JP2023509752A - 多官能性キメラ分子 - Google Patents

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Abstract

本開示は、標的基質の修飾剤としての有用性が見出される多官能性化学的コンジュゲーション分子に関する。本開示は、局在化部分と、化学的リンカー部分と、活性化剤部分と、化学的リンカー部分を一端で活性化剤部分に相互接続する第１の配向アダプターと、任意選択で、化学的リンカー分子を異なる端で局在化部分に相互接続する第２の配向アダプターとを含む多官能性化合物を含む。本発明に係る分子は、活性化剤部分の天然基質でない高分子に翻訳後修飾を行うという使用を見出す。本開示の分子によって疾患又は障害が治療又は予防され得る。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／９５８，６９６号明細書、２０２０年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／０５７，８７９号明細書及び２０２０年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０６９，６５５号明細書の利益を主張する。上記で特定された出願の全ての内容は、参照により本明細書に全体的に援用される。
電子的配列表の参照
電子的配列表（「ＢＲＯＤ－４８５０ＷＰ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」；サイズは、１４，７８２バイトであり、これは、２０２１年１月５日に作成された）の内容は、全体として参照により本明細書に援用される。
本明細書に開示される主題は、概して、標的基質に修飾を誘導するために利用される多官能性化学的コンジュゲーション分子に関する。
プロテインキナーゼは、細胞周期、代謝、分化、増殖及びアポトーシスなどの重要な細胞機能を調節する。キナーゼ機能不全は、癌、炎症性病態、自己免疫障害及び心疾患を含めた種々のヒト疾患とも関係がある。
当技術分野では、酵素機能不全及び翻訳後修飾などの修飾に関連する疾患に対する有効な治療が必要とされ続けている。しかしながら、非特異的効果などが妨げとなり、有効な修飾及び治療の開発は、依然として妨げられている。例として、いずれか所与のタンパク質のリン酸化を誘導する小分子が存在せず、必要に応じて小分子を使用して任意のタンパク質をリン酸化できれば有利であろう。このように、近接性が媒介する効果によって酵素に新規機能を与える新規小分子があれば、重要な細胞機能及び疾患の研究及び治療において有用となる可能性がある。
特定の例示的実施形態において、局在化部分と、化学的リンカー部分と、活性化剤部分と、化学的リンカー部分を一端で活性化剤部分に相互接続する第１の配向アダプターと、任意選択で、化学的リンカー分子を異なる端で局在化部分に相互接続する第２の配向アダプターとを含む多官能性化学的コンジュゲーション分子が提供される。
特定の実施形態における分子は、
式Ｉ－Ａ
Ｌｏｃ－Ｌ－（Ｖ１－Ａｃｔ）ｎ （Ｉ－Ａ）
（式中、Ｌｏｃは、局在化部分を含み、Ｌは、化学的リンカー部分であり、Ｖ１は、第１の配向アダプターであり、及びＡｃｔは、活性化剤部分であり、ｎは、少なくとも１である）；又は
式Ｉ－Ｂ
Ｌｏｃ－Ｖ２－Ｌ－（Ｖ１－Ａｃｔ）ｎ （Ｉ－Ｂ）
（式中、Ｌｏｃは、局在化部分を含み、Ｌは、化学的リンカー部分であり、Ｖ１は、第１の配向アダプターであり、Ｖ２は、第２の配向アダプターであり、及びＡｃｔは、活性化剤部分である）
によって表され得る。本分子は、表１から独立に選択される第１及び第２の配向アダプターを含むことができる。
ある態様において、活性化剤部分は、局在化部分と会合された標的基質を修飾する酵素に結合し、且つそれを活性化させる。特定の実施形態において、標的基質は、酵素の天然の基質ではないか、又は活性化剤分子による酵素の活性化は、活性化剤部分への結合によって活性化されない場合、本来、その酵素によって修飾されないままである１つ以上の新しい修飾部位において、酵素による標的基質の修飾をもたらす。
リンカーは、ＰＥＧ分子、アルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキル、アリール、アルキレン、アルケニル、ヘテロアリール、アミド、アミン、チオール又はこれらの誘導体を含み得る。リンカーは、多官能性リンカーであり得、ある態様では、リンカーは、多官能性ＰＥＧリンカーである。本多官能性分子は、約２～５個の活性化剤分子を含有し得る。活性化剤部分は、ある態様では、酵素を見つけ出し、且つそれを活性化させる能力を有し、酵素は、キナーゼ、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ又はリガーゼであり得る。実施形態において、キナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ、チロシンキナーゼ又はタンパク質セリン／スレオニン及びタンパク質チロシンをリン酸化する二重特異性プロテインキナーゼである。
キナーゼは、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）、グルコキナーゼ（ＧＫ）又はＡＧＣキナーゼを含み得る。実施形態において、活性化剤部分は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）に結合し、且つそれを活性化させる。活性化剤部分は、実施形態において、ＰＫＣ－α、ＰＫＣ－βＩ、ＰＫＣ－βＩＩ、ＰＫＣ－γ、ＰＫＣ－ε、ＰＫＣ－δ、ＰＫＣ－η又はＰＫＣ－ζから選択されるＰＫＣアイソフォームに結合し、且つそれを活性化させる。活性化剤部分は、表１から選択される。
本分子は、核酸、ポリペプチド又は多糖を標的化する局在化部分を含むことができる。実施形態において、局在化部分は、標的ポリペプチド結合部分である。ある態様において、標的ポリペプチド結合部分は、ブロモドメイン含有タンパク質４（ＢＲＤ４）、ＢＲＤ３、ＢＲＤ２、ＢＲＤＴであり得るブロモドメイン及びエクストラターミナルモチーフ（ＢＥＴ）を含む標的ポリペプチドに結合する。標的ポリペプチド結合部分は、（＋）－ＪＱ１を含むことができる。
本分子は、式
Figure 2023509752000002
 （式中、ｎ＝３、５、７、９、１１
Figure 2023509752000003
 ［１．１～１．５］である）
に係るものであり得る。
本分子は、式
Figure 2023509752000004
 （式中、ｎ＝０及びｍ＝０、ｎ＝１及びｍ＝１、ｎ＝２及びｍ＝３、ｎ＝２及びｍ＝１、ｎ＝２及びｍ＝３［ＰＨＩＣＳ２．１～２．５］である）
に係るものであり得る。
本分子は、
Figure 2023509752000005
 から選択され得る。
ある態様において、本分子は、式
Figure 2023509752000006
 （式中、Ｒ１は、ＪＱ１、イブルチニブ、ダサチニブ、ＭＲＴＸ、ＭＩ－１０６１、ゲフィチニブ、パルボシクリブ又はフォレチニブから選択され、及びＲ２は、ＰＦ－０６４０９５７７、ベンゾラクタム又はＤＰＨから選択され、Ｘは、ＣＨ２又は（ＣＨ２）２Ｏであり、及びＸ＝ＣＨ２であるとき、ｎ＝１若しくは５又はｍ＝０若しくは４であり、Ｘ＝（ＣＨ２）２Ｏであるとき、ｎ＝３又はｍ＝３である）
に係るものである。
本分子は、式
Figure 2023509752000007
 （式中、Ｙ及びＺは、ハロゲンである）
に係るものであり得、好ましい実施形態において、この式は、
Figure 2023509752000008
 （式中、Ｘは、（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎ（ＯＣ２Ｈ４）ｎ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２（ＯＣ２Ｈ４）ｎ及び（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＯＣ２Ｈ４）ｎから選択され、ここで、各ｎは、０、１、２、３、４、５、６又は７から独立に選択され、及びＲは、
Figure 2023509752000009
 である）
に係るものである。
本明細書に開示される分子は、本明細書に開示されるとおりの局在化部分のいずれかを独立に選択することを含み得、活性化部分は、本明細書に開示される活性化剤の各々から独立に選択され、第１及び第２の配向アダプターは、表２から独立に選択され、及びリンカーは、本明細書に開示されるとおりのリンカー部分から独立に選択される。
前出の請求項のいずれか１つに係る分子と、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、担体又は希釈剤とを含む医薬組成物が提供され得る。本発明の化合物は、ＡＭＰを提供され得る。
細胞の標的基質を修飾する方法であって、細胞を、本明細書に記載される多官能性分子の１つ以上と接触させることを含む方法である。特定の実施形態において、修飾は、翻訳後修飾を含み、これは、リン酸化、ヒドロキシル化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、プレニル化、アミド化、エリミニレーション（ｅｌｉｍｉｎｙｌａｔｉｏｎ）、脂質化、アシル化、リポイル化、脱アセチル化、ホルミル化、Ｓ－ニトロシル化、Ｓ－スルフェニル化、スルホニル化、スルフィニル化、スクシニル化、硫酸化、カルボニル化又はアルキル化を含み得る。
ある態様において、修飾は、細胞におけるタンパク質のリン酸化を誘導することを含む。タンパク質をリン酸化する方法は、タンパク質を、本明細書に開示される分子と接触させることを含み、ここで、タンパク質は、本分子の活性化剤部分に特異的なキナーゼに近接している。タンパク質のリン酸化は、キナーゼの基質でない複数のタンパク質のリン酸化を含み得る。タンパク質は、ＢＲＤ４であり得る。特定の方法では、タンパク質は、ＢＲＤ４のＢＤ１とＢＤ２との間でリン酸化される。標的基質の修飾を、それを必要としている対象において行う方法も提供され、この方法は、本明細書に開示されるとおりの分子を投与することを含む。ある態様において、対象は、治療される病態を有し、それは、癌であり得る。
目的のタンパク質を修飾する方法も提供され、この方法は、１つ以上の活性化剤を含む環境において、目的のタンパク質を、本明細書に開示される化合物と接触させることを含む。疾患、障害又は病態の治療を、それを必要としている対象において行う方法は、本明細書に開示される分子を対象に投与することを含み得る。
多官能性コンジュゲーション分子を作製する方法であって、リンカー分子の異なる端に局在化部分及び活性化剤部分を結合することを含む方法も提供され、局在化部分及び活性化剤部分は、任意選択で、配向アダプターを介してリンカー分子に結合され、リンカー分子は、活性化剤分子及び局在化部分の両方が細胞において活性であるように、活性化剤分子を連結する。
当業者には、示される例示的実施形態についての以下の詳細な説明を考察することで９１の実施形態の上記及び他の態様、目的、特徴及び利点が明らかになるであろう。
本発明の特徴及び利点の理解は、本発明の原理が利用され得る例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
図１Ａ ＡＭＰＫとＢＲＤ４との間（ＰＨＩＣＳ１．２）又は図１Ｂ ＰＫＣとＢＲＤ４との間（ＰＨＩＣＳ２．３）のＰＨＩＣＳ誘導性三元複合体形成の説明図及び図１Ｃ 近接誘導性リン酸化が本キメラ分子によって推進されることの概略的な説明図。
ＡＭＰＫによるＰＨＩＣＳ１．２誘導性ＢＲＤ４リン酸化の生化学的特徴付け。（図２Ａ）ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎによって観測されるＢＲＤ４、ＰＨＩＣＳ及びＡＭＰＫの三元複合体形成（ＤＭＳＯで正規化した）。（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２は、ＢＲＤ４に対して低親和性の不活性類似体である。（図２Ｂ）（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２と比較したＰＨＩＣＳ１．２によるＢＲＤ４のＡＭＰＫ触媒性リン酸化に関するＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ。（図２Ｃ）ホスホ－ＡＭＰＫ基質モチーフ抗体を用いたＰＨＩＣＳ１．２によるＢＲＤ４リン酸化のウエスタンブロット分析。（図２Ｄ）ウエスタンブロットで分析したＰＨＩＣＳ１．２濃度の関数としてのＢＲＤ４リン酸化のベル型依存性。（図２Ｅ）ＢＲＤ４からの種々のペプチド配列又はＡＭＰＫ基質ＡＣＣに由来するペプチド（ＳＡＭＳペプチド）のＡＭＰＫ媒介性リン酸化に関するＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ。（図２Ｆ）ＡＭＰＫアイソフォームがＰＨＩＣＳ１．２媒介性ＢＲＤ４リン酸化に及ぼす効果。（図２Ｇ）ＡＭＰＫと、ＰＨＩＣＳ１．２と、種々のＢＲＤタンパク質との間の三元複合体形成に関するＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ。（図２Ｈ）ウエスタンブロットによる種々のＢＲＤタンパク質のＰＨＩＣＳ１．２触媒性リン酸化の検出。ＢＲＤタンパク質の負荷レベルは、クーマシーゲルによって決定した。
ＰＫＣによるＰＨＩＣＳ２．３誘導性ＢＲＤ４リン酸化の生化学的特徴付け。（図３Ａ）ＤＭＳＯ対照で正規化したＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎによって観測されるＢＲＤ４、ＰＨＩＣＳ及びＰＫＣ三元複合体の形成。（図３Ｂ）（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ２．３と比較したＰＨＩＣＳ２．３によるＢＲＤ４のＰＫＣ触媒性リン酸化に関するＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイ。（図３Ｃ）ウエスタンブロットにおけるホスホ－ＰＫＣ基質モチーフ抗体によるＢＲＤ４リン酸化の検出。（図３Ｄ）ＰＨＩＣＳ２．３の存在下においてＰＫＣアイソフォーム間で観察される種々のＢＲＤ４リン酸化レベル。（図３Ｅ）種々のＢＲＤタンパク質のＰＨＩＣＳ２．３媒介性リン酸化のウエスタンブロット分析。
（図４Ａ）２次元リガンドマップにおいて主要な相互作用Ｋ２９、Ｋ３１及びＤ８８と併せた、ＡＭＰＫに結合した活性化剤ＰＦ－０６４０９５７７の３次元共結晶構造。（図４Ｂ）２次元リガンドマップにおいて主要な相互作用Ｔ２４２、Ｌ２５１及びＧ２５３と併せた、ベンゾラクタム活性化剤とＰＫＣのドッキング。リンカーが結合した溶媒露出部位を青色で強調表示している。
種々のリンカーを有するＰＨＩＣＳ１を合成するためのクリックケミストリープラットフォーム。
ＳＡＭＳペプチドを基質としたＡＤＰ ＧｌｏアッセイによるＡＭＰＫ活性化剤、ＰＨＩＣＳ１中間体及びＰＨＩＣＳ１．２の生化学的検証。
更なる研究に最適な分子を同定するための種々のリンカーを有するＰＨＩＣＳ１の生化学的検証。（図７Ａ）様々なリンカー長さのＰＨＩＣＳ１類似体の構造。（図７Ｂ）ＢＲＤ４－ＰＨＩＣＳ－ＡＭＰＫ三元複合体形成に関するＡｌｐｈａ ｓｃｒｅｅｎアッセイの概略図。（図７Ｃ）ＤＭＳＯで正規化した種々のリンカーを有するＰＨＩＣＳ１に関するＡｌｐｈａ ｓｃｒｅｅｎアッセイ。（図７Ｄ）種々の濃度のＰＨＩＣＳ１類似体によるＡＭＰＫ触媒性ＢＲＤ４リン酸化のウエスタンブロット分析。
不活性類似体の検証。（図８Ａ）ＰＨＩＣＳ１．２及びその不活性類似体（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２の構造。（図８Ｂ）ＰＨＩＣＳ１分子によるＡＭＰＫ活性化を比較するためのＳＡＭＳｔｉｄｅペプチドを基質としたＡＤＰ－Ｇｌｏ。（図８Ｃ）プルダウンアッセイによって観察されたＰＨＩＣＳ１．２の誘導によるＡＭＰＫ及びＢＲＤ４の三元複合体形成。（図８Ｄ）ＰＨＩＣＳ１．２の存在下におけるＡＭＰＫによるＨｉｓタグ付加ＢＲＤ４（４９－４６０）リン酸化のウエスタンブロット分析。（図８Ｅ）ウエスタンブロットによって観察された、ＡＭＰＫ濃度がＰＨＩＣＳ１．２又は（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２媒介性ＢＲＤ４リン酸化に及ぼす効果。
ＰＨＩＣＳ１．２の存在下におけるＡＭＰＫによるＢＲＤ４リン酸化の質量分析による同定。（図９Ａ）Ｔ１６９、（図９Ｂ）Ｔ１８６、（図９Ｃ）Ｔ２２１、（図９Ｄ）Ｓ３２４及び（図９Ｅ）Ｓ３２５がリン酸化されたペプチドのスペクトル。各スペクトルにフラグメンテーションパターンを示す。
実験で使用したトランケート型ＢＲＤ４、ＢＲＤ３及びＢＲＤ２のアミノ酸配列アラインメント。アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して作成した。質量分光分析によって同定されたＢＲＤ４のリン酸化した残基に赤色（ＡＭＰＫ媒介性）又は青色（ＰＫＣ媒介性）のアスタリスクを付す。
種々のリンカーを有するＰＨＩＣＳ２二官能性分子の合成。
ＰＫＣ活性化剤及びＰＨＩＣＳ２類似体によるＰＫＣ－α活性化を決定するためのＳＡＭＳｔｉｄｅペプチドを基質として使用したＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイ。
ＰＫＣによるＢＲＤ４リン酸化に最適なＰＨＩＣＳ２の同定。（図１３Ａ）種々のＰＨＩＣＳ２類似体による三元複合体形成に関するＡｌｐｈａ ｓｃｒｅｅｎアッセイ。（図１３Ｂ）種々のＰＨＩＣＳ２分子によって媒介されるＢＲＤ４リン酸化を比較するためのウエスタンブロット分析。（図１３Ｃ）ＰＨＩＣＳ２．３又は（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ２．３の存在下におけるＰＫＣ濃度がＢＲＤ４リン酸化に及ぼす効果。
ＰＨＩＣＳ２．３の存在下におけるＰＫＣによるＢＲＤ４リン酸化の質量分析による同定。（図１４Ａ）Ｔ２２９、（図１４Ｂ）Ｓ３２４及び（図１４Ｃ）Ｓ３３８がリン酸化されたペプチドのスペクトル。各スペクトルにフラグメンテーションパターンを示す。
ＮＲＭスペクトル：図１５Ａ 化合物３の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図１５Ｂ．４の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。
図１６Ａ ４の１３Ｃ ＮＭＲ。図１６Ｂ ＰＨＩＣＳ１．１の１Ｈ ＮＭＲ。
図１７Ａ ＰＨＩＣＳ１．１の１３Ｃ ＮＭＲ。図１７Ｂ ＰＨＩＣＳ１．２の１Ｈ ＮＭＲ。
図１８Ａ ＰＨＩＣＳ１．２の１３Ｃ ＮＭＲ。図１８Ｂ （Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２の１Ｈ ＮＭＲ。
図１９Ａ－（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２の１３Ｃ ＮＭＲ。図１９Ｂ ＰＨＩＣＳ１．３の１Ｈ ＮＭＲ。
図２０Ａ ＰＨＩＣＳ１．３の１３Ｃ ＮＭＲ。図２０Ｂ ＰＨＩＣＳ１．４の１Ｈ ＮＭＲ。
図２１Ａ ＰＨＩＣＳ１．３の１３Ｃ ＮＭＲ；図２１Ｂ ＰＨＩＣＳ１．５の１Ｈ ＮＭＲ。
図２２Ａ ＰＨＩＣＳ１．５の１３Ｃ ＮＭＲ。図２２Ｂ ２１の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。
図２３Ａ ２１の１３ＣＮＭＲスペクトル。図２３Ｂ ２２の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。
２２の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図２５Ａ ２３の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図２５Ｂ ２３の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図２６Ａ ２４の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図２６Ｂ ２４の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図２７Ａ ２５の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図２７Ｂ ２５の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図２８Ａ ２６の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図２８Ｂ．２６の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図２９Ａ ２７の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図２９Ｂ．２７の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図３０Ａ ２８の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図３０Ｂ ２８の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図３１Ａ ２９の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図３１Ｂ ２９の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図３２Ａ ３０の１Ｈ ＮＭＲスペクトル；図３２Ｂ ３０の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図３３Ａ ＰＨＩＣＳ２．１の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図３３Ｂ．ＰＨＩＣＳ２．１の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図３４Ａ ＰＨＩＣＳ２．２の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図３４Ｂ．ＰＨＩＣＳ２．２の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図３５Ａ ＰＨＩＣＳ２．３の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図３５Ｂ．ＰＨＩＣＳ２．３の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図３６Ａ ＰＨＩＣＳ２．４の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図３６Ｂ．ＰＨＩＣＳ２．４の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図３７Ａ ＰＨＩＣＳ２．５の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図３７Ｂ．ＰＨＩＣＳ２．５の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図３８Ａ （Ｒ）－ＰＨＩＣＳ２．３の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。図３８Ｂ．（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ２．３の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
図３９Ａ－ＰＨＩＣＳ分子を作成するためのキナーゼ結合剤の同定及びリンカー最適化；図３９Ｂ－ＰＨＩＣＳ－キナーゼ－ＢＲＤ４は、三元複合体に関して観察される「フック効果」を示す。
質量分析により、ＢＲＤ４上のネオリン酸化部位が指示される。キナーゼ基質認識モチーフ中の同定されたリン酸化残基：Ｔ１８６、Ｓ３２４、Ｓ３２５、キナーゼ基質認識モチーフにないリン酸化残基：Ｔ１６９、Ｔ２２１。Ｔ１６９がリン酸化されたペプチドのスペクトル、左。
ホスファターゼがＰＩＣＳ媒介性ＢＲＤ４リン酸化を除去できることを示すゲル。
画像化から、キナーゼアイソフォーム（細胞質ゾル）及びＢＲＤ４（核）を有する細胞でＰＨＩＣＳがＢＲＤ４をリン酸化できないことが示される。
ブルトンチロシンキナーゼＢＴＫに対するＰＨＩＣＳ及び対照の合理的設計）。
ＰＨＩＣＳの媒介によるＢＴＫのリン酸化を調査する。図４４Ａ インビトロでのＰＨＩＣＳの媒介によるＢＴＫのリン酸化、図４４Ｂ インセルロでのＰＨＩＣＳの媒介によるＢＴＫのリン酸化。
ＰＨＩＣＳの媒介によるキナーゼ及びＢＴＫの免疫共沈降。
ホスファターゼ阻害剤は、ＰＨＩＣＳの媒介によるＢＴＫのリン酸化レベルを増加させる。
ＢＴＫポケットの描画であり、Ｔ４７４が水素結合を形成し；Ｄ５３９及びＫ４３０がポケットの基礎を形成する（左）ことを示し；ＢＴＫ突然変異体Ｔ４７４Ａ、Ｋ４３０Ｒ及びＤ５３９Ｎにおけるリン酸化の欠如を呈するゲル。
ＰＨＩＣＳにバルク性の高い基を導入すると、活性の喪失につながる。
ＦＫＢＰ１２に対するＰＨＩＣＳ。
ダサチニブを使用したｃ－Ａｂｌチロシンキナーゼ及びＢＴＫに対するＰＨＩＣＳ。
（Ａ）ホスホ－ＰＫＣ基質モチーフ抗体を使用したイムノブロッティングによるＢＲＤ４リン酸化の検出。（Ｂ～Ｃ）（Ｂ）ＰＨＩＣＳ１又は（Ｃ）ＰＨＩＣＳ２によるＢＲＤ４リン酸化に関して、そのそれぞれのｉＰＨＩＣＳと比較したＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイ。（Ｄ）蛍光体－Ｓｅｒ４８４／４８８抗体を使用したＰＨＩＣＳ１媒介性ＢＲＤ４リン酸化のウエスタンブロット分析。
（Ａ）ＡＭＰＫアイソフォームがＰＨＩＣＳ１媒介性ＢＲＤ４リン酸化に及ぼす効果。（Ｂ）ＰＫＣアイソフォームがＢＲＤ４リン酸化に及ぼす効果。
細胞におけるＡＭＰＫによるＰＨＩＣＳ媒介性ＢＴＫリン酸化。（Ａ）ＡＭＰＫによるＢＴＫのリン酸化のためのＰＨＩＣＳ３及びＰｉｖ－ＰＨＩＣＳ３不活性対照の構造。（Ｂ）ＰＨＩＣＳ３の存在下でのＡＭＰＫ及びＢＴＫ－Ｆｌａｇの免疫共沈降によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞における三元複合体形成の検出。ＷＣＬ：全細胞ライセート（Ｃ～Ｄ）ＷＴ ＢＴＫ－Ｆｌａｇ（Ｃ）及びＢＴＫ－Ｆｌａｇ Ｓ１８０Ａ突然変異体（Ｄ）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＨＩＣＳ３によるＢＴＫリン酸化のウエスタンブロット分析。ＡＭＰＫ活性化剤及びＢＴＫ阻害剤の構造については、ＳＩを参照されたい。
細胞におけるＰＨＩＣＳ３の標的会合。（Ａ）共有結合性ＢＴＫ阻害剤イブルチニブとの競合実験。（Ｂ）イブルチニブとＢＴＫとの主要な相互作用（ＰＤＢ ＩＤ：５Ｐ９Ｉ）。（Ｃ）ＷＴ ＢＴＫ及びＴ４７４突然変異体のＰＨＩＣＳ３誘導性リン酸化のウエスタンブロット分析。（Ｃ）ＰＨＩＣＳ３及びその不活性類似体Ｐｉｖ－ＰＨＩＣＳ３によるＢＴＫリン酸化のウエスタンブロット分析。
分子ドッキング。（５５Ａ）ＡＭＰＫに結合した活性化剤ＰＦ－０６４０９５７７の共結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：５ＫＱ５）。リンカー結合のために溶媒露出部位を修飾した。青色で強調表示する。（５５Ｂ）本分子と、Ｌｙｓ２９、Ｌｙｓ３１及びＡｓｐ８８との主要な相互作用を示す２次元リガンドマップ。
修飾された活性化剤及びＰＨＩＣＳ中間体のＡＤＰ Ｇｌｏアッセイによる生化学的検証。（５６Ａ）ＳＡＭＳペプチドを基質としたＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイによる強力活性化剤ＰＦ－０６４０９５７７、ＡＭＰＫ活性化剤及びリンカーを有するＡＭＰＫ活性化剤によるＡＭＰＫ活性化の生化学的検証。（５６Ｂ）修飾されたＰＫＣ活性化剤によるＰＫＣα活性化を決定するためのＣＲＥＢｔｉｄｅペプチドを基質として使用したＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイ。
ＡＭＰＫ活性化剤、リンカーを有するＡＭＰＫ活性化剤、種々のリンカー長さの二官能性ＡＭＰＫ－ＰＨＩＣＳ（ＰＨＩＣＳ１、ｎ＝５から得られたリード化合物）及び不活性類似体ｉＰＨＩＣＳ１の合成。
ＰＫＣ活性化剤及び種々のリンカー長さの二官能性ＰＫＣ－ＰＨＩＣＳ（ＰＨＩＣＳ２、ｎ＝１、ｍ＝３から得られたリード化合物）及び不活性類似体ｉＰＨＩＣＳ２の合成。
ＡＭＰＫによるＢＲＤ４リン酸化に最適なＰＨＩＣＳの同定。（５９Ａ）様々なリンカー長さのＡＭＰＫ－ＰＨＩＣＳ類似体の構造。（５９Ｂ）ＢＲＤ４－ＰＨＩＣＳ－ＡＭＰＫ三元複合体形成に関するＡｌｐｈａ ｓｃｒｅｅｎアッセイの概略図。（５９Ｃ）ＤＭＳＯで正規化した種々のリンカーを有するＡＭＰＫ－ＰＨＩＣＳに関するＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ。（５９Ｄ）種々の濃度のＡＭＰＫ－ＰＨＩＣＳ類似体によるＡＭＰＫ触媒性ＢＲＤ４リン酸化のウエスタンブロット分析。
ＰＫＣによるＢＲＤ４リン酸化に最適なＰＨＩＣＳの同定。（６０Ａ）様々なリンカー長さのＰＫＣ－ＰＨＩＣＳ類似体の構造。（６０Ｂ）ＤＭＳＯで正規化した種々のＰＫＣ－ＰＨＩＣＳ類似体による三元複合体形成に関するＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ。（６０Ｃ）種々のＰＫＣ－ＰＨＩＣＳ分子によって媒介されるＢＲＤ４リン酸化を比較するためのウエスタンブロット分析。
不活性類似体の検証。（６１Ａ）ＰＨＩＣＳ１、ＰＨＩＣＳ２及びこれらの不活性類似体ｉＰＨＩＣＳ１及びｉＰＨＩＣＳ２の構造。（６１Ｂ）ＰＨＩＣＳ１及びｉＰＨＩＣＳ１によるＡＭＰＫ活性化を比較するためのＳＡＭＳｔｉｄｅペプチドを基質としたＡＤＰ－Ｇｌｏ。（６１Ｃ）ＰＨＩＣＳ２及びｉＰＨＩＣＳ２によるＰＫＣ活性化を比較するためのＣＲＥＢｔｉｄｅペプチドを基質とするＡＤＰ－Ｇｌｏ。（６１Ｄ）プルダウンアッセイによって観察されたＰＨＩＣＳ１の誘導によるＡＭＰＫ及びＢＲＤ４の三元複合体形成。（６１Ｅ）ＰＨＩＣＳ１の存在下におけるＡＭＰＫによるＨｉｓタグ付加ＢＲＤ４（４９－４６０）リン酸化のウエスタンブロット分析。（６１Ｆ）ウエスタンブロットによって観察された、ＡＭＰＫ濃度がＰＨＩＣＳ１又はｉＰＨＩＣＳ１媒介性ＢＲＤ４リン酸化に及ぼす効果。（６１Ｇ）ＰＨＩＣＳ２又はｉＰＨＩＣＳ２の存在下でＰＫＣ濃度がＢＲＤ４リン酸化に及ぼす効果。
ウエスタンブロットで分析したＰＨＩＣＳ１濃度の関数としてのＢＲＤ４リン酸化のベル型依存性。
ＡＭＰを付加すると、リン酸化が亢進する。（６３Ａ）ＡＭＰＫによるＢＲＤ４リン酸化に関するインビトロキナーゼアッセイ（１ｕＭ化合物ＭＳ２３１、ＶＳ８０４、ＶＳ８０６）；（６３Ｂ）ＡＭＰあり及びなしでの、ＡＭＰＫによるＢＲＤ４リン酸化に関するＡＤＰ ｇｌｏ。
（６４Ａ）公知のＡｂｌキナーゼ活性化剤をベースとするＨａｌｏ標的化及びＢＲＤ４標的化ＰＨＩＣＳ分子の構造。Ｌ－リンカー。（６４Ｂ～６４Ｃ）Ｈａｌｏタグ（６４Ｂ）及びＢＲＤ４（６４Ｃ）のＰＨＩＣＳ誘導性リン酸化のウエスタンブロット分析。
ＢＲＤ４からの種々のペプチド配列又はＡＭＰＫ基質ＡＣＣに由来するペプチド（ＳＡＭＳペプチド）のＡＭＰＫ媒介性リン酸化に関するＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイ。
ＰＦ－０６４０９５７７による種々のＡＭＰＫアイソフォームの活性化に関するＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイ。
ＡＭＰＫと、ＰＨＩＣＳ１と、種々のＢＲＤタンパク質との間の三元複合体形成に関するＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ。
非共有結合性ＢＴＫ阻害剤ＰＨＩＣＳ３、種々のリンカーを有するその類似体及び不活性対照Ｐｉｖ－ＰＨＩＣＳ３の合成。
ＰＨＩＣＳの存在下におけるＡＭＰＫによるＢＴＫリン酸化のインビトロ生化学的検証。更なる研究に最適な分子を同定するための、種々のリンカーを有する１０μＭ ＢＴＫ標的化ＡＭＰＫ－ＰＨＩＣＳを使用したＢＴＫリン酸化に関するウエスタンブロット分析。８炭素アルキルリンカーを有する分子（ＰＨＩＣＳ３）は、リン酸化に最適な分子と同定された。
ＡＭＰＫによるＰＨＩＣＳ媒介性ＢＴＫリン酸化に関する細胞ベースの研究。（７０Ａ）種々のリンカーを有するＰＨＩＣＳを使用したＨＥＫ２９３細胞で過剰発現するＦｌａｇ－ＢＴＫのリン酸化に関するウエスタンブロット分析。化合物を４時間処理し、ホスホ－ＢＴＫ（Ｓｅｒ１８０）抗体によってリン酸化を検出した。８炭素アルキルリンカーを有する分子（ＰＨＩＣＳ３）は、リン酸化に最適な分子として同定された。（７０Ｂ）５μＭ ＰＨＩＣＳ３、５μＭ活性化剤又は漸増濃度の強力なＡＭＰＫ活性化剤ＰＦ－０６４０９５７７の存在下におけるＢＴＫ Ｓｅｒ１８０リン酸化を比較するためのウエスタンブロット分析。ウエスタンブロットによって観察した（７０Ｃ）時間依存的及び（７０Ｄ）ＰＨＩＣＳ３用量依存的ＢＴＫリン酸化。時間依存的研究には、５μＭのＰＨＩＣＳ３を使用した。
細胞におけるＢＴＫとのＰＨＩＣＳ３標的会合の検証。（７１Ａ）イブルチニブの構造及びイブルチニブとＢＴＫとの共有結合性の結合。細胞をイブルチニブで前処理すると、Ｃｙｓ４８１の共有結合性の不可逆的な修飾につながり、ＰＨＩＣＳ３によるＢＴＫへの結合が遮断される。（７１Ｂ）主要な相互作用と併せた、ＢＴＫに結合したイブルチニブの結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：５Ｐ９Ｉ）。Ｔｈｒ４７４は、イブルチニブの４アミノ基と水素結合を形成する。Ａｓｐ５３９（シアン色）は、イブルチニブ及びＬｙｓ４３０（緑色）と水素結合相互作用（マゼンタ色）を形成する。（７１Ｃ）ＷＴと比較したＢＴＫのＴ４７４Ａ、Ｋ４３０Ｒ及びＤ５３９Ｎ突然変異体におけるＳ１８０リン酸化の検出。
３７の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。
３７の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
ＤＭＳＯ－ｄ６中で記録したＰＨＩＣＳ３の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。
ＤＭＳＯ－ｄ６中で記録したＰＨＩＣＳ３の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ（１：１）溶媒混合物中で記録したＰｉｖ－ＰＨＩＣＳ３の１Ｈ ＮＭＲスペクトル。
ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ（１：１）溶媒混合物中で記録したＰｉｖ－ＰＨＩＣＳ３の１３Ｃ ＮＭＲスペクトル。
ＰＫＣの活性化にＮ－アシルＮ－アルキルスルホンアミド（ＮＡＳＡ）を使用する際の２つの概念が示される。上のパネルは、概念１を示す：ＮＡＳＡウォーヘッドを使用して局在化部分、例えば目的のタンパク質の結合剤で活性化剤（ＰＫＣ）を標識するもの。下のパネルは、概念２を示す：ＮＡＳＡウォーヘッドを使用してｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）でＰＫＣを標識する。次に、これをテトラジンクリックケミストリーで局在化部分、例えば任意の目的タンパク質の結合剤に取り付けることができる。
転写因子をリン酸化すると、その（７９Ａ）タンパク質－ＤＮＡ結合及び（７９Ｂ）タンパク質－タンパク質結合が破壊されることになる。
例示的活性化剤部分であるＡＢＬ活性化剤、ＩＲ活性化剤、ＭＥＫ阻害剤及びＡＫＴ阻害剤並びにＡＲ結合剤及びＢＲＤ４結合剤として特定される局在化部分と併せた、キナーゼ評価のための例示的ＰＨＩＣＳ分子のモジュラー合成。
ＰＨＩＣＳによって標的化される転写因子の結合剤。
（８２Ａ）ＰＨＩＣＳ標的の細胞局在。（８２Ｂ）タイムライン及びワークフロー。
（８３Ａ）ＤＰＨ及び（８３Ｂ）ＤＰＨ－Ｌ６－アジドの構造。（８３Ｃ）ＤＰＨ及びＤＰＨ－Ｌ６－アジドに関するＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイ。
反応性ハンドル（Ａ及びＢについてそれぞれ赤色及び緑色）で官能化された選択の（８４Ａ）タンパク質標的（局在化部分）又は（８４Ｂ）キナーゼ（活性化剤部分）の結合剤。（８４Ｃ～８４Ｄ）ＰＨＩＣＳ分子の構築に関する合成スキーム。注記：構造の下にある名前は、親結合剤を表し、対応するタンパク質を括弧内に提供する。
三体平衡における協同作用。
薬物の投与から疾患の進行までの薬物作用の動態学的過程の概略図。定義：血漿（Ｃｐ）；標的近傍（Ｃ）；標的との複合体（ＣＴ）における化合物濃度；遊離標的濃度（Ｔ）；ｋｉｎは、生成速度であり；ｋｏｕｔは、散逸速度であり；ｋｏｎは、オン速度定数であり；ｋｏｆｆは、オフ速度定数である。
本研究で当初考えられたＣＤＫ８阻害剤の化学構造及びそれらの実験的滞留時間。共通の１－（３－ｔｅｒｔ－ブチル－１－ｐ－トリル－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）尿素足場を青色で示す。
図８７にある化合物１～７との複合体中におけるヒトＣＤＫ８の結晶構造の活性部位。結晶化阻害剤の尿素基とＧｌｕ６６及びＡｓｐ１７３の相互作用を破線で示す。タンパク質炭素原子は、白色で表す。ヒンジ領域（灰色の略画）を除き、タンパク質骨格は、白色の略画として表す。
８つのｐ３８α阻害剤、ＳＢ５、ＳＢ６、ＳＢ７、Ｂ１２、Ｂ９６、ＢＲ５、ＢＲ８及びＢＭＵの二次元表現。共通の部分構造を強調表示している。
Ａｂｌ１、ダサチニブ、イマチニブ、ポナチニブ及びニロチニブの様々な阻害剤の阻害反応速度。
例示的実施形態に係るチロシンリン酸化Ａｂｌ－ＢＲＤ４（ｐＴｙｒ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）化合物の評価。
例示的実施形態に係るチロシンリン酸化Ａｂｌ－ＢＲＤ４（ＤＰＨ活性化剤）化合物の評価。
本明細書の図は、例示目的に過ぎず、必ずしも一定の尺度で描かれているとは限らない。
一般的定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学技術用語は、本開示が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語及び技法の定義については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔ，２００８（ＩＳＢＮ ０７６３７５２２２３）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ ９７８０４７１１８５７１０）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４），Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）；及びＭａｒｔｅｎ Ｈ．Ｈｏｆｋｅｒ ａｎｄ Ｊａｎ ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１１）を参照し得る。
本明細書で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」には、文脈上特に明確に指示されない限り、単数形及び複数形の両方の指示対象が含まれる。
用語「任意選択の」又は「任意選択で」は、後続の記載されるイベント、状況又は置換基が起こることも又は起こらないこともあり、その記載にイベント又は状況が起こる場合とそれが起こらない場合とが含まれることを意味する。
端点による数値範囲の記載には、それぞれの範囲内に含まれる全ての数及び分数並びに記載される端点が含まれる。
用語「約」又は「近似的に」は、本明細書において、パラメータ、量、時間的持続など、計測可能な値を参照する場合に使用されるとき、指定される値の及びそれからの±１０％以下、±５％以下、±１％以下及び±０．１％以下の変動など、開示される本発明での実施にかかる変動が適切である限りにおいて、指定される値の及びそれからの変動を包含することが意図される。修飾句「約」又は「近似的に」が参照する値は、それ自体も具体的に且つ好ましくは開示されることが理解されるべきである。
本明細書で使用されるとき、「生体試料」は、全細胞及び／又は生細胞及び／又は細胞デブリを含み得る。生体試料は、「体液」を含み得る（又はそれに由来し得る）。本発明は、体液が、羊水、房水、硝子体液、胆汁、血清、母乳、脳脊髄液、耳垢（耳あか）、乳糜、糜汁、内リンパ、外リンパ、滲出液、糞便、雌精液、胃酸、胃液、リンパ、粘液（鼻漏及び痰を含む）、心膜液、腹水、胸水、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂（皮膚の油分）、精液、喀痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、嘔吐物及びこれらの１つ以上の混合物から選択される実施形態を包含する。生体試料には、細胞培養液、体液、体液からの細胞培養液が含まれる。体液は、哺乳類生物から例えば穿刺又は他の収集若しくは試料採取手順によって入手され得る。
用語「対象」、「個体」及び「患者」は、本明細書では、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指して同義的に使用される。哺乳類としては、限定はされないが、マウス、サル、ヒト、農業動物、競技動物及びペットが挙げられる。インビボで得られたか又はインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞及びそれらの子孫も包含される。
「ジアステレオ異性体」は、少なくとも２つの不斉原子を有するが、互いに鏡像でない立体異性体である。絶対立体化学は、カーン－インゴルド－プレローグのＲ－Ｓ方式に従って指定される。化合物がエナンチオマーであるとき、各キラル炭素における立体化学はＲ又はＳのいずれかによって指定することができる。絶対配置が未知の分割された化合物は、ナトリウムＤ線の波長で平面偏光を回転させる方向（右旋性又は左旋性）に応じて（＋）又は（－）を指示することができる。本明細書に記載される化合物のうち、あるものは１つ以上の不斉中心を含み、従って、エナンチオマー、ジアステレオマー及び各不斉原子における絶対立体化学の点で（Ｒ）－又は（Ｓ）－として定義し得る他の立体異性体形態を生じ得る。本化学実体、医薬組成物及び方法には、ラセミ混合物、光学的に実質的に純粋な形態及び中間体混合物を含め、かかる可能な異性体の全てが含まれることが意図される。一部の化学構造では、立体中心が「波形」の結合で識別され得、これは、その立体中心が、特に指定されない限り、Ｒ又はＳ配置であり得ることを指示している。しかしながら、波形の結合のない立体中心（即ち「直線」の結合）も、特に指定されない限り、（Ｒ）又は（Ｓ）配置であり得る。化合物を含む組成物は、立体中心を含むことができ、その各々は、独立に、（Ｒ）配置、（Ｓ）配置又はラセミ混合物であり得る。
光学的に活性な（Ｒ）異性体及び（Ｓ）異性体は、例えば、キラルシントン若しくはキラル試薬を用いて調製することができるか、又は従来技術を用いて分割することができる。エナンチオマーは、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キラル塩の形成及び結晶化を含めた当業者に公知のいずれかの方法によってラセミ混合物から分離するか、又は不斉合成によって調製することができる。
光学異性体は、従来の処理法どおりの、例えば、ジアステレオ異性体塩の形成による、光学的に活性な酸又は塩基での処理による、ラセミ混合物の分割によって入手することができる。適切な酸の例は、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸及びカンファースルホン酸である。結晶化と、続くそれらの塩からの光学活性塩基の遊離によってジアステレオ異性体の混合物を分離すると、異性体の分離が得られる。別の方法は、開示される化合物を活性化形態の光学的に純粋な酸又は光学的に純粋なイソシアネートと反応させることによる共有結合性ジアステレオ異性体分子の合成が関わるものである。合成されたジアステレオ異性体は、クロマトグラフィー、蒸留、結晶化又は昇華などの従来手段によって分離することができ、次に加水分解すると、エナンチオ濃縮された化合物を送り出すことができる。
光学活性化合物は、活性な出発材料を用いることによっても入手され得る。一部の実施形態において、これらの異性体は、遊離酸、遊離塩基、エステル又は塩の形態であり得る。
特定の実施形態において、開示される化合物は、互変異性体であり得る。本明細書で使用されるとき、用語「互変異性体」は、水素原子の少なくとも１回のホルマール移動及び価数の少なくとも１回の変化（例えば、単結合から二重結合への、三重結合から単結合への又はその逆）によって生じる２つ以上の相互変換できる化合物を含む異性体の一種である。互変異性化には、プロトトロピー又はプロトン移動による互変異性化が含まれ、これは酸塩基ケミストリーの一部と考えられている。プロトトロピーによる互変異性化又はプロトン移動による互変異性化には、結合次数の変化を伴うプロトンの転位が関わる。互変異性体の正確な比率は、温度、溶媒及びｐＨを含めた幾つかの要因に依存する。互変異性化が可能な場合（例えば、溶液中）、互変異性体は化学的平衡に達し得る。互変異性化（即ち互変異性体対を提供する反応）は、酸若しくは塩基によって触媒され得るか、又は外部物質の作用若しくは存在なしに起こり得る。例示的互変異性化としては、限定はされないが、ケトとエノール；アミドとイミド；ラクタムとラクチム；エナミンとイミン；及びエナミンと（別の）エナミンの互変異性化が挙げられる。ケト－エノール互変異性化の具体的な例は、ペンタン－２，４－ジオン及び４－ヒドロキシペンタ－３－エン－２－オン互変異性体の相互変換である。互変異性化の別の例は、フェノール－ケト互変異性化である。フェノール－ケト互変異性化の具体的な例は、ピリジン－４－オール及びピリジン－４（１Ｈ）－オン互変異性体の相互変換である。
具体的な立体化学又は異性体形態が具体的に指示されない限り、構造の全てのキラル、ジアステレオマー、ラセミ及び幾何異性体形態が意図される。化合物の調製に用いられる全ての過程及びそこで生じる中間体は、本開示に包含される。図示又は記載される化合物の全ての互変異性体も本開示に包含される。
本明細書で使用されるとき、環から生じる結合置換、例えば、
Figure 2023509752000010
 は、この置換が環上の利用可能な位置のいずれかにあり得ることを意味する。
以下に様々な実施形態を記載する。これらの具体的な実施形態が網羅的な説明であるか、又は本明細書で考察されるより広範囲の態様に限定するものであるとする意図はないことに留意しなければならない。詳細な実施形態と併せて記載される一態様は、必ずしもその実施形態に限定されず、１つ又は複数の任意の他の実施形態で実施することができる。本明細書全体を通して「一実施形態」、「ある実施形態」、「ある例示的実施形態」と言及するとき、それは、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体を通して様々な箇所にある語句「一実施形態において」、「ある実施形態において」又は「ある例示的実施形態」の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているわけではなく、しかしそういうこともあり得る。更に、特定の特徴、構造又は特性は、本開示から当業者に明らかであろうとおり、任意の好適な方法で１つ以上の実施形態に組み合わされ得る。更に、本明細書に記載される一部の実施形態は、他の実施形態に含まれる特徴の一部を含み、他を含まないが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内にあることが意図される。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のいずれも任意の組み合わせで使用することができる。
本明細書に引用される全ての刊行物、公開特許文献及び特許出願は、各個別の刊行物、公開特許文献又は特許出願が参照により援用されると具体的且つ個別的に指示されているとするのと同程度まで本明細書によって参照により援用される。
概要
本明細書に開示される実施形態は、標的基質の修飾を誘導、達成又は推進する化合物を提供する。本化合物は、局在化部分と、化学的リンカー部分と、活性化剤部分と、化学的リンカー部分を一端で活性化剤部分に相互接続する第１の配向アダプターとを含む多官能性コンジュゲーション分子である。任意選択で、化学的リンカー部分を異なる端で局在化部分に相互接続する第２の配向アダプターが存在する。用語「多官能性コンジュゲーション化合物」、「多官能性分子」、「キメラ分子」及び「キメラコンジュゲーション分子」は、本明細書では同義的に使用される。
多官能性化学的コンジュゲーション分子は、標的基質の修飾に利用することができる。一実施形態において、修飾は、翻訳後修飾である。修飾とは、本明細書で使用されるとき、官能基の追加又は官能基の除去を含み得る。本明細書に開示される例示的実施形態は、リン酸化を誘導し、且つ／又はタンパク質のリン酸化能を有する小分子化合物を提供する。
本発明の化合物は、好ましくは、高分子基質、例えばポリペプチド、オリゴ糖及び多糖並びにＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を修飾する。高分子との会合は、高分子との共有結合性の結合、非共有結合性の結合、求電子性の会合又は他の会合を含み得る。結合は、可逆的又は非可逆的結合を含み得る。
多官能性キメラ分子は、修飾を誘導することができ、本明細書に詳述されるとおり、時間依存的及び用量依存的制御が可能となるように設計することができる。
多官能性化合物の活性化剤部分と直接会合するか又は間接的に会合するかのいずれかの活性化剤によって達成される修飾は、可逆的又は不可逆的であり得る。実施形態において、修飾には、リン酸化、ヒドロキシル化、アセチル化又はメチル化など、化学基の追加が含まれ得る。一態様において、修飾は、プレニル化、グリコシル化、ＡＤＰ－リボシル化及びＡＭＰ化など、複合体分子の追加である。別の態様において、修飾には、切断、例えばタンパク質分解が含まれ得る。アミド分解及びエリミニレーションなどのアミノ酸修飾が達成される。
一例示的実施形態において、多官能性キメラ分子又は多官能性化学的コンジュゲーション分子は、局在化部分と、化学的リンカー部分と、活性化剤部分と、化学的リンカー部分を一端で活性化剤部分に相互接続する第１の配向アダプターと、任意選択で、化学的リンカー分子を異なる端で局在化部分に相互接続する第２の配向アダプターとを含む。多官能性キメラ分子には、１つ以上の活性化剤部分が利用され得る。
特定の例示的実施形態において、本分子は、式Ｉ－Ａ
Ｌｏｃ－Ｌ－（Ｖ１－Ａｃｔ）ｎ （Ｉ－Ａ）
（式中、Ｌｏｃは、局在化部分を含み、Ｌは、化学的リンカー部分であり、Ｖ１は、第１の配向アダプターであり、及びＡｃｔは、活性化剤部分であり、ｎは、１～５である）
によって表され得る。
特定の他の例示的実施形態において、本分子は、式Ｉ－Ｂ
Ｌｏｃ－Ｖ２－Ｌ－（Ｖ１－Ａｃｔ）ｎ （Ｉ－Ｂ）
（式中、Ｌｏｃは、局在化部分を含み、Ｌは、化学的リンカー部分であり、Ｖ１は、第１の配向アダプターであり、Ｖ２は、第２の配向アダプターであり、及びＡｃｔは、活性化剤部分であり、ｎは、１～５である）
によって表される。
本明細書に開示される多官能性化合物の使用には、高分子基質の近接誘導性修飾における使用が含まれる。リン酸化を例示的修飾として用いると、化合物は、有利には、目的のタンパク質標的にリン酸化を誘導することができる。例えば、多官能性化合物の活性化剤部分の非基質であるタンパク質は、本明細書に開示される多官能性化合物の例示的実施形態によってリン酸化され得る。本明細書に開示される多官能性化合物は、活性化剤部分の天然基質と共に使用する必要のない標的基質の修飾、例えば標的タンパク質（例えば、ブロモドメインファミリータンパク質）のリン酸化を誘導する能力のある新規クラスの分子をもたらす。近接誘導性の反応性の原理を用いると、ＡＭＰＫ又はＰＫＣなどのキナーゼが非基質タンパク質（例えば、ＢＲＤ４）をリン酸化することができる。
