JP2023514452A - 生体模倣ウイルスペプチドの特定及びその使用 - Google Patents

Abstract

SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びＡＣＥ２受容体それぞれの結合界面に由来する低分子のペプチド、それを含む組成物、並びにペプチド及び組成物の予防的及び治療的使用が開示される。また、コンピュータシミュレーションに基づいて、低分子のペプチドを特定、設計及び修飾する新規プロトコルも開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年2月25日に出願された米国仮特許出願第62/981,453号、2020年3月30日に出願された米国仮特許出願第63/002,249号、2020年8月5日に出願された米国仮特許出願第62/706,225号及び2020年10月13日に出願された米国仮特許出願第63/091,291号に対する優先権を主張するものであり、これらの出願の内容は全体としてこの明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、EFS-Webを介してASCII形式で提出され、その全体が明細書に組み込まれる配列表を含む。2021年2月25日に作成されたASCIIの写しは、ファイル名が2021-02-25 Ligandal 8009.WO00 sequence listingで、サイズが１６０ＫＢである。

COVID-19を引き起こすSARS-CoV-2は、世界的なパンデミックとなっている。SARS-CoV-2並びにMERS及びSARSを含む他のコロナウイルスは、ヒトにおいて重篤な呼吸器疾患を引き起こし、コウモリ及びげっ歯類で広がるウイルスと起源が共通すると考えられている。動物の宿主を持つコロナウイルスの中には、宿主範囲にヒトが含まれるように拡大した変異を獲得したものもある。2020年3月時点で、SARS-CoV-2はヒト全体で変異及び拡大しており、合計２１４種類のハプロタイプ（すなわち、配列バリエーション）及び３４４種類の異なる株が同定されている。変異、組換え及び自然選択を通じて得られたこれらのバリエーションの大部分は、スパイク（Ｓ）タンパク質中に見いだされている。そのようなバリエーションは、更に多くの感染性及び毒性の株をもたらす可能性がある。ウイルスタンパク質に関連する配列空間を探索することは、進化生物学及び疾患予測にとって非常に重要な意味を持つ困難な課題である。過去のいくつかの研究は、ウイルス進化の課題に取り組むことを試みてきたが、SARS-CoV-2のために編集されたものと同様のデータセット、又は研究者に現在利用可能となっているデータサイエンス、数学及び生物物理学からもたらされる豊富な新しい分析ツールのセットを利用したものはほとんどなかった。

回復した個体におけるSARS-CoV-2感染の長期的な健康影響はまだ分かっていないが、神経学から血液学、血管学、免疫学、炎症学、腎臓、呼吸器及び潜在的には自己免疫に及ぶ範囲の後遺症が含まれる。これらの長期的な影響は、SARS-CoV-1の既知の神経精神医学的影響を考慮するときに特に懸念され、２３３人のSARS生存者の２７．１％が、回復後４年間に慢性疲労症候群の診断基準を満たす症状を示した。さらに、４０．３％が慢性的な疲労の悩みを報告し、４０％が精神医学的疾病を示した。現在の予防的アプローチとしては、例えば、ｍＲＮＡワクチンアプローチ、及びウイルス様粒子、組換えスパイクタンパク質断片等を含む組換えワクチンアプローチが挙げられる。これらのワクチンアプローチは、通常、コストが高く、開発が遅く、かつ、新規の抗原にアプローチするために広範囲の再設計を必要とする生体減弱、組換え又はｍＲＮＡベースのアプローチを必要とする。ｍＲＮＡは、ラボスケールで製造するために１０００ドル／ｍｇを超える費用がかかるが、本明細書で開示するペプチドアプローチは、ラボスケールで約５ドル／ｍｇであり、はるかに費用対効果の高い代替手段である。

迅速かつ世界的に大規模で実現可能なワクチン開発は、SARS-CoV-2並びに将来の致死的疾患の発生及びパンデミックから世界を保護するために最も重要である。したがって、SARS-CoV-2又は他の新規ウイルス等におけるＳタンパク質のゲノム配列の潜在的バリエーションをよりよく理解すること、及び手頃な価格で、世界的に展開可能で、室温において安定で、かつ繰り返し投与可能であり、一般集団で合併症リスクの低い治療薬を開発することが急務である。

一側面では、本明細書は、SARS-CoV-2スパイク（Ｓ）タンパク質又はＡＣＥ２受容体の結合ドメインからの切断ペプチド断片を含むスキャフォールドであって、天然タンパク質の構造、コンフォメーション及び／又は結合親和性を実質的に維持するスキャフォールドを開示する。ある特定の態様では、スキャフォールドのサイズは、４０～２００アミノ酸残基である。ある特定の態様では、スキャフォールドは、CoV-2スパイクタンパク質結合界面からの２つの重要な結合モチーフを含む。ある特定の態様では、スキャフォールドは、ＡＣＥ２結合界面からの２つの重要な結合モチーフを含む。ある特定の態様では、２つの重要な結合モチーフは、ＧＳリンカーのようなリンカーによって接続されている。ある特定の態様では、リンカーのサイズは１～２０アミノ酸残基である。ある特定の態様では、スキャフォールドは、挿入、欠失及び／又は置換を含む１つ以上の修飾を有する。ある特定の態様では、スキャフォールドは、１つ以上の免疫エピトープ、１つ以上のタグ、１つ以上のコンジュゲート可能なドメイン、及び／又は極性頭部若しくは尾部を更に含む。ある特定の態様では、１つ以上のスキャフォールドは、１つ以上のリンカーを介して接続され、多価スキャフォールドを形成する。ある特定の態様では、１つ以上のスキャフォールドは、Ｆｃドメイン（例．ヒトＦｃドメイン又はヒト化Ｆｃドメイン）のような免疫応答誘発ドメインに結合され、融合タンパク質を形成する。ある特定の態様では、１つ以上のスキャフォールドは、ナノ粒子又はチップのような基板に結合されている。ある特定の態様では、１つ以上のスキャフォールドは、別のペプチド又は治療剤にコンジュゲートされている。

別の側面では、本明細書は、１つ以上のスキャフォールド、１つ以上のコンジュゲート又は１つ以上の複数の融合タンパク質を含む組成物を開示する。一部の態様では、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を更に含む。ある特定の態様では、組成物は、注射用、吸入用、経口、経鼻、局所、経皮、子宮内又は直腸内剤形に製剤化される。ある特定の態様では、組成物は、非経口、経口、肺、頬、鼻、経皮、直腸又は眼経路によって対象に投与される。ある特定の態様では、組成物はワクチン組成物である。

別の側面では、本明細書は、対象におけるSAR-CoV-2感染を治療又は予防する方法であって、対象に、治療有効量の、１つ以上のスキャフォールド、１つ以上のコンジュゲート、１つ以上の融合タンパク質、又は、１つ以上のスキャフォールド、１つ以上のコンジュゲート若しくは１つ以上の融合タンパク質を含む組成物を投与することを含む方法を開示する。ある特定の態様では、対象は哺乳動物である。ある特定の態様では、対象はヒトである。

別の側面では、本明細書は、対象におけるSAR-CoV-2ウイルス侵入を遮断する方法であって、対象に、治療有効量の、１つ以上のスキャフォールド、１つ以上のコンジュゲート、１つ以上の融合タンパク質、又は、１つ以上のスキャフォールド、１つ以上のコンジュゲート若しくは１つ以上の融合タンパク質を含む組成物を投与することを含む方法を開示する。ある特定の態様では、対象は哺乳動物である。ある特定の態様では、対象はヒトである。

別の側面では、本明細書は、１つ以上の治療剤を、本明細書で開示する１つ以上のスキャフォールドにコンジュゲートすること、及び、必要とする対象にコンジュゲートを送達することを含む、１つ以上の治療剤の標的送達方法を開示する。

別の側面では、本明細書は、スキャフォールドの元となる天然のタンパク質の結合を模倣するスキャフォールドを取得する方法を開示する。この方法は、第１の結合パートナー及び第２の結合パートナーの三次元結合モデルを作製する工程と、結合モデルに基づいて、各結合パートナーに対する結合界面を決定する工程と、結合界面を分析して、各結合パートナーの構造及び／又はコンフォメーションを、その天然、遊離又は結合状態で維持する工程と、熱力学的計算（ΔＧ）に基づいて重要な結合残基を決定する工程と、各結合パートナーの結合界面のアミノ酸配列を決定して、スキャフォールドを取得する工程を伴う。ある特定の態様では、三次元結合は、SWISS-MODELのようなコンピュータプログラムによって生成される。ある特定の態様では、三次元結合は、既知の配列及び／又は構造のタンパク質に対する第１の結合パートナー又は第２の結合パートナーのいずれかの相同性に基づく。ある特定の態様では、この方法は、対応する結合パートナーとフィッティングするさまざまなコンフォメーション又はフォールディング状態のスキャフォールドを設計することを更に伴う。

