JP2023518329A - 短鎖脂肪酸の生成 - Google Patents

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Abstract

本発明は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を有するトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含む微生物細胞、及びこれらの細胞を使用して、ＳＣＦＡを有するＴＡＧを含む脂質を生成する方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を有するトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含む微生物細胞、及びこれらの細胞を使用して、ＳＣＦＡを有するＴＡＧを含む脂質を生成する方法に関する。
世界人口が２０５０年までに９１億人に急増すると、人間の栄養のための食肉及び乳製品の需要は、今後も増加すると予想されている。しかしながら、世界の食肉及び乳製品生産量は、淡水消費量の７０％、耕地利用全体の３８％を占め、世界の温室効果ガス排出量の１９％に寄与している。それほど環境フットプリントを有しない、タンパク質及び脂肪の代替源を見つけることへの関心が高まっている。また、高品質のタンパク質及び脂肪の非動物源、例えば、より持続可能かつ環境に優しいとみなされている植物源の市場が世界的に拡大している。文化的及び宗教的な理由もまた、非動物性タンパク質の市場拡大に寄与している。乳製品の代替品として推進されているいわゆる植物乳の売上高は、２０２４年までに世界で３４０億ドルを超えると予測されている。しかしながら、食肉及び乳製品用の多くの現在の植物ベースの代替品は、不十分な風味及び機能をもたらす可能性がある、ココナッツ、大豆、及びヤシ油などの植物油のブレンドから作られた脂肪を使用している。脂肪及び油は、食品に風味、潤滑性、及び質感を付加し、消費時の満腹感に寄与し、したがって、動物性の脂質を組み込んだ食品及び飲料製品は、依然として消費者によって好まれることが多い。
牛乳には、約８７％の水、４．６％の乳糖、３．４％のタンパク質、３．５～４．５％の脂肪、０．８％のミネラル、及び０．１％のビタミンが含まれている（Ｍａｎｓｓｏｎ、２００８）。牛乳中の脂質は、主に水中油型エマルションとして球状に存在する。脂肪成分は、約９７～９８％のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、約２％のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、０．５％のコレステロール、０．１％のリン脂質（ＰＬ）、及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）からなるが、乳及びその脂肪の組成は、牛の品種、飼料のタイプ、授乳期、及び季節によって異なる。乳脂肪は、その脂肪酸組成及び機能的特性において珍しく、４００種もの異なる脂肪酸を含み、全ての天然脂肪の中で最も複雑なものとなっている。飽和脂肪酸は、総脂肪酸の約３０重量％以上でパルミチン酸（Ｃ１６：０）を含む、ＴＡＧの脂肪酸含有量の約７０重量％を占める。ミリスチン酸塩（Ｃ１４：０）及びステアリン酸塩（Ｃ１８：０）は各々、総脂肪酸含有量の１０％を超えて存在し、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ；Ｃ２：０、Ｃ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０）は、総脂肪酸含有量の約６～８％で共に存在する。一価不飽和脂肪酸、主に最大約２２％のオレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）であるが、低レベルのＣ１４：１及びＣ１６：１も含み、不飽和脂肪酸含有量の大部分を占める。乳脂肪は一般に、リノール酸（Ｃ１８：２）及びリノレン酸（Ｃ１８：３）として存在する低レベル（＜２％）の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）のみを含有する。乳脂肪中に存在する短鎖脂肪酸酪酸（Ｃ４：０）及びカプロン酸（Ｃ６：０）は、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でほぼ排他的にエステル化される。
ヒトの栄養のために、動物性脂肪のような組成及び機能的特性を有する代替の非動物性脂質源の必要性が依然として存在する。
本発明者らは、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含む微生物細胞を生成しており、ＴＡＧは、ＴＡＧのｓｎ－１／３位でエステル化された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含む。
したがって、一態様において、本発明は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）分子を含む微生物細胞から脂質を抽出することであって、各ＴＡＧ分子は、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかは、ｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡを含む、抽出することを行い、それによって、抽出された脂質を生成することを含む、抽出された脂質を生成するためのプロセスを提供する。この文脈において、ｓｎ－１、ｓｎ－２、及びｓｎ－３位は、ＴＡＧ分子のグリセロール成分のｓｎ－１、ｓｎ－２、及びｓｎ－３位を指すことを理解されたい。
一実施形態において、プロセスは、
（ａ）ＴＡＧ分子を含む微生物細胞を得るステップであって、各ＴＡＧ分子が、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかが、ｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡを含む、得るステップと、
（ｂ）微生物細胞から脂質を抽出するステップと、を含み、
それによって、抽出された脂質を生成する。
一実施形態において、ＴＡＧ分子内のエステル化ＳＣＦＡは、酪酸（Ｃ４：０）、カプロン酸（Ｃ６：０）、及びカプリル酸（Ｃ８：０）のうちの１つ以上又は全てである。
実施形態において、ＴＡＧ分子中のエステル化ＳＣＦＡは、Ｃ４：０、又はＣ４：０及びＣ６：０、好ましくはＣ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０を含む。より好ましい実施形態において、抽出された脂質中のＴＡＧの総脂肪酸含有量におけるＣ４：０の量は、Ｃ６：０より多いか、又はＣ８：０より多いか、又はその両方であり、最も好ましくは、Ｃ６：０及びＣ８：０の量の合計より多く、各量は、重量ベースで、抽出された脂質中のＴＡＧの総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される。同じ特徴は、モル％基準で適用され得ることを理解されたい。
更なる実施形態（ａ）において、抽出された脂質は、ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子を含み、抽出された脂質中の、ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数に対する比は、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満である。好ましい実施形態（ｂ）において、抽出された脂質は、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子を含み、抽出された脂質中の、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子の数に対する比は、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満である。更なる実施形態（ｃ）において、抽出された脂質は、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子を含み、抽出された脂質中の、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子の数に対する比（Ｃ６：０比ｓｎ－２：ｓｎ－３）は、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満である。更なる実施形態において、（ａ）及び（ｂ）の両方が適用されるか、又は（ａ）及び（ｃ）が適用されるか、又は（ｂ）及び（ｃ）が適用される。
実施形態（ａ）において、ＳＣＦＡ比ｓｎ－２：ｓｎ－３は、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５である。好ましい実施形態（ｂ）において、Ｃ４：０比ｓｎ－２：ｓｎ－３は、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５である。好ましい実施形態（ｃ）において、Ｃ６：０比ｓｎ－２：ｓｎ－３は、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５である。更なる実施形態において、（ａ）及び（ｂ）の両方が適用されるか、又は（ａ）及び（ｃ）が適用されるか、又は（ｂ）及び（ｃ）が適用される。
実施形態において、ＳＣＦＡは、Ｃ４：０を含み、Ｃ４：０のｓｎ－２：ｓｎ－３比は、約０．０１超又は約０．０２超である。
一実施形態において、抽出された脂質中のＴＡＧ分子のうちの多くは、ＴＡＧ分子中でエステル化された２つのＳＣＦＡよりも、ＴＡＧ分子中でエステル化された１つのＳＣＦＡのみを有する。一実施形態において、抽出された脂質中のＴＡＧ分子のうちの多くは、ＴＡＧ分子中でエステル化された２つのＣ４：０脂肪酸よりも、ＴＡＧ分子中でエステル化された１つのＣ４：０脂肪酸のみを有する。一実施形態において、抽出された脂質中のＴＡＧ分子のうちの多くは、ＴＡＧ分子中でエステル化された２つのＣ６：０脂肪酸よりも、ＴＡＧ分子中でエステル化された１つのＣ６：０脂肪酸のみを有する。
実施形態において、抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１重量％若しくはモル％、又はその両方は、ＳＣＦＡであり、好ましくは、少なくとも１％は、Ｃ４：０、又はＣ４：０とＣ６：０との合計について少なくとも１％である。
実施形態において、抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、又は少なくとも３０重量％は、Ｃ１６：１であり、好ましくは、最大５０重量％である。
実施形態において、抽出された脂質のＴＡＧ分子は、ｓｎ－２位でエステル化された任意の他の脂肪酸よりも、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ１６：１を多く含み、好ましくは、ＴＡＧ分子のｓｎ－２位でエステル化された脂肪酸の少なくとも３０％又は少なくとも４０％は、Ｃ１６：１である。
実施形態において、微生物細胞は、真菌細胞、細菌細胞、若しくは藻類細胞、又はそれらの任意の混合物、好ましくは酵母細胞、より好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を含む。一実施形態において、微生物細胞は、（ｉ）発酵に好適な、（ｉｉ）油性細胞、及び（ｉｉｉ）異栄養細胞のうちの１つ以上又は全てである。
一実施形態において、真菌細胞は、酵母細胞を含む。例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ、及びこれらの任意の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、微生物細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、株ＦＣＣ－１３２４などのＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択された藻類細胞を含む。一実施形態において、微生物細胞は、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａである。
一実施形態において、細胞は、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ又は１つを超える脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼは、基質としてのＳＣＦＡ－ＣｏＡ分子、好ましくは基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ、又は基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ及びカプロイル－ＣｏＡに活性を有し、各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内の該ポリヌクレオチドの発現を指示することができる１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている。
一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、細胞のゲノム、好ましくは細胞の核ゲノムに組み込まれる。一実施形態において、細胞は、細胞の核ゲノムに組み込まれる外因性ポリヌクレオチドを含み、これらは、ゲノム内の単一の部位に組み込まれるか、又は少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドが１つの部位に組み込まれ、少なくとも１つの他の外因性ポリヌクレオチドが第２の部位に組み込まれる。２つを超える統合部位も企図される。あるいは、外因性ポリヌクレオチドは、細胞内の自律複製ベクターに含まれる。
一実施形態において、脂肪酸アシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つは、哺乳類アシルトランスフェラーゼ又はその変異体、好ましくは反射性アシルトランスフェラーゼ又はその変異体である。
一実施形態において、アシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つは、ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、好ましくは、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール：アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＤＡｃＴ）又はＤＧＡＴ１である。一実施形態において、ＤＧＡＴは、哺乳類ＤＧＡＴ又はその変異体、好ましくは反射型ＤＧＡＴ又はその変異体である。
実施形態において、ＤＧＡＴは、配列が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９のうちのいずれか１つとして示されるアミノ酸、又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９のうちのいずれか１つ以上の全長に沿って少なくとも３０％同一であるアミノ酸配列を含む。
実施形態において、ＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０のうちのいずれか１つとして示されるヌクレオチド、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０のうちのいずれか１つの全長に沿って少なくとも３０％同一であるヌクレオチド配列を含む。
脂質は、限定されないが、細胞を有機溶媒に曝露すること、細胞を押すこと、又は細胞を、マイクロ波照射、超音波処理、高速均質化、高圧均質化、ビーズ拍動、オートクレーブ、熱分解、又はこれらの任意の組み合わせで処理するなどの、当該技術分野で既知の任意の手段によって抽出することができる。
一実施形態において、方法は、細胞、好ましくは酵母細胞、より好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を培養することを更に含む。
一実施形態において、細胞は、酪酸塩（Ｃ４：０）を含む培地中で培養され、好ましくは、培地中で約１～約２０ｇ／Ｌの範囲の濃度で培養される。
一実施形態において、方法は、例えば、脂質を脱ガム化、脱臭、又は蒸留若しくは分画することによって、脂質を修飾又は精製することを更に含む。好ましい実施形態において、脂質は、トランスエステル化によって処理されていない。一実施形態（ａ）において、抽出された脂質の総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、ＳＣＦＡ、好ましくはＣ４：０の量は、微生物細胞からの抽出後、相対的基準で１０％超変化していない。例えば、最初に抽出された脂質中のＳＣＦＡの量が、重量ベースで８％であった場合、修飾又は精製された脂質は、７．２％～８．８％のＳＣＦＡを有する。一実施形態（ｂ）において、ＳＣＦＡ ｓｎ－２：ｓｎ－３比は、修飾又は精製プロセスによって１０％超変化していない。（ａ）及び（ｂ）の両方が適用され得る。
別の態様において、本発明は、本発明のプロセスによって生成されるか、又は本発明の細胞から生成される、抽出された微生物脂質、好ましくは抽出された酵母脂質、より好ましくは抽出されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ脂質を提供する。一実施形態において、抽出された微生物脂質は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）分子を含み、各ＴＡＧ分子は、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかは、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含む。
細胞又は脂質は、上記プロセスの態様について概説される任意の特徴を、単独で、又は全ての可能な組み合わせで含み得る。
一実施形態において、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡは、Ｃ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０のうちの１つ以上又は全てである。
一実施形態において、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡは、Ｃ４：０、又はＣ４：０及びＣ６：０、好ましくはＣ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０を含む。好ましい実施形態において、抽出された脂質中のＴＡＧの総脂肪酸含有量におけるＣ４：０の量は、Ｃ６：０より多いか、又はＣ８：０より多いか、又はその両方であり、より好ましくは、Ｃ６：０及びＣ８：０の量の合計より多く、各量は、重量ベースで、抽出された脂質中のＴＡＧの総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される。同じ特徴は、モル％基準で適用され得ることを理解されたい。
実施形態（ａ）において、抽出された脂質は、ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子を含み、抽出された脂質中の、ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数に対する比は、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満である。好ましい実施形態（ｂ）において、抽出された脂質は、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子を含み、抽出された脂質中の、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子の数に対する比は、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満である。更なる実施形態（ｃ）において、抽出された脂質は、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子を含み、抽出された脂質中の、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子の数に対する比（Ｃ６：０比ｓｎ－２：ｓｎ－３）は、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満である。更なる実施形態において、（ａ）及び（ｂ）の両方が適用されるか、又は（ａ）及び（ｃ）が適用されるか、又は（ｂ）及び（ｃ）が適用される。
実施形態（ａ）において、抽出された脂質のＳＣＦＡ比ｓｎ－２：ｓｎ－３は、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５である。好ましい実施形態（ｂ）において、Ｃ４：０の比ｓｎ－２：ｓｎ－３は、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５である。好ましい実施形態（ｃ）において、Ｃ６：０比ｓｎ－２：ｓｎ－３は、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５である。更なる実施形態において、（ａ）及び（ｂ）の両方が適用されるか、又は（ａ）及び（ｃ）が適用されるか、又は（ｂ）及び（ｃ）が適用される。
一実施形態において、ＳＣＦＡは、Ｃ４：０を含み、Ｃ４：０のｓｎ－２：ｓｎ－３比は、約０．０１超又は約０．０２超である。
一実施形態において、抽出された脂質中のＴＡＧ分子のうちの多くは、ＴＡＧ分子中でエステル化された２つのＳＣＦＡよりも、ＴＡＧ分子中でエステル化された１つのＳＣＦＡのみを有する。一実施形態において、抽出された脂質中のＴＡＧ分子のうちの多くは、ＴＡＧ分子中でエステル化された２つのＣ４：０脂肪酸よりも、ＴＡＧ分子中でエステル化された１つのＣ４：０脂肪酸のみを有する。一実施形態において、抽出された脂質中のＴＡＧ分子のうちの多くは、ＴＡＧ分子中でエステル化された２つのＣ６：０脂肪酸よりも、ＴＡＧ分子中でエステル化された１つのＣ６：０脂肪酸のみを有する。
一実施形態（ａ）において、抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１重量％若しくはモル％、又はその両方が、ＳＣＦＡであり、好ましくは、少なくとも１％が、Ｃ４：０、又はＣ４：０とＣ６：０との合計について少なくとも１％である。
実施形態（ｂ）において、抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、又は少なくとも３０重量％は、Ｃ１６：１であり、好ましくは、最大５０重量％又は４５重量％である。
実施形態（ｃ）において、抽出された脂質のＴＡＧ分子は、ｓｎ－２位でエステル化された任意の他の脂肪酸よりも、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ１６：１を多く含み、好ましくは、ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル化された脂肪酸の少なくとも３０％又は少なくとも４０％は、Ｃ１６：１である。（ａ）及び（ｂ）、（ａ）及び（ｃ）、（ｂ）及び（ｃ）の組み合わせ、並びに（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の３つ全てが企図される。
一実施形態において、抽出された脂質の総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出された微生物脂質中の総飽和脂肪酸の量は、乳脂肪中の量よりも少なく、好ましくは相対基準で少なくとも１０％又は少なくとも２０％少ない。一実施形態において、抽出された微生物脂質中の総飽和脂肪酸の量は、重量ベースで、３０％～５０％又は５０％～７０％である。一実施形態において、抽出された微生物脂質中のＣ１６：０若しくはＣ１８：０、又は両方の合計の量は、乳脂肪中の量よりも少なく、好ましくは相対的基準で少なくとも１０％又は少なくとも２０％少ない。
一実施形態において、抽出された脂質は、室温（２５℃）において液体であり、すなわち油である。一実施形態において、抽出された脂質は、室温（２５℃）において固体であり、すなわち、脂肪である。脂質はまた、室温において液体と固体との混合物であり得る。
更なる態様において、本発明は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）分子を含み、各ＴＡＧ分子は、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかは、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含む、微生物細胞又は微生物細胞、好ましくは酵母細胞、より好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を提供する。
本発明の微生物細胞は、上記プロセス又は抽出された脂質態様について概説される任意の特徴を、単独で又は特徴の任意の可能な組み合わせで含み得る。
更なる態様において、本発明は、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ又は１つを超える脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、微生物細胞、又は微生物細胞、好ましくは酵母細胞、より好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を提供し、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼは、基質としてのＳＣＦＡ－ＣｏＡ分子、好ましくは基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ、又は基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ及びカプロイル－ＣｏＡに活性を有し、各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内の該ポリヌクレオチドの発現を指示することができる１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている。