本多官能性キメラ分子は、本明細書に更に詳説するとおり、局在化部分、活性化剤部分及び標的基質の所望の修飾を可能にするのに必要な近接性に応じて設計し、調整することができる。
局在化部分
式Ｉ－Ａ及び式Ｉ－ＢにおいてＬｏｃとして表される局在化部分は、高分子の標的化、それへの結合又はそれとの会合を提供する。実施形態において、高分子は、ポリペプチド、ＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの核酸又は糖分子である。実施形態において、ポリペプチドは、タンパク質、例えば酵素である。
一実施形態において、局在化部分は、修飾しようとする標的基質に結合する。局在化部分の機能は、活性化剤部分に結合する活性化剤によって修飾しようとする基質を結合して、標的基質を活性化剤部分と近接した状態に至らせることである。この反応により、活性化剤がより多くの基質、活性化剤の非天然標的基質を修飾し、かかる基質修飾の反応速度／効率を増加させることが可能となり得る。そのためには、局在化部分は、特異的基質に結合することが可能でなければならず、基質の修飾を可能にするため、本明細書に更に記載するとおり、そのために好適な、且つ活性化剤部分に連結される能力のある多数の分子を含み得る。本明細書には、修飾の標的となる基質に基づき、種々の例示的なクラスの局在化部分が提供される。
実施形態において、局在化部分は、達成しようとする所望の会合及び修飾に基づいて選択される。従って、所望される修飾は、詳細な条件、疾患、治療又は他の所望の効果に基づいて調整され得るものであり、局在化部分を選択する際の設計上の考慮事項であり得る。例として、正電荷であるＤＮＡ結合ドメインは、負電荷のＤＮＡ骨格と相互作用する。リン酸化は、中性残基を負電荷残基に変換し、ここで、電荷中和は、ＤＮＡ結合親和性がより低い。例えば、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，“Ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＤＮＡ－ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”；Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，“Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”を参照されたい。
ポリペプチド基質に結合するための局在化部分
特定の例示的実施形態において、局在化部分は、ポリペプチド基質の結合に用いられる標的ポリペプチド結合部分である。標的ポリペプチド結合部分は、細胞の種々の局在化部位、例えば核、細胞質、ミトコンドリア、細胞表面に位置し得る目的の特異的タンパク質に関して選択され得る。例示的な標的ポリペプチド結合部分は、例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，４：６４（２０１９）に開示されており、これは、例示的タンパク質及び対応するリガンド（即ち標的ポリペプチド結合部分を提供するものであり、特に図５～図４８を参照されたい（これは、参照により本明細書に援用される）。標的ポリペプチド結合部分は、結合時にコンホメーション変化を起こすタンパク質、例えばアンドロゲン受容体（ＡＲ）に結合し得る。
標的ポリペプチド結合部分は、例えば、ブロモドメイン及びエクストラターミナルドメイン（ＢＲＤ）ファミリータンパク質（例えば、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４）に結合し得る。ブロモドメインは、基質タンパク質、特にヒストン中に存在するアセチル化されたリジンを特異的に認識する（約１１０アミノ酸の）構造的及び進化的に保存されているタンパク質相互作用モジュールのファミリーである。ブロモドメインは、クロマチンリモデリング、細胞シグナル伝達及び転写制御に関連する大型の多ドメイン核タンパク質の成分として存在する。公知の機能を持つブロモドメイン含有タンパク質の例としては、（ｉ）ＣＲＥＢＢＰ、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ及びＴＡＦＩＩ２５０を含めた、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）；（ｉｉ）ＡＳＨ１Ｌ及びＭＬＬなどのメチルトランスフェラーゼ；（ｉｉｉ）Ｓｗｉ２／Ｓｎｆ２などのクロマチンリモデリング複合体の成分；及び（ｉｖ）幾つもの転写調節因子が挙げられる（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．２００１，６，Ｄ１００８－１０１８、本明細書によって全体として参照により援用される）。
他の例示的実施形態において、標的ポリペプチド結合部分は、小分子標的ポリペプチド結合部分である。一例示的実施形態において、標的ポリペプチド結合部分は、ＪＱ１由来部分である。例えば、標的ポリペプチド結合部分は、以下であり得る。
Figure 2023509752000011
一部の実施形態において、ＪＱ１由来部分は、（＋）－ＪＱ１由来又は（－）－ＪＱ１由来部分である。
Figure 2023509752000012
更なる標的ポリペプチド結合分子。例えば、標的ポリペプチド結合分子は、ｐ５３結合剤（例えば、２，５－ビス（５－ヒドロキシメチル－２－チエニル）フラン又はＲＩＴＡ）、Ｍａｘ結合剤ＫＩ－ＭＳ２－００８（図８１Ａ）、ＥＲ阻害剤ラロキシフェン又はβ－カテニン阻害剤（ＵＵ－Ｔ０２）から選択され得る。
局在化部分には、図８４Ａに記載されるとおり、イブルチニブ（ＢＴＫ）、ダサチニブ（ＢＣＲ－ＡＢＬ）、ＭＲＴＸ（ＫＲＡＳ）、ＭＩ－１０６１（ＭＤＭ２）、ゲフィチニブ（ＥＧＦＲ）、パルボシクリブ（ＣＤＫ４／６）及びフォレチニブ（Ｃ－ＭＥＴ）などの分子も含まれ得る。
一実施形態において、局在化部分は、抗体又はその結合部分である。局在化部分は、天然に存在する重鎖のみの抗体の構造的及び機能的特性を含むシングルドメイン抗体断片を含むナノボディであり得、例えばＢａｎｎａｓ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１７．０１６０３を参照されたい。抗体の「結合部分」（又は「抗体部分」）という用語には、１つ以上の完全なドメイン、例えば一対の完全なドメイン及び標的分子に特異的に結合する能力を保持している抗体の断片が含まれる。抗体の結合機能は、完全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。結合断片は、組換えＤＮＡ技法によるか、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断によって作製される。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｄ、ｄＡｂ、Ｆｖ、単鎖、ＶＨＨ、単鎖抗体、例えばｓｃＦｖ及びシングルドメイン抗体が含まれる。
特定の実施形態において、「ヒト化」形態の非ヒト抗体は、ヒト抗体フレーム領域に似たアミノ酸残基をフレーム領域に含有する。特定の実施形態では、ラクダ科動物抗体又は重鎖抗体のフレーム領域が修飾される。特定の実施形態において、「ヒト化」形態の非ヒト抗体は、非ヒト免疫グロブリン（例えば、ラクダ科動物）に由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域の残基に置き換えられているものである。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含み得る。こうした修飾は、抗体の性能を更に洗練させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、ここで、超可変領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含むことになる。
本定義に含まれる抗体又はエピトープ結合タンパク質の部分の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（ｉｖ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインとＣＨＩドメインのＣ末端にある１つ以上のシステイン残基とを有するＦｄ’断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖ断片；（ｖｉ）抗原に結合するＶＨドメイン又はＶＬドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，３４１ Ｎａｔｕｒｅ ５４４（１９８９））；（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域又は機能性フレームワークに提供される単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，２４２ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４２３（１９８８）；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，８５ ＰＮＡＳ ５８７９（１９８８））；（ｘ）同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）につながった重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」（例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，９０ ＰＮＡＳ ６４４４（１９９３）を参照されたい）；（ｘｉ）相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒になって抗原結合領域の対を形成する、タンデムＦｄセグメント対（ＶＨ－Ｃｈ１－ＶＨ－Ｃｈ１）を含む「線状抗体」（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－６２（１９９５）；及び米国特許第５，６４１，８７０号明細書）が挙げられる。
抗体の「特異的結合」とは、抗体が特定の抗原又はエピトープに対して認め得る程度の親和性を呈し、概して、有意な交差反応性を呈しないことを意味する。「認め得る程度の」結合とは、少なくとも２５μＭの親和性での結合が挙げられる。１×１０７Ｍ－１より大きい親和性（又は１μＭ以下の解離係数又は１ｎｍ以下の解離係数）の抗体は、典型的には、対応してより高い特異性で結合する。本明細書に示されるものの中間の値も本発明の範囲内にあることが意図され、本発明の抗体は、例えば、１００ｎＭ以下、７５ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、例えば１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下又は実施形態では５００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下又は２５ｐＭ以下の親和性の範囲で結合する。「有意な交差反応性を呈しない」抗体とは、その標的以外の実体（例えば、異なるエピトープ又は異なる分子）に対して認め得るほどの結合を示さないであろうものである。例えば、ある標的分子に特異的に結合する抗体は、その標的分子とは認め得る程度に結合することになるが、非標的分子又はペプチドと有意に反応することはないであろう。特定のエピトープに特異的な抗体は、例えば、同じタンパク質又はペプチド上の遠隔のエピトープと有意に交差反応することはないであろう。特異的結合は、かかる結合の決定に当技術分野で認められている任意の手段により決定することができる。好ましくは、特異的結合は、スキャッチャード分析及び／又は競合的結合アッセイにより決定される。
本明細書で使用されるとき、用語「親和性」は、単一の抗原結合部位が抗原決定基と結合する強度を指す。親和性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の立体化学的嵌め合いの緊密さ、それらの間の接触面積の大きさ、荷電基及び疎水基の分布等に依存する。抗体親和性は、平衡透析法によるか、又は反応速度論的ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）法によって測定することができる。解離定数Ｋｄ及び結合定数Ｋａが親和性の定量的尺度である。
ポリヌクレオチド基質との結合のための局在化部分
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、炎症を悪化させる因子として同定されている。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ロスマンフォールド（例えば、Ｋｌｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２３：６９－７６を参照されたい）及びＰループ含有ヌクレオチドヒドロラーゼフォールド（例えば、Ｓａｒａｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏ Ｓｃｉ，１５：４３０－４３４を参照されたい）など、タンパク質中のヌクレオチド結合フォールドから同定することができる。Ｃｈａｕｈａｎ ｅｔ ａｌ．は、ＡＴＰ及びＧＴＰ結合残基を同定するための方法を開発しており、Ａｎｓａｒｉ ｅｔ ａｌ．は、特異的にＮＡＤに向けた方法を設計している。Ｐａｒｃａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）は、タンパク質構造中のヌクレオチド結合部位を同定しており、タンパク質が結合するヌクレオチド、タンパク質名及び生物名をＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５０２４０（参照により本明細書に援用される）の表Ｓ１に載せている。従って、ヌクレオチド結合局在化部分は、当技術分野において公知であり、当業者が本組成物中の局在化部分として使用するために同定することができる。
オリゴ糖基質との結合のための局在化部分
オリゴ糖結合部分は炭水化物結合タンパク質を含み、抗ウイルス薬及び抗癌薬を考えるときに重要な標的である。局在化部分は、例えば、炭水化物の相互作用部位を促進するレクチンであり得る。例示的分子としては、小分子ボロノレクチン、核酸ベースのボロノレクチン及びペプチドボロノレクチンが挙げられる。例えば、（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ Ｒｅｖ．２０１０ Ｍａｒｃｈ；３０（２）：１７１－２５７；ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｅｄ．２０１５５）（参照により本明細書に援用される）、具体的には、結合分子及び形成される複合体についての図１～図５０を参照されたい。開発済みのバイオインフォマティクスを用いて炭水化物との結合能を有する小分子を選択する公的に利用可能な計算方法が利用可能であり、例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９４：１ １０．１００２／ｃｐｐｓ．７５；Ｓｈｉｏｎｙｕ－Ｍｉｔｓｕｙａｍａ Ｃ，Ｓｈｉｒａｉ Ｔ，Ｉｓｈｉｄａ Ｈ，Ｙａｍａｎｅ Ｔ（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １６：４６７－４７８；及びＫｕｌｈａｒｉａ Ｍ，Ｂｒｉｄｇｅｔｔ ＳＪ，Ｇｏｏｄｙ ＲＳ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＲＭ（２００９）“ＩｎＣａ－ＳｉｔｅＦｉｎｄｅｒ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｏｓｉｔｏｌ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）”．Ｊ Ｍｏｌ Ｇｒａｐｈ Ｍｏｄｅｌ ２８：２９７－３０３を参照されたい。
タンパク質－炭水化物複合体中の結合部位残基を安定化残基と併せて分析することにより、複合体の折り畳み及び結合の同定が可能となり、水素結合の非共有結合性相互作用及び非極性相互作用の他にも相互作用を理解することができる。例えば、Ｓｈａｎｍｕｇａｍ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ．：１０．２１７４／０９２９８６６５２５６６６１８０２２１１２２５２９を参照されたい。公的に利用可能なツールを利用すると、結合部位及び予想される折り畳みを含め、炭水化物結合部分を、かかる炭水化物結合局在化部分を含む多官能性分子の設計に使用することができる。
脂質基質との結合のための局在化部分
脂質結合部分は、本明細書に開示される多官能性分子中の局在化部分として利用することができる。細胞安定性及びシグナル伝達の調節因子として、経路、過程及び条件の処理、調節及び／又は修飾では、その組成、分布又は輸送の修飾が有用となり得る。脂質には、荷電脂質、例えばホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びＰＩリン酸、ＰＩ二リン酸及びＰＩ三リン酸（ＰＩＰ－７つのアニオン性荷電脂質のファミリー）並びにガングリオシド（ＧＭ）が含まれる。双性イオン脂質、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）脂質、セラミド（ＣＥＲ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）及びリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）脂質、スフィンゴ脂質、グリセロリン脂質、コレステロール、ホスファチジルグリセロール。
タンパク質などの脂質結合部分は、脂質に特異的に結合するか（この場合、所与の脂質の明確な結合部位が同定され得る）、又は非特異的に結合するか（この場合、脂質は媒体としての役割を果たす）のいずれでもあり得、厚さ、流動性又は曲率などの物理的特性がタンパク質機能を調節する。ＦＹＶＥ又はＰＸ又はＰＲＯＰＰＩＮのβ－プロペラ中のＦＲＲＧモチーフなどのホスホイノシチド結合ドメインは、より多く見られるドメインであり、脂質結合タンパク質の同定に使用することができる。モチーフを含む最初の４つのタンパク質（Ｆａｂ１、ＹＯＴＢ、Ｖａｃ１ ＥＥＡ１）にちなんで名付けられたＦＹＶＥドメインは、幾つかの保存領域を含み、これらも、関連するドメインの同定に利用することができる。例えば、Ａ．Ｈ．Ｌｙｓｔａｄ，Ａ．Ｓｉｍｏｎｓｅｎ“Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｕｔｏｐｈａｇｙ”，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５９０（２０１６），ｐｐ．２４５４－２４６８，１０．１００２／１８７３－３４６８．１２２８６を参照されたい。更なるＦＹＶＥドメイン含有タンパク質には、ＳＡＲＡ、ＦＲＡＢＩＮ、ＤＦＣＰ１ ＦＧＤ１、ＡＮＫＦＹ１、ＥＥＡ１ ＦＧＤ１、ＦＧＤ２、ＦＧＤ３、ＦＧＤ４、ＦＧＤ５、ＦＧＤ６、ＦＹＣＯ１、ＨＧＳ ＭＴＭＲ３、ＭＴＭＲ４、ＰＩＫＦＹＶＥ、ＰＬＥＫＨＦ１、ＰＬＥＫＨＦ２、ＲＵＦＹ１、ＲＵＦＹ２、ＷＤＦ３、ＷＤＦＹ１、ＷＤＦＹ２、ＷＤＦＹ３、ＺＦＹＶＥ１、ＺＦＹＶＥ１６、ＺＦＹＶＥ１９、ＺＦＹＶＥ２０、ＺＦＹＶＥ２１、ＺＦＹＶＥ２６、ＺＦＹＶＥ２７、ＺＦＹＶＥ２８、ＺＦＹＶＥ９が含まれる。
真核細胞は、マクロオートファジーと呼ばれるリソソーム分解経路を通して細胞内成分を分解することができ、経路の機能不全は幾つかの疾患と関連付けられている。Ｄｉｋｉｃ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｕｔｏｐｈａｇｙ”．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１９（２０１８），ｐｐ．３４９－３６４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８０－０１８－０００３－４。従って、オートファジー関連（ＡＴＧ）タンパク質は、ＬＣ３Ａ、ＬＣ３Ｂ、ＬＣ３Ｃ、ＧＡＢＡＲＡＰ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１及びＧＡＢＡＲＡＰＬ２を含め、本発明における脂質結合部分として利用され得る。Ｄｅ ｌａ Ｂａｌｌｉｎａ（２０１９），ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１９．０５．０５１。脂質結合タンパク質には、タンパク質ＨＣＬＳ１結合タンパク質３（ＨＳ１ＢＰ３）が含まれ、これは、ホスホリパーゼＤ１（ＰＬＤ１）の活性を負に調節することが可能である。
リンカー部分
リンカー又は連結部分は、１つ以上の活性化剤部分を局在化部分に連結するために使用することのできる二官能性又は多官能性部分である。一部の実施形態において、リンカーは、共有結合的に取り付けるためそうした部分と反応する能力のある官能基を有する。リンカー部分は、好ましくは、化学的リンカー部分であり、式Ｉ－Ａ及び式Ｉ－ＢにおいてＬとして表される。リンカーは、切断可能又は切断不能であり得る。実施形態において、リンカーは、切断可能であり、インビボでの有効性、安全性及び分解速度に関して選択することができる。リンカーは、インビボで非可動性、可動性又は切断可能であり得、多官能性分子の部分の特性及び本明細書に詳述される更なる設計上の考慮事項に基づいて合理的に設計することができる。医薬製剤中のリンカーの合理的設計の考察については、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１３ Ｏｃｔ １５；６５（１０）：１３５７－１３６９を参照されたい。リンカーの長さは、様々であり得、三元複合体形成の程度及び様々なリンカー長さに関して研究して、活性化剤部分による修飾レベルを決定することができる。リンカーは、本質的に二官能性又は多官能性であり得、リンカーの１つ以上の官能基に複数の活性化剤部分を付加することができる。詳細な例では、多官能性リンカーにより、リンカー上の複数の部位にベクター及び活性化剤分子を取り付けることが可能となる。活性化剤分子の各々のために長さ及び官能性が調整された分枝状リンカーは、本発明の範囲内にある。
利用することのできるリンカーには、ＰＥＧ分子、アルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキル、アリール、アルキレン、アルケニル、ヘテロアリール、アミド、アミン、チオール又はこれらの誘導体が含まれる。リンカーは、多官能性リンカー、実施形態では多官能性ＰＥＧリンカーであり得る。
特定の実施形態において、リンカーは、アジド／アルキン［３＋２］付加環化の生成物であるか、又はアミド類、カルバメート類、エステル類、尿素類、チオ尿素類及びＰＥＧ分子から選択される。好ましい実施形態において、リンカーは、ＰＥＧ分子、アルキル又はクリックケミストリーリンカー、例えばｔｒａｎｓ－シクロオクテン、シクロオクチン若しくは末端アルキンなど、［例えば、試薬Ｎ－（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルオキシカルボニル－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン（「ＢＣＮアミン」）である。
ある態様において、連結部分は、以下の式に係るものである。
Figure 2023509752000013
式中、ｎは、１～１５であり、好ましくはｎ＝３、５、７、９又は１１である。
実施形態において、連結部分は、式
Figure 2023509752000014
 （式中、ｎは、０～１０、０～５又は０～２であり、及びｍは、０～１０、０～５又は０～３である）
に係るものである。
実施形態において、リンカー部分は、式：
Figure 2023509752000015
 （式中、ｎは、１～５０である）
に係るものである。
リンカーは、
Figure 2023509752000016
 （式中、Ｘは、Ｏ又はＣＨ２であり、及びｎは、０～１０である）
に係るものであり得る。詳細な実施形態において、ＸがＯであるとき、ｎ＝１又は２であり、及びＸ＝ＣＨ２であるとき、ｎ＝１である。
実施形態において、リンカー部分は、
Figure 2023509752000017
 （式中、ｎ＝０～５である）；又は
Figure 2023509752000018
 （式中、ｎ＝０～５及びｍ＝０～５である）
であり得る。
活性化剤部分
活性化剤部分は、所望の修飾の種類に基づいて選択することができる。本明細書で使用されるとき、活性化剤部分は、基質に対し、その基質を阻害する又は活性化させる修飾を行い得る。一実施形態において、活性化剤部分は、酵素を見つけ出し、且つそれを調節する、例えば活性化させるか又は阻害する能力を有する。特定の実施形態において、活性化剤部分は、アロステリック阻害剤などの阻害剤分子である。実施形態において、酵素は、キナーゼ、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ、リガーゼ、ヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）又はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒドロキシラーゼ、グルタミンシンテターゼアデニルトランスフェラーゼ（ＧＳＡＴアーゼ）、タンパク質残基のヒドロキシル化を触媒する酵素、オキシゲナーゼ又はスルホトランスフェラーゼである。
活性化剤部分は、修飾の種類、例えば翻訳後修飾に基づいて選択され得る。詳細な例では、活性化剤部分は、酵素を見つけ出し、且つそれを活性化させる能力を有し、従って、活性化される酵素の種類は、標的基質の所望の修飾に関して選択され得る。実施される修飾の一種である翻訳後修飾（ＰＴＭ）である。これには、ペプチド結合の切断、ジスルフィド結合の形成、アシル化、プレニル化、リポイル化、アセチル化、脱アセチル化、ホルミル化、アルキル化、カルボニル化、リン酸化、グリコシル化又は脂質化、ヒドロキシル化、Ｓ－ニトロシル化、Ｓ－スルフェニル化、スルフィニル化、スルホニル化、スクシニル化、硫酸化、マロニル化が含まれ得る（Ｔａｈｅｒｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．２０１８）。従って、翻訳後修飾酵素は、本発明での使用が想定される一組の活性化剤である。
活性化剤は、所望の基質修飾に基づいて選択され得る。実施形態において、活性化剤は、アミノ酸に修飾を提供し、例えばＫａｒｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｖｏｌｕｍｅ ２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ２０７６９１，１３ ｐａｇｅｓ，ＤＯＩ：１０．４０６１／２０１１／２０７６９１（参照により本明細書に援用される）の例えば表１を参照されたい。
ある実施形態において、活性化剤はキナーゼ活性化剤部分である。キナーゼ活性化剤部分は、キナーゼを活性化させる小分子又は化合物であり得る。本明細書で使用されるとき、キナーゼは、別の分子、典型的にはタンパク質基質のアミノ酸にリン酸基を付加する酵素である。キナーゼの活性化剤はリン酸化を亢進させる。詳細な実施形態において、キナーゼ活性化剤部分は、酵素の活性コンホメーションを、一態様では調節性サブユニットとの結合相互作用を通して推進する。例えば、Ｚｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０１０），ｄｏｉ：１０．１０３８／ＮＣＨＥＭＢＩＯ．３１８を参照されたい。実施形態において、キナーゼはアミノ酸のセリン、スレオニン、チロシン又はこれらの組み合わせに作用する。
実施形態において、活性化剤は、プロテインキナーゼＣアイソザイムの活性化剤である。実施形態において、活性化剤は、ＡＭＰＫの活性化剤である。実施形態において、活性化剤は、Ｓｒｃキナーゼの活性化剤であるか、又はＳｒｃキナーゼファミリーと配列相同性を共有する。実施形態において、キナーゼは、ｃ－Ａｂｌ、非受容体型チロシンキナーゼである。実施形態において、キナーゼは、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）である。活性化剤は、インスリン受容体型チロシンキナーゼの活性化因子であり得る。ある態様において、活性化剤部分は、ＲＡＣ－αセリン／スレオニン－プロテインキナーゼ（ＡＫＴ）又はマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）の阻害剤である。
活性化剤部分は、当技術分野において公知の活性化剤から同定することができる。活性化剤は、当技術分野において公知の活性化剤の誘導体であり得、且つ少ない又は追加の官能基を含み得、それでもなお活性化剤としてのその使用が可能でありながら、本明細書に記載される多官能性分子に関する所望の形成、コンホメーション又は結合部位を亢進させるか又は促進し得る。例示的修飾には、本明細書の他の部分に詳述される配向アダプター又はリンカーと共に使用するための、溶解度、電荷、官能性を増加させる誘導体が含まれ得る。
ＦＫＢＰ活性化剤部分
詳細な実施形態において、活性化剤は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）の活性化剤として設計することができる。ある態様において、ＦＫＢＰはＦＫＢＰ１２であり、これは細胞内カルシウム放出チャネル及びＴＧＦ－β Ｉ型受容体に結合する。ある態様において、ＦＫＢＰ活性化剤部分は、
Figure 2023509752000019
 である。
ＰＫＣ活性化剤部分
詳細な実施形態において、活性化剤は、プロテインキナーゼＣなど、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）反応性Ｃ１ドメイン含有タンパク質の活性化剤として設計することができる。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は複数のアイソザイムを含み、シグナル伝達経路において役割を果たすことにより、組織特異的発現を呈し、種々の生物学的役割を果たす。ＰＫＣの活性化剤は、本明細書に開示される小型キメラ分子に利用することができ、この活性化部分は、ＰＫＣアイソフォームに関して選択的である。
ＤＡＧ反応性タンパク質の活性化剤は、Ｌ．Ｃ．Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２２（２０１４）３１２３－３１４０に記載されるとおりのＤＡＧ－インドラクトンを含み得る。例示的ＤＡＧ－インドラクトンは、式
Figure 2023509752000020
 （式中、Ｒは、インドールである）
に係るものであり得る。Ｒは、例えば、１－メチル、１Ｈ－インドール５－イル、１－メチル、１Ｈ－インドール６－イル、１－メチル、１Ｈ－インドール４－イル又は１－メチル、１Ｈ－インドール７－イルであり得る。実施形態において、この化合物は、ＰＫＣα又はＰＫＣεに関して選択的である。
Ｃｏｏｋｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１８）２９３（２２）８３３０－８３４１に記載されるとおりのＡＪＨ－８３６など、ＤＡＧラクトンである。実施形態において、ＤＡＧラクトンは、式
Figure 2023509752000021
 に係るものであり得る。Ｃｏｏｋｅに提供されるとおり、ＡＪＨ－８３６の式は、
Figure 2023509752000022
 であり、ＰＫＣδ及びＰＫＣに関して選択的である。
（－）－インドラクタム－Ｖ（ＩＬＶ）及びベンゾラクタム－Ｖ８、例えば７－置換ベンゾラクタム－Ｖ８などのテレオシジン類は、ＰＫＣ活性化剤として利用することができる。ＰＫＣ活性化剤は、Ｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．４：１４（２００２）ＤＯＩ：１０．１０２１／ｏｌ０２６１２５ｌに記載されるとおりであり得る。
実施形態において、ＰＫＣ活性化剤は、式
Figure 2023509752000023
 （式中、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、アルキル、アルケニル、アルキニルであり、Ｒ２は、飽和又は不飽和アルキレン（例えば、分枝アルキレン、直鎖アルキレン、シクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ２２分枝アルキレン、Ｃ１～Ｃ２２直鎖アルキレン、Ｃ３～Ｃ２２シクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ１０分枝アルキレン、Ｃ１～Ｃ１０直鎖アルキレン、Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ８分枝アルキレン、Ｃ１～Ｃ８直鎖アルキレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン）、Ｃ１～Ｃ２２飽和又は不飽和ヘテロアルキレン（例えば、分枝ヘテロアルキレン、直鎖ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ２２分枝ヘテロアルキレン、Ｃ１～Ｃ２２直鎖ヘテロアルキレン、Ｃ３～Ｃ２２ヘテロシクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ１０分枝ヘテロアルキレン、Ｃ１～Ｃ１０直鎖ヘテロアルキレン、Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ８分枝ヘテロアルキレン、Ｃ１～Ｃ８直鎖ヘテロアルキレン、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキレン）、アリーレン（例えば、Ｃ５～Ｃ２２アリーレン）、ヘテロアリーレン（例えば、Ｃ５～Ｃ２２ヘテロアリーレン）又はこれらの組み合わせから選択される二価炭化水素から選択することができる）
に係るものであり；ここで、前述の各々は、Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，２００３，４６：３，３６４－３７３の表１、３６６頁の表１（参照により本明細書に具体的に援用される）に記載されるとおりのものから選択されるものを含め、１個以上（例えば、２、３、４、５個）の置換点、置換アミド類を有し得る。Ｒ２は、－（Ｃ（Ｒａ）（Ｒａ））１～８－、－（ＯＣ（Ｒａ）（Ｒａ））１～８－、－（ＯＣ（Ｒａ）（Ｒａ）－Ｃ（Ｒａ）（Ｒａ））１～８－、－Ｎ（Ｒａ）－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、任意選択で置換されているＣ６アリーレン、任意選択で置換されているＣ５～１２ヘテロアリーレン、ヒドロキシで置換されているＣ３～６シクロアルキレン又はヒドロキシで置換されているＣ４ヘテロシクロアルキレンの１つ以上から選択され得；ここで、前述の各々は、１個以上（例えば、２、３、４、５個）の置換点を有し得；及びＲａは、出現毎に、水素又はアルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ７アルキル、Ｃ１～Ｃ３アルキル）から独立に選択される。
詳細な実施形態において、この式は、
Figure 2023509752000024
 （式中、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、アルキル、アルケニル、アルキニルであり、Ｒ２は、飽和又は不飽和アルキレン（例えば、分枝アルキレン、直鎖アルキレン、シクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ２２分枝アルキレン、Ｃ１～Ｃ２２直鎖アルキレン、Ｃ３～Ｃ２２シクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ１０分枝アルキレン、Ｃ１～Ｃ１０直鎖アルキレン、Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ８分枝アルキレン、Ｃ１～Ｃ８直鎖アルキレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン）、Ｃ１～Ｃ２２飽和又は不飽和ヘテロアルキレン（例えば、分枝ヘテロアルキレン、直鎖ヘテロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ２２分枝ヘテロアルキレン、Ｃ１～Ｃ２２直鎖ヘテロアルキレン、Ｃ３～Ｃ２２ヘテロシクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ１０分枝ヘテロアルキレン、Ｃ１～Ｃ１０直鎖ヘテロアルキレン、Ｃ３～Ｃ１０ヘテロシクロアルキレン、Ｃ１～Ｃ８分枝ヘテロアルキレン、Ｃ１～Ｃ８直鎖ヘテロアルキレン、Ｃ３～Ｃ８ヘテロシクロアルキレン）、アリーレン（例えば、Ｃ５～Ｃ２２アリーレン）、ヘテロアリーレン（例えば、Ｃ５～Ｃ２２ヘテロアリーレン）又はこれらの組み合わせから選択される二価炭化水素から選択することができる）
に係るものであり；ここで、前述の各々は、Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，２００３，４６：３，３６４－３７３の表１、３６６頁の表１（参照により本明細書に具体的に援用される）に記載されるとおりのものから選択されるものを含め、１個以上（例えば、２、３、４、５個）の置換点、置換アミド類を有し得る。
Ｒ２は、－（Ｃ（Ｒａ）（Ｒａ））１～８－、－（ＯＣ（Ｒａ）（Ｒａ））１～８－、－（ＯＣ（Ｒａ）（Ｒａ）－Ｃ（Ｒａ）（Ｒａ））１～８－、－Ｎ（Ｒａ）－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－、任意選択で置換されているＣ６アリーレン、任意選択で置換されているＣ５～１２ヘテロアリーレン、ヒドロキシで置換されているＣ３～６シクロアルキレン又はヒドロキシで置換されているＣ４ヘテロシクロアルキレンの１つ以上から選択され得；ここで、前述の各々は、１個以上（例えば、２、３、４、５個）の置換点を有し得；及びＲａは、出現毎に、水素又はアルキル（例えば、Ｃ１～Ｃ７アルキル、Ｃ１～Ｃ３アルキル）から独立に選択される。
詳細な実施形態において、この式は、
Figure 2023509752000025
 （式中、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４は、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニルであり、及びＲ２は、から選択され得る）
に係るものである。実施形態において、ＰＫＣ活性化剤は、Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，４０：９ １３１６－１３２６に記載されるとおり、ＩＬＶのベンゾラクタム類似体であり、ここで、Ｒは、ＣＣ（ＣＨ２）７ＣＨ３又は（ＣＨ２）９ＣＨ３であり得る。
実施形態において、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４はアルキルであり、一部の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４はメチルである。特定の実施形態において、この式は、
Figure 2023509752000026
 に係るものである。
実施形態において、ＰＫＣ活性化剤は、Ｋａｚａｎｉｅｔｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ．４４：２９６－３０７（１９９３）に記載されるとおり、天然産物活性化剤、例えば、ＤＰＰ、プロストラチン、メゼレイン、オクタヒドロメゼレイン、チメレアトキシン、（－）－オクチルインドラクタムＶ、ＯＡＧ又はレシニフェラトキシンである。
実施形態において、ＰＫＣ活性化剤は、ＰＫＣδに関して選択的である。詳細な実施形態において、ＰＫＣ活性化剤は、Ｂｅｓｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１８）９：２３に記載されるとおりの７α－アセトキシ－６β－ベンゾイルオキシ－１２－Ｏベンゾイルロイレアノン（Ｒｏｙ－Ｂｚ）である。
ＰＫＣ活性化剤は、Ｙａｎａｇｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００８，５１：１，４６－５６（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、ｎ－ヘキシルＩＬＶ若しくは１０員環１－ヘキシルインドラクタムＶ１０又はこれらの誘導体など、ＩＬＶ誘導体であり得る。ＰＫＣ活性化剤は、
Figure 2023509752000027
 （式中、Ｒ１及びＲ２＝Ｈ、Ｒ１＝Ｈ及びＲ２＝Ｃｌ又はＲ１＝Ｂｒ及びＲ２＝Ｈである）
であり得、一部の例ではＰＫＣδ、ＰＫＣε又はＰＫＣηであり得る。
実施形態において、活性化剤部分は、６－クロロ－５－［４－（１－ヒドロキシシクロブチル）フェニル］－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸（ＰＦ－０６４０９５７７）、ベンゾラクタム、ＤＰＰ、プロストラチン、メゼレイン、オクタヒドロメゼレイン、チメレアトキシン、（－）－インドラクタムＶ、（－）－オクチルインドラクタムＶ、ＯＡＧ又はこれらの誘導体である。
実施形態において、活性化剤部分は、チエノ［２，３－ｂ］ピリジン、チエノピリドン、キノキサリンジオン、イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジン、［２，３－ｄ］ピリジン、ベンゾイミダゾール、ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン、スピロ環インドリノン、テトラヒドロキノリン、チエノ［２，３－ｂ］ピリジンジオン及びこれらの誘導体である。Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ（２０１２）２２（１２）（参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
Figure 2023509752000028
Figure 2023509752000029
Figure 2023509752000030
Figure 2023509752000031
Figure 2023509752000032
Figure 2023509752000033
Figure 2023509752000034
Figure 2023509752000035
Figure 2023509752000036
Figure 2023509752000037
Figure 2023509752000038
Figure 2023509752000039
Figure 2023509752000040
ＮＡＳＡケミストリーを用いると、活性化剤部分を官能化することができ、そこに局在化部分を更に付加することができる。ＮＡＳＡケミストリーについては、概して、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９，１８７０（２０１８）（参照により本明細書に援用される）に記載されている。特定の実施形態において、ＰＫＣ活性化剤部分は、Ｎ－アシルＮ－アルキルスルホンアミド（ＮＡＳＡ）ウォーヘッドを利用して局在化部分に取り付けることができる。ある態様において、ＮＡＳＡウォーヘッドは、
Figure 2023509752000041
 （式中、Ｒは、蛍光色素、ＢＲＤ４結合剤、ＦＫＢＰ結合剤、ＭＤＭ２結合剤、ＥＲ結合剤又はいずれか他の目的のタンパク質の結合剤を含む）
を含む。
別の手法では、ＮＡＳＡケミストリーを用いてＰＫＣ活性化剤部分がテトラシクロオクテン（ＴＣＯ）で標識され、これにより、テトラジンクリックケミストリーを用いて任意の目的タンパク質の結合剤にクリックすることが可能になる。従って、ある態様において、ＰＫＣ活性化剤は、式：
Figure 2023509752000042
 に従って調製され、次にこれを、
Figure 2023509752000043
 （式中、Ｒは、任意の目的タンパク質の結合剤、例えば局在化部分である）
に従って官能化テトラジンと反応させることができる。従って、ある実施形態は、ＮＡＳＡケミストリーを用いて且つ実施例に更に記載するとおり、本明細書に開示される組成物を作成する方法を含む。
ＡＭＰＫ活性化剤部分
ＡＭＰＫは、触媒性αサブユニットと２つの調節性β及びγサブユニットとで構成されるヘテロ三量体複合体に組織化するセリン／スレオニンキナーゼである。例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２）を参照されたい。γサブユニットへのＡＭＰ結合を模倣する小分子は、ＡＭＰＫを直接活性化し得ると考えられる。ＡＭＰＫ活性化剤は、本明細書に開示されるとおりのＡＭＰＫ活性化剤から選択され得る。
実施形態において、ＡＭＰＫ活性化剤は、
Figure 2023509752000044
 から選択される。他のＡＭＰＫ活性化剤としては、Ａ７６９６６２（Ｃｏｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．３，４０３－４１６（２００６））及びＰＴ１（Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３，１６０５１－１６０６０（２００８）が挙げられる。
ＡＭＰＫ活性化剤は、例えば、米国特許出願公開第２００５００３８０６８号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりであり得、
Figure 2023509752000045
 に係るものであり得る。ＡＭＰＫ活性化剤は、国際公開第２００７０１９９１４号パンフレット、同第２００９１２４６３６号パンフレット、同第２００９１３５５８０号パンフレット、同第２００８００６４３２号パンフレット又は同第２００９１５２９０９号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりであり得る。実施形態において、活性化剤は、
Figure 2023509752000046
 に係るものであり得る。
ＡＭＰＫ活性化剤は、国際公開第２００９１００１３０号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりであり得る。一態様において、ＡＭＰＫ活性化剤は、
Figure 2023509752000047
 に係るものである。
ＡＭＰＫ活性化剤は、国際公開第２０１００３６６１３号パンフレット、同第２０１００４７９８２号パンフレット、同第２０１００５１１７６号パンフレット、同第２０１００５１２０６号パンフレット、同第２０１１１０６２７３号パンフレット又は同第２０１２１１６１４５号パンフレットに記載されるとおりであり得る。実施形態において、ＡＭＰＫ活性化剤は、
Figure 2023509752000048
 に係るものである。
特定の例示的実施形態において、ＡＭＰＫ活性化剤は、国際公開第２０１１０２９８５５号パンフレット、同第２０１１１３８３０７号パンフレット、同第２０１２１１９９７９号パンフレット、同第２０１２１１９９７８号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりであり得る。一態様において、ＡＭＰＫ活性化剤は、
Figure 2023509752000049
 から選択され得る。
特定の例示的実施形態において、ＡＭＰＫ活性化剤は、国際公開第２０１１０３２３２０号パンフレット、同第２０１１０３３０９９号パンフレット、同第２０１１０６９２９８号パンフレット、同第２０１１０７００３９号パンフレット、同第２０１１１２８２５１号パンフレット、同第２０１２００１０２０号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりであり得る。一態様において、ＡＭＰＫ活性化剤は、
Figure 2023509752000050
 から選択され得る。
特定の例示的実施形態において、ＡＭＰＫ活性化剤は、国際公開第２０１１０８０２７７号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりであり得る。一態様において、ＡＭＰＫ活性化剤は、
Figure 2023509752000051
 であり得る。
特定の例示的実施形態において、ＡＭＰＫ活性化剤は、国際公開第２０１２０３３１４９号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりであり得る。一態様において、ＡＭＰＫ活性化剤は、
Figure 2023509752000052
 から選択され得る。
ブルトンチロシンキナーゼ活性化剤部分
ブルトンチロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）は、多重シグナル伝達カスケードに関わり、Ｂ細胞発生及び発癌シグナル伝達において役割を果たす。例えば、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｐａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８を参照されたい。実施形態において、Ｂｔｋ活性化剤は、イブルチニブ又はその誘導体である。
Figure 2023509752000053
特定の例示的実施形態において、Ｂｔｋ活性化剤は、
Figure 2023509752000054
 から選択される。
特定の例示的実施形態において、Ｂｔｋ活性化剤部分には、
Figure 2023509752000055
 のターゲティング部分が提供される。
リンカーは、存在する場合、５～１０個、より好ましくは６～８個の炭素鎖を含むアルキル鎖を含み得る。特定の例示的実施形態において、Ｂｔｋ活性化剤部分を含む分子は、
Figure 2023509752000056
 である。
ＡＢＬキナーゼ活性化剤部分
エーベルソンキナーゼ（ｃ－Ａｂｌ）は、遍在的に発現する非受容体型チロシンキナーゼであり、細胞の分化及び生存において重要な役割を果たす。Ｓｉｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１９ ６２，２１５４－２１７１。ＡＢＬチロシンキナーゼは、核、細胞質及びミトコンドリアに見出すことができる。実施形態において、ｃ－Ａｂｌキナーゼ活性化剤は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｅｌｌ－Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ，Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃ－Ａｂｌ Ｋｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｔｈａｔ Ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ”，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．，１８，１７７－１８６，Ｆｅｂ．２５，２０１１；ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０１０．１２．０１３に記載されるとおり、（５－［３－（４－フルオロフェニル）－１－フェニル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－２，４－イミダゾリジンジオン又は５－（１，３－ジアリール－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ヒダントイン）：
Figure 2023509752000057
 （ＤＰＨ）である。特定の実施形態において、ｃ－Ａｂｌキナーゼ活性化剤は、
Figure 2023509752000058
