JP2023518150A - コロナウイルスの治療用のヌクレオチド類似体 - Google Patents

コロナウイルスの治療用のヌクレオチド類似体 Download PDF

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Abstract

コロナウイルス感染症、及び／又はコロナウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患の治療における使用のための、式Ｉで表される化合物。TIFF2023518150000014.tif35161（式中、Ｒ１は、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、ヒドロキシル基、及びリン酸基から選択され、Ｒ２は、ハロゲン及び／又は水素から選択される基であり、Ｙは、核塩基、好ましくはプリン又はピリミジンである。）【選択図】図１

Description

本発明は、特に、ウイルス感染症、例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲｓ－ＣｏＶ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症の治療におけるヌクレオチド類似体に関する。
潜在的な生物活性標的化合物の前駆体として、キナゾリン部分及びアデニン部分からなる共役化合物が合成された。９－（４－メトキシキナゾリン－２－イル）－９Ｈ－プリン－６－アミン（２）の構造が特徴づけられ、非特許文献１で報告された。
コロナウイルスは、エンベロープ型プラス鎖ＲＮＡウイルスの一群である。そのゲノムサイズは長さ約３０キロベースであり、ＲＮＡウイルスとしては非常に大きい。このサブファミリーの他の共通する特徴には、いくつかの酵素活性をコードする大きいレプリカーゼ遺伝子及び独自の複製戦略が含まれる。
コロナウイルスゲノムの典型的な構成は、５’－リーダー－ＵＴＲ－レプリカーゼ－Ｓ（スパイク）－Ｅ（エンベロープ）－Ｍ（膜）－Ｎ（ヌクレオカプシド）－３’ＵＴＲである。ゲノムはさらに、５’メチル化されたキャップ及び３’ポリアデニル化尾部を含有し、翻訳用のｍＲＮＡとして作用することを可能にする。悪評の高いコロナウイルス、つまりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトにおいて感染力の強い一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、かつ世界保健機関（ＷＨＯ）によって国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態に指定された、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の進行中のパンデミックの原因である。
ビリオンが宿主細胞に付着すると感染が始まる。感染は、ウイルスのスパイク（Ｓ）糖タンパク質と宿主細胞のＡＣＥ２受容体との間の相互作用によって始まる。付着に続き、ウイルスは次いで、そのゲノムを宿主細胞サイトゾル中に放出する必要がある。放出は、Ｓタンパク質の切断を伴うセリンプロテアーゼＴＭＰＲＳＳ２によるスパイク糖タンパク質のプライミングによって実現される。こうして最終的に、ウイルス膜と細胞膜との融合、及び宿主細胞内へのウイルスの侵入を可能にする。コロナウイルスの生活環における次のステップは、細胞の機構を使用したレプリカーゼ遺伝子の翻訳である。レプリカーゼ遺伝子は、長さ約２０キロベースであり、２つのＯＲＦ、即ちｏｒｆ１ａ及びｏｒｆ１ａｂをコードし、それぞれが、ｐｐ１ａポリタンパク質及びｐｐ１ａｂポリタンパク質を発現する。各ポリタンパク質は、様々な酵素活性を発揮するいくつかのｎｓｐ（非構造タンパク質）を含有する。各ポリタンパク質は、ウイルス自身のプロテアーゼによって個々のｎｓｐへと切断される。コロナウイルスの主なプロテアーゼは、セリン型プロテアーゼのＭｐｒｏである。ＣＯＶＩＤ－１９コロナウイルスの３ＣＬ加水分解酵素（Ｍｐｒｏ）の最初の高分解能結晶構造は、上海科技大学のＺｉｈｅ Ｒａｏ及びＨａｉｔａｏ Ｙａｎｇの研究チームによって確定された（ＰＤＢエントリー６ＬＵ７）。
次いで、ｎｓｐの多くが、サブゲノムＲＮＡのＲＮＡ複製及び転写を担うレプリカーゼ－転写酵素複合体（ＲＴＣ）へとアセンブルする。その複合体を含むｎｓｐは、以下を含む：
● ゲノムＲＮＡの合成を仲介するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｎｓｐ１２）
● プルーフリーディング及びＮ７メチルトランスフェラーゼ活性に関与する３’→５’エキソヌクレアーゼ（ｎｓｐ１４）
ＲＴＣ複合体の翻訳及びアセンブリーの後に、ウイルスＲＮＡ合成が起こり、ゲノムＲＮＡ及びサブゲノムＲＮＡの両方が産生される。複製中、ゲノムの全長マイナス鎖ＲＮＡのコピーが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって産生され、全長プラス鎖ＲＮＡゲノムの鋳型として使用される。転写中、サブゲノムＲＮＡのサブセットが、不連続転写を介して産生される。
