JP2023520931A - Ｒｎａウイルス診断アッセイ - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトの呼気からエアロゾル化粒子をサンプリングする代替的で効果的なＲＮＡウイルスサンプル収集デバイスを提供する。本発明は、伝染リスクを評価するために、鼻咽頭スワブよりも直接的で医学的に関連のあるサンプルを提供する。
Description
本発明は、一般に、酵素、核酸、もしくは微生物が関与する測定もしくは検査プロセス；そのための組成物もしくは試験紙；そのような組成物の調製プロセス；微生物学的もしくは酵素学的プロセスにおける条件応答制御；ならびに分析用、例えばポリメラーゼ鎖反応［ＰＣＲ］アッセイ用の核酸の調製に関する。
関連出願に対する参照
本発明は、２０２０年４月１１日に出願された“Ａ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ（ＣＯＶＩＤ－１９）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｓｓａｙ”と題する米国特許出願第６３／００８，６９３号、および２０２０年４月１３日に出願された“Ａ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ（ＣＯＶＩＤ－１９）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｓｓａｙ”と題する米国特許出願第６３／００９，１６５号の優先権を合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づき主張するものである。
関連出願に対する参照
本発明は、２０２０年４月１１日に出願された“Ａ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ（ＣＯＶＩＤ－１９）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｓｓａｙ”と題する米国特許出願第６３／００８，６９３号、および２０２０年４月１３日に出願された“Ａ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ（ＣＯＶＩＤ－１９）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｓｓａｙ”と題する米国特許出願第６３／００９，１６５号の優先権を合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づき主張するものである。
ＣＯＶＩＤ－１９ウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、呼気中の空気媒介性粒子を介して伝染し、重篤な呼吸器疾患を引き起こす。進行中の感染または以前の感染の診断アッセイは、ウイルスＲＮＡまたはウイルスに対する抗体の検出に依存する。診断アッセイは、通常、唾液または鼻咽頭（ＮＰ）スワブによって患者の上気道から収集された患者サンプルに対して行われる。これらのソースは同等な感度を有しており、一致率は９７％である。
ＣＯＶＩＤ－１９診断アッセイ用の患者サンプルは、患者から鼻咽頭スワブによって頻繁に収集され、臨床検査室でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって検出される。患者は、感染後３か月間陽性となり得る。このＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）診断アッセイは、時間、試薬、および手間のかかるプロトコルであり、現在の需要に追いつくことができない。鼻咽頭（ＮＰ）スワブおよび安定化溶液などの試薬は、多くの現場で、医療クリニックによる診断アッセイの律速となっている。
上気道サンプルは活性ウイルスを含んでいるが、最近の臨床研究は、インフルエンザが区画化されていることを示唆している。鼻領域などの上気道のウイルス量は、下気道の症状、すなわち咳とは相関がなかった。エアロゾル化された粒子中のウイルス量は、咳の症状の重症度と相関していた。下気道の関与はしばしば、より重度なＣＯＶＩＤの結果の前兆であるため、生物医学分野では、呼気に焦点を当てた、より直接的なサンプリング手法が必要とされている。
本発明は、代替的で有効なＲＮＡウイルスサンプル収集デバイスを提供する。このサンプル収集デバイスは、鼻咽頭スワブ、安定化、ＲＮＡ抽出、および逆転写を迅速な単一のステップで置き換えることができる。本収集デバイスは、ヒトの呼気からエアロゾル化された粒子をサンプリングする。本発明は、伝染リスクを評価するために、鼻咽頭スワブよりも直接的で医学的に関連のあるサンプルを提供する。
第１の実施形態において、本発明は、対象の息からエアロゾル化されたＲＮＡ含有粒子を捕捉するＢｕｂｂｌｅｒ（商標）と呼ばれるデバイスを提供する。本デバイスは、デバイスに含まれる油／水溶液／エマルジョンを通して息をバブリングさせて、ＲＮＡウイルスの存在について対象を検査することによって使用される。油／水溶液／エマルジョン中には、酵素的な逆転写酵素（ＲＴ）反応を行うための試薬がある。図１（Ａ）を参照されたい。
第２の実施形態では、酵素活性がその後、ウイルスＲＮＡを安定な分子的にバーコード化されたｃＤＮＡに変換する。収集現場における逆転写酵素活性は、下流の大規模配列決定に基づく並列診断に適合したサンプルの収集を有利に可能とする。図３を参照されたい。あるいは、サンプルは配列決定せずにＰＣＲによって診断され得る。
第３の実施形態において、本発明は、空気媒介性ＳＡＲｓ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子からのＲＮＡをサンプルに特異的なバーコード化ｃＤＮＡへと逆転写する方法を提供する。本方法は、本発明のデバイスの使用に関して本明細書に記載されているように、最初に患者から深呼吸サンプルを取得するステップを含む。次に、サンプルは、サンプルに特異的なバーコード化プライマーを使用してウイルスｃＤＮＡへと逆転写される。場合により、超並列アッセイによる分析のためにサンプルをプールすることができる。
第４の実施形態では、本発明は、ヒトの呼気中のＲＮＡウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９、ＳＡＲＳ、他のコロナウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、または他のＲＮＡウイルス）のスクリーニングに使用するためのデバイスを提供する。
第５の実施形態では、本発明は、病院の救急室、空港、建物の暖房、換気、および空調（ＨＶＡＣ）空気処理システムに設置された通気口に真空ポンプを適用して、環境中のＲＮＡウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９、ＳＡＲＳ、他のコロナウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、または他のＲＮＡウイルス）に対するスクリーニングに使用するためのデバイスを提供する。
第６の実施形態では、本発明は、呼気中のＤＮＡウイルスを検出するのに使用するためのデバイスを提供する。
第７の実施形態では、本発明は、呼気中の非ウイルス性核酸（例えば、タバコからのＤＮＡ；大麻からのＤＮＡ）を検出するのに使用するためのデバイスを提供する。
第８の実施形態では、本発明は、環境中のエアロゾル化されたＤＮＡを検出するのに使用するためのデバイスを提供する。
第９の実施形態では、本発明は、ウイルスの株を同定するための配列決定に使用されるサンプルを収集するのに使用するためのデバイスを提供する。
第１０の実施形態では、本発明は、［超並列アッセイ］に使用されるサンプルを収集するのに使用するためのデバイスを提供する。
第１１の実施形態では、本発明は、レセプタクルがパーティーバルーンなどのバルーンであるデバイスを提供する。ヒトの呼気からのＲＮＡウイルス粒子は、－２０℃で１時間インキュベーションした後、膨らませたパーティーバルーンの内面から容易に沈殿された。ＲＴ－ＰＣＲは、ＲＮＡを抽出することなく、この液体中のｒＲＮＡを容易に検出できる。
一態様では、本発明は、大規模なサーベイ配列決定を有利に可能にする迅速なハイスループットアッセイを提供する。図４を参照されたい。Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）は、家庭用に発送することもでき、臨床検査施設の現在の負担を軽減する。
別の態様では、本発明は、感染性を決定するためのデバイスおよび改善された方法を提供する。ヒトの呼気中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を分析する能力がなければ、生物医学分野の当業者は、ＣＯＶＩＤ－１９患者が感染している時間と状況（ワクチン接種済み、無症候性）を知ることができない。この状況が、２０２０年のＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの間、世間一般の不安を煽ったことが広く認識されている。
別の態様において、配列決定による診断は、ウイルス量および株のアイデンティティなどの追加的な情報を提供し得る。
別の態様では、バーコード対応のＢｕｂｂｌｅｒ（商標）からのサンプルは、遺伝子的にバーコード化されたプライマーを使用して増幅されたｃＤＮＡをサンプルが含む場合、サンプルのアイデンティティを保持しながらプールしてバッチ処理することができる。
本発明は、次世代シーケンサーと組み合わせた分子バーコーディングにより、ヒト構築サンプルパネル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を３３４ゲノムコピー／サンプルの検出限界で定量的に検出できることを実証した臨床試験においてテストされた。
病院に入院した７０人の患者に対するＢｕｂｂｌｅｒ（商標）のテストは、他の方法よりも下気道の関与、つまり胸部Ｘ線の異常を予測しやすく、かつ侵襲性も低いことを示した。呼気のＢｕｂｂｌｅｒ（商標）サンプルは、舌スワブよりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡが３倍濃縮されていた。この結果は、ウイルス粒子が直接サンプリングされたことを意味する。
説明のために、本発明のいくつかの実施形態が、以下に記載の図面に示される。図面中の同様な数字は、図面全体を通して同様な要素を指し示す。本発明は、示されている厳密な配置、寸法、および器具には限定されない。
［産業上の利用可能性］
２０１９年のＣＯＶＩＤの出現は、突然のパンデミックに対する現代の対応を改善することの必要性を明らかにした。ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスおよび他の空気媒介性ウイルス、特にインフルエンザウイルス、コロナウイルス、およびライノウイルスなどの空気媒介性ＲＮＡウイルスの拡散を遅らせるか、または止めるには（図４を参照）、（ａ）誰が感染しているかを知り、（ｂ）一度に多くの人を検査できなければならない。２０１９年のＣＯＶＩＤパンデミックの間、様々な理由から検査がしばしば制限された。信頼できる診断法を確立することに関する初期の問題は、診断ラボのキャパシティの不足と、最終的には診断テストを実行するための試薬の不足に道を譲った。２０２１年にＣＯＶＩＤの症例は減少しているが、大量の検査の必要性は依然として強い。ワクチン耐性株が出現した場合、この必要性はさらに高まり得るであろう。
２０１９年のＣＯＶＩＤの出現は、突然のパンデミックに対する現代の対応を改善することの必要性を明らかにした。ＣＯＶＩＤ－１９ウイルスおよび他の空気媒介性ウイルス、特にインフルエンザウイルス、コロナウイルス、およびライノウイルスなどの空気媒介性ＲＮＡウイルスの拡散を遅らせるか、または止めるには（図４を参照）、（ａ）誰が感染しているかを知り、（ｂ）一度に多くの人を検査できなければならない。２０１９年のＣＯＶＩＤパンデミックの間、様々な理由から検査がしばしば制限された。信頼できる診断法を確立することに関する初期の問題は、診断ラボのキャパシティの不足と、最終的には診断テストを実行するための試薬の不足に道を譲った。２０２１年にＣＯＶＩＤの症例は減少しているが、大量の検査の必要性は依然として強い。ワクチン耐性株が出現した場合、この必要性はさらに高まり得るであろう。
Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）（ロードアイランド州および他の一部地域ではＢｕｈｂｌａｈ（商標）と呼ばれることがある）は、現在のスワブベースのサンプル収集技術の魅力的な代替法である。Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）は、鼻咽頭スワブ、安定化、ＲＮＡ抽出、および逆転写を迅速な単一のステップで置き換えることができる。この収集デバイスは、ヒトの呼気からエアロゾル化された粒子をサンプリングし、鼻咽頭スワブよりも直接的で医学的に関連のあるサンプルで伝染のリスクを評価する。このハンドヘルド型デバイスは、ウイルスＲＮＡを安定な分子的にバーコード化されたｃＤＮＡに変換する酵素的な逆転写酵素活性を含む油／水性エマルジョンをバブリングすることにより、エアロゾル化されたＲＮＡを含む粒子を息から捕捉する。重要な進歩は、収集の現場でのＲＴステップを含むことであり、これは大規模な下流の配列決定に基づく並列診断に適合したサンプルの収集を可能にする。
呼気の凝縮物を捕らえるために、いくつかのデバイスが設計された。代謝物をサンプリングするための呼気分析器が開発されている。以前の研究は、肺のマイクロバイオームと上気道のマイクロバイオームの違いを検出できなかった。Ｃｈａｒｌｓｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．（１８４）、９５７～９６３ページ（２０１１年）を参照されたい。しかしながら、サーファクタント関連タンパク質のファミリー（例えば、ＳＰ－Ａ）などのいくつの細胞遺伝子は、主に肺において発現される。ＡＣＥ－２の発現が見られるが、肺に限定はされない。ＨｅｒｍａｎｓとＢｅｒｎａｒｄ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１５９、６４６～６７８ページ（１９９９年）。
本発明は、既存のＣＯＶＩＤ－１９検査プロトコルに直交するデバイスと方法を提供する。並列処理を拡張して、複数のテストまたは呼吸パネル全体を１つのＢｕｂｂｌｅｒ（商標）に含めることができるため、同様な症状を有する疾患が一緒にテストされ得る。
本デバイスおよび方法は、鼻スワブを採取するよりも便利かつ快適に、１日に何万人もの人々を検査することを可能とする。
迅速なハイスループットアッセイは、大規模な調査シーケンシングを可能にする。Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）は家庭用に発送することができ、現在の検査施設の負担を軽減することができる。
本明細書に記載されている発明は、ヒトをクローニングするプロセス、ヒトの生殖細胞系列の遺伝的アイデンティティを改変するプロセス、産業上もしくは商業上の目的でのヒト胚の使用、またはヒトもしくは動物に実質的な医療上の利益を与えずに動物に苦しみを与える可能性のある動物の遺伝的アイデンティティを改変するプロセス、ならびにそのようなプロセスから生じる動物には、関係しない。
定義
便宜のため、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語およびフレーズの意味が以下に列挙される。別段の記載がない限り、または文脈から暗示されない限り、これらの用語およびフレーズは以下の意味を有するものとする。これらの定義は、特定の実施形態を説明するのに役立つが、特許請求される発明を限定することを意図するものではない。別途定義されない限り、全ての技術的および科学的な用語は、この発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において提供される用語の意味は、本明細書で提供される定義の意味と生物医学分野での用語の使用との間に明らかな不一致が生じた場合に優先するものとする。
定義
便宜のため、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語およびフレーズの意味が以下に列挙される。別段の記載がない限り、または文脈から暗示されない限り、これらの用語およびフレーズは以下の意味を有するものとする。これらの定義は、特定の実施形態を説明するのに役立つが、特許請求される発明を限定することを意図するものではない。別途定義されない限り、全ての技術的および科学的な用語は、この発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において提供される用語の意味は、本明細書で提供される定義の意味と生物医学分野での用語の使用との間に明らかな不一致が生じた場合に優先するものとする。
本願で使用される科学的および技術用語は、本明細書中で特に定義されない限り、生物医学分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって変動し得る。
「約」は、およそという平易な意味を持つ。「約」という用語には、関連する検査に本質的に関連する測定誤差が含まれる。パーセンテージとともに使用される場合、約は±１％を意味する。
「通気口」は、閉鎖空間に空気が出入りできるようにする開口部という平易な意味を有する。空気媒介性のウイルスを含み得る通気口が、病院の救急室、空港、および建物の暖房、換気、および空調（ＨＶＡＣ）空気処理システムに設置されている。
