JP2023519337A - 生物学的サンプルを電子的および光学的に監視するためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

生物学的サンプルを電子的および光学的に監視するためのシステムであって、複数の生物学的サンプルを受容するように構成された複数のウェルを有するマルチウェルプレートと、ここで前記ウェルのそれぞれが一組の電極と、電極のないウェルの底面上の透明窓とを有するし、ウェルを照明するように構成された照明モジュールと、マルチウェルプレートを受け入れるように構成されたクレードルであって、ウェルの透明窓を露出させる開口部を底面に有するクレードルと、窓越しに画像を取り込むために、同じマルチウェルプレートの異なるウェル間で移動可能な光学撮像モジュールとを備える、システム。【選択図】図５

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年３月２９日に出願された米国特許出願第１６／８３３，６５１号に対する優先権の利益を主張する。その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

本発明は、概して、生物学的サンプルを電子的および光学的に監視するためのシステムおよび方法に関し、より詳細には、同じ生物学的サンプルを単一ウェル内においてリアルタイムで連続的に電子的および光学的に監視するシステムおよび方法に関する。

細胞(cell)ベースのアッセイ（assay：分析）は、ヒトの生体に関する治療（therapeutic）の効果の予備的な評価を提供する。多くの細胞ベースのアッセイはエンドポイントアッセイであり、単一の時点に限定されているが、細胞基質（cell-substrate）インピーダンス監視として知られる技術により、細胞の継続的な監視が可能になる。細胞基質インピーダンス監視は、電極上での細胞接着、成長、形態、および運動性の変化が検出可能な変化をもたらす細胞と電極間の相互作用を評価する。この目的のために、細胞基質インピーダンス監視は、細胞増殖（cell proliferation）と細胞溶解（cytolysis）を評価するための強力なツールとなる。

細胞基質インピーダンス監視技術は、潜在的な治療法に対する細胞応答の動力学を明らかにすることができるが、それには限界がある。特に、細胞が電極表面で培養されるときに発生する変化の検出に限定される。したがって、細胞生物学に対する治療法の効果を評価するために、細胞基質インピーダンス監視の能力を拡大するさらなる進歩を開発する必要がある。

本発明の一態様では、生物学的サンプルを電子的および光学的に監視するためのシステムであって、複数の生物学的サンプルを受容するように構成された複数のウェルを有するマルチウェルプレートと、ここで前記ウェルのそれぞれは一組の複数の電極と、電極のない前記ウェルの底面上の透明窓とを含み、前記ウェルを照明するように構成された照明モジュールと、前記マルチウェルプレートを受け入れるように構成されたクレードル（cradle）であって、前記ウェルの前記透明窓を露出させるように構成された前記底部に開口部を有するクレードルと、開口された底部を介して窓を通して画像を取り込むために、同じマルチウェルプレートの異なるウェル間で移動可能な光学撮像モジュールとを備えるシステムが提供される。いくつかの実施形態では、一組の電極は、細胞基質インピーダンスを監視するように構成されている。

照明モジュールは単一の照明であってもよいが、照明モジュールは、ウェルのうちの１つまたは複数を独立して照明するように構成された複数の照明を含むことが好ましい。より好ましくは、照明モジュールは発光ダイオード（ＬＥＤ）アレイを含む。最も好ましくは、各ＬＥＤは、単一のウェルを照明するように配置される。好ましい実施形態では、照明モジュールは明視野（bright field）照明モジュールである。

クレードルは、マルチウェルプレートを受け取り、好ましくはカバーする（cover：覆う）ように構成され、したがって、ヒンジ付きカバーを提供することができる。好ましくは、照明モジュールはカバーの内面に接合される。クレードルは、プレートの受け取りを感知する接触センサを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、クレードルは、前記一組の電極と電子的に通信するためのマルチウェルプレートと、照明命令を通信するための照明モジュールとの両方に電子的に係合する。

クレードルの底が開いているとウェルの透明窓が露出するため、光学撮像モジュールは、クレードルの下に配置され、ウェルからウェルへと移動して、対応する透明窓から画像を取得するように構成されうる。いくつかの実施形態では、光学撮像モジュールは、一度に単一のウェルから１つまたは複数の画像を取り込むように構成されている。いくつかの実施形態では、画像は、細胞数または細胞コンフルエンスパラメータ（confluence parameter）（例えば、コンフルエンスパーセント）を決定するためなど、ウェルの明視野照明下で取り込まれる。他の実施形態では、蛍光画像などの画像は、分子励起後に取得される。光学撮像システム自体は、細胞内または細胞表面上の、タンパク質、ポリペプチド、または核酸などの生体分子に結合するための抗体または抗体断片に結合した蛍光分子などの１つまたは複数の分子を励起するように構成された励起光源を含みうる。励起光源の例としては、紫外光、紫光、青色光、緑色光、黄色光、橙色光、および赤色光からなる群から選択される１つまたは複数の光を挙げることができる。

いくつかの実施形態では、光学撮像モジュールは、細胞の動きを示すために十分に短い時間間隔で一連の細胞画像を連続的に取り込むことができるカメラを含む。いくつかの実施形態では、カメラは毎秒少なくとも３０枚の画像を取り込む。他の実施形態では、カメラは毎秒少なくとも６０枚の画像を取り込む。いずれかまたは両方の実施形態において、光学撮像モジュールは、カメラ、バンドパスフィルタ、チューブレンズ、および対物レンズを含みうる。高速撮像により、細胞の動きを視覚的に表示できるだけでなく、運動中に起こる細胞変化を明らかにする異なる光源（例えば、明視野照明と、それぞれが蛍光分子を励起して単色の蛍光画像を生成するための異なる波長の複数の光源）からの画像を重ね合わせることができる。いくつかの実施形態では、明視野照明および３つ以上の色の蛍光から取得された画像を重ね合わせて、各時点について単一の画像を形成する。この撮像から、細胞数または細胞パラメータ、ならびに蛍光の有無、総蛍光強度、および平均蛍光強度を決定することができ、これにより、詳細な細胞動態がさらに明らかになる。

システムはまた、電極のセットのそれぞれを選択的に操作するためのクレードルであって、任意選択的に、１つまたは複数のウェル内の細胞基質インピーダンスを電子的に監視するクレードルと、１つまたは複数のウェルを選択的に照明するための照明モジュールと、選択的な動きならびに１つまたは複数のウェルからの画像の取り込みおよび受信のための光学撮像モジュールとに通信可能に結合されたコンピュータプロセッサを含むか、または結合されうる。いくつかの実施形態では、コンピュータプロセッサは、１つまたは複数のウェルが電子的監視から設定されたインピーダンスベースの値またはパラメータに到達または追従することに応答して、光学撮像モジュールを介して１つまたは複数のウェルから画像を取り込むようにプログラムされる。いくつかの実施形態では、コンピュータプロセッサは、細胞基質インピーダンスを電子的に監視し、同じウェルを光学的に監視するように構成され、表示または分析のためにインピーダンスと光学データを対にするように構成される。いくつかの実施形態では、コンピュータプロセッサは、２つの連続する電子インピーダンス測定／監視間の特定の時間間隔を含む期間にわたって細胞基質インピーダンスを電子的に監視し、電子的監視の期間内の期間、または電子的監視とは異なる期間にわたって同じウェルを光学的に監視するように構成されている。例示的なインピーダンス監視期間は、数分という短い時間から、数時間、数日、さらには数週間という長さまでプログラムされうる。２つの連続するインピーダンス測定間のインピーダンス監視時間間隔は、最短で数秒または１秒未満から、最長で１分、数分、１時間、さらには数時間まで、指定またはプログラムされうる。光学的監視期間は、１つまたは複数のインピーダンス監視期間の内側、外側、または同じ期間にわたってプログラムされうる。

システムは単一のプレートで使用されうるが、システムはまた、それぞれが複数のサンプルを受け取るように構成された複数のウェルを有し、各ウェルが一組の電極と、電極のないウェルの底面上の透明窓とを有する、２つの追加のマルチウェルプレートと、２つの追加のマルチウェルプレートのウェルを照明するように構成された２つの追加の照明モジュールと、２つの追加のマルチウェルプレートを受容するように構成された２つの追加のクレードルであって、それぞれ、２つの追加のマルチウェルプレートのウェルの透明窓を露出させる開放底を有する、２つの追加のクレードルと、を備えていてもよく、光学撮像モジュールは、露出した底部を介してすべての窓から画像を取り込むために、ここですべてのウェルにわたって移動可能である。

システムはまた、光学撮像モジュールが細胞または組織培養容器（tissue culture vessel）内の画像を取り込むように構成されている、電子的監視用に構成されていない細胞または組織培養容器を含んでいてもよい。例示的な実施形態として、システムは、複数の生物学的サンプルを受容するように構成された複数のウェルを有するマルチウェルプレートであって、各ウェルが透明な底面を有するマルチウェルプレートと、ウェルを照明するように構成された照明モジュールと、マルチウェルプレートを受け入れるように構成されたクレードルであって、ウェルの透明な底面のすべてを露出させるように構成された底部に開口部を有するクレードルと、露出した底部を介して窓から画像を取得するために、同じマルチウェルプレートの異なるウェル間で移動可能な光学撮像モジュールとを含みうる。

本発明の関連する態様において、細胞を監視する方法が提供され、方法は、マルチウェルプレートのウェル内の細胞を電子的に監視するステップであって、各ウェルが一組の細胞基質インピーダンス監視電極と、電極のないウェルの底面上の透明窓とを有する、ステップと、電子的に監視されている少なくとも１つのウェルから透明窓を通して画像を取り込むステップとを含む。いくつかの実施形態では、画像は、２つの連続する画像取り込みの間の一定の時間間隔で定期的に、または電子監視期間内の期間にわたって不規則に取り込まれ、この方法は、細胞の２つの連続する電子測定の間の時間間隔と同じ時間間隔で、２つの連続する画像取り込みの間で画像を取り込むステップを任意選択的に含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのウェルから画像を取り込むステップの前に、電子的に監視するステップは、設定値を満たす少なくとも１つのウェルからの結果を出力し、光学撮像モジュールに少なくとも１つのウェルから画像を取り込むように指示する。設定値の例は、所定のインピーダンスベースの値を含みうる。

いくつかの実施形態では、取り込まれる画像は、細胞の明視野画像である。そのような実施形態では、方法はまた、明視野画像から細胞を計数すること、および任意選択的に明視野画像から細胞コンフルエンス数またはパラメータ（例えば、コンフルエンスのパーセント）を導き出すステップを含みうる。

他の実施形態では、取り込まれた画像は、細胞の蛍光画像を含む。そのような実施形態では、方法は、総蛍光計数、総蛍光強度、および平均蛍光強度からなる群のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択される画像から蛍光パラメータを決定するステップを含みうる。蛍光パラメータは、青、緑、赤などの各色の蛍光画像に対して個別に計算または決定される。

さらに他の実施形態では、取り込まれる画像は、細胞の明視野画像および細胞の蛍光画像を含む。そのような実施形態では、方法はまた、明視野画像から細胞コンフルエンス数（cell confluence number）またはパラメータを導出し、任意選択的に明視野画像から細胞を計数するステップと、総蛍光計数、総蛍光強度、および平均蛍光強度からなる群のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択される、蛍光画像からの蛍光パラメータを決定するステップと、任意選択的に、１つまたは複数のウェルの１つまたは複数の色の明視野画像と蛍光画像を重ね合わせるステップと、を含む。

関連する態様において、細胞を監視する方法が提供され、その方法は、マルチウェルプレートのウェル内の細胞をある期間にわたって電子的に監視するステップであって、各ウェルが細胞基質インピーダンス監視電極のセットを有し、ウェルの底面には電極のない透明窓を有するステップと、電子的監視の期間内または期間外の期間にわたって、透明窓を通して画像を取り込むステップとを含む。電子的監視に使用される期間は、画像取り込みに使用される期間と同じであってもよいし、画像取り込みに使用される時間と異なっていてもよい。これらの電子的監視および光学的監視の期間は、最短で１分未満から、最長で数時間、数日、さらには数週間まで指定またはプログラムされうる。電子的監視の期間中、電子的監視は、２つの連続する電子測定の間の指定された固定時間間隔で継続されうる。光学的監視は、２つの連続する画像取り込み間の指定された固定時間間隔で、期間にわたって連続的に行われうる。これらの時間間隔は、最短で数秒または１秒未満から、最長で１分、数分、１時間、さらには数時間まで指定またはプログラムされうる。

いくつかの実施形態では、取り込まれる画像は、細胞の明視野画像である。そのような実施形態では、この方法はまた、明視野画像から細胞を計数するステップと、任意選択的に明視野画像から細胞コンフルエンス数またはパラメータ（例えば、コンフルエンスの割合）を導出するステップとを含みうる。

