JP2023520562A - コロナウイルスワクチン - Google Patents

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Abstract

本開示は、コロナウイルス科若しくはSARS-CoV-2感染症の予防又は処置で利用されるポリペプチド、ワクチン及び医薬組成物に関する。本開示はまた、対象におけるコロナウイルス科若しくはSARS-CoV-2感染症を処置又は予防する方法に関する。ポリペプチド及びワクチンは、ヒト集団の対象の高い割合で免疫原性である、B細胞エピトープと、細胞傷害性及びヘルパーT細胞エピトープとを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、コロナウイルス科(Coronaviridae)ウイルス感染症の予防又は処置で利用されるポリペプチドに関する。
予備的研究は、SARS-CoV-2がSARS-Covに類似していることを示唆しており、SARS-Covについて防御免疫応答に関する以前の研究データが存在している。SARS-CoVに関する様々な報告は、体液性及び細胞性免疫応答の両方の防御的な役割を示唆している。SARS-CoVのスパイク(S)及びヌクレオカプシド(N)タンパク質に対して生じた抗体応答は、SARS-Cov感染患者に特に多く見られた。効果的ではあるが、抗体応答は、回復期のSARS-CoV患者において短命であることが見出された。対照的に、T細胞応答は、回復した患者において感染後の長期持続記憶を提供することが示されている。
有効なワクチンを作り出す上での課題の1つは、異なるヒト対象の免疫系が、感染しているウイルスによって発現される異なる抗原と相互作用する方法には大きなばらつきがあることである。本発明者らは、個々の対象の免疫応答が、単一抗原T細胞エピトープの、対象の複数のHLA対立遺伝子によって認識される能力によって予測されることを以前に示した。対象の複数のHLA対立遺伝子に拘束されるT細胞エピトープは、個々の患者のペプチド特異的T細胞応答を予測する遺伝子バイオマーカーとして作用する。これらの遺伝子バイオマーカーは、「パーソナルエピトープ」又は「PEPI」と称される。多重(multi)HLA対立遺伝子結合PEPIは、ワクチン接種された対象の単一HLA対立遺伝子に拘束されるT細胞エピトープよりも著しく速い速度でT細胞応答を誘導する。モデルヒト集団の対象に対して多重HLA対立遺伝子結合PEPIであるワクチン組成物のポリペプチド中のT細胞エピトープの同定は、臨床試験で報告された免疫応答率を予測することを示した(WO2018/158456、WO2018/158457及びWO2018/158455)。
有効なワクチンの開発における2番目の課題は、変異を通してのウイルスの継続的な進化及び感染ウイルスが不均一である潜在的可能性である。
第3の課題は、新たに出現するSARS-CoV-2コロナウイルスに対するワクチンの迅速な開発、安全性試験、及び有効性の確認の必要性、並びにその後、ワクチンを非常に大規模に製造して、集団の差し迫った需要を満たす必要性である。従来のワクチンの開発は複雑であり、困難なプロセスである。ペプチドワクチンは、死滅若しくは弱毒化病原体、不活化毒素及び組換えサブユニットから作製される従来のワクチンと比べていくつかの利点を提供する。短いポリペプチドは、迅速に合成することができ、ペプチドワクチン製造は比較的安価である。更に、宿主、例えば、リポ多糖、脂質、及び毒素に対して高い反応源性を保有する不必要な成分の封入を回避する。モンタニド(Montanide)アジュバントを含むペプチドワクチンの安全性及び免役原性は、6,000人を超える患者及び200人を超える健康なボランティアを伴う複数の臨床試験で証明されている。
ペプチドワクチンの開発戦略は、通常、人口カバレッジを世界的に最大化しようとして、HLA対立遺伝子拘束性エピトープの組み合わせの選択を目標とする。このアプローチによれば、ペプチド(エピトープ)ベースワクチンによって標的化される患者集団のカバレッジの拡大をもたらすために、異なるHLA型が、異なる民族において劇的に異なる頻度で発現されることも考慮しながら、異なるHLA結合特異性を有する多重ペプチドが選択される。例えば、SF Ahmedらは、世界人口並びに中国においてSARS-Cov-2に対して幅広いカバレッジを提供すると予想されるスクリーニングされたT細胞エピトープのセットを提案している(Ahmed et al. Viruses, 12(3). 2020)。彼らは、SARS-CoV-2に対するワクチンの開発に向けた実験的取り組みを導くために、HLA拘束性SARS-Cov由来エピトープ及び公的に利用可能なIEDB人口カバレッジツール(http://tools.iedb.org/population)を使用した。
このアプローチは、HLA多型及び異なる民族集団における頻度を考慮しようとしている。しかしながら実際には、ほとんどの場合、HLA拘束性エピトープは、HLA適合個体において免疫応答を誘導せず、臨床試験は、予想よりも低い免疫応答率をもたらしている(Slingluff CL. Cancer J 2011; 17(5): 343-50)。加えて、CD8 T細胞によって認識されるペプチドは、選択的であること、および非常に感受性が高いことの両方が示されており、1つのアミノ酸変化が、特異的エピトープを非免疫原性ペプチドに変更し得る。
他のアプローチは、mRNA又はpDNAベクター中のSタンパク質の全配列を含む(Smith TRF et al. under review 10.21203/rs.3.rs-16261/v1; Safety and Immunogenicity Study of 2019-nCoV Vaccine (mRNA-1273) for Prophylaxis SARS CoV-2 Infection, NCT04283461)。
国際公開第2018/158456号パンフレット 国際公開第2018/158457号パンフレット 国際公開第2018/158455号パンフレット
Slingluff CL. Cancer J 2011; 17(5): 343-50 Smith TRF et al. under review 10.21203/rs.3.rs-16261/v1; Safety and Immunogenicity Study of 2019-nCoV Vaccine (mRNA-1273) for Prophylaxis SARS CoV-2 Infection, NCT04283461
したがって、世界的なヒト人口の高い割合において有効であり、ウイルス抗原変異に対してロバスト（堅牢）であり、臨床評価及び製造のための必要なステップを通して迅速に進むことができるワクチンに対する緊急の必要性がある。
本発明者らは、異なる個体の免疫応答における不均一性及び感染性ウイルスの潜在的な不均一性という二重の難問に対処する、SARS-CoV-2に対するグローバルペプチドワクチンの開発に向けて努力を集中してきた。本明細書で詳述するペプチド設計の考え方は、CD4+、CD8+、及び抗体産生B細胞応答を誘導することを目的として、共有されるパーソナルエピトープ設計を、B細胞エピトープ配列の更なる選択と融合させ、重複する多重HLA結合エピトープを個体内にもたらすことである。したがって、本発明者らは、(i)全世界の集団を代表するHLA遺伝子型を有するヒト対象のモデル集団における最大のCD8+パーソナルエピトープ(PEPI);(ii)全世界の集団における最大のCD4+パーソナルエピトープ(PEPI);及び(iii)線形のB細胞エピトープを含む、現在公知のSARS-CoV-2ウイルス抗原の保存された領域の30量体ポリペプチド断片を同定した。本発明者らによって同定されたポリペプチドを含むペプチドワクチンは、ヒト集団中の驚くほど高い割合の対象において細胞傷害性T細胞、ヘルパーT細胞、及びB細胞応答を誘導すると予測される。ヒト集団における更に高い応答率及び進化しつつある不均一な感染性ウイルスに対する持続的な有効性は、本発明者らによって同定された1つより多くの抗原断片を組み合わせることによって、好ましくは異なるSARS-CoV-2構造タンパク質から本発明者らによって同定された抗原断片を組み合わせることによって達成することができる。
したがって、第1の態様では、本開示は、最大50アミノ酸長又は最大60アミノ酸長のポリペプチド又はポリペプチドのパネルであって、ポリペプチドが、配列番号1～17から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチド又はポリペプチドのパネルを提供する。
更なる態様では、本開示は、最大50アミノ酸長又は最大60アミノ酸長のポリペプチドのパネルであって、各ポリペプチドが、配列番号1～17から選択される異なるアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドのパネルを提供する。
ポリペプチドのうちの1つ以上は、コロナウイルス科、ベータ-コロナウイルス科、又はSARS-CoV-2タンパク質の断片からなり得る。ポリペプチドの各々は、異なるコロナウイルス科、ベータ-コロナウイルス科、又はSARS-CoV-2タンパク質の断片である配列番号1～17から選択されるアミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドのパネルは、以下の群:(a)配列番号1～11(SARS-CoV-2表面タンパク質の断片);(b)配列番号12～15(SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質の断片);(c)配列番号16(SARS-CoV-2膜タンパク質の断片);及び(d)配列番号17(SARS-CoV-2エンベロープタンパク質の断片)のうちの少なくとも2つ、3つ、又は4つ全てからの少なくとも1つの配列を含み得る。一部の例では、ペプチドのパネルは、各々が、配列番号1～17から選択される異なるアミノ酸配列を含む、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、又は17個の異なるポリペプチドを含み得る。一実施形態では、パネルは、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、パネルは、配列番号2、5、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、パネルは、配列番号6、及び9～17のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドのパネルは、10個のポリペプチドの各々が、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17から選択される異なるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる10個のポリペプチドを含む。別の実施形態では、ポリペプチドのパネルは、9個のポリペプチドの各々が、配列番号2、5、9、12、13、14、15、16、及び17から選択される異なるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる9個のポリペプチドを含む。別の実施形態では、ポリペプチドのパネルは、10個のポリペプチドの各々が、配列番号6、及び9～17から選択される異なるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる10個のポリペプチドを含む。
更なる態様では、本開示は、活性成分として上記のポリペプチド又はポリペプチドのパネルを有する医薬組成物又はキットを提供する。一部の例では、医薬組成物又はキットは、ポリペプチドの各々をコードするリボ核酸を含み得る。
更なる態様では、本開示は、対象にワクチンを接種する、対象に免疫療法を提供する、又は対象において免疫応答を誘導する方法であって、上記のポリペプチド、ポリペプチドのパネル、又は医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の例では、方法は、対象におけるコロナウイルス科感染症、ベータ-コロナウイルス科感染症、SARS-CoV-2感染症、又はSARS-CoV感染症、コロナウイルス科若しくはベータ-コロナウイルス科感染症、COVID-19、又は重度の急性呼吸窮迫症候群(SARS)に関連する疾患若しくは状態を処置する方法である。一部の例では、方法は、対象におけるコロナウイルス科感染症、ベータ-コロナウイルス科感染症、SARS-CoV-2、若しくはSARS-CoV感染症を防止する方法、又はコロナウイルス科若しくはベータ-コロナウイルス科感染症、若しくはCOVID-19若しくはSARSに関連する疾患若しくは状態の発生を防止する方法である。一部の例では、ポリペプチドのうちの少なくとも1つ、又は少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は各々が、対象の少なくとも2つ、又は一部の例では3つ、又は少なくとも3つのHLAクラスI対立遺伝子に拘束されることが予測されるCD8+ T細胞エピトープであるコロナウイルス科タンパク質、ベータ-コロナウイルス科タンパク質、SARS-CoV-2、又はSARS-CoVタンパク質の断片を含む。一部の例では、ポリペプチドのうちの少なくとも1つ、又は少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は各々が、対象の少なくとも2つ、又は一部の例では少なくとも3つ、又は一部の例では4つ、又は少なくとも4つのHLAクラスII対立遺伝子に拘束されることが予測されるCD4+ T細胞エピトープであるコロナウイルス科タンパク質、ベータ-コロナウイルス科タンパク質、SARS-CoV-2、又はSARS-CoVタンパク質の断片を含む。一部の例では、ポリペプチドのうちの少なくとも1つ、又は少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は各々は、線形のB細胞エピトープを含む。
更なる態様では、本開示は:
- 対象にワクチンを接種する、対象に免疫療法を提供する、若しくは対象において細胞傷害性T細胞応答を誘導する方法、又は対象におけるコロナウイルス科感染症、ベータ-コロナウイルス科感染症、SARS-CoV-2感染症、若しくはSARS-CoV感染症を処置若しくは防止する方法、又はコロナウイルス科若しくはベータ-コロナウイルス科感染症、若しくはCOVID-19若しくはSARSに関連する疾患若しくは状態の発生を処置若しくは防止する方法に使用するための上記のペプチド、ポリペプチドのパネル、又は医薬組成物であって、場合により対象が上記の通りである、ペプチド、ポリペプチドのパネル、又は医薬組成物;並びに
- 対象にワクチンを接種する、対象に免疫療法を提供する、若しくは対象において細胞傷害性T細胞応答を誘導するための医薬の製造における、又はコロナウイルス科感染症、ベータ-コロナウイルス科感染症、SARS-CoV-2感染症、若しくはSARS-CoV感染症を処置若しくは防止する方法、又は対象におけるコロナウイルス科若しくはベータ-コロナウイルス科感染症、若しくはCOVID-19若しくはSARSに関連する疾患若しくは状態の発生を処置若しくは防止する方法における、上記のポリペプチド、ポリペプチドのパネル、又は1つ以上のポリヌクレオチド、又はポリペプチド若しくはポリペプチドのパネルをコードする細胞の使用であって、場合により対象が上記の通りである使用
を提供する。
一部の例では、本明細書に記載される方法は、対象のHLAクラスI及び/又はクラスII遺伝子型を決定するステップを含み得る。
本開示を、より詳細に、限定ではなく例として、添付の図面を参照して以下に記載する。本開示を読むことにより、多くの等価の改変及び変更が当業者に明らかとなるであろう。したがって、以下に記載される本開示の例示的な実施形態は例証であって限定ではないと考えられる。記載の実施形態に対する様々な変化を、本開示の範囲から逸脱することなく行ってもよい。本明細書に引用される全ての文書は、上記又は下記であれ、その全体が参照により本明細書に明白に組み込まれる。
本開示は、そのような組合せが明らかに容認できない場合、又は明白に回避されると述べられている場合を除き、記載される態様及び好ましい特色の組合せを含む。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの」、「1つの(an)」、及び「その」は、本文が明らかにそれ以外であることを要求していない限り、複数形を含む。このように、例えば「1つのペプチド」という言及は、2つ以上のそのようなペプチドを含む。
節の見出しは、本明細書において単に便宜上であり、決して限定であると解釈してはならない。
PolyPEPI1018ワクチンによるワクチン接種時に富化ELISPOTアッセイによって測定された免疫応答である。A)患者毎にプロットされた、免疫応答があったワクチン抗原の数である。濃い灰色のソリッドバーは、ワクチン接種前と比べて減少又は変化なしであり、濃い灰色の縞模様のバーは、ワクチン接種前と比べて高められた応答であり(少なくとも2倍増加)、薄い灰色の縞模様のバーは、新たに誘導されたワクチン特異的免疫応答である。B)ワクチン接種前(黒色)、1回のワクチン接種後(濃い灰色)、2回投与後(薄い灰色)、及び3回投与後(白色)に検出されたPolyPEPI1018ワクチン特異的CD4 T細胞応答であり、C)3点の全てでデータを有していた8人の患者に対して単回のワクチン接種後に測定された、ベースライン(ワクチン接種前)及び12週を経る免疫応答の時間的経過である。各線は、1人の患者を表す(n=8)。 ワクチン特異的多機能CD8(A)及びCD4(B)T細胞応答の平均分布である(n=9、PolyPEPI1018ワクチンの単回投与後に測定された)。 患者010007のワクチン接種前(PRE)及び38週目(POST)の試料におけるIHC検出TILである。 患者の臨床応答である。A)一次治療に対して応答を有した11人の登録患者のスイマープロット(Swimmer plot)及び試験中のRECIST判定結果であり、B)OBERTO-101試験中の標的病変体積(合計)の変化を示すスパイダープロット(Spider plot)である。各データ点が、ベースライン(ワクチン接種前)で測定された病変サイズと比較され、C)単回投与群及び複数回投与群の無進行生存のカプラン・マーヤー分析である。 図４－１の続きである。 レスポンダー患者の標的病変サイズ変化である。A)ベースラインにおいて2つの標的病変を有する、単回投与を受ける患者020004であり、B)ベースラインにおいて3つの標的病変を有する、複数回投与を受ける患者010004であり、C)ベースラインにおいて1つの標的病変を有する、複数回投与を受ける患者010007であり、及びD)ベースラインにおいて1つの標的病変を有する、複数回投与を受ける患者010002である。 予測された(A～B)及び測定された(C～D)多抗原性免疫応答(AGP)が、複数回投与群(n=5)において、腫瘍体積縮小(A及びC)並びにPFS(B及びD)と相関する。 図６－１の続きである。 16の民族の約16,000人の対象において、無作為に選択されたSF Ahmedらによって提案されたエピトープワクチン及びPolyPEPI-SCoV-2ワクチンの10個のペプチドについて予測されたワクチン誘導免疫応答率(CD8)の比較である。 16の民族の約16,000人の対象において、SF Ahmedらによって選択された全59個のペプチド、又はPolyPEPI-SCoV-2ワクチンの10個のペプチドについて予測されたワクチン誘導免疫応答率(CD8)の比較である。 PolyPEPI-SCoV-2ワクチンの少なくとも2個のペプチドに対してCD4及びCD8 T細胞の両方を有する対象の比率である。16の民族の約16,000人の対象コホートにおいて予測を実行した。 無作為に選択されたSF Ahmedらによって提案されたエピトープワクチン及びPolyPEPI-SCoV-2ワクチンの10個のペプチドによって誘導された≧1～10個のワクチンエピトープに対して免疫応答を有する対象(約16,000人のコホート中)の比率である。 SF Ahmedらによって提案されたエピトープワクチンの全59個のペプチド、又はPolyPEPI-SCoV-2ワクチンの10個のペプチドによって誘導された≧1～10個のワクチンエピトープに対して免疫応答を有する対象(約16,000人のコホート中)の比率である。 民族的に多様なインシリコ(in silico)ヒトコホートにおけるSARS-CoV-2スパイク-1タンパク質のホットスポット分析である。各対象について≧3のHLA対立遺伝子結合パーソナルエピトープ(PEPI)を予測することによって、分析を実施した。左パネルの縦軸に沿った各列は、モデル集団における1人の対象を表し、一方横軸は、SARS-Cov-2のS-1タンパク質サブユニット配列を表す。縦バンドは、最も頻繁なエピトープ、すなわち、大部分の対象について支配的な免疫原性タンパク質領域(ホットスポット)又はPEPIを表す。CEU、中央ヨーロッパ;CHB、中国人;JPT、日本人;YRI、アフリカ人;Mix、混合民族の対象である。色は人に拘束されるエピトープの数を表し、薄い灰色、3;ラジウムグレイ、4;黒色、>5である。PEPIは、人の≧3の対立遺伝子に拘束されるエピトープとして定義された。右パネルは、異なる民族の対象に見出されたエピトープ/PEPIの平均数。 2つの動物モデルにおいてPolyPEPI-SCoV-2ワクチン接種によって誘発されたIFN-γ+T細胞応答である。ビヒクルのみを受けるそれぞれの対照コホートと比較した、BALB/c(A)及びヒト化(Hu-マウス)(B)マウスにおけるPolyPEPI-SCoV-2ワクチン誘導T細胞応答の倍率変化である。BALB/c(C)及びヒト化(Hu-マウス)(D)における28日目に検出された2回投与後のSARS-CoV-2タンパク質由来ワクチンペプチドに特異的なワクチン誘導T細胞応答である。試験条件:S-プールは、Sタンパク質に由来する3つのペプチドを含有し;N-プールは、Nタンパク質に由来する4つのペプチドを含有し;M及びEは、両方とも9-mer及び30-merのプールで、それぞれ、M及びEタンパク質に由来するペプチドである。結果を、同じ時点のビヒクル(モンタニドで乳化されたDMSO/水)対照群と比較した。9-mer及び30-merペプチドで刺激することによって、ex vivo ELISpotアッセイを実施した。マウスは、0日目及び14日目に、ワクチン又はビヒクルの2回の投与を受けた。各コホートは、各時点で6匹の動物から構成された。スポット形成単位(SFU)は、2*105個の脾臓細胞に与えられた非刺激のバックグラウンド補正値を表す。t検定を用いて、有意性を計算した。 PolyPEPI-SCoV-2処置は、マウスにおいてIFN-γ産生T細胞を増加させる。PolyPEPI-SCoV-2ワクチン接種されたマウスは、濃い灰色の点で示されており、薄い灰色の点で示されたビヒクル(モンタニドで乳化されたDMSO/水)対照動物と比較した。IFN-γ産生を、14日目(A、BALB/c;及びD、Hu-マウス)、21日目(B、BALB/c;及びE、Hu-マウス)、並びに28日目(C、BALB/c;及びF、Hu-マウス)でペプチドによる再刺激後に、脾臓のex vivo ELISpotによって分析した。条件1、S-プール;S2、S5、及びS9ペプチドのスパイク特異的30-merプールである。条件2、N-プール;N1、N2、N3、及びN4ペプチドの核タンパク質特異的30-merプールである。条件3、M1膜特異的30-merペプチドである。条件4、E1エンベロープ特異的30-merペプチドである。条件5、S-プール、対応する30-merのs2、s5、及びs9 HLAクラスI PEPIホットスポット断片のスパイク特異的9-merプールである。条件6、N-プール、対応する30-merのn1、n2、n3、及びn4 HLAクラスI PEPIホットスポット断片の核タンパク質特異的9-merプールである。条件7は、対応する30-merのm1膜特異的9-merのHLAクラスI PEPIホットスポット断片である。条件8は、対応する30-merのe1エンベロープ特異的9-merのHLAクラスI PEPIホットスポット断片である。条件9は、非刺激の対照である。個々のスポット形成細胞(SFC)値及び平均値が示されており、2*105個の脾臓細胞当たりのスポットを表す。1群当たりn=6のマウスを分析した。統計的分析を、マン・ホイットニー検定によって実施した。*、p<0.05;**、p<0.01である。 マウスモデルにおいてPolyPEPI-SCoV-2によるTh1の支配的な免疫応答があり、有意なTh2サイトカインの誘導がないことである。ICSアッセイを用いての、BALB/c(A)及びHu-マウスモデル(B)の両方について免疫化された群及びビヒクル対照群における、IL2、TNF-α、IFN-γ、IL-5又はIL10を産生する平均CD4+及びiCD8+T細胞である。平均値+/-SEMが示されている。CD45+細胞、CD3+T細胞、CD4+又はCD8+T細胞をゲーティングして、2*105個の細胞を分析した。平均パーセントを、CD4+及びCD8+T細胞に対する各サイトカインの4つの刺激条件(30-merのS-プール、N-プール、E1及びM1ペプチド)のバックグラウンド減算値をプールすることによって得た。 28日目でのBALB/cマウスについてのTh1/Th2バランスである。ICSアッセイを用いての、各免疫化マウス(n=6)についてのIL2、TNF-α、IFN-γ(Th1サイトカイン)及びIL10(Th2サイトカイン)を産生する平均CD4+及びCD8+T細胞である。CD45+細胞、CD3+T細胞、CD4+又はCD8+T細胞をゲーティングして、2*105個の細胞を分析した。平均パーセントを、CD4+及びCD8+T細胞に対する各サイトカインの4つの刺激条件(30-merのS-プール、N-プール、E1及びM1ペプチド)のバックグラウンド減算値をプールすることによって得た。 BALB/cマウス(A)及びHu-マウス(B)モデルの血漿から測定されたワクチン誘導IgG産生である。マウスは、0日目及び14日目に、PolyPEPI-SCoV-2ワクチン又はビヒクルの2回の投与を受けた。各コホートは6匹の動物から構成された。t検定を用いて、有意性を計算した。*、p<0.05である。 細胞内染色アッセイによってそれらのPBMCからex vivoで決定されたPolyPEPI-SCoV-2ペプチドに反応性のCOVID-19の回復期患者のT細胞によるサイトカイン産生である。(A)9-mer及び30-merペプチドを用いた刺激によって得られたCD4+及びCD8+T細胞のサイトカインプロファイルであり(n=17);(B)30-merペプチドで刺激されたワクチン特異的T細胞におけるTh1支配である。 