 から選択され得、これらは、Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１９においてインビボでｃ－Ａｂｌの活性化を示したものである。Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．の表６に記載されている新規アミノピラゾリン小分子活性化剤は、参照により本明細書に具体的に援用される。
特定の例示的実施形態において、ｃ－Ａｂｌキナーゼ活性化剤部分は、
Figure 2023509752000059
 である。
特定の例示的実施形態において、化合物は、式
Figure 2023509752000060
 （式中、Ｒは、
Figure 2023509752000061
 である）
に係るものである。
特定の例示的実施形態において、ＤＰＨは官能化される。
Figure 2023509752000062
特定の例示的実施形態において、ＡＢＬキナーゼ活性化剤は、
Figure 2023509752000063
 （式中、破線の丸は、配向アダプター及び／又はリンカーに取り付ける部分を特定する）
である。ＡＢＬキナーゼ活性化剤の破線の丸内に描かれる官能基は、局在化部分に取り付ける前にリンカー及び配向アダプターを取り付ける方法において利用することができる。
活性化剤部分は、配向アダプター及びリンカーを取り付ける方法のために官能化され得る。ＡＢＬキナーゼ活性化剤親分子ＤＰＨは、配向アダプター及びリンカーを取り付ける方法のために官能化することができる。例示的分子は、
Figure 2023509752000064
 であり得る。
官能化が終わると、配向アダプター及びリンカーを逐次的に又は一度に付加することができ、ここで、配向アダプターとリンカーとは、１つの分子として付加される。例示的分子を以下に提供し、ここで、Ｒ基は、局在化部分を表す。
Figure 2023509752000065
 任意選択で、局在化部分に２つ以上の活性化剤部分が取り付けられ得る。いずれの例でも、同定された活性化剤部分は、リンカー及び配向アダプターを取り付ける方法について本明細書に記載されるとおり官能化することができ、その後、例えば破線の丸に描かれる官能基を利用して局在化部分に取り付けることができる。
ある態様において、Ａｂｌキナーゼ活性化剤は、ＤＰＨ又はジヒドロピラゾール活性化剤である。例示的分子は、
Figure 2023509752000066
 （式中、Ｘは、（ＣＨ２）ｎであり、これは、例えば、アミド、アセタール、アミナール、アミン、アルキル、エーテル、ヒドロカルビル及びこれらの誘導体の１つ以上又は本明細書の他の部分に記載されるとおりの他の基で置換され得る）
を含み得る。特定の実施形態において、ｎは、０～２０であり、より好ましくは、ｎは、１～１０又は２～７であり、及びＲは、
Figure 2023509752000067
 である。ある態様において、ＡＢＬキナーゼ活性化剤ジヒドロピラゾールへの取り付けは、各種のリンカーを介した取り付けであり、例えば（ＰＨＩＣＳ１０．１～１０．５、図６４Ａ）を参照されたい。ある態様において、局在化部分がＢＲＤ４に対するものである場合、
Figure 2023509752000068
 の例示的分子は、
Figure 2023509752000069
 を含み得る。
インスリン受容体（ＩＲＴＫ）活性化剤
特定の例示的実施形態において、キナーゼ活性化剤部分は、膜結合型インスリン受容体キナーゼである。ある態様において、ＩＴＲＫに対する活性化剤は、コウジ酸又はその誘導体である。
実施形態において、標的はＡＲである。ある態様において、局在化部分はエンザルタミドを含み得る。実施形態において、エンザルタミドは、アジド末端を含むリンカーにエーテル結合を介して取り付けられる。従って、特定の実施形態において、活性化剤部分上にアルキン官能基を加えることにより、生体直交型クリックケミストリーによってつなぐことが可能となり得る。例えば、図８０を参照されたい。特定の実施形態において、インスリン受容体は、式
Figure 2023509752000070
 （式中、Ｘは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ又はＰである）
に係るものである。
ＣＡＲＭ－１活性化剤
特定の例示的実施形態において、キナーゼ活性化剤部分は、ＣＡＲＭ１活性化剤である。
特定の例示的実施形態において、ＣＡＲＭ１活性化剤は、
Figure 2023509752000071
 （式中、破線の丸は、配向アダプター及びリンカーに取り付ける部分を特定する）
から選択される。ＣＡＲＭ１活性化剤の破線の丸内に描かれる官能基は、局在化部分に取り付ける前にリンカー及び配向アダプターを取り付ける方法において利用することができる。
Ａｂｌ１阻害剤
Ａｂｌ１は、細胞分化、細胞分裂、細胞接着及びストレス応答の過程に関係があるとされるチロシンプロテインキナーゼである。例示的阻害剤ダサチニブ、イマチニブ、ポナチニブ及びニロチニブの構造は、実施例７に提供する。ある態様において、これらの阻害剤は、その反応速度及び滞留時間の点において、用量に基づいて薬理効果を調整し、オフターゲット効果を低減し、且つ滞留時間を最適化するように選択される。実施例７に記載されるとおりの手法を用いて本発明の多官能性キメラ分子の効果を最適化することができる。
ＭＥＫ阻害剤
ある態様において、部分は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤である。ある態様において、ＭＥＫ阻害剤は、アジド官能化局在化部分との生体直交型クリックケミストリー反応に用いられるアルキンで官能化されたトラメチニブである。ＭＥＫ部分は、例えば、Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ．６５（３）：ｉｉｉ８３－ｉｉｉ８８（２００６）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍ Ｔｈｅｒ １５６：５９－６８（２０１５）；Ｓｕｐｌａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ Ｄｙｎ ３７（８）：２０４９－２０６０（２０１８）；Ｈｅａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｅｄｉｃｉｎ Ｃｈｅｍ ５５（１０）：４５９４－４６０４（２０１２）；Ｆｏｒｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９：１１９６－１２０５（２００４）に開示されるとおりＭＥＫ結合部分を考慮して、本明細書に提供される手引き及び設計に従って合成することができる。
Figure 2023509752000072
本発明の多官能性キメラ分子の活性化部分として、図８９に示されるとおりの例示的ｐ３８αマイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤ＳＢ５、ＳＢ６、ＳＢ７、Ｂ１２、Ｂ９６、ＢＲ５、ＢＲ８及びＢＭＵ及びこれらの誘導体を利用することができる。
ＡＫＴ阻害剤
ある態様において、部分は、ＲＡＣ－αセリン／スレオニン－プロテインキナーゼ（ＡＫＴ）阻害剤である。ある態様において、ＡＴＫ阻害剤は、本明細書の他の部分に記載されるとおりのアジド官能化局在化部分との生体直交型クリックケミストリー反応に用いられるアルキンで官能化されたボルセルチブ（Ｂｏｒｕｓｓｅｒｔｉｂ）である。ＡＫＴ部分は、例えば、Ｐａｎｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ １１６３：２５３－２７８（２０１９）；Ｂｏｔｅｌｌｏ－Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｌ １３（８）：ｅ１００５７１１（２０１７）；Ｍｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ８９（５）：７２３－７３１（２０１７）；Ｒｕｉｚ－Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ８：７３６５（２０１８）及びＢｕｄａｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３５：１０２１－１０２６（２００７）に開示されるとおりＡＫＴ結合部分を考慮して、本明細書に提供される手引き及び設計に従って合成することができる。
Figure 2023509752000073
配向アダプター
多官能性分子は、１つ以上の配向アダプターを含み得る。実施形態において、配向アダプターは、局在化部分又は活性化剤部分のいずれの例でも利用することができる。ある態様において、配向アダプターはリンカー分子の両端に付加され、ここで、配向アダプターは、多官能性分子の各活性化剤部分に取り付けられ、任意選択で、局在化部分の別の末端に化学的リンカー分子を相互接続する配向アダプターを提供する。
実施形態において、配向アダプターとは、局在化部分及び活性化剤の配向を助ける小分子基である。実施形態において、配向アダプターは、小分子化合物がその好ましい低エネルギーのコンホメーションの１つで結合するように選択される。例として、タンパク質が基質であるとき、小分子がその僅かしかない回転可能な結合を歪ませることによって好ましくないコンホメーションをとる場合と比べると、タンパク質はその自由度にわたって小さく変化することによって歪みエネルギーをより容易に散逸させる。従って、小分子化合物の設計に際しては、「ソフト」エネルギー又は低エネルギーのねじれの障壁が役立つ。アリール環の間にある配向分子の設計時には、優先度を考慮することができる。アニソール類（ＡｒＯＣＨ２Ｒ）及びアニリン類（ＡｒＮＨＲ）は、共平面的なコンホメーションを優先的にとり、アルキルアリール類（ＡｒＣＨ２Ｒ）、アリールスルホンアミド類及びアリールスルホン類は、直交するコンホメーションを優先的にとる。配向アダプター原子は、距離及び方向の両方を制御する。例えば、Ｂｒａｍｅｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．２００８，４８，１－２４を参照されたい。
配向アダプターは、実施形態では、出口ベクターと称されることもある。出口ベクターパラメータは、一部には、ケモインフォマティクスソフトウェアを使用して生成し得る可変基の箇所に取り付けられた置換基の平均的な配向に基づいて同定することができる。出口ベクターは、化学的部分から出る結合を含み得る。特定の実施形態において、この結合は、エネルギー的に有利に作用し、好ましくは結合親和性が増加するように選択される。配向アダプターは、特定の実施形態ではリンカーと共に表され得、多官能性分子に利用されるリンカーに応じて調整され得る。実施形態において、配向アダプターは、立体化学的突出を促進する化学的部分又は結合であり、この突出は、続くカップリング、結合及び／又は接触し易さを更に促進し得る。実施形態において、第１及び第２の配向アダプターは、リンカー上の結合として提供され、リンカーと活性化剤部分及び／又は局在化部分との間を取り付けるコンホメーションを提供する。
実施形態において、第１及び第２の配向アダプターは、存在するとき、表２から独立に選択される（配向アダプター表）。
Figure 2023509752000074
標的基質の修飾方法
本明細書に開示される多官能性分子は、標的基質を修飾する方法に利用することができる。標的基質を修飾する方法は、標的基質を本発明の多官能性分子と接触させることを含み得る。接触させることにより、標的基質又は標的基質に近接している分子との結合又は会合が可能となり得る。ある態様において、標的基質は酵素の天然基質ではないか、又は活性化剤分子による酵素の活性化は、活性化剤部分への結合によって活性化されない場合、本来、酵素によって修飾されないままである１つ以上の新しい修飾部位において、酵素による標的基質の修飾をもたらす。修飾には、例えば、リン酸化、ヒドロキシル化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、プレニル化、アミド化、エリミニレーション、脂質化、アシル化、リポイル化、脱アセチル化、ホルミル化、Ｓ－ニトロシル化、Ｓ－スルフェニル化、スルホニル化、スルフィニル化、スクシニル化、硫酸化、カルボニル化又はアルキル化を含めた、本明細書に開示されるとおりの翻訳後修飾が含まれ得る。ある態様において、本方法は、細胞におけるタンパク質のリン酸化を誘導することを含む。ある態様において、インスリンリン酸化カスケードは、小分子化合物の使用によって複製することができる。本方法は、標的基質を多官能性分子と接触させることを含み得る。詳細な実施形態において、標的基質は、分子の活性化剤部分に特異的なキナーゼに近接している。リン酸化を誘導する多官能性分子には、任意選択で、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）又は追加のリン酸基を提供する別の分子が提供され得る。理論によって拘束されるものではないが、ＡＭＰ又は他のリン酸塩を提供する分子を追加すると、リン酸化が亢進し得る。
標的基質
本発明の活性化剤部分は、局在化部分と会合された標的基質を修飾する酵素に結合し、それと会合し、且つ／又はそれを活性化させる。ある実施形態において、標的基質は酵素の天然基質ではなく、即ちその活性化剤部分が会合する基質ではない。一実施形態において、活性化剤分子によって酵素が活性化すると、活性化剤部分への結合によって活性化されない場合、本来、酵素によって修飾されないままである１つ以上の新しい修飾部位において、酵素による標的基質の修飾をもたらす。標的基質は、局在化部分が結合し得るもの、又は他の方法で局在化部分が会合し得るもの、又は局在化部分に近接していることが公知の基質であり得、従って、活性化剤部分は、標的基質を修飾する距離の範囲内、例えばそれに近接した範囲内にある。標的基質が酵素の天然基質である必要はない。標的基質は、タンパク質であり得、遺伝子についての本明細書における考察には、遺伝子発現の産物が含まれる。更なる適用は、タンパク質：ＤＮＡ相互作用、例えばＭｙｃ又はタンパク質：タンパク質相互作用の修飾であり得る。利用は、例えば、核酸又はタンパク質分子の電荷を変化させるためのリン酸化を含み得る。
非限定的な例として、セクレターゼ障害に関連するタンパク質としては、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドβ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（咽頭前部欠損１ホモログＢ（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、ＢＡＣＥ１（βサイトＡＰＰ切断酵素１）、ＩＴＭ２Ｂ（膜内在性タンパク質２Ｂ）、ＣＴＳＤ（カテプシンＤ）、ＮＯＴＣＨ１（ノッチホモログ１、転座関連（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー２））、ＩＮＳ（インスリン）、ＤＹＴ１０（ジストニア１０）、ＡＤＡＭ１７（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７）、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＡＣＥ（アンジオテンシンＩ変換酵素（ペプチジルジペプチダーゼＡ）１）、ＳＴＮ（スタチン）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＩＬ６（インターロイキン６（インターフェロン、ベータ２））、ＮＧＦＲ（神経成長因子受容体（ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１６））、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、ベータ）、ＡＣＨＥ（アセチルコリンエステラーゼ（Ｙｔ血液型））、ＣＴＮＮＢ１（カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、ベータ１、８８ｋＤａ）、ＩＧＦ１（インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ））、ＩＦＮＧ（インターフェロン、ガンマ）、ＮＲＧ１（ニューレグリン１）、ＣＡＳＰ３（カスパーゼ３、アポトーシス関連システインペプチダーゼ）、ＭＡＰＫ１（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１）、ＣＤＨ１（カドヘリン１、１型、Ｅ－カドヘリン（上皮））、ＡＰＢＢ１（アミロイドβ（Ａ４）前駆体タンパク質結合、ファミリーＢ、メンバー１（Ｆｅ６５））、ＨＭＧＣＲ（３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素）、ＣＲＥＢ１（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質１）、ＰＴＧＳ２（プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ））、ＨＥＳ１（ヘアリー及びスプリットエンハンサー１、（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＣＡＴ（カタラーゼ）、ＴＧＦＢ１（形質転換成長因子、ベータ１）、ＥＮＯ２（エノラーゼ２（ガンマ、ニューロン））、ＥＲＢＢ４（ｖ－ｅｒｂ－ａ赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４（トリ））、ＴＲＡＰＰＣ１０（輸送タンパク質粒子複合体１０）、ＭＡＯＢ（モノアミンオキシダーゼＢ）、ＮＧＦ（神経成長因子（ベータポリペプチド））、ＭＭＰ１２（マトリックスメタロペプチダーゼ１２（マクロファージエラスターゼ））、ＪＡＧ１（ジャギド１（アラジール症候群））、ＣＤ４０ＬＧ（ＣＤ４０リガンド）、ＰＰＡＲＧ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）、ＦＧＦ２（線維芽細胞成長因子２（塩基性））、ＩＬ３（インターロイキン３（コロニー刺激因子、多重））、ＬＲＰ１（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１）、ＮＯＴＣＨ４（ノッチホモログ４（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＭＡＰＫ８（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ８）、ＰＲＥＰ（プロリルエンドペプチダーゼ）、ＮＯＴＣＨ３（ノッチホモログ３（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＣＴＳＧ（カテプシンＧ）、ＥＧＦ（上皮成長因子（ベータウロガストロン））、ＲＥＮ（レニン）、ＣＤ４４（ＣＤ４４分子（インド人血液型））、ＳＥＬＰ（セレクチンＰ（顆粒膜タンパク質１４０ｋＤａ、抗原ＣＤ６２））、ＧＨＲ（成長ホルモン受容体）、ＡＤＣＹＡＰ１（アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１（下垂体））、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）、ＭＭＰ３（マトリックスメタロペプチダーゼ３（ストロメライシン１、プロゼラチナーゼ））、ＭＡＰＫ１０（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１０）、ＳＰ１（Ｓｐ１転写因子）、ＭＹＣ（ｖ－ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＣＴＳＥ（カテプシンＥ）、ＰＰＡＲＡ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ）、ＪＵＮ（ｊｕｎ癌遺伝子）、ＴＩＭＰ１（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤１）、ＩＬ５（インターロイキン５（コロニー刺激因子、好酸球））、ＩＬ１Ａ（インターロイキン１、アルファ）、ＭＭＰ９（マトリックスメタロペプチダーゼ９（ゼラチナーゼＢ、９２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ））、ＨＴＲ４（５－ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体４）、ＨＳＰＧ２（ヘパラン硫酸プロテオグリカン２）、ＫＲＡＳ（ｖ－Ｋｉ－ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＣＹＣＳ（シトクロムｃ、体細胞性）、ＳＭＧ１（ＳＭＧ１ホモログ、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ関連キナーゼ（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＩＬ１Ｒ１（インターロイキン１受容体、Ｉ型）、ＰＲＯＫ１（プロキネチシン１）、ＭＡＰＫ３（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ３）、ＮＴＲＫ１（神経栄養チロシンキナーゼ、受容体、１型）、ＩＬ１３（インターロイキン１３）、ＭＭＥ（膜型メタロエンドペプチダーゼ）、ＴＫＴ（トランスケトラーゼ）、ＣＸＣＲ２（ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）受容体２）、ＩＧＦ１Ｒ（インスリン様成長因子１受容体）、ＲＡＲＡ（レチノイン酸受容体、アルファ）、ＣＲＥＢＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）、ＰＴＧＳ１（プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ１（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ））、ＧＡＬＴ（ガラクトース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）、ＣＨＲＭ１（コリン作動性受容体、ムスカリン作動性１）、ＡＴＸＮ１（アタキシン１）、ＰＡＷＲ（ＰＲＫＣ、アポトーシス、ＷＴ１、調節因子）、ＮＯＴＣＨ２（ノッチホモログ２（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、Ｍ６ＰＲ（マンノース－６－リン酸受容体（カチオン依存性））、ＣＹＰ４６Ａ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー４６、サブファミリーＡ、ポリペプチド１）、ＣＳＮＫ１Ｄ（カゼインキナーゼ１、デルタ）、ＭＡＰＫ１４（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４、別名ｐ３８－α）、ＰＲＧ２（プロテオグリカン２、骨髄（ナチュラルキラー細胞活性化因子、好酸球顆粒主要塩基性タンパク質））、ＰＲＫＣＡ（プロテインキナーゼＣ、アルファ）、Ｌ１ＣＡＭ（Ｌ１細胞接着分子）、ＣＤ４０（ＣＤ４０分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５）、ＮＲ１Ｉ２（核内受容体サブファミリー１、グループＩ、メンバー２）、ＪＡＧ２（ジャギド２）、ＣＴＮＮＤ１（カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、デルタ１）、ＣＤＨ２（カドヘリン２、１型、Ｎ－カドヘリン（ニューロン））、ＣＭＡ１（キマーゼ１、マスト細胞）、ＳＯＲＴ１（ソルチリン１）、ＤＬＫ１（デルタ様１ホモログ（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＴＨＥＭ４（チオエステラーゼスーパーファミリーメンバー４）、ＪＵＰ（ジャンクションプラコグロビン）、ＣＤ４６（ＣＤ４６分子、補体調節タンパク質）、ＣＣＬ１１（ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１１）、ＣＡＶ３（カベオリン３）、ＲＮＡＳＥ３（リボヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＡファミリー、３（好酸球カチオン性タンパク質））、ＨＳＰＡ８（熱ショック７０ｋＤａタンパク質８）、ＣＡＳＰ９（カスパーゼ９、アポトーシス関連システインペプチダーゼ）、ＣＹＰ３Ａ４（シトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド４）、ＣＣＲ３（ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）受容体３）、ＴＦＡＰ２Ａ（転写因子ＡＰ－２アルファ（活性化エンハンサー結合タンパク質２アルファ））、ＳＣＰ２（ステロールキャリアータンパク質２）、ＣＤＫ４（サイクリン依存性キナーゼ４）、ＨＩＦ１Ａ（低酸素誘導因子１、アルファサブユニット（塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス転写因子））、ＴＣＦ７Ｌ２（転写因子７様２（Ｔ細胞特異的、ＨＭＧボックス））、ＩＬ１Ｒ２（インターロイキン１受容体、ＩＩ型）、Ｂ３ＧＡＬＴＬ（ベータ１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ様）、ＭＤＭ２（Ｍｄｍ２ ｐ５３結合タンパク質ホモログ（マウス））、ＲＥＬＡ（ｖ－ｒｅｌ細網内皮症ウイルス癌遺伝子ホモログＡ（トリ））、ＣＡＳＰ７（カスパーゼ７、アポトーシス関連システインペプチダーゼ）、ＩＤＥ（インスリン分解酵素）、ＦＡＢＰ４（脂肪酸結合タンパク質４、脂肪細胞）、ＣＡＳＫ（カルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＭＡＧＵＫファミリー））、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１（アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１（下垂体）受容体Ｉ型）、ＡＴＦ４（活性化転写因子４（ｔａｘ反応性エンハンサーエレメントＢ６７））、ＰＤＧＦＡ（血小板由来成長因子アルファポリペプチド）、Ｃ２１ｏｒｆ３３（２１番染色体オープンリーディングフレーム３３）、ＳＣＧ５（セクレトグラニンＶ（７Ｂ２タンパク質））、ＲＮＦ１２３（ＲＩＮＧフィンガータンパク質１２３）、ＮＦＫＢ１（Ｂ細胞におけるカッパ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子１）、ＥＲＢＢ２（ｖ－ｅｒｂ－ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２、神経／膠芽腫由来癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＣＡＶ１（カベオリン１、カベオラタンパク質、２２ｋＤａ）、ＭＭＰ７（マトリックスメタロペプチダーゼ７（マトリライシン、子宮））、ＴＧＦＡ（形質転換成長因子、アルファ）、ＲＸＲＡ（レチノイドＸ受容体、アルファ）、ＳＴＸ１Ａ（シンタキシン１Ａ（脳））、ＰＳＭＣ４（プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）２６Ｓサブユニット、ＡＴＰアーゼ、４）、Ｐ２ＲＹ２（プリン受容体Ｐ２Ｙ、Ｇタンパク質共役型、２）、ＴＮＦＲＳＦ２１（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー２１）、ＤＬＧ１（ｄｉｓｃｓ、ラージホモログ１（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＮＵＭＢＬ（ｎｕｍｂホモログ（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））様）、ＳＰＮ（シアロホリン）、ＰＬＳＣＲ１（リン脂質スクランブラーゼ１）、ＵＢＱＬＮ２（ユビキリン２）、ＵＢＱＬＮ１（ユビキリン１）、ＰＣＳＫ７（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン７型）、ＳＰＯＮ１（スポンジン１、細胞外マトリックスタンパク質）、ＳＩＬＶ（ｓｉｌｖｅｒホモログ（マウス））、ＱＰＣＴ（グルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ）、ＨＥＳＳ（ヘアリー及びスプリットエンハンサー５（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＧＣＣ１（ＧＲＩＰ及びコイルドコイルドメイン含有１）及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
更なる標的としては、脂肪酸障害に関係があるとされる標的を挙げることができる。特定の実施形態において、標的は、ＡＣＡＤＭ、ＨＡＤＨＡ、ＡＣＡＤＶＬの１つ以上である。実施形態において、標的化される編集は、中鎖脂肪酸アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤＭ）遺伝子、長鎖脂肪酸長鎖３－ヒドロキシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨＡ）遺伝子及び極長鎖脂肪酸アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤＶＬ）遺伝子から選択される細胞内の遺伝子の活性である。一態様において、疾患は、中鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤＤ）、長鎖３－ヒドロキシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症（ＬＣＨＡＤＤ）及び／又は極長鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症（ＶＬＣＡＤＤ）である。更なる標的は、アンギオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）であり得る。治療することのできるＡＮＧＰＴＬ４に関連する疾患又は障害は、ＡＮＧＰＴＬ４を含み、ＡＮＧＰＴＬ４は、脂質異常症、血漿トリグリセリド低値、血管新生調節因子、腫瘍発生の調節及び重症糖尿病性網膜症に関連する。
特定の実施形態において、疾患又は障害はアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣＩＩＩ）に関連し、これを修飾の標的とすることができる。一部の実施形態において、標的は、組換え活性化遺伝子１（ＲＡＧ１）、ＢＣＬ１１ Ａ、ＰＣＳＫ９、ラミニン、アルファ２（ｌａｍａ２）、ＡＴＸＮ３、アラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）、ｖｉｉ型コラーゲンアルファ１鎖（ＣＯＬ７ａ１）、脊髄小脳失調症１型タンパク質（ＡＴＸＮ１）、アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）、フラタキシン（ＦＸＮ）、スーパーオキシドジスムターゼ１、可溶性（ＳＯＤ１）、シヌクレイン、アルファ（ＳＮＣＡ）、ナトリウムチャネル、電位開口型、Ｘ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）、脊髄小脳失調症２型タンパク質（ＡＴＸＮ２）、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）、１１番染色体上のベータグロビン遺伝子座、中鎖脂肪酸アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤＭ）、長鎖脂肪酸長鎖３－ヒドロキシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨＡ）、極長鎖脂肪酸アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤＶＬ）、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣＩＩＩ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、アンギオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）、電位開口型ナトリウムチャネルアルファサブユニット９（ＳＣＮ９Ａ）、インターロイキン－７受容体（ＩＬ７Ｒ）、グルコース－６－ホスファターゼ、触媒性（Ｇ６ＰＣ）、ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｃ９ＯＲＦ７２、β－グロビン、ジストロフィン、γ－グロビンを含み得る。
特定の実施形態において、標的は特定の遺伝子に関連する。標的は、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰＩＲ１２Ｃ）、ＡＬＢ遺伝子、Ａｎｇｐｔｌ３遺伝子、ＡｐｏＣ３遺伝子、ＡＳＧＲ２遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＦＩＸ（Ｆ９）遺伝子、Ｇ６ＰＣ遺伝子、Ｇｙｓ２遺伝子、ＨＧＤ遺伝子、Ｌｐ（ａ）遺伝子、Ｐｃｓｋ９遺伝子、セルピンａｌ遺伝子、ＴＦ遺伝子及びＴＴＲ遺伝子であり得る）。ＨＤＲ／ＮＨＥＪの媒介による第１エクソンへのｃＤＮＡのノックイン効率の評価には、以下の領域、例えば：ＡｐｏＣ３（ｃｈｒ１１：１１６８２９９０８～１１６８３３０７１）、Ａｎｇｐｔｌ３（ｃｈｒ１：６２，５９７，４８７～６２，６０６，３０５）、セルピンａｌ（ｃｈｒ１４：９４３７６７４７～９４３９０６９２）、Ｌｐ（ａ）（ｃｈｒ６：１６０５３１４８３～１６０６６４２５９）、Ｐｃｓｋ９（ｃｈｒ１：５５，０３９，４７５～５５，０６４，８５２）、ＦＩＸ（ｃｈｒＸ：１３９，５３０，７３６～１３９，５６３，４５８）、ＡＬＢ（ｃｈｒ４：７３，４０４，２５４～７３，４２１，４１１）、ＴＴＲ（ｃｈｒ１８：３１，５９１，７６６～３１，５９９，０２３）、ＴＦ（ｃｈｒ３：１３３，６６１，９９７～１３３，７７９，００５）、Ｇ６ＰＣ（ｃｈｒ１７：４２，９００，７９６～４２，９１４，４３２）、Ｇｙｓ２（ｃｈｒ１２：２１，５３６，１８８～２１，６０４，８５７）、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ）（ｃｈｒ１９：５５，０９０，９１２～５５，１１７，５９９）、ＨＧＤ（ｃｈｒ３：１２０，６２８，１６７～１２０，６８２，５７０）、ＣＣＲ５（ｃｈｒ３：４６，３７０，８５４～４６，３７６，２０６）又はＡＳＧＲ２（ｃｈｒ１７：７，１０１，３２２～７，１１４，３１０）の１つとの相同性アームを有する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡなど、「セーフハーバー」部位へのｃＤＮＡノックインを利用することができる。一態様において、標的は、スーパーオキシドジスムターゼ１、可溶性（ＳＯＤ１）である。
ある態様において、疾患は、癌に関連する。ある態様において、発癌標的に対するネオリン酸化が免疫応答を引き出し得るか、又はリン酸化が自己抗原として用いられる。ある態様において、リン酸化は、多発性硬化症、例えばαＢ－クリスタリン又は複数の標的を有するＳＬＥに用いられる（例えば、Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｍａｍｕｌａ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２を参照されたい）。一部の実施形態において、疾患は、例えば、増殖性疾患、前癌病態、癌又は腫瘍抗原の発現に関連する非癌関連の適応疾患など、腫瘍抗原の発現に関連し、腫瘍抗原は、一部の実施形態において、Ｂ２Ｍ、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＤＣＫ、ＣＤ５２、ＦＫＢＰ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ又はＮＲ３Ｃ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦベータ又はＰＴＰＮ１１ ＤＣＫ、ＣＤ５２、ＮＲ３Ｃ１、ＬＩＬＲＢ１、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１（別名ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９及び１９Ａ２４）；Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１又はＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テスティシン又はＰＲＳＳ２１）；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）；ステージ特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシンプロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ｎキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びエーベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；グロボＨグリコセラミドの六糖部分（グロボＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレノセプターベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；ＥＴＳ転座変異体遺伝子６、染色体１２ｐに位置する（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンギオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；メラノーマ癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；メラノーマ癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サーバイビング；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１又はガレクチン８）、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原１（メランＡ又はＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；サルコーマ転座切断点；メラノーマアポトーシス阻害因子（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ又は刷り込み部位の調節因子の兄弟（Ｂｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｓｉｔｅｓ））、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；後期糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓遍在性１（ＲＵ１）；腎臓遍在性２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲ又はＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬＳ）；及び免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、Ｇ６ＰＣ、欠失又は切出しによるエクソン５１の修飾を含むジストロフィン、ＤＭＰＫ、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）から選択される標的を含み得る。実施形態において、標的は、ＣＤ７０又はＣＤ３３のノックイン及びＢ２Ｍのノックアウトを含む。実施形態において、標的は、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ又はＴＲＡＣ、Ｂ２Ｍ及びＰＤ１のノックアウトを含み、追加的な標的遺伝子があることも、ないこともある。特定の実施形態において、疾患は、ＳＣＮＮ１Ａ遺伝子が標的となる嚢胞性線維症である。一つの適用では、本明細書に開示される小分子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の提示及び免疫応答において利用される。
詳細な実施形態では、藻類細胞によって産生される脂質の量及び／又は脂質の質の修飾に関与する遺伝子を特異的に修飾することが想定される。脂肪酸合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の例は、例えば、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、脂肪酸シンターゼ、３－ケトアシルアシルキャリアータンパク質シンターゼＩＩＩ、グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、エノイルアシルキャリアータンパク質レダクターゼ（エノイル－ＡＣＰ－レダクターゼ）、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ又はジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼなどの脂肪酸チオエステラーゼ又はリンゴ酸酵素活性を有するタンパク質をコードすることができる。更なる実施形態では、脂質蓄積が増加した珪藻類を作成することが想定される。これは、脂質異化を減少させる遺伝子を標的化することによって実現し得る。トリアシルグリセロール及び遊離脂肪酸の両方の活性化に関わる遺伝子並びにアシル－ＣｏＡシンテターゼ、３－ケトアシル－ＣｏＡチオラーゼ、アシル－ＣｏＡオキシダーゼ活性及びホスホグルコムターゼなどの脂肪酸のβ酸化に直接関わる遺伝子は、本発明の方法で用いるのに特に有益である。本明細書に記載されるシステム及び方法を用いると、その脂質含有量が増加するように珪藻類のかかる遺伝子を特異的に活性化させることができる。
一部の実施形態において、疾患は異染性白質ジストロフィーであり、且つ標的はアリールスルファターゼＡであり、疾患はヴィスコット・オールドリッチ症候群であり、且つ標的はヴィスコット・オールドリッチ症候群タンパク質であり、疾患は副腎白質ジストロフィーであり、且つ標的はＡＴＰ結合カセットＤＩであり、疾患はヒト免疫不全ウイルスであり、且つ標的は受容体５型Ｃ－Ｃケモカイン又はＣＸＣＲ４遺伝子であり、疾患はβ－サラセミアであり、且つ標的はヘモグロビンβサブユニットであり、疾患はＸ連鎖重症複合免疫不全受容体サブユニットガンマであり、且つ標的はインターロイキン－２受容体サブユニットガンマであり、疾患は多系統リソソーム蓄積症、シスチン蓄積症であり、且つ標的はシスチノシンであり、疾患はダイアモンド・ブラックファン貧血であり、且つ標的はリボソームタンパク質Ｓ１９であり、疾患はファンコニー貧血であり、且つ標的はファンコニー貧血相補群（例えば、ＦＮＡＣＡ、ＦＮＡＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ）であり、疾患はシュワックマン・ボディアン・ダイアモンド症候群であり、且つ標的はシュバックマン症候群遺伝子であり、疾患はゴーシェ病であり、且つ標的はグルコセレブロシダーゼであり、疾患は血友病Ａであり、且つ標的は、抗血友病因子又は第ＶＩＩＩ因子、クリスマス因子、セリンプロテアーゼ、血友病Ｂ第ＩＸ因子であり、疾患はアデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）であり、且つ標的はアデノシンデアミナーゼであり、疾患はＧＭ１ガングリオシドーシスであり、且つ標的はβ－ガラクトシダーゼであり、疾患はＩＩ型糖原病、ポンペ病であり、疾患は酸性マルターゼ欠損症であり、且つ標的はα－グルコシダーゼであり、疾患はニーマン・ピック病、ＳＭＰＤｌ関連（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１型又はＡ型及びＢ型）酸であり、且つ標的はスフィンゴミエリナーゼであり、疾患はクラッベ病、グロボイド細胞型白質ジストロフィーであり、且つ標的はガラクトシルセラミダーゼ又はガラクトシルセラミドリピドーシスであり、標的はガラクトセレブロシダーゼ、ヒト白血球抗原ＤＲ－１５、ＤＱ－６であり、疾患は多発性硬化症（ＭＳ）であり、ＤＲＢ１、疾患は、単純ヘルペスウイルス１型又は２型であり、且つ標的は、ＲＳ１、ＲＬ２及び／又はＬＡＴ遺伝子の１、２又は３個のノックダウンである。実施形態において、疾患は、ＴＣＲ又はその抗原結合断片などの結合分子並びにヒトパピローマウイルスを認識し又は結合するものなどの抗体及びその抗原結合断片を含む編集された細胞を含む治療を伴うＨＰＶ関連癌である。疾患は、ＰｒｅＣ、Ｃ、Ｘ、ＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２、Ｓ、Ｐ及び／又はＳＰ遺伝子の１つ以上を標的とするＢ型肝炎であり得る。
染色体配列によりコードされるタンパク質ＡＬＡＳ２ δ－アミノレブリン酸シンターゼ２（ＡＬＡＳ２）ＡＢＣＡ１ ＡＴＰ結合カセットトランスポーター（ＡＢＣＡ１）ＡＣＥ アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ）ＡＰＯＥ アポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＯＥ）ＡＰＰ アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ＡＱＰ１ アクアポリン１タンパク質（ＡＱＰ１）ＢＩＮ１ Ｍｙｃボックス依存性相互作用タンパク質１又は架橋インテグレータ１タンパク質（ＢＩＮ１）ＢＤＮＦ 脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ＢＴＮＬ８ ブチロフィリン様タンパク質８（ＢＴＮＬ８）Ｃ１ＯＲＦ４９ 染色体１オープンリーディングフレーム４９ ＣＤＨ４ カドヘリン４ ＣＨＲＮＢ２ ニューロンアセチルコリン受容体サブユニットβ－２ ＣＫＬＦＳＦ２ ＣＫＬＦ様ＭＡＲＶＥＬ膜貫通ドメイン含有タンパク質２（ＣＫＬＦＳＦ２）ＣＬＥＣ４Ｅ Ｃ型レクチンドメインファミリー４、メンバーｅ（ＣＬＥＣ４Ｅ）ＣＬＵ クラスタリンタンパク質（別名アポリポタンパク質Ｊ）ＣＲ１ 赤血球補体受容体１（ＣＲ１、別名ＣＤ３５、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体及び免疫粘着受容体）ＣＲ１Ｌ 赤血球補体受容体１（ＣＲ１Ｌ）ＣＳＦ３Ｒ 顆粒球コロニー刺激因子３受容体（ＣＳＦ３Ｒ）ＣＳＴ３ シスタチンＣ又はシスタチン３ ＣＹＰ２Ｃ シトクロムＰ４５０ ２Ｃ ＤＡＰＫ１ 細胞死関連プロテインキナーゼ１（ＤＡＰＫ１）ＥＳＲ１ エストロゲン受容体１ ＦＣＡＲ ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲ、別名ＣＤ８９）ＦＣＧＲ３Ｂ ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性ＩＩＩｂ、受容体（ＦＣＧＲ３Ｂ又はＣＤ１６ｂ）ＦＦＡ２ 遊離脂肪酸受容体２（ＦＦＡ２）ＦＧＡ フィブリノゲン（第Ｉ因子）ＧＡＢ２ ＧＲＢ２関連結合タンパク質２（ＧＡＢ２）ＧＡＢ２ ＧＲＢ２関連結合タンパク質２（ＧＡＢ２）ＧＡＬＰ ガラニン様ペプチド ＧＡＰＤＨＳ グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、精子形成（ＧＡＰＤＨＳ）ＧＭＰＢ ＧＭＢＰ ＨＰハプトグロビン（ＨＰ）ＨＴＲ７ ５－ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体７（アデニル酸シクラーゼ共役型）ＩＤＥ インスリン分解酵素 ＩＦ１２７ ＩＦ１２７ ＩＦＩ６インターフェロン、α－誘導性タンパク質６（ＩＦＩ６）ＩＦＩＴ２ テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質２（ＩＦＩＴ２）ＩＬ１ＲＮ インターロイキン－１受容体拮抗薬（ＩＬ－１ＲＡ）ＩＬ８ＲＡ インターロイキン８受容体、α（ＩＬ８ＲＡ又はＣＤ１８１）ＩＬ８ＲＢ インターロイキン８受容体、β（ＩＬ８ＲＢ）ＪＡＧ１ジャグド１（ＪＡＧ１）ＫＣＮＪ１５ カリウム内向き整流性チャネル、サブファミリーＪ、メンバー１５（ＫＣＮＪ１５）ＬＲＰ６ 低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）ＭＡＰＴ 微小管結合タンパク質τ（ＭＡＰＴ）ＭＡＲＫ４ ＭＡＰ／微小管親和性調節キナーゼ４（ＭＡＲＫ４）ＭＰＨＯＳＰＨ１ Ｍ期リンタンパク質１ ＭＴＨＦＲ ５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素 ＭＸ２ インターフェロン誘導ＧＴＰ結合タンパク質 Ｍｘ２ ＮＢＮ ニブリン、別名ＮＢＮ ＮＣＳＴＮ ニカストリン ＮＩＡＣＲ２ ナイアシン受容体２（ＮＩＡＣＲ２、別名ＧＰＲ１０９Ｂ）ＮＭＮＡＴ３ ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ３ ＮＴＭ ニューロトリミン（又はＨＮＴ）ＯＲＭ１ オロソムコイド（Ｏｒｏｓｍｕｃｏｉｄ）１（ＯＲＭ１）又はα－１－酸糖タンパク質１ Ｐ２ＲＹ１３ Ｐ２Ｙ プリン受容体１３（Ｐ２ＲＹ１３）ＰＢＥＦ１ ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡｍＰＲＴアーゼ又はＮａｍｐｔ）別名プレＢ細胞コロニー増強因子１（ＰＢＥＦ１）又はビスファチン ＰＣＫ１ ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ ＰＩＣＡＬＭ ホスファチジルイノシトール結合クラスリン集合タンパク質（ＰＩＣＡＬＭ）ＰＬＡＵ ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＬＡＵ）ＰＬＸＮＣ１ プレキシンＣ１（ＰＬＸＮＣ１）ＰＲＮＰ プリオンタンパク質 ＰＳＥＮ１ プレセニリン１タンパク質（ＰＳＥＮ１）ＰＳＥＮ２ プレセニリン２タンパク質（ＰＳＥＮ２）ＰＴＰＲＡ タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ａ型タンパク質（ＰＴＰＲＡ）ＲＡＬＧＰＳ２ ＰＨドメイン及びＳＨ３結合モチーフを有するＲａｌ ＧＥＦ２（ＲＡＬＧＰＳ２）ＲＧＳＬ２ Ｇタンパク質シグナル伝達様の調節因子２（ＲＧＳＬ２）ＳＥＬＥＮＢＰ１ セレン結合タンパク質１（ＳＥＬＮＢＰ１）ＳＬＣ２５Ａ３７ ミトフェリン１ ＳＯＲＬ１ ソルチリン関連受容体Ｌ（ＤＬＲクラス）Ａリピート含有タンパク質（ＳＯＲＬ１）ＴＦ トランスフェリン ＴＦＡＭ ミトコンドリア転写因子Ａ ＴＮＦ 腫瘍壊死因子 ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ 腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）ＴＮＦＳＦ１０ 腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、（ＴＲＡＩＬ）メンバー１０ａ（ＴＮＦＳＦ１０）ＵＢＡ１ ユビキチン様モディファイヤー活性化酵素１（ＵＢＡ１）ＵＢＡ３ ＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）ＵＢＢ ユビキチンＢタンパク質（ＵＢＢ）ＵＢＱＬＮ１ ユビキリン１ ＵＣＨＬ１ ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１タンパク質（ＵＣＨＬ１）ＵＣＨＬ３ ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ３タンパク質（ＵＣＨＬ３）ＶＬＤＬＲ 超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）。