他の実施形態では、取り込まれた画像は、細胞の蛍光画像を含む。そのような実施形態では、方法は、総蛍光計数、総蛍光強度、および平均蛍光強度からなる群のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択される画像から蛍光パラメータを決定するステップを含みうる。蛍光パラメータは、青、緑、赤などの各色の蛍光画像に対して個別に計算または決定される。

さらに他の実施形態では、取り込まれる画像は、細胞の明視野画像および細胞の蛍光画像を含む。そのような実施形態では、方法はまた、明視野画像から細胞コンフルエンス数またはパラメータを導出し、任意選択的に、明視野画像から細胞を計数するステップと、総蛍光計数、総蛍光強度、および平均蛍光強度からなる群のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択される、蛍光画像からの蛍光パラメータを決定するステップと、任意選択的に、１つまたは複数のウェルについて、１つまたは複数の色の明視野画像と蛍光画像を重ね合わせるステップと、を含む。

生物学的サンプルを電子的および光学的に監視するための例示的なシステム１０の写真であり、ここで任意選択のユーザインターフェース２００が細胞画像データを表示している図である。 ５つのアクセス可能なクレードル１４を備えた主ハウジング１２を示す図である。 閉じた構成のクレードル１４を示す図である。 開いた構成のクレードル１４を示す図である。 開位置および閉位置にあるデュアルクレードル１４を示す図である。 クレードルカバー１４に結合された明視野照明モジュール２６を示す図である。 例示的なマルチウェルプレート２０を描写する図である。 中央に配置された透明窓４４とともに使用するように適合された電極４２のセットの概略図（パネルＡ）と、底面に電極のセット４２を有し、底面に電極４２がない透明窓４４を有するマルチウェルプレート２０（図４参照）からのウェル３２の写真（パネルＢ）と、透明窓４４を通して撮影された細胞の画像（パネルＣ）とを示す写真である。 例示的な光学撮像モジュール２６を示す図である。 例示的な光学撮像モジュール２６の断面図である。 二次元直線運動（直線トラック６６に平行な軸に沿った運動および直線トラック７０に平行な別の軸に沿った運動を含む）を可能にする、図６の撮像モジュール２６のための例示的な光学撮像サポート６０を示す図である。 赤色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスをトランスフェクトしたＭＣＦ７乳癌細胞を処理した後の経時的なインピーダンスに基づくグラフであり、ＮＫ９２細胞は経時的に異なるエフェクタ： ターゲット（Ｅ：Ｔ）比にある。 同じアッセイから経時的に赤色蛍光細胞数（生きた標的細胞を示す）を示す図である。 ＮＫ９２細胞添加前のＥ：Ｔ比が２．５：１の同じウェル内の明視野照明下で取り込まれた画像を示す図である。 ＮＫ９２細胞添加の１２時間後のＥ：Ｔ比が２．５：１の同じウェル内の明視野照明下で取り込まれた画像を示す図である。 ＮＫ９２細胞添加の３０時間後のＥ：Ｔ比が２．５：１の同じウェル内の明視野照明下で取り込まれた画像を示す図である。 例示的な取り込まれ重ね合わされた画像を示しており、左側のパネルは、取り込まれた３つの蛍光画像（赤、緑、青）を取り込まれた明視野照明画像と重ね合わせ、右側のパネルは明視野照明なしで取り込まれた３つの蛍光画像（赤、緑、青）を重ね合わせている。示されているのは、アネキシンＶ（赤）、カスパーゼ３（緑）、細胞核（青）の蛍光マーカにさらされた細胞である。 リアルタイムで薬物誘導性アポトーシスを実証するための、一定期間にわたる細胞基質インピーダンス監視を示すグラフである。Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞をＭＧ１３２（図１１Ａ）で滴定した。陰性対照はＤＭＳＯであった。エラーバーは、３回実行したサンプルの標準偏差を表す。インピーダンスは１５分ごとに１回の時間間隔で連続的に測定されたが、隣接する時点のエラーバーが重ならないようにするために、ここではデータポイントは１時間に１回だけ表示される。 リアルタイムで薬物誘導性アポトーシスを実証するための、一定期間にわたる細胞基質インピーダンス監視を示すグラフである。Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞をスタウロスポリン（図１１Ｂ）で滴定した。陰性対照はＤＭＳＯであった。エラーバーは、３回実行したサンプルの標準偏差を表す。インピーダンスは１５分ごとに１回の時間間隔で連続的に測定されたが、隣接する時点のエラーバーが重ならないようにするために、ここではデータポイントは１時間に１回だけ表示される。 インピーダンス監視期間内の異なる時点での生細胞撮像と組み合わせた、ある期間にわたるインピーダンス監視をプロットしたグラフを提供する図である。Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞をＤＭＳＯ（図１２Ａ）で処理した後、インピーダンス信号と青色核の数を追跡した。代表的な画像は、治療前と治療後１時間または２０時間で示されている。エラーバーは、３回実行したサンプルの標準偏差を表す。 インピーダンス監視期間内の異なる時点での生細胞撮像と組み合わせた、ある期間にわたるインピーダンス監視をプロットしたグラフを提供する図である。Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞を５０μｍのＭＧ１３２（図１２Ｂ）で処理した後、インピーダンス信号と青色核の数を追跡した。代表的な画像は、治療前と治療後１時間または２０時間で示されている。エラーバーは、３回実行したサンプルの標準偏差を表す。 インピーダンス監視期間内の異なる時点での生細胞撮像と組み合わせた、ある期間にわたるインピーダンス監視をプロットしたグラフを提供する図である。Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞を１μｍのスタウロスポリン（図１２Ｃ）で処理した後、インピーダンス信号と青色核の数を追跡した。代表的な画像は、治療前と治療後１時間または２０時間で示されている。エラーバーは、３回実行したサンプルの標準偏差を表す。 ５．５μｍのＭＧ１３２２での処理前後のインピーダンスに基づくプロットを提供する図である。治療後０時間、治療後２０時間、治療後４０時間の画像も表示されている。上の画像はそれぞれ明視野照明下で撮影され、下の画像は蛍光下で撮影され、アネキシンＶ染色（赤）、活性化されたカスパーゼ３（緑）、および核局在ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）がある。矢印は、外側のリーフレットにホスファチジルセリンを含む大きな膜ブレブを示す。 青色核の数を使用して、Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞におけるＭＧ１３２誘導アポトーシスを画像ベースで連続的に追跡することを示すグラフ。エラーバーは、３回実行したサンプルの標準偏差を表す。 ％合流を使用して、Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞におけるＭＧ１３２誘導アポトーシスを画像ベースで連続的に追跡することを示すグラフ。エラーバーは、３回実行したサンプルの標準偏差を表す。 緑色（カスパーゼ３活性化）細胞の数を使用して、Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞におけるＭＧ１３２誘導アポトーシスを画像ベースで連続的に追跡することを示すグラフ。エラーバーは、３回実行したサンプルの標準偏差を表す。 赤（ａｎｎｅｘｉｎＶ結合）細胞の数を使用して、Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞におけるＭＧ１３２誘導アポトーシスを画像ベースで連続的に追跡することを示すグラフ。エラーバーは、３回実行したサンプルの標準偏差を表す。 ５０μＭ ＭＧ１３２で処理された細胞についての異なるアポトーシス（apoptotic）現象の相対速度および相対存在量の比較を示すグラフである。エラーバーは、３回実行したサンプルの標準偏差を表す。 ＥＣ５０を計算するための用量反応曲線（dose response curve）の使用を示す表とグラフを提供する図である。リアルタイムインピーダンス（正規化細胞指標で表される）データ（図１１Ａ）と生細胞撮像（緑の細胞数、赤の細胞数、青の核数）データ（図１４Ａ～Ｃ）を使用して、曲線下面積が計算され、ＭＧ１３２濃度の関数としてここにプロットされている。ＥＣ５０を決定するために、データを４つのパラメータのロジスティック方程式に適合させた。

本明細書に記載のシステムおよび方法は、細胞の健康状態および挙動を、非常に異なる視点から、すなわちリアルタイムの電子監視および生細胞撮像から、同じウェル内で継続的に監視することを可能にする。合理化されたワークフロー、高い再現性、およびシステムの定量的動力学により、細胞の健康状態の監視、増殖、細胞毒性、アポトーシス、免疫細胞の死滅、細胞受容体の活性化、幹細胞の分化を含む細胞の分化などを含むがこれらに限定されない、さまざまな細胞ベースのアッセイが最適となる。

システムと方法の継続的な性質には、２つの大きな利点がある。プロセスの単なるスナップショットを提供するエンドポイントアッセイとは対照的に、リアルタイムの追跡により、重要な現象を見逃すことがない。第２に、技術的アプローチの継続的な性質により、アッセイの実行に必要な実践的な時間が大幅に短縮される。細胞が播種され、処理が追加されたら、それ以上の関与は必要ない。

システムおよび方法は、好ましくは、生体試料または細胞への影響を評価するために使用される。細胞は、任意の種から単離された初代細胞であってもよいし、細胞株の細胞であってもよい。細胞は遺伝子操作された細胞であってもよい。例えば、これらは、例えば「遺伝子ノックアウト（gene knockout）」生物からのような、遺伝子組み換え生物からの細胞、または内因性遺伝子または導入遺伝子を過剰発現するように操作された細胞、または正常な遺伝子発現が（例えば、アンチセンス分子の使用またはＲＮＡのサイレンシングによって）操作された細胞、ＣＲＩＳＰＲおよび／またはその他の遺伝子編集技術によって改変された細胞、またはＣＨＯ細胞などの治療用タンパク質を発現するように操作された細胞を含む。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で参照されるすべての特許、出願、公開された出願、および他の刊行物は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。このセクションに記載されている定義が、引用することにより本明細書の一部をなすものとする特許、出願、公開された出願、およびその他の刊行物に記載されている定義に反するか、または矛盾する場合、このセクションに記載されている定義は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする定義よりも優先される。

本明細書で使用される「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。

「電極」とは、高い電気伝導率、つまり、周囲の材料の電気伝導率よりもはるかに高い電気伝導率を持つ構造体である。

本明細書で使用される場合、「電極構造」は、単一の電極、特に複雑な構造（例えば、らせん電極構造など）を有する電極、または互いに電気的に接続された少なくとも２つの電極要素の集まりを指す。「電極構造」内のすべての電極要素は電気的に接続されている。

本明細書で使用される場合、「電極要素」は、電極構造の単一の構造的特徴、例えば、櫛型電極構造（interdigitated electrode structure）の指状突起などを指す。

本明細書で使用される場合、「電極アレイ」または「電極構造ユニット」は、信号源に接続されている場合、電極の周囲の空間領域に電場を生成するユニットとして動作できるような寸法および間隔を有するように構築された２つ以上の電極構造である。本発明の好ましい電極構造ユニットは、電極表面への細胞付着によるインピーダンス変化を測定することができる。電極構造ユニットの非限定的な例は、櫛型電極構造ユニットおよび同心電極構造ユニットである。電極構造の追加の例には、一対の小さい測定／記録電極（例えば、１０ミクロン未満の小さいサイズと１００または数百ミクロンの大きいサイズとの間の直径を有する円形の微小電極）、およびはるかに大きな参照電極も含まれる。微小電極アレイを形成する複数の小さな記録電極は、共通の参照電極を共有してもよい。このような記録電極は、小さな記録電極とはるかに大きな参照電極との間の電圧信号を増幅および記録することにより、細胞外記録を行うために使用されうる。細胞外記録の実施形態では、インピーダンス測定システム（例えば、電流および電圧を測定する電子ハードウェア回路、ならびに、ソフトウェアおよび／またはファームウェアの信号とデータ処理アルゴリズムを含むインピーダンス分析器システムなど）ではなく、細胞外記録システム（電圧信号増幅器および電圧を測定するためのその他の電子ハードウェア回路と、ソフトウェアおよび／またはファームウェアで実装される信号処理アルゴリズムを含む）が使用される。

本明細書で使用される「電極バス（electrode bus）」は、個々の電極要素または下部構造を接続する電極の一部である。電極バスは、個々の電極要素または個々の電極下部構造から別の電気接続への共通の伝導経路を提供する。本発明のデバイスでは、電極バスは、電極構造の各電極要素に接触し、接続パッドにつながる電気トレースへの電気接続経路を提供することができる。

本明細書で使用される「電極トレース」または「導電性トレース」または「電気トレース」は、電極または電極要素または電極構造から、電極または電極要素または電極構造をインピーダンス分析器に接続するためのデバイスまたは装置の一端または境界に向かって延在する導電性経路である。デバイスの端または境界は、デバイスまたは装置の接続パッドに対応しうる。

