JP2023513579A - 組換えシルク固体及びフィルム - Google Patents
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Abstract
本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体のための組成物に関する。更に、本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体、並びに成形体を製造するためのプロセスに関する。【選択図】図23
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年2月12日に出願された米国仮出願第62/975,656号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年2月12日に出願された米国仮出願第62/975,656号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。2021年2月12日に作成された、このASCIIコピーは、BTT-036WO_SL.txtという名称であり、サイズは、102,055バイトである。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。2021年2月12日に作成された、このASCIIコピーは、BTT-036WO_SL.txtという名称であり、サイズは、102,055バイトである。
分野
本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体のための組成物に関する。更に、本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体、並びに成形体を製造するためのプロセスに関する。
本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体のための組成物に関する。更に、本開示は、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体、並びに成形体を製造するためのプロセスに関する。
背景
生物再生可能な材料、及び生分解性の材料は、石油系製品に代わるものとして関心が高まっている。この目的のために、組換えシルクを含む、植物及び動物に由来する分子から材料及び繊維を作製する方法を開発すべく、かなりの努力がなされてきた。
生物再生可能な材料、及び生分解性の材料は、石油系製品に代わるものとして関心が高まっている。この目的のために、組換えシルクを含む、植物及び動物に由来する分子から材料及び繊維を作製する方法を開発すべく、かなりの努力がなされてきた。
しかしながら、湿式紡糸などの組換えシルクを処理する従来の方法では、溶媒と凝固浴槽との両方を使用して繊維を生成する。これは、化学物質が、溶媒として使用され、凝固浴槽では紡糸プロセス後に繊維から抽出される必要があり、かつ持続可能で信頼性のあるプロセスを提供するために、閉ループのプロセスに供する必要がある、という点で不利である。溶融紡糸も使用されているが、高熱は組換えシルク繊維の分解を引き起こす可能性があり、最終的な組換えシルク材料の特性に悪影響を及ぼす可能性がある。更に、様々な用途のために、固体又はフィルムなどの他の材料形態を組換えシルクから作製することが望ましい。
したがって、必要とされるのは、組換えシルクの分解を最小限に抑えながら、望ましい機械的及び審美的特性を有する、固体及びフィルムを含む組換えシルクポリペプチドの組成物である。加えて、組成物全体の組換えシルクの均一性が重要であり得る。したがって、そのような組成物を生成する新しい方法も必要とされている。
いくつかの実施形態によれば、成形体を製造するための方法であって、組換えシルク及び可塑剤を含む組成物であって、当該組成物が流動可能な状態にある、組成物を提供することと、当該組成物を型に入れることと、当該型内の当該組成物に熱及び圧力を適用することと、当該組成物を冷却して、当該組換えシルクを含む成形体を形成することと、を含む、方法が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、成形体は、固体形態にある。いくつかの実施形態では、成形体は、フィルムである。
いくつかの実施形態では、組換えシルクは、当該可塑剤中に分布した組換えシルク粉末である。いくつかの実施形態では、組換えシルクは、成形前に18Bの結晶化度と同様又はそれ未満の結晶化度を含む。いくつかの実施形態では、組換えシルクタンパク質は、ネフィラスパイダー(nephila spider)鞭毛状シルク又はアラネウススパイダー(araneus spider)シルクである。いくつかの実施形態では、組換えシルクは、18Bである。いくつかの実施形態では、組換えシルクは、配列番号1を含む。
いくつかの実施形態では、可塑剤は、トリエタノールアミン、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、15重量%のトリメチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、可塑剤は、当該組成物の10~50重量%である。
いくつかの実施形態では、熱は、130℃の温度で適用される。いくつかの実施形態では、圧力は、1,500~15,000psiの範囲で適用される。
いくつかの実施形態では、成形体は、タイプAデュロメータにより測定した際に100の硬度を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、タイプAデュロモータ(duromoter)により測定した際に硬度90以上を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、タイプDデュロメータにより測定した際に硬度50以上、60以上、又は70以上を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、機械加工、切断、又は穴あけされ得、その所望の形状を維持することができる。
いくつかの実施形態では、成形体は、当該流動可能な状態の当該組成物の組換えシルクと比較して、少なくとも50%、60%、70%、80%、又は90%の全長18Bモノマーを有する。いくつかの実施形態では、成形体は、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、又は少なくとも50%の全長組換えシルクモノマーを有する。いくつかの実施形態では、成形体は、少なくとも50%の全組換えシルクモノマー、組換えシルク凝集体、及び高分子量中間体を有する。
いくつかの実施形態では、熱及び圧力は、1分間、2分間、3分間、4分間、5分間、6分間、8分間、10分間、又は15分間適用される。いくつかの実施形態では、熱及び圧力は、5~8分間適用される。
いくつかの実施形態では、方法は、当該成形体を少なくとも50%の相対湿度に少なくとも24時間さらすことを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、当該成形体を65%の相対湿度に72時間さらすことを更に含む。
いくつかの実施形態では、圧力は、少なくとも1メートルトン、少なくとも2メートルトン、少なくとも少なくとも3メートルトン、少なくとも4メートルトン、又は少なくとも5メートルトンのプレス荷重によって適用される。いくつかの実施形態では、圧力は、1~5メートルトン、又は3~5メートルトンのプレス荷重によって適用される。
いくつかの実施形態では、冷却は、約1℃/分、約3℃/分、又は約45℃/分の速度にある。
いくつかの実施形態では、組成物は、50MPa以上、60MPa以上、70MPa以上、80MPa以上、90MPa以上、100MPa以上、150MPa以上、200MPa以上、250MPa以上、又は300MPa以上の曲げ弾性率を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、10MPa以上、20MPa以上、30MPa以上、40MPa以上、50MPa以上、60MPa以上、70MPa以上、80MPa以上MPa以上、90MPa以上、又は100MPa以上の最大曲げ強度を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、1~4%の破断点伸び率を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、20%超の破断点伸び率を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、過硫酸アンモニウムを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、当該成形体を過硫酸アンモニウムに浸漬させることを更に含む。いくつかの実施形態では、成形体は、架橋されている。
いくつかの実施形態では、成形体は、化粧品又はスキンケア配合物である。
また、組換えシルク及び可塑剤を含む組成物であって、当該組成物が固体形態にある、組成物も本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、成形体は、固体形態にある。いくつかの実施形態では、成形体は、フィルムである。
いくつかの実施形態では、組換えシルクは、当該可塑剤中に分布した組換えシルク粉末である。いくつかの実施形態では、組換えシルクは、18Bである。いくつかの実施形態では、組換えシルクは、配列番号1を含む。
いくつかの実施形態では、可塑剤は、トリエタノールアミン、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、15重量%のトリメチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、可塑剤は、当該組成物の10~50重量%である。
いくつかの実施形態では、成形体は、タイプAデュロメータにより測定した際に100の硬度を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、タイプAデュロモータにより測定した際に硬度90以上を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、タイプDデュロメータにより測定した際に硬度50以上、60以上、又は70以上を有する。いくつかの実施形態では、成形体は、機械加工、切断、又は穴あけされ得、その所望の形状を維持することができる。
いくつかの実施形態では、成形体は、当該流動可能な状態の当該組成物の組換えシルクと比較して、少なくとも50%、60%、70%、80%、又は90%の全長18Bモノマーを有する。いくつかの実施形態では、成形体は、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、又は少なくとも50%の全長組換えシルクモノマーを有する。いくつかの実施形態では、成形体は、少なくとも50%の全組換えシルクモノマー、組換えシルク凝集体、及び高分子量中間体を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、50MPa以上、60MPa以上、70MPa以上、80MPa以上、90MPa以上、100MPa以上、150MPa以上、200MPa以上、250MPa以上、又は300MPa以上の曲げ弾性率を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、10MPa以上、20MPa以上、30MPa以上、40MPa以上、50MPa以上、60MPa以上、70MPa以上、80MPa以上MPa以上、90MPa以上、又は100MPa以上の最大曲げ強度を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、1~4%の破断点伸び率を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、20%超の破断点伸び率を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、過硫酸アンモニウムを更に含む。いくつかの実施形態では、成形体は、架橋されている。
いくつかの実施形態では、成形体は、化粧品又はスキンケア配合物である。
前述、並びに他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面に示される、本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。
詳細な説明
本発明の様々な実施形態の詳細は、下記説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明から明らかになるであろう。本明細書で別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈に別段の必要性がない限り、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。「a」及び「an」という用語には、文脈上別段の指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。一般に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子及び細胞生物学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションとの関連で使用される専門用語及びそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
本発明の様々な実施形態の詳細は、下記説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明から明らかになるであろう。本明細書で別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈に別段の必要性がない限り、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。「a」及び「an」という用語には、文脈上別段の指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。一般に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子及び細胞生物学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションとの関連で使用される専門用語及びそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
定義
別段の指示がない限り、以下の用語は以下の意味を持つものと理解されるべきである。
別段の指示がない限り、以下の用語は以下の意味を持つものと理解されるべきである。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、長さが少なくとも10塩基のヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語には、DNA分子(例えば、cDNA又はゲノム若しくは合成DNA)及びRNA分子(例えば、mRNA又は合成RNA)、並びに非天然ヌクレオチド類似体、非天然ヌクレオシド間結合、又は両方を含有するDNA又はRNAの類似体が含まれる。核酸は、任意のトポロジー的立体配座であり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四重鎖、部分的に二本鎖、分岐状、ヘアピン状、環状、又は南京錠の立体配座であり得る。
別段の指示がない限り、一般的なフォーマット「配列番号」の下で本明細書に記載される全ての配列についての一例として、「配列番号1を含む核酸」とは、その少なくとも一部分に、(i)配列番号1の配列、又は(ii)配列番号1に相補的な配列のいずれかを有する、核酸を指す。2つの間の選択は、文脈により決定される。例えば、核酸がプローブとして使用される場合、2つの間の選択は、プローブが所望の標的に相補的であるという要件によって決定される。
「単離された」RNA、DNA又は混合ポリマーとは、その天然の宿主細胞において、天然のポリヌクレオチドに天然に付随している他の細胞成分、例えば、天然に関連しているリボソーム、ポリメラーゼ、及びゲノム配列から実質的に分離されているものである。
「単離された」有機分子(例えば、シルクタンパク質)とは、それが由来する宿主細胞の細胞成分(膜脂質、染色体、タンパク質)から、又は宿主細胞が培養されていた培地から実質的に分離されているものである。この用語は、生体分子が、他の全ての化学物質から分離されていることを必要としないが、ある特定の単離された生体分子は、ほぼ均一に精製され得る。
