JP2023518329A - 短鎖脂肪酸の生成 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)TAG分子を含む微生物細胞を得るステップであって、各TAG分子が、sn-1位、sn-2位、及びsn-3位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、TAG分子のうちの少なくともいくつかが、sn-3位でエステル化されたSCFAを含む、得るステップと、
(b)微生物細胞から脂質を抽出するステップと、を含み、
それによって、抽出された脂質を生成する。
(a)TAG分子を生成する微生物細胞を得ることであって、各TAG分子は、sn-1位、sn-2位、及びsn-3位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、TAG分子のうちの少なくともいくつかは、TAG分子のsn-3位でエステル化された短鎖脂肪酸(SCFA)を含む、得ること、かつ/又は(b)脂肪酸アシルトランスフェラーゼ又は1つを超える脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む微生物細胞を得ることであって、少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼは、基質としてのSCFA-CoA、好ましくは基質としての少なくともブチリル-CoA、又は基質としての少なくともブチリル-CoA及びカプロイル-CoAに活性を有し、各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内の該ポリヌクレオチドの発現を指示することができる1つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、得ることと、
(c)細胞を好適な培地で培養することによって、細胞の数を増加させることと、を含む。
(i)導入された外因性ポリヌクレオチドを含む細胞から子孫細胞を生成するステップ、
(ii)本明細書に定義される細胞又は脂質の特徴のうちの1つ以上を有する子孫細胞を選択するステップのうちの1つ以上又は全てのステップを含む。
(i)本明細書で定義される1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む微生物細胞からの脂質を分析するステップと、
(ii)微生物細胞を選択又は同定するステップと、を含む。
(a)トリアシルグリセロール(TAG)分子を含む微生物細胞を得ることであって、各TAG分子は、sn-1位、sn-2位及びsn-3位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、TAG分子のうちの少なくともいくつかは、sn-3位でエステル化されたSCFAを含む、得ることと、
(b)微生物細胞から脂質を抽出することと、を含み、
それによって抽出された脂質を生成する、抽出された脂質を生成するためのプロセスを提供する。この文脈において、sn-1、sn-2、及びsn-3位は、TAG分子のグリセロール成分のsn-1、sn-2、及びsn-3位を指すことを理解されたい。
(a)TAG分子を生成する微生物細胞を得ることであって、各TAG分子は、sn-1位、sn-2位、及びsn-3位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、TAG分子のうちの少なくともいくつかは、TAG分子のsn-3位でエステル化された短鎖脂肪酸(SCFA)を含む、得ることと、
(c)細胞を好適な培地で培養することによって、細胞の数を増加させることと、を含む。
(i)導入された外因性ポリヌクレオチドを含む細胞から子孫細胞を生成するステップ、
(ii)本明細書に定義される細胞又は脂質の特徴のうちの1つ以上を有する子孫細胞を選択するステップのうちの1つ以上又は全てのステップを含む。
(i)本明細書に定義された1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む微生物細胞からの脂質を分析するステップと、
(ii)微生物細胞を選択又は同定するステップと、を含む。
配列番号1:ニシキギ1,2-ジアシル-sn-グリセロール:アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(EaDAcT)のアミノ酸配列。
配列番号2:pAT001におけるニシキギ1,2-ジアシル-sn-グリセロール:アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(EaDAcT)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号3:Capra hircus(ヤギ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX1(ChDGAT1-X1)のアミノ酸配列。
配列番号4:pAT002におけるCapra hircus(ヤギ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX1(ChDGAT1-X1)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号5:Capra hircus(ヤギ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX2(ChDGAT1-X2)のアミノ酸配列。
配列番号6:pAT003におけるCapra hircus(ヤギ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX2(ChDGAT1-X2)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号7:Ovis aries(ヒツジ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX1(OaDGAT1-X1)のアミノ酸配列。
配列番号8:pAT004におけるOvis aries(ヒツジ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX1(OaDGAT1-X1)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号9:Ovis aries(ヒツジ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX2(OaDGAT1-X2)のアミノ酸配列。
配列番号10:pAT005におけるOvis aries(ヒツジ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX2(OaDGAT1-X2)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号11:Bos taurus(ウシ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX1(BtDGAT1-X1)のアミノ酸配列。
配列番号12:pAT006におけるBos taurus(ウシ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX1(BtDGAT1-X1)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号13:Bos taurus(ウシ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX2(BtDGAT1-X2)のアミノ酸配列。
配列番号14:pAT007におけるBos taurus(ウシ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX2(BtDGAT1-X2)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号15:Bubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX1(BbDGAT1-X1)のアミノ酸配列。
配列番号16:pAT008におけるBubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX1(BbDGAT1-X1)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号17:Bubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX2(BbDGAT1-X2)のアミノ酸配列。
配列番号18:pAT009におけるBubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX2(BbDGAT1-X2)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号19:Bubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX3(BbDGAT1-X3)のアミノ酸配列。