「空気媒介性」は、空気中を移動する粒子という平易な意味を有する。様々な種類の呼気（例えば、くしゃみ、咳、および大声で話すこと）に関する初期の研究は、様々な飛沫サイズが空気中に持続することを実証した。小さい飛沫は、より長く持続する。大きな飛沫は、蒸発によって、より小さな飛沫へと縮小する。相応する緑色連鎖球菌（Ｓｔｒ．ｖｉｒｉｄａｎｓ）の飛沫を培養することにより、呼気中のエアロゾル化した飛沫中でどのように病原体が移動し得るかが示された。これらの研究は、換気されていない空間中で３０～６０分間、空気媒介性の細菌の９０％が飛沫中において持続し得ると結論付けた。より小さなウイルスは、おそらくより長く存続し、より遠くまで移動し得るであろう。
「アラートレベル」は、通常の稼働状態からのずれの可能性を早期に警告し、潜在的な問題に対処するための適切な精査とフォローアップのきっかけとなる確立された微生物または空気媒介性粒子のレベルである。米国食品医薬品局の業界向けガイダンス、Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ａｓｅｐｔｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ － Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２００４年９月）を参照されたい。
「無菌処理施設」は、微生物および粒子の汚染を制御するために、空気の供給、材料、および機器が制御されているクリーンルームを含む建物またはその隔離された部分である。米国食品医薬品局の業界向けガイダンス、Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ａｓｅｐｔｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ － Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２００４年９月）を参照されたい。
「クリーンエリア」または「クリーンゾーン」は、定義された粒子および微生物学的清浄度基準を持つエリアである。米国食品医薬品局の業界向けガイダンス、Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ａｓｅｐｔｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ － Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２００４年９月）を参照されたい。
「コロナウイルス」は、哺乳類および鳥類に病気を引き起こす関連するＲＮＡウイルスのグループという、生物医学分野で認められた意味を有している。コロナウイルスは、リボウイルス界、ニドウイルス目、コロナウイルス科のオルトコロナウイルス亜科を構成している。それらは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムとらせん対称のヌクレオキャプシドを有するエンベロープウイルスである。
「ＣＯＶＩＤ－１９」（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＡＣＥ２受容体を介して様々な種類の細胞に侵入し、重度の呼吸器障害であるＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすコロナウイルスである。ＣＯＶＩＤ－１９は、発熱、空咳、および他の様々な症状を特徴とする。ＣＯＶＩＤ－１９は下気道の外側に症状を呈し得るが、危険な成り行きでは肺に炎症を引き起こし、肺炎を引き起こし得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は空気媒介性の病原体であるため、肺と気道の感染状態は、疾患の転帰だけでなく、伝染のリスクも予測的である。
「ＤＮＡウイルス」は、遺伝物質がデオキシリボ核酸であるウイルスという、生物医学の分野で認められた定義を有している。一般に認識されているウイルスのクラスは６つある。ＤＮＡウイルスは、クラスＩ（二本鎖ＤＮＡウイルス）とクラスＩＩ（一本鎖ＤＮＡウイルス）を構成する。
「環境」は、ヒト、動物、または植物が生息または活動する環境または条件、特に周囲の空気という平易な意味を有する。
「マクネマー検定」は、統計学の分野で認められている意味を有する。統計学において、マクネマー検定は、対応のある名目データに対して使用される統計学的検定である。それは、行と列の限界度数が等しいかどうか（つまり、「限界均一性」があるかどうか）を判断するために、対象のマッチドペアの二分特性を持つ２×２分割表に適用される。
「核酸」および「核酸分子」は、本明細書においては交換可能に使用可能であり、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のポリマーまたはポリマーブロックを指す。核酸は、天然源から得られても、または組換えまたは化学合成によって生成されてもよい。核酸は、一本鎖、二本鎖、または多重鎖であってもよく、修飾または非修飾のヌクレオチドまたは非ヌクレオチド、またはそれらの様々な混合物および組み合わせを含んでいてもよい。
「患者」は、アッセイが施される任意のヒトを指す。特に、患者は、ＣＯＶＩＤ－１９に感染しているか、またはその疑いがあり、アッセイが施されるヒトを指し得る。「患者」、「個人」、および「対象」という用語は交換可能である。
「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、特異的なＤＮＡサンプルの数百万から数十億のコピーを迅速に作成するために広く使用されている方法として、生物医学の分野で認識されている意味を有しており、科学者が非常に少量のＤＮＡサンプルを採取して、それを詳細に研究するのに十分多い量にまで増幅することを可能にする。ＰＣＲを使用すると、一連の温度変化のサイクルにおいて、非常に少量のＤＮＡ配列のコピーが指数関数的に増幅される。ＰＣＲは現在、生物医学研究および犯罪科学捜査を含む広範な用途のために、医学実験室での研究において一般的で、しばしば不可欠な技術として使用されている。ＰＣＲキットは市販されている。
「呼吸器疾患」は、生物医学分野において認められた定義を有する。一般的なウイルス性呼吸器疾患は、同様な特性を有し、気道に影響を与える様々なウイルスによって引き起こされる病気である。関与するウイルスは、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（細気管支炎、肺炎、クループ、気管支炎、および中耳炎の主な原因）、パラインフルエンザウイルス（幼児のクループの主な原因であり、気管支炎、肺炎、および細気管支炎を引き起こし得る）、または呼吸器アデノウイルス（咽頭炎から肺炎、結膜炎、および下痢まで、様々な病気を引き起こし得る）でありうる。他のウイルスは、ライノウイルス（典型的には風邪を引き起こす）およびコロナウイルスを含む。気道におけるウイルス感染は、扁桃炎、喉頭炎、気管支炎、肺炎などの合併症を引き起こし得る。Ｂｏｎｃｒｉｓｔｉａｎｉ、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５００～５１８ページ（２００９年２月１７日）を参照されたい。
「逆転写酵素」（ＲＴ）は、逆転写においてＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの形成を触媒する酵素という、生物医学分野で認知されている意味を有する。逆転写酵素は市販されている。
「リボ核酸」（ＲＮＡ）は、リボースを含む核酸という、生物医学分野で認知されている意味を有する。その主な役割は、タンパク質の合成を制御するためのＤＮＡからの指示を運ぶメッセンジャーとして機能することであるが、一部のウイルスでは、ＤＮＡではなくＲＮＡが遺伝情報を運んでいる。
「ＲＮＡウイルス」は、リボ核酸を遺伝物質とするウイルスという、生物医学分野で認知されている定義を有する。ＲＮＡは二本鎖または一本鎖のいずれかでありうる。一般に認識されているウイルスのクラスは６つある。ＤＮＡウイルスは、クラスＩおよびＩＩを構成する。ＲＮＡウイルスは、残りのクラスを構成する。クラスＩＩＩウイルスは、二本鎖ＲＮＡゲノムを有する。クラスＩＶウイルスは、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを持ち、ゲノム自体がｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）として働く。クラスＶウイルスは、ｍＲＮＡ合成のテンプレートとして使用されるマイナス鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを有している。クラスＶＩウイルスは、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを有しているが、複製だけでなくｍＲＮＡの合成にもＤＮＡの中間体を伴う。ＲＮＡウイルスによって引き起こされる注目すべきヒトの呼吸器疾患は、風邪、インフルエンザ、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、およびＣＯＶＩＤ－１９を含む。
コクラン・アーミテージ検定は、統計学分野で認知されている意味を有する。コクラン・アーミテージの傾向検定は、２つのカテゴリーを持つ変数とｋ個のカテゴリーを持つ順序変数との間の関連の存在を評価することを目的とする際に、カテゴリカルデータ分析において使用される。それはピアソンのカイ２乗検定を修正して、第２の変数のｋ個のカテゴリーの影響に疑われる順序を組み込んでいる。
材料および方法からのガイダンス
当業者は、本発明を作成および使用する際の予測可能な結果へのガイダンスとして、これらの材料および方法を使用し得る。
当業者は、本発明を作成および使用する際の予測可能な結果へのガイダンスとして、これらの材料および方法を使用し得る。
Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）－使用説明書
Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）は、被検者が息を吹き込むガラス製のストローが上部に付いたハンドヘルド型デバイスである。ガラス製のストローは、パスツールピペットから作成され得る。このデバイスは、ウイルスの呼気分析器である。このデバイスは、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、またはＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルスなどのＲＮＡウイルスなどの呼吸器ウイルスに誰が感染しているかを決定するために使用され得る。図４を参照されたい。本デバイスは、医療分野の当業者が、１日に何万人もの人々を検査することを可能とするため、鼻スワブを採取するよりも簡単、便利、かつ快適である。
Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）は、被検者が息を吹き込むガラス製のストローが上部に付いたハンドヘルド型デバイスである。ガラス製のストローは、パスツールピペットから作成され得る。このデバイスは、ウイルスの呼気分析器である。このデバイスは、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、またはＣＯＶＩＤ－１９などのコロナウイルスなどのＲＮＡウイルスなどの呼吸器ウイルスに誰が感染しているかを決定するために使用され得る。図４を参照されたい。本デバイスは、医療分野の当業者が、１日に何万人もの人々を検査することを可能とするため、鼻スワブを採取するよりも簡単、便利、かつ快適である。
被検者は、次のステップを実行するであろう：
ステップ（１）．Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）を上から持つ。図１（Ｂ）を参照されたい。
ステップ（１）．Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）を上から持つ。図１（Ｂ）を参照されたい。
ステップ（２）．少し下に傾けて、通常の呼吸をする。
ステップ（３）．チューブに息を吐く。
被検者またはテストの実施者には、バブリングの音が聞こえるはずである。被検者は、肺の中の全ての空気を吐き出すものとする。このプロセスには１０秒以上はかからないはずである。チューブの底にある油／水混合物は、エマルジョン（油と酢のサラダドレッシングのようなもの）であるべきである。時折、少量の唾液がＢｕｂｂｌｅｒ（商標）に入るため、最後のステップは唾液サンプルを採取することである。
超並列ＲＮＡウイルス診断アッセイの有効性に関する臨床試験のための方法
試験参加者の登録とサンプル収集。ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの間、２０２０年５月から２０２１年１月にかけて、臨床スタッフが病院で臨床試験参加者をスクリーニングした。１８歳以上であり、７２時間以内にＣＯＶＩＤ－１９検査が収集されたか、履歴が利用可能であり、英語を話し、書面によるインフォームドコンセントを理解して提供した患者を適格とした。インフォームドコンセントを提供できないと臨床プロバイダにより決定された患者は除外された。登録された各対象から、本発明者らはＢｕｂｂｌｅｒ（商標）での約１５秒間の呼気と２つの舌をスクレイピングしたサンプルを収集した。室温で約３０分後、実験室での検査までサンプルを－８０℃に移した。
試験参加者の登録とサンプル収集。ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの間、２０２０年５月から２０２１年１月にかけて、臨床スタッフが病院で臨床試験参加者をスクリーニングした。１８歳以上であり、７２時間以内にＣＯＶＩＤ－１９検査が収集されたか、履歴が利用可能であり、英語を話し、書面によるインフォームドコンセントを理解して提供した患者を適格とした。インフォームドコンセントを提供できないと臨床プロバイダにより決定された患者は除外された。登録された各対象から、本発明者らはＢｕｂｂｌｅｒ（商標）での約１５秒間の呼気と２つの舌をスクレイピングしたサンプルを収集した。室温で約３０分後、実験室での検査までサンプルを－８０℃に移した。
臨床試験サンプルの調製、ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲ。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１８０９００５０）を逆転写（ＲＴ）プライマーおよびｄＮＴＰと混合して、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）用の４０μｌ反応液または舌スクレイプ用の２０μｌ反応液を作成した。Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２Ｎ遺伝子用の８つのプライマーとＲＮａｓｅ Ｐ用の１つのプライマー（配列表の配列を参照）を２０μＭの濃度にプールし、ＲＴプライマープールとして使用する。患者サンプルからの０．５μｌのＲＴ混合物をプライマー（配列リストに記載）およびＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、４３６７６５９）と混合して、リアルタイムＰＣＲ解析用の１０μｌ反応を行う。リアルタイムＰＣＲプログラムは次のように設定する：（１）ホールドステージ：５０℃で２分間、その後９５℃で３分間；（２）ＰＣＲ：９５℃で１５秒間、６０℃で２０秒間および７２℃で３０秒間、４０サイクル；（３）メルトカーブ：９５℃で１５秒間、６０℃で２０秒間、その後０．０５℃／秒の速度で９５℃まで上げ、９５℃で１５秒間保持。両方のリアルタイムＰＣＲプライマーセットでＣｔ＜３５の場合、患者サンプルはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２陽性と判定される。ＧｏＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ７１２３）は、ＰＣＲ反応において１８Ｓ ｒＲＮＡまたはＡＣＥ２を検出するために使用される。配列表中のプライマーの配列を参照されたい。ヒトトータルＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、４３０７２８１、ロット００８９０９０１）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡ（ＡＴＣＣ、ＶＲ－１９８６Ｄ、ロット７００３５６２４）が対照として使用される。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）。ヒト構築サンプルで使用されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ遺伝子ＲＮＡのコピー数をｑＰＣＲによって定量化した。
ＲＮＡは、ランダム９マー（ｍｅｒ）を使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１８０９００５０）によってｃＤＮＡに逆転写した。その結果得られたｃＤＮＡをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｑＰＣＲ反応に加えた。インビトロで転写したＮ遺伝子ＲＮＡを使用して、絶対標準を調製した。次に、発明者らは、コピー数を計算するための標準曲線を作成した。ｑＰＣＲ反応はＣＤＣ Ｎ１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーを使用して、ＶｉｉＡ ７リアルタイムＰＣＲシステムで実行した。
