JP2023513579A - 組換えシルク固体及びフィルム - Google Patents

Abstract

本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体のための組成物に関する。更に、本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体、並びに成形体を製造するためのプロセスに関する。【選択図】図２３

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月１２日に出願された米国仮出願第６２／９７５，６５６号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。２０２１年２月１２日に作成された、このＡＳＣＩＩコピーは、ＢＴＴ－０３６ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは、１０２，０５５バイトである。

分野
本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体のための組成物に関する。更に、本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体、並びに成形体を製造するためのプロセスに関する。

背景
生物再生可能な材料、及び生分解性の材料は、石油系製品に代わるものとして関心が高まっている。この目的のために、組換えシルクを含む、植物及び動物に由来する分子から材料及び繊維を作製する方法を開発すべく、かなりの努力がなされてきた。

しかしながら、湿式紡糸などの組換えシルクを処理する従来の方法では、溶媒と凝固浴槽との両方を使用して繊維を生成する。これは、化学物質が、溶媒として使用され、凝固浴槽では紡糸プロセス後に繊維から抽出される必要があり、かつ持続可能で信頼性のあるプロセスを提供するために、閉ループのプロセスに供する必要がある、という点で不利である。溶融紡糸も使用されているが、高熱は組換えシルク繊維の分解を引き起こす可能性があり、最終的な組換えシルク材料の特性に悪影響を及ぼす可能性がある。更に、様々な用途のために、固体又はフィルムなどの他の材料形態を組換えシルクから作製することが望ましい。

したがって、必要とされるのは、組換えシルクの分解を最小限に抑えながら、望ましい機械的及び審美的特性を有する、固体及びフィルムを含む組換えシルクポリペプチドの組成物である。加えて、組成物全体の組換えシルクの均一性が重要であり得る。したがって、そのような組成物を生成する新しい方法も必要とされている。

いくつかの実施形態によれば、成形体を製造するための方法であって、組換えシルク及び可塑剤を含む組成物であって、当該組成物が流動可能な状態にある、組成物を提供することと、当該組成物を型に入れることと、当該型内の当該組成物に熱及び圧力を適用することと、当該組成物を冷却して、当該組換えシルクを含む成形体を形成することと、を含む、方法が本明細書に提供される。

いくつかの実施形態では、成形体は、固体形態にある。いくつかの実施形態では、成形体は、フィルムである。

いくつかの実施形態では、組換えシルクは、当該可塑剤中に分布した組換えシルク粉末である。いくつかの実施形態では、組換えシルクは、成形前に１８Ｂの結晶化度と同様又はそれ未満の結晶化度を含む。いくつかの実施形態では、組換えシルクタンパク質は、ネフィラスパイダー（ｎｅｐｈｉｌａ ｓｐｉｄｅｒ）鞭毛状シルク又はアラネウススパイダー（ａｒａｎｅｕｓ ｓｐｉｄｅｒ）シルクである。いくつかの実施形態では、組換えシルクは、１８Ｂである。いくつかの実施形態では、組換えシルクは、配列番号１を含む。

いくつかの実施形態では、可塑剤は、トリエタノールアミン、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、１５重量％のトリメチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、可塑剤は、当該組成物の１０～５０重量％である。

いくつかの実施形態では、熱は、１３０℃の温度で適用される。いくつかの実施形態では、圧力は、１，５００～１５，０００ｐｓｉの範囲で適用される。

いくつかの実施形態では、成形体は、タイプＡデュロメータにより測定した際に１００の硬度を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、タイプＡデュロモータ（ｄｕｒｏｍｏｔｅｒ）により測定した際に硬度９０以上を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、タイプＤデュロメータにより測定した際に硬度５０以上、６０以上、又は７０以上を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、機械加工、切断、又は穴あけされ得、その所望の形状を維持することができる。

いくつかの実施形態では、成形体は、当該流動可能な状態の当該組成物の組換えシルクと比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の全長１８Ｂモノマーを有する。いくつかの実施形態では、成形体は、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％の全長組換えシルクモノマーを有する。いくつかの実施形態では、成形体は、少なくとも５０％の全組換えシルクモノマー、組換えシルク凝集体、及び高分子量中間体を有する。

いくつかの実施形態では、熱及び圧力は、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、８分間、１０分間、又は１５分間適用される。いくつかの実施形態では、熱及び圧力は、５～８分間適用される。

いくつかの実施形態では、方法は、当該成形体を少なくとも５０％の相対湿度に少なくとも２４時間さらすことを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、当該成形体を６５％の相対湿度に７２時間さらすことを更に含む。

いくつかの実施形態では、圧力は、少なくとも１メートルトン、少なくとも２メートルトン、少なくとも少なくとも３メートルトン、少なくとも４メートルトン、又は少なくとも５メートルトンのプレス荷重によって適用される。いくつかの実施形態では、圧力は、１～５メートルトン、又は３～５メートルトンのプレス荷重によって適用される。

いくつかの実施形態では、冷却は、約１℃／分、約３℃／分、又は約４５℃／分の速度にある。

いくつかの実施形態では、組成物は、５０ＭＰａ以上、６０ＭＰａ以上、７０ＭＰａ以上、８０ＭＰａ以上、９０ＭＰａ以上、１００ＭＰａ以上、１５０ＭＰａ以上、２００ＭＰａ以上、２５０ＭＰａ以上、又は３００ＭＰａ以上の曲げ弾性率を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、１０ＭＰａ以上、２０ＭＰａ以上、３０ＭＰａ以上、４０ＭＰａ以上、５０ＭＰａ以上、６０ＭＰａ以上、７０ＭＰａ以上、８０ＭＰａ以上ＭＰａ以上、９０ＭＰａ以上、又は１００ＭＰａ以上の最大曲げ強度を有する。

いくつかの実施形態では、組成物は、１～４％の破断点伸び率を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、２０％超の破断点伸び率を有する。

いくつかの実施形態では、組成物は、過硫酸アンモニウムを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、当該成形体を過硫酸アンモニウムに浸漬させることを更に含む。いくつかの実施形態では、成形体は、架橋されている。

いくつかの実施形態では、成形体は、化粧品又はスキンケア配合物である。

また、組換えシルク及び可塑剤を含む組成物であって、当該組成物が固体形態にある、組成物も本明細書に提供される。

いくつかの実施形態では、成形体は、固体形態にある。いくつかの実施形態では、成形体は、フィルムである。

いくつかの実施形態では、組換えシルクは、当該可塑剤中に分布した組換えシルク粉末である。いくつかの実施形態では、組換えシルクは、１８Ｂである。いくつかの実施形態では、組換えシルクは、配列番号１を含む。

いくつかの実施形態では、可塑剤は、トリエタノールアミン、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、１５重量％のトリメチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、可塑剤は、当該組成物の１０～５０重量％である。

いくつかの実施形態では、成形体は、タイプＡデュロメータにより測定した際に１００の硬度を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、タイプＡデュロモータにより測定した際に硬度９０以上を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、タイプＤデュロメータにより測定した際に硬度５０以上、６０以上、又は７０以上を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、機械加工、切断、又は穴あけされ得、その所望の形状を維持することができる。

いくつかの実施形態では、成形体は、当該流動可能な状態の当該組成物の組換えシルクと比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の全長１８Ｂモノマーを有する。いくつかの実施形態では、成形体は、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％の全長組換えシルクモノマーを有する。いくつかの実施形態では、成形体は、少なくとも５０％の全組換えシルクモノマー、組換えシルク凝集体、及び高分子量中間体を有する。

いくつかの実施形態では、組成物は、５０ＭＰａ以上、６０ＭＰａ以上、７０ＭＰａ以上、８０ＭＰａ以上、９０ＭＰａ以上、１００ＭＰａ以上、１５０ＭＰａ以上、２００ＭＰａ以上、２５０ＭＰａ以上、又は３００ＭＰａ以上の曲げ弾性率を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、１０ＭＰａ以上、２０ＭＰａ以上、３０ＭＰａ以上、４０ＭＰａ以上、５０ＭＰａ以上、６０ＭＰａ以上、７０ＭＰａ以上、８０ＭＰａ以上ＭＰａ以上、９０ＭＰａ以上、又は１００ＭＰａ以上の最大曲げ強度を有する。

いくつかの実施形態では、組成物は、１～４％の破断点伸び率を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、２０％超の破断点伸び率を有する。

いくつかの実施形態では、組成物は、過硫酸アンモニウムを更に含む。いくつかの実施形態では、成形体は、架橋されている。

いくつかの実施形態では、成形体は、化粧品又はスキンケア配合物である。

前述、並びに他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面に示される、本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。

プレス中に可塑化粉末からプレスされて出た追加の溶媒の画像を示す。 トリメチレングリコールによるプレス固体（すなわち、成形体）を示す。 時間の経過とともにタンパク質の色が暗色化することを示す、プレス固体の写真を示す。 時間の関数としての温度の分析を示す。（図４Ａ）型内の固体の遅い冷却では、０．９２℃／分の冷却速度が得られ、（図４Ｂ）型の外側に置いた状態の周囲空気における、固体の中程度の冷却では、２．７℃／分の冷却速度が得られ、（図４Ｃ）型の外側のドライアイスにおける、固体の急速冷却では、４５．２℃／分の冷却速度が得られる。 図４Ａの説明を参照のこと。 図４Ａの説明を参照のこと。 １８Ｂ固体の機械的特性に対する、６５％ＲＨで最低７２時間のコンディショニングの影響を評価するための力対距離の曲線を示す。シリーズ１、３、５、７、及び９はコンディショニングされており、シリーズ２、４、６、８、及び１１はコンディショニングされていない。 １分間の保持時間の、６５％ＲＨ環境での７２時間のコンディショニングに供した（左）、及びコンディショニングされていない（右）固体の形態を示す。同等の粒子サイズであるが、コンディショニングされた試験片は、粒子間により明確な非晶質領域を有し、延性が増加する可能性がある。 １８Ｂ固体の機械的特性に対する、冷却速度の影響を評価するための力対距離の曲線を示す。１０、１１、及び１２シリーズはそれぞれ、遅い、中程度の、及び急速の冷却速度に対応する。 （Ａ）遅い冷却、（Ｂ）中程度の冷却、及び（Ｃ）急速冷却の間の組換えシルク成形体の比較を示す。 １８Ｂ固体の機械的特性に対する、平均荷重の影響を評価するための力対距離の曲線を示す。１３、１４、１５、１６、及び１７シリーズはそれぞれ、１、２、３、４、及び５メートルトンに対応する。 固体表面に気孔空隙を有する組換えシルク成形体の画像を示す。画像の左側にある多くの固体表面の表面上の目に見える空隙。右側は、分散したタンパク質粒子を示している。 組換えシルク成形体に対する平均プレス荷重の影響を示す。平均荷重が（Ａ）１メートルトンから（Ｂ）３メートルトン、（Ｃ）５メートルトンに増加するにつれて、分散したタンパク質粒子の量が減少する。 １８Ｂ固体の機械的特性に対する、成形時間の影響を評価するための力対距離の曲線を示す。シリーズ２、４、６、８、１１、１８、１９、２０、及び２１はそれぞれ、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、８分間、１０分間、及び１５分間に対応する。 組換えシルク成形体の保持時間に対する平均曲げ弾性率（ＭＰａ）を示す。エラーバーは、サンプルの標準偏差を示している。 組換えシルク成形体の保持時間に対する平均曲げ強度（ＭＰａ）を示す。エラーバーは、サンプルの標準偏差を示している。 組換えシルク成形体の保持時間に対する平均破断点伸び（％）を示す。エラーバーは、サンプルの標準偏差を示している。 等しい平均荷重及び冷却速度を維持して、様々な保持時間：（Ａ）１分間（Ｂ）３分間（Ｃ）５分間（Ｄ）８分間（Ｅ）１０分間（Ｆ）１５分間に供したコンディショニングされていない組換えシルク成形体の形態に対する、成形時間の影響を示す。 １分間保持対５分間保持に供したコンディショニングされていない組換えシルク成形体の形態に対する、成形時間の影響を示す。（Ａ）固体黒色表面（Ｂ、Ｃ）明るい光に対する、１分間の保持時間と５分間の保持時間との間の肉眼による目視検査。保持時間が長いほど、粉末の塊が目立ちにくくなり、より半透明である。 Ｂｅｎｃｈｔｏｐ ＳＥＭにより画像化した組換えシルク成形体の破損後の表面を示す。異なる保持時間にわたる表面の画像化。（Ａ）より高いコントラストのために暗色化された１分間の保持時間（Ｂ）５分間の保持時間（Ｃ）１５分間の保持時間。 組換えシルク成形体の架橋された１８Ｂ／ＴＥＯＡサンプルを示す。 ＡＰＳの架橋された１８Ｂ／グリセロールフィルムの乾燥（図２０Ａ）、又は水中での１時間放置後（図２０Ｂ）を示す。左のフィルムは架橋溶液に１０分間浸し、一方で右のフィルムは１時間浸した。 水のコンテナに入れたグルタルアルデヒド化学を使用する架橋された１８Ｂ固体フレームは、３０分間の試験時間内にいかなる構造変化も示さなかったことを示す。 表面に分散した１８Ｂ／グリセロール粉末を示す 組換えシルク／グリセロールフィルムの透明性及びドレープ性を示す。 レーザ切断した組換えシルク／グリセロールフィルムの例を示す。 １３０℃でプレスした、可塑剤なしの１８Ｂ粉末の画像を示す。 プレス成形中のフラッシュ（ｆｌａｓｈ）の形成を示す。 １，３プロパンジオールを用いてプレスすることによって作製した、成形された１８Ｂ固体の画像（左）と、固体を再処理し、１３０℃でプレスして薄いフィルムを形成した画像（右）とを示す。