細胞内染色アッセイによってそれらのPBMCからex vivoで決定されたPolyPEPI-SCoV-2ペプチドに反応性のCOVID-19の回復期患者のT細胞によるサイトカイン産生である。(A)9-mer及び30-merペプチドを用いた刺激によって得られたCD4+及びCD8+T細胞のサイトカインプロファイルであり(n=17);(B)30-merペプチドで刺激されたワクチン特異的T細胞におけるTh1支配である。 COVID-19回復期ドナーからのPolyPEPI-SCoV-2特異的T細胞応答である。A.ex vivo FluoroSpotアッセイによって検出された高度に特異的なワクチン由来の9-merペプチド反応性CD8+T細胞応答及び30-merペプチド反応性CD4+T細胞応答である。B.30-merペプチドプール、9-merペプチドプール、及び市販のSNMOペプチドプール活性化T細胞での富化ELISpot結果である。C.同じ名称を有する30-merペプチド(表9の太字)のそれぞれに対応する個々の9-merペプチドによって活性化されたCD8+T細胞での富化されたELISpotの結果である。dSFUは、非刺激のバックグラウンド補正された106個のPBMC当たりのスポット数として計算されたデルタスポット形成単位である。 富化ELISpotアッセイによって測定されたPolyPEPI-SCoV-2ワクチンの9-merペプチド(PEPIホットスポット)に対するCOVID-19回復期ドナーについて検出されたIFN-γ+T細胞応答である。s2、s5、及びs9は、スパイク特異的ワクチンの30-merに由来する3つのS特異的9-merペプチド配列である。nl～n4は、N特異的ワクチンの30-merに由来する4つの核タンパク質に特異的な9-merペプチド配列である。e1及びm1は、それぞれ、E又はM特異的ワクチンの30-mer(表9の太字)に由来するエンベロープ及び膜特異的9-merペプチド配列である。dSFUは、非刺激のバックグラウンド補正された106個のPBMC当たりのスポット数として計算されたデルタスポット形成単位である。各対象についての平均及び個々のデータが提示されている。PBMCは、末梢血単核細胞である。 症状開始からの時間に対するCOVID-19回復期ドナーのT細胞応答の大きさ及び幅である。富化ELISpotアッセイで検出された、回復期ドナーからのA)PolyPEPI-SCoV-2反応性T細胞応答の大きさであり、B)ワクチンペプチド反応性CD8+T細胞応答の幅である。dSFUは、非刺激のバックグラウンド補正された106個のPBMC当たりのスポット数として計算されたデルタスポット形成単位である。統計的分析は、ピアソン相関分析である。Rは、ピアソン相関係数である。 COVID-19回復期の個体におけるSARS-CoV-2特異的抗体レベルとPolyPEPI-SCoV-2特異的IFN-γ産生CD4+T細胞との間の相関である。A)PolyPEPI-SCoV-2ペプチドの30-merのプールに反応性のT細胞応答を、IgG-S1(EUROIMMUN)に対してプロットした。B)S1タンパク質由来の30-merペプチド(S2及びS5)に反応性の平均T細胞応答を、IgG-S1(EUROIMMUN)に対してプロットした。C)N1、N2、N3及びN4を含む30-merのNペプチドプールに反応性のT細胞応答を、Roche Elecsys(登録商標)アッセイを用いて測定された総IgG-Nに対してプロットした。D)PolyPEPI-SCoV-2ペプチドの30-merのプールに反応性のT細胞応答を、DiaPro IgA ELISAアッセイによって測定されたIgA抗体量に対してプロットした。相関分析をピアソン検定によって実施した。Rは、相関係数である。 様々な民族の大きな集団における予測されたグローバルなカバレッジである。A)9個のPolyPEPI-SCoV-2ワクチンペプチドのうちの少なくとも1つに対してHLAクラスI PEPIを有する対象の比率である。B)PolyPEPI-SCoV-2ワクチン中の少なくとも2つのペプチドに対してHLAクラスI及びクラスII PEPIの両方を有する対象の比率である。C)Ferrettiら(27)によって提案された、6つの選択されたHLA対立遺伝子(A*02:01、A*01:01、A*03:01、A*11:01、A*24:02、及びB*07:02)の頻度に基づいて推定された理論上のグローバルカバレッジである。 グローバルな対立遺伝子頻度を表すモデル集団における対立遺伝子頻度分布である。モデル集団におけるHLA対立遺伝子頻度は、CIWDデータベースにおける800万を超えるHLA遺伝子型の対象の対立遺伝子頻度と類似の分布を表す。CIWD 3.0: 一般的(10,000中>=1)、中間的(100,000中>=1)及び十分に報告された(>=5発生)HLAデータベース3.0(2020年公開)。Rは、ピアソン相関係数である。図20に関連する。 COVID-19回復期患者における多重自家対立遺伝子結合エピトープとCD8+T細胞応答との間の相関である。n=15のドナー(135のデータ点)における予測された多重自家HLA結合エピトープ(n=9)の同じペプチド反応性CD8+T細胞応答とのマッチングである。数は、富化FluoroSpotアッセイによって決定されたdSFUを示す。カラーコードは、特定のペプチドに結合する自家HLA対立遺伝子の予測数を指す。dSFUは、非刺激のバックグラウンド補正された106個のPBMC当たりのスポット数として計算されたデルタスポット形成単位である。 それらの完全なHLA遺伝子型に基づく、様々な民族の個体のSARS-CoV-2 S1タンパク質特異的エピトープ生成能力である。図12に関連する。S2、S5、S9、N1、N2、N3、N4、M1及びE1の各々について、左から右に向かって、バーは、それぞれ、「All」、「CEU」、「CHB」、「JPT」、「YRI」、及び「MIX」に対応する。 モデル集団(N=433)(A)及び大きな集団、N=16,000(B)における多重ペプチド応答率は、元々は、SARS-CoV-2のためにデザインされた17個の30-merペプチドからの共有されたSARS-CoVエピトープを予測した。 モデル集団(N=433)(A)及び大きな集団、N=16,000(B)における多重抗原(多重タンパク質)応答率は、元々は、SARS-CoV-2のためにデザインされた17個の30-merペプチドからの共有されたSARS-CoVエピトープを予測した。 COVID-19回復期個体における多重自家HLA対立遺伝子結合エピトープとPolyPEPI-SCoV-2特異的IFN-γ産生CD8+T細胞応答との間の相関である。(A)多重自家HLA対立遺伝子結合エピトープとT細胞応答の大きさとの間の相関である。Rsは、スピアマン係数(ピアソン相関分析でも確認される)である。(B)濃縮FluoroSpotアッセイによる、PEPIについて(≧3の自家HLAクラスI対立遺伝子への結合)及び非PEPIについて(≦3の自家HLAクラスI対立遺伝子への結合)検出されたCD8+T細胞応答の大きさである(p=0.008、t検定)。各対象についての中央値及び個々のデータが提示され、n=15である。(C)2×2分割表及びフィッシャーの正確検定を使用する変数依存関係分析である。(D)各対象についてのIFN-γ産生CD8+T細胞によるパーソナルエピトープ(PEPI)の確認である[陽性的中率(PPV)=真陽性/予測全数=37/44(84%)]。dSFUは、非刺激のバックグラウンド補正された106個のPBMC当たりのスポット数として計算されたデルタスポット形成単位である。PBMCは、末梢血単核細胞である。
配列の説明
配列番号1～17は、表6Aに記載される30merのT細胞エピトープを示す。
配列番号18～233は、本明細書に開示される様々な配列を示す。
配列番号234～267は、表15に示される配列番号1～17のペプチドをコードする対応するRNA又はDNA配列を示す。
HLA遺伝子型
HLAは、ヒトゲノムの大部分の多型遺伝子によってコードされる。各人は、3つのHLAクラスI分子(HLA-A*、HLA-B*、HLA-C*)及び4つのHLAクラスII分子(HLA-DP*、HLA-DQ*、HLA-DRB1*、HLA-DRB3*/4*/5*)に対して母方及び父方の対立遺伝子を有している。特に、各人は、同じタンパク質抗原からの異なるエピトープを提示する6つのHLAクラスIと8つのHLAクラスII分子の異なる組み合わせを発現する。
HLA分子のアミノ酸配列を表示するために使用される命名は次の通りである:遺伝子名*対立遺伝子:タンパク質番号、これは例えば、HLA-A*02:25のようになり得る。この例では、「02」は、対立遺伝子を指す。ほとんどの場合、対立遺伝子は、血清型によって定義され、これは所与の対立遺伝子のタンパク質が、血清学的アッセイで互いに反応しないことを意味する。タンパク質番号(上記例では「25」)は、タンパク質が発見されると連番で割り当てられる。新しいタンパク質番号は、異なるアミノ酸配列を有する任意のタンパク質に割り当てられる(例えば、配列中の1つのアミノ酸変化であっても、異なるタンパク質番号と考えられる)。所与の遺伝子座の核酸配列に関する更なる情報が、HLAの命名に付加されてもよい。
個体のHLAクラスI遺伝子型又はHLAクラスII遺伝子型は、個体の各クラスI又はクラスII HLAの実際のアミノ酸配列を指してもよく、又はHLA遺伝子の対立遺伝子及びタンパク質番号を最小限表示する、上述したような命名を指してもよい。HLA遺伝子型は、任意の好適な方法を使用して決定することができる。例えば、配列は、当該技術分野において既知の方法及びプロトコールを使用して、HLA遺伝子座を配列決定することを介して決定されてもよい。あるいは、個体のHLAセットが、データベースに保存され、当該技術分野において既知の方法を使用してアクセスされてもよい。
一部の対象は、同じHLA分子をコードする2つのHLA対立遺伝子を有する場合がある(例えば、ホモ接合性の場合のHLA-A*02:25に対する2つのコピー)。これらの対立遺伝子によってコードされるHLA分子は、同じT細胞エピトープの全てに結合する。本開示の目的のために、本明細書で使用される場合、「対象の少なくとも2つのHLA分子に結合すること」は、1人の対象の2つの同一のHLA対立遺伝子によってコードされるHLA分子に結合することを含む。言い換えれば、「対象の少なくとも2つのHLA分子に結合すること」等は、「対象の少なくとも2つのHLA対立遺伝子によってコードされるHLA分子に結合すること」と別途表現され得る。
ポリペプチド
本開示は、SARS-CoV-2抗原に由来し、ヒト集団の高い割合に関して免疫原性であるポリペプチドに関する。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、全長のタンパク質、タンパク質の一部、又はアミノ酸の列として特徴付けられるペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、2、又は3、又は4、又は5、又は6、又は7、又は8、又は9、又は10、又は11、又は12、又は13、又は14、又は15アミノ酸から、10、又は11、又は12、又は13、又は14、又は15、又は20、又は25、又は30、又は35、又は40、又は45、又は50、又は55、又は60アミノ酸の間を含む短いポリペプチドを指す。
用語「断片」又は「ポリペプチドの断片」は、本明細書で使用される場合、典型的に参照ポリペプチドと比較して低減された長さで、一般的な部分にわたって参照ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を含むアミノ酸の列又はアミノ酸配列を指す。本開示に従うそのような断片は、適切であれば、それが構成成分であるより大きいポリペプチドの中に含まれ得る。一部の例では、断片は、例えばポリペプチド全体、例えば9アミノ酸のペプチドが単一のT細胞エピトープである場合、ポリペプチドの全長を含み得る。一部の例では、本明細書において言及される断片は、8又は9アミノ酸から、20、又は25、又は30、又は35、又は40、又は45、又は50アミノ酸の間であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」又は「T細胞エピトープ」は、1つ以上のHLAに対して結合親和性を保有する(1つ以上のHLAに結合することができる)タンパク質抗原内に含有される連続するアミノ酸の配列を指す。エピトープは、HLA及び抗原特異的(公知の方法によって予測されるHLA-エピトープ対)であるが、対象特異的ではない。エピトープ、T細胞エピトープ、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、又はポリペプチド若しくはその断片を含む組成物は、それが特定のヒト対象においてT細胞応答(細胞傷害性T細胞応答又はヘルパーT細胞応答)を誘導することが可能である場合、その対象に関して「免疫原性」である。一部の例では、ヘルパーT細胞応答は、Th1型ヘルパーT細胞応答である。用語「T細胞応答」及び「免疫応答」は、本明細書で互換的に使用され、1つ以上のHLA-エピトープ結合対の認識後のT細胞の活性化及び/又は1つ以上のエフェクター機能の誘導を指す。一部の例では、「免疫応答」は、HLAクラスII分子が、長く持続するCTL応答及び抗体応答の両方の誘導に関係するヘルパー応答を刺激することから、抗体応答を含む。エフェクター機能は、細胞傷害性、サイトカイン産生、及び増殖を含む。本開示に従って、エピトープ、T細胞エピトープ、又はポリペプチドの断片は、それが、対象の少なくとも2つ、若しくは一部の例では少なくとも3つのクラスI、又は少なくとも2つ、若しくは一部の例では少なくとも3つ、若しくは少なくとも4つのクラスII HLAに結合することが可能である場合、特定の対象に関して免疫原性である。
「パーソナルエピトープ」(又は「PEPI」)は、特定のヒト対象の1つ以上のHLAクラスI分子に結合することが可能なT細胞エピトープであるポリペプチドの連続するアミノ酸の配列からなるポリペプチドの断片である。他の場合、「PEPI」は、特定のヒト対象の1つ以上のHLAクラスII分子に結合することが可能なT細胞エピトープであるポリペプチドの連続するアミノ酸の配列からなるポリペプチドの断片である。言い換えれば、「PEPI」は、特定の個体のHLAセットによって認識されるT細胞エピトープであり、その結果HLA及び抗原に加えて対象に対して特異的である。HLA及び抗原のみに対して特異的である「エピトープ」とは対照的に、PEPIは、異なる個体が、各々が異なるT細胞エピトープに結合する異なるHLA分子を有することから、個体に対して特異的である。
「PEPI1」は、本明細書で使用される場合、個体の1つのHLAクラスI分子(又は特定の文脈では、HLAクラスII分子)に結合することができるペプチド、又はポリペプチドの断片を指す。「PEPI1+」は、個体の1つ以上のHLAクラスI分子に結合することができるペプチド、又はポリペプチドの断片を指す。「PEPI2」は、個体の2つのHLAクラスI(又はII)分子に結合することができるペプチド又はポリペプチドの断片を指す。「PEPI2+」は、個体の2つ以上のHLAクラスI(又はII)分子に結合することができるペプチド又はポリペプチドの断片を指す。「PEPI3」は、個体の3つのHLAクラスI(又はII)分子に結合することができるペプチド又はポリペプチドの断片を指す。「PEPI3+」は、個体の3つ以上のHLAクラスI(又はII)分子に結合することができるペプチド又はポリペプチドの断片を指す。「PEPI4」は、個体の3つのHLAクラスI(又はII)分子に結合することができるペプチド又はポリペプチドの断片を指す。「PEPI4+」は、個体の3つ以上のHLAクラスI(又はII)分子に結合することができるペプチド又はポリペプチドの断片を指す。
一般的に、HLAクラスI分子によって提示されるエピトープは、約9アミノ酸長であり、HLAクラスII分子によって提示されるエピトープは、約15アミノ酸長である。しかし、本開示の目的に関して、エピトープは、エピトープがHLAに結合することが可能である限り、9アミノ酸長(HLAクラスIの場合)又は15アミノ酸長(HLAクラスIIの場合)より多くても少なくてもよい。例えば、クラスI HLAに結合することが可能であるエピトープは、7、又は8又は9アミノ酸長から9、又は10、又は11アミノ酸長の間であり得る。クラスII HLAに結合することが可能であるエピトープは、13、又は14、又は15アミノ酸長から15、又は16、又は17アミノ酸長の間であり得る。
対象の所定のHLAは、抗原提示細胞(APC)においてタンパク質抗原を処理することによって産生される有限数の異なるペプチドをT細胞に提示するに過ぎない。本明細書で使用される場合、「表示する」又は「提示する」は、HLAに関連して使用される場合、ペプチド(エピトープ)とHLAとの間の結合に言及する。この点において、ペプチドを「表示する」又は「提示する」は、ペプチドに「結合する」と同義である。
当技術分野で公知の技術を使用して、公知のHLAに結合するエピトープを決定することが可能である。同じ方法を使用して直接比較される複数のHLA-エピトープ結合対を決定する限り、任意の適した方法を使用してもよい。例えば、生化学分析を使用してもよい。同様に、所定のHLAに結合することが公知であるエピトープのリストを使用することが可能である。同様に、予測又はモデリングソフトウェアを使用してどのエピトープが所定のHLAに結合し得るかを決定することも可能である。例を表1に提供する。一部の例では、T細胞エピトープは、それが5000nM未満、2000nM未満、1000nM未満、又は500nM未満のIC50又は予測IC50を有する場合、所定のHLAに結合することが可能である。
Figure 2023520562000001
本開示のペプチドは、表面糖タンパク質、別名スパイクタンパク質、ヌクレオカプシドリンタンパク質、エンベロープタンパク質、及び膜糖タンパク質から選択される1つ以上のコロナウイルス科、ベータ-コロナウイルス科、又はSARS-CoV-2抗原の1つ以上の断片を含み得るか、又はそれからなり得る。参照配列を本明細書に提供する。
一部の例では、アミノ酸配列は、N及び/又はC末端でコロナウイルス科、ベータ-コロナウイルス科、又はSARS-CoV-2抗原の配列の一部ではなく、言い換えれば、標的ポリペプチド抗原において選択された断片に隣接して見出される連続するアミノ酸の同じ配列ではない追加のアミノ酸に隣接する。一部の例では、配列は、N及び/又はC末端で最大20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1つの追加のアミノ酸に隣接する。
本発明者らは、個体の少なくとも3つのHLAクラスIに結合することができる少なくとも2つのポリペプチド断片(エピトープ)(≧PEPI3+)ががんワクチンに存在することが、臨床応答を予測することを以前に見出した。言い換えれば、≧2 PEPI3+をワクチンの活性成分ポリペプチド内に同定することができれば、個体はおそらく臨床的レスポンダーである。
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、少なくとも2つの多重HLA結合PEPIを含むワクチン/免疫療法から臨床利益を引き出す可能性が増加する1つの理由は、疾患を有する細胞集団、例えばがん又は腫瘍細胞又はウイルス若しくは病原体例えばHIVに感染した細胞がしばしば、影響を受ける対象内及び対象間の両方で不均一であるという点であると考えている。加えて、患者は標的PEPI(複数可)の変異を通して組成物に対して耐性を発達させる可能性がより低いことから、より多くの多重HLA結合PEPIが含まれるか、又はワクチンによって標的とされる場合、耐性を発達させる可能性が減少する。
同様に、ウイルス感染症のためのワクチンの文脈では、ウイルス感染症が不均一であり得る場合、複数の対象特異的多重HLA対立遺伝子結合PEPI(例えば、公知のHLA遺伝子型を有する対象の処置のため)又は複数集団の最善のEPI、すなわち標的集団の高い割合における多重HLA対立遺伝子結合PEPIである又はそれらを含むアミノ酸配列を含むことが予測されるワクチンペプチド(複数可)を対象に投与することは有利である。より多くの最善のEPI配列を含めることはまた、処置に応答するヒト対象の全体的な割合も増加させる。したがって、一部の例では、ポリペプチドのパネルは、各々が配列番号1～17から選択される異なるアミノ酸配列を含む少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、又は17個のポリペプチドを含む。一部の例では、ポリペプチドの組合せは、以下の組合せ:配列番号1及び2;配列番号3及び4;配列番号7及び8;及び/又は配列番号9及び10のうちの1つ以上を除外し;並びに/又は以下の組合せ:配列番号2及び3;及び/又は配列番号13及び14のうちの1つ以上を除外する。
ポリペプチドは、同じ又は異なるウイルス抗原の断片であり得るか、又はそれらを含み得る。異なるウイルス構造タンパク質は、異なる速度で変異する傾向があり得る。したがって、一部の例では、各ポリペプチドは、異なるコロナウイルス科、ベータ-コロナウイルス科、又はSARS-CoV-2タンパク質の断片である配列番号1～17から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の例では、ポリペプチドのパネルは、以下の群:(a)配列番号1～11(SARS-CoV-2表面タンパク質の断片)、場合により配列番号1及び2、配列番号2及び3、配列番号3及び4、配列番号7及び8、並びに/又は配列番号9及び10の組合せを除外する;(b)配列番号12～15(SARS-CoV-2ヌクレオカプシドタンパク質の断片)、場合により配列番号13及び14の組合せを除外する;(c)配列番号16(SARS-CoV-2膜タンパク質の断片);及び(d)配列番号17(SARS-CoV-2 エンベロープタンパク質の断片)のうちの少なくとも2つ、3つ、又は4つ全てからの少なくとも1つの配列を含む。一部の例では、ポリペプチドの組合せは、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる10個のポリペプチドを含むか又はそれからなる。別の実施形態では、ポリペプチドのパネルは、配列番号2、5、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる9個のポリペプチドを含む。別の実施形態では、ポリペプチドのパネルは、配列番号6、及び9～17のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる10個のポリペプチドを含む。
ポリペプチド及び患者の選択
本明細書に記載のペプチドは、T細胞応答を誘導するために、又はそれを必要とする対象においてワクチン接種若しくは免疫療法を提供するために使用され得る。ペプチドは、対象においてコロナウイルス科感染症、ベータ-コロナウイルス科感染SARS-CoV-2感染症、SARS-CoV感染症、コロナウイルス科若しくはベータ-コロナウイルス科感染症と関連する疾患若しくは状態、COVID-19又はSARSを処置又は予防するために使用され得る。2つ以上のペプチドが、典型的には、対象の処置用に選択されるであろう。いくつかの場合には、処置に使用されるペプチド(複数可)は、(i)対象において処置される疾患又は状態;(ii)対象のHLA遺伝子型;及び/又は(iii)対象の遺伝的背景(例えば、国籍又は民族群)に基づいて選択されてもよい。
本発明に従って処置され得るコロナウイルス科感染症(及び関連疾患)は、ウイルスが配列番号1～17のいずれか1つのアミノ酸配列(又は表6Aに示した配列番号1～17内のベストEPI配列)を含む少なくとも1つの抗原を発現するいずれかを含む。典型的には、ウイルスは、共に、配列番号1～17(又はベストEPI配列)から選択される、少なくとも2つ、又はより典型的には少なくとも3、4、5、6、7、8、9若しくは10個の異なる配列を含む1つ以上の抗原を発現する。より典型的には、ウイルスは、2つ以上の異なる抗原を発現し、それらの各々が、配列番号1～17(又はベストEPI配列)から選択される配列を含む。本発明の又は本明細書に記載される本発明の医薬組成物若しくはキットの特定のコロナウイルス科の処置のために好適なポリペプチドは、特定のウイルスによって発現される抗原の断片の配列にマッチするものである。当業者は、本開示及び本明細書に提供される実施例に基づいて、そのようなポリペプチドを容易に同定及び選択することができる。
ポリペプチド抗原、及び特に、通常、ワクチン接種及び免疫療法に使用されるポリペプチド抗原に由来する短いペプチドは、ヒト対象のほんの一部でだけ免疫応答を誘導する。本開示のペプチドは、世界人口の高い比率で免疫応答を誘導するために特異的に選択される。しかしながら、HLA遺伝子型の不均一性のために、全ての個体において有効ではない場合がある。
本発明者らは、個体によって発現される複数のHLAが、一般に、T細胞応答を誘発させるために同じペプチドを提示する必要があることを発見した。したがって、特定の個体に対して免疫原性である(PEPI)と予測されるポリペプチド抗原(エピトープ)の断片は、その個体によって発現される複数のクラスI(細胞傷害性T細胞を活性化する)又はクラスII(ヘルパーT細胞を活性化する)HLAに結合することができるものである。一般に、特定のワクチンペプチドに対する対象における細胞傷害性T細胞応答は、≧1のPEPI3+(対象の3つ以上のクラスI HLA対立遺伝子に結合するエピトープ)のワクチンペプチド中の存在によって最も良く予測される。ヘルパーT細胞応答は、一般に、≧1のPEPI3+又は≧1のPEPI4+(対象の3つ以上又は4つ以上のクラスII HLA対立遺伝子に結合するエピトープ)によって最も良く予測される。
したがって、本開示は、ヒト対象が、本明細書に記載されるポリペプチド若しくは医薬組成物のパネルの投与に対するT細胞応答(細胞傷害性及び/又はヘルパー)を有することを予測する方法を提供する。本方法は、(A)(i)ポリペプチド若しくは医薬組成物の活性成分ポリペプチド(複数可)のパネルが、対象の少なくとも3つのHLAクラスI分子に拘束される（restricted）T細胞エピトープを有することを決定することと、(ii)対象が、ポリペプチド若しくは医薬組成物のパネルの投与に対して細胞傷害性(CD8+)T細胞応答を有することを予測することと;及び/又は(B)(i)ポリペプチド若しくは医薬組成物の活性成分ポリペプチド(複数可)のパネルが、対象の少なくとも3つ、又はいくつかの場合には少なくとも4つのHLAクラスII分子に拘束されるT細胞エピトープを有することを決定することと、(ii)対象が、ポリペプチド若しくは医薬組成物のパネルの投与に対してヘルパー(CD4+)T細胞応答を有することを予測することとを含み得る。
