JP2023510143A - プロテアソーム阻害薬及びｈｄａｃ阻害薬の組合せ、並びにタンパク質コンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患の処置のための使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、プロテアソーム阻害薬とヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害薬の組合せ、及びタンパク質のプロテアソーム分解を引き起こす、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患の処置のためのその使用に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、プロテアソーム経路を介してタンパク質の細胞分解を引き起こす、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患を処置するための新規薬理学的ツールを提供する。

タンパク質は、それらの成熟中に、三次構造及び四次構造の形成に必要なフォールディングプロセスを受ける。多くの遺伝性疾患では、関与するタンパク質のフォールディングは、遺伝子変異（通常はミスセンス変異）から生じるアミノ酸変化により強い影響を受け得る。タンパク質は機能的な形質転換受容性を少なくとも部分的に保持し得るが、こうしたフォールディング欠陥はユビキチンプロテアソーム系によるタンパク質の分解をもたらし得る。これは、嚢胞性線維症、いくつかの網膜色素変性症、家族性高コレステロール血症、尿崩症、パーキン遺伝子に関連するパーキンソン病、フェニルケトン尿症、ニーマン・ピック病、α１－アンチトリプシン欠乏症、ファブリー病、ゴーシェ病又はポンペ病などのいくつかのリソソーム病、及びいくつかの筋ジストロフィーなど、小胞体で成熟するタンパク質のいくつかの遺伝性疾患に当てはまる。

肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）は、肩帯及び骨盤帯に悪影響を及ぼす筋力低下の一般的な臨床症状を共有する筋ジストロフィーの異種グループである。グループ内で、サルコグリカン異常症は、横紋筋のサルコレンマに位置する膜貫通タンパク質サルコグリカン（ＳＧ）複合体をコードする遺伝子の変異により引き起こされたサブグループである。ＳＧ複合体は筋収縮中の統合性を管理する役割を果たすことから、これらの遺伝子の変異は筋機能不全を引き起こす。４つのＳＧ、すなわちα－ＳＧ、β－ＳＧ、γ－ＳＧ、δ－ＳＧが説明されているが、これらは近年の命名法を用いるとそれぞれ、ＬＧＭＤ－Ｒ３、ＬＧＭＤ－Ｒ４、ＬＧＭＤ－Ｒ５及びＬＧＭＤ－Ｒ６に対応するＬＧＭＤである、ＬＧＭＤ２Ｄ、ＬＧＭＤ２Ｅ、ＬＧＭＤ２Ｃ、ＬＧＭＤ２Ｆの異なるサブタイプを生じさせる。これらのＬＧＭＤの臨床的特徴は十分説明されているが、サルコグリカン異常症に関連する分子機構の説明は不十分なものに止まっている。患者の多くのコホート分析により、数百の異なるこれらの遺伝子のミスセンス又は無発現変異はサルコグリカン異常症をもたらす可能性がある。最も頻発するタイプは、α－ＳＧの７７番目のアミノ酸（Ｒ７７Ｃ）におけるアルギニンからシステインへの置換である。こうした変異及び他のＳＧミスセンス変異は、小胞体品質管理（ＥＲＱＣ）システムにより認識され、ユビキチン－プロテアソームシステム（Ｂａｒｔｏｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７，１２１４－１２２１（２００８）、Ｇａｓｔａｌｄｅｌｌｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １７３，１７０－１８１（２００８）、Ｓｏｈｅｉｌｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．３３（２）：４２９－３９（２０１２））を介する小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）経路により分解される、ミスフォールドされているが依然として機能的なタンパク質の産生をもたらす。

現在のところ、サルコグリカン異常症に利用可能な処置は存在しないが、近年の研究から、小胞体（ＥＲ）分解システムの異なる段階の阻害は、細胞膜の変異されたＳＧ発現の回復に有効であり得ると示唆されている（Ｂａｒｔｏｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７，１２１４－１２２１（２００８）、Ｇａｓｔａｌｄｅｌｌｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １７３，１７０－１８１（２００８）、Ｓｏｈｅｉｌｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．３３（２）：４２９－３９（２０１２））。

この戦略を支持する証拠は、異なるグループにより説明されており、マンノシダーゼＩ活性を標的とするときのキフネンシンの正の影響（Ｂａｒｔｏｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７，１２１４－１２２１（２００８））、又はチオストレプトン（Ｈｏｃｈ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．９（１）：６９１５（２０１９））のＭＧ１３２（Ｇａｓｔａｌｄｅｌｌｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １７３，１７０－１８１（２００８））などのプロテアソーム阻害薬の使用、又は３－メチルアデニンなどのオートファジー阻害薬の使用（国際公開第２０１２／１６４２３４号パンフレット）により明らかにされている。概して、これらの研究は、細胞品質管理又は分解経路をターゲットとすることは、例えばＬＧＭＤ－Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６を引き起こすミスセンス変異を救出するには興味深いものであるという明確な証拠を提供する。
ただし、特に有効性及び安全性といった観点から、当該種類の遺伝性疾患を処置するための改善された治療的アプローチを見出す必要性は未だ存在している。

国際公開第２００６／１０２５５７号パンフレットは一般に、タンパク質分解障害、特に癌、又はタンパク質沈着障害などの細胞増殖障害を処置するための１種以上のタンパク質分解阻害薬の使用を開示している。

国際公開第２０１２／１６４２３４号パンフレット 国際公開第２００６／１０２５５７号パンフレット

（非特許文献１）Ｂａｒｔｏｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７，１２１４－１２２１（２００８）
（非特許文献２）Ｇａｓｔａｌｄｅｌｌｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １７３，１７０－１８１（２００８）
（非特許文献３）Ｓｏｈｅｉｌｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．３３（２）：４２９－３９（２０１２）
（非特許文献４）Ｈｏｃｈ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．９（１）：６９１５（２０１９）

発明者らは、例えばボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害薬と、ギビノスタットなどのＨＤＡＣ（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ、ヒストンデアセチラーゼ）阻害薬とを組み合わせることで、タンパク質の細胞分解を引き起こす、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患を処置することができることを示した。特に興味深いのは、潜在的な毒性を有するプロテアソーム阻害薬の量は、劇的に減少され得るという事実である。さらには、本出願は様々なプロテアソーム阻害薬、様々なＨＤＡＣ阻害薬、様々な変異タンパク質及び様々な変異を含むこうした組合せの有効性を報告する。
定義

以下の定義は、本発明に関して一般に使用される意味を提示しており、別の定義が明示的に示されない限り、これを考慮すべきである。

本発明の体系では、冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、文法的な冠詞の対象のうち、１つ又は複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用されている。例として、「要素」は、少なくとも１つの要素を意味する。すなわち、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。

量、定期的な持続期間などの測定可能な値を参照して本明細書で使用される場合、用語「約（ａｒｏｕｎｄ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」又は「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、特定の値から±２０％又は±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±１％、及びさらにより好ましくは±０．１％の変動を包含すると理解されるべきである。

本開示、本発明の様々な態様の全体を通して、間隔／範囲は間隔値の形式（範囲形式）で提示され得る。間隔の形式での値の説明は、単純に簡便さのためのものであると理解されるべきであり、本発明の範囲での柔軟性のない限定であると解釈されるべきではない。したがって、範囲の説明は、具体的に開示されているあらゆる可能性のあるサブ範囲及び範囲内の独立した数値を有すると考えられるべきである。例えば、１～６などの範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示されているサブ範囲、及び例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６といった範囲内の独立した数を有すると考えられるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。

「単離された」は、その自然環境又は自然状態から変性又は除去されたことを意味する。例えば、単離された核酸又はペプチドは、例えば植物中又は生存している動物中に存在しているかどうかにかかわらず、これらが通常見出される自然環境から抽出される、核酸又はペプチドである。例えば生存している動物中に天然に存在している核酸又はペプチドは、本発明の意味では、単離された核酸又はペプチドではない。一方で、その自然環境中に存在している他の成分から部分的又は完全に分離された同様の核酸又はペプチドは、本発明の意味では、それ自体「単離され」ている。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在可能、又は例えば宿主細胞などの非自然環境内に存在可能である。

本発明に関して、一般に生じる核酸塩基の以下の略語が使用される。すなわち、「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。

用語「異常な」は、生物、組織、細胞又はそれらの成分に関して使用される場合、「標準的な」（予想される）それぞれの特徴を示すそれらの生物、組織、細胞又はそれらの成分からの少なくとも１種の観察可能な又は検出可能な特徴（例えば、年齢、処置、時刻など）が異なる生物、組織、細胞又はそれらの成分を指す。１つの細胞又は組織の種類について標準的又は予想される特徴は、異なる細胞又は組織の種類については異常であり得る。