詳細な説明
本発明の様々な実施形態の詳細は、下記説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明から明らかになるであろう。本明細書で別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈に別段の必要性がない限り、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。「ａ」及び「ａｎ」という用語には、文脈上別段の指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。一般に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子及び細胞生物学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションとの関連で使用される専門用語及びそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。

定義
別段の指示がない限り、以下の用語は以下の意味を持つものと理解されるべきである。

「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノム若しくは合成ＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ又は合成ＲＮＡ）、並びに非天然ヌクレオチド類似体、非天然ヌクレオシド間結合、又は両方を含有するＤＮＡ又はＲＮＡの類似体が含まれる。核酸は、任意のトポロジー的立体配座であり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的に二本鎖、分岐状、ヘアピン状、環状、又は南京錠の立体配座であり得る。

別段の指示がない限り、一般的なフォーマット「配列番号」の下で本明細書に記載される全ての配列についての一例として、「配列番号１を含む核酸」とは、その少なくとも一部分に、（ｉ）配列番号１の配列、又は（ｉｉ）配列番号１に相補的な配列のいずれかを有する、核酸を指す。２つの間の選択は、文脈により決定される。例えば、核酸がプローブとして使用される場合、２つの間の選択は、プローブが所望の標的に相補的であるという要件によって決定される。

「単離された」ＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合ポリマーとは、その天然の宿主細胞において、天然のポリヌクレオチドに天然に付随している他の細胞成分、例えば、天然に関連しているリボソーム、ポリメラーゼ、及びゲノム配列から実質的に分離されているものである。

「単離された」有機分子（例えば、シルクタンパク質）とは、それが由来する宿主細胞の細胞成分（膜脂質、染色体、タンパク質）から、又は宿主細胞が培養されていた培地から実質的に分離されているものである。この用語は、生体分子が、他の全ての化学物質から分離されていることを必要としないが、ある特定の単離された生体分子は、ほぼ均一に精製され得る。

「組換え」という用語は、生体分子、例えば、遺伝子又はタンパク質であって、（１）その天然に存在する環境から除かれているもの、（２）自然界ではその遺伝子が見られるポリヌクレオチドの全部若しくは一部分に会合していないもの、（３）自然界では連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているもの、又は（４）自然界では生じないものを指す。「組換え」という用語は、クローン化ＤＮＡ単離物、化学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、又は異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、並びにそのような核酸によってコードされるタンパク質及び／若しくはｍＲＮＡに関して使用され得る。

生物のゲノム中の内在性核酸配列（又はその配列のコードされたタンパク質産物）は、この内在性核酸配列の発現が変化するように、内在性核酸配列に隣接して異種配列が置かれている場合、本明細書では「組換え」とみなされる。この文脈において、異種配列は、その異種配列がそれ自体内在性（同じ宿主細胞又はその子孫に由来する）、又は外因性（異なる宿主細胞又はその子孫に由来する）であるかどうかにかかわらず、天然では内在性核酸配列に隣接していない配列である。例として、プロモーター配列は、宿主細胞のゲノム中の遺伝子の天然プロモーターを（例えば、相同組換えによって）置換して、この遺伝子が変化した発現パターンを有するようにすることができる。ここで、この遺伝子は、それに天然に隣接している配列のうちの少なくともいくつかから分離されているため、「組換え」となるであろう。

核酸もまた、それが、ゲノム中の対応する核酸に対する、天然では生じない任意の改変を含有する場合に「組換え」とみなされる。例えば、内在性コード配列は、それが人為的に、例えば、ヒトの介入によって導入された挿入、欠失又は点変異を含有する場合に「組換え」とみなされる。「組換え核酸」には、異種部位で宿主細胞染色体内に組み込まれた核酸、及びエピソームとして存在する核酸構築物も含まれる。

本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、短いポリペプチド、例えば、典型的には約５０アミノ酸長未満、より典型的には約３０アミノ酸長未満のものを指す。本明細書で使用される用語は、類似体、及び構造機能を模倣し、したがって生物学的機能を模倣する模倣物を包含する。

「ポリペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質と天然に存在しないタンパク質との両方、並びにその断片、変異体、誘導体、及び類似体を包含する。ポリペプチドは、モノマーであってもポリマーであってもよい。更に、ポリペプチドは、その各々が１つ以上の別個の活性を有する多数の異なるドメインを含んでよい。

「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」という用語は、その起源又は誘導体源という点で、（１）その天然の状態ではそれに付随する天然での会合成分と会合していないか、（２）自然界では見られない純度で存在し、その場合、純度は、他の細胞物質の存在に関して判定可能であるか（例えば、同じ種からの他のタンパク質を含まない）、（３）異なる種からの細胞によって発現するか、又は（４）自然界では生じない（例えば、それは自然界に見られるポリペプチドの断片であるか、あるいはそれは自然界では見られないアミノ酸類似体若しくは誘導体、又は標準ペプチド結合以外の連結が含まれる）、タンパク質又はポリペプチドである。したがって、化学的に合成されるか、又はそれが天然での起源となる細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その天然での会合成分から「単離されている」。ポリペプチド又はタンパク質は、当該技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して単離することにより、天然での会合成分を実質的に含まないようにしてもよい。このように定義した場合、「単離された」とは、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、又はオリゴペプチドが、その天然の環境から物理的に除かれていることを必ずしも必要としない。

「ポリペプチド断片」という用語は、全長ポリペプチドと比較して、欠失、例えば、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、ポリペプチド断片は、その断片のアミノ酸配列が天然に存在する配列での対応する位置と同一な連続配列である。断片は、典型的には、少なくとも５、６、７、８、９又は１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６又は１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０又は４５アミノ酸、更により好ましくは少なくとも５０又は６０アミノ酸長、更により好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。

タンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードする核酸配列と同様の配列を有する場合、タンパク質は第２のタンパク質に対して「相同性」を有するか、又は「相同」である。あるいは、２つのタンパク質が「同様の」アミノ酸配列を有する場合、タンパク質は第２のタンパク質に対する相同性を有する。（したがって、「相同タンパク質」という用語は、２つのタンパク質が同様のアミノ酸配列を有することを意味するように定義される。）本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列の領域間の相同性（特に、予測される構造類似性に関して）は、機能における類似性を意味すると解釈される。

タンパク質又はペプチドに関して「相同」が使用される場合、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なることが認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性又は相同性の程度を上方に調整して、置換の保存的性質について補正してよい。この調整を行うための手段は、当業者には周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１及び２５：３６５－８９（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

２０種の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用法に従う。参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｇｒｅｎ ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，２ｎｄ ｅｄ．１９９１）を参照のこと。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）、非天然型アミノ酸、例えば、α－，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸など、及び他の非従来型アミノ酸も本発明のポリペプチドのために好適な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例には、４－ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、ε－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、Ｎ－メチルアルギニン、並びに他の同様のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で使用されるポリペプチド表記法では、標準的な用法及び慣例に従って、左側末端はアミノ末端に対応し、右側末端はカルボキシ末端に対応する。

以下の６グループは各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

パーセント配列同一性と呼ばれることもあるポリペプチドの配列相同性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５を参照のこと。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、及び他の改変に割り当てられた相同性の尺度を使用して、同様の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧには、「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムが含有されており、これらをデフォルトのパラメータにより使用して、密接に関連するポリペプチド間、例えば、生物の異なる種からの相同ポリペプチド間など、又は野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の、配列相同性又は配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。

特定のポリペプチド配列を、異なる生物からの多数の配列を含有するデータベースと比較する場合に有用なアルゴリズムは、コンピュータプログラムのＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）；Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６（１９９７））、特に、ｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７））である。

ＢＬＡＳＴｐの好ましいパラメータは、Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ：１０（デフォルト）；Ｆｉｌｔｅｒ：ｓｅｇ（デフォルト）；Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ：１１（デフォルト）；Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ａ ｇａｐ：１（デフォルト）；Ｍａｘ．ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：１００（デフォルト）；Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：１１（デフォルト）；Ｎｏ．ｏｆ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ：１００（デフォルト）；Ｐｅｎａｌｔｙ Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。

ＢＬＡＳＴｐの好ましいパラメータは、Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ：１０（デフォルト）；Ｆｉｌｔｅｒ：ｓｅｇ（デフォルト）；Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ：１１（デフォルト）；Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ａ ｇａｐ：１（デフォルト）；Ｍａｘ．ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：１００（デフォルト）；Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：１１（デフォルト）；Ｎｏ．ｏｆ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ：１００（デフォルト）；Ｐｅｎａｌｔｙ Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。相同性について比較するポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基、通常は少なくとも約２０残基、より通常は少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基を超える。多数の異なる生物からの配列を含有するデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を使用するデータベース検索は、当該技術分野で既知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列及び検索配列の間の最良の重複領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３－９８（１９９０）（参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、アミノ酸配列間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧバージョン６．１で提供されるＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメータにて使用して決定することができる（２のワードサイズ、及びＰＡＭ２５０のスコアリングマトリックス）。

本明細書及び以下の特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述されている整数又は整数群を含むが、他の任意の整数又は整数群を除外しないことを意味すると理解される。

本明細書で定義される「成形体」又は「固体」という用語は、例えば、押し出し成形、射出成形、圧縮成形、ブロー成形、積層、マトリックス成形、回転成形、スピンキャスティング、トランスファー成形、熱成形などが含まれるがこれらに限定されない、成形プロセスのような、型と呼ばれる剛性フレームを使用して、液体又は柔軟な原材料を形作ることによって製造された本体を指す。

本明細書で使用される「ガラス転移」という用語は、物質又は組成物の硬い、堅い、又は「ガラス状」状態から、より柔軟な「ゴム状」又は「粘性」状態への転移を指す。

本明細書で使用される「ガラス転移温度」という用語は、物質又は組成物が、ガラス転移を受ける温度を指す。

本明細書で使用される「溶融転移」という用語は、物質又は組成物のゴム状の状態から、規則性の低い液相又は流動可能な状態への転移を指す。

本明細書で使用される「溶融温度」という用語は、物質が溶融転移を受ける温度範囲を指す。

本明細書で使用される「可塑剤」という用語は、ポリペプチド配列と相互作用して、ポリペプチド配列が三次構造及び結合を形成することを防止し、並びに／又はポリペプチド配列の移動度を増加させる任意の分子を指す。

本明細書で使用される「流動可能な状態」という用語は、液体と実質的に同じ特徴を有する（すなわち、ゴム状の状態からより液体の状態に転移した）組成物を指す。

本明細書で使用される「架橋された（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ）」又は「架橋された（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、２つ以上のタンパク質上の反応性基の間に形成された結合を指す。架橋は、例えば、酵素架橋又は光架橋によって実施することができる。例えば、過硫酸アンモニウム及び光、又は過硫酸アンモニウム及び熱を使用して、シルク又はシルク様ポリペプチドを架橋することができる。

例示的な方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料も本発明の実行に使用することができ、当業者には明らかとなるであろう。本明細書で言及される全ての刊行物及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書が、定義を含め、優先される。材料、方法、及び例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。

概要
本明細書では、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体のための組成物が提供され、組成物は、強度、柔軟性、剛度などの望ましい機械的特性を含む。加えて、いくつかの実施形態では、組成物は、溶融又は流動可能な状態で均質又は実質的に均質である。また、いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、それが成形体へと形成された後には、実質的に分解されない（例えば、１０重量％未満、又は多くの場合６重量％未満の量で分解される）。好ましい実施形態では、組換えシルクタンパク質は粉末の形態である。また、そのような組成物を生成する方法であって、シルクタンパク質及び可塑剤を含む組成物を型に入れることと、型内の組成物に圧力及び熱を適用することによって成形体を形成することと、続いて成形体を冷却することと、任意選択的に、高い相対湿度などの追加のコンディショニングにさらすことと、を含む、方法が本明細書に提供される。好ましい実施形態では、熱は、成形の熱及び時間が、成形体中の組換えシルクタンパク質の分解が最小限であるように十分に少なくなるように、十分に低く、組換えシルクの使用から生じる望ましい特性を維持する。

組換えシルクタンパク質
本開示は、シルク又はシルク様組換えポリペプチドなどの合成タンパク質性コポリマー（すなわち、組換えポリペプチド）から合成された、固体及びフィルムなどの成形体を含む本発明の実施形態を記載する。いくつかの実施形態では、固体又はフィルムなどの成形体は、化粧品又はスキンケア配合物（例えば、皮膚又は毛髪に適用される溶液）を形成する。本明細書で提供される成形体は、実施形態及び配合物の所望の効能に応じて、様々な湿潤剤、皮膚軟化剤、閉塞剤、活性剤及び化粧品補助剤を含有し得る。

好適なタンパク質性コポリマーは、２０１６年８月４５日に公開された米国特許公開第２０１６／０２２２１７４号、２０１８年４月２６日に公開された米国特許公開第２０１８／０１１１９７０号、及び２０１８年３月１日に公開された米国特許公開第２０１８／００５７５４８号に論じられており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。加えて、１８Ｂと同様若しくはそれ未満の結晶化度、及び／又は同様の伸張性指数を有するタンパク質性コポリマー（例えば、ネフィラスパイダー鞭毛状シルク、アラネウススパイダーシルク、再生シルクフィブロイン）は、本明細書に記載される成形体で使用するのに好適である。いくつかの実施形態では、タイチンタンパク質などの、成形体を形成するために好適な同様の特性を有する他の非シルクタンパク質は、本明細書に記載の成形体を形成するために好適なタンパク質性コポリマーである。