本開示はまた、特定のヒト対象が、本明細書に記載のポリペプチド若しくは医薬組成物のパネルの投与に対するT細胞応答(細胞傷害性/CD8+又はヘルパー/CD4+)を有する確率を決定する方法を提供し、本方法は、対象の少なくとも3つのHLAクラスI又は少なくとも3つ若しくは少なくとも4つのHLAクラスIIに拘束されるポリペプチド又は活性成分ポリペプチド中のT細胞エピトープを同定することを含み、(A)(a)より多数の、対象の少なくとも3つのHLAクラスIに拘束されるT細胞エピトープ、並びに/又は(b)より多数の、(I)対象の少なくとも3つのHLAクラスIに拘束され、かつ(II)異なるSARS-CoV-2構造タンパク質の断片である両方のT細胞エピトープが、対象における細胞傷害性/CD8+T細胞応答のより高い確率に相当し、及び/又は(B)(a)より多数の、対象の少なくとも3つ若しくは少なくとも4つのHLAクラスIIに拘束されるT細胞エピトープ、並びに/又は(b)より多数の、(I)対象の少なくとも3つ若しくは少なくとも4つのHLAクラスIIに拘束され、かつ(II)異なるSARS-CoV-2構造タンパク質の断片である両方のT細胞エピトープが、対象におけるヘルパー/CD4+T細胞応答のより高い確率に相当する。
いくつかの場合には、対象が細胞傷害性T細胞応答を有するか、又はペプチド若しくは医薬組成物のパネルの投与に対する細胞傷害性T細胞応答を有する確率が所定の閾値よりも高いと予想され得、医薬組成物の投与を、対象を処置する方法として選択又は推奨することを更に含み、任意選択で、ポリペプチド若しくは医薬組成物のパネルを対象に投与することによって、対象を処置することを更に含む。
本開示はまた、本明細書に記載されるように処置の方法を提供し、処置を受けている対象は、本明細書に記載の方法を使用して、ポリペプチド若しくは医薬組成物のパネルの投与に対する細胞傷害性又はヘルパーT細胞応答を有すると予測されるか、又は本明細書に記載の方法を使用して、ポリペプチド若しくは医薬組成物のパネルの投与に対する細胞傷害性T又はヘルパー細胞応答を有する確率が所定の閾値よりも高いと予測される。方法は、本明細書に記載の方法を使用して、特定の対象に対して免疫原性であると予測されるペプチドを選択することを含み得る。対象に対してそのように選択されたペプチドを活性成分として含むキットの医薬組成物は、対象にとって個別化とみなされ得る(すなわち、個別化薬)。方法は、対象に対する投与を更に含んでもよい。
本発明者らは、(i)1つ以上の標的ポリペプチド抗原の断片に対応し、かつ(ii)個体の少なくとも3つのHLAクラスI対立遺伝子に結合することができる、少なくとも2つのT細胞エピトープのワクチン又は免疫療法組成物中の存在が、臨床応答を予測することを更に発見した。本明細書で使用される場合、「臨床応答」又は「臨床的有用性」は、疾患又は状態の開始における予防若しくは遅延、1つ以上の症状の改善、寛解の誘導若しくは延長、又は再燃若しくは再発若しくは悪化の遅延、あるいは対象の疾患状態における任意の他の改善若しくは安定化であり得る。臨床応答はまた、コロナウイルス科ウイルスの異なる変異したバリアントによって引き起こされる感染症の予防であり得る。
したがって、本開示のいくつかの態様は、特定のヒト対象が、本明細書に記載される処置の方法に対して、又は本明細書に記載されるペプチド若しくは医薬組成物のパネルの投与に対して臨床応答を有すことを予測する方法、又は臨床応答の確率を決定する方法に関する。本方法は、T細胞応答を予測するための本明細書に記載されるものと類似しているが、臨床応答は、ポリペプチド若しくは医薬組成物の活性成分ポリペプチド(複数可)のパネルが、各々が対象の少なくとも3つのHLAクラスI分子に拘束される2つの異なるT細胞エピトープを含むことを決定することによって予測される。
医薬組成物、処置の方法及び投与の様式
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるペプチド、ポリ核酸、ベクター又は細胞のうちの1つ以上を含む医薬組成物又はキットに関する。そのような医薬組成物又はキットは、対象に免疫応答を誘導し、処置し、ワクチン接種し、免疫療法を提供する方法で使用するためのものであり得る。医薬組成物又はキットは、ワクチン又は免疫療法組成物又はキットであり得る。本明細書に記載の処置の方法は、医薬組成物を対象に投与することを含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「活性成分」は、免疫応答を誘導することを意図しており、対象への投与後にin vivoで産生されるワクチン又は免疫療法組成物のポリペプチド産物を含み得るポリペプチドを指す。DNA又はRNA免疫療法組成物の場合、ポリペプチドは組成物が投与される対象の細胞によってin vivoで産生され得る。細胞ベースの組成物の場合、ポリペプチドは組成物の細胞、例えば、ポリペプチドをパルスしたか又はポリペプチドをコードする発現構築物を含む自家樹状細胞若しくは抗原提示細胞によって処理及び/又は提示され得る。医薬組成物又はキットは、1つ以上の活性成分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は細胞を含んでもよい。
本明細書に記載の医薬組成物又はキットは、1つ以上のペプチドに加えて、核酸、ベクター若しくは細胞、医薬的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、緩衝液、安定剤、防腐剤、アジュバント又は当業者に周知の他の材料を含んでもよい。そのような材料は、好ましくは非毒性であり、活性成分(複数可)の医薬活性を妨害しないことが好ましい。医薬担体」又は希釈剤は、例えば、水含有溶液及び水/油エマルジョンであり得る。担体又は他の材料の正確な性質は、投与の経路、例えば、経口、静脈内、皮膚若しくは皮下、鼻腔、筋肉内、皮内、及び腹腔内経路に依存し得る。
本開示の医薬組成物は、1つ以上の「医薬的に許容される担体」を含み得る。典型的には、大きなゆっくりと代謝される高分子、例えば、タンパク質、糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、スクロース(Paoletti,2001,Vaccine,19:2118-2126)、トレハロース(WO 00/56365)、ラクトース及び脂質凝集体(例えば、油滴又はリポソーム)がある。そのような担体は当業者には周知である。医薬組成物はまた、希釈剤、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどを含有してもよい。更に、補助物質、例えば、湿潤又は乳化剤、pH緩衝物質などが存在してもよい。滅菌パイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水は、典型的な担体である(Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN:0683306472)。
本開示の医薬組成物は、凍結乾燥されても、又は水性形態、すなわち、溶液又は懸濁液であってもよい。このタイプの液体製剤は、水性媒体中の復元を必要とすることなく、組成物をそれらのパッケージ化形態から直接投与することを可能にするため、注射に理想的である。医薬組成物は、バイアル中に存在してもよく、又は充填済み注射器で提示されてもよい。注射器は、針があるか、又は針がない状態で供給され得る。注射器は、単回用量を含むが、一方バイアルは単回用量又は複数回用量を含み得る。
本開示の液体製剤はまた、他の医薬を凍結乾燥形態から復元するために好適である。医薬組成物がそのような即時復元に使用されるべき場合、本開示は、2つのバイアルを含むことができるか、又は1つの充填済み注射器と1つのバイアルとを含むことができ、注射器の内容物が注射前にバイアルの内容物を復元するために使用される、キットを提供する。
本開示の医薬組成物は、特に複数回投与様式でパッケージ化される場合、抗菌剤を含み得る。抗菌剤、例えば、2-フェノキシエタノール又はパラベン(メチル、エチル、プロピル、パラベン)が使用されてもよい。任意の防腐剤が、低レベルで存在することが好ましい。防腐剤は、外から添加されてもよく、及び/又は混合されて組成物を形成するバルク抗原の成分であってもよい(例えば、百日咳抗原中に防腐剤として存在する)。
本開示の医薬組成物は、洗浄剤、例えばTween(ポリソルベート)、DMSO(ジメチルスルホキシド)、DMF(ジメチルホルムアミド)を含んでもよい。洗浄剤は、一般に、低レベルで、例えば、<0.01%で存在するが、より高いレベルでも、例えば、0.01～50%で使用されてもよい。
本開示の医薬組成物は、溶液中にナトリウム塩(例えば、塩化ナトリウム)及び遊離リン酸イオン(例えば、リン酸緩衝液の使用によって)を含んでもよい。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、ペプチドを抗原提示細胞中に送達する、又は安定性を増加させるのいずれかのために、好適なビヒクル内に封入されてもよい。当業者には理解されるように、様々なビヒクルが本開示の医薬組成物を送達するために好適である。好適な構造化流体送達システムの非限定的な例としては、ナノ粒子、リポソーム、μエマルジョン、ミセル、デンドリマー及び他のリン脂質含有システムを挙げることができる。医薬組成物を送達ビヒクルに導入する方法は、当該技術分野において既知である。
組成物の免疫原性を増加させるために、薬理学的組成物は、1つ以上のアジュバント及び/又はサイトカインを含んでもよい。
好適なアジュントとしては、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムが挙げられるが、カルシウム、鉄若しくは亜鉛の塩であってもよく、又はアシル化チロシン、若しくはアシル化糖の不溶性懸濁液であってもよく、又はカチオン若しくはアニオン誘導体化糖類、ポリホスファゼン、生分解性マイクロスフェア、モノホスホリルリピドA(MPL)、リピドA誘導体（例えば、毒性が低減されているもの）、3-O-デアセチルMPL[3D-MPL]、クイル(quil)A、サポニン、QS21、フロイント不完全アジュバント(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)、Merckアジュバント65(Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.)、AS-2(Smith-Kline Beecham, Philadelphia, Pa.)、CpGオリゴヌクレオチド、生体接着剤及び粘膜付着剤、微小粒子、リポソーム、ポリオキシエチレンエーテル製剤、ポリオキシエチレンエステル製剤、ムラミルペプチド又はイミダゾキノロン化合物(例えば、イミキアモド及びその同族体)であり得る。本開示におけるアジュバントとして使用するために好適なヒト免疫調節剤としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12など)が挙げられ、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)、顆粒細胞、マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)もまた、アジュバントとして使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、モンタニドISA-51(Seppic, Inc., Fairfield, N.J., United States of America)、QS-21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Lexington, Mass., United States of America)、GM-CSF、シクロホスファミド、カルメット・ゲラン桿菌(bacillus Calmette-Guerin(BCG))、コリネバクテリウム・パルバム(corynbacterium parvum)、レバミソール、アジメゾン、イソプリニソン(isoprinisone)、ジニトロクロロベンゼン(DNCB)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、フロイントアジュバント(完全及び不完全)、ミネラルゲル、水酸化アルミニウム(Alum)、リゾレシチン、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、油エマルジョン、ジニトロフェノール、ジフテリア毒素(DT)からなる群から選択されるアジュバントを含む。特定の実施形態では、アジュバントはモンタニドアジュバントである。
例として、サイトカインは、形質転換増殖因子(TGF)、例えば、限定されないが、TGF-α及びTGF-β;インスリン様成長因子-I及び/又はインスリン様成長因子-II;エリスロポイエチン(EPO);骨誘導因子;インターフェロン、例えば、限定されないが、インターフェロン-α、-β、及び-γ;コロニー刺激因子(CSF)、例えば、限定されないが、マクロファージ-CSF(M-CSF);顆粒細胞-マクロファージ-CSF(GM-CSF)、及び顆粒細胞-CSF(G-CSF)からなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、サイトカインは、神経成長因子、例えばNGF-β;血小板増殖因子;形質転換増殖因子(TGF)、例えば、限定されないが、TGF-α及びTGF-β;インスリン様成長因子-I及びインスリン様成長因子-II;エリスロポイエチン(EPO);骨誘導因子;インターフェロン(IFN)、例えば、限定されないがIFN-α、IFN-β、及びIFN-γ;コロニー刺激因子(CSF)、例えばマクロファージ-CSF(M-CSF);;顆粒細胞-マクロファージ-CSF(GM-CSF)、及び顆粒細胞-CSF(G-CSF);インターロイキン(II)、例えば、限定されないが、IL-1、IL-1.アルファ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12;IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18;LIF;kit-リガンド若しくはFLT-3;アンジオスタチン;トロンボスポンジン;エンドスタチン;腫瘍壊死因子(TNF);並びにLTからなる群から選択される。
アジュバント又はサイトカインは、1回の投与当たり約0.01mg～約10mgの量で、好ましくは、1回の投与当たり約0.2mg～約5mgの量で添加され得ると予想される。あるいは、アジュバント又はサイトカインは、約0.01～50%の濃度で、好ましくは、約2%～30%の濃度であってもよい。
ある特定の態様では、本開示の医薬組成物は、アジュバント及び/又はサイトカインを本明細書に記載のペプチドと、既知の技術に従って、適切な無菌条件下で、物理的に混合して、最終製品を生成することによって調製される。
ポリペプチド断片の好適な組成物及び投与の方法の例は、Esseku and Adeyeye(2011)及びVan den Mooter G(2006)に提供されている。ワクチン及び免疫療法組成物の調製は、一般に、Vaccine Design(“The subunit and adjuvant approach"(eds Powell M.F. & Newman M.J. (1995) Plenum Press New York)に記載されている。リポソーム内の封入も想定され、これは、Fullerton、米国特許第4,235,877号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、(リボ)核酸ワクチンとして調製される。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンは、DNAワクチンである。いくつかの実施形態では、DNAワクチン、又は遺伝子ワクチンは、プロモーター及び適切な転写並びに翻訳調節因子、及び本開示の1つ以上のポリペプチドをコードする核酸配列を有するプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドはまた、例えば、発現レベル、細胞内標的化、又はプロテアソームプロセシングを増強させる配列を含む。いくつかの実施形態では、DNAワクチンは、本開示の1つ以上のポリペプチドをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを含む。追加の態様では、本明細書に開示される組成物は、生体試料と免疫反応性を有することが決定されたペプチドをコードする1つ以上の核酸を含む。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、患者の少なくとも3つのHLAクラスI分子及び/又は少なくとも3つ若しくは4つのHLAクラスII分子に結合することができるT細胞エピトープである断片を含む1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれ以上のペプチドをコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、DNA又は遺伝子ワクチンはまた、結果として生じる免疫応答、例えば、ワクチンの効力を増強させる、免疫系を刺激する又は免疫抑制を低下させることを操作するために、免疫調節分子をコードする。DNA又は遺伝子ワクチンの免疫原性を増強させるための戦略には、抗原の異種バージョンのコード化、抗原のT細胞を活性化するか若しくは関連する認識を誘発する分子への融合、DNAベクターによるプライミングとその後のウイルスベクターによるブースティング、及び免疫調節分子の利用が含まれる。いくつかの実施形態では、DNAワクチンは、数ある中でも、針、遺伝子ガン、エアロゾル注入器によって、パッチを用いて、マイクロニードルを介して、摩擦により導入される。一部の形態では、DNAワクチンは、リポソーム又はナノボディの他の形態中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、DNAワクチンは、トランスフェクション剤;プロタミン;プロタミンリポソーム;多糖粒子;カチオン性ナノエマルジョン;カチオン性ポリマー;カチオン性ポリマーリポソーム;カチオン性ナノ粒子;カチオン性脂質及びコレステロールナノ粒子;カチオン性脂質、コレステロール、及びPEGナノ粒子;デンドリマーナノ粒子からなる群から選択される送達システムを含む。いくつかの実施形態では、DNAワクチンは、吸入又は摂取によって投与される。いくつかの実施形態では、DNAワクチンは、血液、胸腺、膵臓、皮膚、筋肉、腫瘍、又は他の部位に導入される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、RNAワクチンとして調製される。いくつかの実施形態では、RNAは、非複製mRNA又はウイルス由来の自己増幅RNAである。いくつかの実施形態では、非複製mRNAは、本明細書に開示されるペプチドをコードし、5'及び3'非翻訳領域(UTR)を含有する。いくつかの実施形態では、ウイルス由来の自己増幅RNAは、本明細書に開示されるペプチドをコードするばかりでなく、細胞内RNA増幅及び大量のタンパク質発現を可能にするウイルス複製機構もコードする。いくつかの実施形態では、RNAは、個体に直接導入される。いくつかの実施形態では、RNAは、化学的に合成されるか、又はin vitroで転写される。いくつかの実施形態では、mRNAは、T7、T3、又はSp6ファージRNAポリメラーゼを使用して直鎖状DNAテンプレートから生成され、得られた産物は、本明細書に開示されるペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、隣接(flanking)UTR、5'キャップ、及びポリ(A)テールを含有する。いくつかの実施形態では、5'キャップの様々なバージョンがワクチンウイルスキャッピング酵素を使用して、又は合成キャップ若しくはアンチリバースキャップアナログ(anti-reverse cap analogues)を導入することによって、転写反応の中又はその後に付加される。いくつかの実施形態では、最適な長さのポリ(A)テールが、DNAテンプレートをコードすることから直接的に、又はポリ(A)ポリメラーゼを使用することによるのいずれかで、mRNAに付加される。RNAは、患者の少なくとも3つのHLAクラスI及び/又は少なくとも3つ若しくは4つのHLAクラスII分子に結合することができるT細胞エピトープである断片を含む1つ以上のペプチドをコードすることができる。この断片は、コロナウイルス科で発現される抗原に由来する。いくつかの実施形態では、RNAは、安定性及び翻訳を増強するためのシグナルを含む。いくつかの実施形態では、RNAはまた、半減期を増加させるための非天然のヌクレオチド又は免疫刺激プロファイルを変更するための修飾ヌクレオシドも含む。いくつかの実施形態では、RNAは、数ある中でも、針、遺伝子ガン、エアロゾル注入器によって、パッチを用いて、マイクロニードルを介して、摩擦により導入される。一部の形態では、RNAワクチンは、リポソーム又はナノボディの他の形態に組み込まれ、これは、RNAの細胞内取り込みを容易にし、それが分解することから防御する。いくつかの実施形態では、RNAワクチンは、トランスフェクション剤;プロタミン;プロタミンリポソーム;多糖粒子;カチオン性ナノエマルジョン;カチオン性ポリマー;カチオン性ポリマーリポソーム;カチオン性ナノ粒子;カチオン性脂質及びコレステロールナノ粒子;カチオン性脂質、コレステロール、及びPEGナノ粒子;デンドリマーナノ粒子;並びに/又はネイキッド(naked)mRNA; in vivoエレクトロポレーションによるネイキッドmRNA;プロタミン複合体化mRNA;正帯電水中油型カチオン性ナノエマルジョンに会合したmRNA;化学修飾デンドリマーと会合し、ポリエチレングリコール(PEG)-脂質と複合体化したmRNA;PEG-脂質ナノ粒子中のプロタミン複合体化mRNA;カチオン性ポリマー、例えば、ポリエチレンイミン(PEI)と会合したmRNA;カチオン性ポリマー、例えば、PEI及び脂質成分と会合したmRNA;多糖(例えば、キトサン)粒子又はゲルと会合したmRNA;カチオン性脂質ナノ粒子(例えば、1,2-ジオレオイルオキシ-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)脂質中のmRNA;カチオン性脂質及びコレステロールと複合体化されたmRNA;又はカチオン性脂質、コレステロール及びPEG-脂質と複合体化したmRNAからなる群から選択される送達システムを含む。いくつかの実施形態では、RNAワクチンは、吸入又は摂取によって投与される。いくつかの実施形態では、RNAは、血液、胸腺、膵臓、皮膚、筋肉、腫瘍、若しくは他の部位に、及び/又は皮内、筋肉内、皮下、鼻腔内、節内、静脈内、脾臓内、腫瘍内若しくは他の送達経路で導入される。
ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド成分は、ネイキッドヌクレオチド配列であってもよく、又はカチオン性脂質、ポリマー若しくは標的化システムと組み合わされてもよい。それらは、任意の利用可能な手法によって送達され得る。例えば、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、針注射によって、好ましくは、皮内、皮下又は筋肉内で導入され得る。あるいは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、送達デバイス、例えば、パーティクル媒介遺伝子送達(particle-mediated gene delivery)を使用して皮膚を通して直接送達されてもよい。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、皮膚に、又は粘膜表面に、例えば、鼻腔内、経口、若しくは直腸内投与によって局所投与されてもよい。
ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド構築物の取り込みは、いくつかの既知のトランスフェクション手法、例えば、トランスフェクション剤の使用を含むものによって増強され得る。これらの薬剤の例としては、カチオン性薬剤、例えば、リン酸カルシウム及びDEAE-デキストラン並びにリポフェクタント、例えば、リポフェクタム及びトランスフェクタムが挙げられる。投与されるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの投与量は、変更され得る。
したがって、本発明は、配列番号1～17から選択される1つ以上、又は少なくとも1つ(又は少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10個)のポリペプチド配列をコードする1つ以上のポリヌクレオチド(ポリ核酸)若しくはポリリボヌクレオチド(リボポリ核酸)を含むワクチン若しくは医薬組成物又はキットを提供する。ポリヌクレオチド(複数可)若しくはポリリボヌクレオチド(複数可)は、配列番号1～17から選択される1つ以上(又は2、若しくは3、4、5、6、7、8、9、若しくは10個以上)のアミノ酸配列を含む1つ以上のタンパク質を発現する、1つ以上のコロナウイルス科タンパク質、又はβ-コロナウイルス科タンパク質、SAES-Cov-2タンパク質、又はSARS-CoVタンパク質、又は任意のコロナウイルス科のタンパク質の1つ以上の断片をコードすることができる。断片は、配列番号1～17から選択される配列を含み、典型的には、最大50個のアミノ酸の長さである。ポリヌクレオチド(複数可)若しくはポリリボヌクレオチド(複数可)は、配列番号234～267から選択される配列のうちの少なくとも1つ(又は少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10個)を含み得る。典型的には、ポリヌクレオチド(複数可)若しくはポリリボヌクレオチド(複数可)は、共に、配列番号1～17から選択される異なるアミノ酸配列をコードする配列番号234～250又は251～267から選択される異なる配列を含む。より典型的には、ポリヌクレオチド(複数可)又はポリリボヌクレオチド(複数可)は、コロナウイルス科によって発現される異なるタンパク質の断片である配列番号1～17から選択される異なるアミノ酸配列をコードする。例えば、ポリヌクレオチド(複数可)若しくはポリリボヌクレオチド(複数可)は、共に、以下の群のうちの少なくとも2つ、少なくとも3つ、又は4つ全ての各々から選択される少なくとも1つの配列を含み得る:(a)配列番号234～244又は配列番号251～261;(b)配列番号245～248又は配列番号262～265;(c)配列番号249又は配列番号266;及び(d)配列番号250又は配列番号267。ポリヌクレオチド(複数可)若しくはポリリボヌクレオチド(複数可)は、共に、以下のリストのうちの1つでの配列のうちの少なくとも1つ(又
