℃、１０分間）し、上清を除去し、細胞を３０ｍＬの氷冷ＴＦＢ１バッファ（３０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＭｎＣｌ２、１００ｍＭのＲｂＣｌ、１５％ｖ／ｖのグリセロール、２００ｍＬまでの水、ｐＨ＝５．８、滅菌濾過）に再懸濁し、懸濁液を４℃で９０分間インキュベートした。（ｖ）工程ｉｖを繰り返したが、４ｍＬの氷冷ＴＦＢ２バッファ（１０ｍＭのＭＯＰＳ、７５ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＲｂＣｌ２、１５％グリセロール、５０ｍＬまでの水、ｐＨ＝６．５、滅菌濾過）に再懸濁した。（ｉｖ）最終懸濁液を１００μＬのアリコートに分割し、次に使用するまで－８０℃で凍結した。
エレクトロコンピテント細胞は、上記と同様の手法に従って作製した。しかし、工程ｉｖでは、細胞を５０ｍＬの氷冷ＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁し、この工程を２回－－最初は５０ｍＬの２０％滅菌グリセロール（氷冷）、次に、１ｍＬの２０％滅菌グリセロール（氷冷）で繰り返した。ペレットを従来通り凍結した。
材料。アビエチン酸メチルはＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。トランス－カリオフィレン、ファルネソール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｍ９最小塩、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、およびＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａから購入した。グリセロール、細菌タンパク質抽出試薬ＩＩ（Ｂ－ＰＥＲＩＩ）、およびリゾチームはＶＷＲから購入した。クローニング試薬は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。アモルファジエンはＡｍｂｅｅｄ，Ｉｎｃ．から購入した。その他の試薬（例えば、抗生物質、培地成分）はすべてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入した。タキサジエンはＳｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｈｉｌＢａｒａｎからの親切な贈り物であった。メバロン酸は、１容量の２ＭのＤＬ－メバラノラクトンを、１．０５容量の２ＭのＫＯＨと混合し、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートすることによって調製された。
クローニングと分子生物学。すべてのプラスミドは標準的な方法（すなわち、制限消化およびライゲーション、ゴールデンゲートおよびギブソンアセンブリ、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発、ならびに円形ポリメラーゼ伸長クローニング）を用いて構築された。表１は各遺伝子の供給源を記載している。表２および表３は、すべての最終プラスミドの組成を記載している。
Ｂ２Ｈシステムの構築は、ｐＡＢ０９４ａのＨＡ４－ｒｐｏＺの遺伝子をｐＡＢ０７８ｄに組み込み、ｐＡＢ０７８ｄのアンピシリン耐性マーカーをカナマイシン耐性マーカーに置き換えることによって、開始した（ギブソンアセンブリ）。得られた「組み合わされた」プラスミドは、順に、ＨＡ４およびＳＨ２ドメインをそれぞれキナーゼ基質と基質認識（すなわち、ＳＨ２）ドメインに置き換え（ギブソンアセンブリ）、Ｓｒｃキナーゼ、ＣＤＣ３７、およびＰＴＰ１Ｂの遺伝子を様々な組み合わせで組み込むこと（ギブソンアセンブリ）によって、改変された。機能的なＢ２Ｈシステムは、ＳＨ２ドメインを、ホスホペプチドへの親和性を増強することが知られているいくつかの変異（Ｋ１５Ｌ、Ｔ８Ｖ、Ｃ１０Ａ、Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．で番号付けされている４０）で改変し、発光のためのＧＯＩ（ＬｕｘＡＢ）をスペクチノマイシン耐性のもの（ＳｐｅｃＲ）と交換し、および、転写反応を増強するためにプロモーターとリボソーム結合部位をトグリングすること（ギブソンアセンブリとＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｃ．）によって、完了した。注：最後の工程では、Ｐｒｏ１からＰｒｏＤも、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅプロトコルを用いて変換された。必要に応じて、アラビノース誘導性成分を有するプラスミドは、Ｂ２Ｈシステムからの単一成分をｐＢＡＤにクローニングすることにより構築された（ゴールデンゲートアセンブリ）。表４および５は、各プラスミドの構築に使用したプライマーとＤＮＡ断片を列挙している。
テルペノイド生合成の経路は、Ａｄｄｇｅｎｅから第１のモジュール（ｐＭＢＩＳ）とセスキテルペンシンターゼ（ｐＴＲＣ９９ａのＡＤＳまたはＧＨＳ）をコードするプラスミドを購入し、残りのプラスミドを構築することによって、組み立てられた。ＡＢＳ、ＴＸＳ、およびＧＧＰＰＳの遺伝子は、ｐＴＲＣ９９ｔ（すなわち、ＢｓａＩ部位のないｐＴＲＣ９９ａ）に組み込まれ、ｐＡＤＳのバージョンは、アモルファジエンのエポキシ化を可能にする３つの変異（Ｆ８７Ａ、Ｒ４７Ｌ、およびＹ５１Ｆ；Ｐ４５０Ｇ３；Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ、および、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を有するＰ４５０ＢＭ３の遺伝子を加えることで改変された４９。表６は各プラスミドの構築に使用したプライマーとＤＮＡ断片を列挙している。
発光アッセイ。予備的なＢ２Ｈシステム（ＧＯＩとしてＬｕｘＡＢを含有していた）は、発光アッセイで特徴づけられていた。簡単に言えば、必要なプラスミドを大腸菌ｓ１０３０に形質転換し（表２）、形質転換細胞をＬＢ寒天プレート（表２に記載の抗生物質とともに、２０ｇ／Ｌの寒天、１０ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、および５ｇ／Ｌの酵母抽出物）上にプレーティングし、すべてのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。個々のコロニーを使用して、１ｍｌのテリフィックブロス（ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｏｔｈ）（２％のＴＢ、または１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、１２ｍＬ／Ｌの１００％グリセロール、２．２８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２．５３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ＝７．０、および表２に記載の抗生物質）の播種を行い、これらの培養物を一晩インキュベートした（３７℃および２２５ＲＰＭ）。翌朝、各培養物を１ｍｌのＴＢ培地（上記）に１００倍に希釈し、これらの培養物を深型の９６ウェルプレートの個々のウェルで５．５時間インキュベートした（３７℃、２２５ＲＰＭ）。（注：ｐＢＡＤが存在する場合、ＴＢ培地は０－０．０２ｗ／ｖ％アラビノースで補充された）。１００μＬの量の各培養物を標準的な９６ウェルプレートの単一ウェルに移し、Ｂｉｏｔｅｋ ＳｙｎｅｒｇｙプレートリーダーでＯＤ６００と発光（ゲイン：１３５、積分時間：１秒、読み取り高さ：１ｍｍ）の両方を測定した。無細胞培地についても同様の測定を行ってバックグラウンドシグナルを測定し、これをＯＤで正規化された発光（Ｌｕｍ／ＯＤ６００）を算出する前に各測定値から差し引いた。
抗生物質耐性の分析。テルペノイド経路が存在しない場合の様々なＢ２Ｈシステムによって付与されるスペクチノマイシン耐性は、以下の工程を実施することにより評価された：（ｉ）大腸菌を必要なプラスミドで形質転換し（表２）、形質転換細胞をＬＢ寒天プレート（２０ｇ／Ｌの寒天、１０ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン）上にプレーティングした。（ｉｉ）個々のコロニーを使用して１－２ｍｌのＴＢ培地（１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、１２ｍＬ／Ｌの１００％グリセロール、２．２８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２．５３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、ｐＨ＝７．０）を播種し、これらの培養物を一晩インキュベート（３７℃、２２５ＲＰＭ）した。午前中、各培養物を、０～５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（スペクチノマイシンは図１４に描かれた結果に対してのみ使用された）を有する４ｍｌのＴＢ培地（上記の通り）に１００倍希釈し、０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するウェルが０．９～１．１のＯＤ６００に到達するまで、これらの培養物を深型の２４ウェルプレートでインキュベートした。（ｉｖ）各４ｍｌの培養物を、抗生物質を含まないＴＢ培地に１０倍希釈し、１０μＬの希釈液の液滴を、様々な濃度のスペクチノマイシンを有する寒天プレート上にプレーティングした。（ｖ）プレートを一晩培養し（３７℃）、翌日撮影した。
テルペノイド媒介性の耐性を調べるために、すべての液体／固体培地に３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを加えて、上記のように工程ｉとｉｉを実施した。その後、以下の工程で実験を進めた：（ｉｉｉ）試料を１ｍｌの培養物から、４．５ｍｌのＴＢ培地（１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、１２ｍＬ／Ｌの１００％グリセロール、２．２８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２．５３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、および５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補充された）中で０．０５のＯＤ６００に希釈して、これを深型の２４ウェルプレート（３７℃、２２５ＲＰＭ）中でインキュベートした。（ｉｖ）０．３～０．６のＯＤ６００で、各培養物４ｍｌを深型の２４ウェルプレートの新しいウェルに移し、５００μＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）と２０ｍＭのメバロン酸を加え、２０時間インキュベートした（２２°Ｃ、２２５ＲＰＭ）。（ｖ）各４ｍｌの培養物をＴＢ培地でＯＤ６００が０．１になるように希釈し、希釈液１０μＬを、５００μＭのＩＰＴＧ、２０ｍＭのメバロン酸、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、および０～１２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンで補充したＬＢまたはＴＢプレートのいずれかにプレーティングした（両方のプレートについて、２０ｇ／Ｌの寒天は、上記の培地およびバッファの成分と共に使用された）。注：抗生物質耐性の範囲を制御するために、ＡＤＳとその変異体にはＬＢプレートを使用し、ＧＨＳとその変異体にはテルペノイド力価を向上させるＴＢプレートを使用した。（ｉｖ）すべてのプレートを３０℃でインキュベートして２日後に撮影した。
テルペノイド生合成。大腸菌は、必要な経路成分（表２）を保有するプラスミドで細胞を形質転換し、ＬＢ寒天プレート（表２に記載の抗生物質とともに、２０ｇ／Ｌの寒天、１０ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、および５ｇ／Ｌの酵母抽出物）上にプレーティングすることで、テルペノイド産生のために調製された。各菌株の１つのコロニーを使用して、２ｍｌのＴＢ（１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、１２ｍＬ／Ｌの１００％グリセロール、２．２８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２．５３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ＝７．０、および表２に記載の抗生物質）をガラス製の培養チューブ内で約１６時間播種した（３７℃および２２５ＲＰＭ）。これらの培養物を１０ｍｌのＴＢ培地に７５倍に希釈し、新しい培養物を１２５ｍＬのガラス製振とうフラスコで培養した（３７℃および２２５ＲＰＭ）。ＯＤ６００が０．３－０．６のとき、５００μＭのＩＰＴＧと２０ｍＭのメバロン酸を添加した。７２～８８時間の増殖（２２℃および２２５ＲＰＭ）後、各培養物からテルペノイドを抽出した。
経時的なテルペノイド産生を測定するために、上記の手法を以下の改変とともに使用した：（ｉ）一晩の培養物を、ガラス製の培養チューブ内で抗生物質を補充した４．５ｍＬのＴＢで１：７５ｍＬに希釈した。（ｉｉ）培養物が０．３－０．６のＯＤ６００に到達すると、各培養物４ｍＬを新しい培養チューブに移し、５００μＭのＩＰＴＧ、２０ｍＭのメバロン酸、０－８００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、および１ｍＬのドデカンを（テルペノイド抽出のために）添加した。４時間ごとにドデカン試料１００μＬを除去し、ＧＣ／ＭＳ分析を行った。
タンパク質の発現と精製。ＰＴＰは従来通りに発現および精製された４２。簡潔に言えば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をｐＥＴ２１ｂベクターで形質転換し、５００μＭのＩＰＴＧで２２℃で、２０時間誘導した。脱塩、ニッケル親和性、およびアニオン交換クロマトグラフィー（それぞれＨｉＰｒｅｐ２６／１０、ＨｉｓＴｒａｐＨＰ、およびＨｉＰｒｅｐＱＨＰ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、細胞溶解液からＰＴＰを精製した。最終的なタンパク質（３０～５０μＭ）は、２０％グリセロール中のＨＥＰＥＳバッファ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中で－８０℃で保存された。
テルペノイドの抽出および精製。液体培養で生成したテルペノイドの抽出には、ヘキサンを使用した。１０ｍＬの培養物について、１２５ｍＬのガラス製振とうフラスコ中の培養ブロス１０ｍＬにヘキサン１４ｍＬを加え、混合物（１００ＲＰＭ）を３０分間振とうし、遠心分離（４０００×ｇ）し、ヘキサン層１０ｍＬをさらなる分析のために取り除いた。４ｍＬの培養物について、微量遠心チューブ中の培養ブロス１ｍＬにヘキサン６００μＬを加え、３分間ボルテックスし、１分間遠心（１７０００×ｇ）し、ヘキサン層３００－４００μＬをさらなる分析のために保存した。
アモルファジエンを精製するために、５００－１０００ｍＬの培養ブロスにヘキサン（１６．７％ｖ／ｖ）を補充し、混合物を３０分間振とうし（１００ＲＰＭ）、分離漏斗でヘキサン層を単離し、単離した有機相を遠心分離（４０００×ｇ）し、ヘキサン層を取り除いた。テルペノイド生成物を濃縮するために、過剰なヘキサンをロータリーエバポレーターで蒸発させることで最終容量を５００μＬにし、得られた混合物をシリカゲル上に１回または２回通過させた（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；高純度グレード、孔径６０Å、２３０－４００メッシュの粒径）。溶出画分（１００％ヘキサン）をＧＣ／ＭＳで分析し、目的化合物（アモルファジエン）とともにプールした画分を分析した。精製後、プールした画分を緩やかな気流下で乾燥させ、テルペノイド固形物をＤＭＳＯに再懸濁し、最終試料を以下に概説するように定量化した。
テルペノイドのＧＣ－ＭＳ分析。液体培養で生成したテルペノイドは、ガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ－ＭＳ；ＴＧ５－ＳｉｌＭＳカラムとＩＳＱ７０００ＭＳを装備したＴｒａｃｅ １３１０ ＧＣ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定された。すべての試料を、内部標準として２０μｇ／ｍｌのカリオフィレンまたはアビエチン酸メチルを含むヘキサン（直接またはＤＭＳＯの１：１００希釈を介して）中に調製された。内部標準のピーク面積は、標準試料のみを含有するヘキサン試料の平均面積の＋３０％を超えた場合、対応する試料を再分析した。すべての実行について、以下のＧＣ方法を使用した：８０℃に保持（３分）→２５０℃に昇温（１５℃／分）→２５０℃に保持（６分）→２８０℃に昇温（３０℃／分）→２８０℃に保持（３分）。様々な分析物を同定するために、ｍ／ｚ比を５０から５５０まで走査した。