９－（４－Ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎａｚｏｌｉｎ－２－ｙｌ）－９Ｈ－ｐｕｒｉｎ－６－ａｍｉｎｅ；Ｉ．Ｖｌａｃｈｏｕ，Ｅ．Ｋｏｕｒｔｉｄｏｕ及びＩ．Ｐａｐａｓｏｔｉｒｉｏｕ，Ｍｏｌｂａｎｋ ２０１６，２０１６年（１），Ｍ８８５；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／Ｍ８８５
蔓延を停止させ、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２に罹患した患者に効果的な治療選択肢を提供するために、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの必須酵素の標的化によりウイルス複製を破壊することで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者の治療に使用され得る新規化合物を提供する必要性が存在する。
本発明は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、もしくはＳＡＲＳ－ＣｏＶによって引き起こされる疾患又は呼吸器疾患の治療において使用され得るヌクレオチド類似体を提供する。
従って、本発明の主題は、コロナウイルス感染症、及び／又はコロナウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患の治療における使用のために、式Ｉで表される化合物を提供することである。
Figure 2023518150000002
 （式中、
Ｒ１は、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、ヒドロキシル基、及びリン酸基から選択される基であり、
Ｒ２は、ハロゲン及び／又は水素から選択される基であり、
Ｙは、核塩基、好ましくはプリン又はピリミジンである。）
従って、前記化合物は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤としてｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで使用され得る。
本発明の更なる実施形態は、従属請求項に規定される。
本発明の好ましい実施形態を、以下に図面と関連して記載するが、図面は本発明の好ましい実施形態を説明するためのものであり、限定するためのものではない。
図１は、ＰＣＲ増幅産物が、従来型ｄＮＴＰと共に、本発明による化合物の異なる濃度に対するバンドとして可視化されるアガロースゲルの写真を示す。
好ましい実施形態の説明
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ｎｓｐ１２）は、ウイルスゲノムＲＮＡの複製及び転写に直接関与する。研究により、ｎｓｐ１２はそれ自体いくらかの活性を有するが、補因子ｎｓｐ７及びｎｓｐ８の添加が、ポリメラーゼ活性の著しい上昇をもたらすことが示された。ウイルス複製の完全なレパートリーを遂行するためには、さらにｎｓｐサブユニットが必要である可能性が高い。しかしながら、これまでのところ、ｎｓｐ１２－ｎｓｐ７－ｎｓｐ８複合体が、ヌクレオチド重合に必要とされる最小複合体である。
コロナウイルスのサブファミリーメンバーを横断する配列解析は、鋳型侵入、鋳型－プライマー放出、ＮＴＰトンネル、及びポリメラーゼ活性部位が、ｎｓｐ１２上の最も高度に保存された表面であることを明らかにする。さらに、鋳型及びヌクレオチドの結合に関与する７つのモチーフ領域（Ａ－Ｇ）が存在し、それらの領域もまた、コロナウイルスサブファミリー間で保存されていることが分かった。
ポリメラーゼ活性部位は、モチーフＡ及びＣから構成され、モチーフＢ及びＤによってサポートされる。ＲＮＡ鋳型は、活性部位に進入する前にモチーフＧによって通過するのに対して、入ってくるＮＴＰは、トンネルを通過して進入し、モチーフＦと相互作用する。いったん活性部位に入ると、ＮＴＰは、Ｔ６８０、Ｎ６９１、及びＤ６２３と水素結合を形成する可能性が高い。これらの残基の３つはいずれも、コロナウイルスファミリーにわたって保存されている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２では、ｎｓｐ１２は、９３２アミノ酸長であり、ｐｐ１ａｂ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ｉｄ：Ｐ０Ｃ６Ｘ７）の４３９５位～５３２４位を占める。そのタンパク質の利用可能な実験構造は、出願日の時点では存在しない。そのタンパク質配列をＰＤＢに対してＢＬＡＳＴ検索すると、そのタンパク質の最も近いホモログは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶのｎｓｐ１２であることが明らかになった。２つのタンパク質は、９６．３５％の配列同一性を共有し、それは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ１２の９９％をカバーする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶのｎｓｐ１２の構造は、ＰＤＢエントリー６ＮＵＲに登録されている。