は少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは全て)を含み得る:配列番号236、238、242、245、246、247、248、249及び250;配列番号236、238、240、242、245、246、247、248、249及び250;配列番号239、242、243、244、245、246、247、248、249及び250;配列番号252、255、259、262、263、264、265、266及び267;配列番号252、255、257、259、262、263、264、265、266及び267;並びに配列番号256、259、260、261、262、263、264、265、266及び267。ポリヌクレオチド(複数可)又はポリリボヌクレオチド(複数可)は、本明細書に記載される本発明のポリペプチドの任意のパネルをコードし得る。ポリヌクレオチドはDNAであり得る。ポリリボヌクレオチドは、RNAであり得る。例えば、ポリリボヌクレオチドは、mRNAであってもよい。
本発明はまた、細胞ベースの組成物を包含する。1つ以上のポリペプチド又はポリペプチドのパネルは、特に投与後の患者の体内の細胞表面上に提示される。細胞は、いくつかの場合、(自家)樹状細胞又は抗原提示細胞であり得る。細胞には、ポリペプチドがパルスされてもよく、又は細胞はポリペプチド(複数可)をコードする1つ以上の発現構築物/カセットを含んでもよい。発現構築物(複数可)/カセット(複数可)は、本明細書に上述したポリヌクレオチド(複数可)若しくはポリリボヌクレオチド(複数可)のいずれかを含む/発現することができる。
本明細書で使用される場合、「処置（治療）」という用語は、治療的及び予防的処置を含む。投与は、典型的には、「予防有効量」又は「治療有効量」で行われ(場合によっては、予防は療法とみなされることがある)、これは、臨床応答をもたらすのに又は個体に臨床有用性を示すのに十分なものであり、例えば、疾患又は状態の開始を予防若しくは遅延させるために、1つ以上の症状を改善するために、寛解を誘導若しくは延長させるために、又は再燃若しくは再発を遅延させるために有効な量である。
用量は、様々なパラメータに従って、特に、使用される物質:処置される個体の年齢、体重及び状態;投与の経路;並びに必要なレジメンに従って決定され得る。各用量における抗原の量は、免疫応答を誘導する量として選択される。医師は、任意の特定の個体に対して、必要な投与の経路及び投与量を決定することができるであろう。用量は、単回投与として提供されてもよく、又は複数回投与として提供されてもよく、例えば、一定の間隔を置いて取られ、例えば、時間単位で2回、3回又は4回投与される。通常、ペプチド、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、パーティクル媒介送達の場合、典型的には、1pg～1mg、より典型的には1pg～10μg、及び他の経路の場合、1μg～1mg、より典型的には1～100μg、より典型的には5～50μgの範囲で投与される。一般に、各用量は、0.01～3mgの抗原を含むであろうと予想される。特定のワクチンについての最適量は、対象における免疫応答の観察を伴う研究によって確認することができる。
上述した手法及びプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkinsで見出すことができる。
場合によっては、処置の方法は、対象への2つ以上のペプチド、ポリ核酸又はベクターの投与を含んでもよい。これらは、一緒に/同時に及び/又は異なる時間で若しくは逐次的に投与されてもよい。異なるペプチドの組み合わせの使用、任意選択で異なる抗原を標的化することは、ウイルス不均一性及び個体のHLA不均一性の課題を克服するために重要であり得る。本開示のペプチドを組み合わせて使用することは、ワクチン接種から臨床有用性を経験することができる個体の群を拡大する。1つのレジメンで使用するために製造された複数の医薬組成物は、薬物製品を明確に定めることができる。場合によっては、単一処置の異なるペプチド、ポリ核酸又はベクターは、例えば、1年、又は6か月、又は3か月、又は60日又は50日又は40日又は30日の期間内に対象に投与され得る。
投与の経路としては、鼻腔内、経口、皮下、皮内、及び筋肉内が挙げられるが、これらに限定されない。皮下投与が特に好ましい。皮下投与は、例えば、腹部、上腕若しくは大腿部の側面及び前面、背中の肩甲骨部分、又は腹背上部の臀部への注射によるものであってもよい。
本開示の組成物はまた、1回投与、又はそれ以上の回数の投与、並びに他の投与経路で投与されてもよい。例えば、そのような他の経路としては、皮内、静脈内、血管内、動脈内、腹腔内、髄腔内、気管内、心臓内、肺葉内(intralobally)、髄内、肺内、及び膣内が挙げられる。所望の処置期間に応じて、本開示による組成物は、1回又は数回投与されてもよく、また一定の間隔を置いて、例えば、1か月単位で数か月間又は数年間、かつ異なる投与量で投与されてもよい。
経口投与用の固形剤形には、カプセル剤、錠剤、カプレット、丸薬、散剤、ペレット剤、顆粒剤が挙げられる。そのような固形剤形では、活性成分は、通常、1つ以上の医薬的に許容される賦形剤と組み合わされており、それらの例は、上記で詳述している。経口剤もまた、水性懸濁液、エリキシル剤、又はシロップ剤として投与されてもよい。これらのために、活性成分は、様々な甘味剤若しくは風味剤、着色剤、及び、要望があれば乳化剤及び/又は懸濁化剤、並びに希釈剤、例えば、水、エタノール、グリセリン、及びそれらの組み合わせと組み合わされてもよい。
1つ以上の本開示の組成物が投与されてもよく、又は本開示による方法及び処置のための使用が、単独で、又は他の薬理学的組成物若しくは処置、例えば、他の免疫療法、ワクチン又は抗ウイルス剤と組み合わされて実施されてもよい。他の治療用組成物又は処置は、本開示の組成物(複数可)又は処置と同時又は逐次的(その前若しくは後で)のいずれかで投与されてもよい。
いくつかの場合、処置方法は、ワクチン接種方法又は免疫療法を提供する方法である。本明細書で使用される場合、「免疫療法」は、個体において免疫応答を誘導又は増強させることによる、疾患又は状態の処置である。ある特定の実施形態では、免疫療法は、T細胞応答を誘起させるために、1つ以上の薬物の個体への投与を含む療法を指す。具体的な実施形態では、免疫療法は、1つ以上のPEPIを含有するポリペプチドを個体に投与又は発現させることを含み、それにより、T細胞応答を誘起させ、1つ以上のPEPIをクラスI HLAと併せてそれらの細胞表面上で表示する細胞を認識して、それを殺滅する療法を指す。別の実施形態では、免疫療法は、クラスII HLAによって提示される1つ以上のPEPIを含有するポリペプチドを個体に投与又は発現させることを含み、それにより、T細胞応答を誘起し、1つ以上のPEPIをクラスI HLAと併せてそれらの細胞表面上で表示する疾患細胞を認識して、それを殺滅する細胞傷害性T細胞に共刺激を提供する療法を指す。更に別の具体的な実施形態では、免疫療法は、既存のT細胞を再活性化して、標的細胞及び/又はウイルスを殺滅する1つ以上の薬物の個体への投与を含む療法を指す。
本発明は、対象におけるコロナウイルス科感染症又はコロナウイルス科感染症と関連する疾患若しくは状態を処置又は予防する方法を包含する。コロナウイルス科感染症と関連する疾患若しくは状態には、感染症によって引き起こされた、例えば、直接引き起こされた任意の疾患若しくは状態、症状又は他の疾患属性が含まれる。
いくつかの場合、コロナウイルス科は、β-コロナウイルス科、例えば、SARS-CoV-2又はそのバリアント若しくは変異体株である。コロナウイルス科は、SARS-CoVであり得る。具体的には、コロナウイルス科は、本明細書に記載される配列番号1～17から選択される1つ以上のアミノ酸配列、又は表6Aにおいて太字で示した及び/又は下線付きのベストEPI配列のうちの1つ以上を含む1つ以上の抗原/ポリペプチドを発現するものである。より具体的には、特定のコロナウイルス科は、組成物又はキットを使用して処置されることができ、活性成分のポリペプチドは、特定のウイルスによって発現される抗原中で見出された配列番号1～17(又はベストEPI配列)から選択される1つ以上(典型的には、2つ以上、又は3、4、5、6、7、8、若しくは9個以上)の配列を含む。SARS-CoV-2又はSARS-CoV感染症によって引き起こされる疾患を処置又は予防するのに特に好適であるか、又は最適化された特定の組成物が、本明細書に記載されている。しかしながら、当業者は、本開示を用いて、配列番号1～17のアミノ酸配列の異なる組み合わせを活性成分として含むポリペプチドを有する他の組成物又はキットを特定して、他のコロナウイルス科の予防又は処置に使用することができる。特定のコロナウイルス科及び/又は患者のための好適な処置は、本明細書に上述し、以下の実施例に記載されるように選択することができる。
本開示の更なる実施形態-(1)
1.ポリペプチドワクチンであって、配列番号1～17からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、医薬的に許容されるアジュバント、希釈剤、担体、防腐剤、賦形剤、緩衝液、安定剤、又はそれらの組み合わせとを含むポリペプチドワクチン。
2.2つ以上のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、配列番号1～17からなる群から選択される異なるアミノ酸配列を含む、項目1に記載のポリペプチドワクチン。
3.以下の群:
(a)配列番号1～11;
(b)配列番号12～15;
(c)配列番号16;及び
(d)配列番号17のうちの少なくとも2つからの少なくとも1つのポリペプチドを含む、項目1に記載のポリペプチドワクチン。
4.少なくとも2つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含むか、各ポリペプチドが、配列番号2、5、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含むか、又は各ポリペプチドが、配列番号6及び9～17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含む、項目1に記載のポリペプチドワクチン。
5.少なくとも4つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含むか、各ポリペプチドが、配列番号2、5、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含むか、又は各ポリペプチドが、配列番号6及び9～17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含む、項目1に記載のポリペプチドワクチン。
6.少なくとも6つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含むか、各ポリペプチドが、配列番号2、5、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含むか、又は各ポリペプチドが、配列番号6及び9～17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含む、項目1に記載のポリペプチドワクチン。
7.少なくとも8つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含むか、各ポリペプチドが、配列番号2、5、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含むか、又は各ポリペプチドが、配列番号6及び9～17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含む、項目1に記載のポリペプチドワクチン。
8.少なくとも10個のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含むか、各ポリペプチドが、配列番号2、5、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含むか、又は各ポリペプチドが、配列番号6及び9～17のアミノ酸配列のうちの異なる1つを含む、項目1に記載のポリペプチドワクチン。
9.ポリペプチドのうちの1つ以上が、個体の少なくとも2つのHLAクラスI対立遺伝子に拘束されるCD8+T細胞エピトープであるコロナウイルス科タンパク質の断片を含む、項目1に記載のポリペプチドワクチン。
10.ポリペプチドのうちの1つ以上が、個体の少なくとも2つのHLAクラスII対立遺伝子に拘束されるCD4+T細胞エピトープであるコロナウイルス科タンパク質の断片を含む、項目1に記載のポリペプチド。
11.ポリペプチドのうちの1つ以上が、線状B細胞エピトープを含む、項目1に記載のポリペプチド。
12.コロナウイルス科感染症の処置又は予防を必要とする個体において、コロナウイルス科感染症の処置又は予防する方法であって、項目1に記載のポリペプチドワクチンを個体に投与することを含む方法。
13.コロナウイルス科感染症が、SARS-CoV-2感染症である、項目12に記載の方法。
本開示の更なる実施形態-(2)
1.免疫原性組成物であって、(a)少なくとも2つの別個のポリペプチドであって、各ポリペプチドが、少なくとも30個のアミノ酸かつ60個以下のアミノ酸からなり、配列番号1～17からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも2つの別個のポリペプチドと、(b)ポリペプチドの免疫原性を増加させる薬学的に許容される化合物とを含む免疫原性組成物。
2.組成物が、
(a)少なくとも30個のアミノ酸かつ60個以下のアミノ酸残基からなり、配列番号1～11から選択されるアミノ配列を含む、少なくとも1つの別個のポリペプチドと、
(b)少なくとも30個のアミノ酸かつ60個以下のアミノ酸からなり、配列番号12～15から選択されるアミノ配列を含む、少なくとも1つの別個のポリペプチドと、
(c)少なくとも30個のアミノ酸かつ60個以下のアミノ酸からなり、配列番号16から選択されるアミノ配列を含む、少なくとも1つの別個のポリペプチドと、
(d)少なくとも30個のアミノ酸かつ60個以下のアミノ酸からなり、配列番号17から選択されるアミノ配列を含む、少なくとも1つの別個のポリペプチドとを含む、項目1に記載の免疫原性組成物。
3.別個のアミノ酸配列が、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17からなる群から選択される、項目1に記載の免疫原性組成物。
4.アミノ酸配列が、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17からなる群から選択される、項目3に記載の免疫原性組成物。
5.当該組成物が、6つの別個のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、少なくとも30個のアミノ酸かつ60個以下のアミノ酸からなり、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17からなる群から選択される別個のアミノ酸配列を含む、項目1に記載の免疫原性組成物。
6.当該組成物が、8つの別個のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、少なくとも30個のアミノ酸かつ60個以下のアミノ酸からなり、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17からなる群から選択される別個のアミノ酸配列を含む、項目1に記載の免疫原性組成物。
7.当該組成物が、10個の別個のポリペプチドを含み、各ポリペプチドが、少なくとも30個のアミノ酸かつ60個以下のアミノ酸からなり、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17からなる群から選択される別個のアミノ酸配列を含む、項目1に記載の免疫原性組成物。
8.少なくとも1つのポリペプチドが、個体の少なくとも2つのHLAクラスI対立遺伝子に拘束されるCD8+T細胞エピトープであるコロナウイルス科タンパク質の断片を含む、項目1に記載の免疫原性組成物。
9.少なくとも1つのポリペプチドが、個体の少なくとも2つのHLAクラスII対立遺伝子に拘束されるCD4+T細胞エピトープであるコロナウイルス科タンパク質の断片を含む、項目1に記載の免疫原性組成物。
10.少なくとも1つのポリペプチドが、線状B細胞エピトープを含む、項目1に記載の免疫原性組成物。
11.SARS-CoV-2感染症に対する免疫応答を刺激する必要がある個体においてSARS-CoV-2感染症に対する免疫応答を刺激する方法であって、項目1に記載の免疫原性組成物を個体に投与することを含む方法。
12.当該組成物が、配列番号2による配列からなるポリペプチド、配列番号5による配列からなるポリペプチド、配列番号7による配列からなるポリペプチド、配列番号9による配列からなるポリペプチド、配列番号12による配列からなるポリペプチド、配列番号13による配列からなるポリペプチド、配列番号14による配列からなるポリペプチド、配列番号15による配列からなるポリペプチド、配列番号16による配列からなるポリペプチド、及び配列番号17による配列からなるポリペプチドを含む、項目1に記載の免疫原性組成物。
[実施例]
[実施例1]
大腸がん患者におけるPolyPEPI1018ペプチドワクチンの安全性
大腸がんワクチンPolyPEPI1018を、米国特許第10,213,497号に記載されるように、集団PEPI3+を最適化するようにデザインした。PolyPEPI1018によるワクチン接種は、安全で耐用性良好であった。ワクチン接種に関連する有害事象の大部分は、予想通り、注射部位反応及び軽度のインフルエンザ様症状であった。記録されたただ1つのグレード3の重篤な有害事象(非感染性脳炎)が処置に関連している可能性があるが、安全性審査チーム及びメディカルモニターの両方は、その事象を無関係と分類した。表2は、試験中のワクチン接種に関連するものと報告された有害事象をまとめている。
Figure 2023520562000002
[実施例2]
大腸がん患者におけるPolyPEPI1018ワクチンの免疫原性
11人の患者のうち10人は、イムノアッセイによって分析されるのに十分なPMBC試料を有していた。10人の患者のうち7人は、少なくとも1つのPolyPEPI11018ワクチン抗原に対する既存の免疫応答を有しており、10人の患者のうち7人で、少なくとも1つのワクチン抗原に対して免疫応答がブーストされた。10人の患者のうち8人で、デノボ免疫応答が、少なくとも1つのワクチン抗原に対して誘導された(図1A)。既存の免疫応答は、全ての7つの標的抗原に対して見出され、これが、ワクチンデザイン戦略及び標的抗原選択を確実にした。全ての10人の患者が、ワクチン特異的CD4 T細胞応答を有しており、そのうち9人でワクチン接種後応答がブーストされた(図1B)。
8人の患者は、免疫応答の動態を分析するために、12週にわたるワクチン接種前に入手可能な試料を有していた。患者は、経時的に変化する動態パターンを示し、彼らの大部分は3週目+6週目の組み合わされた時点でピークを有し(図1C)、これは、ウイルス再チャレンジ後の免疫応答動態で行われた観察と合致する。Nascimbeniらは、チンパンジーにおいて、HCV特異的試験ペプチドの大部分に対するCD8 T細胞応答の最初のピークが、静脈内再チャレンジ後5～6週及びHCVによる肝臓内再チャレンジ後3～4週近辺で測定されることを見出した(Nascimbeni et al., J Virol, 77, 4781-93. 2003)。
富化ELISPOTアッセイに加えて、本発明者らは、エフェクター型T細胞応答を調べるための検出方法として、直接ex vivo ELISPOT及びフローサイトメトリを伴う定量的細胞内サイトカイン染色(ICS)アッセイも実施した。ワクチン接種前の試料において、ex vivo ELISPOTは、分析された9人の患者のうち3人でポジティブなワクチン特異的CD8応答を、1人でCD4応答を見出した。ワクチン接種の結果として、5人の患者におけるCD8応答及び7人の患者におけるCD4応答をブースト又は新たに誘導させた(表3)。CD8応答がブースト又はデノボ誘導された全ての5人の患者において、ワクチン接種はCD4応答も誘導した。ex vivo ICSによって測定されたように、ワクチン特異的CD8及びCD4 T細胞応答は多機能的であり、機能CD8及びCD4細胞の頻度は、ワクチン接種時に増加した(表3)。CD8 T細胞分画では、TNF-α陽性細胞が支配的であったが、CD 4プール中で最も頻繁に検出されたサイトカインは、IL-2であった(図2)。
Figure 2023520562000003
11人の患者のうち4人が、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を分析するのに十分な腫瘍試料を有していた。ワクチン接種は、試験した患者4人のうちの3人で、TILの侵襲性マージン及びコア腫瘍領域への動員を誘導した。ワクチン接種後に臨床的有効性を経験した2人の患者について、CD8 T細胞がコア腫瘍中に蓄積し(表3)、ワクチンが冷たい腫瘍を熱い腫瘍に変えることができることを示唆している。図3では、患者010007の生検のワクチン接種前及びワクチン接種後(38週)のIHC写真が示されており、ここでは、CD8+TILが、200%を超えて増加した。
[実施例3]
大腸がん患者におけるPolyPEPI1018ワクチンの有効性
11人の患者のうちで、3人の患者が、RECISTによれば、客観的腫瘍奏功(objective tumor response)を有していた。単回投与のみを受けた患者の中で(n=6)、1人が部分奏効を、2人が12週までの安定疾患(stable disease)を達成し、17%の客観的奏功率(objective response rate(ORR))及び50%の病勢コントロール率(disease control rate(DCR))をもたらした(図4A及び4B)。複数回投与を受けた部分群では、2人の患者が部分奏効を達成し、3人が安定疾患を達成し、これは40%のORR及び80%のDCRである。単回投与群及び複数回投与群のPFSの中央値(試験後のフォローアップデータを含む)は、それぞれ、4.5か月及び12.2か月であった(p=0.03)(図4C)。5-FU+ベバシズマブ維持療法と比べると、同等の患者集団(n=148)でのMODUL試験では、7.39か月であった(Grothey et al., Annals of Oncology 29, 2018)。
患者020004は、一次選択化学療法中には部分レスポンダーであった。ワクチンの単回投与を受けた後、彼は寛解を継続しワクチン接種後6週には、彼の標的病変部サイズは、30%を超えるほど減少した(図5A)。この結果は、達成された部分奏効は、誘導期間に一部起因し得る。患者010004は、誘導期間中安定疾患であり、6週には(初回ワクチン接種後6週)すでに部分奏効を達成した。更なるワクチン接種全体を通して腫瘍縮小は続き、24週までに3つの標的病変部のうち2つが完全に消失し、26週には、3つ目の残存する病変を除去するための根治手術が実施された(図5B)。一次選択療法後では安定疾患を有していた患者010007は、ワクチン接種中には穏やかな傾斜を有する非常にゆっくりとした寛解を有し、38週目での彼の最終来院訪問時にだけ部分奏効を達成した(図5C)。患者010004と同様に、標的病変部の縮小が、この患者でも根治手術を可能にし、病理分析では、原発腫瘍にがん細胞は見つからず、肝臓には残存転移はなかった。客観的奏功を経験した後者の3人の患者に加えて、患者010002も強調される必要がある。彼は、ベスト効果(best response)として安定疾患を達成し(19%の標的病変縮小)、奏効期間(duration of response)は53週(～12か月)であった。この患者についての腫瘍奏功の延長及び客観的奏功を有する患者は、PolyPEPI1018ワクチンの抗腫瘍活性を示唆している。
[実施例4]
PEPIテストの回顧的及び前向き検証
対象のT細胞応答を予測するためにPEPIテストを開発した(Toke et al., Journal of Clinical Oncology 37, 2019)。PEPIテストは、対象の少なくとも3つのHLAクラスI対立遺伝子に結合する対象の抗原特異的パーソナルエピトープ(PEPI)を特定する。PEPIテストの入力は、対象の6つのHLAクラスI対立遺伝子及び問題の抗原のアミノ酸配列である。抗原は、オーバーラッピング9-merペプチドでスキャンして、対象のHLAクラスI対立遺伝子に結合するペプチドを特定する。PEPIテストは、結合カットオフ≦5を有するペプチドの包含(IEDBパーセンンタイル順位)によって組み立てられた、エピトープデータベース(EPDE)からHLA-ペプチドペアを得る。6つの臨床試験の免疫原性データを用いたPEPIテストの回顧的検証によれば、特定されたPEPIは、84%の確率で免疫応答を誘導する(表4)。71人のがん患者及び9人のHIV感染患者で行われた6つの臨床試験の回顧的分析によって性能評価試験(検証)を実行した。(Bagarazzi et al., Sci Transl Med 4, 2012, Bioley et al., Clin Cancer Res 15, 2009, Gudmundsdotter et al., Vaccine 29, 2011, Kakimi et al., Int J Cancer 129, 2011, Valmori et al., Proc Natl Acad Sci USA 104, 2007, Wada et al., J Immunother 37, 2014, Yuan et al., Proc Natl Acad Sci USA 108, 2011)。本発明者らは、利用可能な患者データの無作為化によって試験コホートを作り出し、データの有用性以外の理由では、いかなる患者も除外しなかった。本発明者らは、本発明者らの試験がこれらの臨床試験を回顧的に分析することを目的としていないため、元々の臨床試験からの除外を考慮しなかった。本発明者らは、患者のいかなる個人データも取得しなかった。その代わりに、本発明者らは、彼らのHLA遺伝子型を掲載した論文審査のある刊行物で公開された患者識別子を使用した。抗原配列を、公開されているタンパク質配列データベース又は論文審査のある刊行物から入手した。80人の患者を伴う6つの臨床試験に由来する入手可能な157のデータセットを、標準的なランダムナンバージェネレーターで無作為化し、トレーニング及び検証研究のための2つの独立したコホートを作り出した。トレーニング及び検証コホートは、同じ患者集団の異なるデータセットを伴った。48人の患者の76のデータセットがトレーニングコホートに含まれ、51人の患者の81のデータセットが、検証コホートに含まれた。トレーニングデータセットを使用して、本発明者らは、免疫応答の予測のためのカットオフ値としてPEPIカウント≧1を決定した。