用語「患者」、「対象」、「個体」などは本明細書で互換的に使用され、これらは本明細書に説明される方法に対応する、インビトロ又はインサイチュであろうとなかろうと、任意の動物又はその細胞を指す。非限定的なある特定の実施形態では、患者、対象又は個体は動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。これはまたマウス、ラット、ブタ、イヌ又はマカクザルなどのヒト以外の霊長類（ＮＨＰ）であり得る。

本発明の意味では、「疾患」又は「病態」は、有害な影響を受け、かつ疾患を処置しない場合にその恒常性が悪化し続けるような、動物の健康状態である。逆に、本発明の意味では、「障害」又は「不全」は、動物が恒常性を維持可能である健康状態ではあるが、その健康状態は障害に罹患していないであろう状態よりも好ましくないものである。処置されないままであったともしても、障害は、経時的な動物の健康状態において、必ずしも悪化をもたらさない。

疾患又は障害は、疾患若しくは障害の症状の重症度、対象がこうした症状を経験する頻度、又はこれらの両方が減少する場合、「軽減」（「低減」）、又は「緩和」（「改善」）される。これはまた、疾患の進行の消失、すなわち疾患又は障害の進行の停止を含む。疾患又は障害は、疾患若しくは障害の症状の重症度、こうした症状が患者により経験される頻度、又はその両方が排除される場合、「治癒する」（「回復する」）。

本発明に関して、「治療的な」処置は、こうした症状を低減又は除去する目的で、病態の症状（兆候）を示す対象に適用される処置である。本明細書で使用される場合、「疾患又は障害の処置」は、対象が経験する疾患又は障害の少なくとも１つの兆候又は症状の頻度又は重症度の減少を意味する。処置は、疾患の発症、伝播又は悪化を防止するために適用されるとき、特に対象が疾患の症状及び／又はこれまで疾患だと診断されていない症状を有していない、又は未だ有していない場合に、予防的であると言われる。

本明細書で使用される場合、「疾患又は障害を処置する」は、対象が経験する疾患又は障害の少なくとも１つの兆候又は症状の頻度又は重症度の減少を意味する。処置に関して、疾患及び障害は、本明細書では互換的に使用される。

本発明の意味では、化合物の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ）」又は「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、化合物が投与される対象に対し、有益な効果を提供するのに十分である化合物の量である。語句「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ）」又は「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、疾患又は障害の症状を緩和させることを含む、疾患又は障害を防止又は処置（言い換えれば、発症の遅延又は防止、進行の防止、阻害、減少又は逆転）するのに十分である、又はこれに有効である量を指す。

本発明は、タンパク質の細胞分解、特にそのプロテアソーム分解を引き起こす、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患を処置するためのプロテアソーム阻害薬及びＨＤＡＣ（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ、ヒストンデアセチラーゼ）阻害薬の使用に関する。

したがって本発明は、タンパク質の細胞分解、特にそのプロテアソーム分解を引き起こす、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患の処置における使用のためのプロテアソーム阻害薬とＨＤＡＣ阻害薬の組合せに関する。

言い換えれば、プロテアソーム阻害薬及びＨＤＡＣ阻害薬は、タンパク質の細胞分解、特にそのプロテアソーム分解を引き起こす、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患の処置のために意図された薬剤を調製するために使用される。

したがって本発明は、タンパク質の細胞分解、特にそのプロテアソーム分解を引き起こす、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患を処置する方法に関し、その必要がある対象に、有効な用量で、プロテアソーム阻害薬及びＨＤＡＣ阻害薬を投与することを含む。

本発明による組成物の第１の活性成分はプロテアソーム阻害薬である。

本発明の体系では、プロテアソーム阻害薬は、プロテアソーム阻害活性を有する化合物として定義されている。こうした活性は、例えば：
－製造業者の指示に従い、２０Ｓプロテアソーム活性アッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用することで、
－実施例に開示されるようなキモトリプシン様活性、又はプロテアソームのトリプシン様活性若しくはカスパーゼ様活性を評価することで、といった当業者に公知の異なる方法で評価され得る。

こうしたプロテアソーム阻害薬は、以下の一覧：ボルテゾミブ（又はＶｅｌｃａｄｅ又はＰＳ－３４１）、ＭＧ１１５、ＭＧ１３２、ＭＧ２６２、ＭＧ１１０、ラクタシスチン、エポキソミシン、エポネマイシン、カルフィルゾミブ（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ）、ＣＥＰ－１８７７０、ＭＬＮ２２３８、ＯＮＸ－０９１２、マリゾミブ及びオムラリドで有利には選択される。より有利には、プロテアソーム阻害薬はボルテゾミブ、ＭＧ１３２又はカルフィルゾミブ、特にボルテゾミブである。

代替的に又は追加で、環状チオペプチド、特にチオストレプトンは、Ｈｏｃｈ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）により報告されているように使用され得る。

当該プロテアソーム阻害薬は、通常、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｅｏｕｓｌｙ）又は経口的に投与される。

本発明による組成物の第２の活性成分は、ヒストンデアセチラーゼの阻害薬又はＨＤＡＣ阻害薬（ＨＤＡＣｉ）である。

当該技術分野で公知であるように、ヒストンデアセチラーゼの阻害薬（ＨＤＡＣ阻害薬）は、エピゲノムを改変可能な化合物である。それらの作用レベルは、ヒストンの共有結合修飾に関する。好ましくは、こうした修飾は、リジン残基のアセチル化、リジン残基及びアルギニン残基のメチル化、スレオニン及びセリン残基のリン酸化、リジン残基のユビキチン化及びＳＵＭＯ化に関する。

好ましくは、こうした化合物は、ヒストン修飾酵素活性のレベルで直接、又はそれらの発現のレベルで遺伝的に、特にヒストン修飾酵素に作用することでヒストンアセチル化レベルを調節可能である。ヒストンアセチル化レベルは、抑制クロマチンをもたらすヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、及び遺伝子発現を可能にするヒストン－アセチル転移酵素（ＨＡＴ）といった２つの拮抗的な酵素の活性からもたらされる。

より好ましくは、こうした化合物は、ヒストンの脱アセチル化に関与する酵素の活性を阻害可能である。

ＨＤＡＣ阻害薬の阻害様式及び標的とするＨＤＡＣのクラスに従ったＨＤＡＣ阻害薬のいくつかのクラスが存在する。

こうした化合物は、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、化学分子、又は核酸（アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム・・・）といった任意の性質のものであり得る。

ヒストン脱アセチル化阻害薬は、
ｏ ヒドロキサム酸又はそれらの塩：
・ トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、
・ ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、
・ パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、
・ ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、
・ レスミノスタット（４ＳＣ－２０１）、
・ アベキシノスタット（ＰＣＩ－２４７８１）、
・ キシノスタット、
・ リコリノスタット（ＡＣＹ－１２１５）、
・ シタリノスタット（ＡＣＹ－２４１）、
・ プラクチリノスタット、
・ ＣＨＲ－３９９６、
・ α化合物８、
・ ＭＣ１５６８、
・ ツバシン、
・ ツバスタチン、
・ 以下の式を有するスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ又はボリノスタット又はＭＫ０６３）、

ｏ 環状テトラペプチド及びデプシペプチド：
・ トラポキシンＢ、
・ アピシジン、
ｏ ベンズアミド：
・ 以下の式を有するエンチノスタット（ＭＳ－２７５）、

・ Ｃｌ－９９４、
・ １０６；
・ ４ＳＣ－２０２、
・ テセジナリン（ＣＩ９９４）、
・ モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、
ｏ 求電子性ケトン：
・ トリフルオロメチルケトン、
・ α－ケトアミド（ｃｅｔｏａｍｉｄｅ）、
ｏ 脂肪酸化合物：
・ 以下の式を有するフェニル酪酸、

