JP2023507629A - 肥満の予防および処置のための組成物および方法 - Google Patents

肥満の予防および処置のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

６４Ｚｎが濃縮された亜鉛を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、過体重または肥満の対象の体重を低減するための方法。６４Ｚｎが濃縮された亜鉛を含む有効量の組成物を投与することを含む、体重増加を予防または低減するための方法。

Description

本開示は、過体重および肥満の予防および治療に関する。
肥満は現在、あらゆる年齢で発生し得る慢性代謝性疾患であり、主に脂肪組織の過剰な蓄積に起因する体重の過度の増加を特徴としている。過体重および肥満は、先進国で最も一般的な栄養関連の問題である。ＷＨＯのデータによれば、１８歳以上の成人１９億人以上が太りすぎである。これらのうち、６億人以上が肥満である（世界保健機関、２０１５年）。これらの障害の新たに診断された症例の数は毎年増加している。さらに心配なのは、小児肥満のレベルが驚くべき速度で増加していることである。したがって、２０１４年には、５歳未満の約４，０００万人の子供が太りすぎであった。小児期の肥満は成人期の肥満の深刻な予測因子であり、早死または障害のリスクを有意に高めることを考えると、このような状況は必然的に懸念を引き起こす。
肥満に対する現行の薬物療法は、限定的であり、効果がなく、および／または副作用を伴う。
一態様では、本開示は、亜鉛（６４Ｚｎが濃縮された亜鉛である）を含む組成物を提供する（「６４Ｚｎｅ」という用語は、本明細書では、６４Ｚｎが濃縮された亜鉛を指して使用される）；組成物は、肥満および過体重を予防または処置するための治療的または予防的に有効な量（用量）で提供される。別の態様では、前記組成物の使用方法が提供される。いくつかの実施形態において、６４Ｚｎが濃縮された亜鉛は、６４Ｚｎｅ化合物または６４Ｚｎｅ塩の形態である。
開示される組成物は、６４Ｚｎが濃縮された亜鉛を含有する。特定の実施形態において、開示される組成物は、少なくとも８０％の６４Ｚｎｅ、少なくとも９０％の６４Ｚｎｅ、少なくとも９５％の６４Ｚｎｅ、または少なくとも９９％の６４Ｚｎｅである亜鉛、例えば、８０％の６４Ｚｎｅ、８５％の６４Ｚｎｅ、９０％の６４Ｚｎｅ、９５％の６４Ｚｎｅ、９９％の６４Ｚｎｅ、または９９．９％の６４Ｚｎｅである亜鉛を含有する。
別の態様では、本開示は、予防的または治療的に有効な量の開示された組成物を対象に投与して、対象の体重を減少させるか、または体重増加を予防もしくは減少させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、対象は、過体重または肥満であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、過体重または肥満になることを回避したい人であり得る。対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類であっても、または飼いならされたイヌもしくはネコであってもよい。
本発明のこれらおよび他の態様に従って、多数の他の態様が提供される。本発明の他の特徴および態様は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。
図１は、実験群（Ｍ±ｎ、ｎ＝１０）の動物の体重増加の動態を示している。 図２は、実験群（Ｍ±ｎ、ｎ＝１０）の動物によって消費された食物のカロリー含有量を示している。注：１－対照；２－対照＋アスパラギン酸型の６４Ｚｎｅ安定同位体；３－食事誘導性肥満＋アスパラギン酸型の６４Ｚｎｅ安定同位体；４－食事誘導性肥満。 図３は、実験動物の血中のインスリンレベルを示している（Ｍ±ｎ、ｎ＝１０）。 図４は実験動物の膵島面積を示す（Ｍ±ｎ、ｎ＝１０）。 図５は、実験群（Ｍ±ｎ、ｎ＝１０）における動物の体重増加の動態を示している。注：Ｃ－対照；Ｃ＋亜鉛－アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与のバックグラウンドに対する対照；ＤＩＯ－食事誘導性肥満；ＤＩＯ＋亜鉛－アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与のバックグラウンドに対する食事誘導性肥満。 図６は、実験群（Ｍ±ｎ、ｎ＝１０）の動物によって消費された食物のカロリー含有量を示している。注：１－対照；２－対照＋アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体；３－肥満＋アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体；４－肥満。 図７Ａ～図７Ｆは、対照（図７Ａ～図７Ｃ）および肥満（図７Ｄ～図７Ｆ）群、ヘマトキシリンおよびエオシンからの動物における膵臓の切片の顕微鏡写真を示し、矢印は、顕著な脂肪変性を伴う外分泌細胞を示す（接眼１０×対物１０、接眼１０×対物４０）。 図８Ａ～図８Ｆは、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された対照群（図８Ａ～図８Ｃ）の動物、およびアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された肥満群（図８Ｄ～図８Ｆ）の動物の膵臓の切片の顕微鏡写真を示す（ヘマトキシリンおよびエオシン、接眼１０×対物１０、接眼１０×対物４０）。 図９は、ランゲルハンス島の断面積を示している。＊－対照群と実験群との間の差は、р≦０．０５の場合に有意である；＃－肥満群とアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された肥満群との間の差は、р≦０．０５の場合に有意である。 