本明細書で使用される場合、「接続パッド（connection pad）」は、装置またはデバイス上の少なくとも１つの電極構造内の少なくとも１つの電極またはすべての電極要素に電気的に接続され、外部電気回路（例えば、インピーダンス測定回路または信号源）に動作可能に接続できる装置またはデバイス（例えば、マルチウェルプレート）上の領域である。接続パッドとインピーダンス測定回路または信号源との間の電気接続は、リードやワイヤなどの適切な電気伝導手段を介して、直接的または間接的に行うことができる。このような電気伝導手段は、装置またはデバイスの他の領域に配置された電極または電気伝導経路を通過することもできる。

本明細書で使用するとき、「互いに噛み合った（interdigitated）」とは、折り畳まれた手の指のように、異なる方向から来る突起と交錯する一方向に来る突起を有することを意味する（ただし、互いに入り込んだ電極要素は、好ましくは互いに接触しないことに留意されたい）。

本明細書で使用するとき、「電極（または電極構造）が実質的に同じ表面積を有する」とは、参照される電極の表面積が互いに実質的に異ならず、したがって、言及された電極（または電極構造）のいずれか１つにおける細胞付着または増殖によるインピーダンス変化は、言及された他の電極（または電極構造）について細胞付着または増殖によるインピーダンス変化と同程度または類似の程度までインピーダンスの全体的な検出可能な変化に寄与することを意味する。換言すれば、電極（または電極構造）が実質的に同じ表面積を有する場合、電極のいずれか１つが、電極上で細胞が付着または成長する際のインピーダンスの全体的な変化に寄与しうる。ほとんどの場合、「実質的に同じ表面積」を持つ最大の電極と最小の電極の表面積の比は１０未満である。

本明細書で使用される「電極間または電極間のインピーダンスの検出可能な変化」（または「電極構造間または電極構造間のインピーダンスの検出可能な変化」）は、電極表面で分子結合反応が起こるとき、前記電極（または電極構造）の間または間のインピーダンスは、インピーダンス分析器またはインピーダンス測定回路によって検出できる有意な変化を有するであろうことを意味する。インピーダンスの変化は、細胞が電極表面に付着した場合、細胞が電極表面に付着していない場合、または、装置の電極を含む表面に付着した細胞の数、種類、活性、接着性、もしくは形態が変化した場合、インピーダンス値の違いを指す。ほとんどの場合、検出可能なインピーダンスの変化は０．１％より大きくなる。インピーダンスの検出可能な変化は、１％、２％、５％、または８％より大きいことが好ましい。インピーダンスの検出可能な変化が１０％より大きいことがより好ましい。電極間または電極間のインピーダンスは、通常、測定用に印加される電界の周波数の関数である。「電極間または電極間のインピーダンスの検出可能な変化」は、検出可能なすべての周波数でインピーダンスの変化を必要としない。「電極間または電極間のインピーダンスの検出可能な変化」は、任意の単一周波数（または複数の周波数）で検出可能なインピーダンスの変化のみを必要とする。さらに、インピーダンスには抵抗とリアクタンスの２つの成分がある（リアクタンスは、容量性リアクタンスと誘導性リアクタンスの２つのカテゴリに分けることができる）。「電極間または電極間のインピーダンスの検出可能な変化」は、抵抗およびリアクタンスのいずれかが任意の単一周波数または複数の周波数で検出可能な変化を有することのみを必要とする。本開示では、インピーダンスは電気または電子インピーダンスである。このようなインピーダンスの測定方法は、（１）所定の周波数（または複数の周波数、または特定の電圧波形を有する）で電極間または電極間に電圧を印加し、その周波数（または複数の周波数、または特定の波形を有する）で前記電極を通る電流を監視し、電圧振幅値を電流振幅値で割り、インピーダンス値を導き出すステップと、（２）前記電極に単一の周波数成分（または複数の周波数または特定の電流波形を有する）の電流を印加し、その周波数（または複数の周波数または特定の波形を有する）で前記電極間または前記電極間に生じる電圧を監視し、電圧振幅値を電流振幅値で割り、インピーダンス値を導き出すステップと、（３）電気インピーダンスを測定または決定できるその他の方法とによって達成される。なお、上記の「電圧振幅値を電流振幅値で除算してインピーダンス値を求める」の説明において、「除算」は同じ周波数で電流振幅値と電圧振幅値の値について行われることに留意されたい。このような電気インピーダンスの測定は、試薬の使用を伴わない電子的または電気的プロセスである。

本明細書で使用する「少なくとも２つの電極が実質的に異なる表面積を有する」とは、いずれの電極の表面積も互いに類似しておらず、したがって、大きい方の電極での細胞の付着または成長によるインピーダンスの変化が、小さい方の電極での細胞の付着または成長によるインピーダンスの変化と同程度または類似の程度まで、検出可能なインピーダンス全体に寄与しないことを意味する。好ましくは、大きい方の電極（典型的には「対向電極（counter electrode）」と呼ばれる）での細胞の付着または増殖によるインピーダンス変化は、小さい方の電極（典型的には、「作用電極（working electrode）」または「測定電極（measuring electrode）」と呼ばれる）での細胞の付着または増殖によるインピーダンス変化よりも著しく小さい。通常、最大の電極と最小の電極との間の表面積の比は１０以上である。好ましくは、最大の電極と最小の電極との間の表面積の比率は、２０、３０、４０、５０または１００より大きい。「少なくとも２つの電極の表面積が実質的に異なる」例には、GiaverおよびKeeseによって開発された「電子細胞基質インピーダンスセンシング（ＥＣＩＳ：Electronic Cell-Substrate Impedance Sensing）」アプローチが含まれる。

本明細書で使用される場合、「行－列構成で配置される」とは、電気的接続に関して、電極、電極アレイまたはスイッチング回路の位置が、行位置番号および列位置番号の両方によって識別されることを意味する。

「細胞指標：Cell index」または「ＣＩ」は、測定されたインピーダンス値から導き出すことができ、インピーダンス値の変化を反映するために使用できるパラメータである。細胞指標を導出または計算する方法は多数ある。ＣＩは、米国特許第８，３４４，７４２号、米国特許第７，４７０，５３３号、米国特許第７，１９２，７５２号、ＰＣＴ／ＵＳ０３／２２５５７などにおいて以前に詳細に記載されている。それぞれは、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。特定の時点での「正規化された細胞指数」は、その時点での細胞指数を基準時点での細胞指数で割ることによって計算される。したがって、正規化細胞指標は参照時点で１である。「正規化細胞指数」は、米国特許第８，３４４，７４２号、米国特許第７，４７０，５３３号、米国特許第７，１９２，７５２号、ＰＣＴ／ＵＳ０３／２２５５７などにおいて以前に詳細に記載されている。それぞれは、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。所与の時点での「デルタ細胞指数」は、所与の時点での細胞指数から標準時点での細胞指数を差し引くことによって計算される。したがって、デルタ細胞指標は、初期時間（標準時点）から測定時間までの細胞指標の絶対変化である。「デルタ細胞指標」は、米国特許第８，３４４，７４２号、米国特許第７，４７０，５３３号、米国特許第７，１９２，７５２号、ＰＣＴ／ＵＳ０３／２２５５７などにおいて以前に詳細に記載されている。それぞれは、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。「Cell Change Index」または「ＣＣＩ」は、Ｃｅｌｌ Ｉｎｄｅｘから導出されたパラメータであり、ある時点での「ＣＣＩ」は、時間に対するＣｅｌｌ Ｉｎｄｅｘの１次導出を、その時点でのＣｅｌｌ Ｉｎｄｅｘで割った値に等しい。「ＣＣＩ」は、米国特許第８，３４４，７４２号、米国特許第７，４７０，５３３号、米国特許第７，１９２，７５２号、ＰＣＴ／ＵＳ０３／２２５５７などにおいて以前に詳細に記載されている。それぞれは、その全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

本明細書で使用される場合、「用量反応曲線」は、試験化合物の用量濃度に対する細胞の反応の依存関係を意味する。細胞の応答は、さまざまなパラメータで測定できる。例えば、試験化合物が細胞毒性を持ち、細胞死を引き起こす疑いがある。次に、細胞を試験化合物で処理した後、細胞の応答を生存不能（または生存）細胞のパーセンテージで測定することができる。試験化合物の用量濃度の関数として生存不能（または生存）細胞のこのパーセンテージをプロットすると、用量反応曲線が構築される。本出願において、生存不能（または生存）細胞のパーセンテージは、測定されたインピーダンス値に関して、またはインピーダンス測定から導き出された細胞指数に関して、または細胞変化指数に関して表すことができる。例えば、特定の細胞型について、特定の細胞生理学的条件（例えば、特定の細胞培養培地）の下で、細胞指数は、インピーダンス測定から細胞指数が導出されたウェル内の生存細胞数と線形相関または正の相関があることが示される。したがって、本出願では、試験化合物の用量濃度の関数として細胞指数をプロットして、「用量反応曲線」を構築することができる。一般に、細胞指数はウェル内の生存細胞数と相関するだけでなく、細胞の形態と細胞接着にも関連することに留意されたい。したがって、投与濃度に対する細胞指数をプロットすると、細胞数だけでなく、細胞の生理学的状態（細胞の形態や細胞接着など）に関する情報も得られる。さらに、本出願のシステムおよびデバイスによって提供される重要な利点は、システムは細胞の継続的な監視を可能にし、数分という短い時間から数日または数週間という長さまでの時間範囲にわたって多くの時点でインピーダンス測定を提供するため、１回の実験で、複数の時点で「用量反応曲線」をうることができることである。

本明細書で使用される場合、「各ウェルは実質的に同数の細胞を含む」とは、ウェル内の細胞の最小数がウェル内の細胞の最大数の少なくとも５０％であることを意味する。好ましくは、ウェル内の細胞の最小数は、ウェル内の細胞の最大数の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％である。より好ましくは、各ウェルは同数の細胞を含む。

本明細書で使用される場合、「各ウェルが同じタイプの細胞を含む」とは、意図された目的のために、各ウェルが同じタイプの細胞を含むことを意味し、各ウェルが正確に同じタイプの細胞を含む必要はない。例えば、意図した目的が各ウェルに哺乳動物細胞を含むことである場合、各ウェルに、ヒト細胞、または異なる哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、ならびにマウス、ヤギまたはサル細胞などの他の非ヒト哺乳動物細胞など、同じタイプの哺乳類細胞が含まれている場合は許容される。

「既知の化合物」とは、少なくとも１つの活性が知られている化合物である。本発明において、既知の化合物は、好ましくは、細胞に対する１つまたは複数の直接的もしくは間接的な効果が知られている化合物である。既知の化合物の構造が既知であることが好ましいが、そうである必要はない。好ましくは、細胞に対する既知の化合物の作用機構は既知であり、例えば、細胞に対する既知の化合物の効果は、非限定的な例として、細胞生存率、細胞接着、アポトーシス、細胞分化、細胞増殖、細胞形態、細胞周期、ＩｇＥを介した細胞の活性化または刺激、受容体－リガンド結合、細胞数、細胞の質、細胞周期などに対する効果でありうる。

「インピーダンス値」は、細胞が存在する、または存在しないウェル内の電極について測定されたインピーダンスである。インピーダンスは一般に周波数の関数である。つまり、インピーダンス値は測定が行われた周波数に依存する。本出願では、インピーダンス値は、単一周波数または複数周波数のいずれかで測定されたインピーダンスを指す。さらに、インピーダンスには、抵抗成分とリアクタンス成分の２つの成分がある。本願におけるインピーダンス値は、抵抗成分、またはリアクタンス成分、または抵抗成分およびリアクタンス成分の両方を指す。したがって、「インピーダンス値」が測定または監視された場合、抵抗、またはリアクタンス、または抵抗とリアクタンスの両方が測定または監視されたことを指す。本願の方法の多くの実施形態では、インピーダンス値は、生の測定インピーダンスデータから導出されるパラメータ値も指す。例えば、細胞指標、または正規化細胞指標、またはデルタ細胞指標を使用して、インピーダンス値を表すことができる。

本明細書で使用される場合、「液体（流体）サンプル（liquid (flud) sample）」は、液体または流体として自然に存在するサンプル、例えば生体液（biological fluid）を指す。「液体サンプル」はまた、非液体状態、例えば固体または気体で自然に存在するが、固体または気体サンプル材料を含む液体、流体、溶液または懸濁液として調製されるサンプルも指す。例えば、液体サンプルは、生物組織を含む液体、流体、溶液、または懸濁液を包含しうる。

本明細書で使用される場合、「サンプル」は、本出願の装置、マイクロプレートまたは方法を使用して、単離、操作、測定、定量化、検出、または分析される部分を含みうるあらゆるものを指す。サンプルは、好ましくは、生物学的流体または生物学的組織などの生物学的サンプルである。生体液の例としては、細胞培養培地、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などの培地中の細胞の懸濁液が挙げられる。生物組織は細胞の集合体であり、通常は特定の種類の細胞間物質と一緒になって、結合組織、上皮組織、筋肉組織、神経組織を含む、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、またはウイルス構造の構造材料の１つを形成する。生物学的組織の例には、臓器、腫瘍、リンパ節、動脈、および個々の細胞も含まれる。生物学的サンプルは、細胞懸濁液、生物学的分子（例えば、タンパク質、酵素、核酸、炭水化物、生物学的分子に結合する化学分子）を含む溶液をさらに含んでもよい。

