JP2023517943A - 腎障害の処置のためのフェチュインａ - Google Patents

Abstract

本発明は、腎障害を処置する方法における使用のためのフェチュインＡ（ＡＨＳＧ）であって、腎障害を処置するのに効果的なフェチュインＡの量が、それを必要とする対象に投与されるフェチュインＡに関する。本発明は、腎傷害の処置における使用のための医薬組成物であって、フェチュインＡおよび場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物にさらに関する。

Description

本発明は、腎障害を処置する方法における使用のためのフェチュインＡ（ＡＨＳＧ）であって、腎障害を処置するのに効果的なフェチュインＡの量が、それを必要とする対象に投与され、特に腎障害が、虚血性障害である、フェチュインＡに関する。本発明はまた、腎障害の処置における使用のための医薬組成物であって、フェチュインＡおよび場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

現代医学の目的は、特定の患者群の良好な転帰を達成するために新しい標的を含む、新しい処置を提供することである。患者のニーズまたはリスクを考慮するこれらの処置は、例えば細胞または細胞応答機能不全の病理学的シグナル伝達カスケードを標的とする知見に依存し得る。医療用タンパク質化学は広範な分野であり、物理学、化学、生物学、バイオインフォマティクスおよび医療技術が、タンパク質構造および機構を分析および説明し、疾患の根本的な分子遺伝的異常を同定し、これらを修正するための介入を開発するために用いられる。この視点は、患者およびその臓器に対する以前の概念的および観察的焦点より、細胞および／または分子の現象および関与を重視する。タンパク質による処置は、ある特定の治療的手段が有益である患者を同定するために、適切なタンパク質および処置勧告を必要とする。したがって、処置の開発は、新しい分子標的薬および手技の調査に大いに依存する。

虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）は、虚血性脳卒中、心筋梗塞、急性腎臓傷害、心臓血管手術および臓器移植を含む、広範な病理にしばしば関与する。虚血後に血液供給が組織に戻るとき、この再酸素負荷は、組織に損傷を与える。逆説的に、このように必要な再酸素負荷は、以前の虚血性組織への血液の流れを修復した後に、細胞機能障害およびアポトーシスを悪化させる。ＩＲＩは、心臓、肺、腎臓、腸、骨格筋および脳を含む広範な臓器で引き起こされ、虚血性臓器自体に関与し得るだけでなく、遠位の臓器への全身性損傷も誘導し得、多系統臓器不全をもたらす可能性がある。再灌流傷害は、広範な組織破壊をもたらす多因子プロセスである。最初に、十分な血流の欠如が、ＡＴＰレベルの低下を含む、正常なミトコンドリア代謝に必要とされる酸素供給、グルコースおよび他の物質の不足をもたらす。ＡＴＰ産生のこの欠如により、細胞ＡＴＰ依存性イオンポンプ（Ｎａ^＋／Ｋ^＋およびＣａ^２＋ポンプを含む）が機能せず、膜貫通イオン勾配が失われる。損傷または死細胞は、ミトコンドリアまたはアポトーシス小体各々のカルシウムの蓄積を特徴とするカルシウム過負荷を受ける。付随するＡＴＰ（ミトコンドリア機能不全）およびピロリン酸レベル（重要な石灰化阻害因子）の低下は、これらのオルガネラの石灰化傾向を高める。同様にＩＲＩによって生じ得る臓器移植の公知の合併症には、グラフト機能遅延（ＤＧＦ）がある。ＤＧＦは、移植を受けたレシピエントが、移植後最初の数週間グラフト機能が不良であり、透析を必要とする事象を説明する。

臓器を虚血および再灌流に起因する損傷に対してより抵抗性にする治療モダリティは、議論の余地がある結果をもたらしたか、または新たに出現したばかりである。ＩＲＩに対する臓器の抵抗性を高めるか、または突然の酸素制限後に臓器をレスキューするかのいずれかの治療選択肢は、過去数十年、主な研究努力の対象であった。このような戦略としては、例えば、短時間の非致死性の虚血エピソードへの曝露が、その後のＩＲＩ中の組織傷害の減弱をもたらす実験的戦略である虚血プレコンディショニング、虚血耐性を増強するための代謝戦略（転写因子ＨＩＦ－１αの制御下での糖分解酵素、エリスロポエチンなど）、水素、一酸化窒素、硫化水素および一酸化炭素のような治療用ガス、ならびにまた治療標的としてのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）がある。残念ながら、これらのモダリティは、議論の余地がある結果をもたらしたか、または新たに出現したばかりである。したがって、ＩＲＩを含むが、これに限定されない腎障害の処置には、重大な未だ満たされていない必要性が残されている。

したがって、腎障害を処置するための薬剤を提供することが必要とされ、本発明は、様々な設定において、虚血再灌流傷害を含む腎障害に対処する直接的な手法を提供する。

アルファ－２－ＨＳ－糖タンパク質（ＡＨＳＧ）としても公知の天然に存在するフェチュインＡは、ＡＨＳＧ遺伝子によりコードされる、肝臓由来の血漿糖タンパク質である。フェチュインＡは、脳の文脈において早期脳虚血性傷害を減弱させることが当技術分野において報告されており、ＩＲＩ駆動性炎症が、虚血性脳組織を有するラットにおいて減少した（例えば、Ｗａｎｇら、Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．２０１０；３０（３）：４９３～５０４を参照のこと）。フェチュインＡは、脳卒中における脳損傷の予防にさらに関連している（ＷＯ ００／６０９４３）。しかし、フェチュインＡの血漿レベルの上昇は、心筋梗塞および虚血性脳卒中のリスクを高めることも見出され、予防剤としてのフェチュインＡの役割が、虚血性脳損傷については十分に理解されていないことが示された（Ｗｅｉｃｋｅｒｔら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００８；１１８：２５５５～２５６２）。

腎障害のバイオマーカーとしてのフェチュインＡの使用に関して、矛盾したデータも提示された。例えば、腎臓移植におけるバイオマーカーとしてのフェチュインＡの役割を調査する最近の研究は、患者の臨床転帰についての予測的情報を提供できなかった（例えばＲｏｏｓら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓ Ｒｅｓ．２０１１；３４（５）：３２８～３３；Ｍｅｒｓａｉら、Ｕｒｏｌ Ｊ．２０１５；１２（３）：２１８２～６；Ｋｏｃａら、Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１７、３２（３）：ｉｉｉ４１９～ｉｉｉ４２０を参照のこと）。前記刊行物において、フェチュインＡレベルは全般的に末梢血において測定され、これは組織中のフェチュインＡレベルを反映していない。総合すると、これらの刊行物は、血液中のフェチュインＡレベルが、腎障害に罹患している患者の長期生存または臨床予後に有用なバイオマーカーでないことを示唆する。

しかし、本発明の文脈において、フェチュインＡの投与が、腎臓の低酸素状態により誘導される腎臓組織損傷を減弱させることが驚くべきことに見出された。

したがって、第１の態様において、本発明は、腎障害を処置する方法における使用のためのフェチュインＡ（ＡＨＳＧ）であって、腎障害を処置するのに効果的なフェチュインＡの量がそれを必要とする対象に投与される、フェチュインＡに関する。好ましくは、腎障害は、低酸素、例えば移植、心臓血管手術または他の大手術中の低酸素によって生じる。腎障害は、虚血性腎障害であり得る。

任意の理論に拘束されるものではないが、本明細書に提供される実験的証拠に基づき、フェチュインＡがそれを必要とする対象、特に虚血性腎障害に罹患している対象に投与されると、フェチュインＡが、カルシウムレベルを「除去する」ことにより低酸素腎組織において「ミネラルスカベンジャー」として作用すると考えられる。フェチュインＡは、異所石灰化に拮抗して、腎組織の完全性を維持し、コラーゲンのＩＲＩ誘導性発現により腎線維化をもたらし得る下流の炎症カスケードを阻止すると考えられる。本明細書で提案される説明は、フェチュインＡが、腎障害において「ミネラルシャペロン」として作用し、カルシウム含有粒子を除去することにより腎臓における虚血再灌流傷害から臓器を保護し、有害な炎症応答を緩和することである。

本明細書で使用する「腎障害」は、腎臓に影響を与える１つまたはそれ以上の障害または疾患として定義される。用語は、腎疾患を包含するが、それに限定されない。例えば、疾患に起因しない腎傷害も、腎障害であり得る（例えば大手術中に引き起こされる一部の傷害；しかし、大手術も腎臓疾患の原因となり得る）。好ましくは、腎障害は、虚血性腎障害、すなわち虚血によって生じるおよび／またはそれに関連する腎障害である。腎障害がある特定の障害「である」場合、これは、他の障害の存在を排除せず、複数の他の障害が、前記腎障害と同時に独立してまたは相互依存的に引き起こされる場合があり、例えばＩＲＩとＤＧＦが同時に引き起こされる場合がある。

本発明の好ましい実施形態において、腎障害は、急性腎障害、慢性腎障害、腎臓線維化、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、腎不全、腎炎、急性腎臓傷害（ＡＫＩ）、虚血性腎障害、腎臓の低酸素に関連する障害、腎虚血－再灌流傷害（ＩＲＩ）、腎臓組織損傷、腎臓移植に関連する障害、心臓血管手術に関連する障害およびこれらの組合せからなる群から選択され、特に腎臓組織損傷は、虚血性腎臓組織損傷である。心臓血管手術に関連する障害は、例えば心臓血管手術に起因する、特に心臓血管手術中の低酸素および／または虚血に起因する腎臓組織損傷であり得る。

本発明の別の実施形態において、虚血性腎障害は、虚血性急性腎障害、虚血性慢性腎障害、虚血によって生じる腎臓線維化、虚血によって生じる腎炎、虚血によって生じる急性腎臓傷害、虚血性腎障害、腎臓の低酸素に関連する障害、腎虚血－再灌流傷害、虚血性腎臓組織損傷、腎臓移植中の虚血に関連した障害（例えばグラフト機能遅延）およびこれらの組合せからなる群から選択される。

本明細書で使用する「急性腎障害」は、腎臓機能の突然の機能喪失または低下に関する。これは、急性偶発性腎臓損傷または急性障害によって誘発される。この原因は多数あり、腎前性、腎後性および内因性の急性腎臓不全が挙げられるが、これらに限定されない。急性腎臓不全はまた、全身性疾患（自己免疫疾患の徴候など）、挫滅傷、造影剤、一部の抗生物質などによって誘発される。

慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、慢性腎不全または慢性腎盂腎炎のような慢性腎炎のような「慢性腎障害」も、可能性のある処置スペクトルに含まれるが、これらに限定されない。「慢性腎障害」は、解剖学的位置によって誘発され、両側性腎動脈狭窄症のような大血管疾患および虚血性腎症、溶血性尿毒症症候群および血管炎のような小血管疾患を含む血管疾患、糸球体疾患、尿細管間質疾患、閉塞性腎障害、多発性嚢胞腎のような先天性疾患またはメソアメリカ腎症を含むが、これらに限定されない。

「線維化」は、例えば腎臓または腎臓組織における過剰な線維性結合組織の形成に関する。組織炎症は、線維化を誘発し得る。一部の実施形態において、線維化は、間質性線維化に関する。

本明細書で使用する「虚血」または「虚血性」は、臓器または身体の特定の部分への不適切な血液供給である。これは一般に深刻な臨床的問題とみなされる。虚血は、血液供給を減少させ、したがって酸素および栄養素の供給の減少をもたらし、また組織からの老廃物の除去の低下に関与する。これは、不可逆的組織損傷および細胞死をもたらし得る。虚血は、複数の腎障害の文脈において引き起こされる場合があり、これらの原因となり得る。虚血はまた、大手術の文脈において引き起こされる場合があり、例えば虚血は大手術に起因し得る。「再灌流」は、虚血イベント後の血液供給の回復として本明細書で定義される。再灌流は、例えば腎臓において、特にカルシウムの蓄積により、とりわけミネラルバランスを不均衡にすることにより組織損傷を引き起こし得る。再灌流傷害（ＲＩ）または再酸素負荷傷害と呼ばれる場合もある「虚血再灌流傷害」（ＩＲＩ）は、血液供給が、虚血期間後および／または酸素供給の減少（低酸素）期間後に組織に戻る（再灌流）ときに引き起こされる組織損傷である。

本明細書で使用する「心臓血管手術」は、胸部または腹部内の大血管および臓器の外科的処置、例えば心臓、大血管または肺に関与する手術に関する。一部の実施形態において、心臓血管手術は、冠動脈バイパス術または腹部大動脈瘤術であり得る。腹部大動脈瘤術は、腎虚血再灌流傷害を引き起こし得る。心臓血管手術が腎臓に対して直接行われないとしても、腎障害は、それに関連し得る。心臓血管手術中の虚血は、腎臓組織損傷を引き起こし得、この原因となり得る。心臓血管手術後の急性腎臓傷害（ＡＫＩ）の発生は周知であり、一部の実施形態は、心臓血管手術によって生じる急性腎臓傷害の処置に関する。

本発明の文脈において、「それを必要とする対象」は、腎障害に罹患していることが予想されるか、もしくは腎障害に罹患するリスクがある人間、または腎障害に既に罹患している、特に腎障害、好ましくは虚血性腎障害と既に診断された人間のいずれかを一般に指す。対象はまた、「患者」と称される場合もある。対象は、予防的または治療的処置を必要とし得る。腎障害に罹患するリスクの増加についての予想は、一部の実施形態において、虚血を引き起こすリスクがあるか、またはさらにはそれが予想される予定された大手術によるものであり得、例えば予定された腎臓移植または心臓血管手術を考慮した腎障害のリスクの増加である。一部の実施形態において、それを必要とする対象は、大手術を受けることが予想されるか、または大手術を受けたことがある、好ましくは腎臓移植または心臓血管手術を受けることが予想されるか、またはこれらを受けたことがある。

本明細書で使用する「処置」、「処置する」または「処置している」は、障害の治療的処置および予防的処置（予防）を包含する。「処置」、「処置する」または「処置している」は、本明細書で説明されるタンパク質または化合物を投与して、それにより（ｉ）特定の障害の少なくとも１つの症状を低減もしくは排除するか、または（ｉｉ）障害の進行を遅らせるか、または（ｉｉｉ）特定の障害の少なくとも１つの症状の発生を停止もしくは妨げることを含み得る。本明細書で使用する「治療的処置」および「治療的に処置している」は、既存の障害の処置、すなわち前記障害の開始後の処置を指し、その目的は、既存の障害を排除、軽減もしくは減速するか、またはその重症度を低下させることである。対照的に、本明細書で使用する「予防的処置」、「予防」、「予防する」または「予防している」は、リスクを低減することが意図される障害の処置の種類を指し、前記障害を現在有さない対象が、将来、特に、移植のような大手術などのイベント後に前記障害またはその症状および／もしくは徴候を発生させるのを予防するかまたは遅延させる。好ましい実施形態において、治療的処置は、障害の予後を改善することを意味する。一部の実施形態において、予防的処置は、腎臓移植または心臓血管手術のような大手術前、その間および／またはその後に行われて、大手術に関連する、特に腎臓移植または心臓血管手術中の虚血に関連する障害の発症のリスクを低減する。一部のさらなる実施形態において、用語「処置している」または「処置」は、障害の症状が緩和されるだけでなく、障害自体が改善、遅延または予防されること、特に障害の重症度が低下するか、または障害が予防されることを好ましくは意味する。さらに、「処置」および「処置している」は、対象もしくは患者への治療剤の投与もしくは適用、または障害に関連して治療もしくは予防利益を得るための対象での手技もしくはモダリティの実施を含み得る。例えば、処置は、薬学的有効量のフェチュインＡの投与を含み得る。一部の実施形態において、上述の障害は腎疾患である。