配列番号20:pAT010におけるBubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX3(BbDGAT1-X3)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号21:Bubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX4(BbDGAT1-X4)のアミノ酸配列。
配列番号22:pAT011におけるBubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX4(BbDGAT1-X4)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号23:Bubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX5(BbDGAT1-X5)のアミノ酸配列。
配列番号24:pAT012におけるBubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX5(BbDGAT1-X5)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号25:Bubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX6(BbDGAT1-X6)のアミノ酸配列。
配列番号26:pAT013におけるBubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX6(BbDGAT1-X6)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号27:Bubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX7(BbDGAT1-X7)のアミノ酸配列。
配列番号28:pAT014におけるBubulus bubulis(スイギュウ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1アイソフォームX7(BbDGAT1-X7)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号29:Bos taurus(ウシ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1泌乳アイソフォームX1(BtDGAT1lac)のアミノ酸配列。
配列番号30:pAT019におけるBos taurus(ウシ)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ1泌乳アイソフォームX1(BtDGAT1lac)のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
別段に具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者(例えば、細胞培養、発酵、分子遺伝学、タンパク質化学、及び生化学での)によって一般的に理解されるものと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
本明細書で使用される場合、「脂質」は、エステル化又は非エステル化され得る脂肪酸、又はそれらの誘導体であり、水に不溶性であるが、有機溶媒、例えばクロロホルムに可溶性である、又はそれらを含む有機化合物のクラスのいずれかである。本明細書で使用される場合、用語「抽出された脂質」は、微生物細胞から抽出された脂質組成物を指す。抽出された脂質は、例えば、細胞を溶解させることによって得られる比較的粗製の組成物、又は細胞に由来する水、核酸、タンパク質、及び炭水化物のうちの1つ以上又は各々の大部分(全てではないが)が除去されているより精製された組成物であり得る。精製方法の例を以下に記載する。一実施形態において、抽出された脂質は、組成物の少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、又は少なくとも約95%(w/w)の脂質を含む。脂質は、室温(25℃)で固体であっても液体であってもよく、又は2つの混合物であってもよく、液体であれば油とみなされ、固体であれば脂肪とみなされる。一実施形態において、抽出された本発明の脂質は、別の供給源(例えば、動物脂質)によって生成される別の脂質とブレンドされていない。あるいは、抽出された脂質は、例えば、大豆油、キャノーラ油、トウモロコシ油、パーム油、ココナッツ油、綿実油、又はそれらの任意の組み合わせなどの植物油などのTAGのsn-3位にSCFAを含まない、異なる脂質とブレンドされ得る。一実施形態において、抽出後、細胞内の比と比較して、他の脂肪酸に対するSCFAの比が有意に変化していない(例えば、10%又は5%以下の変化)、及び/又はTAG分子内のSCFAの位置分布を修飾する方式で、例えば、インターエステル化又はトランスエステル化によって、脂質が処理されていない。別の実施形態において、抽出された脂質は、インタクトな細胞内の比と比較したときに他の脂肪酸に対するSCFAの比を変化させ得るか、又は脂質の総脂肪酸含有量の飽和度を変化させる水素化又は分画などの手順に曝露されていない。一実施形態において、脂質は、トランス脂肪酸を本質的に含まず、例えば、総脂肪酸含有量の0.5重量%未満がトランス脂肪酸である。本発明の抽出された脂質が油中に含まれる場合、油は、ステロールなどの非脂肪酸分子を更に含み得る。一実施形態において、脂質は、本質的にコレステロールを含まず、例えば、脂質の0.5重量%未満又は0.25重量%未満がコレステロールである。
多種多様な異なる微生物細胞を本発明で使用することができる。一実施形態において、微生物細胞は、単一の細胞生物として存在するが、かかる細胞は一緒に凝集し得る。本発明の微生物細胞の例としては、真菌細胞、細菌細胞、及び藻類細胞が挙げられる。真核微生物は、細菌(原核生物)微生物よりも好ましい。本明細書で使用される場合、「微生物細胞」、「微生物(microbe)」、及び「微生物(microorganism)」という用語は、同じものを意味する。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、概して互換的に使用される。
本発明は、例えば、遺伝子、単離されたポリヌクレオチド、キメラDNAなどのキメラ遺伝子構築物であり得る、ポリヌクレオチドの使用も提供する。ゲノム又は合成起源のDNA又はRNAであってもよく、二本鎖又は一本鎖であってもよく、炭水化物、脂質、タンパク質、又は他の物質と組み合わせて、本明細書に定義される特定の活性を行ってもよい。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、「核酸分子」という用語と互換的に使用される。
組換え発現を使用して、本発明の組換え細胞を生成することができる。組換えベクターは、異種ポリヌクレオチド配列、すなわち、好ましくは、ポリヌクレオチド分子が由来する種以外の種に由来する、本明細書に定義されるポリヌクレオチド分子に天然に隣接して見出されないポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、RNA又はDNAのいずれかであり得、典型的にはプラスミドである。プラスミドベクターは、典型的には、原核細胞、例えば、pYES由来ベクター、pUC由来ベクター、pSK由来ベクター、pGEM由来ベクター、pSP由来ベクター、又はpBS由来ベクターにおける発現カセットの容易な選択、増幅、及び形質転換をもたらす追加の核酸配列を含む。好適な酵母発現ベクターは、pPICシリーズのベクター、酵母積分プラスミド(YIp)、酵母複製プラスミド(YRp)、酵母セントロメアプラスミド(YCp)、及び酵母エピソームプラスミド(YEp)を含む。追加の核酸配列は、ベクターの自律的複製を提供するための複製起点、好ましくは抗生物質又は除草剤耐性をコードする選択可能なマーカー遺伝子、核酸配列又は核酸構築物にコードされる遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する独自の複数のクローニング部位、及び微生物細胞の形質転換を促進する配列を含む。組換えベクターは、本明細書に定義される1つを超えるポリヌクレオチド、例えば、本明細書に定義される3つ、4つ、5つ、又は6つのポリヌクレオチドを組み合わせて、好ましくは本明細書に記載されるキメラ遺伝子構築物を含んでもよく、各ポリヌクレオチドは、細胞において作動可能である発現制御配列に作動可能に連結されている。