診断テストの統計分析。Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）ＰＣＲ法（Ｂ－ＰＣＲ）の臨床上の有用性を比較するために、病院でのＰＣＲ（Ｈ－ＰＣＲ）と検査室でのＰＣＲ（Ｌ－ＰＣＲ）を陽性（ＰＯＳ）または陰性（ＮＥＧ）に分類した。Ｌ－ＰＣＲは、その結果を確認するために二重に実施した；２回のテストのいずれもが陽性の場合、ＰＯＳの結果を割り当てた。Ｘ線所見（ＸＲ）も、ウイルス性肺炎のＸ線徴候に基づいて、正常または異常として二分した。Ｈ－ＰＣＲとＬ－ＰＣＲ、Ｂ－ＰＣＲとＨ－ＰＣＲの測定値の間の一致は、２×２の表（ＳＡＳバージョン９．４ ｐｒｏｃ ｆｒｅｑ）を用いて評価し、ゴールドスタンダードのＬ－ＰＣＲに対して比較したＨ－ＰＣＲまたはＢ－ＰＣＲによってＰＯＳと分類された患者の割合、およびＸＲがＰＯＳでもあるＨ－ＰＣＲがＰＯＳの患者の割合を評価した。感度、特異度、およびＰＰＶの値も、ＣＯＶＩＤ－１９陽性の予測におけるＢ－ＰＣＲの有用性の指標として報告された。Ｌ－ＰＣＲが、この実施例における比較標準であり、Ｈ－ＰＣＲではない。ＰＯＳのＢｕｂｂｌｅｒ（商標）の結果は、二重に行ったＬ－ＰＣＲアッセイのいずれにおいてもＰＯＳであった患者からのＰＯＳであったＢｕｂｂｌｅｒ（商標）である。ＮＥＧのＢｕｂｂｌｅｒ（商標）の結果は、二重に行ったＬ－ＰＣＲアッセイのいずれにおいてもＮＥＧであった患者からのＮＥＧであったＢｕｂｂｌｅｒ（商標）である。
全ての二分比較において、マクネマー検定を使用した。推定値は９５％ＣＩで報告した。次に、推定値を陽性度の低いものから高いものの順にランク付けし、傾向についてコクラン・アーミテージ検定を使用してテストし、片側仮説検定を使用して、異常な胸部ＸＲ結果の割合がＢ－ＰＣＲによって予測されるかどうかを決定した。
舌スクレイプとＢｕｂｂｌｅｒ（商標）テストの間の相対的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２発現の違いを分析するために、陽性のテスト結果のみを含むデータのサブセットを取得した。比較ＣＴ法を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２増幅のＣＴ値を、サンプル中のＲＮａｓｅ Ｐ対照と比較した相対発現レベルに変換した。これらの相対的な発現の中央値は、舌スクレイプとＢｕｂｂｌｅｒ（商標）の両方で別々に計算した。データの外れ値を除外した後、いくつかの連続したテストを行った。各テストにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の相対発現の中央値は、舌スクレイプよりもＢｕｂｂｌｅｒ（商標）の方が大きかった（ｔ検定）（表Ｓ４を参照）。
インビトロＲＮＡ転写。Ｔ７プロモーターを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ遺伝子のＤＮＡオリゴヌクレオチドが、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）において合成された。Ｑ５ Ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、このオリゴヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅を行い、インビトロ転写（ＩＶＴ）用の鋳型を調製した。プライマーは表Ｓ１に列挙されている。単一のＰＣＲアンプリコンが、アガロースゲル電気泳動によって確認された。ＩＶＴは、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ－Ｔ７キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｐ１４４０）を用いて、製造元の推奨する方法に従って行った。ＤＮＡ鋳型はＤＮａｓｅ Ｉを用いた消化により除去し、その後、ＩＶＴしたＲＮＡをフェノール（ｐＨ４．７）：クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。
ヒト構築サンプルのハイスループット検査。ＩＶＴしたＮ遺伝子ＲＮＡを使用した５倍系列希釈を三重に行って、ヒト構築サンプルを作成した。各レプリケートには、１０種類の希釈と２つのブランク対照が含められていた。希釈には、ヒトトータルＲＮＡ対照（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３－０７２－８１）を使用した。バーコード化転写産物特異的ＲＴプライマーは、ＩＤＴにおいて９６ウェルプレート中で合成された。各バーコード化プライマーは、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡまたはＮ遺伝子のいずれかに結合する標的化領域、３ヌクレオチドのランダム配列（Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ、ＵＭＩ）、８ヌクレオチドのバーコード、ＰＣＲリバースプライマーが結合する定常領域、およびＴ７プロモーターを含む。図４（Ａ）。プライマーについては配列表を参照されたい。３６個のヒト構築サンプルが、バーコード化ＲＴプライマーが既に割り当てられている９６ウェル中に配置され、各ウェルは、１つは１８Ｓ ｒＲＮＡ用、もう１つはＮ遺伝子ＲＮＡ用の２つのバーコード化ＲＴプライマーを含んでいた。次に、Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｋ２５６１）を用いて、製造元の推奨に従って、ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡへと逆転写した。残留したＲＮＡおよびＲＴプライマーは、それぞれＲＮａｓｅ ＩおよびエキソヌクレアーゼＩで除去した。プロテイナーゼＫ処理後、全てのｃＤＮＡをプールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を使用して精製し、インビトロ転写反応にかけた。次に、得られたアンチセンスＲＮＡを、１８Ｓ ｒＲＮＡとＮ遺伝子の両方に特異的なＲＴプライマーを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１８０９００５０）によりｃＤＮＡへと逆転写した。次の２ステップのネステッドＰＣＲ増幅は、同じリバースプライマーと２つの異なるフォワードプライマーを使用する。特異的なＲＴおよびＰＣＲプライマーが配列表に列挙されている。各バーコードを定量化するために、アンプリコンの配列決定を行った。
ヒト構築サンプルのアンプリコン配列決定の分析。記載の系列希釈で使用した一般的なリバースプライマー（ＲＰ）の配列を、ｂｏｗｔｉｅ２を使用して、アンプリコンの配列決定から得られた読み取りにマッピングした。サンプルのバーコードとＵＭＩは、全長ＲＰを含む読み取りの隣接配列から取得した。次に、これらの読み取りから非標的配列（つまり、ＵＭＩ、サンプルバーコード、およびＲＰ）をトリミングし、標的配列（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または１８Ｓ ｒＲＮＡのいずれか）にマッピングして、それらがフォワードプライマー（ＦＰ１またはＦＰ２のいずれか）と第１ラウンドの逆転写プライマーとの間に予想される配列を含むことを確認した。各希釈レベルのバーコードのリードカウントを、予想されるＲＰと標的配列を含む一連の読み取りから計算した。各希釈レベルは、前のレベルよりも５倍少ないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを含むため、所与の希釈レベルについて予想されるリードカウントは、前のレベルで観察されたリードカウントの５分の１に設定される。２つの水ベースのブランクサンプルのリードカウントの期待値はゼロとした。最初の希釈レベルについて予想されるリードカウントは、プロットの目的で観察されたリードカウントに設定したが、このレベルは相関の計算からは除外した。以下の比較のためにピアソン相関係数を計算した：観察されたＦＰ１カウントと観察されたＦＰ２カウント、観察されたＦＰ１カウントと予想されたＦＰ１カウント、および観察されたＦＰ２カウントと予想されたＦＰ２カウント。
インビトロＲＮＡ転写。Ｔ７プロモーターを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｎ遺伝子のＤＮＡオリゴヌクレオチドが、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）において合成された。Ｑ５ Ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、このオリゴヌクレオチドに対してＰＣＲ増幅を行い、インビトロ転写（ＩＶＴ）用の鋳型を調製した。プライマーは配列表に列挙されている。単一のＰＣＲアンプリコンが、アガロースゲル電気泳動によって確認された。
インビトロＲＮＡ転写は、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ－Ｔ７キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｐ１４４０）を用いて、製造元の推奨する方法に従って行った。ＤＮＡ鋳型はＤＮａｓｅ Ｉを用いた消化により除去し、その後、転写されたＲＮＡをフェノール（ｐＨ４．７）：クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。
インビトロＲＮＡ転写
ヒト構築サンプルのハイスループット検査。インビトロで転写したＮ遺伝子ＲＮＡを使用した５倍系列希釈を三重に行って、ヒト構築サンプルを作成した。各レプリケートには、１０種類の希釈と２つのブランク対照が含められていた。希釈には、ヒトトータルＲＮＡ対照（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３－０７２－８１）を使用した。バーコード化転写産物特異的ＲＴプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにおいて９６ウェルプレート中で合成された。各バーコード化プライマーは、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡまたはＮ遺伝子のいずれかに結合する標的化領域、３－ヌクレオチドのランダマー（Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ、ＵＭＩ）、８－ヌクレオチドのバーコード、ＰＣＲリバースプライマーが結合する定常領域、およびＴ７プロモーターを含む。プライマーについては配列表を参照されたい。３６個のヒト構築サンプルが、バーコード化ＲＴプライマーが既に割り当てられている９６ウェル中に配置され、各ウェルは、１つは１８Ｓ ｒＲＮＡ用、もう１つはＮ遺伝子ＲＮＡ用の２つのバーコード化ＲＴプライマーを含んでいた。次に、Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号 Ｋ２５６１）を用いて、製造元の推奨に従って、ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡへと逆転写した。残留したＲＮＡおよびＲＴプライマーは、それぞれＲＮａｓｅ ＩおよびエキソヌクレアーゼＩで除去した。図２を参照されたい。プロテイナーゼＫ処理後、全てのｃＤＮＡをプールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を使用して精製し、インビトロ転写反応にかけた。次に、得られたアンチセンスＲＮＡを、１８Ｓ ｒＲＮＡとＮ遺伝子の両方に特異的なＲＴプライマーを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１８０９００５０）によりｃＤＮＡへと逆転写した。次の２ステップのネステッドＰＣＲ増幅は、同じリバースプライマーと２つの異なるフォワードプライマーを使用する。特異的なＲＴおよびＰＣＲプライマーが配列表に列挙されている。各バーコードを定量化するために、アンプリコンの配列決定を行った。
ヒト構築サンプルのハイスループット検査。インビトロで転写したＮ遺伝子ＲＮＡを使用した５倍系列希釈を三重に行って、ヒト構築サンプルを作成した。各レプリケートには、１０種類の希釈と２つのブランク対照が含められていた。希釈には、ヒトトータルＲＮＡ対照（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３－０７２－８１）を使用した。バーコード化転写産物特異的ＲＴプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにおいて９６ウェルプレート中で合成された。各バーコード化プライマーは、ヒト１８Ｓ ｒＲＮＡまたはＮ遺伝子のいずれかに結合する標的化領域、３－ヌクレオチドのランダマー（Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ、ＵＭＩ）、８－ヌクレオチドのバーコード、ＰＣＲリバースプライマーが結合する定常領域、およびＴ７プロモーターを含む。プライマーについては配列表を参照されたい。３６個のヒト構築サンプルが、バーコード化ＲＴプライマーが既に割り当てられている９６ウェル中に配置され、各ウェルは、１つは１８Ｓ ｒＲＮＡ用、もう１つはＮ遺伝子ＲＮＡ用の２つのバーコード化ＲＴプライマーを含んでいた。次に、Ｍａｘｉｍａ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号 Ｋ２５６１）を用いて、製造元の推奨に従って、ＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡへと逆転写した。残留したＲＮＡおよびＲＴプライマーは、それぞれＲＮａｓｅ ＩおよびエキソヌクレアーゼＩで除去した。図２を参照されたい。プロテイナーゼＫ処理後、全てのｃＤＮＡをプールし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を使用して精製し、インビトロ転写反応にかけた。次に、得られたアンチセンスＲＮＡを、１８Ｓ ｒＲＮＡとＮ遺伝子の両方に特異的なＲＴプライマーを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１８０９００５０）によりｃＤＮＡへと逆転写した。次の２ステップのネステッドＰＣＲ増幅は、同じリバースプライマーと２つの異なるフォワードプライマーを使用する。特異的なＲＴおよびＰＣＲプライマーが配列表に列挙されている。各バーコードを定量化するために、アンプリコンの配列決定を行った。
配列表
臨床試験で使用したプライマー
ＲＴプライマー
ｈＲＰｐ１＿ＲＴ － ＮＮＮＮＮＮＧＡＡＴＴＧＧＧＴＴＡ（配列番号１）。
Ｃｖ＿ＲＴ１ － ＮＮＮＮＮＮＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＣ（配列番号２）。
Ｃｖ＿ＲＴ２ － ＮＮＮＮＮＮＣＣＴＧＡＧＴＴＧＡＧ（配列番号３）。
Ｃｖ＿ＲＴ３ － ＮＮＮＮＮＮＡＧＴＴＧＡＧＴＣＡＧ（配列番号４）。
Ｃｖ＿ＲＴ４ － ＮＮＮＮＮＮＡＧＴＣＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号５）。
Ｃｖ＿ＲＴ５ － ＮＮＮＮＮＮＧＡＧＴＣＡＧＣＡＣＴ（配列番号６）。
Ｃｖ＿ＲＴ６ － ＮＮＮＮＮＮＧＴＴＧＡＧＴＣＡＧＣ（配列番号７）。
Ｃｖ＿ＲＴ７ － ＮＮＮＮＮＮＧＧＣＣＴＧＡＧＴＴＧ（配列番号８）。
Ｃｖ＿ＲＴ８ － ＮＮＮＮＮＮＧＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣ（配列番号９）。
臨床試験で使用したプライマー
ＲＴプライマー
ｈＲＰｐ１＿ＲＴ － ＮＮＮＮＮＮＧＡＡＴＴＧＧＧＴＴＡ（配列番号１）。
Ｃｖ＿ＲＴ１ － ＮＮＮＮＮＮＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＣ（配列番号２）。
Ｃｖ＿ＲＴ２ － ＮＮＮＮＮＮＣＣＴＧＡＧＴＴＧＡＧ（配列番号３）。
Ｃｖ＿ＲＴ３ － ＮＮＮＮＮＮＡＧＴＴＧＡＧＴＣＡＧ（配列番号４）。
Ｃｖ＿ＲＴ４ － ＮＮＮＮＮＮＡＧＴＣＡＧＣＡＣＴＧ（配列番号５）。
Ｃｖ＿ＲＴ５ － ＮＮＮＮＮＮＧＡＧＴＣＡＧＣＡＣＴ（配列番号６）。
Ｃｖ＿ＲＴ６ － ＮＮＮＮＮＮＧＴＴＧＡＧＴＣＡＧＣ（配列番号７）。
Ｃｖ＿ＲＴ７ － ＮＮＮＮＮＮＧＧＣＣＴＧＡＧＴＴＧ（配列番号８）。
Ｃｖ＿ＲＴ８ － ＮＮＮＮＮＮＧＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣ（配列番号９）。
ＰＣＲプライマー
１８Ｓ＿ＦＰ － ＴＧＣＡＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＡＣＧＡＧ（配列番号１０）。
１８Ｓ＿ＲＰ － ＣＴＡＧＡＴＡＧＴＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣＣＧＴＣ（配列番号１１）。
ＡＣＥ２＿ＦＰ － ＴＴＣＧＧＣＴＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴ（配列番号１２）。
ＡＣＥ２＿ＲＰ － ＣＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡ（配列番号１３）。