６ＮＵＲの３Ｄ構造を鋳型として使用して、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬウェブサーバー及びＩＣＭ Ｐｒｏによるホモロジーモデルを作成した。両方とも良質のモデルであり、重ね合わせ後に０．９９２１０のＴＭスコアが達成された。２つのモデル間のＲＭＳＤは１．１４であり、大部分は、２つのソフトウェア間で異なる位置にギャップが挿入されたことに由来する。その結果、その領域でのループは、各モデルにおいて異なる立体配座を有する。本発明の化合物のドッキングを行う構造として、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ由来のホモロジーモデルを使用した。
前記のホモロジーモデリングに基づいて、本発明のヌクレオチド類似体は、新しく合成されるＲＮＡ鎖に組み込まれ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで複製の早期集結を引き起こすと予想される。
本発明は、コロナウイルス感染症、及び／又はコロナウイルスによって引き起こされる呼吸器疾患の治療における使用のための、式Ｉで表される化合物を提供する。
Figure 2023518150000003
 （式中、
Ｒ１は、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、ヒドロキシル基、及びリン酸基から選択される基であり、
Ｒ２は、ハロゲン及び／又は水素から選択される基であり、
Ｙは、核塩基、好ましくはプリン又はピリミジンである。）
核塩基がプリンである場合、前記プリンは、９位を介してキナゾリン部分に結合している。
核塩基がピリミジンである場合、前記プリンは、１位を介してキナゾリン部分に結合している。
式Ｉで表される化合物は、核塩基、例えば、生物又はウイルスの遺伝暗号中に見出される核塩基と、４位で修飾されたキナゾリン部分との複合体である。
式Ｉで表される化合物は、核塩基、例えば、生物又はウイルスの遺伝暗号中に見出される核塩基と、さらに７位においてハロゲン又はハロゲン化残基、例えばフッ素で修飾されたキナゾリン部分との複合体である。
核塩基は、標準的な核塩基、例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）であり得る。しかしながら、本発明による化合物中において有用な核塩基はさらに、修飾核塩基又は人工核塩基、例えば、キサンチン、ヒポキサンチン、７－メチルグアニン、Ｎ２－アセチルグアニン、Ｎ４－アセチルシトシン、又はイソグアニンであり得る。
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物において、Ｒ１は、ヒドロキシル基又はリン酸基から好ましくは選択される基であり、最も好ましくはリン酸基である。
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物において、Ｙは、プリン、例えば、アデニン又はグアニンであり、最も好ましくはアデニンである。
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物において、Ｙは、ピリミジン、例えば、シトシン、チミジン、又はウラシルである。さらに、式Ｉで表される化合物において、Ｙは、ピリミジン類似体、例えば５－フルオロシトシンでもあり得る。
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物において、Ｙは、シトシンであり、Ｒ１は、ヒドロキシルであり、Ｒ２は、水素である：
Figure 2023518150000004
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物において、Ｙは、５－フルオロシトシンであり、Ｒ１は、ヒドロキシルであり、Ｒ２は、水素である：
Figure 2023518150000005
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物が、好ましくは、コロナウイルス感染症、及び／又はＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ若しくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患若しくは呼吸器疾患の治療での使用のための化合物である。好ましい一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる前記疾患がＣＯＶＩＤ－１９である。
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物が、２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－オールである。
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物が、２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－イル二水素ホスファートである。