標的としては、ＶＬＤＬＲ遺伝子によってコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によってコードされるユビキチン様モディファイヤー活性化酵素１（ＵＢＡ１）、ＵＢＡ３遺伝子によってコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）、ＡＱＰ１遺伝子によってコードされるアクアポリン１タンパク質（ＡＱＰ１）、ＵＣＨＬ１遺伝子によってコードされるユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１タンパク質（ＵＣＨＬ１）、ＵＣＨＬ３遺伝子によってコードされるユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ３タンパク質（ＵＣＨＬ３）、ＵＢＢ遺伝子によってコードされるユビキチンＢタンパク質（ＵＢＢ）、ＭＡＰＴ遺伝子によってコードされる微小管結合タンパク質τ（ＭＡＰＴ）、ＰＴＰＲＡ遺伝子によってコードされるタンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ａ型タンパク質（ＰＴＰＲＡ）、ＰＩＣＡＬＭ遺伝子によってコードされるホスファチジルイノシトール結合クラスリン集合タンパク質（ＰＩＣＡＬＭ）、ＣＬＵ遺伝子によってコードされるクラスタリンタンパク質（別名アポリポタンパク質Ｊ）、ＰＳＥＮ１遺伝子によってコードされるプレセニリン１タンパク質、ＰＳＥＮ２遺伝子によってコードされるプレセニリン２タンパク質、ＳＯＲＬ１遺伝子によってコードされるソルチリン関連受容体Ｌ（ＤＬＲクラス）Ａリピート含有タンパク質（ＳＯＲＬ１）タンパク質、ＡＰＰ遺伝子によってコードされるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＡＰＯＥ遺伝子によってコードされるアポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＯＥ）又はＢＤＮＦ遺伝子によってコードされる脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を挙げることができる。例示的実施形態において、遺伝子修飾を受ける動物はラットであり、ＡＤに関連するタンパク質をコードする編集された染色体配列は以下のとおりである：ＡＰＰ アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ） ＮＭ＿０１９２８８ ＡＱＰ１ アクアポリン１タンパク質（ＡＱＰ１） ＮＭ＿０１２７７８ ＢＤＮＦ 脳由来神経栄養因子 ＮＭ＿０１２５１３ ＣＬＵ クラスタリンタンパク質（別名ＮＭ＿０５３０２１ アポリポタンパク質Ｊ） ＭＡＰＴ 微小管結合タンパク質 ＮＭ＿０１７２１２ τ（ＭＡＰＴ） ＰＩＣＡＬＭ ホスファチジルイノシトール結合 ＮＭ＿０５３５５４ クラスリン集合タンパク質（ＰＩＣＡＬＭ） ＰＳＥＮ１ プレセニリン１タンパク質（ＰＳＥＮ１） ＮＭ＿０１９１６３ ＰＳＥＮ２ プレセニリン２タンパク質（ＰＳＥＮ２） ＮＭ＿０３１０８７ ＰＴＰＲＡ タンパク質チロシンホスファターゼ ＮＭ＿０１２７６３ 受容体Ａ型タンパク質（ＰＴＰＲＡ） ＳＯＲＬ１ ソルチリン関連受容体Ｌ（ＤＬＲ ＮＭ＿０５３５１９、クラス）Ａリピート含有 ＸＭ＿００１０６５５０６、タンパク質（ＳＯＲＬ１） ＸＭ＿２１７１１５ ＵＢＡ１ ユビキチン様モディファイヤー活性化 ＮＭ＿００１０１４０８０ 酵素１（ＵＢＡ１） ＵＢＡ３ ＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１ ＮＭ＿０５７２０５ 触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ） ＵＢＢ ユビキチンＢタンパク質（ＵＢＢ） ＮＭ＿１３８８９５ ＵＣＨＬ１ ユビキチンカルボキシル末端 ＮＭ＿０１７２３７ エステラーゼＬ１タンパク質（ＵＣＨＬ１） ＵＣＨＬ３ ユビキチンカルボキシル末端 ＮＭ＿００１１１０１６５ ヒドロラーゼアイソザイムＬ３タンパク質（ＵＣＨＬ３） ＶＬＤＬＲ 超低密度リポタンパク質 ＮＭ＿０１３１５５ 受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）。
化合物の送達
目的の標的を修飾する方法は、限定なしに、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光トランスフェクション、専売薬剤による核酸取込みの増強及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム又は人工ビリオンによる送達を含めた、当技術分野において公知の１つ以上の方法によって細胞を投与若しくは又は送達すること又は他の方法で接触させることを含む。一部の方法では、組成物はマイクロインジェクションによって胚に導入される。組成物は、マイクロインジェクションで胚の核又は細胞質に注入され得る。
能動的ターゲティング脂質粒子又はナノ粒子又はリポソーム又は脂質二重層送達システム（概して本発明の実施形態に関して、「本発明の脂質実体」送達システム）は、脂質又はリポソーム表面上に、小分子リガンド、ペプチド及びモノクローナル抗体を含めたターゲティング部分をコンジュゲートすることによって調製され；例えば、葉酸受容及びトランスフェリン（Ｔｆ）受容体（ＴｆＲ）など、ある種の受容体は、多くの癌細胞で過剰発現し、リポソームを腫瘍細胞特異的にするために使用されている。腫瘍微小環境に蓄積するリポソームは、続いて特異的細胞表面受容体と相互作用することにより、エンドサイトーシスで細胞内に取り込まれ得る。リポソームを癌細胞などの細胞に効率的に標的化するため、ターゲティング部分が細胞表面受容体に対して親和性を有すること及び細胞表面受容体に最適な親和性を有するのに十分な量のターゲティング部分を連結することが有用であり；及びこれらの側面を決定することは、当業者の範囲内である。能動的ターゲティングの分野では、幾つもの細胞特異的、例えば、腫瘍特異的ターゲティングリガンドがある。
また、能動的ターゲティングについて、癌細胞表面受容体などの細胞表面受容体を標的化することに関連して、リポソーム上のターゲティングリガンドは、非インターナライズ性エピトープを介したリポソームから細胞、例えば血管細胞への取付けを提供し得；及びこれにより、送達されているものの細胞外濃度が増加し、従って標的細胞に送達される量が増加し得る。癌細胞上に過剰発現した細胞表面受容体など、癌細胞上の細胞表面受容体など、細胞表面受容体を標的化する戦略は、受容体特異的リガンド又は抗体を使用することである。多くの癌細胞タイプが腫瘍特異的受容体の上方制御を示す。例えば、ＴｆＲ及び葉酸受容体（ＦＲ）は、その代謝要求の増加に応答すると、多くの腫瘍細胞型によって大幅に過剰発現される。葉酸は、ナノ担体へのコンジュゲーションのその容易さ、ＦＲに対するその高親和性並びに活性化マクロファージ及び癌細胞、例えばある種の卵巣、乳房、肺、結腸、腎臓及び脳腫瘍におけるその過剰発現と比較したときの正常組織における比較的低いＦＲ頻度のため、特化した送達のためのターゲティングリガンドとして使用することができる。マクロファージ上でのＦＲの過剰発現は、乾癬、クローン病、関節リウマチ及びアテローム性動脈硬化症などの炎症性疾患の指標であり；従って、本発明の葉酸媒介性の標的化も炎症性障害及び癌の研究対処又は治療に使用することができる。本発明の葉酸結合型の脂質粒子又はナノ粒子又はリポソーム又は脂質二重層（「本発明の脂質実体」）は、そのカーゴを、受容体媒介性エンドサイトーシスを通して細胞内に送達する。細胞内輸送は、カーゴ放出を促進する酸性コンパートメントに向けられ得、最も重要なことに、カーゴの放出は、それが細胞質又は標的細胞小器官の近傍に到達するまで変更するか又は遅延させることができる。本発明の葉酸結合型の脂質実体など、ターゲティング部分を有する本発明の脂質実体を用いたカーゴの送達は、本発明の標的化されない脂質実体よりも優れたものであり得る。葉酸を脂質頭部基に直接取り付けることは、本発明の葉酸コンジュゲート型脂質実体の細胞内送達にとって好ましくないこともあり、これは、そうした葉酸が、癌細胞に一層効率的に侵入し得るスペーサーによって本発明の脂質実体表面に取り付けられた葉酸ほど効率的に細胞に結合しない可能性があるためである。葉酸にカップリングされた本発明の脂質実体は、脂質の複合体、例えばリポソーム、例えばアニオン性リポソーム及びアデノウイルス又はＡＡＶなど、本明細書において考察されるものなど、ウイルス、又はカプシド、又はエンベロープ、又はウイルス外被タンパク質の送達に使用することができる。Ｔｆは、体全体を通した鉄の輸送に関わる約８０ＫＤａの単量体血清糖タンパク質である。ＴｆはＴｆＲに結合し、受容体媒介性エンドサイトーシスを経て細胞内へと移行する。ＴｆＲの発現は、腫瘍細胞など、ある種の細胞において（正常細胞と比較したときに高くなり得ると共に、急速に増殖する癌細胞では、鉄要求量の増加を伴う。従って、本発明は、例えば、肝細胞、肝癌、乳癌細胞などの乳房細胞、結腸癌細胞などの結腸、卵巣癌細胞などの卵巣細胞、頭部、頸部及び非小細胞肺癌細胞などの頭部、頸部及び肺細胞、口腔腫瘍細胞などの口の細胞について、本発明のＴｆＲに標的化される脂質実体を包含する。
能動的ターゲティングについて、本発明の脂質実体は、多官能性でもあり得、即ちＴｆと共にＣＰＰなどのターゲティング部分を２つ以上用いることができ；二官能性システム；例えばＴｆと、血液脳関門の内皮を越えた輸送を提供し得るポリ－Ｌ－アルギニンとの組み合わせである。ＥＧＦＲ、これは、細胞、特に非癌性細胞における細胞成長、分化及び修復を媒介するＥｒｂＢ受容体ファミリーに属するチロシンキナーゼ受容体であるが、ＥＧＦは、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、卵巣扁平上皮癌、腎癌、頭部癌、膵癌、頸部癌及び前立腺癌及び特に乳癌を含めた多くの固形腫瘍など、ある種の細胞で過剰発現する。本発明は、本発明の脂質実体に連結した、１つ又は複数のＥＧＦＲ標的化モノクローナル抗体を包含する。ＨＥＲ－２は、多くの場合に乳癌患者において過剰発現し、肺癌、膀胱癌、前立腺癌、脳癌及び胃癌にも関連する。ＨＥＲ－２、これはＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされる。本発明は、ＨＥＲ－２を標的化する本発明の脂質実体、例えば、抗ＨＥＲ－２抗体（又はその結合断片）－本発明の脂質実体、ＨＥＲ－２を標的化するＰＥＧ化された本発明の脂質実体（例えば、抗ＨＥＲ－２抗体又はその結合断片を有する）、ＨＥＲ－２を標的化するマレイミド－ＰＥＧポリマー－本発明の脂質実体（例えば、抗ＨＥＲ－２抗体又はその結合断片を有する）を包含する。細胞会合時、この受容体－抗体複合体は、細胞質への送達のためエンドソームの形成によってインターナライズされ得る。受容体媒介性ターゲティングに関しては、当業者は、リガンド／標的親和性及び細胞表面上にある受容体の量及びＰＥＧ化が、受容体との相互作用に対する障壁としての役割を果たし得ることを考慮に入れる。抗体－本発明の脂質実体のターゲティングの使用は有利であり得る。多価の体裁のターゲティング部分は、抗体断片の取込み及びシグナル伝達特性も増加させることができる。本発明の実施において、当業者は、リガンド密度を考慮に入れる（例えば、本発明の脂質実体上のリガンド密度が高いと、標的細胞への結合の増加に有利であり得る）。マクロファージによる早期の予防は、本発明の立体的に安定した脂質実体及び本発明の脂質実体（例えば、脂質粒子又はナノ粒子又はリポソーム又は脂質二重層）においてアンカリングされるＰＥＧなどの分子の末端にリガンドを連結することで対処することができる。腫瘍微小環境などの細胞塊の微小環境を標的化することができ；例えば、腫瘍血管系微小環境など、細胞塊血管構造を標的化することが有利であり得る。従って、本発明は、ＶＥＧＦを標的化することを包含する。ＶＥＧＦ及びその受容体は、周知の血管新生促進分子であり、抗血管新生療法の十分に特徴付けられた標的である。ＶＥＧＦＲ又は塩基性ＦＧＦＲなど、受容体型チロシンキナーゼの多くの小分子阻害剤が抗癌剤として開発されており、本発明は、それらのペプチドのいずれか１つ以上、例えば１つ又は複数のファージＩＶＯペプチド（例えば、ＰＥＧ末端を介して又はそれと共に）、ＡＰＲＰＧ－ＰＥＧ修飾型などの腫瘍ホーミングペプチドＡＰＲＰＧを本発明の脂質実体にカップリングすることを包含する。ＶＣＡＭ、血管内皮は、炎症、血栓症及びアテローム性動脈硬化症の発病において重要な役割を果たす。ＣＡＭは、癌を含めた炎症性障害に関与し、論理的標的であり、Ｅ－及びＰ－セレクチン、ＶＣＡＭ－１及びＩＣＡＭを、例えばＰＥＧ化で、本発明の脂質実体の標的化に使用することができる。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）は、亜鉛依存性エンドペプチダーゼのファミリーに属する。これらは、組織リモデリング、腫瘍侵襲性、アポトーシス抵抗性及び転移に関与する。ＴＩＭＰ１～４と呼ばれる４つのＭＭＰ阻害剤があり、これが腫瘍成長阻害と転移との間の均衡を決定し；腫瘍血管の血管新生に関与するタンパク質は、ＭＴ１－ＭＭＰであり、これは、新規に形成された血管及び腫瘍組織に発現する。ＭＴ１－ＭＭＰのタンパク質分解活性は、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲン及びラミニンなどのタンパク質を細胞膜で切断し、ＭＭＰ－２などの可溶性ＭＭＰを活性化させ、これがマトリックスを分解する。本発明の実施において、本発明の脂質実体に例えばＰＥＧスペーサーなどのスペーサーを介して連結された抗ヒトＭＴ１－ＭＭＰモノクローナル抗体などに抗体又はＦａｂ’断片などのその断片を使用することができる。αβ－インテグリン又はインテグリンは、細胞とその周囲組織又は細胞外マトリックスとの付着を媒介する一群の膜貫通糖タンパク質受容体である。インテグリンは、α－及びβ－サブユニットと呼ばれる２つの異なる鎖（ヘテロ二量体）を含有する。インテグリン受容体の腫瘍組織特異的発現を本発明の標的化した送達に利用することができ、例えば、従ってターゲティング部分は環状ＲＧＤなどのＲＧＤペプチドであり得る。アプタマーは、オリゴヌクレオチドの結合相互作用に典型的なワトソン・クリックの塩基対合とは対照的に、静電相互作用、水素結合及び疎水性相互作用によって標的分子の高親和性及び特異的認識を付与するｓｓＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドである。ターゲティング部分としてのアプタマーには、抗体を上回る利点があり得る：アプタマーは、抗体と比較したとき、より高い標的抗原認識を実証し得；アプタマーは、抗体と比較したときに安定性が高く、且つ小さいサイズであり得；アプタマーは、分子コンジュゲーションのための合成及び化学的修飾が容易であり得；及びアプタマーは、選択性を向上させるため配列を変更することができ、且つ免疫原性が低い標的を認識するように開発することができる。ｓｇｃ８アプタマーとしてのかかる部分は、ターゲティング部分として（例えば、本発明の脂質実体へと、例えばＰＥＧスペーサーなどのスペーサーを介して共有結合的に連結することによって）使用することができる。ターゲティング部分は、刺激感受性、例えば磁場、超音波又は光など、外部から加えられる刺激に対する感受性があり得；及びｐＨ惹起性も用いることができ、例えばＰＥＧなどの親水性部分と本発明の脂質実体などの疎水性部分との間に易解離性の連結を用いることができ、これは、エンドサイトーシス性の空胞又はアシドーシス性の腫瘍塊など、特定の環境又は微小環境に特有の比較的酸性の条件に曝露されたときに限り切断される。ｐＨ感受性コポリマーも本発明の実施形態に取り入れることができ、これは、遮蔽を提供し得；ジオルトエステル類、ビニルエステル類、システイン切断性リポポリマー類、二重エステル類及びヒドラゾン類がｐＨ７．５で極めて安定しているが、ｐＨ６以下では比較的速く加水分解されるｐＨ感受性結合の少数の例であり、例えば、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸との末端がアルキル化されたコポリマー、このコポリマーは、ｐＨ値の低下に伴い本発明の脂質実体の不安定化及びコンパートメント内での放出を促進するか；又は本発明は、本発明のｐＨ応答性の脂質実体を生成するためのイオン性ポリマーを包含する（例えば、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸ジエチルアミノエチル）、ポリ（アクリルアミド）及びポリ（アクリル酸））。温度惹起性の送達も本発明の範囲内にある。炎症組織及び腫瘍など、多くの病的範囲は、正常組織と比較して特徴的な異常高熱を示す。異常高熱は腫瘍透過性の増加及び取込みの亢進に関連するため、この異常高熱を利用することは、癌療法において魅力的な戦略である。この技法には、その部位を局所的に加熱して微小血管の細孔径及び血流を増加させることが関わり、従って本発明の実施形態の血管外溢出が増加することになり得る。温度感受性の本発明の脂質実体は、臨界共溶温度が低い熱感受性脂質又はポリマーから調製することができる。下限臨界共溶温度を上回ると（例えば、腫瘍部位又は炎症組織部位などの部位において）、ポリマーが沈殿し、リポソームが破壊されて放出される。特定のゲル－液体相転移温度を有する脂質を使用して、これらの本発明の脂質実体が調製され；及び熱感受性の実施形態のための脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリンであり得る。熱感受性高分子も、不安定化、それに続く放出を促進することができ、有用な熱感受性高分子は、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）である。別の温度惹起性システムは、リゾ脂質温度感受性リポソームを用い得る。本発明は、レドックス惹起性送達も包含する：正常組織と炎症又は腫瘍組織との間及び細胞内環境と細胞外環境との間の酸化還元電位の差が送達に利用されており；例えば、ＧＳＨは、細胞、特に細胞質ゾル、ミトコンドリア及び核に豊富に存在する還元剤である。血液及び細胞外マトリックス中のＧＳＨ濃度は、それぞれ僅か１００分の１～１０００分の１の細胞内濃度である。ＧＳＨ、システイン及び他の還元剤によって引き起こされるこの大きい酸化還元電位の差が還元性の結合を壊し、本発明の脂質実体を不安定化させ、結果としてペイロードの放出を生じさせる。ジスルフィド結合は、ジスルフィド－チオール還元反応のためにレドックスに対する感受性を生じさせるため、本発明の脂質実体において切断可能／可逆的なリンカーとして使用することができ；本発明の脂質実体は、２つ（例えば、ジスルフィドコンジュゲート多官能性脂質の２つの形態を用いることにより還元感受性にすることができ、ここで、ジスルフィド結合の（例えば、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン、ジチオスレイトール、Ｌ－システイン又はＧＳＨによる）切断がコンジュゲートの親水性頭部基の除去を引き起こし、膜の組織化を変化させることができるため、ペイロードの放出につながり得る。ジスルフィドコンジュゲートを含有する本発明の還元感受性脂質実体からのカルセイン放出は、還元非感受性の実施形態よりも有用であり得る。酵素も、ペイロードの放出を惹起する因子として使用することができる。ＭＭＰ（例えばＭＭＰ２）、ホスホリパーゼＡ２、アルカリホスファターゼ、トランスグルタミナーゼ又はホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣを含めた酵素は、ある種の組織、例えば腫瘍組織に過剰発現することが分かっている。これらの酵素の存在下では、特別に改変された酵素感受性の本発明の脂質実体が破壊され、ペイロードを放出し得る。ＭＭＰ２によって切断可能なオクタペプチド（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ）（配列番号１）をリンカーに取り込むことができ、これは、抗体ターゲティング、例えば、抗体２Ｃ５を有し得る。本発明は、光又はエネルギー惹起性送達も包含し、例えば、本発明の脂質実体は、光非感受性であり得、従って光又はエネルギーが構造及びコンホメーションの変化を促進し得るため、本発明の脂質実体と標的細胞との膜融合、光異性化、光開裂又は光重合による直接的な相互作用につながり；従って、かかる部分は、ベンゾポルフィリン光増感剤であり得る。超音波は、送達を惹起するエネルギーの一形態であり得；本発明の脂質実体を、空気を含めた少量の特定のガス又はペルフルオロ化炭化水素と共に超音波、例えば低周波数超音波（ＬＦＵＳ）で惹起して放出させることができる。磁気的送達：本発明の脂質実体は、Ｆｅ３Ｏ４又はγ－Ｆｅ２Ｏ３などの磁鉄鉱、例えばサイズが１０ｎｍ未満のものの取込みによって磁化させることができる。従って、標的化した送達は、磁場への曝露によることができる。
能動的ターゲティングに関して、本発明は細胞内送達も包含する。リポソームはエンドサイトーシス経路を辿るため、エンドソーム内に捕捉され（ｐＨ６．５～６）、続いてリソソームと融合し（ｐＨ＜５）、そこでそれが分解を受けるため、潜在的治療能力が低くなる。エンドソームの低いｐＨは、分解の回避に生かすことができる。膜融合性脂質又はペプチド、これは、低下したｐＨでコンホメーションの遷移／活性化後にエンドソーム膜を不安定化させるものである。酸性ｐＨではアミンはプロトン化され、緩衝効果によるエンドソームの膨張及び破裂を引き起こす。不飽和ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、低ｐＨでは逆六角形をとり易く、これがリポソームとエンドソーム膜の融合を引き起こす。この過程は、ＤＯＰＥを含有する脂質実体を不安定化させ、細胞質中にカーゴが放出され；膜融合性脂質ＧＡＬＡ、コレステリル－ＧＡＬＡ及びＰＥＧ－ＧＡＬＡは、極めて効率的なエンドソーム放出を示し得；ポア形成タンパク質リステリオリシンＯは、エンドソームエスケープ機構を提供し得；及びヒスチジンリッチペプチドは、エンドソーム膜と融合する能力を有するため、ポア形成をもたらし、プロトンポンプを緩衝して膜溶解を引き起こすことができる。
能動的ターゲティングに関して、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、細胞膜を通した高分子の取込みも促進し、従って細胞内部でのＣＰＰ修飾分子の送達を亢進させる。ＣＰＰは、２つのクラス、即ちトランスポータン及びＭＡＰなどの両親媒性ヘリカルペプチド（ここでは、リジン残基が正電荷の主要な寄与因子である）；及びＴＡＴｐ、アンテナペディア又はペネトラチンなどのＡｒｇリッチペプチドに分けることができる。ＴＡＴｐは、８６アミノ酸の転写活性化因子であって、強塩基性の（９残基中２つがＬｙｓ及び６つがＡｒｇ）タンパク質形質導入ドメインを含有し、これが核局在化及びＲＮＡ結合をもたらす。リポソームの修飾に用いられている他のＣＰＰとしては、以下が挙げられる：ペネトラチンと呼ばれるショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホメオタンパク質であるアンテナペディアの最小限のタンパク質形質導入ドメイン、これは、ホメオドメインの第３ヘリックスに存在する１６ｍｅｒペプチド（残基４３～５８）であり；スズメバチ毒ペプチドであるマストパランにＬｙｓ残基を介して結合した神経ペプチドガラニンのアミノ末端からのペプチド配列を含有する、２７アミノ酸長キメラＣＰＰ；細胞内輸送を促進するＨＳＶ－１の主要な構造成分であるＶＰ２２並びにエネルギー依存性及び非依存性の両方の機構によってマスト細胞及び内皮細胞の細胞膜を移行するトランスポータン（１８ｍｅｒ）両親媒性モデルペプチド。本発明は、エネルギー依存性マイクロピノサイトーシスと、続くエンドソームエスケープを経て進み得る細胞内送達のための、１つ又は複数のＣＰＰで修飾された本発明の脂質実体を包含する。本発明は、細胞小器官特異的ターゲティングを更に包含する。トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）部分で表面が官能化された本発明の脂質実体又は親油性カチオンのローダミン１２３を有する本発明の脂質実体は、ミトコンドリアへのカーゴの送達において有効であり得る。ＤＯＰＥ／スフィンゴミエリン／ステアリルオクタアルギニンは、膜融合を経てカーゴをミトコンドリア内部に送達することができる。リソソーム向性リガンドのオクタデシルローダミンＢで表面が修飾された本発明の脂質実体は、カーゴをリソソームに送達することができる。セラミドは、リソソーム膜透過の誘導に有用であり；本発明は、セラミドを有する本発明の脂質実体の細胞内送達を包含する。本発明は、核を例えばＤＮＡインターカレート部分を介して標的化する本発明の脂質実体を更に包含する。本発明は、例えば、所望の部位における蓄積が亢進し、且つ／又は細胞小器官特異的送達が推進され、且つ／又は特定の種類の細胞が標的化され、且つ／又は温度（例えば、その上昇）、ｐＨ（例えば、その低下）などの局所的刺激に応答し、磁場、光、エネルギー、熱又は超音波などの外部から加えられる刺激に応答し、且つ／又はカーゴの細胞内送達が推進されるように、本発明の脂質実体の表面に２つ以上の官能基を標的化するための、即ちそれを取り付けるための多官能性リポソームも包含する。これらは、全て能動的ターゲティング部分と考えられる。
本システムの実施形態は、能動的ターゲティング脂質粒子、若しくはナノ粒子、若しくはリポソーム、若しくは脂質二重層送達システム；又はターゲティング部分であって、それによって能動的ターゲティングがあるもの若しくはターゲティング部分が能動的ターゲティング部分であるものを含む、脂質粒子、若しくはナノ粒子、若しくはリポソーム、若しくは脂質二重層を含み得る。ターゲティング部分は、１つ以上のターゲティング部分であり得、及びターゲティング部分は、例えば、本明細書に挙げるいずれかのような細胞を標的化するため；又は本明細書に挙げるいずれかのような細胞小器官を標的化するため；又は熱、エネルギー、超音波、光、ｐＨ、酵素的刺激などの化学物質若しくは磁気的刺激などの物理的条件などへの応答を標的化するため；又は細胞透過によるなど、特定の場所へのペイロードの送達など、特定の帰結を実現することを標的化するためなど、いかなる所望のタイプのターゲティングでもあり得る。
本明細書において考察される各々の可能なターゲティング又は能動的ターゲティング部分に関して、送達システムがかかるターゲティング又は能動的ターゲティング部分を含む本発明の態様があることが理解されなければならない。
医薬組成物
本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される薬剤を１つ又は複数の活性成分として含む医薬組成物の製造及び使用を含む。医薬組成物自体も含まれる。
医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な担体」には、医薬投与と適合性のある、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤など、及びこれらの２つ以上の組み合わせが含まれる。補足的な活性化合物も組成物に配合することができる。
医薬組成物は、典型的には、意図される投与経路と適合性があるように製剤化される。本方法において特に有用な投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内）投与、髄腔内投与、経口投与及び経鼻又は鼻腔内投与（例えば、滴剤としての投与又は吸入による）が挙げられる。一部の実施形態において、血液脳関門を通過しない化合物などについては、例えば、植込み型の髄腔内ポンプ（例えば、Ｂｏｒｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ ２０１４；９５：１０３２－８；Ｐｅｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２０：１５１７－２１（１９８９）；及びＲｅｚａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｉｎ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ２０１３；１６：４１５－４１７を参照されたい）又はナノ粒子、例えば、金ナノ粒子（例えば、グルコースコート金ナノ粒子、例えば、Ｇｒｏｍｎｉｃｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（１２）：ｅ８１０４３を参照されたい）を用いた、ＣＮＳ又はＣＳＦへの直接的な送達を用いることができる。好適な医薬組成物を製剤化及び送達する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ ａｎｄ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ）；及びＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００４）のシリーズにある書籍を参照されたい。
注射剤用途に好適な医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は滅菌注射用溶液若しくは分散液の即時調製のための分散液と滅菌粉末を挙げることができる。静脈内投与には、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合にも、組成物は無菌でなければならず、注射針を容易に通過し得る程度の流動性がなければならない。これは製造及び保管条件下で安定していなければならず、且つ細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合に必要な粒径の維持及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール類、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることにより、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
滅菌注射用溶液は、適切な溶媒に、必要に応じて上記に挙げる成分の１つ又は組み合わせと共に必要量の活性化合物を配合し、続いてろ過滅菌することによって調製し得る。概して、分散液は、基本分散媒と上記に挙げるものからの必要な他の成分とを含有する無菌媒体に活性化合物を配合することによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより、活性成分＋任意の追加的な所望の成分の粉末は、予め滅菌ろ過しておいたそれらの溶液から生じる。
経口投与には、組成物は、不活性希釈剤又は食用担体と共に製剤化することができる。経口治療投与のためには、活性化合物は賦形剤と共に配合され、錠剤、トローチ又はカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用され得る。経口組成物は、洗口剤として使用するために流動性担体を使用しても調製され得る。薬学的に適合性のある結合剤及び／又は補助材料が組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか又は類似した性質の化合物を含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ又はコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動化剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香味料などの香味剤。
吸入による投与には、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスが入った加圧容器若しくはディスペンサー又はネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達することができる。かかる方法には、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記載されるものが含まれる。
核酸であるか又はそれを含む治療用化合物は、ＤＮＡワクチンなど、核酸薬剤の投与に好適な任意の方法によって投与することができる。それらの方法には、遺伝子銃、バイオインジェクター及び皮膚パッチ並びに米国特許第６，１９４，３８９号明細書に開示されるマイクロパーティクルＤＮＡワクチン技術などの無針法及び米国特許第６，１６８，５８７号明細書に開示されるとおりの粉末形態のワクチンによる哺乳類経皮無針ワクチン接種が含まれる。加えて、とりわけ、Ｈａｍａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５－１０（１９９８）に記載されるとおり、鼻腔内送達が可能である。
リポソーム（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号明細書に記載されるとおり）及びマイクロカプセル化も、本明細書に記載される化合物の送達に用いることができる。生分解性マイクロパーティクル送達システムも用いることができる（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号明細書に記載されるとおり）。
一実施形態において、治療用化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化した送達システムを含め、制御放出製剤など、治療用化合物が体内から急速に排出されないように保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類及びポリ乳酸など、生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤は、標準的な技法を用いて調製するか、又は例えばＡｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販品を入手することができる。リポソーム懸濁液（細胞性抗原に対するモノクローナル抗体によって選択の細胞に標的化されたリポソームを含む）も薬学的に許容可能な担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されるとおり、当業者に公知の方法によって調製することができる。
医薬組成物は、容器、パック又はディスペンサー、例えば単回投与ディスペンサーに、投与に関する説明書と共に含まれ得る。容器、パック又はディスペンサーは、例えば、１日、１週間又は１ヵ月の治療に十分な単回投与ディスペンサーを含み得るキットの一部としても含まれ得る。
投薬量
化合物の投薬量、毒性及び治療有効性は、例えば、細胞培養物又は実験動物における、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）を決定するための標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性の副作用を呈する化合物が使用され得るが、非感染細胞が損傷する可能性を最小限に抑えるため、従って副作用を低減するため、かかる化合物を罹患組織の部位に標的化する送達システムを設計するように注意しなければならない。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータを用いて、ヒトに用いる投薬量範囲を処方することができる。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほぼ又は全くないＥＤ５０を含む循環中濃度の範囲内にある。投薬量は、採用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で様々であり得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、当初は細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養下で決定したときのＩＣ５０（即ち症状の最大値の半分の阻害を実現する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現するように処方され得る。かかる情報を用いることにより、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
「有効量」は、有益な又は所望の結果を達成するのに十分な量である。例えば、治療量とは、所望の治療効果が実現するものであり、これは、どの程度修飾が行われるかに関係し得る。この量は、疾患又は疾患症状の発生を予防するために必要な量である予防有効量と同じであるか又は異なり得る。有効量は、１回以上の投与、適用又は投薬で投与することができる。組成物の治療有効量は、選択される組成物に依存する。組成物は、１、１日１回以上～１週間に１回以上；隔日に１回からのもので投与することができる。当業者は、ある種の要因が、限定はされないが、疾患又は障害の重症度、過去の治療、対象の全般的な健康及び／又は年齢及び存在する他の疾患を含め、対象を有効に治療するのに必要な投薬量及びタイミングに影響し得ることを理解するであろう。更に、本明細書に記載される組成物の治療有効量による対象の治療には、単回治療又は一連の治療が含まれ得る。
治療方法
本発明は、種々の疾患及び障害における治療のための、本明細書に記載されるシステムの使用も企図する。局在化部分が目的の標的に結合することができるか、又は目的の標的の領域に局在化することができるため、活性化部分が標的を修飾することが可能になる。本発明は、種々の疾患及び障害における治療のための、本明細書に記載される多官能性分子の使用も企図する。例示的適用には、インスリンの小分子類似体としての使用及び細胞シグナル伝達のリワイヤリングが含まれる。Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１０，１１（６），３９３－４０３を参照されたい。細胞シグナル伝達の必要性には、用量及び時間を制御して疾患又は健康におけるキナーゼシグナル伝達経路のリワイヤリングを可能にしつつ、目的の特異的シグナル伝達タンパク質にホスホリル基を付加することによって対処し得る。本明細書における多官能性システムによれば、タンパク質の標的化した分解が可能となり得、ここで、リン酸化部位は、ユビキチンリガーゼを動員し、且つ分解のシグナルを送る標的である。Ｔｏｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｉｎｔｅｒ’ｌ ｅｄ．Ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ）２０１６，５５（６），１９６６－７３を参照されたい。同様に、タンパク質凝集を防止することは、癌治療手法における治療に役立ち得る。本明細書に記載されるとおり、凝集し易い傾向のあるタンパク質上に多官能性分子を使用して負電荷ホスホリル基を追加すると、溶解度が増加し、自己凝集が減少し得る。Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５，５７９（１７），３５７４－３５７８；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００４ ３６（２）２０７－２１６。最後に、免疫応答を引き出すためのネオリン酸化は、癌免疫療法手法において用途が見出され得る。キナソパチー（ｋｉｎａｓｏｐａｔｈｙ）の治療も企図され、概略的にはＬａｈｉｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１１を参照されたい（遺伝性キナソパチーについての表１の開示は、参照により本明細書に援用される）。標的基質の修飾を、それを必要としている対象において行う方法が提供され、この方法は、本明細書に開示されるとおりの分子を対象に投与することを含む。送達は、本明細書の他の部分に記載されるとおりであり得る。実施形態において、本明細書に記載される発明は、細胞が少なくとも１つの標的基質を修飾するように多官能性分子によってエキソビボで修飾され、続いて編集された細胞が、それを必要としている患者に投与されるという療法のための方法に関する。
実施形態において、治療は、肝疾患、眼疾患、筋疾患、心疾患、血液疾患、脳疾患、腎疾患を含めた、一臓器の疾患／障害の治療であるか、又は自己免疫疾患、中枢神経系疾患、癌及び他の増殖性疾患、神経変性障害、炎症性疾患、代謝障害、筋骨格障害などに対する治療を含み得る。
詳細な疾患／障害としては、軟骨形成不全、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、α－１アンチトリプシン欠損症、α－サラセミア、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、不整脈源性右室、異形成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、β－サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成、ファンコニー貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、β－グロビンの６番目のコドンのヘモグロビンＣ突然変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪・膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー・ウィリ症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュバックマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マジェニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル障害、フォンヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムス症候群、ウィルソン病及びウィスコット・アルドリッチ症候群が挙げられる。
実施形態において、疾患は、例えば、増殖性疾患、前癌病態、癌又は腫瘍抗原の発現に関連する非癌関連の適応疾患など、腫瘍抗原の発現に関連し、腫瘍抗原は、一部の実施形態において、Ｂ２Ｍ、ＣＤ２４７、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＤＣＫ、ＣＤ５２、ＦＫＢＰ１Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ又はＮＲ３Ｃ１、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦベータ又はＰＴＰＮ１１ ＤＣＫ、ＣＤ５２、ＮＲ３Ｃ１、ＬＩＬＲＢ１、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ－１（別名ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９及び１９Ａ２４）；Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１又はＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）又は（ＧａｌＮＡｃａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒａ２又はＣＤ２１３Ａ２）；メソテリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（テスティシン又はＰＲＳＳ２１）；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）；ステージ特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体チロシンプロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ｎキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）；インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びエーベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；グロボＨグリコセラミドの六糖部分（グロボＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレノセプターベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；癌／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）；癌／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）；メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）；ＥＴＳ転座変異体遺伝子６、染色体１２ｐに位置する（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンギオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）；メラノーマ癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；メラノーマ癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サーバイビング；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１又はガレクチン８）、Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原１（メランＡ又はＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；サルコーマ転座切断点；メラノーマアポトーシス阻害因子（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ－ｍｙｃトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽細胞腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ又は刷り込み部位の調節因子の兄弟（Ｂｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｓｉｔｅｓ））、Ｔ細胞によって認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）；後期糖化最終産物受容体（ＲＡＧＥ－１）；腎臓遍在性１（ＲＵ１）；腎臓遍在性２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０－２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲ又はＣＤ８９）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬＳ）；及び免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、Ｇ６ＰＣ、ジストロフィン、ＤＭＰＫ、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）から選択される標的を含み得る。
実施形態において、疾患は異染性白質ジストロフィーであり、且つ標的はアリールスルファターゼＡであり、疾患はヴィスコット・オールドリッチ症候群であり、且つ標的はヴィスコット・オールドリッチ症候群タンパク質であり、疾患は副腎白質ジストロフィーであり、且つ標的はＡＴＰ結合カセットＤＩであり、疾患はヒト免疫不全ウイルスであり、且つ標的は受容体５型Ｃ－Ｃケモカイン又はＣＸＣＲ４遺伝子であり、疾患はβ－サラセミアであり、且つ標的はヘモグロビンβサブユニットであり、疾患はＸ連鎖重症複合免疫不全受容体サブユニットガンマであり、且つ標的はインターロイキン－２受容体サブユニットガンマであり、疾患は多系統リソソーム蓄積症、シスチン蓄積症であり、且つ標的はシスチノシンであり、疾患はダイアモンド・ブラックファン貧血であり、且つ標的はリボソームタンパク質Ｓ１９であり、疾患はファンコニー貧血であり、且つ標的はファンコニー貧血相補群（例えば、ＦＮＡＣＡ、ＦＮＡＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ）であり、疾患はシュワックマン・ボディアン・ダイアモンド症候群であり、且つ標的はシュバックマン症候群遺伝子であり、疾患はゴーシェ病であり、且つ標的はグルコセレブロシダーゼであり、疾患は血友病Ａであり、且つ標的は、抗血友病因子又は第ＶＩＩＩ因子、クリスマス因子、セリンプロテアーゼ、血友病Ｂ第ＩＸ因子であり、疾患はアデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）であり、且つ標的はアデノシンデアミナーゼであり、疾患はＧＭ１ガングリオシドーシスであり、且つ標的はβ－ガラクトシダーゼであり、疾患はＩＩ型糖原病、ポンペ病であり、疾患は酸性マルターゼ欠損症であり、且つ標的はα－グルコシダーゼであり、疾患はニーマン・ピック病、ＳＭＰＤｌ関連（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１型又はＡ型及びＢ型）酸であり、且つ標的はスフィンゴミエリナーゼであり、疾患はクラッベ病、グロボイド細胞型白質ジストロフィーであり、且つ標的はガラクトシルセラミダーゼ又はガラクトシルセラミドリピドーシスであり、標的はガラクトセレブロシダーゼ、ヒト白血球抗原ＤＲ－１５、ＤＱ－６であり、疾患は多発性硬化症（ＭＳ）であり、ＤＲＢ１、疾患は単純ヘルペスウイルス１型又は２型である。疾患は、ＰｒｅＣ、Ｃ、Ｘ、ＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２、Ｓ、Ｐ及び／又はＳＰ遺伝子の１つ以上を標的とするＢ型肝炎であり得る。
実施形態において、免疫疾患は重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、オーメン症候群であり、一態様において標的は組換え活性化遺伝子１（ＲＡＧ１）又はインターロイキン－７受容体（ＩＬ７Ｒ）である。詳細な実施形態において、疾患はトランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、家族性アミロイド心筋症であり、一態様において、標的は、ＴＴＲ遺伝子の１つ以上の突然変異を含む、ＴＴＲ遺伝子である。実施形態において、疾患はα－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）又はα－１アンチトリプシンが関係あるとされる別の疾患、例えば、ＧｖＨＤ、移植臓器拒絶反応、糖尿病、肝疾患、ＣＯＰＤ、気腫及び嚢胞性線維症であり、詳細な実施形態において、標的はＳＥＲＰＩＮＡ１である。