いくつかの実施形態では、合成タンパク質性コポリマーは、シルク様ポリペプチド配列から作製される。いくつかの実施形態では、シルク様ポリペプチド配列は、１）シルクポリペプチド配列に由来する反復ドメインを混合及び一致させることによって生成されるブロックコポリマーポリペプチド組成物、並びに／又は２）工業的に拡張可能な微生物からの分泌によって、有用な成形体組成物を形成するのに十分に大きなサイズ（およそ４０ｋＤａ）を有するブロックコポリマーポリペプチドの組換え発現である。ほぼ全ての公開されているスパイダーシルクポリペプチドのアミノ酸配列からの配列を含む、シルクの反復ドメイン断片から遺伝子操作された大きな（およそ４０ｋＤａ～およそ１００ｋＤａ）ブロックコポリマーポリペプチドは、本明細書に記載される改変微生物で発現させることができる。いくつかの実施形態では、シルクポリペプチド配列は、成形体形成が可能な、高度に発現及び分泌されるポリペプチドを産生するように一致させ、設計される。

いくつかの実施形態では、ブロックコポリマーは、シルクポリペプチド配列空間にわたるシルクポリペプチドドメインの組み合わせ混合から遺伝子操作される。いくつかの実施形態では、ブロックコポリマーは、拡張可能な生物（例えば、酵母、真菌、及びグラム陽性菌）で発現及び分泌させることによって作製される。いくつかの実施形態では、ブロックコポリマーポリペプチドは、０以上のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、１つ以上の反復ドメイン（ＲＥＰ）、及び０以上のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含む。実施形態のいくつかの態様では、ブロックコポリマーポリペプチドは、１００個超のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖である。いくつかの実施形態では、ブロックコポリマーポリペプチドは、その全体が参照により組み込まれる、国際公開第ＷＯ／２０１５／０４２１６４号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｅｒｓ」に開示されているブロックコポリマーポリペプチドの配列と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるドメインを含む。

いくつかのタイプの天然スパイダーシルクが、同定されている。天然に紡がれたシルクの各タイプの機械的特性は、そのシルクの分子組成と密接に関連していると考えられている。例えば、Ｇａｒｂ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ，ＢＭＣ Ｅｖｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：２４３（２０１０）；Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ，ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．，１１：３（２０１２）；Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ．１６９－１８４（２０１１）；及びＨｕｍｅｎｉｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｆｉｂｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｓｃｉ．，１０３，ｐｇ．１３１－８５（２０１１）を参照のこと。例えば、

房状（ＡｃＳｐ）シルクは、適度に高い強度と適度に高い伸張性とが組み合わされた結果、高い靭性を有する傾向がある。ＡｃＳｐシルクは、多くの場合、ポリセリン及びＧＰＸのモチーフを組み込む大きなブロック（「アンサンブル反復」）のサイズによって特徴付けられる。小管状（ＴｕＳｐ又は円筒状）シルクは、適度な強度及び高い伸張性を有する、大きな直径を有する傾向がある。ＴｕＳｐシルクは、それらのポリセリン及びポリスレオニンの含有量、並びにポリアラニンの短い管（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ）によって特徴付けられる。大瓶状（ＭａＳｐ）シルクは、高い強度及び適度な伸張性を有する傾向がある。ＭａＳｐシルクは、ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２の２つのサブタイプのうちの１つであり得る。ＭａＳｐ１シルクは、一般に、ＭａＳｐ２シルクよりも伸張性が低く、ポリアラニン、ＧＸ、及びＧＧＸモチーフによって特徴付けられる。ＭａＳｐ２シルクは、ポリアラニン、ＧＧＸ、及びＧＰＸモチーフによって特徴付けられる。小瓶状（ＭｉＳｐ）シルクは、適度な強度及び適度な伸張性を有する傾向がある。ＭｉＳｐシルクは、ＧＧＸ、ＧＡ、及びポリＡモチーフによって特徴付けられ、多くの場合、およそ１００のアミノ酸のスペーサーエレメントを含有する。鞭毛状（Ｆｌａｇ）シルクは、非常に高い伸張性及び適度な強度を有する傾向がある。Ｆｌａｇシルクは通常、ＧＰＧ、ＧＧＸ、及び短いスペーサーモチーフによって特徴付けられる。

各シルクタイプの特性は、種ごとに異なり得、別個の生活様式を送るクモ（例えば、定住性シロアリモドキ（ｗｅｂ ｓｐｉｎｎｅｒ）対放浪ハンター）又は進化的により古いものは、上記の説明とは特性が異なるシルクを産生し得る（クモ多様性及び分類の説明については、Ｈｏｒｍｉｇａ，Ｇ．，ａｎｄ Ｇｒｉｓｗｏｌｄ，Ｃ．Ｅ．，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ，ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｂ－ｗｅａｖｉｎｇ ｓｐｉｄｅｒｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．５９，ｐｇ．４８７－５１２（２０１４）；及びＢｌａｃｋｅｄｇｅ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｗｅｂ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｉｄｅｒ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｒａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０６：１３，ｐｇ．５２２９－５２３４（２００９）を参照のこと）。しかしながら、天然シルクタンパク質の反復ドメインに対する配列類似性、及び／又はアミノ酸組成類似性を有する合成ブロックコポリマーポリペプチドは、天然シルクポリペプチドから作製された対応する成形体の特性を再現する特性を有する、一貫した成形体を商業規模で製造するために使用することができる。

いくつかの実施形態では、推定シルク配列のリストは、関連用語、例えば、「スピドロイン」「フィブロイン」「ＭａＳｐ」についてＧｅｎＢａｎｋを検索することによって編集することができ、それらの配列は、独立した配列決定努力によって得られた付加的な配列とともにプールすることができる。次いで、配列をアミノ酸へと翻訳し、重複エントリーについてフィルタリングし、手動でドメイン（ＮＴＤ、ＲＥＰ、ＣＴＤ）へと分割する。いくつかの実施形態では、候補アミノ酸配列を、ピキア（コマガタエラ）パストリス（Ｐｉｃｈｉａ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現のために最適化されたＤＮＡ配列へと逆翻訳する。ＤＮＡ配列を発現ベクターへと各々クローニングし、ピキア（コマガタエラ）パストリスへと形質転換する。いくつかの実施形態では、成功した発現及び分泌を示す様々なシルクドメインを、続いて、組み合わせ様式でアセンブルし、成形体形成が可能なシルク分子を構築する。

シルクポリペプチドは、非反復領域（例えば、Ｃ末端及びＮ末端ドメイン）が隣接する反復ドメイン（ＲＥＰ）から特徴的に構成される。一実施形態では、Ｃ末端ドメインとＮ末端ドメインとの両方が、７５～３５０アミノ酸長である。反復ドメインは、図１において示されるように、階層的構造を示す。反復ドメインは、一連のブロック（反復単位とも呼ばれる）を含む。ブロックは、シルクの反復ドメイン全体にわたり、時には完全に、かつ時には不完全に（準反復ドメインを構成する）反復される。ブロックの長さ及び組成は、異なるシルクタイプ間で、及び異なる種にわたり変化する。表１は、選択された種、及びシルクタイプからのブロック配列の例を列挙し、更なる例は、Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ １６９－１８４（２０１１）；及びＧａｔｅｓｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｆｉｂｒｏｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：５５１３，ｐｇ．２６０３－２６０５（２００１）に示されている。場合によっては、ブロックは、規則的なパターンで配置され、シルク配列の反復ドメインにおいて複数回（通常２～８回）出現する、より大きなマクロ反復が形成され得る。反復ドメイン又はマクロ反復の内部の反復したブロック、及び反復ドメイン内の反復したマクロ反復は、スペーシングエレメントによって分離されていてもよい。いくつかの実施形態では、ブロック配列は、グリシンリッチ領域、続いてポリＡ領域を含む。いくつかの実施形態では、短い（約１～１０）アミノ酸モチーフは、ブロックの内部に複数回出現する。本発明の目的のために、異なる天然シルクポリペプチドからのブロックは、円順列を参照せずに選択することができる（すなわち、別様にシルクポリペプチド間で同様の同定されたブロックは、円順列のために整列しなくてもよい）。したがって、例えば、ＳＧＡＧＧ（配列番号３）の「ブロック」は、本発明の目的のために、ＧＳＧＡＧ（配列番号４）と同じであり、ＧＧＳＧＡ（配列番号５）と同じであり、それらは全て、互いの円順列にすぎない。所定のシルク配列について選択される特定の順列は、他の何よりも利便性によって決定され得る（通常Ｇにより始まる）。ＮＣＢＩデータベースから得られたシルク配列は、ブロック及び非反復領域へ区分化され得る。

（表１）ブロック配列のサンプル

本発明のある特定の実施形態による、ブロック及び／又はマクロ反復ドメインからの成形体形成ブロックコポリマーポリペプチドは、参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ／２０１５／０４２１６４号に記載されている。ＧｅｎＢａｎｋなどのタンパク質データベースから、又はデノボ配列決定によって得られた天然シルク配列は、ドメイン（Ｎ末端ドメイン、反復ドメイン、及びＣ末端ドメイン）によって破壊される。繊維又は成形体への合成及びアセンブリの目的で選択されたＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメイン配列には、天然アミノ酸配列情報、及び本明細書に記載の他の改変が含まれる。反復ドメインは、シルクのタイプに依存して通常１～８個、代表的なブロックを含有する反復配列へ分解され、これは、重要なアミノ酸情報を獲得し、一方、アミノ酸をコードするＤＮＡのサイズを、容易に合成可能な断片へ縮小させる。いくつかの実施形態では、適切に形成されたブロックコポリマーポリペプチドは、少なくとも１つの反復配列を含む少なくとも１つの反復ドメインを含み、任意選択的に、Ｎ末端ドメイン及び／又はＣ末端ドメインに隣接する。

いくつかの実施形態では、反復ドメインは、少なくとも１つの反復配列を含む。いくつかの実施形態では、反復配列は、１５０～３００のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、反復配列は、複数のブロックを含む。いくつかの実施形態では、反復配列は、複数のマクロ反復を含む。いくつかの実施形態では、ブロック又はマクロ反復は、複数の反復配列にわたって分割される。

いくつかの実施形態では、反復配列は、ＤＮＡアセンブリ要件を満たすために、グリシンにより始まり、かつフェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、メチオニン（Ｍ）、又はアスパラギン酸（Ｄ）により終わることはできない。いくつかの実施形態では、反復配列のうちのいくつかは、天然配列と比較して変更され得る。いくつかの実施形態では、反復配列は、ポリペプチドのＣ末端に対するセリンの付加などにより変更され得る（Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｍ、又はＤでの終止を回避するため）。いくつかの実施形態では、反復配列は、別のブロックからの相同配列により不完全なブロックを埋めることによって改変され得る。いくつかの実施形態では、反復配列は、ブロック又はマクロ反復の順序を再配置することによって改変され得る。

いくつかの実施形態では、非反復Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインは、合成のために選択され得る。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ドメインは、例えば、ＳｉｇｎａｌＰ（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ．Ａｌ．，ＳｉｇｎａｌＰ ４．０：ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：１０，ｐｇ．７８５－７８６（２０１１）によって同定されるような、リーディングシグナル配列の除去によるものであり得る。

いくつかの実施形態では、Ｎ末端ドメイン、反復配列、又はＣ末端ドメイン配列は、アゲレノプシス・アペルタ（Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ ａｐｅｒｔａ）、アリアチプス・グロサス、アフォノペルマ・シーマニー（Ａｐｈｏｎｏｐｅｌｍａ ｓｅｅｍａｎｎｉ）、アプトスチチュス種（Ａｐｔｏｓｔｉｃｈｕｓ ｓｐ．）ＡＳ２１７、アプトスチチュス種ＡＳ２２０、アラネウス・ディアデマツス（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）、アラネウス・ゲムモイデス、アラネウス・ヴェントリコサス、アルギオペ・アモエナ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｍｏｅｎａ）、アルギオペ・アルゲンタタ（Ａｒｇｉｏｐｅ ａｒｇｅｎｔａｔａ）、アルギオペ・ブルエンニチ（Ａｒｇｉｏｐｅ ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）、アルギオペ・トリファスシアタ、アチポイデス・リヴェルシ（Ａｔｙｐｏｉｄｅｓ ｒｉｖｅｒｓｉ）、アヴィキュラリア・ジュルエンシス（Ａｖｉｃｕｌａｒｉａ ｊｕｒｕｅｎｓｉｓ）、ボスリオシルツム・カリフォルニカム（Ｂｏｔｈｒｉｏｃｙｒｔｕｍ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、デイノピス・スピノサ、ディグエチア・カニチエス（Ｄｉｇｕｅｔｉａ ｃａｎｉｔｉｅｓ）、ドロメデス・テネブロサス、エウアグルス・キソセウス（Ｅｕａｇｒｕｓ ｃｈｉｓｏｓｅｕｓ）、エウプロスセノプス・オーストラリス、ガステラキャンタ・マンモサ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ ｍａｍｍｏｓａ）、ヒポキルス・トレルリ（Ｈｙｐｏｃｈｉｌｕｓ ｔｈｏｒｅｌｌｉ）、ククルカニア・ヒベルナリス（Ｋｕｋｕｌｃａｎｉａ ｈｉｂｅｒｎａｌｉｓ）、ラトロデクツス・ヘスペルス、メガヘクスラ・フルヴァ（Ｍｅｇａｈｅｘｕｒａ ｆｕｌｖａ）、メテペイラ・グランディオサ（Ｍｅｔｅｐｅｉｒａ ｇｒａｎｄｉｏｓａ）、ネフィラ・アンチポディアナ（Ｎｅｐｈｉｌａ ａｎｔｉｐｏｄｉａｎａ）、ネフィラ・クラヴァタ、ネフィラ・クラヴィペス、ネフィラ・マダガスカリエンシス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）、ネフィラ・ピリペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｐｉｌｉｐｅｓ）、ネフィレンギス・クルエンタタ、パラウィキシア・ビストリアタ（Ｐａｒａｗｉｘｉａ ｂｉｓｔｒｉａｔａ）、ペウセチア・ヴィリダンス（Ｐｅｕｃｅｔｉａ ｖｉｒｉｄａｎｓ）、プレクトレウリス・トリスチス、ポエシロセリア・レガリス（Ｐｏｅｃｉｌｏｔｈｅｒｉａ ｒｅｇａｌｉｓ）、テトラグナタ・カウアイエンシス、又はウロボルス・ディヴェルサスに由来し得る。