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物が、２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－７－フルオロ－キナゾリン－４－オールである。
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物において、Ｙがグアニン又はＮ－アセチルグアニンであり、Ｒ１がヒドロキシルである場合、キナゾリン部分がさらに、その７位においてハロゲン又はハロゲン化残基で修飾されていてもよい：
Figure 2023518150000006
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物が、２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－７－フルオロ－キナゾリン－４－イル二水素ホスファートである。
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物において、ＹがＮ－アセチルグアニンであり、Ｒ１がヒドロキシルであり、キナゾリン部分が、その７位においてハロゲン又はハロゲン化残基で修飾されていてもよく、修飾されていなくてもよい：
Figure 2023518150000007
好ましい一実施形態では、式Ｉで表される化合物において、ＹがＮ４－アセチルシトシンであり、Ｒ１がヒドロキシルであり、キナゾリン部分が、その７位においてハロゲン又はハロゲン化残基で修飾されていてもよく、修飾されていなくてもよい。
本発明はさらに、コロナウイルス感染症、及び／又はコロナウイルス、例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、もしくはＳＡＲＳ－ＣｏＶによって引き起こされる呼吸器疾患の治療における使用のための、式Ｉで表される化合物を少なくとも１つ含む医薬製剤を提供し、式中、Ｒは、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、ヒドロキシル基、リン酸基から選択される基であり得、好ましくは、前記医薬製剤は、２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－オール、又は２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－イル二水素ホスファート、又はその両方を含む。
本発明はさらに、コロナウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、特に、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、とりわけＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＮＳＰ１２を阻害するための、式Ｉで表される前記の化合物を提供し、式中、Ｒは、アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基等）、ヒドロキシル基、リン酸基から選択される基であり得、好ましくは、式Ｉで表される化合物は、２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－オール、又は２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－イル二水素ホスファートである。
好ましい一実施形態では、医薬製剤が、経口製剤、例えば、錠剤若しくはカプセル、又は注射用製剤である。
実験データ
ヌクレオチド類似体の合成
Figure 2023518150000008
ａ：１－ドデカンチオール、Ｃｓ２ＣＯ３、ＤＭＳＯ
ｂ：Ｐ２Ｏ５、ＴＢＡＢ、Ｈ２Ｏ２ ３０％、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（１／１）
微量の水及び他の粒子を除去するために窒素でパージした清潔な乾燥した丸底フラスコに、９－（４－メトキシキナゾリン－２－イル）－９Ｈ－プリン－６－アミン（０．７９２２ｇ、２．７ｍｍｏｌ）及びＤＭＳＯ ２．７ｍｌを加えた。次いで、炭酸セシウム（２．６０６３ｇ、８．０ｍｍｏｌ）を加えてから、最後に１－ドセカンチオール（０．９９ｍｌ、４．０ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を、室温で１ｈ撹拌した。反応混合物を砕氷中へと注ぎ、ろ過した。固体をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、望みの生成物を２０％の収率で得た。
ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（１／１）２４ｍｌ中の五酸化リン（０．０６９４ｇ、０．５ｍｍｏｌ）の冷却溶液（０℃）に、過酸化水素の３０％溶液（１．８ｍｌ）を滴下して５分撹拌した。次いで、臭化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（０．９７ｇ、３ｍｍｏｌ）及び２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－オール（０．２７９ｇ、１ｍｍｏｌ）を加え、０℃で５ｈ撹拌した。反応混合物をろ過してから、固体をＭｅＯＨ ２０ｍｌで３回希釈して、２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－イル二水素ホスファートを４９％の収率で得た。
微量の水及び他の粒子を除去するために窒素でパージした清潔な乾燥した丸底フラスコに、アデニン（１．３５１２ｇ、１０ｍｍｏｌ）、２－クロロ－４－ヒドロキシキナゾリン（２．３４ｇ、１３ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（３．２６１２ｇ、１０ｍｍｏｌ）及びシリカゲル（３．５ｇ）の十分に粉砕した混合物を、不活性雰囲気下に加えた。次いで、乾燥ＤＭＳＯ ２０ｍＬを加えた。溶液を１３０℃で３．５ｈ撹拌してから、氷冷水中へと注ぎ、ろ過した。
ポリメラーゼの作用
試験した２つの物質は、２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－オール（ヒドロキシ物質）及び２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－イル二水素ホスファート（リン酸塩物質）である。
前記物質は、修飾ヌクレオチド類似体であることから、第１組の実験では、２つの物質の重合阻害能を試験した。市販の鋳型並びに２つのハウスキーピング遺伝子（１８ＳｒＲＮＡ及びアクチン）を使用してエンドポイントＰＣＲ反応を行った。従来型ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）の異なる濃度と同様に、本発明の生成物の異なる濃度、並びにそれらの組合せを使用して反応を行った。次いでＰＣＲ産物をゲル電気泳動（３％）で解析した。その発想は、３’－５’リン酸ジエステル結合が形成され得ないため、修飾ヌクレオチド類似体の使用が重合を阻害できるというものである。さらに、従来型ｄＡＴＰと修飾アデノシン類似体との混合は、最終生成物と同様に、アガロースゲル上での「スメア」として観察される、より小さい断片も生み出すことになる。データを、下記の画像及び図１に示す。
前記のデータに基づき、本発明による修飾ヌクレオチド類似体の添加は、反応を阻害することが示され得る。なぜなら、生成物が認められないからである。他方、従来型／修飾アデノシンヌクレオチドを混合した結果、予想どおり、最終生成物及びスメアの両方ともが現れる。
各反応は、各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含有する。７５％ ｄＡＴＰでは、７．５ｍＭのｄＡＴＰ、及び残りに関しては１０ｍＭで使用した。５０％ ｄＡＴＰでは、５．０ｍＭのｄＡＴＰ、及び残り（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＰ）に関しては１０ｍＭで使用した。２５％ ｄＡＴＰでは、２．５ｍＭのｄＡＴＰ、及び残り（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＰ）に関しては１０ｍＭで使用した。７５％ Ａ：２５％ ＡＰ（又はＡＨ）では、７．５ｍＭの従来型ｄＡＴＰ、２．５の修飾アデニン類似体、及び残り（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＰ）に関しては１０ｍＭで使用した。５０％ Ａ：５０％ ＡＰ（又はＡＨ）では、５．０ｍＭの従来型ｄＡＴＰ、５．０ｍＭの対応する修飾アデニン類似体、及び残り（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＰ）に関しては１０ｍＭで使用した。２５％ Ａ：７５％ ＡＰ（又はＡＨ）では、２．５ｍＭの従来型ｄＡＴＰ、７．５ｍＭの対応する修飾アデニン類似体、及び残り（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＰ）に関しては１０ｍＭで使用した。すべての濃度を初期濃度と見なす。それらをエンドポイントＰＣＲ反応に使用した。
第２組の実験では、修飾アデノシン類似体を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｍｉｘに添加し、前記と同じ鋳型及びプライマーを使用して反応を行った。各条件に対して、Ｃｔ（閾値サイクル）パラメータを測定した。Ｃｔは、反応の範囲内で生成された蛍光が蛍光閾値と交差するサイクル数である。Ｃｔが高ければ高いほど、生成物の量は少ない（又は発現が低い）。下記の表１は、ｑＰＣＲ反応からのデータを示す。
Figure 2023518150000009
表１のデータから分かるように、リン酸塩物質及びヒドロキシル物質のいずれかの添加は、鋳型の増幅の低下をもたらす。また、反応は用量依存性であって、リン酸塩物質及びヒドロキシル物質のいずれかをより多くすると、より高いＣｔ値をもたらすことを意味することの指摘も重要である。同じ濃度では、増幅を阻害する効果が、リン酸塩ではヒドロキシルよりも高かった。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＮＡポリメラーゼに対する作用