ＡＤＳのバリアントによって生成したセスキテルペンは、分子イオン（ｍ／ｚ＝２０４）を走査するために、選択イオンモード（ＳＩＭ）を用いることによって調査された。定量化のために、方程式１を使用した：
Figure 2023522289000002
ここで、Ａｉは分析物ｉによって生成されるピークの面積であり、Ａｓｔｄは試料中のカリオフィレンのＣｓｔｄによって生成されるピークの面積、Ｒは基準試料中のカリオフィレンとアモルファジエンの応答係数の比である。
ＧＨＳの変異体によって生成されたセスキテルペンは、前述の手順にいくつかの改変を加えて定量化した：内部標準としてアビエチン酸メチルを使用した（ＧＨＳのいくつかの変異体は生成物としてカリオフィレンを生成する）；セスキテルペンとアビエチン酸メチルとの間の共通イオンである、ｍ／ｚ＝２０４とｍ／ｚ＝１２１の両方を走査した。Ｒについてｍ／ｚ＝１２１におけるアモルファジエンとアビエチン酸メチルの応答係数の比を使用した。ピーク面積はｍ／ｚ＝１２１で計算した。すべての分析について、ｍ／ｚ＝２０４のすべてのピークの総面積の１％を超える面積を持つピークに着目して分析を行った。
ジテルペノイドは、再度、一般的な手順にいくつかの改変を加えて定量化された：異なる分子イオン（ｍ／ｚ＝２７２）とジテルペノイドとカリオフィレンの両方に共通するイオン（ｍ／ｚ＝９３）が走査された。純粋なタキサジエン（Ｐｈｉｌ Ｂａｒａｎからの親切な贈り物）とｍ／ｚ＝９３におけるカリオフィレンの応答係数の比が使用された。ｍ／ｚ＝９３でのピーク面積が計算された。すべての分析について、ｍ／ｚ＝２７２でのすべてのピークの面積の１％を超える面積を持つピークのみが調査された。
分子は、ＮＩＳＴ ＭＳライブラリを用いて同定され、この同定は、必要に応じて、分析標準物質または文献に記載されている質量スペクトルで確認された。注：異なるテルペノイドに対して一定の応答係数を仮定することで（例えば、すべてのセスキテルペンとジテルペンは、それぞれアモルファジエンとタキサジエンのようにイオン化する）、その濃度の推定に確実に誤差が生じ得る。本明細書に記載される分析は、微生物系でのテルペノイド産生に関する他の研究と一致しているため５０，５１、アモルファジエンとタキサジエン（分析標準物質を有していた）以外のすべての化合物の濃度の概算値を提供する。
ＡＤＳとＧＨＳのホモロジーモデリング。ＡＤＳとＧＨＳのホモロジーモデルは、それぞれ鋳型として、α－ビサボロールシンターゼ（ｐｄｂエントリー４ｇａｘ）とα－ビサボレンシンターゼ（ｐｄｂエントリー３ｓａｅ）の構造とともにＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬを用いて構築された５２。このソフトウェアパッケージは、ＰｒｏＭｏｄ３を用いて、標的－鋳型間のアラインメントからモデルを構築し、これが保存領域の構造を保存し、断片ライブラリで挿入や欠失をリモデリングする５３，５４。
変異体ライブラリの調製。酵素変異体のライブラリは、部位飽和突然変異誘発（ＳＳＭ）とエラープローンＰＣＲ（ｅＰＣＲ）を用いて調製された。ＳＳＭでは、以下のステップを実施した：（ｉ）選択部位を標的とするＮＮＫプライマーを用いて遺伝子を増幅した。（ｉｉ）増幅した遺伝子をＤｐｎＩで消化し、ゲル電気泳動で精製し、ギブソンアセンブリまたは円形ポリメラーゼ伸長（ＣＰＥＣ）５５を用いて、それらをプラスミド（ｐＴＳｘｘ）に組み込んだ。（ｉｉｉ）熱ショックを用いて、完全に組み立てられたプラスミドをケミカルコンピテントＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ細胞に形質転換した。（ｉｖ）形質転換反応の希釈液を複数のＬＢ寒天プレート（２０ｇ／Ｌの寒天、１０ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン）にプレーティングすることによって、ライブラリーサイズを決定し、残りのすべての細胞をその後の解析のために９－１０枚のプレート上にプレーティングした。（ｖ）コロニーを配列決定することで、６つの形質転換体のうちの少なくとも５つが変異遺伝子を含有していることを確認した。（ｖｉ）プレートをＬＢ培地（２５ｇ／Ｌ ＬＢブロスミックス、抗生物質なし）に掻き入れ、最終的な形質転換体をミニプレップしてＤＮＡライブラリを回収した。（ｖｉｉ）すべての最終ライブラリをＭｉｌｌｉＱ水中で－２０℃にて凍結した。
ｅＰＣＲについては、Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ ＩＩキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、約０．５－２．５突然変異／ｋｂで使用した。最終的なプラスミドを透析し、Ｏｎｅ ＳｈｏｔエレクトロコンピテントなＴｏｐ１０細胞にエレクトロポレーションし、最終的なプラスミドを上記のように配列決定、抽出、および保存した。
変異体ライブラリの解析。各変異体ライブラリは、以下の工程を実施することによりスクリーニングされた：（ｉ）所定のテルペンシンターゼに対する各部位特異的なＳＳＭライブラリ１００ｎｇをプールした。（ｉｉ）各完全なライブラリ（すなわち、ｅＰＣＲまたはプールされたＳＳＭ）を、２時間透析した。（ｉｉｉ）最大で１０μＬ（＜１μｇ）の各ライブラリを、ｐＭＢＩＳ経路とＢ２Ｈシステムの両方を保有する大腸菌の株にエレクトロポレーションした。（ｉｖ）１ｍＬのＳＯＣを形質転換した細胞に加え、１時間インキュベートした（３７℃および２２５ＲＰＭ）。（ｖ）ＳＯＣ増殖物１００μＬを連続希釈し、ＬＢ寒天プレート（２０ｇ／Ｌの寒天、１０ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、および３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール）上にプレーティングし、プレートを一晩インキュベートした（３７℃）。この工程により、スクリーニングされた形質転換体の数（すなわち、コロニーを数えることによって決定される数）を定量化することができた。（ｖｉ）残りの形質転換細胞９００μＬを、５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中の１００ｍＬのＴＢ（１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、１２ｍＬ／Ｌの１００％グリセロール、２．２８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２．５３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、ｐＨ＝７．０）に添加し、これらのフラスコを一晩インキュベート（３７℃および２２５ＲＰＭ）した。（ｖｉｉ）朝に、各培養液のアリコートを４ｍＬのＴＢ中でＯＤ６００が０．０５になるように希釈し、ガラス製の培養チューブ内でインキュベートした（３７℃および２２５ＲＰＭ）。（ｖｉｉｉ）ＯＤ６００が０．３－０．６で、５－２０ｍＭのメバロン酸および５００μＭのＩＰＴＧを添加してテルペノイド産生を誘導し、得られた培養物を２０時間インキュベートした（２２℃および２２５ＲＰＭ）。（ｉｘ）ＯＤ６００が０．００１になるように各培養物を希釈し、希釈液１００μＬを、５００μＭのＩＰＴＧ、５～２０ｍＭのメバロン酸、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、および０～１０００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有する寒天プレート上にプレーティングした。（ｘ）高濃度のスペクチノマイシンに耐えたコロニーを使用して、４ｍＬのＬＢ培地（２５ｇ／ＬのＬＢブロスミックス、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン）に播種し、これを一晩インキュベートした（３７℃、２２５ＲＰＭ）。（ｘｉ）一晩の培養物からプラスミドＤＮＡを抽出してサンガーシーケンシングを行った。
興味深い変異の影響－－および偽陽性のチェック－－は、新しく調製した変異体において再スクリーニングすることによって確認された。部位指向的な突然変異誘発を用いて、ヒットの中で見られた変異体を導入し、その抗生物質耐性を、前記のドロップベースのプレーティング法を用いて分析した。
酵素動力学。テルペノイド媒介性の阻害を調べるために、様々な濃度のテルペノイドの存在下において、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）のＰＴＰ１Ｂ触媒性の加水分解を測定した。各反応は、ＰＴＰ１Ｂ（０．０５μＭ）、ｐＮＰＰ（０．３３、０．６７、２，５、１０、および１５ｍＭ）、阻害剤（アモルファジエンに関して、１１０μＭ、５０μＭ、および１５μＭ；タキサジエンに関して、１００μＭ、５０μＭ、および１６．７μＭ）、ならびにバッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ＝７．５、０．５ｍのＭＴＣＥＰ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、１０％のＤＭＳＯ）を含有していた。ｐ－ニトロフェノールの形成は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ２プレートリーダーで１０秒ごとに５分間、４０５ｎｍの吸光度を測定することによって、モニタリングされた。
動態モデルは３つの工程で評価された：（ｉ）阻害剤の非存在下および存在下で収集した初期速度測定値を、それぞれミカエリスメンテンモデルと阻害モデルに適合させた（ここでは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）からのｎｌｉｎｆｉｔ関数およびｆｍｉｎｓｅａｒｃｈ関数を使用した）。（ｉｉ）Ｆ－検定を使用して、混合モデルと最小二乗誤差を持つ単一パラメータモデルを比較し（ここでは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）のｆｃｄｆ関数を使用してｐ値を割り当てた）、混合モデルは、ｐ＜０．０５のときに認められた。（ｉｉｉ）赤池情報量規準（ＡＩＣ）を用いて、最良適合単一パラメータモデルと各代替単一パラメータモデルを比較し、すべての比較において、ＡＩＣの差（Δｉ）が１０を超える場合に、「最良適合」モデルが認められた５６。注：アモルファジエンについては、この基準は満たされなかった。しかし、非競合モデルと不非競合モデルの両方が、区別できないＩＣ５０をもたらした。
阻害剤の半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、１５ｍＭのｐＮＰＰのＰＴＰ触媒性の加水分解の初期速度を５０％減少させるために必要とされる阻害剤の濃度を決定するために、最良適合の動態モデルを用いて、推定された。ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）関数「ｎｌｐａｒｃｉ」を用いて、動態パラメータの信頼区間を決定し、それらの区間を伝播してＩＣ５０の対応する信頼度を推定した。
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実施例２
疾病関連タンパク質を阻害する小分子の設計は、医薬品化学の長年の課題を表す。ここで、この課題、つまりヒト創薬標的の阻害を微生物宿主へコードすること、およびそれを使用して、標的とされた生物学的に活性な天然生成物の発見ならびに生合成を先導するアプローチを記載する。このアプローチは、タンパク質チロシンホスフォターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）の２個のこれまで未知であったテルペノイド阻害剤を同定し、それらは糖尿病および癌の治療のための難解な治療標的である。少なくとも１個の阻害剤が、普通でない選択性を付与するアロステリック部位を標的とし、両方が、生存細胞におけるＰＴＰ１Ｂを阻害できる。４４６４個の遺伝子のプールからの２４個の特徴づけられていないテルペンシンターゼのスクリーニングは、追加的ヒットを明らかにし、スケーラブルな発見アプローチを示し、異なるＰＴＰを微生物宿主に取り組むことは、ＰＴＰに特異的な検出システムをもたらした。所見は、いまだ予期しない構造および／または結合部位を持つ、正確に定められた生化学活性を表す天然生成物を発見および構築するために、微生物を使用する潜在性を例示する。
構造生物学および計算科学における進歩にもかかわらず、疾病関連タンパク質に密接に、選択的に結びつく小分子の設計は、並みはずれて難しい１。結合相手を溶媒和させる水分子の再配置の自由エネルギー的寄与、および結合相手自体の内の構造変化は、予測し、そして分子設計に取り組むことは特に難解なことである２、３。創薬開発は、その結果、大規模な化合物ライブラリのスクリーニングからたいてい始まる４。
自然は、生態系に、莫大な種類の生物学的な活性物資（多様な自然のライブラリ５）を構築するための触媒機構を与える。これらの分子は、重要な新陳代謝と生態学の機能を実行するために進化した（例えば、草食昆虫の捕食者の植物性化学物質の採用６）が、たいていは有益な医薬の特質を表す。年来、環境抽出物、および天然生成物ライブラリ（時々、コンビナトリアル生化学でされる７～９）のスクリーニングは、アスピリンからパクリキタセルまで治療学の多様なセットを明らかにしてきた１０。不運なことに、これらのスクリーニングは、資源集約的であり１１、低い自然の力価により限られ１２、および大部分はセレンディピティに従う傾向がある１３。バイオインフォマティクスツールは、次に生合成遺伝子クラスターの同定を可能にしており１４、１５、そこで共存化の耐性性遺伝子がそれらの生成物の生化学機能を明らかにすることができる１６，１７。多くの天然生成物の治療応用は、しかしながらネイティブの機能とは異なり１８、多くの生合成経路は、適切に再構成されているときに、全く新しく、ひょっとしたらより効果的な治療分子を生成することが可能である１９，２０。特定の疾病関連タンパク質を阻害する天然生成物を効率的に同定および構築するための方法は、大部分が未発達である。
タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰｓ）は、阻害剤の発見にとって、新規アプローチから得られる創薬標的の重要なクラスである。これらの酵素は、チロシン残基の加水分解脱リン酸化を触媒し、さらに、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫｓ）と共に莫大な数の病気に寄与する。（例えをいくつか挙げると、癌、自己免疫障害、および心臓病）２１，２２ 。過去数十年、ＰＴＫｓの多くの効能のある阻害剤の構築が目撃され、それらは３０を超える承認された薬品の標的である２３。ＰＴＰｓの治療用阻害剤は、対照的に、開発が難しいことが分かっている。これらの酵素は、膜透過性分子２４を用いて阻害することを難しくさせる、良く保存され、正電荷を持った活性部位を保有する。それらは標的とされるいかなる種類の治療も欠いている。
この研究では、薬剤化することが難しいタンパク質を阻害する天然生成物を発見するため、微生物システムを使用するためのアプローチを記載する。我々は、２型糖尿病、肥満、およびＨＥＲ２陽性乳癌の治療のための治療標的であるタンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）に重点を置いた２５。ＰＴＰ１Ｂは、一般的にＰＴＰファミリーを代表する構造的特徴を有し２６、生理的プロセスの多様なセットを規制する。（例えば、エネルギー消費２７、炎症２８、および胚性幹細胞における神経特異化２９）。簡潔に、２個の遺伝的モジュール（ｉ）細胞生存をＰＴＰ１Ｂの阻害に結びつけるもの、および（ｉｉ）構造的に変更されたテルペノイドの生合成を可能にするものを持つ、大腸菌株を組み立てた。５個の特徴がはっきりとしたテルペンシンターゼの研究において、この株はＰＴＰ１Ｂの２個の以前は未知のテルペノイド阻害剤を同定した。両阻害剤はＰＴＰ１Ｂに対して選択的であって、明確な結合機構を示し、および哺乳動物細胞におけるインスリン受容体リン酸化を増加させた。８個の系統的に多様なクレードからの２４の特徴づけられていないテルペンシンターゼのスクリーニングは、追加的なヒットを明らかにし、阻害剤合成遺伝子を発見するためのスケーラブルなアプローチを例示した。ＰＴＰ遺伝子の単純な変化は、新たな標的への我々の遺伝的にコードされた検出システムの容易な拡張を可能にした。我々の所見は、疾病関連酵素の標的とされた簡単に合成可能な阻害剤を発見するために、微生物システムを用いる多方面にわたるアプローチを例示している。