いくつかの実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、アルファ接合因子ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、別の内在性又は異種の分泌シグナルコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、３Ｘ ＦＬＡＧヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、６～８個のＨｉｓ残基（配列番号３３）などの他のアフィニティータグに作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、アルギオペ・ブルエンニチ種などのＭａＳｐ２に由来する組換えスパイダーシルクタンパク質断片配列に基づいている。いくつかの実施形態では、成形体は、２～２０個の反復単位を含むタンパク質分子を含有し、各反復単位の分子量は、約２０ｋＤａ超である。コポリマーの各反復単位内には、約６０超のアミノ酸残基があり、多くの場合、多数の「準反復単位」に組織化されている６０～１００個の範囲のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、本開示に記載されるポリペプチドの反復単位は、ＭａＳｐ２ドラッグラインシルクタンパク質配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有する。

良好な機械的特性を有する成形体を形成するタンパク質性ブロックコポリマーの反復単位は、シルクポリペプチドの一部分を使用して合成され得る。これらのポリペプチド反復単位は、アラニンリッチ領域及びグリシンリッチ領域を含有し、長さが１５０アミノ酸以上である。本開示のタンパク質性ブロックコポリマーにおいて反復として使用され得るいくつかの例示的な配列は、その全体が参照により組み込まれる、共同所有のＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０４２１６４号に提供されており、ピキア発現システムを使用して発現することを示していた。

いくつかの実施形態では、スパイダーシルクタンパク質は、反復単位の少なくとも２つの出現を含み、反復単位は、１５０超のアミノ酸残基、及び少なくとも１０ｋＤａの分子量を有すること；少なくとも８０％のアラニン含有量を含む、６つ以上の連続するアミノ酸を有するアラニンリッチ領域；少なくとも４０％のグリシン含有量及び３０％未満のアラニン含有量を含む、１２個以上の連続するアミノ酸を有するグリシンリッチ領域を含む。

いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、反復単位を含み、各反復単位は、２～２０個の準反復単位を含む配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を有し；各準反復単位は、｛ＧＧＹ－［ＧＰＧ－Ｘ１］ｎ１－ＧＰＳ－（Ａ）ｎ２｝（配列番号３４）を含み、式中、各準反復単位について、Ｘ１は、ＳＧＧＱＱ（配列番号３５）、ＧＡＧＱＱ（配列番号３６）、ＧＱＧＰＹ（配列番号３７）、ＡＧＱＱ（配列番号３８）、及びＳＱからなる群から独立して選択され；ｎ１は、４～８であり、ｎ２は、６～１０である。反復単位は、複数の準反復単位から構成されている。

いくつかの実施形態では、３つの「長い」準反復には、３つの「短い」準反復単位が続く。前述のように、短い準反復単位は、ｎ１＝４又は５のものである。長い準反復単位は、ｎ１＝６、７、又は８のものとして定義される。いくつかの実施形態では、短い準反復のうちの全てが、反復単位の各準反復単位内の同じ位置に、同じＸ１モチーフを有する。いくつかの実施形態では、６つのうちの３つ以下の準反復単位が、同じＸ１モチーフを共有する。

追加の実施形態では、反復単位は、反復単位内で、同じＸ１を続けて３回以上出現させない準反復単位から構成されている。更なる実施形態では、反復単位は、準反復単位から構成されており、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の準反復は、反復単位の単一の準反復単位において、同じＸ１を３回以上使用しない。

いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、配列番号１のポリペプチド配列（すなわち、１８Ｂ）を含む。いくつかの実施形態では、反復単位は、配列番号２を含むポリペプチドである。これらの配列は、表２に提供される。

（表２）組換えタンパク質及び反復単位の例示的なポリペプチド配列

いくつかの実施形態では、記載された組換えスパイダーシルクポリペプチドから形成された成形体の構造は、ベータシート構造、ベータターン構造、又はアルファヘリックス構造を形成する。いくつかの実施形態では、形成された成形体の二次、三次、及び四次タンパク質構造は、ナノ結晶ベータシート領域、非晶質ベータターン領域、非晶質アルファヘリックス領域、非結晶マトリックスに埋め込まれた、ランダムに空間的に分布したナノ結晶領域、又は非結晶マトリックスに埋め込まれた、ランダムに配向したナノ結晶領域を有すると記載されている。理論に拘束されることは望まないが、スパイダーシルク内のタンパク質の構造特性は、成形体の機械的特性に関連すると理論化されている。結晶領域は強度と関連しており、一方で、非晶質領域は伸張性に関連している。大瓶状（ＭＡ）シルクは、鞭毛状シルクよりも強度が高く、伸張性が低い傾向があり、同様に、ＭＡシルクは、鞭毛状シルクと比較して、結晶領域の体積分率が大きい。

いくつかの実施形態では、シルクタンパク質の分子量は、２０ｋＤａ～２０００ｋＤａ、又は２０ｋＤａ超、又は１０ｋＤａ超、又は５ｋＤａ超、又は５～４００ｋＤａ、又は５～３００ｋＤａ、又は５～２００ｋＤａ、又は５～１００ｋＤａ、又は５～５０ｋＤａ、又は５～５００ｋＤａ、又は５～１０００ｋＤａ、又は５～２０００ｋＤａ、又は１０～４００ｋＤａ、又は１０～３００ｋＤａ、又は１０～２００ｋＤａ、又は１０～１００ｋＤａ、又は１０～５０ｋＤａ、又は１０～５００ｋＤａ、又は１０～１０００ｋＤａ、又は１０～２０００ｋＤａ、又は２０～４００ｋＤａ、又は２０～３００ｋＤａ、又は２０～２００ｋＤａ、又は４０～３００ｋＤａ、又は４０～５００ｋＤａ、又は２０～１００ｋＤａ、又は２０～５０ｋＤａ、又は２０～５００ｋＤａ、又は２０～１０００ｋＤａ、又は２０～２０００ｋＤａの範囲であり得る。

組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の不純物及び分解の特徴評価
異なる組換えスパイダーシルクポリペプチドは、タンパク質によって形成される二次及び三次構造の強度及び安定性に基づいた、溶融温度及びガラス転移温度などの異なる物理化学的特性を有する。シルクポリペプチドは、モノマーの形態で、ベータシート構造を形成する。他のモノマーの存在下で、シルクポリペプチドは、ベータシート構造の三次元結晶格子を形成する。ベータシート構造は、ポリペプチド配列の非晶質領域から分離しており、かつ散在している。

ベータシート構造は、高温で非常に安定しており、ベータシートの溶融温度は、高速走査熱量測定により測定した際におよそ２５７℃である。Ｃｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｅａｔ－Ｆａｓｔ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｅｌｔｓ Ｓｉｌｋ Ｂｅｔａ Ｓｈｅｅｔ Ｃｒｙｓｔａｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３：１１３０（２０１３）を参照のこと。ベータシート構造は、シルクポリペプチドのガラス転移温度を超えてもそのままであると考えられているため、組換えシルクポリペプチドのガラス転移温度で見られる構造転移は、ベータシート間の非晶質領域の移動度の増加によるものであると仮定されている。

可塑剤は、非晶質領域の移動度を増加させ、潜在的にベータシート形成を妨害することにより、シルクタンパク質のガラス転移温度及び溶融温度を低下させる。この目的に使用される好適な可塑剤には、水、並びにグリセロール、トリグリセロール、ヘキサグリセロール、及びデカグリセロールなどのポリアルコール（ポリオール）が含まれるが、これらに限定されない。他の好適な可塑剤には、ジメチルイソソルバイト；ジメチルアミノプロピルアミンとアジピン酸（ａｄｉｐｔｉｃ ａｃｉｄ）とのビアサミド（ｂｉａｓａｍｉｄｅ）；２，２，２－トリフルオロエタノール；ジメチルアミノプロピルアミンとカプリル酸／カプリン酸とのアミド；ＤＥＡアセトアミド、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。他の好適な可塑剤は、Ｕｌｌｓｔｅｎ ｅｔ．ａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ ５：Ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｒｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂａｓｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｖｉｓｃｏｅｌｅａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｃｏｐｌａｓｔｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１６）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ／ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ－ａｎｄ－ｖｉｓｃｏｐｌａｓｔｉｃ－ｍａｔｅｒｉａｌｓ／ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｒｓ－ｆｏｒ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ－ｍａｔｅｒｉａｌｓにて入手可能）、及びＶｉｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ－ｂａｓｅｄ ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｒｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｆｉｌｍｓ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ４７（３）：２５４－６３（２０１１）で論じられており、これらのうちの全体が（ｅｎｔｉｒｅｌｙ ｏｆ ｔｈｅｓｅ）、参照により本明細書に組み込まれる。

シルクポリペプチドの親水性部分は、湿気として空気中に存在する周囲の水を結着し得るため、ほとんど常に水は存在しており、結着した周囲の水は、シルクポリペプチドを可塑化し得る。いくつかの実施形態では、好適な可塑剤は、単独、又は水若しくは他の可塑剤との組み合わせのいずれかで存在するグリセロールであってもよい。他の好適な可塑剤は、上で論じられている。

加えて、組換えスパイダーシルクポリペプチドが発酵によって産生され、それから組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末として回収される場合、可塑剤として作用するか、さもなければ三次構造の形成を阻害する不純物が、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在し得る。例えば、残留脂質及び糖は、可塑剤として作用し、したがって、三次構造の形成を妨げることにより、タンパク質のガラス転移温度に影響を与え得る。

組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末又は組成物の純度及び相対的組成を評価するために、確立された様々な方法を使用し得る。サイズ排除クロマトグラフィーは、それらの相対的なサイズに基づいて分子を分離し、その全長のポリマー及びモノマー形態の組換えスパイダーシルクポリペプチドの相対量、並びに組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末中の高分子量、低分子量、及び中分子量の不純物の量を分析するために使用することができる。同様に、迅速高速液体クロマトグラフィーは、組換えスパイダーシルクポリペプチドのモノマー形態などの、溶液中に存在する様々な化合物を測定するために使用され得る。イオン交換液体クロマトグラフィーは、脂質及び糖などの不純物を含む、溶液中の様々な微量分子の濃度を評価するために使用され得る。質量分析法などの、様々な分子のクロマトグラフィー及び定量化の他の方法は、当該技術分野で十分に確立されている。

実施形態に応じて、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の他の成分に対する、重量によるモノマー形態での組換えスパイダーシルクポリペプチドの量に基づいて計算された純度を有し得る。様々な例において、純度は、組換えスパイダーシルクポリペプチドのタイプ、並びに組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末を回収、分離及び後処理するために使用される技術に応じて、５０重量％～９０重量％の範囲であり得る。

サイズ排除クロマトグラフィー及び逆相高速液体クロマトグラフィーはどちらも、全長組換えスパイダーシルクポリペプチドの測定に有用であり、これらは、処理前後の組成物中の全長スパイダーシルクポリペプチドの量を比較することにより、処理ステップが組換えスパイダーシルクポリペプチドを分解したかどうかを決定するための、有用な技術となる。本発明の様々な実施形態では、処理前後の組成物中に存在する全長組換えスパイダーシルクポリペプチドの量は、最小限の分解を受ける可能性がある。分解の量は、０．００１重量％～１０重量％、又は０．０１重量％～６重量％、例えば、１０重量％又は８重量％又は６重量％未満、又は５重量％未満、３重量％未満、又は１重量％未満の範囲であり得る。

組換えシルク固体及びフィルム組成物、並びに作製方法
実施形態に応じて、組換えスパイダーシルク組成物中の組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の重量による好適な濃度は、１～９０重量％、３～８０重量％、５～７０重量％、１０～６０重量％、１５～５０重量％、１８～４５重量％、又は２０～４１重量％の範囲である。

いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルク組成物中の可塑剤の重量による好適な濃度は、１～６０重量％、１０～６０重量％、１０～５０重量％、１０～４０重量％、１５～４０重量％、１０～３０重量％、又は１５～３０重量％の範囲である。いくつかの実施形態では、可塑剤は、グリセロールである。いくつかの実施形態では、可塑剤は、トリエタノールアミン、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールである

水が可塑剤として使用される場合、組換えスパイダーシルク組成物中の水の重量による好適な濃度は、５～８０重量％、１５～７０重量％、２０～６０重量％、２５～５０重量％、１９～４３重量％、又は１９～２７重量％の範囲である。水が別の可塑剤と組み合わせて使用される場合、それは、５～５０重量％、１５～４３重量％、又は１９～２７重量％の範囲で存在し得る。

成形体の形成後、成形体中の組換えタンパク質の結晶化度が増加され得、それによって成形体が強化される。いくつかの実施形態では、Ｘ線結晶学により測定した際の成形体の結晶化度指数は、２％～９０％である。いくつかの他の実施形態では、Ｘ線結晶学により測定した際の成形体の結晶化度指数は、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、又は少なくとも７％である。

いくつかの実施形態では、硬度、曲げ弾性率、及び曲げ強度などの成形体の特徴を変更するために、様々な薬剤が組換えスパイダーシルク組成物に添加され得る。これらには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート）、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレン、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。他の好適な薬剤は、当該技術分野で周知である。