本出願は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。

図１は、ＡＣＥ２に結合したSARS-CoV-2のシミュレートされた構造（右）と、ＡＣＥ２に結合したSARS-CoV-1（PDB ID 6CS2）（左）の結晶構造の比較を示す。結合に促進的に寄与するアミノ酸残基（ΔＧが負）は緑色で示し、ΔＧが約０ΔＧのアミノ酸残基は黄色で示し、反発性アミノ酸残基（ΔＧが正）はピンク色（左）又はオレンジ色（右）で示す。 図２Ａは、以前に公開された２つのSARS-CoV-1免疫エピトープの３Ｄ構造を示す。図２Ｂ～２Ｄは、SARS-CoV-1に対する相同性に基づいて推定されるCoV-2免疫エピトープの３Ｄ構造及び位置を示す。 図３は、免疫エピトープのＭＨＣ－Ｉ結合予測の結果を示す。ImmunoEpitope1＝配列番号６７；ImmunoEpitope2＝配列番号６９；ＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶ＝配列番号７１；ＬＬＦＮＫＶＴＬＡ＝配列番号７；ＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶ＝配列番号６８。 図４は、他の研究者が特定したCoV-2 Ｓタンパク質中のCoV-2 Ｓタンパク質抗体エピトープの位置を示す（配列番号２の残基１５～１１３７を図示）。野生型タンパク質中のCoV-2スキャフォールドには二重下線を付し、エピトープは太字で示し、抗原性スコアが高いエピトープは下線付きの太字で示す。 図５は、ＡＣＥ２にアラインメントした切断CoV-2 Ｓタンパク質、並びに抗体エピトープ（マゼンタ色）及びＡＣＥ２結合残基（緑色）の位置を示す。 図６は、結合コンフォメーションにおける３つの代表的なリンカーの三次元分子モデリングを示す。主鎖は青いコイルで描かれている。側鎖原子は、PyMolでcolor>by chain>chainbows及びColor>by>element>HNOSのコマンドを使用して色分けされ、Ｈ＝白色、Ｎ＝青色、Ｏ＝赤色、Ｓ＝黄色である。示した代表的な配列は、ＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＤＧＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰ（配列番号１１６）；ＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＮＡＮＤＫＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰ（配列番号１１９）；ＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＰＧＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰ（配列番号１２２）である。 図７Ａは、スキャフォールド＃１５（配列番号８６）の、ＡＣＥ２の残基１９～１６９（配列番号１４０）への結合を示す。Ｂ細胞エピトープをマゼンタ色で示し、Ｔ細胞エピトープをオレンジ色で示し、ＡＣＥ２結合部位を緑色で示す。図７Ｂは、５９個のアミノ酸（野生型配列から１８個のアミノ酸を除去したもの）を有する修飾CoV-2スキャフォールドが、ＡＣＥ２への結合親和性を保持することを示す。図７Ｃは、６７個のアミノ酸（野生型配列から除去された１０個のアミノ酸を有する）を有する修飾CoV-2スキャフォールドが、ＡＣＥ２に対する結合親和性を保持することを示す。Ｂ細胞抗体免疫エピトープ領域をマゼンタ色で示し、Ｔ細胞受容体結合領域、ＭＨＣ－１及びＭＨＣ－２ローディング領域をオレンジ色で示し、ＡＣＥ２結合領域を緑色で示す。 図８Ａ～８Ｂは、Ｓタンパク質スキャフォールド＃９（配列番号８０）とＡＣＥ２をフィッティングさせて（図８Ａ、ＡＣＥ２の残基１９～１０７が示される）、コンピュータモデリングに基づいてそのＡＣＥ２結合親和性及びＫ_Ｄを予測できることを示す（図８Ｂ）。 図８Ａ～８Ｂは、Ｓタンパク質スキャフォールド＃９（配列番号８０）とＡＣＥ２をフィッティングさせて（図８Ａ、ＡＣＥ２の残基１９～１０７が示される）、コンピュータモデリングに基づいてそのＡＣＥ２結合親和性及びＫ_Ｄを予測できることを示す（図８Ｂ）。 図９Ａは、CoV-1及びCoV-2の相同性に基づく、ＡＣＥ２（赤色）に結合したCoV-1（シアン色）及びCoV-2（ネイビー色）のコンピュータモデリングを示す。図９Ｂは、ＡＣＥ２（赤色）に結合したCoV-1（シアン色）のコンピュータモデリングを示す。図９Ｃは、ＡＣＥ２（赤色）に結合したCoV-2（ネイビー色）のコンピュータモデリングを示す。 図１０Ａ及び１０Ｂは、それぞれCoV-2及びCoV-1の鍵となる結合残基を決定するためのΔＧの計算を示す。 図１１Ａ～１１Ｂは、ＡＣＥ２に結合したCoV-2の熱力学的モデリングを示し、図１１Ｂに結合界面の拡大を示す。ΔＧが負のアミノ酸残基、ΔＧが正のアミノ酸残基、及びΔＧが約０のアミノ酸残基を、それぞれ緑色、オレンジ色及び黄色で示す。主鎖の残基をネイビー色で示す。Ｌ４５５及びＰ４９１をマゼンタ色で示す。 図１１Ｃは、CoV-2について決定された２つの重要な結合モチーフ：残基４３７～４５５（配列番号６５）及び残基４７３～５０７（配列番号６６）を示す。ΔＧが負のアミノ酸残基、ΔＧが正のアミノ酸残基、及びΔＧが約０のアミノ酸残基を、それぞれ緑色、オレンジ色及び黄色で示す。主鎖の残基をネイビー色で示す。Ｌ４５５及びＰ４９１をマゼンタ色で示す。 図１２Ａ～１２Ｊは、配列番号７２のアミノ酸配列を有するCoV-2スキャフォールド＃１の可能なフォールディング（PyMOLが示す中心０～中心９のコンフォメーション）を示す。 図１３Ａは、CoV-2スキャフォールド＃９（配列番号８０）の中心０とＡＣＥ２との結合を示す。図１３Ｂは、CoV-2スキャフォールド＃９の中心０及び中心９とＡＣＥ２との結合を示す。図１３Ｃ～１３Ｄは、ＡＣＥ２を有するCoV-2スキャフォールド＃９の中心０－中心９の無秩序な並べ替えを示し、Heisenberg不確実性原理で与えられた全ての可能なフォールディング状態のうちの合理的な平均フォールディングとその位置を示す。図１３Ｄは、スキャフォールド＃９及びＡＣＥ２の結合界面の拡大を示す。 図１４Ａは、CoV-2 Ｓタンパク質に結合したＡＣＥ２のシミュレーションを示す。図１４Ｂ～１４Ｄは、RaptorXを介してシミュレートされた、野生型ｈＡＣＥ２（赤色）を重ねたＡＣＥ２スキャフォールド１（配列番号１４１）（紫色）を示す。CoV-2 Ｓタンパク質との界面におけるＡＣＥ２の重要な結合残基は、緑色で強調表示している。 図１５Ａは、ＡＣＥ２タンパク質から切断されたＡＣＥ２スキャフォールド１（配列番号１４１）のコンピュータモデリングを示す。図１５Ｂは、CoV-2 Ｓタンパク質（青色、抗体結合ドメインをティール色の矢印で示す）を有するＡＣＥ２スキャフォールド１（紫色、重要な結合残基を緑色で示す）の分子モデリングを示す。スキャフォールドはCoV-2 Ｓタンパク質に結合し、結合中にＳタンパク質の抗体結合免疫エピトープ領域の提示を維持する。図１５Ｃは、CoV-2 Ｓタンパク質に結合したＡＣＥ２スキャフォールド１を示す。ＡＣＥ２スキャフォールド１は、CoV-2 Ｓタンパク質の免疫結合ドメイン（ピンク色）に影響を及ぼすとは予測されない。 図１６Ａは、他の研究者によって公開されたCoV-2 Ｓタンパク質のクライオＥＭ構造によるＡＣＥ２への結合を示し、図１６Ｂは、SWISS-MODELに基づくCoV-2 Ｓタンパク質によるＡＣＥ２への結合を示す。 図１７Ａは、他の研究者によって公開された構造（上）及び本開示のコンピュータでシミュレートした構造（下）を使用した、ＡＣＥ２を伴うシミュレートされたコンフォメーションを示す。図１７Ｂは、他の研究者によって公開されたCoV-2のクライオＥＭ構造（左）を、開示した切断及び標識SWISS-MODELシミュレート構造（右）と比較した図を示す。赤い破線の楕円形は、クライオＥＭ構造からの欠損残基の位置を示す。紫色の領域は、他の研究者によって決定されたＢ細胞免疫エピトープを示し、一方で、ＳＡを介して決定されるように、オレンジ色の領域は、ＡＣＥ２反発領域を示し、緑色の領域は、ＡＣＥ２結合領域を示し、黄色の領域は、ＡＣＥ２中立性領域を示す。 図１８は、カスタム構築されたペプチドロボットが、９－アミノ酸ＭＨＣ－１ローディングエピトープの合成を約２４分で完了し、商業的にスケールアップする前の迅速なプロトタイピングを可能にしたことを示す。 図１９Ａは、スキャフォールド＃４７（Ligandal-05、配列番号１１８）を一例として用いたアミドカップリングによる溶液中の側鎖保護ペプチドの頭部－尾部（head-to-tail）型環化を示す。 図１９Ｂは、スキャフォールド＃４８（Ligandal-06、配列番号１１９）を一例として使用したアミドカップリングによる頭部－尾部型環化を示す。 図１９Ｃは、スキャフォールド＃４６（Ligandal-04、配列番号１１７）を一例として使用した、ＮＣＬによる精製された直鎖状チオエステルペプチドの環化を示す。 図２０Ａ～２０Ｉは、ＡＣＥ２に対するスキャフォールドの解離定数を決定するための、ストレプトアビジンセンサーチップ（２．５ｎｍ捕捉）上で捕捉されたＡＣＥ２－ビオチンに会合するスキャフォールド＃４（ペプチド１、配列番号７５）、スキャフォールド＃７（ペプチド４、配列番号７８）、スキャフォールド＃８（ペプチド５、配列番号７９）、及びスキャフォールド＃９（ペプチド６、配列番号８０）のバイオレイヤー干渉分光法を示すチャートである。全てのスキャフォールドは、１０μＭの濃度でＡＣＥ２へのＲＢＤ結合の強力な阻害を示した。図２０Ａ～２０Ｄに示すように、濃度を増加させた各スキャフォールドについて、ＡＣＥ２への明確な結合が観察された（ブランクの値は差し引いた）。図２０Ｅ～２０Ｈに示すように用量反応曲線も観察され、それにより、ＲＢＤは、ペプチドの非存在下、３５μＭで各センサーと強く会合でき（緑色、上部の曲線）、ペプチド用量反応依存的結合阻害を示した（青色、シアン色及び赤色は、それぞれ、１０、３及び１μＭ濃度を表す）。図２０Ｉは、ストレプトアビジンセンサーチップで捕捉（５ｎｍ捕捉）され、次いでＡＣＥ２に結合したＲＢＤ－ビオチンに対応する。 図２１Ａ～２１Ｆは、抗ヒトＩｇＧ（ＡＨＣ）センサーチップ（１ｎｍ捕捉）で捕捉された中和抗体に会合するスキャフォールドのバイオレイヤー干渉分光法を示すチャートであり、この干渉分光法を使用して、中和抗体に対するスキャフォールド＃４（ペプチド１、配列番号７５）、スキャフォールド＃７（ペプチド４、配列番号７８）、スキャフォールド＃８（ペプチド５、配列番号７９）、及びスキャフォールド＃９（ペプチド６、配列番号８０）の解離定数を決定した（図２１Ａ～２１Ｄ）。濃度を増加させたＲＢＤの解離定数を、抗ＲＢＤ中和抗体で決定した（図２１Ｅ）。図２１Ｆは、センサーに結合させた中和抗体への導入前に、１１７ｎＭのＲＢＤをＡＣＥ２と混合（ＡＣＥ２の濃度は増加させる）して、ＲＢＤに結合する中和抗体のＡＣＥ２による阻害を実証したことを示す。 図２２は、スキャフォールド＃４（ペプチド１、配列番号７５）、スキャフォールド＃７（ペプチド４、配列番号７８）、スキャフォールド＃８（ペプチド５、配列番号７９）、及びスキャフォールド＃９（ペプチド６、配列番号８０）と同時トランスフェクトした場合の、感染後６０時間における、SARS-CoV-2スパイク感染後のＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞の発光（ＲＬＵ）を示す。対照は、非トランスフェクトＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞（ウイルス無し）及びSARS-CoV2スパイクタンパク質をトランスフェクトしたＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞を含んだ。 図２３Ａ～２３Ｄは、ＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞における発光（ＲＬＵ）を示し、前記細胞は、スキャフォールド＃８（ペプチド５、配列番号７９）（図２３Ａ）、可溶性ＡＣＥ２（図２３Ｂ）、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の可溶性受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（図２３Ｃ）、及びSARS-CoV-2中和抗体（ｎｅｕＡｂ）（図２３Ｄ）でトランスフェクトさせ、また、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のみとウイルス無し（対照）の場合も示す。 図２４Ａは、スキャフォールド＃４（LGDL_NIH_001、配列番号７５）、スキャフォールド＃７（LGDL_NIH_004、配列番号７８）、スキャフォールド＃８（LGDL_NIH_005、配列番号７９）、及びスキャフォールド＃９（LGDL_NIH_006、配列番号８０）が、マイクロモルの濃度で生きたウイルスのウイルス負荷の９０％以上を阻害（ＥＣ９０）したことを示す。図２４Ｂは、図２４Ａで試験したスキャフォールドが、有効濃度で毒性がなかったことを示す。 図２５は、天然様のコンフォメーションから開始したOpenMMにおける１８０ｎｓのラン（単一トラジェクトリー）に基づくスキャフォールド＃４（ペプチド１、配列番号７５）の三次元分子モデリングを示す。 図２６は、スキャフォールド＃４（配列番号７５）のRosettaスコア（ＲＥＵ）のプロットである。 図２７Ａ及び２７Ｂは、融合中にのみ曝露されるＳタンパク質のエピトープを示すダイアグラムである。 図２８Ａ及び２８Ｂは、過程が次の中和工程へ移行することを妨げる結合部位を示すダイアグラムである。図２８Ｃは結合部位の拡大を示す。 図２９Ａ及び２９Ｂ（拡大）は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質（緑色）にフィッティングさせた配列ＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶ（配列番号８）（赤色）の三次元分子モデリングを示す。配列番号８は、プレバンドルの段階においてヘプタッドリピート（ＨＲ）１（ＨＲ１）とＨＲ２との間のヒンジに位置する、図２７～２８で特定した結合部位のうちの１つに対応する。 図３０は、エクステイン挿入配置のダイアグラムを示す。 図３１Ａ～３１Ｄは、ペプチドスクリーニング及び最適化の間に生成されたダイアグラムである。 図３２Ａ～３２Ｂは、本明細書で開示する代表的なSARS-CoV-2 Ｓタンパク質スキャフォールドの配列アラインメントを示す。アラインメントは、配列番号２のアミノ酸残基４３３～５１１を示す。重要な結合モチーフに下線を付している。置換には、二重下線を付し、黄色で強調表示している。ＧＳリンカーは太字で、青色で強調表示している。Ｂ細胞及びＴ細胞結合のエピトープは太字及び斜体で、緑色で強調表示している。ＥＰＥＡ Ｃタグは斜体で、灰色で強調表示している。ポリ荷電Ｎ末端残基及びＣ末端残基は、波線の下線を付し、ピンク色で強調表示している。代替ＴＣＲエピトープは赤色で強調表示している。 図３２Ａ～３２Ｂは、本明細書で開示する代表的なSARS-CoV-2 Ｓタンパク質スキャフォールドの配列アラインメントを示す。アラインメントは、配列番号２のアミノ酸残基４３３～５１１を示す。重要な結合モチーフに下線を付している。置換には、二重下線を付し、黄色で強調表示している。ＧＳリンカーは太字で、青色で強調表示している。Ｂ細胞及びＴ細胞結合のエピトープは太字及び斜体で、緑色で強調表示している。ＥＰＥＡ Ｃタグは斜体で、灰色で強調表示している。ポリ荷電Ｎ末端残基及びＣ末端残基は、波線の下線を付し、ピンク色で強調表示している。代替ＴＣＲエピトープは赤色で強調表示している。 図３３Ａ～３３Ｅは、選択されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（配列番号１４３～１４８）の位置及び配列を含む、ＩＤＴ ｓｉＲＮＡ設計ツールを使用したｓｉＲＮＡ設計方法を示す。 図３３Ａ～３３Ｅは、選択されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（配列番号１４３～１４８）の位置及び配列を含む、ＩＤＴ ｓｉＲＮＡ設計ツールを使用したｓｉＲＮＡ設計方法を示す。 図３３Ａ～３３Ｅは、選択されたセンス鎖及びアンチセンス鎖（配列番号１４３～１４８）の位置及び配列を含む、ＩＤＴ ｓｉＲＮＡ設計ツールを使用したｓｉＲＮＡ設計方法を示す。 図３４は、SWISS-MODELでシミュレートしたSARS-CoV-2（左）の結合界面を近似するための、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合したSARS-CoV-1（PDB ID 6CS2；赤色）の三次元シミュレーションモデルを示す：スキャフォールド＃８（ピンク色）に含めるための選択されたＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩエピトープ領域は、Ｓ１スパイクタンパク質中のＰ８０７～Ｋ８３５及びＡ１０２０～Ｙ１０４７である。右のモデルは、ＡＣＥ２（赤色）との結合をシミュレートしたSARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）（青色／マルチカラー）を示す。シミュレーションモデルは、予測上の熱力学的に好ましい（緑色）、中立的（黄色）及び好ましくない（オレンジ色）相互作用を特定する。スキャフォールドを生成するために使用されるアミノ酸の外側境界（Ｖ４３３～Ｖ５１１）を右側にシアン色で示す。 図３５は、スキャフォールド＃４、＃７、＃８及び＃９（上部、左から右）とアラインメントさせたＡＣＥ２受容体（赤色）の三次元シミュレーションモデルを示す。ペプチド５の複数のフォールディング状態を、ＡＣＥ２とのシミュレートされた結合で示す（下部）。予測される結合残基は緑色（上部及び下部）で示す。 図３６は、SARS-CoV-2ゲノム配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド２１５３６～２５３５７（下線）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＳタンパク質をコードする。ヌクレオチド２６２１８～２６４４５（二重下線）は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するエンベロープタンパク質をコードする。 図３６は、SARS-CoV-2ゲノム配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド２１５３６～２５３５７（下線）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＳタンパク質をコードする。ヌクレオチド２６２１８～２６４４５（二重下線）は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するエンベロープタンパク質をコードする。 図３６は、SARS-CoV-2ゲノム配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド２１５３６～２５３５７（下線）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＳタンパク質をコードする。ヌクレオチド２６２１８～２６４４５（二重下線）は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するエンベロープタンパク質をコードする。 図３６は、SARS-CoV-2ゲノム配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド２１５３６～２５３５７（下線）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＳタンパク質をコードする。ヌクレオチド２６２１８～２６４４５（二重下線）は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するエンベロープタンパク質をコードする。 図３６は、SARS-CoV-2ゲノム配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド２１５３６～２５３５７（下線）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＳタンパク質をコードする。ヌクレオチド２６２１８～２６４４５（二重下線）は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するエンベロープタンパク質をコードする。 図３６は、SARS-CoV-2ゲノム配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド２１５３６～２５３５７（下線）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＳタンパク質をコードする。ヌクレオチド２６２１８～２６４４５（二重下線）は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するエンベロープタンパク質をコードする。 図３６は、SARS-CoV-2ゲノム配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド２１５３６～２５３５７（下線）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＳタンパク質をコードする。ヌクレオチド２６２１８～２６４４５（二重下線）は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するエンベロープタンパク質をコードする。 図３６は、SARS-CoV-2ゲノム配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド２１５３６～２５３５７（下線）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＳタンパク質をコードする。ヌクレオチド２６２１８～２６４４５（二重下線）は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するエンベロープタンパク質をコードする。 図３７は、SARS-CoV-2スパイク（Ｓ）タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図３８は、ＡＣＥ２のアミノ酸配列（配列番号１４０）を示す。

発明の詳細な説明
本明細書で開示するように、数理データ科学、生物物理学及び実験生物学からの方法を組み合わせることによって、宿主範囲を拡大させ、自然選択を通じてヒト集団におけるSARS-CoV-2の安定性を増加させる可能性が最も高いＳタンパク質の配列を予測できる。計算パイプラインを開発して、SARS-CoV-2 Ｓタンパク質の変異状況を推定する。予測された配列を実験的に操作して、ヒト受容体ＡＣＥ２に対するそれらの結合を、生化学アッセイ及び低温電子顕微鏡法を使用して測定する。

遺伝的アルゴリズムの構造による示唆を受けて、新規の数学的アプローチが、SARS-CoV-2のＳタンパク質の蓋然性の高い配列の特定のために開発される。より具体的に、開示されるアプローチは、グラフ理論、トポロジカルデータ分析及び計算生物物理学からの記述子を、ニューラルネットワーク及び遺伝的アルゴリズムを組み合わせる新たな機械学習フレームワークに組み込んでいる。この強力な学際的アプローチにより、SARS-CoV-2からの既存のデータを使用して、そのウイルスのＳタンパク質の進化で生じる可能性が最も高い、いくつかの候補配列を明らかにできる。これらの結果は、得られた配列からペプチドを生成することによって実験的に検証される。得られたパイプラインは、ウイルスタンパク質の変異状況をよりよく理解するための新しい解決策を提供する。

本明細書で開示するように、in silico分析を行って、１）ＡＣＥ２受容体結合領域、２）Ｔ細胞受容体ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩローディングのための免疫エピトープ領域、及び ３）Ｂ細胞受容体又は抗体結合のための免疫エピトープ領域を予測することにより、SARS-CoV-2スパイク（Ｓ）タンパク質の競合阻害剤として機能するように設計した新規ペプチド（スキャフォールド）を生成し、スクリーニングした。実施例で示すように、三次元モデリング及びin silico分析を使用して、新規ペプチドの予測される構造を調べ、さまざまな配列修飾を（例えば、候補ペプチドについてのRosettaエネルギー単位（ＲＥＵ）スコアを調べることによって）評価し、予測結合モデルをコンピュータによってシミュレートした。これらの結果に基づき、ペプチド配列（例．SARS-CoV-2スパイクタンパク質）を採択し、配列修飾を導入し、三次元モデリング技術を使用してフォールディング又は結合コンフォメーションを予測することによって、ワクチン開発における競合阻害剤として使用するためのペプチドスキャフォールドを生成し、最適化する方法がこの明細書で提供される。またこの方法を使用して設計された最適化ペプチドスキャフォールド、このペプチドスキャフォールドを含む製剤、このペプチドスキャフォールドと製剤を使用してウイルスタンパク質を競合的に阻害するか又はウイルス感染を治療する方法、及びウイルス感染を予防するためのワクチンとしてのこのペプチドスキャフォールドと製剤の使用も、この明細書で提供される。

したがって、本開示は、迅速なワクチンプロトタイピングのための画期的なアプローチに関する。一部の側面では、開示されるワクチンアプローチは、ウイルスの新しい変異型に迅速にカスタマイズできる、Ｔ細胞受容体及び抗体結合エピトープを模倣するための完全な合成スキャフォールドを提供する。さらに、合成スキャフォールドは、治療剤を伴った、疾患細胞及び組織を標的とするウイルス侵入を模倣する標的化リガンドとして機能できる。これらの「ミニウイルス」スキャフォールドは、数時間で合成でき、世界的な必要性を満たすために、１００ｋｇを超えるスケールに迅速に規模を調整できる。加えて、この明細書で提供するスキャフォールドは、結合溝相互作用を阻害するための低分子の代わりに別個に使用し得る。

本明細書で開示するスキャフォールドは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）保存モチーフをモデリングすることによって生成されるペプチドであり、ウイルスに対する予防剤、免疫刺激剤及び治療剤としての潜在的有用性を有する。したがって、本明細書は１つ以上のスキャフォールドを含む組成物も開示し、組成物は、１）ＡＣＥ２スパイク相互作用及びＡＣＥ２発現細胞へのウイルス侵入を阻害すること、２）ＲＢＤへの中和抗体結合を競合的に取り除くことなく、中和抗体への結合を促進すること、並びに／又は ３）可溶性ＡＣＥ２のＲＢＤとの会合を防止することのために使用できる。

本開示では、免疫応答を刺激し、免疫系による認識のためのスパイクタンパク質の曝露を促進する一方で、ＡＣＥ２を発現する細胞へのウイルス結合を遮断するように設計されたペプチドスキャフォールドのシミュレーション、設計、合成及び特徴付けが詳細に説明される。中和抗体療法及びウイルスを標的とする他のアプローチとは対照的に、細胞と結合について競合し、ウイルスを中和抗体への結合に曝露させるための生物模倣ウイルスデコイペプチド技術が開発される。

Ｉ．コンピュータ支援３Ｄモデリング
Ａ．結合界面の分析
一側面では、本開示は、タンパク質－タンパク質相互作用を調べるためのコンピュータ支援三次元（３Ｄ）モデリングの方法に関する。これらの方法は、第１の結合パートナー及び第２の結合パートナーの３Ｄモデルを作製すること、アミノ酸配列、３Ｄ構造及び各結合パートナーの界面のコンフォメーションを決定すること、各結合パートナーを表すスキャフォールドを得るためにそれぞれの３Ｄ構造を維持しながら各結合パートナーの結合界面を切断すること、各残基の熱力学的エネルギーの計算に基づいてスキャフォールドにおける各アミノ酸残基の結合親和性を決定すること、並びにスキャフォールドにおける重要な結合モチーフの位置及び配列を決定することを伴う。ある特定の態様では、３Ｄモデルは、第１の結合パートナー又は第２の結合パートナーに対するタンパク質配列相同性に基づいて、SWISS-MODELを用いて作製される。スキャフォールドの構造、コンフォメーション及び結合親和性を維持又は改善するために、スキャフォールドにさまざまな修飾を行うことができる。これらの修飾としては、スキャフォールド内の１つ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換が挙げられるが、これらに限定されない。本開示に詳述されるように、スキャフォールドにさまざまなリンカー、コンジュゲート可能なドメイン及び／又は免疫エピトープを加えて、多機能性のスキャフォールドを得ることができる。ある特定の態様では、結合に重要でない１つ以上のアミノ酸を欠失又は置換してもよい。ある特定の態様では、結合パートナーが、SARS-CoV-2 Ｓタンパク質及びＡＣＥ２である。ある特定の態様では、Ｓタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。他の態様では、Ｓタンパク質は、B.1.1.7バリアント（配列番号１３７）、B.1.351バリアント（配列番号１３８）又はP.1バリアント（配列番号１３９）を含むが、これらに限定されないバリアントである。コロナウイルスの他のバリアントは、nextstrain.org/ncov/globalに見いだすことができる。ある特定の態様では、ＡＣＥ２は、配列番号１４０に示されるアミノ酸配列を有する。

本明細書では、用語「スキャフォールド」は、結合パートナーの結合界面に位置し、他の結合パートナーへの結合に関与するアミノ酸配列の連続ストレッチを意味する。ある特定の態様では、スキャフォールドのサイズは、約１２０未満のアミノ酸残基、約１１０未満のアミノ酸残基、約１００未満のアミノ酸残基、約９０未満のアミノ酸残基、約８０未満のアミノ酸残基、約７０未満のアミノ酸残基、約６０未満のアミノ酸残基又は５０未満のアミノ酸残基である。ある特定の態様では、スキャフォールドは、その結合配列が由来するタンパク質の天然、遊離又は結合状態の３Ｄ構造及び／又はコンフォメーションを維持する。例えば、スキャフォールドは、野生型タンパク質配列から切断されたときに、αヘリックス及び／又はβシート構造を維持するように設計されてもよい。ある特定の態様では、スキャフォールドは、挿入、欠失及び／又は置換といった１つ以上の修飾を有してもよい。ただし、これらの修飾は、スキャフォールドのその結合パートナーへの結合親和性を実質的に減少させず、一部の態様では、実際に増加させるものである。