・ バルプロ酸又はバルプロ酸ナトリウム、
・ 酪酸
ｏ ダシノスタット（ＬＡＱ８２４）、
－他の分子：
ｏ ニコチンアミド、
ｏ ロミデプシンなどの環状テトラペプチド、
ｏ ジヒドロクマリン、
ｏ ナフトピラノン、
ｏ ２－ヒドロキシナフアルデヒド（ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、
ｏ １０－ヒドロキシ－２－デセン酸（１０ＨＤＡ）、
ｏ ＳＢ９３９、
ｏ ＣＵＤＣ－１０１、
ｏ ＣＵＤＣ－９０７、
ｏ ＡＲ－４２、
ｏ ＣＨＲ－２８４５、
ｏ ４ＳＣ－２０２、
ｏ ＣＧ２００７４５、
ｏ スルホラファン、
ｏ ケベトリン、
ｏ アピシジン、
ｏ 酪酸ナトリウム、
ｏ（－）－デプデシン、
ｏ サーチノール、
ｏ カンビノール、
ｏ Ｅｘ－５２７などの他のサーチュイン阻害薬、
ｏ Ｎ－ヒドロキシ－１，３－ジオキソ－１Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－２（３Ｈ）－ヘキサンアミド又はスクリプタイド、
ｏ 酪酸のヒドロキサム誘導体、
ｏ イソブチルアミド、
ｏ ＣＢＨＡ（ｍ－カルボキシケイ皮酸ビスヒドロキシアミド）、
ｏ ＨＣ毒素、
ｏ Ｍ３４４（４－ジメチルアミノ－Ｎ－（６－ヒドロキシカルバモイル－ヘキシル）－ベンゾアミド）、
ｏ ヌルスクリプト（４－（１，３－ジオキソ－１Ｈ，３Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－２－イル）－Ｎ－ヒドロキシブタンアミド）、
ｏ 以下の式を有するＰＣＩ－３４０５１、を含む。

いくつかのこれらの阻害薬の化学式は、Ｋａｚａｎｔｓｅｖ及びＴｈｏｍｐｓｏｎによる文献（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，７（１０）２００８，８５４－８６６）に説明されている。

さらに、ヒストンのメチル化の阻害薬は、
－以下の式を有するＳＬ１１１４４、

－以下の式を有するＤＺＮｅｐ（３－デアザネプラノチン：Ｓ－アデノシルホモシステインヒドロラーゼの阻害剤）、であり得る。

本発明の好ましい実施形態によれば、エピゲノムを改変する化合物はＨＤＡＣ阻害薬である。

本出願に示されるように、ＨＤＡＣ阻害薬は好ましくはＨＤＡＣ６を阻害可能なものである。これらはパン阻害薬、すなわち全てのタイプのＨＤＡＣの阻害薬である。代替的には、これらはＨＤＡＣ６を含む異なるＨＤＡＣに対し、同様の阻害作用、又はＨＤＡＣ６に対し優れた若しくはさらに排除的な阻害作用（選択阻害薬）を有し得る。

特定の実施形態によれば、ＨＤＡＣ阻害薬はギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）又はパノビノスタット（ＬＢＨ５８９）であり、有利にはギビノスタットである。

ＨＤＡＣ６阻害薬の例としては、ツバシンが使用され得る。他の例としては、リコリノスタット（ＡＣＹ－１２１５）、ツバスタチンＡ又はツバスタチンＡ ＨＣｌ、シタリノスタット（ＡＣＹ－２４１）、ネクスチュラスタットＡ、ＨＰＯＢ、ＳＫＬＢ－２３ｂｂ、及びＷＴ１６１がある。

さらなる有用な化合物は、ＴＨ３４、スクリプトドロキシノスタット、ＢＲＤ７３９５４、ＣＡＹ１０６０３、ＡＣＹ－７３８である。

当該ＨＤＡＣ阻害薬は通常、経口的又は場合により静脈内に投与される。

プロテアソーム阻害薬及びＨＤＡＣ阻害薬は、同時に（例えば、別の組成物又は単位組成物）又はいずれかの順序で連続して投与され得る。後者の場合では、２つの化合物は、有利さ及び相乗効果の達成を確実なものとするのに十分である期間内、並びに量、並びに方法で投与される。好ましい方法及び投与の順序、及びそれぞれの投与量、及びこの組合せの各成分のレジメンは、投与される特定のプロテアソーム阻害薬及びＨＤＡＣ阻害薬、この組合せの投与の経路、治療される疾患及び治療される特定の宿主に依存することが理解されよう。最適な方法及び投与順及び投与量及びレジメンは、従来の方法を使用する当業者によって、本明細書に記載の情報を考慮し、容易に決定され得る。

本発明は、タンパク質のプロテアソーム分解を引き起こす、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患に罹患している患者の処置において、同時使用、別々の使用又は連続使用するために組み合わせられた製剤としての、第１の活性成分としてプロテアソーム阻害薬、及び第２の活性成分としてＨＤＡＣ阻害薬を含有する生成物にさらに関する。

当業者は、以下に提示された結果から有効量を容易に決定することができる。一般に、治療有効量のプロテアソーム阻害薬及びＨＤＡＣ阻害薬は、０．００５ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの本体重量、特に０．００５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの本体重量であると企図される。１日を通し、適切な間隔での２回、３回、４回以上のサブ用量として必要な用量を投与することが適切であり得る。当該サブ用量は、例えば、単位剤形あたり、０．５～５００ｍｇ、特に１０ｍｇ～１００ｍｇの活性成分を含有する単位剤形として製剤化され得る。

有用な薬理学的特性を考慮し、本発明による組合せの成分であるプロテアソーム阻害薬及びＨＤＡＣ阻害薬は、投与目的で様々な医薬形態に製剤化され得る。この成分は、個々の医薬組成物で、又は両方の成分を含有する１つの医薬組成物で別々に製剤化されてもよい。

本発明はまた、活性成分として上に定義されるような少なくとも２種の化合物を含有する医薬組成物、及び医薬品又は薬剤としてのこれらの化合物又はこの組成物の使用に関する。有利には、こうした組成物は、治療有効量のこれらの組合せ及び医薬的に許容される担体を含む。

本発明はしたがって、１つ以上の医薬的に許容される担体又は賦形剤とともにプロテアソーム阻害薬及びＨＤＡＣ阻害薬を含む、医薬組成物にも関する。

特定の実施形態では、用語「医薬的に許容される」は、連邦政府若しくは州政府の規制機関により承認されること、又は動物及びヒトでの使用のため、米国薬局方若しくは欧州薬局方若しくは他の一般的に認識されている薬局方に列挙されることを意味する。用語「担体」は、治療薬とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は溶媒を指す。こうした医薬担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、石油起源、動物起源、植物起源又は合成起源のものを含む水及び油などの滅菌液体であり得る。医薬組成物が静脈内投与されるときには、水は好ましい担体である。生理食塩水溶液及びデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液は、液体担体、特に注射液用としても使用可能である。好適な医薬的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。

所望の場合、組成物はまた、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、徐放性製剤などの形態をとることができる。好適な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。こうした組成物は、対象への適正な投与形態を提供するため、好適な量の担体とともに、好ましくは精製形態の治療有効量の治療薬を含有する。

本発明に従い、使用のための医薬組成物を調製するには、活性成分として塩基付加塩又は酸付加塩形態にて、有効量の特定の化合物は医薬的に許容される担体と完全混和状態で組み合わせられる。この担体は、投与に望ましい製剤形態に応じて様々な形態をとることができる。これらの医薬組成物は、好ましくは経口投与、直腸投与、経皮投与にとって好適な単位剤形であること、又は非経口注射によるものが望ましい。例えば、経口剤形で組成物を調製する上で、懸濁液、シロップ、エリキシル剤及び溶液などの経口液体製剤の場合には、例えば、水、グリコール、油、アルコールなど通常の医薬媒体が利用されてもよく、又は散剤、ピル、カプセル及び錠剤の場合には、デンプン、糖、カオリン、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの固体担体が利用されてもよい。投与における容易さから、錠剤、場合によっては分割錠又は発泡錠、及びカプセルは、最も有利な経口投与剤形であることを表す。この場合、明らかなように固体の医薬担体が使用される。これらは、主な食事前に、又は主な食事中に少量の水とともに摂取され得る。

特定の実施形態では、組成物は、ヒトへの筋肉内投与又は静脈内投与に適合した医薬組成物として、所定の順序の手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張性緩衝水溶液中の溶液である。必要に応じ、組成物はまた、可溶化剤、及び注射部位での疼痛から解放するための、リドカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。組成物は好ましくは液体形態であり、有利には生理食塩水、及び／又はグルコース組成物であり、より有利にはリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）組成物、又は乳酸リンゲル溶液である。

既に言及されたように、疾患の処置に有効である本発明の治療薬の量、すなわち上で開示されるような化合物の量は、標準的な臨床技術により決定され得る。加えて、インビボ及び／又はインビトロアッセイは、任意選択的には最適な投与量範囲を予測する一助とするために使用されてもよい。製剤で使用される予測用量もまた、投与の経路、体重及び疾患の重篤度に依存し、施術者の判断及び各患者の状況により決定されなければならない。