発現ベクターは、微生物細胞における遺伝子発現を指示することができる。本明細書で使用される場合、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、かつ1つ以上の特定のポリヌクレオチド分子の発現をもたらすことができるベクターである。本発明に有用な発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製の起点、及び組換え細胞と適合性があり、かつ本発明のポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調節配列などの調節配列を含む。特に、本発明に有用なポリヌクレオチド又はベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター配列及びエンハンサー配列などの転写開始を制御する配列である。好適な転写制御配列には、本発明の組換え細胞のうちの少なくとも1つにおいて機能し得る任意の転写制御配列が含まれる。使用される調節配列の選択は、標的微生物細胞に依存する。そのような様々な転写制御配列は、当業者に既知である。
効果的な培養条件は、当業者に既知であり、脂質生成を可能にする好適な培地、バイオリアクター、温度、pH、及び酸素条件を含むが、これらに限定されない。好適な培地は、細胞を培養して本明細書に定義される脂質を生成させる任意の培地を指す。かかる培地は、典型的には、同化可能な炭素、窒素、及びリン酸塩源、並びに適切な塩、鉱物、金属、及びビタミンなどの他の栄養素を有する水性培地を含む。本明細書で定義される細胞は、従来の発酵バイオリアクター、シェイクフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、及びペトリプレートで培養することができる。培養は、組換え細胞に適した温度、pH、及び酸素含有量で実行することができる。そのような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。
本発明の微生物細胞からの脂質の抽出は、油性微生物からの脂質抽出について当該技術分野で既知のもの(例えば、Patel et al.,2018に記載されているような)と類似の方法を使用する。一実施形態において、抽出は、有機溶媒(例えば、ヘキサン)が、少なくともバイオマスと混合される溶媒抽出によって行われ、好ましくは、バイオマスが、乾燥され研磨された後であるが、それはまた、湿潤条件下で行われ得る。溶媒は、細胞内で脂質を溶解し、その溶液は次いで、物理的作用(例えば、超音波処理)によってバイオマスから分離される。超音波診断は、微生物細胞の細胞の完全性を破壊するために最も広く使用されている前処理方法の1つである。他の前処理方法には、マイクロ波照射、高速均質化、高圧均質化、ビーズ拍動、オートクレーブ、及び熱分解が含まれ得る。次いで、有機溶媒を(例えば、蒸留によって)非極性脂質から分離することができる。この第2の分離ステップは、細胞から非極性脂質を得、従来の蒸気回収を用いる場合、再利用可能な溶媒を得ることができる。
脱脂は、液体形態(油)における脂質の精製の初期段階であり、その主な目的は、抽出された総脂質のおよそ1~2%として存在し得る油から、リン脂質の大部分を除去することである。通常リン酸を含有する約2%の水を原油に70~80℃で添加すると、微量金属及び顔料を伴うリン脂質の大部分が分離される。除去される不溶性材料は、主にリン脂質の混合物であり、レシチンとしても知られている。脱脂は、濃リン酸を粗抽出脂質に添加して、非加水分解性リン脂質を加水分解可能な形態に変換し、存在する軽微な金属をキレートすることによって行うことができる。ガムは遠心分離によって油から分離される。
アルカリ精製は、中和とも称されることがある、油の形態で脂質を処理するための精製プロセスのうちの1つである。通常は脱脂に続き、漂白に先立つ。脱脂後、十分な量のアルカリ溶液を添加して、脂肪酸及びリン酸の全てを滴定し、このようにして形成された石鹸を除去することによって、油を処理することができる。好適なアルカリ性材料には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、及び水酸化アンモニウムが挙げられる。このプロセスは、通常、室温で行われ、遊離脂肪酸分画を除去する。石鹸は、遠心分離又は石鹸用溶媒への抽出により除去し、中和した油を水で洗浄する。必要に応じて、油中の任意の過剰なアルカリを、塩酸又は硫酸などの好適な酸を用いて中和することができる。
漂白は、90~120℃で10~30分間、漂白アース(0.2~2.0%)の存在下、及び窒素若しくは蒸気で動作することによって、又は真空中での酸素の不在下で、油を加熱する精製プロセスである。油処理におけるこのステップは、不要な顔料を除去するように設計されており、このプロセスはまた、酸化生成物、微量金属、硫黄化合物、及び微量の石鹸を除去する。
脱臭は、高温(200~260℃)、低圧(0.1~1mm Hg)での油脂の処理である。これは典型的には、約0.1ml/分/100mlの油の速度で油中に蒸気を導入することによって達成される。約30分間スパージした後、オイルを真空下で冷却する。油は、典型的にはガラス容器に移され、冷蔵下で保管される前にアルゴンでフラッシュされる。この処理は、油の色を改善し、残りの任意の遊離脂肪酸、モノアシルグリセロール、及び酸化生成物を含む揮発性物質又は臭気化合物の大部分を除去する。
本明細書で使用される場合、「トランスエステル化」は、TAG内及びTAG間で脂肪酸を交換する(インターエステル化)、又は脂肪酸を別のアルコールに移してエステルを形成するプロセスを意味する。これは、最初に、遊離脂肪酸としてTAGから脂肪酸を放出することを伴ってもよく、又は脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル若しくはエチルエステルを直接生成してもよい。TAGと、メタノール又はエタノールなどのアルコールとのトランスエステル化反応において、アルコールのアルキル基は、TAGのアシル基(SCFAを含む)とのエステル結合を形成する。分画プロセスと組み合わせた場合、トランスエステル化を使用して、脂質の脂肪酸組成物を修飾することができる(Marangoni et al.,1995)。トランスエステル化は、化学的(例えば、強酸又は触媒された塩基)又は酵素的手段のいずれかを使用することができ、後者は、TAG上の脂肪酸に対して位置特異的(sn-1/3又はsn-2特異的)であり得るリパーゼを使用するか、又は他のものよりもいくつかの脂肪酸を好む(Speranza et al,2012)。油中のLC-PUFAの濃度を増加させるための脂肪酸分画は、例えば、凍結結晶化、尿素を使用する複合体形成、分子蒸留、超臨界流体抽出、対電流クロマトグラフィー、及び銀イオン錯体形成などの当該技術分野で既知の方法のいずれかによって達成することができる。尿素との複合体形成は、油中の飽和脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸のレベルを低減する際のその単純性及び効率のための好ましい方法である(Gamez et al.,2003)。最初に、油のTAGは、多くの場合、脂肪酸エステルの形態で、酸又は塩基触媒反応条件のいずれか下での加水分解によって、それらの構成脂肪酸に分割され、それによって、1モルのTAGが、形成されたアルキルエステルと、同じく形成されるグリセロールとの分離を可能にするために使用される過剰のアルコールと、少なくとも3モルのアルコール(例えば、エチルエステルの場合はエタノール、又はメチルエステルの場合はメタノール)と、又はリパーゼによって反応する。これらの遊離脂肪酸又は脂肪酸エステルは、通常、処理によって脂肪酸組成物中で変更されず、次いで、複合体形成のために尿素のエタノール溶液と混合され得る。飽和脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸は、尿素と容易に複合し、冷却時に結晶化し、その後、濾過によって除去され得る。それによって、非尿素錯体化画分をLC-PUFAで濃縮する。
本発明は、ヒト消費のための食品若しくは飲料、又は動物消費のための飼料、好ましくは少なくともヒト消費のための食品として使用され得る組成物を含む。本発明の目的のために、食品、飲料、又は飼料は、体内に取り込まれたときに(a)組織に栄養を与えるか、若しくは組織を築く役割を果たすか、又はエネルギーを供給するか、及び/又は(b)適切な栄養状態若しくは代謝機能を維持、回復、若しくはサポートする、ヒト又は動物消費のための調製物である。本発明の食品及び飲料は、乳児及び/又は幼児のための栄養組成物、例えば、乳児用フォーミュラを含む。
微生物株及びクローニングベクター
酵母における種々の脂質修飾遺伝子を試験するための塩基ベクターとして、pYES2プラスミドを有する宿主株として、Saccharomyces cerevisiae株INVSc1を使用した。株及びプラスミドをInvitrogen(カタログ番号v825-20、Invitrogen)から入手した。INVSc1の遺伝子型は、MATa his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52/MATα his3Δ1 leu2 trp1-289 ura3-52であり、その表現型は、His-、Leu-、Trp-、Ura-であった。pYES2ベクターは、以下に記載するように、種々のタンパク質をコードするDNA断片の挿入に使用される独自のHindIII及びXhoI制限酵素部位を有した。pYES2発現ベクターは、Ura-であった酵母株への導入のための選択マーカー遺伝子としてのURA3遺伝子、高コピー維持のための2μ複製起点、及び酵母におけるタンパク質コード領域の発現のためのGal1プロモーターを含有した。プラスミドはまた、クローニング実験中のE.coliにおける選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を含有した。