本明細書で開示するように、SARS-CoV-2スパイクタンパク質（SARS-CoV-2又はCoV-2；配列番号２）のタンパク質配列をSARSコロナウイルスタンパク質配列（PDB ID 6CS2）と比較して、ＡＣＥ２に結合するCoV-2の３Ｄモデルを作製した（図１）。CoV-2及びＡＣＥ２のそれぞれの結合界面を調べて、結合に関与するアミノ酸残基のストレッチを決定した。このアミノ酸配列のストレッチを残りのタンパク質配列から切断してもよく、このアミノ酸配列のストレッチの構造及び／又はコンフォメーションを維持して、遊離又は結合状態の天然タンパク質のストレッチをシミュレートし、それによって本開示のCoV-2スキャフォールド又はＡＣＥ２スキャフォールドを取得する。

したがって、本明細書は、配列番号２（ＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶ）の残基４３３～５１１のアミノ酸配列と少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を有するCoV-2スキャフォールドを開示する。

一部の態様では、CoV-2スキャフォールドは、アミノ酸配列：

と少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を有する。

上記配列番号７２において、CoV-2 Ｓタンパク質主鎖におけるアミノ酸残基は、装飾のない文字で示され（４３３Ｖ～４３６Ｗ、Ｆ４５６～Ｉ４７２及びＹ５０８～Ｖ５１１を含む）、結合に中立的なΔＧが約０のアミノ酸残基は、下線が付され（Ｎ４３７、Ｓ４３８、Ｎ４４０～Ｋ４４４、Ｇ４４７、Ｎ４４８、Ｎ４５０～Ｌ４５２、Ｒ４５４、Ｓ４７７～Ｖ４８３、Ｇ４８５、Ｃ４８８、Ｐ４９１、Ｌ４９２、Ｆ４９７、Ｇ５０４及びＰ５０７を含む）、重要な結合残基であるΔＧが負のアミノ酸残基は、太字で示され（Ｎ４３９、Ｙ４４９、Ｙ４５３、Ｑ４７４、Ｅ４８４、Ｎ４８７、Ｑ４９３～Ｙ４９５、Ｑ４９８、Ｐ４９９、Ｎ５０１及びＱ５０６を含む）、反発性残基であるΔＧが正のアミノ酸残基は斜体で示される（Ｖ４４５、Ｇ４４６、Ｌ４５５、Ｙ４７３、Ａ４７５、Ｇ４７６、Ｆ４８６、Ｙ４８９、Ｆ４９０、Ｇ４９６、Ｔ５００、Ｇ５０２、Ｖ５０３及びＹ５０５を含む）。

コンピュータモデリング及び熱力学的エネルギーの計算に基づいて、本開示の１つのCoV-2スキャフォールドが、配列番号２の残基４３７～４５５を含む第１の重要な結合モチーフ、配列番号２の残基４７３～５０７を含む第２の重要な結合モチーフ、及び配列番号２の残基４５６～４７２を含む主鎖領域を含むことが決定される。第１及び第２の重要な結合モチーフは、結合界面でＡＣＥ２と直接相互作用するが、主鎖領域は、ＡＣＥ２と直接相互作用しないアミノ酸残基を含む。

CoV-2スキャフォールドは、所望のサイズを達成するために、Ｎ末端、Ｃ末端又は両末端において、CoV-2 Ｓタンパク質主鎖からの１つ以上のアミノ酸を更に含んでもよい。一部の態様では、CoV-2スキャフォールドのアミノ酸残基数は、約４０～約２００、約５０～約１００、約５５～約９５、約６０～約９０、約６５～約８５、約７０～約８０である。一部の態様では、CoV-2スキャフォールドのアミノ酸残基数は、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５又は約１００である。

CoV-2スキャフォールドのサイズは変化してもよく、挿入、欠失及び／又は置換といった特定の修飾が組み込まれてもよいが、スキャフォールドは、ＡＣＥ２結合界面に関してその天然状態の構造及び／又はコンフォメーションを維持する。この構造及び／又はコンフォメーションの保存により、スキャフォールドは、切断されているにもかかわらず、全長Ｓタンパク質と同じかそれを超える親和性でＡＣＥ２に結合できる。例えば、βシート構造を維持し、更なる改変により安定化できる。一部の態様では、CoV-2スキャフォールドは、位置４５５と位置４９１との間にジスルフィド結合が形成されてβシート構造が安定化されるように、Ｌ４５５Ｃ及びＰ４９１Ｃ置換を含む。コンピュータモデリングに基づくと、これらの２つの位置は、ＡＣＥ２に結合した天然のCoV-2 Ｓタンパク質内で互いに近接しているようである。一部の態様では、CoV-2スキャフォールドは、ジスルフィド結合の形成の望ましくない干渉を回避するために、位置４５５及び４９１の導入されたＣｙｓ残基のみが残存するように、既存のＣｙｓ残基のうちの１つ以上を置換する１つ以上の変異を含む。例えば、Ｃｙｓは、置換がＡＣＥ２に対する結合親和性を損なわない限りにおいて、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又は他の残基で置換できる。Ｃｙｓ残基の置きかえの一部の例としては、Ｃ４８０Ｇ及びＣ４８８Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の態様では、明細書で開示されるCoV-2スキャフォールドは、頭部－尾部型環化スキャフォールドを得るために、アミン－カルボキシリンカーのようなリンカーを使用して、Ｎ末端残基とＣ末端残基を接続するループを更に含んでもよい。ある特定の態様では、スキャフォールドの環化は、より低い自由エネルギー、強化されたフォールディング、基質への結合又はコンジュゲーション、及び／又は増強された溶解性を伴う増加した安定性をもたらす。ループは、スキャフォールドの結合パートナーと直接相互作用しない。ある特定の態様では、ループは、スキャフォールドが、ｓｉＲＮＡペイロード又は他の基質に結合されることを可能にする。ある特定の態様では、ループのアミノ酸残基は１～２００である。ある特定の態様では、ループのアミノ酸残基数は約１５０未満である。スキャフォールド、リンカー、コンジュゲート可能なドメイン、極性頭部又は尾部等の所望のコンフォメーションに応じて、ループのサイズを適宜調整できる。一部の態様では、ループは、９～１５のＡｒｇ及び／又はＬｙｓ残基を含む。一部の態様では、ループは、スキャフォールドを基質又はポリアミノ酸鎖にコンジュゲートするための、マレイミド又は他のリンカーなどのコンジュゲート可能なドメインを含む。一部の態様では、ループは、１つ以上の免疫活性化ポリアミノ酸鎖又は免疫反応性グリカンを含む。Ｎ末端及びＣ末端は、ジスルフィド結合の形成、他の適切なリンカー（柔軟性又は剛性）、クリックケミストリー、ＰＥＧ、ポリサルコシン又は生体共役反応によって接続されてもよい。したがって、ペプチドは、環化、安定化、直鎖状、若しくは、クリックケミストリー若しくは生体共役反応を受けたものでもよく、又は、非天然アミノ酸、ペプトイド、糖ペプチド、脂質、コレステロール部分、多糖類、若しくは、フォールディング、結合、溶解性若しくは安定性を向上させるもので置換されたものでもよい。

本明細書は、配列番号１４０の残基１９～８４のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一であるＡＣＥ２スキャフォールドも開示する。

一部の態様では、ＡＣＥ２スキャフォールドは、アミノ酸配列：

と少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一である。

上記配列番号１５１において、重要な結合残基であるΔＧが負のアミノ酸残基（Ｓ１９、Ｑ２４、Ｄ３８、Ｑ４２、Ｅ７５、Ｑ７６及びＹ８３を含む）を太字で示す。

コンピュータモデリング及び熱力学的エネルギーの計算に基づいて、本開示のＡＣＥ２スキャフォールドは、配列番号１４０のアミノ酸残基１９～４２を含む第１の重要な結合モチーフ、配列番号１４０の残基６４～８４を含む第２の重要な結合モチーフ、及び配列番号１４０の残基４３～６３を含む主鎖領域を含むことが決定される。第１及び第２の重要な結合モチーフは、結合界面上でCoV-2 Ｓタンパク質と直接相互作用するが、ＡＣＥ２の主鎖アミノ酸残基を含み、CoV-2 Ｓタンパク質と直接相互作用しない。

一部の態様では、ＡＣＥ２スキャフォールドは、２つの重要な結合モチーフを接続するリンカー（太字）を含む。例えば、ＡＣＥ２スキャフォールド１（配列番号１４１）：

を参照。

一部の態様では、ＡＣＥ２スキャフォールドは、ＥＰＥＡ Ｃタグ（下線）を更に含む。例えば、ＡＣＥスキャフォールド２（配列番号１４２）：

を参照。

ＡＣＥ２スキャフォールドは、ＡＣＥ２タンパク質主鎖からの１つ以上のアミノ酸又は単量体単位を更に含んでいてもよく、又は、ＡＣＥ２のＮ末端、Ｃ末端若しくは両者に由来するスパイクタンパク質との適切な界面において、ＡＣＥ２の結合効果を再現して、所望のサイズ、フォールディング及び親和性を達成してもよい。一部の態様では、ＡＣＥ２スキャフォールドのアミノ酸残基数は、約１０～約２００、約５０～約１００、約５５～約９５、約６０～約９０、約６５～約８５、約７０～約８０である。一部の態様では、ＡＣＥ２スキャフォールドのアミノ酸残基数は、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５又は約１００である。

ＡＣＥ２スキャフォールドのサイズは変化してもよく、挿入、欠失及び／又は置換といった特定の修飾が組み込まれてもよいが、スキャフォールドは、CoV-2 Ｓタンパク質結合界面に関してその天然状態の構造及び／又はコンフォメーションを維持する。この構造及び／又はコンフォメーションの保存により、スキャフォールドは、切断されているにもかかわらず、全長ＡＣＥ２タンパク質と同じかそれを超える親和性でＳタンパク質に結合できる。

ある特定の態様では、ＡＣＥ２スキャフォールドのＮ末端、Ｃ末端又は両末端は、任意の数のバイオコンジュゲーションモチーフ、リンカー、スペーサー、タグ（例．Ｈｉｓタグ及びＣタグ）等で修飾される。ある特定の態様では、CoV-2 Ｓタンパク質への結合に重要ではない１つ以上のアミノ酸が、欠失又は置換されている。

更なるスキャフォールドは、CoV-2 Ｓタンパク質へのＡＣＥ２結合を模倣するように設計され得る。これらのＡＣＥ２スキャフォールドは、CoV-2ウイルスに結合して、ウイルスがＡＣＥ２に結合できないようにウイルスをコーティングし、それによってヒト（又は他の宿主）の体内へのウイルス侵入を阻害できる。さらに、ＡＣＥ２スキャフォールドは、例えば、結晶化可能断片（Ｆｃ）ドメイン又は免疫応答を活性化する役割を果たす代替ドメインを含むように修飾されてもよい。

第１の重要な結合モチーフ、第２の重要な結合モチーフ、及び重要な結合モチーフを接続するリンカーを含むＡＣＥ２スキャフォールド１（配列番号１４１）は、野生型ＡＣＥ２よりも、CoV-2 Ｓタンパク質に対する親和性が高いと予測される。加えて、CoV-2 Ｓタンパク質に結合し、CoV-2 Ｓタンパク質の免疫エピトープ領域を遮断するＡＣＥ２とは対照的に、ＡＣＥ２スキャフォールド１は、CoV-2 Ｓタンパク質の免疫結合ドメインに影響を及ぼすとは予想されず、免疫系がCoV-2ウイルスを認識することを可能にする。この明細書で提供される他のスキャフォールドと同様に、ＡＣＥ２スキャフォールド１は、ナノ粒子又は他の好適な基材中に提供されてもよく、ウイルスを凝集させるように作用し得る。例えば、Ｎ末端又はＣ末端は、任意の数のバイオコンジュゲーションモチーフ、リンカー、スペーサー等で修飾されてもよく、バッキーボール（例．Ｃ６０／Ｃ７０フラーレン）、分枝ＰＥＧ、多分枝デンドリマー、単層カーボンナノチューブ、二重層カーボンナノチューブ、ＫＬＨ、ＯＶＡ及び／又はＢＳＡを含むさまざまな基材を有してもよい。ＡＣＥ２スキャフォールド１は、遊離ＡＣＥ２よりもウイルスのスパイクタンパク質に対して高い親和性を有すると予測される。

Ｂ．免疫エピトープの分析
免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）は、さまざまなＨＬＡ対立遺伝子を有する集団のさまざまなＴ細胞受容体（ＴＣＲ）応答に関して、臨床データが判明する前に、重要なエピトープを予測するために利用された。これらの予測されたエピトープを、SARS-CoV-1におけるＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ応答の既知のエピトープと比較した。アミノ酸配列ＬＰＤＰＬＫＰＴＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＭＫＱＹＧ（SARS-CoV-1の残基７８８～８２０）を有するＳ５ペプチド、及びアミノ酸配列ＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨ（SARS-CoV-1の残基１００２～１０３０）を有するＳ６ペプチドは、SARS-CoV Ｓタンパク質の切断された組換えタンパク質類似体を使用した並行調査で見いだされたものと同様の免疫原性応答を示すことが、報告されている(2)。Ｓ５ペプチドは、ＭＨＣ－Ｉ応答及び抗体応答を誘発する能力の観点から一価ペプチドの既知の免疫原性に基づいて定義されたが、他の多くのペプチドは、多価でありながら免疫原性のみであった。Ｓ６ペプチドは、SARS-CoV-1に由来する既知のＭＨＣ－ＩＩドメインを表す。

SARS-CoV-1 Ｓタンパク質のこれらの免疫エピトープをCoV-2 Ｓタンパク質にアラインメントし、CoV-2 Ｓタンパク質上の可能性のある免疫原性部位を決定した。相同性に基づいて、CoV-2 Ｓタンパク質中の対応する免疫エピトープは、以下のように特定され、Ｓ１－Ｓ２界面のＴＭＰＲＳＳ２切断後の、その融合前コンフォメーションにおいてＳ２スパイクの領域と重複するように設計される：

SARS-CoV-1免疫エピトープの３Ｄ構造を図２Ａに示し、CoV-2免疫エピトープの３Ｄ構造及びCoV-2 Ｓタンパク質中の位置を図２Ｂ～２Ｄに示す。それぞれ、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１に対するＭＨＣ－ＩＩ及びＭＨＣ－Ｉ結合ドメインである、SARS-CoV-2 Ｓタンパク質の配列ＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶ（配列番号７１）及びＬＬＦＮＫＶＴＬＡ（配列番号７）が、ＩＥＤＢより、それぞれ、０．９及び１．２のパーセンタイルランクで免疫原性であると判定された。パーセンタイルランクが低いほど、結合性は良好である。図３に、これらの免疫エピトープのＭＨＣ－Ｉ結合予測の結果を示す。この結果に基づいて、以下の配列を有する免疫エピトープを更なる研究において使用し、一部のスキャフォールドに含める：ＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶ（配列番号７１）及びＬＬＦＮＫＶＴＬＡ（配列番号７）。

追加のエピトープを、さまざまなデータベースから特定できる。例えば、TepiToolの結果では、ＹＬＱＰＲＴＦＬＬ（配列番号９）、ＦＩＡＧＬＩＡＩＶ（配列番号２２）及びＦＶＦＬＶＬＬＰＬ（配列番号２１）が、スコアリングが上位のＨＬＡ－Ａ^＊０２０１エピトープである。これらのエピトープは非常に疎水性である。スコアリングが上位のエピトープ、又は利用可能であればin vivo若しくはin vitroで免疫原性を示すエピトープは、本明細書で開示するスキャフォールドに含まれてもよい。

図４は、他の研究者(12)が特定したCoV-2 Ｓタンパク質中のＢ細胞エピトープのような抗体エピトープが、CoV-2 Ｓタンパク質アミノ酸配列にアラインメントすることを示す。

図５に示すように、配列番号４（下記）に示すアミノ酸配列を有する切断CoV-2 Ｓタンパク質をＡＣＥ２とアラインメントさせ、抗体エピトープ（マゼンタ色）及びＡＣＥ２結合残基（緑色）の位置を示す：

Bepipredツールを使用した配列検索では、受容体結合モチーフ（残基４４０～５０１）のほとんどが、Ｂ細胞直鎖状エピトープであると予測される。

同様に、ＰＤＢを使用してＢ細胞エピトープを特定できる。例えば、ＰＤＢには、以前に実験によって探索された８つのエピトープが列挙されている。SARS-CoV-2 Ｓタンパク質上の２つの直鎖状エピトープが、COVID-19患者において中和抗体を誘発することが実証された(12)。Ｂ細胞エピトープの一部の例として、ＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶ（Ｓ２１Ｐ２）（配列番号３０）、ＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡ（Ｓ１４Ｐ５）（配列番号２５）、ＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣ（配列番号２４）、ＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫ（配列番号２６）、ＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩ（配列番号２７）、ＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳ（配列番号２９）、ＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬ（配列番号２３）及びＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦ（配列番号２８）が挙げられる。

以下に詳細に開示するように、本明細書で開示するスキャフォールドは、Ｔ細胞エピトープ及び／又はＢ細胞エピトープを含む１つ以上の免疫エピトープを含むように改変されてもよい。

これらの結果は、結合ポケットが、クライオＥＭ及び他の高解像度構造データと一致する方法で予測され得ることを実証する。ウイルス全体のゲノムデータの類似性がわずか８０％程度を示唆している場合であっても、この手法は、既知又は新規のウイルスの将来的変異に迅速に対処するために使用できる。この明細書で開示する技術はまた、ＴＣＲ及びＢＣＲ／抗体エピトープをマッピングするためのバイオインフォマティクス駆動アプローチを組み込み、タンパク質サイズの「圧縮アルゴリズム」を可能にする。組換え技術及び他のアプローチとは対照的に、この明細書で開示する技術は、アミノ酸数約１２００のスパイクタンパク質のうちのアミノ酸数が７０未満のペプチドといった低分子のペプチドを利用して、ＡＣＥ２結合及びＴＣＲ／抗体認識のための多機能スキャフォールドを生成する。

ＩＩ．スキャフォールド／ペプチド修飾
CoV-2 Ｓタンパク質及びＡＣＥ２のそれぞれの結合界面からのアミノ酸配列の１つ以上の断片を含む一方、天然タンパク質の遊離又は結合状態での構造及び／又はコンフォメーションを実質的に維持しているCoV-2スキャフォールド又はＡＣＥ２スキャフォールドを本明細書で開示する。この明細書で開示するスキャフォールドは、対応する結合パートナーに対する結合親和性を実質的に維持又は改善する。例えば、この明細書で開示するCoV-2スキャフォールドは、野生型ＡＣＥ２に対する結合親和性を実質的に維持又は改善し、この明細書で開示するＡＣＥ２スキャフォールドは、野生型CoV-2 Ｓタンパク質に対する結合親和性を実質的に維持又は改善する。CoV-2スキャフォールド又はＡＣＥ２スキャフォールドのアミノ酸残基数は、約１０～約１００、１５～約３０、約５５～約９５、約６０～約９０、約６５～約８５、約７０～約８０である。一部の態様では、CoV-2スキャフォールド又はＡＣＥ２スキャフォールドのアミノ酸残基数は、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５又は約１００である。一部の態様では、CoV-2スキャフォールド又はＡＣＥ２スキャフォールドは、スキャフォールドの結合、転位又は免疫原性を増強する２つ以上の配列を含む。一部の態様では、ウイルス模倣又は病原体模倣スキャフォールドは、SARS-CoV-2及びそのＡＣＥ２への結合に関連する必要はなく、真核生物及び原核生物を含む、その随伴するヒト又は宿主タンパク質結合パートナーに結合する病原体に由来し得る。