いくつかの実施形態では、第２のポリマーを添加して、組換えスパイダーシルク組成物とのポリマーブレンド又は二構成成分繊維を作り出すことができる。これらの例では、組換えスパイダーシルクポリペプチドの非晶質領域を分解することなく、組換えスパイダーシルク組成物自体と並行して、溶融に好適となる溶融温度を有する第２のポリマーを含めることが有用であり得る。様々な実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチドとのブレンドに好適なポリマーは、２００℃、１８０℃、１６０℃、１４０℃、１２０℃又は１００℃未満の溶融温度（Ｔｍ）を有する。多くの場合、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、２０℃、又は２５℃又は５０℃超の溶融温度を有する。例示的なポリマー及び溶融温度の非限定的なリストは、以下の表３に含まれる。

（表３）ポリマー

いくつかの実施形態では、水は、冷却中又は成形後のコンディショニング中に蒸発され得る。いくつかの実施形態では、成形後の水の損失は、水の総量に基づいて、１～５０重量％、３～４０重量％、５～３０重量％、７～２０重量％、８～１８重量％、又は１０～１５％の範囲であり得る。多くの場合、損失は、１５重量％未満、場合によっては、１０重量％未満、例えば、１～１０重量％になる。蒸発は、意図的なものであるか、又は適用された処理の結果であり得る。蒸発の程度は、当該技術分野で理解されているように、例えば、適用される動作温度、流速、及び圧力の選択によって、容易に制御することができる。

いくつかの実施形態では、好適な可塑剤は、ポリオール（例えば、グリセロール）、水、乳酸、メチルヒドロペルオキシド、アスコルビン酸、１，４－ジヒドロキシベンゼン（１，４ベンゼンジオール）ベンゼン－１，４－ジオール、リン酸、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリエタノールアミン、酸アセテート、プロパン－１，３－ジオール、又はそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。

様々な実施形態では、可塑剤の量は、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の純度、及び相対的組成に応じて変化し得る。例えば、高純度の粉末は、可塑剤として作用し得る低分子量化合物などの不純物が少なく、したがって、より高い重量パーセンテージの可塑剤の添加を必要とし得る。

特定の実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に対する可塑剤（例えば、グリセロールと水との組み合わせ）の様々な（重量による）比率は、０．５又は０．７５～３５０重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、１又は５～３００重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、１０～３００重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、３０～２５０重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、５０～２２０重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクタンパク質、７０～２００重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、又は９０～１８０重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の範囲であり得る。本明細書で使用される場合、０．５～３５０重量％の可塑剤：組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末への言及は、０．５：１～３５０：１の比率に相当する。

理論に限定されることを意図するものではないが、本発明の様々な実施形態では、組換えスパイダーシルク組成物を、流動可能な状態へと転移するために誘導させることは、組換えスパイダーシルクポリペプチドをそのモノマー形態で含めることが有益である状況下において、任意の配合での前処理ステップとして使用され得る。より具体的には、組換えスパイダーシルク溶融組成物を誘導させることは、モノマーの組換えスパイダーシルクポリペプチドの、その結晶ポリマー形態への凝集を防止すること、又は処理の後の段階で、組換えスパイダーシルクポリペプチドの、その結晶ポリマー形態への転移を制御することが望ましい用途において使用され得る。１つの特定の実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融組成物は、組換えスパイダーシルクポリペプチドを第２のポリマーとブレンドする前に、組換えスパイダーシルクポリペプチドの凝集を防止するために使用され得る。別の特定の実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融組成物を使用して、組換えスパイダーシルクポリペプチドがそのモノマー形態で基剤に存在している、化粧品又はスキンケア製品の基剤を作リ出すことができる。この実施形態では、基剤中に組換えスパイダーシルクポリペプチドをそのモノマー形態で有することにより、皮膚との接触時に、又は様々な他の化学反応を介して、モノマーの、その結晶ポリマー形態への凝集の制御が可能になる。

化粧品又はスキンケア製品は、皮膚又は毛髪に直接適用され得る。いくつかの実施形態では、成形体は、低い溶融温度を有する。様々な実施形態では、成形体は、体温（約３４～３６℃）よりも低い溶融温度を有し、皮膚との接触時に溶融する。

上で論じた化粧品又はスキンケア製品は、実施形態及び製品の所望の効能に応じて、様々な湿潤剤、皮膚軟化剤、閉塞剤、活性剤及び化粧品補助剤を含有し得る。

本明細書で使用される「湿潤剤」という用語は、水分子と結合を形成する吸湿性物質を指す。好適な湿潤剤には、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ペンタリエン（ｐｅｎｔａｌｙｅｎｅ）グリコール、トレメラ（ｔｒｅｍｅｌｌａ）抽出物、ソルビトール、ジシアンアミド、乳酸ナトリウム、ヒアルロン酸、アロエベラ抽出物、アルファ－ヒドロキシ酸、及びピロリドンカルボキシレート（ＮａＰＣＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「皮膚軟化剤」という用語は、皮膚表面のひび割れを埋めることによって、皮膚に柔らかい又はしなやかな外観を提供する化合物を指す。好適な皮膚軟化剤には、シアバター、コカオ（ｃｏｃａｏ）バター、スクアレン、スクアラン、オクタン酸オクチル、ゴマ油、ブドウ種子油、オレイン酸を含有する天然油（例えば、甘いアーモンド油、アルガン油、オリーブ油、アボカド油）、ガンマリノール酸を含有する天然油（例えば、月見草油、ルリヂサ油）、リノール酸を含有する天然油（例えば、ベニバナ油、ヒマワリ油）、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。「閉塞剤」という用語は、水分を保持するために皮膚表面にバリアを形成する化合物を指す。場合によっては、皮膚軟化剤又は湿潤剤は、閉塞剤であり得る。他の好適な閉塞剤には、蜜蝋、カヌバ（ｃａｎｕｂａ）蝋、セラミド、野菜性蝋、レシチン、アラントインが含まれ得るが、これらに限定されない。理論に限定されるものではないが、組換えスパイダーシルクポリペプチドの作用は水分子を引き付け、湿潤剤のようにも作用するため、本明細書に提示される組換えスパイダーシルク組成物のフィルム形成能力は、水分保持バリアを形成する閉塞剤を作る。

「活性剤」という用語は、スキンケア配合物又は日焼け止めにおいて既知の有益な影響を有する、任意の化合物を指す。様々な活性剤には、酢酸（すなわち、ビタミンＣ）、アルファヒドロキシル酸、ベータヒドロキシル酸、酸化亜鉛、二酸化チタン、レチノール、ナイアシンアミド、他の組換えタンパク質（全長配列として、又は部分配列若しくは「ペプチド」に加水分解されたもののいずれか）、銅ペプチド、クルクミノイド、グリコール酸、ヒドロキノン、コウジ酸、ｌ－アスコルビン酸、アルファリポ酸、アゼライン酸、乳酸、フェルラ酸、マンデル酸、ジメチルアミノエタノール（ＤＭＡＥ）、レスベラトロール、抗酸化物質を含有する天然抽出物（例えば、緑茶抽出物、松の木の抽出物）、カフェイン、アルファアルブチン、コエンザイムＱ－１０、及びサリチル酸が含まれ得るが、これらに限定されない。「化粧品補助剤」という用語は、界面活性剤、乳化剤、防腐剤及び増粘剤を含むがこれらに限定されない、商業的に望ましい特性を有する化粧品製品を作り出すために使用される、様々な他の薬剤を指す。

様々な実施形態では、組換えスパイダーシルク組成物が成形中に加熱される温度は、組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解を最小限に抑えるか、又は完全に防止するために、最小限に抑えられる。特定の実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融物は、１２０℃未満、１００℃未満、８０℃未満、６０℃未満、４０℃未満、又は２０℃未満の温度に加熱される。多くの場合、溶融物は、成形中に１０℃～１２０℃、１０℃～１００℃、１５℃～８０℃、１５℃～６０℃、１８℃～４０℃、又は１８～２２℃の範囲の温度になる。

本発明のいくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルク固体又はフィルムは、光学顕微鏡により検査した際に、材料が介在物又は沈殿物を少量有するか、又は全く有さないことを意味する、実質的に均質なものとなる。いくつかの実施形態では、光学顕微鏡を使用して複屈折を測定することができ、これは、組換えスパイダーシルクの三次元格子への整列の代用として使用することができる。複屈折は、光の偏光及び伝搬に依存する屈折率を有する材料の光学特性である。具体的には、複屈折によって測定される高度の軸方向秩序は、高い引張強度に関連付けることができる。いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルク固体及びフィルムは、最小限の複屈折を有する。

組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解の量は、様々な技術を使用して測定され得る。上に論じたように、組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解の量は、存在する全長組換えスパイダーシルクポリペプチドの量を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定され得る。様々な実施形態では、組成物は、それが成形体に形成された後、６．０重量％未満の量で分解される。別の実施形態では、組成物は、成形後に４．０重量％未満、３．０重量％未満、２．０重量％未満、又は１．０重量％未満の量で（分解の量が、０．００１重量％～１０重量％、８重量％、６重量％、４重量％、３重量％、２重量％、若しくは１重量％、又は０．０１重量％～６重量％、４重量％、３重量％、２重量％、若しくは１重量％の範囲であり得るように）分解される。別の実施形態では、溶融組成物中の組換えスパイダーシルクタンパク質は、実質的に分解されていない。

いくつかの実施形態では、成形体は、架橋されている。例えば、いくつかの実施形態では、成形体の形成中又は形成後に、成形体を過硫酸アンモニウムに浸して、成形体中のタンパク質間の架橋を促進する。いくつかの実施形態では、当該架橋は、酵素架橋である。いくつかの実施形態では、当該架橋は、光化学架橋である。

いくつかの実施形態では、望ましい機械的特性を有する架橋された組換えシルク成形体、及びそれらを製造する方法が、本明細書に提供される。本明細書で提供される架橋された成形体組成物は、ある特定の用途において好ましい柔軟性、硬度、又は強度などの所望の機械的特性を達成するように架橋され得る。いくつかの実施形態では、組換えシルク成形体組成物を架橋して、架橋された組換えシルク固体を形成する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、架橋反応は、成形体を過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩にさらすことを含む。熱を適用して、過硫酸塩によって触媒される架橋反応を開始することができる。このタイプの架橋反応は、組成物中にいずれの光活性化合物又は酵素化合物も残さない。更に、この架橋反応は、光活性化を必要としないため、光が架橋溶液の全ての部分に到達する必要がなく、大量のバッチを効率的に生成することができる。いくつかの実施形態では、架橋は、得られた組換えシルク成形体が特定の形状又は形態を有するように、容器又は型内で起こる。

いくつかの実施形態では、成形体は、３Ｄ印刷を介して形成される。したがって、いくつかの実施形態では、成形体は、所望の３Ｄ構造を構築するために、連続して流動可能な状態の組換えシルク及び可塑剤を含む組成物の薄層を堆積又は形成することによって形成される。各層は、あたかも１つの層の印刷であるかのように、例えば、ある種の印刷ヘッドを加工物上で動かし、印刷ヘッドの要素を作動させることによって形成され、「印刷」を作り出す。重合可能な液体材料。したがって、いくつかの実施形態では、成形体は層ごとに形成される。各層は、流動可能な状態の組換えシルク及び可塑剤を含む分散組成物を含み、分散組成物は、形成される物体による断面と同じパターンで架橋又は固化される。１つの層が完成した後、分布した組成物のレベルを小さな距離にわたって上げ、プロセスを繰り返す。各重合層は、次の層を支持するために十分に安定して形成されなければならない。

別の実施形態では、組換えシルク及び可塑剤を含む組成物は、形成される物体の断面の形状に従って、基材上に分布され、合着される。更に別の実施形態では、組換えシルク及び可塑剤を含む組成物は、形成される物体の関連する断面に応じたパターンで堆積される、液滴の形態で堆積される。なお別の方法は、高温で組成物の液滴を分配し、次いで、より低温の加工物と接触して固結させることを伴う。

組換えシルク固体及びフィルムの再形成
本発明のいくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルク成形体を製造するためのプロセスは、組換えスパイダーシルクを含む成形体（例えば、組換えスパイダーシルクから形成された固体、フィルム、又は他の成形物品）を再処理することを追加的に含み得る。

理論に限定されることを意図するものではないが、グリセロールなどの可塑剤の存在下で、組換えスパイダーシルクポリペプチドを熱及び圧力に供することにより、組換えスパイダーシルクポリペプチドが「開放形態（ｏｐｅｎ－ｆｏｒｍ）組換えスパイダーシルクポリペプチド」に変換され、非結晶化及び非晶質組換えスパイダーシルクポリペプチドセグメントが展開し、可塑剤との相互作用を形成する。可塑剤との相互作用により、この「開放形態組換えスパイダーシルクポリペプチド」は、固体の成形及び形成を可能にする。具体的には、開放形態組換えスパイダーシルクポリペプチドは、分子間相互作用を形成して、不可逆的な三次元格子を形成することを防止する。

成形プロセス中の組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解は（あるとしても）最小限であるため、いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルク成形体は、成形体を流動可能な組換えスパイダーシルク組成物へと転換して戻すことによって再処理され、次いで、再成形される。様々な実施形態では、組換えスパイダーシルク成形体は、少なくとも２０回、少なくとも１０回、又は少なくとも５回再成形され得る。これらの実施形態では、複数の再成形ステップにわたって見られる分解は、１０％程度に低くなり得る。分解のない再成形の選択肢により、実質的に均質な組成物の生成、及び組成物から形成された製品の転用又は再設計が可能になる。例えば、品質が不十分な成形製品は、再成形され得る。寿命末期の製品のリサイクルも可能である。

同等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載の本発明による特定の実施形態に対する多くの同等物を認識し、又は日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されているものである。