酵母における試験のために挿入された単一遺伝子を有するpYES2の誘導体は、独自のHindIII部位とXhoI部位との間にタンパク質コード領域を挿入するか、又は標準的なクローニング方法によって適宜プラスミド中に他の制限酵素部位を挿入することによって作製した。E.coli株DH5αを、標準的な方法に従ってクローニング及びプラスミド増殖及びDNA調製に使用した。
有能な細胞を使用しなかったpYES2に基づく遺伝子構築物をS.cerevisiaeに導入するために、RAPID法を使用した。S.cerevisiae細胞を満載したループを新鮮なプレートから削り取り、細胞を100μlの形質転換緩衝液(Sigma Aldrich、カタログ番号T0809)に再懸濁した。使用前に5分間煮沸した10μlの10mg/mlのサーモン精巣DNAを有する約1μgのプラスミドDNAを、600μlのプレート緩衝液(Sigma Aldrich、カタログ番号P8966)と共に細胞懸濁液に添加し、よく混合した。混合物を、室温で、最低速度で、回転輪中で、16時間インキュベートした。次いで、混合物を42℃で15分間熱ショックを与え、3500rpmで3分間回転させ、細胞のペレットを200μlの滅菌水中に再懸濁した。最大100μlのアリコートを、形質転換体の選択のために、ウラシルを欠く合成脱落選択培地(SD-URA、Sigma Aldrich、カタログ番号Y1501)上に配置した。プレートを28℃で3日間、又はコロニーが出現するまでインキュベートした。2つ以上のコロニーを各プレートから選択し、コロニーPCRによって遺伝子構築物の存在について試験して、形質転換体を同定した。
相同組換えによるY.lipolyticaへの挿入のための発現カセット(転写単位)を含む遺伝子構築物のDNAを、NotIで消化して、発現カセットを放出した。直鎖状DNAを、凍結EZ酵母形質転換IIキット(Zymo Research,California,USA)を使用して調製したY.lipolytica株JM23の適格な細胞に導入した。簡潔に述べると、5μl(2ug)のNotI消化及び線形化発現ベクターを、キットからの50μlの有能な細胞及び500μlのEZ3溶液と混合し、完全に混合した。陰性対照形質転換には、遺伝子構築物のDNAを含まない有能な細胞が含まれた。混合物を28℃で2時間インキュベートし、次いでSD-Uraプレート上に100μl拡散した。プレートを28℃で2日間インキュベートした。宿主株JM23は機能的URA3遺伝子を欠く補助栄養生物であったため、URA遺伝子を有するベクターを受容した形質転換体のみがこれらのプレート上で増殖した。Y.lipolytica形質転換において多くのコロニーが観察された。Ura+コロニーを選択プレートから採取し、導入されたベクターについてコロニーPCRによって形質転換されたことを確認した。
トランスジェニック及び対照S.cerevisiae細胞の小規模培養物を、2%ラフィノース(w/v)を含有するSD-Ura培地(MP Chemicals,USA、カタログ番号4010022)5ml中のグリセロールストックから、28℃で一晩、通気のために振盪しながら増殖させた。細胞を、2%(w/v)ラフィノース及び1%テルギトール(v/v)を含有するSD-Ura培地(NP-40;Sigma Aldrich カタログ番号NP40S)培地の10mlに懸濁液として、50mlのチューブ又は250mlのフラスコ内で0.1の光学密度で600nm(OD600)に接種し、28℃、200rpmのシェーカーインキュベーター内で、通気のために増殖させた。OD600を15又は30分の時間間隔でチェックした。OD600が0.3に達したとき、GAL1プロモーターからの導入遺伝子の誘導のために、潜在的な基質(存在する場合)としての外因性化合物を2%ガラクトースと共に添加した。
酪酸塩又はパルミチン酸塩などの脂肪酸を増殖培地に加えたところ、50mlのチューブ中で3500rpmで5分間遠心分離して細胞を採取した。細胞ペレットを1mlの1%テルギトール(v/v)、1mlの0.5%テルギトールで連続的に洗浄し、1mlの水で最終洗浄して、細胞の外側から任意の残留化合物を除去した。最終洗浄中、ペレットを事前に秤量した2mlエッペンドルフチューブに移し、凍結乾燥した後、秤量及び脂質抽出を行った。
以下のようにBligh and Dyer(1959)から改変した方法を使用してペレットから総脂質を抽出した。簡単に述べると、0.5gのジルコニウムビーズ及び0.6mlのクロロホルム:メタノール(2:1 v:v)を細胞ペレットに添加した。細胞をブレットブレンダー内で粉砕した(速度7を5分間)。次いで、細胞を超音波水浴中で5分間超音波処理し、0.3mlの0.1M KClを水中に添加した。混合物を10分間振盪し、10,000rpmで5分間遠心分離し、脂質を含有する下部有機相を上部水相から分離した。下部相を2mlのガラスバイアルに移した。更に、0.3mlクロロホルムをチューブ内の残りの水性混合物に加え、ブレットブレンダー内で5分間再び均質化した。この混合物を5分間遠心分離し、下部有機相を収集し、同じガラスバイアル中の第1の抽出物と組み合わせる。溶媒を窒素の流れ下で完全に蒸発させ、脂質をクロロホルム60μl中に溶解させた。
TAG、DAG、遊離脂肪酸、及びリン脂質(PL)などの極性脂質などの異なる脂質タイプを分離するために、ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸(70:30:1 v:v:v)を溶媒系として使用して、全脂質を薄層クロマトグラフィー(TLC)プレート(シリカゲル60;カタログ番号1.05626.0001、MERCK、Darmstadt、Germany)上で分画した。次いで、プレートに、アセトン:水(80:20 v/v)中の5mg/100mlの濃度で調製したプリムリン(Sigma、カタログ番号206865、Taufkirchen、Germany)溶液、及びUV光下で可視化した脂質バンドをスプレーした。等量のトリアセチン(TAG6:0)、トリブチリン(TAG12:0)、トリカプリリン(TAG18:0)、及びトリデカノイン(TAG30:0)(Sigma Aldrich、カタログ番号17810-1AMP-S)を含有する、Triheptadecanoin(Nuchek、USA、カタログ番号T-155)及びトリグリセリド混合物C2-C10などの脂質標準物を、隣接するレーンで実行して、TAG脂質スポットを同定した。脂質画分を、メチル化、プロピル化、又はブチル化のいずれかを使用して、誘導体化のためにシリカから抽出した。
脂肪酸メチルエステル(FAME)を、定量化のための内部標準物質として、既知の量のヘプタデカイン(Nu-Chek PREP,Inc.、カタログ番号N-7-A、Waterville、MN、USA)と共に、80℃で2時間、PTTE裏打ちされたスクリューキャップを有する2mlガラスバイアル内で、0.7ml 1Nメタノール-HCl(Sigma Aldrich、カタログ番号90964)で処理することによって、全抽出脂質又は精製されたTAG又はPL画分から調製した。バイアルを冷却した後、0.3mlの0.9%NaCl(w/v)及び0.1mlヘキサンを添加し、混合物を5分間渦巻いた。混合物を1700gで5分間遠心分離し、FAMEを含有する上部相をGCによって分析した。
遊離脂肪酸を、1mgTAGを0.2ml 3M KOH中で80℃で3分間インキュベートすることによって、TAGから放出した。試料を室温まで冷却した後、100μlヘキサンを混合物に加えた。混合物を5分間ボルテックスし、1700gで5分間遠心分離し、上部有機相をGC分析のために収集した。
TAG中の脂肪酸を脂肪酸エチルエステル(FAEE)に変換するために、2mgのTAGを1N HCl/エタノール溶液中で80℃で2時間インキュベートした。試料を室温まで冷却した後、100μlのヘキサンを混合物に加えた。混合物を5分間ボルテックスし、1700gで5分間遠心分離し、上部有機相をGC分析のために収集した。TAG中の脂肪酸を脂肪酸プロピルエステルに変換するために、2mgのTAGを、1N HCl/エタノールではなく1N HCl/プロパノール中でインキュベートし、それ以外の方法で処理した。
TLCプレート上のTAGスポットのシリカから以下のようにTAG画分を抽出した:0.6mlクロロホルム:メタノール(2:1、v/v)をTLCプレートから削り取ったシリカに添加した。混合物を振盪し、10,000gで5分間遠心分離した。次いで、0.3mlの0.1M KClを添加し、混合物を5分間振盪した。混合物を10,000gで5分間遠心分離し、下部有機相を2ml GCバイアルに収集した。シリカ/水相を2回、今回は0.3mlクロロホルムで抽出し、10分間混合した後、10,000gで5分間遠心分離した。下部有機相を再び収集し、第1の抽出物と同じGCバイアルにプールした。TAGを含有するプールした抽出物を、0.2μmマイクロスピンフィルター(Chromservis、EU、カタログ番号CINY-02)を通して濾過し、シリカ粒子の痕跡を除去した。次いで、濾過したTAG抽出物を、平らなインサートを有するGCバイアルに移し、窒素の流れ下で完全に乾燥させた。