ある特定の態様では、本明細書は、CoV-2スキャフォールド又はＡＣＥ２スキャフォールドであって、それぞれ２つの重要な結合モチーフを含み、重要な結合モチーフが、結合パートナーへの直接結合に関与する、CoV-2スキャフォールド又はＡＣＥ２スキャフォールドを開示する。一部の態様では、スキャフォールドは、結合パートナーへの直接結合に関与しないアミノ酸残基を含む１つ以上の主鎖領域を更に含む。一部の態様では、主鎖領域は、２つの重要な結合モチーフの間に位置する。一部の態様では、主鎖領域は、第１の重要な結合モチーフのＮ末端に位置する。一部の態様では、主鎖領域は、第２の重要な結合モチーフのＣ末端に位置する。

ある特定の態様では、この明細書で開示するCoV-2スキャフォールドは、アミノ酸配列ＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬ（配列番号６５）に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％の同一性を有する第１の重要な結合モチーフと、アミノ酸配列ＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰ（配列番号６６）に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％の同一性を有する第２の重要な結合モチーフを含む。

ある特定の態様では、この明細書で開示するＡＣＥ２スキャフォールドは、アミノ酸配列ＳＴＩＥＥＱＡＫＴＦＬＤＫＦＮＨＥＡＥＤＬＦＹＱ（配列番号１４９）に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％の同一性を有する第１の重要な結合モチーフと、アミノ酸配列ＮＡＧＤＫＷＳＡＦＬＫＥＱＳＴＬＡＱＭＹＰ（配列番号１５０）に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は１００％の同一性を有する第２の重要な結合モチーフを含む。

この明細書で開示するスキャフォールドは、第１の重要な結合モチーフのＮ末端及び／又は第２の重要な結合モチーフのＣ末端という２つの重要な結合モチーフ間の主鎖のアミノ酸残基の数に応じて、さまざまなサイズであってもよい。例えば、以下でアラインメントした、スキャフォールド＃１（配列番号７２）（上）及びスキャフォールド＃１０（配列番号８１）（下）のアミノ酸配列を参照されたい。

ある特定の態様では、スキャフォールド内の１つ以上のアミノ酸残基が欠失している又は置換されている。例えば、ΔＧが正の１つ以上の反発性アミノ酸残基が欠失又は置換され、ΔＧが約０の１つ以上の中立性アミノ酸残基が欠失又は置換され、及び／又は、例えば主鎖領域内の重要な結合モチーフの外側の１つ以上のアミノ酸残基が欠失又は置換される。望ましくはないが、ΔＧが負の１つ以上の重要なアミノ酸残基を欠失又は置換できる。

ある特定の態様では、スキャフォールドは、重要な結合モチーフ間の主鎖領域内のアミノ酸残基を、さまざまな長さのＧＳリンカーなどのリンカーで置きかえることによって修飾される。一部の態様では、スキャフォールドは、アミノ酸残基数約１～約２０のリンカーを含み、例えば、リンカーのアミノ酸残基は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０である。スキャフォールドの所望の構造及び／又はコンフォメーションを達成するために、リンカーのサイズを最適化できる。例えば、上から下へアラインメントさせた、スキャフォールド＃１（配列番号７２）、スキャフォールド＃３（配列番号７４）、スキャフォールド＃１１（配列番号８２）、スキャフォールド＃１２（配列番号８３）、スキャフォールド＃１３（配列番号８４）及びスキャフォールド＃１４（配列番号８５）のアミノ酸配列を参照されたい。ＧＳリンカーを太字で示す。

ある特定の態様では、スキャフォールドは、１つ以上のＴ細胞エピトープ、１つ以上のＢ細胞エピトープ又は両者といった、１つ以上の免疫エピトープを含む。免疫エピトープは、スキャフォールドの２つの重要な結合モチーフ間の主鎖領域の全部又は一部の配列を置きかえる非界面ループ構造内に含まれてもよい。例えば、主鎖領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、１つ以上の免疫エピトープによって置きかえられてもよい。別の例では、重要な結合モチーフにおける１つ以上のアミノ酸残基、好ましくは、反発性又は中立性アミノ酸残基は、１つ以上の免疫エピトープによって置きかえられてもよい。スキャフォールドの望ましいサイズ及び構造に応じて、１つ以上の免疫エピトープによって置きかえられるアミノ酸残基を選択できる。

ある特定の態様では、免疫エピトープの長さは、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ結合に対応する９又は１３アミノ酸残基である。例えば、Ｔ細胞エピトープとしては、限定されないが、ＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶ（配列番号８）及びＬＬＦＮＫＶＴＬＡ（配列番号７）が挙げられる。同様に、他の既知のエピトープがスキャフォールドに含まれてもよい。例えば、ＫＬＷＡＱＣＶＱＬ（配列番号１０）（ORF1ab、3886-3894、17.7nM、大部分はＡ^＊０２）、ＹＬＱＰＲＴＦＬＬ（配列番号９）（S、269-277、5.4nM、大部分はＡ^＊０２）及びＬＬＹＤＡＮＹＦＬ（配列番号１１）（ORF3a、139-147、大部分はＡ^＊０２）(3)を含む顕性ＴＣＲエピトープ。他の既知のＴＣＲエピトープとしては、ＰＲＷＹＦＹＹＬＧＴＧＰ（配列番号１２）（ヌクレオカプシド）、ＳＰＲＷＹＦＹＹＬ（配列番号１３）（ヌクレオカプシド、大部分はＢ^＊０７：０２、Ａ^＊１１：０１、Ａ^＊０３：０１）、ＷＳＦＮＰＥＴＮ（配列番号１４）（膜タンパク質）、ＱＰＰＧＴＧＫＳＨ（配列番号１５）（ORF1abポリプロテイン）及びＶＹＴＡＣＳＨＡＡＶＤＡＬＣＥＫＡ（配列番号１６）（ORF1abポリプロテイン）(1, 4-6)が挙げられる。ＫＴＦＰＰＴＥＰＫ（配列番号１７）（Ｎタンパク質；20.8nM）、ＣＴＤＤＮＡＬＡＹＹ（配列番号１８）（ORF1ab；5.3nM）、ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ（配列番号１９）（ORF1ab；7.2nM）及びＦＴＳＤＹＹＱＬＹ（配列番号２０）（ORF3a；3.2nM）のような一部のエピトープは、強力であるがＨＬＡ拘束性であり得る。

ある特定の態様では、Ｂ細胞エピトープとして、限定されないが、ＦＤＥＤＤＳ（配列番号６３）、ＩＱＫＥＩＤＲＬ（配列番号６２）、ＫＹＦＫＮＨＴＳＰ（配列番号６１）、ＭＡＹＲ（配列番号５６）、ＮＶＬＹＥＮＱ（配列番号５７）、ＱＳＫＲ（配列番号５８）、ＹＱＰＹ（配列番号４５）、ＳＥＦＲ（配列番号３６）、ＴＰＧＤＳＳ（配列番号３８）、ＴＴＫＲ（配列番号６４）、ＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭ（配列番号３５）、ＡＳＴＥＫ（配列番号３３）、ＡＷＮＲＫＲ（配列番号４１）、ＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦ（配列番号５５）、ＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹ（配列番号５０）、ＥＱＤＫＮＴＱ（配列番号５４）、ＥＳＮＫＫ（配列番号４７）、ＦＰＱＳＡ（配列番号５９）、ＧＦＱＰＴ（配列番号４４）、ＧＴＮＴＳＮ（配列番号４９）、ＨＶＮＮＳＹ（配列番号５１）、ＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴ（配列番号４８）、ＩＹＳＫＨＴ（配列番号３７）、ＫＹＮＥＮＧＴ（配列番号３９）、ＬＤＳＫＴＱ（配列番号３４）、ＬＫＰＦＥＲＤＩ（配列番号４３）、ＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳ（配列番号３１）、ＮＳＮＮＬＤ（配列番号４２）、ＰＫＫＳ（配列番号４６）、ＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴ（配列番号４０）、ＳＭＴＫＴ（配列番号５３）、ＴＮＧＴＫＲＦＤ（配列番号３２）、ＶＰＡＱＥＫＮＦＴ（配列番号５０）及びＹＱＴＱＴＮＳＰＲＲＡＲ（配列番号５２）が挙げられる。CoV-2 Ｓタンパク質中のＢ細胞エピトープの位置を図４に示す。

例えば、上から下へアラインメントさせた、スキャフォールド＃１０（配列番号８１）、スキャフォールド＃１５（配列番号８６）、スキャフォールド＃１６（配列番号８７）、スキャフォールド＃１７（配列番号８８）、スキャフォールド＃１８（配列番号８９）、スキャフォールド＃１９（配列番号９０）及びスキャフォールド＃２０（配列番号９１）のアミノ酸配列を参照されたい。上から下へアラインメントさせた、スキャフォールド＃１（配列番号７２）、スキャフォールド＃３（配列番号７４）、スキャフォールド＃１１（配列番号８２）、スキャフォールド＃１２（配列番号８３）、スキャフォールド＃１３（配列番号８４）、スキャフォールド＃１４（配列番号８５）のアミノ酸配列。重要な結合モチーフのアミノ酸残基には下線を付し、免疫エピトープは太字で示す。スキャフォールドの所望のサイズ及び／又は構造に応じて、免疫エピトープは、重要な結合モチーフ間の主鎖領域の全部又は一部の配列を置きかえることができ、並びに／又は重要な結合モチーフの一部の配列、特に、重要な結合モチーフにおける反発性及び／又は中立性アミノ酸残基を置きかえることができる。

ある特定の態様では、スキャフォールドは、ジスルフィド結合を介して所望の位置でＣｙｓ－Ｃｙｓ架橋が形成され得るように、１つ以上のＣｙｓ置換を含む。例えば、Ｌ４５５Ｃ及びＰ４９１Ｃ置換を行い、スキャフォールドのβシート構造を維持又は安定化するためのＣｙｓ－Ｃｙｓ架橋を導入する。一部の態様では、他の位置におけるＣｙｓ残基をＧｌｙ又は他の残基によって置換して、所望の位置におけるＣｙｓ－Ｃｙｓ架橋に対する干渉を回避できる。他の態様では、他のクリックケミストリー又はジセレニド化学技術を使用して、スキャフォールドの２つのアミノ酸又は単量体領域を架橋して、所望の構造を再現できる。

ある特定の態様では、スキャフォールドは、Ｎ末端、Ｃ末端又は両末端に結合した、ポリ（アルギニン）、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（グルタミン酸）又はポリ（アスパラギン酸）といった１つ以上の荷電アミノ酸を含む頭部及び／又は尾部を更に含む。これらの陽イオン又は陰イオン配列を加えて、この明細書で開示するスキャフォールドのナノ粒子を作製する。

ある特定の態様では、スキャフォールドは、ＡＣＥ２結合親和性、抗体親和性又は両者を増加させるための１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、ＡＣＥ２結合親和性を増加させる置換としては、Ｎ４３９Ｒ、Ｌ４５２Ｋ、Ｔ４７０Ｎ、Ｅ４８４Ｐ、Ｑ４９８Ｙ、Ｎ５０１Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、抗体親和性を変化させる置換としては、Ａ３７２Ｔ、Ｓ３７３Ｆ、Ｔ３９３Ｓ、Ｉ４０２Ｖ、Ｓ４３８Ｔ、Ｎ４３９Ｒ、Ｌ４４１Ｉ、Ｓ４４３Ａ、Ｇ４４６Ｔ、Ｋ４５２Ｋ、Ｌ４５５Ｙ、Ｆ４５６Ｌ、Ｓ４５９Ｇ、Ｔ４７０Ｎ、Ｅ４７１Ｖ、Ｙ４７３Ｆ、Ｑ４７４Ｓ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｐ、Ｆ４９０Ｗ、Ｑ４９３Ｎ、Ｓ４９４Ｄ、Ｑ４９８Ｙ、Ｐ４９９Ｔ及びＮ５０１Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。ＡＣＥ２結合親和性を増加させる一方、それらの配列への抗体結合及びＢ細胞結合を減少させるか又は潜在的に取り除く置換は、免疫回避及び免疫エスケープに寄与できる。ある特定の態様では、スキャフォールドは、増強された病原性又は伝染性への選択圧を有する活性配列に対する、Ｎ５０１Ｙ、Ｎ５０１Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｌ４５２Ｒ及びＮ４３９Ｋを含むアミノ酸置換、配列、必ずしもＳタンパク質に由来するものではない配列の他の断片（snippet）を含むか、抗原ドリフト／エスケープに寄与する。これらのペプチドは、新たな株が出現するとき、世界中に広がる前に迅速に設計・配布して特定のゾーンをカバーでき、この原理は他の病原体（例．細菌、真菌、原生動物など）及びウイルスにも適用できる。ＡＣＥ２結合を増強する一部の代表的な病原性バリアントは、それに対応して感染性、病原性及び抗体エスケープを増加させる場合もあれば増加させない場合もある。例えば、Ｎ４２６～Ｆ４４３及びＹ４６０～Ｙ４９１は維持され得る。

ある特定の態様では、スキャフォールドは、Ｈｉｓタグ又はＥＰＥＡアミノ酸配列を有するＣタグを含む。

この明細書で開示するスキャフォールドは、直鎖状ペプチドであってもよい。あるいは、この明細書で開示するスキャフォールドは環状ペプチドであってもよく、例えば、直鎖状ペプチドがアミドカップリングを介して頭部－尾部型で環化されてもよい。頭部－尾部型スキャフォールドの一部の例としては、以下のアミノ酸配列（太字はＧＳリンカー）を有するスキャフォールド＃４３（配列番号１１４）及びスキャフォールド＃４４（配列番号１１５）が挙げられる：

これらの環状スキャフォールドは、非凝集性及び非毒性であり、直鎖状スキャフォールドと同等又はそれ以上の結合親和性を有することが予測される。ある特定の態様では、代替リンカーを使用して、環状スキャフォールドを更に最適化してもよい。頭部－尾部型環状スキャフォールドの一部の例は、以下のアミノ酸配列を有する（太字はリンカー）：

ある特定の態様では、追加のアミノ酸残基をスキャフォールドに付加して、所望のサイズ又は構造を達成してもよい。同様に、これらのスキャフォールドは、直鎖状ペプチドであってもよく、又は頭部－尾部型環状ペプチドであってもよい。スキャフォールドの一部の例は、以下のアミノ酸配列を有する（付加された残基を太字で示す）：

ある特定の態様では、スキャフォールドは、より剛性の構造を得るために、Ｐｒｏ残基を含むリンカーを含むように修飾される。そのような剛性スキャフォールドの一部の例は、以下のアミノ酸配列を有する（プロリン含有リンカーを太字で示す）：

図６に、結合コンフォメーションにおける３つの代表的なリンカーの三次元分子モデリングを示す。

ある特定の態様では、スキャフォールドは、ＰＥＧ２０００（４５単位）のようなＰＥＧ鎖を含み、二量体ＡＣＥ２の２つのユニットへの結合を可能にする。一部の態様では、ＰＥＧ鎖の長さは、３０～６０単位、３５～５５単位又は４０～５０単位である。一部の態様では、ＰＥＧ鎖の長さは、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９又は約６０単位である。

ある特定の態様では、スキャフォールドは、凝集を低減するための、親水性アミノ酸又はポリマー配列による１つ以上のアミノ酸置換を含む。ある特定の態様では、スキャフォールドは、親水性アミノ酸の数を増加させるための修飾を有する。ある特定の態様では、スキャフォールドは、疎水性アミノ酸を内側に向けるように構成される。一部の態様では、ＰＥＧ、ポリ（サルコシン）又は親水性ポリマー配列を付加して、スキャフォールドの溶解度を増加させてもよい。そのようなスキャフォールドの一部の例は、以下のアミノ酸配列を有する（シリン置換を太字で示す）：

この明細書で開示するスキャフォールドは、適切なリンカーを使用して１つ以上の追加のスキャフォールド又は他のペプチドに結合して、多量体構造を生成してもよい。ある特定の態様では、二量体は、リンカーを用いて２つのスキャフォールド又はペプチドを連結することによって形成され得る。ある特定の態様では、三量体は、２つのリンカーを用いて３つのスキャフォールド又はペプチドを連結することによって形成され得る。より大きな多量体構造（例．共に連結した４つ、５つ、６つ、７つ又は８つのスキャフォールド又はペプチドを含むアセンブリ）を生成してもよい。リンカーとしては、ＰＥＧ又はポリ（サルコシン）が挙げられるが、これらに限定されない。

ある特定の態様では、スキャフォールドは、Ｎ末端に天然Ｆ残基、Ｃ末端に残基ＩＹＱ又は両者を含む。一部の態様では、スキャフォールドは、残基ＹＱＰに頭部－尾部型環状ペプチドの閉鎖を含む。

SARS-CoV-2 Ｓタンパク質に由来するスキャフォールドの代表例を以下の表１に示す。重要な結合モチーフには下線を付し、免疫エピトープを太字及び斜体で示し、リンカーを太字で示す。これらの代表的なスキャフォールド配列のアラインメントを、図３２Ａ～３２Ｂに示す。図７Ａ～７Ｃに示すように、得られたスキャフォールドをＡＣＥ２にフィッティングさせて、結合親和性を調べることができる。

図８Ａ～８Ｂに示すように、CoV-2スキャフォールドは、修飾の有無にかかわらず、ＡＣＥ２にフィッティングさせて、コンピュータモデリングに基づいて、そのＡＣＥ２結合親和性及びＫ_Ｄを予測できる。

選択されたスキャフォールドは、より高い結合親和性、より良い効能、及び／又は改善された安定性を達成するために、更なる構造分析及び修飾に供される。この明細書で開示するスキャフォールドは、修飾の有無にかかわらず、既存の技術、例えば、ペプチド合成又は組換え技術によって得ることができる。