Figure 2023520562000004
PolyPEPI1018ワクチンのデザインに使用されたPEPIテストのインシリコツールは、免疫分析を受ける資格がある10人の患者の免疫原性データを使用して前向きに検証した。70のデータセット(7つの標的抗原×10人の患者)を使用して、抗原特異的CTL応答を予測するためのPEPIテスト能力を評価した。各データセットに対して、PEPIテストが免疫応答を予測することができるかを決定した。予測されたPEPIを有する患者が分析された抗原(複数可)に対するCD8 T細胞特異的免疫応答を生じる確率を表す、79%の陽性的中率で、全体一致率は64%であった(表5)。臨床試験データは、回顧的試験結果と有意に相関していた(p=0.01)。
Figure 2023520562000005
[実施例5]
可能なコンパニオン診断(CDx)の実現可能性の実証
OBERTO-101試験の1つの目的は、免疫原性を予測するPEPIテストに加えて、臨床有効性を予測すると意図されるバイオマーカーを定義することであった。測定された免疫応答は、RECISTによって測定された臨床応答と直接相関させることはできないが、相関ががんワクチン臨床試験の多重抗原免疫応答率と客観的奏効率との間にすでに見出されたことが、文献からすでに明らかである(Klebanoff et al., Immunological reviews 239, 2011, Lorincz et al., Annals of Oncology 30, 2019)。候補バイオマーカーは、AGP(PEPIを含む抗原)であり得、これは、ワクチンに含まれる標的抗原の濃度を考慮に入れるだけでなく、各ワクチン抗原の発現確率も考慮に入れるものである。対象についてのAGPカウントは、ワクチンがPEPIと「ヒットする」ことができる抗原の予想される数を示す。OBERTO-101試験の複数回投与群において、本発明者らは、AGPを有望なバイオマーカーとして調査し、腫瘍体積縮小及びPFSの両方と関連する傾向性を見出した(図6A及びB)。試料数が少ないために、有意性は決定できなかった。本発明者らは、測定された多重抗原免疫応答との類似する関連パターンを同じように見出した(図6C及びD)。
[実施例6]
polyPEPI-SCoV-2ワクチンデザイン
SARS-CoVゲノムは、約30キロベースのサイズを有し、他のコロナウイルスと同様に、複数の構造タンパク質及び非構造タンパク質をコードする。構造タンパク質には、スパイク(S)タンパク質、エンベロープ(E)タンパク質、膜(M)タンパク質、及びヌクレオカプシド(N)タンパク質が含まれる。
本明細書に開示されるPolyPEPI-SCoV-2ワクチンは、世界人口の個体の高い割合において、構造ウイルス抗原のうちの1つ以上、及び好ましくは4つ全てに対してポジティブな望ましいT細胞(CD8細胞傷害性及びCD4ヘルパーの両方)応答及びB細胞媒介抗体応答を誘導することができる1つ以上の30アミノ酸長のペプチドから構成される。
COVID-19の合計19個の全ゲノム配列を、NCBIデータベースから2020年3月28日にダウンロードした。
(https://www.ncbi.nm.nih.gov/genome/genomes/86693)
登録IDは次の通りである:NC_045512.2、MN938384.1、MN975262.1、MN985325.1、MN988713.1、MN994467.1、MN994468.1、MN997409.1、MN988668.1、MN988669.1、MN996527.1、MN996528.1、MN996529.1、MN996530.1、MN996531.1、MT135041.1、MT135043.1、MT027063.1、MT027062.1。最初のIDは、GenBank参照配列を表す。翻訳されたコード配列の4つの構造タンパク質配列(表面糖タンパク質、エンベロープタンパク質、膜糖タンパク質、ヌクレオカプシドリンタンパク質)を整列させて、複数の配列アライメントと比較した。19の配列のうち、15が完全に同じであった。しかしながら、本発明者らは、4つのヌクレオカプシドタンパク質において単一のアミノ酸変化を得た。これらの置換は、次の通りである:MN988713.1:ヌクレオカプシド194 S->X、MT135043.1:ヌクレオカプシド343 D->V、MT027063.1:ヌクレオカプシド194 S->L、MT027062.1:ヌクレオカプシド194 S->L。これらの変化のいずれも、本ワクチンポリペプチドにおいて標的に選択されたエピトープに影響を与えなかった。
17のペプチド断片を、SARS-CoV-2構造タンパク質について現在既知のウイルス抗原配列の保存領域から選択した。断片を、モデル集団において、多重HLAクラスI結合PEPI3+及び多重HLAクラスII結合PEPI4+、すなわち、共有パーソナルエピトープを最大化させるように選択した。ペプチドはまた、線状B細胞エピトープを導入するようにもデザインした。具体的には、モデル集団において最も高い割合の対象でPEPI2+である4つの標的抗原の保存領域中の9mer配列を選択した。これらの9merを伸長させて、標的抗原の保存配列中の線状B細胞エピトープの近くに導入した。次いで、9mer「ベストEPI」及び線状B細胞エピトープの両方を導入する標的抗原の30mer断片を、30mer断片中のHLAクラスII結合PEPI4+を有するモデル集団中の対象の割合を最大化するように選択した。モデル集団は、約16,000人の骨髄移植バイオバンクから得たHLA遺伝子型の対象を含み、16の異なる民族群の各々から約1,000人の対象がいた。選択された30merペプチド断片の配列及びモデル集団中の対象の最も高い割合のPEPI3+であるHLAクラスI結合エピトープ及びPEPI4+であるHLAクラスII結合エピトープを表6Aに示す。
Figure 2023520562000006
Figure 2023520562000007
Figure 2023520562000008
Figure 2023520562000009
[実施例7]
PolyPEPI-SCoV-2と最新ワクチンとの比較
論文“Preliminary Identification of Potential Vaccine Targets for the COVID-19 Coronavirus (SARS-CoV-2) Based on SARS-CoV Immunological Studies"(Ahmedら)で示唆されたように、本発明者らは、その中で特定された標的に基づいて、ワクチンの可能な有効性(免疫原性)をモデル化した。その結果を、本明細書に記載されるPolyPEPI-SCov-2ワクチンペプチドの選択と比較した。
SF Ahmedらは、19のHLAI対立遺伝子と関連する61のT細胞エピトープを特定し、グローバル対立遺伝子頻度(Ahmed et al. Viruses, 12(3). 2020)に基づいて、96.29%の推定累積人口カバレッジを提供した。表7に示される以下のT細胞エピトープは、ワクチンの標的候補として示唆された(論文の表3;61のうちの2つがわずか8merのエピトープであり、本発明者らはシミュレーションから除外した)。
Figure 2023520562000010
Figure 2023520562000011
Figure 2023520562000012
Figure 2023520562000013
Ahmedらは、推定最大人口カバレッジが、各リストされたHLA対立遺伝子に対して少なくとも1つのエピトープ(すなわち、19個の配列)を選択することによって達成され得ることを示唆している。したがって、本発明者らは、このT細胞エピトープセットからランダム選択を行い、各HLA対立遺伝子に対して1つのエピトープを選択した(著者が示唆した通り正確に)。これらが無差別の（乱雑な）HLA結合エピトープであるため、したがって、時には、本発明者らは、2つ以上のHLA対立遺伝子に対して同じエピトープを選択したこともあった。これを30回繰り返し、選択されたエピトープを、PolyPEPI-SCoV-2について選択された10個のペプチド(配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、17)と比較した。骨髄移植バイオバンクから得られた本発明者らの約16,000人のHLA遺伝子型の対象のデータベースで、インシリコ比較を実施した。本発明者らのデータベースは、16の民族群(各群当たり約1,000人の対象)からのデータを含有する。本発明者らは、少なくとも1つのエピトープに対するCD8+免疫応答を有する対象の割合を計算した。シミュレートされたワクチン(ランダムエピトープ選択)と比較した、PolyPEPI-SCoV-2の全世界(グローバル)カバレッジは99.8%であり、民族群のいくつか(例えば、白人)について、平均カバレッジは61%(±9.9%)であって、他の民族(例えば、日本人)よりも低い防御を得た(図7)。
更なる特別な(実際的ではない)状況をモデル化し、ここでは、Ahmedらによってリストされた全てのT細胞エピトープ(n=59)をワクチンに選択した。この場合には、全世界のカバレッジは最大88%に増加したが、依然としてPolyPEPI-SCoV-2のレベルには達しなかった(図8)。これにより、エピトープワクチンについてまた民族群間の均一なカバレッジが示された。
本発明者らは、PolyPEPI-SCoV-2ワクチン(選択された同じ10個のペプチド)の、CD8応答に加えて、HLAクラスII拘束性CD4応答(HLAクラスII PEPI)を誘導する能力もモデル化した(図9)。各民族コホートにおいて、対象の少なくとも97%は、PolyPEPI-SCoV-2ワクチンの少なくとも2つのペプチドに対する両方のCD8及びCD4 T細胞応答を誘発した。
[実施例8]
PolyPEPI-SCoV-2と最新ペプチドワクチンの免疫原性エピトープの数の比較
Ahmedらによって導出された以前のデータセットに基づいて、本発明者らは、モデル集団における各対象の免疫原性エピトープを計算した。この数の分布は、潜在的変異に対するワクチンの強さを示している。
図10は、対象の61%(±9.9%)が、ワクチンのエピトープのうちの少なくとも1つに対して免疫応答を有するが、対象のわずか25%(±10.4%)が19のうちの少なくとも2つのエピトープに対して応答を有することを示している。これは、ウイルスが1つの特定のエピトープで変異した場合、他のエピトープが依然として免疫応答を生じることができる(一部の対象に対して)ことを意味する。対照的に、PolyPEPI-SCoV-2で処置されたモデル集団の99%が、少なくとも2つのエピトープに対して応答を有する。少なくとも3つの標的エピトープについてはギャップは更に大きい(PolyPEPI-SCoV-2の96%対エピトープワクチンの6%)。
全ての59のエピトープを含有するワクチンの場合、状況はいくらかよくなり、対象の69%が2つ以上のエピトープに対する免疫応答を有し得る(図11)が、これは、依然として、PolyPEPI-SCoV-2ワクチン(10個のペプチド)と比べて集団のより小さな割合である。
[実施例9]
COVID-19感染症及び予測のモデリングは、感染症に対するワクチン接種を受けて処置しようとする試みを台無しにする可能性がある急速な進化について警告している。新規なベータコロナウイルスSARS-CoV-2の伝播がここ数年のうちにどのように展開するかを予測することの緊急の必要性がある。これらの動態は、季節性、免疫の持続期間、及び他のヒトへの/他のヒトからのコロナウイルスに対する交差免疫の強さに依存する。米国からのデータを使用して、本発明者らは、これらの因子がヒトコロナウイルスHCoV-OC43及びHCoV-HKU1の伝播にどのような影響を与えるかを測定した(Kissler et al. 2020 https://doi.org/10.1101/2020.03.04.20031112)。本明細書に記載のワクチンペプチド及び組成物のデザインはウイルスの急激な進化に対してロバストであり、複数の免疫原性であるが保存された配列、好ましくは複数の構造タンパク質に由来する配列の選択によって世界人口をカバーする。
ウイルスが進化し続け、そして、より多くのデータが収集されるにつれて、追加の変異が観察されることが予想される。そのような変異は、その変異が特定されたエピトープ領域の外側で発生するならば、本明細書に記載のポリペプチド及び多重ペプチドワクチンのグローバルカバレッジに影響を及ぼさないこととなる。変異が選択されたエピトープ領域のいずれかの範囲内で発生しても、対象の大部分がウイルス特異的メモリーT細胞クローンの広範囲のレパートリーを保持するために、残りの免疫原性エピトープが依然として、ウイルスに対するロバストな防御を提供する。例えば、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17のポリペプチドを含む10個のペプチドワクチンの場合、患者の94%が少なくとも3つのワクチンペプチドに対して免疫応答を有し、4つのペプチド及び5つのペプチドに対しては、それぞれ患者の85%及び71%が免疫応答を有すると予測される。
[実施例10]
概要
この実施例は、異なる個体の免疫応答における不均一性及び感染ウイルスの潜在的な不均一性という二重の課題に対処するSARS-CoV-2に対するグローバルペプチドワクチンの開発を記載する。この実施例では、「PolyPEPI-SCoV-2」は、以下に記載されるSARS-CoV-2ウイルスの4つの全ての主要な構造タンパク質に由来する9個の30-merペプチドを含有する多重ペプチドワクチンである。ワクチンペプチドは、異なる民族の433人の対象のインシリココホートにおける個体の複数の自家HLA対立遺伝子に拘束されるHLAクラスI及びクラスIIパーソナルエピトープ(PEPI)としてそれらの頻度に基づいて選択された。モンタニドISA 51VGアジュバントと共に投与されるPolyPEPI-SCoV-2ワクチンは、BALB/c及びCD34+トランスジェニックマウスへの皮下注射の際に、ウイルスの4つの全ての構造タンパク質に対するロバストなCD8+及びCD4+T細胞応答を生成し、並びに結合抗体を生成した。加えて、PolyPEPI-SCoV-2に特異的な多機能CD8+及びCD4+T細胞が、症状の開始後1～5か月後に、調査された17の無症候性/軽度COVID-19回復期患者の血液の各々で、ex vivoで検出された。COVID-19から回復するために使用されたPolyPEPI-SCoV-2特異的T細胞レパートリーは、非常に多様であった:ドナーは平均で、SARS-CoV-2タンパク質に対して7つの異なるペプチド特異的T細胞を有しており、ドナーの87%が、少なくとも3つのSARS-CoV-2タンパク質に対して複数の標的を有しており、53%が4つ全てに対して複数の標的を有していた。加えて、回復期のドナーの完全なクラスI HLA遺伝子型に基づいて決定されたPEPIを84%の精度で検証して、個体について測定されるPEPI特異的CD8+T細胞応答を予測した。上記の発見の、16の異なる民族の16,000人のHLA遺伝子型を有する個体(各民族群n=1,000)の米国骨髄ドナーコホートへの外挿は、一般集団におけるPolyPEPI-SCoV-2ワクチン接種が、黒人、アジア人、及び少数民族(BAME)コホートが含まれる民族集団とは無関係に、個体の98%において広範囲の多抗原性CD8+及びCD4+T細胞応答を誘発する可能性が高いことを示唆している。モンタニドISA 51VGと共に投与されるPolyPEPI-SCoV-2は、ヒト免疫系をモデル化するBALB/c及びhCD34+トランスジェニックマウスへの皮下注射の際に、全ての代表的なタンパク質に対するロバストなTh1に偏ったCD8+及びCD4+T細胞応答、並びに結合抗体を生成した。
序論
新型コロナウイルスSARS-CoV-2によって引き起こされたパンデミックは、2019年12月のその発生から依然として広がり続けている。世界保健機構(WHO)によれば、臨床開発中のワクチン候補の少なくとも3分の2が、主に、ウイルススパイク(S)タンパク質に対する中和抗体を生成するようにデザインされているが(1)、SARS-CoV及びMERSエピデミック並びにCOVID-19回復期患者から学んだ教訓は、このワクチンデザイン戦略に対する潜在的な課題を示している(2、3)。潜在的な問題は二重であり、徐々に弱まる抗体レベル及びスパイクタンパク質のみに対する不十分なT細胞応答の生成である。
2003年の以前のSARS-CoVウイルスエンデミック及び2012年のMERSエンデミックで感染した患者は、多くの場合、一過性(最大3～6年間だけ検出される)体液性免疫を有していた。更にまた、風邪コロナウイルスによる低リスクの実験的感染によって生成された抗体は、1年以内に減少し、再チャレンジに対して防御しなかった(4、5)。同様に、SARS-CoV-2では、SARS-CoV-2ウイルス感染の自然な経過に関連する免疫応答は、抗スパイクIgG抗体応答が、通常弱く(幸いなことに、頻度の低い重症例を除いて)、それらの持続性は多くの場合最大3か月間持続するか、又はこの期間内に最大70%減少することを示唆している(6)。加えて、個体の2～9%が、SARS-CoV-2による感染後2か月たっても血清転換せず(7)、個体が適応免疫系の別のアームである、T細胞を使用する免疫に達していることを示唆している。実際に、SARS-CoV-2感染症の病歴を有する実質的に全ての対象が、ウイルスに対するT細胞応答を上昇させる(血清反応陰性及び重度疾患を有する対象を含む)と結論付けることができた(2、8～10)。T細胞応答は多様であり、すなわち、ウイルスの全抗原性レパートリーに向けられ、スパイクタンパク質はあまり支配的ではない。具体的には、いくつかの研究は、最大の構造タンパク質であるにもかかわらず、スパイク特異的T細胞応答は、自然感染によって引き起こされるCD4+及びCD8+T細胞の全体のわずか25～27%を占めることを報告した。更に、MERS、SARS-CoV-1及びSARS-CoV-2について実証されたように、この多様性は無症候性/軽度疾患と関連付けられ、なぜばらな回復した患者がSよりも膜(M)及び核タンパク質(N)タンパク質に対するより多くのCD8+T細胞を有しており、一方T細胞強度及び多様性は、疾患の重症度と共に増加しないからである(6、9、11、12)。実際に、COVID-19患者においては、低いCD8+T細胞数が、死亡のより高いリスクの予測因子であり、重症疾患を有する患者又は死亡者は、疲弊したT細胞を有していた(2、13)。感染後の初期の検出可能なウイルス特異的CD8+T細胞応答は、ウイルス負荷の低下に寄与し、したがって、抗体レベルの低下に寄与し、これらの患者のより好ましい転帰を有した理
由を説明している(12)。これを支持して、SARS-CoV-2特異的T細胞受容体のマッピングが、ウイルス曝露すぐに、かつ任意の抗体検出の前に可能であることが最近報告されている(14)。
これらの観察は、感染前に多数の多様なウイルス特異的メモリーT細胞を達成すること(ワクチン接種によって)が、SARS-CoV-2感染の初期段階におけるウイルス除去及びウイルス保有宿主(reservoir)除去に寄与し得ることを示唆する。これらの予想は、再活性化T細胞が、SARS-CoV-1による致死量感染からの防御を提供したことを実証する動物チャレンジ研究によって支持される(9、15)。注目すべきことには、SARS-CoV-1ウイルスのNタンパク質に対するメモリーT細胞が、23/23人のテストされた患者について、SARSからの回復後17年間報告されたことである(9)。他の報告も、コロナウイルス感染症によって引き起こされたメモリーT細胞の持続性を支持した(16、17)。
したがって、ウイルスSタンパク質に対するT細胞応答を生成することを目指す臨床開発中のワクチン候補は、回復期患者の免疫応答の一部だけを生成する可能性が高く、したがって、ロバストなメモリーT細胞応答を誘導する可能性は低い。全ウイルス、複数の大きなタンパク質を使用するワクチン技術は、多様性の欠如に関連する問題を理論的に解決し得る。しかしながら、これらは、防御的免疫応答にほとんど寄与しないばかりではなく、アレルギー反応及び/又は反応原性反応によって状況を複雑にする不必要な抗原負荷を包含する制限を有する(18～23)。同様に、標的抗原をコードする複製欠損ウイルス構築物は、特に、繰り返し投与によって、ウイルスベクターに対する非特異的免疫応答を引き起こし得る(24)。
ペプチドワクチンは、ポジティブな所望のT細胞及びB細胞媒介免疫応答を誘導することができる短いペプチド断片、エピトープの使用に依存する代替サブユニットワクチン戦略である。
しかしながら、ペプチドワクチンデザインを悩ます中核となる問題は、各人が独自に備える免疫応答プロファイルを有することである。実際には、SARS-Cov-2の場合、様々な民族、特に、黒人、アジア人、少数民族(BAME)群によって表される遺伝的多様性に従って疾患経過が変化するが、この理由は未だ十分に理解されていない(25、26)。遺伝的多様性は、ヒト白血球抗原(HLA)対立遺伝子における遺伝的分散によって捉えることができ、これは、体内のがん細胞若しくは感染細胞を認識及び殺滅することができる細胞傷害性T細胞(CTL)を引き起こす、ウイルス抗原(エピトープ)提示経路における重要な成分である。SARS-CoV-2に対するグローバルワクチンのデザインにおいてこの不均一性を捉えるために、頻出するヒトHLA対立遺伝子に基づくウイルス抗原エピトープ予測が、広く使用されてきた(27)。しかしながら、実際には、これらのエピトープマッピング研究は、検証されたT細胞応答に関して、収穫が少ない。例えば、1つの研究では、10個の最も優勢なHLAクラスI対立遺伝子を予測するための100個のSARS-Cov-2由来のエピトープをテストし、12個のみが支配的なエピトープとして確認され、すなわち、COVID-19ドナーCD8+T細胞の>50%によって認識された。これは、いくつかの感染症ワクチン及びがんワクチンの臨床試験の分野で確認された免疫応答率と、並びに個別化変異ネオアンチゲンベースのエピトープの比較的低い確認レベルと一致する(28～30)。
ペプチドワクチンデザインのこれらの制限を克服するために、本発明者らは、単一のHLA対立遺伝子を使用する代わりに、完全なHLA遺伝子型を有する個体の民族的に多様なインシリコヒトコホートを使用して、PolyPEPI-SCoV-2をデジタル的に開発した。各個体の1つだけではなく複数の自家HLA対立遺伝子に拘束されるが、民族的に多様な集団における対象の高い割合の中で共有もされている、複数のいわゆるパーソナルエピトープ(PEPI)が選択された。特に、このインシリコヒトコホートは、PEPIのコンセプトと共に、以前に、79のワクチン臨床試験の免疫応答率、並びに転移性大腸がん患者で行われた臨床試験において本発明者らのPolyPEPI1018がんワクチンの注目すべき免疫原性(6個の抗原のうちの少なくとも3つに対する80%のCD8+T細胞応答)を回顧的に予測した(31～33)。乳がん患者のために調製された個別化ポリペプチド混合物中のPEPIによって生成されたCD8+T細胞応答は、それらが4つの腫瘍抗原に対する最後のワクチン接種後14か月間(436日)検出されたために、長く持続することが証明された(34)。
感染の自然な経過中のSARS-CoV-2の明白な長期メモリーT細胞形成能力と一致して、本ポリペプチドワクチンは、(1)SARS-CoV-2の全ての4つの構造タンパク質を標的化することによって、各対象においてロバストかつ広範な免疫応答を誘導するように、(2)各患者において複数の免疫原性標的を確保することによって、潜在的なウイルス進化の影響に対処し、それを克服するように、及び(3)ペプチドのパーソナルエピトープカバレッジによって、ヒト民族の異なる感度に対処するようにデザインされている。COVID-19に対するワクチン候補のデザイン及び前臨床特性評価が、本明細書に記載される。免疫原性及び忍容性は、2つのマウスモデルで確認され、2回目の投与によってブーストされたロバストなCD4+及びCD8+T細胞応答、並びに体液性応答の誘導をもたらした。回復期COVID-19患者の血液試料において、感染症からの回復につながるSARS-CoV-2誘導免疫レパートリーの重要な成分を表すワクチン特異的免疫細胞が、全てのペプチド及び全ての対象において検出された。ペプチドワクチンは、死んだウイルス又は弱毒化ウイルス及び組換えタンパク質から作製された従来型ワクチンと比べて、安全かつ経済的な技術である。数キログラムのスケールで製造する合成ペプチドは、比較的安価であり、mRNA生産よりも明らかに成熟している。この技術は、特定の疾患/病原体に対する抗原標的の特定だけではなく、より重要なことに、大きなコホートにおける個体の免疫系が応答することができる抗原の計算による決定を可能にする。
材料及び方法
患者/ドナー
ドナーを、SARS-CoV-1又はSARS-CoV-2感染の彼らの病歴に基づいて招集した。血液試料を、オランダ国内の個別の医療研究センターにおいて、承認されたプロトコール(NL57912.075.16.)の下で回復期の個体(n=15)から採取し、又はPepTC Vaccines Ltd(n=2)が採取した。非曝露の個体(n=5)からの血清及びPBMC試料が2018年以前に採取されており、Nexelis-IMXP(Belgium)によって提供された。提供された全てのドナーは、インフォームドコンセントに署名した。研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施した。COVID-19回復期患者(n=17;16人が無症候性/軽度の疾患を有し、1人が重度疾患を有した)からの血液試料を、症状の開始から17～148日目に得た。驚くべきことに、1つの陽性のIgM抗体応答が、健康なドナーの中で見出され、これを更なる分析から除外した。対象の人口統計学的及びベースライン情報を、表8に提供する。