「試験化合物」とは、細胞に対する活性または直接的または間接的な効果が任意のアッセイで調査される任意の化合物である。試験化合物は、限定されないが、小分子、大分子、分子複合体、有機分子、無機分子、脂質、ステロイド、炭水化物、脂肪酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質などであるがこれらに限定されない生体分子、核酸、またはこれらの任意の組み合わせを含む任意の化合物でありうる。試験化合物は、合成化合物、天然化合物、天然化合物の誘導体などでありうる。試験化合物の構造は既知または未知であってもよい。

はじめに、図１Ａから始めて、サンプルを電子的および光学的にリアルタイムで連続的に監視するように構成された例示的なシステム１０が、ソフトウェアおよびユーザインターフェース２００がロードされたコンピュータプロセッサ１００と通信するように示されている。システム１０は、単一のアッセイからの異なる別個の流れの情報を収集して分析することにより、細胞活動を研究するための複数の視点を提供する。このマルチプレックスアッセイの豊富な情報は、それが報告するパラメータの数だけにあるのではなく、それが提供する視点の明確性／独自性にもある。本明細書に記載のシステム１０は、リアルタイムの細胞インピーダンスおよび生細胞撮像の非常に異なる観点から、細胞の健康状態および挙動を同時に、かつ同じウェル内で監視することを可能にする。

図１Ｂに移ると、システム１０は、細胞の温度、ＣＯ２および水分条件を調節するために、市販の細胞培養インキュベータに配置できるサイズであることが好ましい。すなわち、システム１０は、システム１０ではなくインキュベータが温度、ＣＯ２および湿度などの細胞培養条件を調節するように、細胞培養インキュベータに配置するための寸法である。寸法はユーザのニーズに応じて変更できるが、図１Ａおよび図１Ｂに示すシステム１０は、約４３０ｍｍ×４４５ｍｍ×４１０ｍｍの設置面積を有する。

一次ハウジング１２の上部は、５つのクレードル１４を有するプラットフォームとして具体化され、３つのクレードル１４Ａは、電子的（例えば、細胞基質インピーダンス）および光学的に生物学的サンプルを監視するように構成され、２つのクレードル１４Ｂは、電子的監視ではなく、生物学的サンプルを光学的に監視するためのものである。合計５つのクレードル１４が示されているが、当業者は、システム１０の設置面積を増加させることにより、クレードル１４を追加できることを認識するであろう。さらに、当業者は、生物学的サンプルの電子的および光学的監視の両方のために構成された同数または少ないクレードル１４Ａ（例えば、３つ、２つまたは１つのクレードル１４Ａ）、および／または生物学的サンプルの光学的監視のみのために構成された同数またはそれ以下の数の「光学のみ」のクレードル１４Ｂ（例えば、２つまたは１つ）（つまり、生物学的サンプルの電子的および光学的監視の両方のために構成された同数または少ないクレードル１４Ａ（例えば、３つ、２つまたは１つのクレードル１４Ａ）、又は、生物学的サンプルの光学的監視のみのために構成された同数またはそれ以下の数の「光学のみ」のクレードル１４Ｂ（例えば、２つまたは１つ）あるいはそれらの両方）を含む、図１に示されるものよりも少ないクレードル１４（例えば、４つ、３つ、２つのクレードル１４または単一クレードル１４）を有することが可能であることを認識するであろう。

図２Ａ～図２Ｃにより明確に示されるように、電子監視用に構成された各クレードル１４Ａは、好ましくは、可動係合ハンドル１８を使用して閉じてロックすることができるヒンジ付きカバー１６を有する。カバー１６を閉じてロックすると、電子プレート２０（図４を参照）とポゴピン２２（図２Ｂを参照）の間のぴったり合った電気的係合が確実に行われ、システム１０内のインピーダンスを監視するためのインピーダンス分析器またはインピーダンス測定回路に接続され、そして最終的に電子監視のために外部コンピュータプロセッサ１００（図１Ａ）と通信する。しかしながら、図２Ｃに示されるように、光学撮像専用に構成された各クレードル１４Ｂは、プレートとクレードル構成要素との間の電子的係合を必要とせず、したがって、カバー１６を閉じてロックする機構を必要としない。両方の場合において、ヒンジ付きカバー１６の外側は、クレードル１４に追加されるプレートまたは容器の意図されたフォーマットと一致する印（indecia）２４で印を付けることができる。

クレードルの内側には、好ましくはカバー１６に沿って、クレードル１４の内部を照明するように構成された照明モジュール２６がある。図３によりよく示されているように、好ましい実施形態では、照明モジュール２６は、コンピュータプロセッサ１００（図１Ａ）から電気接点３０経由で命令を受け取る複数の別個のＬＥＤ２８から形成される発光ダイオード（ＬＥＤ）アレイから構成される。いくつかの実施形態では、ＬＥＤアレイは、異なるマルチウェル形式のプレート（例えば、６ウェル、１２ウェル、２０ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル）または他の培養容器などとねじにより交換することができる。好ましくは、各ダイオード２８は、９６ウェルプレートの単一のウェル３２（図４～図５を参照）に割り当てられ、したがって、撮像のために対応するウェル３２を独立して照明するように構成される。ウェル３２のすぐ上にダイオード２８を設けることによって、システム１０は、ウェル３２全体を十分に照明して、高品質の撮像を保証する。好ましい実施形態では、照明モジュール２６は、明視野照明用に構成され、これは、照明モジュール２６が白色光を放出することを意味する。従来の光学顕微鏡法と同様に、生物学的サンプルを通過する白色光の量の違いは、カメラの倍率に応じて、細胞膜、核、その他の細部などの細胞成分を識別するのに十分なコントラストを提供し、したがって、細胞計数および／もしくは細胞コンフルエンス分析に、または、電子監視の前に、細胞がウェル３２の底に適切に定着していることを確認するために使用できる。細胞毒性、細胞生存率、および／または細胞増殖を評価するために、明視野照明下で生細胞のコントラストまたは識別を改善する画像増強色素で生物学的サンプルを染色することにより、画像化をさらに強化することができる（例えば、死細胞はトリパンブルーを吸収する）。

照明の制御は、コンピュータプロセッサ１００によって実行される。この目的のために、コンピュータプロセッサ１００は、生物学的サンプルの電子監視からの結果に応答して、１つまたは複数のダイオード２８を選択的に照射することができる。例えば、生体細胞は、細胞基質インピーダンス監視を使用して監視して、細胞増殖を評価することができ、確立された細胞単層または確立された細胞集団を示す設定値またはパラメータに到達すると、コンピュータプロセッサ１００は、１つまたは複数のＬＥＤ２８を使用して、１つまたは複数の電子的に監視されるウェル３２の照明を指示して、細胞画像を取り込むことができる。さらに、その細胞毒性を評価するための試験化合物の投与などの実験的治療中に、コンピュータプロセッサ１００は、所定の時点で、または細胞撮像のための細胞基質インピーダンス監視の変化に応答して、１つまたは複数のＬＥＤ２８の照明を選択的に指示して、細胞集団の減少を確認することができる。さらに、コンピュータプロセッサ１００は、照明モジュール２６からの１つまたは複数のダイオード２８を使用して明視野照明に指示し、電子監視（例えば、細胞基質インピーダンス監視）を行いながら同時に画像を取得することができる。

図２Ｂおよび図２Ｃに戻ると、生物学的サンプルを通過する白色光は、最終的に、クレードル１４の開いた底部３４を通ってクレードル１４を出る。「開いている（または、開いた）」とは、底部３４が完全に不透明ではないことを意味する。以下の段落でより詳細に説明するように、この開いている底部３４は、画像を取り込むための経路を提供する透明窓（図５を参照）を露出させる。細胞の電子監視用に構成された実施形態では、特にマルチウェルプレート２２をクレードル１４、１４Ａに、またはクレードル１４、１４Ａからロードおよびアンロードする際に、ポゴピン２２を保護するために、スロット付き保護シールド３６が開口底部３４にまたがってもよい。

完全を期すために、電子監視に適合したクレードル１４の開発は、マルチウェルプレートを使用した細胞の電子測定に固有の課題を克服する必要があった。例えば、生物学的サンプルの従来の電子監視では、電極を備えたマルチウェルプレートなどの容器には、プレートの異なるウェルにある異なるセットの電極と通信し、測定値を切り替えるための複雑な電極選択回路をそれ自体備えたドケットステーションが必要である。測定電極を切り替えて選択するためのそのような回路の多くは、必要な開口部を提供するために移動しなければならず、したがって、クレードル１４の底部３４を通して画像化する必要があった。例えば、図２Ｂは、クレードル１４の外周の部分を裏打ちするポゴピン２２（９６ウェル電子プレート２０との通信のために１２０が示されている）の使用を示している。しかし、必要な開口部を形成するためにこの回路を移動または再配線すると、システム１０の電気的特性に影響する。特に、必要な電極スイッチング回路をポゴピンから遠ざけるために電気ワイヤを長くすると、システムの抵抗が増加し、他の電気部品（図８のシステム１０における直線運動ステージ６６および７０を駆動するための回路など）から電子ノイズの干渉をもたらしうるので、最終的に電子監視の解像度と精度に影響を与えることになる。これは、好ましい電極構成において特に重要であり、すべてのウェルにわたって電極の各セットを切り替えて選択するためのすべてのワイヤ抵抗が等しいか、ほぼ等しくなければならない。さらに、細胞の電子監視に関する別の課題は、電極スイッチング回路がシステム１０内の局所的な熱生成を増加させることであり、これは、以前はドッキングステーションの下の各クレードル内で放散されていた。したがって、電極のスイッチング／選択回路および配線を従来の配置から遠ざけて移動または再構成することも、システム１０の加熱に影響を及ぼし、そのようなシステム１０の開発においてさらなる課題を提示した。したがって、過度の局所的な発熱を引き起こすことなく、電子監視のパフォーマンスに影響を与えることなく、電極スイッチングおよび選択回路をシステム１０内に再配置することができるように、システム１０の特別な技術開発が必要とされる同じウェル内のサンプルの電子的監視および光学的撮像の両方に適したシステムを達成する。

多くの革新的なエンジニアリング設計ステップを通じて、電極スイッチングおよび選択回路がポゴピン２２の近くに配置された。電極スイッチングチップの位置と向きは、局所的な発熱を最小限に抑えるために利用できるスペースが小さいにもかかわらず、チップ間の距離を最大化するように設計されている。さらに、プリント回路基板（ＰＣＢボード）は、マルチウェルプレート上のすべてのウェルにわたる電極の各セットのポゴピン２２と回路スイッチングチップとの間の電極抵抗の変動を最小限に抑えるために、電気伝導面の異なる層に適切な電気トレースレイアウトを使用して設計された。さらに、システム内の他の回路からの電気的インターフェースを最小限に抑えるために、ＰＣＢボード上の電気的グランドラインおよび電気的グランドプレーンに対して適切な関係で電気信号ワイヤ／ラインが設計された。

ここで、図２Ｂおよび図２Ｃを参照すると、各クレードル１４は、押されると、マルチウェルプレート２０の受け取りと閉じたカバー１６の両方を知らせる機械的センサ３８を含んでいてもよい。信号を送ると、クレードル１４は電子的および／または光学的監視の準備が整う。

図４～図５に移ると、好ましくは、電子プレート２０の各ウェル３２は、電極のセット４２と、ウェル３２の底面に電極４２がない透明窓４４とを有する。電極４２を有する領域と、電極４２を含まない透明領域とを提供することにより、少なくとも２つの明確に異なるアッセイを単一のウェル３２で行うことができる。特に、電子監視（例えば、細胞基質インピーダンス監視）は、電極４２のセットを使用して行うことができ、光学撮像は、クレードルの開いた底部３４（図２Ｂ、図２Ｃを参照）を通して、および透明窓４４を通して、光学撮像モジュール４６（図６）の焦点を合わせることによって行うことができる。図４に示すように、電子プレート２０は好ましくはマルチウェルプレート２０であり、サンプルの電気的接続または電子的監視のために構成された「複数のウェル」を有すると説明することができる。当業者は、これらの「複数のウェル」に加えて、電気接続を持たないか、または電子監視用ではない、１つまたは複数のウェル３２が存在しうることを理解するであろう。このような場合、電子監視機能を欠くウェル３２は、コントロールウェルとして、または「光学撮像のみ」のウェル３２として機能する。この目的のために、電子的に監視するウェル３２は、非導電性基板（例えば、ウェルの底）と、基板上に作製された電極のセット４２によって画定される電極アレイと、電極４２のない基板上の透明な表示窓４４とを有するものとして説明することができる。