実施形態（ａ）において、脂肪酸アシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つは、哺乳類アシルトランスフェラーゼ若しくはその変異体、好ましくは反射型アシルトランスフェラーゼ若しくはその変異体であるか、又はアシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つは、ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、好ましくは１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール：アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＤＡｃＴ）若しくはＤＧＡＴ１であるか、又はＤＧＡＴは、哺乳類ＤＧＡＴ又はその変異体、好ましくは反射型ＤＧＡＴ又はその変異体である。
更なる実施形態（ｂ）において、ＤＧＡＴは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９のうちのいずれか１つとして示されるアミノ酸、又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９のうちのいずれか１つの全長に沿って少なくとも３０％同一であるアミノ酸配列を含む。
更なる実施形態（ｃ）において、ＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０のうちのいずれか１つとして示されるヌクレオチド、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０のうちのいずれか１つの全長に沿って少なくとも３０％同一であるヌクレオチド配列を含む。
実施形態（ｄ）において、微生物細胞は、ＴＡＧ分子を含み、ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかは、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含む。更なる実施形態において、（ａ）及び（ｂ）の両方が適用されるか、又は（ａ）及び（ｃ）が適用されるか、又は（ａ）及び（ｄ）が適用されるか、又は（ｂ）及び（ｄ）が適用されるか、又は（ｃ）及び（ｄ）が適用される。
一実施形態において、微生物細胞は、同じ条件下で培養された、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを欠く、対応する微生物細胞と比較して増加した量のＴＡＧを含む。好ましい実施形態において、増加した量は、絶対的基準で少なくとも１％、例えば、重量ベースで１％～少なくとも２％、又は相対的基準で少なくとも２０％、例えば、２０％～２００％若しくは２５０％、すなわち、１．２倍～３．０倍若しくは３．５倍増加する。好ましい実施形態において、増加したＴＡＧ含有量のこの特徴は、上記の特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）のいずれか、又は本発明のプロセス又は本発明の抽出された脂質について記載された特徴と組み合わされる。
本発明の微生物細胞は、上記プロセス又は抽出された脂質態様について概説される任意の特徴を、単独で又は特徴の任意の可能な組み合わせで含み得る。
別の態様において、本発明は、微生物細胞、好ましくは酵母細胞、より好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を培養するためのプロセスを提供し、プロセスは、
（ａ）ＴＡＧ分子を生成する微生物細胞を得ることであって、各ＴＡＧ分子は、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかは、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含む、得ること、かつ／又は（ｂ）脂肪酸アシルトランスフェラーゼ又は１つを超える脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む微生物細胞を得ることであって、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼは、基質としてのＳＣＦＡ－ＣｏＡ、好ましくは基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ、又は基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ及びカプロイル－ＣｏＡに活性を有し、各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内の該ポリヌクレオチドの発現を指示することができる１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、得ることと、
（ｃ）細胞を好適な培地で培養することによって、細胞の数を増加させることと、を含む。
一実施形態において、培地は、好ましくは、培養中のある時点で、より好ましくは培養期間のほとんどを通して、１～２０ｇ／Ｌのレベルで、酪酸塩（Ｃ４：０）を含む。
別の態様において、本発明は、ＴＡＧ分子を生成する微生物細胞を生成するためのプロセスを提供し、プロセスは、本明細書に定義される１つ以上の脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入するステップを含む。アシルトランスフェラーゼは、微生物細胞に適用される、上記の（ａ）及び（ｂ）、又は（ａ）及び（ｃ）、又は（ａ）及び（ｄ）、又は（ｂ）及び（ｄ）、又は（ｃ）及び（ｄ）の両方を特徴とし得る。
一実施形態において、プロセスは、
（ｉ）導入された外因性ポリヌクレオチドを含む細胞から子孫細胞を生成するステップ、
（ｉｉ）本明細書に定義される細胞又は脂質の特徴のうちの１つ以上を有する子孫細胞を選択するステップのうちの１つ以上又は全てのステップを含む。
別の態様において、本発明は、本明細書に定義される特徴のうちの１つ以上を含む、本発明の微生物細胞を選択又は同定するためのプロセスを提供し、プロセスは、
（ｉ）本明細書で定義される１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む微生物細胞からの脂質を分析するステップと、
（ｉｉ）微生物細胞を選択又は同定するステップと、を含む。
本発明の脂質又は本発明の微生物細胞のうちの１つ以上を含む組成物も提供される。
一実施形態において、組成物は、本発明の細胞以外の供給源からの少なくとも１つの他の脂質を含む。一実施形態において、他方の供給源からの脂質は、ＴＡＧの形態でエステル化されたＳＣＦＡを含まない。一実施形態において、本発明の抽出された微生物性脂質の、他方の供給源からの脂質に対する量の比は、１０：１～１：１０である。
更なる態様において、本発明は、本発明の抽出された脂質、本発明の微生物細胞、又は本発明の組成物のうちの１つ以上、並びに少なくとも１つの他の食品、飼料、又は飲料成分を含む、食品、飼料、若しくは飲料成分、又は食品、飼料、又は飲料を提供する。好ましくは、食品又は飼料中の、本発明の抽出された脂質、本発明の微生物細胞、又は本発明の組成物の量は、乾燥重量ベースで少なくとも１％であり、好ましくは１％～２０％である。好ましくは、飲料中の、本発明の抽出された脂質、本発明の微生物細胞、又は本発明の組成物の量は、重量ベースで少なくとも０．５％であり、好ましくは重量ベースで０．５～５％である。
一実施形態において、食品、飼料、又は飲料成分、又は食品、飼料、又は飲料は、動物に由来する成分を有しない。
別の態様において、本発明は、食品、飼料、若しくは飲料成分、又は食品、飼料、若しくは飲料を生成する方法を提供し、方法は、本発明の抽出された脂質、本発明の微生物細胞、又は本発明の組成物のうちの１つ以上を、少なくとも１つの他の食品、飼料、若しくは飲料成分と混合すること、及び／又は本発明の抽出された脂質、本発明の微生物細胞、又は本発明の組成物を処理することを含む。
別の態様において、本発明は、食品、飼料、若しくは飲料成分、又は食品、飼料、若しくは飲料を生成することを提供するための、本発明の抽出された脂質、本発明の微生物細胞、又は本発明の組成物のうちの１つ以上の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、
（ａ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）分子を含む微生物細胞を得ることであって、各ＴＡＧ分子は、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかは、ｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡを含む、得ることと、
（ｂ）微生物細胞から脂質を抽出することと、を含み、
それによって抽出された脂質を生成する、抽出された脂質を生成するためのプロセスを提供する。この文脈において、ｓｎ－１、ｓｎ－２、及びｓｎ－３位は、ＴＡＧ分子のグリセロール成分のｓｎ－１、ｓｎ－２、及びｓｎ－３位を指すことを理解されたい。
一実施形態において、ＴＡＧ分子内のエステル化ＳＣＦＡは、酪酸（Ｃ４：０）、カプロン酸（Ｃ６：０）、及びカプリル酸（Ｃ８：０）のうちの１つ以上又は全てである。
別の実施形態において、ＴＡＧ分子中のエステル化されたＳＣＦＡは、Ｃ４：０、又はＣ４：０及びＣ６：０を含む。
更なる実施形態において、抽出された脂質は、ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子を含み、抽出された脂質中の、ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数に対する比は、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満である。
一実施形態において、ＳＣＦＡ比ｓｎ－２：ｓｎ－３は、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５である。
一実施形態において、ＳＣＦＡは、Ｃ４：０であり、ＳＣＦＡ比ｓｎ－２：ｓｎ－３は、約０．０１超又は約０．０２超である。
一実施形態において、抽出された脂質中のＴＡＧ分子のうちの多くは、ＴＡＧ分子中でエステル化された２つのＳＣＦＡよりも、ＴＡＧ分子中でエステル化された１つのＳＣＦＡのみを有する。
一実施形態において、抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１重量％若しくはモル％、又はその両方は、ＳＣＦＡ、好ましくはＣ４：０、又はＣ４：０及びＣ６：０である。
一実施形態において、抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、又は少なくとも３０重量％は、Ｃ１６：１であり、好ましくは、最大５０重量％である。
一実施形態において、抽出された脂質のＴＡＧ分子は、ｓｎ－２位でエステル化された任意の他の脂肪酸よりも、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ１６：１を多く含み、好ましくは、ＴＡＧ分子のｓｎ－２位でエステル化された脂肪酸の少なくとも３０％又は少なくとも４０％は、Ｃ１６：１である。
一実施形態において、抽出された脂質のＴＡＧ分子は、ＴＡＧ分子のｓｎ－２位でエステル化された任意の他の脂肪酸よりも、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ１６：０を多く含む。
一実施形態において、微生物細胞は、真菌細胞、細菌細胞、若しくは藻類細胞、又はそれらの任意の混合物を含む。一実施形態において、微生物細胞は、（ｉ）発酵に好適な、（ｉｉ）油性細胞、及び（ｉｉｉ）異栄養細胞のうちの１つ以上又は全てである。
一実施形態において、真菌細胞は、酵母細胞を含む。例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ、及びこれらの任意の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、微生物細胞は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、株ＦＣＣ－１３２４などのＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択された藻類細胞を含む。一実施形態において、微生物細胞は、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａである。
一実施形態において、細胞は、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ又は１つを超える脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼは、基質としてのＳＣＦＡ－ＣｏＡ分子、好ましくは基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ、又は基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ及びカプロイル－ＣｏＡに活性を有し、各外因性ポリヌクレオチドは、細胞内の該ポリヌクレオチドの発現を指示することができる１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている。
一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、細胞のゲノムに組み込まれる。
一実施形態において、脂肪酸アシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つは、哺乳類アシルトランスフェラーゼ又はその変異体、好ましくは反射性アシルトランスフェラーゼ又はその変異体である。
一実施形態において、アシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つは、ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である。
一実施形態において、ＤＧＡＴは、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール：アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＤＡｃＴ）である。
一実施形態において、ＤＧＡＴは、ＤＧＡＴ１である。一実施形態において、ＤＧＡＴは、哺乳類ＤＧＡＴ又はその変異体、好ましくは反射型ＤＧＡＴ又はその変異体である。
一実施形態において、ＤＧＡＴは、配列が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９のうちのいずれか１つとして示されるアミノ酸、又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９のうちのいずれか１つの全長に沿って少なくとも３０％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、ＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０のうちのいずれか１つとして示されるヌクレオチド、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、又は３０のうちのいずれか１つの全長に沿って少なくとも３０％同一であるヌクレオチド配列を含む。
脂質は、限定されないが、細胞を有機溶媒に曝露すること、細胞を押すこと、又は細胞を、マイクロ波照射、超音波処理、高速均質化、高圧均質化、ビーズ拍動、オートクレーブ、熱分解、又はこれらの任意の組み合わせで処理することなど、当該技術分野で既知の任意の手段によって抽出することができる。
一実施形態において、方法は、細胞を培養することを更に含む。
一実施形態において、細胞は、酪酸塩（Ｃ４：０）を含む培地中で培養され、好ましくは、培地中で約１～約２０ｇ／Ｌの範囲の濃度で培養される。
一実施形態において、方法は、例えば、脂質を脱ガム化、脱臭、又は蒸留若しくは分画することによって、脂質を修飾又は精製することを更に含む。好ましい実施形態において、脂質は、トランスエステル化によって処理されていない。
別の態様において、本発明は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）分子を含む、抽出された微生物脂質を提供し、各ＴＡＧ分子は、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかは、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含む。
細胞又は脂質は、上記プロセスの態様について概説される任意の特徴を含み得る。
一実施形態において、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡは、Ｃ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０のうちの１つ以上又は全てである。
一実施形態において、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡは、Ｃ４：０、又はＣ４：０及びＣ６：０を含む。
一実施形態において、抽出された脂質は、ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子を含み、抽出された脂質中の、ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数に対する比は、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満である。
一実施形態において、ＳＣＦＡ比ｓｎ－２：ｓｎ－３は、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５である。
一実施形態において、ＳＣＦＡは、Ｃ４：０であり、ＳＣＦＡ比ｓｎ－２：ｓｎ－３は、約０．０１超又は約０．０２超である。
一実施形態において、抽出された脂質中のＴＡＧ分子のうちの多くは、ＴＡＧ分子中でエステル化された２つのＳＣＦＡよりも、ＴＡＧ分子中でエステル化された１つのＳＣＦＡのみを有する。
一実施形態において、抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１重量％若しくはモル％、又はその両方は、ＳＣＦＡ、好ましくはＣ４：０、又はＣ４：０及びＣ６：０である。
一実施形態において、抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、又は少なくとも３０重量％は、Ｃ１６：１であり、好ましくは、最大５０重量％又は４５重量％である。
一実施形態において、抽出された脂質のＴＡＧ分子は、ｓｎ－２位でエステル化された任意の他の脂肪酸よりも、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ１６：１を多く含み、好ましくは、ＴＡＧのｓｎ－２位でエステル化された脂肪酸の少なくとも３０％又は少なくとも４０％は、Ｃ１６：１である。
一実施形態において、抽出された脂質のＴＡＧ分子は、ｓｎ－２位でエステル化された任意の他の脂肪酸よりも、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ１６：０を多く含む。
一実施形態において、抽出された脂質は、室温（２５℃）において液体であり、すなわち油である。一実施形態において、抽出された脂質は、室温（２５℃）において固体であり、すなわち、脂肪である。脂質はまた、室温において液体と固体との混合物であり得る。
更なる態様において、本発明は、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）分子を含む、微生物細胞を提供し、各ＴＡＧ分子は、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかは、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含む。
本発明の微生物細胞は、上記プロセス又は抽出された脂質態様について概説される任意の特徴を含み得る。
別の態様において、本発明は、微生物細胞を培養するためのプロセスを提供し、プロセスは、
（ａ）ＴＡＧ分子を生成する微生物細胞を得ることであって、各ＴＡＧ分子は、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかは、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含む、得ることと、
（ｃ）細胞を好適な培地で培養することによって、細胞の数を増加させることと、を含む。
一実施形態において、培地は、酪酸塩（Ｃ４：０）を含む。
別の態様において、本発明は、ＴＡＧ分子を生成する微生物細胞を生成するためのプロセスを提供し、プロセスは、本明細書に定義される１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入するステップを含む。
一実施形態において、プロセスは、
（ｉ）導入された外因性ポリヌクレオチドを含む細胞から子孫細胞を生成するステップ、
（ｉｉ）本明細書に定義される細胞又は脂質の特徴のうちの１つ以上を有する子孫細胞を選択するステップのうちの１つ以上又は全てのステップを含む。
別の態様において、本発明は、本明細書に定義される特徴のうちの１つ以上を含む、本発明の微生物細胞を選択又は同定するためのプロセスを提供し、プロセスは、
（ｉ）本明細書に定義された１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む微生物細胞からの脂質を分析するステップと、
（ｉｉ）微生物細胞を選択又は同定するステップと、を含む。
本発明の脂質又は本発明の微生物細胞のうちの１つ以上を含む組成物も提供される。
一実施形態において、組成物は、本発明の細胞以外の供給源からの少なくとも１つの他の脂質を含む。
更なる態様において、本発明は、本発明の抽出された脂質、本発明の微生物細胞、又は本発明の組成物のうちの１つ以上、及び少なくとも１つの他の食品成分を含む、食品又は飼料を提供する。
一実施形態において、食物又は飼料は、動物に由来する成分を有しない。
別の態様において、本発明は、食品又は飼料を生成する方法を提供し、方法は、本発明の抽出された脂質、本発明の微生物細胞、又は本発明の組成物のうちの１つ以上を、少なくとも１つの他の食品成分と混合することを含む。
本明細書の任意の実施形態は、特に明記しない限り、任意の他の実施形態に準用されると解釈されるものとする。
本発明は、例示のみを目的とする本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。機能的に等価な製品、組成物、及び方法は、本明細書に記載されるように、明らかに本発明の範囲内である。
本明細書全体を通して、特に別段の定めがない限り、又は文脈上別段の定めが必要でない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップの群、又は物質の組成物の群は、それらのステップ、物質の組成物、ステップの群、又は物質の組成物の群のうちの１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含するものと解釈されるものとする。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって、及び添付の図面を参照して以下に説明される。
ＤＧＡＴ遺伝子で形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の油分。
配列表への鍵
配列番号１：ニシキギ１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール：アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥａＤＡｃＴ）のアミノ酸配列。
配列番号２：ｐＡＴ００１におけるニシキギ１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール：アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥａＤＡｃＴ）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号３：Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ（ヤギ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ１（ＣｈＤＧＡＴ１－Ｘ１）のアミノ酸配列。
配列番号４：ｐＡＴ００２におけるＣａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ（ヤギ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ１（ＣｈＤＧＡＴ１－Ｘ１）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号５：Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ（ヤギ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ２（ＣｈＤＧＡＴ１－Ｘ２）のアミノ酸配列。