遺伝的にコードされた対象の開発
大腸菌は、インキュベート不可能または低収量有機体からの天然生成物を構築するための多方面にわたるプラットフォームである３０，３１。我々は、ＰＴＰ１Ｂの不活性化を検出するようプログラムされた大腸菌株（つまり、遺伝的にコードされた対象）が、それを阻害する天然生成物（つまり、対象に対する分子溶液）の発見を可能にするかもしれない仮説を立てた。そのような株をプログラムするために、我々はＰＴＰ１ＢおよびＳｒｃキナーゼが遺伝子発現を制御する、バクテリアツーハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システムを組み立てた（図２１Ａ）。このシステムでは、Ｓｒｃは基質ドメインをリン酸化することで、興味対象遺伝子（ＧＯＩ）の転写を活性化するタンパク質間相互作用を可能にする。ＰＴＰ１Ｂは基質ドメインを脱リン酸化することでその相互作用を妨げて、ＰＴＰ１Ｂの不活性化により相互作用を再度可能にする。大腸菌は、そのプロテオームがＳｒｃとＰＴＰ１Ｂ（注１）３２の調節活性から結果として生じ得るオフターゲットの増殖障害を最小にするために、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのプロテオームと十分に直交しているため、この検出システムにとって特に良い宿主である。
我々は、いくつかの工程でＢ２Ｈの開発を実行した。初めに、我々は、ＳＲｃが基質ドメインをＳｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインへの結合を調節する、ベースシステムを組み立てた（図２１Ｂ）。Ｓｒｃの折りたたみを助けるシャペロン（Ｃｄｃ３７）３３を含む、このシステムは、タンパク質間結合を検出する他のＢ２Ｈ設計と類似している３４。不運なことに、我々の初期のシステムはリン酸化依存的な転写反応を生み出さなかったので、我々は準最適の発現レベルをもつタンパク質を同定するために、それぞれ異なるシステム構成要素を保有する誘導性プラスミドによりそれを補った（図２１Ｂ）。興味深いことに、これは、Ｓｒｃの２番目の導入が発光を増加させ、不十分な基質リン酸化および／または弱い基質ＳＨ２結合が、我々のベースシステムにおけるＧＯＩ発現を低下させるということを示すもの。我々は、異なる基質ドメインにおいて交換すること、ホスホペプチドに対するその親和性を高めるＳＨ２ドメインに突然変異を付加すること３５、およびＳＲｃの遺伝子を除去することで、このシステムを修正した。つまり、これは２番目のプラスミドからのみの発現を我々が制御することを可能にする修正である。この構成と共にＳｒｃの導入は、ＭｉｄＴ基質に対して最も顕著に、発光を増加させ（図１Ｃ）、ＳｒｃならびにＰＴＰ１Ｂの同時に導入することがその増加を防いだ。つまりこれは、細胞間ＰＴＰ１Ｂ活性化を示すものである（図２１Ｄ）。我々は、ＰＴＰ１ＢとＳｒｃの遺伝子を組み込むこと、転写反応をさらに増幅するためにプロモーターとリボソームの結合部位を調節すること（図２１Ｂ、図１３、および図１４）、およびＧＯＩとしてスペクチノマイシン耐性（ＳｐｅｃＲ）の遺伝子を付加することでＭｉｄＴシステムを完了させた。最後のプラスミド由来の検出システムは、抗生物質の高濃度の増殖を可能にするためにＰＴＰ１Ｂの不活性化を要した（図２１Ｅ）。
ＰＴＰ１Ｂ阻害剤の生合成
活性部位の外側に結合するＰＴＰ１Ｂの阻害剤を探索するため、我々は、Ｂ２Ｈシステムを、大部分が非極性構造二次代謝物の構造的に多様なクラスであるテルペノイドに対する代謝経路と結び付け（図２２Ａ）、そのうちのいくつかは、ＰＴＰ１Ｂを阻害すると知られている３６，３７。テルペノイドは８００００超の既知の化合物を含み、および全ての特徴づけられる天然生成物の３分の１近くを表す３８（臨床的に承認されている薬品３９のおよそ５０％の基礎となっている）。初めに、我々は確立した阻害効果なしに、構造的に多様なテルペノイドの一握りに焦点をあてた（図２２Ｂ）：アモルファジン（ＡＤ）、γ－フムレン、α－ビサボレン（ＡＢ）、アビエタジエン、およびタキサジエン。各テルペノイド経路は２個のプラスミド由来モジュールから成っていた：（ｉ）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（大腸菌における発現に最適化された４０）からのメバロン酸依存性のイソプレノイド経路、および（ｉｉ）大腸菌における選ばれた５個のテルペノイドの１を発現および生成すると事前に例示されたテルペンシンターゼ４０～４４。テルペンシンターゼは、ジテルペノイド生成に必要な時に、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼを補充された。これらのモジュールは大腸菌において、力価０．３～１８ｍｇ／Ｌのテルペノイドを生成した（図２６）。
我々は、大腸菌を関心のある経路とＢ２Ｈシステムを保有しているプラスミドと合体させることによりＰＴＰ１Ｂの阻害剤を生成するその能力について各経路をスクリーニングした（図２２Ｃ）。驚いたことに、ＡＤおよびＡＢのための経路は、抗生物質の高濃度での生存を可能にした。決定的なことに、ＧＣ－ＭＳトレースにより、全ての経路はＢ２Ｈシステムが存在下でテルペノイドを生成し（図２２Ｄ、図２６）、ＡＤおよびＡＢ生成株の最大耐性が活性テルペンシンターゼと機能的Ｂ２Ｈシステムを両方要した（図２６Ｄ）ことが確認された。
我々は、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ；図２２Ｅ、 表１２）ＰＴＰ１Ｂ媒介性加水分解への影響を調べることにより、精製されたテルペンの阻害効果を確認した。ＡＤおよびＡｂのＩＣ５０は、１０％ＤＭＳＯにおいて、それぞれ５３±８μＭおよび１３±２μＭであった（図２２Ｆ）。これらのＩＣ５０は小さく非機能的な炭化水素にとっては驚くほど強い。両阻害剤のリガンド効率は高く（表１５）、それらの効力は、水素結合ならびにＰＴＰ１Ｂの他の安定化相互作用を形成するより大きい分子の効力に類似している２１，４５。両ＩＣ５０は液体インキュベートにおけるそれぞれのテルペノイドの濃度にも類似しており（図２２Ｇ）、それはインビボ阻害と一致する所見である。（テルペノイドは細胞内で蓄積する傾向があり４６、したがってインビボの濃度はさらに高いかもしれない）。我々の増殖共役アッセイ、動体アッセイ、および生成測定はまとめて、ＡＤならびにＡＢは細胞内のＰＴＰ１Ｂを阻害することにより、Ｂ２Ｈシステムを活性化することを示している。
ＰＴＰ１Ｂ阻害剤の生合成分析
ＰＴＰのアロステリック部位阻害剤は薬品開発にとって貴重な起点である。これらの分子は、ＰＴＰの、よく保存され正電荷を帯びた活性部位の外部に結合し、および選択性ならびに膜透過性を基質アナログよりも改善させる傾向がある２１。これらの考慮に動機づけられて、早期のスクリーニングは、基質と競合することなく、ＰＴＰ１Ｂを弱く阻害する（ＩＣ５０＝３５０μＭ）ベンズブロマロン誘導体を同定した。この化合物のその後の最適化は、アロステリック領域に結合する２個の改善された阻害剤（ＩＣ５０ｓ＝８，および２２μＭ）をもたらす４５（図２３Ａ）。次の１５年にわたって、触媒ドメインにおけるこのまたは他のアロステリック部位に結合する新規阻害剤を探索するための努力は、大部分が失敗に終わっている４７。ベンズブロマロンは 結晶学的に立証された結合部位を伴うアロステリック阻害剤に過ぎない。（しかしながら完全長のタンパク質の無秩序領域に結合するアロステリック阻害剤はＮＭＲで特徴づけられる２５）アロステリック部位を発見するための新規アプローチは明らかに必要とされている。
我々の微生物システムは、予期しない方法で結合する新規化合物へのアクセスを付与できた。ＡＤおよびＡＢが実施例を提供する。それらは高い非極性であるため、多くのＰＴＰ阻害剤が依拠する水素結合および静電相互作用に関与することができない２１，４５。それらの結合メカニズムを詳しく調べるために、我々はＡＤおよびα－ビサボロール、つまりＡＢの可溶性アナログ（難溶性ゆえに浸水実験から除外されたリガンド）に結合されるＰＴＰ１ＢのＸ線結晶構造を収集しようとした。不運なことに、ＡＤに結合されたＰＴＰ１Ｂの構造だけで、結合部位の明白な決定にとって十分であった（図３０および図３１）。この阻害剤は、ベンズブロマロン誘導体によって標的とされる同じアロステリック部位に結合する。しかしながら、その結合モードは明確である。（ｉ）ＰＴＰ１Ｂのα７ヘリックスが再編成し、疎水性クレフトを作成することを引き起こす（図２３Ｂ）再編成のこの種類は興味深い、なぜならそれは一般的に遅く（マイクロ～ミリ秒）４８および計算リガンド設計に組み込むことが難しいから４９である。（ｉｉ）複数の結合立体を採用する可能性が高いからである（つまり、電子密度は障害領域を示す。図３０）。分子動態シミュレーションにより裏付けられているこの挙動は、結合ポケットにおいて可動性を持つ傾向がある炭化水素部分にタンパク質を結合することに関する先行研究と一致している。
我々はいくつかの追加的分析によってＡＤおよびＡＢの結合を探った。初めに、ジヒドロアルテミシン酸によってＰＴＰ１Ｂの阻害を調べた。ＡＤのこの構造的アナログは、我々の結晶構造に従ってα７ヘリックスによって生成された炭化水素クレフトへ結合することに干渉するはずであるカルボキシル基を保有する（図２３Ｃ）。この分子のＩＣ５０は、ＡＤのＩＣ５０よりも８倍高かった。つまり結晶学的ポーズ（ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ｐｏｓｅ）と一致する効力の低下の現象であった（図２３Ｄ、および図３３）。２番目に、我々はＡＤと活性部位に結合する２個の阻害剤：（ｉ）ＷＰＤループに閉鎖立体構造を採用することを引き起こすＴＣＳ４０１、および（ｉｉ）ＷＰＤループに引き起こさないオルトバナジン酸との比較を調べた。背景として、ベンズブロマロンは、Ｃ末端アロステリック部位に結合する際に、ＴＣＳ４０１の結合と互換性のない開立体構造におけるＷＰＤループに安定化するが（ただしオルトバナジン酸では安定しない）、我々の動体データは、ＡＤは同様の挙動をすることを示唆している（図２３Ｅ、および図２３Ｆ）。これは共有された結合部位と調節メカニズムを一致する所見である。最後に、我々はＴＣ－ＰＴＰ、つまりＰＴＰ１Ｂの細菌似ホモログに対するＡＤおよびＡＢの阻害効果を評価した。興味深いことに、両分子はＰＴＰ１Ｂよりも５，６倍弱くＴＣ－ＰＴＰを阻害した（図２３Ｇ、および図３３）。この所見は不十分に保存されたアロステリック部位に結合することと一致している。重要なことに、この選択性は適度だと思えるが、それは事前に最適化された阻害剤（ベンズブロマロン誘導体を含む）のほとんどの選択性にマッチするかまたは超えていて、かつ機能化されていない炭化水素にとって非常に珍しいことである５０。我々は次にＰＴＰ１ＢおよびＴＣ－ＰＴＰから同等領域を除去することによって、α７ヘリックスの選択性への寄与について評価した（図２３Ｇ）。この修正はＡＤの選択性において４倍の減少を引き起こした。これは、結合においてα７ヘリックスの関与に一致する効果である。興味深いことに、ＡＢの選択性はこの修正に非感受性である。このリガンドの結合部位の明確な決定には追加的データを要する。
ＡＤおよびＡＢは、哺乳類細胞膜を通過する能力にとって貴重であり得る親油性分子である。これらの分子の生物学的活性の選択性を調べるために、我々はそれらをＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞でインキュベートし、およびインスリン受容体（ＩＲ）リン酸における変化を測定するために酵素結合免疫吸着検査法を使用した。ＩＲは原形質膜のサイトゾル側からのＰＴＰ１Ｂ由来脱リン酸化を経験する受容体チロシンキナーゼである（ＰＴＰ１Ｂは次に、細胞小胞体に局在化する）。両分子は陰性対照よりもＩＲリン酸化を増加させた（図２３Ｈ、および図３５）。我々は次に、同等の濃度のジヒドロアルテミシニン酸およびα－ビサボロールでＥＬＩＳＡを繰り返すことにより、我々はこの信号へのオフターゲットの寄与をチェックした。我々の満足の行くように、両分子は、効力の減少と一致する信号をもたらした。
他のＰＴＰはＩＲ脱リン酸化を促進することができる。ＳＨＰ１およびＳＨＰ２は２個の実施例を提供する５１～５３。これらの酵素の、我々のＥＬＩＳＡで観察されたＩＲリン酸化の増加への潜在的寄与を調べるために、我々はそれらの阻害剤をＡＤおよびＡｂによって測定した。簡潔に、ＡＤはＰＴＰ１Ｂよりも３倍弱くＳＨＰ２を阻害し、ＳＨＰ１の阻害剤は測定するには弱すぎた（図３４Ａ～３４Ｂ）。ＳＨＰ１およびＳＨＰ２に対するＡＢの弱い効力はまた、実験測定を妨げた（図３４Ｃ～３４Ｄ）。これらの効力は、脆弱な阻害性の構造アナログの前述された分析をまとめて、ＡＤおよびＡＢによるＰＴＰ１Ｂの阻害は、我々のＥＬＩＳＡ実験で観察されたＩＲリン酸化の増加の主要な原因であることを主張している。
分子の発見へのスケーラブルなアプローチ
我々の微生物株は、新規ＰＴＰ１Ｂ阻害剤を生成するそれらの能力についての遺伝子をスクリーニングする力強いツールを提供する。ほとんどのテルペノイドは、ケーススタディとして商業的に利用可能ではなく、さらに、それらの代謝経路が判明している時でさえ、それらの生合成、精製、インビトロの分析は既存の方法と並列化するのが難しい資源集約的なプロセスである５４。我々のＢ２Ｈシステムは、可能性のある解を提供するものである。それは単純な増殖共役アッセイで阻害合成遺伝子を同定することが可能である。我々は特徴づけられていない生合成遺伝子の多様なセットをスクリーニングするためにそれを用いることにより、発見への取り組みにそれを応用することを模索した。簡潔に言って、我々は、４４６４個の構成部要素のクラドグラムを構築しおよび注釈をつけることにより、最大のテレペンシンターゼファミリーのバイオインフォマティクス分析を実行した（図２７）。ここから、我々は８個のクレード：全く特徴づけられていない遺伝子を伴う６個のクレードと、いくつか特徴づけられる遺伝子を伴う２個のクレードの各々から３個の特徴づけられていない遺伝子を合成した（図２４Ａ）。我々は、これら２４個の系統学的に多様な遺伝子（菌類から８個、植物から１３個、細菌から３個）は、酵素を異なる生成プロフャイルで、および潜在的に特徴づけられていないクレード、新規のセスキテルペンスキャフォールドの包含を通してコードすることができる。
我々の初期のスクリーニングに従い、我々は特徴づけられていない遺伝子の各々を、ＦＰＰ経路と対にすることで、セスキテルペン阻害剤を探した。驚いたことに、６個の遺伝子は重要な生存優位性を付与し（図２４Ｂ）、最大耐性性は活性Ｂ２Ｈシステムを要した（図２８）。各ヒットが、異なる生成プロフャイルを生成した（図２９）。我々は、主要な生成物として（＋）－１（１０），４―カジナジエンをもっとも生成したＡ０Ａ０Ｃ９ＶＳＬ７における我々の分析に注目した（図２４Ｃ～２４Ｄ）。このテルペノイドはＡＤの構造的アナログであるが、より弱い効力を持つ（ＩＣ５０＝１６５±３３μＭ；図２４Ｅ）。力価３３±１８μＭは、細胞内の蓄積が、細胞内のＰＴＰ１Ｂを阻害することを可能にし得ることを示唆している。弱い阻害剤を検出する我々の能力は、Ｂ２Ｈシステムが、分子を発見する取り組みにおいて、スキャフォールドの幅広いセットを捕捉することが可能であることを示唆している。追加的ヒットの精製ならびに分析、異なるサイズのイソプレノイド気質の組み込み（ゲラニル２リン酸シンターゼまたはゲラニルゲラニル２リン酸シンターゼの使用を通じて）、およびより多くの特徴づけられていない遺伝子の包含は、そのような取り組み範囲を広げることを可能にした。
代替的なＰＴＰに特異的な対象の設計
我々は、複数の他の疾病関連ＰＴＰの不活性化を検出するその能力を評価することにより、我々のＢ２Ｈシステムの汎用性を模索した。簡潔に言えば、我々はＰＴＰ１Ｂの遺伝子をＰＴＰＮ２、ＰＴＰＮ６，またはＰＴＰＮ１２の遺伝子と交換した。これらの酵素はそれぞれ免疫療法強化５５、卵巣癌の治療５６、および急性心筋梗塞の治療５７のための標的である。それらの触媒ドメインは、ＰＴＰ１Ｂの触媒ドメインと３１～６５％の配列同一性を共有する。興味深いことに、新規Ｂ２Ｈシステムは即座に機能的であった。ＰＴＰ不活性化は、高濃度スペクチノマイシンの増殖を可能にした（図２５Ａ）。この所見は、我々の検出システムはＰＴＰファミリーの他のメンバーへと簡単に拡大することが可能であることを示唆している。
ＰＴＰに特異的なＢ２Ｈシステムは、別のＰＴＰよりも１個のＰＴＰを選択的に阻害する天然生成物の同定を容易にすることができた。我々は、ＡＤとα－ビサボレンの代謝経路に応じて、ＰＴＰ１ＢおよびＴＣ－ＰＴＰに特異的なシステムによって付与された抗生物質耐性を比較することにより、この応用を模索した（図２５Ｂ）。予想通りに、ＰＴＰ１Ｂに特異的なシステムは、高濃度の抗生物質での増殖を可能にし、これはＰＴＰ１Ｂに対する両テルペノイドの選択性と一致した結果である。前述の２個の株の間の区別できないテルペノイドの力価は、この生存優位性は細胞内の濃度の違いによって生じるものではないということを示唆している（図２５Ｃ）。所見はこのように、Ｂ２Ｈシステムの単純な比較、つまり潜在的２次スクリーニングは、選択性ＰＴＰ阻害遺伝子生成を評価するための単純なアプローチを提供する。とりわけ、２個の株における高濃度の阻害剤は選択的な効果を交換する。そのような場合、テルペノイドレベルは低いメバロン酸濃度によって減少し得る。