「組換え」という用語は、生体分子、例えば、遺伝子又はタンパク質であって、(1)その天然に存在する環境から除かれているもの、(2)自然界ではその遺伝子が見られるポリヌクレオチドの全部若しくは一部分に会合していないもの、(3)自然界では連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているもの、又は(4)自然界では生じないものを指す。「組換え」という用語は、クローン化DNA単離物、化学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、又は異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、並びにそのような核酸によってコードされるタンパク質及び/若しくはmRNAに関して使用され得る。
生物のゲノム中の内在性核酸配列(又はその配列のコードされたタンパク質産物)は、この内在性核酸配列の発現が変化するように、内在性核酸配列に隣接して異種配列が置かれている場合、本明細書では「組換え」とみなされる。この文脈において、異種配列は、その異種配列がそれ自体内在性(同じ宿主細胞又はその子孫に由来する)、又は外因性(異なる宿主細胞又はその子孫に由来する)であるかどうかにかかわらず、天然では内在性核酸配列に隣接していない配列である。例として、プロモーター配列は、宿主細胞のゲノム中の遺伝子の天然プロモーターを(例えば、相同組換えによって)置換して、この遺伝子が変化した発現パターンを有するようにすることができる。ここで、この遺伝子は、それに天然に隣接している配列のうちの少なくともいくつかから分離されているため、「組換え」となるであろう。
核酸もまた、それが、ゲノム中の対応する核酸に対する、天然では生じない任意の改変を含有する場合に「組換え」とみなされる。例えば、内在性コード配列は、それが人為的に、例えば、ヒトの介入によって導入された挿入、欠失又は点変異を含有する場合に「組換え」とみなされる。「組換え核酸」には、異種部位で宿主細胞染色体内に組み込まれた核酸、及びエピソームとして存在する核酸構築物も含まれる。
本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、短いポリペプチド、例えば、典型的には約50アミノ酸長未満、より典型的には約30アミノ酸長未満のものを指す。本明細書で使用される用語は、類似体、及び構造機能を模倣し、したがって生物学的機能を模倣する模倣物を包含する。
「ポリペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質と天然に存在しないタンパク質との両方、並びにその断片、変異体、誘導体、及び類似体を包含する。ポリペプチドは、モノマーであってもポリマーであってもよい。更に、ポリペプチドは、その各々が1つ以上の別個の活性を有する多数の異なるドメインを含んでよい。
「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」という用語は、その起源又は誘導体源という点で、(1)その天然の状態ではそれに付随する天然での会合成分と会合していないか、(2)自然界では見られない純度で存在し、その場合、純度は、他の細胞物質の存在に関して判定可能であるか(例えば、同じ種からの他のタンパク質を含まない)、(3)異なる種からの細胞によって発現するか、又は(4)自然界では生じない(例えば、それは自然界に見られるポリペプチドの断片であるか、あるいはそれは自然界では見られないアミノ酸類似体若しくは誘導体、又は標準ペプチド結合以外の連結が含まれる)、タンパク質又はポリペプチドである。したがって、化学的に合成されるか、又はそれが天然での起源となる細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その天然での会合成分から「単離されている」。ポリペプチド又はタンパク質は、当該技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して単離することにより、天然での会合成分を実質的に含まないようにしてもよい。このように定義した場合、「単離された」とは、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、又はオリゴペプチドが、その天然の環境から物理的に除かれていることを必ずしも必要としない。
「ポリペプチド断片」という用語は、全長ポリペプチドと比較して、欠失、例えば、アミノ末端及び/又はカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、ポリペプチド断片は、その断片のアミノ酸配列が天然に存在する配列での対応する位置と同一な連続配列である。断片は、典型的には、少なくとも5、6、7、8、9又は10アミノ酸長、好ましくは少なくとも12、14、16又は18アミノ酸長、より好ましくは少なくとも20アミノ酸長、より好ましくは少なくとも25、30、35、40又は45アミノ酸、更により好ましくは少なくとも50又は60アミノ酸長、更により好ましくは少なくとも70アミノ酸長である。
タンパク質をコードする核酸配列が、第2のタンパク質をコードする核酸配列と同様の配列を有する場合、タンパク質は第2のタンパク質に対して「相同性」を有するか、又は「相同」である。あるいは、2つのタンパク質が「同様の」アミノ酸配列を有する場合、タンパク質は第2のタンパク質に対する相同性を有する。(したがって、「相同タンパク質」という用語は、2つのタンパク質が同様のアミノ酸配列を有することを意味するように定義される。)本明細書で使用される場合、2つのアミノ酸配列の領域間の相同性(特に、予測される構造類似性に関して)は、機能における類似性を意味すると解釈される。
タンパク質又はペプチドに関して「相同」が使用される場合、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なることが認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の化学的特性(例えば、電荷又は疎水性)を有する側鎖(R基)を有する別のアミノ酸残基によって置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。2つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性又は相同性の程度を上方に調整して、置換の保存的性質について補正してよい。この調整を行うための手段は、当業者には周知である。例えば、Pearson,1994,Methods Mol.Biol.24:307-31及び25:365-89(参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。
20種の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用法に従う。参照により本明細書に組み込まれる、Immunology-A Synthesis(Golub and Gren eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.,2nd ed.1991)を参照のこと。20種の従来のアミノ酸の立体異性体(例えば、D-アミノ酸)、非天然型アミノ酸、例えば、α-,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸など、及び他の非従来型アミノ酸も本発明のポリペプチドのために好適な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例には、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、N-メチルアルギニン、並びに他の同様のアミノ酸及びイミノ酸(例えば、4-ヒドロキシプロリン)が含まれる。本明細書で使用されるポリペプチド表記法では、標準的な用法及び慣例に従って、左側末端はアミノ末端に対応し、右側末端はカルボキシ末端に対応する。
以下の6グループは各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する:1)セリン(S)、スレオニン(T);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アラニン(A)、バリン(V)、及び6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
パーセント配列同一性と呼ばれることもあるポリペプチドの配列相同性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group(GCG)、University of Wisconsin Biotechnology Center、910 University Avenue,Madison,Wis.53705を参照のこと。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、及び他の改変に割り当てられた相同性の尺度を使用して、同様の配列を一致させる。例えば、GCGには、「Gap」及び「Bestfit」などのプログラムが含有されており、これらをデフォルトのパラメータにより使用して、密接に関連するポリペプチド間、例えば、生物の異なる種からの相同ポリペプチド間など、又は野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の、配列相同性又は配列同一性を決定することができる。例えば、GCGバージョン6.1を参照のこと。
特定のポリペプチド配列を、異なる生物からの多数の配列を含有するデータベースと比較する場合に有用なアルゴリズムは、コンピュータプログラムのBLAST(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990);Gish and States,Nature Genet.3:266-272(1993);Madden et al.,Meth.Enzymol.266:131-141(1996);Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997);Zhang and Madden,Genome Res.7:649-656(1997))、特に、blastp又はtblastn(Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))である。
BLASTpの好ましいパラメータは、Expectation value:10(デフォルト);Filter:seg(デフォルト);Cost to open a gap:11(デフォルト);Cost to extend a gap:1(デフォルト);Max.alignments:100(デフォルト);Word size:11(デフォルト);No.of descriptions:100(デフォルト);Penalty Matrix:BLOWSUM62である。
BLASTpの好ましいパラメータは、Expectation value:10(デフォルト);Filter:seg(デフォルト);Cost to open a gap:11(デフォルト);Cost to extend a gap:1(デフォルト);Max.alignments:100(デフォルト);Word size:11(デフォルト);No.of descriptions:100(デフォルト);Penalty Matrix:BLOWSUM62である。相同性について比較するポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約16アミノ酸残基、通常は少なくとも約20残基、より通常は少なくとも約24残基、典型的には少なくとも約28残基、好ましくは約35残基を超える。多数の異なる生物からの配列を含有するデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を使用するデータベース検索は、当該技術分野で既知のblastp以外のアルゴリズムによって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列は、GCGバージョン6.1のプログラムであるFASTAを使用して比較することができる。FASTAは、クエリー配列及び検索配列の間の最良の重複領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する。Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990)(参照により本明細書に組み込まれる)。例えば、アミノ酸配列間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に組み込まれるGCGバージョン6.1で提供されるFASTAをそのデフォルトパラメータにて使用して決定することができる(2のワードサイズ、及びPAM250のスコアリングマトリックス)。
本明細書及び以下の特許請求の範囲全体を通して、「含む(comprise)」という単語、又は「含む(comprises)」若しくは「含む(comprising)」などの変形は、記述されている整数又は整数群を含むが、他の任意の整数又は整数群を除外しないことを意味すると理解される。
本明細書で定義される「成形体」又は「固体」という用語は、例えば、押し出し成形、射出成形、圧縮成形、ブロー成形、積層、マトリックス成形、回転成形、スピンキャスティング、トランスファー成形、熱成形などが含まれるがこれらに限定されない、成形プロセスのような、型と呼ばれる剛性フレームを使用して、液体又は柔軟な原材料を形作ることによって製造された本体を指す。
本明細書で使用される「ガラス転移」という用語は、物質又は組成物の硬い、堅い、又は「ガラス状」状態から、より柔軟な「ゴム状」又は「粘性」状態への転移を指す。
本明細書で使用される「ガラス転移温度」という用語は、物質又は組成物が、ガラス転移を受ける温度を指す。
本明細書で使用される「溶融転移」という用語は、物質又は組成物のゴム状の状態から、規則性の低い液相又は流動可能な状態への転移を指す。
本明細書で使用される「溶融温度」という用語は、物質が溶融転移を受ける温度範囲を指す。
本明細書で使用される「可塑剤」という用語は、ポリペプチド配列と相互作用して、ポリペプチド配列が三次構造及び結合を形成することを防止し、並びに/又はポリペプチド配列の移動度を増加させる任意の分子を指す。
本明細書で使用される「流動可能な状態」という用語は、液体と実質的に同じ特徴を有する(すなわち、ゴム状の状態からより液体の状態に転移した)組成物を指す。
本明細書で使用される「架橋された(crosslinked)」又は「架橋された(cross-linked)」という用語は、2つ以上のタンパク質上の反応性基の間に形成された結合を指す。架橋は、例えば、酵素架橋又は光架橋によって実施することができる。例えば、過硫酸アンモニウム及び光、又は過硫酸アンモニウム及び熱を使用して、シルク又はシルク様ポリペプチドを架橋することができる。
例示的な方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料も本発明の実行に使用することができ、当業者には明らかとなるであろう。本明細書で言及される全ての刊行物及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書が、定義を含め、優先される。材料、方法、及び例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
概要
本明細書では、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体のための組成物が提供され、組成物は、強度、柔軟性、剛度などの望ましい機械的特性を含む。加えて、いくつかの実施形態では、組成物は、溶融又は流動可能な状態で均質又は実質的に均質である。また、いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、それが成形体へと形成された後には、実質的に分解されない(例えば、10重量%未満、又は多くの場合6重量%未満の量で分解される)。好ましい実施形態では、組換えシルクタンパク質は粉末の形態である。また、そのような組成物を生成する方法であって、シルクタンパク質及び可塑剤を含む組成物を型に入れることと、型内の組成物に圧力及び熱を適用することによって成形体を形成することと、続いて成形体を冷却することと、任意選択的に、高い相対湿度などの追加のコンディショニングにさらすことと、を含む、方法が本明細書に提供される。好ましい実施形態では、熱は、成形の熱及び時間が、成形体中の組換えシルクタンパク質の分解が最小限であるように十分に少なくなるように、十分に低く、組換えシルクの使用から生じる望ましい特性を維持する。