電極４２の構成は、サンプル撮像用の透明窓４４を保持できる限り、使用者のニーズまたは要望に応じて変更することができる。いくつかの実施形態では、電極アレイは、ＧａｉｖｅｒおよびＫｅｅｓｅによって記載された電子細胞基質インピーダンスセンシング（ＥＣＩＳ）システムと一致する微小電極アレイ（ＭＥＡ）であり、単一の大きな参照電極が複数の小さな作用電極または測定電極と対になっている。ＥＣＩＳでは、小さな交流電流が電極アレイ全体に印加される。これにより、電極間の電位がＥＣＩＳ機器によって測定される。細胞がＥＣＩＳアレイに追加され、測定電極に付着すると、それらは絶縁体として機能し、インピーダンスが増加する。細胞が成長して測定電極を覆うと、電極を覆う細胞の数、細胞の形態、および細胞付着の性質に関連する方法で電流が妨げられる。細胞が増殖または死ぬと、インピーダンスが変化する。

代替のより好ましいアプローチは、以前に記載されており（例えば、米国特許第８，３４４，７４２号、米国特許第７，４７０，５３３号、米国特許第７，１９２，７５２号、および他の場所で、列挙された特許のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、各電極アレイは２つの電極構造４２Ａ、４２Ｂを含み、各電極構造４２Ａ、４２Ｂは電極要素４２Ｃを含むが、透明窓４４を形成するために最も内側の電極要素４２Ｃが除去される（図５のパネルＡに示される概略図を参照）。電極構造４２Ａ、４２Ｂは、接続パッドまたはインターフェースに電気的に結合され、これらは基板の端部に配置され、したがってクレードル１４上のポゴピン２２に電気的に接続するように構成される。各電極アレイは、アレイ全体でほぼ均一な電極抵抗を有する。細胞基質インピーダンスの大幅な変化が作用電極または測定電極のみで監視されるＥＣＩＳアプローチとは対照的に（大面積の参照電極ではない）、電極を覆う細胞の数、細胞の形態、および細胞付着の性質に関連して、任意の櫛型電極上での細胞付着または成長が検出可能な方法で電流を妨げる。すなわち、この構成では、すべての電極４２が測定電極または作用電極として機能する。したがって、電極アレイは、コンピュータプロセッサ１００およびクレードル１４などを介して信号源に接続されたときに、電極構造４２Ａ、４２Ｂの周囲の空間の領域に電界を生成するユニットとして動作できるような寸法および間隔を有するように構築された２つ以上の電極構造４２Ａ、４２Ｂとすることができる。

電子監視が細胞基質インピーダンス監視である場合、電子回路はクレードル１４を介して電極４２のセットをコンピュータプロセッサ１００に接続する。好ましくは、そのような実施形態では、コンピュータプロセッサ１００は、システム１０内に完全に組み込むことができるインピーダンス測定回路またはインピーダンス分析器と通信する。インピーダンス分析器は、電流と電圧を測定する電子ハードウェア回路と、ファームウェアおよび／またはソフトウェアの信号およびデータ処理アルゴリズムを含みうる。システム１００は、インピーダンス分析器に接続されると、細胞の挙動に関連するインピーダンス値の差を測定することができる。例えば、システム１０は、細胞が電極アレイに付着している場合と細胞が電極アレイに付着していない場合のインピーダンス値の差を測定することができ、または、電極４２に付着した細胞の数、種類、活性、接着性、または形態が変化したときのインピーダンス値の違いを検出することができる。特に、細胞基質インピーダンス監視は、電極４２上に細胞の成長または増殖状態と、ウェル内の生細胞および／または死細胞の数（つまり、ウェル内の生細胞の数または死細胞の数あるいはそれらの両方）と、細胞骨格の変化と再編成、およびアポトーシスおよび／または壊死（つまり、アポトーシスまたは壊死あるいはそれらの両方）を経る細胞の数とを含む基板上の細胞付着または接着状態（例えば、細胞拡散の程度、細胞の付着面積、細胞付着の密着度、細胞形態）に関する情報を明らかにすることができる。

いくつかの実施形態では、インピーダンス分析器は、１Ｈｚから１ＭＨｚの周波数範囲で０．１オームから１０^５オームの間のインピーダンスを測定することができる。より好ましくは、インピーダンス分析器は、１００Ｈｚから１００ｋＨｚの周波数範囲で０．１オームから１０^３オームの間のインピーダンスを測定することができる。インピーダンス分析器はまた、インピーダンスの抵抗成分とリアクタンス成分（容量性リアクタンスと誘導性リアクタンス）の両方を測定できることが好ましい。

さらに、システム１０は、選択的監視のために電極４２のセットのそれぞれへの接続をオンおよびオフに切り替えることができる電子スイッチを含む。これらのスイッチは、好ましくはコンピュータプロセッサ１００にロードされるソフトウェアプログラムによって制御される。ソフトウェアプログラムは、電極アレイのインピーダンス分析器への接続を指示し、電極４２からの細胞基質インピーダンスを監視する。インピーダンス監視中、インピーダンス分析器は１つの周波数または複数の周波数でインピーダンスを監視できる。ほとんどの場合、インピーダンス監視は、特定のアッセイに対して複数の時点で実行される。したがって、システムは個々のアレイをインピーダンス分析器に接続して、アレイ１つ、一部、またはすべてを１つまたは複数の時点で監視できる。さらに、スイッチを使用すると、選択した個々のアレイを、必要な監視時点ごとにすばやく連続して監視できる。各監視時点は、実際には、インピーダンス監視が実行されるアッセイにおける測定の狭い時間枠（例えば、ミリ秒から数分）である。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、選択された時間間隔でアレイを含むプレート２０のウェル３２のいずれかのインピーダンス監視を指示するようにプログラム可能である。

上記を推進するために、システム１０を使用して、回路を使用して複数のアッセイを効率的かつ同時に実行し、１つのウェル３２内のアレイにわたる細胞基質インピーダンス監視から、同じ電子回路プレート２０または別の電子プレート２０からかどうかにかかわらず、別のウェル３２内のアレイにわたる細胞基質インピーダンス監視にデジタル的に切り替えることができる。いくつかの実施形態では、ソフトウェア制御下のシステムは、単一の周波数で約１秒以内に個々のウェル３２のインピーダンス測定を完了することができる。さらなる実施形態では、細胞基質インピーダンスはミリ秒の分解能で監視される。ミリ秒の分解能で細胞基質インピーダンスを監視するアプローチは、米国特許第１０，５３３，９８５号、米国特許第１０，０１２，６３６号、および米国特許第９，７０９，５４８号、その他に記載されている。列挙された特許のそれぞれは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。したがって、いくつかの実施形態では、２つの連続したインピーダンス測定が、互いに離れて４０ｍｓ以内に監視される。いくつかの実施形態では、２つの連続したインピーダンス測定値が互いに２０ｍｓ以内に監視される。いくつかの実施形態では、２つの連続したインピーダンス測定が互いに１０ｍｓ以内に監視される。いくつかの実施形態では、２つの連続したインピーダンス測定が互いに１ｍｓ以内に監視される。いくつかの実施形態では、２つの連続したインピーダンス測定が、互いに１ｍｓ秒未満離れて監視される。

システムは、主に細胞の細胞基質インピーダンス監視に関して説明されているが、当業者は、システムが細胞外記録を行うためにも適合されうることを認識するであろう。細胞外記録は、小さな記録電極とはるかに大きな参照電極との間の電圧信号を増幅および記録することによって行うことができる（このような小さな記録電極と大きな参照電極の使用は、ＥＣＩＳで使用されるものと同様であることに留意されたい)。細胞外記録の実施形態では、インピーダンス測定システム（例えば、電流と電圧を測定する電子ハードウェア回路を含むインピーダンス分析システム、ソフトウェアおよび／またはファームウェア（つまり、ソフトウェアまたはファームウェアあるいはそれらの両方）の信号とデータ処理アルゴリズム）ではなく、細胞外記録システム（電圧信号増幅器および電圧を測定するためのその他の電子ハードウェア回路と、ソフトウェアおよび／またはファームウェア（つまり、ソフトウェアまたはファームウェアあるいはそれらの両方）で実装される信号処理アルゴリズムを含む）が使用される。

図６～図７に進むと、例示的な光学撮像モジュール２６は、各ウェル３２から画像を取り込むことができる。好ましい実施形態では、光学撮像モジュール２６は、一次ハウジング１２（図１Ｂを参照）内でクレードル１４の下に配置される。例示的な光学撮像モジュール２６は、一端に長作動距離対物レンズ４８を含み、反対側の端に密封されたＣＭＯＳカメラ５０を含む。いくつかの実施形態では、カメラは毎秒３０枚の画像を取り込む。いくつかの実施形態では、カメラは毎秒４０枚の画像を取り込む。いくつかの実施形態では、カメラは毎秒５０枚の画像を取り込む。いくつかの実施形態では、カメラは毎秒６０枚の画像を取り込む。いくつかの実施形態では、カメラは毎秒７０枚の画像を取り込む。いくつかの実施形態では、カメラは毎秒７０枚を超える画像を取り込む。高速撮影により、撮影条件やフィルタを変えて撮影した画像を重ね合わせることができる。結像を強化するためのチューブレンズ５２Ａ、５２Ｂおよびバンドパスフィルタ５４も示されている。光学撮像システム２６は、コンピュータプロセッサ１００から命令を受信し、画像をコンピュータプロセッサ１００に送信する。したがって、ウェル３２の明視野照明により、光学撮像システム２６は、クレードル１４が閉じている場合でも、クレードル１４の開いた底部３４を通して画像を取り込むことができる（図２Ａ～図２Ｂを参照）。

好ましくは、光学撮像システム２６は励起光源５６も含み、これは集束レンズ５８を通して光を導くか、または蛍光撮像のための蛍光を誘導するなどしてウェル３２内の分子を励起するＬＥＤのセットとして示されている。黄色５６Ａ、紫外線５６Ｂ、および青色５６Ｃに対応するＬＥＤが示されているが、励起には１～７個のライトの任意の数を含めることができる。例えば、励起光源５６は、紫外光、紫光、青色光、緑色光、黄色光、橙色光、および赤色光を含む１つまたは複数の光を含みうる。したがって、システム１０は、細胞の明視野コントラスト画像だけでなく、蛍光タグ付き抗体、抗体フラグメント、または細胞に結合する他の分子などの蛍光タグ付きマーカも取り込むように構成される。この目的のために、システムは、適切な蛍光色素または蛍光標識分子を細胞サンプルに添加し、撮像モジュールを介して蛍光を捕捉することにより、細胞増殖、細胞死、細胞アポトーシス、エフェクタ細胞殺傷、細胞間相互作用、細胞結合、ＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質アップレギュレーション、ＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質ダウンレギュレーションなど、さまざまな段階の撮像を提供できる。

光学撮像システム５６の一部であるため、励起光源５６も、ソフトウェアがロードされたコンピュータプロセッサ１００によって制御される。したがって、コンピュータプロセッサ１００は、各ＬＥＤ５６Ａ、５６Ｂ、５６Ｃのオン／オフ切り替えを指示し、カメラ５０を介して画像の高速取り込みを指示することができる。細胞の光学的監視の操作では、一度に１つのＬＥＤがオンになり、対応する色の蛍光画像が単色（白黒）ＣＭＯＳカメラ５０によって取り込まれる。例えば、黄色ＬＥＤ５６Ａ、紫外ＬＥＤ５６Ｂ、および青色ＬＥＤ５６Ｃは、それぞれ赤、青、および赤の蛍光画像に対応する。取り込まれた単色画像は、対応する蛍光色を表現するために疑似カラーリングで表示される。さらに、コンピュータプロセッサ１００は、撮像から生細胞の数を決定し、蛍光の有無（＋／－）、各ウェルまたは多数のウェルにおける細胞の総蛍光強度、１つのウェルまたは複数のウェルにある細胞の平均蛍光強度などのパラメータを決定することができる。さらに、コンピュータプロセッサ１００は、包括的な分析のために蛍光画像（または単一または複数の色）および明視野照明画像を重ねることができる。

まとめて図５、図６、および図８を参照すると、光学モジュール５６は、異なる窓４４を横切って移動するために可動支持体６０に取り付けられている。一般に、レンズ調整またはコンピュータ制御のフォーカスにより、ウェル３２間のわずかな焦点距離の違いを説明できるため、Ｘ軸とＹ軸に沿った移動のみが必要である。したがって、可動支持体６０は、Ｘ軸モータとタイミングベルト６２、Ｘ軸ケーブルラック６４、Ｘ軸直線運動ガイド６６、Ｙ軸ケーブルラック６８、およびＹ軸直線運動ガイド７０を使用して２方向に移動する。磁気リニアエンコーダ７２は、光学撮像モジュール５６のＸ、Ｙ座標を識別するのに役立つ。