配列番号６：ｐＡＴ００３におけるＣａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ（ヤギ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ２（ＣｈＤＧＡＴ１－Ｘ２）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号７：Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ（ヒツジ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ１（ＯａＤＧＡＴ１－Ｘ１）のアミノ酸配列。
配列番号８：ｐＡＴ００４におけるＯｖｉｓ ａｒｉｅｓ（ヒツジ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ１（ＯａＤＧＡＴ１－Ｘ１）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号９：Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ（ヒツジ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ２（ＯａＤＧＡＴ１－Ｘ２）のアミノ酸配列。
配列番号１０：ｐＡＴ００５におけるＯｖｉｓ ａｒｉｅｓ（ヒツジ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ２（ＯａＤＧＡＴ１－Ｘ２）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号１１：Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ１（ＢｔＤＧＡＴ１－Ｘ１）のアミノ酸配列。
配列番号１２：ｐＡＴ００６におけるＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ１（ＢｔＤＧＡＴ１－Ｘ１）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号１３：Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ２（ＢｔＤＧＡＴ１－Ｘ２）のアミノ酸配列。
配列番号１４：ｐＡＴ００７におけるＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ２（ＢｔＤＧＡＴ１－Ｘ２）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号１５：Ｂｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ１（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ１）のアミノ酸配列。
配列番号１６：ｐＡＴ００８におけるＢｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ１（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ１）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号１７：Ｂｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ２（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ２）のアミノ酸配列。
配列番号１８：ｐＡＴ００９におけるＢｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ２（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ２）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号１９：Ｂｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ３（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ３）のアミノ酸配列。
配列番号２０：ｐＡＴ０１０におけるＢｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ３（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ３）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号２１：Ｂｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ４（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ４）のアミノ酸配列。
配列番号２２：ｐＡＴ０１１におけるＢｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ４（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ４）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号２３：Ｂｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ５（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ５）のアミノ酸配列。
配列番号２４：ｐＡＴ０１２におけるＢｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ５（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ５）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号２５：Ｂｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ６（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ６）のアミノ酸配列。
配列番号２６：ｐＡＴ０１３におけるＢｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ６（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ６）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号２７：Ｂｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ７（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ７）のアミノ酸配列。
配列番号２８：ｐＡＴ０１４におけるＢｕｂｕｌｕｓ ｂｕｂｕｌｉｓ（スイギュウ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１アイソフォームＸ７（ＢｂＤＧＡＴ１－Ｘ７）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
配列番号２９：Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１泌乳アイソフォームＸ１（ＢｔＤＧＡＴ１ｌａｃ）のアミノ酸配列。
配列番号３０：ｐＡＴ０１９におけるＢｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ１泌乳アイソフォームＸ１（ＢｔＤＧＡＴ１ｌａｃ）のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列、酵母における発現に最適化されたコドン。
一般的な技術及び標準的な定義
別段に具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、発酵、分子遺伝学、タンパク質化学、及び生化学での）によって一般的に理解されるものと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
別段の指示がない限り、本発明で利用される組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技法は、当業者に周知の標準的な手順である。そのような技法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、ＴＡ．Ｂｒｏｗｎ（編者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ１ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ及びＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編者），ＤＮＡクローニング：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ１～４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５及び１９９６）、並びにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての更新を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全ての更新を含む）などのソースの文献全体で記載及び説明される。
用語「及び／又は」、例えば「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味するものと理解され、両方の意味又はいずれかの意味の明示的な支持を提供すると解釈されるものとする。
本明細書で使用される場合、反対に述べられない限り、約という用語は、指定値の＋／－２０％、より好ましくは＋／－１０％を指す。
本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群の除外を意味するものではないことを理解されたい。
選択された定義
本明細書で使用される場合、「脂質」は、エステル化又は非エステル化され得る脂肪酸、又はそれらの誘導体であり、水に不溶性であるが、有機溶媒、例えばクロロホルムに可溶性である、又はそれらを含む有機化合物のクラスのいずれかである。本明細書で使用される場合、用語「抽出された脂質」は、微生物細胞から抽出された脂質組成物を指す。抽出された脂質は、例えば、細胞を溶解させることによって得られる比較的粗製の組成物、又は細胞に由来する水、核酸、タンパク質、及び炭水化物のうちの１つ以上又は各々の大部分（全てではないが）が除去されているより精製された組成物であり得る。精製方法の例を以下に記載する。一実施形態において、抽出された脂質は、組成物の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％（ｗ／ｗ）の脂質を含む。脂質は、室温（２５℃）で固体であっても液体であってもよく、又は２つの混合物であってもよく、液体であれば油とみなされ、固体であれば脂肪とみなされる。一実施形態において、抽出された本発明の脂質は、別の供給源（例えば、動物脂質）によって生成される別の脂質とブレンドされていない。あるいは、抽出された脂質は、例えば、大豆油、キャノーラ油、トウモロコシ油、パーム油、ココナッツ油、綿実油、又はそれらの任意の組み合わせなどの植物油などのＴＡＧのｓｎ－３位にＳＣＦＡを含まない、異なる脂質とブレンドされ得る。一実施形態において、抽出後、細胞内の比と比較して、他の脂肪酸に対するＳＣＦＡの比が有意に変化していない（例えば、１０％又は５％以下の変化）、及び／又はＴＡＧ分子内のＳＣＦＡの位置分布を修飾する方式で、例えば、インターエステル化又はトランスエステル化によって、脂質が処理されていない。別の実施形態において、抽出された脂質は、インタクトな細胞内の比と比較したときに他の脂肪酸に対するＳＣＦＡの比を変化させ得るか、又は脂質の総脂肪酸含有量の飽和度を変化させる水素化又は分画などの手順に曝露されていない。一実施形態において、脂質は、トランス脂肪酸を本質的に含まず、例えば、総脂肪酸含有量の０．５重量％未満がトランス脂肪酸である。本発明の抽出された脂質が油中に含まれる場合、油は、ステロールなどの非脂肪酸分子を更に含み得る。一実施形態において、脂質は、本質的にコレステロールを含まず、例えば、脂質の０．５重量％未満又は０．２５重量％未満がコレステロールである。
本明細書で使用される場合、用語「非極性脂質」は、有機溶媒に可溶性であるが水に不溶性であり、ｐＨ５～７で荷電されていない脂肪酸及びその誘導体を指す。非極性脂質には、極性脂質のタイプであるリン脂質、ガラクト脂質、及びスフィンゴ脂質が含まれない。典型的には、非極性脂質は、エタノールに可溶性ではないか、又は非常にわずかに可溶性である。脂肪酸は、遊離脂肪酸及び／又はエステル化形態であり得る。エステル化形態の例には、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）が含まれるが、これらに限定されない。非極性脂質には、ステロール、ステロールエステル、及びワックスエステルも含まれる。非極性脂質はまた、「中性脂質」としても知られているか、又はいくつかの文脈において、「油」と称される。非極性脂質は、非極性脂質中の脂肪酸の不飽和度に応じて、室温において液体、又は固体であり得る。典型的には、飽和脂肪酸含有量が多いほど、脂質の融解温度が高い。
本明細書で使用される場合、「油」は、主に脂質を含み、室温で液体である組成物である。例えば、本発明の油は、好ましくは、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、又は少なくとも９０重量％の脂質を含む。典型的には、精製油は、油中の脂質の少なくとも９０重量％のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、好ましくは、少なくとも９５重量％、少なくとも９６重量％、少なくとも９７重量％、少なくとも９８重量％のＴＡＧを含む。ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、リン脂質、及びステロールなどの油の微量成分が、本明細書に記載されるように存在し得る。
本明細書で使用される場合、「脂肪酸」という用語は、多くの場合、飽和又は不飽和のいずれかの長い脂肪族尾部を有するカルボン酸（又は有機酸）を指す。不飽和脂肪酸としては、一価不飽和脂肪酸及び多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が挙げられる。脂肪酸は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）であってもよく、又はグリセロール又はグリセロール－リン酸分子、ＣｏＡ分子、又は当該技術分野で既知の他のヘッド基にエステル化されていてもよく、好ましくはＴＡＧ分子の一部としてエステル化されている。
本明細書で使用される場合、「短鎖脂肪酸」又は「ＳＣＦＡ」という用語は、Ｃ２：０、Ｃ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０などの長さが２、４、６、又は８個の炭素原子の炭素－炭素結合鎖を有する脂肪酸を指す。典型的には、本発明の脂質中のＳＣＦＡは、飽和しており、すなわち、それらのアシル鎖に任意の炭素－炭素二重結合を有さず、非分岐アシル鎖を有する。本明細書で使用されるＳＣＦＡは、それらのアシル鎖に９個以上の炭素原子を有する脂肪酸を含まない。本明細書で使用される場合、「中鎖脂肪酸」又は「ＭＣＦＡ」という用語は、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１２：１、Ｃ１４：０、及びＣ１４：１などの長さが１０～１４個の炭素原子の炭素－炭素結合鎖を有する脂肪酸を指し、典型的には、Ｃ１０、Ｃ１２、及びＣ１４脂肪酸の混合物が本発明の脂質に存在する。典型的には、本発明の脂質中のＭＣＦＡは、飽和若しくは一価不飽和のいずれかであるか、又は好ましくは、本発明の脂質は、飽和及び一価不飽和のＭＣＦＡの両方を含み、非分岐アシル鎖を有する。本明細書で使用されるＭＣＦＡは、それらのアシル鎖に１０個未満又は１４個超の炭素原子を有する脂肪酸を含まない。本明細書で使用される場合、「長鎖脂肪酸」又は「ＬＣＦＡ」という用語は、Ｃ１５：０、Ｃ１６：０、Ｃ１６：１、Ｃ１７：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、及びＣ１８：３脂肪酸などの、１５～１９個の炭素原子の長さの炭素－炭素結合鎖を有する脂肪酸を指す。典型的には、本発明の脂質中のＬＣＦＡは、飽和ＬＣＦＡと単不飽和ＬＣＦＡの両方を含み、非分岐アシル鎖を有する。典型的には、本発明の脂質は、いくつかの長鎖ＰＵＦＡ（ＬＣ－ＰＵＦＡ）を含み、主にＣ１８：２、好ましくは総脂肪酸含有量の５％未満、より好ましくは脂質の総脂肪酸含有量の３％未満又は２％未満がＬＣ－ＰＵＦＡである。本明細書で使用されるＬＣＦＡは、それらのアシル鎖に１５個未満又は１８個超の炭素原子を有する脂肪酸を含まない。
「飽和脂肪酸」は、鎖に沿ったいかなる二重結合又は他の官能基も含有しない。「飽和」という用語は、全ての炭素（カルボン酸［－ＣＯＯＨ］基を除く）が可能な限り多くの水素を含有する点で、水素を指す。
「不飽和脂肪酸」は、１つ以上のアルケン官能基が鎖に沿って存在し、各アルケンが鎖の単結合の「－ＣＨ２－ＣＨ２－」部分を二重結合の「－ＣＨ＝ＣＨ－」部分（すなわち、別の炭素に二重結合した炭素）で置換することを除いて、飽和脂肪酸に類似した形態である。二重結合のいずれかの側に結合する鎖中の次の２つの炭素原子は、シス又はトランスの立体配置で、好ましくはシス立体配置で生じ得る。
本明細書で使用される場合、「一価不飽和脂肪酸」という用語は、その炭素鎖に少なくとも１２個の炭素原子を含み、かつ鎖に１つのアルケン基（炭素－炭素二重結合）のみを含む脂肪酸を指す。一価不飽和脂肪酸としては、Ｃ１２：１Δ９、Ｃ１４：１Δ９、Ｃ１６：１Δ９、Ｃ１８：１Δ９、及びＣ１８：１Δ１１が挙げられ、これらは各々、本発明の脂質のＴＡＧ分子に存在し得る。本明細書で使用される場合、用語「多価不飽和脂肪酸」又は「ＰＵＦＡ」は、その炭素鎖に少なくとも１２個の炭素原子、及び少なくとも２個のアルケン基（炭素－炭素二重結合）を含む脂肪酸を指す。ＰＵＦＡには、Ｃ１８：２Δ９，１２及びＣ１８：３ Δ９，１２，１５が含まれ、これらは各々、本発明の脂質のＴＡＧ分子に存在し得る。
本明細書で使用される場合、「Ｃ４：０」は、エステル化又は非エステル化のいずれかである酪酸を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｃ６：０」は、エステル化又は非エステル化のいずれかであるカプロン酸を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｃ８：０」は、エステル化又は非エステル化のいずれかであるカプリル酸を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１０：０」は、エステル化又は非エステル化のいずれかであるカプリン酸を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１２：０」は、エステル化又は非エステル化のいずれかであるラウリン酸を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１４：０」は、エステル化又は非エステル化のいずれかであるミリスチン酸を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１５：０」は、エステル化又は非エステル化のいずれかであるｎ－ペンタデカン酸を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１６：１」は、ω－７一価不飽和脂肪酸である、エステル化又は非エステル化のいずれかのパルミトレイン酸、又はヘキサデカン－９－エン酸を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｃ１６：０」は、エステル化又は非エステル化のいずれかであるパルミチン酸を指す。
本明細書で使用される場合、「総脂肪酸（ＴＦＡ）含有量」という用語又はその変形は、細胞内の脂肪酸の総量を、細胞の重量のパーセンテージとして重量ベースで指す。別段の指定がない限り、細胞の重量は乾燥重量である。ＴＦＡ含有量は、ＧＣ中の定量基準として既知の量の特徴的な脂肪酸標準物質の添加を用いて、ＦＡＢＥへの脂肪酸の変換及びＧＣによるＦＡＢＥの量の測定によって測定する（実施例１を参照）。したがって、ＴＦＡは、脂質中の脂肪酸及びそれらの連結部分の重量ではなく、単に脂肪酸の重量を表す。
「トリアシルグリセリド」又は「ＴＡＧ」は、グリセロールが３つの脂肪酸でエステル化されたグリセリドであり、これらは、同じであるか（例えば、トリオレインのように）、又はより一般的には異なる場合がある。脂肪酸のうちの３つ全てが異なる場合があり、又は脂肪酸のうちの２つが同じである場合があり、かつ第３の脂肪酸が異なる。ＴＡＧ合成のケネディ経路では、上記のようにＤＡＧが形成され、次いで、第３のアシル基がＤＧＡＴの活性によってグリセロール骨格にエステル化される。
「ジアシルグリセリド」又は「ＤＡＧ」は、グリセロールが、同じか、又は好ましくは異なる場合がある２つの脂肪酸でエステル化されたグリセリドである。本明細書で使用される場合、ＤＡＧは、ｓｎ－１、３、又はｓｎ－２位にヒドロキシル基を含み、したがって、ＤＡＧは、ＰＡ又はＰＣなどのリン酸化分子を含まない。ＤＡＧ合成のケネディ経路において、前駆体ｓｎ－グリセロール－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）は、ｓｎ－１位のグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）によって触媒される第１の反応において、各々、脂肪酸補酵素Ａエステルに由来する２つのアシル基にエステル化されて、ＬｙｓｏＰＡを形成し、続いて、ｓｎ－２位の第２のアシル化が、リソホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）によって触媒されて、ホスファチジン酸（ＰＡ）を形成する。次いで、この中間体は、ＰＡＰによって脱リン酸化されて、ＤＡＧを形成する。
「モノアシルグリセリド」又は「ＭＡＧ」は、グリセロールが１つの脂肪酸でエステル化されたグリセリドである。本明細書で使用される場合、ＭＡＧは、ｓｎ－１／３（ｓｎ－１ＭＡＧ又は１－ＭＡＧ又は１／３－ＭＡＧとも称される）又はｓｎ－２位（本明細書において２－ＭＡＧとも称される）にヒドロキシル基を含み、したがって、ＭＡＧは、ＰＡ又はＰＣなどのリン酸化分子を含まない。
本明細書で使用される場合、用語「トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量」又はその変形は、文脈に従って、細胞内又は抽出された脂質内のＴＡＧの量を指す。ＴＡＧ含有量は、グリセロール及び脂肪族アシル部分の合計などの当該技術分野で既知の技法を使用して、関係式：重量％ＴＡＧ＝１００倍（（４１倍総モルＦＡＭＥ／３）＋（総ｇ ＦＡＭＥ－（１５倍総モルＦＡＭＥ））／ｇ、式中、４１及び１５は、それぞれ、グリセロール部分及びメチル基の分子量である（式中、ＦＡＭＥは、脂肪酸メチルエステルである）を使用して計算することができる。
本明細書で使用される場合、「脂肪酸アシルトランスフェラーゼ」という用語は、アシル基をアシル－ＣｏＡ、ＰＣ、又はアシル－ＡＣＰ、好ましくはアシル－ＣｏＡ又はＰＣから基質上に移して、ＴＡＧ、ＤＡＧ、又はＭＡＧを形成することができるタンパク質を指す。これらのアシルトランスフェラーゼとしては、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、及びＤＡｃＴなどのＤＧＡＴ、並びにＬＰＡＡＴが挙げられる。他のアシルトランスフェラーゼは、ＰＤＡＴ、ＬＰＣＡＴ、及びＭＧＡＴである。
本明細書で使用される場合、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＥＣ２．３．１．２０；ＤＧＡＴ）という用語は、脂肪族アシル基をアシル－ＣｏＡからジアシルグリセロール基質に移して、トリアシルグリセロールを生成するタンパク質を指す。したがって、アシルＣｏＡ及びＤＡＧ分子は、ＤＧＡＴの基質であり、ＴＡＧは、ＤＧＡＴの生成物のうちの１つである。したがって、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、トリアシルグリセロールを生成するためのアシルＣｏＡのジアシルグリセロールへの移行を指す。ＤＧＡＴは、それぞれＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、及びＤＧＡＴ３と称される３つの既知のタイプがある。ＤＧＡＴ酵素のアミノ酸配列には、本明細書に開示されるもの及びその変異体が含まれる。
本明細書で使用される場合、「１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール：アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ」又はＤＡｃＴ」という用語は、アセチル基をＤＡＧのｎ－３位に移して、それによってＴＡＧを形成することができるＤＧＡＴのサブクラスを指す。ＤＡｃＴはまた、例えば、Ｃ４：０－ＣｏＡ及び／又はＣ６：０－ＣｏＡなどの他のアシル－ＣｏＡ分子からアシル基を移すことができる場合もある。
本明細書で使用される場合、「油性」細胞は、乾燥重量ベースで細胞質量の１０％～７０％又は２０％～７０％などの多量のＴＡＧを保存することができる細胞である。ＴＡＧ含有量は、当該技術分野で知られているように、培養条件に依存し得る。
本明細書で使用される場合、「異栄養」細胞は、代謝及び成長のための炭素源として有機材料を利用することができる細胞である。異栄養生物はまた、好適な条件下で自己栄養的に増殖することができる場合もある。
本明細書で使用される場合、「発酵」は、酸素が不足しているか、又は空気と比較して酸素レベルが低下している条件下で、細胞内の酵素の作用を通じて有機基質に化学変化を生じさせる代謝プロセスを指す。微生物において、発酵は、嫌気的に有機栄養素の分解によってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成する主要な手段である。