実施形態において、本発明は、腎障害を処置する、特に腎障害を治療的に処置する方法における使用のためのフェチュインＡであって、腎障害を処置するのに効果的なフェチュインＡの量が、腎障害に罹患している対象に投与されるフェチュインＡに関する。一部の実施形態において、腎障害は虚血性腎障害である。この文脈において、「処置」または「処置している」は、確立された腎障害の処置および／または前記腎障害の発症後の処置を意味する。

代替的な実施形態において、本発明は、腎障害の予防的処置とも呼ばれるその予防のための方法における使用のためのフェチュインＡであって、腎障害を予防するのに効果的なフェチュインＡの量が、それを必要とする対象、特に将来障害に罹患するリスクがある対象、例えば、腎臓の虚血に関与し得る大手術を予定している対象に投与されるフェチュインＡに関する。前記代替的な実施形態において、「処置」または「処置している」は、前記障害の発症前の腎障害の「予防」またはそれを「予防している」ことを意味する。場合によっては、少なくとも１用量のフェチュインＡは、虚血を含む手術、特に移植手術前４８時間以内に投与される。

本発明の別の実施形態において、腎障害は、腎臓移植に関連し、特にそれに起因する障害であり、特に、前記障害は、グラフト機能遅延（ＤＧＦ）、腎臓移植片の臓器拒絶反応、腎臓移植によって生じる腎臓組織損傷、腎臓移植によって生じる炎症、腎臓移植によって生じる虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）およびこれらの組合せからなる群から選択される。本発明の一部の実施形態において、腎障害は、腎臓移植に起因する障害であり、前記障害は、グラフト機能遅延、腎臓移植によって生じる腎臓組織損傷、腎臓移植によって生じる虚血再灌流傷害およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一部の実施形態において、腎障害は、虚血性腎障害、特に腎臓移植または心臓血管手術によって生じる虚血性腎障害である。

本発明の別の好ましい実施形態において、腎障害、特に虚血性腎障害は、低酸素に関連または起因し、特に、低酸素は、大手術中の虚血、例えば心臓血管手術または腎臓移植中の虚血に起因する。

本明細書で使用する「大手術」は、侵襲手技、特に切除が行われる侵襲手技により定義される。大手術は、体腔に侵入すること、臓器を取り除くこと、臓器を移植することおよび／または通常の解剖学的構造を変更することを含み得る。一部の実施形態において、大手術は、対象の局所または全身麻酔状態を含む。一般に、間葉系バリア（胸膜腔、腹膜、髄膜）を開く場合、手術は「大」手術とみなされる。例えば、腎臓移植および心臓血管手術はいずれも大手術である。用語「手術」が大手術であることを特定せずに用いられる場合、これはまた、本発明に従って「大手術」の実施形態を含む。

本発明の文脈において、「腎臓組織損傷」は、低酸素のすべての症例、特に腎臓移植、心臓血管手術または他の大手術中の低酸素に起因する、偶発的に引き起こされるような組織損傷のすべての形態を含む。

本明細書で使用する「低酸素」は、身体または身体領域で、適切な酸素供給が組織レベルで枯渇した状態を指す。これはしばしば病理学的障害の一部である。低酸素誘導性組織損傷は、酸素供給が失われるかまたは減少し、任意の組織において酸素供給不足を引き起こす、すべての障害を含む。これはまた、一般に大手術または血管損傷による血液供給の減少を含む。用語「低酸素」はまた、極端な形態の低酸素として無酸素、すなわち酸素レベルの完全な枯渇を含む。

本発明の別の好ましい実施形態において、ＩＲＩは、手術、特に大手術中の低酸素に起因する。このような手術、特に大手術の過程で引き起こされる低酸素障害は、腎臓において虚血再灌流傷害をもたらし得、それにより組織を損傷させる。虚血再灌流傷害は、少なくとも部分的に石灰化に起因し得る。

本発明のさらなる実施形態において、腎障害は、グラフト機能遅延、腎線維化またはこれらの組合せである。

本明細書で使用する「フェチュインＡ」は、天然に存在するフェチュインＡであるか、または天然に存在しないが、天然に存在するフェチュインＡと同じもしくは類似の機能、特に天然に存在するヒトフェチュインＡと同じもしくは類似の機能を有するタンパク質またはその断片もしくはその誘導体を指す。好ましくは、これは石灰化阻害因子であるか、および／またはタンパク質配列が、ヒトフェチュインＡと少なくとも部分的に同一である。一部の実施形態において、フェチュインＡは、血漿由来または組換えヒトフェチュインＡである。ヒト血漿由来フェチュインＡは、ヒト血漿から得られる。用語フェチュインＡはまた、石灰化の阻害のような天然に存在するフェチュインＡおよび／またはヒトフェチュインＡと同じまたは類似の機能を有する、すべての天然に存在するアレル、スプライスバリアントおよびアイソフォーム、ならびに合成ペプチド、ペプチドミメティックまたはペプチド断片を包含するものとする。

本発明の一部の実施形態において、フェチュインＡは、ヒトフェチュインＡである。一部の実施形態において、ヒトフェチュインＡは、ヒト血漿に由来するか、または代替的には、ヒトフェチュインＡは、組換えヒトフェチュインＡである。血漿由来ヒトフェチュインＡは、ヒト血漿から精製される。組換えヒトフェチュインＡは、血漿由来ヒトフェチュインＡと異なるグリコシル化パターンを有し得る。一部の実施形態において、フェチュインＡは、天然に存在するフェチュインＡである。本発明の文脈において言及される「天然に存在するタンパク質」は、任意の種類の生体に天然に見出され、そのようなものとして前記生物の組織、液体から、および／またはあらゆる個々の細胞から単離できるタンパク質を一般に示す。例えば、一部の天然に存在するタンパク質はヒト血漿から得ることができる。組換え産生タンパク質はまた、例えば精製を容易にする場合もまたはしない場合もある遺伝子タグ（ＦＬＡＧ－タグ、Ｈｉｓ－タグ、Ｍｙｃ－タグ、ＨＡ－タグまたはＧＦＰ、ＹＦＰもしくはＲＦＰのような蛍光標識タンパク質のようなもの）を結合することにより、何らかの形でマークまたは標識される、フェチュインＡ誘導体を含む。

本明細書の「精製される」は、一般に、当業者に周知であるタンパク質の精製を説明する。一般に、タンパク質は、可溶性、サイズ、電荷および特異的結合親和性のようなその特性に基づき精製される。すなわち、タンパク質はしばしば、その正味の電荷に基づきイオン交換クロマトグラフィーにより分離される。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、１つのレベルでの、細胞、組織または臓器のホモジナイゼーション、ならびにポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのこれらの分画を含む。別段特定されない限り、目的のタンパク質またはポリペプチドを、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製して、部分的または完全な精製（または均質になるまでの精製）を達成することができる。純粋なペプチドの製造に特に適した方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーおよび等電点がある。ペプチドを精製する方法としては、高速液体クロマトグラフィーがある。別のタンパク質精製方法としては、高速タンパク質液体クロマトグラフィーがある。例えば、血漿タンパク質の精製は、血漿分画および／またはクロマトグラフィー工程により行うことができる。タンパク質精製はまた、工程としてウイルス不活性化を含み得る。用語「精製される」は、一部の不純物の存在を排除しないが、一般に、他の血液成分および／または不純物が主として除去されている。

本発明の別の好ましい実施形態において、ヒトフェチュインＡの機能的に活性な誘導体または断片は、以下で定義される配列番号１に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％または最も好ましくは少なくとも９９％同一および／または相同である。「相同体」は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質配列レベルでの様々な生物学的配列の配列類似性として本明細書で定義される。「機能的に活性な誘導体」は、天然に存在するフェチュインＡと同じまたは類似の活性を有し、特に石灰化を阻害し得る。配列同一性のパーセンテージは、例えば配列アラインメントで決定できる。比較のための配列アラインメントの方法は当技術分野で周知である。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ；２１５：３、４０３～４１０）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連した使用のため、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給元およびインターネット上から入手可能である。

したがって、本発明の別の実施形態において、フェチュインＡは、配列番号１によるアミノ酸配列またはその１つの断片もしくはその複数の断片を含むか、またはこれらからなる。本発明の文脈において、用語「その１つの断片」または「その複数の断片」は、フェチュインＡ活性を有する天然に存在するタンパク質の断片および誘導体について上に定義されたように、フェチュインＡ活性を示すあらゆる小さな断片または付加アミノ酸を含む任意の断片を含むが、これらに限定されない、配列番号１により定義される任意のアミノ酸配列またはペプチドを指す。一部の実施形態において、前記断片の長さは、配列番号１の長さの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％であり、長さは、配列番号１の全長に対するアミノ酸の数に関連している。断片は、配列番号１の一部ではない付加アミノ酸を含み得る。本発明のタンパク質の断片は、タンパク質配列変化により（例えば１つまたはそれ以上のアミノ酸欠失、置換および／または付加により）得ることができ、配列が変化したタンパク質は、変化していないタンパク質の機能、すなわち、細胞周期進行中に細胞表層、収縮環および中心体からなる群から選択される細胞内構造体に局在するか、または蛍光レポータータンパク質として機能するその能力を保持する。このような配列変化は、保存的置換、欠失、変異および／または挿入を含み得るが、これらに限定されない。

ヒトフェチュインＡ配列（タンパク質および核酸配列）は、「アメリカ国立生物工学情報センター」（ＮＣＢＩ）から入手可能である。

配列番号１（ヒトフェチュインＡのタンパク質配列）
ＭＫＳＬＶＬＬＬＣＬＡＱＬＷＧＣＨＳＡＰＨＧＰＧＬＩＹＲＱＰＮＣＤＤＰＥＴＥＥＡＡＬＶＡＩＤＹＩＮＱＮＬＰＷＧＹＫＨＴＬＮＱＩＤＥＶＫＶＷＰＱＱＰＳＧＥＬＦＥＩＥＩＤＴＬＥＴＴＣＨＶＬＤＰＴＰＶＡＲＣＳＶＲＱＬＫＥＨＡＶＥＧＤＣＤＦＱＬＬＫＬＤＧＫＦＳＶＶＹＡＫＣＤＳＳＰＡＤＳＡＥＤＶＲＫＶＣＱＤＣＰＬＬＡＰＬＮＤＴＲＶＶＨＡＡＫＡＡＬＡＡＦＮＡＱＮＮＧＳＮＦＱＬＥＥＩＳＲＡＱＬＶＰＬＰＰＳＴＹＶＥＦＴＶＳＧＴＤＣＶＡＫＥＡＴＥＡＡＫＣＮＬＬＡＥＫＱＹＧＦＣＫＡＴＬＳＥＫＬＧＧＡＥＶＡＶＴＣＭＶＦＱＴＱＰＶＳＳＱＰＱＰＥＧＡＮＥＡＶＰＴＰＶＶＤＰＤＡＰＰＳＰＰＬＧＡＰＧＬＰＰＡＧＳＰＰＤＳＨＶＬＬＡＡＰＰＧＨＱＬＨＲＡＨＹＤＬＲＨＴＦＭＧＶＶＳＬＧＳＰＳＧＥＶＳＨＰＲＫＴＲＴＶＶＱＰＳＶＧＡＡＡＧＰＶＶＰＰＣＰＧＲＩＲＨＦＫＶ
タンパク質配列：ＮＰ＿００１３４１５００．１（３６８番目のアミノ酸）
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ＿００１３４１５００．１）

配列番号２（ヒトフェチュインＡの核酸配列）
ＡＴＧＡＡＧＴＣＣＣＴＣＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＴＴＧＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＡＴＴＴＡＴＡＧＡＣＡＡＣＣＧＡＡＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＡＧＡＣＴＡＣＡＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＴＧＧＧＧＡＴＡＣＡＡＡＣＡＣＡＣＣＴＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＧＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＡＧＡＴＴＧＡＡＡＴＡＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＧＣＡＡＧＡＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧＡＡＡＣＴＡＧＡＴＧＧＣＡＡＧＴＴＴＴＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＣＧＣＡＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＣＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＡＡＧＡＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＧＣＴＣＡＧＡＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＡＴＧＴＧＧＡＧＴＴＴＡＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＴＧＴＴＧＣＴＡＡＡＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＴＧＴＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＴＧＧＣＴＴＴＴＧＴＡＡＧＧＣＡＡＣＡＣＴＣＡＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＧＴＴＣＣＡＡＡＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＧＡＧＣＴＣＡＣＡＧＣＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＣＡＣＣＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＴＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＡＴＧＴＧＴＴＡＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＡＣＣＧＧＧＣＧＣＡＣＴＡＣＧＡＣＣＴＧＣＧＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＧＴＣＧＣＡＣＣＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＣＧＣＡＣＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＡＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣＴＡＧ
核酸配列：ＮＭ＿００１３５４５７１．２（１１０７番目のヌクレオチド）
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／１９７；ＮＭ＿００１３５４５７１．２；コンセンサスコード化配列ＣＣＤＳ８７１７６．１）

別の好ましい実施形態において、天然に存在するタンパク質フェチュインＡの機能的に活性な誘導体または断片は、以下で定義される配列番号３（ウシフェチュインＡ配列）に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％または最も好ましくは少なくとも９９％同一および／または相同である。

配列番号３（ウシフェチュインＡのタンパク質配列）
ＭＫＳＦＶＬＬＦＣＬＡＱＬＷＧＣＨＳＩＰＬＤＰＶＡＧＹＫＥＰＡＣＤＤＰＤＴＥＱＡＡＬＡＡＶＤＹＩＮＫＨＬＰＲＧＹＫＨＴＬＮＱＩＤＳＶＫＶＷＰＲＲＰＴＧＥＶＹＤＩＥＩＤＴＬＥＴＴＣＨＶＬＤＰＴＰＬＡＮＣＳＶＲＱＱＴＱＨＡＶＥＧＤＣＤＩＨＶＬＫＱＤＧＱＦＳＶＬＦＴＫＣＤＳＳＰＤＳＡＥＤＶＲＫＬＣＰＤＣＰＬＬＡＰＬＮＤＳＲＶＶＨＡＶＥＶＡＬＡＴＦＮＡＥＳＮＧＳＹＬＱＬＶＥＩＳＲＡＱＦＶＰＬＰＶＳＶＳＶＥＦＡＶＡＡＴＤＣＩＡＫＥＶＶＤＰＴＫＣＮＬＬＡＥＫＱＹＧＦＣＫＧＳＶＩＱＫＡＬＧＧＥＤＶＲＶＴＣＴＬＦＱＴＱＰＶＩＰＱＰＱＰＤＧＡＥＡＥＡＰＳＡＶＰＤＡＡＧＰＴＰＳＡＡＧＰＰＶＡＳＶＶＶＧＰＳＶＶＡＶＰＬＰＬＨＲＡＨＹＤＬＲＨＴＦＳＧＶＡＳＶＥＳＳＳＧＥＡＦＨＶＧＫＴＰＩＶＧＱＰＳＩＰＧＧＰＶＲＬＣＰＧＲＩＲＹＦＫＩ
タンパク質配列：ＮＰ＿７７６４０９．１（３５９番目のアミノ酸）
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ＿７７６４０９．１）