前記の実験に加えて、本発明による化合物がＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ポリメラーゼＮＳＰ１２のＲＮＡ重合作用を阻害する能力を試験する更なるアッセイを行った。
試験された化合物は、アデノシン類似体であった：
Figure 2023518150000010
アッセイで使用したＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼのＲｄＲｐ触媒ドメイン（参照：ＰＸ－ＣＯＶ－Ｐ００６、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ社）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡ（２０１９年新型コロナウイルス；株：２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（参照：ＡＴＣＣ－ＶＲ－１９８６Ｄ、ＡＴＣＣ））からなり、アッセイで使用したプライマーは、特定領域に相補性の（ＲＮＡ又はＤＮＡ）（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ社）からなった。
ＰＣＲ反応は、アミノアリルＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＩＩ ａＲＮＡ増幅キット（参照：ＡＭ１７５３、Ｔｈｅｒｍｏ社）からの１０Ｘ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ及びＲＮａｓｅ阻害剤、並びにそれぞれｄＮＴＰ／ｒＮＴＰを使用した。実行条件は３７℃、２ｈであり、試料は、アガロースゲル及びＰＡＧＥゲル上で流した。
対照反応は、市販の重合阻害剤、コルジセピン５’－三リン酸ナトリウム塩（参照：Ｃ９１３７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて行った。
異なる化合物及び対照の能力は、ＭｉｄｏｒｉＧｒｅｅｎ Ｄｙｅ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ及びｓｓＲＮＡのいずれも染色する）で染色したＰＡＧＥゲルを図示した図２から得られ得る。
図２中のレーンは、左から右に向かって、以下のように命名した：
「100bp ladder（１００ｂｐラダー）」
このレーンには、互いの間隔が１００ｂｐのマーカー断片を含むマーカー組成物をロードした。
「RNA Primer（ＲＮＡプライマー）」
このレーンには、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社から入手したおよそ２４ベースの特異的ＲＮＡプライマーをロードした。
「RNA Control（ＲＮＡ対照）」
このレーンには、２０１９年新型コロナウイルス；株：２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（参照：ＡＴＣＣ－ＶＲ－１９８６Ｄ、ＡＴＣＣ）由来のゲノムＲＮＡをロードした。
「Positive Control（陽性対照）」
このレーンには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼのＲｄＲｐ触媒ドメイン（参照：ＰＸ－ＣＯＶ－Ｐ００６、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ社）及びＲＮＡプライマー（レーン「ＲＮＡプライマー」と同じ）を使用し、アミノアリルＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＩＩ ａＲＮＡ増幅キット（参照：ＡＭ１７５３、Ｔｈｅｒｍｏ社）からの１０Ｘ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ及びＲＮａｓｅ阻害剤、並びにｒＮＴＰを使用して、２０１９年新型コロナウイルス；株：２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（参照：ＡＴＣＣ－ＶＲ－１９８６Ｄ、ＡＴＣＣ）由来のゲノムＲＮＡを増幅することにより得られた増幅産物をロードした。
「No-Adenosine（アデノシンなし）」
このレーンには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼのＲｄＲｐ触媒ドメイン（参照：ＰＸ－ＣＯＶ－Ｐ００６、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ社）及びＲＮＡプライマー（レーン「ＲＮＡプライマー」と同じ）を使用し、アミノアリルＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＩＩ ａＲＮＡ増幅キット（参照：ＡＭ１７５３、Ｔｈｅｒｍｏ社）からの１０Ｘ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ及びＲＮａｓｅ阻害剤、並びにｒＡＴＰを含まなかったことを除くと等モル量のｒＮＴＰを使用して、２０１９年新型コロナウイルス；株：２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（参照：ＡＴＣＣ－ＶＲ－１９８６Ｄ、ＡＴＣＣ）由来のゲノムＲＮＡを増幅することにより得られた増幅産物をロードした。