微生物細胞
多種多様な異なる微生物細胞を本発明で使用することができる。一実施形態において、微生物細胞は、単一の細胞生物として存在するが、かかる細胞は一緒に凝集し得る。本発明の微生物細胞の例としては、真菌細胞、細菌細胞、及び藻類細胞が挙げられる。真核微生物は、細菌（原核生物）微生物よりも好ましい。本明細書で使用される場合、「微生物細胞」、「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」、及び「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、同じものを意味する。
一実施形態において、微生物細胞は、発酵に好適である。別の実施形態において、微生物細胞は、油性細胞である。別の実施形態において、微生物細胞は、異栄養細胞である。微生物細胞は、好ましくはこれらのうちの少なくとも２つであり、より好ましくは、これらの３つの特徴のうちの全てを特徴とする。
一実施形態において、真菌細胞は、酵母細胞である。本発明に有用な酵母細胞の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ属、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどのＰｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａなどのＣａｎｄｉｄａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓなどのＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉなどのＬｉｐｏｍｙｃｅｓ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ Ｙ４などのＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓなどのＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属、及びＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓなどのＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、真菌細胞は、カビ細胞である。本発明に有用なカビ細胞の例としては、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｅｃｈｉｎｕｌａｔｅなどのＣｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ 属、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ又はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａなどのＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ ｆｕｎｇｉなどのＭｕｃｏｒａｌｅｓ属、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ Ｑ２－３７などのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、細胞は、細菌細胞である。本発明に有用な細菌細胞の例としては、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１（ＭＴ）などのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ ＳＫ２などのＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７ＲｖなどのＤＧ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属などのＧｏｒｄｏｎｉａ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｇｌｏｂｅｒｕｌａ ４３２などのＮｏｃａｒｄｉａ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ ＰＤ６３０などのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＴＲ０９５８又はＴＲ０１２３などのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、細胞は、微小藻類、又は珪藻綱細胞などの藻類細胞である。本発明に有用な藻類細胞の例としては、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓなどのＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ属、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、又はＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ ＹＳＲ０３などのＣｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ株ＦＣＣ－１３２４などの Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ属、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓなどのＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属、株ＵＴＥＸ ＃１１８５などのＮｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｌｅａｂｕｎｄａｎｓなどのＮｅｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓなどのＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｈｕｉ又はＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｔｅｔｒａｔｈｅｌｅなどのＴｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ属、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ ＣＳ１７８、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ、又はＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉなどのＣｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ属、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｃｆ．ｐｕｓｉｌｌａ ＹＳＲ０２などのＮｉｔｚｓｃｈｉａ属、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ Ｆ＆Ｍ－Ｍ４０などのＰｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ属、株ＣＳ２５２などのＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ属、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ ＣＳ１７３などのＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉなどのＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ属、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｚｈａｎｇｊｉａｎｇｅｎｓｉｓなどのＩｓｏｃｈｒｙｓｉｓ属、株ＮＣＴＵ－３などのＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａなどのＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属、Ｐａｖｌｏｖａ ｓａｌｉｎａ ＣＳ４９などのＰａｖｌｏｖａ属、Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ属、及びＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｗｅｉｓｓｆｌｏｇｉｉなどのＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ属が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリペプチド
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、概して互換的に使用される。
ポリペプチド、又はポリペプチドのクラスは、そのアミノ酸配列の参照アミノ酸配列に対する同一性（％同一性）の程度によって、又はある参照アミノ酸配列に対する同一性％が他の参照アミノ酸配列に対するよりも大きいことによって定義され得る。参照アミノ酸配列に対するポリペプチドの％同一性は、典型的には、ギャップ形成ペナルティ＝５、及びギャップ伸長ペナルティ＝０．３のパラメータを有するＧＡＰ分析（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０；ＧＣＧプログラム）によって決定される。クエリ配列は、少なくとも１００アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインメントする。更に好ましくは、クエリ配列は少なくとも２５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも２５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインメントする。更により好ましくは、ＧＡＰ分析は、参照アミノ酸配列の全長にわたって２つの配列をアラインメントする。ポリペプチド、又はポリペプチドのクラスは、参照ポリペプチドと同じ酵素活性を有してもよく、参照ポリペプチドとは異なる活性を有してもよく、又は参照ポリペプチドの活性を欠いてもよい。好ましくは、ポリペプチドは、参照ポリペプチドの活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、又は少なくとも９０％の酵素活性を有する。
本明細書に定義されるポリヌクレオチドは、アシルトランスフェラーゼなどの酵素の生物学的に活性な断片をコードし得る。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な」断片は、本明細書に定義されるポリペプチドの一部分であって、例えば、デサチュラーゼ活性及び／若しくはエロンガーゼ活性、又は他の酵素活性を有する、全長参照ポリペプチドの定義された活性を維持する部分である。本明細書で使用される生物学的に活性な断片は、全長ポリペプチドを除外する。生物学的に活性な断片は、定義された活性を維持する限り、任意のサイズの部分であり得る。好ましくは、生物学的に活性な断片は、全長タンパク質の活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、又は少なくとも９０％を維持する。
定義されたポリペプチド又は酵素に関して、本明細書に提供されるものよりも高い同一性％の数値は、好ましい実施形態を包含することを理解されたい。したがって、該当する場合、最低％同一性の数字に照らして、ポリペプチド／酵素が、少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、更により好ましくは少なくとも９９．９％、関連する指名配列番号と同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。一実施形態において、上に列挙される範囲の各々について、％同一性は、１００％を含まない、すなわち、アミノ酸配列は、指名配列番号とは異なる。
本明細書に定義されるポリペプチドのアミノ酸配列変異体／突然変異体は、本明細書に定義される核酸に、適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又は所望のポリペプチドのインビトロ合成によって調製することができる。かかる変異体／突然変異体として、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、又は置換が挙げられる。最終ペプチド生成物が所望の酵素活性を有することを条件に、欠失、挿入、及び置換の組み合わせを行い、最終構築物に到達させることができる。
突然変異体（改変された）ペプチドは、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して調製することができる。例えば、本明細書に定義されるポリヌクレオチドは、Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）によって広く説明されるように、インビトロ突然変異誘発又はＤＮＡシャッフリング技術に供することができる。突然変異した／改変されたＤＮＡに由来する生成物は、本明細書に記載される技術を使用して容易にスクリーニングして、それらが、例えば、デサチュラーゼ又はエロンガーゼ活性を有するかどうかを決定することができる。
アミノ酸配列突然変異体の設計において、突然変異部位の場所及び突然変異体の性質は、修飾される特徴に依存する。突然変異体のための部位は、例えば、（１）まず、保存的アミノ酸選択で置換し、次いで、達成された結果に応じて、よりラジカル的な選択で置換すること、（２）標的残基を欠失させること、又は（３）位置する部位に隣接する他の残基を挿入することによって、個別に又は連続して修飾することができる。
アミノ酸配列欠失は、概して、約１～１５残基、より好ましくは、約１～１０残基、及び典型的には、約１～５連続残基の範囲である。
置換突然変異体は、ポリペプチド分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入される。置換突然変異誘発のための最大の関心部位には、天然に存在するデサチュラーゼ又はエロンガーゼの間で保存されていない部位が含まれる。これらの部位は、好ましくは、酵素活性を維持するために、比較的保存的な方法で置換される。そのような保存的置換は、「例示的置換」の見出しで表１に示される。
好ましい実施形態において、突然変異体／変異体ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドと比較して、１つ又は２つ又は３つ又は４つの保存的アミノ酸変化のみを有するか、又はそれ以下を有する。保存的アミノ酸変化の詳細が、表３に提供される。当業者が認識するように、そのようなわずかな変化は、組換え細胞内で発現したときにポリペプチドの活性を変化させないことが合理的に予測され得る。
ポリヌクレオチド
本発明は、例えば、遺伝子、単離されたポリヌクレオチド、キメラＤＮＡなどのキメラ遺伝子構築物であり得る、ポリヌクレオチドの使用も提供する。ゲノム又は合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、二本鎖又は一本鎖であってもよく、炭水化物、脂質、タンパク質、又は他の物質と組み合わせて、本明細書に定義される特定の活性を行ってもよい。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、「核酸分子」という用語と互換的に使用される。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、非天然に存在する。非天然に存在するポリヌクレオチドの例には、微生物細胞における発現のためにコドン最適化されたもの、突然変異されたもの（例えば、本明細書に記載の方法を使用することによって）、及びタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、タンパク質が天然に会合していないプロモーターに作動可能に連結されているポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の構築物において）が含まれるが、これらに限定されない。
Figure 2023518329000001
本明細書で使用される場合、「キメラＤＮＡ」又は「キメラ遺伝子構築物」又は同様のものは、本明細書において「ＤＮＡ構築物」とも称される、その天然位置における天然ＤＮＡ分子ではない任意のＤＮＡ分子を指す。典型的には、キメラＤＮＡ又はキメラ遺伝子は、自然界で一緒に作用可能に連結されていない、すなわち互いに異種である調節及び転写又はタンパク質コード配列を含む。したがって、キメラＤＮＡ又はキメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来するが、天然に見られるものとは異なる方法で配置された調節配列及びコード配列を含み得る。
ポリヌクレオチドの文脈における「外因性」という用語は、その天然状態と比較して変化した量で細胞内に存在するときのポリヌクレオチドを指す。一実施形態において、細胞は、天然にポリヌクレオチドを含まない細胞である。しかしながら、細胞は、コードされたポリペプチドの生成量の変化をもたらす非内因性ポリヌクレオチドを含む細胞であり得る。外因性ポリヌクレオチドは、それが存在するトランスジェニック（組換え）細胞又は無細胞発現系の他の構成要素から分離されていないポリヌクレオチドと、その後少なくともいくつかの他の構成要素から離れて精製される、かかる細胞又は無細胞系において生成されるポリヌクレオチドと、を含む。外因性ポリヌクレオチド（核酸）は、自然界に存在するヌクレオチドの連続した伸長物であってもよく、又は単一のポリヌクレオチドを形成するように連結された異なる供給源（天然に存在する及び／又は合成的な）からのヌクレオチドの２つ以上の連続した伸長物を含むことができる。典型的には、かかるキメラポリヌクレオチドは、対象となる細胞におけるオープンリーディングフレームの転写を駆動するのに好適なプロモーターに作動可能に連結されたポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを少なくとも含む。
定義されたポリヌクレオチドに関して、上で提供されたものよりも高い同一性％の数値は、好ましい実施形態を包含することが理解される。したがって、該当する場合、最低同一性％の数字に照らして、ポリヌクレオチドは、少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、更により好ましくは少なくとも９９．９％、関連する指名配列番号と同一であるポリヌクレオチド配列を含むことが好ましい。一実施形態において、上記に列挙される範囲の各々について、％同一性は１００％を含まない、すなわち、ヌクレオチド配列は、指名配列番号とは異なる。
ポリヌクレオチドは、天然に存在する分子と比較した場合、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、又は置換である１つ以上の突然変異体を有し得る。参照配列に対して突然変異体を有するポリヌクレオチドは、天然に存在する（すなわち、天然源から単離される）か、又は合成的である（例えば、上述のように、核酸に部位特異的変異誘発又はＤＮＡシャッフルを行うことによって）ことができる。したがって、ポリヌクレオチドは、天然に存在する供給源又は組換えのいずれかに由来することができることが明らかである。好ましいポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知であるように、微生物細胞での翻訳のためにコドン最適化されるコード領域を有するものである。
組み換えベクター
組換え発現を使用して、本発明の組換え細胞を生成することができる。組換えベクターは、異種ポリヌクレオチド配列、すなわち、好ましくは、ポリヌクレオチド分子が由来する種以外の種に由来する、本明細書に定義されるポリヌクレオチド分子に天然に隣接して見出されないポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり得、典型的にはプラスミドである。プラスミドベクターは、典型的には、原核細胞、例えば、ｐＹＥＳ由来ベクター、ｐＵＣ由来ベクター、ｐＳＫ由来ベクター、ｐＧＥＭ由来ベクター、ｐＳＰ由来ベクター、又はｐＢＳ由来ベクターにおける発現カセットの容易な選択、増幅、及び形質転換をもたらす追加の核酸配列を含む。好適な酵母発現ベクターは、ｐＰＩＣシリーズのベクター、酵母積分プラスミド（ＹＩｐ）、酵母複製プラスミド（ＹＲｐ）、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）、及び酵母エピソームプラスミド（ＹＥｐ）を含む。追加の核酸配列は、ベクターの自律的複製を提供するための複製起点、好ましくは抗生物質又は除草剤耐性をコードする選択可能なマーカー遺伝子、核酸配列又は核酸構築物にコードされる遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する独自の複数のクローニング部位、及び微生物細胞の形質転換を促進する配列を含む。組換えベクターは、本明細書に定義される１つを超えるポリヌクレオチド、例えば、本明細書に定義される３つ、４つ、５つ、又は６つのポリヌクレオチドを組み合わせて、好ましくは本明細書に記載されるキメラ遺伝子構築物を含んでもよく、各ポリヌクレオチドは、細胞において作動可能である発現制御配列に作動可能に連結されている。
「作用可能に連結された」は、本明細書で使用される場合、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、転写調節要素（プロモーター）と転写配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーターは、適切な細胞におけるコード配列の転写を刺激又は調節する場合、本明細書に定義されるポリヌクレオチドなどのコード配列に作動的に連結されている。一般に、転写配列に作動可能に連結されているプロモーター転写調節要素は、転写配列に物理的に連続しており、すなわち、それらはシス作動性である。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの転写調節要素は、物理的に連続しているか、又はそれらが転写を増強するコード配列に近接して位置する必要はない。例えば、５’ＵＴＲ配列中又はタンパク質コード領域の５’末端に向かうイントロンは、転写エンハンサーを含有し得、増加した発現レベル、例えば、ＦＢＡＩＮプロモーター領域を提供する。
形質転換体の同定を容易にするために、核酸構築物は、好ましくは、外来性又は外因性ポリヌクレオチドとして、又はそれに加えて、選択可能又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む。「マーカー遺伝子」とは、マーカー遺伝子を発現する細胞に、明確な表現型を付与する遺伝子を意味し、したがって、そのような形質転換された細胞を、マーカーを有しない細胞と区別することを可能にする。選択可能なマーカー遺伝子は、選択的薬剤（例えば、除草剤、抗生物質、放射線、熱、又は非形質転換細胞に損傷を与える他の処理）に対する耐性に基づいて「選択」することができる形質を付与する。スクリーニング可能なマーカー遺伝子（又はレポーター遺伝子）は、観察又は試験、すなわち、「スクリーニング」（例えば、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、又は非形質転換細胞に存在しない他の酵素活性）によって同定することができる形質を付与する。目的のマーカー遺伝子及びヌクレオチド配列は、連結される必要はない。マーカーの実際の選択は、選択された細胞と組み合わせて機能的（すなわち、選択的）である限り重要ではない。
選択可能なマーカーの例は、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性、好ましくはカナマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。
本発明の組換え酵母は、ガラクトシダーゼ又は選択可能な成長マーカーのいずれかをコードするレポーター遺伝子を含み得る。
「ガラクトシダーゼ」は、様々な基質から末端ガラクトース残基を切断し、また基質を切断して、検出可能なシグナルを生成することができる任意の酵素であり得る。一実施形態において、ガラクトシダーゼは、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来）ＬａｃＺなどのβ－ガラクトシダーゼである。代替的な実施形態において、ガラクトシダーゼは、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｍｅｌ－１などのα－ガラクトシダーゼである。β－ガラクトシダーゼ活性は、切断後に強烈な青色生成物を形成するＸ－ｇａｌ（５－ブロモ－４－クロロ－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド）、切断後に最大吸光度が約４２０ｎｍである水溶性黄色染料を形成するＯＮＰＧ（ｏ－ニトロフェニルガラクトシド）、及び切断後に分光光度法によって測定可能な水溶性赤色生成物を生じるＣＰＲＧ（クロロフェノールレッド－β－Ｄ－ガラクトピラノシド）などの酵素の基質を使用して検出され得る。α－ガラクトシダーゼ活性は、切断後にインディゴ色素を形成するｏ－ニトロフェニルα－Ｄ－ガラクトピラノシド、及び切断後に分光光度法によって測定可能な赤色生成物を生じるクロロフェノールレッド－α－Ｄ－ガラクトピラノシドなどの酵素の基質を使用して検出され得る。酵母におけるガラクトシダーゼ発現を検出するためのキットは、市販されており、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのβ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）発現キットである。