１８Ｓ＿ＦＰ － ＴＧＣＡＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＡＣＧＡＧ（配列番号１０）。
１８Ｓ＿ＲＰ － ＣＴＡＧＡＴＡＧＴＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣＣＧＴＣ（配列番号１１）。
ＡＣＥ２＿ＦＰ － ＴＴＣＧＧＣＴＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴ（配列番号１２）。
ＡＣＥ２＿ＲＰ － ＣＴＣＴＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡ（配列番号１３）。
リアルタイムＰＣＲプライマー
ｈＲＰｐ１＿ｒｔＰＣＲ＿１ － ＧＧＡＴＧＣＣＴＣＣＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ（配列番号１４）。
ｈＲＰｐ１＿ｒｔＰＣＲ＿２ － ＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＣＴＣＡＣＴＴＣＧＣ（配列番号１５）。
Ｃｖ１９Ｎ＿ｒｔＰＣＲ１＿１ － ＡＧＴＣＡＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＧＴＴＣＣ（配列番号１６）。
Ｃｖ１９Ｎ＿ｒｔＰＣＲ１＿２ － ＧＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣ（配列番号１７）。
Ｃｖ１９Ｎ＿ｒｔＰＣＲ２＿１ － ＧＧＴＧＴＴＡＡＴＴＧＧＡＡＣＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＣ（配列番号１８）。
Ｃｖ１９Ｎ＿ｒｔＰＣＲ２＿２ － ＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＣＣＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡ（配列番号１９）。
ｈＲＰｐ１＿ｒｔＰＣＲ＿１ － ＧＧＡＴＧＣＣＴＣＣＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧ（配列番号１４）。
ｈＲＰｐ１＿ｒｔＰＣＲ＿２ － ＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＣＴＣＡＣＴＴＣＧＣ（配列番号１５）。
Ｃｖ１９Ｎ＿ｒｔＰＣＲ１＿１ － ＡＧＴＣＡＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＧＴＴＣＣ（配列番号１６）。
Ｃｖ１９Ｎ＿ｒｔＰＣＲ１＿２ － ＧＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣ（配列番号１７）。
Ｃｖ１９Ｎ＿ｒｔＰＣＲ２＿１ － ＧＧＴＧＴＴＡＡＴＴＧＧＡＡＣＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＣ（配列番号１８）。
Ｃｖ１９Ｎ＿ｒｔＰＣＲ２＿２ － ＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＣＣＧＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡ（配列番号１９）。
ヒト構築サンプルの検査に使用したプライマー。図２中のＲＴプライマー１は、Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１からＮ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３６までを指す。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＣＡＣＧＴＣＧＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２０）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＧＡＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２１）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＴＡＴＴＧＴＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２２）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＴＡＧＣＡＣＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２３）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＣＡＣＡＴＧＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２４）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＴＧＴＡＡＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２５）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＧＴＡＴＣＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２６）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＴＴＧＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２７）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＡＣＴＧＴＡＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２８）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＣＡＧＧＣＡＴＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２９）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＡＧＧＣＧＡＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３０）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＣＧＴＣＧＡＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３１）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１３ － ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３２）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３３）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＣＧＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３４）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３５）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３６）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＡＣＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３７）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＣＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３８）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３９）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＣＴＣＡＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４０）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＡＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４１）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＴＡＴＧＣＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４２）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＣＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４３）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＣＴＴＣＧＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４４）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４５）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４６）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＡＣＧＣＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４７）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４８）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４９）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５０）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５１）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５２）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５３）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＣＧＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５４）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＧＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５５）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＣＴＴＣＡＣＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号５６）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＣＧＡＴＧＴＴＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号５７）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＡＧＧＣＡＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号５８）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号５９）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＣＣＡＡＴＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６０）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６１）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＣＴＴＧＡＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６２）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＧＣＴＴＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６３）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６４）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＴＡＣＣＴＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６５）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６６）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧＧＡＧＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６７）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６８）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＣＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６９）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７０）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７１）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７２）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７３）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７４）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７５）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２１－ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＡＣＧＣＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７６）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７７）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７８）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＣＴＴＣＧＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７９）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＣＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８０）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＴＡＴＧＣＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８１）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＡＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８２）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＣＴＣＡＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８３）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８４）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＣＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８５）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＡＣＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８６）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８７）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８７）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＣＧＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８９）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号９０）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号９１）。