しかしながら、特定の態様によれば、プロテアソーム阻害薬がエピゲノムを改変する化合物、好ましくはＨＤＡＣ阻害薬との組合せで使用されるという事実により、投与されるプロテアソーム阻害薬の量を劇的に減少させることができる。プロテアソーム阻害薬は、特に細胞生存に関する副作用を有することで知られており、したがって慢性疾患の処置にとって有望な薬物であると予測されていないため、非常に有利である。さしあたり、プロテアソーム阻害薬の適用は癌に限定されている。

本出願の体系では、他の活性化合物を加えることによって、プロテアソーム阻害薬の量又は濃度は、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、又はさらには６分の１、７分の１、８分の１、９分の１若しくは１０分の１に低減され得ることが示されている。言い換えれば、他の化合物の存在下でのプロテアソーム阻害薬の有効量は、当該他の化合物が存在しない場合のプロテアソーム阻害薬の有効量よりも２倍、３倍、４倍、５倍、又はさらには６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍少ない。

好ましい実施形態によれば、同一の組成物中で組み合わせられるとき、プロテアソーム阻害薬は、ＨＤＡＣ阻害薬を含まない組成物中のその量よりも少ない量で存在する。

好ましい実施形態によれば、プロテアソーム阻害薬は、その半数阻害濃度（ＩＣ_５０）以下の濃度で使用され得る。

言い換えれば、プロテアソーム阻害薬の量は、プロテアソーム活性の５０％未満、有利には４０％未満、３０％未満、又はさらには２０％未満を阻害するように選択される。プロテアソーム活性の阻害は、実施例で説明されるようなキモトリプシン様活性パーセントの測定に基づき、又はプロテアソームのトリプシン様活性若しくはカスパーゼ様活性の測定に基づき、監視され得る。

好適な投与により、疾患に応じて、治療有効量の治療用生成物を標的組織へと送達可能にしなければならない。

利用可能な投与の経路は、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）（局所（ｌｏｃａｌ））、腸内（システム全体効果、ただし胃腸（ＧＩ）管を通じて送達される）、又は非経口（全身作用、ただしＧＩ管以外の経路により送達される）である。いくつかの実施形態では、投与の好ましい経路は、一般には経口投与を含む経腸投与である。他の実施形態によれば、これは非経口投与であり得、特に筋肉内投与（すなわち、筋肉内）又は全身投与（すなわち、循環系内）であり得る。これに関して、用語「注射」（又は「灌流」又は「点滴」）は、血管内、特に静脈内（ＩＶ）投与及び筋肉内（ＩＭ）投与を包含する。注射は、シリンジ又はカテーテルを使用して通常実施される。

一実施形態によれば、組成物は、経口的、筋肉内、腹膜内、皮下、局所的、局部的、又は血管内で投与され、有利には経口的、及び／又は静脈内で投与される。

好ましい実施形態によれば、本発明のよる組合せ又は組成物は毎日、例えば１日につき１回投与される。処置は数週間、数ヶ月、数年、又は一生涯にわたり継続し得る。

既に記載した通り、患者は有利にはヒトであり、特に新生児、幼児、小児、成年又は成人である。ただし本発明による治療的ツールは、他の動物、特にブタ、マウス、イヌなどのペット、家畜又はマカクサルの処置に適合し、有用であり得る。

既に言及されているように、本発明は、タンパク質の細胞分解、特にそのプロテアソーム分解を引き起こす、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション異常に関連する遺伝性疾患の処置に関する。こうした疾患は、これがボルテゾミブ、ＭＧ１３２及びカルフィルゾミブなどのプロテアソーム阻害薬の投与により少なくとも部分的に軽減され得ることを意味することから、容易に識別され得る。これは、ＳＧモデルに対し、実施例に開示されるように試験され得る。

遺伝性疾患は、定義によれば、１つの遺伝子又は複数の遺伝子における１つの変異又は複数の変異から生じる疾患である。有利には、本出願は一遺伝子性疾患、すなわち単一遺伝子に関連する疾患に照準を合わせている。

得られたタンパク質のコンフォメーション障害の原因となる変異は、点変異であり得る。ただし、コンフォメーション障害は、点よりも大きい変異、例えば、分解されていない場合に依然として少なくとも部分的に活性であるタンパク質をコードする遺伝子中のコドンの欠損に関連し得る。

本発明に関して、「少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害」又は「タンパク質コンフォメーション障害」は、疾患を引き起こすタンパク質は、これをコードする遺伝子で少なくとも１つの変異が存在するためにミスフォールドされ、細胞、特にプロテアソーム経路による当該タンパク質の分解を引き起こすという事実を意味する。したがって、標的化された病態は、例えば、変異タンパク質に対する抗体によって容易に同定され得る。実際、この病態が正確に発現される場合であっても（これは転写レベルで確認され得る）少なくとも部分的に分解されていることから、こうした抗体の使用では検出されにくい。

一実施形態によれば、本発明に従い処置される疾患は、プロテアソーム阻害薬を使用して処置され得る疾患である。

一実施形態によれば、本発明に従い処置される疾患は、細胞増殖障害／疾患、特に癌、例えば多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、又は肝臓癌などではない。

別の実施形態によれば、本発明に従い処置される疾患は、タンパク質沈着障害／疾患（ＰＤＤ）、特に神経変性障害、例えばウィルソン病、脊髄小脳失調症、プリオン病、パーキンソン病、ハンチントン病、家族性筋萎縮性側索硬化症、アミロイドーシス、アルツハイマー病、アレキサンダー病、アルコール性肝疾患、嚢胞性線維症、ピック病、又はレビー小体病といったものではない。タンパク質沈着疾患は、タンパク質が病原性コンフォメーションを受け、様々な組織にて自己集合（凝集）及び沈着する疾患として定義され、組織統合性及び機能の破壊、並びに細胞死を誘発させ得る。本発明の体系で処置される疾患では、病理学的コンフォメーションを受けるタンパク質はプロテアソームにより分解される。

本発明に関して、提供された溶液は、特許請求される組合せの使用に依存しており、結果、変異されたタンパク質の分解を避け、それらの位置を最終的な細胞区画に配置させることを確実なものとし、したがって正常な表現型を回復させる。

特定の態様によれば、コンフォメーション障害を有し、細胞分解を受けたタンパク質は、膜のタンパク質であり、又は場合によってはタンパク質複合体に組み込まれる膜に関連するタンパク質である。

本出願に図示されるように、本発明は筋病態の処置に有用であり、有利には骨格筋に影響を与えるものであるが、場合によっては心筋にも影響を与えるものである。

特定の実施形態によれば、本発明は潜性の筋病態を目的とする。

有利には、タンパク質コンフォメーション障害に関連する遺伝性筋肉疾患は筋ジストロフィーであり、より有利には近位型及び遠位型の進行性筋ジストロフィーである。

進行性筋ジストロフィーの中で、以下の疾患：
－サルコグリカン異常症、すなわち、α－サルコグリカン異常症、又はα－サルコグリカン欠損に関連するＬＧＭＤ－Ｒ３、β－サルコグリカン異常症、又はβ－サルコグリカン欠損に関連するＬＧＭＤ－Ｒ４、γ－サルコグリカン異常症、又はγ－サルコグリカン欠損に関連するＬＧＭＤ－Ｒ５、又はδ－サルコグリカン異常症、又はδ－サルコグリカン欠損に関連するＬＧＭＤ－Ｒ６、
－ジスフェリン欠損に関連するジスフェリン異常症（ＬＧＭＤ－Ｒ２（＝ＬＧＭＤ２Ｂ又は三好型筋ジストロフィー）、
－カルパイン３欠損又はＬＧＭＤ－Ｒ１（＝ＬＧＭＤ２Ａ）に関連するカルパイノパチー、
－アノクタミン５欠損に関連するアノクタミノパチー（ａｎｏｃｔａｍｉｎｏｐａｔｈｙ）（ＬＧＭＤ－Ｒ１２（＝ＬＧＭＤ２Ｌ）又は三好３型筋ジストロフィー）、
－ＦＫＲＰ（「フクチン関連タンパク質」）の欠損に関連するＦＫＲＰ又はＬＧＭＤ－Ｒ９（＝ＬＧＭＤ２Ｉ）を有する、肢帯型筋ジストロフィー、が特に言及され得る。