すでに述べたように、監視システム１０は、データを保存および表示することもできる。データは、画面２００に表示することも、印刷データとして表示することも、またはその両方を行うこともできる。好ましくは、ソフトウェアは、細胞タイプ、化合物濃度、監視される時間間隔などを含む記述情報などの実験パラメータの入力および表示を可能にしうる。さらに、データは、異なる蛍光チャネル（つまり、異なる蛍光色）からの光学撮像、明視野照明、および電子監視データを示す組み合わせなど、重ねて表示できる。

好ましくは、ソフトウェアはインピーダンスデータも分析できる。好ましい実施形態では、ソフトウェアは、１つまたは複数のウェルについて１つまたは複数の時点について細胞指数（ＣＩ）を計算することができる。いくつかの好ましい実施形態では、ソフトウェアは、１つまたは複数のウェルのインピーダンス測定から細胞変化指数（ＣＣＩ：cell change index）を計算することができる。ソフトウェアは、好ましくは、インピーダンスデータおよびインピーダンス値（限定されないが、ＣＩまたはＣＣＩなど）の時間に対するプロットを生成することができる。ソフトウェアは、ＣＩから細胞数を計算する、インピーダンスデータに基づいて用量反応曲線を生成する、インピーダンス値に基づいてＩＣ値を計算する、インピーダンス値とインピーダンス値曲線とに基づいて細胞増殖または挙動の動力学的パラメータを計算するなど、他の分析も実行できる。インピーダンス監視システムのソフトウェアは、計算されたインピーダンス値やそこから得られた動力学的パラメータなど、データの分析を保存および表示することもできる。データは、画面に表示することも、印刷データとして表示することも、またはその両方を行うこともできる。

同様に、ソフトウェアを使用して取り込んだ画像を分析することもできる。好ましくは、ソフトウェアは画像から細胞計数機能を実行でき、統計分析のために経時的にデータをプロットできる。好ましくは、ソフトウェアは、異なる波長チャネルの蛍光撮像、明視野照明、および対応する電子監視時点と重ね合わせた対細胞撮像結果からの計数など、データの分析を保存および表示することもできる。

例えば、取り込まれている画像が細胞の明視野画像である場合、使用方法は、明視野画像から細胞コンフルエンス数またはパラメータを決定するか、細胞を計数するステップを含み、または、取り込まれている画像が細胞の蛍光画像である場合、使用方法は、総蛍光計数、総蛍光強度、および平均蛍光強度からなる群のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択された、各色の画像から蛍光パラメータを決定するステップを含み、または、取得される画像に細胞の明視野画像と細胞の蛍光画像が含まれる場合、使用方法は、明視野画像から細胞コンフルエンス数またはパラメータを導出し、任意選択的に明視野画像から細胞を計数するステップと、総蛍光計数、総蛍光強度、および平均蛍光強度からなる群のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択される、蛍光画像からの蛍光パラメータを決定するステップと、任意選択的に、１つまたは複数のウェルについて、１つまたは複数の色の明視野画像と蛍光画像を重ね合わせるステップとを含む。

細胞の電子監視と生細胞撮像を組み合わせることの利点は、図１１Ａ～図１２Ｃを見ると特に明らかである（以下の実施例でより詳細に説明する）。特に、細胞基質インピーダンスは、Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞に対するスタウロスポリン（staurosporine）を介した急速な影響を検出できたが、この変化を引き起こす細胞現象は、インピーダンスのみを使用して解読することはできなかった。しかし、生細胞撮像は、細胞質の大規模な収縮を明らかにし、大きくて急速なインピーダンス応答のメカニズムの説明を即座に示唆した。同様に、インピーダンスは、撮像だけでは得られなかったであろう洞察を提供した。そのような例の１つでは、ＭＧ１３２処理により、細胞が電極から分離されたが、ウェル内に存在したままであり（細胞コンフルエンス（cellular confluence）は＞５０％のままであり（図１４Ｂ）、コンフルエンス数は画像解析アルゴリズムによって明視野画像から得られる）、細胞撮像ではウェル内に細胞が存在することが示されたが、インピーダンス（インピーダンス信号がゼロに低下（図１１Ａ））のみが細胞基質付着強度を明らかにした。２つの独立した測定技術を持つことの利点を超えて、ユーザからの処理や入力なしで直接報告されるインピーダンスの読み取り値の客観性に注意することが重要である。

集合的に図１～図８に戻ると、結合細胞基質インピーダンス監視および同じ細胞集団の生細胞撮像の非限定的な使用が、ここでより詳細に説明される。すなわち、マルチウェルプレート２０のウェル３２内の細胞を電子的に監視するステップであって、各ウェル３２が一組の複数の電極４２、好ましくは一組の細胞基質インピーダンス監視電極４２、および電極４２がないウェル３２の底面上の透明窓４４を有するステップと、電子的に監視されている、または監視されてきた少なくとも１つのウェル３２から窓４４を通して画像を取り込むステップと、を含む、細胞を監視する方法が開示される。この監視から、方法は、経時的に監視されたインピーダンスからインピーダンスベースの曲線（例えば、ＣＩ曲線）を生成するステップと、インピーダンスベースの曲線と対応する光学画像を表示するステップとを含みうる。画像は、明視野照明または蛍光励起（抗体、抗体フラグメント、または他の結合分子に結合した蛍光分子標識の励起など）から取得できる。そのため、データは、細胞の健康状態、挙動、および細胞間相互作用に関する詳細な情報を明らかにする定量的動力学を提供できる。

細胞増殖アッセイを実施するための方法も開示される。これらのアッセイでは、監視されたインピーダンスの増加は、細胞数の増加を示しており、対応するリアルタイム撮像によって確認できる。インピーダンス測定値またはインピーダンス測定から導出されたインピーダンス値を時間に対してプロットして、マルチウェルプレート２０のウェル３２で増殖する細胞の増殖曲線を取得し、同じウェル３２から、特に、明視野照明から、および／または細胞増殖に関連する経路またはマーカの蛍光撮像から（つまり、明視野照明から、または、細胞増殖に関連する経路またはマーカの蛍光撮像から、あるいはそれらの両方）の取り込み細胞画像とともに提示することができる。

関連して、少なくとも１つの細胞増殖曲線を生成する方法が提供され、方法は、各ウェル３２が、一組の電極４２と、電極４２がないウェル３２の底面上の透明窓４４とを含む、マルチウェルプレート２０内で細胞を経時的にインキュベートするステップと、細胞基質インピーダンスを監視し、窓４４を通して同じウェル３２から光学画像を取得するステップと、監視されたインピーダンスからインピーダンスベースの曲線を生成するステップと、インピーダンスベースの曲線と対応する光学画像の表示するステップとを含む。

リアルタイムの細胞撮像と組み合わせた１つまたは複数の細胞タイプの成長曲線を使用して、力学的パラメータを決定できる。例えば、異なる原発性癌細胞の増殖率を比較することができ、または同じタイプであるがグレードが異なる原発性癌細胞の増殖率を比較することができる。別の例では、異なる遺伝子型の個体の初代細胞を比較することができる。別の例では増殖率を比較することができ、初代幹細胞または細胞株の幹細胞を比較できる。さらに別の例では、細胞株の対照細胞および遺伝子改変細胞の増殖曲線またはパラメータを比較することができる。さらに別の例では、ウイルスに感染した細胞と対照細胞の増殖曲線またはパラメータを比較することができる。さらに、システムの撮像機能を使用して、明視野照明によって取り込まれた画像を介して細胞計数または細胞コンフルエンス計算を実行することによって、または蛍光分子または蛍光タグ付き結合分子で染色され、蛍光撮像下で取り込まれた細胞を計数することなどによって、成長を確認できる。

システム１０はまた、細胞に対する１つまたは複数の試験化合物の効果を調査するために使用することができる。例示的な実施形態は、マルチウェルプレート２０内で細胞を経時的にインキュベートする（incubate：培養する）ステップであって、各ウェル３２が、一組の電極４２と、電極４２がないウェル３２の底面上の透明窓４４とを含むステップと、細胞基質インピーダンスを監視し、窓４４を通して同じウェル３２から光学画像を取得するステップと、ウェル３２の少なくとも１つに試験化合物を添加するステップと、細胞基質インピーダンスを監視し続け、窓４４を通して同じウェル３２から光学画像を取得するステップと、経時的に監視されたインピーダンスからインピーダンスベースの曲線を生成するステップと、対応するウェルからインピーダンスベースの曲線と光学画像を表示するステップとを含む。効果の変化は、化合物添加後の結果を化合物添加前の結果と比較することによって、および／または細胞を有する別のウェル３２にビークルコントロール（vehicle control）を提供し、ウェル３２間でインピーダンスベースの曲線および／または画像（つまり、曲線または画像あるいはそれらの両方）を比較することによって（つまり、化合物添加後の結果を化合物添加前の結果と比較することによって、または、細胞を有する別のウェル３２にビークルコントロールを提供し、ウェル３２間でインピーダンスベースの曲線および／または画像を比較することによって、あるいはそれらの両方によって）決定することができる。

２つ以上の細胞型に対する化合物の効果を比較する方法も開示される。例示的な方法は、マルチウェルプレート２０内で細胞を経時的にインキュベートするステップであって、各ウェル３２が一組の電極４２と、電極４４のないウェル３２の底面上の透明窓４４とを含み、ウェル３２の少なくとも１つが、１つの細胞型を受容し、少なくとも別のウェル３２が異なる細胞型を受容するステップと、細胞基質インピーダンスを監視し、細胞を有するウェル３２のそれぞれから光学画像を取得するステップと、各細胞型を有するウェル３２に同じ試験化合物を添加するステップと、細胞基質インピーダンスを監視し続け、窓４４を通して細胞および試験化合物を有するウェル３２のそれぞれから光学画像を取得するステップと、経時的に監視されたインピーダンスからインピーダンスベースの曲線を生成するステップと、互いに比較するために、ウェル３２のそれぞれについてインピーダンスベースの曲線および対応する光学画像を表示するステップとを含む。当技術分野で知られているように、ビークルコントロールを使用するウェル３２も含めることができる。

細胞に対する２つ以上の異なる化合物の効果を比較する方法も開示される。例示的な方法は、マルチウェルプレート２０内で細胞を経時的にインキュベートするステップであって、各ウェル３２が一組の電極４２と、電極４２のないウェル３２の底面上の透明窓４４とを含み、ウェル３２のうちの少なくとも２つが細胞を受け取るステップと、細胞基質インピーダンスを監視し、細胞を有するウェル３２のそれぞれから光学画像を取得するステップと、細胞を有する異なるウェル３２に異なる試験化合物を添加するステップと、細胞基質インピーダンスを監視し続け、窓４４を通して細胞および試験化合物を有する各ウェル３２から光学画像を取得するステップと、経時的に監視されたインピーダンスからインピーダンスベースの曲線を生成するステップと、互いに比較するために、ウェル３２のそれぞれについてインピーダンスベースの曲線および対応する光学画像を表示するステップとを含む。当技術分野で知られているように、ビークルコントロールを使用するウェル３２も含めることができる。

関連して、異なる濃度の１つまたは複数の試験化合物の細胞に対する効果を試験するためのアッセイを行う方法も開示される。このような用量反応関係を使用して、時間依存性ＩＣ５、ＩＣ１０、ＩＣ２０、ＩＣ３０、ＩＣ４０、ＩＣ５０、ＩＣ６０、ＩＣ７０、ＩＣ８０、ＩＣ９０、またはＩＣ９５を導き出すことができ、これらはすべて用量反応曲線から導き出すことができる。通常、ＩＣ５０が最も重要である。化合物の時間依存性ＩＣ５０の範囲を決定することで、細胞に対する化合物の効果が最大になる時期に関する情報が得られる。したがって、例示的な方法は、マルチウェルプレート２０内で細胞を経時的にインキュベートするステップであって、各ウェル３２が、一組の電極４２と、電極４２のないウェル３２の底面上の透明窓４４とを含み、少なくとも２つのウェル３２が細胞を受け入れるステップと、細胞基質インピーダンスを監視し、細胞を有するウェル３２のそれぞれから光学画像を取得するステップと、細胞を有する異なるウェル３２に異なる濃度の試験化合物を添加するステップと、細胞基質インピーダンスを監視し続け、窓４４を通して細胞および試験化合物を有するウェル３２のそれぞれから光学画像を取得するステップと、経時的に監視されたインピーダンスからインピーダンスベースの曲線を生成するステップと、ウェル３２のそれぞれについてインピーダンスベースの曲線および対応する光学画像を表示して、それらの用量反応曲線または用量関係を比較するか、または用量反応曲線のそれぞれから導出されたＩＣ５０値を比較するなど、相互に比較するステップと、を含む。当技術分野で知られているように、ビークルコントロールを使用するウェル３２も含めることができる。