本明細書では、組換えスパイダーシルクタンパク質及び可塑剤を含む成形体のための組成物が提供され、組成物は、強度、柔軟性、剛度などの望ましい機械的特性を含む。加えて、いくつかの実施形態では、組成物は、溶融又は流動可能な状態で均質又は実質的に均質である。また、いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、それが成形体へと形成された後には、実質的に分解されない(例えば、10重量%未満、又は多くの場合6重量%未満の量で分解される)。好ましい実施形態では、組換えシルクタンパク質は粉末の形態である。また、そのような組成物を生成する方法であって、シルクタンパク質及び可塑剤を含む組成物を型に入れることと、型内の組成物に圧力及び熱を適用することによって成形体を形成することと、続いて成形体を冷却することと、任意選択的に、高い相対湿度などの追加のコンディショニングにさらすことと、を含む、方法が本明細書に提供される。好ましい実施形態では、熱は、成形の熱及び時間が、成形体中の組換えシルクタンパク質の分解が最小限であるように十分に少なくなるように、十分に低く、組換えシルクの使用から生じる望ましい特性を維持する。
組換えシルクタンパク質
本開示は、シルク又はシルク様組換えポリペプチドなどの合成タンパク質性コポリマー(すなわち、組換えポリペプチド)から合成された、固体及びフィルムなどの成形体を含む本発明の実施形態を記載する。いくつかの実施形態では、固体又はフィルムなどの成形体は、化粧品又はスキンケア配合物(例えば、皮膚又は毛髪に適用される溶液)を形成する。本明細書で提供される成形体は、実施形態及び配合物の所望の効能に応じて、様々な湿潤剤、皮膚軟化剤、閉塞剤、活性剤及び化粧品補助剤を含有し得る。
本開示は、シルク又はシルク様組換えポリペプチドなどの合成タンパク質性コポリマー(すなわち、組換えポリペプチド)から合成された、固体及びフィルムなどの成形体を含む本発明の実施形態を記載する。いくつかの実施形態では、固体又はフィルムなどの成形体は、化粧品又はスキンケア配合物(例えば、皮膚又は毛髪に適用される溶液)を形成する。本明細書で提供される成形体は、実施形態及び配合物の所望の効能に応じて、様々な湿潤剤、皮膚軟化剤、閉塞剤、活性剤及び化粧品補助剤を含有し得る。
好適なタンパク質性コポリマーは、2016年8月45日に公開された米国特許公開第2016/0222174号、2018年4月26日に公開された米国特許公開第2018/0111970号、及び2018年3月1日に公開された米国特許公開第2018/0057548号に論じられており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。加えて、18Bと同様若しくはそれ未満の結晶化度、及び/又は同様の伸張性指数を有するタンパク質性コポリマー(例えば、ネフィラスパイダー鞭毛状シルク、アラネウススパイダーシルク、再生シルクフィブロイン)は、本明細書に記載される成形体で使用するのに好適である。いくつかの実施形態では、タイチンタンパク質などの、成形体を形成するために好適な同様の特性を有する他の非シルクタンパク質は、本明細書に記載の成形体を形成するために好適なタンパク質性コポリマーである。
いくつかの実施形態では、合成タンパク質性コポリマーは、シルク様ポリペプチド配列から作製される。いくつかの実施形態では、シルク様ポリペプチド配列は、1)シルクポリペプチド配列に由来する反復ドメインを混合及び一致させることによって生成されるブロックコポリマーポリペプチド組成物、並びに/又は2)工業的に拡張可能な微生物からの分泌によって、有用な成形体組成物を形成するのに十分に大きなサイズ(およそ40kDa)を有するブロックコポリマーポリペプチドの組換え発現である。ほぼ全ての公開されているスパイダーシルクポリペプチドのアミノ酸配列からの配列を含む、シルクの反復ドメイン断片から遺伝子操作された大きな(およそ40kDa~およそ100kDa)ブロックコポリマーポリペプチドは、本明細書に記載される改変微生物で発現させることができる。いくつかの実施形態では、シルクポリペプチド配列は、成形体形成が可能な、高度に発現及び分泌されるポリペプチドを産生するように一致させ、設計される。
いくつかの実施形態では、ブロックコポリマーは、シルクポリペプチド配列空間にわたるシルクポリペプチドドメインの組み合わせ混合から遺伝子操作される。いくつかの実施形態では、ブロックコポリマーは、拡張可能な生物(例えば、酵母、真菌、及びグラム陽性菌)で発現及び分泌させることによって作製される。いくつかの実施形態では、ブロックコポリマーポリペプチドは、0以上のN末端ドメイン(NTD)、1つ以上の反復ドメイン(REP)、及び0以上のC末端ドメイン(CTD)を含む。実施形態のいくつかの態様では、ブロックコポリマーポリペプチドは、100個超のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖である。いくつかの実施形態では、ブロックコポリマーポリペプチドは、その全体が参照により組み込まれる、国際公開第WO/2015/042164号、「Methods and Compositions for Synthesizing Improved Silk Fibers」に開示されているブロックコポリマーポリペプチドの配列と、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるドメインを含む。
いくつかのタイプの天然スパイダーシルクが、同定されている。天然に紡がれたシルクの各タイプの機械的特性は、そのシルクの分子組成と密接に関連していると考えられている。例えば、Garb,J.E.,et al.,Untangling spider silk evolution with spidroin terminal domains,BMC Evol.Biol.,10:243(2010);Bittencourt,D.,et al.,Protein families,natural history and biotechnological aspects of spider silk,Genet.Mol.Res.,11:3(2012);Rising,A.,et al.,Spider silk proteins:recent advances in recombinant production,structure-function relationships and biomedical applications,Cell.Mol.Life Sci.,68:2,pg.169-184(2011);及びHumenik,M.,et al.,Spider silk:understanding the structure-function relationship of a natural fiber,Prog.Mol.Biol.Transl.Sci.,103,pg.131-85(2011)を参照のこと。例えば、
房状(AcSp)シルクは、適度に高い強度と適度に高い伸張性とが組み合わされた結果、高い靭性を有する傾向がある。AcSpシルクは、多くの場合、ポリセリン及びGPXのモチーフを組み込む大きなブロック(「アンサンブル反復」)のサイズによって特徴付けられる。小管状(TuSp又は円筒状)シルクは、適度な強度及び高い伸張性を有する、大きな直径を有する傾向がある。TuSpシルクは、それらのポリセリン及びポリスレオニンの含有量、並びにポリアラニンの短い管(short tract)によって特徴付けられる。大瓶状(MaSp)シルクは、高い強度及び適度な伸張性を有する傾向がある。MaSpシルクは、MaSp1及びMaSp2の2つのサブタイプのうちの1つであり得る。MaSp1シルクは、一般に、MaSp2シルクよりも伸張性が低く、ポリアラニン、GX、及びGGXモチーフによって特徴付けられる。MaSp2シルクは、ポリアラニン、GGX、及びGPXモチーフによって特徴付けられる。小瓶状(MiSp)シルクは、適度な強度及び適度な伸張性を有する傾向がある。MiSpシルクは、GGX、GA、及びポリAモチーフによって特徴付けられ、多くの場合、およそ100のアミノ酸のスペーサーエレメントを含有する。鞭毛状(Flag)シルクは、非常に高い伸張性及び適度な強度を有する傾向がある。Flagシルクは通常、GPG、GGX、及び短いスペーサーモチーフによって特徴付けられる。
各シルクタイプの特性は、種ごとに異なり得、別個の生活様式を送るクモ(例えば、定住性シロアリモドキ(web spinner)対放浪ハンター)又は進化的により古いものは、上記の説明とは特性が異なるシルクを産生し得る(クモ多様性及び分類の説明については、Hormiga,G.,and Griswold,C.E.,Systematics,phylogeny,and evolution of orb-weaving spiders,Annu.Rev.Entomol.59,pg.487-512(2014);及びBlackedge,T.A.et al.,Reconstructing web evolution and spider diversification in the molecular era,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,106:13,pg.5229-5234(2009)を参照のこと)。しかしながら、天然シルクタンパク質の反復ドメインに対する配列類似性、及び/又はアミノ酸組成類似性を有する合成ブロックコポリマーポリペプチドは、天然シルクポリペプチドから作製された対応する成形体の特性を再現する特性を有する、一貫した成形体を商業規模で製造するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、推定シルク配列のリストは、関連用語、例えば、「スピドロイン」「フィブロイン」「MaSp」についてGenBankを検索することによって編集することができ、それらの配列は、独立した配列決定努力によって得られた付加的な配列とともにプールすることができる。次いで、配列をアミノ酸へと翻訳し、重複エントリーについてフィルタリングし、手動でドメイン(NTD、REP、CTD)へと分割する。いくつかの実施形態では、候補アミノ酸配列を、ピキア(コマガタエラ)パストリス(Pichia(Komagataella)pastoris)における発現のために最適化されたDNA配列へと逆翻訳する。DNA配列を発現ベクターへと各々クローニングし、ピキア(コマガタエラ)パストリスへと形質転換する。いくつかの実施形態では、成功した発現及び分泌を示す様々なシルクドメインを、続いて、組み合わせ様式でアセンブルし、成形体形成が可能なシルク分子を構築する。
シルクポリペプチドは、非反復領域(例えば、C末端及びN末端ドメイン)が隣接する反復ドメイン(REP)から特徴的に構成される。一実施形態では、C末端ドメインとN末端ドメインとの両方が、75~350アミノ酸長である。反復ドメインは、図1において示されるように、階層的構造を示す。反復ドメインは、一連のブロック(反復単位とも呼ばれる)を含む。ブロックは、シルクの反復ドメイン全体にわたり、時には完全に、かつ時には不完全に(準反復ドメインを構成する)反復される。ブロックの長さ及び組成は、異なるシルクタイプ間で、及び異なる種にわたり変化する。表1は、選択された種、及びシルクタイプからのブロック配列の例を列挙し、更なる例は、Rising,A.et al.,Spider silk proteins:recent advances in recombinant production,structure-function relationships and biomedical applications,Cell Mol.Life Sci.,68:2,pg 169-184(2011);及びGatesy,J.et al.,Extreme diversity,conservation,and convergence of spider silk fibroin sequences,Science,291:5513,pg.2603-2605(2001)に示されている。場合によっては、ブロックは、規則的なパターンで配置され、シルク配列の反復ドメインにおいて複数回(通常2~8回)出現する、より大きなマクロ反復が形成され得る。反復ドメイン又はマクロ反復の内部の反復したブロック、及び反復ドメイン内の反復したマクロ反復は、スペーシングエレメントによって分離されていてもよい。いくつかの実施形態では、ブロック配列は、グリシンリッチ領域、続いてポリA領域を含む。いくつかの実施形態では、短い(約1~10)アミノ酸モチーフは、ブロックの内部に複数回出現する。本発明の目的のために、異なる天然シルクポリペプチドからのブロックは、円順列を参照せずに選択することができる(すなわち、別様にシルクポリペプチド間で同様の同定されたブロックは、円順列のために整列しなくてもよい)。したがって、例えば、SGAGG(配列番号3)の「ブロック」は、本発明の目的のために、GSGAG(配列番号4)と同じであり、GGSGA(配列番号5)と同じであり、それらは全て、互いの円順列にすぎない。所定のシルク配列について選択される特定の順列は、他の何よりも利便性によって決定され得る(通常Gにより始まる)。NCBIデータベースから得られたシルク配列は、ブロック及び非反復領域へ区分化され得る。
本発明のある特定の実施形態による、ブロック及び/又はマクロ反復ドメインからの成形体形成ブロックコポリマーポリペプチドは、参照により組み込まれる国際公開第WO/2015/042164号に記載されている。GenBankなどのタンパク質データベースから、又はデノボ配列決定によって得られた天然シルク配列は、ドメイン(N末端ドメイン、反復ドメイン、及びC末端ドメイン)によって破壊される。繊維又は成形体への合成及びアセンブリの目的で選択されたN末端ドメイン及びC末端ドメイン配列には、天然アミノ酸配列情報、及び本明細書に記載の他の改変が含まれる。反復ドメインは、シルクのタイプに依存して通常1~8個、代表的なブロックを含有する反復配列へ分解され、これは、重要なアミノ酸情報を獲得し、一方、アミノ酸をコードするDNAのサイズを、容易に合成可能な断片へ縮小させる。いくつかの実施形態では、適切に形成されたブロックコポリマーポリペプチドは、少なくとも1つの反復配列を含む少なくとも1つの反復ドメインを含み、任意選択的に、N末端ドメイン及び/又はC末端ドメインに隣接する。
いくつかの実施形態では、反復ドメインは、少なくとも1つの反復配列を含む。いくつかの実施形態では、反復配列は、150~300のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、反復配列は、複数のブロックを含む。いくつかの実施形態では、反復配列は、複数のマクロ反復を含む。いくつかの実施形態では、ブロック又はマクロ反復は、複数の反復配列にわたって分割される。
いくつかの実施形態では、反復配列は、DNAアセンブリ要件を満たすために、グリシンにより始まり、かつフェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、システイン(C)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、メチオニン(M)、又はアスパラギン酸(D)により終わることはできない。いくつかの実施形態では、反復配列のうちのいくつかは、天然配列と比較して変更され得る。いくつかの実施形態では、反復配列は、ポリペプチドのC末端に対するセリンの付加などにより変更され得る(F、Y、W、C、H、N、M、又はDでの終止を回避するため)。いくつかの実施形態では、反復配列は、別のブロックからの相同配列により不完全なブロックを埋めることによって改変され得る。いくつかの実施形態では、反復配列は、ブロック又はマクロ反復の順序を再配置することによって改変され得る。
いくつかの実施形態では、非反復N末端ドメイン及びC末端ドメインは、合成のために選択され得る。いくつかの実施形態では、N末端ドメインは、例えば、SignalP(Peterson,T.N.,et.Al.,SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions,Nat.Methods,8:10,pg.785-786(2011)によって同定されるような、リーディングシグナル配列の除去によるものであり得る。