好ましくは、選択可能な成長マーカーは、栄養マーカー又は抗生物質耐性マーカーである。
典型的な酵母選択性栄養マーカーには、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＳＦＡ１、ＡＤＥ２、ＭＥＴ１５、ＬＹＳ５、ＬＹＳ２、ＩＬＶ２、ＦＢＡ１、ＰＳＥ１、ＰＤＩ１、及びＰＧＫ１が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、染色体欠失又は不活性化によって生存不可能な宿主がもたらされるいわゆる必須遺伝子のいずれの遺伝子も、例えば、ｐｇｋ１酵母株におけるＰＧＫ１について実証されるように、機能的遺伝子がプラスミド上に提供される場合、選択的マーカーとして使用することができることを理解するであろう。好適な必須遺伝子は、スタンフォードゲノムデータベース（ＳＧＤ）（ｈｔｔｐ：：／／ｄｂ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ）内に見出すことができる。欠失又は不活性化された場合に、補助栄養（生合成）要件をもたらさない任意の必須遺伝子産物（例えば、ＰＤＩ１、ＰＳＥ１、ＰＧＫ１、又はＦＢＡ１）は、例えば、プラスミドが存在しない場合に、その遺伝子産物を生成することができない酵母宿主細胞において、細胞を特定の選択的条件下で培養することを必要とする欠点なしに、増加したプラスミド安定性を達成するために、選択可能なマーカーとして使用することができる。「補助栄養（生合成）要件」によって、増殖培地への添加又は修飾によって補完され得る欠乏症を含む。
発現
発現ベクターは、微生物細胞における遺伝子発現を指示することができる。本明細書で使用される場合、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、かつ１つ以上の特定のポリヌクレオチド分子の発現をもたらすことができるベクターである。本発明に有用な発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製の起点、及び組換え細胞と適合性があり、かつ本発明のポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調節配列などの調節配列を含む。特に、本発明に有用なポリヌクレオチド又はベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター配列及びエンハンサー配列などの転写開始を制御する配列である。好適な転写制御配列には、本発明の組換え細胞のうちの少なくとも１つにおいて機能し得る任意の転写制御配列が含まれる。使用される調節配列の選択は、標的微生物細胞に依存する。そのような様々な転写制御配列は、当業者に既知である。
酵母細胞は、典型的には、化学的方法（例えば、Ｒｏｓｅら，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，及びＫａｗａｉ ｅ ｔ ａ ｌ．，２０１０に記載される）によって形質転換される。典型的には、細胞を酢酸リチウムで処理して、約１０４コロニー形成単位（形質転換細胞）／μｇのＤＮＡの形質転換効率を達成する。酵母を形質転換するための他の標準的な手順としては、ｉ）その名の通り、酵母スフェロプラストの生成に依存するスフェロプラスト法、ｉｉ）ＤＮＡでコーティングされた金属マイクロプロジェクションを細胞に撃ち込むバイオリスティック法、及びｉｉｉ）ガラスビーズを用いて酵母細胞の撹拌及び細胞に送達されるＤＮＡに依存するガラスビーズ法が挙げられる。もちろん、核酸を酵母細胞に導入するための任意の好適な手段を使用することができる。
外因性プラスミドを用いた酵母などの生物の形質転換は、コピー数の違い又は他の要因に起因して、形質転換遺伝子の浸透にクローン性の違いをもたらす可能性があることは周知である。したがって、スクリーニング中に好適な受容体＝リガンド対を同定する可能性を最大化するために、各形質転換受容体について２つ以上の独立したクローン分離株をスクリーニングすることが推奨される。異なるクローン分離株を独立してスクリーニングしてもよく、又はスクリーニングのために単一のウェルに組み合わせてもよい。後者のオプションは、比色レポーターではなく栄養レポーターが使用される場合に特に好都合であり得る。
「構成的プロモーター」とは、特定の増殖条件によって誘導される必要なしに、細胞内の作用可能に結合した転写配列の発現を指示するプロモーターを指す。本発明の酵母細胞に有用な構成的プロモーターの例としては、酵母ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、酵母ＡＤＨ－１（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、酵母ＥＮＯ（エノラーゼ）プロモーター、酵母グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーター、酵母ＰＹＫ－１（ピルビン酸キナーゼ）プロモーター、酵母翻訳伸長因子－１－アルファプロモーター（ＴＥＦ）プロモーター、及び酵母ＣＹＣ－１（シトクロムＣ－オキシダーゼプロモーター）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、酵母プロモーターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロモーターである。別の実施形態において、構成的プロモーターは、酵母に由来していない場合がある。本発明に有用なかかるプロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、グルココルチコイド応答要素、及びアンドロゲン応答要素が含まれるが、これらに限定されない。構成的プロモーターは、天然に存在する分子、又は例えば、プロモーター機能を廃止しない（好ましくは増強しない）１つ、２つ、若しくは３つのヌクレオチド置換を含むその変異体であり得る。
組換えＤＮＡ技術を使用して、例えば、宿主細胞内のポリヌクレオチド分子のコピー数、それらのポリヌクレオチド分子が転写される効率、得られる転写物が翻訳される効率、及び翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換ポリヌクレオチド分子の発現を改善することができる。本明細書に定義されるポリヌクレオチド分子の発現を増加させるのに有用な組換え技術には、１つ以上の宿主細胞染色体へのポリヌクレオチド分子の組み込み、ｍＲＮＡへの安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換又は修飾、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ配列）の置換又は修飾、宿主細胞のコドン使用に対応するポリヌクレオチド分子の修飾、及び転写物を不安定化する配列の欠失が含まれるが、これらに限定されない。
任意の方法を使用して、微生物細胞に核酸分子を導入することができ、多くのそのような方法が周知である。例えば、形質転換及びエレクトロポレーションは、酵母細胞に核酸を導入するための一般的な方法である（例えば、Ｇｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３、及びＢｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１を参照）。
一実施形態において、目的の遺伝子の微生物細胞における特定の染色体部位への組み込みは、相同組換えを介して生じる。この実施形態によれば、少なくとも１つのマーカー遺伝子及び／又は組み込まれる遺伝子（内部モジュール）を含むモジュールを含有する組み込みカセットは、標的組み込み部位（組換え遺伝子配列）の末端のものに相同なＤＮＡ断片によっていずれかの側に隣接される。適切な方法によって微生物細胞をカセットで形質転換した後、組換え配列間の相同組換えにより、内部モジュールが、組み込みカセットの組換え配列に対応するゲノムの２つの部位間の染色体領域を置き換え得る（Ｏｒｒ－Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１）。
一実施形態において、目的の遺伝子を微生物細胞に組み込むための組み込みカセットは、適切なプロモーターの制御下にある異種遺伝子と、異種遺伝子を微生物細胞染色体に組み込むための組換え遺伝子配列に隣接する選択可能なマーカーと、を含む。一実施形態において、異種遺伝子は、本明細書に記載されるアシルトランスフェラーゼ遺伝子のうちのいずれかを含む。
内因性遺伝子の欠失が所望される場合、組み込みカセットは、欠失の標的となる内因性遺伝子の末端（及び／又は隣接配列）のものに相同なＤＮＡ断片に隣接する選択可能なマーカー（任意の他の異種遺伝子配列なし）を含むことができる。内因性遺伝子を欠失又は変異させるのに好適な他の方法（例えば、部位特異的又はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを使用する）を以下に記載する。
選択可能なマーカー遺伝子は、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ｂａｒ、ｂｌｅ、ｈｐｈ、及びｋａｎを含むがこれらに限定されない、微生物細胞で使用される任意のマーカー遺伝子であり得る。組み換え遺伝子配列は、所望の用途に好適な所望の組み込み部位に応じて任意に選択することができる。
別の実施形態において、遺伝子の、微生物細胞の染色体への組み込みは、ランダム組み込みを介して生じ得る（Ｋｏｏｉｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
更に、一実施形態において、特定の導入されたマーカー遺伝子は、当業者に周知の技法を使用して、ゲノムから除去される。例えば、培地を含有するＦＯＡ（５－フルオロ－オルト酸）中にＵＲＡ３含有細胞を播種し、ＦＯＡ耐性コロニーを選択することにより、ＵＲＡ３マーカー損失を得ることができる（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。
本開示の微生物細胞内に含まれる外因性核酸分子は、任意の形態でその細胞内に維持することができる。例えば、外因性核酸分子は、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、又は娘細胞に安定的に受け継がれ得る（「遺伝的」）エピソーム状態で維持され得る。そのような染色体外の遺伝子要素（プラスミド、ミトコンドリアゲノムなど）は、娘細胞におけるそのような遺伝子要素の存在を確実にする選択マーカーを更に含有することができる。更に、微生物細胞は、安定的又は一過性に形質転換され得る。加えて、本明細書に記載の微生物細胞は、上記のような特定の外因性核酸分子の単一のコピー、又は複数のコピーを含有することができる。
細胞培養
効果的な培養条件は、当業者に既知であり、脂質生成を可能にする好適な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ、及び酸素条件を含むが、これらに限定されない。好適な培地は、細胞を培養して本明細書に定義される脂質を生成させる任意の培地を指す。かかる培地は、典型的には、同化可能な炭素、窒素、及びリン酸塩源、並びに適切な塩、鉱物、金属、及びビタミンなどの他の栄養素を有する水性培地を含む。本明細書で定義される細胞は、従来の発酵バイオリアクター、シェイクフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、及びペトリプレートで培養することができる。培養は、組換え細胞に適した温度、ｐＨ、及び酸素含有量で実行することができる。そのような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。
脂質抽出
本発明の微生物細胞からの脂質の抽出は、油性微生物からの脂質抽出について当該技術分野で既知のもの（例えば、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８に記載されているような）と類似の方法を使用する。一実施形態において、抽出は、有機溶媒（例えば、ヘキサン）が、少なくともバイオマスと混合される溶媒抽出によって行われ、好ましくは、バイオマスが、乾燥され研磨された後であるが、それはまた、湿潤条件下で行われ得る。溶媒は、細胞内で脂質を溶解し、その溶液は次いで、物理的作用（例えば、超音波処理）によってバイオマスから分離される。超音波診断は、微生物細胞の細胞の完全性を破壊するために最も広く使用されている前処理方法の１つである。他の前処理方法には、マイクロ波照射、高速均質化、高圧均質化、ビーズ拍動、オートクレーブ、及び熱分解が含まれ得る。次いで、有機溶媒を（例えば、蒸留によって）非極性脂質から分離することができる。この第２の分離ステップは、細胞から非極性脂質を得、従来の蒸気回収を用いる場合、再利用可能な溶媒を得ることができる。
溶媒抽出において、有機溶媒（例えば、ヘキサン）は、好ましくは、バイオマスを乾燥させ、粉砕した後に、少なくとも微生物細胞のバイオマスと混合される。溶媒は、脂質をバイオマスなどに溶解させ、次いで、溶液は、機械的作用によって（例えば、上記のプロセスにより）バイオマスから分離される。この分離ステップはまた、濾過（例えば、濾過プレス又は同様のデバイスを用いて）又は遠心分離などによっても行うことができる。次いで、有機溶媒を（例えば、蒸留によって）非極性脂質から分離することができる。この第２の分離ステップは、微生物細胞から非極性脂質を得、従来の蒸気回収を用いる場合、再利用可能な溶媒を得ることができる。
本発明の微生物細胞から抽出された脂質は、通常の油処理手順に供され得る。本明細書で使用される場合、本発明の脂質に関連して使用される場合、「精製された」という用語は、典型的には、抽出された脂質が、脂質成分の純度を増加させるための１つ以上の処理ステップに供されたことを意味する。かかる処理ステップは、例えば、抽出された脂質から１つ以上の他の細胞成分を除去し得る。精製ステップは、抽出された油の脱脂、脱臭、脱色、乾燥、及び／又は分画からなる群のうちの１つ以上又は全てを含み得る。しかしながら、本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、総脂肪酸含有量の脂肪酸組成を変化させるように、本発明の脂質又は油の脂肪酸組成を変化させるトランスエステル化プロセス又は他のプロセスを含まない。言い換えると、好ましい実施形態において、精製された脂質の脂肪酸組成物は、精製されていない脂質と本質的に同じである。
脱脂
脱脂は、液体形態（油）における脂質の精製の初期段階であり、その主な目的は、抽出された総脂質のおよそ１～２％として存在し得る油から、リン脂質の大部分を除去することである。通常リン酸を含有する約２％の水を原油に７０～８０℃で添加すると、微量金属及び顔料を伴うリン脂質の大部分が分離される。除去される不溶性材料は、主にリン脂質の混合物であり、レシチンとしても知られている。脱脂は、濃リン酸を粗抽出脂質に添加して、非加水分解性リン脂質を加水分解可能な形態に変換し、存在する軽微な金属をキレートすることによって行うことができる。ガムは遠心分離によって油から分離される。
アルカリ精製
アルカリ精製は、中和とも称されることがある、油の形態で脂質を処理するための精製プロセスのうちの１つである。通常は脱脂に続き、漂白に先立つ。脱脂後、十分な量のアルカリ溶液を添加して、脂肪酸及びリン酸の全てを滴定し、このようにして形成された石鹸を除去することによって、油を処理することができる。好適なアルカリ性材料には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、及び水酸化アンモニウムが挙げられる。このプロセスは、通常、室温で行われ、遊離脂肪酸分画を除去する。石鹸は、遠心分離又は石鹸用溶媒への抽出により除去し、中和した油を水で洗浄する。必要に応じて、油中の任意の過剰なアルカリを、塩酸又は硫酸などの好適な酸を用いて中和することができる。
漂白
漂白は、９０～１２０℃で１０～３０分間、漂白アース（０．２～２．０％）の存在下、及び窒素若しくは蒸気で動作することによって、又は真空中での酸素の不在下で、油を加熱する精製プロセスである。油処理におけるこのステップは、不要な顔料を除去するように設計されており、このプロセスはまた、酸化生成物、微量金属、硫黄化合物、及び微量の石鹸を除去する。
脱臭
脱臭は、高温（２００～２６０℃）、低圧（０．１～１ｍｍ Ｈｇ）での油脂の処理である。これは典型的には、約０．１ｍｌ／分／１００ｍｌの油の速度で油中に蒸気を導入することによって達成される。約３０分間スパージした後、オイルを真空下で冷却する。油は、典型的にはガラス容器に移され、冷蔵下で保管される前にアルゴンでフラッシュされる。この処理は、油の色を改善し、残りの任意の遊離脂肪酸、モノアシルグリセロール、及び酸化生成物を含む揮発性物質又は臭気化合物の大部分を除去する。
トランスエステル化
本明細書で使用される場合、「トランスエステル化」は、ＴＡＧ内及びＴＡＧ間で脂肪酸を交換する（インターエステル化）、又は脂肪酸を別のアルコールに移してエステルを形成するプロセスを意味する。これは、最初に、遊離脂肪酸としてＴＡＧから脂肪酸を放出することを伴ってもよく、又は脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステル若しくはエチルエステルを直接生成してもよい。ＴＡＧと、メタノール又はエタノールなどのアルコールとのトランスエステル化反応において、アルコールのアルキル基は、ＴＡＧのアシル基（ＳＣＦＡを含む）とのエステル結合を形成する。分画プロセスと組み合わせた場合、トランスエステル化を使用して、脂質の脂肪酸組成物を修飾することができる（Ｍａｒａｎｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。トランスエステル化は、化学的（例えば、強酸又は触媒された塩基）又は酵素的手段のいずれかを使用することができ、後者は、ＴＡＧ上の脂肪酸に対して位置特異的（ｓｎ－１／３又はｓｎ－２特異的）であり得るリパーゼを使用するか、又は他のものよりもいくつかの脂肪酸を好む（Ｓｐｅｒａｎｚａ ｅｔ ａｌ，２０１２）。油中のＬＣ－ＰＵＦＡの濃度を増加させるための脂肪酸分画は、例えば、凍結結晶化、尿素を使用する複合体形成、分子蒸留、超臨界流体抽出、対電流クロマトグラフィー、及び銀イオン錯体形成などの当該技術分野で既知の方法のいずれかによって達成することができる。尿素との複合体形成は、油中の飽和脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸のレベルを低減する際のその単純性及び効率のための好ましい方法である（Ｇａｍｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）。最初に、油のＴＡＧは、多くの場合、脂肪酸エステルの形態で、酸又は塩基触媒反応条件のいずれか下での加水分解によって、それらの構成脂肪酸に分割され、それによって、１モルのＴＡＧが、形成されたアルキルエステルと、同じく形成されるグリセロールとの分離を可能にするために使用される過剰のアルコールと、少なくとも３モルのアルコール（例えば、エチルエステルの場合はエタノール、又はメチルエステルの場合はメタノール）と、又はリパーゼによって反応する。これらの遊離脂肪酸又は脂肪酸エステルは、通常、処理によって脂肪酸組成物中で変更されず、次いで、複合体形成のために尿素のエタノール溶液と混合され得る。飽和脂肪酸及び一価不飽和脂肪酸は、尿素と容易に複合し、冷却時に結晶化し、その後、濾過によって除去され得る。それによって、非尿素錯体化画分をＬＣ－ＰＵＦＡで濃縮する。
食品及び飼料
本発明は、ヒト消費のための食品若しくは飲料、又は動物消費のための飼料、好ましくは少なくともヒト消費のための食品として使用され得る組成物を含む。本発明の目的のために、食品、飲料、又は飼料は、体内に取り込まれたときに（ａ）組織に栄養を与えるか、若しくは組織を築く役割を果たすか、又はエネルギーを供給するか、及び／又は（ｂ）適切な栄養状態若しくは代謝機能を維持、回復、若しくはサポートする、ヒト又は動物消費のための調製物である。本発明の食品及び飲料は、乳児及び／又は幼児のための栄養組成物、例えば、乳児用フォーミュラを含む。
本発明の食品、飲料、又は飼料は、例えば、本発明の抽出された脂質、本発明の微生物細胞、又は本発明の組成物を含む。
本発明の食品、飲料、又は飼料は、本明細書に開示される方法、細胞の使用によって直接的又は間接的に生成される油、脂肪酸エステル、又は脂肪酸を含む。組成物は、固体形態又は液体形態のいずれかであり得る。更に、組成物は、特定の使用のために所望の量で、食用多量栄養素、タンパク質、炭水化物、ビタミン、及び／又はミネラルを含み得る。これらの成分の量は、組成物が、正常な個体との使用を意図しているか、又は代謝障害などに罹患している個体などの、特殊な必要性を有する個体との使用を意図しているかに応じて変化するであろう。
栄養価を有する好適な成分の例としては、食用脂肪、炭水化物、及びタンパク質などの多量栄養素が挙げられるが、これらに限定されない。かかる食用脂肪の例としては、ココナッツ油、ボラージオイル、真菌油、黒色電流油、大豆油、並びにモノグリセリド及びジグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。かかる炭水化物の例には、グルコース、食用乳糖、及び加水分解されたデンプンが含まれる（がこれらに限定されない）。加えて、本発明の栄養組成物において利用され得るタンパク質の例には、大豆タンパク質、電気透析乳清、電気透析脱脂乳、乳清、又はこれらのタンパク質の加水分解物が含まれるが、これらに限定されない。
ビタミン及びミネラルに関して、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素、及びビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、及びＢ複合体が本発明の食品／飼料に添加され得る。ビタミン及びミネラルなどの他の物質も添加され得る。
追加の成分としては、キャノーラ、トウモロコシ、ヒマワリ、大豆、オリーブ若しくはココナッツ油などの食品用油、食用塩（例えば、塩化ナトリウム若しくはカリウム）若しくはハーブ（例えば、ローズマリー、タイム、バジル、セージ、若しくはミント）などの調味剤、香味剤、タンパク質（例えば、大豆タンパク質単離物、小麦グルチン、エンドウ豆ビシリン、及び／若しくはエンドウ豆レグミン）、タンパク質濃縮物（例えば、大豆タンパク質濃縮物）、乳化剤（例えば、レシチン）、ゲル化剤（例えば、ｋ－カラギーナン若しくはゼラチン）、繊維（例えば、竹ファイラ若しくはイヌリン）、又は鉱物（例えば、ヨウ素、亜鉛、及び／若しくはカルシウム）が挙げられる。
本発明の食品、飲料、及び飼料はまた、ターメリック又はビートジュースなどの天然着色剤、又はアゾ染料、トリフェニルメタン、キサンテン、キニーネ、インジゴイド、二酸化チタン、赤色＃３、赤色＃４０、青色＃１、又は黄色＃５などの人工着色剤を含むことができる。
本発明の食品、飲料、及び飼料はまた、一酸化炭素、亜硝酸塩、メタ重亜硫酸ナトリウム、ボンバル、ビタミンＥ、ローズマリー抽出物、緑茶抽出物、カテキン、及び他の抗酸化物質などの保存期間延長剤を含むことができる。
本発明の食品、飲料、又は飼料組成物において利用される成分は、半精製又は精製由来であることができる。半精製又は精製とは、天然材料の精製又はデノボ合成によって調製された材料を意味する。
本発明の食品、飲料、又は飼料組成物は、食事の補給が必要でない場合でも、食品に添加し得る。例えば、組成物は、マーガリン、修飾バター、チーズ、牛乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディー、軽食、サラダ油、調理油、調理脂肪、肉、魚、及び飲料を含む（がこれらに限定されない）任意のタイプの食品に添加され得る。
いくつかの実施形態において、食品、飲料、若しくは飼料成分、又は食品、飲料、若しくは飼料は、乳製品の代替物である。いくつかの実施形態において、食品、飲料、又は飼料は、乳製品を含まない。一実施形態において、食品又は飼料は、乳製品を含まない乳、乳製品を含まないバター、乳製品を含まないチーズ、又は乳製品を含まないヨーグルトである。
一実施形態において、食品、飲料、又は飼料は、動物に由来する成分を有しない。したがって、好ましい実施形態において、成分のうちの少なくともいくつかは、植物材料又は植物に由来する材料である。いくつかの実施形態において、食品、飲料、又は飼料は、ラクトースを含まない、大豆を含まない、小麦を含まない、酵母を含まない、ＭＳＧを含まない、及び／又はタンパク質加水分解生成物を含まない場合がある。
更に、本発明の飼料は、例えば、ヒト又は動物消費のためのエビなどの魚又は甲殻類の養殖に使用することができる。好ましい魚はサーモンである。
本明細書に記載される食品、飲料、及び飼料は、訓練されたヒトパネリストを使用して評価することができる。評価は、外観、色、完全性、質感、風味、及び口当たりなどを判断するために、製品の注視、感覚、咀嚼、匂い、及び／又は味わいを含むことができる。パネリストは、赤色又は白色の光の下で試料を提供することができる。スケールを使用して、食品の全体的な許容性又は品質、又は乳製品のような性質、食感、及び風味などの特定の品質属性を評価することができる。
実施例１．材料及び方法
微生物株及びクローニングベクター
酵母における種々の脂質修飾遺伝子を試験するための塩基ベクターとして、ｐＹＥＳ２プラスミドを有する宿主株として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＩＮＶＳｃ１を使用した。株及びプラスミドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号ｖ８２５－２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手した。ＩＮＶＳｃ１の遺伝子型は、ＭＡＴａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１－２８９ ｕｒａ３－５２／ＭＡＴα ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１－２８９ ｕｒａ３－５２であり、その表現型は、Ｈｉｓ－、Ｌｅｕ－、Ｔｒｐ－、Ｕｒａ－であった。ｐＹＥＳ２ベクターは、以下に記載するように、種々のタンパク質をコードするＤＮＡ断片の挿入に使用される独自のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を有した。ｐＹＥＳ２発現ベクターは、Ｕｒａ－であった酵母株への導入のための選択マーカー遺伝子としてのＵＲＡ３遺伝子、高コピー維持のための２μ複製起点、及び酵母におけるタンパク質コード領域の発現のためのＧａｌ１プロモーターを含有した。プラスミドはまた、クローニング実験中のＥ．ｃｏｌｉにおける選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を含有した。