この方法は、精製されたTAG調製を含む、脂質、特に中鎖脂肪酸(MCFA、C10~C14)及び長鎖脂肪酸(LCFA、C16~C18)、又はより長鎖脂肪酸の脂肪酸組成物の決定に好適であった。方法は、SCFAのメチルエステルの揮発性により、SCFAの定量化にはあまり好ましくなかった。脂質を誘導体化して、上記のようなFAMEを生成した。FAMEを、30m BPX70カラム(0.25mm内径、0.25μm膜厚、SGE)を有するAgilent7890A GCを使用してGCにより定量化した。カラム温度を150℃で1分間プログラムし、3℃/分で210℃まで上昇させ、2分間保持し、50℃/分で240℃に達し、次いで0.4分間保持した。インジェクタ温度を240℃、検出器を280℃に設定した。ヘリウムを、1.0ml/分の一定の流量でキャリアガスとして使用した。FAMEピークは、FAME基準の保持時間(GLC-411、GLC-674;NuChek INC.,USA)に基づいて同定した。ピークは、Agilent Technologies ChemStationソフトウェア(Rev B.04.03(16))と統合した。得られたデータは、総脂肪酸含有量100%における各脂肪酸のパーセンテージ(重量%)を有する、重量ベースでの脂肪酸組成物を提供する。重量ベースでのこれらのパーセンテージは、各脂肪酸の既知の分子量に基づいて、モル基準でのパーセンテージ(モル%)に容易に換算することができる。
この方法は、精製されたTAG調製物を含む、脂質試料中の短鎖脂肪酸(SCFA、C2-C8)、並びに培地(MCFA、C10-C14)及び長鎖脂肪酸(LCFA、C16-C18)の定量化に好適であった。それは、SCFAの定量化のための好ましい方法であった。上記のように調製したFABEを、30m BPX70カラム(0.25-mm内径、0.25-μm膜厚、SGE、Australia)を使用して、Agilent7890A GC上で分析した。カラム温度を40℃で1分間設定した後、3℃/分の速度で210℃まで温度を上げ、2分間保持した。カラム温度を更に100℃/分の速度で240℃まで上げ、この温度で0.5分間保持した。ヘリウムを、1.031ml/分の流量でキャリアガスとして使用した。インジェクタ温度は、11.8psiの入口圧力で240℃でプログラムした。試料を50:1の比で分割モードで注入した。FID検出器温度は、40ml/分の水素ガス、400ml/分の空気、及び25ml/分のメイクアップガス(He)の流れで280℃であった。FABEピークは、等量の分析グレードC4~C18:1脂肪酸を用いて調製したFABE標準混合物の保持時間に基づいて同定した。FABE混合物のピーク面積は、GCにおける個々のFABEピークの応答因子を決定するために使用され、FABEピークの面積パーセンテージを補正するために適用された。
脂肪酸ピークの同一性を確認するために、試料を、70eVの電子イオン化モードで動作するガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)上に流して、ピーク同一性を確認し、溶媒、分解生成物、又は試薬シグナルに対応する、可能性のある追加のピークを同定した。HTX-Pal液体自動サンプラーに接続された島津GC-MS QP2010 Plusシステムは、パラメータ:15:1の分割で、250℃の温度で、スプリット/スプリットレス入口を使用して、1又は2μlの注入体積で使用した。オーブン温度プログラムは、60℃で1分間開始し、次いで5℃/分を200℃、10℃/分を250℃まで増加させ、250℃で5分間保持した。MSイオン源及び界面温度は、それぞれ200℃及び250℃であった。データは、1000の走査速度及び40~500m/zの走査範囲で収集した。ピーク分離は、Heをキャリアガスとして30cm/秒で使用して、Stabilwax(登録商標)(Restek)キャピラリーカラム(30m×0.25mm i.d.、0.25μm膜厚)によって提供した。質量スペクトル相関は、NISTライブラリ及び真正SCFA標準のマッチング保持時間を使用して行った。S/N比が10:1を超えたときに、同定されたSCFAが存在するように設定した。品質管理の目的のために、器具ブランク及び手順ブランクを実行した。
脂質抽出物を、80μlのメタノール(MeOH):イソプロパノール(IPA)(1:1、v/v)中で再構成し、サプライヤの指示に従って、0.2μmのマイクロスピンフィルター(Chromservis、EU、カタログ番号CINY-02)を通して濾過した。非標的化脂質同定実験のために、加熱エレクトロスプレーイオン化(HESI)プローブを装備したQ-Exactive Orbitrap質量分析計(Thermo Fisher、CA、USA)を使用した。脂質抽出物の分離は、UPLCガードカラムに結合されたZorbax Eclipse Plus C18 2.1mm×50mm、1.8μm RRHDカラムを使用して、UPLC Vanquish Systemを使用して達成した。カラムコンパートメントを40℃の温度に設定した。二元溶媒系は、移動相A(60:40 v/vアセトニトリル/水と、90:10 v/v IPA/アセトニトリルを含有する移動相Bとからなり、A及びBの両方とも、10mM酢酸アンモニウム及び0.1%ギ酸を含有した。試料を40分間にわたって40% B~100% Bの範囲の線形勾配で溶出し、再平衡化のために初期勾配に戻した。流量は200μl/分であり、注入量は1μlであった。試料をオートサンプラートレイ内で10℃に保管した。データを、m/z200~1000の範囲でのフルスキャンデータ依存のMS/MS取得により、正イオン化モードで取得した。フルスキャン及び断片スペクトルを、それぞれ、70000及び17500の分解能で収集した。イオン源パラメータは、スプレー電圧3.8kV、気化器350℃、イオン伝達管320℃、s-レンズRFレベル50%、シースガス35、補助ガス5、及びスイープガス1であった。データ分析及び脂質同定は、Freethyle Software(Thermo Fisher、CA)を使用して行った。TAG脂質は、MS1質量誤差<5ppmで、保持時間及び特徴的な生成物イオンの情報を使用して同定した。
DNase RQ1キット(Promegaカタログ番号M6101)及びQiagenカラム(Qiagen RNAse不含DNAse)を使用して、導入遺伝子の発現を解析して、細胞からRNAを精製し、標準方法を使用して逆転写のためのオリゴdTプライマー(200~500ng)、dNTP(10mM)、Superscript III逆転写酵素、及び0.1M DTTを解析した。
候補遺伝子同定
反射性哺乳類の乳脂肪におけるトリアシルグリセロール(TAG)は、C4:0及びC6:0を含む短鎖脂肪酸(SCFA)を含有し、これらは主にTAG分子のsn-3位でエステル化される。TAG分子は、特定のDGAT酵素によってsn-3位でSCFAのアシル基が組み込まれるグリセロールリン酸経路によって、反射型哺乳類の乳腺において新規に合成される(Marshall and Knudsen1979)。例えば、乳脂肪TAG中のC4:0は、これらのDGATによるアシル化の結果として、TAGのsn-3位でほぼ完全にエステル化される(Jensen、2002)。Marshall及びKnudsen(1979)は、DGAT酵素が、SCFAの組み込みに関与していることを特定したが、これらのDGATをコードする遺伝子はクローニングされておらず、哺乳類ゲノムには、これらのTAG分子の生成に関与する可能性のある複数のDGAT配列が存在した。したがって、本発明者らは、候補DGATとして試験するために、ヤギ、ヒツジ、ウシ、及びスイギュウを含む哺乳類源からの様々なDGATアミノ酸配列を同定した(配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、又は29を参照)。
遺伝子構築物pAT001-020を、設計し、酵母プラスミドベクターpYES2にタンパク質コード領域を挿入することによって作製した。試験のために候補DGAT酵素をコードする、挿入されたヌクレオチド配列は、コード領域の挿入されたヌクレオチド配列を提供する配列番号:1~30の間の偶数番号の配列番号、及び酵素のアミノ酸配列を提供する配列番号:1~30の間の奇数番号の配列番号を参照されたい。pYES2ベクターは、酵母細胞における自律複製のための2μレプリコン、及びURA-遺伝的背景における形質転換体の選択を可能にするURA選択可能なマーカー遺伝子を含有した。各構築物は、S.cerevisiaeにおける脂肪酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現のために、単一のDGAT酵素をコードする遺伝子、又はpAT001の場合にはEaDAcTタンパク質を含有した。酵母S.cerevisiae株INVSc1をpAT001-014及びpAT019構築物で形質転換し、SD-Ura培地上のURA+細胞を選択した。形質転換細胞の培養物(10ml、50ml、又は3L)を実施例1に記載されるように増殖させた。培養物を、10ml培養物についての添加された酪酸(最終濃度2mg/ml)又は50ml培養物についての酪酸ナトリウム(2mg/ml)のいずれかの存在下又は不在下で、潜在的な炭素源として増殖させた。外因性基質を用いて生成された細胞は、本明細書において「C4:0供給細胞」と称され、酪酸塩の不在下で生成された細胞は、「非供給細胞」と称される。アシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠くpYES2ベクターで形質転換したS.cerevisiae細胞を、対照培養物として、酪酸塩の有無にかかわらず、同じ条件下で増殖させた。GAL1プロモーターからの候補アシルトランスフェラーゼ遺伝子の転写の誘導物質として、活性増殖期中に、培養物の全てが2%(w/v)のガラクトースを受け取った。