この研究では、分子の生合成を先導するよう遺伝的にコードされた制約として、望ましい生化学の活性（つまり対象）を用いることにより治療用化学の重要な課題、つまり疾病関連酵素を阻害する分子構造の設計に取り組んでいる。このアプローチはＰＴＰ１Ｂの２個の選択的、生物学的活性阻害剤、つまり難しい創薬標的の同定を可能にした５８。これらの分子は薬品ではなく、リード開発の有望なスキャフォールドである。これらの調節のメカニズムは、アロステリック立体構造変化が、ゆるやかで立体構造的にフレキシブルな結合に未だに依存しているように思われ、普通でなく（ならびに計算的に難しい５９）および、分子設計における難しい課題に対する新しい解決策を発見する微生物システムの能力を実証している。比較的小さなライブラリにおいて、普通でない阻害剤を我々が同定したことは次に、微生物システムが、分子の発見のための既存のアプローチによって効率的に模索されていない豊富な分子ランドスケープにアクセスすることが可能であることを示唆している。
我々のアプローチの中心にある、Ｂ２Ｈシステムは、構造的に複雑で合成するのが困難であり、さらに不可解な遺伝子クラスター内によく隠されている、生物学的に活性な天然生成物を同定するための貴重なツールである６０。それは阻害剤の発見への現代のアプローチを上回る重要な優位性を複数有している。（ｉ）それは薬品リードの重要な属性である探索基準として合成可能性を組み込んでいる６１。（ｉｉ）それは、スケーラブルである。我々は、２４個の特徴づけられていないテルペンシンターゼを合成スクリーニングするための増殖共役アッセイを用いた。この種類のアッセイはまた、非常に大きな突然変異誘発ライブラリ（例えば１０１０）と互換性がある６２。（ｉｉｉ）それは、タンパク質を安定させるために細胞の機構を使用することができる（例えばＳｒｃのためのＣＤＣ３７）。この能力は、不安定なおよび／または無秩序な標的の組み込むことを容易にすることができた。変異させられたおよび／または再構成させられた経路の大きなライブラリ、代替的な生合成酵素（例えばシトクロムＰ４５０、ハロゲナーゼ、およびメチルトランスフェラーゼ）、または新規クラスの疾病関連酵素を組み込むことにより、前述の利点を利用する将来の努力は有益であろう。
Ｂ２Ｈシステムにはまた重要な制限がある。代謝経路に沿って使用されるとき、それは生存を、代謝物の効力だけでなく、それらの力価、オフターゲット効果と経路毒性にも関連付ける。これらの限定は有益になり得る。それらは、発見プロセスを効能で、容易に合成可能な阻害剤に偏らせ、そうして関心のある分子の力価を改善する発見後の努力を容易にすることを可能にした６３。にもかかわらず、それらは、大腸菌の中で合成するのが難しいいくつかの種類の構造上複雑な分子を除外するだろう。他の有機体（例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）中の同様の活性ベースのスクリーニングの使用は興味深くなり得る。
異なるＰＴＰを用いて我々の発見アプローチの互換性は、新しい治療標的の豊富な（および本質的に利用されていない）源として、その潜在性がますます良く確認されてきていることを考慮すると、貴重である６４。我々は、いくつかのＰＴＰがシャペロンの使用、および／または転写の調整をＢ２Ｈシステムに組み込まれることを要することになると予想する。ＰＴＰベースのシステムの我々の系統的最適化は、それらの修正の模索のための実験的フレームワークを提供する。Ｂ２Ｈシステムの対照比較は、次に、２次スクリーニングにおける阻害剤選択性を評価するための有望な戦略を提供する。今後の研究では、対象の新たな種類（例えば、１個のＰＴＰの他のＰＴＰを上回る選択的阻害剤（または、ひょっとしたら活性化）を検出するＢ２Ｈシステムまたは遺伝回路）は、１次スクリーニングにおける調節の洗練されたメカニズムを備えた分子の発見を容易にし得るであろう。遺伝的にコードされた対象の汎用性は、標的とされた生物学的に活性な分子を見つけるために微生物システムを用いる力を強調する。
注１ プロテオームの直交性。大腸菌とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、共に薬学的に関連のある天然生成物のための良く開発されたプラットフォームである２０，６５，６６。タンパク質をリン酸化するための機構が真核細胞のそれとは相違し、そしてＰＴＰ１Ｂの阻害を細胞増殖に関連付ける遺伝学的にコードされたシステムの機能に支障をきたすことがあまりないので、我々は、大腸菌をこの研究のために選んだ６７。対照的に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＳｒｃキナーゼの過剰発現は致死的であり、ＰＴＰ１Ｂによって緩和される６８。これらの効果は我々の生化学の対象と一致しない。より広範囲には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとヒトは、およそ１０億年前の共通の祖先から進化してきたにもかかわらず６９、多くの機能的に等価なタンパク質を共有している。オーソロガス遺伝子は実際に酵母ゲノムの３分の１以上を占める７０。最も際立つことに、最近の研究ではＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからの４１４個の必須遺伝子のほぼ半分（４７％）を増殖障害なく、ヒトオーソロガスに取り替え得ることが判明した７１。この所見は、酵母がヒトの調節酵素の活性における任意の変化を適合優位性に関連付ける、遺伝学的にコードされたシステムのための特に制限的な宿主であることを示唆する。
方法
細菌株。我々は、分子クローニング、およびテルペノイド産生の予備的分析を実行するために、大腸菌ＤＨ１０Ｂ、ケミカルコンピテントなＮＥＢ ＴｕｒｂｏまたはエレクトロコンピテントＯｎｅ Ｓｈｏｔ Ｔｏｐ１０ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。我々は、インビトロにおける研究におけるタンパク質を発現するために、大腸菌ＢＬ２－ＤＥ３１を使用した。および、我々は大腸菌ｓ１０３０７２を発光研究、およびテルペノイド媒介性の増殖（すなわち増殖研究）に関する全ての実験に使用した。
全ての株について、我々は以下の工程を実行することによりケミカルコンピテント細胞を生成した：（ｉ）我々は、必要とされた抗生物質とともにＬＢ寒天プレート上の各株をプレーティングした。（ｉｉ）我々は、ガラス培験チューブにおいてＬＢ培地１ｍＬ（表８に記載された適切な抗生物質を含む２５ｇ／ＬのＬＢ）を播種するために、各株の１個のコロニーを用い、および我々はこの培養物を一晩増殖させた（３７℃、２２５ＲＰＭ）。（ｉｉｉ）我々は、ガラス振盪フラスコにおいてＬＢ培地１００～３００ｍＬ（上記のとおり）を播種するために１ｍＬの培養物を用い、および我々は数時間この培養物を増殖させた（３７℃、２２５ＲＰＭ）。（ｉｖ）培養物が０．３～０．６のＯＤに到達した際、我々は細胞を遠心分離し（４，０００ｘｇ、１０分間、４℃で）、上清部分を除去し、それらを氷冷のＴＦＢ１バッファ３０ｍＬ（３０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭのＣａＣｌ２、５０ｍＭのＭｎＣｌ２、１００ｍＭのＲｂＣｌ、１５％ｖ／ｖのグリセロール、２００ｍＬ、ｐＨ＝５．８、減菌濾過された水）において再懸濁し、および懸濁液を４℃で９０分間インキュベートした。（ｖ）我々は工程（ｉｖ）を繰り返したが、氷冷のＴＦＢ２バッファ４ｍＬ（１０ｍＭのＭＯＰＳ、７５ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＲｂＣｌ２、１５％のグリセロール、５０ｍＬ、ｐＨ＝６．５、減菌濾過された水）において再懸濁した。（ｉｖ）我々は、最終の懸濁液を１００μＬずつアリコートに分割し、それらをさらなる使用まで－８０℃で凍らせた。
我々は上記に似たアプローチに従って、エレクトロコンピテント細胞を生成した。しかしながら、工程（ｉｖ）では、我々は氷冷のＭｉｌｌｉＱ水５０ｍＬにおいて細胞を再懸濁し、およびこの工程を２回繰り返した。つまり初めに２０％の減菌グリセロール（氷冷の）５０ｍＬで、および次に２０％の減菌グリセロール（氷冷の）１ｍＬで従来どおり、我々はペレットを凍らせた。
材料。我々は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからアビエチン酸メチルを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａから、トランスカリオフィレン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｍ９の最小限の塩、フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）およびＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を、ＶＷＲからグリセロール、細菌タンパク質抽出試薬ＩＩ（Ｂ－ＰＥＲＩＩ）およびリゾチームを、Ｎｅｗ ＥｎｇＬａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓからクローニング試薬を、Ａｍｂｅｅｄ，Ｉｎｃ．からＡＤを、およびＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから他の全ての試薬（例えば抗生物質および培地成分）を購入した。タキサジエンは、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅｒａｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｈｉｌ Ｂａｒａｎからの親切な贈り物であった。我々は、２ＭのＤＬ－メバロノラクトンの１容量を２ＭのＫＯＨの１．０５容量と混合し、および３７℃で３０分間この混合物をインキュベートすることにより、メバロン酸を調製した。
クローニングと分子生物学。我々は、標準方法（つまり制限分解とライゲーション、ゴールデンゲート法とギブソンアセンブリ、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発、円形ポリメラーゼ伸長クローニング）を用いることにより、全てのプラスミドを構築した。表７は、各遺伝子供給源を記載しており、表８および表３は、全ての最終プラスミドの組成物を記載している。
我々は、ｐＡＢ０９４ａからｐＡＢ０７８ｄへＨＡ４－ＲｐｏＺの遺伝子の組み込むことにより、およびｐＡＢ０７８ｄのアンピシリン耐性マーカーをカナマイシン耐性マーカー（ギブソンアセンブリ）に取り替えることにより、Ｂ２Ｈシステムの構築を始めた。我々は、結果として生じる「組み合わされた」プラスミド、ＨＡ４とＳＨ２のドメインをそれぞれキナーゼ基質ドメインおよび基質認識（つまりＳＨ２）ドメインに（ギブソンアセンブリ）取り替えること、および、様々な組み合わせ（ギブソンアセンブリ法）においてＳｒｃキナーゼ、ＣＤＣ３７およびＰＴＰ１Ｂ用遺伝子を組み込むことによって、（ギブソンアセンブリ）修正した。我々は、ホスホペプチド（Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．において番号付けされたように、Ｋ１５Ｌ、Ｔ８Ｖ、およびＣ１０Ａ３５）への親和性を高めると知られているいくつかの突然変異でＳＨ２ドメインを修飾すること、発光（ＬｕｘＡＢ）のためのＧＯＩをスペクチノマイシン耐性（ＳｐｅｃＲ）用のものと交換すること、および転写反応を高めるために（ギブソンアセンブリおよびＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， Ａｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｃ．）、プロモーターならびにリボソーム結合部位をトグルすることにより、機能的なＢ２Ｈシステムを完成した。注記：最後の工程について、我々はさらにＱｕｉｋｃｈａｎｇｅプロトコルを用いて、Ｐｒｏ１をＰｒｏＤに変換した。必要に応じて、我々は、Ｂ２Ｈシステムからの単一成分をｐＢＡＤへとクローニングすることにより、アラビノース誘導可能な成分を用いてプラスミドを構築した。（ゴールデンゲートアセンブリ）。表４、表９、および表１０は各プラスミドを構築するために用いられるプライマー、ならびにＤＮＡフラグメントを記載する。
我々は、第１のモジュールをコードするプラスミド（ｐＭＢＩＳ）および様々なセスキテルペンシンターゼ（ｐＴＲＣ９９ａにおけるＡＤＳあるいはＧＨＳ）をＡｄｄｇｅｎｅから購入すること、および残りのプラスミドを構築することにより、テルペノイド生合成用経路を組み立てた。我々は、ｐＭＢＩＳＣｍＲを作成するために、ｐＭＢＩＳにおけるテトラサイクリン耐性をクロラムフェニコール耐性の遺伝子と入れ替えた。我々は、ＡＢＳ、ＴＸＳ、ＡＢＡ、およびＧＧＰＰＳの遺伝子をｐＴＲＣ９９ｔに組み込んだ（つまりＢｓａＩ部位のないｐＴＲＣ９９ａ）。表４、表９、および表１０は各プラスミドを構築するために用いられるプライマー、ならびにＤＮＡフラグメントを記載する。
ルミネッセンスアッセイ。我々は予備のＢ２Ｈシステム（ＧＯＩとしてＬｕｘＡＢを含有していた）を発光アッセイで特徴づけた。簡潔に言えば、我々は必要なプラスミドを大腸菌ｓ１０３０に形質転換し（表８）、形質転換細胞をＬＢ寒天プレート（表８に記載されている、抗生物質とともに、２０ｇ／Ｌの寒天、１０ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、および５ｇ／Ｌの酵母抽出液）上でプレーティングし、全てのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。我々は、テリフィックブロス１ｍｌ（表８に記載されている２％のＴＢ、あるいは１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出液、１２ｍＬ／Ｌの１００％のグリセロール、２．２８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２．５３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ＝７．３、および抗生物質）を播種するために個別のコロニーを使用し（および我々は、これらの培養物を一晩インキュベートした（３７℃および２２５ＲＰＭ）。翌朝、我々は各培養物をＴＢ培地１ｍｌ（上記）に各培養物を１００倍希釈し、および我々は、これらの培養物を深型の９６ウェルプレートの個々のウェルで５．５時間インキュベートした（３７℃、２２５のＲＰＭ）。（注記：ｐＢＡＤが存在した時、我々は０～０．０２のｗ／ｖ ％のアラビノースでＴＢ培地を補完した。）我々は、各培養物の１００μＬを標準の９６ウェルクリアプレートの単一のウェルへ移し、およびＢｉｏｔｅｋＳｙｎｅｒｇｙプレートリーダー（ゲイン：１３５、積分時間：１秒、読み取り高さ：１ｍｍ）におけるＯＤ６００および発光の両方を測定した。無細胞培地のアナログ測定は、我々が背景信号を測定することを可能にし、我々はＯＤに正規化された発光（つまりＬｕｍ／ＯＤ６００）を計算する前に各測定値からその値を引いた。
抗生物質耐性の分析。我々は、以下の工程を実行することにより、テルペノイド経路不在下の様々なＢ２Ｈシステムによって付与されたスペクチノマイシン耐性を評価した。（ｉ）我々は、必要なプラスミドを用いて大腸菌を形質変換し（表８）、そして、ＬＢ寒天プレート（２０ｇ／Ｌの寒天、１０ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、５ｇ／Ｌの酵母抽出液、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン）上に形質変換細胞をプレーティングした。（ｉｉ）我々は、ＴＢ培地１～２ｍＬ（１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出液、１２ｍＬ／Ｌの１００％グリセロール、２．２８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２．５３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、ｐＨ＝７．３）を播種するために個別のコロニーを用いて、我々はこれらの培養物を一晩インキュベートした（３７℃、２２５ＲＰＭ）。午前に、我々は０～５００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン（我々は、図１４のためだけに、液体インキュベートの中でスペクチノマイシンを使用した）を用いて，ＴＢ培地４ｍＬ（上記のとおり）に各培養物を１００倍に希釈して、０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含有しているウェルが０．９～１．１のＯＤ６００に達するまで、我々は、深型の２４ウェルプレートにおいて培養物をインキュベートした。（ｉｖ）我々は抗生物質なしでＴＢ培地に各４ｍＬの培養物を１０倍に希釈して、希釈液の１０μＬの滴をスペクチノマイシンの様々な濃度で寒天プレート上でプレーティングした。（ｖ）我々はプレートを一晩培養し（３７℃）、翌日それらを撮影した。