いくつかの実施形態では、N末端ドメイン、反復配列、又はC末端ドメイン配列は、アゲレノプシス・アペルタ(Agelenopsis aperta)、アリアチプス・グロサス、アフォノペルマ・シーマニー(Aphonopelma seemanni)、アプトスチチュス種(Aptostichus sp.)AS217、アプトスチチュス種AS220、アラネウス・ディアデマツス(Araneus diadematus)、アラネウス・ゲムモイデス、アラネウス・ヴェントリコサス、アルギオペ・アモエナ(Argiope amoena)、アルギオペ・アルゲンタタ(Argiope argentata)、アルギオペ・ブルエンニチ(Argiope bruennichi)、アルギオペ・トリファスシアタ、アチポイデス・リヴェルシ(Atypoides riversi)、アヴィキュラリア・ジュルエンシス(Avicularia juruensis)、ボスリオシルツム・カリフォルニカム(Bothriocyrtum californicum)、デイノピス・スピノサ、ディグエチア・カニチエス(Diguetia canities)、ドロメデス・テネブロサス、エウアグルス・キソセウス(Euagrus chisoseus)、エウプロスセノプス・オーストラリス、ガステラキャンタ・マンモサ(Gasteracantha mammosa)、ヒポキルス・トレルリ(Hypochilus thorelli)、ククルカニア・ヒベルナリス(Kukulcania hibernalis)、ラトロデクツス・ヘスペルス、メガヘクスラ・フルヴァ(Megahexura fulva)、メテペイラ・グランディオサ(Metepeira grandiosa)、ネフィラ・アンチポディアナ(Nephila antipodiana)、ネフィラ・クラヴァタ、ネフィラ・クラヴィペス、ネフィラ・マダガスカリエンシス(Nephila madagascariensis)、ネフィラ・ピリペス(Nephila pilipes)、ネフィレンギス・クルエンタタ、パラウィキシア・ビストリアタ(Parawixia bistriata)、ペウセチア・ヴィリダンス(Peucetia viridans)、プレクトレウリス・トリスチス、ポエシロセリア・レガリス(Poecilotheria regalis)、テトラグナタ・カウアイエンシス、又はウロボルス・ディヴェルサスに由来し得る。
いくつかの実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、アルファ接合因子ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、別の内在性又は異種の分泌シグナルコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、3X FLAGヌクレオチドコード配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、シルクポリペプチドヌクレオチドコード配列は、6~8個のHis残基(配列番号33)などの他のアフィニティータグに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、アルギオペ・ブルエンニチ種などのMaSp2に由来する組換えスパイダーシルクタンパク質断片配列に基づいている。いくつかの実施形態では、成形体は、2~20個の反復単位を含むタンパク質分子を含有し、各反復単位の分子量は、約20kDa超である。コポリマーの各反復単位内には、約60超のアミノ酸残基があり、多くの場合、多数の「準反復単位」に組織化されている60~100個の範囲のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、本開示に記載されるポリペプチドの反復単位は、MaSp2ドラッグラインシルクタンパク質配列に対して、少なくとも95%の配列同一性を有する。
良好な機械的特性を有する成形体を形成するタンパク質性ブロックコポリマーの反復単位は、シルクポリペプチドの一部分を使用して合成され得る。これらのポリペプチド反復単位は、アラニンリッチ領域及びグリシンリッチ領域を含有し、長さが150アミノ酸以上である。本開示のタンパク質性ブロックコポリマーにおいて反復として使用され得るいくつかの例示的な配列は、その全体が参照により組み込まれる、共同所有のPCT公開第WO2015/042164号に提供されており、ピキア発現システムを使用して発現することを示していた。
いくつかの実施形態では、スパイダーシルクタンパク質は、反復単位の少なくとも2つの出現を含み、反復単位は、150超のアミノ酸残基、及び少なくとも10kDaの分子量を有すること;少なくとも80%のアラニン含有量を含む、6つ以上の連続するアミノ酸を有するアラニンリッチ領域;少なくとも40%のグリシン含有量及び30%未満のアラニン含有量を含む、12個以上の連続するアミノ酸を有するグリシンリッチ領域を含む。
いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、反復単位を含み、各反復単位は、2~20個の準反復単位を含む配列に対して、少なくとも95%の配列同一性を有し;各準反復単位は、{GGY-[GPG-X1]n1-GPS-(A)n2}(配列番号34)を含み、式中、各準反復単位について、X1は、SGGQQ(配列番号35)、GAGQQ(配列番号36)、GQGPY(配列番号37)、AGQQ(配列番号38)、及びSQからなる群から独立して選択され;n1は、4~8であり、n2は、6~10である。反復単位は、複数の準反復単位から構成されている。
いくつかの実施形態では、3つの「長い」準反復には、3つの「短い」準反復単位が続く。前述のように、短い準反復単位は、n1=4又は5のものである。長い準反復単位は、n1=6、7、又は8のものとして定義される。いくつかの実施形態では、短い準反復のうちの全てが、反復単位の各準反復単位内の同じ位置に、同じX1モチーフを有する。いくつかの実施形態では、6つのうちの3つ以下の準反復単位が、同じX1モチーフを共有する。
追加の実施形態では、反復単位は、反復単位内で、同じX1を続けて3回以上出現させない準反復単位から構成されている。更なる実施形態では、反復単位は、準反復単位から構成されており、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20の準反復は、反復単位の単一の準反復単位において、同じX1を3回以上使用しない。
いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、配列番号1のポリペプチド配列(すなわち、18B)を含む。いくつかの実施形態では、反復単位は、配列番号2を含むポリペプチドである。これらの配列は、表2に提供される。
いくつかの実施形態では、記載された組換えスパイダーシルクポリペプチドから形成された成形体の構造は、ベータシート構造、ベータターン構造、又はアルファヘリックス構造を形成する。いくつかの実施形態では、形成された成形体の二次、三次、及び四次タンパク質構造は、ナノ結晶ベータシート領域、非晶質ベータターン領域、非晶質アルファヘリックス領域、非結晶マトリックスに埋め込まれた、ランダムに空間的に分布したナノ結晶領域、又は非結晶マトリックスに埋め込まれた、ランダムに配向したナノ結晶領域を有すると記載されている。理論に拘束されることは望まないが、スパイダーシルク内のタンパク質の構造特性は、成形体の機械的特性に関連すると理論化されている。結晶領域は強度と関連しており、一方で、非晶質領域は伸張性に関連している。大瓶状(MA)シルクは、鞭毛状シルクよりも強度が高く、伸張性が低い傾向があり、同様に、MAシルクは、鞭毛状シルクと比較して、結晶領域の体積分率が大きい。
いくつかの実施形態では、シルクタンパク質の分子量は、20kDa~2000kDa、又は20kDa超、又は10kDa超、又は5kDa超、又は5~400kDa、又は5~300kDa、又は5~200kDa、又は5~100kDa、又は5~50kDa、又は5~500kDa、又は5~1000kDa、又は5~2000kDa、又は10~400kDa、又は10~300kDa、又は10~200kDa、又は10~100kDa、又は10~50kDa、又は10~500kDa、又は10~1000kDa、又は10~2000kDa、又は20~400kDa、又は20~300kDa、又は20~200kDa、又は40~300kDa、又は40~500kDa、又は20~100kDa、又は20~50kDa、又は20~500kDa、又は20~1000kDa、又は20~2000kDaの範囲であり得る。
組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の不純物及び分解の特徴評価
異なる組換えスパイダーシルクポリペプチドは、タンパク質によって形成される二次及び三次構造の強度及び安定性に基づいた、溶融温度及びガラス転移温度などの異なる物理化学的特性を有する。シルクポリペプチドは、モノマーの形態で、ベータシート構造を形成する。他のモノマーの存在下で、シルクポリペプチドは、ベータシート構造の三次元結晶格子を形成する。ベータシート構造は、ポリペプチド配列の非晶質領域から分離しており、かつ散在している。
異なる組換えスパイダーシルクポリペプチドは、タンパク質によって形成される二次及び三次構造の強度及び安定性に基づいた、溶融温度及びガラス転移温度などの異なる物理化学的特性を有する。シルクポリペプチドは、モノマーの形態で、ベータシート構造を形成する。他のモノマーの存在下で、シルクポリペプチドは、ベータシート構造の三次元結晶格子を形成する。ベータシート構造は、ポリペプチド配列の非晶質領域から分離しており、かつ散在している。
ベータシート構造は、高温で非常に安定しており、ベータシートの溶融温度は、高速走査熱量測定により測定した際におよそ257℃である。Cebe et al.,Beating the Heat-Fast Scanning Melts Silk Beta Sheet Crystals,Nature Scientific Reports 3:1130(2013)を参照のこと。ベータシート構造は、シルクポリペプチドのガラス転移温度を超えてもそのままであると考えられているため、組換えシルクポリペプチドのガラス転移温度で見られる構造転移は、ベータシート間の非晶質領域の移動度の増加によるものであると仮定されている。
可塑剤は、非晶質領域の移動度を増加させ、潜在的にベータシート形成を妨害することにより、シルクタンパク質のガラス転移温度及び溶融温度を低下させる。この目的に使用される好適な可塑剤には、水、並びにグリセロール、トリグリセロール、ヘキサグリセロール、及びデカグリセロールなどのポリアルコール(ポリオール)が含まれるが、これらに限定されない。他の好適な可塑剤には、ジメチルイソソルバイト;ジメチルアミノプロピルアミンとアジピン酸(adiptic acid)とのビアサミド(biasamide);2,2,2-トリフルオロエタノール;ジメチルアミノプロピルアミンとカプリル酸/カプリン酸とのアミド;DEAアセトアミド、及びそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。他の好適な可塑剤は、Ullsten et.al,Chapter 5:Plasticizers for Protein Based Materials Viscoeleastic and Viscoplastic Materials(2016)(https://www.intechopen.com/books/viscoelastic-and-viscoplastic-materials/plasticizers-for-protein-based-materialsにて入手可能)、及びVierra et al.,Natural-based plasticizers and polymer films:A review,European Polymer Journal 47(3):254-63(2011)で論じられており、これらのうちの全体が(entirely of these)、参照により本明細書に組み込まれる。
シルクポリペプチドの親水性部分は、湿気として空気中に存在する周囲の水を結着し得るため、ほとんど常に水は存在しており、結着した周囲の水は、シルクポリペプチドを可塑化し得る。いくつかの実施形態では、好適な可塑剤は、単独、又は水若しくは他の可塑剤との組み合わせのいずれかで存在するグリセロールであってもよい。他の好適な可塑剤は、上で論じられている。
加えて、組換えスパイダーシルクポリペプチドが発酵によって産生され、それから組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末として回収される場合、可塑剤として作用するか、さもなければ三次構造の形成を阻害する不純物が、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に存在し得る。例えば、残留脂質及び糖は、可塑剤として作用し、したがって、三次構造の形成を妨げることにより、タンパク質のガラス転移温度に影響を与え得る。
組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末又は組成物の純度及び相対的組成を評価するために、確立された様々な方法を使用し得る。サイズ排除クロマトグラフィーは、それらの相対的なサイズに基づいて分子を分離し、その全長のポリマー及びモノマー形態の組換えスパイダーシルクポリペプチドの相対量、並びに組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末中の高分子量、低分子量、及び中分子量の不純物の量を分析するために使用することができる。同様に、迅速高速液体クロマトグラフィーは、組換えスパイダーシルクポリペプチドのモノマー形態などの、溶液中に存在する様々な化合物を測定するために使用され得る。イオン交換液体クロマトグラフィーは、脂質及び糖などの不純物を含む、溶液中の様々な微量分子の濃度を評価するために使用され得る。質量分析法などの、様々な分子のクロマトグラフィー及び定量化の他の方法は、当該技術分野で十分に確立されている。
実施形態に応じて、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の他の成分に対する、重量によるモノマー形態での組換えスパイダーシルクポリペプチドの量に基づいて計算された純度を有し得る。様々な例において、純度は、組換えスパイダーシルクポリペプチドのタイプ、並びに組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末を回収、分離及び後処理するために使用される技術に応じて、50重量%~90重量%の範囲であり得る。
サイズ排除クロマトグラフィー及び逆相高速液体クロマトグラフィーはどちらも、全長組換えスパイダーシルクポリペプチドの測定に有用であり、これらは、処理前後の組成物中の全長スパイダーシルクポリペプチドの量を比較することにより、処理ステップが組換えスパイダーシルクポリペプチドを分解したかどうかを決定するための、有用な技術となる。本発明の様々な実施形態では、処理前後の組成物中に存在する全長組換えスパイダーシルクポリペプチドの量は、最小限の分解を受ける可能性がある。分解の量は、0.001重量%~10重量%、又は0.01重量%~6重量%、例えば、10重量%又は8重量%又は6重量%未満、又は5重量%未満、3重量%未満、又は1重量%未満の範囲であり得る。
組換えシルク固体及びフィルム組成物、並びに作製方法
実施形態に応じて、組換えスパイダーシルク組成物中の組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の重量による好適な濃度は、1~90重量%、3~80重量%、5~70重量%、10~60重量%、15~50重量%、18~45重量%、又は20~41重量%の範囲である。
実施形態に応じて、組換えスパイダーシルク組成物中の組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の重量による好適な濃度は、1~90重量%、3~80重量%、5~70重量%、10~60重量%、15~50重量%、18~45重量%、又は20~41重量%の範囲である。
いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルク組成物中の可塑剤の重量による好適な濃度は、1~60重量%、10~60重量%、10~50重量%、10~40重量%、15~40重量%、10~30重量%、又は15~30重量%の範囲である。いくつかの実施形態では、可塑剤は、グリセロールである。いくつかの実施形態では、可塑剤は、トリエタノールアミン、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールである
水が可塑剤として使用される場合、組換えスパイダーシルク組成物中の水の重量による好適な濃度は、5~80重量%、15~70重量%、20~60重量%、25~50重量%、19~43重量%、又は19~27重量%の範囲である。水が別の可塑剤と組み合わせて使用される場合、それは、5~50重量%、15~43重量%、又は19~27重量%の範囲で存在し得る。
成形体の形成後、成形体中の組換えタンパク質の結晶化度が増加され得、それによって成形体が強化される。いくつかの実施形態では、X線結晶学により測定した際の成形体の結晶化度指数は、2%~90%である。いくつかの他の実施形態では、X線結晶学により測定した際の成形体の結晶化度指数は、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも6%、又は少なくとも7%である。
いくつかの実施形態では、硬度、曲げ弾性率、及び曲げ強度などの成形体の特徴を変更するために、様々な薬剤が組換えスパイダーシルク組成物に添加され得る。これらには、ポリエチレングリコール(PEG)、Tween(ポリソルベート)、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレン、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。他の好適な薬剤は、当該技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、第2のポリマーを添加して、組換えスパイダーシルク組成物とのポリマーブレンド又は二構成成分繊維を作り出すことができる。これらの例では、組換えスパイダーシルクポリペプチドの非晶質領域を分解することなく、組換えスパイダーシルク組成物自体と並行して、溶融に好適となる溶融温度を有する第2のポリマーを含めることが有用であり得る。様々な実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチドとのブレンドに好適なポリマーは、200℃、180℃、160℃、140℃、120℃又は100℃未満の溶融温度(Tm)を有する。多くの場合、組換えスパイダーシルクポリペプチドは、20℃、又は25℃又は50℃超の溶融温度を有する。例示的なポリマー及び溶融温度の非限定的なリストは、以下の表3に含まれる。
いくつかの実施形態では、水は、冷却中又は成形後のコンディショニング中に蒸発され得る。いくつかの実施形態では、成形後の水の損失は、水の総量に基づいて、1~50重量%、3~40重量%、5~30重量%、7~20重量%、8~18重量%、又は10~15%の範囲であり得る。多くの場合、損失は、15重量%未満、場合によっては、10重量%未満、例えば、1~10重量%になる。蒸発は、意図的なものであるか、又は適用された処理の結果であり得る。蒸発の程度は、当該技術分野で理解されているように、例えば、適用される動作温度、流速、及び圧力の選択によって、容易に制御することができる。
いくつかの実施形態では、好適な可塑剤は、ポリオール(例えば、グリセロール)、水、乳酸、メチルヒドロペルオキシド、アスコルビン酸、1,4-ジヒドロキシベンゼン(1,4ベンゼンジオール)ベンゼン-1,4-ジオール、リン酸、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリエタノールアミン、酸アセテート、プロパン-1,3-ジオール、又はそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
様々な実施形態では、可塑剤の量は、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の純度、及び相対的組成に応じて変化し得る。例えば、高純度の粉末は、可塑剤として作用し得る低分子量化合物などの不純物が少なく、したがって、より高い重量パーセンテージの可塑剤の添加を必要とし得る。
特定の実施形態では、組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末に対する可塑剤(例えば、グリセロールと水との組み合わせ)の様々な(重量による)比率は、0.5又は0.75~350重量%の可塑剤:組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、1又は5~300重量%の可塑剤:組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、10~300重量%の可塑剤:組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、30~250重量%の可塑剤:組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、50~220重量%の可塑剤:組換えスパイダーシルクタンパク質、70~200重量%の可塑剤:組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末、又は90~180重量%の可塑剤:組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末の範囲であり得る。本明細書で使用される場合、0.5~350重量%の可塑剤:組換えスパイダーシルクポリペプチド粉末への言及は、0.5:1~350:1の比率に相当する。
理論に限定されることを意図するものではないが、本発明の様々な実施形態では、組換えスパイダーシルク組成物を、流動可能な状態へと転移するために誘導させることは、組換えスパイダーシルクポリペプチドをそのモノマー形態で含めることが有益である状況下において、任意の配合での前処理ステップとして使用され得る。より具体的には、組換えスパイダーシルク溶融組成物を誘導させることは、モノマーの組換えスパイダーシルクポリペプチドの、その結晶ポリマー形態への凝集を防止すること、又は処理の後の段階で、組換えスパイダーシルクポリペプチドの、その結晶ポリマー形態への転移を制御することが望ましい用途において使用され得る。1つの特定の実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融組成物は、組換えスパイダーシルクポリペプチドを第2のポリマーとブレンドする前に、組換えスパイダーシルクポリペプチドの凝集を防止するために使用され得る。別の特定の実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融組成物を使用して、組換えスパイダーシルクポリペプチドがそのモノマー形態で基剤に存在している、化粧品又はスキンケア製品の基剤を作リ出すことができる。この実施形態では、基剤中に組換えスパイダーシルクポリペプチドをそのモノマー形態で有することにより、皮膚との接触時に、又は様々な他の化学反応を介して、モノマーの、その結晶ポリマー形態への凝集の制御が可能になる。
化粧品又はスキンケア製品は、皮膚又は毛髪に直接適用され得る。いくつかの実施形態では、成形体は、低い溶融温度を有する。様々な実施形態では、成形体は、体温(約34~36℃)よりも低い溶融温度を有し、皮膚との接触時に溶融する。
上で論じた化粧品又はスキンケア製品は、実施形態及び製品の所望の効能に応じて、様々な湿潤剤、皮膚軟化剤、閉塞剤、活性剤及び化粧品補助剤を含有し得る。
本明細書で使用される「湿潤剤」という用語は、水分子と結合を形成する吸湿性物質を指す。好適な湿潤剤には、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ペンタリエン(pentalyene)グリコール、トレメラ(tremella)抽出物、ソルビトール、ジシアンアミド、乳酸ナトリウム、ヒアルロン酸、アロエベラ抽出物、アルファ-ヒドロキシ酸、及びピロリドンカルボキシレート(NaPCA)が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「皮膚軟化剤」という用語は、皮膚表面のひび割れを埋めることによって、皮膚に柔らかい又はしなやかな外観を提供する化合物を指す。好適な皮膚軟化剤には、シアバター、コカオ(cocao)バター、スクアレン、スクアラン、オクタン酸オクチル、ゴマ油、ブドウ種子油、オレイン酸を含有する天然油(例えば、甘いアーモンド油、アルガン油、オリーブ油、アボカド油)、ガンマリノール酸を含有する天然油(例えば、月見草油、ルリヂサ油)、リノール酸を含有する天然油(例えば、ベニバナ油、ヒマワリ油)、又はそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。「閉塞剤」という用語は、水分を保持するために皮膚表面にバリアを形成する化合物を指す。場合によっては、皮膚軟化剤又は湿潤剤は、閉塞剤であり得る。他の好適な閉塞剤には、蜜蝋、カヌバ(canuba)蝋、セラミド、野菜性蝋、レシチン、アラントインが含まれ得るが、これらに限定されない。理論に限定されるものではないが、組換えスパイダーシルクポリペプチドの作用は水分子を引き付け、湿潤剤のようにも作用するため、本明細書に提示される組換えスパイダーシルク組成物のフィルム形成能力は、水分保持バリアを形成する閉塞剤を作る。
「活性剤」という用語は、スキンケア配合物又は日焼け止めにおいて既知の有益な影響を有する、任意の化合物を指す。様々な活性剤には、酢酸(すなわち、ビタミンC)、アルファヒドロキシル酸、ベータヒドロキシル酸、酸化亜鉛、二酸化チタン、レチノール、ナイアシンアミド、他の組換えタンパク質(全長配列として、又は部分配列若しくは「ペプチド」に加水分解されたもののいずれか)、銅ペプチド、クルクミノイド、グリコール酸、ヒドロキノン、コウジ酸、l-アスコルビン酸、アルファリポ酸、アゼライン酸、乳酸、フェルラ酸、マンデル酸、ジメチルアミノエタノール(DMAE)、レスベラトロール、抗酸化物質を含有する天然抽出物(例えば、緑茶抽出物、松の木の抽出物)、カフェイン、アルファアルブチン、コエンザイムQ-10、及びサリチル酸が含まれ得るが、これらに限定されない。「化粧品補助剤」という用語は、界面活性剤、乳化剤、防腐剤及び増粘剤を含むがこれらに限定されない、商業的に望ましい特性を有する化粧品製品を作り出すために使用される、様々な他の薬剤を指す。
様々な実施形態では、組換えスパイダーシルク組成物が成形中に加熱される温度は、組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解を最小限に抑えるか、又は完全に防止するために、最小限に抑えられる。特定の実施形態では、組換えスパイダーシルク溶融物は、120℃未満、100℃未満、80℃未満、60℃未満、40℃未満、又は20℃未満の温度に加熱される。多くの場合、溶融物は、成形中に10℃~120℃、10℃~100℃、15℃~80℃、15℃~60℃、18℃~40℃、又は18~22℃の範囲の温度になる。
本発明のいくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルク固体又はフィルムは、光学顕微鏡により検査した際に、材料が介在物又は沈殿物を少量有するか、又は全く有さないことを意味する、実質的に均質なものとなる。いくつかの実施形態では、光学顕微鏡を使用して複屈折を測定することができ、これは、組換えスパイダーシルクの三次元格子への整列の代用として使用することができる。複屈折は、光の偏光及び伝搬に依存する屈折率を有する材料の光学特性である。具体的には、複屈折によって測定される高度の軸方向秩序は、高い引張強度に関連付けることができる。いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルク固体及びフィルムは、最小限の複屈折を有する。
組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解の量は、様々な技術を使用して測定され得る。上に論じたように、組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解の量は、存在する全長組換えスパイダーシルクポリペプチドの量を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定され得る。様々な実施形態では、組成物は、それが成形体に形成された後、6.0重量%未満の量で分解される。別の実施形態では、組成物は、成形後に4.0重量%未満、3.0重量%未満、2.0重量%未満、又は1.0重量%未満の量で(分解の量が、0.001重量%~10重量%、8重量%、6重量%、4重量%、3重量%、2重量%、若しくは1重量%、又は0.01重量%~6重量%、4重量%、3重量%、2重量%、若しくは1重量%の範囲であり得るように)分解される。別の実施形態では、溶融組成物中の組換えスパイダーシルクタンパク質は、実質的に分解されていない。
いくつかの実施形態では、成形体は、架橋されている。例えば、いくつかの実施形態では、成形体の形成中又は形成後に、成形体を過硫酸アンモニウムに浸して、成形体中のタンパク質間の架橋を促進する。いくつかの実施形態では、当該架橋は、酵素架橋である。いくつかの実施形態では、当該架橋は、光化学架橋である。
いくつかの実施形態では、望ましい機械的特性を有する架橋された組換えシルク成形体、及びそれらを製造する方法が、本明細書に提供される。本明細書で提供される架橋された成形体組成物は、ある特定の用途において好ましい柔軟性、硬度、又は強度などの所望の機械的特性を達成するように架橋され得る。いくつかの実施形態では、組換えシルク成形体組成物を架橋して、架橋された組換えシルク固体を形成する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、架橋反応は、成形体を過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩にさらすことを含む。熱を適用して、過硫酸塩によって触媒される架橋反応を開始することができる。このタイプの架橋反応は、組成物中にいずれの光活性化合物又は酵素化合物も残さない。更に、この架橋反応は、光活性化を必要としないため、光が架橋溶液の全ての部分に到達する必要がなく、大量のバッチを効率的に生成することができる。いくつかの実施形態では、架橋は、得られた組換えシルク成形体が特定の形状又は形態を有するように、容器又は型内で起こる。
いくつかの実施形態では、成形体は、3D印刷を介して形成される。したがって、いくつかの実施形態では、成形体は、所望の3D構造を構築するために、連続して流動可能な状態の組換えシルク及び可塑剤を含む組成物の薄層を堆積又は形成することによって形成される。各層は、あたかも1つの層の印刷であるかのように、例えば、ある種の印刷ヘッドを加工物上で動かし、印刷ヘッドの要素を作動させることによって形成され、「印刷」を作り出す。重合可能な液体材料。したがって、いくつかの実施形態では、成形体は層ごとに形成される。各層は、流動可能な状態の組換えシルク及び可塑剤を含む分散組成物を含み、分散組成物は、形成される物体による断面と同じパターンで架橋又は固化される。1つの層が完成した後、分布した組成物のレベルを小さな距離にわたって上げ、プロセスを繰り返す。各重合層は、次の層を支持するために十分に安定して形成されなければならない。
別の実施形態では、組換えシルク及び可塑剤を含む組成物は、形成される物体の断面の形状に従って、基材上に分布され、合着される。更に別の実施形態では、組換えシルク及び可塑剤を含む組成物は、形成される物体の関連する断面に応じたパターンで堆積される、液滴の形態で堆積される。なお別の方法は、高温で組成物の液滴を分配し、次いで、より低温の加工物と接触して固結させることを伴う。
組換えシルク固体及びフィルムの再形成
本発明のいくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルク成形体を製造するためのプロセスは、組換えスパイダーシルクを含む成形体(例えば、組換えスパイダーシルクから形成された固体、フィルム、又は他の成形物品)を再処理することを追加的に含み得る。
本発明のいくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルク成形体を製造するためのプロセスは、組換えスパイダーシルクを含む成形体(例えば、組換えスパイダーシルクから形成された固体、フィルム、又は他の成形物品)を再処理することを追加的に含み得る。
理論に限定されることを意図するものではないが、グリセロールなどの可塑剤の存在下で、組換えスパイダーシルクポリペプチドを熱及び圧力に供することにより、組換えスパイダーシルクポリペプチドが「開放形態(open-form)組換えスパイダーシルクポリペプチド」に変換され、非結晶化及び非晶質組換えスパイダーシルクポリペプチドセグメントが展開し、可塑剤との相互作用を形成する。可塑剤との相互作用により、この「開放形態組換えスパイダーシルクポリペプチド」は、固体の成形及び形成を可能にする。具体的には、開放形態組換えスパイダーシルクポリペプチドは、分子間相互作用を形成して、不可逆的な三次元格子を形成することを防止する。