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの２つの株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国バージニア州マナサス）から入手した：遺伝子型ｌｅｕ２３５ ｌｙｓ５１２ ｕｒａ３１８ ｘｐｒ２：：ＬＹＳ５Ｂを有する株ＪＭ２３（ＡＴＣＣ９０８１２）、及び遺伝子型ｌｅｕ２３５ ｌｙｓ５１２ ｕｒａ３１８ ｘｐｒ２：：ＬＹＳ５Ｂを有する株ＩＦＰ２９（ＡＴＣＣ２０４６０）。
組み換えＤＮＡ法
酵母における試験のために挿入された単一遺伝子を有するｐＹＥＳ２の誘導体は、独自のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｈｏＩ部位との間にタンパク質コード領域を挿入するか、又は標準的なクローニング方法によって適宜プラスミド中に他の制限酵素部位を挿入することによって作製した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αを、標準的な方法に従ってクローニング及びプラスミド増殖及びＤＮＡ調製に使用した。
ゴールデンゲート（ＧＧ）法（Ｌａｒｒｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１８）は、単一のベクターにおける複数の発現カセットの迅速かつ効率的な組み合わせアセンブリを可能にし、したがって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける試験のためのマルチ遺伝子構築物を作製するために使用した。Ｌ０ベクターとも呼ばれるＧＧ ＤＮＡ部分及びドナーベクターは、Ｃｅｌｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）及びＬａｒｒｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）、及びＡｄｄｇｅｎｅ，ＵＳＡから入手した。ＤＮＡ部分は、プロモーター（ＧＧＥ１４６、ＧＧＥ１５１、及びＧＧＥ２９４）、ターミネーター（ＧＧＥ０１４、ＧＧＥ０１５、ＧＧＥ０８０、ＧＧＥ０２０、及びＧＧＥ０２１）を含み、骨格アセンブリベクター（宛先ベクター）は、ＧＧＥ１１４であった。
ＧＧアセンブリによるベクターへの挿入のためのタンパク質コード領域を、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ及びＧｅｎｅＡｒｔオンラインソフトウェア（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｗｗｗ．ｔｗｉｓｔｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｅｎｅｓ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ／ＧｅｎｅＡｒｔ：ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ａｕ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｇｅｎｅ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ／ｇｅｎｅａｒｔ－ｇｅｎｅ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ｈｔｍｌ）を使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａについてコドン最適化し、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ若しくはＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）によって、又は実験室内で合成した。内部ＢｓａＩ制限酵素部位は、ＧＧアセンブリ法においてＢｓａＩ部位を使用したため、タンパク質コード領域のコドン最適化ヌクレオチド配列において回避された。ＮｏｔＩは、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換のために遺伝子構築物を線形化するために使用したため、ＮｏｔＩ制限酵素部位もヌクレオチド配列内で回避された。１つ、２つ、又は３つの遺伝子を単一のベクターに挿入する場合、表２によれば、個々の構成要素は、各翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の５’及び翻訳停止コドンの３’の直後に４ヌクレオチドオーバーハングを有して設計され、各４ヌクレオチドオーバーハングの配列が、骨格ベクターＧＧＥ１１４における構成要素の位置に依存した。適切な４ｎｔオーバーハングを有する外部ＢｓａＩ部位を各ＤＮＡ鎖の５’末端に加えた。
Figure 2023518329000002
タンパク質コード領域を、カナマイシン選択マーカー遺伝子を有するクローニングベクターで合成して、アンピシリン選択マーカー遺伝子を有するＧＧ骨格ベクターＧＧＥ１１４とのＧＧ反応を行う際に、いかなる偽陽性も回避した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αを、標準的な方法に従ってクローニング及びプラスミド増殖に使用した。抗生物質を、形質転換細胞を選択するために適宜使用し、例えば、アンピシリン選択マーカー遺伝子を有する構築物の選択のために１００μｇ／ｍＬでアンピシリンを添加した。
宛先ベクターＧＧＥ１１４は、Ｌａｒｒｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１８）に記載されているように、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるネガティブクローニングのための色ベースの視覚マーカーとして機能する赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）発色団を含有した。ベクターＧＧＥ１１４は、細菌レプリコンに加えて、高コピー維持のための２μ起点を含有する骨格ベクターｐＹＥＳ２に、この組み合わせを用いるときに組み立てる断片の数を減少させることを目的として、ＩｎｓＵｐ及びＩｎｓＤｏｗｎ断片の代わりに、良く知られているレンガＺＥＴＡ配列、及びＵＲＡ３マーカーを含有する予め組み立てられた宛先ベクターであった。この場合、ＲＦＰは、ＵＲＡ３マーカーとＺＥＴＡダウンとの間にあった。ＢｓａＩ酵素の存在下で、ＲＦＰを放出し、１つ、２つ、又は３つの転写単位（ＴＵ；プロモーター－タンパク質コード領域－ターミネーター）を挿入した。
ＧＧアセンブリ反応混合物は、０．７５μｌ １０ｘ Ｔ４リガーゼ緩衝液、０．７５μｌ １０ｘ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、０．７５μｌ Ｂｓａｌ ＨＦ－Ｖ２（ＮＥＢ）、０．５μｌ Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ）を添加することによって、７．５μｌの最終体積の、ＧＧＥ１１４及び他のＤＮＡ成分（ドナーベクター）などのＧＧ骨格ベクターの等モル量（５０ｎｇ）を含有した。反応混合物を、３分間３７℃、続いて４分間１６℃の２５サイクル、次いで５分間５０℃、及び５分間８０℃の１サイクルでインキュベートした。２～３μｌの試料を、標準的な方法によりＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αの有能な細胞に導入した。ＲＦＰを欠くコロニーは、適切なプライマーを有するコロニーＰＣＲによって所望の遺伝子挿入物を含有することを確認し、制限ダイジェストで検証した。グリセロールストックを作製し、－８０℃で保管した。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換
有能な細胞を使用しなかったｐＹＥＳ２に基づく遺伝子構築物をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入するために、ＲＡＰＩＤ法を使用した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を満載したループを新鮮なプレートから削り取り、細胞を１００μｌの形質転換緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ０８０９）に再懸濁した。使用前に５分間煮沸した１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのサーモン精巣ＤＮＡを有する約１μｇのプラスミドＤＮＡを、６００μｌのプレート緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ８９６６）と共に細胞懸濁液に添加し、よく混合した。混合物を、室温で、最低速度で、回転輪中で、１６時間インキュベートした。次いで、混合物を４２℃で１５分間熱ショックを与え、３５００ｒｐｍで３分間回転させ、細胞のペレットを２００μｌの滅菌水中に再懸濁した。最大１００μｌのアリコートを、形質転換体の選択のために、ウラシルを欠く合成脱落選択培地（ＳＤ－ＵＲＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｙ１５０１）上に配置した。プレートを２８℃で３日間、又はコロニーが出現するまでインキュベートした。２つ以上のコロニーを各プレートから選択し、コロニーＰＣＲによって遺伝子構築物の存在について試験して、形質転換体を同定した。
発現カセットの統合のためのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの形質転換
相同組換えによるＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａへの挿入のための発現カセット（転写単位）を含む遺伝子構築物のＤＮＡを、ＮｏｔＩで消化して、発現カセットを放出した。直鎖状ＤＮＡを、凍結ＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して調製したＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株ＪＭ２３の適格な細胞に導入した。簡潔に述べると、５μｌ（２ｕｇ）のＮｏｔＩ消化及び線形化発現ベクターを、キットからの５０μｌの有能な細胞及び５００μｌのＥＺ３溶液と混合し、完全に混合した。陰性対照形質転換には、遺伝子構築物のＤＮＡを含まない有能な細胞が含まれた。混合物を２８℃で２時間インキュベートし、次いでＳＤ－Ｕｒａプレート上に１００μｌ拡散した。プレートを２８℃で２日間インキュベートした。宿主株ＪＭ２３は機能的ＵＲＡ３遺伝子を欠く補助栄養生物であったため、ＵＲＡ遺伝子を有するベクターを受容した形質転換体のみがこれらのプレート上で増殖した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ形質転換において多くのコロニーが観察された。Ｕｒａ＋コロニーを選択プレートから採取し、導入されたベクターについてコロニーＰＣＲによって形質転換されたことを確認した。
脂質含有量の解析のためのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ培養物の成長
トランスジェニック及び対照Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の小規模培養物を、２％ラフィノース（ｗ／ｖ）を含有するＳＤ－Ｕｒａ培地（ＭＰ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ、カタログ番号４０１００２２）５ｍｌ中のグリセロールストックから、２８℃で一晩、通気のために振盪しながら増殖させた。細胞を、２％（ｗ／ｖ）ラフィノース及び１％テルギトール（ｖ／ｖ）を含有するＳＤ－Ｕｒａ培地（ＮＰ－４０；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号ＮＰ４０Ｓ）培地の１０ｍｌに懸濁液として、５０ｍｌのチューブ又は２５０ｍｌのフラスコ内で０．１の光学密度で６００ｎｍ（ＯＤ６００）に接種し、２８℃、２００ｒｐｍのシェーカーインキュベーター内で、通気のために増殖させた。ＯＤ６００を１５又は３０分の時間間隔でチェックした。ＯＤ６００が０．３に達したとき、ＧＡＬ１プロモーターからの導入遺伝子の誘導のために、潜在的な基質（存在する場合）としての外因性化合物を２％ガラクトースと共に添加した。
ＩＮＶＳｃ１：：ｐＡＴ００３又はｐＹＥＳ２などの形質転換体について、３Ｌの体積でのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞のより大きなスケール培養物を増殖させた。これらをグリセロール株から接種した。スターター培養物を、２％（ｗ／ｖ）ラフィノースを含有する１０ｍｌＳＤ－Ｕｒａ培地中で２晩増殖させた。細胞を、２％（ｗ／ｖ）ラフィノース及び１％テルギトール（ＮＰ－４０）を含む３ＬのＳＤ－Ｕｒａ培地に０．１のＯＤ６００に移し、２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で増殖させた。ＯＤ６００を１５分及び３０分の間隔でチェックした。ＯＤ６００が０．３に達したとき、ガラクトースを２％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで添加して、導入遺伝子を誘導した。所望の場合、酪酸ナトリウムを２ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで培養物に添加した。次いで、フラスコを滅菌アルミホイルで緩く閉じた。培養物をインキュベーター内で４８時間増殖させた後、遠心分離により細胞を収穫した。
トランスジェニック株及び対照Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株の培養物を、酵母エキス１０ｇ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｙ１６２５）、ペプトン２０ｇ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ０５５６）、及びデキストロース２０ｇ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ７０２１）を１リットル当たり４８時間含有する１０ｍｌのＹＰＤ培地中のグリセロール株から増殖させた。該培養物を使用して、アミノ酸及び硫酸アンモニウムを欠く１．７ｇ／ｌ酵母窒素塩基、８０ｇ／ｌグルコース、及び硫酸アンモニウム２．２ｇ／ｌを含有する定義された細胞培養培地５０ｍｌを含有する２５０ｍｌ円錐形フラスコに接種した（Ｑｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。所望の場合、油などの潜在的な炭素源としての追加の化合物を４８時間で添加した。
潜在的な炭素源として化合物を添加した場合（供給アッセイ）、酪酸（カタログ番号Ｂ１０３５００）、酪酸ナトリウム（カタログ番号Ｂ５８８７）、トリブチリン（カタログ番号Ｗ２２２３０５）、又はパルミチン酸（カタログ番号７６１１９）の化合物をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから得た。水に溶解した酪酸を、最大２ｍｇ／ｍｌの最終濃度までＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに提供した。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ培養物に提供した場合、酪酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｂ１０３５００）を５０％グリセロールで調製し、培養物に２ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。
いくつかのＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ培養物にも油調製物を提供した：ヒマシ油（Ａｕｓｓｉｅ Ｓｏａｐ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ、ＡＵ、カタログ番号ＳＫＵ：ＣＢ１００）、トリブチリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｗ２２２３０５）、及び長鎖多価不飽和脂肪酸（ＧｒｅｅｎＯＭＥＧＡ３カプセル、Ｇｒｅｅｎ栄養素、ＡＵ）。これらの油を７０％ＮＰ４０中で乳化し、２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で培地に添加した。この場合、ＮＰ４０最終濃度は７％（ｖ／ｖ）であった。
細胞の採取、洗浄、及び凍結乾燥
酪酸塩又はパルミチン酸塩などの脂肪酸を増殖培地に加えたところ、５０ｍｌのチューブ中で３５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を採取した。細胞ペレットを１ｍｌの１％テルギトール（ｖ／ｖ）、１ｍｌの０．５％テルギトールで連続的に洗浄し、１ｍｌの水で最終洗浄して、細胞の外側から任意の残留化合物を除去した。最終洗浄中、ペレットを事前に秤量した２ｍｌエッペンドルフチューブに移し、凍結乾燥した後、秤量及び脂質抽出を行った。
増殖培地に油を添加した場合、上記のように遠心分離により細胞を採取したが、細胞ペレットを、５ｍｌの１０％テルギトール（ｖ／ｖ）、５ｍｌの５％テルギトール、５ｍｌの１％テルギトール、５ｍｌの０．５％テルギトールで連続的に洗浄し、５ｍｌの水で最終洗浄して、細胞の外側から残留油を除去した。ある場合には、Ｂｏｄｉｐｙで染色した後の顕微鏡観察により、細胞壁に油が染色されていないことが確認された。最終洗浄に伴い、ペレットを事前に秤量した２ｍｌエッペンドルフチューブに移し、凍結乾燥した後、秤量及び脂質抽出を行った。
全脂質抽出
以下のようにＢｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ（１９５９）から改変した方法を使用してペレットから総脂質を抽出した。簡単に述べると、０．５ｇのジルコニウムビーズ及び０．６ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１ ｖ：ｖ）を細胞ペレットに添加した。細胞をブレットブレンダー内で粉砕した（速度７を５分間）。次いで、細胞を超音波水浴中で５分間超音波処理し、０．３ｍｌの０．１Ｍ ＫＣｌを水中に添加した。混合物を１０分間振盪し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、脂質を含有する下部有機相を上部水相から分離した。下部相を２ｍｌのガラスバイアルに移した。更に、０．３ｍｌクロロホルムをチューブ内の残りの水性混合物に加え、ブレットブレンダー内で５分間再び均質化した。この混合物を５分間遠心分離し、下部有機相を収集し、同じガラスバイアル中の第１の抽出物と組み合わせる。溶媒を窒素の流れ下で完全に蒸発させ、脂質をクロロホルム６０μｌ中に溶解させた。
薄層クロマトグラフィーにおける脂質分画
ＴＡＧ、ＤＡＧ、遊離脂肪酸、及びリン脂質（ＰＬ）などの極性脂質などの異なる脂質タイプを分離するために、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（７０：３０：１ ｖ：ｖ：ｖ）を溶媒系として使用して、全脂質を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（シリカゲル６０；カタログ番号１．０５６２６．０００１、ＭＥＲＣＫ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で分画した。次いで、プレートに、アセトン：水（８０：２０ ｖ／ｖ）中の５ｍｇ／１００ｍｌの濃度で調製したプリムリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２０６８６５、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液、及びＵＶ光下で可視化した脂質バンドをスプレーした。等量のトリアセチン（ＴＡＧ６：０）、トリブチリン（ＴＡＧ１２：０）、トリカプリリン（ＴＡＧ１８：０）、及びトリデカノイン（ＴＡＧ３０：０）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１７８１０－１ＡＭＰ－Ｓ）を含有する、Ｔｒｉｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｎ（Ｎｕｃｈｅｋ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｔ－１５５）及びトリグリセリド混合物Ｃ２－Ｃ１０などの脂質標準物を、隣接するレーンで実行して、ＴＡＧ脂質スポットを同定した。脂質画分を、メチル化、プロピル化、又はブチル化のいずれかを使用して、誘導体化のためにシリカから抽出した。
メチルエステルへの脂質誘導体化
脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を、定量化のための内部標準物質として、既知の量のヘプタデカイン（Ｎｕ－Ｃｈｅｋ ＰＲＥＰ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｎ－７－Ａ、Ｗａｔｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＮ、ＵＳＡ）と共に、８０℃で２時間、ＰＴＴＥ裏打ちされたスクリューキャップを有する２ｍｌガラスバイアル内で、０．７ｍｌ １Ｎメタノール－ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号９０９６４）で処理することによって、全抽出脂質又は精製されたＴＡＧ又はＰＬ画分から調製した。バイアルを冷却した後、０．３ｍｌの０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）及び０．１ｍｌヘキサンを添加し、混合物を５分間渦巻いた。混合物を１７００ｇで５分間遠心分離し、ＦＡＭＥを含有する上部相をＧＣによって分析した。
トリアシルグリセロールの沈殿
遊離脂肪酸を、１ｍｇＴＡＧを０．２ｍｌ ３Ｍ ＫＯＨ中で８０℃で３分間インキュベートすることによって、ＴＡＧから放出した。試料を室温まで冷却した後、１００μｌヘキサンを混合物に加えた。混合物を５分間ボルテックスし、１７００ｇで５分間遠心分離し、上部有機相をＧＣ分析のために収集した。
エチルエステル又はプロピルエステルへの脂質誘導体化
ＴＡＧ中の脂肪酸を脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）に変換するために、２ｍｇのＴＡＧを１Ｎ ＨＣｌ／エタノール溶液中で８０℃で２時間インキュベートした。試料を室温まで冷却した後、１００μｌのヘキサンを混合物に加えた。混合物を５分間ボルテックスし、１７００ｇで５分間遠心分離し、上部有機相をＧＣ分析のために収集した。ＴＡＧ中の脂肪酸を脂肪酸プロピルエステルに変換するために、２ｍｇのＴＡＧを、１Ｎ ＨＣｌ／エタノールではなく１Ｎ ＨＣｌ／プロパノール中でインキュベートし、それ以外の方法で処理した。
ＴＡＧ中の脂肪酸のブチルエステルへの誘導体化
ＴＬＣプレート上のＴＡＧスポットのシリカから以下のようにＴＡＧ画分を抽出した：０．６ｍｌクロロホルム：メタノール（２：１、ｖ／ｖ）をＴＬＣプレートから削り取ったシリカに添加した。混合物を振盪し、１０，０００ｇで５分間遠心分離した。次いで、０．３ｍｌの０．１Ｍ ＫＣｌを添加し、混合物を５分間振盪した。混合物を１０，０００ｇで５分間遠心分離し、下部有機相を２ｍｌ ＧＣバイアルに収集した。シリカ／水相を２回、今回は０．３ｍｌクロロホルムで抽出し、１０分間混合した後、１０，０００ｇで５分間遠心分離した。下部有機相を再び収集し、第１の抽出物と同じＧＣバイアルにプールした。ＴＡＧを含有するプールした抽出物を、０．２μｍマイクロスピンフィルター（Ｃｈｒｏｍｓｅｒｖｉｓ、ＥＵ、カタログ番号ＣＩＮＹ－０２）を通して濾過し、シリカ粒子の痕跡を除去した。次いで、濾過したＴＡＧ抽出物を、平らなインサートを有するＧＣバイアルに移し、窒素の流れ下で完全に乾燥させた。
次いで、精製したＴＡＧを、Ｍａｎｎｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８により記載されるように、６０μｌのブタノール：１Ｎ ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号８７４７２）を使用して、いくつかの修飾を加えてブチルエステルに誘導体化した。バレリアン酸（Ｃ５：０）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号７５０５４）を、ＳＣＦＡ及びＭＣＦＡ定量化のために２３．２５μｇの量で、内部標準物質として添加し、５μｇのヘプタン酸（Ｎｕ－Ｃｈｅｋ ＰＲＥＰ，Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｎ－７－Ａ Ｗａｔｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＮ、ＵＳＡ）をＬＣＦＡ定量化のための内部標準物質として添加した。混合物をボルテックスし、８０℃で２時間加熱した。次いで、０．０３ｍｌの水及び０．０３ｍｌのヘキサンを添加することによって反応を停止させ、１０分間完全に混合した。１７００ｇで５分間遠心分離した後、上部有機相を、０．１ｍｌの飽和ＮａＣｌを含有する平らなインサートを有する新しいチューブに移し、２回目の洗浄を行い、ブタノールの痕跡を除去した。混合物を５分間混合し、１７００ｇで５分間遠心分離し、有機相を円錐形インサートを有する新しいＧＣバイアルに移し、以下に記載するようにＧＣ－ＦＩＤ分析のために迅速にキャップした。