オランダからの回復期ドナー患者のHLA遺伝子型決定を、次世代シーケンシングを使用して、IMGM laboratories GmbH(Martinsried,Germany)によって行った。2人のPepTCドナーのHLA遺伝子型決定を、次世代シーケンシング(Illumina)を使用して、Laboratory Corporation(LabCorp;Burlington,VA,USA)により口腔粘膜検体採取から実行し、HLA対立遺伝子解読は、IMGT/HLAデータベースバージョン3.38.0に基づいた。オランダからの回復期のドナー患者のHLA遺伝子型決定は、次世代シーケンシングを使用して、IMGM laboratories GmbH(Martinsried,Germany)によって行った。このコホートは、合計で46個の異なるHLAクラスI対立遺伝子(15個のHLA-A*、18個のHLA-B*及び13個のHLA-C*)と、35個の異なるHLAクラスII対立遺伝子(14個のDRB1、12個のDQB1及び9個のDPB1)を使用する。対象のHLA遺伝子型データを表8Bに提供する。
動物
CD34+トランスジェニックヒト化マウス(Hu-マウス)。雌NOD/Shi-scid/IL-2Rγヌル免疫不全マウス(Charles River Laboratories,France)を、ヒト臍帯血から単離された造血幹細胞(CD34+)を使用してヒト化した。>50%のヒト化率(hCD45/総CD45)を有するマウスだけを研究中に使用した。実験は、20～30週齢の雌マウスを用いて行った。
BLLB/cマウス.実験は、6～8週齢の雌BALB/cマウス(Janvier,France)を用いて行った。
Figure 2023520562000014
Figure 2023520562000015
ワクチンデザイン
SARS-CoV-2構造タンパク質(S、N、M、E)をスクリーニングし、9個の異なる30-merペプチドを多段階プロセス中に選択した。最初に、配列多様性分析を実施した(NCBIデータベースの2020年3月28日の時点で)(35)。登録IDは、次の通りであった:NC_045512.2、MN938384.1、MN975262.1、MN985325.1、MN988713.1、MN994467.1、MN994468.1、MN997409.1、MN988668.1、MN988669.1、MN996527.1、MN996528.1、MN996529.1、MN996530.1、MN996531.1、MT135041.1、MT135043.1、MT027063.1、及びMT027062.1。最初の(太字の)IDは、GenBank参照配列を表す。4つの構造タンパク質配列の翻訳されたコード配列を整列させて、複数の配列アライメント(Clustal Omega,EMBL-EBI,United Kingdom)を使用して比較した(36)。19の配列のうち、15が完全に同じであった。しかしながら、4つのNタンパク質配列において単一のAAが変化している:MN988713.1:N194 S->X、MT135043.1:N343 D->V、MT027063.1:N194 S->L、MT027062.1:N194 S->L。得られたAA置換はNタンパク質配列の2つの位置(AA194及び343)のみに影響を与え、これらのいずれも、ワクチン開発のための標的として選択されたエピトープ(配列番号2、5、9、及び12～17)中では発生しなかった。ウイルスSタンパク質における13個の報告された一文字変化(D614G、S943P、L5F、L8V、V367F、G476S、V483A、H49Y、Y145H/del、Q239K、A831V、D839Y/N/E、P1263L)のうちのただ1つ(H49Y)が、PolyPEPI-SCoV-2ワクチンに関与していたが、このバリアントの普及率は、その後のウイルス単離物中で減少している(37)。ペプチド選択に関する更なる詳細は、結果のセクションに提供されており、9個の選択された30-merペプチドの得られた組成物は表9に示されている。
ヒトコロナウイルス株との交差反応性
PolyPEPI-SCoV-2ワクチンの配列を、SARS-CoV、MERS-CoV及び風邪(季節性)ヒトコロナウイルス株のものと比較して、可能な交差反応領域を明らかにした。米国疾病予防対策センター(Centers for Disease Control and Prevention (CDC))によれば、ヒト集団における風邪コロナウイルス感染症は、4つのコロナウイルス群:αコロナウイルス229E及びNL63、並びにベータコロナウイルスOC43及びHKU1によって引き起こされる(38)。構造タンパク質のペアワイズアライメントも、以下の参照配列ID:229E:P15423(S)、P15130(N)、P19741(E)、P15422(M);NL63:Q6Q1S2(S)、Q6Q1R8(N)、Q6Q1S0(E)、Q6Q1R9(M);OC43:P36334(S)、P33469(N)、Q04854(E)、Q01455(M);HKU1(単離物N1):Q5MQD0(S)、Q5MQC6(N)、Q5MQC8(E)、Q5MQC7(M)を用いて、Uniprotを使用して実施した(39)。加えて、コロナウイルス株を、PolyPEPI-SCoV-2ワクチンを含む9個の30-merペプチドでアライメントした。エピトープの最小限の要件については、8個のAA長の領域を、潜在的な交差反応性を担う領域としてスクリーニングした(スライディングウインドウ)。加えて、より短い(及びより長い)長さのマッチングする連続ペプチド断片を記録し、分析中に報告した。
インシリコヒトコホート
モデル集団は、その完全なHLAクラスI遺伝子型が利用可能であった(2×HLA-A、2×HLA-B、2×HLA-C)、全世界のいくつかの民族群を表す433人の個体のコホートである。モデル集団は、90人のヨルバアフリカ人(YRI)、90人のヨーロッパ人(CEU)、45人の中国人(CHB)、45人の日本人(JPT)、67人の混合民族の対象(米国、カナダ、オーストラリア、ニュージーランド)、及び96人のHIVデータベースからの対象(MIX)から集められた(40～43)。HLA遺伝子型を、PCR手法、Affymetrix 6.0及びIllumina 1.0 Million SNPマスアレイ、並びにReference Strand-mediated Conformational Analysis(RSCA)又はシーケンシングベースのタイピング(SBT)により6つのHLA遺伝子の高解像度HLAタイピングを使用して決定した(44～46)。モデル集団の特性評価は、以前に報告された(31)。このコホートは、現在の、グローバルな一般的(Common)、中間的(Intermediate)及び十分に報告された(Well-Documented)(CIWD)対立遺伝子の97.4%を代表し、主要な民族をよく表している(2020年に公開されたデータベース3.0)、合計で152の異なるHLAクラスI対立遺伝子(49のHLA-A*、71のHLA-B*及び32のHLA-C*)を使用した(表8A)(Hurleyら、2020)。モデル集団のA*、B*及びC*対立遺伝子の頻度は、CIWDデータベースの>800万のHLA遺伝子型の対象について報告された頻度と相関する(それぞれ、R=0.943、0.869、0.942、p<0.00001)(図24)。
Figure 2023520562000016
4桁対立遺伝子分解能での特徴的なHLAクラスII遺伝子型(2×HLA-DRB、2×HLA-DP、及び2×HLA-DQ)を有する356人の個体の第2のモデルコホートを、cDNA又はゲノム配列の対立遺伝子組成を評価するために開発された米国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information(NCBI))が運営するオンラインで利用可能なリポジトリであるdbMHCデータベースから得た(47)。世界中の多くの国における広範囲の民族に対してサンプリングを実施した。合計で、このデータベース中の356人の対象が十分な分解能を有するHLAクラスII遺伝子型データを有していた(少なくとも4桁分解能を有する2×HLA-DRB、2×HLA-DP、及び2×HLA-DQ)。HLA遺伝子型決定をSBTによって実施した。
大きな米国コホート(n=16,000)
16,000人の個体からのデータを含むデータベースを、米国骨髄バンク(National Marrow Donor Program(NMDP))から16の民族群の各々から1,000人のドナー(500人の男性及び500人の女性)を得ることによって作り出した(48)。16の民族群は:アフリカ人、アフリカ系アメリカ人、アジア太平洋諸島人、フィリピン人、黒人カリブ人、白人、中国人、ヒスパニック、日本人、韓国人、ネイティブアメリカンインディアン、南アジア人、ベトナム人、米国人、中東/北アフリカ領域、ハワイ人、及び他の太平洋諸島人であった。HLA遺伝子型決定を、>0.7の平均「タイピング分解能スコア」を用いた配列特異的オリゴヌクレオチド(SSO)及び配列特異的プライマー(SSP)法を使用して、NMDPに動員された研究所により実施した(49)。
ペプチド及びPolyPEPI-SCoV-2ワクチンの調製
9-mer(s2、s5、s9、n1、n2、n3、n4、e1、m1)及び30-mer(S2、S5、S7、N1、N2、N3、N4、E1、M1)ペプチドを、固相ペプチド合成を使用して、Intavis Peptide Services GmbH&Co.KG(Tubingen,Germany)及びPEPScan(Lelystad,The Netherlands)により製造した。アミノ酸配列を、9-merテストペプチド(表9、太字)及び30-merワクチンペプチドの両方について表9に提供する。動物研究用のペプチドワクチンを、等質量の9個の30-merペプチドをDMSO中に溶解して1mg/mLの濃度を達成し、次いで純水で0.2mg/mLの最終濃度まで希釈することによって調製し、使用するまで凍結保存した。注射準備済みワクチン製剤を、製造業者によって提供される標準2シリンジプロトコールに従って、等量の解凍したペプチドミックス溶液とモンタニドISA 51VGアジュバント(Seppic,Paris,France)を乳化させることによって調製した。
エピトープ予測及び分析
各個体の中の≧3のHLAクラスI対立遺伝子結合エピトープ(PEPI)の予測を、免疫エピトープデータベース(IEDB)ベースのエピトープ予測法を使用して実施した。抗原をオーバーラッピング9-mer及び15-merペプチドでスキャンして、対象のHLAクラスI対立遺伝子に結合するペプチドを特定した。選択パラメータを、直接結合アッセイ(327個の結合及び100個の非結合HLA-エピトープペア)を使用することにより実験的に特徴付けられた427個のHLA-ペプチドペアのインハウスセットで検証した。特異性及び感度の両方ともに、真のHLA対立遺伝子-エピトープペアの予測で93%をもたらした。HLAクラスIIエピトープの予測を、NetMHCpan(2.4)予測アルゴリズムによって実施し、1人の個体当たり≧4のHLAクラスII結合エピトープが、HLAクラスII PEPIと定義される。
前臨床マウス試験デザイン
36匹のHu-マウス及び36匹のBALB/cマウスは、PolyPEPI-SCoV-2ワクチン(200μLの溶液中に0.66mg/kg/ペプチド;n=18)、又はモンタニドISA 51 VGアジュバント(200μLビヒクル;n=18)中に乳化させた20%DMSO/水を、皮下投与により0日目及び14日目に受け、フォローアップ期間は28日目に終了した。14、21、及び28日目からの試料を分析した(コホート当たりn=6)。試験を、Transcure Bioservicesの施設(Archamps,France)で実施した。マウスを、苦痛の予期せぬ徴候について毎日監視した。毛並み(スコア0～2)、動き(0～3)、活動(0～3)、蒼白(0～2)、及び体重(0～3)(正常状態は0と採点した)を監視することによって、完全臨床採点評価を毎週実施した。
この試験で説明された全ての手順は、地元の倫理委員会(CELEAG)によって審査及び承認され、フランス科学技術省によって検証されている。ワクチン誘導T細胞応答を、マウスの脾臓細胞のex vivo ELISpot及び細胞内サイトカイン染色アッセイ(ICS)(以下に詳述)によって評価した。抗体応答を、血漿試料中の総IgGの測定によって調査した(以下に詳述)。
ELISpot/FluoroSpotアッセイ
動物試験のためのex vivo ELISPotアッセイを、以下のように実施した。IFN-γ産生T細胞を、20時間/ペプチド刺激した2×105個の脾臓細胞(10μg/ml、最終濃度)を使用して特定した。脾臓細胞を9-merペプチド(4つのN特異的ペプチド、N-プール(n1、n2、n3、n4)、3つのS特異的ペプチドのプール、S-プール(s2、s5、s9)、Eタンパク質由来ペプチド、e1若しくはMタンパク質由来ペプチド、m1))で、又は9-merと同じ方法でプールされた30-merペプチド(ペプチドN1、N2、N3、及びN4を含むN-プール)、ペプチドS2、S5及びS9を含むS-プール、並びに個々のペプチドE1及びM1で処理した。ELISpotアッセイは、Hu-マウスコホートについては、mab TechからのヒトIFN-γ ELISpot PROキット(ALP;参照番号3321-4APT-2)を、Balb/cマウスコホートについては、mab TechからのマウスIFN-γ ELISpot PROキット(ALP;参照番号3321-4APT-10)を使用して、製造業者の使用説明書に従って実施した。非刺激の(DMSO)アッセイ対照のバックグラウンドスポット形成単位(SFU)を各データ点から差し引いて、次いでデルタSFU(dSFU)を算出した。PMA/イオノマイシン(Invitrogen)を陽性対照として使用した。
回復期ドナー試験法のためのex vivo FluoroSpotアッセイを、Nexelis-IMXP(Belgium)によって以下のように実施した。IFN-γ/IL-2 FluoroSpotプレートをRPMI-10% FBSでブロックし、次いでペプチド(5μg/mlの最終濃度)又はペプチドプール(ペプチド当たり5μg/mlの最終濃度)を関連するウェルに添加した。PBMCを低温貯蔵庫から取り出し、培養基中で解凍した。次いで、200,000個のPBMC細胞/ウェルを三通りで(刺激条件)又は六通りで(参照条件)でプレートし、37℃、5%CO2で一晩インキュベートし、その後発色させた。FluoroSpotプレートの発色を製造業者の推奨に従って実施した。細胞を除去後、0.1%のBSAを含有するPBS中で希釈した検出抗体をウェルに添加し、FluoroSpotプレートを室温で2時間インキュベートした。Mabtech IRIS(商標)自動FluoroSpotリーダーを使用する読出しの前に、FluoroSpotプレートを空にして、室温で遮光して24時間乾燥させた。全てのデータは、Mabtech IRIS(商標)リーダーを用いて取得し、Mabtech Apex TMソフトウェアを使用して分析した。非刺激(DMSO)陰性対照、CEF陽性対照(CMV、EBV及びインフルエンザ由来のT-細胞エピトープ、Mabtech,Sweden)、及び市販のSARS-CoV-2ペプチドプール(SARS-CoV-2 S N M O定義ペプチドプール(3622-1)-Mabtech,Sweden)を、アッセイ対照として追加した。ex vivo FluoroSpotの結果は、テスト結果が非刺激の対照(dSFU)を差し引いた後のDMSO陰性対照よりも高い場合に、陽性と見なされた。
回復期ドナー試験法のための富化ELISpotアッセイを、Nexelis-IMXP(Belgium)によって以下の通りに実施した。PBMCを低温貯蔵庫から取り出し、培養基中で解凍した。PBMCを、ペプチドプール(ペプチド当たり5μg/ml)の存在下で、4,000,000細胞/24ウェルで播種し、37℃、5%CO2で7日間インキュベートした。培養の1日目及び4日目に、培地を新鮮なものに代えて、5ng/mLのIL-7、又は5ng/mLのIL-7及び4ng/mlのIL-2(R&D Systems)をそれぞれ補充した。培養の7日後に、PBMCを採取し、16時間休ませた。休ませたPBMCをトリパンブルー溶液、0.4%(VWR)及びCellometer K2 Fluorescent Viability Cell Counter(Nexcelom)を使用して計数し、10%ヒト血清HI、2mMのL-グルタミン、50μg/mlのゲンタマイシン及び100μMのβ-Meを含むRPMI 1640中200,000個の細胞/ウェルで、IFN-γ/Granzyme-B/TNF-αFluoroSpotプレート(Mabtech)上に播種し、ペプチド(5μg/ml)、又はペプチドプール(ペプチド当たり5μg/ml)を含有する関連したFluoroSpotウェルにいれた。FluoroSpotプレートを37℃で5%のCO2にて一晩インキュベートし、その後発色させた。全てのデータは、Mabtech IRIS(商標)リーダーを用いて取得し、Mabtech Apex TMソフトウェアを使用して分析した。DMSO、培地のみ、市販のCOVIDペプチドプール(SARS-CoV-2 S N M O定義ペプチドプール[3622-1]-Mabtech)、及びCEFを、アッセイ対照として1μg/mlの濃度で含めた。陽性基準は、バックグラウンド(dSFU)を差し引いた後、非刺激対照の>1.5倍であった。
細胞内サイトカイン染色(ICS)アッセイ
前臨床マウス試験のためのex vivo ICSアッセイを以下の通りに実施した。脾臓細胞を、20時間の刺激後にELISpotプレートから取り出し、従来の96ウェル平底プレートに移し、BD GolgiStop(商標)と共に、製造業者の推奨に従って4時間インキュベートした。BD GolgiStop(商標)タンパク質輸送阻害剤(モネンシンを含有する;カタログ番号554715)と共にBD Cytofix/Cytoperm Plus Kitを使用して、製造業者の使用説明書に従って、フローサイトメトリを実施した。フローサイトメトリ分析及びサイトカインプロファイル決定を、Attune NxTフローサイトメーター(Life Technologies)で実施した。合計で2×105個の細胞を、CD45+、CD3+、CD4+、又はCD8+T細胞をゲーティングして分析した。25を下回るカウントを0と評価した。≧25のスポットカウントを、非刺激(DMSO)対照を差し引くことによってバックグラウンド補正した。PMA/イオノマイシン(Invitrogen)を陽性対照として使用した。アッセイ対照として、マン・ホイットニー検定を用いて、陰性対照(非刺激)及び陽性対照(PMA/イオノマイシン)を各サイトカインについて比較した。対照間で統計的差異が決定される場合、他の刺激条件に対応する値を分析した。以下の染料をHu-マウスコホートに使用した:MAb11 502932(Biolegend)、MP4-25D2 500836(Biolegend)、4S.B3 502536(Biolegend)、HI30 304044(Biolegend)、SK7 344842 (Biolegend)、JES6-5H4 503806 (Biolegend), VIT4 130-113-218 (Miltenyi)、JES1-39D10 500904(Biolegend)、SK1 344744(Biolegend)、JES10-5A2 501914(Biolegend)、JES3-19F1 554707(BD)、及びNA 564997(BD)。以下の染料を、BALB/cマウスコホートに使用した:11B11 562915(BD)、MP6-XT22 506339(Biolegend)、XMG1.2 505840(Biolegend)、30-F11 103151(Biolegend)、145-2C11 100355(Biolegend)、JES6-5H4 503806(Biolegend)、GK1.5 100762(Biolegend)、JES1-39D10 500904(Biolegend)、53-6.7 100762(Biolegend)、eBio13A 25-7133-82(Thermo Scientific)、JESS-16E3 505010(Biolegend)、及びNA 564997(BD)。
回復期のドナー試験法のためのex vivo ICSアッセイを、Nexelis-IMXP(Belgium)によって実施した。簡単に言うと、200,000個のPBMC細胞/ウェルを解凍した後、PBMCを、10%ヒト血清HI、2mMのL-グルタミン、50μg/mlのゲンタマイシン、及び100μMの2-Meを含む合計のRPMI中、ペプチド(5μg/mL)又はペプチドプール(ペプチド当たり5μg/mL)の存在下で、滅菌丸底96ウェルプレートに播種した。2時間のインキュベーション後、BD GolgiPlug(商標)(BD Biosciences)を、培地中1μl/mlの濃度で96ウェルプレートに添加した。10時間のインキュベーション後、プレートを遠心分離し(800g、3分、8℃)、37℃で10分間インキュベートし、Zombie NIR Viability色素(Biolegend)を各ウェルに添加した。プレートを、遮光して、室温で15分間インキュベートした。インキュベーション後、PBS/0.1%のBSAをウェル毎に添加し、プレートを遠心分離した(800g、3分、8℃)。その後、細胞をFcRブロッキング剤中、4℃で5分間インキュベートし、次いで、染色混合物(抗CD3、Biolegend、抗CD4、及び抗CD8抗体を含有する;BD Biosciences)を各ウェルに添加した。4℃で30分間のインキュベーション、洗浄及び遠心分離(800g、3分、8℃)の後、製造業者(BD Biosciences)の推奨に従って、細胞を透過処理し、固定化した。固定化後、サイトカイン染色混合物(抗IFN-γ、抗IL-2、抗IL-4、抗IL-10、及び抗TNF-α抗体を含有する、Biolegend)を各ウェルに添加した。プレートを4℃で30分間インキュベートし、次いで、収集の前に2回洗浄した。全てのフローサイトメトリデータは、LSRFortessa(商標)X-20で収集し、FlowJo V10ソフトウェアを使用して分析した。DMSO陰性対照を、テストペプチド又はプールを使用して得られた各データ点から差し引いた。
抗体ELISA
マウス試験のためのELISAを、BALC/cコホートにはIgG (Total)Mouse Uncoated ELISA Kit(Invitrogen、#88-50400-22)、及びHu-マウスにはIgG(Total)Human Uncoated ELISA Kit(Invitrogen、#88-50550-22)を用いて、製造業者の使用説明書に従って、血漿試料中の総マウスIgG産生の定量測定用に実施した。14日目、21日目、及び28日目に採取した試料(時点ごとに群当たりn=6)を使用して分析を実施した。吸光度をEpoch Microplate Reader(Biotech)で読み取り、Gen5ソフトウェアを使用して分析した。
回復期ドナー試験法のためのELISAを、ヒト血清及び血漿中のCOVID-19に対するIgM抗体の決定用のDiaPro COVID-19 IgM酵素イムノアッセイ、ヒト血清及び血漿中のCOVID-19に対するIgG抗体の決定用のDiaPro COVID-19 IgG酵素イムノアッセイ、並びにヒト血清及び血漿中のCOVID-19に対するIgA抗体の決定用のDiaPro COVID-19 IgA酵素イムノアッセイを使用して、製造業者(Dia.Pro Diagnostic Bioprobes S.r.l.,Italy)の使用説明書に従って、Mikromikomed Kft(Budapest,Hungary)によって実施した。総N特異的Ig抗体の決定については、SARS-CoV-2に対する抗体(IgGを含む)の定量的検出のためのRoche Elecsys(商標)抗-SARS-CoV-2イムノアッセイを、COBAS e411分析器(ディスクシステム;ROCHE、Switzerland)と共に製造業者の使用説明書に従って用いた。個別の医療研究センターを介して、EUROIMMUN ELISAアッセイを実施し、回復期ドナーにおけるS1特異的IgGレベルを決定した。抗SARS-CoV-2 ELISAプレートを、SARS-CoV-2に対する抗体が結合するSARS-CoV-2からの組換えS1構造タンパク質でコーティングした。この抗原を他のコロナウイルス科、特にSARS-CoV-1に対するその比較的低い相同性のために選択した。イムノアッセイを、製造業者の使用説明書に従って実施した。
シュードパーティクル中和アッセイ
マウス血清中の中和抗体を、細胞ベースのシュードパーティクル中和アッセイ(PNA)を使用して、SARS-CoV-2シュードパーティクル中和アッセイ試験法で見られる投与範囲に従って、評価した。ACE-2受容体を発現するVero E6細胞(Vero C1008(ATCC番号CRL-1586、US)を、20000細胞/ウェルで播種し、80%の細胞集密度を達成した。血清試料及び対照(内部生成されたヒト回復期血清のプール)を、細胞増殖培地中で、1/25若しくは1/250(試料用)又は1/100(対照用)の開始希釈で繰り返し希釈し、続いて連続希釈した(2倍希釈、5回)。並行して、SARS-CoV-2シュードウイルス(Wuhan株からのスパイク(マイナス19C末端アミノ酸)を有するKerafastシステムを使用して、Nexelisによって調製)を、所望の濃度(所定のTU/mLに従って)に達するように希釈した。次いで、シュードウイルスを希釈した血清試料に添加し、37℃、CO2下で1時間予備インキュベートした。次いで、混合物を、事前に播種したVero E6細胞層に添加し、プレートを37℃で5%のCO2にて18～24時間インキュベートした。インキュベーション及び培地の除去後に、ONE-Glo EXルシフェラーゼアッセイ基質、Promega、カタログ番号E8110を細胞に添加し、振盪しながら室温で3分間インキュベートした。SpectraMax i3xマイクロプレートリーダー及びSoftMax Pro v6.5.1(Molecular Devices)を使用して、ルミネセンスを測定した。各希釈物についてのルミネセンスの結果を、マイクロソフトエクセル(マイクロソフトオフィス365用)を使用する4パラメータロジスティック回帰(4PL)を使用して、滴定曲線を生成することに用いた。力価は、ルミネセンスが、50%の中和に相当する50という所定のカットポイントと等しい試料の希釈度の逆数として定義された。このカットポイントは、50%のフランキングポイントを使用する直線回帰を用いて確立された。
統計的分析
必要に応じて、両側t検定又はマン・ホイットニー検定を使用して、群間及び群内の有意性を比較し、p<0.05を有意と見なした。ピアソン検定を実施して、相関を評価した。相関は、R>0.7の場合に強いと見なされ、0.5<R≦0.7の場合に中程度と見なされ、0.3<R≦0.5の場合に弱いと見なされた(50)。
結果