実施形態において、疾患は原発性高シュウ酸尿症であり、ここで、特定の実施形態において、標的は、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）及びヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ １）の１つ以上を含む。実施形態において、疾患は、腺癌、慢性アルコール中毒、アルツハイマー病、クーリー貧血、動脈瘤、不安障害、喘息、乳房悪性新生物、皮膚悪性新生物、腎細胞癌、心血管疾患、子宮頸部悪性腫瘍、冠動脈硬化症、冠動脈心疾患、糖尿病、真性糖尿病、インスリン非依存性真性糖尿病、糖尿病性腎症、子癇、湿疹、亜急性細菌性心内膜炎、膠芽腫、ＩＩ型糖原病、感音難聴（障害）、肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ホモシスチン尿症、遺伝性感覚自律神経性ニューロパチー１型、高アルドステロン症、高コレステロール血症、高シュウ酸尿症、原発性高シュウ酸尿症、高血圧疾患、炎症性腸疾患、腎結石、腎疾患、慢性腎不全、平滑筋肉腫、代謝疾患、先天性代謝異常、僧帽弁逸脱症候群、心筋梗塞、新生物転移、ネフローゼ症候群、肥満症、卵巣疾患、歯周炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎不全、成人呼吸窮迫症候群、網膜疾患、脳血管発作、ターナー症候群、ウイルス性肝炎、歯牙喪失、早期卵巣障害、本態性高血圧症、左室肥大、片頭痛障害、皮膚黒色腫、高血圧性心疾患、慢性糸球体腎炎、前兆を伴う片頭痛、二次性高血圧、急性心筋梗塞、大動脈アテローム性硬化症、アレルギー性喘息、松果体芽細胞腫、肺悪性新生物、原発性高シュウ酸尿症Ｉ型、原発性高シュウ酸尿症２型、炎症性乳癌、子宮頸癌、再狭窄、出血性潰瘍、小児全身性糖原病、腎結石症、腎移植慢性拒絶反応、尿路結石、皮膚のチクチクする痛み、メタボリックシンドロームＸ、母体高血圧症、アテローム性頸動脈硬化症、発癌、乳癌、肺癌、ネフロン癆、微量アルブミン尿、家族性網膜芽細胞腫、収縮期心不全、虚血性脳卒中、左室収縮機能障害、馬尾傍神経節腫、肝発癌、慢性腎疾患、多形性膠芽腫、非新生物性障害、シュウ酸カルシウム腎結石症、無眼瞼・巨口症症候群、冠動脈疾患、肝癌、慢性腎疾患ステージ５、アレルギー性鼻炎（障害）、クリグラー・ナジャー症候群２型及び虚血性脳血管発作など、原発性高シュウ酸尿症１型（ｐｈ１）及び他のアラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ａｇｘｔ）遺伝子関連の病態又は障害である。特定の実施形態において、治療は肝臓に標的化される。実施形態において、遺伝子は、細胞遺伝学的位置が２ｑ３７．３のＡＧＸＴであり、ゲノム座標は、２番染色体上のフォワード鎖上の位置２４０，８６８，４７９～２４０，８８０，５０２にある。
治療は、皮膚悪性新生物、扁平上皮癌、結腸直腸新生物、クローン病、表皮水疱症、間接鼠径ヘルニア、掻痒症、統合失調症、皮膚科学的障害、遺伝性皮膚疾患、奇形腫、コケイン・トゥレーヌ病、後天性表皮水疱症、栄養障害型表皮水疱症、接合部型表皮水疱症、アロポー・ジーメンス病、水疱性皮膚疾患、脳梁欠損症、爪異栄養症、水疱性口内炎、先天性限局性皮膚欠損症及び爪変形を伴う表皮水疱症、若年性ミオクローヌスてんかん、食道扁平上皮癌、キンドラーの多形皮膚萎縮症、前脛骨表皮水疱症、優性栄養障害性表皮水疱症白色丘疹型（障害）、限局性劣性栄養障害性表皮水泡症、全身性栄養障害型表皮水疱症、皮膚扁平上皮癌、痒疹性表皮水疱症、乳房新生物、表在性単純型表皮水疱症、孤立性趾爪異栄養症、新生児一過性水疱性皮膚融解、常染色体劣性栄養障害型表皮水疱症限局性バリアント及び常染色体劣性栄養障害型表皮水疱症反対型など、ｖｉｉ型コラーゲンα１鎖（ｃｏｌ７ａ１）遺伝子関連病態又は障害も標的化することができる。
実施形態において、疾患は、ウィルムス腫瘍Ｉ（ＷＴＩ）及びＨＬＡ発現細胞を標的とする急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。実施形態において、療法は、本明細書の他の部分に記載されるとおり、ＷＴＩ特異的ＴＣＲを有する改変Ｔ細胞を含むＴ細胞療法である。特定の実施形態において、標的は、ＡＭＬにおけるＣＤ１５７である。
実施形態において、疾患は血液疾患である。特定の実施形態において、疾患は血友病であり、一態様において標的は第ＸＩ因子である。他の実施形態において、疾患は、鎌状赤血球症、鎌状赤血球形質、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＣ形質、ヘモグロビンＳ／Ｃ症、ヘモグロビンＤ症、ヘモグロビンＥ症、サラセミア、酸素親和性が増加したヘモグロビンに関連する病態、酸素親和性が低下したヘモグロビンに関連する病態、不安定ヘモグロビン症、メトヘモグロビン血症など、異常ヘモグロビン症である。止血因子並びに第Ｘ及び第ＸＩＩ因子欠損症も治療することができる。実施形態において、標的は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａ遺伝子）、ＢＣＬ１１ａエンハンサー（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａエンハンサー）若しくはＨＦＰＨ領域（例えば、ヒトＨＰＦＨ領域）、βグロブリン、胎児ヘモグロビン、γ－グロビン遺伝子（例えば、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２若しくはＨＢＧ１及びＨＢＧ２）、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球特異的エンハンサー（ＢＣＬ１１Ａｅ）又はこれらの組み合わせである。
実施形態において、標的遺伝子座は、ＲＡＣ、ＴＲＢＣｌ、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｄ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＣＤ２４７、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＤＣＫ、ＣＤ５２、ＦＫＢＰ１Ａ、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＮＲ３Ｃ１、ＣＤ２７４、ＨＡＶＣＲ２、ＬＡＧ３、ＰＤＣＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＨＣＦ２、ＰＡＩ、ＴＦＰＩ、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＧ、ＲＰＯＺ、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ２、Ｆ５、Ｆ７、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ１３Ａ１、Ｆ１３Ｂ、ＳＴＡＴ１、ＦＯＸＰ３、ＩＬ２ＲＧ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＩＣＯＳ、ＭＨＣ２ＴＡ、ＧＡＬＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＡＲＳＢ、ＲＦＸＡＰ、ＣＤ２０、ＣＤ８１、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＳＥＣ２３Ｂ、ＰＫＬＲ、ＩＦＮＧ、ＳＰＴＢ、ＳＰＴＡ、ＳＬＣ４Ａ１、ＥＰＯ、ＥＰＢ４２、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＶＦＷ、ＳＥＲＰＩＮＣＡ１、ＣＴＬＡ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３及び／又はＣＥＡＣＡＭ－５）、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ１１３）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮｌ）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ１０７）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン及びＴＧＦβ、ＰＴＰＮ１１及びこれらの組み合わせの１つ以上であり得る。実施形態において、Ｃｈｒｌ １：５，２５０，０９４～５，２５０，２３７、－鎖、ｈｇ３８；Ｃｈｒｌ ｌ：５，２５５，０２２～５，２５５，１６４、－鎖、ｈｇ３８；無欠損ＨＦＰＨ領域；Ｃｈｒｌ １：５，２４９，８３３～Ｃｈｒｌ １：５，２５０，２３７、－鎖、ｈｇ３８；Ｃｈｒｌ １：５，２５４，７３８～Ｃｈｒｌ １：５，２５５，１６４、－鎖、ｈｇ３８；Ｃｈｒｌ １：５，２４９，８３３～５，２４９，９２７、－鎖、ｈｇ３；Ｃｈｒｌ １：５，２５４，７３８～５，２５４，８５１、－鎖、ｈｇ３８；Ｃｈｒｌ １：５，２５０，１３９～５，２５０，２３７、－鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列中の標的配列である。
実施形態において、疾患は高コレステロールに関連するものであり、コレステロールの調節が提供され、一部の実施形態において、調節は、標的ＰＣＳＫ９の修飾によって達成される。ＰＣＳＫ９が関係しているとされ得る、従ってそれが本明細書に記載されるシステム及び方法の標的となり得る他の疾患としては、無βリポタンパク血症、腺腫、動脈硬化、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、胆石症、冠動脈硬化症、冠動脈心疾患、インスリン非依存性真性糖尿病、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、高インスリン症、高脂血症、家族性複合型高脂血症、低βリポ蛋白血症、慢性腎不全、肝疾患、肝新生物、黒色腫、心筋梗塞、ナルコレプシー、新生物転移、腎芽細胞腫、肥満症、腹膜炎、弾性線維性仮性黄色腫、脳血管発作、血管疾患、黄色腫症、末梢血管疾患、心筋虚血、脂質異常症、耐糖能異常、黄色腫、多遺伝子性高コレステロール血症、肝の続発性悪性新生物、認知症、過体重、Ｃ型肝炎、慢性、アテローム性頸動脈硬化症、高リポタンパク血症Ｈａ型、頭蓋内アテローム性動脈硬化症、虚血性脳卒中、急性冠症候群、大動脈石灰化、心血管の病的状態、高リポタンパク血症ｌｉｂ型、末梢動脈疾患、家族性高アルドステロン症ＩＩ型、家族性低βリポ蛋白血症、常染色体劣性高コレステロール血症、常染色体優性高コレステロール血症３型、冠動脈疾患、肝癌、虚血性脳血管発作及び動脈硬化性心血管病ＮＯＳが挙げられる。実施形態において、治療は、ＰＣＳＫ９の主要な活性場所である肝臓に標的化され得る。
実施形態において、疾患又は障害は、高ＩＧＭ症候群又はＣＤ４０シグナル伝達欠損を特徴とする障害である。特定の実施形態において、ＣＤ４０Ｌエクソンの挿入を用いると、適切なＣＤ４０シグナル伝達及びＢ細胞クラススイッチ組換えが回復する。詳細な実施形態において、標的は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である－細胞、例えばＴ細胞又は造血幹細胞（ＨＳＣ）において、ＣＤ４０Ｌ遺伝子のエクソン２～５の１つ以上が編集される。
実施形態において、疾患は、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー（ｍｄｃｍｄ）及び他のラミニンα２（ｌａｍａ２）遺伝子に関連する病態又は障害である。療法は、筋肉、例えば、骨格筋、平滑筋及び／又は心筋を標的化することができる。特定の実施形態において、標的はラミニンα２（ＬＡＭＡ２）であり、これは、ラミニン－１２サブユニットα、ラミニン－２サブユニットα、ラミニン－４サブユニットα３、メロシン重鎖、ラミニンＭ鎖、ＬＡＭＭ、先天性筋ジストロフィー及びメロシンと称されることもある。ＬＡＭＡ２は細胞遺伝学的位置が６ｑ２２．３３であり、ゲノム座標は６番染色体上のフォワード鎖上の位置１２８，８８３、１４１～１２９，５１６，５６３にある。実施形態において、治療される疾患は、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー（ＭＤＣＭＤ）、筋萎縮性側索硬化症、膀胱新生物、シャルコー・マリー・トゥース病、結腸直腸癌、拘縮、嚢胞、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、疲労、遠視、腎血管性高血圧症、黒色腫、精神遅滞、ミオパチー、筋ジストロフィー、近視、筋炎、神経筋疾患、末梢性ニューロパチー、屈折異常、統合失調症、重度精神遅滞（Ｉ．Ｑ．２０～３４）、甲状腺新生物、タバコ使用障害、重症複合免疫不全症、滑膜嚢胞、肺腺癌（障害）、腫瘍進行、皮膚イチゴ状母斑、筋変性、小歯症（障害）、ウォーカー・ワールブルク先天性筋ジストロフィー、慢性歯周炎、白質脳症、認知障害、福山型先天性筋ジストロフィー、硬化無緊張性（ｓｃｌｅｒｏａｔｏｎｉｃ）筋ジストロフィー、アイヒスフェルト（Ｅｉｃｈｓｆｅｌｄ）型先天性筋ジストロフィー、ニューロパチー、筋・眼・脳病、肢帯型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー（障害）、筋肉線維化、癌の再発、薬物耐性てんかん、呼吸不全、粘液様嚢胞、異常呼吸、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、結腸直腸癌、部分的ＬＡＭＡ２欠損による先天性筋ジストロフィー及び常染色体優性頭蓋骨幹端異形成症であり得る。
一態様において、標的は、スーパーオキシドジスムターゼ１、可溶性（ＳＯＤ１）であり、これは、この遺伝子に関連する疾患又は障害の治療に役立ち得る。詳細な実施形態において、疾患又は障害はＳＯＤ１に関連し、例えば、腺癌、アルブミン尿、慢性アルコール中毒、アルツハイマー病、健忘、アミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症、貧血症、自己免疫性溶血性貧血、鎌状赤血球貧血、無酸素症、不安障害、大動脈疾患、動脈硬化、関節リウマチ、新生児仮死、喘息、アテローム性動脈硬化症、自閉性障害、自己免疫疾患、バレット食道、ベーチェット症候群、膀胱悪性新生物、脳新生物、乳房悪性新生物、口腔カンジダ症、結腸悪性腫瘍、気管支原性癌、非小細胞肺癌、扁平上皮癌、移行上皮癌、心血管疾患、頸動脈血栓症、新生物細胞形質転換、脳梗塞、脳虚血、一過性脳虚血発作、シャルコー・マリー・トゥース病、コレラ、大腸炎、結腸直腸癌、冠動脈硬化症、冠動脈心疾患、クリプトコッカス・ネオフォルマンス感染症、聴覚消失、生命活動の停止、嚥下障害、初老期認知症、抑鬱障害、接触性皮膚炎、糖尿病、真性糖尿病、実験的真性糖尿病、インスリン依存性真性糖尿病、インスリン非依存性真性糖尿病、糖尿病性血管障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、ダウン症候群、小人症、浮腫、日本脳炎、中毒性表皮壊死症、側頭葉てんかん、発疹、筋線維束性攣縮、アルコール性脂肪肝、胎児発育遅延、線維筋痛症、線維肉腫、脆弱Ｘ症候群、ジアルジア症、膠芽腫、神経膠腫、頭痛、部分難聴、心停止、心不全、心房中隔欠損症、蠕虫病、ヘモクロマトーシス、溶血（障害）、慢性肝炎、ＨＩＶ感染症、ハンチントン病、高コレステロール血症、高血糖症、過形成、高血圧疾患、甲状腺機能亢進症、下垂体機能低下症、低タンパク血症、低血圧症、自然低体温、甲状腺機能低下症、免疫不全症候群、免疫系疾患、炎症、炎症性腸疾患、インフルエンザ、腸疾患、虚血、カーンズ・セイヤー症候群、円錐角膜、腎結石、腎疾患、急性腎不全、慢性腎不全、多発性嚢胞腎疾患、白血病、骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、肝硬変、肝疾患、肝新生物、閉じ込め症候群、慢性閉塞性気道疾患、肺新生物、全身性エリテマトーデス、非ホジキンリンパ腫、マシャド・ジョセフ病、マラリア、胃悪性新生物、動物乳房新生物、マルファン症候群、髄膜脊髄瘤、精神遅滞、僧帽弁狭窄、後天性歯のフッ素症、運動障害、多発性硬化症、筋固縮、筋痙縮、筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症、ミオパチー、真菌症、心筋梗塞、心筋再灌流傷害、壊死、ネフローゼ、ネフローゼ症候群、神経変性、神経系障害、神経痛、神経芽細胞腫、神経腫、神経筋疾患、肥満症、職業病、高眼圧症、精子減少症、変性性多発性関節炎、骨粗鬆症、卵巣癌、疼痛、膵炎、パピヨン・ルフェーブル病、不全麻痺、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、下垂体疾患、子癇前症、前立腺新生物、タンパク質欠乏症、タンパク尿、乾癬、肺線維症、腎動脈閉塞、再灌流傷害、網膜変性症、網膜疾患、網膜芽細胞腫、住血吸虫症、マンソン住血吸虫症、統合失調症、スクレイピー、発作、加齢性白内障、脊髄の圧迫、脳血管発作、くも膜下出血、進行性核上性麻痺、破傷風、トリソミー、ターナー症候群、単極性うつ病、蕁麻疹、白斑、声帯麻痺、腸捻転、体重増加、ＨＭＮ（遺伝性運動性ニューロパチー）近位Ｉ型、全前脳症、運動ニューロン疾患、神経原線維変性（形態学的異常）、灼熱感、無関心、気分変動、滑膜嚢胞、白内障、片頭痛障害、坐骨神経ニューロパチー、感覚性ニューロパチー、萎縮性皮膚病態、筋脱力、食道癌、舌・顔・頬ジスキネジア、特発性肺高血圧症、側索硬化症、前兆を伴う片頭痛、混合性難聴、鉄欠乏性貧血、栄養失調、プリオン病、ミトコンドリアミオパチー、ＭＥＬＡＳ症候群、慢性進行性外眼筋麻痺、全身麻痺、早老症候群、細動、精神科的症状、記憶障害、筋変性、神経学的症状、胃出血、膵癌、脳ピック病、肝線維症、肺悪性新生物、加齢黄斑変性症、パーキンソン病様障害、疾患進行、低銅血症、チトクロムｃ酸化酵素欠損症、本態性振戦、家族性運動ニューロン疾患、下位運動ニューロン疾患、変性性脊髄症、糖尿病性多発ニューロパチー、肝・肝内胆管癌、ペルシャ湾症候群、老人斑、萎縮性前頭側頭型認知症、意味性認知症、普通型片頭痛、認知障害、肝悪性新生物、膵悪性新生物、前立腺悪性新生物、純粋型自律神経不全症、運動症状、痙性認知症、神経変性障害、Ｃ型慢性肝炎、グアム型筋萎縮性側索硬化症、硬直肢、多系統障害、頭髪脱毛、前立腺癌、肝肺症候群、橋本病、進行性新生物疾患、乳癌、末期疾患、肺癌、遅発性ジスキネジア、リンパ節続発性悪性新生物、結腸癌、胃癌、中枢神経芽細胞腫、解離性胸部大動脈瘤、糖尿病性黄斑浮腫、微量アルブミン尿、中大脳動脈閉塞、中大脳動脈梗塞、上位運動ニューロン徴候、前頭側頭葉変性症、記憶喪失、古典的フェニルケトン尿症、ＣＡＤＡＳＩＬ症候群、神経性歩行障害、脊髄小脳失調症２型、脊髄虚血、レビー小体病、筋萎縮症、球脊髄性、２１番染色体モノソミー、血小板増加症、皮膚斑点、薬物性肝傷害、レーベル遺伝性視神経萎縮症、脳虚血、卵巣新生物、タウオパチー、大血管障害、遷延性肺高血圧症、卵巣悪性新生物、粘液様嚢胞、ドルーゼン、肉腫、体重減少、大うつ病性障害、軽度認知障害、変性障害、部分トリソミー、心血管の病的状態、聴覚障害、認知変化、尿管結石、乳房新生物、結腸直腸癌、慢性腎疾患、微小変化型ネフローゼ症候群、非新生物性障害、Ｘ連鎖球脊髄性萎縮症、マンモグラフィ濃度、所見）に対する正常眼圧緑内障感受性、白斑関連多発性自己免疫疾患感受性１（所見）、筋萎縮性側索硬化症及び／又は前頭側頭型認知症１、筋萎縮性側索硬化症１、孤発性筋萎縮性側索硬化症、単肢筋萎縮症、冠動脈疾患、変容性片頭痛、逆流、尿路上皮癌、運動障害、肝癌、タンパク質折り畳み異常、ＴＤＰ－４３タンパク質症、前骨髄球性白血病、体重増加有害事象、ミトコンドリア細胞症、特発性肺動脈高血圧症、進行性ｃＧＶＨＤ、感染症、ＧＲＮ関連前頭側頭型認知症、ミトコンドリア病変及び難聴であり得る。
詳細な実施形態において、疾患は、遺伝子ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２又はＡＴＸＮ３に関連し、これらは治療の標的となり得る。一部の実施形態において、ＡＴＸＮ１のエクソン８、ＡＴＸＮ２のエクソン１又はＡＴＸＮ３のエクソン１０に位置するＣＡＧリピート領域が標的化される。実施形態において、疾患は、脊髄小脳失調症３型（ｓｃａ３）、ｓｃａ１又はｓｃａ２及び他の関連障害、例えば、先天性異常、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、失調、毛細血管拡張運動失調症、小脳性運動失調症、小脳疾患、舞踏病、口蓋裂、嚢胞性線維症、精神の抑鬱、抑鬱障害、ジストニア、食道新生物、外斜視、心停止、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、運動障害、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、ナルコレプシー、神経変性、神経芽細胞腫、パーキンソン病、末梢性ニューロパチー、下肢静止不能症候群、網膜変性症、網膜色素変性症、統合失調症、シャイ・ドレーガー症候群、睡眠障害、遺伝性痙性対麻痺、血栓塞栓症、全身硬直症候群、脊髄小脳失調症、食道癌、多発ニューロパチー、熱の影響、筋攣縮、錐体外路徴候、失調性、神経学的症状、脳萎縮症、パーキンソン病様障害、プロテインＳ欠乏症、小脳変性症、家族性アミロイドニューロパチーポルトガル型、痙性症候群、垂直性眼振、極位眼振、アンチトロンビンＩＩＩ欠乏症、萎縮性合併遺伝性痙性対麻痺、多系統萎縮症、淡蒼球ルイ体変性症、ジストニア障害、純粋型自律神経不全症、血栓形成傾向、プロテインＣ欠乏症、先天性筋強直性ジストロフィー、運動症状、ニューロパチー、神経変性障害、食道悪性新生物、視覚障害、活性化プロテインＣ抵抗性、末期疾患、ミオキミア、中枢神経芽細胞腫、睡眠異常、四肢失調、ナルコレプシー・脱力発作症候群、マシャド・ジョセフ病Ｉ型、マシャド・ジョセフ病ＩＩ型、マシャド・ジョセフ病ＩＩＩ型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、歩行失調、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症６型（障害）、脊髄小脳失調症７型、球脊髄性筋萎縮症、ゲノム不安定性、発作性運動失調症２型（障害）、Ｘ連鎖球脊髄性萎縮症、脆弱Ｘ振戦失調症候群、活性化プロテインＣ抵抗性に起因する血栓形成傾向（障害）、筋萎縮性側索硬化症１型、神経核内封入体疾患、遺伝性アンチトロンビンＩｉｉ欠乏症及び遅発性パーキンソン病などである。
実施形態において、疾患は、腫瘍抗原の発現に関連する－癌又は非癌関連適応疾患、例えば、急性リンパ性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫である。実施形態において、標的は、ＴＥＴ２イントロン、ＴＥＴ２イントロン－エクソンジャンクション、ｃｈｒ４のゲノム領域内にある配列であり得る。
実施形態において、神経変性疾患が治療され得る。詳細な実施形態において、標的はαシヌクレイン（ＳＮＣＡ）である。特定の実施形態において、治療される障害は、先天性無痛覚、圧迫性ニューロパチー、発作性激痛症、高度房室ブロック、小径線維ニューロパチー及び家族性発作性疼痛症候群２型を含めた疼痛関連障害である。特定の実施形態において、標的は、ナトリウムチャネル、電位開口型、Ｘ型αサブユニット（ＳＣＮＩＯＡ）である。
特定の実施形態において、リソソーム蓄積症、糖原病、ムコ多糖体症又はタンパク質の分泌が疾患を改善するであろう任意の疾患の治療のためを含め、造血幹細胞及び前駆幹細胞が修飾される。一実施形態において、疾患は鎌状赤血球症（ＳＣＤ）である。別の実施形態において、疾患はβ－サラセミアである。
方法及びシステムは、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）を標的化することができる。ＤＭＰＫに関連する障害又は疾患としては、アテローム性動脈硬化症、無精子症、肥大型心筋症、セリアック病、先天性染色体疾患、真性糖尿病、巣状糸球体硬化症、ハンチントン病、性腺機能低下症、筋萎縮症、ミオパチー、筋ジストロフィー、筋強直症、筋強直性ジストロフィー、神経筋疾患、視神経萎縮、不全麻痺、統合失調症、白内障、脊髄小脳失調症、筋脱力、副腎白質ジストロフィー、中心核ミオパチー、間質性線維症、筋強直性筋ジストロフィー、異常な精神状態、Ｘ連鎖シャルコー・マリー・トゥース病１型、先天性筋強直性ジストロフィー、両側白内障（障害）、先天性筋線維タイプ不均等症、筋強直性障害、多系統障害、３－メチルグルタコン酸尿症３型、心イベント、心臓性失神、先天性構造性ミオパチー、精神遅滞、副腎脊髄ニューロパチー、筋強直性ジストロフィー２型及び知的障害が挙げられる。
実施形態において、疾患は、先天性代謝異常である。疾患は、糖質代謝の障害（糖原病、Ｇ６ＰＤ欠乏症）、アミノ酸代謝の障害（フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、グルタル酸血症１型）、尿素サイクル障害又は尿素サイクル異常症（カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ欠損症）、有機酸代謝の障害（アルカプトン尿症、２－ヒドロキシグルタル酸尿症）、脂肪酸酸化／ミトコンドリア代謝の障害（中鎖アシル－補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症）、ポルフィリン代謝の障害（急性間欠性ポルフィリン症）、プリン／ピリミジン代謝の障害（レッシュ・ナイハン症候群）、ステロイド代謝の障害（リポイド先天性副腎過形成、先天性副腎過形成）、ミトコンドリア機能の障害（カーンズ・セイヤー症候群）、ペルオキシソーム機能の障害（ツェルウェガー症候群）又はリソソーム蓄積障害（ゴーシェ病、ニーマン・ピック病）から選択され得る。
実施形態において、標的は、組換え活性化遺伝子１（ＲＡＧ１）、ＢＣＬ１１ Ａ、ＰＣＳＫ９、ラミニン、アルファ２（ｌａｍａ２）、ＡＴＸＮ３、アラニン－グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）、ｖｉｉ型コラーゲンアルファ１鎖（ＣＯＬ７ａ１）、脊髄小脳失調症１型タンパク質（ＡＴＸＮ１）、アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）、フラタキシン（ＦＸＮ）、スーパーオキシドジスムターゼ１、可溶性（ＳＯＤ１）、シヌクレイン、アルファ（ＳＮＣＡ）、ナトリウムチャネル、電位開口型、Ｘ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）、脊髄小脳失調症２型タンパク質（ＡＴＸＮ２）、筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）、１１番染色体上のベータグロビン遺伝子座、中鎖脂肪酸アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤＭ）、長鎖脂肪酸長鎖３－ヒドロキシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨＡ）、極長鎖脂肪酸アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤＶＬ）、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣＩＩＩ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、アンギオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）、電位開口型ナトリウムチャネルアルファサブユニット９（ＳＣＮ９Ａ）、インターロイキン－７受容体（ＩＬ７Ｒ）、グルコース－６－ホスファターゼ、触媒性（Ｇ６ＰＣ）、ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ｃ９ＯＲＦ７２、β－グロビン、ジストロフィン、γ－グロビンを含み得る。
特定の実施形態において、疾患又は障害はアポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣＩＩＩ）に関連し、これを編集の標的とすることができる。実施形態において、疾患又は障害は、脂質異常症、高αリポタンパク血症２型、ループス腎炎、ウィルムス腫瘍５型、病的肥満及び精子形成、緑内障、糖尿病性網膜症、関節拘縮症・腎機能障害・胆汁うっ滞症候群、認知障害、心筋梗塞に対する応答変化、グルコース不耐性、トリグリセリド生合成過程の正の調節、慢性腎機能不全、高脂血症、慢性腎不全、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ欠乏症、冠疾患、先天性甲状腺機能低下症を伴う新生児真性糖尿病、常染色体優性高コレステロール血症３型、高リポタンパク血症ＩＩＩ型、甲状腺機能亢進症、冠動脈疾患、腎動脈閉塞、メタボリックシンドロームＸ、家族性複合型高脂血症、インスリン抵抗性、一過性小児高トリグリセリド血症、糖尿病性腎症、真性糖尿病（１型）、眼球異常を伴う又は伴わないネフローゼ症候群５型及び腎症候性出血熱であり得る。
特定の実施形態において、標的はアンギオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）である。治療し得るＡＮＧＰＴＬ４に関連する疾患又は障害としては、脂質異常症、血漿トリグリセリド低値、血管新生の制御因子及び腫瘍発生を調節し、且つ増殖性糖尿病性網膜症及び非増殖性糖尿病性網膜症の両方の重症糖尿病性網膜症が挙げられ、ＡＮＧＰＴＬ４は、それに関連する。
結合するタンパク質は、キナーゼからリン酸化を誘導するため、目的のタンパク質がそのキナーゼの基質でないとしても、目的のタンパク質に結合する。このようなタンパク質の一つは、ブロモドメインタンパク質ファミリーにある。ブロモドメインは、基質タンパク質、特にヒストン中に存在するアセチル化されたリジンを特異的に認識する（約１１０アミノ酸の）構造的及び進化的に保存されているタンパク質相互作用モジュールのファミリーである。ブロモドメインは、クロマチンリモデリング、細胞シグナル伝達及び転写制御に関連する大型の多ドメイン核タンパク質の成分として存在する。公知の機能を持つブロモドメイン含有タンパク質の例としては、（ｉ）ＣＲＥＢＢＰ、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ及びＴＡＦＩＩ２５０を含めた、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）；（ｉｉ）ＡＳＨ１Ｌ及びＭＬＬなどのメチルトランスフェラーゼ；（ｉｉｉ）Ｓｗｉ２／Ｓｎｆ２などのクロマチンリモデリング複合体の成分；及び（ｉｖ）幾つもの転写調節因子が挙げられる（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．２００１，６，Ｄ１００８－１０１８、本明細書によって全体として参照により援用される）。
ブロモドメイン媒介性又はＢＥＴ媒介性、例えば、ＢＲＤ２媒介性、ＢＲＤ３媒介性、ＢＲＤ４媒介性及び／又はＢＲＤＴ媒介性などの障害又は病態は、ブロモドメイン含有タンパク質の１つ以上、例えばＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４及び／又はＢＲＤＴを含めたＢＥＴタンパク質又はその突然変異体などが役割を果たすことが公知の任意の疾患又は他の有害な病態であり得る。従って、本開示の別の実施形態は、ブロモドメイン含有タンパク質の１つ以上、例えばＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４及び／又はＢＲＤＴなどのＢＥＴタンパク質又はその突然変異体などが役割を果たすことが公知の１つ以上の疾患を治療すること又はその重症度を低下させることに関する。例えば、ブロモドメインの生物学的機能が疾患又は病態の展開及び／又は経過に影響を及ぼし、且つ／又はブロモドメインの調節が展開、経過及び／又は症状を変化させる疾患又は病態。ブロモドメイン媒介性疾患又は病態には、ブロモドメイン阻害が治療利益をもたらす疾患又は病態が含まれ、例えばここで、本明細書に記載される化合物を含めた、ブロモドメイン阻害剤による治療は、その疾患又は病態に罹患しているか又はそのリスクがある対象に治療利益をもたらす。ブロモドメインを阻害する化合物又はブロモドメイン阻害剤は、典型的には、ブロモドメインがそのコグネイトのアセチル化されたタンパク質と結合するのを阻害する化合物であり、例えば、ブロモドメイン阻害剤は、ブロモドメインがアセチル化されたリジン残基に結合するのを阻害する化合物である。
目的のタンパク質を修飾する方法も提供され、この方法は、１つ以上の活性化剤を含む環境において、目的のタンパク質を、本明細書に開示される化合物と接触させることを含む。疾患、障害又は病態の治療を、それを必要としている対象において行う方法は、本明細書に開示される分子を対象に投与することを含み得る。
多官能性コンジュゲーション分子を作製する方法であって、リンカー分子の異なる端に局在化部分及び活性化剤部分を結合することを含む方法も提供され、局在化部分及び活性化剤部分は、任意選択で、配向アダプターを介してリンカー分子に結合され、リンカー分子は、活性化剤分子及び局在化部分の両方が細胞において活性であるように、活性化剤分子を連結する。例示的方法には、例えば、図５、図５７、図５８、図７８、図８０、図８４Ｃ及び図８４Ｄに描かれるとおり、本明細書の実施例に記載するものが含まれる。
本発明は、以下の実施例において更に説明され、実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１－
小分子は、古典的には、酵素機能を阻害する（即ち機能喪失させる）ために用いられているが、近接性が媒介する効果によって酵素に新しい機能を与える幾つかの新規クラスの小分子が出現しつつある。ここで、本出願人らは、２つのキナーゼ（ＡＭＰＫ及びＰＫＣ）が、それらのキナーゼの基質でない標的タンパク質（ＢＲＤ４）をリン酸化することを可能にする本出願人らがリン酸化誘導キメラ小分子（ＰＨＩＣＳ）と称する新規クラスの分子について記載する。ＰＨＩＣＳは、これらのキナーゼの小分子活性化剤をＢＲＤ４結合剤（＋）－ＪＱ１とリンカーを用いてつなぎ合わせることによって形成し、「フック効果」、代謝回転、アイソフォーム特異性及び活性の近接性（即ちリンカー長さ）依存を含め、二官能性分子の特徴を幾つか呈した。本研究は、酵素の特異性をリワイヤリングすることによってタンパク質に翻訳後修飾を誘導する化学的二量化誘導剤の範囲を拡大する更に別の例を提供する。ＰＨＩＣＳの媒介による部位特異的な生物学的に関連性のあるリン酸化及びネオリン酸化は、基礎研究及び医薬において有用性が見出されることになると想定される。
多くのタンパク質にとってホスホリル基の付加は、その構造及び機能に著明な影響を与える。当然ながら、キナーゼ阻害によってタンパク質リン酸化を遮断する小分子は、基礎科学及び医薬において変革的影響を及ぼしている。本出願人らは、いずれか所与の目的タンパク質のリン酸化を必要に応じて誘導する小分子も無数のシナリオで有用となるであろうと仮定する。例えば、特異的且つ生物学的に関連性のあるリン酸化を誘導すると、シグナル伝達イベントを惹起することができる一方で、タンパク質のネオリン酸化がその構造に影響を与え、免疫応答を誘発し、細胞における相分離を誘導するか、又はタンパク質と他の生体分子との、特に負電荷リン酸ジエステル骨格を有するＲＮＡ／ＤＮＡとの相互作用に影響を及ぼし得る。かかるリン酸化誘導分子を設計するに際して、本出願人らは、化学的二量化誘導剤５～６及び標的タンパク質の周りのユビキチンリガーゼの有効モル濃度を増加させて、標的タンパク質がリガーゼの基質でないときにもユビキチン化を惹起するユビキチン化誘導小分子（例えば、ＰＲＯＴＡＣ）７に触発された。本明細書には、キナーゼ活性化剤を標的タンパク質の小分子結合剤とコンジュゲートすることによって形成されるリン酸化誘導キメラ小分子（ＰＨＩＣＳ）と称される新規クラスの二官能性分子について記載する。具体的には、本明細書では、ＰＨＩＣＳの誘導により、２つのキナーゼ、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）及びプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の特異性が、ＡＭＰＫ又はＰＫＣの基質でないブロモドメイン含有タンパク質４（ＢＲＤ４）のリン酸化を誘導するようにリワイヤリングされることが実証される（図１Ａ）。キナーゼ特異性はアダプタータンパク質を用いてリワイヤリングされているが８～９、これらの研究は、小分子を使用したキナーゼ特異性リワイヤリングの最初の例を提供するものと考えられる。
ＡＭＰＫ及びＰＫＣに対するＰＨＩＣＳを作成するため、本出願人らは、リンカー結合のための官能基を有する小分子キナーゼ結合剤を設計した。ＡＭＰＫについては、本出願人らは、そのアロステリックな活性化剤（１４）ＰＦ－０６４０９５７７を、シクロブチル環から合成的により適したアミノエチルハンドルに置き換えることによって修飾し（図５５Ａ）、一方、ＰＫＣについては、９－（４－アミノメチルベンジルオキシ）置換ベンゾラクタム活性化剤を使用した（１５）。キナーゼ反応によって生成されたＡＤＰの量を測定するＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイにより評価したとき（１６）、ＡＭＰＫ又はＰＫＣを活性化させるこの結合剤の能力がこれらの化学修飾によって乱されることはなかった（図５６）。次に、本出願人らは、様々な長さのリンカーでこれらの結合剤をＢＲＤ４結合剤である（＋）－ＪＱ１にコンジュゲートすることによってＰＨＩＣＳを作成した（図５７及び図５８）。ＡＭＰＫ ＰＨＩＣＳは、モジュール式のクリックケミストリーに基づく収束的合成（１７）を用いて合成し（図５７）、一方、ＰＫＣ ＰＨＩＣＳは、２つの連続するアミド化ステップを用いて構築した（図５８）。
本出願人らは、これらのＰＨＩＣＳによって誘導される三元複合体形成及びＢＲＤ４リン酸化レベルの両方を評価し（図５９及び図６０）、ＰＨＩＣＳ１及びＰＨＩＣＳ２がそれぞれＡＭＰＫ及びＰＫＣに最適であると同定した（図８Ａ及び図１１）。本出願人らは、ＢＲＤ４結合剤の不活性エナンチオマーである（－）－ＪＱ１（１８）を使用してｉＰＨＩＣＳ１及びｉＰＨＩＣＳ２を合成し、陰性対照として供した。本出願人らは、ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイを用いて、キナーゼ結合部分が変化しないまま残るとおり、ｉＰＨＩＣＳ１及びｉＰＨＩＣＳ２がなおもＡＭＰＫ及びＰＫＣを活性化させたことを確認した（図６１Ａ～図６１Ｃ）。三元複合体形成については、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ（増幅発光近接性均一アッセイ）（１９～２０）により、ＢＲＤ４及びＡＭＰＫ（α１β１γ１アイソフォーム）又はＰＫＣ（αアイソフォーム）を使用して評価した。ＰＨＩＣＳ１及びＰＨＩＣＳ２は、三元複合体平衡と一致するベル型曲線を示したが、ｉＰＨＩＣＳ１及びｉＰＨＩＣＳ２は示さず（図３９Ｂ及び図３９Ｃ）（２１）、ここで、二官能性分子が高濃度であるとき、平衡においてキナーゼ－ＰＨＩＣＳ及びＢＲＤ４－ＰＨＩＣＳ種が優勢となり、「フック効果」が引き出される（２２）。本出願人らは、ホスホ－ＡＭＰＫ－又はＰＫＣ－基質モチーフ抗体を使用して、ＰＨＩＣＳ、ＢＲＤ４及びキナーゼが存在するときに限りＢＲＤ４リン酸化があることを観察した（図２Ｃ及び図５１Ａ）（２３～２４）。ＢＲＤ４リン酸化は、タグの性質（即ちＧＳＴ対Ｈｉｓタグ）とは無関係に観察された（図６１Ｄ～図６１Ｅ）。ＢＲＤ４リン酸化レベルはまた、ＰＨＩＣＳではＡＭＰＫ依存的／ＰＫＣ依存的に増加したが、ｉＰＨＩＣＳでは増加しなかった（図６１Ｆ～図６１Ｇ）。本出願人らは、ＰＨＩＣＳ濃度の増加に伴うＢＲＤ４リン酸化におけるフック効果も観察し（図６２）、１μＭのＰＨＩＣＳ１で最も高いリン酸化レベルに達し、これは、三元－複合体形成についてのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイにおける最大シグナルの濃度に対応した（図３９Ｂ）。本出願人らは、ｐＳｅｒ４８４／４８８抗体を使用して、天然環境ではカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ２）によってリン酸化される（２５）ＢＲＤ４上の部位のＡＭＰＫによるリン酸化がＰＨＩＣＳ１によって誘導されたことを観察した（図５１Ｂ）。
次に、本出願人らは、ＰＨＩＣＳがトランケート型ＢＲＤ４（４９～４６０ａａ）にネオリン酸化を誘導できることを、質量分析を用いて確認した。ＡＭＰＫ ＰＨＩＣＳについては、統計的に有意なリン酸化部位は、Ｔ１６９、Ｔ１８６、Ｔ２２１、Ｓ３２４及びＳ３２５であった一方、ＰＫＣについてのそうした部位は、Ｔ２２９、Ｓ３２４及びＳ３３８であった（図９及び図１４）。部位Ｔ１６９、Ｔ１８６、Ｔ２２１及びＴ２２９におけるリン酸化は、これまで報告されたことがないとおり、ネオリン酸化である（２６）。ＡＭＰＫがこれらのＢＲＤ４部位のリン酸化に関して固有の優先傾向を有しないこと及びそれらの部位が未知の基質モチーフの一部でないことを確認するため、本出願人らは、これらの残基を担持するＢＲＤ４配列に由来するペプチドを試験した。ＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイでは、これらのペプチドは、リン酸化に関しての優先傾向がＡＭＰＫの天然のＡＣＣ基質－ＳＡＭＳペプチドの２５０分の１であることを示したため（図６５）（２７）、ＡＭＰＫ特異性のリワイヤリングに、ＰＨＩＣＳの誘導によるＡＭＰＫとＢＲＤ４との近接性が決定的に重要であることが更に確認された。最後に、本出願人らは、部位Ｔ１８６、Ｓ３２４及びＳ３２５が、塩基性残基が－３位にあることが好ましい（ＲＸＸｐＳ／ｐＴ）、最も好ましいＡＭＰＫコンセンサス基質認識モチーフ中にあるが、Ｔ１６９及びＴ２２１はなく、しかし、ＡＭＰＫは、このモチーフを欠くタンパク質もリン酸化できることを注記する（２８～３０）。
ＰＨＩＣＳは、可逆的結合剤をベースとして設計されたため、本出願人らは、ＰＨＩＣＳが代謝回転を呈し、各ＰＨＩＣＳ分子が複数のＢＲＤ４分子をリン酸化するであろうと仮定した。ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ並びに陰性対照としてのｉＰＨＩＣＳ１及びｉＰＨＩＣＳ２を用いると（図５１Ｃ及び図５１Ｄ、ＰＨＩＣＳ１（３２４±２２ｎＭ）及びＰＨＩＣＳ２（７４０±３１ｎＭ）の存在下におけるＡＤＰ生成計算値は、それぞれ限界ＡＭＰＫ（２０ｎＭ）又はＰＫＣ（５０ｎＭ）濃度よりも高かったことから、ＰＨＩＣＳが代謝回転を呈することが示唆される。二官能性分子の別の特徴はアイソフォーム特異性であり、これは、様々なアイソフォームに対するＰＨＩＣＳの結合親和性の差から生じるのみならず、三元複合体形成時の酵素と標的アイソフォームとの間の相互作用が本質的に異なることからも生じる（３１）。ＰＦ－０６４０９５７７によって活性化されないＡＭＰＫアイソフォーム（α１β２γ１）では（図６６）（１４）、本出願人らはＰＨＩＣＳ１によるＢＲＤ４リン酸化の誘導を観察しなかった（図５２Ａ）。加えて、ＰＨＩＣＳ２もアイソフォーム特異性を呈し、ＰＫＣαで最も高いＢＲＤ４リン酸化が起こり、ＰＫＣβＩ及びＩＩでは中程度のリン酸化が起こり、ＰＫＣγ及びδアイソフォームでは僅かなリン酸化しか起こらなかった（図５２Ｂ）（３２）。アイソフォーム特異性は、標的タンパク質ＢＲＤ（２／３／４）についても観察され、ＢＲＤ４が最も高いリン酸化レベルを示した（図２Ｈ、図３Ｅ及び図６７）。
本出願人らは、恐らくキナーゼとＢＲＤ４との局在化が異なるために（前者はほぼ細胞質ゾルにある一方、後者は主に核に存在する）、細胞におけるＰＨＩＣＳ媒介性ＢＲＤ４リン酸化を観察することができなかった。本出願人らは、幾つかの理由から、Ｂ細胞で広範に発現するタンパク質（３３～３４）であるブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）を選択した。第一に、ＢＴＫは細胞質タンパク質であり、従って細胞質ＡＭＰＫとの相互作用に利用可能である。第二に、ＢＴＫはＰＫＣと相互作用することができるが、ＡＭＰＫと相互作用することは知られていない（３５）。第三に、ＢＴＫの高品質の化学的プローブ及びそれらの共結晶構造が利用可能であり、ＢＴＫ又はＰＨＩＣＳのエンジニアリングによるＰＨＩＣＳ及び不活性対照の合理的設計が可能となる（３６）。第四に、ＢＴＫはリン酸化部位（Ｓ１８０）を持ち、これはＡＭＰＫの基質様モチーフにあるのみならず、ＢＴＫの負の調節において重要な役割を果たす（３５）。最後に、ＢＴＫはＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出不能であるため、非天然細胞環境でＰＨＩＣＳがＢＴＫリン酸化を誘導する能力を評価することが可能となる。
本出願人らは、ＡＭＰＫ結合剤を様々なリンカーで非共有結合性のイブルチニブ類似体と連結し（３７）（図６８）、８個の炭素アルキルリンカー（ＰＨＩＣＳ３、図５３Ａ）がインビトロリン酸化に最適であることを見出し（図６９）、これはホスホＢＴＫ（Ｓｅｒ１８０）抗体を用いてモニタされたものであった。細胞内部での三元複合体形成を実証するため、本出願人らはＨＥＫ２９３ＴにＢＴＫ－Ｆｌａｇをトランスフェクトし、ＰＨＩＣＳ３の存在下でのＢＴＫとのＡＭＰＫの免疫共沈降を実施した（図５３Ｂ）。更に、本出願人らは、Ｓｅｒ１８０にＰＨＩＣＳ媒介性ＢＴＫリン酸化を検出することができ（図５３Ｃ及び図７０Ａ）、及び本出願人らは、Ｓ１８０Ａ突然変異体を使用してこのリン酸化部位を検証し、ここでは、リン酸化は、検出されなかった（図５３Ｄ）。強力なＡＭＰＫ活性化剤、ＰＦ－０６４０９５７７は、単独では、４倍高い濃度であってもＰＨＩＣＳ３と同じレベルのＢＴＫリン酸化を誘導しなかったことが注記される（図７０Ｂ）。最後に、本出願人らは、ＰＨＩＣＳ誘導性Ｓ１８０リン酸化を高速の反応速度で用量依存的に制御することができた（図７０Ｃ及び図７０Ｄ）。
非天然環境での観察されたＢＴＫリン酸化がＰＨＩＣＳによって媒介されたことを確認するため、本出願人らは幾つかの化学遺伝学手法を活用した。第一に、細胞を共有結合性ＢＴＫ結合剤イブルチニブで前処理することにより、ＰＨＩＣＳ３がＢＴＫリン酸化を誘導する能力を破壊した（図５４Ａ及び図７１Ａ）。第二に、本出願人らは、ＰＨＩＣＳによるＢＴＫへの結合に関与しているとされる残基（Ｔｈｒ４７４、Ｌｙｓ４３０及びＡｓｐ５３９）を突然変異させた。特に、Ｔｈｒ４７４は、イブルチニブの４アミノ基と水素結合を形成し（図５４Ｂ）（３８）、本出願人らは、Ｔ４７４Ａ突然変異体についてＢＴＫリン酸化が激的に減少したことを観察した（図５４Ｃ）。Ｄ５３９Ｎ及びＫ４３０Ｒ突然変異によるＡＴＰ結合ポケットの変化によってもＰＨＩＣＳ３誘導性リン酸化が著しく減少した（図７１Ｂ及び図７１Ｃ）。最後に、本出願人らは、アザプリン窒素にバルク性のピバロイル（Ｐｉｖ）基を置くことにより（それがＢＴＫへの結合を立体的に妨げるはずである）、ＰＨＩＣＳ３の不活性類似体を設計した。実際に、ピバロイルを担持するＰＨＩＣＳ（Ｐｉｖ－ＰＨＩＣＳ３、図５３Ａ）は、有意なＢＴＫリン酸化を誘導することができなかった（図５４Ｄ）。まとめると、これらの研究は、ＢＴＫのＳｅｒ１８０リン酸化がＰＨＩＣＳの誘導による近接効果のために生じることを裏付けている。
本明細書では、本出願人らは、ＢＲＤ４のネオリン酸化及びシグナル伝達に関連性のあるＢＴＫリン酸化を含めた、新規リン酸化イベントを誘導するための、キメラ小分子を使用したＡＭＰＫ及びＰＫＣの両方のキナーゼのリワイヤリングに成功した。ＰＨＩＣＳは、フック効果、代謝回転、近接性（リンカー長さ）依存性、アイソフォーム特異性並びにリン酸化の用量制御及び時間制御を含め、典型的な二官能性分子の特徴を呈した。代謝回転は、ＰＨＩＣＳによるキナーゼ及び標的タンパク質への可逆的結合によって生じる可能性があり、これは、ＰＲＯＴＡＣについても観察されるものである。キナーゼ特異性は、これまでアダプタータンパク質を用いてリワイヤリングされていたが（１２～１３）、本出願人らは、それが細胞透過性且つ非免疫原性であるという理由で小分子に注目した。更に、小分子は、容易な用量及び時間制御をもたらし、高速の反応速度及び代謝回転を呈し、且つ迅速な構築を可能にする分子設計を備える。これらの研究は、セリン／スレオニンキナーゼに焦点を合わせているが、本出願人らは、チロシンキナーゼのＰＨＩＣＳ媒介性リワイヤリングについて調査中である。将来、研究では、シグナル伝達に関連性のあるリン酸化及び腫瘍に対する免疫応答を誘発する可能性のある発癌タンパク質のネオリン酸化又はＤＮＡへのその結合能力に悪影響を与える可能性のある転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（３９）（これらは、化学的にアンドラッガブルと見なされることが多い）に対するＰＨＩＣＳの媒介による負電荷の供給を誘導するように、ＰＨＩＣＳが展開されるであろう。全体的に見て、ＰＨＩＣＳは、様々な翻訳後修飾を誘導するために使用することのできるキメラ小分子のツールキットを拡大する。
材料及び方法
２．１ 材料及び一般的手順
ＡＭＰＫ α１β１γ１－Ｈｉｓタグ（Ｐ４７－１０Ｈ）、ＡＭＰＫ α１β２γ１－Ｈｉｓタグ（Ｐ５０－１０Ｈ）、ＰＫＣα－ＧＳＴ（Ｐ６１－１８Ｇ）、ＰＫＣβＩ－ＧＳＴ（Ｐ６２－１８Ｇ）、ＰＫＣβＩＩ－ＧＳＴ（Ｐ６３－１８Ｇ）、ＰＫＣγ－ＧＳＴ（Ｐ６６－１８Ｇ）、ＰＫＣδ－ＧＳＴ（Ｐ６４－１８Ｇ）、キナーゼアッセイ緩衝液ＩＩＩ ５×（Ｋ０３－０９）、ＳＡＭＳｔｉｄｅペプチド、ＨＭＲＳＡＭＳＧＬＨＬＶＫＲＲ（Ｓ０７－５８）及びＣＲＥＢｔｉｄｅペプチド、ＫＲＲＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲ（Ｃ５０－５８）は全て、ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍから購入した。ＢＲＤ４－ＧＳＴ（（ＢＤ１及びＢＤ２（４９－４６０））（３１０４４）及びＢＲＤ４－Ｈｉｓタグ（（ＢＤ１及びＢＤ２（４９－４６０））（３１０４５）、ＢＲＤ３－ＧＳＴ（（ＢＤ１及びＢＤ２（２９－４１７））（３１０３５）、ＢＲＤ２－ＧＳＴ（（ＢＤ１及びＢＤ２（６５－４５９））（３１０２４）は、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＡＤＰ－Ｇｌｏ（商標）キナーゼアッセイキット（Ｖ６９３０）は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからであった。ＯｐｔｉＰｌａｔｅ－３８４（白色不透明３８４ウェルマイクロプレート、６００７２９０）、ニッケルキレートＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（ＡＬ１０８Ｃ）及びαグルタチオンドナービーズ（６７６５３００）は全て、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入した。ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ビス－トリスタンパク質ゲル（ＮＰ０３３６又はＮＰ０３３５）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからであり、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズは、Ｑｉａｇｅｎから購入した。
化学合成について、試薬は全て購入し、商業的供給元から受領時のまま、更なる精製なしに使用した。反応は、丸底フラスコ内において、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）コートされた磁気撹拌子で撹拌しながら実施した。水分及び空気に感受性のある反応は、乾燥窒素／アルゴン雰囲気下で実施した。水分及び空気に感受性のある液体又は溶液は、窒素でフラッシュしたシリンジを用いて移動させた。必要に応じて、有機溶媒は、液体を窒素／アルゴンでバブリングすることによって脱気した。反応の進行は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び超高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＵＰＬＣ－ＭＳ）によってモニタした。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩｓｃｏコンビフラッシュＲｆシステムでシリカゲル（６０Åメッシュ、２０～４０μｍ）を使用して実施した。分析的ＴＬＣは、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０ Ｆ２５４プレコートプレート（０．２５ｍｍ）を使用して実施した；２５４ｎｍの照明によってＵＶ活性物質の可視化を可能にし、且つリンモリブデン酸（ＰＭＡ）染色を用いてＵＶ不活性物質を可視化した。ＵＰＬＣ－ＭＳは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＳＱ検出器２を備えたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＰＬＵＳシステムで実施した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、ＭＩＴ及びハーバード大学のブロード研究所（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）において、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ＨＤ ４００ＭＨｚ分光計で室温において収集した（１Ｈ ＮＭＲ、４００ＭＨｚ；１３Ｃ、１０１ＭＨｚ）。１Ｈ及び１３Ｃ化学シフトは百万分率（ｐｐｍ）単位で示され、残留溶媒シグナルを内部標準とした。ＮＭＲ溶媒は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入し、ＮＭＲデータはＣＤＣｌ３及びＤＭＳＯ－ｄ６中で入手した。１Ｈ ＮＭＲのデータは、以下のとおり報告する：ｐｐｍ単位の化学シフト値、多重度（ｓ＝一重線、ｂｒ ｓ＝幅広の一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｄｄ＝二重線の二重線及びｍ＝多重線）、積分値及びＨｚ単位の結合定数値。タンデム液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）は、３１００質量検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ２７９５分離モジュールで実施した。