化合物のリアルタイム細胞毒性アッセイを実施する方法も開示される。例示的な実施形態は、各ウェル３２が、一組の電極４２と、電極４２のないウェル３２の底面上の透明窓４４とを含むマルチウェルプレート２０内で細胞を経時的にインキュベートするステップと、細胞基質インピーダンスを監視し、細胞を有するウェル３２のそれぞれから光学画像を取得するステップと、細胞毒性化合物または細胞毒性が疑われる化合物を、細胞を有する１つまたは複数のウェル３２に添加するステップと、細胞基質インピーダンスを監視し続け、窓４４を通して細胞および添加された化合物を有する各ウェル３２から光学画像を取得するステップと、経時的に監視されたインピーダンスからインピーダンスベースの曲線を生成するステップと、互いに比較するために、ウェル３２のそれぞれについてインピーダンスベースの曲線および対応する光学画像を表示するステップとを含む。当技術分野で知られているように、ビークルコントロールを使用するウェル３２も含めることができる。

細胞型に対する第１の化合物および第２の化合物の時間依存性細胞毒性効果を分析および比較する方法も開示される。例示的な実施形態は、各ウェル３２が、一組の電極４２と、電極４２のないウェル３２の底面上の透明窓４４とを含むマルチウェルプレート２０内で細胞を経時的にインキュベートするステップと、細胞基質インピーダンスを監視し、細胞を有するウェル３２のそれぞれから光学画像を取得するステップと、第１の細胞毒性化合物または細胞毒性であると疑われる第１の化合物を、細胞を有する１つまたは複数のウェル３２に添加し、第２の細胞毒性化合物または細胞毒性であると疑われる第２の化合物を、細胞を有する別の１つまたは複数のウェル３２に添加するステップと、細胞基質インピーダンスを監視し続け、窓４４を通して細胞および添加された化合物を有する各ウェル３２から光学画像を取得するステップと、経時的に監視されたインピーダンスからインピーダンスベースの曲線を生成するステップと、互いに比較するために、第１および第２の化合物に関連するウェル３２のインピーダンスベースの曲線および対応する光学画像を表示するステップとを含む。当技術分野で知られているように、ビークルコントロールを使用するウェル３２も含めることができる。いくつかの実施形態では、時間依存性細胞毒性応答は、複数回投与濃度での第１の化合物について決定される。いくつかの実施形態では、時間依存性細胞毒性応答は、複数回投与濃度での第２の化合物について決定される。いくつかの実施形態では、時間依存性細胞毒性応答は、複数回投与濃度での第１の化合物および第２の化合物の両方について決定される。

いくつかの実施形態では、第１の化合物は、その細胞毒性効果について既知のメカニズムを有する化合物であり、第２の化合物は、その細胞毒性効果について未知のメカニズムを有する化合物である。第２の化合物からの時間依存性細胞毒性応答が第１の化合物のそれと類似している場合、第２の化合物は、第１の化合物と同様の細胞毒性効果のメカニズムに従いうる。

化合物の細胞毒性応答を比較する際に、さまざまなアプローチを使用できる。細胞指標（または細胞数指標）は、取得したインピーダンス値を使用して任意選択的に計算できる。いくつかの実施形態では、化合物について時間依存性ＩＣ５０を導き出すことができ、細胞指数値に基づいてそれらの時間依存性ＩＣ５０曲線を比較することによって、それらの細胞毒性（cytotoxic）応答間の比較を行うことができる。ＩＣ５０曲線が同様の時間依存傾向をたどる場合、２つの化合物は細胞毒性効果を誘発するための同様のメカニズムに従いうる。

いくつかの実施形態では、２つの化合物の濃度が同じであっても異なっていてもよい場合に、２つの化合物の時間依存性細胞毒性応答の直接比較が行われる。時間依存性細胞毒性応答間の直接比較は、測定された応答の変化の勾配（時間に対する応答の一次導関数に相当する）を分析し、２つの化合物の時間依存性勾配を比較することによって行うことができる。別のアプローチでは、時間依存性細胞毒性応答を分析して、時間に関する高次導関数を求めることができる。このような高次誘導体を比較することで、化合物が誘発する細胞毒性のメカニズムに関する追加情報が得られる可能性がある。

いくつかの実施形態では、リアルタイムの細胞毒性応答を分析することは、複数の細胞型に対する化合物の時間依存性ＩＣ５０値の導出を含みうる。いくつかの実施形態では、リアルタイムの細胞毒性応答を分析することは、所与の化合物濃度での時間依存性細胞毒性応答における変化の勾配の導出を含みうる。いくつかの実施形態では、リアルタイムの細胞毒性応答を分析することは、所与の化合物濃度での時間に対する時間依存性細胞毒性応答の高次導関数の導出を含みうる。

癌細胞に対する提案された抗癌治療薬の効果を評価するための方法も開示される。例示的な実施形態は、マルチウェルプレート２０内で癌細胞を経時的にインキュベートするステップであって、各ウェル３２が一組の電極４２と、電極のないウェル３２の底面上の透明窓４４とを含むステップと、１つまたは複数の提案された治療薬を細胞に追加するステップと、細胞基質インピーダンスを監視し、細胞を有するウェル３２のそれぞれから光学画像を取得するステップと、エフェクタ細胞、好ましくは癌細胞が得られたのと同じ被験体からのエフェクタ細胞をウェル３２に加えるステップと、細胞基質インピーダンスを監視し続け、窓４４を通してウェル３２の各々から光学画像を取得するステップと、経時的に監視されたインピーダンスからインピーダンスベースの曲線を生成するステップと、インピーダンスベースの曲線とウェル３２からの対応する光学画像を表示するステップとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、エフェクタ細胞としてのＣＡＲ－Ｔ細胞の添加を含む。当技術分野で知られているように、ビークルコントロールを使用するウェル３２も含めることができる。

操作されたエフェクタ細胞による癌細胞の細胞溶解を評価する方法も開示される。例示的な実施形態は、各ウェル３２が、電極のセット４２と、電極４２のないウェル３２の底面上の透明窓４４とを含むマルチウェルプレート２０内で癌細胞を経時的にインキュベートするステップと、細胞－基板インピーダンスを監視し、細胞を有するウェル３２のそれぞれから光学画像を取得するステップと、好ましくは癌細胞が得られたのと同じ被験体からの、癌細胞に結合すると疑われる結合部分を示すように操作されたエフェクタ細胞をウェル３２に添加するステップと、細胞基質インピーダンスを監視し続け、窓４４を通してウェル３２の各々から光学画像を取得するステップと、経時的に監視されたインピーダンスからインピーダンスベースの曲線を生成するステップと、インピーダンスベースの曲線とウェル３２からの対応する光学画像を表示するステップとを含む。当技術分野で知られているように、ビークルコントロールを使用するウェル３２も含めることができる。

二重特異性エンゲージャ（bispecific engager）による癌細胞の細胞溶解を評価する方法も開示される。例示的な実施形態は、マルチウェルプレート２０内で癌細胞を経時的にインキュベートするステップであって、各ウェル３２が一組の電極４２と、電極のないウェル３２の底面上の透明窓４４とを含むステップと、細胞基質インピーダンスを監視し、細胞を有するウェル３２のそれぞれから光学画像を取得するステップと、好ましくは癌細胞と同じ患者からのエフェクタ細胞をウェル３２に加えるステップと、エフェクタ細胞を癌細胞に橋渡しするように構成された二重特異性エンゲージャを追加し、細胞基質インピーダンスを監視し続け、窓４４を通してウェル３２の各々から光学画像を取得するステップと、経時的に監視されたインピーダンスからインピーダンスベースの曲線を生成するステップと、インピーダンスベースの曲線とウェル３２からの対応する光学画像を表示するステップとを含む。当技術分野で知られているように、ビークルコントロールを使用するウェル３２も含めることができる。

以下の例でより詳細に示されるように、本明細書のシステムおよび方法は、生細胞撮像の非常に特異的な読み出しと、リアルタイムインピーダンス監視のシンプルさ、分析感度、および客観性を組み合わせて、比類のない豊富な情報で細胞プロセスを継続的に追跡する。

［実施例１］
［リアルタイムでの癌標的細胞の免疫細胞媒介死滅の監視］
ＭＣＦ７乳癌細胞に赤色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルス（ｅＬｅｎｔｉ Ｒｅｄ、カタログ番号８７１１０１１）をトランスフェクト（transfect）し、Ｅ－Ｐｌａｔｅ（ＡＣＥＡ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カリフォルニア州サンディエゴ）に２５時間播種し、ＮＫ９２細胞によりで異なるエフェクタ：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比率で処理した。

光学撮像は、インピーダンス監視と同時に実行された。図９Ａ～図９Ｂに示すように、エフェクタの追加は、インピーダンス監視（図９Ａ）および光学撮像（図９Ｂ）によって示されるように、Ｅ：Ｔ比に依存する方法で癌細胞死を引き起こす。蛍光オブジェクト数（図９Ｂ）は、生きている標的細胞の数を示す。

図９Ｃ～図９Ｅは、時間の経過に伴う標的細胞死を示す、２．５：１のＥ：Ｔ比で事前に（図９Ｃ）、および３０時間（図９Ｄ、図９Ｅ）に撮影された画像である。

［実施例２］
［生細胞撮像によるリアルタイムインピーダンスの多重化による細胞死滅の追跡］
細胞の維持とアッセイは、１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｃｏｍｉｎｇ、カタログ番号３５０１６ＣＶ）を含むＦ－１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０－２００４）で３７°Ｃ／５％のＣＯ_２で実施された。インピーダンスは１５分ごとに測定されたが、画像は１時間に１回取得された。各ウェルで、各チャネル（明視野、赤、緑、青）の４つの視野が取り込まれた。露光時間は、赤（３００ｍｓ）、緑 （３００ｍｓ）、および青（８０ｍｓ）である。核局在青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を安定して発現するＡ５４９－Ｂｌｕｅ細胞株は、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ－１８５）にＡｇｉｌｅｎｔｅＬｅｎｔｉ Ｂｌｕｅ（ｐ／ｎ ８７１１０１２）を感染多重度１で形質導入することによって作製された。感染後２日目から１１日目まで、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを増殖培地に含めて、形質導入株を選択した。活性化されたカスパーゼ３（caspase 3）のリアルタイム可視化のために、Ａｇｉｌｅｎｔ ｅＣａｓｐａｓｅ ３ ＮｕｃＶｉｅｗ ４８８（ｐ／ｎ ８７１１００５）を５μｍの濃度で増殖培地に含めた。移動したホスファイジルセリン（phosphatidylserine）をリアルタイムで可視化するために、Ａｇｉｌｅｎｔ ｅＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ｒｅｄ（ｐ／ｎ ８７１１００７）を０．２５μｇ／ｍＬの濃度で増殖培地に含めた。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅ－Ｐｌａｔｅ ＶＩＥＷマイクロプレート（ｐ／ｎ ００３００６０１０３０）も使用された。ＭＧ１３２（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号１７４８／５）およびスタウロスポリン （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５６９３９６）のストックをＤＭＳＯに溶解した。

Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞（上記）をＥ－ＰＡＴＥ ＶＩＥＷに１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞が１日目で増殖するにつれて、細胞はバイオセンサアレイの表面積を拡大し、インピーダンス信号を着実に上昇させる（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。未処理のままにしておくと、細胞はコンフルエンスまで増殖し、バイオセンサアレイを飽和させ、安定したインピーダンス信号を与える。プロテアソーム阻害剤（proteasome inhibitor）ＭＧ１３２またはパンキナーゼ（pan-kinase）阻害剤スタウロスポリン（staurosporine）を２５時間の時点で添加すると、時間および用量依存的にインピーダンス信号が著しく減少する。これらの薬物誘発性反応の動力学、およびインピーダンス トレースの全体的な形状は、化合物ごとに異なる。これは、１０年以上にわたる広範な文献と一致しており、インピーダンス応答は通常、作用メカニズムの種類ごとに固有であることを示している。ＭＧ１３２とスタウロスポリンはどちらもアポトーシスを誘導するが、細胞死に至る途中で異なる細胞挙動を誘発し、このことは、リアルタイムのインピーダンスを生細胞撮像と多重化すると驚くほど明確になる。

Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞は２６時間の時点ですでにウェルの底の大部分を覆っているが、薬剤の非存在下ではさらに５０時間増殖を続け、細胞を高密度に詰め込む（図１２Ａ）。これと一致して、インピーダンス信号は約３０時間で頭打ちになり、青い核の総数は約８０時間まで増加し続ける（図１２Ａ）。青色核数は、画像処理アルゴリズムによって取得され、青色蛍光画像内の青色のオブジェクトの数を計数する。各青色核は、核局在青色蛍光タンパク質を発現するように形質導入されたＡ５４９細胞に対応する。そのため、ウェル内の青色の核の数は、ウェル内に存在する生存可能なＡ５４９－ｂｌｕｅ細胞の数に対応する。Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞を４つの最高濃度のＭＧ１３２（１．９、５．５、１６．７、および５０μｍ）で処理すると、青色核の総数は、インピーダンスの低下とよく相関する方法で時間の経過とともに減少する（図１２Ｂ、５０μｍ処理のデータのみを示す）。対照的に、スタウロスポリンの４つの最高濃度（０．１２５、０．２５０、０．５００、および１μｍ）で細胞を処理すると、最初の数分以内にインピーダンスが急激に低下するが、その後の６０時間にわたって青色核の数に適度な影響がある（図１２Ｃ、１μｍ処理のデータのみを示す）。スタウロスポリンを添加してから１時間後、Ａ５４９－Ｂｌｕｅ細胞は細胞に水を排出させるその能力と一致して、細胞質がほとんど見えず、青い核だけが残るほどひどく収縮した。時間が経つにつれて、これらの核はサイズが縮小し、一緒にクラスター化し始めるが、それらはほとんど無傷のままであり、図１２Ｃで青い核の数がかなり一定のままである理由を説明している。上記のインピーダンスと撮像の組み合わせにより、いずれかの技術のみを使用した場合よりも、薬物媒介Ａ５４９細胞死滅のより完全で微妙な理解が得られることは明らかである。単純な細胞計数を超えて、次に、アポトーシスによる死滅経路に特有の生化学現象の動力学を調べた。

［実施例３］
［５つの異なる視点からの同時追跡ＭＧ１３２媒介アポトーシス］
ＭＧ１３２によるアポトーシスの誘導は、インピーダンスおよび青色核ＥＩ計数に加えて、細胞コンフルエンスの割合、カスパーゼ３活性化（細胞が緑色に蛍光を発する原因）、およびホスファチジルセンヌ転座（細胞が赤色に蛍光を発する原因）によっても追跡された。図１３に見られるように、薬剤によるインピーダンスの低下は、これらのアポトーシス特異的マーカの一時的な蓄積とよく相関する。２０時間および４０時間の時点のパネルの太い白い矢印は、外側のリーフレットにホスファジルセリン（phosphatidylserine）を含む大きな膜ブレブを強調している。

次に、ＭＧ１３２に対するＡ５４９－Ｂｌｕｅ細胞の連続応答を、画像ベースの読み取り値のそれぞれを使用してプロットした。青色の核数（図１４Ａ）は、図１１Ａに見られるインピーダンス応答を厳密に反映する薬物濃度への依存性を示す。広範なアポトーシス応答にもかかわらず、このアッセイの過程を通じて、％細胞コンフルエンスが５０％を下回ることはなく（図１４Ｂ）、ここで細胞コンフルエンス数は、画像処理アルゴリズムによって明視野画像から得られる。これは、アポトーシス細胞とその破片が食作用によって除去される体内の状況とは異なり、体外ではアポトーシス細胞の大部分がウェルの底を占有し続けるという事実と一致している（図１２Ｂ）。高濃度のＭＧ１３２によりインピーダンス信号がゼロに低下する（図１１Ａ）一方で、コンフルエンス％が５０％を下回ることはないという事実は、残留細胞がプレートの底に付着していないことを示している。カスパーゼ３陽性（蛍光緑色）オブジェクトの数（図１４Ｃ）とアネキシンＶ陽性（蛍光赤色）オブジェクトの数（図１４Ｄ）は時間の経過とともに増加し、ＭＧ１３２濃度への明確な依存関係を示す。播種された細胞の数、それらの成長率、およびアポトーシスマーカを表示する細胞のパーセンテージを考慮すると（図１３）、図１４Ａ～図１４Ｃの出力数値は予想と一致している。異なるアポトーシス現象の相対速度と相対存在量を比較するために、インピーダンス応答を３つの異なる画像ベースの読み取り値と一緒にプロットした（図１５）。予想どおり、青い核の数が減少し始める時間（ＭＧ１３２添加後～１０時間）は、カスパーゼ３の活性化とホスファチジルセリン転座が検出可能になるのと同じ時間である。薬物治療の最初の２０時間では、カスパーゼ３とホスファチジルセリンのシグナルを示す細胞の数は類似しているが、その後の４０時間では、カスパーゼ３で活性化された細胞の数が、ホスファチジルセリンが移行した細胞の数を約２０％上回っている。

［実施例４］
［細胞基質インピーダンスと光学撮像の同時監視による薬効の定量化］
実施例ＩＩ～ＩＶに提示されたインピーダンスおよび画像ベースの読み出しを使用して、ＭＧ１３２のＥＣ５０を計算した。薬剤添加時から薬剤添加後６０時間までにわたる曲線下面積をＭＧ１３２濃度の関数としてプロットし、図１６に見られる用量応答曲線を得た。Ｒ２値が０．９６～０．９８の範囲で、４つの異なる読み取り値のフィッティングの質は非常に良好である。計算されたＥＣ５０値は０．８６～３．０μｍの範囲であり、文献で報告されている値と一致している。Han, Y. H.他、The Effect of MG132, a Proteasome Inhibitor on HeLa Cells in Relation to Cell Growth, Reactive Oxygen Species and GSH. Oncol. Rep. 2009, 22(1), 215-21を参照されたい。

Claims (25)

1. 複数の生物学的サンプルを受容するように構成された複数のウェルを有するマルチウェルプレートであって、前記ウェルのそれぞれが一組の電極、電極のない前記ウェルの底面上の透明窓とを含むマルチウェルプレートと、
   前記ウェルを照明するように構成された照明モジュールと、
   前記ウェルの前記透明窓を露出させるように構成された前記底部に開口部を有し、前記マルチウェルプレートを受け入れるように構成されたクレードルと、
   前記露出した窓を通して画像を取り込むために、同じマルチウェルプレートの異なるウェル間で移動可能な光学撮像モジュールと
   を備える、生物学的サンプルを電子的および光学的に監視するためのシステム。
2. 前記生物学的サンプルが細胞、任意選択的に癌細胞を含む、請求項１に記載のシステム。
3. 前記照明モジュールが、前記ウェルのうちの１つまたは複数を独立して照明するように構成された複数のライトを備える、請求項１に記載のシステム。
4. 前記照明モジュールが発光ダイオード（ＬＥＤ）アレイを備え、各ＬＥＤが単一のウェルを照明するように配置される、請求項１に記載のシステム。
5. 前記照明モジュールが明視野照明モジュールである、請求項１に記載のシステム。
6. 前記クレードルがヒンジ付きカバーをさらに備え、前記照明モジュールが前記カバーに接合される、請求項１に記載のシステム。
7. 前記クレードルは、前記一組の電極と電子的に通信するための前記マルチウェルプレートと、照明命令を通信するための前記照明モジュールとの両方に電気的に係合する、請求項１に記載のシステム。
8. 前記光学撮像モジュールが、一度に単一のウェルから１つまたは複数の画像を取り込むように構成されている、請求項１に記載のシステム。
9. 前記光学撮像モジュールが前記クレードルの下にある、請求項１に記載のシステム。
10. 前記光学撮像システムは、１つまたは複数の分子を励起するように構成された励起光源をさらに含み、前記励起光源は、紫外光、紫光、青色光、緑色光、黄色光、橙色光、および赤色光からなる群から選択される１つまたは複数の光を任意選択的に含む、請求項１に記載のシステム。
11. 前記光学撮像モジュールがカメラを含む、請求項１に記載のシステム。
12. 前記光学撮像モジュールが、カメラと、バンドパスフィルタと、チューブレンズと、対物レンズとを備える、請求項１に記載のシステム。
13. １つまたは複数のウェル内の細胞基質インピーダンスを電子的に監視するための前記一組の電極セットのそれぞれを選択的に操作するための前記クレードルと、
    前記１つまたは複数のウェルを選択的に照明するための前記照明モジュールと、
    前記１つまたは複数のウェルからの画像の取り込みおよび受信と選択的な動きのための前記光学撮像モジュールと
    に通信可能に結合されたコンピュータプロセッサをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
14. 前記コンピュータプロセッサは、前記１つまたは複数のウェルが電子的監視から設定されたインピーダンスベースの値またはインピーダンスベースのパラメータに到達または追従することに応答して、前記光学撮像モジュールを介して前記１つまたは複数のウェルから画像を取り込むようにプログラムされている、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記プロセッサが、細胞基質インピーダンスを電子的に監視し、同じウェルを光学的に監視するようにプログラムされ、表示または分析のためにインピーダンスと光学データとを対にするように構成されている、請求項１３に記載のシステム。
16. それぞれが複数のサンプルを受け取るように構成された複数のウェルを有し、前記ウェルのそれぞれが一組の電極と、電極のない前記ウェルの底面上の透明窓とを含む２つの追加のマルチウェルプレートと、
    前記２つの追加のマルチウェルプレートの前記ウェルを照明するように構成された２つの追加の照明モジュールと、
    それぞれが前記ウェルの前記透明窓を露出させる開放底を有し、前記２つの追加のマルチウェルプレートを受け入れるように構成された２つの追加のクレードルと
    をさらに備え、
    前記光学撮像モジュールは、すべての窓を通して画像を取り込むために、すべてのウェルにわたって移動可能である、請求項１に記載のシステム。
17. 電子監視用に構成されていない細胞または組織培養容器をさらに備え、前記光学撮像モジュールは、前記細胞または組織培養容器内の画像を取り込むように構成されている、請求項１に記載のシステム。
18. マルチウェルプレートのウェル内の細胞を、連続監視間の特定の時間間隔で、ある期間にわたって連続的に電子的に監視するステップであって、前記ウェルのそれぞれが、一組の細胞基質インピーダンス監視電極と、電極のない前記ウェルの底面上の透明窓とを含むステップと、
    電子的に監視されている少なくとも１つのウェルから前記透明窓を通して画像を取り込むステップと
    を含む、細胞を監視する方法。
19. 前記画像は、前記電子監視期間内の期間にわたって定期的または不定期に取り込まれ、前記方法は、前記細胞の電子測定を実行すると同時に前記画像を取り込むステップを任意選択的に含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記少なくとも１つのウェルから画像を取り込む前記ステップの前に、前記電子監視ステップが、設定値を満たす前記少なくとも１つのウェルからの結果を出力し、前記光学撮像モジュールに前記少なくとも１つのウェルから前記画像を取り込むように指示する、請求項１８に記載の方法。
21. 前記取得される画像が細胞の明視野画像を含み、前記明視野画像から細胞コンフルエンス数またはパラメータを決定し、任意選択的に細胞を計数するステップをさらに含む請求項１８に記載の方法。
22. 前記取り込まれた画像が細胞の蛍光画像を含み、総蛍光計数と、総蛍光強度と、平均蛍光強度とからなる群のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択される画像から蛍光パラメータを決定するステップをさらに含む請求項１８に記載の方法。
23. 前記取得された画像は、前記細胞の明視野画像および前記細胞の蛍光画像を含み、
    前記明視野画像から細胞コンフルエンス数またはパラメータを導出し、任意選択的に前記明視野画像から細胞を計数するステップと、
    総蛍光計数と、総蛍光強度と、平均蛍光強度とからなる群のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択される、蛍光画像からの蛍光パラメータを決定するステップと、
    任意選択的に、前記明視野画像および蛍光画像、または同じウェルの１つまたは複数の色を重ね合わせるステップと
    をさらに含む請求項１８に記載の方法。
24. ある期間にわたってマルチウェルプレートのウェル内の細胞を電子的に監視するステップであって、前記ウェルのそれぞれが、一組の細胞基質インピーダンス監視電極と、電極のない前記ウェルの底面上の透明窓とを構成するステップと、
    前記マルチウェルプレートの少なくとも１つのウェルから、前記透明窓を通して、電子的監視の前記期間内の期間にわたって画像を取り込むステップと
    を含む細胞を監視する方法。
25. 前記取得される画像は前記細胞の明視野画像であり、前記明視野画像から細胞を計数するステップ、または細胞コンフルエンス数またはパラメータを決定するステップを任意選択的に含み、
    前記取得される画像は、前記細胞の蛍光画像であり、総蛍光計数と、総蛍光強度と、平均蛍光強度とからなる群のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択される、前記画像からある蛍光パラメータを任意選択的に決定するステップを含み、
    前記取得される画像は、前記細胞の明視野画像と前記細胞の蛍光画像とを含むもので、
    前記明視野画像から細胞を計数することと、任意選択的に前記明視野画像から細胞コンフルエンス数またはパラメータを導き出すことと、任意選択的に、総蛍光計数と、総蛍光強度と、平均蛍光強度とからなる群のうちの１つまたは複数から選択される、前記蛍光画像からの蛍光パラメータを決定することと、任意選択的に、１つまたは複数の前記ウェルについて、１つまたは複数の色の前記明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせることとをさらに含む請求項２４に記載の方法。
    

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