細胞のTAG含有量を計算するために、乾燥細胞バイオマスの測定重量から抽出した、抽出された脂質調製物からTAGを精製した。各TAG画分の試料を内部標準物質として既知の量の トリヘプタデカノインと混合し、各混合物中の脂肪酸を実施例1に記載されるようにFAMEに変換した。FAMEは、GC-FIDによって定量化された。GC分析においてヘプタデカノイル-FAMEについて観察された内部標準物質の重量及びピーク面積に基づいて、TAG中の各個体のFAMEの重量を算出した。TAGの全てのFAMEの含有量を合計したとき、これは、乾燥重量ベースでの細胞中のTAGの総量を提供した。対照pYES2細胞を同じ条件下で増殖させ、比較のために同じ方式で分析した。
pAT001~pAT014、及びpAT019を含有するS.cerevisiae形質転換体中の選択されたDGAT酵素の生化学的活性をアッセイするために実験を行った。上述のように、増殖培地は、添加化合物として、追加の炭素源として、及びTAG合成のための潜在的な基質として、2mg/mlの酪酸塩を含むか、又は欠如していた。初期培養物は10mlであり、後期培養物は50mlの体積であった。総脂質を、実施例1に記載のように、TLCによって単離した細胞、並びにTAG及びPL画分から抽出し、各形質転換株について脂肪酸組成物を決定した。TAG及びPLをFAMEに誘導体化し、GC-FID及びSPME-GCMSによって解析した。初期の実験は、TAGでエステル化された脂肪酸のメチルエステル(FAME)への変換を使用した。後の実験では、SCFA、特にC4:0メチルエステルのFAMEの揮発性に起因して、プロピルエステル(FAPE)又はブチリルエステル(FABE)への変換を使用した。1つの実験において、FAMEを実施例1に記載されるようにSPME-GCMSを通じて分析し、抽出された脂質からのTAG中のC4:0、C6:0、及びC8:0の存在及び分子同一性の確認を提供した。
細胞から抽出された脂質をTLCにより分画して、TAG分子を精製した。その分画はまた、精製リン脂質(PL)分画を提供し、したがって、その脂肪酸組成について分析した。データは、pYES2(対照)及びDGAT形質転換細胞から得られたPL画分が、類似した脂肪酸組成を有し、顕著な差異は観察されなかったことを示した。
乳脂肪は、TAG28:0、すなわち28:0に合計した3つのアシル鎖を含む、比較的低分子量のTAG分子を含有することが報告されている(Gresti et al.,1993)。TAG28:0には、C14-C10-C4、C16-C8-C4、C18-C6-C4、C12-C10-C6、C14-C8-C6、及びC16-C6-C6を含む少なくとも7つの異性体が報告されている(Liu et al.,2017)。
ヤギ酵素ChDGAT1-X2をコードする形質転換酵母株INVSc1::pAT003を更なる試験のために選択した。形質転換細胞を、実施例1に記載されるように、2mg/ml酪酸ナトリウムの存在下、又は酪酸ナトリウムを添加しなかった状態で、3L培養中で増殖させた。対照酵母株INVSc1::pYES2もまた、ChDGAT1-X2酵素の効果を決定するために、同じ条件下で酪酸ナトリウムの有無にかかわらず増殖させた。細胞を採取し、凍結乾燥し、3L培養物から約2gの乾燥細胞重量を得、総脂質を抽出した。TAGを、実施例1に記載されるように、TLCによる分画によって全脂質から単離した。INVSc1::pAT003細胞の3L培養物から単離した精製TAGの量は、酪酸塩を添加した培養物では32mg、同様に酪酸塩を添加したINVSc1::pYES2培養物では9mgであった。
3L培養物からの精製TAGの脂肪酸組成物を、脂肪酸のFAME及びGC-FIDへのメチル化によって分析した。酪酸塩を添加したINVSc1::pYES2細胞からのTAG調製物、及び乳脂肪試料からのTAG調製物も、メチル化及びGC-FIDを通じて同じ処理を使用して並行して分析した。データを表4に提示する。酪酸塩を供給されたpAT003形質転換酵母細胞からのTAGは、SCFA C4:0及びC6:0を含有し、C8:0脂肪酸の量を増加させたが、INVSc1::pYES2からのTAGは、C4:0及びC6:0脂肪酸を欠いていたことに留意されたい。INVSc1::pAT003からのTAGはまた、INVSc1:pYES2からのTAGと比較して増加した量のMCFA C10:0、C12:0、及びC14:0を含有し、培地からの酪酸塩の少なくとも一部が、TAGに組み込まれる前に形質転換酵母細胞内で細長くなっていたことを示す。酵母におけるChDGAT1-X2酵素の発現は、グリセロール骨格にエステル化された少なくとも1つのSCFAを有するかなりの量のTAGを生成することができたと結論付けられた。更に、形質転換酵母細胞からのTAG中のC4:0、C6:0、C8:0、及びC10:0のレベルは、乳脂肪のTAG中のこれらの脂肪酸のレベルに類似していた(表4)。乳脂肪TAGは、酵母細胞TAGよりもはるかに多くの量のC14:0を有したが、両方とも大量のC16:0を有し、各試料中に30%(モル%)を超えた。C16:1n-7脂肪酸(パルミトール酸)の量は、TAG調製物において、酵母細胞及び乳脂肪とは大きく異なり、乳脂肪における約2%と比較して、INVSc1::pAT001からのTAGでは約36%であった。INVSc1::pYES2のC16:1n-7のレベルは、約49%で更に高く、INVSc1:pYES2のTAGでもC18:1のレベルが大きく上昇したが、11.2%のC16:0のレベルは、30.92%のINVSc1:pAT003のTAGよりもはるかに低かった。
実施例1に記載したように、脂肪酸のメチル化ではなく、脂肪酸のブチルエステル(FABE)へのブチル化を含む方法を使用して、酪酸塩を供給された3L酵母培養物からの精製TAGも脂肪酸組成物について分析した。簡単に述べると、TAGをTLCによって総脂質から精製し、600μlのクロロホルム/メタノール(2:1v/v)を使用して、TAGスポットのシリカから抽出し、混合物を10分間振盪した後、混合物を遠心分離した。水中の0.1M KClを300μl添加した。混合物を5分間振盪し、遠心分離して、相を分離した。TAGを含有する下部非極性相を収集した。残りのシリカ/水性混合物を、300μlのクロロホルム及び非極性相を合わせた状態で2回抽出した。抽出物をフィルターを通して回転させて、任意のシリカ粒子を除去し、平らな挿入部を有するGCバイアルで乾燥させた。ブチル化のために、10mlの3N HClと、20mlの乾燥ブタノールを混合することによって調製した60μlのブタノール-1M HClを、5μlの既知の量のペンタン酸標準物質(C5:0、約23.25μg)と共に添加し、混合し、80℃で2時間加熱した。冷却後、30μlの水及び30μlのヘキサンを添加し、混合物を5分間振盪させ、回転させて相を分離した。上部有機相をGCバイアルに収集し、蒸発を最小限に抑え、脂肪酸分析のためにGC-FIDにアリコートを注射した。FABEを、実施例1に記載されるようにAgilent7890A GC上で定量化した。FABEもまた、実施例1に記載されるように、C8C24法を使用して定量化した。
酪酸塩の存在下で増殖させた酵母INVSc1::pAT003細胞の3L培養物から単離したTAG中の脂肪酸の位置分布を、プロピル化による単離されたMAG中の脂肪酸のプロピルエステル(FAPE)への変換を除いて、実施例1に記載のRhizopusリパーゼアッセイを使用して分析した。方法は、それによって、sn-2MAGの、FAPEへの変換及びGC-FIDによる解析を含んでいた。データは、重量ベース又はモル%ベースのいずれかで表7に示される。データは、TAGに存在するC4:0及びC6:0が、ほぼ完全にTAG分子のsn-1/3位にあったことを示し、TAGのsn-1及びsn-3位は、TAGの合成中に生化学的に区別されるにもかかわらず、リパーゼ活性に関して化学的に不明瞭である。導入されたChDGAT1-X2遺伝子からのDGAT活性の結果としてのみ、C4:0及びC6:0がTAG内に存在したため、これは、C4:0及びC6:0のほぼ全て(>95%)が、酵母細胞内で生成されたTAGのsn-3位でエステル化されたことを意味した。C8:0脂肪酸もまた、主にTAGのsn-1/3位にあり、DGAT活性に起因してsn-3位に存在することが再び示唆された。飽和脂肪酸C14:0及びLCFA C16:0及びC18:0の各々もまた、主にsn-1/3位にあった。これは、C16:0(パルミチン酸)について最も顕著であった:TAGのsn-1/3位の脂肪酸の39.16%はパルミチン酸であったが、TAG分子のsn-2位の脂肪酸の2.68%はパルミチン酸であった。対照的に、C10:0及びC12:0脂肪酸は、ほとんどTAGのsn-2位でエステル化された。更に、一価不飽和脂肪酸C14:1、C16:1、C18:1Δ9、及びC18:1Δ11は全て、主にTAGのsn-2位にあった。したがって、異なる脂肪酸のsn-1/3位及びsn-2位で観察されたこれらの嗜好の多くは、乳脂肪TAGで観察されたものと同様であった(表7)。発明者らは、種々の脂肪酸の位置分布に関して、酵母生成されたTAGは、乳脂肪TAGと同様の特徴を有すると結論付けた。