より一般的には、標的疾患は以下の群：
－進行性筋ジストロフィー：
ｏ ジスフェリン（ＤＹＳＦ）を含む
ｏ γ－サルコグリカンを含む
ｏ α－サルコグリカンを含む
ｏ β－サルコグリカンを含む
ｏ δ－サルコグリカンを含む
ｏ カルパイン３を含む
ｏ アノクタミン５（Ａｎｏ５）を含む
ｏ フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）を含む
ｏ フクチン（ＦＫＴＮ）を含む
ｏ タンパク質－Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）を含む
ｏ タンパク質－Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼ２（ＰＯＭＴ２）を含む
ｏ タンパク質－Ｏ－結合型マンノースβ１，２－アセチルグルコサミン転移酵素（ＰＯＭＧＴ１）、又はＧＭＰＰＢ、ＰＯＭＫ、ＲＸＹＬＴ１、ＰＯＭＧＮＴ１、ＰＯＭＧＮＴ２、Ｂ４ＧＡＴ１、ＣＲＰＰＡ、Ｂ３ＧＡＬＮＴ２、ＩＳＰＤなどのα－ジストログリカンのグリコシル化経路に関与する他の酵素を含む
ｏ カベオリン３（Ｃａｖ３）を含む
ｏ ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼ（ＧＮＥ）を含む
－先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）：
ｏ α－ジストログリカン（ＤＡＧ１）を含む
ｏ ラミニンα－２（ＬＡＭＡ２）を含む
ｏ 同様のグルコシル転移酵素（ＬＡＲＧＥ）を含む
ｏ コラーゲン６Ａ１、６Ａ２、又は６Ａ３を含む
ｏ セレンタンパク質１（ＳＥＰＮ１）を含む
ｏ インテグリンα７（ＩＴＧＡ７）を含む
ｏ リアノジン受容体（ＲＹＲ）
－場合によっては他の器官の機能障害に関連する、骨格筋又は心筋に影響を与える他の疾患：
ｏ 膜貫通タンパク質４３（ＴＭＥＭ４３）を含む不整脈原性右室心筋症
ｏ ポリメラーゼＩ及び転写放出因子（ＰＴＲＦ）を含む４型脂肪栄養症筋ジストロフィー
ｏ ヘパラン硫酸（ＨＳＰＧ２）を含む軟骨形成不全筋強直症、又はシュワルツ・ヤンペル症候群
ｏ リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）を含むダノン病
ｏ Ｉ型アクチンＡ受容体（ＡＣＶＲ１）を含む進行性骨化性線維異形成症、から選択される。

特定の実施形態によれば、筋ジストロフィーは、先天性筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ、良性仮性肥大筋ジストロフィー）、遠位型筋ジストロフィー（遠位型ミオパチー）、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー（ＥＤＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＭＤ、ＦＳＨＤ又はＦＳＨ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、筋緊張性ジストロフィー、中心核ミオパチー、眼咽頭型筋ジストロフィー及びラミニン－α２－欠損型先天性筋ジストロフィー（筋ジストロフィー、メロシン欠損型先天性、１ａ／ＭＤＣ１Ａ）からなる群から選択される。

同一の疾患に関して、異なる変異は同一の遺伝子に影響を与え、コードされたタンパク質のコンフォメーション障害の原因となり得る。それゆえに、サルコグリカン異常症の例として、今に至るまで列挙された主要な点変異は、国際公開第２００８／００９８０２号パンフレットに列挙されている。

本出願に関して、本発明の実現可能性は、α－サルコグリカンのＲ７７Ｃ変異、並びにγ－サルコグリカンのＣ２８３Ｙ及びＥ２６３Ｋに関連して例えば実証される。ただし、請求された組合せは、プロテアソーム分解を引き起こす、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する任意の遺伝性疾患を処置するために使用され得る。

したがって、別の態様によれば、本発明は、特許請求された組合せにより治癒され得る任意の遺伝性疾患を同定するための方法に関する。これは、
－遺伝性疾患を引き起こすミスフォールドされたタンパク質を産生可能な細胞を組合せと接触された状態で配置する工程、
－正確にフォールドされたタンパク質の割合を決定する工程、を含む。

一実施形態は、プロテアソーム分解を引き起こす、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連した遺伝性疾患に推定的には冒された患者の細胞、有利には筋細胞、線維芽細胞又はＩＰＳＣ由来細胞を試験することを含む。バリエーションとして、患者の遺伝子型に対応するｃＤＮＡは細胞へとトランスフェクトされ、インビトロで試験を実施する。

患者がこうした疾患を完全に発症している場合、コンフォメーション障害を有するタンパク質は、分解されることから、低減され、又は検出可能ではないと予想される。これは、上記のように、特に当該タンパク質に対して方向付けられた抗体によって容易に試験される。

本発明の組合せの存在下では、正確にフォールドされたタンパク質の割合については、特に前の工程で実行された検出試験にて増加していると予想される。

正確にフォールドされたタンパク質の割合は、本発明の組合せと連動して増加する場合には、これはプロテアソーム分解を引き起こす、試験されたタンパク質のコンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患であり、患者はこうした組合せにより効果的に処置され得ると結論付けることが可能である。

一態様によれば、本発明による組合せは、同一の疾患への他の処置、特に同一の疾患を処置するための別の化合物に関連する。

特定の実施形態によれば、本発明は組成物に関し、有利には本発明による組合せ、及び同一の疾患、若しくは異なる疾患、有利には同一の疾患の処置のための、潜在的な他の活性分子（他の遺伝子治療タンパク質、化学基、ペプチド又はタンパク質など）を含有する医薬組成物又は医薬品に関する。

筋ジストロフィーに関連して、デコリン（国際公開第２０１０／１０６２９５号）又はフィブロモジュリン（国際公開第２０１３／０７２５８７号）など、筋肉量を増加することが可能であるペプチド又はタンパク質の同時投与又は連続投与が想定され得る。

より一般的には、少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患に関して、タンパク質の細胞分解を防止可能であるさらなる化合物は、同時に、又は異なる時間に投与され得る。同時投与の場合には、異なる化合物は同一の組成物中に結合され得る。

これに関して、Ｂａｒｔｏｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００８）に開示されるようなマンノシダーゼＩ阻害薬などの他の化合物、特にキフネンシンが使用され得る。代替的には、国際公開第２０１４／０１３１８４号に開示されるような、エピゲノムを改変するさらなるプロテアソーム阻害薬又はさらなる化合物が使用され得る。

本発明の実践は、特段明記しない限り、分子生物学（組換え技術）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用する。これらは、十分、当業者の範囲内である。こうした技術は例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ，１９８４）、「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，２０１０）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｗｅｉｒ，１９９７）、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，１９８７）、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌ，２００２）、「Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｒｏｕｂｌｅｓｈｏｏｔｉｎｇ」（Ｂａｂａｒ，２０１１）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎ，２００２）などの文献で十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に適用可能であり、それゆえに本発明の作成及び実践に考慮され得る。特定の実施形態にとって特に有用な技術は、以下のセクションにて説明される。

本発明にて引用される各特許及び全ての特許、特許出願、及び特許公報の開示は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。

さらなる説明がない場合、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用し、本発明の化合物を作製及び利用し、特許請求された方法を実践することができる。

本発明及びその利点は、以下に示される添付の図面を支持する実施例から良好に理解される。特に本発明は、α－サルコグリカン（α－ＳＧ）をコードする遺伝子中の変異Ｒ７７Ｃに関連するＬＧＭＤ２Ｄ（又はＬＧＭＤ－Ｒ３）のインビトロモデル、及びγ－サルコグリカン（γ－ＳＧ）をコードする遺伝子中の変異Ｃ２８３Ｙ又はＥ２６３Ｋに関連するＬＧＭＤ２Ｃ（又はＬＧＭＤ－Ｒ５）のインビトロモデルにおける、プロテアソーム阻害薬（ボルテゾミブ、ＭＧ１３２又はカルフィルゾミブ）とＨＤＡＣ阻害薬（ギビノスタット、ベリノスタット、又はツバシン）の様々な組合せの効果に関して例示される。ただしこれらの実施例は、いかなる方法であっても限定的ではない。

Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈ膜レスキューにおけるボルテゾミブ処置の効果の図である。

（Ａ）非透過処理条件下でＲ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈを発現するレンチウイルスで形質導入され、０．１％のＤＭＳＯ又は５ｎＭ若しくは３０ｎＭのＢＴＺで処理された線維芽細胞の免疫蛍光で検出された、ｍＣｈｅｒｒｙシグナル及びα－ＳＧの共焦点画像である。核はＨｏｅｃｈｓｔ染色により標識される。スケールバーは５０μｍである。

（Ｂ～Ｃ）ＢＴＺの濃度を上昇させながら行った線維芽細胞処理後の、細胞生存率（Ｂ）、プロテアソームのキモトリプシン様活性、並びにｍＣｈｅｒｒｙ及び膜α－ＳＧ陽性線維芽細胞の定量化（Ｃ）である。
ＢＴＺはボルテゾミブである。
ギビノスタットの効果の図である。