１８Ｓ ｒＲＮＡ用ＲＴプライマー２ － ＧＡＴＴＴＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＴＴＣＣＧＡＴＡＡＣＧ（配列番号９２）。
Ｎ遺伝子用ＲＴプライマー２ － ＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡ（配列番号９３）。図２中のＲＴプライマー２は、Ｎ遺伝子用ＲＴプライマー２を指す。
１８Ｓ ｒＲＮＡ用ＦＰ１ － ＣＡＡＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴ（配列番号９４）。
１８Ｓ ｒＲＮＡ用ＦＰ２ － ＴＧＣＡＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＡＣＧＡＧ（配列番号９５）。
Ｎ遺伝子用ＦＰ１ － ＡＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＧＡＴＧＡＣＡ（配列番号９７）。図２中のＦＰ１は、Ｎ遺伝子用ＦＰ１を指す。
Ｎ遺伝子用ＦＰ２ － ＣＴＧＡＡＴＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＡＣＧＣＡＴＡＣ（配列番号９８）。図２中のＦＰ２は、Ｎ遺伝子用ＦＰ２を指す。
ＲＰ － ＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（配列番号９９）。図２中のＲＰは、Ｎ遺伝子用ＲＰを指す。
ＩＶＴ－ＰＣＲ－ＦＰ － ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴ（配列番号１００）。
ＩＶＴ－ＰＣＲ－ＲＰ － ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号１０１）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＣＡＣＧＴＣＧＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２０）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＧＡＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２１）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＴＡＴＴＧＴＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２２）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＴＡＧＣＡＣＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２３）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＣＡＣＡＴＧＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２４）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＴＧＴＡＡＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２５）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＧＴＡＴＣＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２６）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＴＴＧＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２７）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＡＣＴＧＴＡＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２８）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＣＡＧＧＣＡＴＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号２９）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＡＧＧＣＧＡＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３０）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＣＧＴＣＧＡＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３１）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１３ － ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３２）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３３）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＣＧＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３４）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３５）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３６）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＡＣＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３７）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ１９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＣＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３８）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号３９）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＣＴＣＡＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４０）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＡＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４１）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＴＡＴＧＣＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４２）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＣＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４３）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＣＴＴＣＧＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４４）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４５）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４６）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＡＣＧＣＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４７）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ２９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４８）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＧＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４９）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５０）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５１）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５２）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５３）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＣＧＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５４）。
Ｎ－ｇｅｎｅ－ＢＣ３６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＧＴＮＮＮＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号５５）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＣＴＴＣＡＣＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号５６）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＣＧＡＴＧＴＴＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号５７）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＡＧＧＣＡＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号５８）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号５９）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＣＣＡＡＴＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６０）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＣＡＧＡＴＣＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６１）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＡＣＴＴＧＡＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６２）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＧＣＴＴＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６３）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６４）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＴＡＣＣＴＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６５）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６６）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧＧＡＧＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６７）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＧＣＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６８）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＣＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号６９）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＣＡＴＡＧＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７０）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＣＧＡＴＣＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７１）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＴＧＣＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７２）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＴＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７３）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ１９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７４）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７５）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２１－ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＡＣＧＣＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７６）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７７）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７８）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＣＴＴＣＧＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号７９）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＣＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８０）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＴＡＴＧＣＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８１）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２７ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＡＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８２）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２８ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧＣＴＣＡＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８３）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ２９ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８４）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３０ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＴＣＡＧＡＴＴＣＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８５）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３１ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＡＣＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８６）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３２ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８７）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３３ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＧＧＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８７）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３４ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＴＡＡＣＣＧＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号８９）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３５ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号９０）。