テルペノイド媒介性の耐性を調べるために、我々は、全ての液体／固液培地において３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加して、上に述べられているような工程（ｉ）および（ｉｉ）を始めた。我々は、その後以下の工程を進めた。（ｉｉｉ）我々は、ＴＢ培地４．５ｍＬ（１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出液、１２ｍＬ／Ｌの１００％グリセロール、２．２８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２．５３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、および５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンで補充された）において、１ｍＬの培養物から０．０５のＯＤ６００まで試料を薄め、それを深型の２４ウェルプレートにおいてインキュベートした（３７℃、２２５ＲＰＭ）。（ｉｖ）０．３～０．６のＯＤ６００になると、我々は、各培養物４ｍＬを深型の２４ウェルプレートに移し、５００μＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）と２０ｍＭのメバロン酸を添加し、２０時間インキュベートした（２２℃、２２５ＲＰＭ）。（ｖ）我々は、ＴＢ培地を用いて各４ｍＬの培養物を０．１のＯＤ６００となるまで希釈して、５００μＭのＩＰＴＧ、２０ｍＭのメバロン酸、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン、および０～１２００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンが補充されたＬＢまたはＴＢプレート上に希釈液１０μＬをプレーティングした（両方のプレートについては、我々は、上記の培地とバッファの成分とともに２０ｇ／Ｌの寒天を使用した）
テルペノイド生合成。我々は、必要な経路成分を保有するプラスミドを用いて細胞を形質変換すること（表８）、およびそれらをＬＢ寒天プレート（表８に記載されている抗生物質とともに、２０ｇ／Ｌの寒天、１０ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、および、５ｇ／Ｌの酵母抽出液）上でプレーティングすることによって、テルペノイド生成のために大腸菌を調製した。我々は、２ｍＬのＴＢ（１２ｇ／Ｌのトリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出液、１２ｍＬ／Ｌの１００％グリセロール、２．２８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１２．５３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ＝７．０、および表８に述べられていた抗生物質）を播種するために、各株から１個のコロニーを約１６時間（３７℃および２２５ＲＰＭ）、ガラス製の培養チューブで使用した。我々は、これらの培養物を１０ｍＬのＴＢ培地１０ｍＬに７５倍希釈して、１２５ｍＬのガラス振盪フラスコにおいて新規培養物をインキュベートした（３７℃および２２５ＲＰＭ）。０．３～０．６のＯＤ６００では、我々は５００μＭのＩＰＴＧ、および２０ｍＭのメバロン酸を加えた。７２～８８時間の増殖（２２℃および２２５ＲＰＭ）の後に、我々は以下に概略が説明されるように、各培養物からテルペノイドを抽出した。
タンパク質発現および精製。我々は、前述したようにＰＴＰを発現および精製した７３。簡潔に言えば、我々は、ｐＥＴ１６ｂまたはｐＥＴ２１ｂのベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質変換し（詳細は表８を参照）、我々は２０時間２２℃で５００μＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。我々は、脱塩、ニッケル親和性、および陰イオン交換クロマトグラフィー（それぞれＨｉＰｒｅｐ ２６／１０、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ、およびとＨｉＰｒｅｐ Ｑ ＨＰ；ＧＥヘルスケア）を使用することにより、細胞溶解物から、ＰＴＰを精製した。我々は、ＨＥＰＥＳバッファ（５０ｍＭ、ｐＨ ７．５、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）における最終タンパク質（３０～５０μＭ）を－８０℃で２０％グリセロール中に保存した。
テルペノイドの抽出および精製。我々は、液体インキュベートで生成されたテルペノイドを抽出するために、ヘキサンを使用した。１０ｍＬの培養物については、我々は１２５ｍＬのガラス振盪フラスコ中の１０ｍＬの培養ブロスに１４ｍＬのヘキサンを添加し、３０分間混合物（１００ＲＰＭ）を振り、それを遠心分離し（４０００ｘｇ）、更なる分析のためにヘキサン層１０ｍＬを取り出した。４ｍＬの培養物について、我々は６００μＬヘキサンを、マイクロ遠心チューブにおける培養ブロス１ｍＬに加えて、３分間チューブをボルテックスし、チューブを１分間遠心分離（１７０００ｘｇ）、更なる分析のためにヘキサン層３００～４００μＬを保存した。
ＡＤ、ＡＢ、および（＋）－１（１０）４－カジナジエンを精製するために、我々は、ヘキサン（１６．７％ｖ／ｖ）で５００～１０００ｍＬの培養ブロスを補充し、３０分間混合物を振り（１００ＲＰＭ）、分液漏斗を用いてヘキサン層を単離し、単離された有機相を遠心分離し（４０００ｘｇ）、ヘキサン層を取り出した。テルペノイド生成物を濃縮するために、我々は、最終容量を５００μＬにするためにロータリーエバポレーター中で過剰なヘキサンを蒸発させ、我々は、結果として生じる混合物をシリカゲル（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；高純度グレード、６０Åの孔径、２３０～４００のメッシュ粒子径）に１～３回通した。我々は、ＧＣ／ＭＳ上の溶出画分（１００％ヘキサン）を分析して、関心のある化合物（ＡＤ）とともに画分をプールした。一旦精製されたら、我々は穏やかな気流の下でプールされた画分を乾かし、再懸濁、ＤＭＳＯにおいて濃縮されたテルペノイドを再懸濁し、以下に概略が説明されるように最終試料を定量化した。特に注記しない限り、ＧＣ／ＭＳにより試料（ＤＭＳＯ中で）が９５％超純粋となるまで、我々は精製プロセスを繰り返した。
テルペノイドのＧＣ－ＭＳ分析。我々は、ガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ－ＭＳ ＴＧ５－ＳｉｌＭＳカラムおよびＩＳＱ ７０００ ＭＳが取り付けられたＴｒａｃｅ １３１０ ＧＣ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて液体インキュベートで生成されたテルペノイドを測定した。我々は、内部標準としてカリオフィレン２０μｇ／ｍＬを用いてヘキサン（直接あるいはＤＭＳＯの１：１００稀釈を介して）中で全ての試料を全て調製した。高度に濃縮された試料は、濃度をＭＳ検出限界以内にするために、調製に先立ち１０～２０倍に希薄した。内部標準のピーク面積がその標準を含有している全ての試料の平均面積の±４０％を超過した時、我々は対応する試料を再分析した。全ての実行について、我々は以下のＧＣ法を使用した：８０℃を保ち（３分）、２５０℃に上昇させ（１５℃／分）、２５０℃を保ち（６分）、２８０℃に上昇させ（３０℃／分）、および２８０℃を保つ（３分）。様々な分析物を同定するために、我々は５０から５５０までｍ／ｚ比率を走査した。
我々は、分子イオン（ｍ／ｚ＝２０４）を走査するためにセレクトイオンモード（ＳＩＭ）を使用することで、ＡＤＳの変異体によって生成されるセスキテルペンを調べた。定量化について、我々は方程式１を使用した。
Figure 2023522289000003
 式中、Ａｉは分析物ｉによって産生されたピークの面積であり、Ａｓｔｄは、試料におけるカリオフィレンのＣｓｔｄによって産生されるピークの面積であり、Ｒは、参照試料におけるカリオフィレンの応答係数およびＡＤの比率である。表１１は、この分析で使用されるすべての標準と参照化合物の濃度を提供する。
我々は、もう一度いくつかの修正とともに基本手順に従って、ジテルペノイドを定量化した。我々は、異なる分子イオン（ｍ／ｚ＝２７２）、およびジテルペノイドならびにカリオフィレン（ｍ／ｚ＝９３）の両方に共通のイオンを走査した。我々は、純タキサジエン（Ｐｈｉｌ Ｂａｒａｎからの親切な贈り物）とｍ／ｚ＝９３でのカリオフィレンの比率を使用した。および、我々はｍ／ｚ＝９３でのピーク面積を計算した。全ての質量スペクトル分析については、我々は、ｍ／ｚ＝２７２での全てのピークの合計面積の１％を超過した面積を伴うピークだけを調べた。
我々はＮＩＳＴ ＭＳのライブラリの使用により分子を同定し、必要な場合は、文献に報告された分析的基準、または質量スペクトルでこの同定を確認した。注記。異なるテルペノイドの一定の応答係数の仮定（すなわち、全てのセスキテルペンおよびジテルペンは、それぞれＡＤとタキサジエンのようにイオン化するという仮定）は、確実にそれらの濃度の推定値における誤差を生じさせ得る。微生物システムにおけるテルペノイド生成に関する他の研究のものと一致している７４，７５、我々の分析はＡＤおよびタキサジエン（分析的基準があった）以外の全ての化合物の濃度の概算推定値を供給する。
バイオインフォマティクス。我々は、テルペンシンターゼの系統的に多様なセットを同定するためにバイオインフォマティクス分析を使用した。簡潔に言えば、（ｉ）我々はＰＦＡＭデータベースから、ＰＦ０３９３６の構成遺伝子（Ｃ末端ドメインによってグループ化された最大のテルペンシンターゼファミリー）、および（ｉｉ）Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースから、４．２．３．＃のＥｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ（ＥＣ）の番号を用いた全ての酵素をダウンロードした。リン酸塩に作用する炭素酸素リアーゼを定義するこのストリングは、テルペンシンターゼを含む。我々はＥｘｃｅｌにおいて両データセットをクリーニングして（つまり、我々は全ての識別子が１列のみを持っていることを保証した）、我々は、各ＰＦ０３９３６メンバーを特徴づけられた（つまりＵｎｉｐｒｏｔに基づいたＥＣ番号を所有している）、あるいは特徴づけられていないかを選定するためにカスタムＲスクリプトを使用した。最後に、我々は、ＰＦ０３９３６ファミリーの系統樹を作成するためデフォルト設定でＦａｓｔＴｒｅｅ７６、および結果として生じるツリーならびに関数データを分岐図とヒートマップとして視覚化するためにＲパッケージｇｇｔｒｅｅ７７を使用した。
手動で分岐図を注釈した後に、我々は６個のクレードから３個の遺伝子を選んだ：特徴づけられていない遺伝子を用いた６個、およびいくつかの特徴づけられた遺伝子を用いた２個。我々は我々のシステムにおいて存在しないＧＧＰＰ異性体（例えば、エントーコパリルジホスフェート）に作用すると知られている、既知のモノテルペンシンターゼあるいはジテルペンシンターゼに近位のクレードを回避した。これらの酵素は、ｐＭＢＩＳＣｍＲの一次産物であるＦＰＰに作用しそうにない。クレード内の酵素を選択する時、我々は我々の選択を細菌／真菌の種に偏らせ、およびクレード内で共通祖先が最小の遺伝子を選択した。選択された遺伝子はＴｗｉｓｔ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによってｐＴｒｃ９９ａベクターへ合成およびクローン化され、上記のように抗生物質耐性についてアッセイされた。
酵素反応速度論。テルペノイド媒介性の阻害を調べるために、我々は、テルペノイドが様々な濃度で存在する状態でｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）、または４－メチルウンベリフェリルリン酸（４－ＭＵＰ、ｐＮＰＰのＫＭが大きい時に使用された）のＰＴＰ触媒性の加水分解を測定した。各反応はＰＴＰ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、５０μｇ／ｍＬのＢＳＡにおける０．０５μＭのＰＴＰ１Ｂ／ＴＣＰＴＰ、または０．１μＭのＳＨＰ１／ＳＨＰ２）、ｐＮＰＰ（０．３３、０．６７、２、５、１０、および１５ｍＭ）あるいは４－ＭＵＰ（０．１３、０．２７、０．８、２．２７、２．９３、４．５３、７．０７、および８ｍＭ）、阻害剤（図に表記された濃度を用いる）、バッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ＝７．３、５０μｇ／ｍＬのＢＳＡ）、および１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯを含んでいた。我々は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２プレートリーダー上で５分間１０秒ごとに４０５ｎｍにおける吸光度を測定することによって、ｐ－ニトロフェノールの形成、および４５０ｎｍにおける（例えば３７０ｎｍ ｅｘ、４３５ｎｍのカットオフ、媒体利得）で蛍光を測定することによって４－メチルウンベリフェリルの形成をモニタリングした。
我々は、全ての生反応速度データを処理するために、カスタムＭＡＴＬＡＢ（登録商標）スクリプトを使用した。このスクリプトは、（ｉ）我々の標準曲線（図３９；吸光度／蛍光対μＭ）の範囲、あるいは（ｉｉ）初期速度レジーム（アッセイの中で使用されるｐＮＰＰまたは４－ＭＵＰ濃度の１０％を上回る）のいずれかから外れる濃度値を全て削除した。この工程が、反応速度データセットを１０ポイント未満に減らした時、我々は、少なくとも１０収集するために、それらのデータセットを再測定した。我々は、次に最終データセットを線形回帰モデル（ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）の除算演算子を使用して）に適合させる。
我々は３個の工程で反応速度モデルを評価した：（ｉ）我々は、阻害剤がない状態と存在する状態において収集された初期速度測定をそれぞれ、ミハエリス・メンテンと阻害モデルへ適合させる（ここで、我々は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）のｎｌｉｎｆｉｔとｆｍｉｎｓｅａｒｃｈの関数を使用した；表１２）。（ｉｉ）我々は、最小二乗和誤差を用いて 混合モデルを単一パラメータモデルと比較するために、Ｆ検定を使用し（ここで、我々は、ｐ値を割り当てるためにＭＡＴＬＡＢ（登録商標）のｆｃｄｆ関数を使用した）、ｐ＜０．０５のときにその混合モデルを採用した。（ｉｉｉ）我々は、最良適合単一パラメータモデルを各代替単一パラメータモデルと比較するために赤池情報量基準（ＡＩＣ）を使用し、全ての比較に対して、ＡＩＣにおける差異（Δｉ）が５を超えたとき、我々はその最良適合モデルを採用する７８。注記：ＡＤ、ＡＢ、および（＋）１－（１０）、４－カジナジエンについて、この基準は満たしていなかった。しかしながら非競合的および不競合的モデルは、判別不能なＩＣ５０をもたらした。
我々は、ｐＮＰＰ１５ｍＭのＰＴＰ触媒性の加水分解の初期速度を５０％減少することを必要とされる阻害剤の濃度を決定するために、最良適合反応速度モデルを使用することにより、阻害剤の最大阻害濃度（ＩＣ５０）の半分を評価した。我々は、反応速度パラメータの信頼区間を決定するために、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）の「ｎｌｐａｒｃｉ」関数を使用し、我々は、各ＩＣ５０の対応する信頼区間を推定するためにそれらの区間を広めた。