（Ａ）０．１％のＤＭＳＯで、又は１０μＭのギビノスタットを単独で、若しくは５ｎＭのＢＴＺと組み合わせて処理された、Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈを過剰発現する線維芽細胞における、非透過処理条件での５ｎＭのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナル及びα－ＳＧ染色。核はＨｏｅｃｈｓｔ染色により標識される（青）。スケールバーは５０μｍである。

（Ｂ～Ｄ）ギビノスタット単独で又は５ｎＭのＢＴＺと組み合わせて濃度を上昇させながら行った線維芽細胞処理後の、ｍＣｈｅｒｒｙ及び膜α－ＳＧ陽性線維芽細胞（Ｂ）、細胞生存率（Ｃ）又はプロテアソームのキモトリプシン様活性（Ｄ）の定量化。
ＢＴＺはボルテゾミブである。
ベリノスタットの効果の図である。

（Ａ）０．１％のＤＭＳＯで、又は１０μＭのベリノスタットを単独で、若しくは５ｎＭのＢＴＺと組み合わせて処理された、Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈを過剰発現する線維芽細胞における、非透過処理条件での５ｎＭのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナル及びα－ＳＧ染色。核はＨｏｅｃｈｓｔ染色により標識される（青）。スケールバーは５０μｍである。

（Ｂ～Ｄ）ベリノスタット単独で又は５ｎＭのＢＴＺと組み合わせて濃度を上昇させながら行った線維芽細胞処理後の、ｍＣｈｅｒｒｙ及び膜α－ＳＧ陽性線維芽細胞（Ｂ）、細胞生存率（Ｃ）又はプロテアソームのキモトリプシン様活性（Ｄ）の定量化。
ＢＴＺはボルテゾミブである。
ギビノスタットとボルテゾミブとの併用効果を示す。

（Ａ～Ｂ）プロテアソームのキモトリプシン様活性（Ａ）及びＲ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈを過剰発現し、ギビノスタットが存在しない状態で、又は１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ又は１０μＭのギビノスタットが存在する状態で、ＢＴＺの濃度を上昇させながら処理した線維芽細胞における、ｍＣｈｅｒｒｙ及び膜α－ＳＧ発現（Ｂ）の定量化。値を、０．１％のＤＭＳＯにより誘発された応答のパーセンテージとして（Ａ）、又はＢＴＺにより誘発された最大応答のパーセンテージとして（Ｂ）表す。

（Ｃ）膜α－ＳＧｍＣｈ膜レスキューにおいてＢＴＺと、ギビノスタットを用いた併用処置のＥＣ_５０、及びプロテアソーム活性におけるＢＴＺと、ギビノスタットを用いた併用処置のＩＣ_５０。
ボルテゾミブはＢＴＺである。
プロテアソーム阻害薬であるＣＦＺ又はＭＧ１３２とギビノスタットとの併用効果の図である。

１０ｎＭのカルフィルゾミブの存在下若しくはこれが存在しない状態（Ａ、Ｃ）で、又は１００ｎＭのＭＧ１３２の存在下若しくはこれが存在しない状態（Ｂ、Ｃ）で、ギビノスタットの濃度を上昇させながら処置した後の、ｍＣｈｅｒｒｙ及び膜α－ＳＧ陽性細胞の定量化（Ａ、Ｂ）及び代表的な免疫蛍光画像（Ｃ）。
ＢＴＺ＝ボルテゾミブ、ＣＦＺ＝カルフィルゾミブ。
γ－ＳＧ変異タンパク質におけるギビノスタット及びボルテゾミブの効果の評価の図である。

５ｎＭのＢＴＺの存在下で、又は存在しない状態で２４時間にわたりＤＭＳＯ（０．１％）、ＢＴＺ（５ｎＭ及び３０ｎＭ）又はギビノスタット（１０μＭ）で処理されたＣ２８３Ｙ－γ－ＳＧｍＣｈ又はＥ２６３Ｋ－γ－ＳＧｍＣｈコンストラクトを発現するレンチウイルスを用いて、ＳＧＣＧ－／－線維芽細胞に形質導入された。非透過処理条件での免疫蛍光により、膜γ－ＳＧ発現を評価した。（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナル（赤色）及び膜γ－ＳＧ染色（緑色）の画像。核はＨｏｅｃｈｓｔ染色により標識される（青）。スケールバーは５０μｍである。（Ｂ～Ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙ及び膜Ｃ２８３Ｙ－γ－ＳＧ（Ｂ）、並びに膜Ｅ２６３Ｋ－γ－ＳＧ（Ｃ）陽性線維芽細胞の定量化。
ＢＴＺ＝ボルテゾミブ。
ギビノスタット及びボルテゾミブの作用の組合せの機序の図である。

（Ａ）ミスフォールドされたタンパク質のプロテアソーム分解経路及びリソソーム分解経路の概略図である。

（Ｂ）Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈを過剰発現し、５ｎＭのＢＴＺの存在下で、又はこれが存在しない状態で２４時間にわたり、ＤＭＳＯ（０．１％）、ＢＴＺ（５ｎＭ又は３０ｎＭ）、又はギビノスタット（１０μＭ）で処理された線維芽細胞における、ユビキチン化されたタンパク質発現（上のパネル）、Ｐ６２及びＬＣ３ＢＩ／ＩＩ発現（中央のパネル）及びアセチル化α－チューブリン発現（下のパネル）のウェスタンブロット解析。
ＢＴＺはボルテゾミブである。
ツバシンとボルテゾミブとの併用効果の図である。

（Ａ）１０μＭのツバシンを単独で、又は５ｎＭのＢＴＺと組み合わせて処理された、Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈを過剰発現する線維芽細胞における、非透過処理条件での５ｎＭのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナル及びα－ＳＧ染色。核はＨｏｅｃｈｓｔ染色により標識される（青）。スケールバーは５０μｍである。

（Ｂ～Ｃ）ツバシン単独で又は５ｎＭのＢＴＺと組み合わせて濃度を上昇させながら行った線維芽細胞処理後の、ｍＣｈｅｒｒｙ及び膜α－ＳＧ陽性線維芽細胞（Ｂ）、並びに細胞生存率（Ｃ）の定量化。

（Ｄ）Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈを過剰発現し、５ｎＭのＢＴＺの存在下で、又はこれが存在しない状態で２４時間にわたり、ＤＭＳＯ（０．１％）、ＢＴＺ（５ｎＭ又は３０ｎＭ）、又はツバシン（１０μＭ）で処理された線維芽細胞における、ユビキチン化されたタンパク質発現（中央のパネル）、α－ＳＧ（上のパネル）及びアセチル化α－チューブリン発現（下のパネル）のウェスタンブロット解析。
ＢＴＺはボルテゾミブである。
材料及び方法
プラスミドクローニング及び突然変異誘発

ＮＣＢＩポータルに見出されるヒトＳＧＣＡコンセンサスコーディング配列（ＣＣＤＳ）（遺伝子ＩＤ：６４４２、ＣＣＤＳ番号４５７２９．１）及びｍＣｈｅｒｒｙ配列に基づき、α－サルコグリカン融合タンパク質を設計した。融合タンパク質の安定性／フォールディングをも増加させる可動型リンカーとして、ＧＧＧＧＳのアミノ酸形態のリンカーを選択した。Ｇｅｎｅｃｕｓｔにより融合タンパク質ヌクレオチド配列を合成し、レンチウイルス産生用に調製されたベクタープラスミドにクローニングした。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータにより、α－ＳＧｍＣｈと呼ばれる最終コンストラクトを駆動させた。ＳＧＣＡ遺伝子の２２９Ｃ＞Ｔヌクレオチド変化に基づき、Ｒ７７Ｃ変異を作製した。突然変異誘発は、製造業者の指示に従い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（２００５１６、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。

Ｒ７７Ｃ変異を導入するために使用されるプライマーは、
順方向５’－ＧＣＣＣＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＣ－３’（配列番号１）及び逆方向５’－ＧＣＧＣＴＧＧＧＴＧＴＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＧＧＧＧＣ－３’（配列番号２）であった。

ＮＣＢＩポータルに見出されるヒトＳＧＣＧコンセンサスコーディング配列（ＣＣＤＳ）（遺伝子ＩＤ：６４４５、ＣＣＤＳ番号９２９９．１）及びｍＣｈｅｒｒｙ配列に基づき、γ－サルコグリカン融合タンパク質を設計した。融合タンパク質の安定性／フォールディングをも増加させる可動型リンカーとして、ＧＧＧＧＳのアミノ酸形態のリンカーを選択した。Ｇｅｎｅｃｕｓｔにより融合タンパク質ヌクレオチド配列を合成し、レンチウイルス産生用に調製されたベクタープラスミドにクローニングした。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータにより、γ－ＳＧｍＣｈと呼ばれる最終コンストラクトを駆動させた。ＳＧＣＧ遺伝子のＴＧｃ＞Ｔａｃ及びＣａａ＞Ａａａヌクレオチド変化に基づき、Ｃ２８３Ｙ変異及びＥ２６３Ｋ変異を作製した。突然変異誘発は、製造業者の指示に従い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（２００５１６、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。