ＩＩＩ．スキャフォールドのin vitroアッセイ
実施例に示すように、バイオレイヤー干渉分光法アッセイを実施して、in vitroでＡＣＥ２に対して高い結合親和性を有し、CoV-2感染を有意に阻害するスキャフォールドをスクリーニングする。バイオレイヤー干渉分光法（ＢＬＩ）は、センサー先端表面のリガンドのローディング後の入射白色光の波長シフト、及び／又はセンサー先端表面のそのリガンドへの可溶性分析物の結合を測定する方法である。波長シフトは、存在する分析対象物の量に対応し、複数の分析対象物と固定化されたリガンドとの間の解離定数及び競合を求めるために使用できる。

具体的には、スキャフォールドとＡＣＥ２及びSARS-CoV-2中和抗体との相互作用は、バイオレイヤー干渉分光法及びＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞の偽型レンチウイルス感染によって特徴付けられる。実施例に示すように、感染の統計学的に有意な阻害は、スキャフォールド＃８（配列番号７９）の３０ｎＭほどの低用量で観察され、６．６６μＭで９５％以上の感染の阻害が観察された。

SARS-CoV-2のウイルス侵入受容体として一般に知られるＡＣＥ２は、膜結合形態及び可溶性形態の両者で存在する。ＡＣＥ２は、in vitroでは、可溶性形態の場合に感染を防止するが、in vivoでは、ウイルスの免疫クローキング及び免疫誘発特性に寄与し得、適応免疫系による認識から開放的コンフォメーションのスパイクタンパク質を本質的に遮蔽する。実施例に示すように、SARS-CoV-2偽型レンチウイルス感染症の統計学的に有意な阻害が４ｎＭの低いＡＣＥ２濃度で観察された。なお、実施例は、可溶性ＡＣＥ２が、中和抗体をスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合することから妨げたことを更に示す。

心不全の患者では、可溶性ＡＣＥ２の血漿濃度は１６．６～４１．１ｎｇ／ｍＬ（第１及び第４の四分位範囲）で、これは約１９３～４７８ｐＭに相当する。一部の研究では、急性心不全患者における７．９ｎｇ／ｍＬの濃度及び健康なボランティアにおける４．８ｎｇ／ｍＬの濃度が報告されており、それぞれ、約９２ｐＭ及び約５６ｐＭに相当する(4, 6)。

他の研究では、糖尿病性腎症（約２５．６ｎｇ／ｍＬ）及び／又は冠動脈疾患（約３５．５ｎｇ／ｍＬ）を併発した１型糖尿病の男性患者及び女性患者（約２７．０ｎｇ／ｍＬ）の循環ＡＣＥ２濃度は、男性対照（約２７．０ｎｇ／ｍＬ）よりも高く、動脈硬化及び微小血管又は大血管疾患の多さが、可溶性ＡＣＥ２濃度と正の相関を示すことが報告されている(14)。個々のウイルスのスパイクは、フューリン（生合成中）及びＴＭＰＲＳＳ２（膜会合中）に曝露した後にのみ、「開放的（open）」コンフォメーションを取ることを考えると、そのような範囲では、ＡＣＥ２は、この開放的コンフォメーションのＳ１スパイクタンパク質の受容体結合ドメインを閉塞することによりin vivoでの感染を増強し得る(7; 17)。さらに、心血管、糖尿病、腎臓及び血管疾患の患者におけるより高い濃度のＡＣＥ２は、SARS-CoV-2の病原性の増加と更に関連付けられ得る。ＡＣＥ２は、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に対して極めて強力な結合親和性を示し、中和抗体のウイルスへの結合を妨げ得るため、ウイルスは可溶性ＡＣＥ２の機能として免疫系による検出を回避し得る。臨床検体の血液中のSARS-CoV-2ウイルス力価は、血液中の１ｍＬあたり約１０００ウイルスコピーに対応し、気管支卵胞洗浄液、線維気管支鏡ブラシ生検、痰、鼻スワブ、咽頭スワブ及び糞便と比較して低い（＜２．６×１０^４コピー／ｍＬに対応する３０のサイクル閾値に対して平均２^４．６の減少）(20)。ウイルスあたり約１００個のスパイクと仮定すると、全てのスパイクが開放的コンフォメーションである場合、それは、血液１ｍＬあたり約１００，０００個の可能性のあるＡＣＥ２結合部位に相当する。しかし、開放的コンフォメーションがＴＭＰＲＳＳ２切断後にのみ生じることを考慮すると、各スパイクの開始位置は閉じていると仮定しなければならず、おそらくこれら約１００，０００部位の一部のみが、所与の時点でＡＣＥ２又は中和抗体結合に曝露される。したがって、約１９３～４７８ｐＭの可溶性ＡＣＥ２濃度は、１．６×１０^１４～２．９×１０^１４分子／ｍＬに相当し、これは、開放的コンフォメーションのスパイクタンパク質に対するＡＣＥ２の約７２０ｐＭ～１．２ｎＭのＫｄと結びつけると、SARS-CoV-2が、血液中でＡＣＥ２によってその「開放的」スパイクが閉塞された状態で主に存在することを示唆する。ＡＣＥ２は、わずか１１０～１３０ｐＭのＫｄで特定のSARS-CoV-2ＲＢＤ変異体に結合すると予測され、重要なことに、完全に「開放的」コンフォメーションの場合、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、この同じ結合部位に競合する中和抗体と同等の結合親和性を示す(25; 26)。これは、ＡＣＥ２がこの部位への中和抗体結合を妨げる能力を考慮すると特に厄介であり、そして中和抗体はＢ細胞成熟の産物であり、そのため、Ｂ細胞は、ＡＣＥ２スパイク結合に匹敵する強度の一桁のナノモル又はピコモルの結合親和性に到達するために、抗体及びＢＣＲを成熟させなければならない。

実際、SARS-CoV-2は、潜在的に中和抗体に匹敵するＡＣＥ２への結合親和性を有し、これは、この明細書で提供する結果に従う。本明細書で実証するように、ＡＣＥ２は、SARS-CoV-2スパイクＲＢＤへの抗体結合及びin vitroでのＡＣＥ２発現細胞におけるSARS-CoV-2偽型レンチウイルス感染の強力な阻害剤としての機能を、著しく破棄する。まとめると、これらのデータは、ＡＣＥ２が、感染に対する防御機能及びウイルスの免疫認識における阻害機能の両者を果たし、スパイクタンパク質に対する中和抗体認識の競合的阻害剤として作用し、結合親和性は、約６７６ｐＭ～約３３．９７ｎＭの範囲であることを示す(1)。

実施例において実証されるように、SARS-CoV-2スパイクの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、約３ｎＭの親和性でＡＣＥ２に結合し、ＡＣＥ２は、本来であれば約６ｎＭの結合親和性を有する中和抗体とＲＢＤとの会合を防止できた。要するに、「開放的」コンフォメーションのスパイクタンパク質へのＡＣＥ２結合は、中和抗体形成を阻害し、スパイクタンパク質ＲＢＤに対して結合するための、生理学的ＡＣＥ２濃度で活性可能な機構であり、ウイルスは、結果として、中和抗体による検出を回避するための複数の機構を有する。

最新のスパイクタンパク質変異であるＤ６１４Ｇは、元の配列と比較した表面上の「開放的」スパイクタンパク質の密度、及び全体的なスパイクの密度を更に増加させ、これにより、顕著に、この変異体を、感染性も増加させながら、アスパラギン酸（Ｄ）を含有するバリアントと比較して中和抗体に対してより感受性にするようである(9; 23)。実際、Ｄ６１４Ｇバリアントは、SARS-CoV-2偽型レンチウイルス感染アッセイで、ＡＣＥ２発現細胞において＞１／２ｌｏｇ^１０（約３倍）増加した感染性を示すようである(11)。

SARS-CoV-2及びＣＯＶＩＤ１９が世界に大損害を与え続けているため、中和抗体認識又は「開放的」コンフォメーションにおけるスパイクタンパク質の認識を回避することによって、さまざまな変異体の出現及び「免疫クローキング」に対する感受性を監視することが重要であろう。

ＩＶ．スキャフォールド／ペプチド及びそれらを含む組成物の用途
本明細書は、１つ以上のスキャフォールドを含む組成物、１つ以上のスキャフォールドを含むコンジュゲート又は１つ以上のスキャフォールドを含む融合タンパク質も開示する。一部の態様では、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む。一部の態様では、組成物は、注射用、吸入用、経口、経鼻、局所、経皮、子宮内、滑沢性、油性、キャンディ、グミ、並びに／又は膣内及び直腸内剤形に製剤化され得る。一部の態様では、組成物は、非経口、経口、肺、頬、鼻、経皮、直腸、膣、カテーテル、尿道又は眼の経路によって対象に投与される。

本明細書で開示するように、スキャフォールドは、例えば、ポリ（アルギニン）、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（グルタミン酸）又はポリ（アスパラギン酸）を含む２～１５０アミノ酸残基の極性頭部又は極性尾部をＮ末端又はＣ末端に付加することによって、並びに非天然アミノ酸及び他のポリマー種、例えば糖ペプチド、多糖類、直鎖状ポリマー及び分枝ポリマーなどを付加することによって改変できる。本開示のスキャフォールドとの使用に適し得る非天然アミノ酸及び他のポリマー種の例としては、本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第62/889,496号に記載のポリマー性分子が挙げられる。また、組換え膜融合ドメインを、リンカーを介してスキャフォールドに付加してもよい。したがって、スキャフォールドを静電ナノ粒子に組み立てることができる。さらに、スキャフォールドは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のためにチップ上に固定されてもよい。スキャフォールドは、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲベースの技術、合成及び天然／組換え誘導送達系の両者の一部としての小分子、遺伝子及びタンパク質ベースのペイロード等さまざまな治療薬の標的送達のためのリガンドとして機能できる。スキャフォールドは、合成又は組換えのいずれかであり得、膜融合又は送達基質融合を更に増強するために、リンカー及びＮ末端又はＣ末端への合成又は組換え修飾を含むことができる。任意に、標的送達は、ナノ粒子ベースであってもよい。同様に、当該技術分野で公知のさまざまなタグ（例．Ｈｉｓタグ及びＣタグ）をスキャフォールドに付加できる。

また、本明細書に開示されているように、スキャフォールドは、既存のペプチドコンジュゲート技術を使用して、コンジュゲート可能なドメインの結合を可能にするループを含んでもよい。一部の態様では、この明細書で開示するスキャフォールドは、バイオコンジュゲーションにおいて一般的に使用され、かつ、Ｃｙｓ残基内の反応性基であるチオールと反応するマレイミドを介してコンジュゲートされ得る。マレイミドを使用して、以下に示すように、この明細書で開示するスキャフォールドをＳＨ含有表面に結合させてもよい：

この明細書で開示するスキャフォールドは、１つ以上の免疫エピトープを含んでいてもよい。さらに、この明細書で開示する１つ以上のスキャフォールドを、リンカー又は他のコンジュゲート可能なドメインを介してコンジュゲートさせて、マルチエピトープ、多価スキャフォールドを得てもよい。さらに、この明細書で開示するスキャフォールドを、他の免疫応答誘発ドメイン又は断片に結合させてもよい。一部の態様では、この明細書で開示するスキャフォールドの１つ以上をＦｃ断片に結合させて融合タンパク質を形成してもよい。

この明細書で開示するＡＣＥ－２スキャフォールド及びCoV-2スキャフォールドが、ウイルス侵入を遮断又は阻害するための「コーティング」として組成物中で使用できる。一部の態様では、ＡＣＥ－２スキャフォールドは、CoV-2ウイルスのＲＢＤに結合してウイルスをコーティングし、それによってヒト体内へのウイルス侵入を阻止できる。一部の態様では、CoV-2スキャフォールドは、ＡＣＥ２結合ドメインに結合してＡＣＥ２受容体をコーティングし、それによってヒト体内へのウイルス侵入を阻止できる。

この明細書で開示するスキャフォールドは、アミノ酸残基数が１００未満（例．約７０以下）で、かつ、１）Ｔ細胞受容体ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩローディングのための免疫エピトープ領域、２）Ｂ細胞受容体又は抗体結合のための免疫エピトープ領域、及び ３）ＡＣＥ２受容体結合領域を含む低分子のペプチドである。これらの合成又は組換えスキャフォールドは、SARS-CoV-2ウイルスによるＡＣＥ２結合の競合阻害剤として機能するだけでなく、免疫学習を誘発し、さまざまな免疫学的に活性なスキャフォールド及びアジュバント上に提示されることができるように設計されている。加えて、これらのスキャフォールドは、さまざまな免疫アジュバント並びに多価ディスプレイのための既知の及び新規の基質に容易にコンジュゲートできる。これらのスキャフォールドはまた、細菌、真菌、原虫、アメーバ、寄生虫、ウイルス、性感染症等のさまざまな感染性疾患を引き起こす因子のために使用されてもよい。

さらに、開示された技術は、サイレンシングＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ及び他の遺伝子編集ベースの技術、並びにウイルス感染細胞に向けた小分子剤を含む種々の治療剤の標的送達を可能にする。例えば、この明細書で開示するスキャフォールドは、治療設計及び開発におけるナノ粒子ベースのｓｉＲＮＡ送達及び小分子コンジュゲートアプローチのためのリガンドとして機能し得る。さらに、免疫エピトープを含むスキャフォールドは、ＩＥＤＢ免疫エピトープ予測アプローチに加えて、中和抗体を伴うSARS-CoV-1の結晶構造データに基づいて、SARS-CoV-2タンパク質全体の最も遠位のループ構造についての予測された抗体結合領域によって決定されるＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩローディングを介した抗体及びＴ細胞受容体による免疫エピトープ認識のための鍵となる残基を提示することもできる。

ＲＢＤに対する中和抗体への結合により、この明細書で開示するスキャフォールドは、SARS-CoV-2を鈍化させるのではなく、SARS-CoV-2に対する免疫応答を増強することも期待される。対照的に、ＡＣＥ２模倣療法及び抗体療法などのアプローチは、ウイルスをコーティングし、かつ、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）が「開放的」コンフォメーションのスパイクタンパク質ＲＢＤを標的とする中和抗体に成熟するために必要なスパイクタンパク質の同じセグメントである、結合される部分への適応免疫系の結合を防止するため、ウイルスに対する中和抗体応答を低減する可能性がある。

重要なことに、この明細書で開示するスキャフォールドは、酵素のアンジオテンシンＩＩを代謝しない側に結合するため、ＡＣＥ２の活性を妨げるとは考えられていない。ワクチンの設計及び免疫応答の促進に重要なことに、これらのペプチドはまた、ペプチド配列内に抗体結合エピトープを含むことに加えて、さまざまな患者集団のハプロタイプにカスタマイズできる、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩ認識のためのモジュール式エピトープを有するように設計されている。有望なことに、回復したCOVID-19患者は、保存された一連のエピトープに対する顕性ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を形成し、６つのＨＬＡタイプにわたる２４人のスクリーニングされた患者の９４％は、１つ以上の顕性エピトープに対するＴ細胞応答を示し、患者の５３％は、３つ全ての顕性エピトープに対する応答を示す(5; 27)。さらに、以前の研究は、さまざまなＨＬＡ遺伝子型の患者がさまざまなSARS-CoV-2エピトープに対してＭＨＣ－Ｉ媒介性応答をすることを実証しており、これはバイオインフォマティクスアプローチで予測できる(10)。さまざまなＨＬＡ遺伝子型に対応するＭＨＣローディングのバイオインフォマティクス予測は、どのペプチド配列がローディングされるか又はローディングされないかを予測的に明らかにしないが、実証的検証のための可能な状態空間の包括的な全体像を作成する。この明細書で開示するスキャフォールドは、選択的ＴＣＲレパートリーのクローン性拡大をプライミングするためのモジュラーモチーフを提示するように設計されており、これは、回収された患者ＴＣＲレパートリーの配列決定及びスキャフォールドへのその挿入、並びに標的集団のＨＬＡ遺伝子型の評価によって促進され得る(28)。これは、迅速なワクチン及び解毒剤設計のための促進化方法を提供し、バイオインフォマティクスを構造及び患者由来のオミックスデータと結びつけて、感染性因子を処理するための反復的設計アプローチを作成する。

in vitro研究は、抗体認識及び有効なウイルス遮断のための原理を提供する。スキャフォールドの合成的性質は、本願の実施例では裸のアルキン末端ペプチドが検討されているが、クリックケミストリーを介してこれらのペプチドをさまざまな基質－限定さるものではないが、Ｃ６０バックミンスターフラーレン、単層及び多層カーボンナノチューブ、デンドリマー、ＫＬＨ、ＯＶＡ及びＢＳＡといった従来のワクチン基質、及び同様のものが含まれる－につなぎとめるのに有用性である。合成的性質、in silicoスクリーニング及びこれらのペプチドの正確なコンフォメーションは、組換え、弱毒化、遺伝子送達系、ウイルスベクター又は不活性化ウイルスワクチンアプローチの従来の制限のない迅速な合成を可能にする。これらのペプチドはクリックケミストリーの性質を有するため、静電配列による修飾、又は脂質粒子へのクリックケミストリー若しくは膜融合による薬物及び遺伝子送達担体としても機能し得る。この明細書で開示するスキャフォールド及びこれらのペプチドの将来的順列を含む、この明細書で提供する組成物は、より広範な生体防御イニシアチブの一部として、さまざまな感染性因子に対する精密な治療剤及びワクチンの設計、開発及びスケールアップを促進するために使用され得る。ペプチドは合成である必要はなく、任意に、組換えバリアント又は組換えタンパク質と、合成ペプチド、ポリマー、ペプチド、糖タンパク質、多糖類、リポペプチド及びリポ糖からなる群から選択される部分との融合体を含んでもよい。

この明細書で開示するスキャフォールドは、抗体療法、ＡＣＥ２－Ｆｃ療法及び他の抗ウイルス療法に関連する多くの制限を克服するように設計される。中和抗体は、疾患の進行を防止するための「ストップギャップ」治療薬として用い得るが、投与される抗体の一過性の性質は、生物を再感染の影響を受けやすいままにする。さらに、実施例で示されるように、ＡＣＥ２は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質受容体結合ドメインに結合する中和抗体の強力な阻害剤である。ＡＣＥ２を模倣し、この重要なエピトープを遮蔽する治療薬は、抗体の形成をオフターゲット部位に偏らせる可能性があり、このことは、抗体依存性増強（ＡＤＥ）、ワクチン関連の呼吸窮迫増強（ＶＡＥＲＤ）、及びウイルスチャレンジを繰り返す際の宿主の他の免疫学的問題に寄与し得る。これらの重要な事項は、SARS-CoV-1を有するワクチン接種動物において呼吸器疾患が増強された前例があるため(29)、ワクチン開発において考慮することがまた重要である。SARS-CoV-1では、感染後６年の患者において、末梢メモリーＢ細胞応答の顕著な欠如が認められた(30)。したがって、独立して又は別のワクチンアプローチ若しくは感染と併せて、特異的かつ中和的な免疫応答を促進する任意のアプローチは、免疫抑制剤及び潜在的なオフターゲット抗体形成アプローチの代替手段として考慮されるはずである。