配列番号４（ウシフェチュインＡの核酸配列）
ＡＴＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＧＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＴＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＴＴＧＡＣＣＣＧＧＴＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＡＧＧＡＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＧＧＧＧＣＴＡＣＡＡＧＣＡＣＡＣＣＴＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＴＧＡＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＡＣＧＧＧＡＧＡＧＧＴＧＴＡＴＧＡＣＡＴＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＡＣＧＴＡＣＴＧＧＡＣＣＣＣＡＣＧＣＣＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＣＡＣＧＣＧＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＴＧＣＧＡＴＡＴＣＣＡＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＴＣＣＧＴＧＣＴＧＴＴＴＡＣＡＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＣＡＧＴＣＣＡＧＡＴＴＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＣＡＡＧＴＴＧＴＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＣＡＣＴＣＡＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＣＧＣＧＣＴＧＧＣＴＡＣＣＴＴＣＡＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＴＴＴＣＴＣＧＧＧＣＴＣＡＡＴＴＴＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＡＣＴＧＡＣＴＧＴＡＴＴＧＣＴＡＡＡＧＡＡＧＴＣＧＴＡＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＡＧＴＧＣＡＡＣＣＴＡＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＡＡＧＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＴＴＣＡＧＡＡＡＧＣＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＧＡＧＴＧＡＣＴＴＧＣＡＣＧＴＴＧＴＴＣＣＡＡＡＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧＡＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＴＡＣＧＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣＣＧＴＧＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＣＧＴＧＧＴＡＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＧＡＧＣＡＣＡＣＴＡＣＧＡＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＧＧＧＧＴＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＡＴＣＣＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＣＧＴＴＣＣＡＣＧＴＧＧＧＣＡＡＡＡＣＡＣＣＣＡＴＡＧＴＧＧＧＧＣＡＧＣＣＴＡＧＣＡＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＧＣＣＣＡＧＧＧＡＧＡＡＴＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＴＡＧ
ヌクレオチド配列：ＮＭ＿１７３９８４．３（コード化ヌクレオチド配列（１０８０番目のｎｔ））
（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿１７３９８４．３）

本発明の別の実施形態において、フェチュインＡは、翻訳後修飾、より好ましくはグリコシル化を提供する、好ましくは宿主細胞系において組換え的に発現される。

本明細書で使用する用語「発現される」は、遺伝子またはＤＮＡ配列中の情報を顕在化することができるまたはそれを顕在化させることを一般に意味する。特に、本発明の文脈において、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによる、本発明の核酸発現構築物によりコードされるタンパク質の細胞内産生を意味する。すなわち、ＤＮＡ配列は、細胞においてまたはそれにより発現されて、タンパク質のような「発現産物」を形成する。細胞におけるまたはそれによるタンパク質の発現は、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結されるプロモーター配列、転写速度を制御するエンハンサーおよび／もしくはサイレンサー配列もしくは他のＤＮＡ配列の存在もしくは非存在、細胞を培養するために用いられる培地を含む各ＤＮＡ配列を有する細胞に適用される細胞培養条件、ならびに／または細胞に導入されたＤＮＡ配列のコピー数を含むが、これらに限定されない様々な因子に依存し得る。融合タンパク質の発現の成功は、ウェスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、定量ＲＴ－ＰＣＲ、ならびに直接または間接蛍光読出しに関係する方法を含むが、これらに限定されない当業者に公知の標準的な方法により分析および／または可視化することができる。「組換え」および「組換え的に」は人工的に産生されることを意味し、組換えにより形成された生物、細胞、タンパク質または遺伝物質に関連するかまたはこれらを示す。所望のタンパク質の組換え発現は、当技術分野で標準的な方法であり、その後に、以下に記載される標準的なタンパク質精製法が続く。

「翻訳後修飾」は、官能基もしくはタンパク質の共有結合的付加、調節サブユニットのタンパク質分解切断またはタンパク質全体の分解により、プロテオームの機能的多様性を高める。これらの修飾としては、とりわけリン酸化、ユビキチン化、Ｓ－ニトロシル化、メチル化、Ｎ－アセチル化、脂質化およびグリコシル化が挙げられる。

「翻訳後修飾を提供する宿主細胞」は、必要な修飾モダリティを送達し、哺乳動物タンパク質の正確な翻訳後修飾を可能にする宿主細胞である。これらの要件を提供する系としては、例えば、ＢＴＩ－Ｔｎ５Ｂ１－４もしくはＳＦ９細胞株のような昆虫細胞発現系、または例えば、これらに限らないがＨＥＫ２９３（Ｔ）、ＣＨＯもしくはＨＥＬＡ細胞のような哺乳動物細胞発現系がある。

「グリコシル化」は、糖類を連結して、グリカン（次いでタンパク質、脂質または他の有機分子に結合される）を産生する、酵素により導かれる部位特異的プロセスとして定義される。翻訳後プロセスとしてのタンパク質のグリコシル化は、高い構造的安定性または機能を天然のタンパク質構造に付与するために、糖類が特定のタンパク質残基に選択的に付加される、細胞における天然のプロセスである。それに関して、グリコシル化は、多様なタンパク質の適切な機能性において重要な役割を果たす。グリコシル化としては、Ｃ－連結、Ｎ－連結、Ｏ－連結またはＳ－連結型グリコシル化および糖化が挙げられるが、これらに限定されない。それに関して、「糖化」は、タンパク質の窒素原子への還元糖の非酵素的結合を指す。

本明細書で使用する「注射」は、経口投与または吸入を包含しない、非経口モードの投与である。本明細書で使用する「注射」は、静脈内（ｉｖ）、動脈内、筋肉内（ｉｍ）、皮下（ｓｃ）および皮内（ｉｄ）、腹腔内、骨内、心臓内、関節内および空洞内投与を包含する。一部の有利な実施形態において、注射は、静脈内（ｉｖ）または皮下（ｓｃ）投与を指す。注射は、例えば単回用量のフェチュインＡと共に針を用いる不連続および／または短時間注射であり得る（および場合によりその後さらなる用量を注射する）。代替的には、注射はまた、点滴、すなわち長時間の連続注射であり得る。一部の実施形態において、注射は１５分未満で、特に１０分未満でまたは５分未満で投与される。注射による投与はまた、全身投与、例えば体外循環（ＥＣＣ）による投与を含む。本明細書で使用する「吸入」は、空気、ガス、活性物質およびエアロゾルを肺に運ぶことができる吸入または呼吸方法を説明する。例えば、フェチュインＡは、吸入の目的でエアロゾルの一部として提供される。

本発明の一部の実施形態において、フェチュインＡは、注射または吸入により患者に投与される。一部の好ましい実施形態において、フェチュインＡは、注射により患者に投与される。一部の実施形態において、フェチュインＡは、静脈内（ｉｖ）、筋肉内（ｉｍ）または皮下（ｓｃ）注射、好ましくは静脈内（ｉｖ）注射により患者に投与される。

一部の実施形態において、フェチュインＡは、腎障害を処置するのに効果的な量で患者に投与され、特にフェチュインＡは、１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の濃度で患者に投与され、特に静脈内投与される。一部の実施形態において、フェチュインＡは、５ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の濃度で患者に投与され、特に静脈内投与される。一部の実施形態において、フェチュインＡは、１０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の濃度で患者に投与され、特に静脈内投与される。一部の実施形態において、フェチュインＡは、１０ｍｇ／ｋｇ～約７５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の濃度で患者に投与され、特に静脈内投与される。一部の実施形態において、フェチュインＡは、２０または３０ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の濃度で患者に投与され、特に静脈内投与される。一部の実施形態において、フェチュインＡは、２０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の濃度で患者に投与され、特に静脈内投与される。一部の実施形態において、フェチュインＡは、３０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の濃度で患者に投与され、特に静脈内投与される。

さらなる実施形態において、フェチュインＡは、大手術中、例えば心臓血管手術中または腎臓移植中にそれを必要とする対象に投与される。さらなる実施形態において、フェチュインＡは、大手術後に、例えば心臓血管手術後または腎臓移植後にそれを必要とする対象に投与される。さらなる実施形態において、フェチュインＡは、大手術前に、例えば心臓血管手術前または腎臓移植前にそれを必要とする対象に投与される。これらの実施形態は組み合わせることができ、例えば一部の実施形態において、フェチュインＡは、大手術前およびその後に投与される。

本発明の文脈において、フェチュインＡは、転写因子ＨＩＦ－１αの標的であり得る。低酸素誘導性因子１－アルファとしても公知のＨＩＦ－１αは、ヘテロ二量体転写因子である低酸素誘導性因子１（ＨＩＦ－１）のサブユニットである。「標的」は、細胞シグナル伝達経路またはカスケードに関連して、「下流」において影響を受けるタンパク質として本明細書で定義される。本発明の文脈において、フェチュインＡは、ＨＩＦ－１αの下流において作用し得る。

本発明の一部の実施形態において、処置は、腎臓組織の石灰化レベル、好ましくは低酸素に関連した石灰化レベルの調節を含む。「石灰化」は、組織の永久的な損傷をもたらし得る、体組織における、特に腎臓におけるカルシウム塩の蓄積として本明細書で定義される。これは、組織における酸素供給の制限の結果として炎症応答および組織損傷をもたらし得る。一実施形態において、処置は、腎臓組織におけるカルシウムミネラル沈着物の除去、特に移植された腎臓組織におけるカルシウムミネラル沈着物の除去を含む。

本発明の別の実施形態において、少なくとも２用量のフェチュインＡが投与されるか、または少なくとも３用量のフェチュインＡが投与される。一部の実施形態において、少なくとも４用量のフェチュインＡが投与される。本発明の別の実施形態において、対象の処置は、好ましくは虚血事故および／または手術、特に大手術の翌週または翌月の少なくとも１用量のフェチュインＡの少なくとも毎日または毎週の投与による処置期を含む。

本発明の文脈において、用語「虚血事故」は、虚血を引き起こすおよび／または含む、特に虚血を含む任意のイベントを指す。手術は、組織への血液供給が前記手術中制限される虚血事故である。例えば、腎臓移植手技中、グラフトにしばしば血液が適切に灌流されない場合がある。事故時の突然の失血も虚血事故であり得、その間腎臓に適切に灌流されない。一部の実施形態において、虚血事故は、大手術中の虚血であり、特に、大手術は、腎臓移植または心臓血管手術である。

本発明の別の実施形態において、少なくとも１用量のフェチュインＡは、虚血事故および／または手術、特に大手術の前、その間またはその後に投与される。一部の実施形態において、虚血事故および／または手術は、腎臓移植または心臓血管手術である。

本発明のさらに別の実施形態において、少なくとも１用量のフェチュインＡは、腎臓移植または心臓血管手術のような虚血事故前またはその後４８時間以内、特に２４時間以内に投与される。一部の実施形態において、少なくとも１用量のフェチュインＡは、虚血事故後４８時間以内、特に２４時間以内に投与される。さらに別の実施形態において、少なくとも１用量のフェチュインＡは、大手術前４８時間以内、特に２４時間以内に投与される。さらに別の実施形態において、少なくとも１用量のフェチュインＡは、大手術後４８時間以内、特に２４時間以内に投与される。一部のさらなる実施形態において、フェチュインＡは、大手術中に投与される。前記大手術は、一部の実施形態において、腎臓移植または心臓血管手術である。

本発明のさらに別の実施形態において、少なくとも１つの第１の用量のフェチュインＡは、虚血事故前４８時間以内、特に２４時間以内に投与され、少なくとも１つの第２の用量のフェチュインＡは、虚血事故後４８時間以内、特に２４時間以内に投与される。一部の実施形態において、少なくとも２用量のフェチュインＡは、虚血事故前４８時間以内、特に２４時間以内に投与される。さらに別の実施形態において、少なくとも２用量のフェチュインＡは、大手術前４８時間以内、特に２４時間以内に投与される。さらに別の実施形態において、２または３用量のフェチュインＡは、大手術前４８時間以内、特に２４時間以内に投与される。一部の実施形態において、少なくとも２用量のフェチュインＡは、虚血事故後４８時間以内、特に２４時間以内に投与される。さらに別の実施形態において、少なくとも２用量のフェチュインＡは、大手術後４８時間以内、特に２４時間以内に投与される。さらに別の実施形態において、２または３用量のフェチュインＡは、大手術後４８時間以内、特に２４時間以内に投与される。

一部の実施形態において、フェチュインＡは、患者に少なくとも週１回、特に少なくとも４８時間に１回、好ましくは少なくとも２４時間に１回投与される。

一部の実施形態において、フェチュインＡは、１～１００日間の合計持続期間にわたって、特に１～５０日間の合計持続期間にわたって分割量で投与される。別の実施形態において、フェチュインＡは、１～２５日間の合計持続期間にわたって分割量で投与される。別の実施形態において、フェチュインＡは、１～１０日間の合計持続期間にわたって分割量で投与される。別の実施形態において、フェチュインＡは、２～１０日間の合計持続期間にわたって分割量で投与される。

本発明の実施形態において、処置は、フェチュインＡを医薬組成物の一部としてそれを必要とする対象に投与することを含む。好ましくは、医薬組成物は液体形態である。好ましくは、前記医薬組成物は、本発明の第２の態様において以下に定義される実施形態のうちの１つまたはそれ以上に従ったものである。

第２の態様において、本発明は、腎障害の処置における使用のための医薬組成物であって、フェチュインＡ（ＡＨＳＧ）および場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。一部の実施形態において、第２の態様は、腎障害を処置する方法における使用のための医薬組成物であって、腎障害を処置するのに効果的なフェチュインＡの量が、それを必要とする対象、好ましくは患者に投与される医薬組成物に関する。

本明細書において言及される「医薬担体」は、薬物投与の選択性、有効性、および／または安全性を改善するのに役立つ、薬物送達方法で用いられる任意の基質であり得る。

第２の態様による医薬組成物は、フェチュインＡに関連して上で説明されたのと同じ処置および腎障害のために使用でき、上で説明された任意の処置はまた、このような処置における使用のための医薬組成物の実施形態を説明し得る。この第２の態様の好ましい実施形態において、腎障害は、急性腎障害、慢性腎障害、腎臓線維化、慢性腎臓疾患、腎不全、腎炎、急性腎臓傷害、虚血性腎障害、低酸素に関連する障害、腎虚血－再灌流傷害、腎臓組織損傷、好ましくは虚血性腎臓組織損傷、腎臓移植に関連する障害、心臓血管手術に関連する障害およびこれらの組合せからなる群から選択される。