Ｃ２８３Ｙ変異及びＥ２６３Ｋ変異を導入するために使用されるプライマーは、
Ｃ２８３Ｙについては、
順方向５’－ｇｇｔｇｔｇａｇｃａｃｃａｃｇｔＡｃｃａｇｇａｇｃａｃａａｃｃ－３’（配列番号３）及び
逆方向５’－ｇｇｔｔｇｔｇｃｔｃｃｔｇｇＴａｃｇｔｇｇｔｇｃｔｃａｃａｃｃ－３’（配列番号４）であり、
Ｅ２６３Ｋについては、
順方向５’－ｇｃｔｃａｃａｇａｇｃｃｔｃｔａｃＡａａａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｇｔｃｃ－３’（配列番号５）及び
逆方向５’－ｇｇａｃａｃａｃａｃａｇａｔｔｔＴｇｔａｇａｇｇｃｔｃｔｇｔｇａｇｃ－３’（配列番号６）であった。
細胞培養、形質導入及び薬理学的処置

Ｇｅｎｅｔｈｏｎ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋで得られた患者の生検から、本研究で使用される線維芽細胞を単離した。関与する機関の倫理ガイドライン及び原産国の法律要件に従い、本研究に含まれる患者の両親からインフォームドコンセントを得た。

ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の触媒サブユニットをコードする配列を含有するｐＢＡＢＥ－ピューロベースのレトロウイルスベクターを、線維芽細胞へと形質導入し、既に説明されるように（Ｃｈａｏｕｃｈ，Ｓ．ｅｔ，Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２０，７８４－７９０（２００９））、ピューロマイシン（１ｍｇ／ｍＬ）の存在下で１０日間にわたり選択した。線維芽細胞を、１０％のウシ胎児血清（研究グレード、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１％のペニシリン－ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充されたダルベッコ変性イーグル培地＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。

変異α－ＳＧ及びγ－ＳＧを過剰発現させるため、４μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で、感染多重度（ＭＯＩ）が２０のヒトＲ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈ、Ｃ２８３Ｙ－γ－ＳＧｍＣｈ又はＥ２６３Ｋ－γ－ＳＧｍＣｈを発現するレンチウイルスベクターを用いて不死化線維芽細胞を形質導入した。５０μｇ／ｍＬのコラーゲンＩでコーティングされたプレートに細胞を播種し、３７℃で５％のＣＯ２の加湿雰囲気でこれを維持した。播種の２４時間後、細胞を試験化合物（ボルテゾミブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ギビノスタット（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ベリノスタット（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ツバシン（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ＭＧ１３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、カルフィルゾミブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ））又は担体であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ＶＷＲ）で処理した。処理の２４時間後に細胞を分析した。
イムノブロッティング

播種の２４時間後、試験化合物又は担体とともに、Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈを発現している不死化線維芽細胞をインキュベートした。処理の２４時間後に細胞を回収した。細胞溶解緩衝剤（ＮＰ４０緩衝剤、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びプロテアーゼ阻害薬（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＰＩＣ，Ｒｏｃｈｅ）により、タンパク質を抽出した。３～８％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＸＴトリスアセタートタンパク質ゲルを使用してタンパク質を分離し、次いで７分／２５Ｖのプログラムを使用するトランスブロットＴｕｒｂｏ転写システム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。以下の抗体：
－ユビキチン化されたタンパク質：Ｍｅｒｃｋ、０４－２６３、
－アセチル化αチューブリン：Ｓｉｇｍａ、Ｔ６７９３、
－Ｐ６２：Ａｂｃａｍ、ａｂ５６４１６、
－ＬＣ３ＢＩ／ＩＩ：Ｎｏｖｕｓ、ＮＢ６００－１３８４、を用いたインキュベーションにより標準的なＯｄｙｓｓｅｙプロトコールを使用し、タンパク質の検出を実施した。

１：１００００に希釈されたＯｄｙｓｓｅｙ二次抗体ロバ抗マウス（ＤＡＭ）６８０、及び１：５０００に希釈されたロバ抗ウサギ（ＤＡＲ）８００を１時間、室温で使用してウェスタンブロットを表し、次いでＯｄｙｓｓｅｙ機器を用いてスキャンした。
ＳＧ局在化細胞ベースのアッセイ及び生存率試験

薬物処理の２４時間後、細胞を４％のパラホルムアルデヒド（１０分、室温）で固定した。ブロッキング（１時間、室温）のために１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）を追加し、一次ハイブリダイゼーション工程（一晩、４℃）のためにマウス抗－α－ＳＧ（ＮＣＬ－Ｌ－ａ－ＳＡＲＣ、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、Ｌｅｉｃａ）又は抗－γ－ＳＧ（ＮＣＬ－Ｌ－ｇ－ＳＡＲＣ、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、Ｌｅｉｃａ）を使用し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中で免疫組織染色を実施した。フルオロフォア結合二次抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１時間、室温）で細胞を染色し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で核を可視化した。ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ ＣＸ７ ＨＣＳ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ）を用いてＳＧ局在化を分析した。核同定のために第１のチャネルを使用し、膜ＳＧ染色同定のために第２のチャネルを使用し、ｍＣｈｅｒｒｙタグの同定のために第３のチャネルを使用した。高解像度カメラモードで１０倍対物レンズを用いて写真を取得し、共局在バイオアプリケーションを使用してこれを分析した。視野あたりのＨｏｅｃｈｓｔ染色細胞を数えること（細胞生存率の定量化を可能とする）で、細胞の数を監視した。
プロテアソーム活性アッセイ

線維芽細胞を３８４ウェルプレートに播種し、１２時間にわたり示されるような試験の組合せで処理した。製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示に従い、プロテアソーム－Ｇｌｏ（商標）又はキモトリプシン様細胞ベースアッセイ試薬を加えた。ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）マイクロプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用し、ルミネセンスを読み取った。
統計分析

全データを平均±ＳＤとして表す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用し、統計分析を実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ５．０．３）を使用し、曲線フィッティング、ＩＣ_５０及びＥＣ_５０の決定を実施した。
結果
１／Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈ細胞モデルのバリテーション

異種条件のＲ７７Ｃ－α－ＳＧ変異の膜局在化を容易に評価するために、外因性タンパク質の陽性細胞の同時同定及び細胞膜のタンパク質の量の定量化を可能とする系を生成した。Ｃ末端にてｍＣｈｅｒｒｙ蛍光レポータ（ｍＣｈ）を融合したヒトＲ７７Ｃ－α－ＳＧのコード配列からなる、融合タンパク質を生成した。タンパク質成熟及びフォールディング時のタンパク質の干渉を避けるため、２つのコード配列間に可動性リンカーを挿入した。以下Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈと呼ばれるコンストラクトをサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータの転写制御下に置き、レンチウイルス骨格へと挿入した。内在性α－ＳＧが存在しないことを理由に、細胞モデルとして、ＬＧＭＤ－Ｒ３患者に由来する不死化線維芽細胞を使用した。

α－ＳＧ免疫蛍光（ＩＦ）の共焦点分析は、非透過処理条件（図１Ａ、上のパネル）におけるＲ７７Ｃ変異タンパク質の膜局在化を検出可能であると表しておらず、タンパク質の保留を示した。このモデルの関連性は、プロテアソーム阻害薬である３０ｎＭのボルテゾミブ（ＢＴＺ）で処理した後に原形質膜におけるＲ７７Ｃ－α－ＳＧ局在化のレスキューを示すことで検証された（図１Ａ、下のパネル）。ＢＴＺの毒性学的なプロファイル（図１Ｂ）、並びにプロテアソーム活性におけるＩＣ_５０及びＲ７７Ｃ－α－ＳＧレスキューにおけるＥＣ_５０（図１Ｃ）を定量化する用量応答実験により、プロテアソーム活性及び毒性の限定的な阻害を伴う、部分的にＲ７７Ｃ－α－ＳＧ分解をレスキューするＢＴＺ（５ｎＭ）の毒性水準下の用量を確認することが可能となる。ＢＴＺのこの濃度は、Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧ膜レスキューについて相乗的に作用する薬物を同定するためのコンビナトリアルスクリーニング向けに選択された。
２／ミスフォールドされた変異α－ＳＧタンパク質分解の阻害薬としての、ギビノスタット及びベリノスタットの同定