特に、限定されるものではないが、「開放的」コンフォメーションと「閉鎖的」コンフォメーションとの間のスパイクタンパク質のスイッチング、アクセス可能な領域を制限する多大なグリコシル化、並びに、感染細胞でのＭＨＣ下方調節及びＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を制限するSARS-COV-2スパイクタンパク質の潜在的なＭＨＣ－ＩＩ結合によるＴ細胞回避の存在といった、感染患者におけるＴ細胞枯渇及び無効、並びに／又は、一過性の抗体及びメモリーＢ細胞応答に寄与する要因になり得るメカニズムによるウイルスの免疫回避技術のため、内因性の抗体形成を制限する可能性があるアプローチは、慎重に再検討されるべきである。理想的な治療ストラテジーは、ウイルスが細胞に侵入して複製するのを防ぎながら、中和抗体の形成を、鈍らせるのではなく、増強するはずである(31; 32; 33; 34)。実際、重症及び危篤の患者は、極端なＢ細胞活性化及びおそらく抗体応答を示す。しかし、不良な臨床転帰が見られ、免疫回避及び／又はオフターゲット抗体形成が顕性であることが示唆される(35; 36)。

この現象に寄与するさまざまな要因が個々に果たす程度は、依然としてあまり理解されていない。確かにCOVID19は、それ自体、有害作用の連鎖を伴う多因子疾患として現れている。また、さまざまな疾患重症度のコホートにわたる再感染の可能性は、完全には解明されていないが、多数の臨床的及び事例報告は、コロナウイルスに対する免疫が著しく短期間であり、α及びβコロナウイルスによる再感染の感受性の季節的変動が頻繁に観察され、一部の抗体応答は、３ヶ月より長く持続しないことを示している(37)。

特にSARS-CoV-2では、中等度の抗体応答を発現する患者は、わずか５０日で抗体が検出不能になるようである(38)。さらに、収集された１４９個体についての研究では、試験参加者の３３％が症状発現後３９日で検出可能な中和抗体を生成しなかったこと、及びコホートの大部分が高い中和抗体活性を有していなかったことが報告された(39)。

重要なことに、本明細書で提供する結果は、この明細書が開示するスキャフォールドが、抗体形成のための鍵となるエピトープの存在、並びにこれらの実験における１つのＭＨＣ－Ｉエピトープ及び１つのＭＨＣ－ＩＩエピトープを示すスキャフォールド＃８（配列番号７９）の性能により、治療剤及びワクチンとして使用され得ることを示す。ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩドメインは、さまざまな集団におけるＨＬＡタイプと一致するように柔軟に置換されてもよく、又は複数のドメインを示すペプチドのパネルにわたってプールされてもよい。開示したスキャフォールドは、ウイルスに結合するのではなく、ウイルスを模倣するものであり、またＡＣＥ２がウイルスのスパイクタンパク質をクローキングすることから外す能力もあるため、この明細書で提供する組成物は、感染した患者において有効な免疫亢進戦略であり、予防ワクチンとして機能する更なる可能性を有することが証明され得る。

したがって、この明細書で開示するスキャフォールド及びそれを含む組成物は、ＡＣＥ２とのウイルス会合及び感染を防止するために使用でき、一方で、ウイルスの可溶性ＡＣＥ２遮蔽の減少にも寄与する。この明細書で提供するスキャフォールド（約１μＭのＫ_Ｄ）に対する抗体とウイルスとの熱力学的に有利な相互作用（ここで試験される中和抗体との約６ｎＭのＫ_Ｄ）は、感染中にスキャフォールドがＡＣＥ２を解離し、ウイルスに対する抗体形成を促進し、ウイルスを排除するために免疫系を優先的に訓練できることを示唆する。

実施例１ SARS-CoV-2スパイク（Ｓ）タンパク質の構造データを使用しないシミュレーション及びドッキング
この実施例は、SARS-CoV-2の原子分解能構造を決定する結晶学的データ又はクライオＥＭデータが存在しない場合、及びCoV-2ウイルスのＡＣＥ２受容体への結合溝に関するデータが存在しない場合に、SARS-CoV-2スパイクタンパク質配列（UniProt ID P0DTC2）及びSARS-CoV-1（PDB ID 6CS2）とのその相同性に基づくSWISS-MODELを使用して、新規ウイルスSARS-CoV-2の構造シミュレーションを構築することを実証する。

構造データを使用せずにCoV-2受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の結合モチーフを解明するために、ＡＣＥ２を伴うSARS-CoV-1に対する以前の結晶学的実験の結果に依拠した。2020年2月にクライオＥＭ又はＸ線結晶学データが利用可能になる前に、SARS-CoV-2スパイクタンパク質構造を作成するために、SWISS-MODELを使用した(20-23)。

SARS-CoV-2スパイクタンパク質構造を、PyMOL（The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.3.5 Schroedinger, LLC.）を使用して、ＡＣＥ２に結合したSARS-CoV-1スパイクタンパク質（PDB ID 6CS2）とアラインメントさせた。次いで、この構造を、ＰＤＢｅＰＩＳＡで実行させて、ギブスの自由エネルギー（ΔＧ）を決定し、SARS-CoV-2スパイクタンパク質とＡＣＥ２受容体との間のアミノ酸相互作用を予測した(10)。またPyMOLを使用して、その天然コンフォメーションにおけるSARS-CoV-1の切断配列（位置３２２～５１５）を、SARS-CoV-2 Ｓタンパク質（位置３３６～５３１）に対するＡＣＥ２受容体とアラインメントさせ、SARS-CoV-2 Ｓタンパク質とＡＣＥ２とのシミュレートされた結合ポケットの熱力学的ΔＧ計算を、ＰＤＢｅＰＩＳＡを利用して行った。構造データが利用可能になった際に、このアプローチを比較し、実施例４に詳述するように、ＡＣＥ２への結合に必要なアミノ酸のストレッチが正しく特定されたと判断した。

図１に示すように、SARSコロナウイルス（SARS-CoV；SARS-CoV-1又はCoV-1）タンパク質配列（PDB ID 6CS2）を、SARS-CoV-2 Ｓタンパク質配列（以下、「CoV-2」；配列番号２、配列番号１に示されるヌクレオチド２１５３６～２５３５７によりコードされる）と比較し、SWISS-MODELを用いて相同モデルを生成し、ＰＤＢファイルとしてPyMOLにインポートした。

CoV-2の鎖Ａを、ＡＣＥ２受容体へ結合させた状態で、SARS-CoV-1（PDB ID6 CS2）の鎖Ａとアラインメントさせた（図９Ａ～９Ｃ参照）。ＰＤＢ－ＰＩＳＡを、CoV-2 Ｓタンパク質とＡＣＥ２受容体との結合界面に対して実行して、重要な結合残基を決定した。図１０Ａ及び１０Ｂは、それぞれ、CoV-2及びCoV-1の結合界面上の各残基についてのΔＧの計算結果を示す。図１１Ａ～１１Ｃに示すように、ＡＣＥ２に結合するためのCoV-2 Ｓタンパク質の鍵となる残基（負のＧ）は緑色で強調表示し、ΔＧが約０の残基は黄色で示し、正のＧの反発性残基はオレンジ色で示す。マゼンタ色で示されるＬ４５５及びＰ４９１は、コンピュータモデルに基づくと近接している。したがって、Ｃｙｓ残基によって置きかえ、これら２つの位置の間にジスルフィド結合を導入して、CoV-2結合界面におけるβシート構造を安定化させ得る。

実施例２ Ｓタンパク質受容体結合モチーフを模倣する合成ペプチドスキャフォールドの設計及びシミュレーション
SARS-CoV-2 Ｓタンパク質ＲＢＤの構造及び結合のシミュレーションに続いて、切断型の受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）を含むペプチドスキャフォールドを設計した。この配列は、βシート形成を容易にするために実施された鍵となる修飾を用いて、このモチーフにおける大型タンパク質の構造を再現するように設計した。さまざまな深層学習ベースのアプローチを使用して、ペプチドスキャフォールドの構造をシミュレートした。例えば、SUMMITスーパーコンピュータベースのモデリング手法を用いて、推定されるスキャフォールドの結合をシミュレートできる。さらに、ＰＤＢｅＰＩＳＡとProdigyを組み合わせたアプローチを、結合溝相互作用を評価するために、スーパーコンピュータのヒューリスティクに加えることができる。モデリング技術はまた、スーパーコンピュータの分子動力学シミュレーションが事前のバイアスアラインメント無しで予測できるような構成要素としてＣＤ１４７－ＳＰＩＫＥ相互作用を含むことができる。さらに、スーパーコンピュータの使用の有無によるモデリングは、RaptorX（又はAlphaFold若しくは同等物）の使用と組み合わせて、ランダムペプチド配列の自由エネルギーフォールディング状態をモデリングできる。これにより、スーパーコンピュータを使用し、次いで標的受容体上で分子動力学シミュレーションを実行する、ランダムペプチド配列のコンビナトリアルスクリーニングが可能になる。これらのフォールディング技術は、ペプチドの自由エネルギー、及び、より大きなタンパク質とは異なる自由エネルギーを有する、より小さな切断タンパク質断片の可能性のあるフォールディング状態の全色域を考慮しない相同モデリングとは独特に区別される。この明細書で提供するアプローチは、後にフォールディング及び結合状態でシミュレートされるde novoペプチド配列の生成を可能にする。

例示のために、修飾有り又は無しのペプチドスキャフォールドを、強力な深層学習技術(19)に基づいて、効率的かつ正確なタンパク質構造予測ソフトウェアパッケージであるRaptorXを使用してシミュレートした。配列を与え、RaptorXを使用して相同性検索ツールＨＨｂｌｉｔｓを実行して、その配列ホモログを見つけ、複数配列アラインメント（ＭＳＡ）を構築し、次いで、配列プロファイル及び残基間共進化情報を導出する(13)。その後、RaptorXを使用して、配列プロファイル及び共進化情報を、（約１００畳み込み層の）非常に深い畳み込み残差ニューラルネットワークに送り、予測下でのタンパク質の原子間距離（つまり、Ｃａ－Ｃａ、Ｃｂ－Ｃｂ及びＮ－Ｏ距離）及び残基間配向分布（inter-residue orientation distribution）を予測する。原子間距離分布を予測するために、RaptorXは、２つの原子間のユークリッド距離を、０－２、２－２．４、２．４－２．８、２．８－３．２・・・１９．６－２０、及び２０超Ａの４７間隔に離散化する。残基間配向分布を予測するために、RaptorXは、以前(13)に定義された配向角度を１０度のビンに離散化する。最後に、RaptorXは、予測される分布から距離と配向のポテンシャルを導き出し、ポテンシャルを最小限に抑えることによってタンパク質の３Ｄモデルを構築する。実験的検証は、そのような深層学習技術が、ＰＤＢにおいて予測中のタンパク質が非常に密接なホモログを有する場合を除き、これまで以上に多くのタンパク質の正しいフォールディングを予測でき、比較モデリングの性能を上回ることを示す。

この明細書で開示するスキャフォールドをRaptorXで分析して、それらの可能なフォールディング状態を得た。図１２Ａ～１２Ｊは、アミノ酸配列：ＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶ（配列番号７２）を有するスキャフォールド＃１の可能なフォールディング（PyMOLが示す中心０から中心９のコンフォメーション）を示す。

その１０個の可能なフォールディング状態の各スキャフォールドを、PyMOLアラインコマンドを使用してＡＣＥ２にドッキングさせたCoV-2 ＲＢＤと重ね合わせ、結合を近似させた。図１３Ａ～１３Ｄは、ＡＣＥ２に結合するスキャフォールド＃９のさまざまなコンフォメーションを示す。スキャフォールド＃９は、アミノ酸配列：ＥＥＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＣＧＳＧＳＧＱＡＧＳＴＰＧＮＧＶＥＧＦＮＧＹＦＣＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＲＲＲ（配列番号８０）を有する。

実施例３ ＡＣＥ２結合ドメインを模倣する合成ペプチドスキャフォールドの設計及びシミュレーション
ＡＣＥ２の結合界面を、実施例２で開示したのと同様の方法で調査した。ＡＣＥ２（配列番号１４０）の位置１９～８４からのアミノ酸配列のストレッチは、CoV-2 Ｓタンパク質への結合に関与しているように見えた。重要な結合残基としては、図１４Ａ～１４Ｄに緑色で示されるＳ１９、Ｑ２４、Ｄ３８、Ｑ４２、Ｅ７５、Ｑ７６及びＹ８３が挙げられる。この分析に基づき、アミノ酸配列

を有するＡＣＥ２スキャフォールド１を合成した（ＧＳリンカーは、斜体とし下線を付している）。ＡＣＥ２スキャフォールド１は、２つの重要な結合モチーフ：
ＳＴＩＥＥＱＡＫＴＦＬＤＫＦＮＨＥＡＥＤＬＦＹＱ（配列番号１４９）（位置１９～４２）及びＮＡＧＤＫＷＳＡＦＬＫＥＱＳＴＬＡＱＭＹＰ（配列番号１５０）（位置６４～８４）を有するようである。図１５Ａは、ＡＣＥ２タンパク質から切断されたＡＣＥ２スキャフォールド１のコンピュータモデリングを示し、図１５Ｂ～１５Ｃは、CoV-2 Ｓタンパク質に結合したＡＣＥ２スキャフォールド１のシミュレーションを示す。

実施例４ クライオＥＭ構造とシミュレートされた構造の比較
実施例１に開示したコンピュータでシミュレートした結合モデルを、他の研究者が決定し、公開しているCoV-2 Ｓタンパク質の実際のクライオＥＭ溶液構造（例．22; Veesler Lab, Univ. of Washington (faculty.washington.edu/dveesler/publications/）と比較した（図１６Ａ～１６Ｂ）。結合界面は、ＡＣＥ２との結合に関与するアミノ酸残基のストレッチに関してほぼ一致しており、正確には重要なアミノ酸にいくつかの隔たりがあることが判明した。驚くべきことに、他の研究者によって公表されたクライオＥＭ構造は、コンピュータモデリングによって特定されたこれらの重要な結合残基を欠いていた（図１７Ａ～１７Ｂ）。公開された構造は残基４４４～５０２を含まず、したがって位置４３７～４５３及び位置４７３～５０７の重要な結合モチーフを欠いていた。

この実施例は、相同結合スキャフォールドに基づくタンパク質結合界面のシミュレーションが、結合スキャフォールド、阻害剤を迅速に設計し、薬物発見を補助するための有効な手段であることを示唆する。

実施例５ CoV-2スキャフォールドの作製
この実施例は、CoV-2スキャフォールドの設計及び製造を例示する。

SARS-CoV-2 Ｓタンパク質のシミュレーション及びそのＡＣＥ２結合領域の決定 SWISS-MODELを使用して、SARS-CoV-1（PDB ID 6CS2）と比較したCoV-2ウイルスの構造シミュレーションを生成した。次に、PyMOLを使用して、その天然のコンフォメーションにおけるSARS-CoV-1（位置３２２～５１５）の切断配列を、SARS-CoV-2（位置３３６～５３１）のＡＣＥ２受容体とアラインメントさせた。

最小界面配列のマッピング SARS-CoV-2 Ｓタンパク質とＡＣＥ２とのシミュレートされた結合ポケットの熱力学的ΔＧ計算を、ＰＤＢｅＰＩＳＡを利用して行い、ＡＣＥ２と結合するCoV-2スキャフォールド及びスキャフォールド中の重要な結合残基を決定した。

免疫エピトープのマッピング スパイク糖タンパク質の配列全体、及び以前に定義されたSARS-CoV-1免疫原性部位のストレッチを、SARS-CoV-2上の類似部位と比較した。ＩＥＤＢを、推奨２．２２抗原性スコアリングに使用して、SARS-CoV-2の相同部位が免疫原性であるかどうかを決定した。

切断CoV-2スキャフォールドのシミュレート SWISS-MODEL及び追加の深層学習駆動タンパク質シミュレーションアプローチを使用して、新規スキャフォールドの構造シミュレーションを実施した。スキャフォールドに、リンカーの付加、SARS-CoV-2糖タンパク質の最も近位のＡＣＥ２界面断片の非ＡＣＥ２結合領域及び非抗体結合領域の置きかえといったさまざまな修飾を行い、抗体結合領域を組み込んだ。これらのドメインは可変であり、既知の及び予測される免疫原性部位の全体的なスクリーニングを包含するように並行して作製できる。

ペプチド合成 ペプチドスキャフォールド配列を設計し、自社で、又はｓｂ－ＰＥＰＴＩＤＥ（フランス）などの商業的プロバイダーによってカスタム合成した。質量分析を使用して、適切なペプチド分子量を確認した。

標的化リガンドを自社で製造した場合の方法と材料は以下のとおりであった。ペプチドを、標準的なＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＰ）を用いて、カスタム作製ペプチドロボットを使用して合成し、９アミノ酸配列のアミノ酸カップリングにつき約１２０秒で行った。従前は、３０～５０アミノ酸のペプチドが２時間ほどで合成された（図１８）。合成は、好適な手段によって行い得る。例えば、ペプチドロボットの代替として、酵母を使用してタンパク質を合成してもよい。ペプチドをＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂上で合成した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でO-(1H-6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）カップリング試薬及びN-メチルモルホリン（ＮＭＭ）を用いてアミノ酸カップリングを行った。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び水でペプチドの脱保護及び切断を行った。粗製ペプチド混合物を逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）で精製した。純粋なペプチド画分を冷凍し、凍結乾燥して、精製ペプチドを得た。

実施例６ CoV-2スキャフォールドの環化
この実施例は、CoV-2スキャフォールドの頭部－尾部型環化のさまざまな戦略、例えば（１）アミドカップリングによる溶液中の側鎖保護ペプチドの頭部－尾部型環化（図１９Ａ）、（２）アミドカップリングによる樹脂上での頭部－尾部型環化（図１９Ｂ）、及び（３）ＮＣＬによる精製した直鎖状チオエステルペプチドの環化（図１９Ｃ）を例示する。戦略（１）について、合成は、全般的に脱保護された、ＨＰＬＣ純度約３０％のペプチドで完了した。戦略（２）については、合成を完了し、脱アリル化及び全般的脱保護の後で、ＨＰＬＣ純度は約２５％であった。戦略（３）について、マイクロ波合成は、約２０％の、Ｏ－アリル保護基を伴って得られた粗生成物で完了した。樹脂での脱アリル化後、環化をＰｙＢＯＰ／ＤＩＰＥＡで１６時間試みた。所望の生成物質量は観察されなかったが、チオエステル化が次の工程である。