成形プロセス中の組換えスパイダーシルクポリペプチドの分解は(あるとしても)最小限であるため、いくつかの実施形態では、組換えスパイダーシルク成形体は、成形体を流動可能な組換えスパイダーシルク組成物へと転換して戻すことによって再処理され、次いで、再成形される。様々な実施形態では、組換えスパイダーシルク成形体は、少なくとも20回、少なくとも10回、又は少なくとも5回再成形され得る。これらの実施形態では、複数の再成形ステップにわたって見られる分解は、10%程度に低くなり得る。分解のない再成形の選択肢により、実質的に均質な組成物の生成、及び組成物から形成された製品の転用又は再設計が可能になる。例えば、品質が不十分な成形製品は、再成形され得る。寿命末期の製品のリサイクルも可能である。
同等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載の本発明による特定の実施形態に対する多くの同等物を認識し、又は日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されているものである。
当業者は、本明細書に記載の本発明による特定の実施形態に対する多くの同等物を認識し、又は日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されているものである。
特許請求の範囲では、「a」、「an」、及び「the」などの冠詞は、反対のことが示されない限り、又はそうでなければ文脈から明らかでない限り、1つ以上を意味し得る。グループの1つ以上のメンバーを含む「又は」メンバー間の特許請求の範囲又は説明は、反対のことが示されない限り、又はそうでなければ文脈から明らかでない限り、所与の製品又はプロセスに1つ、2つ以上、又は全てのグループメンバーが存在する、採用される、又は他の方法で関連する場合、満たされていると見なされる。本発明は、グループのうちの厳密に1つのメンバーが、所与の製品又はプロセスに存在する、採用される、又は他の方法で関連する実施形態を含む。本発明は、グループメンバーのうちの2つ以上、又は全てが、所与の製品又はプロセスに存在する、採用される、又は他の方法で関連する実施形態を含む。
「含む」という用語は、オープンであることが意図され、許容されるが、追加の要素又はステップを含む必要はないことも留意されたい。したがって、「含む」という用語が本明細書で使用される場合、「からなる」という用語も包含され、開示される。
範囲が与えられている場合、終点は含まれる。更に、別段の指示がない限り、又はそうでなければ文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が別の方法で明確に指示しない限り、範囲の下限の単位の10分の1まで、本発明の異なる実施形態において記載された範囲内の任意の特定の値又は部分範囲を想定することができることが理解されるべきである。
全ての引用された情報源、例えば、本明細書で引用された参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び技術は、引用で明示的に記載されていなくても、参照により本出願に組み込まれる。引用された情報源及び本出願の記述が矛盾する場合には、本出願の記述を優先するものとする。
セクション及び表の見出しは、限定することを意図していない。
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。実施例は、例示のみを目的として提供されており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。使用される数値(例えば、量、温度など)に関して正確性を確保するための努力がなされているが、当然ながら、若干の実験誤差及び偏差は許容されるべきである。
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当該技術分野の範囲内で、タンパク質化学、生物化学、組換えDNA技術、及び薬理学の従来の方法を採用する。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,current addition);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.);Remington′s Pharmaceutical Sciences,18th Edition(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990);Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed.(Plenum Press)Vols A and B(1992)を参照のこと。
実施例1:組換えシルクタンパク質固体の形成
ベータシートは、シルク材料の構造的完全性において重要な役割を果たす。それらは、シルクの結晶セグメントを構成している。典型的には、ベータシートが形成されるとき、ベータシートを妨害するために強力なカオトロピック溶媒が必要とされる。ベータシートの溶融温度は、その分解点を超えている。しかしながら、ガラス転移温度は、分解温度よりも低く、可塑剤を使用することにより更に低減され得る。
ベータシートは、シルク材料の構造的完全性において重要な役割を果たす。それらは、シルクの結晶セグメントを構成している。典型的には、ベータシートが形成されるとき、ベータシートを妨害するために強力なカオトロピック溶媒が必要とされる。ベータシートの溶融温度は、その分解点を超えている。しかしながら、ガラス転移温度は、分解温度よりも低く、可塑剤を使用することにより更に低減され得る。
固体を作製するためには、適切なもつれが必要である。ベータシートの溶融温度は高すぎるが、タンパク質の大部分が非晶質であるため、非晶質鎖に鎖の移動性を提供して、適切なもつれを可能にすることができる。熱及び可塑剤を適用すると、熱ガラス転移温度を低減させることができる。18B固体を得るために必要な3つの成分は、熱、圧力、及び可塑剤である。
18Bポリペプチド配列(配列番号1)の組換えスパイダーシルクを、様々なロットの大規模発酵によって生成して、粉末にて回収し、乾燥させた(「18B粉末」)。18B組換えシルク粉末の製造の詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、PCT公開第WO2015/042164号「Methods and Compositions for Synthesizing Improved Silk Fibers」に見出される。家庭用スパイスグラインダを使用して、組換えシルク粉末を混合した。水及び可塑剤の比率を、18B粉末に添加して、可塑剤に対してタンパク質粉末の比率が異なる組換えスパイダーシルク組成物を生成した。得られた組成物は、10~50重量%のトリエタノールアミン(TEOA)、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールであった。次いで、混合物を130℃でプレスした。1500~15000psiの範囲の圧力を使用して、サンプルを型にプレスした。
図1に示すように、30重量%のTEOAでは、プレス中にTEOA可塑剤の一部が型から絞り出された。これは、TEOAを粉末全体に均一に分布することができる場合、TEOAの量を下げることができることを示唆している。粉末粒子を圧縮するために圧力を使用した。
固体の硬度を、デュロメータを用いて測定した。デュロメータは、材料へと貫入する圧子を有する。貫入が大きいほど、材料は柔らかくなり、測定される硬度値は低くなる。硬度の様々な範囲を対象とした複数のタイプのデュロメータがある。タイプAデュロメータは軟質プラスチック用であり、値が90を超える場合は、タイプDデュロメータを使用するべきである。それらの間の違いは、圧子の形状及び適用される力である。デュロメータDは、より硬いプラスチックを対象としているため、より鋭い圧子及びより高い押し込み力を有する。TEOA、プロピレングリコール、トリメチレングリコール(1,3プロパンジオール)を用いてプレスされた固体は全て、タイプAにより測定した場合、100の硬度を有しており、それらの硬度は、タイプAデュロメータにより測定可能な硬度を超えていることを示す。TEOA処理固体は、タイプDデュロメータにより測定した際に76HDの硬度を有していた。トリメチレングリコール処理固体は、タイプDデュロメータにより測定した際に71HDの硬度を有していた(図2)。比較のために、高密度ポリエチレン(HDPE)の保護帽は、同様の硬度を有している。プロピレングリコール固体は、最も低い硬度を有しており、タイプDデュロメータにより測定した際に、55HDに始まり10秒間以内に30まで低下した。固体は、それらの剛性が、固体の工具の力による変形を防止したため、所望の形状へと機械加工、切断、及び穴あけすることができた(図2)。
実施例2:シルク固体中の組換えシルクの分解
プレスされたフィルム及び固体のSEC結果は、固体サンプル、フィルムサンプル(実施例5を参照)、及び対照18B粉末の間で同様の低分子量及び中分子量を示した。これは、プレスによって生じる分解が、最小限又は存在しないことを示唆していた。
プレスされたフィルム及び固体のSEC結果は、固体サンプル、フィルムサンプル(実施例5を参照)、及び対照18B粉末の間で同様の低分子量及び中分子量を示した。これは、プレスによって生じる分解が、最小限又は存在しないことを示唆していた。
表4.対照粉末とともに、プレスされた固体及びフィルムのSECデータ。N=2の平均結果及び標準偏差。HMNI=高分子量不純物;IMWI=中分子量不純物;LMWI=低分子量不純物。全てのサンプルは、同じ18B粉末ロットによるものであった。固体を、30重量%(wt%)(重量%(%by weight))のTEOAを用いてプレスし、フィルムを、40重量%のグリセロールを用いてプレスした。
(表4)組換えシルク固体及び前駆体の組成
(表4)組換えシルク固体及び前駆体の組成
タンパク質分解データを表5まとめる。ここでは、サンプルを130℃で加熱し、時間を増加させてプレスをした。各時点で、固体をサンプリングし、型に入れて戻し、熱及び圧力を適用した。サンプル間のHMWI、18B凝集体及び18Bモノマー、並びにIMWI及びLMWIの値に基づくと、最大10分間まで顕著な分解はなかった。20分間から後は、18Bモノマーの含有量が低下する一方で、中間(IMWI)及び低(LMWI)分子量の成分が増加し、20分を超える分解を示唆していた。固体をより長い時間プレスすると、それはまた、より暗くなった(図3)。
表5.対照粉末(SLD33-P)、溶媒を用いて可塑化された粉末(SLD33-PH)、及びプレス時間を増加させるプレス固体(SLD33)のSECデータ。全てのサンプルは、同じ18B粉末ロットによるものであった。固体を、15重量%の1,3プロパンジオールを用いてプレスした。
実施例3:18B固体の曲げ特徴評価
18Bタンパク質粉末は、本明細書(例えば、実施例1)に記載されるように圧縮成形を介して焼結した場合に、望ましい固体の特徴を有する安定なタンパク質粉末として有望な能力を示した。トリメチレングリコール(TMG又は1,3-プロパンジオール)を、成形を補助するための好適な可塑剤として特定した。成形プロセスを最適化する目的のために、18B-TMG固体の機械的特性の更なる特徴評価を必要とした。15重量%のTMG固体粉末を有する18Bのバッチを作り出し、ASTM D790に従って3点曲げ試験に供した。
18Bタンパク質粉末は、本明細書(例えば、実施例1)に記載されるように圧縮成形を介して焼結した場合に、望ましい固体の特徴を有する安定なタンパク質粉末として有望な能力を示した。トリメチレングリコール(TMG又は1,3-プロパンジオール)を、成形を補助するための好適な可塑剤として特定した。成形プロセスを最適化する目的のために、18B-TMG固体の機械的特性の更なる特徴評価を必要とした。15重量%のTMG固体粉末を有する18Bのバッチを作り出し、ASTM D790に従って3点曲げ試験に供した。
以下に記載するように、成形保持時間、冷却速度、成形後のコンディショニング、及び平均プレス荷重を含む、一連の処理パラメータにわたる18B固体の機械的特性を提供した。最終固体製品の機械的特性に有益又は有害な処理パラメータもまた発見し、それによって、処理効率及び能力を改善した。
材料及び方法
組換えシルク固体の曲げ特徴を試験するために、ASTM D790規格では、スパン対深さ(厚さ)の比率をできるだけ16:1に近づけることを推奨しているが、Zwickでは、スパン対深さの比率を15:1~17:1に保持することを推奨している。この実験では、最終の試験片の深さが2.25mm~2.54mmになるように、装置のスパンを38.1mmに固定した。
組換えシルク固体の曲げ特徴を試験するために、ASTM D790規格では、スパン対深さ(厚さ)の比率をできるだけ16:1に近づけることを推奨しているが、Zwickでは、スパン対深さの比率を15:1~17:1に保持することを推奨している。この実験では、最終の試験片の深さが2.25mm~2.54mmになるように、装置のスパンを38.1mmに固定した。
25.4mmx50.8mm(1インチx2インチ)の圧縮型を使用すると、固体の最終重量グラム当たり0.66mmの厚さが得られた。成形中の重量の約10%の減少の観察に基づいて、最終の試験片の深さを達成するために、試験片当たり3.8g~4.0gの成形前の重量を使用した。
18B粉末255.16g及びTMG45.347gを使用して18B/TMG混合物を調製し、これをスパイスグラインダを使用して5回混合し、TMG15.1重量%/18B84.9重量%の合計300.5gのマスターバッチを得た。これらを、定義された条件下での成形、及びその後の曲げ特徴の試験のために、各々4.0gの試験片に分離した。
試験のために63個にわたる試験片を使用し、平均のスパン対深さの比率は、0.35の標準偏差を有する15.72であり、0.022の変動係数が得られた。Zwick ProLineにおける試験構成を、ASTM D790の試験プログラムファイルに従って実施した。重要な試験パラメータは、0.1MPaの予備荷重(pre-load)、3mmの開始位置間隔、及び254mm/分のクロスヘッド速度であった。
試験した組換えシルク固体調製条件は、成形時間、冷却速度、成形後のコンディショニング、及び成形中の平均荷重であった。
成形時間は、型が130℃で圧縮されている時間(分)として定義される。1分間、2分間、3分間、4分間、5分間、6分間、8分間、10分間、及び15分間の成形時間を試験した。
成形後のコンディショニングでは、コンディショニングされるサンプルを、成形時間の後、65%の相対湿度(RH)で最低72時間、コンディショニングチャンバ内に置いた。コンディショニングしていない試験片は、実験室の周囲条件下で作業台の上に保管した。
平均荷重は、試験片が受けたメートルトンにおける荷重であった。試験片のサイズ及び型のサイズは一定であったため、サンプルグループ内の各試験片を、成形中にほぼ同等の圧力に供した。1メートルトン、2メートルトン、3メートルトン、4メートルトン、及び5メートルトンの平均荷重を試験した。
最後に、冷却速度レベルは、遅い、中程度、又は急速のいずれかとして定義された。各レベルを、固体試験片を取り出すために型を開いたときに開始する、1分間隔(低速、中程度)、又は10秒間隔(急速)のいずれかの固体表面温度を記録する、IR温度計を使用して定量化した。以下に示す曲線の結果は、遅い、中程度、及び急速について、それぞれ、0.92℃/分、2.7℃/分、及び45.2℃/分の冷却速度をもたらした。図4A~4Cを通して、中程度の冷却速度によるサンプルは、遅い及び急速冷却速度によるサンプルと比較して異なる保持時間にあったが、冷却の速度は、保持時間によって実質的に異ならなかった。上で定義した遅い、中程度の、及び急速の冷却速度を試験した。
以下の表6は、各サンプルIDの調製に使用された条件を示す。各サンプルIDを、調製された合計63個の18B固体サンプルに対して3連で実行した。
成形後のコンディショニング
4.0gのサンプルを使用して上記のように18B固体サンプルを成形し、2メートルトンの平均荷重下で130℃で成形した。成形されたサンプルを、中程度の冷却速度で冷却し、成形後に65%の相対湿度(RH)で最低72時間、コンディショニングにさらすか、又はさらさなかった。サンプルを、1、2、3、4、又は5分間成形した。成形後のコンディショニングの影響を評価するための条件は、表6に提供されたサンプル1~9及び11に基づいていた。