一部の実施形態において、医薬組成物は液体である。一部の実施形態において、医薬組成物は水を含む。

この第２の態様の別の実施形態において、腎臓移植に関連する障害は、グラフト機能遅延、腎臓移植片の臓器拒絶反応、腎臓移植によって生じる腎臓組織損傷、腎臓移植によって生じる炎症、腎臓移植によって生じる腎ＩＲＩおよびこれらの組合せからなる群から選択される。

好ましくは、腎障害は、手術、特に大手術中の低酸素に起因する。例えば、低酸素は、腎臓移植または心臓血管手術中の虚血に起因し得る。

同様に好ましい実施形態において、医薬組成物のフェチュインＡは、上で詳細に説明したように定義される。医薬組成物は、フェチュインＡの上記実施形態のいずれかを含み得る。

本発明の医薬組成物の文脈において、フェチュインＡは、好ましくはヒトフェチュインＡ、より好ましくはヒト血漿に由来するフェチュインＡである。

代替実施形態において、医薬組成物のフェチュインＡは、翻訳後修飾、特にグリコシル化を提供する、好ましくは宿主細胞系において組換え的に発現される。

フェチュインＡが、配列番号１に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一および／または相同であることが、この文脈において同様に好ましい。また、フェチュインＡが、配列番号１またはその断片を含むか、またはこれらからなることが好ましい。

実施形態において、医薬組成物は、上で詳細に説明したように対象に投与される。好ましくは、医薬組成物は、注射または吸入用に製剤化される。

下記の図面および実施例は、本発明の様々な実施形態を例示することが意図される。したがって、そこで考察される特定の改変は、本発明の範囲の限定として理解されるべきではない。様々な同等物、変更および改変が、本発明の範囲から逸脱することなくなされることは、当業者に明らかであり、したがって、このような同等の実施形態が本明細書に含まれるべきであることが理解されるべきである。

慢性胎児低酸素は、マウスにおける子宮内成長制限を誘導する：図１Ａ。分析の実験的設定および時点。図１Ｂ。同腹仔あたりの平均仔数。図１Ｃ。Ｅ１８．５胎児の合計の体重分布（実験条件ごとにｎ＝４９；Ｎｏ：正常酸素、Ｈｙ：低酸素、Ｃｃ：カロリー制限）。図１Ｄ。Ｅ１８．５腎臓あたりの平均ネフロン数は、糸球体マーカーネフリンの染色により決定された。ウェルチの補正による独立ｔ検定。 図１－１の続き。 腎臓における低酸素誘導性遺伝子発現：図２Ａ。低酸素、正常酸素カロリー制限群Ｅ１８．５胎児（実験条件ごとにｎ＝３）の腎遺伝子発現プロファイルを比較するｃＤＮＡマイクロアレイデータの階層的クラスタリング。白色領域は誘導、および縦ハッチング領域は抑制を示す（誘導、抑制の程度は図２Ａに図示されない）。Ａｈｓｇの位置は矢印で記される。両方の正常酸素対照と対比して低酸素の少なくとも１．３倍調節により遺伝子のクラスタリングを行った；１元配置ＡＮＯＶＡ；Ｐ＜０．０５。図２Ｂ～Ｅ。Ｅ１８．５腎臓（丸）または肝臓サンプル（四角）におけるＡｈｓｇ（Ｂ）、Ａｐｏａ２（Ｃ）、Ｆｇｇ（Ｄ）およびＧｙｓ２（Ｅ）の相対ｍＲＮＡ値。図２Ｆ。ＥＬＩＳＡにより評価したＥ１８．５胎児のフェチュインＡ血漿レベル。 図２－１の続き。 図２－２の続き。 図２－３の続き。 近位尿細管における胎児低酸素誘導性フェチュインＡ発現：図３Ａ～Ｈ。正常酸素（Ａ～Ｄ）または低酸素（Ｅ～Ｈ）、野生型（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）またはＣｌｃｎ５ ＫＯ（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）胎児のＥ１８．５腎臓切片でのフェチュインＡ染色。（Ｄ、Ｈ）の矢頭は、Ｃｌｃｎ５ ＫＯマウスのＰＴにおける低分子量タンパク質のエンドサイトーシス障害によって生じる腔内フェチュインＡ染色を示す。（Ｉ～Ｌ）Ｅ１８．５腎臓切片での示されたネフロンセグメントマーカータンパク質およびフェチュインＡの免疫蛍光染色。ＰＴ、近位尿細管；ＴＡＬ、太い上行脚；ＤＣＴ、遠位曲尿細管；ＣＤ、集合管；スケールバー、３００μｍ（概観画像）または５０μｍ。 インビトロでの低酸素活性化フェチュインＡ発現：図４Ａ。ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物（１～８）を産生するために用いられたマウスＡｈｓｇの潜在的なＨＲＥの描写。変異ＨＲＥが示される。図４Ｂ。レポーター構築物でトランスフェクトされたＮＲＫ細胞中のルシフェラーゼ活性。低酸素と正常酸素培養条件との間でのルシフェラーゼ発光の倍率変化が示される。各条件は、空のベクター対照に正規化される（ｐＧＬ３）。ダネット多重比較検定。図４Ｃ～Ｅ。正常酸素または低酸素条件下で培養された、４匹の異なるマウスから単離されたマウス初代近位尿細管細胞（ｐＰＴＣ）（Ｃ）における、ラット細胞株ＮＲＫ（Ｄ）におけるおよびヒト細胞株ＨＫ－２（Ｅ）におけるフェチュインＡの発現。 図４－１の続き。 フェチュインＡ欠損は、低酸素ＩＵＧＲ腎臓においてＣＫＤの進行を悪化させた：図５Ａ～Ｂ。タンパク質／クレアチニン比および糸球体濾過率（ＧＦＲ）により評価された９週齢のマウスの腎臓機能の低下。図５Ｂ。最も顕著であるのは、胎児低酸素Ａｈｓｇ ＫＯ動物であり、低酸素およびフェチュインＡ欠損の相加効果が示される（実験条件ごとにｎ≧５）。図５Ｃ～Ｄ。コラーゲンのピクロシリウスレッド染色の代表的な画像は、胎児低酸素ｗｔマウス（Ｃ）と比較して、Ｐ１４胎児低酸素Ａｈｓｇ ＫＯマウス（Ｄ）に由来する腎臓切片でより強くより複雑なパターンを示す。図５Ｅ～Ｇ。線維化マーカーＡｃｔａ２（Ｅ）、Ｃｏｌ１ａ１（Ｆ）およびＦｎ１（Ｇ）の相対的な発現レベルが、胎児低酸素Ａｈｓｇ ＫＯマウスの腎臓において著しく増強される（実験条件ごとにｎ≧５）。フィッシャーのＬＳＤ検定（Ａ～Ｂ）。スケールバー、５０μｍ。 図５－１の続き。 図５－２の続き。 フェチュインＡ欠損は、低酸素ＩＵＧＲ腎臓におけるカルシウムミネラル粒子およびマクロファージの蓄積を促進した：図６Ａ～Ｉ。正常酸素ｗｔ（Ａ、Ｄ、Ｇ）、低酸素ｗｔ（Ｂ、Ｅ、Ｈ）または低酸素Ａｈｓｇ ＫＯ胚（Ｃ、Ｆ、Ｉ）のＥ１８．５腎臓切片でのＡＴＴＯ４８８蛍光標識フェチュインＡ（４８８－ＦＡ）染色によるカルシウムバイオミネラルの検出。低酸素Ａｈｓｇ ＫＯマウスは、正常酸素および低酸素ｗｔマウス（Ａ、Ｂ）と比較してＰＴ（Ｃ）において最強の染色強度を示し、ミネラル化マトリックスのターンオーバーの上昇が示される。矢頭は顆粒染色パターンの方を向き、低酸素Ａｈｓｇ ＫＯマウスにのみ存在する乳頭（Ｆ）および皮質（Ｉ）における４８８－ＦＡの大量の蓄積が反映される。図６Ｊ～Ｍ。示された遺伝子型および酸素条件で、Ｅ１８．５腎臓切片での、マクロファージマーカーＦ４／８０（ｊ’、ｋ’、ｌ’、ｍ’）およびフェチュインＡ（ｊ’’’、ｋ’’’、ｌ’’’、ｍ’’’）の代表的な免疫蛍光染色、ＤＡＰＩ（ｊ’’’’、ｋ’’’’、ｌ’’’’、ｍ’’’’）および４８８－ＦＡ（ｊ’’、ｋ’’、ｌ’’、ｍ’’）による対比染色。マクロファージの蓄積および拡散、ならびに顆粒４８８－ＦＡ染色は、低酸素Ａｈｓｇ ＫＯマウス（Ｍ）においてのみ検出された。図６Ｎ。視野あたりの総Ｆ４／８０染色面積の定量化。少なくとも３匹のマウスの複数の切片を、実験条件ごとに分析した。スケールバー、１００μｍ。 図６－１の続き。 図６－２の続き。 フェチュインＡは、線維化マーカーの低酸素誘導性発現を減弱させた：図７Ａ。ｗｔまたはＡｈｓｇ ＫＯマウスから単離した初代近位尿細管細胞（ｐＰＴＣ）における低酸素培養条件下でのフィブロネクチンおよびα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）の誘導を示す、代表的なウェスタンブロット。図７Ｂ～Ｄ。フェチュインＡ補給は、ｐＰＴＣにおいて線維化マーカーＡｃｔａ２（Ｂ）、Ｃｏｌ１ａ１（Ｃ）およびＦｎ１（Ｄ）の低酸素誘導性発現を減弱させる（実験条件ごとにｎ≧５）。図７Ｅ～Ｆ。フェチュインＡだけが、線維化マーカーの発現に対して低減効果があり、ＢＳＡは該効果がなかった（実験条件ごとにｎ≧４）。図７Ｇ。フェチュインＡ補給が、フィブロネクチンおよびＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）タンパク質の発現を減弱させることを示す代表的なウェスタンブロット。図７Ｈ。ＴＧＦ－β１処置および低酸素は、Ｓｍａｄ３のリン酸化に対して相加効果がある。代表的なウェスタンブロットが示される。図７Ｉ。（Ｈ）に示すＳｍａｄ３活性化の定量化。ウェルチ補正による独立ｔ検定（Ｂ～Ｄ、正常酸素ｗｔおよび正常酸素Ａｈｓｇ ＫＯサンプルの比較のみ）。フィッシャーのＬＳＤ検定（Ｉ）。 図７－１の続き。 図７－２の続き。 図７－３の続き。 図７－４の続き。 低酸素応答ＩＲＩは、腎臓においてカルシウム含有微粒子の沈着を誘導した：虚血再灌流（ＩＲＰ）後の４８８－ＦＡによるカルシウム含有微粒子の検出。手術の７日後の対照側（Ｉ）および虚血再灌流（ｍ）での４８８ＦＡ染色は、ＩＲＰ腎臓においてのみカルシウムバイオミネラルの存在を示す。 フェチュインＡ補給は、虚血再灌流傷害後、線維化マーカーの発現を減弱させた：図９Ａ～Ｆ。フェチュインＡ補給は、Ｃｏｌ１ａ１（Ａ）、Ｃｏｌ３ａ１（Ｂ）、Ｃｏｌ６ａ１（Ｃ）の虚血誘導性発現を減弱させるが、非コラーゲン線維化マーカーＡｃｔａ２（Ｄ）、Ｆｎ１（Ｅ）またはＶｉｍ（Ｆ）の発現に対して効果がない。一元配置ＡＮＯＶＡ検定。 図９－１の続き。 図９－２の続き。 図９－３の続き。 虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）を受けるマウスにおけるヒトフェチュインＡの予防的投与は、損傷を抑え、線維化リモデリングを減少させた：図１０Ａ～Ｄ。早期損傷マーカーＫｉｍ１（Ａ）、Ｋｒｔ１８（Ｂ）、Ｋｒｔ２０（Ｃ）およびＬｃｎ２（Ｄ）の発現レベルは、ＰＢＳで前処置したＩＲＩ腎臓と比較してフェチュインＡで前処置したＩＲＩ腎臓において低下する。図１０ＥおよびＦ。線維化リモデリングマーカーＣｌｕ（Ｅ）およびＴｇｆｂ１（Ｆ）は、ＩＲＩ中のＰＢＳ対照と比較して同様に減少する。図１０Ｇ。非コラーゲン線維化マーカーＶｉｍ（Ｇ）は、ＰＢＳ前処置ＩＲＩ腎臓と比較して、フェチュインＡ前処置ＩＲＩ腎臓において減少する。図１０Ｈ～Ｊ。フェチュインＡ予防的処置時のコラーゲン発現が、Ｃｏｌ１ａ１（Ｈ）、Ｃｏｌ３ａ１（Ｉ）およびＣｏｌ６ａ１（Ｊ）について示される。図１０Ｋ。Ａｒｇ１（Ｋ）発現は、ＰＢＳ前処置マウスと比較してフェチュインＡ前処置マウスにおいて抑制され、コラーゲン合成の必要性の減少が示される。図１０Ｌ～Ｎ。フェチュインＡによる前処置はまた、虚血条件下で通常増加する損傷シグナル伝達および修復に関与するケモカインＣｃｌ２（Ｌ）、ＩＩ－６（Ｍ）およびＴｎｆ－α（Ｎ）の発現を低下させる。図１０のレジェンド：白丸：ＰＢＳ注射、未手術対照腎臓；白三角：ＰＢＳ注射、ＩＲＩ腎臓；黒丸：フェチュインＡ注射、未手術対照腎臓；黒三角：フェチュインＡ注射、ＩＲＩ腎臓。図１０のＰ値は、多重比較（通常のフォント）および対ｔ検定（太字フォント）のテューキー補正による通常の一元配置ＡＮＯＶＡについて示される。 図１０－１の続き。 図１０－２の続き。 図１０－３の続き。 図１０－４の続き。 図１０－５の続き。 図１０－６の続き。 図１０－７の続き。 静脈内投与時のマウスの腎組織における内因性フェチュインＡの存在：図１１Ａ。ウェスタンブロット。レーンＡ～Ｃ：フェチュインＡ注射、未手術対照腎臓；レーンＤ～Ｆ：フェチュインＡ注射、ＩＲＩ腎臓；レーンＧ～Ｉ：ＰＢＳ注射、未手術対照腎臓；レーンＪ～Ｌ：ＰＢＳ注射、ＩＲＩ腎臓；レーンＭ：空；レーンＮ：注射に使用したヒトフェチュインＡタンパク質。上部パネル：ａｂｃａｍからのａｂ１８７０５１抗フェチュインＡ抗体（マウスフェチュインＡに特異的）を用いる内因性マウスフェチュインＡについてのウェスタンブロット。中間パネル：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚからのｓｃ－１３３１４６－ＨＲＰ抗フェチュインＡ抗体（ヒトフェチュインＡに特異的）を用いるヒトフェチュインＡについてのウェスタンブロット。下部パネル：負荷対照として利用したＲｐｌｐ０。ヒトフェチュインＡタンパク質を注射したマウスからの腎臓サンプルは、ヒトフェチュインＡ（レーンＡ～Ｆ）の強いバンドを示した。フェチュインＡは、ＰＢＳ注射対照サンプル（レーンＧ～Ｌ）で検出されなかった。ＰＢＳ注射ＩＲＩ腎臓（レーンＪ～Ｌ）は、すべてのサンプル間でマウスフェチュインＡの存在量が最も高いことを示した。ヒトフェチュインＡタンパク質（レーンＮ）がシグナルを送らなかったため、ヒトフェチュインＡは、マウス特異的抗フェチュインＡ抗体ａｂ１８７０５１で検出されなかった。図１１Ｂ。ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅからのＭＦＴＡ００ ＥＬＩＳＡキット（マウスフェチュイン－Ａに特異的）を用いるマウスフェチュイン－ＡについてのＥＬＩＳＡ。内因性マウスフェチュインＡは、すべての他のサンプルと比較してＰＢＳ注射ＩＲＩ腎臓においてのみ上昇した。図１１Ｃ。ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅからのＤＦＴＡ００ ＥＬＩＳＡキット（ヒトフェチュイン－Ａに特異的）を用いるヒトフェチュイン－ＡについてのＥＬＩＳＡ。ヒトフェチュインＡは、ＰＢＳ注射マウスの腎臓サンプルにおいて検出できなかった。フェチュインＡ注射ＩＲＩ腎臓は、未手術対側（右）腎臓よりヒトフェチュインＡの組織レベルが高い。図１１Ｄ～Ｆ。内因性フェチュインＡは、静脈内投与時、マウスの腎組織に存在した。蛍光標識フェチュインＡ（Ａｌｅｘａ－４８８標識フェチュインＡ）は、静脈内注射の１５、３０、および６０分後、近位尿細管（ＰＴ）に存在した。Ａｌｅｘａ－４８８－標識フェチュインＡの注射の１５分後、微細な断続的な染色が、近位尿細管で検出された。この染色強度は、注射の３０分および６０分後に増加した。Ｇ、糸球体。図１１ＢおよびＣのレジェンド：白丸：ＰＢＳ注射、未手術の対照腎臓；白三角：ＰＢＳ注射、ＩＲＩ腎臓；黒丸：フェチュインＡ注射、未手術対照腎臓；黒三角：フェチュインＡ注射、ＩＲＩ腎臓。図１１ＢおよびＣのＰ値は、多重比較（通常のフォント）および対ｔ検定（太字フォント）のテューキー補正による通常の一元配置ＡＮＯＶＡについて示される。 図１１－１の続き。 図１１－２の続き。 図１１－３の続き。 静脈内投与時のマウス血清中のヒトフェチュインＡの経時変化：図１２Ａ。レーンＡおよびＢ：注射の１分後；レーンＣおよびＤ：注射の１時間後；レーンＥおよびＦ：注射の１日後；レーンＧおよびＨ：注射の１週間後；レーンＩおよびＪ：対照ＰＢＳ注射；レーンＫ：注射に使用したヒトフェチュインＡタンパク質。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚからのヒト特異的ｓｃ－１３３１４６－ＨＲＰ抗フェチュインＡ抗体を用いるヒトフェチュインＡについてのウェスタンブロット。１日後、血清中のヒトフェチュインＡの検出量は、注射の１分または１時間後と比較して減少した。１週間後、ヒトフェチュインＡは検出できなかった。ＰＢＳ注射対照動物がシグナルを送らなかったため、マウスフェチュインＡは、ｓｃ－１３３１４６－ＨＲＰ抗フェチュインＡ抗体で検出されなかった。図１２Ｂ。マウス血清サンプル中の静脈内注射ヒトフェチュインＡの低下を示す、ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅからのＤＦＴＡ００ ＥＬＩＳＡキット（ヒトフェチュインＡに特異的）を用いる正規化ＥＬＩＳＡデータ。注射時点（１分）と比較して、循環ヒトフェチュインＡの量は、１時間後８０％に減少し、１日後８．５％に減少した。１週間後、ヒトフェチュインＡは、ＰＢＳ注射マウス（黒丸）と同様にもはや検出できなかった。図１２Ｃ。静脈内投与時のマウスの血清中のヒトフェチュインＡの経時変化。マウス血清サンプル中の静脈内注射ヒトフェチュインＡの低下を示す、正規化ＥＬＩＳＡデータ。注射時点（１分）と比較して、循環ヒトフェチュインＡの量は、１時間後８０％に減少し、１日後８．５％に減少した。１週間後、ヒトフェチュインＡは、もはや検出できなかった。 図１２－１の続き。