図２Ａ及び図３Ａに示されるように、ギビノスタット（１０μＭ）及びベリノスタット（１０μＭ）は、点状のα－ＳＧ染色により検出されるＲ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈ膜レスキューにおいては低い効果を表したが、５ｎＭのＢＴＺの添加は、拡散α－ＳＧ染色を誘発させ、ＢＴＺとの相乗効果を示唆した。これらの観察は、用量応答実験により確認された。膜におけるＲ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈの存在を定量化し、ギビノスタット又はベリノスタットの単独処置（それぞれ、３．０μＭ及び５．３μＭのＥＣ５０）と比較すると、追加の毒性なく（図２Ｃ及び図３Ｃ）、併用処置の有効性が有意に高いことを表した（それぞれ、０．８μＭ及び０．３μＭのＥＣ５０）（図２Ｂ及び図３Ｂ）。ギビノスタット又はベリノスタットの濃度を増加させた後のプロテアソームのキモトリプシン様活性の測定（図２Ｄ及び図３Ｄ）は、プロテアソーム阻害を表さず、ＢＴＺの作用機序とは別の作用機序を示唆した。

１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ又は１０μＭのギビノスタットの存在下で、ＢＴＺ濃度を上昇させながら処置した後のキモトリプシン様活性の測定による、ＢＴＺ介在プロテアソーム阻害におけるギビノスタットの評価（図４Ａ及び図４Ｃ）は、異なる組合せにより誘発されるＩＣ_５０の有意な変化を表さなかった。一方、膜Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈ変異タンパク質レスキューの有意なＥＣ_５０変化は観察され（図４Ｂ及び図４Ｃ）、ギビノスタットはＢＴＺ介在プロテアソーム阻害における効果を有さないという証拠を提供した。

ギビノスタットと、２つの他のプロテアソーム阻害薬であるカルフィルゾミブ及びＭＧ１３２それぞれとの組合せにより、同様の結果が得られた（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ）。Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈの膜局在化は、低用量のカルフィルゾミブ（１０ｎＭ）又はＭＧ１３２（１００ｎＭ）と組み合わせられたギビノスタットの濃度を上昇させながら処置した後に観察され、Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈ変異タンパク質レスキューにおけるそれらの相乗効果が確認された。
３／ギビノスタット及びボルテゾミブの組合せによるＳＧタンパク質の異なるミスセンス変異のレスキュー

ギビノスタットとＢＴＺとの組合せの効果を、ＬＧＭＤ－Ｒ５患者で頻繁に報告されているミスフォールドされたγ－ＳＧを引き起こす他の異なるミスセンス変異に関して評価した。ＳＧＣＧ ＫＯ線維芽細胞に、Ｃ２８３Ｙ又はＥ２６３Ｋ γ－ＳＧｍＣｈを発現しているレンチウイルスを形質導入した。非透過処理条件での免疫蛍光画像分析は、変異を形質導入した細胞において、膜レベルでの検出可能なγ－ＳＧ染色が存在しないことを表した（図６Ａ）。ギビノスタットとＢＴＺとの組合せの評価は、これらのミスフォールドされたγ－ＳＧタンパク質もまた、レスキューされた細胞の５５％～６５％の範囲の有効性によりプロテアソーム分解から救出され得ることを表した（図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃ）。
４／ギビノスタット及びボルテゾミブの作用のコンビナトリアル機序

プロテアソーム阻害薬が代償的な応答としてオートファジーを誘発し得ることを実証した研究は、文書にて十分立証されている（図７Ａ）。図４Ａのデータは、ギビノスタットがプロテアソーム阻害により作用しないことを示すことから、リソソーム分解に関与するＨＤＡＣ６の阻害によるその可能な作用を調査した。

図７Ｂに示されるように、ギビノスタットとＢＴＺの組合せは、ユビキチン化タンパク質の相乗的な蓄積を誘発し、ユビキチン化タンパク質の分解を相乗的に遮断することを示唆している（図７Ｂ、上のパネル）。ギビノスタットとＢＴＺを組み合わせた処置後のＰ６２蓄積によるＬＣ３Ｂ－ＩのＬＣ３Ｂ－ＩＩへの変換のさらなる増加が観察されているが、これはオートファジーの阻害を反映したものである（図７Ｂ、中央のパネル）。最終的に、ギビノスタット単独、又は５ｎＭのＢＴＺと組み合わせた処置は、α－チューブリンのアセチル化を誘発させたが、これはＬＧＭＤ－Ｒ３細胞のＨＤＡＣ６活性におけるギビノスタットの阻害効果を示唆している（図７Ｂ、下のパネル）。ＨＤＡＣ６に感受性のあるタンパク質を監視することによって図７に実証されるように、ＢＴＺと組合せ可能なギビノスタットは、オートファジー分解からこれらのタンパク質を保護することが可能である。

ＬＧＭＤ－Ｒ３細胞のＨＤＡＣ６活性におけるギビノスタットの阻害効果の仮説に基づき、Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈ変異レスキューに関する、選択的ＨＤＡＣ６阻害薬である１０μＭのツバシンの効果を調べた。ツバシンは、膜Ｒ７７Ｃ－α－ＳＧｍＣｈ発現についての用量応答曲線、及び同一の範囲でギビノスタット（図８Ｃ）よりも細胞毒性を有する５ｎＭのＢＴＺ（図８Ａ及び図８Ｂ）との相乗効果を引き起こす。ウェスタンブロット解析により、ツバシンとＢＴＺを組み合わせた処置後の、増加したα－ＳＧタンパク質レベル、ユビキチン化タンパク質の相乗的な蓄積、及びα－チューブリンのアセチル化（図８Ｄ）の増加を確認した。
結論

本研究は、小胞体保留及び初期の分解によるＳＧ変異タンパク質をレスキュー可能な候補分子としてのＨＤＡＣ阻害薬、及び濃度を劇的に減少させることが可能であるプロテアソーム阻害薬との組合せでのそれらの使用を確認する。

この組合せは次いで、ミスセンス変異により影響される、例えばＬＧＭＤ－Ｒ３又はＬＧＭＤ－Ｒ５患者の処置にとってより有効で安全である、新しい治療的解決策を構成する。

Claims (15)

1. プロテアソームにより分解される少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する遺伝性疾患の処置における使用のための、プロテアソーム阻害薬とヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害薬の組合せ。
2. 前記プロテアソーム阻害薬が、ボルテゾミブ、ＭＧ１３２及びカルフィルゾミブからなる群で選択され、有利にはボルテゾミブである、請求項１に記載の使用のための組合せ。
3. 前記ＨＤＡＣ阻害薬がＨＤＡＣ６を阻害する、請求項１又は２に記載の使用のための組合せ。
4. 前記ＨＤＡＣ阻害薬が、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ツバシンからなる群で選択され、有利にはギビノスタットである、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
5. 前記プロテアソーム阻害薬が、半数阻害濃度（ＩＣ_５０）以下の濃度である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
6. 前記プロテアソーム阻害薬及び前記ＨＤＡＣ阻害薬を含む医薬組成物の形態である、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
7. 前記プロテアソーム阻害薬が、ＨＤＡＣ阻害薬を含まない組成物中の量よりも少ない量で存在する、請求項６に記載の使用のための組合せ。
8. 同時使用、別々の使用、又は連続使用のためのものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
9. 少なくとも１種のタンパク質のコンフォメーション障害に関連する前記遺伝性疾患が、筋ジストロフィーである、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
10. 前記筋ジストロフィーが、サルコグリカン異常症、ジスフェリン異常症、アノクタミノパチー、カルパイノパチー、ＦＫＲＰ（「フクチン関連タンパク質」）障害に関連するジストロフィーからなる群から選択され、有利にはサルコグリカン異常症、より有利にはα－サルコグリカン異常症又はγ－サルコグリカン異常症である、請求項９に記載の使用のための組合せ。
11. 前記タンパク質が、サルコグリカン、有利にはα－サルコグリカン又はγ－サルコグリカン、ジスフェリン、アノクタミン５、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）及びカルパイン３からなる群から選択される、請求項９に記載の使用のための組合せ。
12. 同一の疾患の他の処置と関連する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
13. 同一の疾患を処置するためのさらなる化合物を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
14. 前記さらなる化合物が、別のプロテアソーム阻害薬、マンノシダーゼＩ阻害薬、又はエピゲノムを改変する別の化合物である、請求項１３に記載の使用のための組合せ。
15. 経口的、筋肉内、腹膜内、皮下、局所的、局部的、又は血管内で投与され、有利には経口的、及び／又は静脈内で投与される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のための組合せ。
    
    

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