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Claims (22)
- 抽出された脂質を生成するためのプロセスであって、トリアシルグリセロール(TAG)分子を含む微生物細胞から脂質を抽出することであって、各TAG分子が、sn-1位、sn-2位、及びsn-3位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、前記TAG分子のうちの少なくともいくつかが、前記sn-3位でエステル化されたSCFAを含む、抽出することを行い、それによって、前記抽出された脂質を生成することを含む、プロセス。
- 前記TAG分子中の前記エステル化されたSCFAが、酪酸(C4:0)、カプロン酸(C6:0)、及びカプリル酸(C8:0)のうちの1つ以上又は全てであり、好ましくはC4:0、又はC4:0及びC6:0、より好ましくはC4:0、C6:0、及びC8:0を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記抽出された脂質は、
(i)前記脂質が、sn-2位でエステル化されたSCFAを含むTAG分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記sn-2位でエステル化されたSCFAを含むTAG分子の数の、sn-3位でエステル化されたSCFAを含むTAG分子の数に対する比(SCFA比sn-2:sn-3)が、約0.50未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.10未満、約0.05未満、約0.04未満、約0.03未満、又は約0.02未満であること、
(ii)前記脂質が、sn-2位でエステル化されたC4:0を含むTAG分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記sn-2位でエステル化されたC4:0を含むTAG分子の数の、sn-3位でエステル化されたC4:0を含むTAG分子の数に対する比(C4:0のsn-2:sn-3比)が、約0.50未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.10未満、約0.05未満、約0.04未満、約0.03未満、又は約0.02未満であること、
(iii)前記脂質が、sn-2位でエステル化されたC6:0を含むTAG分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記sn-2位でエステル化されたC6:0を含むTAG分子の数の、sn-3位でエステル化されたC6:0を含むTAG分子の数に対する比(C6:0のsn-2:sn-3比)が、約0.50未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.10未満、約0.05未満、約0.04未満、約0.03未満、又は約0.02未満であること、
(iv)SCFAの前記sn-2:sn-3比が、約0.005超、約0.01超、約0.005~約0.10、約0.01~約0.10、約0.005~約0.05、又は約0.01~約0.05であること、
(v)C4:0の前記sn-2:sn-3比が、約0.005超、約0.01超、約0.005~約0.10、約0.01~約0.10、約0.005~約0.05、又は約0.01~約0.05であること、
(vi)C6:0の前記sn-2:sn-3比が、約0.005超、約0.01超、約0.005~約0.10、約0.01~約0.10、約0.005~約0.05、又は約0.01~約0.05であること、
(vii)前記SCFAが、C4:0を含み、C4:0の前記sn-2:sn-3比が、約0.01超又は約0.02超であること、
(viii)前記抽出された脂質中の前記TAG分子のうちの多くが、前記TAG分子中でエステル化された2つのSCFAよりも、前記TAG分子中でエステル化された1つのSCFAのみを有すること、
(ix)前記抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも1重量%若しくはモル%、又はその両方が、SCFAであり、好ましくは、少なくとも1%が、C4:0であり、又はC4:0とC6:0との合計について少なくとも1%であること、
(x)前記抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも10重量%、少なくとも15重量%、少なくとも20重量%、少なくとも25重量%、又は少なくとも30重量%が、C16:1であり、好ましくは、最大50重量%であること、及び
(xi)前記抽出された脂質の前記TAG分子が、前記sn-2位でエステル化された任意の他の脂肪酸よりも、前記sn-2位でエステル化されたC16:1を多く含み、好ましくは、前記TAG分子の前記sn-2位でエステル化された前記脂肪酸の少なくとも30%又は少なくとも40%が、C16:1であること、のうちの1つ以上又は全てを特徴とする、請求項1又は2に記載のプロセス。 - 前記微生物細胞が、真菌細胞、細菌細胞、若しくは藻類細胞、又はそれらの任意の混合物、好ましくは酵母細胞、より好ましくはSaccharomyces cerevisiae細胞を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記細胞が、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ又は1つを超える脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼが、基質としてのSCFA-CoA分子、好ましくは基質としての少なくともブチリル-CoA活性を有し、各外因性ポリヌクレオチドが、前記細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができる1つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項1~4のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記脂肪酸アシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも1つが、
(i)哺乳類アシルトランスフェラーゼ又はその変異体、好ましくは反射型アシルトランスフェラーゼ又はその変異体、
(ii)ジアシルグリセロールO-アシルトランスフェラーゼ(DGAT)、好ましくはDGAT1、
(iii)1,2-ジアシル-sn-グリセロール:アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ(DAcT)、
(iv)哺乳類DGAT又はその変異体、好ましくは反射型DGAT又はその変異体、及び
(v)配列が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、又は29のうちのいずれか1つとして示されるアミノ酸、又は配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、又は29のうちのいずれか1つ以上の全長に沿って少なくとも30%同一であるアミノ酸配列を含むDGATのうちの1つ以上である、請求項5に記載のプロセス。 - 前記脂質を抽出するステップが、前記細胞を有機溶媒に曝露すること、前記細胞を押すこと、又は前記細胞を、マイクロ波照射、超音波処理、高速均質化、高圧均質化、ビーズ拍動、オートクレーブ、熱分解、又はそれらの任意の組み合わせで処理することを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記方法が、好ましくは、酪酸塩(C4:0)を含む培地中で、例えば、前記培地中の約1~約20g/Lの範囲内の濃度で、前記細胞を培養することを更に含み、及び/又は抽出後に前記脂質を修飾又は精製することを更に含む、請求項1~7のいずれか一項に記載のプロセス。
- トリアシルグリセロール(TAG)分子を含む、抽出された微生物脂質であって、各TAG分子が、sn-1位、sn-2位、及びsn-3位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、前記TAG分子のうちの少なくともいくつかが、前記TAG分子の前記sn-3位でエステル化された短鎖脂肪酸(SCFA)を含む、抽出された微生物脂質。