メチルエステルの分析及び定量化
この方法は、精製されたＴＡＧ調製を含む、脂質、特に中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ、Ｃ１０～Ｃ１４）及び長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ、Ｃ１６～Ｃ１８）、又はより長鎖脂肪酸の脂肪酸組成物の決定に好適であった。方法は、ＳＣＦＡのメチルエステルの揮発性により、ＳＣＦＡの定量化にはあまり好ましくなかった。脂質を誘導体化して、上記のようなＦＡＭＥを生成した。ＦＡＭＥを、３０ｍ ＢＰＸ７０カラム（０．２５ｍｍ内径、０．２５μｍ膜厚、ＳＧＥ）を有するＡｇｉｌｅｎｔ７８９０Ａ ＧＣを使用してＧＣにより定量化した。カラム温度を１５０℃で１分間プログラムし、３℃／分で２１０℃まで上昇させ、２分間保持し、５０℃／分で２４０℃に達し、次いで０．４分間保持した。インジェクタ温度を２４０℃、検出器を２８０℃に設定した。ヘリウムを、１．０ｍｌ／分の一定の流量でキャリアガスとして使用した。ＦＡＭＥピークは、ＦＡＭＥ基準の保持時間（ＧＬＣ－４１１、ＧＬＣ－６７４；ＮｕＣｈｅｋ ＩＮＣ．，ＵＳＡ）に基づいて同定した。ピークは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｒｅｖ Ｂ．０４．０３（１６））と統合した。得られたデータは、総脂肪酸含有量１００％における各脂肪酸のパーセンテージ（重量％）を有する、重量ベースでの脂肪酸組成物を提供する。重量ベースでのこれらのパーセンテージは、各脂肪酸の既知の分子量に基づいて、モル基準でのパーセンテージ（モル％）に容易に換算することができる。
ブチルエステルの分析及び定量化
この方法は、精製されたＴＡＧ調製物を含む、脂質試料中の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ、Ｃ２－Ｃ８）、並びに培地（ＭＣＦＡ、Ｃ１０－Ｃ１４）及び長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ、Ｃ１６－Ｃ１８）の定量化に好適であった。それは、ＳＣＦＡの定量化のための好ましい方法であった。上記のように調製したＦＡＢＥを、３０ｍ ＢＰＸ７０カラム（０．２５－ｍｍ内径、０．２５－μｍ膜厚、ＳＧＥ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ７８９０Ａ ＧＣ上で分析した。カラム温度を４０℃で１分間設定した後、３℃／分の速度で２１０℃まで温度を上げ、２分間保持した。カラム温度を更に１００℃／分の速度で２４０℃まで上げ、この温度で０．５分間保持した。ヘリウムを、１．０３１ｍｌ／分の流量でキャリアガスとして使用した。インジェクタ温度は、１１．８ｐｓｉの入口圧力で２４０℃でプログラムした。試料を５０：１の比で分割モードで注入した。ＦＩＤ検出器温度は、４０ｍｌ／分の水素ガス、４００ｍｌ／分の空気、及び２５ｍｌ／分のメイクアップガス（Ｈｅ）の流れで２８０℃であった。ＦＡＢＥピークは、等量の分析グレードＣ４～Ｃ１８：１脂肪酸を用いて調製したＦＡＢＥ標準混合物の保持時間に基づいて同定した。ＦＡＢＥ混合物のピーク面積は、ＧＣにおける個々のＦＡＢＥピークの応答因子を決定するために使用され、ＦＡＢＥピークの面積パーセンテージを補正するために適用された。
本明細書において「Ｃ８Ｃ２４法」と称されるＦＡＢＥの定量化のためのＧＣ法の変形例において、いくつかのカラムパラメータを調整した。カラム温度を４０℃で１３分間設定し、続いて３２０℃／分の速度で２１０℃まで温度を上昇させ、２分間保持した。カラム温度を更に１０℃／分の速度で２４０℃まで上げ、この温度で０．５３分間保持した。インジェクタ温度、ＦＩＤ検出器温度、及びヘリウム流量は従来通りであった。
ＧＣ－ＭＳによるピーク同一性
脂肪酸ピークの同一性を確認するために、試料を、７０ｅＶの電子イオン化モードで動作するガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）上に流して、ピーク同一性を確認し、溶媒、分解生成物、又は試薬シグナルに対応する、可能性のある追加のピークを同定した。ＨＴＸ－Ｐａｌ液体自動サンプラーに接続された島津ＧＣ－ＭＳ ＱＰ２０１０ Ｐｌｕｓシステムは、パラメータ：１５：１の分割で、２５０℃の温度で、スプリット／スプリットレス入口を使用して、１又は２μｌの注入体積で使用した。オーブン温度プログラムは、６０℃で１分間開始し、次いで５℃／分を２００℃、１０℃／分を２５０℃まで増加させ、２５０℃で５分間保持した。ＭＳイオン源及び界面温度は、それぞれ２００℃及び２５０℃であった。データは、１０００の走査速度及び４０～５００ｍ／ｚの走査範囲で収集した。ピーク分離は、Ｈｅをキャリアガスとして３０ｃｍ／秒で使用して、Ｓｔａｂｉｌｗａｘ（登録商標）（Ｒｅｓｔｅｋ）キャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．、０．２５μｍ膜厚）によって提供した。質量スペクトル相関は、ＮＩＳＴライブラリ及び真正ＳＣＦＡ標準のマッチング保持時間を使用して行った。Ｓ／Ｎ比が１０：１を超えたときに、同定されたＳＣＦＡが存在するように設定した。品質管理の目的のために、器具ブランク及び手順ブランクを実行した。
相対的に揮発性であったメチルエステルの形態の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）も、ＧＣ－ＭＳと結合したヘッドスペース固相マイクロ抽出（ＨＳ－ＳＰＭＥ）技術を使用して同定した。メチル化脂質抽出物又はメチル化ＴＬＣ画分のヘッドスペース中の短鎖ＦＡＭＥ含有量を、ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ繊維（Ｓｕｐｅｌｃｏ、ＵＳＡ）及び３０℃で設定されたヒーター撹拌器を使用して、ＨＴＸ－Ｐａｌオートサンプラーで分析した。オートサンプラープログラムを、１０ｍｌのヘッドスペースバイアルを使用して、撹拌下で６０分のヘッドスペース抽出時間に設定した。分析物を含有する繊維を、インジェクタ温度２５０℃で３分間、スプリットレス入口で脱着した。ＶＦＡメチルエステルを、４５℃で５．５分間開始し、３℃／分を１７０℃まで、７℃／分を２５０℃まで増加させ、２５０℃で２分間保持する温度プログラムを有するＳｔａｂｉｌｗａｘ（登録商標）（Ｒｅｓｔｅｋ）キャピラリーカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．、０．２５μｍ膜厚）で分析した。ＭＳイオン源及び界面温度は、それぞれ、２００℃及び２７０℃であった。ヘリウムは、最初のランピングプログラムで３０ｃｍ／秒の線速度でキャリアガスであった。データは、１０００の走査速度及び３５～３５０ｍ／ｚの走査範囲で収集した。スペクトルライブラリーマッチング、保持インデックス、及びＶＦＡメチルエステル標準を同定に使用した。
ＬＣ－ＭＳ法によるピーク同一性
脂質抽出物を、８０μｌのメタノール（ＭｅＯＨ）：イソプロパノール（ＩＰＡ）（１：１、ｖ／ｖ）中で再構成し、サプライヤの指示に従って、０．２μｍのマイクロスピンフィルター（Ｃｈｒｏｍｓｅｒｖｉｓ、ＥＵ、カタログ番号ＣＩＮＹ－０２）を通して濾過した。非標的化脂質同定実験のために、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）プローブを装備したＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。脂質抽出物の分離は、ＵＰＬＣガードカラムに結合されたＺｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ ２．１ｍｍ×５０ｍｍ、１．８μｍ ＲＲＨＤカラムを使用して、ＵＰＬＣ Ｖａｎｑｕｉｓｈ Ｓｙｓｔｅｍを使用して達成した。カラムコンパートメントを４０℃の温度に設定した。二元溶媒系は、移動相Ａ（６０：４０ ｖ／ｖアセトニトリル／水と、９０：１０ ｖ／ｖ ＩＰＡ／アセトニトリルを含有する移動相Ｂとからなり、Ａ及びＢの両方とも、１０ｍＭ酢酸アンモニウム及び０．１％ギ酸を含有した。試料を４０分間にわたって４０％ Ｂ～１００％ Ｂの範囲の線形勾配で溶出し、再平衡化のために初期勾配に戻した。流量は２００μｌ／分であり、注入量は１μｌであった。試料をオートサンプラートレイ内で１０℃に保管した。データを、ｍ／ｚ２００～１０００の範囲でのフルスキャンデータ依存のＭＳ／ＭＳ取得により、正イオン化モードで取得した。フルスキャン及び断片スペクトルを、それぞれ、７００００及び１７５００の分解能で収集した。イオン源パラメータは、スプレー電圧３．８ｋＶ、気化器３５０℃、イオン伝達管３２０℃、ｓ－レンズＲＦレベル５０％、シースガス３５、補助ガス５、及びスイープガス１であった。データ分析及び脂質同定は、Ｆｒｅｅｔｈｙｌｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＣＡ）を使用して行った。ＴＡＧ脂質は、ＭＳ１質量誤差＜５ｐｐｍで、保持時間及び特徴的な生成物イオンの情報を使用して同定した。
遺伝子発現分析
ＤＮａｓｅ ＲＱ１キット（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｍ６１０１）及びＱｉａｇｅｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｓｅ不含ＤＮＡｓｅ）を使用して、導入遺伝子の発現を解析して、細胞からＲＮＡを精製し、標準方法を使用して逆転写のためのオリゴｄＴプライマー（２００～５００ｎｇ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素、及び０．１Ｍ ＤＴＴを解析した。
実施例２．酵母細胞におけるアシルトランスフェラーゼの発現
候補遺伝子同定
反射性哺乳類の乳脂肪におけるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）は、Ｃ４：０及びＣ６：０を含む短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含有し、これらは主にＴＡＧ分子のｓｎ－３位でエステル化される。ＴＡＧ分子は、特定のＤＧＡＴ酵素によってｓｎ－３位でＳＣＦＡのアシル基が組み込まれるグリセロールリン酸経路によって、反射型哺乳類の乳腺において新規に合成される（Ｍａｒｓｈａｌｌ ａｎｄ Ｋｎｕｄｓｅｎ１９７９）。例えば、乳脂肪ＴＡＧ中のＣ４：０は、これらのＤＧＡＴによるアシル化の結果として、ＴＡＧのｓｎ－３位でほぼ完全にエステル化される（Ｊｅｎｓｅｎ、２００２）。Ｍａｒｓｈａｌｌ及びＫｎｕｄｓｅｎ（１９７９）は、ＤＧＡＴ酵素が、ＳＣＦＡの組み込みに関与していることを特定したが、これらのＤＧＡＴをコードする遺伝子はクローニングされておらず、哺乳類ゲノムには、これらのＴＡＧ分子の生成に関与する可能性のある複数のＤＧＡＴ配列が存在した。したがって、本発明者らは、候補ＤＧＡＴとして試験するために、ヤギ、ヒツジ、ウシ、及びスイギュウを含む哺乳類源からの様々なＤＧＡＴアミノ酸配列を同定した（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９を参照）。
選択された酵素の別のものは、Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ａｌａｔｕｓ １，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール：アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥａＤＡｃＴ）であった。ＥａＤＡｃＴ酵素は、アセチル基をアセチル－ＣｏＡからＤＡＧに移して、ＴＡＧを生成し、ＴＡＧ分子のｓｎ－３位にアセチル基をもたらす。ＤＡｃＴ酵素は、ＤＧＡＴ酵素を含むアシルトランスフェラーゼのＭＢＯＡＴファミリーのメンバーである。Ｂａｎｓａｌ及びＤｕｒｒｅｔｔ（２０１６）は、ＥａＤＡｃＴの基質特異性について記載し、これは、アセチル基を転写するための強力な基質優先順位を有することが示されたが、ブチリル（Ｃ４：０）及びヘキサノイル（Ｃ６：０）基を転写することもできるが、Ｃ８基は転写しない。ＥａＤＡｃＴ酵素を遺伝子構築物ｐＡＴ００１、配列番号２によってコードした（以下を参照）。
遺伝子構築物の生成及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへの導入
遺伝子構築物ｐＡＴ００１－０２０を、設計し、酵母プラスミドベクターｐＹＥＳ２にタンパク質コード領域を挿入することによって作製した。試験のために候補ＤＧＡＴ酵素をコードする、挿入されたヌクレオチド配列は、コード領域の挿入されたヌクレオチド配列を提供する配列番号：１～３０の間の偶数番号の配列番号、及び酵素のアミノ酸配列を提供する配列番号：１～３０の間の奇数番号の配列番号を参照されたい。ｐＹＥＳ２ベクターは、酵母細胞における自律複製のための２μレプリコン、及びＵＲＡ－遺伝的背景における形質転換体の選択を可能にするＵＲＡ選択可能なマーカー遺伝子を含有した。各構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける脂肪酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現のために、単一のＤＧＡＴ酵素をコードする遺伝子、又はｐＡＴ００１の場合にはＥａＤＡｃＴタンパク質を含有した。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＩＮＶＳｃ１をｐＡＴ００１－０１４及びｐＡＴ０１９構築物で形質転換し、ＳＤ－Ｕｒａ培地上のＵＲＡ＋細胞を選択した。形質転換細胞の培養物（１０ｍｌ、５０ｍｌ、又は３Ｌ）を実施例１に記載されるように増殖させた。培養物を、１０ｍｌ培養物についての添加された酪酸（最終濃度２ｍｇ／ｍｌ）又は５０ｍｌ培養物についての酪酸ナトリウム（２ｍｇ／ｍｌ）のいずれかの存在下又は不在下で、潜在的な炭素源として増殖させた。外因性基質を用いて生成された細胞は、本明細書において「Ｃ４：０供給細胞」と称され、酪酸塩の不在下で生成された細胞は、「非供給細胞」と称される。アシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠くｐＹＥＳ２ベクターで形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、対照培養物として、酪酸塩の有無にかかわらず、同じ条件下で増殖させた。ＧＡＬ１プロモーターからの候補アシルトランスフェラーゼ遺伝子の転写の誘導物質として、活性増殖期中に、培養物の全てが２％（ｗ／ｖ）のガラクトースを受け取った。
形質転換細胞のＴＡＧ含有量
細胞のＴＡＧ含有量を計算するために、乾燥細胞バイオマスの測定重量から抽出した、抽出された脂質調製物からＴＡＧを精製した。各ＴＡＧ画分の試料を内部標準物質として既知の量の トリヘプタデカノインと混合し、各混合物中の脂肪酸を実施例１に記載されるようにＦＡＭＥに変換した。ＦＡＭＥは、ＧＣ－ＦＩＤによって定量化された。ＧＣ分析においてヘプタデカノイル－ＦＡＭＥについて観察された内部標準物質の重量及びピーク面積に基づいて、ＴＡＧ中の各個体のＦＡＭＥの重量を算出した。ＴＡＧの全てのＦＡＭＥの含有量を合計したとき、これは、乾燥重量ベースでの細胞中のＴＡＧの総量を提供した。対照ｐＹＥＳ２細胞を同じ条件下で増殖させ、比較のために同じ方式で分析した。
形質転換細胞培養物中の候補ＤＧＡＴ酵素をコードする遺伝子の発現は、総ＴＡＧ含有量の増加、空のベクター対照と比較した重量ベースで最大３．３％の増加、２．６倍の増加（ＩＮＶＳＣ１：：ｐＹＥＳ２）をもたらした（図１）。これは、同じ条件下で増殖させたときにＤＧＡＴを発現する遺伝子構築物を欠く対照細胞と比較して、相対的基準で最大約１６０％の増加を表した。加えて、Ｃ４：０を供給された細胞について、酪酸塩を増殖培地に添加したことにより、ＴＡＧ含有量の更なる増加が観察された。ＤＧＡＴ酵素の発現は、外因性酪酸塩の添加なしでも細胞のＴＡＧ含有量を増加させることができ、酪酸塩の添加と、ＤＧＡＴ酵素の発現との組み合わせは、細胞のＴＡＧ含有量を更に増加させることができたと結論付けられた。
ＤＧＡＴ遺伝子で形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで生成されたＴＡＧの脂肪酸組成物
ｐＡＴ００１～ｐＡＴ０１４、及びｐＡＴ０１９を含有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換体中の選択されたＤＧＡＴ酵素の生化学的活性をアッセイするために実験を行った。上述のように、増殖培地は、添加化合物として、追加の炭素源として、及びＴＡＧ合成のための潜在的な基質として、２ｍｇ／ｍｌの酪酸塩を含むか、又は欠如していた。初期培養物は１０ｍｌであり、後期培養物は５０ｍｌの体積であった。総脂質を、実施例１に記載のように、ＴＬＣによって単離した細胞、並びにＴＡＧ及びＰＬ画分から抽出し、各形質転換株について脂肪酸組成物を決定した。ＴＡＧ及びＰＬをＦＡＭＥに誘導体化し、ＧＣ－ＦＩＤ及びＳＰＭＥ－ＧＣＭＳによって解析した。初期の実験は、ＴＡＧでエステル化された脂肪酸のメチルエステル（ＦＡＭＥ）への変換を使用した。後の実験では、ＳＣＦＡ、特にＣ４：０メチルエステルのＦＡＭＥの揮発性に起因して、プロピルエステル（ＦＡＰＥ）又はブチリルエステル（ＦＡＢＥ）への変換を使用した。１つの実験において、ＦＡＭＥを実施例１に記載されるようにＳＰＭＥ－ＧＣＭＳを通じて分析し、抽出された脂質からのＴＡＧ中のＣ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０の存在及び分子同一性の確認を提供した。
ＦＡＭＥへの変換を使用した解析からのデータを表３に示す。レベルが低かったにもかかわらず、ｐＡＴ００１～ｐＡＴ０１４、及びｐＡＴ０１９で形質転換された細胞から、抽出された脂質のＴＡＧ画分において、Ｃ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０脂肪酸のうちの少なくとも１つの存在が確認された。これらの脂肪酸の同一性は、ＧＣ－ＭＳによって確認された。ｐＹＥＳ２ベクターで形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（対照）細胞によって生成されたＴＡＧではＣ４：０及びＣ６：０は検出されず、Ｃ８：０は、Ｃ４：０供給ｐＹＥＳ２形質転換細胞のみ検出された（表３）。ＴＡＧ中のＣ４：０の存在は、酪酸塩を供給された培養物について最も明確に実証された。いくつかの事例では、ＤＧＡＴ構築物で形質転換細胞が、ＴＡＧ内のＭＣＦＡ Ｃ１０：０及びＣ１２：０、並びにＬＣＦＡ Ｃ１４：０及びＣ１６：０のレベルをわずかに上昇させたことも観察された。これらのデータから、導入されたＤＧＡＴ酵素は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞によって生成されるＴＡＧにＳＣＦＡ、特にＣ４：０のＳＣＦＡを組み込むことができたと結論付けられた。増殖培地に酪酸塩を添加すると、組み込みが増加する傾向があった。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで生成されるＰＬの脂肪酸組成物
細胞から抽出された脂質をＴＬＣにより分画して、ＴＡＧ分子を精製した。その分画はまた、精製リン脂質（ＰＬ）分画を提供し、したがって、その脂肪酸組成について分析した。データは、ｐＹＥＳ２（対照）及びＤＧＡＴ形質転換細胞から得られたＰＬ画分が、類似した脂肪酸組成を有し、顕著な差異は観察されなかったことを示した。
抽出された脂質中のＴＡＧ（２８：０）の存在
乳脂肪は、ＴＡＧ２８：０、すなわち２８：０に合計した３つのアシル鎖を含む、比較的低分子量のＴＡＧ分子を含有することが報告されている（Ｇｒｅｓｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＴＡＧ２８：０には、Ｃ１４－Ｃ１０－Ｃ４、Ｃ１６－Ｃ８－Ｃ４、Ｃ１８－Ｃ６－Ｃ４、Ｃ１２－Ｃ１０－Ｃ６、Ｃ１４－Ｃ８－Ｃ６、及びＣ１６－Ｃ６－Ｃ６を含む少なくとも７つの異性体が報告されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
酪酸塩の存在下又は不在下で増殖した酵母ＩＮＶＳｃ１：：ｐＡＴ００３細胞から抽出した脂質から精製したＴＡＧ調製物を、ＬＣ－ＭＳによって分析した。ＴＡＧ２８：０は、ピークＲＴ＝１６．２４～１６．３７、分子量５４４．４５１７で、両方の試料に存在することを観察した。対照的に、ＩＮＶＳｃ１：：ｐＹＥＳ２形質転換細胞からのＴＡＧ調製において、ＴＡＧ２８：０は検出されなかった。したがって、ＬＣ－ＭＳ分析は、ＤＧＡＴ遺伝子構築物を有する形質転換細胞におけるＴＡＧ２８：０種の生成を確認した。これは、ｐＡＴ００３を含有する形質転換酵母細胞において、ＳＣＦＡ、具体的にはＣ４：０及び／又はＣ６：０がＴＡＧに組み込まれたことの更なる証拠を提供した。
Figure 2023518329000003
Figure 2023518329000004
Ｃ４：０を含むＴＡＧを生成する酵母細胞の大規模培養物
ヤギ酵素ＣｈＤＧＡＴ１－Ｘ２をコードする形質転換酵母株ＩＮＶＳｃ１：：ｐＡＴ００３を更なる試験のために選択した。形質転換細胞を、実施例１に記載されるように、２ｍｇ／ｍｌ酪酸ナトリウムの存在下、又は酪酸ナトリウムを添加しなかった状態で、３Ｌ培養中で増殖させた。対照酵母株ＩＮＶＳｃ１：：ｐＹＥＳ２もまた、ＣｈＤＧＡＴ１－Ｘ２酵素の効果を決定するために、同じ条件下で酪酸ナトリウムの有無にかかわらず増殖させた。細胞を採取し、凍結乾燥し、３Ｌ培養物から約２ｇの乾燥細胞重量を得、総脂質を抽出した。ＴＡＧを、実施例１に記載されるように、ＴＬＣによる分画によって全脂質から単離した。ＩＮＶＳｃ１：：ｐＡＴ００３細胞の３Ｌ培養物から単離した精製ＴＡＧの量は、酪酸塩を添加した培養物では３２ｍｇ、同様に酪酸塩を添加したＩＮＶＳｃ１：：ｐＹＥＳ２培養物では９ｍｇであった。
抽出された脂質を少量有する試料も、ＴＬＣプレート上でクロマトグラフィーを行って、異なるＴＡＧタイプをより良く分解した。酪酸塩の存在下で増殖したＩＮＶＳｃ１：：ｐＹＥＳ２と比較して、酪酸塩の存在下で増殖したＩＮＶＳｃ１：：ｐＡＴ００３細胞からの脂質のプリムリン染色後に、プレート上で２つの新しい脂質バンドが観察された。これらは、ＩＮＶＳｃ１：：ｐＡＴ００３細胞で生成されたが、ＩＮＶＳｃ１：：ｐＹＥＳ２細胞では生成されなかった脂質タイプであったので、明らかにＤＧＡＴ活性の結果であった。両方の新しいバンドは、培養物の各々からのＴＡＧの大部分を有するより強度の高いバンドよりもゆっくりとした可動性でＴＬＣプレート上に移動し、新しいバンドは、メインＴＡＧバンドから明確に分解された。２つの新しいバンドは、ＴＬＣプレート上の隣接レーンに適用されたトリアセチン、トリブチリン、トリカプリリン、及びトリデカノインのトリグリセリド混合物を含有するＣ２－Ｃ１０ＴＡＧ対照脂質（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１７８１０－１ＡＭＰ－Ｓ）とほぼ同じ移動度で移動し、新たなバンドが、脂質中のＴＡＧ分子の大部分よりも低い分子量のＴＡＧ種を含有したことを示す。これらの２つのバンドのうちの１つは、添加された酪酸塩の不在下で増殖したＩＮＶＳｃ１：：ｐＡＴ００３からのＴＡＧにも現れたので、酵母細胞内の内因性脂肪酸基質上のＣｈＤＧＡＴ１－Ｘ２酵素の活性の結果であった。他方の新しいバンドは、おそらく内因性脂肪酸基質と共に、添加した酪酸塩を使用したＣｈＤＧＡＴ１－Ｘ２酵素の活性の結果であったと結論付けられた。この実験は、酪酸塩を供給されたＤＧＡＴ形質転換酵母細胞における新しいタイプのＴＡＧの生成を実証した。
ＦＡＭＥによって形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞から抽出されたＴＡＧの脂肪酸組成物
３Ｌ培養物からの精製ＴＡＧの脂肪酸組成物を、脂肪酸のＦＡＭＥ及びＧＣ－ＦＩＤへのメチル化によって分析した。酪酸塩を添加したＩＮＶＳｃ１：：ｐＹＥＳ２細胞からのＴＡＧ調製物、及び乳脂肪試料からのＴＡＧ調製物も、メチル化及びＧＣ－ＦＩＤを通じて同じ処理を使用して並行して分析した。データを表４に提示する。酪酸塩を供給されたｐＡＴ００３形質転換酵母細胞からのＴＡＧは、ＳＣＦＡ Ｃ４：０及びＣ６：０を含有し、Ｃ８：０脂肪酸の量を増加させたが、ＩＮＶＳｃ１：：ｐＹＥＳ２からのＴＡＧは、Ｃ４：０及びＣ６：０脂肪酸を欠いていたことに留意されたい。ＩＮＶＳｃ１：：ｐＡＴ００３からのＴＡＧはまた、ＩＮＶＳｃ１：ｐＹＥＳ２からのＴＡＧと比較して増加した量のＭＣＦＡ Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、及びＣ１４：０を含有し、培地からの酪酸塩の少なくとも一部が、ＴＡＧに組み込まれる前に形質転換酵母細胞内で細長くなっていたことを示す。酵母におけるＣｈＤＧＡＴ１－Ｘ２酵素の発現は、グリセロール骨格にエステル化された少なくとも１つのＳＣＦＡを有するかなりの量のＴＡＧを生成することができたと結論付けられた。更に、形質転換酵母細胞からのＴＡＧ中のＣ４：０、Ｃ６：０、Ｃ８：０、及びＣ１０：０のレベルは、乳脂肪のＴＡＧ中のこれらの脂肪酸のレベルに類似していた（表４）。乳脂肪ＴＡＧは、酵母細胞ＴＡＧよりもはるかに多くの量のＣ１４：０を有したが、両方とも大量のＣ１６：０を有し、各試料中に３０％（モル％）を超えた。Ｃ１６：１ｎ－７脂肪酸（パルミトール酸）の量は、ＴＡＧ調製物において、酵母細胞及び乳脂肪とは大きく異なり、乳脂肪における約２％と比較して、ＩＮＶＳｃ１：：ｐＡＴ００１からのＴＡＧでは約３６％であった。ＩＮＶＳｃ１：：ｐＹＥＳ２のＣ１６：１ｎ－７のレベルは、約４９％で更に高く、ＩＮＶＳｃ１：ｐＹＥＳ２のＴＡＧでもＣ１８：１のレベルが大きく上昇したが、１１．２％のＣ１６：０のレベルは、３０．９２％のＩＮＶＳｃ１：ｐＡＴ００３のＴＡＧよりもはるかに低かった。