［実施例］
慢性胎児低酸素は、マウスにおいてＩＵＧＲを誘導する。慢性胎児低酸素をモデル化するために、適時交配による妊娠マウスをＥ１４．５からＥ１８．５まで１０％の酸素に曝露した（図１Ａ）。食物を自由摂取としたにもかかわらず、低酸素雌親（Ｈｙ）が小食であることが観察されたため、およびカロリーが制限されること自体がＩＵＧＲ５の公知の誘導因子であるため、知見が低酸素によるものではなく、摂取カロリーの低下によるものであり得る可能性を排除するために、第２の対照群を分析に含めた。このカロリー制限（Ｃｃ）群において、正常酸素雌親には、低酸素マウスが消費した少ない食物量に匹敵する食物量で給餌した。産仔数、胎盤重量または胎児生存率は、３つの群の間で区別できなかったが、母体の体重増加は、低酸素雌親において著しく低減された（図１Ｂ）。重要なことに、低酸素雌親からの胎児のみがＬＢＷを示し、ＩＵＧＲ基準を満たしているが（図１Ｃ）、正常酸素またはＣｃ群からの胎児は示さなかった。対照と比較して、低酸素胎児の腎臓は小さく、ネフロンも著しく少なかった（図１Ｄ）。

低酸素胎児腎臓は、肝臓遺伝子発現パターンを採用する。次に、胎児低酸素腎臓における全ゲノム発現を、遺伝子アレイを用いて調べた。６２個の誘導および２８個の抑制遺伝子を同定し、両方の対照群と比較した（図２Ａ）。真のＨＩＦ標的遺伝子であるトランスフェリン、トレフォイル因子３、ニューリチン、アルファ－１－アンチトリプシン（セルピナ１ｄ）およびアルファ－１－抗キモトリプシン（セルピナ３ｎ）を含む、誘導遺伝子のうちの１７個は、低酸素により調節されることが公知である。さらに、誘導遺伝子の２０％超が、主要なカルシプロテイン粒子（ＣＰＰ）成分であるフェチュインＡ（Ａｈｓｇ）、アルブミン、Ａｐｏ－Ａ１およびトロンビン（Ｆ２）を含むＣＰＰから高頻度で精製されることが見出された。誘導遺伝子の機能アノテーションクラスタリングでは、専ら肝臓で通常転写される分泌血漿タンパク質の濃縮が低酸素腎臓において明らかになった。選択遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲによるマイクロアレイデータの検証では、低酸素胎児腎臓においてのみ１０倍超の誘導が確認されたが、対照群の腎臓においては確認されなかった（図２Ｂ～Ｅ）。ｍＲＮＡレベルの変化は、胎児肝臓サンプルでは見出されなかった。

フェチュインＡは、低酸素条件下で近位尿細管において局所的に産生される。興味深いことに、最も高い誘導を有する遺伝子（Ａｈｓｇ）が、アノテーション群１０群のうち７群で見出された。Ａｈｓｇは、システインプロテアーゼ阻害剤のシスタチンスーパーファミリーに属し、陰性急性期の糖タンパク質であるフェチュインＡをコードし、その主な機能はミネラル化マトリックスの代謝に関係する。低酸素腎臓におけるその強い誘導にもかかわらず、胎児血漿フェチュインＡレベルの著しい上昇は検出できず（図２Ｆ）、低酸素発生チャレンジ中の特異的、全身性ではなく局在的な機能的関連性が暗示された。胎児低酸素腎臓におけるＡｈｓｇ発現の機能的関連性にさらに対処するために、その正確な局在化を調べた。図３は、胎児腎臓近位尿細管（図３Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）または尿細管腔（図３Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）の免疫組織化学を示す。強いフェチュインＡ染色は、酸素条件にかかわらず近位尿細管（ＰＴ）の細胞の境界を画定した（図３Ａ、Ｅ）。これは、全身フェチュインＡの濾過、およびメガリン依存性エンドサイトーシスによるＰＴへのその取り込みによるものであり、低酸素胎児腎臓において局在的に産生された任意のフェチュインＡを遮蔽する。腎起源のフェチュインＡタンパク質を選択的に視覚化するために、Ｈｉｓ－ｓＲＡＰ（ヒスチジンタグ化可溶性受容体関連タンパク質）を用いるメガリン依存性エンドサイトーシスの７薬理学的阻害に代わる方法である、ＰＴへのエンドサイトーシスをブロックする遺伝的アプローチを採用した。Ｃｌｃｎ５ノックアウト（ＫＯ）マウスは、デント病を模倣する、ＰＴにおける低分子量タンパク質の重篤なエンドサイトーシス障害を示した。正常酸素Ｃｌｃｎ５ ＫＯ腎臓では、ＰＴ細胞において顕著なフェチュインＡ染色がなかった（図３Ｂ）。その代わりに、野生型（ｗｔ）サンプルに存在しない（図３Ｃ）、強い腔内シグナルが検出され（図３Ｄ）、Ｃｌｃｎ５ ＫＯマウスのエンドサイトーシス表現型障害が強調された。しかし、低酸素Ｃｌｃｎ５ ＫＯ腎臓は、管腔シグナルに加えてＰＴにおいて強いフェチュインＡ染色を示し（図３Ｆ、Ｈ）、観察された細胞フェチュインＡ染色がＰＴに純粋に起源を持つという証拠が提供された。フェチュインＡおよび様々な腎セグメントマーカーの二重免疫蛍光染色（図３Ｉ～Ｌ）では、フェチュインＡが、低酸素胎児腎臓のＰＴにおいてのみ発現されたことが確認された。ホールマウントのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでは、低酸素胎児腎臓におけるフェチュインＡのｍＲＮＡ合成が実証されたが、正常酸素腎臓においては実証されなかった。

Ａｈｓｇは、エンハンサー領域と重複する推定ＨＩＦ結合部位を内包する。フェチュインＡが低酸素胎児腎臓において局在的に産生されることが示されたため、Ａｈｓｇの発現が、低酸素により直接活性化されるか否かを評価した。ヒトＡＨＳＧ遺伝子座における潜在的なＨＩＦ結合部位（低酸素応答要素－ＨＲＥ）を確認するため、低酸素ＭＣＦ７細胞由来のＨＩＦ－１α（ＨＩＦ－１－アルファ）およびＨＩＦ－２α（ＨＩＦ－２－アルファ）ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットを使用した。Ｈ３Ｋ２７ＡｃおよびＨ３Ｋ４Ｍｅ１（活性エンハンサー要素のクロマチンマーク）ならびにＤＮａｓｅ１過敏症と重複するヒトＡＨＳＧの第４エクソン付近に潜在的なＨＲＥのクラスターが同定された。別の推定ＨＲＥは、第１イントロンに位置していた。ＡＴＧの１０ｋｂ上流および下流にあるコンセンサスＨＩＦ結合部位（ＲＣＧＴＧ）の存在についての１５種のＡｈｓｇ遺伝子のスクリーニングでは、１ｋｂウィンドウあたり平均２個のＨＲＥ数で、ＡＴＧの１～５ｋｂ下流にピークが示された。とりわけ、アノテートされたヒトＣｈＩＰ－ｓｅｑ ＨＩＦ部位だけでなく、４個の潜在的なマウスＨＲＥもこのピークに局在した。エンハンサーマークを有する後者のアラインメントは、Ｈ３Ｋ２７Ａｃ、Ｈ３Ｋ４Ｍｅ１およびＤＮａｓｅ１過敏症との密接な関連を明らかにした。

低酸素は、インビトロでのフェチュインＡ転写を活性化する。マウスＡｈｓｇの５つの推定ＨＲＥおよびこれらの周辺のＤＮＡを、これらの部位のナンセンス変異と共に、ルシフェラーゼレポータープラスミドにクローン化した（図４Ａ）。推定－２ｋｂのＨＲＥのみを含有するレポータープラスミドでトランスフェクトされた正常なラットの腎臓上皮（ＮＲＫ）細胞は、低酸素条件下でルシフェラーゼ活性の増加を示さなかった（図４Ｂ）。反対に、下流のＨＲＥを含有するレポータープラスミドを有するＮＲＫ細胞は、低酸素においてルミネセンスが著しく増大した。これらのＨＲＥを変異させた場合、ルシフェラーゼ活性の増加は検出されなかった。さらに、上流と下流のＨＲＥを組み合わせた場合、ルシフェラーゼ活性は増強されなかった。要約すると、ＡＴＧの下流に位置するＨＲＥは、マウスＡｈｓｇ遺伝子に低酸素誘導能を与えた。最後に、初代マウスＰＴ細胞（ｐＰＴＣ）、ＮＲＫ細胞およびヒトＨＫ２細胞中のフェチュインＡタンパク質は、低酸素条件下で培養した場合検出された（図４Ｃ～Ｅ）。総合すると、これらの知見により、フェチュインＡが、新規な進化的に保存されたＨＩＦ依存性標的遺伝子として同定された。

フェチュインＡ欠損は、低酸素ＩＵＧＲ腎臓においてＣＫＤの進行を悪化させる。胎児低酸素ＩＵＧＲ腎臓におけるフェチュインＡの誘導が、どのように腎機能に長期間影響を与えるのかについて調査するために、成体マウスにおいて尿中タンパク質レベルを測定し、糸球体濾過率（ＧＦＲ）を決定した（図５Ａ、Ｂ）。正常酸素と対比して胎児低酸素に曝露した９週齢のマウスにおいて、ＧＦＲは低下し、タンパク尿は増加した。さらに、線維化組織のリモデリングの評価では、低酸素ｗｔおよび正常酸素対照各々と比較して、９匹の胎児低酸素Ａｈｓｇ ＫＯマウスの腎臓において、より多くのコラーゲン構造が皮質下領域に深く広がり、線維化マーカーの発現レベルが最も高いことが明らかになった（図５Ｃ～Ｇ）。重要なことに、これらの結果は、腎機能がＡｈｓｇ ＫＯマウスにおいて系統的に影響を受けやすかったことを明確に示し、低酸素およびフェチュインＡ欠損の相加効果が示される。