Ｘ線結晶学。我々は、ハンギングドロップ蒸気拡散の使用によりＰＴＰ１Ｂの結晶を調製した。簡潔に言えば、我々は、ＰＴＰ１Ｂ２μＬ（～６００μＭのＰＴＰ１Ｂ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）を結晶化溶液６μＬ（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００ｍＭの酢酸マグネシウム、および１４％のポリエチレングリコール８０００、ｐＨ７．５）に加えて、結果として生じる液滴を結晶化溶液で、１週間４℃でインキュベートした（ＥａｓｙＸｔａｌ ＣｒｙｓｔａｌＳｕｐｐｏｒｔ， Ｑｉａｇｅｎ）。我々は、結晶化溶液６μＬ、およびリガンド水溶液（ＤＭＳＯにおける１０ｍＭ）により形成された液滴に結晶を移すことにより結晶をリガンドに浸し、我々は４℃で２～５日間それをインキュベートした。我々は、バッファ（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００ｍＭの酢酸マグネシウム、および２５％のポリエチレングリコール８０００、ｐＨ７．５）とグリセロールの７０／３０（ｖ／ｖ）混合物から形成された凍結保護物質にそれをつけることによって、凍結用のリガンドを全て調製した。
我々は、Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂ（ＡＬＳ ＥＮＡＢＬＥ、ビームライン ８．２．１、１００Ｋ、１．００００３Å）でのＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ Ｐｒｏｇｒａｍを通して、Ｘ線回折データを収集した。我々は、ｘｉａ２ソフトウェアパッケージ７９を使用して、Ｘ線回折の組み込む、スケーリング、および結合を実施して、ＣＯＯＴ８１における手動モデル調節とＰＤＢ－ＲＥＤ８２（後者はＰＴＰ１Ｂ－ＡＤ複合体に対してのみ）１回を補充されたＰＨＥＮＩＸグラフィカルインターフェイス８０を用いて分子置換と構造精密化を実行した。
分子動力学（ＭＤ）シミュレーション。完全長ＰＴＰ１Ｂは、α７ヘリックス（すなわち、２９９－４３５）を超えて無秩序領域を含む。この研究では、無秩序領域からの残基を含む、よく研究されたトランケーション変異体（すなわち、ＰＴＰ１Ｂ１－３２１）を使用した。ＰＴＰ１Ｂをモデル化するために、我々は無秩序尾部のない結晶構造から各複合体（すなわち、ＰＴＰ１Ｂ－ＡＤの残基２８８－３２１）の異常部位の構造を生成するためにＣＡＭＰＡＲＩ ｖ．２８３を用いた。尾部構造を迅速に熱平衡化するために、ＡＢＳＩＮＴＨ陰溶媒力場８４，８５を用い、短いモンテカルロ（ＭＣ）シミュレーションを実行しリガンドとタンパク質コアの原子の座標を固定した。
我々はＧＲＯＭＡＣＳ ２０２０を用いてＭＤシミュレーションを行った８６。簡潔に言えば、ＣＨＡＲＭＭ３６ｍタンパク質力場８７、ＣＨＡＲＭＭ修正ＴＩＰ３Ｐ水モデル８８、およびＣＧｅｎＦＦで生成されたリガンドパラメータ８９，９０を用いた。我々は、各ＰＴＰ１Ｂ－リガンド複合体（対応する結晶構造から初期化された）を、その複合体の表面から１０Å以上に位置付けられた縁を有する十二面体箱の中で溶媒和し、各システムを中和するために、６個のナトリウムイオンを加えた。我々は、水素原子に関与する全ての結合を制約するためにＬＩＮＣＳアルゴリズム９１を、運動方程式を２ｆｓの時間ステップで数値的に組み込むためにＶｅｒｌｅｔリープフロッグアルゴリズムを、および長距離静電相互作用を計算するために粒子メッシュエワルド合計９２（グリッド間隔０．１６ｎｍの立方体補間）を使用した。我々は次に、短距離静電およびレナード－ジョーンズ相互作用のために、１．２ｎｍのカットオフを使用した。我々は、緩和時間０．１ｐｓの修正ベレンセンサーモスタット９３を使用して、タンパク質－リガンド複合体と溶媒分子を温度浴（３００Ｋ）に独立的に結合させ、我々は緩和時間２ｐｓ、および等温圧縮率４．５×１０－５ｂａｒ－１のＰａｒｒｉｎｅｌｌｏ－Ｒａｈｍａｎアルゴリズム９４を使用して圧力結合を１ｂａｒに固定した。
各システムについて、サンプリングバイアスを低減するために３０の独立したＭＤシミュレーションを実施した。各ＭＤ軌道について、我々は最急降下法を使用してエネルギーを最小限に抑え、続いてＮＶＴアンサンブルで１００ｐｓの溶媒緩和、およびＮＰＴアンサンブルで１００ｐｓの溶媒緩和を行った。追加的５ｎｓのＮＰＴ平衡化の後、ＮＰＴアンサンブルにおいて５ｎｓの生成工程を実行し、１０ｐｓごとに座標データを登録した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＴＰ１Ｂ阻害の分析。我々は１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００単位／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地を用いて、７５ｃｍ２培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内でＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を増殖させることにより、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のためにＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞を調製した。細胞が８０～１００％の培養密度に達するまで、３～５日間毎日培地を交換した。
我々はインスリン受容体（ＩＲ）に特異的なＥＬＩＳＡを用いることにより、ＩＲリン酸化に対する阻害剤の影響を測定した（図３５）。簡潔に言えば、ＦＢＳを含まない培地で細胞を４８時間飢餓状態にし、阻害剤（全て３％ＤＭＳＯで）を用いて１０分間インキュベートした。インキュベーション後、我々は、１Ｘ停止ホスファターゼ阻害剤カクテルおよび１Ｘ停止プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した溶解バッファ（９８０３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて細胞を１０分間溶解し、細胞破片をペレット化し、および各試料を総タンパク質６０ｍｇ／ｍＬに希釈するために溶解バッファを使用した。我々は、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標） Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ β（ｐａｎＴｙｒ） Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；＃７０８２）を用いて、６０ｍｇ／ｍＬの試料の、その後の希釈におけるＩＲリン酸化を測定した。注記：ＡＢおよびＡＤの生物学的に活性な濃度を同定するために、我々はいくつかの濃度をスクリーニングし、最も高いシグナルを与えたものを選択し（ＡＢで４０５μＭ、およびＡＤで９３０μＭ）、同様の濃度の弱い阻害剤は検出可能なシグナルをもたらさなかった（図３５Ｂおよび３５Ｃ）。
統計分析と再現性。我々は、両側スチューデントｔ検定（詳細は表１４）を用いて、統計的有意性を決定し（図２３Ｈ）、阻害の１パラメータモデルと２パラメータモデルを比較するために、Ｆ検定を使用した（表１２）。
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１０． Ａｔａｎａｓｏｖ， Ａ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ａ Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ３３， １５８２－１６１４ （２０１２）．
１１． Ｐａｕｌ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｈｏｗ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ＲＤ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ： Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ’ｓ ｇｒａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ９， ２０３－２１４ （２０１０）．
１２． Ｌｉ， Ｊ． Ｗ． Ｈ． ＆ Ｖｅｄｅｒａｓ， Ｊ． Ｃ． Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ： Ｅｎｄ ｏｆ ｅｒａ ｏｒ ａｎ ｅｎｄｌｅｓｓ ｆｒｏｎｔｉｅｒ？ Ｂｉｏｍｅｄｉｔｓｉｎｓｋａｙａ Ｋｈｉｍｉｙａ ５７， １４８－１６０ （２０１１）．
１３． Ｊｅｎｓｅｎ， Ｐ． Ｒ．， Ｃｈａｖａｒｒｉａ， Ｋ． Ｌ．， Ｆｅｎｉｃａｌ， Ｗ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｂ． Ｓ． ＆ Ｚｉｅｍｅｒｔ， Ｎ． Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｔｒｉｕｍｐｈｓ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃｓ－ｂａｓｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４１， ２０３－２０９ （２０１４）．
１４． Ｍｅｄｅｍａ， Ｍ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． ＡｎｔｉＳＭＡＳＨ： Ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９， Ｗ３３９－Ｗ３４６ （２０１１）．
１５． Ｊｅｎｓｅｎ， Ｐ． Ｒ． Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２４， ９６８－９７７ （２０１６）．
１６． Ｙａｎ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－ｇｅｎｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌ－ｐｒｏｄｕｃｔ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｎｅｗ ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ５５９， ４１５－４１８ （２０１８）．
１７． Ｃｕｌｐ， Ｅ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ－ｇｕｉｄｅｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ５７８， ５８２－５８７ （２０２０）．
１８． Ｚｈａｂｉｎｓｋｉｉ， Ｖ． Ｎ．， Ｋｈｒｉｐａｃｈ， Ｎ． Ｂ． ＆ Ｋｈｒｉｐａｃｈ， Ｖ． Ａ． Ｓｔｅｒｏｉｄ ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅｓ： Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｕｔｓｉｄｅ ｐｌａｎｔ ｋｉｎｇｄｏｍ． Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ９７， ８７－９７ （２０１５）．
１９． Ｌｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎｏｓｃａｐｉｎｅ ａｎｄ ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １１５， Ｅ３９２２－Ｅ３９３１ （２０１８）．
２０． Ｌｕｏ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ． Ｎａｔｕｒｅ ５６７， １２３－１２６ （２０１９）．
２１． Ｈｅ， Ｒ．， Ｙｕ， Ｚ．， Ｚｈａｎｇ， Ｒ． ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｚ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ． Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｉｎ． ３５， １２２７－１２４６ （２０１４）．
２２． Ｐａｕｌ， Ｍ． Ｋ． ＆ Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ， Ａ． Ｋ． Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ － Ｒｏｌｅ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． １， １０１－１１５ （２０１２）．
２３． Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｆ． Ｍ． ＆ Ｇｒａｙ， Ｎ． Ｓ． Ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： Ｔｈｅ ｒｏａｄ ａｈｅａｄ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １７， ３５３－３７６ （２０１８）．
２４． Ｓｔａｎｆｏｒｄ， Ｓ． Ｍ． ＆ Ｂｏｔｔｉｎｉ， Ｎ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ： Ｔｉｍｅ ｔｏ Ｅｎｄ ｔｈｅ Ｓｔｉｇｍａ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３８， ５２４－５４０ （２０１７）．
２５． Ｋｒｉｓｈｎａｎ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ Ｃ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ ＰＴＰ１Ｂ ｗｉｔｈ ａｎ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｎａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １０， ５５８－５６６ （２０１４）．
２６． Ｂａｒｒ， Ａ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔｏｍｅ． Ｃｅｌｌ １３６， ３５２－３６３ （２００９）．
２７． Ｂａｎｎｏ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． ＰＴＰ１Ｂ ａｎｄ ＳＨＰ２ ｉｎ ＰＯＭＣ ｎｅｕｒｏｎｓ ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｅｎｅｒｇｙ ｂａｌａｎｃｅ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２０， ７２０－７３４ （２０１０）．
２８． Ｚａｂｏｌｏｔｎｙ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １Ｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８３， １４２３０－１４２４１ （２００８）．
２９． Ｍａｔｕｌｋａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ＰＴＰ１Ｂ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｎｅｕｒａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １３， ７０６－７１９ （２０１３）．
３０． Ｚｈａｎｇ， Ｈ．， Ｗａｎｇ， Ｙ．， Ｗｕ， Ｊ．， Ｓｋａｌｉｎａ， Ｋ． ＆ Ｐｆｅｉｆｅｒ， Ｂ． Ａ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ Ａ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎａｌｏｇｓ ｕｓｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｓ ａ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｈｏｓｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １７， １２３２－１２４０ （２０１０）．
３１． Ａｎｔｏｓｃｈ， Ｊ．， Ｓｃｈａｅｆｅｒｓ， Ｆ． ＆ Ｇｕｌｄｅｒ， Ｔ． Ａ． Ｍ． Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｋａｒｕｇａｍｙｃｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ． Ｅｄ． ５３， ３０１１－３０１４ （２０１４）．