１８Ｓ－ｒＲＮＡ－ＢＣ３６ － ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＮＮＮＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ（配列番号９１）。
１８Ｓ ｒＲＮＡ用ＲＴプライマー２ － ＧＡＴＴＴＧＴＣＴＧＧＴＴＡＡＴＴＣＣＧＡＴＡＡＣＧ（配列番号９２）。
Ｎ遺伝子用ＲＴプライマー２ － ＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡ（配列番号９３）。図２中のＲＴプライマー２は、Ｎ遺伝子用ＲＴプライマー２を指す。
１８Ｓ ｒＲＮＡ用ＦＰ１ － ＣＡＡＴＡＡＣＡＧＧＴＣＴＧＴＧＡＴＧＣＣＣＴ（配列番号９４）。
１８Ｓ ｒＲＮＡ用ＦＰ２ － ＴＧＣＡＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＡＣＧＡＧ（配列番号９５）。
Ｎ遺伝子用ＦＰ１ － ＡＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＧＡＴＧＡＣＡ（配列番号９７）。図２中のＦＰ１は、Ｎ遺伝子用ＦＰ１を指す。
Ｎ遺伝子用ＦＰ２ － ＣＴＧＡＡＴＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧＡＣＧＣＡＴＡＣ（配列番号９８）。図２中のＦＰ２は、Ｎ遺伝子用ＦＰ２を指す。
ＲＰ － ＣＣＧＡＴＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（配列番号９９）。図２中のＲＰは、Ｎ遺伝子用ＲＰを指す。
ＩＶＴ－ＰＣＲ－ＦＰ － ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴ（配列番号１００）。
ＩＶＴ－ＰＣＲ－ＲＰ － ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ（配列番号１０１）。
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］
パーティーバルーン
本発明の第１３の実施形態において、ヒトの呼気からのＲＮＡウイルス粒子は、－２０℃で１時間インキュベーションした後、膨張したパーティーバルーンの内面から容易に沈殿した。この液体では、ＲＴ－ＰＣＲにより、ＲＮＡを抽出することなく、ｒＲＮＡを容易に検出できる。この収集手法は簡単であった。
パーティーバルーン
本発明の第１３の実施形態において、ヒトの呼気からのＲＮＡウイルス粒子は、－２０℃で１時間インキュベーションした後、膨張したパーティーバルーンの内面から容易に沈殿した。この液体では、ＲＴ－ＰＣＲにより、ＲＮＡを抽出することなく、ｒＲＮＡを容易に検出できる。この収集手法は簡単であった。
［実施例２］
デバイスの臨床試験
この実施例は、サンプル収集のデバイスおよび方法の有効性のテストを示す。
デバイスの臨床試験
この実施例は、サンプル収集のデバイスおよび方法の有効性のテストを示す。
本発明者らは、従来的な方法でサンプリングされたＲＮＡと同じ効率で、息から１８Ｓ ｒＲＮＡをコピー可能なプロトタイプの開発に成功した。このＢｕｂｂｌｅｒ（商標）デバイスをテストする臨床試験において、本発明者らは：（Ａ）診断目的ではなく、比較のために、従来の鼻咽頭スワブ検査と並行してＢｕｂｂｌｅｒ（商標）を適用し；また、（Ｂ）標準的な分子生物学的診断法（ウェスタン、ＰＣＲ、配列決定）を使用して、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）患者分離物の特徴付けを行った。肺上皮マーカー、唾液汚染の可能性、およびウイルスＲＮＡについて、収集されたサンプルを評価し、アンプリコンの設計を改善するために、最も豊富なウイルス領域を決定した。
この集団に対する標準治療のテストは、ＮＰ－ＰＣＲベースのアッセイであり、患者は治験検査に加えてこれを受け、比較のためのゴールドスタンダードとして使用した。
患者には、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）テスト以外の費用を支払う責任があり、これには、来診時に行われる標準治療のＮＰ－ＰＣＲテスト、および来診に関連するその他の料金が含まれる。
［実施例３］
デバイスの臨床試験の患者集団
臨床試験は、ロードアイランド病院（ＲＩＨ）とミリアム病院で行われた。
デバイスの臨床試験の患者集団
臨床試験は、ロードアイランド病院（ＲＩＨ）とミリアム病院で行われた。
包含基準：未診断のＣＯＶＩＤ感染と一致する症状を呈した１８歳以上の患者を臨床試験のためにリクルートした。これらの患者は、既に標準治療の鼻咽頭スワブを受けており、その結果を待っているか、または既に陽性の結果を受け取っていた。
除外基準：ＣＯＶＩＤ感染によって悪化した喘息またはＣＯＰＤを有する患者は、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）への呼気を維持できなかったため、臨床試験から除外した。口に火傷または外傷を負った患者も除外された。同意への署名を提供できない患者は除外された。
試験プロトコル：最初に、臨床試験への参加について、患者をスクリーニングした。次に、１人の試験参加者に対して別の見本的なデバイスを呼吸中に使用して、患者にＢｕｂｂｌｅｒ（商標）を使用する方法を示した。このデモンストレーションは、偶発的な吸入など、何を避けるべきかを患者に示した。患者がＢｕｂｂｌｅｒ（商標）を使用しているところを観察した。臨床試験への参加時に、患者には、分析後にサンプルの残りを保管できるように、標本バンクフォームに署名する機会が提供された。病院の記録を用いて、人口統計、病歴および身体検査情報、バイタルサイン、検査所見、入院期間、死亡率、感染関連の診断と介入の結果、ならびにパルスオキシメーターの測定値を記録することにより、患者の経過をフォローした。
特にサンプルが保存され、バッチで実行されたため、臨床試験は、全ての検査の結果について盲検化された。
標準化された治療：その時点で同意した患者と臨床試験について話し合った。この臨床試験は、前向き観察試験であった。この臨床試験からのデータは、治療の提供時には患者の提供元には利用可能でなく、患者の治療または処置を左右するために使用されることはなかった。
第一義的転帰：本発明者らは、従来の鼻咽頭スワブ検査と並行して、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）デバイスを試験した。この検査は比較目的であり、診断目的ではなかった。
本発明者らは、生物医学分野の当業者に知られている標準的な分子生物学的診断法（ウエスタン分析、ＰＣＲ、配列決定）を使用して、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）患者分離物を特徴付けた。肺上皮マーカー、唾液汚染の可能性、およびウイルスＲＮＡについて、収集されたサンプルを評価し、アンプリコンの設計を改善するために、最も豊富なウイルス領域を決定した。
統計分析：登録の時点で一部の患者は陰性と判定されており、これはアッセイの特異度と感度を決定する上で重要である。標準的なＮＰ－ＰＣＲベースのアッセイを、この臨床試験のゴールドスタンダード比較として使用した。ＮＰ－ＰＣＲベースのアッセイにもいくつかの制限があるため、ＮＰ－ＰＣＲベースのアッセイが陰性であることが疑問視される場合、最終的に結果を評価するために吐き出されたＲＮＡ粒子を保持するための患者のバイオバンキングへの同意が重要であった。
この臨床試験は、重病で入院した患者の綿密なフォローアップは要求しなかった。無症候性の患者は、標準的なＮＰ－ＰＣＲまたはＢｕｂｂｌｅｒ（商標）ＲＴ－ＰＣＲで陽性と判定されるのに十分な量のＣＯＶＩＤ－１９ウイルス負荷をまだ生じていない可能性がある。
ヒト対象の保護：本臨床試験は、呼気とウイルス粒子の捕捉によるＣＯＶＩＤの検出におけるＰＯＣを実証することを意図していた。患者の唇は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより製造された清潔で未使用の既製品のガラス製ピペットとしか接触しなかった。
リスクおよびベネフィット：この臨床試験における患者へのリスクは最小限であった。１５ｍｌの遠心チューブの底にあるキャノーラ油（体積で９０％）および逆転写酵素試薬（１０％ｖ／ｖ）の量は０．６ｍｌであった。遠心チューブ内のパスツールピペットのデッドスペース容量は２．４ｍｌであった。
臨床試験で使用したデバイスは、無菌構築プロトコルを使用して製造されたものであり、使用するまで無菌に保たれ、患者の汚染のリスクはほとんど呈さない。本デバイスは、手袋をはめた人員によって組み立てられ、７０％エタノールを噴霧し、紫外線（ＵＶ）フード内で一晩乾燥させた。エマルジョンは、無菌プロトコル下で使用前に添加される。
参加している患者が誤って液体を吸い込む可能性はほとんどなかった。このリスクは、最初に別の見本的なデバイスを使用する方法を患者に示すことによって、さらに最小限に抑えられた。呼吸中の安全な使用を確保するために、患者のデバイスの使用を観察した。歴史的に使用されてきたガラス製パスツールピペットは、過去にはマウスピペッティングで使用されていた。全体として、このプロトコルでのサンプル収集介入のリスクは最小限である。
データの安全性の監視：機密性に対するリスクから保護するために、カルテからの情報収集は救急医と訓練を受けた研究コーディネーターによって行われた。データの安全性を確保するために、データは患者番号ごとにＭＳ－Ｅｘｃｅｌワークシートに入力した。これらのワークシートは、救急部門の研究室にあるパスワードで保護されたコンピューターに保存した。臨床スタッフは、患者の同意書のコピー、緊急記録、および病院記録を施錠されたキャビネット中に保管した。
登録された各患者について収集されたデータは、名前、性別、年齢、医療記録番号、アカウント識別子、生年月日、入院日、関連する入院条件、血行動態、治療的介入、診断（例えば、培養結果、Ｘ線検査結果、血液分析、病理要約）、処置状況および入院日／曜日を含んでいた。これらのデータは、ＣＯＶＩＤ関連感染の診断を検証し、病気の重症度をスコアリングして、人口統計学的に適切な管理が必要な場合には、それを構築することができるであろう。繰り返しになるが、各患者に関する全ての識別情報は、臨床試験サンプルとは別に保管した。分析に使用したデータは、患者名、ＭＲ番号、アカウント識別子、生年月日、入院日、処置日は含んでいなかった。これらとその他の標準的な機密性およびデータの安全性のプロトコルを順守しているため、機密性が破られる可能性は最小限に抑えられていた。
［実施例４］
患者受け入れフォームの例（一部）
対象ＩＤ番号＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
到着日（月／日／年）：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
到着時刻（２４時間形式）：＿＿＿＿＿＿＿：＿＿＿＿＿＿＿＿
医療記録番号：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
併存疾患（該当するもの全てにチェックしてください）
□ 肥満
□ 高血圧
□ 高脂血症
□ 糖尿病
□ 喘息
□ 慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
□ 冠動脈疾患
□ 心筋梗塞
□ 心不全
□ 脳血管疾患
□ 慢性腎臓疾患
□ がん － 具体的に記入してください＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
初期バイタルサイン：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
バイタルサインの評価日（月／日／年）：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
バイタルサインの評価時間（２４時間形式）：＿＿＿＿＿＿＿：＿＿＿＿＿＿＿
体温：＿＿＿＿＿．＿＿＿＿＿°Ｆ
脈拍数：＿＿＿＿＿＿＿拍動／分
血圧：＿＿＿＿＿＿＿／＿＿＿＿＿＿＿ｍｍＨｇ
酸素飽和度：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿％
呼吸数：毎分＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿呼吸
ＳＯＦＡスコア：（カテゴリーごとに１つのボックスに丸を付けてください）
患者受け入れフォームの例（一部）
対象ＩＤ番号＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
到着日（月／日／年）：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
到着時刻（２４時間形式）：＿＿＿＿＿＿＿：＿＿＿＿＿＿＿＿
医療記録番号：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
併存疾患（該当するもの全てにチェックしてください）
□ 肥満
□ 高血圧
□ 高脂血症
□ 糖尿病
□ 喘息
□ 慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
□ 冠動脈疾患
□ 心筋梗塞
□ 心不全
□ 脳血管疾患
□ 慢性腎臓疾患
□ がん － 具体的に記入してください＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
初期バイタルサイン：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
バイタルサインの評価日（月／日／年）：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
バイタルサインの評価時間（２４時間形式）：＿＿＿＿＿＿＿：＿＿＿＿＿＿＿
体温：＿＿＿＿＿．＿＿＿＿＿°Ｆ
脈拍数：＿＿＿＿＿＿＿拍動／分
血圧：＿＿＿＿＿＿＿／＿＿＿＿＿＿＿ｍｍＨｇ
酸素飽和度：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿％
呼吸数：毎分＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿呼吸
ＳＯＦＡスコア：（カテゴリーごとに１つのボックスに丸を付けてください）
合計スコア：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
採血
採血日（月／日／年）：＿＿＿＿＿
採血時間（２４時間形式）：＿＿＿＿＿：＿＿＿＿＿＿
注：全ての検査結果のコピーを、最低限、以下を含めて印刷し、添付してください：
□ 全血球数（ＣＢＣ）
□ 化学分析（Ｃｈｅｍ ７）
□ 肝機能パネル
□ 血液培養
□ ＣＯＶＩＤ血清学的分析
□ ＣＯＶＩＤ ＰＣＲ
Ｘ線撮影結果：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
注：参加者の胸部Ｘ線読影のコピーを印刷して添付してください。
採血
採血日（月／日／年）：＿＿＿＿＿
採血時間（２４時間形式）：＿＿＿＿＿：＿＿＿＿＿＿
注：全ての検査結果のコピーを、最低限、以下を含めて印刷し、添付してください：
□ 全血球数（ＣＢＣ）
□ 化学分析（Ｃｈｅｍ ７）
□ 肝機能パネル
□ 血液培養
□ ＣＯＶＩＤ血清学的分析
□ ＣＯＶＩＤ ＰＣＲ
Ｘ線撮影結果：＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