実施例７ CoV-2スキャフォールドのバイオレイヤー干渉分光法
バイオレイヤー干渉分光法（ＢＬＩ）は、２つ以上の分析物間の結合を直接的に調べる。この実施例では、ＢＬＩを使用してCoV-2スキャフォールドのin vitro分析を実施して、二量体ＡＣＥ２と関連付けられたスキャフォールドの解離定数、及びＡＣＥ２の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）への結合に対するスキャフォールドの阻害効果を決定することによって、結合動態を特徴付けた。また、ＢＬＩを使用して、ＩｇＧ中和抗体（ＮＡｂ）に関連するスキャフォールドの解離定数を決定した。

Octet（登録商標）RED384バイオレイヤー干渉計（Fortebio）を、９６ウェルプレート中の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＡＣＨ）、ストレプトアビジン（ＳＡ）、ニッケル帯電トリス－ニトリロ酢酸（ＮＴＡ）、又は抗ペンタ－ｈｉｓ（ＨＩＳ１Ｋ）を示すセンサーチップと共に使用した。ストレプトアビジンチップについては、１ｍＭのビオチンを用いて、所与の固定化リガンドで飽和後の表面を遮断した。ＡＣＥ２及びＲＢＤのＨｉｓタグ付きバリアントとビオチンタグ付きバリアントを用いたプロトコル最適化の後、溶液中のスキャフォールド分析物は、ＮＴＡ及びＨＩＳ１Ｋチップを用いたセンサー先端表面への非特異的結合を示したが、ビオチン化表面は、この非特異的結合を最小化した。さらに、ＡＣＥ２－Ｈｉｓ（Sino Biological）及びＲＢＤ－ｈｉｓ（Sino Biological）は、ＨＩＳ１Ｋチップへの結合が極めて弱かった。したがって、二量体ＡＣＥ２ビオチン（ＵＣＳＦ）及びＲＢＤ－ビオチン（ＵＣＳＦ）をＳＡチップに使用し、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する中和モノクローナルＩｇＧ抗体（CR3022, antibodies-online）を全ての試験のＡＨＣチップに使用した。非特異的結合は依然として、ＡＨＣチップ上の中和抗体に結合するスキャフォールド＃８（配列番号７９）で観察され、これは、中和抗体リガンドと比較して、分析物としてのスキャフォールド＃８を使用してＫ_Ｄを決定する試みを複雑にした。全てのストック溶液は、０．２％のＢＳＡ及び０．０２％のTween（登録商標）２０を含有する１× ＰＢＳ中で調製した。以下のリガンド及び分析物を試験した。
１）二量体ＡＣＥ２ビオチンをＳＡチップ上に固定化した（約２．５ｎｍ捕捉）
ａ．スキャフォールド＃４（ペプチド１、配列番号７５）、スキャフォールド＃７（ペプチド４、配列番号７８）、スキャフォールド＃８（ペプチド５、配列番号７９）及びスキャフォールド＃９（ペプチド６、配列番号８０）を加え、１、３及び１０μＭの濃度でＡＣＥ２を固定化した（図２０Ａ～２０Ｄ）。
ｂ．センサーチップをペプチド溶液から取り出し、３５μＭのＲＢＤ－Ｈｉｓ（Sino Biological）に加えた（図２０Ｅ～２０Ｈ）。
２）ＲＢＤ－ビオチンをＳＡチップ上に固定した（約５ｎｍ捕捉）
ａ．ＡＣＥ２－Ｈｉｓ（Sino Biological）を、１．３、３．９、１１．７、３５及び１０５μＭの濃度で固定化ＲＢＤに加えた（図２０Ｉ）。
３）中和ＩｇＧ抗体をＡＨＣチップに固定した（約１ｎｍ捕捉）
ａ．スキャフォールド＃４、スキャフォールド＃７、スキャフォールド＃８及びスキャフォールド＃９を、０．３７、１．１、３．３３及び１０μＭの濃度で固定化ＡＣＥ２に加えた（図２０Ａ～２０Ｄ）。
ｂ．ＲＢＤ－Ｈｉｓ（Sino Biological）を１、３、９、２７及び８１μＭの濃度で固定化中和抗体（CR3022, antibodies-online）に加えた。
ｃ．１１７ｎＭのＲＢＤ－Ｈｉｓ（Sino Biological）を、０（ＲＢＤのみ）、２．８８、８．６３、２５．９及び７７．７μＭの濃度でＡＣＥ２－Ｈｉｓと混合した。次に、固定化中和抗体（CR3022, antibodies-online）を加えた。

ＢＬＩを使用して、二量体ＡＣＥ２に関連する選択されたスキャフォールドの解離定数、及びＡＣＥ２のＲＢＤへの結合に対するスキャフォールドの阻害効果を決定した。図２０Ａ～２０Ｉに示すように、この実験で試験したCoV-2スキャフォールドは、濃度依存的にＡＣＥ２がＳタンパク質ＲＢＤに結合することを防止した。試験した全てのスキャフォールドは、ＡＣＥ２へのＲＢＤ結合を１０μＭの濃度で強力に阻害した。スキャフォールドは、１、３及び１０μＭの濃度で飽和までＡＣＥ２と会合した（図２０Ａ～２０Ｄ）。ＡＣＥ２に結合した後、３５μＭでのSARS-CoV-2 ＲＢＤのＡＣＥ２会合がスキャフォールドの非存在下で測定され（図２０Ｅ～２０Ｈ）、スキャフォールドは生理食塩水＋ＦＢＳ洗浄後も強力な拮抗剤として作用することが示された。興味深いことに、１μＭ及び３μＭでのＡＣＥ２とスキャフォールド＃８との会合はＲＢＤ結合を増強したが、１０μＭの濃度は、結合を強く抑制した（図２０Ｇ）。他の全てのペプチドは、１μＭ及び３μＭの濃度を含め、ＲＢＤ結合の防止において用量反応様の挙動を示した（図２０Ｅ、２０Ｇ及び２０Ｈ）。競合性不可逆的拮抗作用を評価するために、図２０Ｉに示すように、スキャフォールドは３５μＭのＲＢＤの最終溶液に含めなかった。

ＢＬＩを使用して、ＩｇＧ中和抗体に関連する選択されたスキャフォールドの解離定数も決定した。スキャフォールド＃８は、センサー先端への非特異的結合を示し（図２１Ｃ）、中和抗体に対するＫＤの決定を妨げた。センサー表面のビオチン遮断を有するビオチン化基質を利用しなかった全ての試験で、このスキャフォールド＃８との非特異的結合が観察された。しかし、他の全てのスキャフォールドに対する単一マイクロモル結合親和性は、中和抗体を用いて決定された（図２１Ａ、２１Ｂ及び２１Ｄ）。次に、抗ＲＢＤ中和抗体を用いて、濃度を増加させたＲＢＤについて解離定数を測定した（図２１Ｅ）。ＲＢＤに結合する中和抗体についてのＡＣＥ２の阻害を調べるために、１１７ｎＭのＲＢＤを、固定化中和抗体への導入前にＡＣＥ２と混合した（ＡＣＥ２の濃度は増加させる）（図２１Ｆ）。ＲＢＤと中和抗体との間の相互作用を阻害するＡＣＥ２の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、ＲＢＤ濃度が１１７ｎＭであった場合、ＡＣＥ２について約３０～３５ｎＭに挿入された（図２１Ｆ）。これらのデータは、ＡＣＥ２が中和抗体よりもＲＢＤに強力に結合し、可溶性ＡＣＥ２が、SARS-CoV-2スパイクＲＢＤへの中和抗体認識に対して、分画モル濃度でさえ、強力な「遮蔽」として機能できることを示す。この実験で試験したスキャフォールドは全て免疫原性であった。

上述した図で提示するＢＬＩデータを使用して、解離定数（Ｋ_Ｄ）及びＲＭａｘ値（定常状態結合分析）を、１）ＡＣＥ２に結合するスキャフォールド＃４、スキャフォールド＃７、スキャフォールド＃８及びスキャフォールド＃９、２）ＡＣＥ２及びＲＢＤに結合する中和抗体、３）中和抗体に結合するスキャフォールド、並びに ４）濃度を増加させたＡＣＥ２の存在下で中和抗体に結合するＲＢＤについて決定した。Ｋ_Ｄ及びＲＭａｘ値を以下の表２に示す。

表２に提示されるデータは、スキャフォールド４、７、８及び９が、それぞれ、ＡＣＥ２と１．８±１．１μＭ（スキャフォールド＃４）、５．２±１．７μＭ（スキャフォールド＃７）、２．４±１．７μＭ（スキャフォールド＃８）及び２．４±１．７μＭ（スキャフォールド＃９）の解離定数を有し、中和抗体と、４．３±１．０μＭ（スキャフォールド＃４）、５．２±１．７μＭ（スキャフォールド＃７）、不明（スキャフォールド＃８）及び３．３±１．１９μＭ（スキャフォールド＃９）の解離定数を有することを示す。中和抗体に結合するスキャフォールド＃８は、センサーチップとの非特異的相互作用に起因する技術的エラーにより、確定できなかった。ＡＣＥ２とＲＢＤの解離定数は２．３±０．３ｎＭであり、中和抗体とＲＢＤの解離定数は８．６±１．１ｎＭである。これらのデータは、スキャフォールド＃４が、中和抗体及びＡＣＥ２の両者に対し、最も強い親和性を示したことを示す。

実施例８ SARS-CoV-2スパイクタンパク質偽型レンチウイルスによるＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞の感染
ＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞（BPS Bioscience）を、SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質（BPS Bioscience）を示す偽型レンチビリオンで形質導入し、感染の６０時間後にルシフェラーゼ活性及びトリパンブルー毒性について評価した。SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質に対する中和モノクローナルＩｇＧ抗体（CR3022, antibodies-online）、ＡＣＥ２（Sino Biological）、スパイク糖タンパク質（Sino Biological）の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、及び本開示の選択されたスキャフォールドを、感染の阻害剤として使用した。感染は、生物発光を介して定量化し、毒性は、Synergy（商標）H1 BioTek分光光度計を利用したトリパンブルー吸光度アッセイを介して特徴付けた。

図２２に示すように、スキャフォールド＃４及びスキャフォールド＃７は、感染６０時間後のルシフェラーゼ活性によって評価されるように、２０μＭ未満の濃度でのＡＣＥ２－ＨＥＫ２９３細胞のSARS-CoV-2スパイクタンパク質偽型ウイルス感染を遮断しなかった。しかし、スキャフォールド＃８及びスキャフォールド＃９は、共に６．６６μＭでウイルス感染を阻害し、スキャフォールド＃８は、ナノモルの範囲でこの遮断効果を有意に示した（８０ｎＭ及び３０ｎＭ、ｐ＜０．０５、ウイルスのみとのｔ検定比較）。（^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊＊、ｐ＜０．００１；対のないスチューデントｔ検定、３回の実験）。

図２３Ａ～２３Ｄは、０．３３ｕＭでの可溶性ＲＢＤ及び可溶性ＡＣＥ２によるSARS-CoV-2スパイクタンパク質偽型ウイルス感染が事実上完全に阻害され、一方で、SARS-CoV-2中和抗体が、６ｎＭほどの低い濃度で同程度に感染を阻害したことを示す。興味深いことに、１２ｎＭのＲＢＤは感染を増強した。（^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊＊、ｐ＜０．００１；対のないスチューデントｔ検定、３回の実験）。

重要なことに、２０μＭの用量のスキャフォールド＃８が細胞死を引き起こし、溶液中のスキャフォールドの目視可能な凝集を導いたこと、及び１６６ｎＭの中和抗体が細胞生存を増強させたことの例外を除いて、異なる濃度でのスキャフォールド、可溶性ＡＣＥ２、可溶性ＲＢＤ又はSARS-CoV-2中和抗体の添加は、約５０％ウイルスの存在下での細胞生存率に統計学的に有意な変化をもたらさなかった。

したがって、この明細書で開示する新規の合成ペプチドスキャフォールドは、ウイルスが細胞と会合することを遮断することを実証する一方、抗体及びＴ細胞受容体形成のためのエピトープも実証する。この実験は、試験したスキャフォールドが、ＥＣ９５用量で毒性無しでＡＣＥ２発現細胞に感染するSARS-CoV-2スパイクタンパク質を示す偽型レンチウイルスの９５％超の感染を効果的に遮断することを実証し、試験したスキャフォールドが、極めて高いＲＢＤ濃度（３５μＭ）でさえも、SARS-CoV-2受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とＡＣＥ２との会合を防止したことを実証する。試験したスキャフォールドは、３０ｎＭで統計学的に有意なウイルス阻害を有し、マイクロモル未満の範囲でＩＣ５０を示した。

実施例９ 生のウイルスに対するCoV-2スキャフォールドの効果
スキャフォールド＃４、スキャフォールド＃７、スキャフォールド＃８及びスキャフォールド＃９の阻害効果を、ＣａＣｏ２細胞内のウイルスにおいて試験し、続いて毒性試験を行った。Ｖｅｒｏ７６細胞上のエンドポイント希釈によって決定される５０％細胞培養感染性用量（ＣＣＩＤ５０）として示されるSARS-CoV-2に対する試験されたスキャフォールドの抗ウイルス活性、及びＣａｃｏ－２細胞上の中性の赤色色素取り込みによって決定されるスキャフォールドの毒性について、表３を参照されたい。

図２４Ａは、試験したスキャフォールドが、マイクロモルの濃度で生きたウイルスのウイルス負荷の９０％以上を阻害（ＥＣ９０）したことを示す。図２４Ｂは、生SARS-CoV-2ウイルスによるウイルス負荷で最大２．５対数阻害まで毒性が無いことを示す。

実施例１０ スキャフォールドの分子動力学とモデリング
図２５に示すように、分子動力学モデリングを使用して、アミノ酸配列ＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＣＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＧＮＧＶＥＧＦＮＧＹＦＣＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶ（配列番号７５）を有するスキャフォールド＃４のフォールディングをモデル化した。最良のスコアリング構造が溶液中でそれ自体、安定であるかどうか、またどの程度、柔軟性があるかを調べた。ペプチドは、開始点がモデリングから明らかな局所的最小値に近づいていない場合、時々、非常に迅速に再フォールディングできる。ペプチドが短～中程度の時間スケールで安定しているかどうかは、それが全体的に最小値であるかどうかよりも、はるかに容易な問いである。

定性的に、大ループ（ＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥ；配列番号１２８）は、中間のβシートに接触するまで、１ｎｓ未満で、下及び上へフォールディングされた；ＴＮＧ結合ループは、約２０ｎｓで、中央に向かって折りたたまれた；その後、構造は、シミュレーションの残りの間基本的に安定であったが、非常に柔軟であり続けた。結合ループは柔軟性が高く、絶えずアンフォールディング及び再フォールディングされ、動きは５～６Ａ ｒｍｓｄであった。構造の中央はかなり剛性であり、１Ａ ｒｍｓｄ未満であった。フォールディング中のRosettaスコアを図２６に示す。これらのデータは、理想化された構造に対して約２０単位が失われたことを示す。Rosettaは、安定したフォールディングを有する秩序だったタンパク質に最適化された、非全体的な物理エネルギー関数を有するが、ループの畳み込みを駆動する溶媒効果を完全にモデル化していない。特に良好な特異的結合相互作用はなく、無秩序な領域では分析が困難な可能性がある。実行の終わり近くのアニーリング構造は、より良いRosettaスコアを見いだせる可能性がある。

全てのスキャフォールド構造は、複製物で上記工程を実行できる。より長い時間スケールで効率的にサンプリングするための改善を行うことができる。例えば、ＡＭＤは、スクラッチ又はトレーシング結合経路からのフォールディングでさえも分析できるように、単純ＭＤに対して１００倍の有効なスピードアップをもたらすことができる。

ペプチドの設計において、剛性は最も重要な考慮事項の可能性がある。水素結合又は共有結合（例．ステープルペプチド）のいずれかによる架橋鎖は、直ちに結合可能なコンフォメーションのペプチドの有効濃度を増加させ、屈曲によりペプチドの結合が解除される可能性を低くできる。特に表面に露出した領域では、生物学的デザインをより柔軟にするために強い選択圧があり得る。複数のプロリンの追加や、２つのβシートビットを１つの大きなβシートにする方法の決定などにより、柔軟性は後続の設計において考慮される。スキャフォールド＃４、５、６、７、８及び９（それぞれ、配列番号７５～８０）を含むいくつかの代表的なペプチドを使用して、更なる構造解析及び修飾を行った。

スキャフォールドの配列又は一部の配列を、最初に受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）無しで試験し、それが予想される構造を生じさせるかどうかを決定した。最初の試験は、Ｎ末端及びＣ末端にシステイン残基を有し、確実に閉環するスキャフォールド＃８からのループのみの配列ＣＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＱＡＬＬＦＮＫＶＴＬＡＧＦＮＧＹＦＣ（配列番号１２９）、並びに、Ｃ末端に３つのアミノ酸残基（太字及び下線）を付加することにより免疫エピトープよりもわずかに大きく、またループも形成する部分配列

を使用して実行し得る。

図２７に示すように、融合中にのみ曝露されるＳタンパク質の固有のエピトープを調べた。過程が次の中和工程へ移行することを妨げる結合部位も調べ、いくつかの隠れたエピトープを不確定に曝露させた（図２８）。融合中のＳタンパク質のバンドルの立体配置である、ＰＤＢからの配列６ＸＲＡ（SARS-CoV-2スパイクタンパク質の異なる立体構造形状、www.rcsb.org/structure/6XRA）を調べた。配列ＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶ（配列番号７１）を、図２９Ａに示すようにタンパク質構造にフィッティングさせた。図２９Ｂに拡大図を示す。これは、プレバンドルの段階の間のＨＲ１とＨＲ２との間のヒンジにある、図２７～２８で特定される結合部位のうちの１つの位置、つまり図２９Ｂで拡大された結合部位であることが決定された。したがって、スキャフォールド＃８は、ＡＣＥ２から完全に独立した機構を用いて、一部がこの部位に結合しているため、ナノモル濃度で偽型ウイルスの融合／感染を防止することが予測された。この仮説は、スキャフォールド＃８のＡＣＥ２への結合が他のペプチドよりもあまり良くなかったが、非常に低い濃度（ｎＭ）での効果が著しく異なっており、第２の作用機序が示唆される、という結果により支持される。第２の作用機序は、実際のスパイクタンパク質と実際のウイルスでのみ始動する。したがって、おそらくスパイクタンパク質に結合している。この結合ポケットは、バンドル内の他の２つの鎖によって囲まれている。結合ポケットになんとか入ったいずれのペプチドも、おそらく一桁のナノモル以下の濃度の非常に緊密な結合を有している可能性が高く、融合を完全に妨げるであろう。スパイクタンパク質が、その元のフォールディング形態から結合形態に移行するために通過する一連の再配列を決定するために、更なる分析が必要である。複数の経路があり得るが、結合中にこの部位が一時的に開放的であり得るのはそれらの一部のみである。また、６ＸＲＡ構造の小断片が構造全体と競合し得る他の多くの結合部位がある。１０～２０アミノ酸の直鎖状断片ごとのin silico又はin vitroスクリーニングは、より多くの部位を発見し得る。