３２． Ｍｏｎｔａｌｉｂｅｔ， Ｊ． ＆ Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｂ． Ｐ． Ｕｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １Ｂ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６８， １８０７－１８１４ （２００４）．
３３． Ｐｉｓｅｒｃｈｉｏ， Ａ．， Ｃｏｗｂｕｒｎ， Ｄ． ＆ Ｇｈｏｓｅ， Ｒ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｒｃ－ｆａｍｉｌｙ ｋｉｎａｓｅｓ ｆｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＮＭＲ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８３１， １１１－１３１ （２０１２）．
３４． Ｂａｄｒａｎ， Ａ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｏｘｉｎｓ ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ ｉｎｓｅｃｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５３３， ５８－６３ （２０１６）．
３５． Ｋａｎｅｋｏ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｓｕｐｅｒｂｉｎｄｅｒ ＳＨ２ ｄｏｍａｉｎｓ ａｃｔ ａｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｓｃｉ． Ｓｉｇｎａｌ． ５， ｒａ６８－ｒａ６８ （２０１２）．
３６． Ｊｉａｎｇ， Ｃ． Ｓ．， Ｌｉａｎｇ， Ｌ． Ｆ． ＆ Ｇｕｏ， Ｙ． Ｗ． Ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １Ｂ （ＰＴＰ１Ｂ） ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｓｔ ｄｅｃａｄｅｓ． Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ （２０１２）． ｄｏｉ：１０．１０３８／ａｐｓ．２０１２．９０
３７． Ｈｊｏｒｔｎｅｓｓ， Ｍ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ａｂｉｅｔａｎｅ－Ｔｙｐｅ Ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ ｂｙ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｎ Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５７， ５８８６－５８９６ （２０１８）．
３８． Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ， Ｄ． Ｗ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ Ｃｙｃｌａｓｅｓ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １０６， ３４１２－３４４２ （２００６）．
３９． Ｎｅｗｍａｎ， Ｄ． Ｊ． ＆ Ｃｒａｇｇ， Ｇ． Ｍ． Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｓ Ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ ｆｒｏｍ １９８１ ｔｏ ２０１４． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ７９， ６２９－６６１ （２０１６）．
４０． Ｍａｒｔｉｎ， Ｖ． Ｊ． Ｊ．， Ｐｉｔｅｒａ， Ｄ． Ｊ．， Ｗｉｔｈｅｒｓ， Ｓ． Ｔ．， Ｎｅｗｍａｎ， Ｊ． Ｄ． ＆ Ｋｅａｓｌｉｎｇ， Ｊ． Ｄ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２１， ７９６－８０２ （２００３）．
４１． Ｍｏｒｒｏｎｅ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ ｙｉｅｌｄ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ： Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＭＥＶ ａｎｄ ＭＥＰ ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８５， １８９３－１９０６ （２０１０）．
４２． Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｄ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ‘ｐｓｅｕｄｏｍａｔｕｒｅ’ ｆｏｒｍ ｏｆ ｔａｘａｄｉｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ （Ｔａｘｏｌ） ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ ｄｉｔｅｒｐｅｎｅ ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． （２０００）． ｄｏｉ：１０．１００６／ａｂｂｉ．２０００．１８６５
４３． Ｙｏｓｈｉｋｕｎｉ， Ｙ．， Ｆｅｒｒｉｎ， Ｔ． Ｅ． ＆ Ｋｅａｓｌｉｎｇ， Ｊ． Ｄ． Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ ４４０， １０７８－１０８２ （２００６）．
４４． Ｐｅｒａｌｔａ－Ｙａｈｙａ， Ｐ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｅｒｐｅｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｄｖａｎｃｅｄ ｂｉｏｆｕｅｌ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． （２０１１）． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４９４
４５． Ｗｉｅｓｍａｎｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １Ｂ． Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １１， ７３０－７３７ （２００４）．
４６． Ｚｈａｎｇ， Ｃ．， Ｃｈｅｎ， Ｘ．， Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ， Ｇ． ＆ Ｔｏｏ， Ｈ． Ｐ． Ｅｆｆｌｕｘ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ＡＤ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． （２０１６）． ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２５９４３
４７． Ｋｅｅｄｙ， Ｄ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｅｘｐａｎｄｅｄ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎ ＰＴＰ１Ｂ ｂｙ ｍｕｌｔｉｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ， ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ， ａｎｄ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ． Ｅｌｉｆｅ ７， ｄｏｉ： １０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．３６３０７ （２０１８）．
４８． Ｖａｌｌｕｒｕｐａｌｌｉ， Ｐ．， Ｂｏｕｖｉｇｎｉｅｓ， Ｇ． ＆ Ｋａｙ， Ｌ． Ｅ． Ｓｔｕｄｙｉｎｇ ‘ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ’ ｅｘｃｉｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｔｅｓ ｉｎ ｓｌｏｗ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｗｉｔｈ ａ ｍａｊｏｒ ｓｔａｔｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３４， ８１４８－８１６１ （２０１２）．
４９． Ａｍａｍｕｄｄｙ， Ｏ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ａｎｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｃｉ． ２１， ８４７ （２０２０）．
５０． Ｓｈｉｍａｄａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ｓ １Ａ１， １Ａ２， ａｎｄ １Ｂ１． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． １１， １０４８－１０５６ （１９９８）．
５１． Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｂ． Ｊ．， Ｂｉｔｔｎｅｒ－Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ， Ａ．， Ｗｈｉｔｅ， Ｍ． Ｆ． ＆ Ｈａｒｂｅｃｋ， Ｍ． Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－１ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １Ｂ． Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｅｒｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＧＲＢ２ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， ４２８３－４２８９ （２０００）．
５２． Ｃｈｏｉ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｍｉｔｏｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ＳＨＰ２－ＭＡＰＫ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｍｏｔｅ ＩＲ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０， （２０１９）．
５３． Ｄｕｂｏｉｓ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＳＨＰ－１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｇｌｕｃｏｓｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １２， ５４９－５５６ （２００６）．
５４． Ｈｕｂｅｒｔ， Ｊ．， Ｎｕｚｉｌｌａｒｄ， Ｊ． Ｍ． ＆ Ｒｅｎａｕｌｔ， Ｊ． Ｈ． Ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ： Ｈｏｗ ｍａｎｙ ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｂｅｈｉｎｄ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｃｅｐｔ？ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６， ５５－９５ （２０１７）．
５５． Ｍａｎｇｕｓｏ， Ｒ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｐｔｐｎ２ ａｓ ａ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔ． Ｎａｔｕｒｅ ５４７， ４１３－４１８ （２０１７）．
５６． Ｖａｒｏｎｅ， Ａ．， Ｓｐａｎｏ， Ｄ． ＆ Ｃｏｒｄａ， Ｄ． Ｓｈｐ１ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｃａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０， ９３５ （２０２０）．
５７． Ｙａｎｇ， Ｃ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＰＴＰ－ＰＥＳＴ （ＰＴＰＮ１２） ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ． Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． １１６， １０３２－１０４６ （２０２０）．
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８９． Ｖａｎｏｍｍｅｓｌａｅｇｈｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ＣＨＡＲＭＭ ｇｅｎｅｒａｌ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ： Ａ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣＨＡＲＭＭ ａｌｌ－ａｔｏｍ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄｓ． Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ． ３１， ６７１－６９０ （２０１０）．
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９２． Ｄａｒｄｅｎ， Ｔ．， Ｙｏｒｋ， Ｄ． ＆ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ， Ｌ． Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｍｅｓｈ Ｅｗａｌｄ： Ａｎ Ｎ・ｌｏｇ（Ｎ） ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｗａｌｄ ｓｕｍｓ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． ９８， １００８９ （１９９３）．
９３． Ｂｕｓｓｉ， Ｇ．， Ｄｏｎａｄｉｏ， Ｄ． ＆ Ｐａｒｒｉｎｅｌｌｏ， Ｍ． Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｒｅｓｃａｌｉｎｇ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． １２６， ０１４１０１ （２００７）．
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９６． Ｐａｌｉｎｇ， Ｎ． Ｒ． Ｄ． ＆ Ｗｅｌｈａｍ， Ｍ． Ｊ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＳＨＰ－１ （Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－１） ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ， ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３６８， ８８５－８９４ （２００２）．
９７． Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｒｋ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ Ｓｒｃ ｆａｍｉｌｙ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ． Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６， ２５３－２６０ （２００５）．