注：参加者の胸部Ｘ線読影のコピーを印刷して添付してください。
入院の場合は、滞在期間を記録してください（月／日／年 － 月／日／年）。
［実施例５］
ＲＮＡ抽出を行わない呼気または口腔サンプルからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの効率的な増幅。
ＲＮＡ抽出を行わない呼気または口腔サンプルからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの効率的な増幅。
本発明者らは、アッセイを簡素化し、テスト区画を広げることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を改善した。次に、本発明者らは、気道の３点からＣＯＶＩＤをサンプリングする臨床試験を設計した。唾液／舌スクレイプによる口腔サンプル、または呼気を従来の鼻咽頭スワブと比較した。アッセイを単純化するために、本発明者らは、サンプルを安定化する必要をなくし、自宅でアッセイを行うことを可能にする、ＲＮＡ抽出なしでサンプルに対して直接逆転写を行うことの実現性を調査した。本発明者らは、呼気中のエアロゾル化粒子を直接サンプリングするＢｕｂｂｌｅｒ（商標）と呼ばれる呼気分析器の設計と検査について説明する。
結果。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は主に鼻咽頭スワブによって上気道でサンプリングされるが、ほとんどの死亡は下気道の関与によって生じる。伝染のリスクは呼気飛沫中のウイルス量の関数であるため、呼気中のウイルス量をアッセイすることには強い議論がある。ヒトの呼気中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡをアッセイするために、本発明者らは、サンプル収集の現場でＲＮＡをＤＮＡに逆転写するハンドヘルド型の呼気分析器を開発した。
Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）は、改良された代替的な捕獲デバイスとして開発された。臨床試験で使用されたプロトタイプは、呼気を油／ＲＴ混合エマルションを通してバブリングできるようにするガラス製ストローを備えた、改良された１５ｍｌのファルコンチューブであった。図１（Ｃ）および図６を参照されたい。
前臨床試験は、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）サンプルのＲＴ－ＰＣＲ効率が培養細胞から抽出されたＲＮＡと同レベルであることを実証した。従来的な方法で抽出されたＲＮＡから検出できるよりも、１回の呼吸（１０秒未満）から、より多くのｒＲＮＡを検出できた。
第１４の実施形態において、本発明者らは、デバイスを最適化し、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）を小型化でき、ＲＴ反応混合物がキット中で少なくとも２週間安定であることを実証した。図５を参照されたい。
本発明者らは、ロードアイランド病院の救急部門で遭遇した患者に対してＢｕｂｂｌｅｒ（商標）を試験した。この臨床試験は、（ａ）呼気の診断の可能性、および（ｂ）収集の現場での逆転写の実行可能性を明示的にテストすること意図していた。収集の現場で逆転写を実行することは、安定化およびＲＮＡ抽出ステップを排除し、プロトコルを簡素化する。キットは、１つのＢｕｂｂｌｅｒ（商標）と対照として２つの唾液／舌スクレイプサンプルを含むように構築された。Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）から収集されたサンプルを対照と比較するために、いくつかの実験を行った。興味深いことに、舌スクレイプから収集されたサンプルはＡＣＥ２受容体の発現について陽性であったが、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）と舌スクレイプは別の区画からＲＮＡをサンプリングしたことを示唆し、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）サンプルでは、ＡＣＥ２シグナルは検出されなかった。図６を参照されたい。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＢｕｂｂｌｅｒ（商標）から検出できるかどうかを判断するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを増幅するＲＴ－ＰＣＲアッセイを市販の陽性対照に対して最適化した。最適化は、ＣＤＣプライマーＮ１およびＮ２と同様な感度で機能するＲＴおよびＰＣＲプライマーをもたらした。図２を参照されたい。ハウスキーピング遺伝子のＲＮａｓｅ Ｐの増幅をサンプル対照として使用した。逆転写酵素反応混合物をＢｕｂｂｌｅｒ（商標）とサンプルチューブに加え、ロードアイランド病院での治療中に同意した登録患者に用いられる検査キットにパッケージ化した。合計７０人の患者が約７か月間にわたって検査された。図３を参照されたい。各患者は、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）と舌スクレイプをテストするための試験への登録を提案され、標準的な救急部門の評価プロトコルの一部は、病院のスワブＰＣＲテスト（Ｈ－ＰＣＲ）を含んでいたため、これらの結果は比較に利用可能であった。３つのテストの陽性率は全て、ＣＤＣの全州的な検査データと一致していた。図３を参照されたい。ラボベースの舌スクレイプＰＣＲ（Ｌ－ＰＣＲ）とＢｕｂｂｌｅｒ（商標）ベースのＰＣＲ（Ｂ－ＰＣＲ）の両方が、おそらく最適化されたＰＣＲの効率が向上したために、Ｈ－ＰＣＲよりも多くの陽性サンプルを返した。
臨床試験で展開された３つのテスト間の比較を要約するために、二値分類検定を計算した。表１を参照されたい。Ｈ－ＰＣＲテストは、Ｌ－ＰＣＲテストと比較して０．６５の陽性適中率（ＰＰＶ）を示し、Ｈ－ＰＣＲとＬ－ＰＣＲからの結果は、有意に異なっていた（マクネマー検定、ｐ＝０．０２）。Ｈ－ＰＣＲは、異常な胸部Ｘ線（ＸＲ陽性）に対して０．９５のＰＰＶを示した。Ｈ－ＰＣＲは、確認された陽性のＢｕｂｂｌｅｒ（商標）テストで０．６９のＰＰＶを示した。確認された陽性のＢｕｂｂｌｅｒ（商標）テストは、陽性のＸＲに対して０．９４のＰＰＶを示した。全体として、Ｌ－ＰＣＲで確認されたＢｕｂｂｌｅｒ（商標）の結果は、Ｈ－ＰＣＲの陽性結果と同等に陽性のＸＲの強力な予測を示した。しかしながら、順位付け予測推定では、Ｂ－ＰＣＲはＨ－ＰＣＲの結果よりも陽性のＸＲ所見に対してより強力な予測を示した（Ｚ＝１．９８；ｐ＝０．０２）。
未知のエラー率の複数のアッセイを比較することは、明確に定義された真の陽性の欠如によって制限されるが、例えば、Ｘ線で可視化された肺炎など、下気道の関与の証拠を伴うＣＯＶＩＤ－１９症例に対するＢｕｂｂｌｅｒ（商標）の増加した予測力は、インフルエンザの区画化を連想させる。これらの結果は、下気道をサンプリングするための気管支肺胞洗浄の魅力的な代替手段として、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）を位置づける。
鼻咽頭スワブと舌スクレイプに対するＢｕｂｂｌｅｒ（商標）のベンチマークでは、これらのサンプルに対して実行されたＰＣＲが、例えば、ウイルス粒子のゲノム；溶解された細胞中のウイルス転写産物など、異なる文脈において同じアンプリコンを測定している可能性を考慮しなければならない。Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）によって収集されたサンプルをよりよく特徴付けるために、７０人の患者から収集された呼気中の細胞ＲＮＡの組成を再分析した。ＲＮａｓｅ Ｐのレベルは、呼気中の細胞ＲＮＡとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの比率を、従来的な方法で収集されたサンプルに対して比較するための代用値であった。ＲＮａｓｅ Ｐは全ての細胞で発現していると予想されるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡはおそらく空気媒介性ウイルス粒子と溶解された細胞から放出された物質に局在している。この実施例で得られたデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＣＴスコアとＲＮａｓｅ Ｐの比率が舌スクレイプで観察されたものよりも３倍以上高かったため、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）サンプルがウイルス粒子により重きを置くものであることを示した。
収集チューブ中で逆転写を実行する利点は、ハイスループットな検査スキームでバーコード化ｃＤＮＡを使用することであった。図７（Ａ）。各ＲＴプライマーはＲＮＡの１つの領域を標的とするが、５’末端にある追加の配列によっても機能する。この配列は、シグナルを増幅するためのＴ７プロモーター、６ヌクレオチドのサンプルバーコード、および増幅で生じる複製から固有のＲＴイベントを区別するための３ヌクレオチドのランダムタグから成っていた。このアッセイの検出限界をテストするために、バーコード化プライマーを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５倍希釈液１０個と水ベースのブランク２個を三重にテストした。サンプルを逆転写し、プールし、２ステップのネステッドＰＣＲストラテジーに付した。図７（Ｂ）を参照されたい。その結果得られたアンプリコンを配列決定した後、バーコードをカウントし、個々の増幅イベントに関連付けた。バーコードカウントは、レプリケート全体で、予想される数と大いに相関していた。相関は、３３４ゲノムコピーの検出限界に対応する５番目の系列希釈で失われた。
議論。呼気分析器からの凝縮物の分析を通して、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がヒトの呼気において容易に検出可能であると結論付けている。ウイルスＲＮＡは、口腔サンプルと比較してヒトの呼気でより濃縮されている一方、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を複製できる細胞からの内容物は唾液中に存在するが、ヒトの呼気には存在しない。この所見は、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）で検出されたウイルスシグナルがウイルス粒子に由来することを示唆している。空気媒介性のウイルス粒子をサンプリングすることの重要性は、他の技術に対するＢｕｂｂｌｅｒ（商標）の重要な利点である。Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）は進行中の感染を測定できるが、他の技術は進行中の感染と回復した以前のイベントとを区別できない。Ｘ線での異常は、以前の感染で引き起こされたダメージに起因する可能性があり、ＣＤＣの隔離ガイドラインである３か月は、過去に感染した患者のウイルスシグナルが長期化するという所見を反映したものである。患者がもはや感染していなくとも、細胞内に存在するウイルス断片のために、これらの状況を偽陽性として分類することは困難である。しかしながら、本発明者らは、以前に感染した患者のうち、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）で陰性、舌スクレイプで陽性という一貫性のない症例を見出した。
異常なＸ線結果の予測においてＢｕｂｂｌｅｒ（商標）が病院のアッセイと一致することに加えて、これらの結果は、Ｂｕｂｂｌｅｒ（商標）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが濃縮された区画をサンプリングすることを示しており、鼻咽頭スワブよりも現在の感染のより良い指標となる可能性が高い。
米国疾病対策センター（ＣＤＣ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の初期診断検査に上気道検体を推奨している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のための最高のウイルス量が得られるものの、エアロゾル化の可能性があるため、喀痰吸引によるサンプル収集は推奨されない。ＣＯＶＩＤ－１９肺炎が疑われる患者からの下気道サンプルの収集は、上気道サンプルが陰性の場合にのみ推奨されている。米国国立衛生研究所のコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）治療ガイドラインを参照されたい。
上気道検体の最も一般的な検査は、鼻咽頭スワブである。しかしながら、鼻咽頭スワブは非常に不快であり（例えば、ある患者は従来的なスワブを拒否した）、患者はしばしば処置中に咳、くしゃみ、または吐き気を催すため、鼻咽頭スワブもエアロゾル化のリスクを有する。Ｂｕｂｂｌｅｒ（登録商標）などの代替的なアッセイは、上気道サンプルの安全性とともに下気道サンプルを評価する。さらに、鼻咽頭スワブの代替法を見つけることで、スワブと輸送媒体のサプライチェーンを軽減し、エアロゾル化中の個人保護具の必要性を減らし、より快適な患者体験を提供できる。
この実施例の結果は、バーコード化がどのようにして、従来の検査の何分の一かのコストでハイスループットなＲＮＡウイルス検査を可能にできるかを示している。並列化によるコストの節約と時間の節約に加えて、配列決定による診断は株の同定を可能とし、これは、伝染性と株特異的な治療決定の可能性について、より多くの情報が得られることから有用である。
実施形態のリスト
大規模並列ＲＮＡウイルス診断アッセイの具体的な組成物および方法が提示されている。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義されるべきである。生物医学分野の当業者は、全ての請求項の用語を、開示の文脈および精神に一致する可能な限り広い様式で解釈するものとする。本明細書における詳細な説明は、例示的なものであり、限定的または網羅的なものではない。本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されるものではなく、実際には変動し得る。本明細書または特許請求の範囲が、順序付けられたステップまたは機能を記載している場合、代替的な実施形態は、それらの機能を異なる順序で、または実質的に同時に実行しうる。生物医学分野の当業者が認識するように、本明細書に記載された発明の概念から逸脱することなく、既に記載されたもの以外の他の同等物および改変が可能である。
大規模並列ＲＮＡウイルス診断アッセイの具体的な組成物および方法が提示されている。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ定義されるべきである。生物医学分野の当業者は、全ての請求項の用語を、開示の文脈および精神に一致する可能な限り広い様式で解釈するものとする。本明細書における詳細な説明は、例示的なものであり、限定的または網羅的なものではない。本発明は、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されるものではなく、実際には変動し得る。本明細書または特許請求の範囲が、順序付けられたステップまたは機能を記載している場合、代替的な実施形態は、それらの機能を異なる順序で、または実質的に同時に実行しうる。生物医学分野の当業者が認識するように、本明細書に記載された発明の概念から逸脱することなく、既に記載されたもの以外の他の同等物および改変が可能である。
本明細書を通して引用される全ての特許および刊行物は、本明細書に記載される技術とともに使用される材料および方法を開示および説明するために、参照により組み込まれる。特許および刊行物は、本明細書の出願日以前におけるそれらの開示のみのために提供されている。特許および刊行物の開示および発行日に関する全ての記述は、本発明者らの情報および信念に基づいている。本発明者らは、これらの文書の内容または日付の正確性について自認するものではない。本明細書に記載された日付と実際の発行日に相違がある場合は、実際の発行日付が優先されるものとする。本発明者らは、先の発明または別の理由のために、そのような開示に実際より前の日付をつける可能性がある。以前の特許または刊行物の科学的または技術的教示と本明細書との間に矛盾がある場合には、本明細書およびこれらの請求項の教示が支配するものとする。
本明細書に数値の範囲が記載されている場合、その範囲の上限と下限の間に介在する各数値は、文脈上他に指示されない限り、数値の範囲内にある。
参考文献
生物医学分野の当業者は、本発明を作成および使用する際に、これらの科学的参考文献を予測可能な結果へのガイダンスとして使用することができる。
生物医学分野の当業者は、本発明を作成および使用する際に、これらの科学的参考文献を予測可能な結果へのガイダンスとして使用することができる。
非特許文献
Duguid, The size and the duration of air-carriage of respiratory droplets and droplet-nuclei. The Journal of Hygiene 44, 471-479 (1946). Early research from different types of exhaled breath (e.g. sneezing, coughing and talking loudly) has demonstrated a wide range of droplet sizes that persist in the air .