スキャフォールド＃８自体は、ＲＢＤビットがバルク又は立体障害を提供する以外に何もしないように見えるため、最適である可能性は低いが、おそらく結合をより緩やかにし、ヘアピン構造もより妨害されるものの、概念実証として機能する。ジスルフィド結合を有する配列ＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣ（配列番号７０）を最初に試験し、その後最適化した。

前述のように自己触媒する、遺伝子コード化された環状ペプチドも利用した(16)。選択したエクステインを、インテインスプライシングに必要な１位におけるＣｙｓ又はＳｅｒ残基を有する、図３０で特定された領域に挿入する。配列の一例は、以下のとおりである：

太字の配列は、得られた環状ペプチドであり、残りは、それ自体が環状の６以上のアミノ酸にスプライシングされ、第１のアミノ酸は、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり得る。インテイン－エクステイン融合は、ペプチド又は組換え／合成配列を自己触媒及び自己スプライシングアウト配列と融合させ、２つのペプチド配列間の融合を作製するための機構として使用できる。

実施例１１ スキャフォールド配列の更なる最適化
スキャフォールドを設計するための更なる配列を、最高スコアのコンセンサスに基づいて特定した。スコアは、安定性と結合親和性の組合せであり、親和性を重視した。

ペプチドが非常に高い親和性を有する「スーパー結合剤」として機能するためには、ＡＣＥ２側に突き出してより多くの接触を行う、より長いループを有することが望ましい。目標は、結合親和性を損なうことなく、それ自体によってスキャフォールドの安定性を向上させることである。好ましくは、結合親和性は、同じ結合残基をより良好な位置に突き動かすことによって改善される。

図３１Ａ～３１Ｄに、ペプチド配列をスクリーニング及び最適化する方法を示す。工程１：ＲＬｘｘｘｘｘＱＡの長さ５のループ、約６０，０００回の試行。最初の位置でＦが最も広く優位であった。図３１Ａ。工程２：最初のＦを固定し、この点で、ＹＱＡは、ＱＡよりも次の残基に近いように思われ、したがって、長さ５のループＲＬＦｘｘｘｘｘＹＱＡを、約１５，０００回の試行で構築した。非常に良好なことに、これにより、天然の

ビットが再生された：その実行からの単一の最良の配列は、

であった。図３１Ｂ。工程３：第２の残基の形状は、プロリンとそれほど不適合ではなかったが、ループ構築アルゴリズムはその挿入に困難を有した。プロリンをその位置に固定することを試行した。ＲＬＦＰｘｘｘｘＹＱＡの長さ４のループを、約２２，０００回の試行で構築する。

を含むループ配列のスコアは

と等しかった。

を含むループ配列も同様に良好であった。図３１Ｃ。工程４。ＲＬＦｘｘｘｘｘＩＹＱＡのやや長い５残基のループを、約４１，０００回の試行で構築する。この実行はそれほど終結的ではなかった。スコアリング関数は、全ての位置でＤ又はＥを支持した。これは、ループが溶媒に面しているときに、それらがその主鎖と水素結合を形成できるためであろう。さらに、必ずしも非隣接残基と相互作用しているようではないが、それらは依然としてループを安定化し得る。このバッチからの最良の候補は

であった。図３１Ｄ。

実施例１２ ｓｉＲＮＡ送達のためのスキャフォールドの使用
ｓｉＲＮＡを、ＩＤＴのサイレンシングＲＮＡ設計ツールを使用して、SARS-CoV-2のエンベロープタンパク質のために設計した。エンベロープタンパク質は、配列番号１に示されるヌクレオチド２６，１９１～２６，２８８によってコードされる。以下の配列を利用した。１３．４センス（配列番号１４３）及び１３．４アンチセンス（配列番号１４４）（配列番号１に示されるヌクレオチド２６，２００～２６，２２４に対応）；１３．１０センス（配列番号１４５）及び１３．１０アンチセンス（配列番号１４６（配列番号１に示されるヌクレオチド２６，２３５～２６，２５９に対応）；並びに１３．５センス（配列番号１４７）及び１３．５アンチセンス（配列番号１４８）（配列番号１に示されるヌクレオチド２６，２０７～２６，２３１に対応）。図３３Ａ～３３Ｅに、選択されたセンス鎖及びアンチセンス鎖の位置及び配列を含む、ＩＤＴ ｓｉＲＮＡ設計ツールを使用した設計方法を示す。

修飾有り又は無し、若しくは免疫エピトープ有り又は無しのCoV-2スキャフォールドを、以前に開発された方法に従ってｓｉＲＮＡと混合し、ａ）免疫プライミング活性及びワクチン挙動、並びにｂ）ウイルス複製のためのＲＮＡ挙動のサイレンシングを有する遺伝子ベクターを作製する。米国仮特許出願第62/889,496号を参照されたい。このアプローチは、遺伝子編集、ＲＮＡ編集及びさまざまなウイルスを処理する他のタンパク質ベースのＣａｓツールにも使用できる。

実施例１３ ＡＣＥ２へのCoV-2スキャフォールド結合のコンピュータシミュレーション
この実施例は、ＡＣＥ２に結合するスキャフォールド＃４、スキャフォールド＃７、スキャフォールド＃８及びスキャフォールド＃９のシミュレーションを実証する。

「アライン」コマンドを、ＡＣＥ２に結合したSARS-CoV-1を有するPyMOL（PDB ID 6CS2）で利用して、SWISS-MODELでシミュレートされたSARS-CoV-2（左）の結合界面を近似した。スキャフォールド＃４に含めるために選択されたＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩエピトープ領域は、ピンク色に着色しており、Ｓ１スパイクタンパク質中のＰ８０７～Ｋ８３５及びＡ１０２０～Ｙ１０４７を表す。これをＩＥＤＢ免疫エピトープ分析によって更に精製した。図３４。次に、SARS-CoV-2 Ｓ１スパイクタンパク質の図３４の右側に示すＡＣＥ２（赤色）に結合する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ、青色及びマルチカラー）を、より大きな構造から切断した。得られたＲＢＤ構造を、ＰＤＢｅＰＩＳＡで実行し、相互作用する残基を決定した。右のモデル（図３４）では、緑色の残基は、ＡＣＥ２とＳ１スパイクタンパク質ＲＢＤとの間の予測上の熱力学的に有利な相互作用を示し、一方で、黄色は、予測上の熱力学的に中立の相互作用を示し、オレンジ色は、予測上の熱力学的に不利な相互作用を示す。シアン色の残基は、SARS-BLOCK（商標）ペプチド（Ｖ４３３～Ｖ５１１）を生成するために使用されるアミノ酸の外側境界を示す。予測される結合残基は、その後の経験的に検証された配列と完全に重複しないが、シミュレートされたモチーフに反映されるアミノ酸のストレッチは、結合挙動を正確に反映し、それにより、Ｎ４３９、Ｙ４４９、Ｙ４５３、Ｑ４７４、Ｇ４８５、Ｎ４８７、Ｙ４９５、Ｑ４９８、Ｐ４９９及びＱ５０６は、開示されるＰＤＢｅＰＩＳＡシミュレーションによって、重要なＡＣＥ２界面残基であることが示唆された。他の突然変異誘発研究により、Ｇ４４６、Ｙ４４９、Ｙ４５３、Ｌ４５５、Ｆ４５６、Ｙ４７３、Ａ４７５、Ｇ４７６、Ｅ４８４、Ｆ４８６、Ｎ４８７、Ｙ４８９、Ｆ４９０、Ｑ４９３、Ｇ４９６、Ｑ４９８、Ｔ５００、Ｎ５０１、Ｇ５０２及びＹ５０５が、Ｓ４２５～Ｙ５０８のストレッチ内で結合するために重要であることが決定されている(40)。したがって、ここで示す残基予測は、実際の結合挙動の数個内のアミノ酸まで精密で正確であるとして評価され得、十分な長さのアミノ酸配列が使用されるときに、構造無しで結合タンパク質のストレッチを予測する迅速かつ計算的に最小限の方法を表す。

RaptorXを介してシミュレートしたスキャフォールドを、PyMOLの「アライン」コマンドを使用して、ＡＣＥ２受容体（赤色、ＰＤＢｅＰＩＳＡ予測結合界面を緑色で示す）とアラインメントさせた。左から右（上）へ、スキャフォールド＃４、スキャフォールド＃７、スキャフォールド＃８及びスキャフォールド＃９を示す、図３５を参照。スキャフォールド＃４及びスキャフォールド＃７は、２つの架橋モチーフ置換を有する野生型配列を含んだ。スキャフォールド＃８は、ＭＨＣ－Ｉ及びＭＨＣ－ＩＩエピトープを含み、スキャフォールド＃９は、その非ＡＣＥ２界面ループ領域の１つにＧＳＧＳＧリンカー（白色）を含んだ。各ペプチドについて生成された全ての可能なフォールディング状態（下部にスキャフォールド＃８について示す）を考慮に入れると、これらの単純なアラインコマンドは、各ペプチドの複数の潜在的なコンフォメーションを考慮でき、結合界面で分子内相互作用を緩和させ、シミュレートするためのより高度な分子力学的アプローチを探求する将来の研究の基礎となり得る。多くの可能なフォールディング状態のオーバーレイは、既存の構造を欠くde novoペプチド又はタンパク質－タンパク質界面の結合ポケットをモデル化するために通常必要とされるよりも、はるかに少ない計算リソースでそれらの最小界面自由エネルギーについてシミュレートできる、起こり得る状態の電子分布雲を表す。

以上の記載から、本発明の具体的態様が、例示の目的のために明細書に記載されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、さまざまな修飾がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、本発明は、特許請求の範囲によることを除いて限定されるものではない。

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Claims (46)

1. SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びＡＣＥ２受容体それぞれの結合界面からの切断ペプチド断片を含むスキャフォールドであって、前記スキャフォールドが、天然のSARS-CoV-2スパイクタンパク質又はＡＣＥ２受容体の、構造、コンフォメーション又は結合親和性を実質的に維持している、スキャフォールド。
2. 前記スキャフォールドのサイズが、１０～２００アミノ酸残基、約５０～約１００アミノ酸残基、約５５～約９５アミノ酸残基、約６０～約９０アミノ酸残基、約６５～約８５アミノ酸残基、約７０～約８０アミノ酸残基である、請求項１に記載のスキャフォールド。
3. 前記スキャフォールドのサイズが、約１２０未満のアミノ酸残基、約１１０未満のアミノ酸残基、約１００未満のアミノ酸残基、約９０未満のアミノ酸残基、約８０未満のアミノ酸残基、約７０未満のアミノ酸残基、約６０未満のアミノ酸残基、又は５０未満のアミノ酸残基である、請求項１又は２に記載のスキャフォールド。
4. 前記スキャフォールドが、配列番号２の残基４３３～５１１のアミノ酸配列、又は配列番号１４０の残基１９～８４のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一である、請求項１～３のいずれか一項に記載のスキャフォールド。
5. 前記スキャフォールドが、前記SARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合界面からの切断ペプチド断片を含み、βシート構造を維持しているか、又は、ＡＣＥ２の結合界面からの切断ペプチド断片を含み、αヘリックス構造を維持している、請求項１～４のいずれか一項に記載のスキャフォールド。
6. 前記スキャフォールドが、第１の重要な結合モチーフ、第２の重要な結合モチーフ及びこれらの重要な結合モチーフ間の主鎖領域を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のスキャフォールド。
7. 前記主鎖領域の全配列又は一部分の配列がリンカーによって置きかえられている、請求項６に記載のスキャフォールド。
8. 前記リンカーがＧＳリンカーである、請求項７に記載のスキャフォールド。
9. 前記リンカーのサイズが１～２０アミノ酸残基である、請求項７又は８に記載のスキャフォールド。
10. 前記スキャフォールドが、挿入、欠失又は置換を含む１つ以上の修飾を有し、ここで、前記１つ以上の修飾は前記スキャフォールドとその結合パートナーの結合親和性を実質的に低下させない、請求項１～９のいずれか一項に記載のスキャフォールド。
11. 前記１つ以上の修飾は、前記スキャフォールドとその結合パートナーの前記結合親和性を増加させる、請求項１０に記載のスキャフォールド。
12. 前記スキャフォールドは、その所望の位置にジスルフィド結合が形成されるように１つ以上のＣｙｓ置換を含む、請求項１０又は１１に記載のスキャフォールド。
13. １つ以上の免疫エピトープを更に含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のスキャフォールド。
14. 前記免疫エピトープが、Ｔ細胞エピトープ又はＢ細胞エピトープである、請求項１３に記載のスキャフォールド。
15. 前記免疫エピトープが、配列番号７～６４及び６７～７１に示されるアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１３又は１４に記載のスキャフォールド。
16. １つ以上のタグ又は１つ以上のコンジュゲート可能なドメインを更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のスキャフォールド。
17. 前記タグがＨｉｓタグ及びＣタグを含む、請求項１６に記載のスキャフォールド。
18. 前記コンジュゲート可能なドメインが、マレイミド－チオールコンジュゲーションを含む、請求項１６に記載のスキャフォールド。
19. 前記スキャフォールドが、前記コンジュゲート可能なドメインを介して、ナノ粒子、チップ、別の基質、別のペプチド又は別の治療剤に結合される、請求項１６又は１８に記載のスキャフォールド。
20. Ｎ末端における極性頭部、Ｃ末端における極性尾部又は両者を更に含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のスキャフォールド。
21. 前記極性頭部又は前記極性尾部が、ポリ（アルギニン）、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（グルタミン酸）又はポリ（アスパラギン酸）を含む、請求項２０に記載のスキャフォールド。
22. 前記極性頭部又は前記極性尾部は２～２０の荷電アミノ酸を有する、請求項２０又は２１に記載のスキャフォールド。
23. 前記スキャフォールドが、直鎖状ペプチドである、請求項１～２２のいずれか一項に記載のスキャフォールド。
24. 前記スキャフォールドが、頭部－尾部（head-to-tail）型環状ペプチドである、請求項１～２２のいずれか一項に記載のスキャフォールド。
25. ２つ以上の請求項１～２４のいずれか一項に記載のスキャフォールドを含む、多価スキャフォールド。
26. １つ以上の請求項１～２４のいずれか一項に記載のスキャフォールド及び免疫応答誘発ドメインを含む、融合タンパク質。
27. 前記免疫応答誘発ドメインがＦｃドメインである、請求項２６に記載の融合タンパク質。
28. 別のペプチド又は別の治療剤にコンジュゲートされている、１つ以上の請求項１～２４のいずれか一項に記載のスキャフォールドを含む、コンジュゲート。
29. １つ以上の請求項１～２４のいずれか一項に記載のスキャフォールド、１つ以上の請求項２５に記載の多価スキャフォールド、１つ以上の請求項２６又は２７に記載の融合タンパク質、及び１つ以上の請求項２８に記載のコンジュゲートを含む、組成物。
30. １つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を更に含む、請求項２９に記載の組成物。
31. 前記組成物が、注射用、吸入用、経口、経鼻、局所、経皮、子宮内又は直腸内剤形に製剤化される、請求項２９又は３０に記載の組成物。
32. 前記組成物が、非経口、経口、肺、頬、鼻、経皮、直腸又は眼経路によって対象に投与される、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の組成物。
33. 前記組成物が、ワクチン組成物である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の組成物。
34. 対象におけるSAR-CoV-2感染を治療又は予防する方法であって、前記対象に、治療有効量の、１つ以上の請求項１～２４のいずれか一項に記載のスキャフォールド、１つ以上の請求項２５に記載の多価スキャフォールド、１つ以上の請求項２６又は２７に記載の融合タンパク質、１つ以上の請求項２８に記載のコンジュゲート、又は１つ以上の請求項２９～３３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
35. 前記対象が哺乳動物である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記対象がヒトである、請求項３４又は３５に記載の方法。
37. 対象におけるSAR-CoV-2ウイルス侵入を阻止する方法であって、前記対象に、治療有効量の、１つ以上の請求項１～２４のいずれか一項に記載のスキャフォールド、１つ以上の請求項２５に記載の多価スキャフォールド、１つ以上の請求項２６又は２７に記載の融合タンパク質、１つ以上の請求項２８に記載のコンジュゲート、又は１つ以上の請求項２９～３３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
38. 前記対象が哺乳動物である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記対象がヒトである、請求項３７又は３８に記載の方法。
40. １つ以上の治療剤の標的送達方法であって、前記１つ以上の治療剤と、１つ以上の請求項１～２４のいずれか一項に記載のスキャフォールドをコンジュゲートすること、及び、必要とする対象に前記コンジュゲートを送達することを含む、方法。
41. スキャフォールドの元となる天然のタンパク質の結合を模倣するスキャフォールドを取得する方法であって、
    第１の結合パートナー及び第２の結合パートナーの三次元結合モデルを作製すること、
    前記結合モデルに基づいて、各結合パートナーに対する結合界面を決定すること、
    前記結合界面を分析して、各結合パートナーの構造及び／又はコンフォメーションを、その天然、遊離又は結合状態で維持すること、
    熱力学的計算（ΔＧ）に基づいて重要な結合残基を決定すること、並びに
    各結合パートナーの結合界面のアミノ酸配列を決定して、前記スキャフォールドを取得すること、
    を含む、方法。
42. 前記三次元結合が、コンピュータプログラムによって作製される、請求項３８に記載の方法。
43. 前記コンピュータプログラムがSWISS-MODELである、請求項３９に記載の方法。
44. 前記三次元結合が、既知の配列及び／又は構造のタンパク質に対する前記第１の結合パートナー又は前記第２の結合パートナーのいずれかの相同性に基づく、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
45. さまざまなコンフォメーション又はフォールディング状態のスキャフォールドを設計して、対応する結合パートナーにフィッティングさせることを更に含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記第１の結合パートナー及び前記第２の結合パートナーが、それぞれ、SARS-CoV-2スパイクタンパク質及びＡＣＥ２である、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。

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