特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対のことが示されない限り、又はそうでなければ文脈から明らかでない限り、１つ以上を意味し得る。グループの１つ以上のメンバーを含む「又は」メンバー間の特許請求の範囲又は説明は、反対のことが示されない限り、又はそうでなければ文脈から明らかでない限り、所与の製品又はプロセスに１つ、２つ以上、又は全てのグループメンバーが存在する、採用される、又は他の方法で関連する場合、満たされていると見なされる。本発明は、グループのうちの厳密に１つのメンバーが、所与の製品又はプロセスに存在する、採用される、又は他の方法で関連する実施形態を含む。本発明は、グループメンバーのうちの２つ以上、又は全てが、所与の製品又はプロセスに存在する、採用される、又は他の方法で関連する実施形態を含む。

「含む」という用語は、オープンであることが意図され、許容されるが、追加の要素又はステップを含む必要はないことも留意されたい。したがって、「含む」という用語が本明細書で使用される場合、「からなる」という用語も包含され、開示される。

範囲が与えられている場合、終点は含まれる。更に、別段の指示がない限り、又はそうでなければ文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が別の方法で明確に指示しない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態において記載された範囲内の任意の特定の値又は部分範囲を想定することができることが理解されるべきである。

全ての引用された情報源、例えば、本明細書で引用された参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び技術は、引用で明示的に記載されていなくても、参照により本出願に組み込まれる。引用された情報源及び本出願の記述が矛盾する場合には、本出願の記述を優先するものとする。

セクション及び表の見出しは、限定することを意図していない。

以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。実施例は、例示のみを目的として提供されており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、当然ながら、若干の実験誤差及び偏差は許容されるべきである。

本発明の実施は、別段の指示がない限り、当該技術分野の範囲内で、タンパク質化学、生物化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を採用する。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照のこと。

実施例１：組換えシルクタンパク質固体の形成
ベータシートは、シルク材料の構造的完全性において重要な役割を果たす。それらは、シルクの結晶セグメントを構成している。典型的には、ベータシートが形成されるとき、ベータシートを妨害するために強力なカオトロピック溶媒が必要とされる。ベータシートの溶融温度は、その分解点を超えている。しかしながら、ガラス転移温度は、分解温度よりも低く、可塑剤を使用することにより更に低減され得る。

固体を作製するためには、適切なもつれが必要である。ベータシートの溶融温度は高すぎるが、タンパク質の大部分が非晶質であるため、非晶質鎖に鎖の移動性を提供して、適切なもつれを可能にすることができる。熱及び可塑剤を適用すると、熱ガラス転移温度を低減させることができる。１８Ｂ固体を得るために必要な３つの成分は、熱、圧力、及び可塑剤である。

１８Ｂポリペプチド配列（配列番号１）の組換えスパイダーシルクを、様々なロットの大規模発酵によって生成して、粉末にて回収し、乾燥させた（「１８Ｂ粉末」）。１８Ｂ組換えシルク粉末の製造の詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０４２１６４号「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｉｌｋ Ｆｉｂｅｒｓ」に見出される。家庭用スパイスグラインダを使用して、組換えシルク粉末を混合した。水及び可塑剤の比率を、１８Ｂ粉末に添加して、可塑剤に対してタンパク質粉末の比率が異なる組換えスパイダーシルク組成物を生成した。得られた組成物は、１０～５０重量％のトリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールであった。次いで、混合物を１３０℃でプレスした。１５００～１５０００ｐｓｉの範囲の圧力を使用して、サンプルを型にプレスした。

図１に示すように、３０重量％のＴＥＯＡでは、プレス中にＴＥＯＡ可塑剤の一部が型から絞り出された。これは、ＴＥＯＡを粉末全体に均一に分布することができる場合、ＴＥＯＡの量を下げることができることを示唆している。粉末粒子を圧縮するために圧力を使用した。

固体の硬度を、デュロメータを用いて測定した。デュロメータは、材料へと貫入する圧子を有する。貫入が大きいほど、材料は柔らかくなり、測定される硬度値は低くなる。硬度の様々な範囲を対象とした複数のタイプのデュロメータがある。タイプＡデュロメータは軟質プラスチック用であり、値が９０を超える場合は、タイプＤデュロメータを使用するべきである。それらの間の違いは、圧子の形状及び適用される力である。デュロメータＤは、より硬いプラスチックを対象としているため、より鋭い圧子及びより高い押し込み力を有する。ＴＥＯＡ、プロピレングリコール、トリメチレングリコール（１，３プロパンジオール）を用いてプレスされた固体は全て、タイプＡにより測定した場合、１００の硬度を有しており、それらの硬度は、タイプＡデュロメータにより測定可能な硬度を超えていることを示す。ＴＥＯＡ処理固体は、タイプＤデュロメータにより測定した際に７６ＨＤの硬度を有していた。トリメチレングリコール処理固体は、タイプＤデュロメータにより測定した際に７１ＨＤの硬度を有していた（図２）。比較のために、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）の保護帽は、同様の硬度を有している。プロピレングリコール固体は、最も低い硬度を有しており、タイプＤデュロメータにより測定した際に、５５ＨＤに始まり１０秒間以内に３０まで低下した。固体は、それらの剛性が、固体の工具の力による変形を防止したため、所望の形状へと機械加工、切断、及び穴あけすることができた（図２）。

実施例２：シルク固体中の組換えシルクの分解
プレスされたフィルム及び固体のＳＥＣ結果は、固体サンプル、フィルムサンプル（実施例５を参照）、及び対照１８Ｂ粉末の間で同様の低分子量及び中分子量を示した。これは、プレスによって生じる分解が、最小限又は存在しないことを示唆していた。

表４．対照粉末とともに、プレスされた固体及びフィルムのＳＥＣデータ。Ｎ＝２の平均結果及び標準偏差。ＨＭＮＩ＝高分子量不純物；ＩＭＷＩ＝中分子量不純物；ＬＭＷＩ＝低分子量不純物。全てのサンプルは、同じ１８Ｂ粉末ロットによるものであった。固体を、３０重量％（ｗｔ％）（重量％（％by weight））のＴＥＯＡを用いてプレスし、フィルムを、４０重量％のグリセロールを用いてプレスした。
（表４）組換えシルク固体及び前駆体の組成

タンパク質分解データを表５まとめる。ここでは、サンプルを１３０℃で加熱し、時間を増加させてプレスをした。各時点で、固体をサンプリングし、型に入れて戻し、熱及び圧力を適用した。サンプル間のＨＭＷＩ、１８Ｂ凝集体及び１８Ｂモノマー、並びにＩＭＷＩ及びＬＭＷＩの値に基づくと、最大１０分間まで顕著な分解はなかった。２０分間から後は、１８Ｂモノマーの含有量が低下する一方で、中間（ＩＭＷＩ）及び低（ＬＭＷＩ）分子量の成分が増加し、２０分を超える分解を示唆していた。固体をより長い時間プレスすると、それはまた、より暗くなった（図３）。

表５．対照粉末（ＳＬＤ３３－Ｐ）、溶媒を用いて可塑化された粉末（ＳＬＤ３３－ＰＨ）、及びプレス時間を増加させるプレス固体（ＳＬＤ３３）のＳＥＣデータ。全てのサンプルは、同じ１８Ｂ粉末ロットによるものであった。固体を、１５重量％の１，３プロパンジオールを用いてプレスした。

実施例３：１８Ｂ固体の曲げ特徴評価
１８Ｂタンパク質粉末は、本明細書（例えば、実施例１）に記載されるように圧縮成形を介して焼結した場合に、望ましい固体の特徴を有する安定なタンパク質粉末として有望な能力を示した。トリメチレングリコール（ＴＭＧ又は１，３－プロパンジオール）を、成形を補助するための好適な可塑剤として特定した。成形プロセスを最適化する目的のために、１８Ｂ－ＴＭＧ固体の機械的特性の更なる特徴評価を必要とした。１５重量％のＴＭＧ固体粉末を有する１８Ｂのバッチを作り出し、ＡＳＴＭ Ｄ７９０に従って３点曲げ試験に供した。

以下に記載するように、成形保持時間、冷却速度、成形後のコンディショニング、及び平均プレス荷重を含む、一連の処理パラメータにわたる１８Ｂ固体の機械的特性を提供した。最終固体製品の機械的特性に有益又は有害な処理パラメータもまた発見し、それによって、処理効率及び能力を改善した。

材料及び方法
組換えシルク固体の曲げ特徴を試験するために、ＡＳＴＭ Ｄ７９０規格では、スパン対深さ（厚さ）の比率をできるだけ１６：１に近づけることを推奨しているが、Ｚｗｉｃｋでは、スパン対深さの比率を１５：１～１７：１に保持することを推奨している。この実験では、最終の試験片の深さが２．２５ｍｍ～２．５４ｍｍになるように、装置のスパンを３８．１ｍｍに固定した。

２５．４ｍｍｘ５０．８ｍｍ（１インチｘ２インチ）の圧縮型を使用すると、固体の最終重量グラム当たり０．６６ｍｍの厚さが得られた。成形中の重量の約１０％の減少の観察に基づいて、最終の試験片の深さを達成するために、試験片当たり３．８ｇ～４．０ｇの成形前の重量を使用した。

１８Ｂ粉末２５５．１６ｇ及びＴＭＧ４５．３４７ｇを使用して１８Ｂ／ＴＭＧ混合物を調製し、これをスパイスグラインダを使用して５回混合し、ＴＭＧ１５．１重量％／１８Ｂ８４．９重量％の合計３００．５ｇのマスターバッチを得た。これらを、定義された条件下での成形、及びその後の曲げ特徴の試験のために、各々４．０ｇの試験片に分離した。

試験のために６３個にわたる試験片を使用し、平均のスパン対深さの比率は、０．３５の標準偏差を有する１５．７２であり、０．０２２の変動係数が得られた。Ｚｗｉｃｋ ＰｒｏＬｉｎｅにおける試験構成を、ＡＳＴＭ Ｄ７９０の試験プログラムファイルに従って実施した。重要な試験パラメータは、０．１ＭＰａの予備荷重（ｐｒｅ－ｌｏａｄ）、３ｍｍの開始位置間隔、及び２５４ｍｍ／分のクロスヘッド速度であった。

試験した組換えシルク固体調製条件は、成形時間、冷却速度、成形後のコンディショニング、及び成形中の平均荷重であった。

成形時間は、型が１３０℃で圧縮されている時間（分）として定義される。１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、８分間、１０分間、及び１５分間の成形時間を試験した。

成形後のコンディショニングでは、コンディショニングされるサンプルを、成形時間の後、６５％の相対湿度（ＲＨ）で最低７２時間、コンディショニングチャンバ内に置いた。コンディショニングしていない試験片は、実験室の周囲条件下で作業台の上に保管した。

平均荷重は、試験片が受けたメートルトンにおける荷重であった。試験片のサイズ及び型のサイズは一定であったため、サンプルグループ内の各試験片を、成形中にほぼ同等の圧力に供した。１メートルトン、２メートルトン、３メートルトン、４メートルトン、及び５メートルトンの平均荷重を試験した。

最後に、冷却速度レベルは、遅い、中程度、又は急速のいずれかとして定義された。各レベルを、固体試験片を取り出すために型を開いたときに開始する、１分間隔（低速、中程度）、又は１０秒間隔（急速）のいずれかの固体表面温度を記録する、ＩＲ温度計を使用して定量化した。以下に示す曲線の結果は、遅い、中程度、及び急速について、それぞれ、０．９２℃／分、２．７℃／分、及び４５．２℃／分の冷却速度をもたらした。図４Ａ～４Ｃを通して、中程度の冷却速度によるサンプルは、遅い及び急速冷却速度によるサンプルと比較して異なる保持時間にあったが、冷却の速度は、保持時間によって実質的に異ならなかった。上で定義した遅い、中程度の、及び急速の冷却速度を試験した。

以下の表６は、各サンプルＩＤの調製に使用された条件を示す。各サンプルＩＤを、調製された合計６３個の１８Ｂ固体サンプルに対して３連で実行した。

（表６）サンプルＩＤの調製条件

成形後のコンディショニング
４．０ｇのサンプルを使用して上記のように１８Ｂ固体サンプルを成形し、２メートルトンの平均荷重下で１３０℃で成形した。成形されたサンプルを、中程度の冷却速度で冷却し、成形後に６５％の相対湿度（ＲＨ）で最低７２時間、コンディショニングにさらすか、又はさらさなかった。サンプルを、１、２、３、４、又は５分間成形した。成形後のコンディショニングの影響を評価するための条件は、表６に提供されたサンプル１～９及び１１に基づいていた。

図５は、コンディショニングされていない１８Ｂ固体サンプル対コンディショニングされた１８Ｂ固体サンプルから生成された、応力－ひずみ曲線を示している。応力－ひずみ曲線を使用して、破断点伸びを含む、１８Ｂ固体の機械的特性を決定した。表６及び表７に示すように、サンプルＩＤ１、３、５、７、及び９はコンディショニングされており、サンプルＩＤ２、４、６、８、及び１１はコンディショニングされていなかった。

コンディショニングされた１８Ｂ固体サンプル対コンディショニングされていない１８Ｂ固体サンプルについての曲げデータを、以下の表７に示す。３連で測定された、コンディショニングされたサンプル対コンディショニングされていないサンプルの各々についての、曲げ弾性率（ＭＰａ）、最大曲げ強度（ＭＰａ）、及び破断点伸び（％）の平均値を、（測定された標準偏差（ＳＤ）とともに）提供する。２０％の伸びは、２０％が試験可能な最大の伸びであったため、固体の破壊がないことを示していることに留意されたい。

（表７）コンディショニングされた１８Ｂ固体サンプル対コンディショニングされていない１８Ｂ固体サンプル（曲げデータ）

図６は、１分間の保持時間の、６５％ＲＨ環境での７２時間のコンディショニングに供した（左）、及びコンディショニングされていない（右）固体の形態を示す。固体は、同等の粒子サイズを有していたが、コンディショニングされた試験片は、粒子間により明確な非晶質領域を有し、延性が増加する可能性があった。