Asadi et al., Aerosol emission and superemission during human speech increase with voice loudness. Scientific Reports 9, 2348 (2019). Research from different types of exhaled breath (e.g. sneezing, coughing and talking loudly) has demonstrated a wide range of droplet sizes that persist in the air.
Pasomsub et al., Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study. Clin. Microbiol. Infect. 27, 285 (2021). Testing strategies for active or prior infection rely on detection of viral RNA or antibodies to the virus. Collection is usually performed in the upper respiratory tract by saliva or nasopharyngeal swab, which have comparable sensitivities (97% agreement).
Wolfel et al., Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature 581, 465-469 (2020). While samples contain active coronavirus, a recent study suggested influenza was compartmentalized.
Yan et al., Infectious virus in exhaled breath of symptomatic seasonal influenza cases from a college community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 115, 1081-1086 (2018). While samples contain active coronavirus, a recent study suggested influenza was compartmentalized.
Charlson et al., Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am. J. Respir. Crit. Care Med. (184), 957-963 (2011). Prior studies failed to detect differences between lung microbiome and the microbiome of the upper respiratory tract.
Hermans &. Bernard, Lung epithelium-specific proteins: characteristics and potential applications as markers. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 159, 646-678 (1999). Cellular genes expressed predominantly in the lung include the family of Surfactant-associated proteins (e.g. SP-A). ACE-2 expression is found, but not restricted to the lung.
Li, Wang & Lv, Prolonged SARS-CoV-2 RNA shedding: Not a rare phenomenon. J. Med. Virol. 92, 2286-2287 (2020). An abnormal X-ray can result from damage caused during prior infections, and the CDC’s isolation guideline of three months reflected findings of prolonged viral signal in previously-infected patients.
Yu et al., Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clin. Infect. Dis. 71, 793-798 (2020). Despite yielding the highest viral loads for the detection of SARS-CoV-2, sample collection via sputum induction is not recommended due to the likelihood of aerosolization.
Tu et al., Swabs collected by patients or health care workers for SARS-CoV-2 testing. N. Engl. J. Med. 383, 494-496 (2020). Nasopharyngeal swabs carry an aerosolization risk, because they are so uncomfortable that patients often cough, sneeze or gag during the procedure.
Hossain et al., A Massively Parallel COVID-19 Diagnostic Assay for Simultaneous Testing of 19200 Patient Samples.
教科書と技術参考書
Current Protocols in Immunology (CPI) (2003). John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc. (ISBN 0471142735, 9780471142737).
Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), (2014). Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons (ISBN 047150338X, 9780471503385).
Current Protocols in Protein Science (CPPS), (2005). John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc.
Immunology (2006). Werner Luttmann, published by Elsevier.
Janeway's Immunobiology, (2014). Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, (ISBN 0815345305, 9780815345305).
Laboratory Methods in Enzymology: DNA, (2013). Jon Lorsch (ed.) Elsevier (ISBN 0124199542).
Lewin's Genes XI, (2014). published by Jones & Bartlett Publishers (ISBN-1449659055).
Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, (1995). Robert A. Meyers (ed.), published by VCH Publishers, Inc. (ISBN 1-56081-569-8).
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Michael Richard Green and Joseph Sambrook, (2012). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (ISBN 1936113414).
The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, Robert S. Porter et al. (eds.), published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908).
The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th edition (Merck Sharp & Dohme Corp., 2018).
Pharmaceutical Sciences 23rd edition (Elsevier, 2020).
Duguid, The size and the duration of air-carriage of respiratory droplets and droplet-nuclei. The Journal of Hygiene 44, 471-479 (1946). Early research from different types of exhaled breath (e.g. sneezing, coughing and talking loudly) has demonstrated a wide range of droplet sizes that persist in the air .
Asadi et al., Aerosol emission and superemission during human speech increase with voice loudness. Scientific Reports 9, 2348 (2019). Research from different types of exhaled breath (e.g. sneezing, coughing and talking loudly) has demonstrated a wide range of droplet sizes that persist in the air.
Pasomsub et al., Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study. Clin. Microbiol. Infect. 27, 285 (2021). Testing strategies for active or prior infection rely on detection of viral RNA or antibodies to the virus. Collection is usually performed in the upper respiratory tract by saliva or nasopharyngeal swab, which have comparable sensitivities (97% agreement).
Wolfel et al., Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature 581, 465-469 (2020). While samples contain active coronavirus, a recent study suggested influenza was compartmentalized.
Yan et al., Infectious virus in exhaled breath of symptomatic seasonal influenza cases from a college community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 115, 1081-1086 (2018). While samples contain active coronavirus, a recent study suggested influenza was compartmentalized.
Charlson et al., Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. Am. J. Respir. Crit. Care Med. (184), 957-963 (2011). Prior studies failed to detect differences between lung microbiome and the microbiome of the upper respiratory tract.
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Li, Wang & Lv, Prolonged SARS-CoV-2 RNA shedding: Not a rare phenomenon. J. Med. Virol. 92, 2286-2287 (2020). An abnormal X-ray can result from damage caused during prior infections, and the CDC’s isolation guideline of three months reflected findings of prolonged viral signal in previously-infected patients.
Yu et al., Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clin. Infect. Dis. 71, 793-798 (2020). Despite yielding the highest viral loads for the detection of SARS-CoV-2, sample collection via sputum induction is not recommended due to the likelihood of aerosolization.
Tu et al., Swabs collected by patients or health care workers for SARS-CoV-2 testing. N. Engl. J. Med. 383, 494-496 (2020). Nasopharyngeal swabs carry an aerosolization risk, because they are so uncomfortable that patients often cough, sneeze or gag during the procedure.
Hossain et al., A Massively Parallel COVID-19 Diagnostic Assay for Simultaneous Testing of 19200 Patient Samples.
教科書と技術参考書
Current Protocols in Immunology (CPI) (2003). John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc. (ISBN 0471142735, 9780471142737).
Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), (2014). Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons (ISBN 047150338X, 9780471503385).
Current Protocols in Protein Science (CPPS), (2005). John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc.
Immunology (2006). Werner Luttmann, published by Elsevier.
Janeway's Immunobiology, (2014). Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, (ISBN 0815345305, 9780815345305).
Laboratory Methods in Enzymology: DNA, (2013). Jon Lorsch (ed.) Elsevier (ISBN 0124199542).
Lewin's Genes XI, (2014). published by Jones & Bartlett Publishers (ISBN-1449659055).
Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, (1995). Robert A. Meyers (ed.), published by VCH Publishers, Inc. (ISBN 1-56081-569-8).
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Michael Richard Green and Joseph Sambrook, (2012). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (ISBN 1936113414).
The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, Robert S. Porter et al. (eds.), published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908).
The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th edition (Merck Sharp & Dohme Corp., 2018).
Pharmaceutical Sciences 23rd edition (Elsevier, 2020).
Claims (15)
- （１）対象が息を吹き込むことができる上部のチューブ；および
（２）デバイスの下部にあるレセプタクル；
を含むデバイスであって、
前記チューブと前記レセプタクルが、一緒に取り付けられており；
前記レセプタクルが、油／水混合物を含んでおり、ここで、前記油は逆転写酵素反応を阻害せず；
前記油／水が、逆転写酵素、逆転写酵素反応のためのプライマー、ならびに逆転写酵素反応のための試薬およびバッファーを含む、デバイス。 - 前記油／水混合物中の前記油が、キャノーラ油または鉱油である、請求項１に記載のデバイス。
- 前記レセプタクル中での逆転写が、サンプル中のＲＮＡを安定で分子的にバーコード化されたｃＤＮＡに変換する、請求項１に記載のデバイス。
- 前記安定で分子的にバーコード化されたｃＤＮＡが、下流の大規模配列決定に基づく並列診断に適合する、請求項３に記載のデバイス。
- ヒトの呼気中のＲＮＡウイルスのスクリーニングとして使用するための、請求項１に記載のデバイス。
- ヒトの呼気中のＤＮＡウイルスのスクリーニングとして使用するための、請求項１に記載のデバイス。
- ヒトの呼気中の呼吸器ウイルスのスクリーニングとして使用するための、請求項１に記載のデバイス。
- 前記呼吸器ウイルスがＣＯＶＩＤ－１９（ＳＡＲｓ－ＣｏＶ－２）である、請求項７に記載のデバイス。
- 環境中の空気媒介性ウイルスのスクリーニングとして使用するためのデバイスであって、真空ポンプが通気口に適用される、請求項１に記載のデバイス。
- 呼気中の非ウイルス性核酸の検出に使用するための、請求項１に記載のデバイス。
- 環境中のエアロゾル化されたＤＮＡの検出に使用するための、請求項１に記載のデバイス。
- ウイルスの株を同定するための配列決定に使用されるサンプルを収集するのに使用するための、請求項１に記載のデバイス。
- （１）対象が息を吹き込むことができる上部のチューブ；および
（２）デバイスの下部にあるレセプタクル；
を含むデバイスであって、
前記レセプタクルが、そこからＲＮＡウイルスが収集され得るバルーンである、デバイス。 - 空気媒介性ＳＡＲｓ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子からのＲＮＡをサンプルに特異的なバーコード化ｃＤＮＡへと逆転写する方法であって、
（１）ＣＯＶＩＤ－１９が疑われる患者から深呼吸サンプルを取得するステップ；
（２）サンプルに特異的なバーコード化プライマーを用いて、ウイルスＲＮＡをウイルスｃＤＮＡに逆転写するステップを含む、方法。 - （３）超並列アッセイによる分析のためにサンプルをプールするステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
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| US202063009165P | 2020-04-13 | 2020-04-13 | |
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| PCT/US2021/026919 WO2021207741A1 (en) | 2020-04-11 | 2021-04-12 | Rna virus diagnostic assay |
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