4.0gのサンプルを使用して上記のように18B固体サンプルを成形し、2メートルトンの平均荷重下で130℃で成形した。成形されたサンプルを、中程度の冷却速度で冷却し、成形後に65%の相対湿度(RH)で最低72時間、コンディショニングにさらすか、又はさらさなかった。サンプルを、1、2、3、4、又は5分間成形した。成形後のコンディショニングの影響を評価するための条件は、表6に提供されたサンプル1~9及び11に基づいていた。
図5は、コンディショニングされていない18B固体サンプル対コンディショニングされた18B固体サンプルから生成された、応力-ひずみ曲線を示している。応力-ひずみ曲線を使用して、破断点伸びを含む、18B固体の機械的特性を決定した。表6及び表7に示すように、サンプルID1、3、5、7、及び9はコンディショニングされており、サンプルID2、4、6、8、及び11はコンディショニングされていなかった。
コンディショニングされた18B固体サンプル対コンディショニングされていない18B固体サンプルについての曲げデータを、以下の表7に示す。3連で測定された、コンディショニングされたサンプル対コンディショニングされていないサンプルの各々についての、曲げ弾性率(MPa)、最大曲げ強度(MPa)、及び破断点伸び(%)の平均値を、(測定された標準偏差(SD)とともに)提供する。20%の伸びは、20%が試験可能な最大の伸びであったため、固体の破壊がないことを示していることに留意されたい。
図6は、1分間の保持時間の、65%RH環境での72時間のコンディショニングに供した(左)、及びコンディショニングされていない(右)固体の形態を示す。固体は、同等の粒子サイズを有していたが、コンディショニングされた試験片は、粒子間により明確な非晶質領域を有し、延性が増加する可能性があった。
巨視的には、65%RHでコンディショニングされたサンプルは全て、コンディショニングされていない対照物と比較して、荷重下でより延性があることが明らかであった。TMG可塑剤に存在する2つのヒドロキシル基は、水溶性及び吸湿性の増加に寄与していた。図6に示すように、型内での時間が短いほど、粉末様の形態を有し、より多くの粒子を含有した固体が得られた。
コンディショニングの影響に基づいて、コンディショニングされたサンプルの剛度と伸びとの間にはトレードオフがあった。試験片をコンディショニングすることにより、それほど強度も硬さもなく、破損しない試験片を作り出した。試験装置の安全限界により、試験は最大20%の伸びで停止する必要があり、コンディショニングされたサンプルはいずれもその伸びまで破損しなかった。また、コンディショニングされていないサンプルは、より多くの変動性を有していた。コンディショニングの影響は、架橋されていない18B固体で顕著であり、それらは水にさらされやすいことを示唆している。したがって、架橋された18B固体は、18B固体の水に対する応答が減少されるように生成される。架橋された18B固体についての強度、剛性、及び伸びの機械的特徴もまた最大化される。
コンディショニングされたサンプルは、それらの伸び率が、Zwick ProLineによる所定位置での安全対策を超えていたため、破損しなかった。その理由のため、コンディショニングされたサンプルの破損表面は、評価できなかった。コンディショニングされていないサンプルの破損表面の、肉眼による(目による視覚的)破損後視検では、ほぼ全ての曲げ破損が、処理に応じて延性挙動の程度がわずかに変化する、非常に脆いものとして特徴評価することができることが明らかとなった。開始は典型的には、試験片の幅の中心から0.5cm以内であった。3つの表面のSEMの画像化により、これらの結論を確認した。
成形後の冷却速度
4.0gのサンプルを使用して上記のように18B固体サンプルを成形し、2メートルトンの平均荷重下で130℃で5分間成形した。成形されたサンプルを、遅い、中程度の、又は急速の冷却速度で冷却した。冷却速度を測定するための方法論、並びに遅い、中程度、及び急速冷却の定量的基準は、上記の材料及び方法で説明されている。冷却速度の影響を評価するための条件は、表6に提供されたサンプル10~12に基づいている。
4.0gのサンプルを使用して上記のように18B固体サンプルを成形し、2メートルトンの平均荷重下で130℃で5分間成形した。成形されたサンプルを、遅い、中程度の、又は急速の冷却速度で冷却した。冷却速度を測定するための方法論、並びに遅い、中程度、及び急速冷却の定量的基準は、上記の材料及び方法で説明されている。冷却速度の影響を評価するための条件は、表6に提供されたサンプル10~12に基づいている。
図7は、18B固体の機械的特性に対する、冷却速度の影響を評価するための、サンプル10~12から生成された応力ひずみ曲線を示す。10、11、及び12シリーズはそれぞれ、遅い、中程度の、及び急速の冷却速度に対応する。
遅い、中程度の、及び急速の冷却速度での18B固体サンプルの曲げデータを、以下の表8に示す。3連で測定された、コンディショニングされたサンプル対コンディショニングされていないサンプルの各々についての、曲げ弾性率(MPa)、最大曲げ強度(MPa)、及び破断点伸び(%)の平均値を、(測定された標準偏差(SD)とともに)提供する。
図8は、(A)遅い冷却、(B)中程度の冷却、及び(C)急速冷却にさらした18B固体の形態を示す。
構造ポリマーでは、冷却速度の増加により、比較的同様の伸びを有する、より強力かつより硬いサンプルが得られる。より速い冷却は、より小さい結晶、及びより低い結晶性(非晶質領域がより多くなる)をもたらすため、それはより低い剛性が予想される。しかしながら、現在の結果はその仮定と矛盾している。平均して、遅い冷却は、それぞれ、262.72MPa及び5.29MPaの曲げ弾性率及び最大強度を有していた。平均して、中程度の冷却サンプルでは、それぞれ、309.54MPa及び6.11MPaの曲げ弾性率及び最大強度が得られた。急速に冷却されたサンプルは、平均して、それぞれ、292.35MPa及び6.12MPaの曲げ弾性率及び最大強度を有していた。冷却速度が増加するにつれて、変動性は減少した。
成形圧力
4.0gのサンプルを使用して上記のように18B固体サンプルを成形し、130℃で5分間成形し、続いて中程度の冷却速度で冷却した。サンプルを、1メートルトン、2メートルトン、3メートルトン、4メートルトン、又は5メートルトンの平均荷重下で成形した。成形中の平均荷重圧力の影響を評価するための条件は、表6に提供されたサンプル13~17に基づいている。
4.0gのサンプルを使用して上記のように18B固体サンプルを成形し、130℃で5分間成形し、続いて中程度の冷却速度で冷却した。サンプルを、1メートルトン、2メートルトン、3メートルトン、4メートルトン、又は5メートルトンの平均荷重下で成形した。成形中の平均荷重圧力の影響を評価するための条件は、表6に提供されたサンプル13~17に基づいている。
図9は、18B固体の機械的特性に対する、成形圧力(平均荷重)の影響を評価するための、サンプル13~17から生成された応力ひずみ曲線を示す。13、14、15、16、及び17シリーズはそれぞれ、1、2、3、4、及び5メートルトンに対応する。
異なる平均荷重での18B固体サンプルの曲げデータを、以下の表9に示す。3連で測定された、コンディショニングされたサンプル対コンディショニングされていないサンプルの各々についての、曲げ弾性率(MPa)、最大曲げ強度(MPa)、及び破断点伸び(%)の平均値を、(測定された標準偏差(SD)とともに)提供する。
サンプルID番号13~17は、5分間プレスし、中程度の速度で冷却したサンプルの異なるプレス荷重の影響を示していた。プレス荷重の増加による傾向は、曲げ弾性率の増加であったが、強度及び伸び率の傾向は、変動性のために確信的に識別することができなかった。設定荷重が増加すると、強度は、荷重平均1メートルトンのときに大きくなり(平均で5.68MPa)、その後の荷重平均2~4メートルトンのときに減少し、次いで平均荷重が5メートルトンのときに最大の5.85MPaまで増加した。依然として、強度に対するプレス荷重の効果は、変動性のために確定的ではなかった。伸び率は、平均荷重に応じて2.05%~4.38%の範囲であり、任意の重大な、顕著な傾向はなかった。組換えシルク固体材料の剛度を最大化するためには、3~5メートルトンの平均荷重が好ましいことを決定した。
分散したタンパク質粒子は、黒い点のように見えるが、文脈に応じて図10に示すように表面の気孔空隙であり得る。粒子は、それら自体を、これらの空隙に優先的に配置する傾向があった。プレス荷重を増やすと、分散した粒子の数が減少するように見えるが、(図11に示すように)3メートルトンを超えるとその利点は減少した。具体的には、図11は、異なる平均プレス荷重によって生成された固体の画像を示している。平均荷重が(A)1メートルトンから(B)3メートルトン、(C)5メートルトンに増加するにつれて、分散したタンパク質粒子の量の減少があった。
成形時間
4.0gのサンプルを使用して上記のように18B固体サンプルを成形し、2メートルトンの平均荷重下で130℃で成形した。サンプルを、1、2、3、4、5、6、8、10、又は15分間成形した。成形されたサンプルを、中程度の冷却速度で冷却し、コンディショニングは行わなかった。成形後のコンディショニングの影響を評価するための条件は、表6及び表10に提供されたサンプル2、4、6、8、14、18、19、20、及び21に基づいている。
4.0gのサンプルを使用して上記のように18B固体サンプルを成形し、2メートルトンの平均荷重下で130℃で成形した。サンプルを、1、2、3、4、5、6、8、10、又は15分間成形した。成形されたサンプルを、中程度の冷却速度で冷却し、コンディショニングは行わなかった。成形後のコンディショニングの影響を評価するための条件は、表6及び表10に提供されたサンプル2、4、6、8、14、18、19、20、及び21に基づいている。
図12は、18B固体の機械的特性に対する、成形時間の影響を評価するための、サンプル2、4、6、8、14、18、19、20、及び21から生成された応力-ひずみ曲線を示す。2、4、6、8、14、18、19、20、及び21シリーズはそれぞれ、1、2、3、4、5、6、8、10、及び15分間の成形時間と対応する。
異なる長さの時間で成形された18B固体サンプルの曲げデータを、以下の表10に示す。3連で測定された、コンディショニングされたサンプル対コンディショニングされていないサンプルの各々についての、曲げ弾性率(MPa)、最大曲げ強度(MPa)、及び破断点伸び(%)の平均値を、(測定された標準偏差(SD)とともに)提供する。
成形保持時間の増加は、固体の剛度の増加を示唆するのみであったことを発見した。成形時間が変化しても、固体の曲げ強度及び破断点伸び率に、統計的に重大な任意の効果を与えることはないように思われた。これは、それぞれ、平均曲げ弾性率、平均曲げ強度、及び平均破断点伸びのための図13、図14、及び図15で裏付けられた。具体的には、図13は、保持時間にわたる平均曲げ弾性率(MPa)を示している。保持時間が増加するにつれて、平均曲げ弾性率が増加した。エラーバーは、サンプルの標準偏差を示している。図14は、保持時間にわたる平均曲げ強度(MPa)を示している。試験した全ての成形時間にわたって、最大曲げ強度に統計的に重大な差があるようには見えなかった。図15は、保持時間にわたる平均破断点伸び(%)を示している。破断点伸び率と保持時間との間に任意の重大な関係があるようには見えなかった。エラーバーは、サンプルの標準偏差である。
曲げ弾性率は一般に、保持時間が増加するにつれて増加した。曲げ強度については、任意の所与の保持時間の公称値が、他の成形時間の誤差の範囲内であったことに留意されたい。その理由のため、成形時間に基づく強度の重大な差は見られないと結論付けることができた。同様に、保持時間と破断点伸びとの間に任意の重大な関係があるようには見えなかった。比較的大きな誤差の範囲及び変動性は、時間の制約により、試験をサンプルグループごとに3つの試験片に制限することで、部分的に説明され得る。これらの結果から、3~5メートルトンの平均荷重及び中程度の冷却速度を伴う約5~8分間の成形時間を中心に今後の処理を行うことが推奨された。成形時間をより長くすると、平均してより硬い固体を得ることができるが、長すぎる成形時間の増加は、スループット/生産性を低下させる結果となった。あるいは、成形時間をより短くすると、粉末様の固体が生じ、これは、審美的に非常に満足できるものではなかった。
破損前の試験片表面の光学顕微鏡検査は、固体形態に対する4つの要因の各々の影響を明らかにし、固体処理における各要因の役割の理解を手助けすることを意図していた。成形時間のみを1分間から15分間まで変化させる結果を、図16に示す。具体的には、図16は、等しい平均荷重及び冷却速度を維持して、様々な保持時間:(A)1分間(B)3分間(C)5分間(D)8分間(E)10分間(F)15分間に供したコンディショニングされていない固体の形態を示す。成形時間が1分間から5分間に増加すると、成形の追加の各分ごとに粒子凝集体が大幅に減少した。
この結論は、図17に示す目視の肉眼検査によって裏付けられ、より長い成形時間が、より均質で半透明な固体をもたらした。具体的には、図17は、(A)固体黒色表面(B、C)明るい光に対する、1分間の保持時間と5分間の保持時間との間の肉眼による目視検査を示す。より長い保持時間を有する固体は、粉末の塊が目立ちにくくなり、より半透明であった。粒子の凝集体は、15分間でもまだ存在していたが、5~6分間を超えると重大な差異の欠如が認められた。推奨される成形時間は、タンパク質を高温に長時間さらすことを避け、顕著な粒子凝集体を最小限に抑えるために、最大3mmの範囲の厚さに対して5分間であった。
図18は、異なる成形時間にわたってBenchtop SEMにより画像化した組換えシルク成形体の破損後の表面を示す。(A)より高いコントラストのために暗色化された1分間の保持時間(B)5分間の成形時間(C)15分間の成形時間。5分間の保持時間は、延性と脆性挙動の最も優れた混合を示した。
結論
最も優れた剛度を有する試験片は、より大きな成形時間、及び増加したプレス荷重の結果であった。硬い固体に向けての最も良好な経路として、これらのサンプルを調査することが推奨された。最も有望な試験片は、サンプルID番号11、12、及び17によるものであった。成形時間に基づく強度及び伸びの傾向は、サンプル間の変動が大きいため、確信的に識別することができなかった。
最も優れた剛度を有する試験片は、より大きな成形時間、及び増加したプレス荷重の結果であった。硬い固体に向けての最も良好な経路として、これらのサンプルを調査することが推奨された。最も有望な試験片は、サンプルID番号11、12、及び17によるものであった。成形時間に基づく強度及び伸びの傾向は、サンプル間の変動が大きいため、確信的に識別することができなかった。
推奨される成形時間は、5~8分間であった。成形時間をより長くすると、平均してより硬い固体を得ることができるが、長すぎる成形時間の増加は、スループット/生産性の低下を生じさせ、かつタンパク質の分解を引き起こした。あるいは、5分間未満のより短い成形時間では、粉末様の固体が生じ、これは、審美的に非常に満足できるものではなかった。
急速、中程度、及び遅い冷却の間で、弾性率、最大強度、及び破断点伸びに、統計的に重大な差があるようには見えなかった。中程度及び遅い冷却は実行するために最も便利であるため、それらが推奨された。
最も優れた破断点伸び率を有する試験片は、65%の相対湿度(RH)で最低72時間コンディショニングされ、Zwick ProLine装置の能力をはるかに超える破断点伸び率を示していた。
実施例4:架橋された組換えシルク固体
過硫酸アンモニウムを使用して18B固体を架橋した。過硫酸アンモニウムは、水には溶解したが、TEOA又はIPAには溶解しなかった。水は、固体の作製に悪影響を及ぼし、固体は、それが膨潤して崩壊するため、水中に長時間放置することができなかった。しかしながら、過硫酸アンモニウムを水に溶解させ、それを別の溶媒と混合することは可能であった。
過硫酸アンモニウムを使用して18B固体を架橋した。過硫酸アンモニウムは、水には溶解したが、TEOA又はIPAには溶解しなかった。水は、固体の作製に悪影響を及ぼし、固体は、それが膨潤して崩壊するため、水中に長時間放置することができなかった。しかしながら、過硫酸アンモニウムを水に溶解させ、それを別の溶媒と混合することは可能であった。
過硫酸アンモニウムを使用して固体を架橋するための、2つの方法を試みた。最初の方法では、79.7mgの過硫酸アンモニウム(APS)を、100.4mgの水に添加し、ボルテックスミキサを使用して溶解させた。この溶液を7.79gのTEOAに添加し、ボルテックスミキサを使用して混合した。これにより、99/1のTEOA/水溶液中の過硫酸アンモニウムの50mM溶液が得られた。