PolyPEPI-SCoV-2の個体への調整
PolyPEPI-SCoV-2のデザイン中に、本発明者らは、インシリコヒトコホート中の対象のHLA-遺伝子型データを用いて、CD8+T細胞応答を誘導させる目的で、4つの選択されたSARS-CoV-2構造タンパク質の最も免疫原性のペプチド(すなわち、HLAクラスI PEPIホットスポット、9-mer)を決定した。特定された9-mer PEPIホットスポットの配列は、次いで、ウイルスタンパク質配列に基づいて30-merまで伸長され、CD4+T細胞応答を誘導させる目的で、HLAクラスII結合PEPI(15-mer)の数を最大化させた。
最初に、本発明者らは、インシリコヒトコホート中の各対象に対して、9mer(HLAクラスI)及び15-mer(HLAクラスII)フレームをそれぞれ使用して、19個の既知のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質の保存領域のAA配列について、彼らのHLAクラスI及びクラスII遺伝子型の各々(6個のHLAクラスI及び8個のHLAクラスII対立遺伝子)についてエピトープ予測を実施した(図1)。次いで、本発明者らは、複数の(≧3)自家HLA対立遺伝子に結合することができるエピトープ(PEPI)を選択した。本発明者らは、各個人に関して、いくつかのHLAに拘束されるエピトープを特定した(S-1タンパク質のみで、平均166個のエピトープ)。対照的に、PEPIは、全ての民族において非常に低いレベルで表されている(平均で、14個の多重HLA結合エピトープ、図12)。
得られたPEPIリストから、本発明者らは、民族とは無関係に、モデル集団中の高い割合の個体の中で共有される(頻繁な)オーバーラッピングするクラスI及びクラスII PEPIを含む9個の30-merポリペプチド断片を特定した(表9)。個体及び集団レベルの両方で、多重抗原性免疫応答を最大化するために、本発明者らは、大きなスパイク(S)及び核タンパク質(N)タンパク質から2つ以上のペプチドを、より短い膜(M)及びエンベロープ(E)タンパク質から1つだけのペプチドを選択した。ペプチド:Sに由来する3つのペプチド、Nに由来する4つのペプチド、及び各MとEに由来する1つのペプチドの化学的特性及び製造可能性の特性も考慮しながら、SARS-CoV-2ウイルスの4つの構造ウイルス抗原から、合計で9つの30-merペプチドをワクチンのために選択した。S-1タンパク質の受容体結合ドメインからのペプチドは含まれなかった。全体で、モデル集団の各メンバーは、9つのペプチドのうちの少なくとも2つに対するPEPIを有しており、97%が、少なくとも3つに対するPEPIを有していた(表9)。
Figure 2023520562000017
Figure 2023520562000018
本発明者らは、関連するSARS-CoV-2抗原と100%の配列同一性を有する、SARS-CoV-1に由来する確認された線状B細胞エピトープを、長いペプチドの潜在的なB細胞産生能力を考慮して、実験的に特定した(54)。PolyPEPI-SCoV-2ワクチンのNタンパク質に由来するペプチド中に位置する3つのオーバーラッピングエピトープ及びSタンパク質に由来するペプチド中に位置する1つのエピトープは、重症急性呼吸器症候群(SARS)の回復期患者の血清と反応性であった。これは、S及びNタンパク質の上記抗原性部位がSARS-CoV-1に対する体液性免疫応答を引き起こす上で重要であり、ヒトのSARS-CoV-2に対しても可能性が高いことを示唆している。
予想通りに、PolyPEPI-SCoV-2は、SARS-CoV-2とSARS-CoVとの間の高い配列相同性のために、SARS-CoVと交差反応性であるいくつかの(9つのうち8つの)ペプチドを含有する。PolyPEPI-SCoV-2ペプチドとアルファコロナウイルス(229E及びNL63)、ベータコロナウイルス(OC43、HKU1)並びにMERSに属する風邪(季節性)コロナウイルス株との間の配列類似性は低い。したがって、本ワクチンと以前にコロナウイルス感染した個体との間の交差反応性は低いままであり、本ワクチンのM1ペプチドのみが関連し得る(方法及び表10を参照されたい)。
Figure 2023520562000019
マウスにおけるPolyPEPI-SCoV-2ワクチンに誘導された広範なT細胞応答
非ヒト化BALB/cモデルにおいて、及びCD34+Hu-NCG(Hu-マウス)マウスのヒト化免疫設定において2週間離して投与された(0日目及び14日目)1回投与及び2回のワクチン投与後の誘導された免疫応答を測定するために、PolyPEPI-SCoV-2ワクチンの前臨床免疫原性試験法を実施した。免疫化の後に、マウスはいかなる臨床スコアもないことを表し(スコア0、正常からの逸脱がないことを表す)、いかなる副作用も免疫嫌悪もないことを示唆している。加えて、各時点で実施された顕微鏡観察による剖検は、脾臓、肝臓、腎臓、胃及び腸におけるいかなる目に見える臓器の変化も明らかにしなかった。繰り返しワクチン投与も忍容性が良好であり、免疫毒性又はその他の全身性有害事象の徴候は検出されなかった。全体として、これらのデータは、この試験で使用された製剤がマウスにおいて安全であったことを強く示唆している。
IFN-γ産生ワクチンに誘導されたT細胞を、初回投与後の14日目(D14)及び2回目投与後の21日目(D21)と28日目(D28)に測定した。14日目には、PolyPEPI-SCoV-2処置は、ビヒクル(DMSO/モンタニドで乳化された水)処置よりも多くのCD8+T細胞によるIFN-γ産生を誘導せず、この後者は、おそらくはモンタニド媒介非特異的応答に起因して予想外の高い応答をもたらした。それでも、21日目及び28日目には、PolyPEPI-SCoV-2の2回目の投与は、ビヒクル対照群と比べて、ペプチドの30-mer及び9-merプールで刺激された脾臓細胞に対して、それぞれ6倍及び3.5倍だけ、IFN-γ産生をブーストした(図13A)。21日目及び28日目でのPolyPEPI-SCoV-2処置マウスからのT細胞によるIFN-γ産生の増加は、スポット形成細胞の数の増加によって確認され、これは、以下の条件について統計的有意性に達した:それぞれ、21日目での30-merのS-プール、ペプチドE1、9-merのN-プール及びペプチドe1並びに28日目でのペプチドE1及び9-merのS-プール(図14A～C)。
免疫不全Hu-マウスでは、14日目に、PolyPEPI-SCoV-2処置がペプチドの9-merプールで刺激された脾臓細胞でIFN-γ産生を2倍増加させたが、30-mer刺激脾臓細胞では増加は観察されなかった。21日目及び28日目には、PolyPEPI-SCoV-2の2回目の投与が、ペプチドの9-mer及び30-merプールで刺激された脾臓細胞で、IFN-γ産生を、それぞれ2倍及び4倍だけブーストした(図13B)。重要なことに、9-merで検出されたCD8+T細胞応答及び30-merで検出されたCD4+とCD8+T細胞応答の両方が共に、両方の動物モデルにおいてワクチンによって標的化される4つ全てのウイルスタンパク質に対して等しく向けられた(図13C、D、及び図14D～Fの詳細な結果)。
ワクチン接種によって引き起こされるT細胞応答の極性化(polarization)を調べるために、細胞内染色(ICS)アッセイを行った。T細胞の低い頻度のために、個々のペプチド特異的T細胞は、ICSによる視覚化は、ELISpotによるものよりも困難であったが、TNF-α及びIL-2のTh1型サイトカインを産生するCD4+とCD8+T細胞の明確な集団が、BALB/c及びHu-マウスモデルの両方で、ビヒクルのみ(DMSO/モンタニドで乳化された水)を受けた動物と比較して検出可能であった(図15)。Th2型サイトカインのIL-4及びIL-13については、分析は、あらゆる時点においていかなる特異的応答も明らかにしなかった。IL-5及び/又はIL-10サイトカイン産生CD4+T細胞の低レベルが、両方のモデルで検出されたが、これは、BALB/cマウスの28日目についてだけ、ビヒクル対照とは著しく異なっていた。更にこのコホートについては、6匹のマウスのうち5匹で(1つの外れ値)Th1/Th2のバランスがTh1に向かってシフトしたままであって、ワクチンによって引き起こされた全体的なTh1に歪んだT細胞応答を確認した(図16)。
PolyPEPI-SCoV-2ワクチン接種はまた、BALB/cでの総マウスIgG及びHu-マウスでのヒトIgGによって測定されるように、体液性応答も誘導した。BALB/cマウスでは、ワクチン接種は、ビヒクルのみを受けた対照動物と比べて、初回投与後(14日目)にワクチン誘導IgG産生をもたらした。2回目の投与後のより遅い時点で、BALB/c及びHu-マウスモデルの両方に、IgGの上昇が観察された(図17)。予想通りに、PolyPEPI-SCoV-2ペプチドが構造的エピトープ(conformational epitopes)を含有しない限り、ワクチン接種は、シュードパーティクルを用いた中和アッセイ(データ示さず)を使用するHu-マウスの血清から評価されるように、中和抗体をもたらさなかった。
2つの動物モデルにおけるPolyPEPI-SCoV-2ワクチンにより誘導された広範なT細胞応答
BALB/c及びHu-マウスモデルにおいて2週間離して投与された(0日目及び14日目)1回投与及び2回のワクチン投与後の誘導された免疫応答を測定するために、PolyPEPI-SCoV-2ワクチンの前臨床免疫原性試験法を実施した。免疫化の後に、マウスは、14、21又は28日目にいかなる臨床スコアも表さず(スコア0、正常からの逸脱がないことを表す)、いかなる副作用も免疫嫌悪もないことを示唆している(表10A及びB)。加えて、各時点で実施された顕微鏡観察による剖検は、脾臓、肝臓、腎臓、胃及び腸におけるいかなる目に見える臓器の変化も明らかにしなかった(表10C)。繰り返しワクチン投与も忍容性が良好であり、免疫毒性又はその他の全身性有害事象の徴候は検出されなかった。全体として、これらのデータは、PolyPEPI-SCoV-2がマウスにおいて安全であったことを強く示唆している。
ワクチンに誘導されたIFN-γ産生T細胞を、初回投与後の14日目及び2回目投与後の21日目と28日目に測定した。ワクチンによって誘導されたT細胞を、CD4+及びCD8+T細胞応答を評価するために、それらのソースタンパク質:S、N、M及びEに従って4つのプールにグループ分けされた9つの30-merワクチンペプチドを使用することによって検出した。CD8+T細胞応答はまた、具体的には、4つのプール中の9つのワクチンペプチドの各々について上で定義された共有HLAクラスI PEPIに対応する短い9-merテストペプチド(s、n、m、及びeペプチド;表9の太字)を使用して測定した。
BALB/cマウスでは、14日目に、PolyPEPI-SCoV-2ワクチン接種は、ビヒクル(DMSO/モンタニドで乳化された水)よりも多くのIFN-γ産生を誘導せず、この後者は、おそらくはモンタニド媒介非特異的応答に起因して予想外の高い応答をもたらした。それでも、21日目及び28日目には、PolyPEPI-SCoV-2の2回目の投与は、ビヒクル対照群と比べて、30-mer及び9-merで検出された脾臓細胞に対して、それぞれ6倍及び3.5倍だけ、IFN-γ産生を増加させた(図13A)。
免疫不全Hu-マウスでは、14日目に、PolyPEPI-SCoV-2ワクチン摂取がペプチドの9-merプールに特異的な脾臓細胞でIFN-γ産生を2倍増加させたが、30-mer刺激脾臓細胞では増加は観察されなかった。21日目及び28日目には、PolyPEPI-SCoV-2の2回目の投与が、ペプチドの30-mer及び9-merプールで検出された脾臓細胞で、IFN-γ産生を、それぞれ4倍及び2倍だけブーストした(図13B)。重要なことに、9-merで検出されたCD8+T細胞応答及び30-merで検出されたCD4+とCD8+T細胞応答の両方が共に、両方の動物モデルにおいてワクチンによって標的化される4つ全てのウイルスタンパク質に対して向けられた(図13C～D、及び図14D～F)。Hu-マウスモデルは、ヒト抗原提示細胞を生成するためのヒトCD34+造血幹細胞、並びにT-及びB-リンパ球をNOD/Shi-scid/IL-2Rγヌル免疫不全マウスに移植することによって開発されたために、このモデルは、実際のヒト免疫系モデルを提供している(Brehnら、2013)。したがって、このモデルで得られたロバストな多重抗原性CD4+及びCD8+T細胞応答は、ワクチン接種が、適切に処理されかつHLA提示されたエピトープ及びその後のHu-マウスのヒト免疫細胞による抗原特異的T細胞応答をもたらしたことを示している。
ワクチン接種によって引き起こされるT細胞応答の極性化を調べるために、ICSアッセイを行った。T細胞の低い頻度のために、個々のペプチド特異的T細胞は、ICSによる視覚化は、ELISpotによるものよりも困難であったが、TNF-α及びIL-2のTh1型サイトカインを産生するCD4+とCD8+T細胞の明確な集団が、BALB/c及びHu-マウスモデルの両方で、ビヒクルを受けた動物と比較して検出可能であった(図15)。Th2型サイトカインのIL-4及びIL-13については、分析は、あらゆる時点においていかなる特異的応答も明らかにしなかった。IL-5及び/又はIL-10サイトカイン産生CD4+T細胞の低レベルが、両方のモデルで検出されたが、これは、BALB/cマウスの28日目についてだけ、ビヒクル対照とは著しく異なっていた。更にこのコホートについては、6匹のマウスのうち5匹で(1つの外れ値)Th1/Th2のバランスがTh1に向かってシフトしたままであって、ワクチンによって引き起こされた全体的なTh1に歪んだT細胞応答を確認した(図16)。
PolyPEPI-SCoV-2ワクチン接種はまた、BALB/cでの総マウスIgG及びHu-マウスでのヒトIgGによって測定されるように、体液性応答も誘導した。BALB/cマウスでは、ワクチン接種は、ビヒクル対照群と比べて、初回投与後(14日目)にワクチン誘導IgG産生をもたらした。2回目の投与後のより遅い時点で、BALB/c及びHu-マウスモデルの両方に、IgGの上昇が観察された(図17)。Hu-マウスの血漿から測定されたIgGレベル(平均115ng/mL、図17B)は、BALB/cのD28でのもの(平均529ng/mL、図17A)よりも低かった。これは、NOD/Shi-scid/IL-2Rγヌル免疫不全マウスのそのクラス-スイッチング及びIgG産生につながるヒト体液性応答を生成する困難さ(Brehamら、2013)に関して知られている制限と一致する。Hu-マウスモデルにおける約50%のヒト化率は、理論的に予想されたIgGレベルを更に低下させる。これらの制限にもかかわらず、用量依存性ヒトIgG産生は、ワクチンにより生成されたヒト体液性応答を示唆している。予想通りに、PolyPEPI-SCoV-2ペプチドが構造的B細胞エピトープを含有しない限り、ワクチン接種は、PNAアッセイを使用するHu-マウスの血清から評価されるように、測定可能な中和抗体をもたらさなかった。50%の中和抗体力価(NT50)は、各テスト試料について、1:25の希釈のアッセイ検出限界で検出不能であった(データ示さず)。
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COVID-19回復期ドナーのPolyPEPI-SCoV-2ペプチド特異的T細胞応答
次に、本発明者らは、COVID-19回復期ドナーの血液中を循環するワクチン特異的T細胞を調べることによって、ワクチン接種された動物で検出されたロバストかつ広範なT細胞応答が人に関連することを実証することを目指した(ベースラインデータを表8に報告する)。
ワクチンペプチドの回復期患者免疫成分との反応性を、17人の回復期の患者及び4人の健康なドナーで調べた。ワクチン反応性CD4+T細胞を、それらのソースタンパク質:S、N、M及びEペプチドに従って4つのプールにグループ分けされた9つの30-merワクチンペプチドを使用することによって検出した。CD8+T細胞応答は、動物実験で使用したように、それらのソースタンパク質(s、n、m、及びeペプチド;表8の太字)に従って4つのプールにグループ分けされた9つのワクチンペプチドの各々について定義された、支配的な共有HLAクラスI PEPIに対応する9-merテストペプチドを使用して測定した。
活性化エフェクター相T細胞応答を迅速に検出することができるex vivo FluoroSpotアッセイを使用して、相当数のワクチン反応性のIFN-γ発現T細胞を、健康な対象と比べて30-mer(平均dSFU:48.1、p=0.04)及び9-merペプチド(平均dSFU:16.5、p=0.011)で検出した(図19A及びB)。4つのタンパク質特異的ペプチドプールの詳細な分析は、17人のドナーのうちの3人が30-merワクチンペプチドを有する4つ全ての構造抗原に反応し、ドナーの82%が2つの抗原に反応し、59%が3つの抗原に反応することを明らかにした。特に、短い9-mer特異的CD8+T細胞応答もまた、17人の全てのドナーにおいて4つの抗原のうちの少なくとも1つに対して特定され、53%で少なくとも2つの抗原に対して特定された(表11)。
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ICSアッセイによって決定されたように、9-merペプチドによる刺激は、83%のCD8+T細胞、及び17%のCD4+T細胞の平均T細胞構成をもたらした(図18A)。興味深いことに、30-merテストペプチドは、CD4+及びCD8+T細胞の両方と、50:50の平均比で反応した(図18A)。T細胞の機能試験法は、CD8+T細胞は、主にIFN-γ、TNF-α、及びIL-2(これらと共に、少量のIL-4及びIL-10)を産生し、一方、CD4+T細胞は主として、IL-2及びIFN-γに対して陽性であることを明らかにした。リコール応答は、明確なTh1サイトカイン特性を示した;Th2応答は、30-merワクチンペプチドによるリコール応答には存在しなかった(図18B)。
次に、本発明者らは、ex vivoで検出された、利用可能な迅速に活性化するT細胞がまた、ワクチンペプチドの存在下、in vitroで増殖することができるかどうかを決定した。富化ELISpotを使用して、相当数のワクチン反応性のIFN-γ発現T細胞を、健康な対象と比べて30-mer(平均dSFU:3746、p=0.025)及び9-mer(平均dSFU=2088、p=0.028)ペプチドプールで検出した(図19A)。PolyPEPI-SCoV-2由来T細胞応答(30-merプール)の強度も、構造(S、M、N)及び非構造(オープンリーディングフレームORF-3a及び7a)タンパク質の両方に由来する47個の長いペプチドを含有する市販の大きなSARS-CoV-2ペプチドプール(SMNO)で検出された応答と比較して評価した。2つのプールに対して得られた相対強度は、COVID-19ドナーの中のワクチンプールに好ましいものであり、一方より多くの健康なドナーは市販のペプチドプールに反応しており、PolyPEPI-SCoV-2ワクチンの改善された特異性を確認した(図19B)。
COVID-19から回復した個体においてex vivoで検出されたPolyPEPI-SCoV-2特異的T細胞応答の多重特異性を確認し、更に概略を示すために、本発明者らは、彼らのT細胞によって標的化された特徴的なペプチドを定義した。本発明者らは、最初に、ペプチドプールをデコンボリューションし、in vitro拡張を使用して、各ワクチンペプチドに対応する9-merのHLAクラスI PEPIの各々に特異的なCD8+T細胞応答をテストした(図20)。分析は、各9-merペプチドが、数人の対象によって認識され、COVID-19回復期ドナーにおける最も高い認識率は、n4(93%)、s9(87%)、s2、n1、m1(80%)、e1(60%)、s5、n2(40%)に対して観察されることを明らかにした(図19C)。
9つのペプチド特異的CD8+T細胞応答の詳細な分析は、COVID-19から回復した対象の100%が、少なくとも1つのペプチドで再活性化されるPolyPEPI-SCoV-2特異的T細胞を有し、93%が2つ以上のワクチンペプチドに対して、87%が5つを超えるワクチンペプチドに対して、27%が9つ全てのワクチンペプチドに対して特異的なT細胞プールを有することを明らかにした。タンパク質のレベルでは、対象の87%は複数(3つ)のタンパク質に対してT細胞を有し、15人の測定されたドナーのうちの8人(53%)は、4つ全ての標的化されたウイルスタンパク質に反応した(図19C)。これらのデータは、PolyPEPI-SCoV-2-ペプチドが個体に支配的であり、COVID-19対象間で共有されること、及び回復期患者の集団で得られた多重ペプチド特異的T細胞の頻度が、インシリココホートについて共有されたPEPIに基づく予測された頻度とよく一致していたことを確認している(表9)。更に、本発明者らのワクチンペプチドの一部の断片(エピトープ)は、回復期患者を伴う体系的な実験室でのT細胞エピトープスクリーニング研究において、Ferrettiらによって、共有された免疫優性(immunodominant)エピトープとして独立して確認されている(27)。
本発明者らの回復期対照のコホートについて、ワクチン特異的T細胞応答の幅及び大きさは、症状の開始からの時間と相関せず、これらのT細胞は持続的である(最大5か月)ことを示唆した(図21)。
PEPI(多重HLA結合エピトープ)が、個々のレベルでT細胞応答を生成することができることを実証するために、本発明者らは、最初に、各対象について完全なクラスI HLA遺伝子型を決定し、次いで、ELISpotアッセイで使用された9つの9-merペプチドのリストから人の少なくとも3つのHLA対立遺伝子に結合することができるペプチドを予測した。各対象について、9つのうち2つ～7つのペプチドがPEPIであることを証明した。予測されたペプチド(PEPI)の中で、84%が、高度に特異的なT細胞応答を生成するとELISpotによって確認された(表12)。
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複数の自家対立遺伝子結合エピトープとCD8+T細胞応答との間の相関
各対象について検出された免疫原性ペプチドのHLA結合能力を調べた。最初に、本発明者らは、各対象について完全なHLAクラスI遺伝子型を決定し、次いで、FluoroSpotアッセイで使用された9つの共有された9-merペプチドの各々に結合することができる自家HLA対立遺伝子の数を予測した。次いで、本発明者らは、予測されたHLA結合エピトープを、各患者における各ペプチドに対して測定されたCD8+T細胞応答に対してマッチングさせた(合計で15×9=135のデータ点、図25)。CD8+T細胞応答の大きさは、複数の自家HLA対立遺伝子に拘束されたエピトープと相関する傾向があった(RS=0.188、p=0.028、図29B)。加えて、本発明者らは、PEPI(HLA≧3)によって生成されたCD8+T細胞応答の大きさ(dSFU中央値=458)が、非PEPI(HLA<3)によって生成されたもの(dSFU中央値=110)よりも有意に高い(p=0.008)ことを観察した(図29B)。
135のデータ点にわたって、98の陽性応答及び37の陰性応答が記録された。98の陽性応答の中で、37はPEPIによって生成され、一方37の陰性応答の中で、わずか7つがPEPIであって、他のものは≦3自家HLA対立遺伝子に拘束されたエピトープであった(図25)。全体で、2×2分割表は、T細胞応答のPEPIとの関連を明らかにした(p=0.041、フィッシャーの正確検定)が、HLA拘束性エピトープとの関連は明らかにしなかった(p=1.000、フィッシャーの正確検定)(図25)。各対象について、9つのペプチドのうち1～7つのペプチドが、PEPIであると証明された。予測されたPEPIの中で、37/44(84%)が所定の対象において特異的T細胞応答を生成することがIFN-γFluoroSpotアッセイによって確認された(図29D及び図25)。
これらのデータは、対象の完全なHLA遺伝子型がCD8+T細胞応答に影響を与え、複数の自家対立遺伝子結合能力が免疫原性エピトープの重要な特徴であることを実証している。PEPIは、一般に、対象の全体的なT細胞レパートリーを少なく見積もったが、それらは、対象のPEPI特異的CD8+T細胞応答を正確に予測した。
PolyPEPI-SCoV-2反応性T細胞とSARS-CoV-2特異的抗体応答との間の相関
T細胞依存性B細胞活性化は、抗体産生を必要とする。各対象について、異なるレベルの抗体応答を、異なる市販のキットを使用して決定されたSARS-CoV-2のS及びN抗原の両方に対して検出した(表8)。テストした全ての対象は、ウイルスS-1に対してEuroimmune ELISA(IgG)で、及びN関連抗体を測定するためのRocheキットで陽性であった。テストした全ての対象は、DiaPro IgG及びIgMに対して陽性であり(2人のドナーを除いて)、混合S-1及びNタンパク質特異的抗体応答を検出するDiaPro IgAに7/17が陽性であった(表8)。
本発明者らは、次に、PolyPEPI-SCoV-2特異的CD4+T細胞反応性と抗体応答との間の相関を評価した(図22)。PolyPEPI-SCoV-2反応性CD4+T細胞の総数は、ELISAによって測定されたS-1タンパク質特異的IgGの量と相関した(R=0.59、p=0.02、図22A)。次に、PolyPEPI-SCoV-2ワクチンの特異的S-1タンパク質由来のペプチド(S2及びS5)を分析したところ、相関は類似していた(R=0.585、p=0.02、図22B)。同様に、Nタンパク質由来のPolyPEPI-SCoV-2ペプチド(N1、N2、N3及びN4)で検出されたT細胞応答は、Rocheキットによって検出されるN特異的抗体との弱いが有意でない相関を示した(図22C)。これらのデータは、COVID-19回復期ドナーについての、PolyPEPI-SCoV-2特異的CD4+T細胞応答とその後のIgG産生との間のつながりを示唆している。
興味深いことに、IgA産生は、PolyPEPI-SCoV-2特異的メモリーCD4+T細胞応答と相関していた(R=0.63、p=0.006、図6D)。SMNOペプチドプールに反応性のT細胞応答は、抗体サブセットのいずれとも相関を示さなかった。これは、全てのCD4+T細胞がB細胞応答に寄与するわけではなく、その結果、IgG産生に寄与するわけではないことを示唆している(データは示さず)。
異なる民族で予測された免疫原性