２．２ 分子ドッキング
ドッキングは、Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ Ｍａｅｓｔｒｏ ｖ１１．６を使用して標準的な精密プロトコルで実施した。リガンドは、Ｅｐｉｋを使用してｐＨ７．０±２．０で可能な状態を生成し、脱塩し、ＯＰＬＳ３ｅの力場に供することにより調製した。ドッキング結果から二次元リガンド相互作用マップを生成して、リンカーの結合部位を予測した。
２．３ ＰＨＩＣＳ分子によるキナーゼ活性化を検証するＡＤＰ－Ｇｌｏキナーゼアッセイ
種々のリンカーを有するＰＨＩＣＳ分子の存在下でＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイ１を実施することにより、キナーゼ（ＡＭＰＫα１β１γ１又はＰＫＣα）を活性化するその潜在的能力を検証し、キナーゼへのその結合を確認した。９６ウェルプレート（白色、平底）において、キナーゼアッセイ緩衝液（４０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５０μＭ ＤＴＴ、１％ＤＭＳＯ）を使用してＰＨＩＣＳ（１．１、１．２、１．３、１．４及び１．５）分子の濃度系列を調製し、１５０μＭ ＡＴＰの存在下で５ｎｇのＡＭＰＫ及び０．２μｇ／μＬ ＳＡＭＳｔｉｄｅペプチドと共にインキュベートした。室温で２時間インキュベートした後、キナーゼ反応混合物にＡＤＰ－Ｇｌｏ試薬を１：１の比で加え、反応混合物を室温で更に４０分間維持した。最後に、この混合物にキナーゼ検出試薬を１：２の比で加え、室温で更に３０分間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０４プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって発光を記録した。ＡＭＰＫのない対照から生じるバックグラウンドシグナルを取り除いた後にＰＨＩＣＳ分子によるキナーゼ活性化を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ バージョン８．１．１を使用して、ＤＭＳＯ対照で正規化したデータをプロットした。
同じように、但し以下のとおり幾つかの変更を加えて、ＡＤＰ－ＧｌｏアッセイをＰＨＩＣＳ（ＰＫＣ）で実施した。９６ウェルプレート（白色、平底）において、同じキナーゼアッセイ緩衝液を用いてＰＨＩＣＳ（２．１、２．２、２．３、２．４及び２．５）の同様の濃度系列を調製し、２ｎｇのＰＫＣ、０．２μｇ／μＬ ＣＲＥＢｔｉｄｅペプチド及び５０μＭ ＡＴＰと共に室温で１時間インキュベートした後、ＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイ試薬とインキュベートした。
２．４ キナーゼとＰＨＩＣＳ分子との間の触媒的性質を判定するＡＤＰ－Ｇｌｏキナーゼアッセイ
キナーゼ、ＢＲＤ４－ＧＳＴ（ＢＤ１及びＢＤ２）及びＰＨＩＣＳ分子の混合物でＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイを実施して、ＰＨＩＣＳ（（Ｒ）－１．２又は（Ｒ）－２．３、三元複合体形成の妨害剤）と比較したＰＨＩＣＳ（１．２又は２．３、三元複合体形成の促進剤）による酵素代謝回転効率を決定した。初めに、キナーゼアッセイ緩衝液（４０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５０μＭ ＤＴＴ、１％ＤＭＳＯ）を使用して９６ウェルプレート（白色、平底）に１μＭのＰＨＩＣＳ１．２及び（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２を調製し、１５０μＭ ＡＴＰの存在下で２０ｎＭ ＡＭＰＫ及び７００ｎＭ ＢＲＤ４－ＧＳＴ（ＢＤ１及びＢＤ２）と共に室温で２時間インキュベートした。次に同じようにＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイ試薬を加え、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０４プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を記録した。ＰＨＩＣＳ１．２媒介性キナーゼ反応（２０ｎＭ ＡＭＰＫ、１μＭ ＰＨＩＣＳ１．２、７００ｎＭ ＢＲＤ４－ＧＳＴ及び１５０μＭ ＡＴＰ）から生じる実際のシグナルを、不活性対照（２０ｎＭ ＡＭＰＫ、１μＭ（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２、７００ｎＭ ＢＲＤ４－ＧＳＴ及び１５０μＭ ＡＴＰ）の発光シグナルを差し引くことによって計算した。Ｐｒｏｍｅｇａの仕様書に従ってプロットした検量線（発光（ＲＬＵ）対％ＡＴＰからＡＤＰへの変換率）によってキナーゼ反応中のＡＤＰ生成を決定した。
ＰＨＩＣＳ２．３についても同様に、同じプロトコルに従った。初めに、キナーゼアッセイ緩衝液を使用して９６ウェルプレート（白色、平底）に１μＭのＰＨＩＣＳ２．３及び（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ２．３を調製し、５０μＭ ＡＴＰの存在下で５０ｎＭ ＰＫＣ及び７００ｎＭ ＢＲＤ４－ＧＳＴ（ＢＤ１及びＢＤ２）と共に室温で１時間インキュベートした後、ＡＤＰ－Ｇｌｏ試薬を加えた。
２．５ ＢＲＤ４ペプチドリン酸化を評価するＡＤＰ－Ｇｌｏキナーゼアッセイ
ＢＲＤ４タンパク質から合成した幾つかのペプチドでＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイを実施して、これらのペプチド基質のリン酸化に関するＡＭＰＫの優先傾向を判定した。質量分光分析に基づき、以下に示すペプチド領域を選択し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入した。
Ｓ３２５＝ＧＱＲＲＥＳＳＲＰＶＫＰＰＲＲ（配列番号２）（質量分析によってリン酸化の標的と確認された）
Ｔ１６９＝ＥＬＰＴＥＥＴＥＩＭＩＶＱＲＲ（配列番号３）（質量分析によってリン酸化の標的と確認された）
Ｓ３３８＝ＫＫＤＶＰＤＳＱＱＨＰＡＰＲＲ（配列番号４）（ＢＲＤ４上のリン酸化部位候補）
Ｓ３５８＝ＥＱＬＫＣＣＳＧＩＬＫＥＭＲＲ（配列番号５）（ＢＲＤ４上のリン酸化部位候補）
１５０μＭ ＡＴＰの存在下で０．２μｇ／μＬの各ペプチドを２０ｎＭ ＡＭＰＫと共に室温で２時間インキュベートした後、ＡＤＰ－Ｇｌｏ試薬を加えることにより、キナーゼ反応を同じように実施した。０．２μｇ／μＬ ＳＡＭＳｔｉｄｅペプチド及び２０ｎＭ ＡＭＰＫでのＡＤＰ－Ｇｌｏキナーゼアッセイを陽性対照として使用し、各ＢＲＤ４ペプチドから生成された発光シグナルをこの陽性対照と比較することにより、これらのＢＲＤ４ペプチドのリン酸化に対するＡＭＰＫの優先傾向を決定した。
２．６ ＰＨＩＣＳ誘導性タンパク質二量化を決定するＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ２を実施して、キナーゼ（ＡＭＰＫ又はＰＫＣ）：ＰＨＩＣＳ分子：ＢＲＤ４（ＢＤ１及びＢＤ２）の間のＰＨＩＣＳ誘導性三元複合体形成を検証した。初めに、最終混合物中１％ＤＭＳＯとして希釈アッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡ、０．０１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０）を使用して白色不透明３８４ウェルマイクロプレートに、種々のリンカーを有するＰＨＩＣＳ（１．１、１．２、１．３、１．４及び１．５）又はＤＭＳＯを伴う（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２対照の濃度系列を調製した。次にこの混合物に７ｎＭ ＡＭＰＫ（６×Ｈｉｓタグ）及び６７ｎＭ ＢＲＤ４－ＧＳＴを加え、室温で１時間インキュベートした。次に、この混合物にニッケルキレートＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）及びグルタチオンドナービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を２０μｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。室温で１時間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０４プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光を記録した。ＤＭＳＯ対照又はタンパク質のないウェルからのバックグラウンドシグナルを取り除いた後、正規化後の発光値を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ バージョン８．１．１を使用してデータを分析し、プロットした。同じようにＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを実施して、ＡＭＰＫ：ＰＨＩＣＳ１．２：ＢＲＤ３（ＢＤ１及びＢＤ２）又はＢＲＤ２（ＢＤ１及びＢＤ２）の間の三元複合体形成も決定した。初めに、希釈緩衝液を使用してＰＨＩＣＳ１．２の濃度系列を調製し、７ｎＭ ＡＭＰＫ及び６７ｎＭ ＢＲＤ３－ＧＳＴ又はＢＲＤ２－ＧＳＴと共に室温で１時間インキュベートした後、アクセプター及びドナービーズを加えた。
同様の手法に従い、ＰＫＣ：ＰＨＩＣＳ２：ＢＲＤ４－ＧＳＴ（ＢＤ１及びＢＤ２）の間のＰＨＩＣＳ２誘導性三元複合体形成を決定した。初めに、最終混合物中１％ＤＭＳＯとして希釈アッセイ緩衝液を使用して白色不透明３８４ウェルマイクロプレートに、種々のリンカーを有するＰＨＩＣＳ（２．１、２．２、２．３、２．４及び２．５）及びＤＭＳＯ対照を伴う（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ２．３の濃度系列を調製した。次にこの混合物に１０ｎＭ ＰＫＣ－ＧＳＴ及び１００ｎＭ ＢＲＤ４（６×Ｈｉｓタグ）を加え、室温でインキュベートした。１時間インキュベートした後、この系にアクセプタービーズ及びドナービーズを加えた。
２．７ 三元複合体形成を決定するプルダウンアッセイ
ＰＨＩＣＳ１．２によるＡＭＰＫとＢＲＤ４との間の相互作用をインビトロプルダウンアッセイにより決定した。結合緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡ、０．０１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０、１０ｍＭイミダゾール）中４℃でインキュベートすることにより、Ｈｉｓタグ付加ＡＭＰＫ（７０ｎＭ）をＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズに固定化した。１時間後、ビーズを２回洗浄し、ＢＲＤ４－ＧＳＴ（３００ｎＭ）及びＰＨＩＣＳ１．２又は（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２（１μＭ）と共に４℃で４時間インキュベートした。次にビーズを徹底的に洗浄し、ＳＤＳローディング緩衝液と混合し、９５℃で５分間加熱した。ＡＭＰＫ－αに対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号５８３２）及びＢＲＤ４（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号６６４４）でウエスタンブロット分析を実施した。
２．８ ＢＲＤ４リン酸化を確認するイムノブロッティング分析
近接性によって駆動されるＢＲＤ４上のＳｅｒ／Ｔｈｒにおけるリン酸化がＰＨＩＣＳによって誘導されることを、ホスホ－（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）キナーゼ基質抗体を使用したウエスタンブロッティングによって確認した。初めに、１％ＤＭＳＯとして１×キナーゼアッセイ緩衝液を使用して１０μＭ、５μＭ及び１μＭ濃度の種々のリンカーを有するＰＨＩＣＳ１（１．１、１．２、１．３、１．４及び１．５）、（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２及びＤＭＳＯ対照を調製した。次に、２０ｎＭ ＡＭＰＫ、７００ｎＭ ＢＲＤ４－ＧＳＴ及び１５０μＭ ＡＴＰの存在下でキナーゼ反応を室温で２時間実施した。別の実験では、希釈濃度のＰＨＩＣＳ１．２でキナーゼ反応を同じように実施した。ＢＲＤ４－ＧＳＴに加えて、同じキナーゼ反応をＰＨＩＣＳ１．２の存在下又は非存在下で７００ｎＭ ＢＲＤ３－ＧＳＴ（ＢＤ１及びＢＤ２）及び７００ｎＭ ＢＲＤ３－ＧＳＴ（ＢＤ１及びＢＤ２）で実施した。ＰＨＩＣＳ誘導性リン酸化にＢＲＤ４上のＧＳＴタグが重要であるかどうかをＢＲＤ４－（６×Ｈｉｓタグ）（ＢＤ１及びＢＤ２）（７００ｎＭ）バージョンで同じキナーゼアッセイに従って検証した。２時間インキュベートした後、ＳＤＳローディング緩衝液を加えることによってキナーゼ反応をクエンチした。タンパク質をＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ビストリスタンパク質ゲルによって分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。次に膜をブロッキング緩衝液（０．１％ｔｗｅｅｎ ２０及び５％ＢＳＡ含有ＴＢＳ）中において室温で１時間インキュベートした。その後、ＢＲＤ４上のＳｅｒ／Ｔｈｒにおけるリン酸化を検出するためホスホ－ＡＭＰＫ基質モチーフ［ＬＸＲＸＸ（ｐＳ／ｐＴ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号５７５９）（１：１０００）一次抗体と共に、且つ負荷レベルを検出するため抗ＢＲＤ４一次抗体（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号６６４４）（１：１０００）と共に膜をインキュベートした。４℃で一晩インキュベートした後、膜をＴＢＳＴ緩衝液（０．１％ｔｗｅｅｎ ２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄した。ＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した後、適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体（ウサギ／マウス、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７０７４／７０７６）での化学発光（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃ６００イメージャー）によるか、又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ／ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤ二次抗体（ウサギ／マウス、ＬＩ－ＣＯＲ、カタログ番号９２６－３２２１１／９２６－６８０７０）でのＮＩＲ蛍光（ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージャー）によるかのいずれかでタンパク質バンドを可視化した。
ＰＫＣによるＢＲＤ４上のＰＨＩＣＳ誘導性リン酸化も同様の条件を用いて検証した。１μＭ ＰＨＩＣＳ（２．１、２．２、２．３、２．４、２．５及び（Ｒ）－２．３）、５０ｎＭ ＰＫＣ、７００ｎＭ ＢＲＤ４－ＧＳＴ及び５０μＭ ＡＴＰを使用してキナーゼ反応を室温で１時間実施した後、ＳＤＳローディング緩衝液でクエンチした。ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ビストリスタンパク質ゲルでタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜をブロッキング緩衝液とインキュベートした後、膜にホスホ－ＰＫＣ基質モチーフ［（Ｒ／Ｋ）ＸｐＳＸ（Ｒ／Ｋ）］（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号６９６７）（１：１０００）一次抗体を加え、４℃で一晩更にインキュベートした。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ／ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤ二次抗体を使用してタンパク質バンドを可視化した。
同様の手法に従い、種々のＡＭＰＫ及びＰＫＣアイソフォームのＢＲＤ４のリン酸化並びに種々のＢＲＤタンパク質のリン酸化を決定した。
２．９ ＢＲＤ４におけるリン酸化した部位を同定する質量分光分析
ＡＭＰＫ、ＢＲＤ４及びＰＨＩＣＳの存在下でキナーゼ反応を実施し、質量分析研究を実施することにより、近接性によって駆動されたＢＲＤ４上のリン酸化部位を決定した。初めに、１μＭ ＰＨＩＣＳ１．２又は（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２の存在下で２０ｎＭ ＡＭＰＫと７００ｎＭ ＢＲＤ４－ＧＳＴ（ＢＤ１及びＢＤ２）を使用してキナーゼ反応を同じように実施した。２時間インキュベートした後、６×ローディング色素を加えることによって反応をクエンチした。ＰＨＩＣＳ１．２、（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２及びＤＭＳＯ対照との各反応混合物中のタンパク質をＮｕＰＡＧＥ ４～１２％ビストリスタンパク質ゲルによって分離し、トリプシン又はエラスターゼでの消化後にＢＲＤ４－ＧＳＴを含むゲル切片をＨａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＴａｐｌｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙに提出してリン酸化部位を決定した。
２．１０ ＰＨＩＣＳ１類似体の合成
（＋）－ＪＱ１ ＰＡはＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓから購入し、不活性類似体である（－）－ＪＱ１ ＰＡは、文献に従って合成した３。化合物５～９は、購入するか、又は前駆体アジド酸及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドとのアミドカップリングで合成し、水で洗浄し、次に更なる精製なしに次のステップに使用するかのいずれかであった４。
Figure 2023509752000075
 ５－ブロモ－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸メチル（１）
文献の手順に従い、５－ブロモ－６－クロロ－１Ｈ－インドール（２．２２ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのＤＭＦに溶解し、氷浴中で０℃に冷却した。この溶液にトリフルオロ酢酸無水物（５．４ｍＬ、３８．５ｍｍｏｌ）を撹拌しながらゆっくりと加えた。１時間後、反応を飽和Ｎａ２ＣＯ３（ａｑ）でクエンチし、黄褐色の沈殿物をろ過し、収集した。この粗沈殿物を３Ｍ ＮａＯＨ（ａｑ）で直接処理し、一晩還流すると、カルボン酸が形成された。次に、反応物を１～２のｐＨに酸性化し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、減圧下で蒸発乾固させた。この粗固体を５０ｍＬ ＭｅＯＨ及び１ｍＬの濃Ｈ２ＳＯ４中で還流して、メチルエステルを、赤みを帯びた固体として得た（２．００ｇ、７２％収率）。
データは文献報告と一致する。
Figure 2023509752000076
 Ｎ－Ｂｏｃ－（（４－アミノエトキシ）フェニル）ボロン酸ピナコールエステル（２）
文献の手順に従い、４－ヒドロキシフェニルボロン酸（２．００ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）、２－（Ｂｏｃ－アミノ）エチルブロミド（２．０４ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）及びオーブン乾燥させたＫ２ＣＯ３（３．７７ｇ、２７．２６ｍｍｏｌ）を４０ｍＬ ＤＭＦに加え、得られた懸濁液を６０℃で一晩加熱した。次に、この反応混合物に水を加え、水層をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出した。Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、減圧下で濃縮した後、この粗油をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（４：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、無色の油を得た（３．０４ｇ、９２％収率）。データは文献報告と一致する５。
Figure 2023509752000077
 ５－（４－（２－（（Ｎ－Ｂｏｃ）アミノ）エトキシ）フェニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸メチル（３）
５－ブロモ－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸メチル（０．９７ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）及びＮ－Ｂｏｃ－（（４－アミノエトキシ）フェニル）ボロン酸ピナコールエステル（１．２２ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）を６７ｍＬトルエンに懸濁した。炭酸カリウム（３．０２ｇ、２１．８５ｍｍｏｌ）を３３ｍＬ脱イオン水に溶解し、トルエン混合物に加え、次にＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２・ＤＣＭ（０．２４７ｇ、０．３０３ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を速やかに脱気し、次に２時間還流した。次に、反応物を減圧下で濃縮し、酢酸エチルに再溶解させて、セライトパッドでろ過し、水及びブラインで洗浄し、次にＮａ２ＳＯ４で乾燥させて、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、白色の固体を得た（１．４０ｇ、９４％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １２．０５（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｓ，１Ｈ），７．６４（ｓ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），４．０３（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ）１．４０（ｓ，９Ｈ）．
Figure 2023509752000078
 ５－（４－（２－アミノエトキシ）フェニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸（４）
５－（４－（２－（（Ｎ－Ｂｏｃ）アミノ）エトキシ）フェニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－カルボン酸メチル（１．４０ｇ、３．１７ｍｍｏｌ）を初めに３当量の１Ｍ ＮａＯＨで処理することによって対応するカルボン酸に加水分解し、１：１：１のＴＨＦ：ＭｅＯＨ：水の溶液として１００℃で２時間マイクロ波処理した。次に、溶液を減圧下で濃縮し、水層をｐＨ＝３～４に酸性化し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて、ろ過し、濃縮すると、白色の残渣となり、これを更なる精製なしに次のステップに送った。０℃で２５ｍＬ ＤＣＭ中に溶解させた白色の固体に、ＴＦＡ（８ｍＬ）をＤＣＭ中５０％溶液としてゆっくりと加えた。反応物を室温で２時間撹拌し、次に減圧下で濃縮して、赤紫色の油を得た。この油をエーテルの複数の２０ｍＬアリコートで処理し、蒸発させ、高真空下で乾燥させて、赤みを帯びた黄褐色の固体を得た（０．９４ｇ、９０％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．９９（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｓ，１Ｈ），７．６３（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），４．２２（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），３．２６（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １６５．６，１５７．１，１３６．０，１３３．９，１３３．１，１３２．７，１３０．９，１２５．８，１２５．３，１２２．７，１１４．２，１１２．９，１０７．６，６４．５．
Figure 2023509752000079
 ５－（４－（２－アミノエトキシ）フェニル）－６－クロロ－１Ｈ－インドール－３－アシルアジド類（１０－１４）
以下の一般的方法を用いて様々なリンカー長さのアジドを調製した：ＤＭＦ（０．１Ｍ）中の４の溶液（０．２０ｍｍｏｌ、０．９ｍｍｏｌ）に化合物５～９（０．２２ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。窒素下でＤＩＰＥＡを加え（２当量）、溶液を窒素下に室温で２時間撹拌し、次に減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１：１０のＭｅＯＨ：ＤＣＭ）によって精製して、１０～１４を白色の粉末として得た。
Figure 2023509752000080
 ＰＨＩＣＳ１．１～１．５
以下の一般的方法を用いて様々なリンカー長さのＡＭＰＫ ＰＨＩＣＳ問題を調製した：化合物１０～１４（０．０３７ｍｍｏｌ、１当量）、（＋）又は（－）－ＪＱ１－ＰＡ（０．０４１ｍｍｏｌ、１．１当量）をＴＨＦ（０．０５Ｍ）に溶解した。この溶液に、０．５Ｍ ＣｕＳＯ４（０．２当量）、０．５Ｍアスコルビン酸ナトリウム（０．２当量）及び０．５Ｍ ＴＢＴＡ（０．２当量）を加えた。完了後（５分～１時間）、溶液が褐色から青色に変わり、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１：１０のＭｅＯＨ：ＤＣＭ）又はＨＰＬＣによって直接精製して、ＰＨＩＣＳ１．１（ｎ＝３）、ＰＨＩＣＳ１．２（ｎ＝５）、ＰＨＩＣＳ１．３（ｎ＝７）、ＰＨＩＣＳ１．４（ｎ＝９）、ＰＨＩＣＳ１．５（ｎ＝１１）及び（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２（ｎ＝５、不活性（－）－ＪＱ１を含む）を淡いベージュ色の固体として得た。
ＰＨＩＣＳ１．１：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．９３（ｂｒ），１１．４２（ｓ），８．７１（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０７（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，２Ｈ），７．６２（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），４．５３（ｍ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．３８－４．３２（ｍ，４Ｈ），４．０５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），３．４７（ｑ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），２．１５（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．０５（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．６２（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １７１．３，１６９．５，１６５．６，１６３．０，１５７．６，１５５．０，１４９．８，１４４．９，１３６．７，１３５．９，１３５．２，１３３．８，１３３．７，１３２．８，１３２．５，１３２．２，１３０．８，１３０．６，１３０．２，１２９．９，１２９．５，１２８．４，１２５．８，１２５．２，１２２．８，１２２．７，１１４．０，１１２．８，６６．３，５３．９，４８．９，３８．３，３７．５，３１．９，２５．９，１４．０，１２．７，１１．３．
ＰＨＩＣＳ１．２：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １２．１９－１２．００（ｂｒ，１Ｈ），１１．９２（ｓ，１Ｈ），８．７１（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｓ，２Ｈ），７．９３（ｓ，２Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），４．５２（ｍ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．３５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），４．２８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０６－４．００（ｍ，２Ｈ），３．４４（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２７（ｄｄ，２Ｈ），２．５９（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．７８（ｐ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６１（ｓ，３Ｈ），１．５２（ｐ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．２９－１．１８（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １７２．３，１６９．５，１６５．６，１６３．０，１５７．６，１５５．１，１４９．８，１４４．９，１３６．７，１３５．９，１３５．２，１３３．７，１３３．７，１３２．７，１３２．５，１３２．３，１３０．８，１３０．７，１３０．２，１２９．８，１２９．５，１２８．４，１２５．８，１２５．３，１２２．７，１２２．７，１１４．０，１１２．８，６６．４，５３．９，４９．１，３８．２，３７．５，３５．０，３４．３，２９．５，２５．５，２４．６，１４．０，１２．７，１１．３．
（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ１．２：ＮＭＲデータはＰＨＩＣＳ１．２と一致する。
ＰＨＩＣＳ１．３：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．９３（ｓ，１Ｈ），８．７２（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｓ，２Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄｄ，Ｊ＝８．６，１．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４１－７．３１（ｍ，４Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），４．５２（ｍ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），４．２７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），３．４４（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．２９－３．２２（ｍ，２Ｈ），２．５９（ｓ，３Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．６１（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．２５－１．１８（ｂｒ，８Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １７２．５，１６９．６，１６５．６，１６３．０，１５７．６，１５５．１，１４９．８，１４４．９，１３６．７，１３５．９，１３５．２，１３３．８，１３３．８，１３２．８，１３２．５，１３２．３，１３０．８，１３０．７，１３０．２，１２９．８，１２９．５，１２８．４，１２５．８，１２５．３，１２２．７，１２２．７，１１４．０，１１２．９，６６．４，５３．９，５０．６，４９．２，３８．２，３７．５，３５．２，３４．３，２９．７，２８．４，２８．１，２５．７，１４．１，１２．７，１１．３．
ＰＨＩＣＳ１．４：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．９２（ｓ，１Ｈ），８．７２（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，８．４Ｈｚ，４Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），４．５２（ｍ，Ｊ＝８．１，６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），４．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．４４（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２８－３．２０（ｍ，２Ｈ），２．５９（ｓ，３Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），２．１０－２．０６（ｍ，２Ｈ），１．６１（ｓ，３Ｈ），１．５１－１．４６（ｍ，２Ｈ），１．２１（ｓ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １７２．７，１６９．６，１６５．６，１６３．０，１５７．６，１５５．１，１４９．８，１４４．９，１３６．７，１３５．９，１３５．２，１３３．８，１３３．７，１３２．８，１３２．５，１３２．３，１３０．７，１３０．７，１３０．２，１２９．８，１２９．５，１２８．４，１２５．８，１２５．２，１２２．７，１１４．０，１１２．８，１０７．６，６６．４，５３．９，４９．３，３８．２，３７．５，３５．３，３４．３，２９．７，２８．７，２８．６，２８．４，２５．８，２５．２，２５．１，１４．１，１２．７，１１．３．
ＰＨＩＣＳ１．５：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ １１．９２（ｓ，１Ｈ），８．７２（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，８．４Ｈｚ，４Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），４．５２（ｍ，Ｊ＝８．１，６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），４．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０３（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．４４（ｑ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．２８－３．２０（ｍ，２Ｈ），２．５９（ｓ，３Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），２．１０－２．０６（ｍ，２Ｈ），１．６１（ｓ，３Ｈ），１．５１－１．４６（ｍ，２Ｈ），１．２１（ｓ，１２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ １７２．９５，１７０．０３，１６３．４８，１５８．１２，１３７．１７，１３６．３８，１３５．６６，１３４．３２，１３３．２４，１３２．９４，１３２．７７，１３１．２１，１３１．１４，１３０．６５，１３０．２８，１２９．９９，１２８．８７，１２６．２７，１２５．７０，１２３．１４，１１４．５０，１１３．３３，６６．９０，５４．３８，４９．７３，３８．６８，３８．０１，３５．７８，３４．７５，３０．２１，２９．３９，２９．３６，２９．３０，２９．２７，２９．１０，２８．８６，２６．３４，２５．７３，１４．５２，１３．１３，１１．７８．
２．１１ ＰＨＩＣＳ２類似体の合成
（Ｓ）－（１－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシ－２－ニトロフェニル）プロパン－２－イル）カルバミン酸メチル（２０）を報告される手順に従って合成した６。
Figure 2023509752000081
 （Ｓ）－（１－（４－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）ベンジル）オキシ）－２－ニトロフェニル）－３－ヒドロキシプロパン－２－イル）カルバミン酸メチル（２１）の合成
３３ｍＬのＤＭＦ中の２０（１．２ｇ、４．４ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（１．２ｇ、８．７ｍｍｏｌ）の溶液に、３ｍＬ ＤＭＦ中の（４－（ブロモメチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１．４ｇ、４．７ｍｍｏｌ）を滴下する方式で加えた。この反応混合物を５０℃で一晩加熱し、反応の進行をＬＣＭＳによってモニタした。出発材料ＶＳ－３のシグナルが消えたところで、溶媒を減圧下で除去した。固体残渣を２２０ｍＬの酢酸エチルと４０ｍＬの水との間に分配した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、減圧下で濃縮した。この粗生成物をカラムクロマトグラフィー（溶離液としての２０：８０酢酸エチル／石油エーテルから５０：５０／石油エーテルに至るグラジエント）によって精製して１．５ｇ（７０％）の所望の生成物を黄色の固体として提供し、これが入手された。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ７．５０（ｓ，１Ｈ），７．３８－７．３６（ｍ，２Ｈ），７．３１－７．２９（ｍ，２Ｈ），７．１５－７．１２（ｍ，１Ｈ），５．３２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），４．９２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．３１（ｓ，２Ｈ），３．９６（ｓ，１Ｈ），３．７３－３．６２（ｍ，２Ｈ），３．５７（ｓ，３Ｈ），３．１４－３．１１（ｍ，１Ｈ），２．９９－２．９５（ｍ，１Ｈ），２．３９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１．４５ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １５７．８，１５７．２，１５６．１，１５０．２，１３９．４，１３４．９，１３３，７，１２８．０，１２７．９，１２５．５，１２０．７，１１０．６，７９．８１，７０．４３，６４．５８，５４．３２，５２．３１，３３．４６，２８．５２ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＝５１２．
Figure 2023509752000082
 （５－（（４－（（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）ベンジル）オキシ）－２－（（Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－（（メトキシカルボニル）アミノ）プロピル）フェニル）－Ｄ－バリン酸ベンジル（２２）の合成
ステップ１．ＭｅＯＨ（５２ｍＬ）中の２１（１．５ｇ、３．１ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸銅（ＩＩ）の飽和溶液（１７ｍＬ）を加えた。得られた溶液を氷水で冷却しながらＮａＢＨ４（１．８ｇ、４７．４ｍｍｏｌ）を１時間かけて少量ずつ加えた。反応の進行をＬＣＭＳでモニタした（反応が完了に達しない場合、更に多くのＮａＢＨ４を加えなければならない）。ニトロ基が完全に還元されたところで、反応混合物をショートシリカゲルカラムに通過させた。ろ液を減圧下で濃縮し、固体残渣を１８０ｍＬ ＥｔＯＡｃと３５ｍＬの水との間に分配した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濃縮することにより粗アニリンを提供し、これを追加の精製なしに次のステップに使用した。
ステップ２：前のステップからの生成物に、（Ｒ）－３－メチル－２－ヒドロキシブタン酸ベンジルから入手した１．１ｇのトリフレートを加えた。混合物を脱気し、３５ｍＬのジクロロメタンに溶解させて窒素雰囲気下で加え、６００μＬの２，６－ルチジンによって処理し、７０℃で撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳでモニタし、出発材料が完全に消費されたところで（約７２時間）、溶媒を減圧下で除去し、粗混合物をＬＣＭＳ（溶離液として２０：８０酢酸エチル／石油エーテルから７０：３０酢酸エチル／石油エーテルに至るグラジエント）で精製した。白色の固体として９７０ｍｇ（４８％）の所望の生成物が入手された。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ７．３２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２６－７．２３（ｍ，７Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．２２（ｓ，１Ｈ），５．３４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），４．９０－４．８３（ｍ，３Ｈ），４．２９（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．８５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ），３．５２（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４４（ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，１Ｈ），２．８２－２．７８（ｍ，１Ｈ），２．７２－２．６６（ｍ，１Ｈ），２．１５－２．１０（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．９８ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １７４．７，１５９．０，１５７．０，１５６．０，１４６．４，１３８．７，１３６．５，１３５．４，１３２．１，１２８．７，１２８．６，１２７．９，１２７．８，１１６．２，１０３．９，９９．２，７９．７，６９．７，６７．１，６２．６，６１．８，５３．４，５２．２，４４．６，３１．７，２８．５，１９．４，１９．２ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝６５１．
Figure 2023509752000083
 （４－（（（（２Ｓ，５Ｓ）－５－（ヒドロキシメチル）－２－イソプロピル－３－オキソ－１，２，３，４，５，６－ヘキサヒドロベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゾシン－９－イル）オキシ）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２３）の合成
混合物２２（２２０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、５．８ｍＬのメタノール及び２．９ｍＬの２Ｎ ＫＯＨ（水溶液）を７０℃で一晩加熱した。反応の進行をＬＣＭＳでモニタした。反応が完了した後、混合物を室温に冷却し、２Ｎ ＨＣｌでｐＨ７に中和し、次に減圧下で濃縮した。残渣の固体を真空中で１日乾燥させた後、それを３４ｍＬのＤＭＦに溶解した。この溶液に、０℃でトリエチルアミン（１０２μＬ）及びＤＰＰＡ（９０μＬ）を加えた。撹拌を０℃で１時間及び室温で１７時間継続した後、ＤＭＦを減圧下で蒸発させた。残渣を２００ｍＬの酢酸エチルと３５ｍＬの水との間に分配した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離液として２０：８０酢酸エチル／石油エーテルから７０：３０酢酸エチル／石油エーテルに至るグラジエント）で精製した。黄色の油として１２０ｍｇ（７４％）の所望の生成物が入手された。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ７．３４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２９－７．２６（ｍ，３Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７５－６．７２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．４６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．４２（ｓ，１Ｈ），５．０１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．９３（ｓ，２Ｈ），４．３０（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７０－３．６６（ｍ，１Ｈ），３．６２－３．５９（ｍ，１Ｈ），３．１４－３．０７（ｍ，１Ｈ），２．８０－２．７６（ｍ，１Ｈ），２．１４－２．０２（ｍ，１Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ），１．０９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），０．９６ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；δ １３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１７５．３，１５８．４，１５６．１，１４７．７，１３８．８，１３６．２，１３２．８，１２７．８，１２７．７，１１８．４，１０８．１，１０６．７，７９．６，６９．６，６６．８，６６．０，５５．４６，４４．４，３５．４，３０．５，２８．５，２０．３及び１９．２ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝４８５．
Figure 2023509752000084
 （４－（（（（２Ｓ，５Ｓ）－５－（ヒドロキシメチル）－２－イソプロピル－１－メチル－３－オキソ－１，２，３，４，５，６－ヘキサヒドロベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゾシン－９－イル）オキシ）メチル）ベンジル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２４）の合成
５ｍＬのＣＨ３ＣＮ中の２３（１２０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でホルムアルデヒド（０．２ｍＬ、水中３７％ｗｔ）、ＮａＣＮＢＨ３（４７ｍｇ）及びＨＯＡｃ（２５μＭ）を順次加えた。反応の進行をＬＣＭＳでモニタし、出発材料のシグナルが消えたところで、反応物を５０ｍＬの酢酸エチルと１０ｍＬの水とに分配した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶離液として１０：９０酢酸エチル／石油エーテルから４０：６０酢酸エチル／石油エーテルに至るグラジエント）で精製して、１００ｍｇ（８０％）の所望の生成物を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ７．３９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝８．４＆２．８Ｈｚ，１Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），４．８８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．３１（ｓ，２Ｈ），３．９１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．６９（ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ＆７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５２－３．４６（ｍ，２Ｈ），３．０３（ｄｄ，Ｊ＝１６．８＆８．０Ｈｚ，１Ｈ），２．７５（ｓ，３Ｈ），２．４５－２．３６（ｍ，１Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．０４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８５ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ １７４．０，１５８．７，１５６．１８，１５６．１５，１５２．９，１３９．０，１３６．４，１３２．６，１２８．１，１２７．９，１２３．７，１０７．３，１０７．１，７９．９，７０．１，６６．１，５４．６，５４．５，３６．９，３５．３，２８．７，２８．５，２０．７及び２０．１ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＝５２１．