フェチュインＡ欠損は、低酸素ＩＵＧＲ腎臓においてカルシウムミネラル粒子およびマクロファージの蓄積を促進する。成体フェチュインＡ ＫＯマウスは、軟組織石灰化しやすいが、フォンコッサ染色により評価されるように、低酸素Ａｈｓｇ ＫＯマウスの腎臓において明白な石灰化は検出されなかった。胎児低酸素腎臓におけるフェチュインＡの発現が、ミネラル化マトリックス処理に影響を与えるか否かをさらに試験するために、カルシウム含有ナノ粒子の存在を、ＡＴＴＯ４８８蛍光標識フェチュインＡ（４８８－ＦＡ）と共にＥ１８．５胚の新たに切断した腎臓切片をインキュベートすることによって証明した。リン酸カルシウムへのフェチュインＡの高親和性結合により、４８８－ＦＡ染色は、一般的に用いられるミネラル染色プロトコルより、カルシウム含有マトリックスおよび細胞レムナントの検出に対する感受性が高い。したがって、フォンコッサまたはアリザリンレッド染色の非存在下での陽性４８８－ＦＡ染色も、しばしば明らかな石灰化に先行する非晶質リン酸カルシウムの凝集物を含む単にカルシウム強化された構造を強調する。４８８－ＦＡ染色により、正常酸素ｗｔ腎臓において、主なカルシウムの再吸収およびしたがって同様にミネラル化マトリックス処理の部位であるＰＴの強い標識化が明らかになった（図６Ａ）。ＰＴ染色の強さは、低酸素ｗｔにおいて低下し、低酸素Ａｈｓｇ ＫＯにおいて増加し、ミネラル化マトリックスのターンオーバーの上昇および低下が各々示唆された（図６Ｂ、Ｃ）。また、低酸素Ａｈｓｇ ＫＯ腎臓だけが、乳頭領域においておよびそれほど多くはないが外皮質の腎性領域において粒状染色パターンを示し（図６Ｄ～Ｉの矢頭）、内因性フェチュインＡの非存在下での大量のミネラルの沈着が示された。過剰な大量のミネラルまたは細胞デブリは、細胞死が増大した部位でしばしば見出される。実際に、ＴＵＮＥＬ染色では、低酸素Ａｈｓｇ ＫＯ腎臓においてアポトーシスが確認されたが、正常酸素または低酸素ｗｔ腎臓においては確認されなかった。低酸素Ａｈｓｇ ＫＯ腎臓における切断型カスパーゼ－３免疫染色では、これらの腎臓における細胞死がさらに実証された。最後に、ミネラル化した物質の蓄積は、炎症応答を誘発し、マクロファージの浸潤、組織損傷および線維化もたらした。マクロファージマーカーＦ４／８０の染色では、ｗｔ腎臓と対比して低酸素Ａｈｓｇ ＫＯにおいてのみこれらの細胞の著しい蓄積が明らかになり、フェチュインＡの保護効果が示唆された（図６Ｊ～Ｎ）。総合すると、これらのデータからは、組織の完全性を保護する、腎臓におけるミネラル化マトリックスの結合およびクリアランスにおけるフェチュインＡの役割が初めて例示された。

フェチュインＡは、ＴＧＦ－βシグナル伝達をアンタゴナイズすることにより線維化マーカーの低酸素誘導性発現を減弱させる。強力な線維化誘導因子である形質転換成長因子ベータ－１（Ｔｇｆｂ１）の類似のｍＲＮＡレベルにもかかわらず、胎児低酸素Ａｈｓｇ ＫＯマウスの腎臓は、胎児低酸素ｗｔ動物と対比して、線維化マーカーの発現レベルが高いことを全般的に示した（図５）。これらの知見を、新鮮に単離されたｐＰＴＣを用いてインビトロで解明した。線維化マーカーの発現は、ｗｔ細胞と比較してＡｈｓｇ ＫＯ ｐＰＴＣで全般的に増強され、低酸素培養条件下でより一層増加した（図７Ａ～Ｄ、Ｇ）。この低酸素誘導性増加は、培養培地へのフェチュインＡの補給により鈍化した（図７Ｂ～Ｇ）。組換えＴＧＦ－β１によるｐＰＴＣの刺激は、その細胞内シグナルトランスデューサーＳｍａｄ３のロバストなリン酸化をもたらし、これは、ｗｔ細胞と対比してＡｈｓｇ ＫＯ ｐＰＴＣで３倍超強く（図７Ｈ、Ｉ）、Ａｈｓｇ ＫＯ細胞が、ＴＧＦ－β１に対してより活発に応答したことが示された。対照的に、ＴＧＦ－β１処置前のフェチュインＡの添加は、Ｓｍａｄ３のリン酸化を減少させた。これらの知見は、ＴＧＦ－βＩＩ型受容体模倣物およびサイトカインアンタゴニストとしてフェチュインＡを説明する先の報告と一致する。総合すると、結果は、フェチュインＡが、ミネラルシャペロンとしてのその保護的役割に加えて、ＴＧＦ－β１シグナル伝達を直接アンタゴナイズすることにより低酸素１１誘導性腎線維化を減少させることを示唆する。

フェチュインＡは、虚血再灌流傷害後の腎臓における線維化マーカーの発現をインビボで著しく低下させる。次に、腎臓傷害の処置でのフェチュインＡ補給の治療的可能性を実験的に探求した。この目的のために、片側性虚血－再灌流傷害の十分に確立されたマウスモデルを使用した。このＩＲＩモデルは、その名の通り、心臓血管手術、腎臓移植または腎腫瘍の除去後の腎臓における虚血－再灌流病変を最もよく模倣する。これは単純で再現性がある。虚血を、腎血管を３０分間クランプすることにより左腎臓において誘導し、右腎臓は対照として利用した。虚血再灌流が実際に、カルシウムミネラルナノ粒子の沈着を手術後の腎臓においては誘導するが、対側対照腎臓では誘導しないことが、低酸素ＩＵＧＲ腎臓におけるカルシウムミネラル粒子およびマクロファージの蓄積により初めて示された（図８）。加えて、ＮａＣｌ０．９％と対比したフェチュインＡによるＩＲＩマウスの処置では、既に５日目に、フェチュインＡ処置が、ＮａＣｌ０．９％で処置した動物と比較して、虚血、傷害を受けた腎臓において特異的な線維化マーカー（コラーゲンＣｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１およびＣｏｌ６ａ１）を著しく減少させることが示された（図９Ａ、Ｂ、Ｃ）。対照的に、フェチュインＡ補給は、非コラーゲン線維化マーカーＡｃｔａ２、Ｆｎ１またはＶｉｍの発現に対しては効果がない（図９Ｄ、Ｅ、Ｆ）。したがって、フェチュインＡ補給は、虚血再灌流傷害後、線維化マーカーの発現を減弱させる。要約すると、これらのインビボ実験は、腎臓を低酸素応答ＩＲ傷害から保護するミネラルシャペロンとしてのフェチュインＡの役割を明確に確立する。

虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）を受けるマウスにおけるヒトフェチュインＡの予防的投与は、組織損傷を抑え、線維化リモデリングを減少させた。フェチュインＡ ９００μｇを、左腎臓の片側性ＩＲＩの２４時間前およびさらに３時間前に静脈内注射した（２０分の虚血時間）。ＰＢＳを対照動物に注射した。腎臓を手術の２４時間後に採取し、右腎臓は対照として利用した。早期損傷マーカーＫｉｍ１（図１０Ａ）、Ｋｒｔ１８（図１０Ｂ）、Ｋｒｔ２０（図１０Ｃ）およびＬｃｎ２（図１０Ｄ）の発現レベルは、フェチュインＡで前処置したＩＲＩ腎臓において減少したことが示された。これは、フェチュインＡによる前処置が、再灌流傷害（ＩＲＩ）の組織損傷を軽減することを既に示している。加えて、Ｖｉｍ発現において観察された低下（図１０Ｇ）では、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の減少が示された。コラーゲンリモデリングは、線維化リモデリング中の比較的後期のイベントであり、これは、ＩＲＩの２４時間後重要な役割を果たさず、結果的に、Ｃｏｌ１ａ１（図１０Ｈ）、Ｃｏｌ３ａ１（図１０Ｉ）およびＣｏｌ６ａ１（図１０Ｊ）は、予想外の変化を示さなかった。Ａｒｇ１（図１０Ｋ）発現は、フェチュインＡ前処置マウスにおいて抑制され、コラーゲン合成の必要性の減少が示された。Ａｒｇ１は、コラーゲンの主成分であるＬ－プロリンの供給に必要とされるため、コラーゲンの合成の増加に重要である。さらに、フェチュインＡによる前処置は、損傷シグナル伝達および修復に関与するケモカインＣｃｌ２（図１０Ｌ）、Ｉｌ－６（図１０Ｍ）およびＴｎｆ－α（図１０Ｎ）の発現を低下させた。結論として、これらの実験、特に早期損傷マーカーは、虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）を受けるマウスにおけるヒトフェチュインＡの予防的投与が、比較的低濃度のフェチュインＡでも損傷を抑え、線維化リモデリングを減少させたことを示す。

静脈内（ｉｖ）投与後のマウスの腎組織における内因性フェチュインＡの存在。ヒトフェチュインＡは、ＰＢＳ注射サンプルで検出されず（図１１Ａ、レーンＧ～Ｌ）、マウスフェチュインＡではなくヒトフェチュインＡに対するｓｃ－１３３１４６－ＨＲＰ抗フェチュインＡ抗体の特異性が確認された。ＰＢＳ注射ＩＲＩ腎臓（図１１Ａ、レーンＪ～Ｌ）では、すべてのサンプル間でマウスフェチュインＡの存在量が最も高いことが示され、これらの腎臓におけるバイオミネラル化および組織損傷の程度が高いことが示された。ヒトフェチュインＡタンパク質を注射したマウスからの腎臓サンプルは、ヒトフェチュインＡの強いバンドを示し（図１１Ａ、レーンＡ～Ｆ）、フェチュインＡが、静脈内投与後腎組織に存在したことが確認された。内因性マウスフェチュインＡは、すべての他のサンプルと比較してＰＢＳ注射ＩＲＩ腎臓においてのみ上昇し、これらの腎臓におけるバイオミネラル化および組織損傷の程度が高いことが示された（図１１Ｂ）。ヒトフェチュインＡは、ＰＢＳ注射腎臓サンプルにおいて検出されず、Ｒ＆Ｄシステム（ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅ）からのＤＦＴＡ００ ＥＬＩＳＡキットのマウスフェチュインＡではなくヒトフェチュインＡに対する特異性が確認された（図１１Ｃ）。フェチュインＡ注射ＩＲＩ腎臓は、ヒトフェチュインＡの組織レベルが高く、未手術対照腎臓と比較して虚血腎臓におけるバイオミネラル化の程度が高いことが示された（図１１Ｃ）。内因性フェチュインＡは、静脈内投与後マウスの近位尿細管中に存在した（図１１Ｄ～Ｆ）。任意の理論に拘束されるものではないが、フェチュインＡが、血液から組織損傷部位に取り込まれ、さらなる組織破壊に拮抗し、血液中のその濃度を低下させることができると仮定できた。結論として、これらの実験は、フェチュインＡの静脈内投与が、腎臓組織においてフェチュインＡの増加をもたらすことを示す。

静脈内投与時のマウスの血清中のヒトフェチュインＡの経時変化。１日後、血清中のヒトフェチュインＡの検出量は、注射の１分後または１時間後と比較して減少し（図１２Ａ）、１週間後、ヒトフェチュインＡは検出できなかった。マウスフェチュインＡは、ＰＢＳ注射動物がシグナルを送らなかったという事実から導き出され得るように、ｓｃ－１３３１４６－ＨＲＰ抗ヒトフェチュインＡ抗体で検出されなかった。ヒトフェチュインＡ特異的ＤＦＴＡ００ ＥＬＩＳＡキットを用いる正規化ＥＬＩＳＡデータは、マウス血清サンプル中の静脈内注射ヒトフェチュインＡの減少を示した（図１２Ｂ、Ｃ）。注射時点（１分）と比較して、循環ヒトフェチュインＡの量は、１時間後８０％に、１日後８．５％に減少した。１週間後、ヒトフェチュインＡは、ＰＢＳ注射対照マウス（黒丸）と同様にもはや検出できなかった。結論として、これらの実験は、循環中のヒトフェチュインＡの存在を維持するために、注射が毎日繰り返されるべきであることを示す。

方法
動物。繁殖、遺伝子型判定およびすべての動物実験は、動物福祉に関するスイス連邦法に従って行われ、地方自治体により承認された（Ｃａｎｔｏｎ ｏｆ Ｂｅｒｎ ＢＥ９６／１１、ＢＥ１０５／１４およびＢＥ１０５／１７）。Ａｈｓｇ^{ｔｍ１Ｍｂｌ}マウスおよびＣｌｃｎ５^{ｔｍ１Ｇｕｇ}を含むすべてのマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６背景で維持し、飼料および水を自由摂取とし、１２時間の明暗サイクルでＩＶＣケージに収容した。

妊娠マウスにおける低酸素の誘導。時限交配のために、繁殖期の雌の膣栓を毎朝確認し、存在した場合、その時点を妊娠日（Ｅ）０．５に設定した。Ａｈｓｇ ＫＯマウスを、ヘテロ接合繁殖ペアから得、またヘテロ接合およびｗｔ同腹仔を生じさせ、これらを対照として使用した。Ｅ０．５からＥ１８．５までの妊娠中の毎日の食物摂取量（最初に提供された食物と２４時間後に残っている食物の重量差）および母体の体重増加を記録した。低酸素の誘導のために、Ｅ１３．５妊娠マウスを、低酸素グローブボックス（Ｃｏｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒａｓｓ Ｌａｋｅ、ＵＳＡ）に移した。翌日、酸素含有量を、１６％および１２．５％で間欠的に休止しながら６～８時間以内に１０％に徐々に低下させて、動物を低酸素状態の増加に適応させた。室内の扇風機で適切な空気循環を維持した。ＣＯ_２レベルを、空気循環システムに接続された、ソーダ石灰（Ｓｉｇｍａ、７２０７３）を充填したカートリッジで過剰なＣＯ_２をキレート化することにより低レベルで維持した。過剰な湿気を、顆粒状シリカゲルオレンジ（Ｓｉｇｍａ、１．０１９６９）で吸収し、毎日交換した。カロリー制限群のマウスには、低酸素群のマウスが消費した平均食物量に匹敵する食物を給餌した。妊娠低酸素または対照マウスを、Ｅ１８．５に安楽死させ、胎児および胎盤を、さらなる分析のために採取、秤量および調製した。胎児腎臓を、ＬｅｉｃａＭ８０立体鏡を用いてＰＢＳ中で解剖した。初代近位尿細管細胞（ｐＰＴＣ）の調製のために、３～４週齢の正常酸素マウスの腎臓を単離した。腎機能の評価（ＧＦＲおよびタンパク尿）を９週齢の胎児低酸素または正常酸素で行った。