本発明者らは、米国骨髄ドナーデータベースからの16の異なる民族群の中で分布する16,000人のHLA遺伝子型の対象の大きなコホートにおいて本発明者らのPolyPEPI-SCoV-2ワクチンのインシリコ試験法を実施した(49)。この大きなコホート中の各対象に対して、本発明者らは、彼らの完全なHLAクラスI及びクラスII遺伝子型に基づいて、PolyPEPI-SCoV-2特異的PEPIを予測した。大部分の対象は、ウイルス特異的メモリーCD8+T細胞クローンに変換される可能性が高いPEPIの幅広いレパートリーを有している:対象の98%が、少なくとも2つのワクチンペプチドに対してPEPIを有し、95%、86%、及び70%が、それぞれ、3つ、4つ、及び5つのペプチドに対してPEPIを有すると予測された(図23A)。
インシリコ試験法は、各民族群における対象の≧98%が、CD8+及びCD4+T細胞の両方がワクチン中の少なくとも2つのペプチドに対して応答する状態で、ロバストな細胞応答を開始する可能性が高いことを明らかにした(図23B)。この予測された高い応答率は、COVID-19からの不良な臨床転帰を有すると報告された民族にとって真実でもある(黒人、アジア人)(25)。これらのデータに基づいて、本発明者らは、本ワクチンが、民族及び地理的位置に無関係に、グローバルカバレッジを提供すると予想する。
本発明者らはまた、16,000の集団(及び民族群を含む)を用いて、他の人たちが提案したように、すなわち、世界人口の95%を網羅すると見なされる6つの関連するHLAクラスI対立遺伝子の少なくとも1つを有する部分集団をフィルタリングして、理論的グローバルカバレッジを評価した(27、55、56)。このアプローチを使用して、本発明者らは、民族レベルにおいて著しい不均一性を観察した。本発明者らは、選択された6つのHLA対立遺伝子が、白人及び北アメリカ人コホートにおいて関連している(91=93%)ことを確認したが、これらの対立遺伝子の頻度は、全ての他の民族群、特にアフリカ人集団でより低かった(48～54%)(図23C)。本発明者らは、提案された関連するHLA対立遺伝子セットは、民族的に重み付けされた世界人口におけるHLA頻度を網羅するが、これらの対立遺伝子のみに基づいて提案されたワクチン接種のためのエピトープの選択は、一部の民族を区別すると結論付けた。したがって、本発明者らは、人種における不均一性に感受性があり（敏感であり）、民族にわたって個体間で共有されるPEPIを選択することを可能にする代表的なモデル集団を使用することを提案する。注目すべきは、本発明者らは、異なる民族の個体の彼らの完全なHLA遺伝子型に基づくSARS-CoV-2タンパク質由来のエピトープ生成能力におけるいかなる差異も観察しなかったが(図12)(それは、BAMEで観察されたより高い感染率及び死亡率を説明するとは考えられない)、サブユニットワクチン用のエピトープは、BAME群のHLA遺伝子型プロファイルに対処するように注意深く選択され得る。異なる民族群で共有されるPEPIの頻度における不均一性が観察され、特にタンパク質Nの場合、グローバルワクチンのデザインに大きな影響を与える(図26)。民族群内及び民族群間で異なる頻度を有する標的を高いグローバルカバレッジを有するワクチン候補に組み合わせることは、実際の対象の大きな集団における「インシリコ臨床試験」を実施することによって実現可能である。
したがって、個体及び集団/民族レベルの両方での多重抗原免疫応答を最大化させるために、また、ペプチドの化学的特性及び製造可能性の特性も考慮しながら、SARS-CoV-2の4つの構造タンパク質から合計で9つの30-merペプチド:スパイク(S)から3つのペプチド、核タンパク質(N)から4つのペプチド、並びに各マトリックス(M)及びエンベロープ(E)から1つのペプチドを選択した。Sタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)からのペプチドは含まれなかった。全体で、モデル集団の各メンバーは、9つのペプチドのうちの少なくとも2つに対してHLAクラスI PEPIを有しており、97%が、少なくとも3つに対してHLAクラスI PEPIを有していた(表9)。各対象は、ワクチンペプチドに対して複数のクラスII PEPIを有していた(表9)。各対象は、ワクチンペプチドに対して複数のクラスII PEPIを有していた(表9)。
考察
本発明者らは、SARS-CoV-2ウイルスの4つの構造タンパク質(S、N、M、E)に由来する9つの合成の長い(30-mer)ペプチドを含むPolyPEPI-SCoV-2、ポリペプチドワクチンが、モンタニドISA 51 VGアジュバントと共に投与されるとき、BALB/cマウス及びヒト化CD34+マウスにおいて安全かつ高度に免疫原性であることを実証した。加えて、ワクチンの免疫原性能力を、SARS-CoV-2感染によって生成されたT細胞免疫と広く重なる、PolyPEPI-SCoV-2特異的T細胞を成功裏に再活性化することによって、COVID-19の回復期ドナーにおいて確認した。
個体及び集団レベルの両方における多重抗原性免疫応答を標的化する本ワクチンデザイン概念は、臨床現場での初期有効性と相関する新奇な免疫応答率を達成するためのがんワクチンの開発において既に成功を収めている新規標的特定プロセスを表す(32)。COVID-19に対しては、本発明者らは、民族的に多様なHLA遺伝子型の個体の間で共有されたオーバーラッピングHLクラスI及びII T細胞エピトープを含有し、ウイルス構造全体に対して多様かつ広範な免疫応答も生成するSARS-CoV-2タンパク質の断片を選択することに焦点を当てた。したがって、本発明者らは、比較的長い30-mer断片を選択し、複数のエフェクター応答(B細胞及び細胞傷害性T細胞)とヘルパーT細胞応答の生成を助けた。
PolyPEPI-SCoV-2ワクチンは、ワクチン接種されたBALB/c及びヒト化CD34+マウスにおいて、4つ全てのSAR-CoV-2タンパク質に対して、ワクチン特異的CD8+及びCD4+T細胞の両方への所望の多重抗原性IFN-γ産生T細胞応答を引き起こし、これらの応答は、ブースター投与後により顕著であった。COVID-19回復期患者におけるリコール応答は、PolyPEPI-SCoV-2特異的T細胞が、ドナーの100%で検出される状態で、全ての9つのペプチドに対して、迅速に活性化するエフェクター型(ex vivoで検出)と拡張された(in vitroで検出)メモリー型CD8+及びCD4+T細胞応答の両方を含んだ。個体のレベルでは、COVID-19からの回復に使用されたPolyPEPI-SCoV-2特異的T細胞レパートリーは、非常に多様であり(各ドナーは平均で7つの異なるペプチド特異的T細胞プールを有していた)、SARS-CoV-2タンパク質に対して複数の標的を有し、疾患から1～5か月後に、ドナーの87%が、少なくとも3つのSARS-CoV-2タンパク質に対して複数の標的を有し、53%が4つ全てのSARS-CoV-2タンパク質に対して複数の標的を有していた。加えて、対象の87%が、Sタンパク質に対してCD8+T細胞を有しており、これは、第I/II相臨床試験中の最前線のCOVID-19ワクチン候補について報告されている免疫応答率と同様である(57)。しかしながら、本発明者らは、S特異的(メモリー)T細胞が、ワクチンペプチドで検出された回復期患者の総T細胞レパートリーの36%のみを表し、残りの64%が、N、M及びEタンパク質の間でほぼ等しく分配されていることを見出した。これらのデータは、特に、多様なT細胞応答が、軽度/無症候性COVID-19と関連していたことから、Sタンパク質ベースの候補ワクチンが、ヒト抗SARS-CoV-2免疫の能力を十分に発揮できないという懸念が高まっていることを確認している(4)。
T細胞とB細胞との間の相互作用は、抗体を産生する血漿細胞の産生及びメモリーB細胞の生成の両方に向かう既知のメカニズムである(59)。回復期患者の抗体サブセットの分析中に、本発明者らは、抗原特異的IgGレベルと対応するペプチド特異的CD4+T細胞応答との間の相関を見出した。この相関は、CD4+T細胞と抗体産生とのつながりを表すことができ、動物モデルにおける総IgG産生によっても支持される概念である。結合するIgG抗体は、その後のワクチンのSARS-CoV-2曝露時に、ワクチンによって誘導されたCD8+キラーT細胞と協働して作用し得る。この相互作用は、感染細胞の有効なCD8+T細胞媒介直接殺滅並びにウイルス感染細胞及びウイルス粒子のIgG媒介殺滅をもたらし、Th2依存性免疫病理学的プロセスも阻害することがある。このようにして、中和抗体の非存在下であっても迅速なウイルス排除の助けとなるように、細胞内及び細胞外の両方のウイルスの貯留箇所（リザーバ、reservoir)が攻撃されることが予想される(59、60)。
本データは、PolyPEPI-SCoV-2ペプチドセットに反応性の個体の抗SAR-CoV-2 T細胞応答が、HLA遺伝子型依存性であることを実証している。具体的には、複数の自家HLA結合エピトープ(PEPI)が、抗原特異的CD8+T細胞応答を、84%の精度で決定する。PEPIは、一般に、対象のT細胞レパートリー全体を少なく見積もったが、それらは、エピトープ結合親和性のみをT細胞応答予測因子として使用する分野において一般的に観察される高い擬陽性率を克服する、正確な標的特定「ツール」及びPEPI特異的免疫応答の予測因子である(34、61)。したがって、白人の個体(のみの)の完全なHLA遺伝子型に基づくT細胞応答の検証されたPEPI予測及びヒトにおける動物モデル化免疫応答でのPolyPEPI-SCoV-2に誘導された免疫応答の注意深い解釈によって、本発明者らの発見は、16,000人のHLA遺伝子型の個体及び16のヒト民族の大規模なコホートに外挿することができた。この大規模な米国コホートで表された民族群は、世界人口の組成を網羅するが、それらの世界代表性について重み付けされていなかった(意図的に使用される場合、各民族についてn=1,000の対象)(62)。これに基づくと、PolyPEPI-SCoV-2は、民族とは無関係に、世界人口の>98%において、有意義な免疫応答(少なくとも2つのワクチンペプチドに対してCD8+及びCD4+T細胞応答の両方)を生成する可能性が高いであろう。これと比べて、世界的に頻繁なHLA対立遺伝子に基づくT細胞エピトープベースのワクチンデザインアプローチは、黒人系カリブ人、アフリカ人、アフリカ系アメリカ人、及びベトナム人の民族の約50%で免疫応答の生成に失敗するであろう。ワクチン接種によって、ワクチン接種された対象の高いパーセンテージで均一に有意義な免疫応答を誘導すること(SARS-CoV-2によって誘導される免疫の不均一性を模倣する広範で多機能なメモリー応答)は、望ましい「集団免疫」を達成するために必須である。市中感染の抑制を達成するためには、集団の約25～50%がウイルスに対して免疫を有さなければならないと考えられる(3)。しかしながら、第1世代COVID-19ワクチンは、少なくとも50%の疾患リスクの低減を示すようにテストされているが、ウイルスの
感染を同程度まで減少させるとは期待されていない。この事実は、これらのワクチンがまた長期免疫を提供しないという可能性と組み合わさって、パンデミックと戦うために第2世代のツールが必要とされることを示唆している(3)。
本発明者らは、各対象においていくつかの標的に焦点を合わせることが、ウイルスによって誘導される自然T細胞免疫をより良好に反復させ、有効な長期メモリー応答をもたらすと考える。この目的のために、合成ポリペプチドベースのプラットフォーム技術は、いくつかの重要な利点を有する安全で免疫原性のワクチン接種戦略と考えられる。モンタニドアジュバントを伴う同じ部類のペプチドワクチンは、>6000人の患者及び231人の健康なボランティアにおいて安全で忍容性が良好であった(63～69)。SARSでの試験は、ウイルスタンパク質全体の包含を制限する候補コロナウイルスワクチンが、より有益な安全性プロファイルを有することを示唆している。加えて、有効なTh1に歪んだT細胞応答及び非構造的(線状)B細胞エピトープは、理論的な抗体媒介疾患増強現象及びTh2ベースの免疫病理学的プロセスのリスクを軽減する。
ペプチドベースのワクチンは、現在まで十分な成功を収めていないが、これは、どのペプチドを使用するべきかに関する知識不足に起因する。そのような不確実性は、本発明者らが上で実証したように、個体の遺伝的背景が特異的ペプチドに対してどのように応答することができるかを理解することによって低減される。
結論として、本明細書に記載のペプチドベースの多重エピトープコードワクチンデザインは、安全で並外れて広い前臨床での免疫原性を実証し、注意深い臨床試験法の後に、SARS-CoV-2に対して有効な第2世代ワクチンを提供すると期待される。
[実施例11]
SARSに対するクロスプロテクションPolyPEPI-SCoV-2特異的ポリペプチドの分析
モデル集団(MP、N=433)内の自家≧3のHLA結合エピトープの高頻度を予測することによるワクチン組成物用のポリペプチド選択は、異なる病原体種間で共有される配列の選択を可能にする。例えば、SARSウイルスとSARS-CoV-2のプロテオーム内には、いくつかの保存的な100%同一のペプチド断片がある(配列番号6及び9～17)。これらの断片を分析することによって、本発明者らは、適切な≧3の自家HLA結合9-merPEPIを、MPからの個体の高いパーセンテージで特定した。99%が、配列番号1～17の分析された組成物からの少なくとも1つの予測された共有エピトープを有していた(表13及び図27A)。MPの94%が、少なくとも2つのHLAクラスI特異的(CD8+T細胞)PEPIを有しており、その結果、本組成物は、MPの94%で多重ペプチド免疫応答を誘導すると予測される。平均で、3つ又は4つのSARS由来の共有ペプチドが、17個の30-merペプチドと反応性であると予測された。1つのペプチドが1つのT細胞クローンを表す場合(実施例5で、予測された免疫応答とEKISPOT測定された免疫応答との間の相関が証明されたため、例えば、PPV=0.79)、これらの17個のペプチドが免疫化に使用されるならば、これらのインシリコ結果は、多重ペプチド特異的免疫原性T細胞応答の誘導として解釈され得る。
Figure 2023520562000025
少なくとも2つの抗原に対して多重タンパク質又は多重抗原応答は、個体の91%に置いて共有され、SARSコホートで使用される場合、この組成物に対して良好なカバレッジを表している(図28A)。これらのデータは、17個のペプチドが、SARSに対して多重ペプチドまた多重タンパク質特異的T細胞応答を誘導する能力を有することを示唆している。
これらの結果は、16,000人のヒトコホートにおいても確認された。個体の95%が、少なくとも2つの共有されたペプチドに対して多重HLA拘束性パーソナルエピトープを有していた。
Figure 2023520562000026
これらのデータは、異なる病原体に対して、例えば、SARSに対して共有された特異性を有する多量の多重HLA結合エピトープを特定する機会を表した(図27B及び図28B)。
[実施例12]
配列番号1～17をコードし発現する核酸製剤
ポリペプチド配列番号1～17は、注射用に溶解又は乳化された水溶性若しくはアジュバントペプチドで様々な製剤で製造され得る。また、ペプチドは、3文字のアミノ酸コードが配列番号1～17と同一のアミノ酸配列に翻訳される場合、mRNA、RNA又はDNA製剤にコード化され、プラスミドDNA中又はウイルスベクター中で発現され得る。コード化されたポリペプチドを送達及び/又は発現するために適切なベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、レンチウイルス若しくはレトロウイルスベクター、ポックスウイルス由来ベクター、ニューカッスル病ウイルスベクター、モザイクウイルスベクターのような植物ウイルスベクター、及びハイブリッドベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
抗原提示細胞中で発現されたタンパク質は、ワクチンの皮下又は皮内送達時に、ポリペプチドがAPCによって取り込まれると、同様なHLAクラスI及びクラスII抗原提示経路を介して処理及び提示される。
Figure 2023520562000027
Figure 2023520562000028
[実施例13]
複数の自家対立遺伝子結合エピトープとCD8+T細胞応答との間の相関
本発明者らは、分析されたCOVID-19回復期ドナーから各対象(N=15)について検出された免疫原性ペプチド配列番号2、5、9、12～17のHLA結合能力を調べた。
最初に、本発明者らは、各対象について完全なHLAクラスI遺伝子型を決定し、次いで、ペプチド特異的IFN-y産生T細胞の検出のために、FluoroSpotアッセイで使用された9つの共有された9-merペプチドの各々に結合することができる自家HLA対立遺伝子の数を予測した。次いで、予測されたHLA結合エピトープを、各患者における各ペプチドに対して測定されたCD8+T細胞応答に対してマッチングさせた(合計で15×9=135のデータ点、図25)。CD8+T細胞応答の大きさは、複数の自家HLA対立遺伝子に拘束されたエピトープと相関する傾向があった(RS=0.189、p=0.029、図29A)。加えて、PEPI(HLA≧3)によって生成されたCD8+T細胞応答の大きさ(dSFU中央値=458)が、非PEPI(HLA<3)によって生成されたもの(dSFU中央値=110)よりも有意に高かった(p=0.008)(図29B)。
135のデータ点にわたって、98の陽性応答及び37の陰性応答が記録された。98の陽性応答の中で、37はPEPIによって生成され、一方37の陰性応答の中で、わずか7つがPEPIであって、他のものは≦3自家HLA対立遺伝子に拘束されたエピトープであった(図25)。全体で、2×2分割表は、T細胞応答のPEPIとの関連を明らかにした(p=0.041、フィッシャーの正確検定)が、HLA拘束性エピトープとの関連は明らかにしなかった(p=1.000、フィッシャーの正確検定)(図29C)。各対象について、9つのペプチドのうち1～7つのペプチドが、PEPIであると証明された。予測されたPEPIの中で、37/44(84%)が所定の対象において特異的T細胞応答を生成することがIFN-γFluoroSpotアッセイによって確認された(図29D及び図25)。
これらのデータは、対象の完全なHLA遺伝子型がCD8+T細胞応答に影響を与え、複数の自家対立遺伝子結合能力が免疫原性エピトープの重要な特徴であることを実証している。PEPIは、対象のPEPI特異的CD8+T細胞応答を正確に予測した。
[実施例14]
ワクチン製剤用の標的ペプチドの分析及び特定並びにユニバーサルワクチン候補のデザイン
インシリコヒトコホート(MP、n=433)中の各対象に対して、9mer(HLAクラスI)及び15-mer(HLAクラスII)フレームを使用して(図1)、19個の既知のSARS-CoV-2ウイルスタンパク質の保存領域のAA配列について、彼らのHLAクラスI及びクラスII対立遺伝子型の各々(6個のHLAクラスI及びHLAクラスII対立遺伝子)のエピトープ予測を、実施例6に記載した。
SARS-CoV-2構造タンパク質(S、N、M、E)をスクリーニングし、9個の異なる30-merペプチドを多段階プロセス中に選択した。最初に、配列多様性分析を実施した(NCBIデータベースの2020年3月28日時点で)(‘U.S.National Library of Medicine.Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browses#!/viruses/86693/')。登録IDは、次の通りであった:NC_045512.2、MN938384.1、MN975262.1、MN985325.1、MN988713.1、MN994467.1、MN994468.1、MN997409.1、MN988668.1、MN988669.1、MN996527.1、MN996528.1、MN996529.1、MN996530.1、MN996531.1、MT135041.1、MT135043.1、MT027063.1、及びMT027062.1。太字のIDは、GenBank参照配列を表す。4つの構造タンパク質配列の翻訳されたコード配列を整列させて、複数の配列アライメント(Clustal Omega,EMBL-EBI,United Kingdom)を使用して比較した。19の配列のうち、15が完全に同じであった。しかしながら、4つのNタンパク質配列において単一のAAが変化している:MN988713.1:N194 S->X、MT135043.1:N343 D->V、MT027063.1:N194 S->L、MT027062.1:N194 S->L。得られたAA置換はNタンパク質配列の2つの位置(AA194及び343)のみに影響を与え、これらのいずれも、ワクチン開発のための標的として選択されたエピトープ中では発生しなかった。ウイルスSタンパク質における13個の報告された一文字変化(D614G、S943P、L5F、L8V、V367F、G476S、V483A、H49Y、Y145H/del、Q239K、A831V、D839Y/N/E、P1263L)のうちのただ1つ(H49Y)が、PolyPEPI-SCoV-2ワクチンに関与していたが、このバリアントの普及率は、その後のウイルス単離物中で減少している(Korberら、2020)。最近の報告(2021年2月)は、世界中の45,494の完全なSARS-CoV-2ゲノム配列を分析することによって、4つの異なる系統を確立した。この報告からの最も頻繁な循環変異は、11個のミスセンスアミノ酸変異を特定し、1つはSタンパク質に位置し(D614G)、3つはNタンパク質に位置し(2つの異なるDNA置換を有するR203K及びG204R)、NSP2、NSP12、NSP13、ORF3a及びORF8の更なる7つの変異である(Wang et al.2021)。これらのアミノ酸位置のいずれも9つの3-merには含まれず、保存領域の適切な選択及びユニバーサルワクチン候補ペプチドを特定する意図を支持している。更に、PolyPEPI-SCoV-2ペプチドのいずれも出現する変異体SARS-CoV-2株:B.1.1.7(UK、17個の変異)、B.1.351(南アフリカ、9つの変異)又はB.1.1.28.1(ブラジル、16個の変異)のいずれによっても影響を受けない(Thomson et al.2020;Rambaut A 2020;O'Toole A 2021a,2021b)。
2020年3月～2021年2月の期間に出現した変異体のこの分析は、配列番号2、5、9、12～17の分析した組成物の配列領域に影響を与えおらず(ペプチドの前臨床の免疫原性試験法に使用されたものと同じ組成物)、本選択法が、ユニバーサル組成物をデザインするために使用することができることを示唆している。
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Claims (18)

  1. 最大50アミノ酸長の2つ以上のポリペプチドのパネルであって、各ポリペプチドが、配列番号1～17から選択される異なるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドのパネル。
  2. 各ポリペプチドが、コロナウイルス科タンパク質の断片からなる、請求項1に記載のポリペプチドのパネル。
  3. 各ポリペプチドが、SARS-CoV-2タンパク質の断片からなる、請求項2に記載のポリペプチドのパネル。
  4. 各ポリペプチドが、異なるコロナウイルス科又はSARS-CoV-2タンパク質の断片である配列番号1～17から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチドのパネル。
  5. 以下の群:
    (a)配列番号1～11;
    (b)配列番号12～15;
    (c)配列番号16;及び
    (d)配列番号17
    のうちの少なくとも2つ、3つ、又は4つ全てからの少なくとも1つの配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリペプチドのパネル。
  6. パネルが、配列番号2、5、7、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる10個のポリペプチドを含む、請求項5に記載のポリペプチドのパネル。
  7. パネルが、配列番号2、5、9、12、13、14、15、16、及び17のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる9個のポリペプチドを含む、請求項5に記載のポリペプチドのパネル。
  8. 活性成分として請求項1から7のいずれか一項に記載のポリペプチドのパネルを有する、医薬組成物又はキット。
  9. 一緒になってポリペプチドの各々をコードするポリ核酸、リボ核酸、又は1つ以上のベクター若しくは細胞を含む、請求項8に記載の医薬組成物又はキット。
  10. 配列番号234～251又は252～268から選択される少なくとも2つの配列を含む1つ以上のポリヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドを含む、請求項9に記載の医薬組成物又はキット。
  11. 対象にワクチンを接種する、対象に免疫療法を提供する、又は対象において免疫応答を誘導する方法であって、請求項1から7のいずれか一項に記載のポリペプチドのパネル又は請求項8から10のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
  12. 対象におけるコロナウイルス科感染症又はコロナウイルス科感染症に関連する疾患若しくは状態を処置する方法である、請求項11に記載の方法。
  13. 対象におけるSARS-CoV-2感染症又はCOVID-19疾患を処置する方法である、請求項12に記載の方法。
  14. 対象におけるコロナウイルス科感染症、又はコロナウイルス科感染症に関連する疾患若しくは状態の発生を防止する方法である、請求項11に記載の方法。
  15. 対象におけるSARS-CoV-2感染症又はCOVID-19疾患の発生を防止する方法である、請求項14に記載の方法。
  16. ポリペプチドのうちの1つ以上が、対象の少なくとも2つのHLAクラスI対立遺伝子に拘束されることが予測されるCD8+ T細胞エピトープであるコロナウイルス科タンパク質の断片を含む、請求項11から15のいずれか一項に記載の方法。
  17. ポリペプチドのうちの1つ以上が、対象の少なくとも2つのHLAクラスII対立遺伝子に拘束されることが予測されるCD4+ T細胞エピトープであるコロナウイルス科タンパク質の断片を含む、請求項16に記載の方法。
  18. ポリペプチドのうちの1つ以上が、線形のB細胞エピトープを含む、請求項11から17のいずれか一項に記載の方法。
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