Figure 2023509752000085
 （４－（（（（２Ｓ，５Ｓ）－５－（ヒドロキシメチル）－２－イソプロピル－１－メチル－３－オキソ－１，２，３，４，５，６－ヘキサヒドロベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゾシン－９－イル）オキシ）メチル）フェニル）メタンアミニウムトリフルオロ酢酸塩（２５）の合成
ＤＣＭ（３００μＬ）中のＶＳ－４３（１２ｍｇ、２４．０μｍｏｌ）の氷冷溶液に３００μＬトリフルオロ酢酸を加え、反応物を室温になるまで加温させておき、３０分間撹拌した。反応混合物を濃縮することにより１２．２ｍｇ（９９％）の粗ＶＳ－３５を得て、これを次のステップにそのまま使用した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ７．５２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７５（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），６．５９（ｄｄ，Ｊ＝８．４＆２．６Ｈｚ，１Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），４．１１（ｓ，２Ｈ），３．５９（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ＆１１．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５１－３．４６（ｍ，２Ｈ），２．９７－２．８３（ｍ，２Ｈ），２．７４，（ｓ，３Ｈ），２．４４－２．３５（ｍ，１Ｈ），１．０９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），０．９２ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７５．６，１５９．７，１５４．３，１４０．２，１３３．９，１３３．５，１３０．３，１３０．１，１２９．３４，１２９．３１，１２９．２７，１２６．５，１１０．５，１０９．１，９８．２，７０．４，６５．７，５５．３，４０．１，３７．７，２９．７，２０．８，１９．９ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ－ＣＦ３ＣＯ２］＝３９８．
Figure 2023509752000086
 （Ｓ）－４－（２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）ブタン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２６）の合成
（＋）－ＪＱ－１の調製したての遊離酸（２０ｍｇ、５０μｍｏｌ）７を１．０ｍＬ ＤＭＦに溶解し、４－アミノブタン酸ｔｅｒｔ－ブチル（９．６ｍｇ、６０μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（３２ｍｇ、３０μｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（４０μＬ）で処理した。反応混合物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣで精製して、１９．５ｍｇ（７２％）のＶＳ－３２７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ７．４８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．７１（ｄｄ，Ｊ＝５．２＆９．２Ｈｚ，１Ｈ），３．４６－３．４１（ｍ，１Ｈ），３．３５－３．２４（ｍ，３Ｈ），２．７５（ｓ，３Ｈ），２．４６（ｓ，３Ｈ），２．３２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．８２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．７１（ｓ，３Ｈ），１．４４ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７４．３，１７２．５，１６６．７，１５６．８，１５２．６，１３８．４，１３４．０，１３３．３，１３２．３，１３２．１，１３１．５，１２９．９，８１．６，５４．９，３９．８，３８．４，３３．７，２８．４，２６．１，１４．４，１３．０，１１．５ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝５４２．
Figure 2023509752000087
 （Ｓ）－６－（２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）ヘキサン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２７）の合成
（＋）－ＪＱ－１の調製したての遊離酸（１０ｍｇ、２５μｍｏｌ）７を０．５ｍＬ ＤＭＦに溶解し、６－アミノヘキサン酸ｔｅｒｔ－ブチル（５．６ｍｇ、３０μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１６ｍｇ、３０μｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２０μＬ）で処理した。反応混合物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣで精製して、１２ｍｇ（８５％）のＶＳ－３５９を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ７．４７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），４．７１（ｄｄ，Ｊ＝５．４＆９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４３（ｄｄ，Ｊ＝９．２及び１５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．３２－３．１９（ｍ，３Ｈ），２．７５（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．２４－２．２０（ｍ，２Ｈ）．１．７０（ｓ，３Ｈ），１．６４－１．５４（ｍ，４Ｈ），１．４９－１．３７ｐｐｍ（ｓ及びｍ，１３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７４．８，１７２．３，１６６．７，１５６．８，１５２．６，１３８．４，１３７．４５，１３４．０１，１３３．３，１３２．３，１３２．０６，１３１．５，１２９．９，８１．４，５４．９，４０．３，３８．３，３６．３，３０．２，２８．４，２７．４，２５．９，１４．４，１３．０，１１．５ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝５７１．
Figure 2023509752000088
 （Ｓ）－４－（４－（２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）ブタンアミド）ブタン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２８）の合成
（＋）－ＪＱ－１の調製したての遊離酸（１０ｍｇ、２５μｍｏｌ）７を０．５ｍＬ ＤＭＦに溶解し、４－（４－アミノブタンアミド）ブタン酸ｔｅｒｔ－ブチル（７．３ｍｇ、３０μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１６ｍｇ、３０μｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２０μＬ）で処理した。反応混合物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣで精製して、１２．４ｍｇ（７９％）のＶＳ－３２９を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ７．４６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．６９（ｄｄ，Ｊ＝５．８＆９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４２（ｄｄ，Ｊ＝８．４＆１５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．３６－３．２７（ｍ，３Ｈ），３．２（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．２９－２．２３（ｍ，４Ｈ），１．８９－１．８２（ｍ，２Ｈ），１．７８－１．７２（ｍ，２Ｈ），１．７０（ｓ，３Ｈ），１．４４ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７５．４，１７４．２，１７２．６，１６６．６，１５６．９，１５２．４，１３８．２，１３７．７，１３３．７，１３３．５，１３２．２，１３２．０，１３１．４，１２９．９，８１．５，５５．０，３９．９，３９．７，３８．５，３４．４，３３．７，２８．３，２６．９，２５．９，１４．４，１３．０，１１．６ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝６２８．
Figure 2023509752000089
 （Ｓ）－６－（６－（２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）ヘキサンアミド）ヘキサン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２９）の合成
（＋）－ＪＱ－１の調製したての遊離酸（２０ｍｇ、５０μｍｏｌ）７を１．０ｍＬ ＤＭＦに溶解し、６－（６－アミノヘキサンアミド）ヘキサン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１８．０ｍｇ、６０μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（３２ｍｇ、３０μｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（４０μＬ）で処理した。反応混合物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣで精製して、２７．３ｍｇ（８０％）のＶＳ－３５５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ７．４７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．６９（ｄｄ，Ｊ＝５．６＆８．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４６－３．４０（ｍ，１Ｈ），３．３５－３．２６（ｍ，３Ｈ），３．１６（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｓ，３Ｈ），２．４６（ｓ，３Ｈ），２．２２－２．１８（ｍ，４Ｈ），１．７１（ｓ，３Ｈ），１．６７－１．４８（ｍ，８Ｈ），１．４３（ｓ＋ｍ，１１Ｈ），１．３７－１．２８ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７６．０，１７４．９，１７２．３，１６６．７，１５６．８，１５２．６，１３８．４，１３７．５，１３４．０，１３３．３，１３２．３，１３２．０，１３１．５，１２９．９１，１２９．８７，８１．３，５４．９，４０．３，４０．２，３８．３，３７．０，３６．３，３０．０９，３０．１１，２８．４，２７．６，２７．４，２６．７，２５．８，１４．４，１３．０及び１１．５ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝６８４．
Figure 2023509752000090
 （Ｒ）－６－（２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）ヘキサン酸ｔｅｒｔ－ブチル（３０）の合成
（－）－ＪＱ－１の調製したての遊離酸（６ｍｇ、１５μｍｏｌ）７を０．２５ｍＬ ＤＭＦに溶解し、６－アミノヘキサン酸ｔｅｒｔ－ブチル（２．８ｍｇ、１５μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（８ｍｇ、１５μｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ １０μＬ）で処理した。反応混合物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣで精製して、５．７ｍｇ（８０％）のＶＳ－３６１を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ７．４７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．６６（ｄｄ，Ｊ＝５．２＆９．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４５－３．３９（ｍ，１Ｈ），３．２７－３．２１（ｍ，３Ｈ），２．７２（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．２３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．７１（ｓ，３Ｈ），１．６５－１．５５（ｍ，４Ｈ），１．４４－１．２９ｐｐｍ（ｓ及びｍ，１２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７４．９，１７２．５，１６６．４，１５６．９，１５２．３，１３８．３，１３７．９，１３３．６，１３３．４，１３２．１，１３２．０，１３１．４，１２９．８，８１．４，５５．１，４０．３，３８．６，３６．３，３０．２，２８．４，２７．４，２５．９，１４．４，１３．０，１１．６ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝５７１．
Figure 2023509752000091
 ＰＨＩＣＳ２．１（３１）の合成
（＋）－ＪＱ－１の調製したての遊離酸（５ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）７を０．３５ｍＬ ＤＭＦに溶解し、調製したての２５（６．４ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）、続いてＰｙＢＯＰ（８．８ｍｇ）及びＥｔ３Ｎ（２５μＬ）で処理した。反応物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣで精製して、５．５ｍｇの所望の生成物ＰＨＩＣＳ２．１（５６％収率）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．４９－７．３２（ｍ，８Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｄｄ，Ｊ＝８．４＆２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．０４（ｓ，２Ｈ），４．６８（ｄｄ，Ｊ＝９．６＆４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．６０（ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３５（ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２４（ｓ，１Ｈ），３．５９（ｄｄ，Ｊ＝１１．２＆４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５３－３．４５（ｍ，３Ｈ），２．９５－２．８７（ｍ，２Ｈ），２．７４（ｓ，３Ｈ），２．７２（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．４５－２．３５（ｍ，１Ｈ），１．６８（ｓ，３Ｈ），１．０７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．９１ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７２．６，１６６．５，１５９．９，１５６．９，１５４．２，１３９．８，１３８．１，１３７．９，１３７．８，１３３．６，１３３．５，１３３．４，１３２．２，１３２．１，１３１．４，１２９．８，１２８．９，１２８．８，１１０．３，１１０．９，７０．８，６５．８，５５．４，５５．２，４３．９，３８．７，３７．８，３６．７，２９．６，２４．２，２０．７，２０，１４．４，１２．９及び１１．５ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝７８０．
Figure 2023509752000092
 ＰＨＩＣＳ２．２（３２）の合成
１．２５ｍＬのＤＣＭ中の２６（１３．５ｍｇ、２５μｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（０．３５ｍＬ）で処理した。反応混合物を室温になるまで加温し、３時間撹拌した後、溶媒を減圧下で濃縮した。調製したての２５（１２．８ｍｇ、２５μｍｏｌ）を０．７ｍＬ ＤＭＦに加え、続いてＰｙＢＯＰ（１７．５ｍｇ）及びＥｔ３Ｎ（５０μＬ）を加えた。反応物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣで精製して、１４．７ｍｇの所望の生成物ＰＨＩＣＳ２．２（６８％収率）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．４５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５５（ｄｄ，Ｊ＝８．４＆２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．０１（ｓ，２Ｈ），４．６９（ｄｄ，Ｊ＝８．４＆５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｄｄ，Ｊ＝１４．８＆６．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２４（ｓ，１Ｈ），３．５９（ｄｄ，Ｊ＝１０．８＆６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．５０－３．３９（ｍ，３Ｈ），２．９４－２．８７（ｍ，２Ｈ），２．７３（ｓ，３Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），２．３６－２．３２（ｍ，２Ｈ），１．６８（ｓ，３Ｈ），１．０７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．９１ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７５．３，１６６．６，１５９．８，１５４．２，１３９．６，１３８．２，１３８．１，１３７．８，１３７．７，１３３．６，１３３．５，１３２．２，１３１．９，１３１．４，１２９．９，１２８．９，１２８．８，１２８．６，１２６．１，１１０．２，１０８．９，７０．７，６５．８，５５．４，５５．０，４３．９，３９．９，３８．５，３７．７，３６．８，３４．４，２９．６，２６．９，２０．７，２０．０，１４．４，１３．０及び１１．６ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝８６６．
Figure 2023509752000093
 ＰＨＩＣＳ２．３（３３）の合成
１ｍＬのＤＣＭ中の２７（１１．４ｍｇ、２０μｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（０．３ｍＬ）で処理した。反応混合物を室温になるまで加温し、３時間撹拌した後、溶媒を減圧下で濃縮した。調製したての２５（１０．２ｍｇ、２０μｍｏｌ）を０．５ｍＬ ＤＭＦに加え、続いてＰｙＢＯＰ（１４ｍｇ）及びＥｔ３Ｎ（４０μＬ）を加えた。反応物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣで精製して、９ｍｇの所望の生成物ＰＨＩＣＳ２．３（５０％収率）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．４５－７．３６（ｍ，６Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５４（ｄｄ，Ｊ＝８．４及び２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），４．６３（ｄｄ，Ｊ＝５．４＆８．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），４．２３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．６１－３．５７（ｍ，１Ｈ），３．５０－３．３７（ｍ，３Ｈ），３．２８－３．２３（ｍ，２Ｈ），２．９１－２．８７（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｓ，３Ｈ），２．６８（ｓ，３Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６９（ｓ及びｍ，４Ｈ），１．６３－１．５５（ｍ，３Ｈ），１．４５－１．３９（ｍ，２Ｈ），１．３３－１．２９（ｍ，２Ｈ），１．０７（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）及び０．９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７５．９，１７５．６，１６７．０，１５９．８，１５４．１，１３９．７，１３８．７，１３７．８，１３７．１，１３４．４，１３３．５，１３２．５，１３２．０，１３１．６，１２９．９，１２８．９１，１２８．８７，１２８．８，１２８．７，１２６．１，１１０．３，１０８．９，７０．７，６５．８，５５．４，５４．８，４４．０，４３．８，４０．３，３８．１，３７．７，３６．９，３６．８，３０．１，２９．７，２７．５，２６．６，２０．７，２０．０，１４．４，１３．０，１１．５ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝８９４．
Figure 2023509752000094
 ＰＨＩＣＳ２．４（３４）の合成
１ｍＬのＤＣＭ中の２８（１２．４ｍｇ、１９．８μｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（０．３ｍＬ）で処理した。反応混合物を室温になるまで加温し、３時間撹拌した後、溶媒を減圧下で濃縮した。調製したての２５（１０．２ｍｇ、２０μｍｏｌ）を０．５ｍＬ ＤＭＦに加え、続いてＰｙＢＯＰ（１４ｍｇ）及びＥｔ３Ｎ（４０μＬ）を加えた。反応物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣで精製して、９．２ｍｇの所望の生成物ＰＨＩＣＳ２．４（４９％収率）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．４５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５４（ｄｄ，Ｊ＝８．４及び２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），４．６３（ｄｄ，Ｊ＝５．８＆８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３３（ｓ，２Ｈ），４．２４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．５９（ｄｄ，Ｊ＝１０．８＆４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．５０－３．４５（ｍ，２Ｈ），３．４２－３．３４（ｍ，３Ｈ），３．２３－３．１８（ｍ，２Ｈ），２．９４－２．８７（ｍ，２Ｈ），２．７３（ｓ，３Ｈ），２．６９（ｓ，３Ｈ），２．４４（ｓ，３Ｈ），２．４１－２．３６（ｍ，１Ｈ），２．２８－２．２３（ｍ，４Ｈ），１．８９－１．７７（ｍ，４Ｈ），１．６８（ｓ，Ｈ），１．４５－１．３９（ｍ，２Ｈ），１．０７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）及び０．９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７５．５，１６６．５，１５９．８，１５４．２，１３９．６，１３７．８，１３３．５，１３２．２，１３１．４，１２９．９，１２８．８，１２８．７，１１０．２，１０８．９，７０．７，６５．８，５５．４，５５．１，４３．９，３９．９，３９．８，３８．６，３７．７，３４．４，３４．３，２９．６，２６．８，２０．７，２０．０，１４．４，１２．９及び１１．６ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝９５１．
Figure 2023509752000095
 ＰＨＩＣＳ２．５（３５）の合成
１．２５ｍＬのＤＣＭ中の２９（１７．１ｍｇ、２５μｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（０．３５ｍＬ）で処理した。反応混合物を室温になるまで加温し、３時間撹拌した後、溶媒を減圧下で濃縮した。調製したての２５（１２．８ｍｇ、２５μｍｏｌ）を０．７ｍＬ ＤＭＦに加え、続いてＰｙＢＯＰ（１７．５ｍｇ）及びＥｔ３Ｎ（５０μＬ）を加えた。反応物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣで精製して、１５．０ｍｇの所望の生成物ＰＨＩＣＳ２．５（６０％収率）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．４６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．４及び２．８Ｈｚ，１Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），４．６９（ｄｄ，Ｊ＝５．６＆８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３４（ｓ，２Ｈ），４．２５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．５９（ｄｄ，Ｊ＝１０．８＆４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４９－３．３５（ｍ，４Ｈ），３．２７－３．２３（ｍ，３Ｈ），３．１７－３．１３（ｍ，２Ｈ），２．９１－２．８７（ｍ，３Ｈ），２．７４（ｓ，３Ｈ），２．７３（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），２．４１－２．３４（ｍ，１Ｈ），２．２５－２．１７（ｍ，４Ｈ），１．７０（ｓ，Ｈ），１．６７－１．３１（ｍ，１５Ｈ），１．０７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）及び０．９０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７５．５，１６６．５，１５９．８，１５４．２，１３９．６，１３７．８，１３３．５，１３２．２，１３１．４，１２９．９，１２８．８，１２８．７，１１０．２，１０８．９，７０．７，６５．８，５５．４，５５．１，４３．９，３９．９，３９．８，３８．６，３７．７，３４．４，３４．３，２９．６，２６．８，２０．７，２０．０，１４．４，１２．９及び１１．６ｐｐｍ；１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７６．０，１７５．９，１７２．３，１６６．７，１５９．８，１５４．２，１３９．７，１３８．４，１３７．８，１３７．５，１３４．０，１３３．５，１３２．３，１３２．０，１３１．５，１２９．９，１２８．８，１２８．７，７０．７，６５．８，５５．４，５４．９，４３．８，４０．３，４０．２，３８．３，３７．７，３７．０，３６．９，３０．１，２９．７，２７．５，２６．７１，２６．６６，２０．７，２０．０，１４．４，１３．０及び１１．６ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝１００７．
Figure 2023509752000096
 （Ｒ）－ＰＨＩＣＳ２．３（３６）の合成
０．６ｍＬのＤＣＭ中の３０（５．７ｍｇ、１２μｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（０．１８ｍＬ）で処理した。反応混合物を室温になるまで加温し、３時間撹拌した後、溶媒を減圧下で濃縮した。調製したての２５（６．１ｍｇ、１２μｍｏｌ）を０．３ｍＬ ＤＭＦに加え、続いてＰｙＢＯＰ（８．４ｍｇ）及びＥｔ３Ｎ（２４μＬ）を加えた。反応物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣで精製して、６．８ｍｇの所望の生成物（Ｒ）－ＰＨＩＣＳ２．３（６３％収率）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：７．４５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）７．２７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．５４（ｄｄ，Ｊ＝８．４及び２．５Ｈｚ，１Ｈ），５．００（ｓ，２Ｈ），４．６６（ｄｄ，Ｊ＝５．５＆８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３６（ｓ，２Ｈ），４．２４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．６１－３．５７（ｍ，１Ｈ），３．５０－３．４７（ｍ，２Ｈ），３．２７－３．２４（ｍ，２Ｈ），２．９１－２．８７（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｓ，３Ｈ），２．７０（ｓ，３Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），２．４１－２．３４（ｍ，１Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．７２－１．６７（ｓ及びｍ，４Ｈ），１．６３－１．５５（ｍ，２Ｈ），１．４５－１．３９（ｍ，２Ｈ），１．３３－１．２９（ｍ，２Ｈ），１．０７（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，３Ｈ）及び０．９ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ １７５．９，１７５．６，１７２．６，１６６．４，１５９．８，１５８．４，１５４．２，１５２．３，１３９．７，１３８．１，１３７．９，１３７．８，１３３．４，１３２．１，１３２．０，１３１．４，１３１．１，１２９．９，１２８．８，１２８．７，１２８．７，１２６．１，１２４．３，１２１．７，１１１．８，１１０．２，１０８．９，７０．７，６５．８，５６．２，５５．４，５５．１，４５．３，４３．８，４０．３，３８．７，３７．７，３７．０，３０．１，２９．７，２７．５，２６．７，２０．７，２０．０，１４．４，１３．０，１１．６ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝８９４．
ＰＨＩＣＳ３及びＰｉｖ－ＰＨＩＣＳ３の合成
Figure 2023509752000097
 （Ｒ）－１０－（３－（４－アミノ－３－（４－フェノキシフェニル）－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－１－イル）ピペリジン－１－イル）－１０－オキソデカン酸２，５－ジオキソピロリジン－１－イル（３７）の合成
１ｍＬ ＤＭＦ中の３９．６ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ、１当量）のセバシン酸ビス（Ｎ－スクシンイミジル）エステルの溶液に、３８．６ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ、１当量）の（Ｒ）－３－（４－フェノキシフェニル）－１－（１－ピペリジン－３－イル）－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－４－アミンを加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、減圧下で濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１００：０から９５：５のＤＣＭ：ＭｅＯＨグラジエント）により精製して、２０ｍｇ（３０％）の所望の生成物３７を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３Ｃｌ）：８．３１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．６２（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），７．４０－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．１９－７．１３（ｍ，３Ｈ），７．０８（ｄ，８Ｈｚ，２Ｈ），４．８７－４．７６（ｍ，１．５Ｈ），４．５８（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，０．５Ｈ），４．０５（ｄｄ，Ｊ＝１２＆４Ｈｚ，０．５Ｈ），３．８９（ｄ，Ｊ＝１６Ｈｚ，０．５Ｈ），３．６８－３．６２（ｍ，０．５Ｈ），３．３１－３．２５（ｍ，０．５Ｈ），３．１７－３．１０（ｍ，０．５Ｈ），２．８７－２．７８（ｍ，３Ｈ），２．７４－２．６７（ｍ，２Ｈ），２．６１－２．５５（ｍ，２Ｈ），２．４２－２．１８（ｍ，２Ｈ），２．００－１．９２（ｍ，１Ｈ），１．７７－１．５５（ｍ，５Ｈ），１．４０－１．２５ｐｐｍ（ｍ，９Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤ３Ｃｌ）δ １７３．２２，１７１．９６，１７１．９０，１６９．２９，１６８．６９，１５８．６９，１５８．５９，１５７．７４，１５６．３０，１５６．２４，１５４．８５，１５４．５９，１５３．９６，１５３．７６，１４４．４１，１３０．０２，１３０．００，１２９．９７，１２９．９４，１２７．５０，１２７．３４，１２４．１５，１２４．０８，１１９．５９，１１９．５６，１１９．５２，１１９．１６，１１８．９８，５３．５３，５２．６６，４９．９６，４５．６３，４１．６９，３３．５１，３３．４６，３０．９７，３０．９３，３０．３４，２９．９９，２９．７０，２９．３６，２９．３２，２９．１９，２９．１２，２９．０９，２８．９３，２８．７０，２５．６２，２５．５１，２５．３４，２５．３０，２５．１５，２４．５５，２４．０６ｐｐｍ．ＬＳ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＝６６８．５．
Figure 2023509752000098
 ＰＨＩＣＳ３の合成
１ｍＬのＤＣＭ中の３（２８ｍｇ、６５μｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）で処理した。反応混合物を室温になるまで加温し、２時間撹拌した後、溶媒を減圧下で濃縮した。調製したての３７（４０ｍｇ、６０μｍｏｌ）を１ｍＬ ＤＭＦに加え、続いてＤＩＰＥＡ（４０μＬ）を加えた。反応物を一晩撹拌し、減圧下で濃縮し、ＨＰＬＣで精製して、３０ｍｇ（５７％）の所望の生成物ＰＨＩＣＳ３を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：１１．９１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．２５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｂｒ ｓ，２Ｈ），７．９４（ｓ，１Ｈ），７．６６－７．６２（ｍ，２Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），７．４５－７．４１（ｍ，２Ｈ），７．３６－７．３１（ｍ，２Ｈ），７．２１－７．０９（ｍ，４Ｈ），７．０４－６．９７（ｍ，２Ｈ），４．７７－４．６８（ｍ，０．５Ｈ），４．６５－４．５６（ｍ，０．５Ｈ），４．５３－４．４６（ｍ，０．５Ｈ），４．１８－４．１１（ｍ，０．５Ｈ），４．０６－３．９６（ｍ，２．５Ｈ），３．８９－３．８１（ｍ，０．５Ｈ），３．６１－３．５５（ｍ，０．５Ｈ），３．４８－３．４０（ｍ，２Ｈ），３．１５－３．０６（ｍ，１．５Ｈ），２．９３－２．８３（ｍ，０．５Ｈ），２．３６－２．２０（ｍ，３Ｈ），２．１５－２．０４（ｍ，３Ｈ），１．９３－１．８３（ｍ，１Ｈ），１．６５－１．３７（ｍ，５Ｈ），１．２４－１．１５（ｍ，８Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：１７２．５５，１７０．８２，１７０．７１，１７０．３１，１６５．６１，１６２．２９，１５８．１９，１５７．６５，１５７．１２，１５６．３０，１５５．６２，１５４．０４，１５３．９０，１４３．２３，１４３．１５，１３５．９３，１３３．７５，１３２．７９，１３２．５０，１３０．７５，１３０．０９，１３０．０５，１２７．９５，１２７．８０，１２５．８４，１２５．２７，１２３．７６，１２２．７１，１１８．９５，１１４．０２，１１２．８６，１０７．６１，９７．４８，９７．３７，７３．５４，６６．４１，５９．７５，５２．７１，５２．１１，４９．３１，４５．３０，４５．００，４１．０８，３８．２３，３５．７７，３５．３４，３２．３８，３０．７７，２９．６０，２９．２２，２８．７９，２８．７２，２８．６４，２５．２８，２４．９４，２４．８４，２４．６９，２３．４６，２０．７４，１４．０７ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）：Ｃ４９Ｈ５２ＣｌＮ８Ｏ６の計算値（Ｍ＋Ｈ）：８８３．３６９３、実測値：８８３．３６９０．
Figure 2023509752000099
 Ｐｉｖ－ＰＨＩＣＳ３の合成
ステップ１：ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中の３７（２０ｍｇ、３０μｍｏｌ）の溶液をゼロに冷却し、ゼロにおいて塩化ピバロイル（１０μＬ、８０μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２０μＬ）で処理した。反応混合物を室温になるまで加温し、２時間撹拌し、減圧下で濃縮して、粗３８を得た。生成物３８を更なる精製なしに次のステップに使用した。
ステップ２：０．５ｍＬのＤＣＭ中の３（１３ｍｇ、３０μｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）で処理した。反応混合物を室温になるまで加温し、２時間撹拌した後、溶媒を減圧下で濃縮した。ステップ１からの生成物３８（３０μｍｏｌ）を１ｍＬ ＤＭＦに加え、続いてＤＩＰＥＡ（２０μＬ）を加えた。反応物を一晩撹拌し、減圧下で濃縮し、ＨＰＬＣで精製して、７ｍｇ（２４％）の所望の生成物Ｐｉｖ－ＰＨＩＣＳ３をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＨ １：１）：８．６１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．９８（ｂｒ ｓ １Ｈ），７．８７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．５５－７．６７（ｍ，２Ｈ），７．４３－７．５０（ｍ，１Ｈ），７．３４－７．２４（ｍ，４Ｈ），７．１１－７．０８（ｍ，１Ｈ），７．０４－６．９７（ｍ，４Ｈ），６．８５（ｍ，２Ｈ），４．９０－４．７７（ｍ，１Ｈ），４．５９－４．４８（ｍ，１Ｈ），４．３２－４．１９（ｍ，１Ｈ），４．０９－３．９９（ｍ，２Ｈ），３．５８－３．５０（ｍ，２Ｈ），３．２９－３．２４（ｍ，２Ｈ），２．３５－２．２６（ｍ，２Ｈ），２．２２－２．１０（ｍ，３Ｈ），２．０３－１．９０（ｍ，１Ｈ），１．６７－１．４６（ｍ，５Ｈ），１．３１－１．１７（ｍ，１０Ｈ），１．０７（ｓ，９Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＨ １：１）：１７４．６８，１７２．４２，１５７．７４，１５７．３５，１５６．０７，１５３．９７，１５２．７６，１３３．６２，１３３．０７，１３２．７９，１３２．５６，１３０．２５，１２９．３９，１２９．１０，１２７．９７，１２６．４７，１２４．７５，１２３．１０，１２２．４６，１１８．４９，１１７．７９，１１３．０３，１１１．８３，６５．７０，５２．９５，５２．１２，４９．１２，４５．１４，４４．９０，４１．１４，３８．２９，３５．２１，３２．４６，２９．０１，２８．７６，２８．４２，２８．１７，２５．６４，２５．０７，２４．６１，２３．９７，２２．８８ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ－ＴＯＦ）：Ｃ５４Ｈ６０ＣｌＮ８Ｏ７の計算値（Ｍ＋Ｈ）：９６７．４２６８、実測値：９６７．４２６５．
２．１２．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における三元複合体（ＡＭＰＫ：ＰＨＩＣＳ３：ＢＴＫ）形成の検証
免疫共沈降を実施して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、本来、これらの細胞に存在しないＢＴＫを過剰発現させた後、三元複合体（ＡＭＰＫ：ＰＨＩＣＳ３：ＢＴＫ）形成を判定した。１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補足したＤＭＥＭでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２加湿雰囲気中に維持した。
ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３トランスフェクション試薬を使用してｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＢＴＫ－Ｆｌａｇプラスミドを３６時間トランスフェクトした後、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を無血清培地に一晩維持してから化合物とインキュベートした。その後、細胞を新鮮な無血清培地中において５μＭ濃度のＡＭＰＫ活性化剤又はＢＴＫ結合剤又はＰＨＩＣＳ３又はＤＭＳＯ対照で４時間処理した後、細胞を溶解緩衝液（Ｍ－ＰＥＲ（商標）哺乳類タンパク質抽出試薬、Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（２×）及び５０ｍＭ ＮａＦ）中で氷上において溶解させた。次に、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して細胞ライセートのタンパク質濃度を測定した。等量の細胞ライセートを抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２磁気ビーズと共に４℃で一晩インキュベートした。次にビーズをＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、９５℃で５分間加熱することによってＳＤＳローディング緩衝液でタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質について、ＡＭＰＫ－αウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号５８３２）又はＦｌａｇマウス抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号８１４６）（１：２０００）又はβ－アクチンマウス抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号３７００）（１：２０００）を使用してウエスタンブロッティングにより分析した。
２．１３．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢＴＫリン酸化を確認するイムノブロッティング分析
免疫共沈降を実施して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、本来、これらの細胞に存在しないＢＴＫを過剰発現させた後、三元複合体（ＡＭＰＫ：ＰＨＩＣＳ３：ＢＴＫ）形成を判定した。１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補足したＤＭＥＭでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２加湿雰囲気中に維持した。
ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３トランスフェクション試薬を使用してｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＢＴＫ－Ｆｌａｇプラスミドを３６時間トランスフェクトした後、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を無血清培地に一晩維持してから化合物とインキュベートした。その後、細胞を新鮮な無血清培地中において５μＭ濃度のＡＭＰＫ活性化剤又はＢＴＫ結合剤又はＰＨＩＣＳ３又はＤＭＳＯ対照で４時間処理してから、細胞を溶解緩衝液（Ｍ－ＰＥＲ（商標）哺乳類タンパク質抽出試薬、Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（２×）及び５０ｍＭ ＮａＦ）中で氷上において溶解させた。次に、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して細胞ライセートのタンパク質濃度を測定した。等量の細胞ライセートを抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２磁気ビーズと共に４℃で一晩インキュベートした。次にビーズをＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、９５℃で５分間加熱することによってＳＤＳローディング緩衝液でタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質について、ＡＭＰＫ－αウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号５８３２）又はＦｌａｇマウス抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号８１４６）（１：２０００）又はβ－アクチンマウス抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号３７００）（１：２０００）を使用してウエスタンブロッティングにより分析した。
同様のプロトコルに従い、細胞におけるＰＨＩＣＳ３誘導性リン酸化のリンカー長さ、濃度及び用量依存性を観察した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を無血清培地に一晩維持してから、Ｆｌａｇ－ＢＴＫを過剰発現させた後に化合物と共にインキュベートした。一実験では、種々のリンカー（ｎ＝６、ｎ＝８及びＰＥＧ２）を有する５μＭ濃度のＰＨＩＣＳ３を４時間インキュベートした。別の実験では、種々の濃度（０．１、０．５、１、５及び１０μＭ）のＰＨＩＣＳ３を４時間インキュベートし、５μＭのＰＨＩＣＳ３をＨＥＫ２９３Ｔ細胞と種々の時点（１、２、４及び５時間）についてインキュベートした後、溶解させた。次にホスホ－Ｂｔｋ（Ｓｅｒ１８０）（３Ｄ３）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号３５３７）（１：１０００）及びＦｌａｇマウス抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号８１４６）（１：２０００）でウエスタンブロッティングを実施した。ＡＭＰＫ活性化単独は細胞における有意なＳｅｒ１８０リン酸化の誘導に関与しないことを更に検証するため、種々の濃度（５、１０及び２０μＭ）の強力な市販のＡＭＰＫ活性化剤（ＰＦ－０６４０９５７７）又は５μＭのＰＨＩＣＳ３又は５μＭのＡＭＰＫ活性化剤又はＤＭＳＯ対照をＨＥＫ２９３Ｔ細胞と共に４時間インキュベートした後、細胞を溶解させて、ホスホ－Ｂｔｋ（Ｓｅｒ１８０）（３Ｄ３）抗体及びＦｌａｇマウス抗体を使用してウエスタンブロッティングを実施した。
次に、本出願人らは、イブルチニブの存在下における且つ化学的に修飾されたＰＨＩＣＳ３（Ｐｉｖ－ＰＨＩＣＳ３）を使用した競合実験によって細胞におけるＰＨＩＣＳ３の標的会合を確認した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を無血清培地に一晩維持してから、Ｆｌａｇ－ＢＴＫを過剰発現させた後に化合物をインキュベートした。次に、細胞を５μＭ濃度のＰＨＩＣＳ３又はＰｉｖ－ＰＨＩＣＳ３で４時間処理した後、細胞を溶解させて、ホスホ－Ｂｔｋ（Ｓｅｒ１８０）（３Ｄ３）抗体及びＦｌａｇマウス抗体を使用してウエスタンブロッティングを実施した。この競合実験では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＳＯ又はＡＭＰＫ活性化剤（５μＭ）又はＰＨＩＣＳ３（５μＭ）又はＰＨＩＣＳ３（５μＭ）＋イブルチニブ（１μＭ）又はイブルチニブ（１μＭ）と共に無血清培地で４時間インキュベートした。この実験では、イブルチニブは、ＰＨＩＣＳ３分子を加える１時間前に処理した。細胞溶解後、ホスホ－Ｂｔｋ（Ｓｅｒ１８０）（３Ｄ３）抗体及びＦｌａｇマウス抗体を使用してウエスタンブロッティングを実施した。
２．１４．ＢＴＫのリン酸化部位及びＰＨＩＣＳ３の標的会合の突然変異研究による確認
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＨＩＣＳ３誘導性リン酸化部位を確認するため、Ｓ１８０Ａ突然変異を実施した。加えて、イブルチニブの可逆的類似体はＢＴＫのＡＴＰ競合阻害剤であるため、ＢＴＫのＡＴＰ結合ポケットに幾つかの突然変異を実施して、ＰＨＩＣＳ３の標的会合を検証した。これらの突然変異体コンストラクトは、Ｑ５（登録商標）部位特異的突然変異誘発キットを使用して、以下のプライマー：ＢＴＫ Ｓ１８０Ａ（フォワード：５’－ＡＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＣＴＣＡＣＣＧＧＡ－３’（配列番号６）、リバース：５’－ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣ－３’（配列番号７））Ｋ４３０Ｒ（フォワード：５’－ＣＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡＴＣＡＡＡＧ－３’（配列番号８）、リバース：５’－ＴＣＧＴＡＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＣＡＴ－３’（配列番号９））Ｔ４７４Ａ（フォワード：５’－ＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＡＴＧＧＣＣＡＡＴＧ－３’（配列番号１０）、リバース：５’－ＡＴＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＴＧＧＴＧ－３’（配列番号１１））Ｄ５３９Ｎ（フォワード：５’－ＴＡＡＡＧＴＡＴＣＴＡＡＴＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＣ－３’（配列番号１２）、リバース：５’－ＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＧＡＴＣＧＴＴＴＡＣ－３’（配列番号１３））で調製した。調製した全てのプラスミドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体をＤＮＡシーケンシングによって確認した。