治療的処置実験のための虚血の誘導および投与。図８および９の実験のために、マウスをイソフルランで麻酔した。深麻酔した動物において、正中腹部切開を行った。虚血を、腎血管を３０分間クランプすることにより左腎臓において誘導し、右腎臓は対照として利用した（図９）。手術直後、マウスは、腹腔内注射による生理ＮａＣｌ溶液またはウシフェチュインＡモノマー（１００μｇ／ｇ体重）のいずれかの初回処置を受けた。注射を４日間毎日繰り返した。腎臓を５日目に単離し分析した。ＮａＣｌ溶液：塩化ナトリウム≪Ｂｉｃｈｓｅｌ≫０．９％（１５４ｍＭ）；（ＲＥＦ１００ ０ ０９０、Ｂｉｃｈｓｅｌ、Ｉｎｔｅｒｌａｋｅｎ、ＣＨ）。フェチュインＡ溶液：０．３３８ＥＵ／ｍｌ ＬＰＳ、１０ｍＭ Ｎａ_３ＰＯ_４、８ｇ／ｌ ＮａＣｌ（１３７ｍＭ）。

予防的処置（予防）実験のための虚血の誘導および投与。図１０の実験のために、マウスにフェチュインＡを９００μｇ片側性虚血の２４時間および３時間前に静脈内注射した。ＰＢＳを、対照動物に静脈内注射した。虚血の誘導のために、マウスをイソフルランで麻酔した。深麻酔した動物において、正中腹部切開を行い、虚血を、腎血管を２０分間クランプすることにより左腎臓において誘導した。右腎臓は、未手術対照として利用した。腎臓を、手術の２４時間後に採取した。図１０の実験のマウスは、平均体重が２２ｇであった。ＰＢＳ溶液：２．６７ｍＭ ＫＣｌ、１．４７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１３７．９３ｍＭ ＮａＣｌ、８．０６ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４－７ｘＨ_２Ｏ。

糸球体濾過の経皮的評価。糸球体濾過率（ＧＦＲ）を、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ａ．ら、Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ ｍｉｃｅ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０３、Ｆ７８３～７８８（２０１２）に説明されるように意識下の動物において決定した。簡単に言えば、ＦＩＴＣ－シニストリン（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ－Ｋａｂｉ、ＬＩ９８３００７６）の血漿クリアランスを、４７０ｎｍにＦＩＴＣの放出極大を有する発光ダイオード、および５２５ｎｍに最大感度を有する蛍光を検出するフォトダイオードを用いて皮膚全体で測定した。次いで、経時的な蛍光強度の減少をＧＦＲに変換した。

タンパク尿。尿タンパク含有量を、ブラッドフォードアッセイを用いて決定した。尿３μｌおよび１×ブラッドフォード試薬１５０μｌを混合し、ＲＴで５分間インキュベートし、吸光度を５９５ｎｍで測定した（５×ブラッドフォード試薬を、ブリリアントブルーＧ－２５０ ５０ｍｇ（Ｓｉｇｍａ、Ｂ－１１３１）をエタノール２４ｍｌおよび８５％リン酸５０ｍｌに溶解し、次いで総体積を、超純水で１００ｍｌに調整することにより製造した）。尿クレアチニン含有量を、ヤッフェ法を用いて決定した。１：１０希釈尿１０μｌを、クレアチニン試薬１００μｌと混合し、ＲＴで１０分間インキュベートし、吸光度を５１０ｎｍで測定した（１０ｍＭピクリン酸および２５０ｍＭ ＮａＯＨ、ｐＨ１３からなるクレアチニン試薬）。最終的に、タンパク質クレアチニン比を、サンプルごとに計算した。

糸球体数。ネフリン（Ｒ＆Ｄ ＡＦ３１５９）について染色したホールマウントＥ１８．５腎臓の１００μｍＺ－スタック画像を、オープンソース画像処理ソフトウェアＦｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ、バージョン２．０．０－ｒｃ６９／１．５２ｉ、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｅｔ／Ｆｉｊｉ）で分析した。ＴｒａｃｋＭａｔｅ ｖ３．８．０プラグインでは、Ｄｏｗｎｓａｍｐｌｅ ＬｏＧ検出器を、ピクセル閾値１６およびダウンサンプリングファクター２で推定ブロブ直径８０．０ピクセルに設定した。フレームあたりのスポット数をマウスに追加して、腎臓あたりの糸球体数を計算した。フレーム間１００μｍの距離を選択して、連続画像における同一の糸球体のダブルカウントを回避し、平均糸球体直径８０μｍを得た。

マイクロアレイ分析。雄の低酸素、正常酸素およびカロリー制限群のＥ１８．５腎臓からの全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、７４１０４）を用いて単離した。高品質のＲＮＡ（ＲＩＮ＞８、２６０／２８０比＞２、２６０／２３０比＞１．８）のみを、さらなる分析に使用した。全ＲＮＡサンプル１００ｎｇを、Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＷＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（４４１１９７３、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）キットで処理した。ｃＤＮＡ５．５μｇを断片化し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＷＴ末端標識キット（９０１５２５、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で標識した。ビオチン化断片２．３μｇを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ １．０ＳＴアレイに４５℃で１６時間ハイブリダイズさせ、洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現分析マニュアル（流体プロトコルＦＳ４５０＿０００７）に説明されるプロトコルに従って染色した。アレイを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇでスキャンし、原データを、スキャンした画像から抽出し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｐｏｗｅｒ Ｔｏｏｌｓソフトウェアパッケージで分析した。ハイブリダイゼーションの質を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ １．１．２８００．２８０６１）を用いて評価した。正規化発現シグナルを、ロバストマルチアレイ平均アルゴリズム（ＲＭＡ）によりＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＣＥＬファイルから計算した。差次的にハイブリダイズした特徴を、マイクロアレイデータの線形モデルを実装するＲ Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ「ｌｉｍｍａ」を用いて同定した。Ｐ値を、偽発見率（ＦＤＲ）を制御するためのベンジャミーニとホッホベルグ法で多重試験のために補正した。少なくとも１．３倍の変化およびＦＤＲ＜０．０５を示すプローブ設定を有意とみなした。低酸素、正常酸素およびカロリー制限群のＥ１８．５腎臓間の差次的発現値を、平均連結およびユークリッド距離測定を用いてＨｅａｔｍａｐｐｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｅａｔｍａｐｐｅｒ．ｃａ）でマッピングした。機能アノテーションのために、ＧＯ用語分析を、ＤＡＶＩＤプラットフォーム（ｈｔｔｐｓ：／／ｄａｖｉｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ）を用いて行った。

ＲＴ－ｑＰＣＲ。全ＲＮＡを、製造者プロトコルに従って、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５５９６０２６）を用いて単離した。ＲＮＡ濃度および質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で決定し、１０００ｎｇを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ試薬キット（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ０３７Ａ）を用いてｃＤＮＡに転写した。ｃＤＮＡを２ｎｇ／μｌに希釈し、ｑＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、またはＦＡＭ標識ＵＰＬプローブ（Ｒｏｃｈｅ）さらに対応する遺伝子特異的プライマーおよびＴａｑＭａｎ ＦａｓｔユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４３５２０４２）のいずれかを用いて７５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で行った。データ分析を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで行った。２^{（－ΔＣｔ）}法を使用して、ＲＴ－ｑＰＣＲの相対発現レベルを計算した。

ＨＩＦ結合部位の同定。推定ＨＩＦ結合部位の同定のために、１５の異なる種（ネコ、ニワトリ、チンパンジー、ウシ、イヌ、ギンザメ、ウマ、ヒト、マウス、ブタ、ウサギ、ラット、ヒツジ、ゼノパス、ゼブラフィッシュ）のＡｈｓｇ遺伝子座と重複する２０ｋｂゲノム領域（開始コドンの１０ｋｂ上流および下流）を、ＪＡＳＰＡＲデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｊａｓｐａｒ．ｇｅｎｅｒｅｇ．ｎｅｔ）で分析した。相対プロファイルのスコア閾値を９０％に設定した。濃縮分析のために、すべての種の推定部位を、１ｋｂウィンドウにクラスタリングした。相対スコア＞０．９、＞０．９３および＞０．９７を有するＨＲＥが示された。ＡＨＳＧ遺伝子座の活性調節マークを有する低酸素ＭＣＦ７細胞のＣｈＩＰ－ｓｅｑにより同定されたヒトＨＩＦアルファ部位のアラインメントのために（Ｓｃｈｏｄｅｌ Ｊ、Ｏｉｋｏｎｏｍｏｐｏｕｌｏｓ Ｓ、Ｒａｇｏｕｓｓｉｓ Ｊ、Ｐｕｇｈ ＣＷら、Ｂｌｏｏｄ ２０１１年６月９日；１１７（２３）：ｅ２０７～１７；Ｓｅｒｉｅｓ ＧＳＥ２８３５２；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ２８３５２を参照のこと）、ｃｈｒ３：１８０，０００，０００－１９０，０００，０００を包含するＨＩＦ－１－アルファおよびＨＩＦ－２－アルファデータセット（ＡＨＳＧ遺伝子座を含む）を、ＷｅｂベースのＧａｌａｘｙプラットフォーム（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｓｅｇａｌａｘｙ．ｏｒｇ）を用いてＢＡＭファイルに変換し、ＵＳＣＳゲノムブラウザ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）上でヒトアセンブリＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９にアップロードした。このアラインメントに、以下のデータセットを加えた：７つの細胞株の活性調節要素付近でしばしば見出される層状クロマチンマーク（Ｈ３Ｋ２７ＡｃおよびＨ３Ｋ４Ｍｅ１、ＥＮＣＯＤＥ）および低酸素ＭＣＦ７細胞のオープンクロマチン（ＤＮａｓｅＩ ＨＳ、ＥＮＣＯＤＥ）。マウスＡｈｓｇ遺伝子座について、ＪＡＳＰＡＲで同定された潜在的なＨＩＦ結合部位を、８週齢のマウスの肝臓、心臓および腎臓に由来するデータセット（ＤＮａｓｅＩ ＨＳ、ＥＮＣＯＤＥ／ＵＷ；Ｈ３Ｋ２７ＡｃおよびＨ３Ｋ４Ｍｅ１、ＥＮＣＯＤＥ／ＬＩＣＲ）とアラインメントし、平均シグナル強度を示した（棒グラフ、オートスケール、ログ形質転換、スムーズンド（１６ピクセル））。

分子クローン化。ルシフェラーゼアッセイのために、マウスＡｈｓｇ ＡＴＧの２．５ｋｂのプロモーター断片上流を、特異的プライマーおよびＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｒ０５０Ａ）を用いて、ゲノムＤＮＡ（Ｃ５７ＢＬ／６）から増幅した。５００ｂｐのプロモーター断片（ｗｔおよび変異）および５００ｂｐのイントロン配列の断片（ｗｔおよび変異）をＩＤＴＤＮＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ）により合成した。プロモーター断片を、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ制限酵素（いずれもＮＥＢ、Ｒ３１９３ＳおよびＲ３１５６Ｓ）でｐＧＬ３－塩基性－Ｐ２Ｐ－６０７プラスミドに挿入した。イントロン断片を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌｌ制限酵素（いずれもＮＥＢ、Ｒ３１３６ＳおよびＲ３１３８Ｓ）を用いて、ｐＧＬ３－塩基性ベクターまたはプロモーター断片を有するｐＧＬ３－塩基性ベクターに挿入した。ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、マウスＡｈｓｇの第２～５エクソンのｃＤＮＡを、ＩＤＴＤＮＡから得、ＳｐｅｌおよびＥｃｏＲＩ制限酵素（いずれもＮＥＢ、Ｒ３１３３ＳおよびＲ３１０１Ｓ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌ ＫＳ－にクローン化した。

ルシフェラーゼアッセイ。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷上で２０分間溶解し（２５０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭトリス／Ｈ_３ＰＯ_４ ｐＨ７．８、１０％グリセリン、０．１％ＮＰ４０）、１４０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離した。上清のうち１０μｌを反応ごとに使用した。反応溶液（ルシフェラーゼ：２５ｍＭトリス／Ｈ_３ＰＯ_４ ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２ｍＭ ＡＴＰ ｐＨ７．５、５０μＭルシフェリンからなる１００μｌ；ウミシイタケ：５０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．６、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５μＭセレンテラジンからなる１００μｌ）の注射および活性測定を、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で行った。各サンプルを二連で測定し、ルシフェラーゼ活性をウミシイタケ活性に対して正規化した。

ホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。Ｅ１８．５腎臓を、４％ＰＦＡに固定し、脱水し、メタノール中に－２０℃で保存した。ジゴキシゲニン標識リボプローブを用いるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、Ｒｕｄｌｏｆｆ，Ｓ．およびＫｅｍｌｅｒ，Ｒ、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３９、３７１１～３７２１（２０１２）に説明されているように行った。プローブを、ＤＩＧ ＲＮＡ標識ミックス（Ｒｏｃｈｅ、１１１７５０２５９１０）およびＴ３またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（いずれもＲｏｃｈｅ、１１０３１１６３００１または１０８８１７６７００１）を用いて生成した。アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体を使用して、ＤＩＧ標識プローブ（Ｒｏｃｈｅ、１１０９３２７４９１０）を検出した。

ＴＵＮＥＬ染色。アポトーシス細胞の断片化ＤＮＡを、製造者に従ってＰｒｏｍｅｇａ ＤｅａｄＥｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇ７３６０）を用いて検出した。

組織化学。免疫組織化学のために、ＰＦＡ固定パラフィン包埋組織切片を再水和し、内因性ペルオキシダーゼを、スライドを１．５％Ｈ_２Ｏ_２溶液（０．０２Ｍクエン酸、０．０６Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４）中でＲＴで暗所において１５分間インキュベートすることによりブロックした。抗原賦活化を、トリス－ＥＤＴＡ緩衝液ｐＨ９中で２０分間沸騰させ、次いでＲＴにゆっくり冷却することにより行った。ＰＢＳ中２％ＢＳＡにＲＴで１時間ブロックした後、切片を、ブロッキング溶液中の一次抗体と共にｏ／ｎ、４℃でインキュベートした。ＰＢＳ中での３回の洗浄工程後、切片を、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（マウスまたはウサギ：ＡｇｉｌｅｎｔからのＤａｋｏ ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋ４００１またはＫ４００３）、ヤギ：ＳＣＢＴ、ｓｃ－２３０４）と共にＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ中での３回の洗浄工程後、シグナルをＤＡＢ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｋ３４６８）で発生させた。切片を、ハリスヘマトキシリン溶液（Ｓｉｇｍａ、ＨＨＳ１６）で対比染色し、脱水し、Ｅｕｋｉｔｔ培地（Ｓｉｇｍａ、０３９８９）を用いてマウントした。コラーゲンのピクロシリウスレッド染色のために、脱脂し、再水和した組織切片を、染色溶液（ピクリン酸の飽和水溶液中ダイレクトレッド８０ ０．５ｇ（いずれもＳｉｇｍａ、Ｐ６７４４および３６５５４８））中でＲＴで１時間インキュベートした。酸性化水（０．５％氷酢酸）中で２回洗浄した後、切片を脱水し、Ｅｕｋｉｔｔを用いてマウントした。