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他の実施形態
本明細書で開示されたすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特徴は、同一の、同等の、または類似の目的を果たす代替的な特徴によって置き換えられてもよい。したがって、明示的に別段の記載がない限り、開示された各特徴は、一般的な一連の同等または類似の特徴の一例に過ぎない。
以上の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に把握することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本開示を様々な用途および条件に適合させるために、本開示の様々な変更および修正を行うことができる。
したがって、他の実施形態も特許請求の範囲に含まれる。
同等物および範囲
複数の本発明の実施形態が本明細書で説明および図示されてきたが、当業者は、本明細書に記載された機能を実行し、および／または結果および／または１つ以上の利点を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想定し、そのような変形および／または修正の各々は、本明細書に記載された本発明の実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載されたすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、ならびに、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が、本発明の教示が用いられる特定の用途に依存することを容易に理解するであろう。
当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または日常的な実験以上のことを用いずに、上記同等物を確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例示としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に説明および請求されたものとは別に実施され得ることを理解されたい。
本開示の本発明の実施形態は、本明細書に記載された個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を対象としている。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせは、本開示の本発明の範囲に含まれる。
本明細書で定義され、使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、および／または定義された用語の通常の意味を支配するものと理解されるべきである。
本明細書で開示されたすべての参考文献、特許、および特許出願は、それぞれが引用された主題に関して参照により組み込まれ、場合によっては、その文書の全体を包含することがある。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明確に反対の指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用されるフレーズ「および／または」は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合では接続的に存在し、他の場合では離接的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙された複数の要素は、同じ方法で、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」で解釈されるべきである。他の要素は、「および／または」節によって具体的に特定された要素以外に、具体的に特定された要素に関連するか否かに関わらず、任意選択で存在することができる。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンドの言語と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（任意選択でＢ以外の要素も含む）を、別の実施形態では、Ｂのみ（任意選択でＡ以外の要素を含む）を、さらに別の実施形態では、ＡとＢの両方（任意選択で他の要素を含む）などを指すことができる。
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、１つ以上の要素のリストに関連して「少なくとも１つ」というフレーズは、要素のリスト内の任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙された各々およびすべての要素の少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外しないものとする。この定義はさらに、「少なくとも１つ」というフレーズが参照する要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定された要素に関連するか否かにかかわらず、任意に存在することができることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（あるいは、等価的に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、あるいは、等価的に、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂが存在しない（および、任意選択でＢ以外の要素を含む）少なくとも１つの、任意選択で１を超える、Ａを、別の実施形態では、Ａが存在しない（および、任意選択でＡ以外の要素を含む）、少なくとも１つの、任意選択で１を超える、Ｂを、さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で１を超える、Ａ、ならびに、少なくとも１つの、任意選択で１を超える、Ｂ（および、任意選択で他の要素を含む）を指すことができる。
また、明確に反対の指示がない限り、１を超える工程または行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、方法の工程または行為の順序は、方法の工程または行為が記載される順序に必ずしも限定されないことを理解されたい。
特許請求の範囲において、上記明細書と同様に、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を持つ」、「～を有する」、「～を含有する」、「～を含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「～を保持する」、「～で構成される」等のすべての経過句は、非限定的な（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）、すなわち、～を含むがそれに限定されないことを意味すると理解されるものとする。移行句である「～からなる」および「～から本質的になる」だけは、米国特許商標庁審査基準便覧第２１１．０３条に規定されているように、それぞれ限定的な（ｃｌｏｓｅｄ）または一部限定的な（ｓｅｍｉ－ｃｌｏｓｅｄ）移行句でなければならない。

Claims (28)

  1. タンパク質機能を調節する分子を産生する代謝経路の発見と進化のための方法であって、前記方法は、
    目的のタンパク質を含む宿主細胞の集団を、異なる代謝経路を含む発現ベクターの集団と接触させる工程であって、前記宿主細胞が前記発現ベクターの集団の導入を受け入れることができる、工程と、
    前記宿主細胞の集団において代謝経路を発現させる工程であって、前記宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットは、前記代謝経路が目的のタンパク質を調節する生成物を生成する際に検出可能な出力を生成する、工程と、
    前記宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットにおける検出可能な出力の測定を可能にする条件下で、前記宿主細胞の集団をスクリーニングする工程と、
    検出可能な出力を生成する前記宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットを単離する工程と、
    参照経路を保有する参照ベクター、例えば、前記宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットにおいて、目的のタンパク質の活性を調節するのに十分な濃度および／または効力を有する分子を生成しない経路をコードするベクターの出力よりも高い検出可能な出力をもたらす発現ベクターを単離する工程と、
    前記宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットにおいて、前記参照ベクターの出力よりも高い検出可能な出力をもたらす発現ベクターによってコードされる代謝経路の生成物を特徴づける工程と、を含む、方法。
  2. 前記宿主細胞は遺伝的にコードされたシステムを含み、ここで、目的のタンパク質の活性は、タンパク質複合体の２つ以上の成分のいずれかが有していない活性を有するタンパク質複合体の組み立てを制御し、したがって、形成された複合体の量に比例して検出可能な出力をもたらす、請求項１に記載の方法。
  3. 前記目的のタンパク質は、最初は解離している２つのタンパク質を共有結合させるか、または非共有結合複合体を形成させる、翻訳後修飾を付加する酵素である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記複合体は、ＳＨ２ドメインとそのリン酸化基質との間で形成される複合体の解離定数（Ｋｄ）以下のＫｄを有する２つのタンパク質によって形成される、請求項１－３のいずれか１つに記載の方法。
  5. 前記代謝経路は、フェニルプロパノイドまたは非リボソームペプチドを産生する、請求項１－４のいずれか１つに記載の方法。
  6. 異なる代謝経路を含む前記発現ベクターは、出発代謝経路内の１つ以上の遺伝子を変異させることによって生成される経路のライブラリを含む、請求項１－５のいずれか１つに記載の方法。
  7. 前記代謝経路の１つ以上は、未知の生合成能力の遺伝子のセットを含む、請求項１－６のいずれか１つに記載の方法。
  8. 前記参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する前記代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路の生成物とは異なる生成物を生成する、請求項１－７のいずれか１つに記載の方法。
  9. 前記参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する前記代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路によって生成される生成物の量よりも多い量の生成物を生成する、請求項１－８のいずれか１つに記載の方法。
  10. 前記参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する前記代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路よりも低い細胞毒性を示す、請求項１－９のいずれか１つに記載の方法。
  11. 前記代謝経路の生成物は、標準的な分析方法、好ましくは、ガスクロマトグラフィー－質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、および／または核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって特徴づけられる、請求項１－１０のいずれか１つに記載の方法。
  12. 前記生成物を単離する工程をさらに含む、請求項１－１１のいずれか１つに記載の方法。
  13. 好ましくは、ロータリーエバポレーターを使用して、前記生成物を濃縮する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記目的のタンパク質に対する前記生成物の効果を試験する工程をさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 前記目的のタンパク質は、ユビキチンリガーゼ、ＳＵＭＯトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、パルミトイルトランスフェラーゼ、または関連ヒドロラーゼである、請求項１－１４のいずれか１つに記載の方法。
  16. 目的のタンパク質を含む宿主細胞の集団と、異なる代謝経路を含む発現ベクターの集団とを含む組成物またはシステムであって、
    前記宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットは、前記代謝経路が前記目的のタンパク質を調節する生成物を生成する際に検出可能な出力を生成し、
    任意選択で、前記発現ベクターは、参照経路を保有する参照ベクター、例えば、前記宿主細胞の集団の１つの細胞またはサブセットにおいて、目的のタンパク質の活性を調節するのに十分な濃度および／または効力を有する分子を生成しない経路をコードするベクターの出力よりも高い検出可能な出力をもたらす、組成物またはシステム。
  17. 前記宿主細胞は遺伝的にコードされたシステムを含み、ここで、前記目的のタンパク質の活性は、タンパク質複合体の２つ以上の成分のいずれかが有していない活性を有するタンパク質複合体の組み立てを制御し、したがって、形成された複合体の量に比例して検出可能な出力をもたらす、請求項１６に記載の組成物またはシステム。
  18. 前記目的のタンパク質は、最初は解離している２つのタンパク質を共有結合させるか、または非共有結合複合体を形成させる、翻訳後修飾を付加する酵素である、請求項１６または１７に記載の組成物またはシステム。
  19. 前記複合体は、ＳＨ２ドメインとそのリン酸化基質との間で形成される複合体の解離定数（Ｋｄ）以下のＫｄを有する２つのタンパク質によって形成される、請求項１６－１８のいずれか１つに記載の組成物またはシステム。
  20. 前記代謝経路は、フェニルプロパノイドまたは非リボソームペプチドを産生する、請求項１６－１９のいずれか１つに記載の組成物またはシステム。
  21. 異なる代謝経路を含む前記発現ベクターは、出発代謝経路内の１つ以上の遺伝子を変異させることによって生成される経路のライブラリを含む、請求項１６－２０のいずれか１つに記載の組成物またはシステム。
  22. 前記代謝経路の１つ以上は、未知の生合成能力の遺伝子のセットを含む、請求項１６－２１のいずれか１つに記載の組成物またはシステム。
  23. 前記参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する前記代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路の生成物とは異なる生成物を生成する、請求項１６－２２のいずれか１つに記載の組成物またはシステム。
  24. 前記参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する前記代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路によって生成される生成物の量よりも多い量の生成物を生成する、請求項１６－２３のいずれか１つに記載の組成物またはシステム。
  25. 前記参照経路の出力よりも高い検出可能な出力を生成する前記代謝経路の１つ以上は、他の代謝経路よりも低い細胞毒性を示す、請求項１６－２４のいずれか１つに記載の組成物またはシステム。
  26. 前記目的のタンパク質は、ユビキチンリガーゼ、ＳＵＭＯトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、パルミトイルトランスフェラーゼ、または関連ヒドロラーゼである、請求項１６－２５のいずれか１つに記載の組成物またはシステム。
  27. 請求項１６－２６のうちのいずれか１つに記載の発現ベクターの集団を含む、キット。
  28. 請求項１６－２６のうちのいずれか１つに記載の宿主細胞の集団をさらに含む、請求項２７に記載のキット。
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