巨視的には、６５％ＲＨでコンディショニングされたサンプルは全て、コンディショニングされていない対照物と比較して、荷重下でより延性があることが明らかであった。ＴＭＧ可塑剤に存在する２つのヒドロキシル基は、水溶性及び吸湿性の増加に寄与していた。図６に示すように、型内での時間が短いほど、粉末様の形態を有し、より多くの粒子を含有した固体が得られた。

コンディショニングの影響に基づいて、コンディショニングされたサンプルの剛度と伸びとの間にはトレードオフがあった。試験片をコンディショニングすることにより、それほど強度も硬さもなく、破損しない試験片を作り出した。試験装置の安全限界により、試験は最大２０％の伸びで停止する必要があり、コンディショニングされたサンプルはいずれもその伸びまで破損しなかった。また、コンディショニングされていないサンプルは、より多くの変動性を有していた。コンディショニングの影響は、架橋されていない１８Ｂ固体で顕著であり、それらは水にさらされやすいことを示唆している。したがって、架橋された１８Ｂ固体は、１８Ｂ固体の水に対する応答が減少されるように生成される。架橋された１８Ｂ固体についての強度、剛性、及び伸びの機械的特徴もまた最大化される。

コンディショニングされたサンプルは、それらの伸び率が、Ｚｗｉｃｋ ＰｒｏＬｉｎｅによる所定位置での安全対策を超えていたため、破損しなかった。その理由のため、コンディショニングされたサンプルの破損表面は、評価できなかった。コンディショニングされていないサンプルの破損表面の、肉眼による（目による視覚的）破損後視検では、ほぼ全ての曲げ破損が、処理に応じて延性挙動の程度がわずかに変化する、非常に脆いものとして特徴評価することができることが明らかとなった。開始は典型的には、試験片の幅の中心から０．５ｃｍ以内であった。３つの表面のＳＥＭの画像化により、これらの結論を確認した。

成形後の冷却速度
４．０ｇのサンプルを使用して上記のように１８Ｂ固体サンプルを成形し、２メートルトンの平均荷重下で１３０℃で５分間成形した。成形されたサンプルを、遅い、中程度の、又は急速の冷却速度で冷却した。冷却速度を測定するための方法論、並びに遅い、中程度、及び急速冷却の定量的基準は、上記の材料及び方法で説明されている。冷却速度の影響を評価するための条件は、表６に提供されたサンプル１０～１２に基づいている。

図７は、１８Ｂ固体の機械的特性に対する、冷却速度の影響を評価するための、サンプル１０～１２から生成された応力ひずみ曲線を示す。１０、１１、及び１２シリーズはそれぞれ、遅い、中程度の、及び急速の冷却速度に対応する。

遅い、中程度の、及び急速の冷却速度での１８Ｂ固体サンプルの曲げデータを、以下の表８に示す。３連で測定された、コンディショニングされたサンプル対コンディショニングされていないサンプルの各々についての、曲げ弾性率（ＭＰａ）、最大曲げ強度（ＭＰａ）、及び破断点伸び（％）の平均値を、（測定された標準偏差（ＳＤ）とともに）提供する。

（表８）１８Ｂ固体サンプルに対する冷却速度の影響（曲げデータ）

図８は、（Ａ）遅い冷却、（Ｂ）中程度の冷却、及び（Ｃ）急速冷却にさらした１８Ｂ固体の形態を示す。

構造ポリマーでは、冷却速度の増加により、比較的同様の伸びを有する、より強力かつより硬いサンプルが得られる。より速い冷却は、より小さい結晶、及びより低い結晶性（非晶質領域がより多くなる）をもたらすため、それはより低い剛性が予想される。しかしながら、現在の結果はその仮定と矛盾している。平均して、遅い冷却は、それぞれ、２６２．７２ＭＰａ及び５．２９ＭＰａの曲げ弾性率及び最大強度を有していた。平均して、中程度の冷却サンプルでは、それぞれ、３０９．５４ＭＰａ及び６．１１ＭＰａの曲げ弾性率及び最大強度が得られた。急速に冷却されたサンプルは、平均して、それぞれ、２９２．３５ＭＰａ及び６．１２ＭＰａの曲げ弾性率及び最大強度を有していた。冷却速度が増加するにつれて、変動性は減少した。

成形圧力
４．０ｇのサンプルを使用して上記のように１８Ｂ固体サンプルを成形し、１３０℃で５分間成形し、続いて中程度の冷却速度で冷却した。サンプルを、１メートルトン、２メートルトン、３メートルトン、４メートルトン、又は５メートルトンの平均荷重下で成形した。成形中の平均荷重圧力の影響を評価するための条件は、表６に提供されたサンプル１３～１７に基づいている。

図９は、１８Ｂ固体の機械的特性に対する、成形圧力（平均荷重）の影響を評価するための、サンプル１３～１７から生成された応力ひずみ曲線を示す。１３、１４、１５、１６、及び１７シリーズはそれぞれ、１、２、３、４、及び５メートルトンに対応する。

異なる平均荷重での１８Ｂ固体サンプルの曲げデータを、以下の表９に示す。３連で測定された、コンディショニングされたサンプル対コンディショニングされていないサンプルの各々についての、曲げ弾性率（ＭＰａ）、最大曲げ強度（ＭＰａ）、及び破断点伸び（％）の平均値を、（測定された標準偏差（ＳＤ）とともに）提供する。

（表９）１８Ｂ固体サンプルに対する成形圧力の影響（曲げデータ）

サンプルＩＤ番号１３～１７は、５分間プレスし、中程度の速度で冷却したサンプルの異なるプレス荷重の影響を示していた。プレス荷重の増加による傾向は、曲げ弾性率の増加であったが、強度及び伸び率の傾向は、変動性のために確信的に識別することができなかった。設定荷重が増加すると、強度は、荷重平均１メートルトンのときに大きくなり（平均で５．６８ＭＰａ）、その後の荷重平均２～４メートルトンのときに減少し、次いで平均荷重が５メートルトンのときに最大の５．８５ＭＰａまで増加した。依然として、強度に対するプレス荷重の効果は、変動性のために確定的ではなかった。伸び率は、平均荷重に応じて２．０５％～４．３８％の範囲であり、任意の重大な、顕著な傾向はなかった。組換えシルク固体材料の剛度を最大化するためには、３～５メートルトンの平均荷重が好ましいことを決定した。

分散したタンパク質粒子は、黒い点のように見えるが、文脈に応じて図１０に示すように表面の気孔空隙であり得る。粒子は、それら自体を、これらの空隙に優先的に配置する傾向があった。プレス荷重を増やすと、分散した粒子の数が減少するように見えるが、（図１１に示すように）３メートルトンを超えるとその利点は減少した。具体的には、図１１は、異なる平均プレス荷重によって生成された固体の画像を示している。平均荷重が（Ａ）１メートルトンから（Ｂ）３メートルトン、（Ｃ）５メートルトンに増加するにつれて、分散したタンパク質粒子の量の減少があった。

成形時間
４．０ｇのサンプルを使用して上記のように１８Ｂ固体サンプルを成形し、２メートルトンの平均荷重下で１３０℃で成形した。サンプルを、１、２、３、４、５、６、８、１０、又は１５分間成形した。成形されたサンプルを、中程度の冷却速度で冷却し、コンディショニングは行わなかった。成形後のコンディショニングの影響を評価するための条件は、表６及び表１０に提供されたサンプル２、４、６、８、１４、１８、１９、２０、及び２１に基づいている。

図１２は、１８Ｂ固体の機械的特性に対する、成形時間の影響を評価するための、サンプル２、４、６、８、１４、１８、１９、２０、及び２１から生成された応力－ひずみ曲線を示す。２、４、６、８、１４、１８、１９、２０、及び２１シリーズはそれぞれ、１、２、３、４、５、６、８、１０、及び１５分間の成形時間と対応する。

異なる長さの時間で成形された１８Ｂ固体サンプルの曲げデータを、以下の表１０に示す。３連で測定された、コンディショニングされたサンプル対コンディショニングされていないサンプルの各々についての、曲げ弾性率（ＭＰａ）、最大曲げ強度（ＭＰａ）、及び破断点伸び（％）の平均値を、（測定された標準偏差（ＳＤ）とともに）提供する。

（表１０）１８Ｂ固体サンプルに対する成形時間の影響（曲げデータ）

成形保持時間の増加は、固体の剛度の増加を示唆するのみであったことを発見した。成形時間が変化しても、固体の曲げ強度及び破断点伸び率に、統計的に重大な任意の効果を与えることはないように思われた。これは、それぞれ、平均曲げ弾性率、平均曲げ強度、及び平均破断点伸びのための図１３、図１４、及び図１５で裏付けられた。具体的には、図１３は、保持時間にわたる平均曲げ弾性率（ＭＰａ）を示している。保持時間が増加するにつれて、平均曲げ弾性率が増加した。エラーバーは、サンプルの標準偏差を示している。図１４は、保持時間にわたる平均曲げ強度（ＭＰａ）を示している。試験した全ての成形時間にわたって、最大曲げ強度に統計的に重大な差があるようには見えなかった。図１５は、保持時間にわたる平均破断点伸び（％）を示している。破断点伸び率と保持時間との間に任意の重大な関係があるようには見えなかった。エラーバーは、サンプルの標準偏差である。

曲げ弾性率は一般に、保持時間が増加するにつれて増加した。曲げ強度については、任意の所与の保持時間の公称値が、他の成形時間の誤差の範囲内であったことに留意されたい。その理由のため、成形時間に基づく強度の重大な差は見られないと結論付けることができた。同様に、保持時間と破断点伸びとの間に任意の重大な関係があるようには見えなかった。比較的大きな誤差の範囲及び変動性は、時間の制約により、試験をサンプルグループごとに３つの試験片に制限することで、部分的に説明され得る。これらの結果から、３～５メートルトンの平均荷重及び中程度の冷却速度を伴う約５～８分間の成形時間を中心に今後の処理を行うことが推奨された。成形時間をより長くすると、平均してより硬い固体を得ることができるが、長すぎる成形時間の増加は、スループット／生産性を低下させる結果となった。あるいは、成形時間をより短くすると、粉末様の固体が生じ、これは、審美的に非常に満足できるものではなかった。

破損前の試験片表面の光学顕微鏡検査は、固体形態に対する４つの要因の各々の影響を明らかにし、固体処理における各要因の役割の理解を手助けすることを意図していた。成形時間のみを１分間から１５分間まで変化させる結果を、図１６に示す。具体的には、図１６は、等しい平均荷重及び冷却速度を維持して、様々な保持時間：（Ａ）１分間（Ｂ）３分間（Ｃ）５分間（Ｄ）８分間（Ｅ）１０分間（Ｆ）１５分間に供したコンディショニングされていない固体の形態を示す。成形時間が１分間から５分間に増加すると、成形の追加の各分ごとに粒子凝集体が大幅に減少した。

この結論は、図１７に示す目視の肉眼検査によって裏付けられ、より長い成形時間が、より均質で半透明な固体をもたらした。具体的には、図１７は、（Ａ）固体黒色表面（Ｂ、Ｃ）明るい光に対する、１分間の保持時間と５分間の保持時間との間の肉眼による目視検査を示す。より長い保持時間を有する固体は、粉末の塊が目立ちにくくなり、より半透明であった。粒子の凝集体は、１５分間でもまだ存在していたが、５～６分間を超えると重大な差異の欠如が認められた。推奨される成形時間は、タンパク質を高温に長時間さらすことを避け、顕著な粒子凝集体を最小限に抑えるために、最大３ｍｍの範囲の厚さに対して５分間であった。

図１８は、異なる成形時間にわたってＢｅｎｃｈｔｏｐ ＳＥＭにより画像化した組換えシルク成形体の破損後の表面を示す。（Ａ）より高いコントラストのために暗色化された１分間の保持時間（Ｂ）５分間の成形時間（Ｃ）１５分間の成形時間。５分間の保持時間は、延性と脆性挙動の最も優れた混合を示した。

結論
最も優れた剛度を有する試験片は、より大きな成形時間、及び増加したプレス荷重の結果であった。硬い固体に向けての最も良好な経路として、これらのサンプルを調査することが推奨された。最も有望な試験片は、サンプルＩＤ番号１１、１２、及び１７によるものであった。成形時間に基づく強度及び伸びの傾向は、サンプル間の変動が大きいため、確信的に識別することができなかった。

推奨される成形時間は、５～８分間であった。成形時間をより長くすると、平均してより硬い固体を得ることができるが、長すぎる成形時間の増加は、スループット／生産性の低下を生じさせ、かつタンパク質の分解を引き起こした。あるいは、５分間未満のより短い成形時間では、粉末様の固体が生じ、これは、審美的に非常に満足できるものではなかった。

急速、中程度、及び遅い冷却の間で、弾性率、最大強度、及び破断点伸びに、統計的に重大な差があるようには見えなかった。中程度及び遅い冷却は実行するために最も便利であるため、それらが推奨された。

最も優れた破断点伸び率を有する試験片は、６５％の相対湿度（ＲＨ）で最低７２時間コンディショニングされ、Ｚｗｉｃｋ ＰｒｏＬｉｎｅ装置の能力をはるかに超える破断点伸び率を示していた。

実施例４：架橋された組換えシルク固体
過硫酸アンモニウムを使用して１８Ｂ固体を架橋した。過硫酸アンモニウムは、水には溶解したが、ＴＥＯＡ又はＩＰＡには溶解しなかった。水は、固体の作製に悪影響を及ぼし、固体は、それが膨潤して崩壊するため、水中に長時間放置することができなかった。しかしながら、過硫酸アンモニウムを水に溶解させ、それを別の溶媒と混合することは可能であった。