次に、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－２９３トランスフェクション試薬を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞に野生型（ＷＴ）又は突然変異体ＢＴＫ－Ｆｌａｇプラスミドをトランスフェクトした。３６時間トランスフェクトした後、細胞を無血清培地に一晩維持してから、化合物と共にインキュベートした。その後、新鮮な無血清培地中において細胞を５μＭ濃度のＡＭＰＫ活性化剤又はＰＨＩＣＳ３又はＤＭＳＯ対照で４時間処理してから、細胞を溶解緩衝液（Ｍ－ＰＥＲ（商標）哺乳類タンパク質抽出試薬、Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（２×）及び５０ｍＭ ＮａＦ）中で氷上において溶解させた。次に、ホスホ－Ｂｔｋ（Ｓｅｒ１８０）（３Ｄ３）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号３５３７）（１：１０００）及びＦｌａｇマウス抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号８１４６）（１：２０００）でウエスタンブロッティングを実施した。
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実施例２－インビトロでのリン酸化のＡＭＰ亢進
ＡＭＰＫ（１ｕＭ化合物）によるＢＲＤ４リン酸化に関してインビトロキナーゼアッセイを行った。試験した化合物ＭＳ２３１及びＶＳ８０６を以下に示す。
Figure 2023509752000100
化合物ＭＳ２３１、ＶＳ８０６及びＶＳ８０４について、１００ｕＭのＡＭＰあり及びなしで試験した。ＡＭＰを加えると、図６３Ａに示されるとおり、リン酸化シグナルが亢進する。ＡＭＰあり及びなしでのＡＭＰＫによるＢＲＤ４リン酸化に関するＡＤＰ ｇｌｏを行った。ＡＤＰ生成を２時間、２０ｎＭ ＡＭＰＫで測定して、ＡＭＰを加えるとリン酸化シグナルが亢進した。
Figure 2023509752000101
実施例３－Ａｂｌ会合ＰＨＩＣＳ分子の設計
Ａｂｌ会合ＰＨＩＣＳ分子を設計するため、本出願人らは、２つの公知のＡｂｌキナーゼ活性化剤：ＤＰＨ１及びジヒドロピラゾール活性化剤（２）を選択した。既報告のＡｂｌの結晶構造とその活性化剤に基づき、ＤＰＨ及びジヒドロピラゾール環のそれぞれ１位及び３位にある溶媒露出したフェニル基及びアミノ基をリンカー結合部位として選択した。第一に、概念実証実験について、Ｈａｌｏｔａｇ結合クロロアルキル鎖を、その長さ及び極性が様々な３つのリンカーを介して両方の活性化剤に取り付けた。次に、本出願人らは、アデノシン５’－［γ－チオ］三リン酸（ＡＴＰ－γ－Ｓ）をリン酸のドナーとして使用し、抗チオリン酸エステル抗体でリン酸化をプローブして、Ａｂｌ－ＰＨＩＣＳがＨａｌｏＴａｇタンパク質上のリン酸化を誘導するかを判定した（３）。インビトロリン酸化により、ジヒドロピラゾール由来の二官能性分子（ＰＨＩＣＳ９．１～９．３、図６４Ａ～図６４Ｂ）は、Ａｂｌ結合剤単独でのリン酸化レベルと比較したとき、ＡｂｌキナーゼによるＨａｌｏタグリン酸化レベルを有意に増加させたことが明らかになった。興味深いことに、ほぼ無極性のリンカーを含有するＰＨＩＣＳ９．１が最も高いリン酸化レベルを呈している（図６４Ｂ）。同時に、試験した条件では、同じリンカーを有するＤＰＨ由来のＰＨＩＣＳは、検出可能なレベルのリン酸化をもたらさなかった（データは示さず）。ＤＰＨ及びジヒドロピラゾール由来のＰＨＩＣＳはいずれも、Ｈａｌｏｔａｇタンパク質を効率的に標識し、これはＴＭＲ標識の抑制によって確認された４（図６４Ｂ）。ＤＰＨ及びジヒドロピラゾール活性化剤はＡｂｌに同程度の親和性（１００～２００ｎＭ）で結合するが、選択のリンカー結合部位が異なる出口ベクターを提供し、そのため潜在的に２つの異なる三元複合体につながった可能性がある。ＤＰＨベースの出口ベクターとの三元複合体におけるタンパク質の配向は、非生産的である可能性がある。これは、試験した二官能性分子によるＨａｌｏｔａｇのリン酸化レベルの観察された差を説明し得る。しかしながら、２つのシステムをより良く理解するためには、更なる実験（例えば、Ａｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎ、出口ベクター位置をジヒドロピラゾールと同様に変更することによるＤＰＨ類似体の設計）が実施されることになる。
Ｈａｌｏｔａｇ標的化実験におけるジヒドロピラゾールＡｂｌ結合剤の検証後、本出願人らは、提案されている標的の１つ－ＢＲＤ４に対するＰＨＩＣＳ分子を設計することにした。Ｈａｌｏ－Ａｂｌ ＰＨＩＣＳ設計と同様に、ＢＲＤ４タンパク質の結合剤－（＋）－ＪＱ１－を各種のリンカーを介してジヒドロピラゾールに取り付けた（ＰＨＩＣＳ１０．１～１０．５、図６４Ａ）。得られた分子を同じチオ－ＡＴＰベースのプロトコルに従ってインビトロで試験し、Ａｂｌ結合剤単独と比較したときに種々のＢＲＤ４リン酸化レベルが実証された（図６４Ｃ）。興味深いことに、ＢＲＤ４の場合、平均的長さのより極性の高いリンカーのＰＨＩＣＳ １０．３が最も高いリン酸化レベルを示した。対照として、本出願人らは、ＰＨＩＣＳ １０．３のエナンチオマー－ＰＨＩＣＳ ｉ１０．３（（－）－ＪＱ１に由来する）を調製しており、これはＢＲＤ４に結合できないはずであった。予想どおり、ＰＨＩＣＳ ｉ１０．３の存在下では、リン酸化レベルはＤＭＳＯ又はＡｂｌ結合剤単独と同じであり、ＰＨＩＣＳ １０．３の存在下で観察されるシグナルが、生産的なＰＨＩＣＳ誘導性三元複合体形成の結果であることを立証している。更に、三元複合体の３つの成分のいずれか又はチオ－ＡＴＰが存在しない場合、リン酸化は検出されなかった。最後に、本出願人らは、Ａｌｐｈａ ＳｃｒｅｅｎアッセイによってＰＨＩＣＳ １０．３の存在下で三元複合体形成を観察したが、ＰＨＩＣＳ ｉ１０．３では観察しなかった（データは示さず）。
以下の文献は実施例３に関する。
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実施例４－ＰＨＩＣＳ作成に使用されるキナーゼ及びその結合剤の性質の多様化
上述のとおり、本出願人らは、両方ともＳｅｒ及びＴｈｒ残基をリン酸化するＡＭＰＫ及びＰＫＣキナーゼを使用して、２つの概念実証型のＰＨＩＣＳを開発した。しかしながら、細胞性リン酸化の範囲は、はるかに広い：５００を超えるキナーゼがあり、その約５分の１が、Ｔｙｒ残基のリン酸化に関与するＴｙｒキナーゼファミリーに属する。異なる種類の細胞では、キナーゼの存在量及び局在化に大きいばらつきがあるという事実を考慮に入れて、本出願人らは、ＡＭＰＫ／ＰＫＣに留まることなく、ＰＨＩＣＳの範囲を他のキナーゼに拡大することを提案する。
第一に、Ｔｙｒリン酸化のためのＰＨＩＣＳが構築されなければならなかった。それに加えて、これまで本出願人らは、その範囲が極めて限られているバリデートされたキナーゼ活性化剤のみを利用した。可逆的アロステリック阻害剤も機能性のＰＨＩＣＳを作り出すことができる可能性が高い。サリドマイド、ベスタチン及びポマリドミドは、Ｅ３リガーゼの阻害剤であるが；それにも関わらず、これらの化合物を含有するＰＲＯＴＡＣは、ＰＯＩの効率的な分解につながる。二官能性分子（ＰＲＯＴＡＣ又はＰＨＩＣＳ）の第一の目的は、適切な酵素と目的のタンパク質とを互いに近付けることである。非共有結合性阻害剤による酵素への結合は可逆的であるため、二官能性分子からＥ３リガーゼ又はキナーゼが解離すると、そのコンホメーションが活性型に変化して、近接したタンパク質のユビキチン化（又はＰＨＩＣＳの場合にはリン酸化）が起こり得る。
ＰＨＩＣＳによって利用されるキナーゼの範囲を拡大するため、本出願人らは、局在化部位が異なる２つの比較的豊富にあるチロシンキナーゼ：膜結合型インスリン受容体（ＩＲＴＫ）及びエーベルソン（ＡＢＬ）Ｔｙｒキナーゼを試みることになり、これらは、核、細胞質及びミトコンドリアに見出すことができるものである。これらのキナーゼに対するＰＨＩＣＳ分子を構築するため、本出願人らは、その十分に特徴付けられた活性化剤ＤＰＨ及びコウジ酸を使用することになる（１６～１８）。アロステリック阻害剤に関して、ボルセルチブ及びトラメチニブは、比較的高い存在量の（それぞれ各Ｕ２ＯＳ細胞につき８．６×１０３及び１．２×１０５個の分子）（１９）、且つ細胞局在が様々な（細胞質、膜及び核）（２０）酵素であるＲＡＣ－αセリン／スレオニン－プロテインキナーゼ（ＡＫＴ）及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）を標的化するバリデートされた化学物質である。
４つの提案されるキナーゼを判定するため、本出願人らは、核標的（ＢＲＤ４）及び細胞質標的（ＡＲ）に対するＰＨＩＣＳ分子を設計しようとしているところである。その結合剤に由来するＰＲＯＴＡＣ、（＋）－ＪＱ１及びエンザルタミドは、両方のタンパク質の分解に成功しており、その一方（ＡＲＶ－１１０）は、転移性去勢抵抗性前立腺癌患者の治療向けにＦＤＡからファスト・トラック指定さえ受けている。６つのキナーゼ及び２つの標的の結合剤から着手して、本出願人らはそれらを３つの異なる種類のリンカーでつなぐ予定であり、従って複数の組み合わせが生じることになる。これらの分子の合成を単純化するため、迅速モジュラー手法を利用することになる：６つのキナーゼ活性化剤がアルキンで官能化されることになるとき（６つのユニークな分子、図８０）、末端にアジドを含有する３つの異なるリンカーへと（それぞれアミド結合及びエーテル結合によって）（＋）－ＪＱ１及びエンザルタミドを取り付けることになる（６つのユニークな分子）。得られたビルディングブロックは、生体直交型クリックケミストリーで結び付けられることになる。全ての組み合わせが合成され、インビトロで上記に記載したアッセイを用いて且つインセルロでＵ２ＯＳ及びＨＥＫ２９３細胞株を用いて判定されることになる。最も有望なキナーゼが実施例５における転写因子の標的化に利用されることになる。本出願人らは、設計されたＰＨＩＣＳが生化学アッセイにおいてＢＲＤ４及びＡＲのリン酸化を誘導しない場合、幾つかのキナーゼ結合剤が存在する他のキナーゼ（例えば、Ｌｙｎ（２１）、ＢＴＫ（２２）、Ｓｒｃ（２３）、ＧＳＫ（２４）及びＬＩＭＫ（２５）が利用されることになることを注記する。
実施例５－様々な転写因子を調節するためのＰＨＩＣＳの設計及びインビトロ判定
約１６００個のヒト転写因子（ＴＦ）が知られており、これは全遺伝子の８％に相当し、癌遺伝子の２０％を占める（２６）。本出願人らは、サブクラスへの割当て、標的化される相互作用の様式及び意図される癌抑制機構が異なる４つのＴＦを選択した（図８１Ａ～図８１Ｄ）。本出願人らの第一目標は、発癌性Ｍｙｃ－Ｍａｘペア（潜在性細胞質性因子サブクラス）におけるタンパク質－タンパク質相互作用の破壊である。近年、Ｋｏｅｈｌｅｒの研究室は、小分子マイクロアレイスクリーニングアッセイを用いることにより、ヘテロ二量体Ｍｙｃ－Ｍａｘを破壊し、インビボでＭａｘ－Ｍａｘホモ二量体を安定化させることによって腫瘍成長を抑制することのできる化合物ＫＩ－ＭＳ２－００８（図８１Ａ）を見出した（２７）。本出願人らはこの発見を生かし、ＫＩ－ＭＳ２－００８を使用して、Ｍａｘをリン酸化することのできるＰＨＩＣＳを構築する予定である。Ｍａｘの表面上にリン酸基が導入されると、Ｍａｘ－Ｍｙｃヘテロ二量体の形成が妨げられ、平衡が未結合Ｍｙｃの方にシフトするであろうことが予想される。
本出願人らの第２の目標は、エストロゲン受容体（ＥＲ、核常在因子サブクラス）のタンパク質－ＤＮＡ相互作用の破壊である。ＰＨＩＣＳ分子は、公知のＥＲ阻害剤－ラロキシフェンを用いて設計されることになる（図８１Ｂ）（２８）。ラロキシフェンを単独で使用すると、ＥＲがＤＮＡと相互作用しないように一定のリガンド飽和が維持されるはずである。ＰＨＩＣＳ戦略は、二官能性小分子の触媒によるＥＲのリン酸化に頼るものであり、これには、より少ない用量で治療効果の増加を呈する潜在的能力がある。本出願人らの第３の目標であるｐ５３タンパク質は、リン酸化の部位及び価数に依存して、タンパク質－タンパク質相互作用又はタンパク質－ＤＮＡ相互作用のいずれも破壊され得るため、更に一層興味深い。ｐ５３のリン酸化の欠損は、ｐ５３がその分解因子ＭＤＭ２から解離できなくなるため、口腔扁平上皮癌におけるｐ５３抵抗性の獲得に寄与することが分かった（２９）。従って本出願人らは、２，５－ビス（５－ヒドロキシメチル－２－チエニル）フラン又はＲＩＴＡ由来のＰＨＩＣＳによってリン酸化を回復し、タンパク質－タンパク質ｐ５３－ＭＤＭ２相互作用を破壊することを目指す（３０）。同時に、ＤＮＡ結合ドメインにおけるｐ５３のリン酸化がタンパク質－ＤＮＡ相互作用への干渉につながることになり、これは、ｐ５３の過剰発現を伴う種類の癌において極めて有益であり得る（３１～３２）。最終目標については、本出願人らは、タンパク質－タンパク質相互作用の安定性を向上させる予定である：β－カテニンは、リン酸化を受けると、安定した分解複合体を形成して、下流シグナル伝達を妨げることが公知である（３３）。このために、ＵＵ－Ｔ０２由来のＰＨＩＣＳが設計されることになる（３４）。
上記に特定したキナーゼを使用して、本出願人らは、各標的に対する幾つかのＰＨＩＣＳ分子を設計し、インビトロでリン酸化を誘導するその能力を判定することになる。Ｕ２ＯＳ及びＨＥＫ２９３細胞株で予備的データが生成されることになる。細胞を活性又は不活性ＰＨＩＣＳで処理することになり、ホスホＳｅｒ／Ｔｈｒ又はＴｙｒに特異的な抗体による免疫沈降と、続くイムノブロッティング後、標的リン酸化をモニタすることになる。細胞を活性又は不活性ＰＨＩＣＳで処理した後にキナーゼ及び標的の免疫共沈降が試みられ、複合体形成が更に確認されることになる。第二に、リン酸化部位を同定し、且つＰＨＩＣＳ設計を何らか変更すると標的のリン酸化部位及びレベルに影響が及ぶかどうかを決定するため、質量分析研究も実施することになる。第三に、設計されたＰＨＩＣＳが様々な癌細胞モデルに及ぼす効果を判定することになる。より具体的に、Ｍｙｃ－Ｍａｘペアが関わる研究には、Ｐ４９３－６、ＳＴ４８６及びＭｙｃ誘導性Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）細胞株を使用することになる。ＥＲの場合、ＰＨＩＣＳ分子はＭＣＦ－７及びＴ４７Ｄ ＥＲ＋細胞で判定することになる。最後に、ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ Ｄａｏｙ ＭＢ及びＲｈ３６細胞株を使用してｐ５３及びβ－カテニンリン酸化効果を研究することになる。
提案される標的を直接リン酸化できない場合、本出願人らは、その結合パートナーのリン酸化によって転写因子を調節することになる。例えば、ｐ５３へのその結合が分解に関してそれを標識するＭＤＭ２又はＨＩＦ－αを安定化させるＨＳＰ９０は、それぞれＭＩ－１０６１又はデグエリン由来のＰＨＩＣＳで標的化することができる（３５～３７）。
以下の参考文献は、実施例４～５に関する。
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実施例６－チロシンキナーゼ結合剤の検証
ＰＨＩＣＳの範囲をＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ（ＡＭＰＫ又はＰＫＣ）を超えて拡大するため、本出願人らは、ＳＨ３－ＳＨ２－ＴＫ（３－Ｓｒｃホモロジー２－チロシンキナーゼ）ドメインを有する非受容体型チロシンキナーゼであるエーベルソン（ＡＢＬ）ファミリーを使用してＰＨＩＣＳを開発することになる（４２、４３）。分子内相互作用が関わる自己抑制機構により、このキナーゼが「ロックされた」コンホメーションで安定するため、活性化剤の結合によってＳＨ３ドメイン相互作用が破壊されない限り、キナーゼ活性を阻害する。ＡＢＬのＳＨ２ドメインは、基質特異性に関与する：ＳＨ２ドメインを別のタンパク質のＳＨ２ドメインに交換した場合、そのとき、基質特異性が変化する（４３）。ＡＢＬに好ましいプロリンリッチなリン酸化モチーフが同定されているが、多くの基質はこのモチーフを欠いているため、ＡＢＬキナーゼの特異性要件が柔軟であることが示唆され、このことはＰＨＩＣＳプラットフォームの開発に有益である。本出願人らは、２つのＡＢＬキナーゼ活性化剤を同定した（４４、４５）：ピラゾール活性化剤ＤＰＨ（図８３Ａ）及び細胞透過性の亢進を示すピラゾリン活性化剤。リンカーを有するＤＰＨ及びＤＰＨは両方とも（図８３Ｂ）、ＡＤＰ－ＧｌｏアッセイでＡＢＬを活性化させた（図８３Ｃ）。
方法
ＰＨＩＣＳのライブラリの合成。６つ全てについてのＰＨＩＣＳ分子の設計及び合成により、これらのタンパク質に対する幾つかのタンパク質分解ターゲティングキメラ（ＰＲＯＴＡＣ）が既に存在し、結合剤の選択、リンカーの種類及びその結合サイドが既に検証されているため、標的が単純であることが示唆された（４６）。本出願人らは、拡大したデータを生かして標的タンパク質の６つの結合剤（図８４Ａ）を選択しており、少なくとも３つの異なる長さのアルキル又はＰＥＧリンカー（図８４Ｂ）を介してこれらを３つの異なるキナーゼ活性化剤につなぐことになる。これらの結合剤は全て、ダサチニブ及びＭＲＴＸを除き、その標的の選択的可逆的阻害剤である。第１のものは、広域スペクトルチロシンキナーゼ阻害剤であり、これはＰＲＯＴＡＣの一部としてＡＢＬの選択的分解をなおも誘導した（４７）。第２は、可逆的共有結合性結合剤であり、これは、その不可逆的類似体が効率的なＰＲＯＴＡＣを生成できなかったとき、ＫＲＡＳＧ１２Ｃの分解への使用が成功した（４８）。これらの結合剤からのＰＨＩＣＳ分子は、多重薬理学及び共有結合性結合の可逆性がネオリン酸化に及ぼす効果及び得られるＨＬＡ提示に関して価値ある情報を提供することになる。キナーゼ結合剤に関しては、本出願人らは、ＡＭＰＫ、ＰＫＣ及びＡＢＬのナノモル濃度のアロステリック活性化剤：それぞれＰＦ－０６４０９５７７（ＡＭＰＫ α１β１γ１に対してＫｄ＝７ｎＭ）（２１）、ベンゾラクタム（ＰＫＣαに対してＫｄ＝４ｎＭ）（４９）及びジアリールピラゾリルヒダントイン（ＤＰＨ、Ｋｄ＝１３７ｎＭ）（４５）を選択した。３つの足場全てについて、リンカー結合部位は、ＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイで官能化を確認した後、既発表の結晶構造又はＳＡＲデータ及び活性に基づいて選択した。タンパク質標的毎に幾つかのＰＨＩＣＳ分子を作成するため、本出願人らは、ＰＲＯＴＡＣの合成方法と同様に、合理化された手法を利用することになる：カルボン酸又はそのＮＨＳエステルを含有する様々な長さのアルキル又はＰＥＧリンカーに、酵素動員アミン官能化キナーゼ活性化剤をコンジュゲートすることになる。リンカーの他方の末端は、アミン又はカルボン酸であることになり、これらは、それぞれ遊離酸（ＪＱ１及びＭＩ－１０６１の場合、図８４Ｃ）又はアミン（４つの他の結合剤、図８４Ｄ）と第２のアミド結合でカップリングすることになる。ＫＲＡＳターゲティングＰＨＩＣＳ分子の合成のみ、この概略的計画から外れることになる。α，β－不飽和アミド類は求核剤との反応性が高いため、可逆的共有結合性ＰＨＩＣＳは、分子をアクリルアミドで官能化する前にリンカーをコンジュゲートする必要がある。
ＰＨＩＣＳの生化学的検証。ＰＨＩＣＳ合成後、本出願人らはＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイを実施することにより、このアッセイのハイスループットの性質を生かして標的タンパク質リン酸化を決定することになる。次に、本出願人らは、種々のリンカーを有するＰＨＩＣＳの存在下でＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを用いて、キナーゼと標的タンパク質との間の三元複合体形成に最適な分子を同定することになる。このアッセイ後、標的タンパク質結合剤のＳＡＲ（構造活性関係）研究に基づき、選択されたＰＨＩＣＳの不活性対照を合成することになる。更に、活性及び不活性ＰＨＩＣＳでＡＤＰ－Ｇｌｏ及びＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを実施して、キナーゼ活性化及び三元複合体形成を確認することになる。これらの活性ＰＨＩＣＳ分子の触媒的性質をＡＤＰ－Ｇｌｏアッセイによって評価することになる。ウエスタンブロッティングを実施することにより、ホスホ－ＡＭＰＫ／ホスホ－ＰＫＣ基質モチーフ又はホスホ－チロシン抗体を使用して活性及び不活性ＰＨＩＣＳの存在下における標的タンパク質のリン酸化を決定することになる。ＰＨＩＣＳ誘導性リン酸化の用量及び時間依存性並びにホスファターゼに対するかかるリン酸化の感受性も判定することになる。活性又は不活性ＰＨＩＣＳの存在下で質量分析研究を実施して、標的タンパク質上の大域的ネオリン酸化部位を同定することになる。
ＰＨＩＣＳの細胞検証。合成したＰＨＩＣＳ分子を生化学アッセイで検証した後、各標的タンパク質並びにキナーゼの存在量に基づき、様々な癌細胞株でそれらの分子を判定することになる。それぞれの標的タンパク質及びキナーゼアイソフォームが細胞において異なる細胞内局在性を示し、本出願人らは、これを考慮に入れながら細胞ベースの研究を実施することになる。細胞を活性又は不活性ＰＨＩＣＳ分子で処理して三元複合体形成を確認した後、キナーゼ及び対応する標的タンパク質の免疫共沈降を試みることになる。細胞を活性又は不活性ＰＨＩＣＳで処理することになり、蛍光体－Ｓ／Ｔ／Ｙ抗体による免疫沈降と、続くイムノブロッティング後、標的のリン酸化をモニタすることになる。免疫沈降した試料を質量分析研究に供してリン酸化部位を同定することになる。更に、競合実験を実施して、過剰量の標的タンパク質結合剤の存在下でＰＨＩＣＳの標的会合を検証することになる。ＰＨＩＣＳ誘導性リン酸化の可逆性をウォッシュアウト実験によって特徴付けることになり、ＰＨＩＣＳの存在下においてホスファターゼ阻害剤で処理することにより、ホスファターゼによる脱リン酸化に対するネオリン酸化の抵抗性を判定することになる。最後に、同じ癌細胞株でＰＨＩＣＳ誘導性リン酸化の時間及び用量依存性を判定することになり、種々の癌細胞株における更なる特徴付けは、ＰＨＩＣＳ分子の細胞型特異性に関する情報を提供することになる。
質量分析によるＨＬＡ提示リンペプチドの検出及び分析。Ｓｔｅｖｅ Ｃａｒｒ博士の研究室と連携して、本出願人らは、ＨＬＡ結合リンペプチドを同定する既発表のプロトコル（１８、１９）に従うことにより、ＰＨＩＣＳによって誘導されるネオリン酸化を分析することになる。簡潔に言えば、異常にリン酸化したタンパク質のタンパク質分解から生成されたリンペプチドをＨＬＡクラスＩ分子に負荷する。次にＨＬＡ結合ペプチド複合体を細胞表面にシャトル輸送し、免疫系に提示して、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き出す。ここで、ＦＨＩＯＳＥ細胞には、ＶＬＤＬｒ配列を下流精製タグとして有する可溶性ＨＬＡ（ｓＨＬＡ）－Ａ＊０２０１コンストラクトを安定にトランスフェクトすることになる。続いて、細胞をＰＨＩＣＳと共にインキュベートすることになり、抗ＶＬＤＬｒ抗体とカップリングしたイムノアフィニティーカラムを使用してｓＨＬＡ／ペプチド複合体を抽出することになる。Ｆｅ（ＩＩＩ）－ＩＭＡＣカラムを用いたリンペプチド濃縮後、試料をＭＳ／ＭＳに供することになる。
代替的な手法。本出願人らは、アイソフォーム特異的キナーゼ結合剤に焦点を合わせた。しかしながら、一部の標的がリン酸化されない場合、本出願人らは、更なる汎アイソフォームキナーゼ結合剤を調査することになる。例えば、ＰＫＣ活性化剤インドラクタム（５０）及び汎ＡＭＰＫ活性化剤ＭＫ－８７２２５１は、ベンゾラクタム及びＰＦ－０６４０９５７７と比べてはるかに広い範囲のキナーゼ特異性を実証しており、これらの結合剤をベースとして設計されたＰＨＩＣＳは、幅広い範囲の潜在的標的を有することになる。選択された標的は、十分な研究がなされているオンコプロテインであり、これらも、特異性が様々である多様な一組の阻害剤を有する。例えば、γ－カルボリンは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．によってＢＲＤタンパク質の３つのアイソフォーム（ＢＲＤ２～４）に対するピコモル濃度の効力のＰＲＯＴＡＣを作り出すために使用された汎ＢＥＴタンパク質結合剤である（５２、５３）。最後に、種々の標的会合様式が利用されることになる。広域スペクトル結合剤（提案されている特異的結合剤と対比される）は、複数の標的のリン酸化がＨＬＡ提示にどのような影響を及ぼすかを決定する助けとなるであろう。
現在、ＫＲａｓＧ１２Ｃと可逆的共有結合を形成するＭＲＴＸベースの結合剤を除いては、選択された結合剤の大部分は非共有結合性である。最近になって、幾つかの報告において、共有結合性の可逆的ＰＲＯＴＡＣがその非共有結合性及び共有結合性の不可逆的類似体よりも優れていることが指摘された（５４）。本出願人らも、非共有結合性の結合剤が所望のレベルのリン酸化を提供できない場合、可逆的な共有結合性の結合手法（ＢＴＫ又はＥＧＦＲに対して）を適用することになる。提案されている種類のリンカーは、既報告のＰＲＯＴＡＣの大部分に対して極めて成功することが分かったという事実にも関わらず、個別の標的には、更なる最適化が必要となる可能性がある。ビスアミド化戦略の代替例として、本出願人らは、クリックケミストリーベースのＰＨＩＣＳアセンブリプラットフォーム（２３）及びアルデヒド／ハロゲン化物で官能化されたリンカーによるアミン含有結合剤の還元的アミノ化又はアルキル化を考察することになる。最後に、提案されている６つの標的のいずれも機能しない場合、市販の結合剤（フォレチニブ及びパルボシクリブ、図８４Ａ）でのｃ－ＭＥＴ及びＣＤＫ４／６が代替的な標的となることになる。
今後の方向性。第Ｉ相では、本出願人らはＰＨＩＣＳを開発し、適用することにより、ＰＨＩＣＳがＨＬＡ提示に影響を与えるかどうかを決定することになる。第ＩＩ相では、本出願人らは、ＨＬＡ提示が機能的帰結を有するかどうかを決定することになる。例えば、本出願人らは、これらのＨＬＡ提示が共培養系でＴ細胞の活性を惹起するかどうかを決定することになる。本出願人らは、ＰＨＩＣＳの開発についての何らかの一般的規則も開発することになる。例えば、大域的リン酸化プロテオミクスを用いて、本出願人らは、様々なキナーゼ活性化剤及び標的に関して作成されたＰＨＩＣＳによって誘導されるオフターゲットリン酸化を同定することになる。本出願人らは、非標的タンパク質のオフターゲットリン酸化のみならず、キナーゼ基質モチーフと一致しない標的タンパク質の範囲内にあるリン酸化部位のオフターゲットリン酸化にも焦点を合わせることになる。
キナーゼと標的タンパク質との間のタンパク質－タンパク質相互作用は、ＰＨＩＣＳ分子の活性を亢進させることも又は減弱させることもあり得る。ＰＨＩＣＳを含む個々の成分の結合親和性が極めて高い場合でも、強制的な配向が正しくない場合、そのとき、生産的複合体は、形成されないことになり、リン酸化が有効に起こらないことになる。キナーゼ／標的タンパク質結合剤のアイデンティティ、リンカー結合部位、リンカーの長さ及びアイデンティティ並びに出口ベクター－リンカーがどのようにタンパク質から抜け出るか－を変化させることにより、協同作用を推進することのできるＰＨＩＣＳを設計することができる（図８５）。協同作用の性質を決定するため、本出願人らは、三元複合体の平衡を理解するための数学的モデルを開発したＤａｖｉｄ Ｓｐｉｅｇｅｌ教授（エール大学）と連携して三体平衡に関する数学的フレームワークを構築することになる。
ＰＨＩＣＳは、幾つかの他のシナリオで有用であり得る。幾つかのリン酸化部位がユビキチンリガーゼを動員し（５５）、ＰＨＩＣＳによる標的化したタンパク質分解が可能となり得る（５６～６０）。本出願人らは、ＰＨＩＣＳが複数の方法でＰＲＯＴＡＣを補完するであろうことを注記する。例えば、ＰＨＩＣＳは、潜在的に幾つかの標的部位（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ及びＨｉｓ）を有し得るが、ＰＲＯＴＡＣが有するのはリジンのみである。ＰＲＯＴＡＣの効率はユビキチン化効率に依存し、これはリン酸化と比較すると複雑な過程である。ユビキチン化は、タンパク質の付加が関わる多段階修飾であり、多くの場合に準化学量論量のポリユビキチン化された種の不均一混合物を生じる。リン酸化は、小さいホスホリル基の付加（非コンカテネート）が関わるものであり、比較的単純である。最後に、ユビキチン化には、キナーゼと比較して大型の複合体が関わる。
転写因子及びタンパク質－タンパク質相互作用は、依然として化学的に扱いにくいものである。タンパク質リン酸化は中性残基を負電荷残基に変換し、過剰リン酸化が構造、結合相互作用又は静電表面に劇的な影響を及ぼし得る。例えば、ＤＮＡ結合を促進するように正電荷である転写因子のＤＮＡ結合ドメインが過剰にリン酸化すると、転写因子の結合親和性は下がることになる。同様に、過剰なリン酸化は、タンパク質－タンパク質相互作用も阻害し得る。従って、過剰なリン酸化は、化学的に扱いにくいタンパク質を標的化する一般的手法をもたらし得る。
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実施例７－局在化部分キナーゼ阻害剤及びその滞留時間
滞留時間タウ（τ）は、化合物がその標的上に滞留する時間として定義される：
Figure 2023509752000102
 （式中、Ｋｄは平衡定数である）。本明細書に開示される組成物の目標は、有効性の改善（接触の延長、阻害の延長）、より低い用量でのより長い薬理効果及びオフターゲット効果の低減を実現することである。化合物のその標的への結合は、薬物動態学と薬力学との間の関連付けと見ることができる（図８６）。長い標的滞留時間を有する局在化部分の同定を含め、滞留時間を調査することにより、遊離化合物が細胞から排出された後の時点で阻害性の部分を発見することが可能となる。本発明の多官能性化合物の設計戦略に利用することのできる種々の化合物及びその滞留時間の調査及び考察が以下に続く。
Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ－Ｓｅｅｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．は、滞留時間、キナーゼ阻害剤相互作用の会合及び解離定数並びに平衡親和性定数を調査して、酵素アッセイにおける阻害剤効力値（ＩＣ５０）及びキナーゼ阻害剤の生物学的活性の予測指標としての標的滞留時間を比較した。表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）によって決定したときの種々のキナーゼとその阻害剤との間の結合相互作用の反応速度を表４に示す（Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ－Ｓｅｅｇｅｒｓ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４２９（４）：５７４－５８６（２０１７），Ｔａｂｌｅ １；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１６．１２．０１９）。
Figure 2023509752000103
Figure 2023509752000104
Figure 2023509752000105
表５（Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ－Ｓｅｅｇｅｒｓ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４２９（４）：５７４－５８６（２０１７），Ｔａｂｌｅ ２；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１６．１２．０１９）は、３つの異なる可逆的ＥＧＦＲ阻害剤：ゲフィチニブ、エルロチニブ及びラパチニブの酵素アッセイにおける反応速度パラメータ及び効力を示す。実施したアッセイ及び結果は、Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ－Ｓｅｅｇｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）（参照により本明細書に援用される）に開示されるとおりである。
Figure 2023509752000106
Figure 2023509752000107
Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ－Ｓｅｅｇｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）の表Ｓ３において調査されているとおりの誘導適合結合モデルで入手された不可逆的チロシンキナーゼ阻害剤の見かけの反応速度パラメータを表６に示す。パラメータは見かけの（モデル化された）値であり、従ってアスタリスクを付して示す。
Figure 2023509752000108
表７は、１０個の異なるキナーゼに対するポナチニブの結合の反応速度パラメータ及び酵素アッセイにおけるＩＣ５０を示す（Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ－Ｓｅｅｇｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．の表Ｓ４）。
Figure 2023509752000109
Figure 2023509752000110
オーロラキナーゼは、細胞増殖に必須のセリン／スレオニンキナーゼである。これはホスホトランスフェラーゼ酵素であり、分裂細胞を助け、その遺伝子材料をその娘細胞へと分配する。オーロラＡは有糸分裂前期に機能し、中心体の正しい複製及び分離に必要である。オーロラＢは、セントロメアへの紡錘体の付着において機能する。オーロラＡ及びＢは遍在的に発現する。表８及び表９には、それぞれオーロラＡ及びＢのオーロラキナーゼ阻害剤の反応速度パラメータを掲載する（Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ－Ｓｅｅｇｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１７，Ｔａｂｌｅｓ ３Ａ ａｎｄ ３Ｂ）による。
Figure 2023509752000111
Figure 2023509752000112
Figure 2023509752000113
ＰＩ３Ｋキナーゼは、細胞成長、増殖、分化、運動性、生存及び細胞内輸送などの細胞機能に関与する、従って癌に関与する酵素のファミリーである。詳細には、α及びβアイソフォームは多くの細胞型に発現し、腫瘍学の主な標的となっている。ＰＩ３Ｋ ｐ１１０γ及びｐ１１０δ触媒サブユニットは造血細胞に発現し、適応及び自然免疫において役割を果たす。表１０～表１２は、ＰＩＫ３Ｃα／ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＫ３Ｃγ及びＰＩＫ３Ｃδ／ＰＩＫ３Ｒ１に対するＰＩ３Ｋ阻害剤の反応速度パラメータを掲載する。
Figure 2023509752000114
Figure 2023509752000115
Figure 2023509752000116
Figure 2023509752000117
サイクリン依存性プロテインキナーゼ８（ＣＤＫ８）は、幾つかの転写因子に結合する及び／又はそれをリン酸化することによるなど、幾つかの機構によって転写を調節し、これは転写因子機能に活性化効果又は阻害効果を及ぼし得る。ＣＤＫ８の阻害は、細胞成長を抑制し、且つ細胞アイデンティティ遺伝子ＣＥＢＰＡ及びＩＲＦ８を含むスーパーエンハンサー関連遺伝子の選択的且つ不均衡な上方制御を引き起こすことによる抗癌活性を有し得る。図８７は、様々な長さの滞留時間を示す幾つかのＣＤＫ８阻害剤の化学構造を示す。図８８は、図８７の化合物１～７との複合体中におけるヒトＣＤＫ８の結晶構造の活性部位を示す（Ｃａｌｌｅｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｈｅｍ Ｉｎｆ Ｍｏｄｅｌ ５７（２）：３８６（２０１７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１０（２０）：８０８１－８０８６（２０１３））。
ｐ３８αマイトジェン活性化プロテインキナーゼは、炎症誘発性サイトカイン生合成の調節において重要な役割を果たし、自己免疫性及び炎症性疾患の治療の治療標的である。これらのキナーゼの阻害剤の化学構造を図８９に示し、それらの実験的親和性、反応速度及びタンパク質コンホメーション状態の比較を表１３に掲載する。Ｂｒａｋａ ｅｔ ａ．，“Ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ Ｔｉｍｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ １ ａｎｄ ２ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｕｎｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．２０２０，６０，１，３４２－３４８，ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｃｉｍ，９ｂ００４９７）。Ｂ９６、ＢＭＵ、ＳＢ６は、ｐ３８αとの複合体中における構造が解かれており、それぞれＰＤＢコード１ＫＶ２，１ＫＶ１及び１Ａ９Ｕで利用可能である。Ｂｒａｋａ ｅｔ ａｌ．に開示されるとおりのこれらの化合物の相対的リガンド反応速度及び滞留時間を予測するプロトコルを使用して、本発明の多官能性分子における本発明者らにとっての候補薬物を同定することができる。
Figure 2023509752000118
Ａｂｌ１は、細胞分化、細胞分裂、細胞接着及びストレス応答の過程に関係があるとされるチロシンプロテインキナーゼである。このキナーゼの阻害剤の化学構造を以下に示し、阻害の反応速度を図９０に及び表１４に示す（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ“Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ Ｔｉｍｅｓ，”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ、ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ－ｄｏｃｕｍｅｎｔｓで利用可能）。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈの頁にあるこのＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅには、キナーゼ阻害剤の滞留時間を測定するプロトコルも提供され、キナーゼとの相互作用時における滞留時間を決定することが可能となり、所望の活性プロファイルを有する候補分子の計算が可能となる。
Figure 2023509752000119
Figure 2023509752000120
表１５（出典Ｒｏｓｋｏｓｋｉ Ｒ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｓ １０３：２６－４８（２０１６）の表５）は、様々な選択の薬物のそのプロテインキナーゼ標的との薬物－標的滞留時間を示す。ラパチニブ結合ポケットは、ＥＧＦＲをプロテインキナーゼ標的とする他の薬物と比べてはるかに大きく、ゲフィチニブ及びエルロチニブは、活性酵素形態からのそれらの解離にいかなるタンパク質コンホメーションの変化も必要ないため、短い滞留時間を示す。ＥＧＦＲからのラパチニブの解離には、受容体コンホメーション変化が必要であり得る。
Figure 2023509752000121
実施例８ Ａｂｌ－ＢＲＤ４キメラ分子
ＢＲＤ４局在化部分とＡｂｌ活性化剤部分とを含む多官能性分子をチロシンリン酸化活性に関してアッセイした（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（図９１）。活性分子ＶＳ８０１は、対照ＤＭＳＯ及び不活性分子ＶＳ８５０と比べて高いチロシンリン酸化酵素活性を示した。ＤＰＨ由来のＰＨＩＣＳリン酸化レベル、従ってＡｂｌ会合は、配向アダプター及びリンカーを介した多官能性キメラ分子へのＤＰＨ誘導体の結合によって変わる（図９２）。
Figure 2023509752000122
当業者には、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、説明される本発明の方法、医薬組成物及びキットの様々な改良形態及び変形形態が明らかであろう。本発明は、具体的な実施形態に関連して説明されているが、更なる改良形態が可能であり、特許請求されるとおりの本発明は、かかる具体的な実施形態に過度に限定されてはならないことが理解されるであろう。実際に、当業者に明らかな本発明の実施についての説明される態様の様々な改良形態は、本発明の範囲内にあることが意図される。本願は、概して、本発明の原理に従い、且つ本発明が関係する技術分野の範囲内にある公知の慣行の範囲内に入る本開示からのかかる逸脱を含む、本発明の任意の変形形態、使用又は適合形態を包含することを意図され、且つ以上に示される本明細書における必須の特徴に適用され得る。

Claims (46)

  1. 局在化部分と、化学的リンカー部分と、活性化剤部分と、前記化学的リンカー部分を一端で前記活性化剤部分に相互接続する第１の配向アダプターと、任意選択で、前記化学的リンカー分子を異なる端で前記局在化部分に相互接続する第２の配向アダプターとを含む多官能性化学的コンジュゲーション分子。
  2. 式Ｉ－Ａ
    Ｌｏｃ－Ｌ－（Ｖ１－Ａｃｔ）ｎ （Ｉ－Ａ）
    （式中、Ｌｏｃは、前記局在化部分を含み、Ｌは、前記化学的リンカー部分であり、Ｖ１は、前記第１の配向アダプターであり、及びＡｃｔは、前記活性化剤部分であり、ｎは、少なくとも１である）；又は式Ｉ－Ｂ
    Ｌｏｃ－Ｖ２－Ｌ－（Ｖ１－Ａｃｔ）ｎ （Ｉ－Ｂ）
    （式中、Ｌｏｃは、前記局在化部分を含み、Ｌは、前記化学的リンカー部分であり、Ｖ１は、前記第１の配向アダプターであり、Ｖ２は、前記第２の配向アダプターであり、及びＡｃｔは、前記活性化剤部分である）
    によって表される、請求項１に記載の分子。
  3. 前記第１及び第２の配向アダプターは、表２から独立に選択される、請求項１又は２に記載の分子。
  4. 前記活性化剤部分は、前記局在化部分と会合された標的基質を修飾する酵素に結合し、且つそれを活性化させる、請求項１に記載の分子。
  5. 前記標的基質は、前記酵素の天然基質ではないか、又は前記活性化剤分子による前記酵素の活性化は、前記活性化剤部分への結合によって活性化されない場合、本来、前記酵素によって修飾されないままである１つ以上の新しい修飾部位において、前記酵素による前記標的基質の修飾をもたらす、請求項４に記載の分子。
  6. リンカーは、
    Figure 2023509752000123
     （式中、ｎは、１～５０である）
    から選択される、請求項１に記載の分子。
  7. 前記リンカーは、ＰＥＧ分子、アルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキル、アリール、アルキレン、アルケニル、ヘテロアリール、アミド、アミン、チオール又はこれらの誘導体である、請求項１に記載の分子。
  8. 前記リンカーは、多官能性リンカーである、請求項１に記載の分子。
  9. 前記リンカーは、多官能性ＰＥＧリンカーである、請求項８に記載の分子。
  10. ｎは、２～５である、請求項２に記載の分子。
  11. 前記活性化剤部分は、酵素を見つけ出し、且つそれを活性化させる能力を有する、請求項１に記載の分子。
  12. 前記酵素は、キナーゼ、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ又はリガーゼである、請求項１１に記載の分子。
  13. 前記キナーゼ、セリン／スレオニンキナーゼ、チロシンキナーゼ又はタンパク質セリン／スレオニン及びタンパク質チロシンをリン酸化する二重特異性プロテインキナーゼである、請求項１２に記載の分子。
  14. 前記キナーゼは、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）、グルコキナーゼ（ＧＫ）又はＡＧＣキナーゼである、請求項１３に記載の分子。
  15. 前記活性化剤部分は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）に結合し、且つそれを活性化させる、請求項１に記載の分子。
  16. 前記活性化剤部分は、ＰＫＣ－α、ＰＫＣ－βＩ、ＰＫＣ－βＩＩ、ＰＫＣ－γ、ＰＫＣ－ε、ＰＫＣ－δ、ＰＫＣ－η又はＰＫＣ－ζから選択されるＰＫＣアイソフォームに結合し、且つそれを活性化させる、請求項１５に記載の分子。
  17. 前記活性化剤部分は、表２から選択される、請求項１５に記載の分子。
  18. 前記局在化部分は、核酸、ポリペプチド又は多糖を標的化する、請求項１に記載の分子。
  19. 前記局在化部分は、標的ポリペプチド結合部分である、請求項１に記載の分子。
  20. 前記標的ポリペプチド結合部分は、ブロモドメイン及びエクストラターミナルモチーフ（ＢＥＴ）を含む標的ポリペプチドに結合する、請求項１９に記載の分子。
  21. 前記標的ポリペプチドは、ブロモドメイン含有タンパク質４（ＢＲＤ４）、ＢＲＤ３、ＢＲＤ２、ＢＲＤＴである、請求項２０に記載の分子。
  22. 前記標的ポリペプチド結合部分は、（＋）－ＪＱ１である、請求項２１に記載の分子。
  23. 式
    Figure 2023509752000124
     （式中、ｎ＝３、５、７、９、１１［ＰＨＩＣＳ１．１～１．５］である）
    に係るものである、請求項１に記載の分子。
  24. 式
    Figure 2023509752000125
     （式中、ｎ＝０及びｍ＝０、ｎ＝１及びｍ＝１、ｎ＝２及びｍ＝３、ｎ＝２及びｍ＝１、ｎ＝２及びｍ＝３である）
    に係るものである、請求項１に記載の分子。
  25. Figure 2023509752000126
     から選択される、請求項２４に記載の分子。
  26. 前記局在化部分は、表Ｙから独立に選択され、前記活性化部分は、表Ｚから独立に選択され、前記第１及び第２の配向アダプターは、表１から独立に選択され、及び前記リンカーは、表２から独立に選択される、請求項１に記載の分子。
  27. 式
    Figure 2023509752000127
     （式中、Ｘは、（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎ（ＯＣ２Ｈ４）ｎ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２（ＯＣ２Ｈ４）ｎ及び（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ（ＯＣ２Ｈ４）ｎから選択され、ここで、各ｎは、０、１、２、３、４、５、６又は７から独立に選択され、及びＲは、
    Figure 2023509752000128
     である）
    に係るものである、請求項１に記載の分子。
  28. 式
    Figure 2023509752000129
     に係るものである、請求項１に記載の分子。
  29. 式
    Figure 2023509752000130
     （式中、Ｒ１は、ＪＱ１、イブルチニブ、ダサチニブ、ＭＲＴＸ、ＭＩ－１０６１、ゲフィチニブ、パルボシクリブ又はフォレチニブから選択され、及びＲ２は、ＰＦ－０６４０９５７７、ベンゾラクタム又はＤＰＨから選択され、Ｘは、ＣＨ２又は（ＣＨ２）２Ｏであり、及びＸ＝ＣＨ２であるとき、ｎ＝１若しくは５又はｍ＝０若しくは４であり、Ｘ＝（ＣＨ２）２Ｏであるとき、ｎ＝３又はｍ＝３である）
    に係るものである、請求項１に記載の分子。
  30. 請求項１～２９のいずれか一項に記載の分子と、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、担体又は希釈剤とを含む医薬組成物。
  31. ＡＭＰを更に含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 細胞の標的基質を修飾する方法であって、前記細胞を、請求項１～３２のいずれか一項に記載の分子と接触させることを含む方法。
  33. 前記修飾は、翻訳後修飾を含む、請求項３３に記載の方法。
  34. 前記翻訳後修飾は、リン酸化、ヒドロキシル化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、プレニル化、アミド化、エリミニレーション、脂質化、アシル化、リポイル化、脱アセチル化、ホルミル化、Ｓ－ニトロシル化、Ｓ－スルフェニル化、スルホニル化、スルフィニル化、スクシニル化、硫酸化、カルボニル化又はアルキル化を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記修飾は、前記細胞におけるタンパク質のリン酸化を誘導することを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. タンパク質をリン酸化する方法であって、前記タンパク質を、請求項１～３２のいずれか一項に記載の分子と接触させることを含み、前記タンパク質は、前記分子の前記活性化剤部分に特異的なキナーゼに近接している、方法。
  37. 前記タンパク質の前記リン酸化は、前記キナーゼの基質でない複数のタンパク質のリン酸化を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記タンパク質は、ＢＲＤ４である、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記タンパク質は、前記ＢＲＤ４のＢＤ１とＢＤ２との間でリン酸化される、請求項３８に記載の方法。
  40. 標的基質の修飾を、それを必要としている対象において行う方法であって、請求項１～３２のいずれか一項に記載の分子を前記対象に投与することを含む方法。
  41. 前記対象は、癌を有する、請求項４０に記載の方法。
  42. 目的のタンパク質を修飾する方法であって、１つ以上の活性化剤を含む環境において、前記目的のタンパク質を、請求項１～３２のいずれか一項に記載の化合物と接触させることを含む方法。
  43. 疾患、障害又は病態の治療を、それを必要としている対象において行う方法であって、請求項１～３２のいずれか一項に記載の分子を前記対象に投与することを含む方法。
  44. 多官能性コンジュゲーション分子を作製する方法であって、リンカー分子の異なる端に局在化部分及び活性化剤部分を結合することを含み、前記局在化部分及び活性化剤部分は、任意選択で、配向アダプターを介して前記リンカー分子に結合され、前記リンカー分子は、前記活性化剤分子及び局在化部分の両方が細胞において活性であるように、前記活性化剤分子を連結する、方法。
  45. 前記化合物は、表４、表５、表６、表８、表９、表１０、表１１、表１２又は表１４からの化合物から選択される、請求項４２に記載の方法。
  46. 式
    Figure 2023509752000131
     に係るものである、請求項１に記載の組成物。
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