「Phospho（ホスホ）」
このレーンには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼのＲｄＲｐ触媒ドメイン（参照：ＰＸ－ＣＯＶ－Ｐ００６、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ社）及びＲＮＡプライマー（レーン「ＲＮＡプライマー」と同じ）を使用し、アミノアリルＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＩＩ ａＲＮＡ増幅キット（参照：ＡＭ１７５３、Ｔｈｅｒｍｏ社）からの１０Ｘ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ及びＲＮａｓｅ阻害剤、並びにｒＡＴＰの基準量をｒＡＴＰと化合物Ｃとの間で５０：５０に分配したことを除くと等モル量のｒＮＴＰを使用して、２０１９年新型コロナウイルス；株：２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（参照：ＡＴＣＣ－ＶＲ－１９８６Ｄ、ＡＴＣＣ）由来のゲノムＲＮＡを増幅することにより得られた増幅産物をロードした。
「Fluoro（フルオロ）」
このレーンには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼのＲｄＲｐ触媒ドメイン（参照：ＰＸ－ＣＯＶ－Ｐ００６、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ社）及びＲＮＡプライマー（レーン「ＲＮＡプライマー」と同じ）を使用し、アミノアリルＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＩＩ ａＲＮＡ増幅キット（参照：ＡＭ１７５３、Ｔｈｅｒｍｏ社）からの１０Ｘ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ及びＲＮａｓｅ阻害剤、並びにｒＡＴＰの基準量をｒＡＴＰと化合物Ｂとの間で５０：５０に分配したことを除くと等モル量のｒＮＴＰを使用して、２０１９年新型コロナウイルス；株：２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（参照：ＡＴＣＣ－ＶＲ－１９８６Ｄ、ＡＴＣＣ）由来のゲノムＲＮＡを増幅することにより得られた増幅産物をロードした。
「Hydroxy（ヒドロキシ）」
このレーンには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼのＲｄＲｐ触媒ドメイン（参照：ＰＸ－ＣＯＶ－Ｐ００６、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ社）及びＲＮＡプライマー（レーン「ＲＮＡプライマー」と同じ）を使用し、アミノアリルＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＩＩ ａＲＮＡ増幅キット（参照：ＡＭ１７５３、Ｔｈｅｒｍｏ社）からの１０Ｘ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ及びＲＮａｓｅ阻害剤、並びにｒＡＴＰの基準量をｒＡＴＰと化合物Ａとの間で５０：５０に分配したことを除くと等モル量のｒＮＴＰを使用して、２０１９年新型コロナウイルス；株：２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（参照：ＡＴＣＣ－ＶＲ－１９８６Ｄ、ＡＴＣＣ）由来のゲノムＲＮＡを増幅することにより得られた増幅産物をロードした。
「Commercial Inhibitor（市販の阻害剤）」
このレーンには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼのＮＳＰ１２／ＲｄＲｐ触媒ドメイン（参照：ＰＸ－ＣＯＶ－Ｐ００６、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ社）及びＲＮＡプライマー（レーン「ＲＮＡプライマー」と同じ）を使用し、アミノアリルＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＩＩ ａＲＮＡ増幅キット（参照：ＡＭ１７５３、Ｔｈｅｒｍｏ社）からの１０Ｘ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ及びＲＮａｓｅ阻害剤、並びにｒＡＴＰの基準量をｒＡＴＰと市販の阻害剤との間で５０：５０に分配したことを除くと等モル量のｒＮＴＰを使用して、２０１９年新型コロナウイルス；株：２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（参照：ＡＴＣＣ－ＶＲ－１９８６Ｄ、ＡＴＣＣ）由来のゲノムＲＮＡを増幅することにより得られた増幅産物をロードした。阻害剤は、修飾ヌクレオチド類似体であり、３’－ヒドロキシル基を欠く。