過硫酸アンモニウムを使用して固体を架橋するための、２つの方法を試みた。最初の方法では、７９．７ｍｇの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を、１００．４ｍｇの水に添加し、ボルテックスミキサを使用して溶解させた。この溶液を７．７９ｇのＴＥＯＡに添加し、ボルテックスミキサを使用して混合した。これにより、９９／１のＴＥＯＡ／水溶液中の過硫酸アンモニウムの５０ｍＭ溶液が得られた。

この溶液を、９．５１８ｇの１８Ｂに分散させ、５５重量％の１８Ｂ分散液を得た。混合物を型に入れ、１３０～１３５℃でプレスした。固体を、オーブンに１５時間放置して硬化させ、次いで水中に入れた。固体が、水中で膨潤し、崩壊し始めたことは、架橋が起こらなかったことを示している。

別の架橋方法では、１８Ｂプレス固体を、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）溶液に浸漬させた。６８４ｍｇのＡＰＳを、１．３ｍＬのＤＩ水に溶解させた。固体が純水中で過度に膨潤し、崩壊したため、ＩＰＡを溶液に添加した。１１．４５ｍＬのＩＰＡを追加すると、ＡＰＳが溶液からクラッシュした。別の３．３ｍＬの水を添加すると、塩は溶液に戻り、７１／２９のＩＰＡ／水混合物における１８７ｍＭのＡＰＳ溶液を得た。重量パーセントに関しては、過硫酸アンモニウムが５重量％、水が３２重量％、及び水が６３重量％であった。

ＴＥＯＡプレスサンプルを架橋溶液に１時間浸漬させ、次いで８０℃で３時間保存した。得られた固体は耐水性があり、１日間の水への曝露の後であっても水中で崩壊することはなかった（図１９）。

グリセロールプレスフィルムについても架橋を行った。フィルムを、ＡＰＳ／ＩＰＡ／水溶液に１０分間及び６０分間浸し、一晩硬化させた。より長時間浸したフィルムは、特に濡れたときに、より不透明であった。オーブンで硬化させた後には、乾燥フィルムは、堅くて脆弱であった（図２０Ａ）。水に１時間未満浸した後、水は構造内に拡散し、ゴム状の挙動が得られた（図２０Ｂ）。

耐水性に加えて、架橋はまた、固体材料による別の問題も解決した。可塑剤は全て吸湿性であるため、固体は水を吸収し、寸法安定性を失う。高湿度レベルで保持された固体プレスサンプルは、グリセロールプレスフィルムと同様に軟質かつ柔軟になる。架橋は、材料の構造的完全性を維持するのに役立った。１３０℃で１０重量％のプロパンジオールを用いてプレスされた固体は、２つの化学物質、グルタルアルデヒド及び過硫酸アンモニウムを使用して架橋した。

グルタルアルデヒド化学物質は、１０重量％のグルタルアルデヒド、１０重量％の水、１．５重量％の塩化アルミニウム六水和物、及び７８．５重量％のイソプロピルアルコールで構成されていた。固体を、架橋溶液に１２時間浸したまま放置し、次いで硬化のために１２５℃の高温オーブンに５分間入れた。

過硫酸アンモニウム化学物質は、５重量％の過硫酸アンモニウム、２５重量％の水、及び７３重量％のイソプロピルアルコールで構成されていた。固体を、化学物質中に１時間入れて、硬化のために６０℃で３時間入れた。

いずれかの化学物質により架橋した後、固体は耐水性になり、水に浸してもそれらの形状を保持していた（図２１）。

実施例５：組換えシルクタンパク質からのフィルムの形成
フィルムプレス
可塑剤としての３０～５０重量％のグリセロールに溶媒和した１８Ｂ粉末を、また、表面上に分散させ（図２２）、グリセロールとともに２つの平行プレートの間でプレスした。グリセロールとともにプレスされたフィルムは容易に曲がり、表面に適合することができたが、他の溶媒は堅くて脆弱なフィルムを形成した。フィルム厚が少ないほどドレープ性が増加した。これらの柔軟なフィルムは、光学的に透明であった（図２３）。これらのフィルムは、レーザーカッタを使用して、又は金型を使用して切断することができる（図２４）。

対照として、１８Ｂを、１３０℃で任意の溶媒なしでプレスした結果、脆弱なフィルムの白いフィルム（図２５）が得られ、粉末は単純に平坦化され、フィルムへと圧縮された。

フィルム押し出し
溶媒和された１８Ｂを、１８Ｂフィルム押し出しとして、押し出した。実施例１及び２に記載される１８Ｂ固体／フィルムを形成するためのプレス中に、フラッシュと称される、平坦な表面の間をドープが流れ、薄い柔軟なフィルムを形成した（図２６）。このようにして、押し出しによりフィルム成形を実施した。

実施例６：組換えシルク固体の再成形
実施例１に記載のように１，３プロパンジオールを用いてプレスすることによって作製した、成形された１８Ｂ固体を再処理し、１３０℃でプレスして薄いフィルムを形成した。再処理されたフィルムの写真を図２７に示す。具体的には、１，３プロパンジオールを用いてプレスすることによって作製した元の１８Ｂ固体を左側に、再処理されたフィルムを右側に示している。この結果は、本明細書に記載される組換えシルク固体を、本明細書に記載される方法を使用して再処理して、異なる成形体の形状を形成することができることを示している。

他の実施形態
使用された言葉は、限定ではなく説明の言葉であり、そのより広い態様における本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範疇内で変更がなされ得ることを理解されたい。

本発明は、いくつかの記載された実施形態に関して、ある程度の長さで及びある程度の特殊性とともに記載されているが、任意のそのような詳細若しくは実施形態、又は任意の特定の実施形態に限定されるべきであることを意図するものではなく、しかし、先行技術を考慮して、そのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、したがって、本発明の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲に対する参照と解釈されるべきである。

本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書が、定義を含め、優先される。加えて、セクション見出し、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

Claims (58)

1. 成形体を製造するための方法であって、
   ａ．組換えシルク及び可塑剤を含む組成物を提供することであって、前記組成物が流動可能な状態にある、提供することと、
   ｂ．前記組成物を型に入れることと、
   ｃ．前記型内の前記組成物に熱及び圧力を適用することと、
   ｄ．前記組成物を冷却して、前記組換えシルクを含む成形体を形成することと
   を含む、方法。
2. 前記成形体が、固体形態にある、請求項１に記載の方法。
3. 前記成形体が、フィルムである、請求項１に記載の方法。
4. 前記組換えシルクが、前記可塑剤中に分布した組換えシルク粉末である、請求項１に記載の方法。
5. 前記組換えシルクが、成形前に１８Ｂの結晶化度と同様又はそれ未満の結晶化度を含む、請求項１に記載の方法。
6. 組換えシルクタンパク質が、ネフィラスパイダー（ｎｅｐｈｉｌａ ｓｐｉｄｅｒ）鞭毛状シルク又はアラネウススパイダー（ａｒａｎｅｕｓ ｓｐｉｄｅｒ）シルクである、請求項１に記載の方法。
7. 前記組換えシルクが、１８Ｂである、請求項１に記載の方法。
8. 前記組換えシルクが、配列番号１を含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記可塑剤が、トリエタノールアミン、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
10. 前記組成物が、１５重量％のトリメチレングリコールを含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記可塑剤が、前記組成物の１０～５０重量％である、請求項１に記載の方法。
12. 前記熱が、１３０℃の温度で適用される、請求項１に記載の方法。
13. 前記圧力が、１，５００～１５，０００ｐｓｉの範囲で適用される、請求項１に記載の方法。
14. 前記成形体が、タイプＡデュロメータにより測定した際に１００の硬度を有する、請求項１に記載の方法。
15. 前記成形体が、タイプＡデュロモータ（ｄｕｒｏｍｏｔｅｒ）により測定した際に硬度９０以上を有する、請求項１に記載の方法。
16. 前記成形体が、タイプＤデュロメータにより測定した際に硬度５０以上、６０以上、又は７０以上を有する、請求項１に記載の方法。
17. 前記成形体が、機械加工、切断、又は穴あけされ得、かつその所望の形状を維持することができる、請求項１に記載の方法。
18. 前記成形体が、前記流動可能な状態の前記組成物の前記組換えシルクと比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の全長１８Ｂモノマーを有する、請求項１に記載の方法。
19. 前記成形体が、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％の全長組換えシルクモノマーを有する、請求項１に記載の方法。
20. 前記成形体が、少なくとも５０％の全組換えシルクモノマー、組換えシルク凝集体、及び高分子量中間体を有する、請求項１に記載の方法。
21. 前記熱及び圧力が、１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、８分間、１０分間、又は１５分間適用される、請求項１に記載の方法。
22. 前記熱及び圧力が、５～８分間適用される、請求項１に記載の方法。
23. 前記成形体を、少なくとも５０％の相対湿度に少なくとも２４時間さらすことを更に含む、請求項１に記載の方法。
24. 前記成形体を、６５％の相対湿度に７２時間さらすことを更に含む、請求項１に記載の方法。
25. 前記圧力が、少なくとも１メートルトン、少なくとも２メートルトン、少なくとも少なくとも３メートルトン、少なくとも４メートルトン、又は少なくとも５メートルトンのプレス荷重によって適用される、請求項１に記載の方法。
26. 前記圧力が、１～５メートルトン、又は３～５メートルトンのプレス荷重によって適用される、請求項１に記載の方法。
27. 前記冷却が、約１℃／分、約３℃／分、又は約４５℃／分の速度にある、請求項１に記載の方法。
28. 前記組成物が、５０ＭＰａ以上、６０ＭＰａ以上、７０ＭＰａ以上、８０ＭＰａ以上、９０ＭＰａ以上、１００ＭＰａ以上、１５０ＭＰａ以上、２００ＭＰａ以上、２５０ＭＰａ以上、又は３００ＭＰａ以上の曲げ弾性率を有する、請求項１に記載の方法。
29. 前記組成物が、１０ＭＰａ以上、２０ＭＰａ以上、３０ＭＰａ以上、４０ＭＰａ以上、５０ＭＰａ以上、６０ＭＰａ以上、７０ＭＰａ以上、８０ＭＰａ以上ＭＰａ以上、９０ＭＰａ以上、又は１００ＭＰａ以上の最大曲げ強度を有する、請求項１に記載の方法。
30. 前記組成物が、１～４％の破断点伸び率を有する、請求項１に記載の方法。
31. 前記組成物が、２０％超の破断点伸び率を有する、請求項１に記載の方法。
32. 前記組成物が、過硫酸アンモニウムを更に含む、請求項１に記載の方法。
33. 前記成形体を、過硫酸アンモニウムに浸漬させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
34. 前記成形体が、架橋されている、請求項１に記載の方法。
35. 前記成形体が、化粧品又はスキンケア配合物である、請求項１に記載の方法。
36. 組換えシルク及び可塑剤を含む組成物であって、固体形態にある、組成物。
37. 前記成形体が、固体形態にある、請求項３６に記載の組成物。
38. 前記成形体が、フィルムである、請求項３６に記載の組成物。
39. 前記組換えシルクが、前記可塑剤中に分布した組換えシルク粉末である、請求項３６に記載の組成物。
40. 前記組換えシルクが、１８Ｂである、請求項３６に記載の組成物。
41. 前記組換えシルクが、配列番号１を含む、請求項３６に記載の組成物。
42. 前記可塑剤が、トリエタノールアミン、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールからなる群から選択される、請求項３６に記載の組成物。
43. 前記組成物が、１５重量％のトリメチレングリコールを含む、請求項３６に記載の組成物。
44. 前記可塑剤が、前記組成物の１０～５０重量％である、請求項３６に記載の組成物。
45. 前記成形体が、タイプＡデュロメータにより測定した際に１００の硬度を有する、請求項３６に記載の組成物。
46. 前記成形体が、タイプＡデュロモータにより測定した際に硬度９０以上を有する、請求項３６に記載の組成物。
47. 前記成形体が、タイプＤデュロメータにより測定した際に硬度５０以上、６０以上、又は７０以上を有する、請求項３６に記載の組成物。
48. 前記成形体が、機械加工、切断、又は穴あけされ得、かつその所望の形状を維持することができる、請求項３６に記載の組成物。
49. 前記成形体が、前記流動可能な状態の前記組成物の前記組換えシルクと比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の全長１８Ｂモノマーを有する、請求項３６に記載の組成物。
50. 前記成形体が、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％の全長組換えシルクモノマーを有する、請求項３６に記載の組成物。
51. 前記成形体が、少なくとも５０％の全組換えシルクモノマー、組換えシルク凝集体、及び高分子量中間体を有する、請求項３６に記載の組成物。
52. 前記組成物が、５０ＭＰａ以上、６０ＭＰａ以上、７０ＭＰａ以上、８０ＭＰａ以上、９０ＭＰａ以上、１００ＭＰａ以上、１５０ＭＰａ以上、２００ＭＰａ以上、２５０ＭＰａ以上、又は３００ＭＰａ以上の曲げ弾性率を有する、請求項３６に記載の組成物。
53. 前記組成物が、１０ＭＰａ以上、２０ＭＰａ以上、３０ＭＰａ以上、４０ＭＰａ以上、５０ＭＰａ以上、６０ＭＰａ以上、７０ＭＰａ以上、８０ＭＰａ以上ＭＰａ以上、９０ＭＰａ以上、又は１００ＭＰａ以上の最大曲げ強度を有する、請求項３６に記載の組成物。
54. 前記組成物が、１～４％の破断点伸び率を有する、請求項３６に記載の組成物。
55. 前記組成物が、２０％超の破断点伸び率を有する、請求項３６に記載の組成物。
56. 前記組成物が、過硫酸アンモニウムを更に含む、請求項３６に記載の組成物。
57. 前記成形体が、架橋されている、請求項３６に記載の組成物。
58. 前記成形体が、化粧品又はスキンケア配合物である、請求項３６に記載の組成物。

Images