- 前記TAG分子の前記sn-3位でエステル化された前記SCFAが、C4:0、C6:0、及びC8:0、好ましくはC4:0及びC6:0、より好ましくはC4:0、C6:0、及びC8:0のうちの1つ以上又は全てである、請求項9に記載の脂質。
- (i)前記抽出された脂質が、sn-2位でエステル化されたSCFAを含むTAG分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記sn-2位でエステル化されたSCFAを含むTAG分子の数の、sn-3位でエステル化されたSCFAを含むTAG分子の数に対する比(SCFA比sn-2:sn-3)が、約0.50未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.10未満、約0.05未満、約0.04未満、約0.03未満、又は約0.02未満であること、
(ii)前記抽出された脂質が、sn-2位でエステル化されたC4:0を含むTAG分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記sn-2位でエステル化されたC4:0を含むTAG分子の数の、sn-3位でエステル化されたC4:0を含むTAG分子の数に対する比(C4:0のsn-2:sn-3比)が、約0.50未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.10未満、約0.05未満、約0.04未満、約0.03未満、又は約0.02未満であること、
(iii)前記抽出された脂質が、sn-2位でエステル化されたC6:0を含むTAG分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記sn-2位でエステル化されたC6:0を含むTAG分子の数の、sn-3位でエステル化されたC6:0を含むTAG分子の数に対する比(C6:0のsn-2:sn-3比)が、約0.50未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.10未満、約0.05未満、約0.04未満、約0.03未満、又は約0.02未満であること、
(iv)SCFAの前記sn-2:sn-3比が、約0.005超、約0.01超、約0.005~約0.10、約0.01~約0.10、約0.005~約0.05、又は約0.01~約0.05であること、
(v)C4:0の前記sn-2:sn-3比が、約0.005超、約0.01超、約0.005~約0.10、約0.01~約0.10、約0.005~約0.05、又は約0.01~約0.05であること、
(vi)C6:0の前記sn-2:sn-3比が、約0.005超、約0.01超、約0.005~約0.10、約0.01~約0.10、約0.005~約0.05、又は約0.01~約0.05であること、
(vii)前記SCFAが、C4:0を含み、前記SCFA比sn-2:sn-3が、約0.01超又は約0.02超であること、
(viii)前記抽出された脂質中の前記TAG分子のうちの多くが、前記TAG分子にエステル化された2つのSCFAよりも、前記TAG分子にエステル化された1つのSCFAのみを有すること、
(ix)前記抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも1重量%若しくはモル%、又は両方が、SCFAであり、好ましくはC4:0であるか、又はC4:0とC6:0との合計であるか、又はC4:0、C6:0、及びC8:0の合計であること、
(x)前記抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも10重量%、少なくとも15重量%、少なくとも20重量%、少なくとも25重量%、又は少なくとも30重量%が、C16:1であり、好ましくは、最大50重量%であること、及び
(xi)前記抽出された脂質の前記TAG分子が、前記sn-2位でエステル化された任意の他の脂肪酸よりも、前記sn-2位でエステル化されたC16:1を多く含み、好ましくは、TAGの前記sn-2位でエステル化された前記脂肪酸の少なくとも30%又は少なくとも40%が、C16:1であること、のうちの1つ以上又は全てを特徴とする、請求項9又は10に記載の脂質。 - 微生物細胞であって、
(a)トリアシルグリセロール(TAG)分子であって、各TAG分子が、sn-1位、sn-2位、及びsn-3位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、前記TAG分子のうちの少なくともいくつかが、前記TAG分子の前記sn-3位でエステル化された短鎖脂肪酸(SCFA)を含む、TAG分子と、
(b)脂肪酸アシルトランスフェラーゼ又は1つを超える脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチドであって、少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼが、基質としてのSCFA-CoA分子、好ましくは基質としての少なくともブチリル-CoA、又は基質としての少なくともブチリル-CoA及びカプロイル-CoAに活性を有し、各外因性ポリヌクレオチドが、前記細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができる1つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドと、を含む、微生物細胞。 - 前記TAG分子又は前記脂肪酸アシルトランスフェラーゼが、請求項5又は6に記載の特徴のうちの1つ以上を有する、請求項12に記載の細胞。
- 微生物細胞を培養するためのプロセスであって、
(a)TAG分子を生成する微生物細胞を得ることであって、各TAG分子は、sn-1位、sn-2位、及びsn-3位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、前記TAG分子のうちの少なくともいくつかが、前記TAG分子の前記sn-3位でエステル化された短鎖脂肪酸(SCFA)を含む、得ること、かつ/又は
(b)脂肪酸アシルトランスフェラーゼ又は1つを超える脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む微生物細胞を得ることであって、少なくとも1つのアシルトランスフェラーゼが、基質としてのSCFA-CoA分子、好ましくは基質としての少なくともブチリル-CoA、又は基質としての少なくともブチリル-CoA及びカプロイル-CoAに活性を有し、各外因性ポリヌクレオチドが、前記細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができる1つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、得ること、及び
(c)前記細胞を好適な培地で培養することによって、前記細胞の数を増加させること、を含む、プロセス。 - 前記培地が、酪酸塩(C4:0)を含む、請求項14に記載のプロセス。
- TAG分子を生成する微生物細胞を生成するためのプロセスであって、請求項5又は6に記載の1つ以上の脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入するステップを含む、プロセス。
- 請求項12又は13に記載の微生物細胞を選択又は同定するためのプロセスであって、
(i)請求項5又は6に記載の脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む微生物細胞からの脂質を分析するステップと、
(ii)請求項12又は13に記載の微生物細胞である、ステップi)からの微生物細胞を選択又は同定するステップと、を含む、プロセス。 - 好ましくは、別の食品又は飲料成分と共に、請求項9~11のいずれか一項に記載の脂質、又は請求項12若しくは13に記載の微生物細胞のうちの一方又は両方を含む、組成物。
- 請求項9~11のいずれか一項に記載の抽出された脂質、請求項12若しくは13に記載の微生物細胞、又は請求項18に記載の組成物のうちの1つ以上、及び少なくとも1つの他の食品、供給、又は飲料成分を含む、食品、飼料、又は飲料。
- 動物に由来する成分を有さない、請求項19に記載の食品、飼料、又は飲料。
- 食品、飼料、若しくは飲料成分、又は食品、飼料、若しくは飲料を生成する方法であって、請求項9~11のいずれか一項に記載の抽出された脂質、請求項12若しくは13に記載の微生物細胞、又は請求項18に記載の組成物のうちの1つ以上を、少なくとも1つの他の食品若しくは飼料成分と混合すること、及び/又は請求項9~11のいずれか一項に記載の抽出された脂質、請求項12若しくは13に記載の微生物細胞、又は請求項18に記載の組成物を処理することを含む、方法。
- 食品、飼料、若しくは飲料成分、又は食品、飼料、若しくは飲料を生成するための、請求項9~11のいずれか一項に記載の抽出された脂質、請求項12若しくは13に記載の微生物細胞、又は請求項18に記載の組成物のうちの1つ以上の使用。
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