免疫蛍光染色。凍結切片を、４％ＰＦＡにＲＴで１０分間固定し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中でＲＴで１０分間のインキュベーションにより透過させた。ＰＢＳ中１０％ＦＣＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０でＲＴで１時間ブロックした後、切片をブロッキング溶液中の一次抗体と共にｏ／ｎ、４℃でインキュベートした。ＰＢＳ中での３回の洗浄工程後、切片を、ブロッキング溶液中の蛍光コンジュゲート二次抗体と共に暗所でＲＴで１時間インキュベートした。ＤＮＡを、ＰＢＳ中ＤＡＰＩ １：５０００で染色した。切片をＭＯＷＩＯＬ溶液（グリセリン６ｇ中ＭＯＷＩＯＬ ４－８８試薬２．４ｇ（Ｍｅｒｃｋ、４７５９０４）および０．１３ＭトリスｐＨ８．５ １８ｍｌ）にマウントした。Ｅ１８．５腎臓のホールマウント免疫蛍光染色のために、メタノール前処理を含むｉＤｉｓｃｏ染色プロトコル（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｄｉｓｃｏ．ｉｎｆｏ／ｉｄｉｓｃｏ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ／）を適用した。インキュベーション時間ｎ＝１日および溶液量１．６ｍｌを、関連する工程に使用した。腎臓を８ウェルガラスチャンバスライド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５４５３４）にマウントし、直ぐに撮像した。

カルシウムの蛍光検出。厚い凍結切片（３０μｍ）を、ＡＴＴＯ ４８８蛍光標識フェチュインＡ １０ｎｇ／ｍｌ（カルシウム不含ＰＢＳ中）と共に暗所でＲＴで６０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回すすぎ、ＭＯＷＩＯＬ溶液でマウントした。核をＤＡＰＩで対比染色した。

撮像。蛍光撮像を、Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍｅ Ｖ光源を用いるＩＭＩＣデジタル顕微鏡（ＦＥＩ、４００１型）、ＨａｍａｍａｔｓｕからのＯｒｃａ－Ｒ^２カメラコントローラ（Ｃ１０６００）およびライブ取得ソフトウェア（ＦＥＩ、バージョン２．６．０．１４）で行った。画像解析を、オフライン解析ソフトウェア（ＦＥＩ）を用いて行った。明視野撮像を、デジタルサイトＤＳ－ＵＥカメラコントローラおよびＤＳＲｉ１カメラ（いずれもＮｉｋｏｎ）を用いる、Ｎｉｋｏｎ対物レンズを備えるＮｉｋｏｎ Ｅ６００顕微鏡（Ｐｌａｎ Ｆｌｕｏｒ ＥＬＷＤ ２０×／０．４５、Ｐｌａｎ Ａｐｏ ４０×／１．０ Ｏｉｌおよび６０×／１．４０ Ｏｉｌ）で行った。画像解析を、ＮｉｋｏｎソフトウェアＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ４．０を用いて行った。

ＥＬＩＳＡ。例えば血清または腎組織中のマウスフェチュインＡレベルを、製造者ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅに従ってマウス特異的フェチュインＡ／ＡＨＳＧ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、ＭＦＴＡ００）を用いて決定した。例えば血清または腎組織中のヒトフェチュインＡレベルを、製造者ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅに従ってヒト特異的フェチュインＡ／ＡＨＳＧ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、ＤＦＴＡ００）を用いて決定した。

細胞培養。正常なラット腎臓（ＮＲＫ）細胞株を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、４１９６５－０３９）および１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）で培養した。ヒト腎臓（ＨＫ－２）細胞株を、ケラチノサイト－ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、１７００５－０７５）で培養した。ルシフェラーゼアッセイのために、ＮＲＫ細胞を、ｊｅｔＰｒｉｍｅ（登録商標）試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、１１４－０７）を用いてルシフェラーゼレポータープラスミドおよびｐＣＭＶ－ウミシイタケ（全トランスフェクトＤＮＡの１０％、正規化のために使用）でトランスフェクトし、トランスフェクションの６時間後に１ｍＭ ＤＭＯＧ（Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆ－００１０）で刺激し、トランスフェクションの２４時間後に収集した。低酸素のために、細胞培養を、０．２％酸素で４８時間行った。初代近位尿細管細胞（ｐＰＴＣ）を、３～４週齢の腎臓から単離した（Ｔｅｒｒｙｎ，Ｓ．ら、Ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ， ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｃｏａｔｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９３、Ｆ４７６～４８５（２００７）を参照のこと）。簡単に言えば、近位尿細管断片を、腎臓皮質組織をコラゲナーゼで消化し、孔径８０μｍの膜を通して濾過することにより得た。ｐＰＴＣを、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５５ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ＮＥＡＡを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、２１０４１－０２５）および腎上皮細胞増殖培地（ＲＥＧＭ）補充物（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－４１２７）で培養した。ＦＢＳの代わりに、Ａｈｓｇ ＫＯマウスからの血清を使用した。密集度に応じて、ｐＰＴＣを分割し、Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液（Ｓｉｇｍａ、Ａ６９６４）を用いて一度再播種した。２４低酸素のために、細胞培養を０．２％酸素で４８時間行った。フェチュインＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ３３８５）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ、Ａ３０５９）１００μｇ／ｍｌを、実験終了の４８時間前に培養培地に添加した。ｒｍＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ、７６６６－ＭＢ）５ｎｇ／ｍｌでの５分間の処置前に、細胞を２４時間飢餓させた。

ウェスタンブロット分析。全タンパク質可溶化液を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、１１８３６１５３００１）を補足したＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｒ０２７８）を用いて得た。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、８８５１８）上にブロットした。ＴＢＳＴ中５％乳でブロックしたら、膜を、一次抗体と共に４℃、ｏ／ｎでインキュベートし、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共にＲＴで１時間インキュベートした。シグナルを、シグナル強度に応じてＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＲＰＮ２１０６）またはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、３４０７６）で検出した。濃度測定分析を、オープンソース画像処理ソフトウェアＦｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ、バージョン２．０．０－ｒｃ６９／１．５２ｉ、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｅｔ／Ｆｉｊｉ）で行った。

マウス中の腹腔内注射ウシフェチュインＡの濃度の計算。マウスの基準血液量は、５８．５ｍｌ／ｋｇ（ｎｃ３ｒｓ．ｏｒｇ．ｕｋ）、７７～８０ｍｌ／ｋｇ（ｊａｘ．ｏｒｇ）であった。これらの値に基づき、６８．５ｍｌ／ｋｇを計算に使用した。ウシフェチュインＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１２７６３（ＦＥＴＵＡ＿ＢＯＶＩＮ））の計算された分子量は、３８．４ｋＤａである。したがって、注射フェチュインＡがすべて血液中に存在した場合、またはフェチュインＡの静脈内注射を行った場合、血液中３８μｍの濃度に達する。さらに、フェチュインＡは、翻訳後修飾を受ける。ここで、とりわけグリコシル化は中心的な役割を果たし、分子量は５１～６７ｋＤａに増加する。したがって、分子量６０ｋＤａを計算に使用した（１Ｄａ＝１ｇ／ｍｏｌ）。注射フェチュインＡがすべて血液中に存在した場合、またはフェチュインＡの静脈内注射を行い、それが注射量１００μｇ／ｇ体重に基づく場合、注射されたマウスの血液中で２４．３μＭの濃度になる：

しかし、腹腔内注射を行うと、フェチュインＡを腹腔から循環中に運ばねばならないため、血中濃度の低下をもたらす。この過程で、腔内での部分的な分解、または中皮細胞による飲作用および代謝により、分子がすべて吸収されるとは限らない。研究（Ｒｅｇｏｅｃｚｉら（１９８９）、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．；２５６（４ Ｐｔ １）：Ｅ４４７－５２）において、アルブミンの腹腔内注射は、同じ量のアルブミンの静脈内注射と比較して、２～３時間後、血液中約４０％の用量に達することが示された。マウスにおける４０％の取り込みに基づき、腹腔内注射後に得られる濃度は：

である。したがって、フェチュインＡ １００ｍｇ／ｋｇ体重を腹腔内注射する場合、得られる血中濃度は、約９．７μＭである。上記のように、このような比較的低用量が、腎虚血損傷を処置するのに十分であることが見出された。

マウス中の静脈内注射ヒトフェチュインＡの濃度の計算。マウスの基準血液量は、５８．５ｍｌ／ｋｇ（ｎｃ３ｒｓ．ｏｒｇ．ｕｋ）、７７～８０ｍｌ／ｋｇ（ｊａｘ．ｏｒｇ）であった。これらの値に基づき、６８．５ｍｌ／ｋｇを計算に使用した。ヒトフェチュインＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１２７６３（ＦＥＴＵＡ＿ＢＯＶＩＮ））の計算された分子量は、３８．４ｋＤａである。さらに、フェチュインＡは、翻訳後修飾を受ける。ここで、とりわけグリコシル化は中心的な役割を果たし、分子量は５１～６７ｋＤａに増加する。したがって、６０ｋＤａの分子量を計算に使用した。予防的処置の実験において、マウスの平均体重は２２ｇであった。体重２２ｇのマウスについて、対応する血液量は約：

である。

ヒトフェチュインＡ ９００μｇの注射で、これは、

の血中濃度になる。
したがって、ヒトフェチュインＡ ９００μｇを、平均体重２２ｇのマウスに静脈内注射する場合、得られる血中濃度は、約９．９μＭである。上記のように、このような比較的低用量が、腎虚血損傷を予防するのに十分であることが見出された。

ヒトにおけるヒトフェチュインＡの濃度および服用量の計算。ヒト成人の基準血液量は、７７ｍｌ／ｋｇ（男性）および６５ｍｌ／ｋｇ（女性）であり、平均量は７１ｍｌ／ｋｇである。ヒトフェチュインＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０２７６５ （ＦＥＴＵＡ＿ＨＵＭＡＮ））の分子量は一般に、ウシフェチュインＡと同等であり、すなわち同様に約６０ｋＤａである（グリコシル化による）。ヒト成人へのフェチュインＡ １０ｍｇ／ｋｇ（ｉｖ）、２５ｍｇ／ｋｇ（ｉｖ）、５０ｍｇ／ｋｇ（ｉｖ）の投与に対して、得られるヒト血中濃度は：

である。

同様に、９．７μｍの上述の濃度に対応する用量を計算できる：

同様に、９．９μｍの上述の濃度に対応する用量を計算できる：

したがって、マウスに腹腔内注射されるフェチュインＡ １００μｇ／ｇ体重に対して計算される当量は、成人ヒトに静脈内注射される場合約４１．３ｍｇ／ｋｇであり、体重２２ｇのマウスに静脈内注射されるフェチュインＡ ９００μｇに対して計算される当量は、成人ヒトに静脈内注射される場合約４２．２ｍｇ／ｋｇである。

データ分析。統計的分析およびグラフを、Ｐｒｉｓｍ ７（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）で行った。２つの群をｔ検定により、複数の群を一元配置ＡＮＯＶＡ（別段特定されない限り、テューキーの多重比較検定）により比較した。^＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；^＊＊＊、Ｐ＜０．００１；^＊＊、Ｐ＜０．０１；^＊、Ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意でない；エラーバー、標準偏差（ＳＤ）；ウィスカー、最小から最大。

Claims (22)

1. 腎障害を処置する方法における使用のためのフェチュインＡ（ＡＨＳＧ）であって、腎障害を処置するのに効果的なフェチュインＡの量が、それを必要とする対象に投与される、フェチュインＡ。
2. 腎障害は、急性腎障害、慢性腎障害、腎臓線維化、慢性腎臓疾患、腎不全、腎炎、急性腎臓傷害、虚血性腎障害、腎臓の低酸素に関連する障害、腎虚血－再灌流傷害、腎臓移植に関連する障害、心臓血管手術に関連する障害、腎臓組織損傷およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
3. 腎障害は、腎臓移植に関連する障害であり、特に、腎臓移植に関連する障害が、グラフト機能遅延、腎臓移植片の臓器拒絶反応、腎臓移植によって生じる腎臓組織損傷、腎臓移植によって生じる炎症、腎臓移植によって生じる腎虚血－再灌流傷害およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
4. 腎障害は、手術中の低酸素に起因し、好ましくは、低酸素が、腎臓移植中または心臓血管手術中の虚血に起因する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
5. フェチュインＡは、ヒトフェチュインＡであり、好ましくはフェチュインＡは、ヒト血漿に由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
6. フェチュインＡは、配列番号１に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一および／または相同である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
7. フェチュインＡは、配列番号１またはその断片を含むか、またはこれらからなる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
8. フェチュインＡは、翻訳後修飾、より好ましくはグリコシル化を提供する、好ましくは宿主細胞系において組換え的に発現される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
9. フェチュインＡは、注射または吸入により対象に投与される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
10. フェチュインＡは、対象に静脈内注射される、請求項９に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
11. フェチュインＡは、１～２００ｍｇ／ｋｇ（体重）、５～１００ｍｇ／ｋｇ（体重）または１０～５０ｍｇ／ｋｇ（体重）の濃度で対象に投与される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
12. 処置は、腎臓組織の石灰化レベル、特に低酸素に関連した石灰化レベルの調節を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
13. 処置が、腎臓組織におけるカルシウムミネラル沈着物の除去、特に移植された腎臓組織におけるカルシウムミネラル沈着物の除去を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
14. 少なくとも２または少なくとも３用量のフェチュインＡが投与される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
15. 少なくとも１用量のフェチュインＡは、虚血事故および／または手術の前、その間またはその後に投与され、特に、虚血事故および／または手術は、腎臓移植または心臓血管手術である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
16. 少なくとも１用量のフェチュインＡは、虚血事故および／もしくは手術前４８時間以内に投与されるか、または少なくとも１用量のフェチュインＡは、虚血事故および／もしくは手術後４８時間以内に投与される、請求項１５に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
17. フェチュインＡは、１～５０日間の合計持続期間にわたって、特に１～２５日間の合計持続期間にわたってまたは２～１０日間の合計持続期間にわたって分割量で投与される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法における使用のためのフェチュインＡ。
18. 腎障害の処置における使用のための医薬組成物であって、フェチュインＡおよび場合により少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
19. 腎障害は、急性腎障害、慢性腎障害、腎臓線維化、慢性腎臓疾患、腎不全、腎炎、急性腎臓傷害、虚血性腎障害、低酸素に関連する障害、腎虚血－再灌流傷害、腎臓移植に関連する障害、心臓血管手術に関連する障害、腎臓組織損傷およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１８に記載の腎障害の処置における使用のための医薬組成物。
20. 腎臓移植に関連する障害は、グラフト機能遅延、腎臓移植片の臓器拒絶反応、腎臓移植によって生じる腎臓組織損傷、腎臓移植によって生じる炎症、腎臓移植によって生じる腎虚血－再灌流傷害およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の腎障害の処置における使用のための医薬組成物。
21. 腎障害は、手術中の低酸素に起因し、好ましくは、低酸素は、腎臓移植中または心臓血管手術中の虚血に起因する、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の腎障害の処置における使用のための医薬組成物。
22. フェチュインＡは、請求項５～１７のいずれか１項と同様に定義される、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の腎障害の処置における使用のための医薬組成物。

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