この溶液を、9.518gの18Bに分散させ、55重量%の18B分散液を得た。混合物を型に入れ、130~135℃でプレスした。固体を、オーブンに15時間放置して硬化させ、次いで水中に入れた。固体が、水中で膨潤し、崩壊し始めたことは、架橋が起こらなかったことを示している。
別の架橋方法では、18Bプレス固体を、過硫酸アンモニウム(APS)溶液に浸漬させた。684mgのAPSを、1.3mLのDI水に溶解させた。固体が純水中で過度に膨潤し、崩壊したため、IPAを溶液に添加した。11.45mLのIPAを追加すると、APSが溶液からクラッシュした。別の3.3mLの水を添加すると、塩は溶液に戻り、71/29のIPA/水混合物における187mMのAPS溶液を得た。重量パーセントに関しては、過硫酸アンモニウムが5重量%、水が32重量%、及び水が63重量%であった。
TEOAプレスサンプルを架橋溶液に1時間浸漬させ、次いで80℃で3時間保存した。得られた固体は耐水性があり、1日間の水への曝露の後であっても水中で崩壊することはなかった(図19)。
グリセロールプレスフィルムについても架橋を行った。フィルムを、APS/IPA/水溶液に10分間及び60分間浸し、一晩硬化させた。より長時間浸したフィルムは、特に濡れたときに、より不透明であった。オーブンで硬化させた後には、乾燥フィルムは、堅くて脆弱であった(図20A)。水に1時間未満浸した後、水は構造内に拡散し、ゴム状の挙動が得られた(図20B)。
耐水性に加えて、架橋はまた、固体材料による別の問題も解決した。可塑剤は全て吸湿性であるため、固体は水を吸収し、寸法安定性を失う。高湿度レベルで保持された固体プレスサンプルは、グリセロールプレスフィルムと同様に軟質かつ柔軟になる。架橋は、材料の構造的完全性を維持するのに役立った。130℃で10重量%のプロパンジオールを用いてプレスされた固体は、2つの化学物質、グルタルアルデヒド及び過硫酸アンモニウムを使用して架橋した。
グルタルアルデヒド化学物質は、10重量%のグルタルアルデヒド、10重量%の水、1.5重量%の塩化アルミニウム六水和物、及び78.5重量%のイソプロピルアルコールで構成されていた。固体を、架橋溶液に12時間浸したまま放置し、次いで硬化のために125℃の高温オーブンに5分間入れた。
過硫酸アンモニウム化学物質は、5重量%の過硫酸アンモニウム、25重量%の水、及び73重量%のイソプロピルアルコールで構成されていた。固体を、化学物質中に1時間入れて、硬化のために60℃で3時間入れた。
いずれかの化学物質により架橋した後、固体は耐水性になり、水に浸してもそれらの形状を保持していた(図21)。
実施例5:組換えシルクタンパク質からのフィルムの形成
フィルムプレス
可塑剤としての30~50重量%のグリセロールに溶媒和した18B粉末を、また、表面上に分散させ(図22)、グリセロールとともに2つの平行プレートの間でプレスした。グリセロールとともにプレスされたフィルムは容易に曲がり、表面に適合することができたが、他の溶媒は堅くて脆弱なフィルムを形成した。フィルム厚が少ないほどドレープ性が増加した。これらの柔軟なフィルムは、光学的に透明であった(図23)。これらのフィルムは、レーザーカッタを使用して、又は金型を使用して切断することができる(図24)。
フィルムプレス
可塑剤としての30~50重量%のグリセロールに溶媒和した18B粉末を、また、表面上に分散させ(図22)、グリセロールとともに2つの平行プレートの間でプレスした。グリセロールとともにプレスされたフィルムは容易に曲がり、表面に適合することができたが、他の溶媒は堅くて脆弱なフィルムを形成した。フィルム厚が少ないほどドレープ性が増加した。これらの柔軟なフィルムは、光学的に透明であった(図23)。これらのフィルムは、レーザーカッタを使用して、又は金型を使用して切断することができる(図24)。
対照として、18Bを、130℃で任意の溶媒なしでプレスした結果、脆弱なフィルムの白いフィルム(図25)が得られ、粉末は単純に平坦化され、フィルムへと圧縮された。
フィルム押し出し
溶媒和された18Bを、18Bフィルム押し出しとして、押し出した。実施例1及び2に記載される18B固体/フィルムを形成するためのプレス中に、フラッシュと称される、平坦な表面の間をドープが流れ、薄い柔軟なフィルムを形成した(図26)。このようにして、押し出しによりフィルム成形を実施した。
溶媒和された18Bを、18Bフィルム押し出しとして、押し出した。実施例1及び2に記載される18B固体/フィルムを形成するためのプレス中に、フラッシュと称される、平坦な表面の間をドープが流れ、薄い柔軟なフィルムを形成した(図26)。このようにして、押し出しによりフィルム成形を実施した。
実施例6:組換えシルク固体の再成形
実施例1に記載のように1,3プロパンジオールを用いてプレスすることによって作製した、成形された18B固体を再処理し、130℃でプレスして薄いフィルムを形成した。再処理されたフィルムの写真を図27に示す。具体的には、1,3プロパンジオールを用いてプレスすることによって作製した元の18B固体を左側に、再処理されたフィルムを右側に示している。この結果は、本明細書に記載される組換えシルク固体を、本明細書に記載される方法を使用して再処理して、異なる成形体の形状を形成することができることを示している。
実施例1に記載のように1,3プロパンジオールを用いてプレスすることによって作製した、成形された18B固体を再処理し、130℃でプレスして薄いフィルムを形成した。再処理されたフィルムの写真を図27に示す。具体的には、1,3プロパンジオールを用いてプレスすることによって作製した元の18B固体を左側に、再処理されたフィルムを右側に示している。この結果は、本明細書に記載される組換えシルク固体を、本明細書に記載される方法を使用して再処理して、異なる成形体の形状を形成することができることを示している。
他の実施形態
使用された言葉は、限定ではなく説明の言葉であり、そのより広い態様における本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範疇内で変更がなされ得ることを理解されたい。
使用された言葉は、限定ではなく説明の言葉であり、そのより広い態様における本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範疇内で変更がなされ得ることを理解されたい。
本発明は、いくつかの記載された実施形態に関して、ある程度の長さで及びある程度の特殊性とともに記載されているが、任意のそのような詳細若しくは実施形態、又は任意の特定の実施形態に限定されるべきであることを意図するものではなく、しかし、先行技術を考慮して、そのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、したがって、本発明の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲に対する参照と解釈されるべきである。
本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書が、定義を含め、優先される。加えて、セクション見出し、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
Claims (58)
- 成形体を製造するための方法であって、
a.組換えシルク及び可塑剤を含む組成物を提供することであって、前記組成物が流動可能な状態にある、提供することと、
b.前記組成物を型に入れることと、
c.前記型内の前記組成物に熱及び圧力を適用することと、
d.前記組成物を冷却して、前記組換えシルクを含む成形体を形成することと
を含む、方法。 - 前記成形体が、固体形態にある、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体が、フィルムである、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えシルクが、前記可塑剤中に分布した組換えシルク粉末である、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えシルクが、成形前に18Bの結晶化度と同様又はそれ未満の結晶化度を含む、請求項1に記載の方法。
- 組換えシルクタンパク質が、ネフィラスパイダー(nephila spider)鞭毛状シルク又はアラネウススパイダー(araneus spider)シルクである、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えシルクが、18Bである、請求項1に記載の方法。
- 前記組換えシルクが、配列番号1を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記可塑剤が、トリエタノールアミン、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、15重量%のトリメチレングリコールを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記可塑剤が、前記組成物の10~50重量%である、請求項1に記載の方法。
- 前記熱が、130℃の温度で適用される、請求項1に記載の方法。
- 前記圧力が、1,500~15,000psiの範囲で適用される、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体が、タイプAデュロメータにより測定した際に100の硬度を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体が、タイプAデュロモータ(duromoter)により測定した際に硬度90以上を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体が、タイプDデュロメータにより測定した際に硬度50以上、60以上、又は70以上を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体が、機械加工、切断、又は穴あけされ得、かつその所望の形状を維持することができる、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体が、前記流動可能な状態の前記組成物の前記組換えシルクと比較して、少なくとも50%、60%、70%、80%、又は90%の全長18Bモノマーを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体が、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、又は少なくとも50%の全長組換えシルクモノマーを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体が、少なくとも50%の全組換えシルクモノマー、組換えシルク凝集体、及び高分子量中間体を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記熱及び圧力が、1分間、2分間、3分間、4分間、5分間、6分間、8分間、10分間、又は15分間適用される、請求項1に記載の方法。
- 前記熱及び圧力が、5~8分間適用される、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体を、少なくとも50%の相対湿度に少なくとも24時間さらすことを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体を、65%の相対湿度に72時間さらすことを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記圧力が、少なくとも1メートルトン、少なくとも2メートルトン、少なくとも少なくとも3メートルトン、少なくとも4メートルトン、又は少なくとも5メートルトンのプレス荷重によって適用される、請求項1に記載の方法。
- 前記圧力が、1~5メートルトン、又は3~5メートルトンのプレス荷重によって適用される、請求項1に記載の方法。
- 前記冷却が、約1℃/分、約3℃/分、又は約45℃/分の速度にある、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、50MPa以上、60MPa以上、70MPa以上、80MPa以上、90MPa以上、100MPa以上、150MPa以上、200MPa以上、250MPa以上、又は300MPa以上の曲げ弾性率を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、10MPa以上、20MPa以上、30MPa以上、40MPa以上、50MPa以上、60MPa以上、70MPa以上、80MPa以上MPa以上、90MPa以上、又は100MPa以上の最大曲げ強度を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、1~4%の破断点伸び率を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、20%超の破断点伸び率を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、過硫酸アンモニウムを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体を、過硫酸アンモニウムに浸漬させることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体が、架橋されている、請求項1に記載の方法。
- 前記成形体が、化粧品又はスキンケア配合物である、請求項1に記載の方法。
- 組換えシルク及び可塑剤を含む組成物であって、固体形態にある、組成物。
- 前記成形体が、固体形態にある、請求項36に記載の組成物。
- 前記成形体が、フィルムである、請求項36に記載の組成物。
- 前記組換えシルクが、前記可塑剤中に分布した組換えシルク粉末である、請求項36に記載の組成物。
- 前記組換えシルクが、18Bである、請求項36に記載の組成物。
- 前記組換えシルクが、配列番号1を含む、請求項36に記載の組成物。
- 前記可塑剤が、トリエタノールアミン、トリメチレングリコール、又はプロピレングリコールからなる群から選択される、請求項36に記載の組成物。
- 前記組成物が、15重量%のトリメチレングリコールを含む、請求項36に記載の組成物。
- 前記可塑剤が、前記組成物の10~50重量%である、請求項36に記載の組成物。
- 前記成形体が、タイプAデュロメータにより測定した際に100の硬度を有する、請求項36に記載の組成物。
- 前記成形体が、タイプAデュロモータにより測定した際に硬度90以上を有する、請求項36に記載の組成物。
- 前記成形体が、タイプDデュロメータにより測定した際に硬度50以上、60以上、又は70以上を有する、請求項36に記載の組成物。
- 前記成形体が、機械加工、切断、又は穴あけされ得、かつその所望の形状を維持することができる、請求項36に記載の組成物。
- 前記成形体が、前記流動可能な状態の前記組成物の前記組換えシルクと比較して、少なくとも50%、60%、70%、80%、又は90%の全長18Bモノマーを有する、請求項36に記載の組成物。
- 前記成形体が、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、又は少なくとも50%の全長組換えシルクモノマーを有する、請求項36に記載の組成物。
- 前記成形体が、少なくとも50%の全組換えシルクモノマー、組換えシルク凝集体、及び高分子量中間体を有する、請求項36に記載の組成物。
- 前記組成物が、50MPa以上、60MPa以上、70MPa以上、80MPa以上、90MPa以上、100MPa以上、150MPa以上、200MPa以上、250MPa以上、又は300MPa以上の曲げ弾性率を有する、請求項36に記載の組成物。
- 前記組成物が、10MPa以上、20MPa以上、30MPa以上、40MPa以上、50MPa以上、60MPa以上、70MPa以上、80MPa以上MPa以上、90MPa以上、又は100MPa以上の最大曲げ強度を有する、請求項36に記載の組成物。
- 前記組成物が、1~4%の破断点伸び率を有する、請求項36に記載の組成物。
- 前記組成物が、20%超の破断点伸び率を有する、請求項36に記載の組成物。
- 前記組成物が、過硫酸アンモニウムを更に含む、請求項36に記載の組成物。
- 前記成形体が、架橋されている、請求項36に記載の組成物。
- 前記成形体が、化粧品又はスキンケア配合物である、請求項36に記載の組成物。
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