「Template/Primer（鋳型／プライマー）」
このレーンには、ＲＮＡ対照とＲＮＡプライマーとの混合物を、他のいずれの成分も含めずにロードし、この混合物が、物質の長さの位置にいかなるシグナルももたらさないことを確かめるためにゲル上にロードした。
「1 Kb ladder（１Ｋｂラダー）」
このレーンには、互いの間隔が１０００ｂｐのマーカー断片を含むマーカー組成物をロードした。
前記のデータに基づき、化合物Ａ、Ｂ又はＣのいずれか１つの添加が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡポリメラーゼを介する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ複製を阻害することが示され、それぞれのレーンのスメアは、増幅産物が、重合反応のいくつかの段階での阻害を反映する異なるサイズを有すること示す。いずれの場合も、ｉｎ ｖｉｖｏ条件を模倣するように、化合物Ａ、Ｂ、Ｃが、ｄＡＴＰ及びｒＡＴＰとの競合状態にあったことに留意されたい。さらに、スメアは、「陽性対照」のレーンで可視化される材料の下方に位置し、それは、各化合物が、増幅産物の長さを短縮でき、かつＮＳＰ１２の重合活性を阻害できたことを意味する。スメアは、７００～９００ｂｐの間に位置する。
ＲＮＡ対照は、３０００ｂｐの上方にあるスメア、及び１０００～１５００ｂｐの間の単一バンドを有する。陽性対照では、バンドははるかに弱く、かつ６００～１２００ｂｐの間のスメアが認められ、異なる断片上での重合を示唆するのと同様に、スメアの説明ともなる。
アデノシンなしのレーンは、ＲＮＡ対照と類似のイメージを示す。なぜなら、ＮＳＰ１２が、アデノシンヌクレオチドを組み込むべきであったところでは重合が起こらなかったためである。
市販の阻害剤では、プロファイルが同じくＲＮＡ対照と類似する。なぜなら、重合が同じく阻害されたためである。
プライマーは、ラダーの１００ｂｐよりも小さいため観察できない。
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なし

Claims (10)

  1. コロナウイルス感染症の治療における使用のための、式Ｉで表される化合物。
    Figure 2023518150000011
     （式中、
    Ｒ１は、ヒドロキシル基又はリン酸基であり、
    Ｒ２は、ハロゲン又は水素から選択される基であり、
    Ｙは、プリン又はピリミジンである。）
  2. 前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＭＥＲＳ－ＣｏＶのいずれかである、請求項１に記載の使用のための化合物。
  3. ２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－オールである、請求項１又は２に記載の使用のための化合物。
  4. ２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－イル二水素ホスファートである、請求項１又は２に記載の使用のための化合物。
  5. Ｙが５－フルオロシトシンであり、Ｒ１がヒドロキシル基であり、Ｒ２が水素である、請求項１又は２に記載の使用のための化合物。
  6. 式Ｉで表される化合物。
    Figure 2023518150000012
     （式中、
    Ｒ１は、ヒドロキシル基又はリン酸基であり、
    Ｒ２は、ハロゲン又は水素から選択される基であり、
    Ｙは、プリン又はピリミジンである。）
  7. ２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－オールである、請求項６に記載の化合物。
  8. ２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－イル二水素ホスファートである、請求項６に記載の化合物。
  9. ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ等のコロナウイルス感染症の治療における使用のための、式Ｉで表される化合物を少なくとも１つ含む、医薬製剤。
    Figure 2023518150000013
     （式中、
    Ｒ１は、ヒドロキシル基又はリン酸基であり、
    Ｒ２は、ハロゲン又は水素から選択される基であり、
    Ｙは、プリン又はピリミジンである。）
  10. ２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－オールもしくは２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）キナゾリン－４－イル二水素ホスファート、又はその両方を含む、請求項９に記載の医薬製剤。

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