ＧＣ－ＦＩＤによって観察されたＦＡＭＥ分子の同一性は、ＧＣ－ＭＳによっても確認された（表５）。
ＩＮＶＳｃ１：：ｐＡＴ００３の１．６％におけるＴＡＧ含有量は、ＩＮＶＳｃ１：：ｐＹＥＳ２の０．５％におけるＴＡＧ含有量と比較して有意に増加し、各図は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）ベースである。
Figure 2023518329000005
ブチル化による脂肪酸組成物
実施例１に記載したように、脂肪酸のメチル化ではなく、脂肪酸のブチルエステル（ＦＡＢＥ）へのブチル化を含む方法を使用して、酪酸塩を供給された３Ｌ酵母培養物からの精製ＴＡＧも脂肪酸組成物について分析した。簡単に述べると、ＴＡＧをＴＬＣによって総脂質から精製し、６００μｌのクロロホルム／メタノール（２：１ｖ／ｖ）を使用して、ＴＡＧスポットのシリカから抽出し、混合物を１０分間振盪した後、混合物を遠心分離した。水中の０．１Ｍ ＫＣｌを３００μｌ添加した。混合物を５分間振盪し、遠心分離して、相を分離した。ＴＡＧを含有する下部非極性相を収集した。残りのシリカ／水性混合物を、３００μｌのクロロホルム及び非極性相を合わせた状態で２回抽出した。抽出物をフィルターを通して回転させて、任意のシリカ粒子を除去し、平らな挿入部を有するＧＣバイアルで乾燥させた。ブチル化のために、１０ｍｌの３Ｎ ＨＣｌと、２０ｍｌの乾燥ブタノールを混合することによって調製した６０μｌのブタノール－１Ｍ ＨＣｌを、５μｌの既知の量のペンタン酸標準物質（Ｃ５：０、約２３．２５μｇ）と共に添加し、混合し、８０℃で２時間加熱した。冷却後、３０μｌの水及び３０μｌのヘキサンを添加し、混合物を５分間振盪させ、回転させて相を分離した。上部有機相をＧＣバイアルに収集し、蒸発を最小限に抑え、脂肪酸分析のためにＧＣ－ＦＩＤにアリコートを注射した。ＦＡＢＥを、実施例１に記載されるようにＡｇｉｌｅｎｔ７８９０Ａ ＧＣ上で定量化した。ＦＡＢＥもまた、実施例１に記載されるように、Ｃ８Ｃ２４法を使用して定量化した。
Figure 2023518329000006
脂肪酸組成データ（表６）は、ｐＡＴ００３を含有するトランスジェニック酵母細胞が、そのＴＡＧ中で４～５％（重量％）のＣ４：０を生成し、約２．３％（重量％）の乳脂肪よりもかなり高いことを示した。Ｃ６：０及びＣ８：０は、形質転換酵母細胞のＴＡＧにも存在した。約３６％（重量％）の形質転換酵母細胞によって生成されたＴＡＧの飽和ＬＣＦＡ含有量（Ｃ１６：０＋Ｃ１８：０）は、約５２～５８％（重量％）の乳脂肪中の含有量よりも有意に低かった。飽和ＭＣＦＡ含有量（Ｃ１０：０＋Ｃ１２：０＋Ｃ１４：０）も、乳脂肪と比較して、酵母細胞のＴＡＧにおいて有意に低かったため、全体として、酵母生成ＴＡＧにおける飽和脂肪含有量は、乳脂肪における約８２～８８％ではなく、重量ベースで約５４％の減少をもたらした。飽和脂肪、特に飽和ＬＣＦＡは、一価不飽和脂肪及び多価不飽和脂肪よりもヒト消費者にとって健康ではないと考えられるため、発明者らは、酵母生成ＴＡＧは、乳脂肪などの動物性脂肪よりも重量ベースで消費するために健康であると結論付けた。加えて、酵母生成ＴＡＧは、乳脂肪よりも比較的健康な脂肪酸とも考えられる、実質的に高いレベルの一価不飽和脂肪酸Ｃ１６：１（パルミトレイン酸）を含んでいた。
トランスジェニック酵母細胞からのＴＡＧにおけるＳＣＦＡの位置分布。
酪酸塩の存在下で増殖させた酵母ＩＮＶＳｃ１：：ｐＡＴ００３細胞の３Ｌ培養物から単離したＴＡＧ中の脂肪酸の位置分布を、プロピル化による単離されたＭＡＧ中の脂肪酸のプロピルエステル（ＦＡＰＥ）への変換を除いて、実施例１に記載のＲｈｉｚｏｐｕｓリパーゼアッセイを使用して分析した。方法は、それによって、ｓｎ－２ＭＡＧの、ＦＡＰＥへの変換及びＧＣ－ＦＩＤによる解析を含んでいた。データは、重量ベース又はモル％ベースのいずれかで表７に示される。データは、ＴＡＧに存在するＣ４：０及びＣ６：０が、ほぼ完全にＴＡＧ分子のｓｎ－１／３位にあったことを示し、ＴＡＧのｓｎ－１及びｓｎ－３位は、ＴＡＧの合成中に生化学的に区別されるにもかかわらず、リパーゼ活性に関して化学的に不明瞭である。導入されたＣｈＤＧＡＴ１－Ｘ２遺伝子からのＤＧＡＴ活性の結果としてのみ、Ｃ４：０及びＣ６：０がＴＡＧ内に存在したため、これは、Ｃ４：０及びＣ６：０のほぼ全て（＞９５％）が、酵母細胞内で生成されたＴＡＧのｓｎ－３位でエステル化されたことを意味した。Ｃ８：０脂肪酸もまた、主にＴＡＧのｓｎ－１／３位にあり、ＤＧＡＴ活性に起因してｓｎ－３位に存在することが再び示唆された。飽和脂肪酸Ｃ１４：０及びＬＣＦＡ Ｃ１６：０及びＣ１８：０の各々もまた、主にｓｎ－１／３位にあった。これは、Ｃ１６：０（パルミチン酸）について最も顕著であった：ＴＡＧのｓｎ－１／３位の脂肪酸の３９．１６％はパルミチン酸であったが、ＴＡＧ分子のｓｎ－２位の脂肪酸の２．６８％はパルミチン酸であった。対照的に、Ｃ１０：０及びＣ１２：０脂肪酸は、ほとんどＴＡＧのｓｎ－２位でエステル化された。更に、一価不飽和脂肪酸Ｃ１４：１、Ｃ１６：１、Ｃ１８：１Δ９、及びＣ１８：１Δ１１は全て、主にＴＡＧのｓｎ－２位にあった。したがって、異なる脂肪酸のｓｎ－１／３位及びｓｎ－２位で観察されたこれらの嗜好の多くは、乳脂肪ＴＡＧで観察されたものと同様であった（表７）。発明者らは、種々の脂肪酸の位置分布に関して、酵母生成されたＴＡＧは、乳脂肪ＴＡＧと同様の特徴を有すると結論付けた。
位置分布解析は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓリパーゼアッセイにおいてプロピル化ではなくブチル化を使用して繰り返される。
Figure 2023518329000007
Figure 2023518329000008
広範に記載されている本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるように本発明に多数の変形及び／又は修正が行われ得ることは、当業者には理解されよう。したがって、本実施形態は、あらゆる点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
本明細書において考察及び／又は参照される全ての刊行物は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス、物品などのいかなる考察も、本発明のための文脈を提供することのみを目的としている。これらの事項のいずれか又は全てが、従来技術の基盤の一部を形成する、又は本出願の各特許請求項の優先日以前に存在したため、本発明に関連する分野における一般的な知識であったことを認めるものとみなされるべきではない。
本出願は、２０２０年３月１３日に出願されたＡＵ２０２０／９００７８０からの優先権を主張し、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
参考文献
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Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ，７：２４．
Ｍａｎｎｉｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２０１９，６７，４９９－５０６．
Ｍａｒｓｈａｌｌ ａｎｄ Ｋｎｕｄｓｅｎ（１９７９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４，９３－９８．
Ｍａｎｓｓｏｎ（２００８）Ｆｏｏｄ ＆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＯＩ：１０．３４０２／ｆｎｒ．ｖ５２ｉ０．１８２１．
Ｍａｒａｎｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６：３２９－３３５．
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３．
Ｏｒｒ－Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７８：６３５４－５８．
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Claims (22)

  1. 抽出された脂質を生成するためのプロセスであって、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）分子を含む微生物細胞から脂質を抽出することであって、各ＴＡＧ分子が、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、前記ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかが、前記ｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡを含む、抽出することを行い、それによって、前記抽出された脂質を生成することを含む、プロセス。
  2. 前記ＴＡＧ分子中の前記エステル化されたＳＣＦＡが、酪酸（Ｃ４：０）、カプロン酸（Ｃ６：０）、及びカプリル酸（Ｃ８：０）のうちの１つ以上又は全てであり、好ましくはＣ４：０、又はＣ４：０及びＣ６：０、より好ましくはＣ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０を含む、請求項１に記載のプロセス。
  3. 前記抽出された脂質は、
    （ｉ）前記脂質が、ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数に対する比（ＳＣＦＡ比ｓｎ－２：ｓｎ－３）が、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満であること、
    （ｉｉ）前記脂質が、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記ｓｎ－２位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子の数に対する比（Ｃ４：０のｓｎ－２：ｓｎ－３比）が、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満であること、
    （ｉｉｉ）前記脂質が、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記ｓｎ－２位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子の数に対する比（Ｃ６：０のｓｎ－２：ｓｎ－３比）が、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満であること、
    （ｉｖ）ＳＣＦＡの前記ｓｎ－２：ｓｎ－３比が、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５であること、
    （ｖ）Ｃ４：０の前記ｓｎ－２：ｓｎ－３比が、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５であること、
    （ｖｉ）Ｃ６：０の前記ｓｎ－２：ｓｎ－３比が、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５であること、
    （ｖｉｉ）前記ＳＣＦＡが、Ｃ４：０を含み、Ｃ４：０の前記ｓｎ－２：ｓｎ－３比が、約０．０１超又は約０．０２超であること、
    （ｖｉｉｉ）前記抽出された脂質中の前記ＴＡＧ分子のうちの多くが、前記ＴＡＧ分子中でエステル化された２つのＳＣＦＡよりも、前記ＴＡＧ分子中でエステル化された１つのＳＣＦＡのみを有すること、
    （ｉｘ）前記抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１重量％若しくはモル％、又はその両方が、ＳＣＦＡであり、好ましくは、少なくとも１％が、Ｃ４：０であり、又はＣ４：０とＣ６：０との合計について少なくとも１％であること、
    （ｘ）前記抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、又は少なくとも３０重量％が、Ｃ１６：１であり、好ましくは、最大５０重量％であること、及び
    （ｘｉ）前記抽出された脂質の前記ＴＡＧ分子が、前記ｓｎ－２位でエステル化された任意の他の脂肪酸よりも、前記ｓｎ－２位でエステル化されたＣ１６：１を多く含み、好ましくは、前記ＴＡＧ分子の前記ｓｎ－２位でエステル化された前記脂肪酸の少なくとも３０％又は少なくとも４０％が、Ｃ１６：１であること、のうちの１つ以上又は全てを特徴とする、請求項１又は２に記載のプロセス。
  4. 前記微生物細胞が、真菌細胞、細菌細胞、若しくは藻類細胞、又はそれらの任意の混合物、好ましくは酵母細胞、より好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。
  5. 前記細胞が、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ又は１つを超える脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼが、基質としてのＳＣＦＡ－ＣｏＡ分子、好ましくは基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ活性を有し、各外因性ポリヌクレオチドが、前記細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができる１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のプロセス。
  6. 前記脂肪酸アシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つが、
    （ｉ）哺乳類アシルトランスフェラーゼ又はその変異体、好ましくは反射型アシルトランスフェラーゼ又はその変異体、
    （ｉｉ）ジアシルグリセロールＯ－アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、好ましくはＤＧＡＴ１、
    （ｉｉｉ）１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール：アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＤＡｃＴ）、
    （ｉｖ）哺乳類ＤＧＡＴ又はその変異体、好ましくは反射型ＤＧＡＴ又はその変異体、及び
    （ｖ）配列が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９のうちのいずれか１つとして示されるアミノ酸、又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、又は２９のうちのいずれか１つ以上の全長に沿って少なくとも３０％同一であるアミノ酸配列を含むＤＧＡＴのうちの１つ以上である、請求項５に記載のプロセス。
  7. 前記脂質を抽出するステップが、前記細胞を有機溶媒に曝露すること、前記細胞を押すこと、又は前記細胞を、マイクロ波照射、超音波処理、高速均質化、高圧均質化、ビーズ拍動、オートクレーブ、熱分解、又はそれらの任意の組み合わせで処理することを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のプロセス。
  8. 前記方法が、好ましくは、酪酸塩（Ｃ４：０）を含む培地中で、例えば、前記培地中の約１～約２０ｇ／Ｌの範囲内の濃度で、前記細胞を培養することを更に含み、及び／又は抽出後に前記脂質を修飾又は精製することを更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のプロセス。
  9. トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）分子を含む、抽出された微生物脂質であって、各ＴＡＧ分子が、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、前記ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかが、前記ＴＡＧ分子の前記ｓｎ－３位でエステル化された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含む、抽出された微生物脂質。
  10. 前記ＴＡＧ分子の前記ｓｎ－３位でエステル化された前記ＳＣＦＡが、Ｃ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０、好ましくはＣ４：０及びＣ６：０、より好ましくはＣ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０のうちの１つ以上又は全てである、請求項９に記載の脂質。
  11. （ｉ）前記抽出された脂質が、ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記ｓｎ－２位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＳＣＦＡを含むＴＡＧ分子の数に対する比（ＳＣＦＡ比ｓｎ－２：ｓｎ－３）が、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満であること、
    （ｉｉ）前記抽出された脂質が、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記ｓｎ－２位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＣ４：０を含むＴＡＧ分子の数に対する比（Ｃ４：０のｓｎ－２：ｓｎ－３比）が、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満であること、
    （ｉｉｉ）前記抽出された脂質が、ｓｎ－２位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子を含み、前記抽出された脂質中の、前記ｓｎ－２位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子の数の、ｓｎ－３位でエステル化されたＣ６：０を含むＴＡＧ分子の数に対する比（Ｃ６：０のｓｎ－２：ｓｎ－３比）が、約０．５０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１０未満、約０．０５未満、約０．０４未満、約０．０３未満、又は約０．０２未満であること、
    （ｉｖ）ＳＣＦＡの前記ｓｎ－２：ｓｎ－３比が、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５であること、
    （ｖ）Ｃ４：０の前記ｓｎ－２：ｓｎ－３比が、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５であること、
    （ｖｉ）Ｃ６：０の前記ｓｎ－２：ｓｎ－３比が、約０．００５超、約０．０１超、約０．００５～約０．１０、約０．０１～約０．１０、約０．００５～約０．０５、又は約０．０１～約０．０５であること、
    （ｖｉｉ）前記ＳＣＦＡが、Ｃ４：０を含み、前記ＳＣＦＡ比ｓｎ－２：ｓｎ－３が、約０．０１超又は約０．０２超であること、
    （ｖｉｉｉ）前記抽出された脂質中の前記ＴＡＧ分子のうちの多くが、前記ＴＡＧ分子にエステル化された２つのＳＣＦＡよりも、前記ＴＡＧ分子にエステル化された１つのＳＣＦＡのみを有すること、
    （ｉｘ）前記抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１重量％若しくはモル％、又は両方が、ＳＣＦＡであり、好ましくはＣ４：０であるか、又はＣ４：０とＣ６：０との合計であるか、又はＣ４：０、Ｃ６：０、及びＣ８：０の合計であること、
    （ｘ）前記抽出された脂質の総脂肪酸含有量の少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、又は少なくとも３０重量％が、Ｃ１６：１であり、好ましくは、最大５０重量％であること、及び
    （ｘｉ）前記抽出された脂質の前記ＴＡＧ分子が、前記ｓｎ－２位でエステル化された任意の他の脂肪酸よりも、前記ｓｎ－２位でエステル化されたＣ１６：１を多く含み、好ましくは、ＴＡＧの前記ｓｎ－２位でエステル化された前記脂肪酸の少なくとも３０％又は少なくとも４０％が、Ｃ１６：１であること、のうちの１つ以上又は全てを特徴とする、請求項９又は１０に記載の脂質。
  12. 微生物細胞であって、
    （ａ）トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）分子であって、各ＴＡＧ分子が、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、前記ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかが、前記ＴＡＧ分子の前記ｓｎ－３位でエステル化された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含む、ＴＡＧ分子と、
    （ｂ）脂肪酸アシルトランスフェラーゼ又は１つを超える脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドであって、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼが、基質としてのＳＣＦＡ－ＣｏＡ分子、好ましくは基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ、又は基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ及びカプロイル－ＣｏＡに活性を有し、各外因性ポリヌクレオチドが、前記細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができる１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドと、を含む、微生物細胞。
  13. 前記ＴＡＧ分子又は前記脂肪酸アシルトランスフェラーゼが、請求項５又は６に記載の特徴のうちの１つ以上を有する、請求項１２に記載の細胞。
  14. 微生物細胞を培養するためのプロセスであって、
    （ａ）ＴＡＧ分子を生成する微生物細胞を得ることであって、各ＴＡＧ分子は、ｓｎ－１位、ｓｎ－２位、及びｓｎ－３位の各々でエステル化された脂肪酸を有し、前記ＴＡＧ分子のうちの少なくともいくつかが、前記ＴＡＧ分子の前記ｓｎ－３位でエステル化された短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を含む、得ること、かつ／又は
    （ｂ）脂肪酸アシルトランスフェラーゼ又は１つを超える脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む微生物細胞を得ることであって、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼが、基質としてのＳＣＦＡ－ＣｏＡ分子、好ましくは基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ、又は基質としての少なくともブチリル－ＣｏＡ及びカプロイル－ＣｏＡに活性を有し、各外因性ポリヌクレオチドが、前記細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができる１つ以上のプロモーターに作動可能に連結されている、得ること、及び
    （ｃ）前記細胞を好適な培地で培養することによって、前記細胞の数を増加させること、を含む、プロセス。
  15. 前記培地が、酪酸塩（Ｃ４：０）を含む、請求項１４に記載のプロセス。
  16. ＴＡＧ分子を生成する微生物細胞を生成するためのプロセスであって、請求項５又は６に記載の１つ以上の脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを導入するステップを含む、プロセス。
  17. 請求項１２又は１３に記載の微生物細胞を選択又は同定するためのプロセスであって、
    （ｉ）請求項５又は６に記載の脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む微生物細胞からの脂質を分析するステップと、
    （ｉｉ）請求項１２又は１３に記載の微生物細胞である、ステップｉ）からの微生物細胞を選択又は同定するステップと、を含む、プロセス。
  18. 好ましくは、別の食品又は飲料成分と共に、請求項９～１１のいずれか一項に記載の脂質、又は請求項１２若しくは１３に記載の微生物細胞のうちの一方又は両方を含む、組成物。
  19. 請求項９～１１のいずれか一項に記載の抽出された脂質、請求項１２若しくは１３に記載の微生物細胞、又は請求項１８に記載の組成物のうちの１つ以上、及び少なくとも１つの他の食品、供給、又は飲料成分を含む、食品、飼料、又は飲料。
  20. 動物に由来する成分を有さない、請求項１９に記載の食品、飼料、又は飲料。
  21. 食品、飼料、若しくは飲料成分、又は食品、飼料、若しくは飲料を生成する方法であって、請求項９～１１のいずれか一項に記載の抽出された脂質、請求項１２若しくは１３に記載の微生物細胞、又は請求項１８に記載の組成物のうちの１つ以上を、少なくとも１つの他の食品若しくは飼料成分と混合すること、及び／又は請求項９～１１のいずれか一項に記載の抽出された脂質、請求項１２若しくは１３に記載の微生物細胞、又は請求項１８に記載の組成物を処理することを含む、方法。
  22. 食品、飼料、若しくは飲料成分、又は食品、飼料、若しくは飲料を生成するための、請求項９～１１のいずれか一項に記載の抽出された脂質、請求項１２若しくは１３に記載の微生物細胞、又は請求項１８に記載の組成物のうちの１つ以上の使用。
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