図１０Ａ～図１０Ｄは、対照（図１０Ａおよび図１０Ｂ）および肥満（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）群の動物における肝臓の切片の顕微鏡写真を示す（ヘマトキシリンおよびエオシン、接眼１０×対物１０、接眼１０×対物４０）。 図１１Ａ～図１１Ｄは、全ての動物は、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置した対照群（図１１Ａおよび図１１Ｂ）および肥満群（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）の動物の肝臓の切片の顕微鏡写真を示す（ヘマトキシリンおよびエオシン、接眼１０×対物１０、接眼１０×対物４０）。 図１２Ａ（肝細胞核面積）、図１２Ｂ（肝細胞面積）、および図１２Ｃ（肝細胞の核対細胞質の比）は、肝臓の形態学的分析を示している。＊－対照群と実験群の差は、р≦０．０５の場合に有意である。＃－アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された肥満群と肥満群の差は、р≦０．０５の場合に有意である。 図１３Ａ～図１３Ｄは、対照群（図１３Ａおよび図１３Ｂ）および肥満群（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）由来の動物における肝臓の切片の顕微鏡写真を示す（コラーゲン線維（線維症）の検出にはヴァンギーソンの染色法、接眼１０×対物１０、接眼１０×対物４０）。 図１４Ａ～図１４Ｄは、全ての動物は、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置した、対照群（図１４Ａおよび図１４Ｂ）および肥満群（図１４Ｃおよび図１４Ｄ）由来の動物における肝臓の切片の顕微鏡写真を示す（コラーゲン線維（線維症）の検出にはヴァンギーソンの染色法、接眼１０×対物１０、接眼１０×対物４０）。 図１５は、肝線維症の形態計測分析を示している。＊－対照群と実験群との間の差は、р≦０．０５の場合に有意である。＃－肥満群と、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された肥満群との間の差は、р≦０．０５の場合に有意である。 図１６Ａ～図１６Ｅは、実験群の動物による体重、食物および水の消費量の分析を示している。図１６Ａは動物１匹あたりのグラム単位の食物消費率；図１６Ｂは動物１匹あたりのｍｌ単位の水消費率；図１６Ｃは動物１匹あたりの１日あたりの平均食物消費量（実験中）；図１６Ｄは、動物１匹あたりの１日あたりの平均水消費量（実験中）；図１６Ｅは、薬物投与２週間後のラットの体重増加。 図１７は、血清インスリンレベル（ＣＵ／総タンパク質のｍｇ）を示すグラフである。 図１８Ａ（血清）および図１８Ｂ（肝臓）は、スーパーオキシドジスムターゼ活性（抗酸化Ｚｎ依存性酵素）ＣＵ／ｍｇ＊分を示すグラフである。 図１９は、実験動物の膵臓におけるランゲルハンス島の面積の測定値を示すグラフである（顕微鏡で、最後の薬物投与後７日目）。 図２０Ａ～図２０Ｆは、ランゲルハンス島の顕微鏡写真である。図２０Ａおよび図２０Ｂ－上部パネル；図２０Ｃおよび図２０Ｄ－中央のパネル；図２０Ｅおよび図２０Ｆ－下部パネル。 図２１Ａ～図２１Ｃは、実験動物の肝臓組織における金属の蓄積を示している。 図２２Ａ～図２２Ｃは、実験動物の腎臓組織における金属の蓄積を示している。 図２３Ａ～図２３Ｆは、ランゲルハンス島の顕微鏡写真である。図２３Ａおよび図２３Ｂ－対照群、それぞれ倍率は×１０および×４０、図２３Ｃおよび２３Ｄ－酢酸亜鉛、比較群、それぞれ倍率は×１０および×４０、図２３Ｅおよび２３Ｆ－亜鉛同位体、治療群、それぞれ倍率は×１０および×４０。
本明細書で使用される場合、名詞の前の「１つの、ある（ａ）」または「複数」という単語は、特定の名詞の１つ以上を表す。
「例えば」および「など」という用語、ならびにそれらの文法的同等物については、特に明記しない限り、「および限定するものではないが」という句が続くと理解される。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、実験誤差による変動を説明することを意味する。本明細書で報告されている全ての測定値は、用語が明示的に使用されているか否かに関係なく、特に明記されていない限り、「約」という用語によって修飾されると理解される。本明細書で使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「この、その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の言及を含む。
「有効量」、「予防的有効量」、または「治療的有効量」とは、対象に有益な効果または好ましい結果を提供する薬剤または組成物の量、あるいは、所望のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）またはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）活性を示す薬剤または組成物の量を指す。「有効量」、「予防的有効量」、または「治療的有効量」とは、所望の生物学的、治療的、および／または予防的結果を提供する薬剤または組成物の量を指す。その結果は、患者／対象の疾患、障害もしくは状態の１つ以上の兆候、症状、もしくは原因の軽減、改善、寛解、減少、遅延、および／もしくは緩和、または生物学的システムの任意の他の望ましい変化であり得る。有効量は、１回以上の投与で投与してもよい。
「有効量」、「予防的有効量」、または「治療的有効量」は、細胞培養アッセイに従って、または動物モデル、典型的にはマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌもしくはブタを使用して、最初に推定され得る。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲および投与経路を決定してもよい。次に、そのような情報を使用して、ヒトの適切な用量および投与経路を決定し得る。ヒトの等価用量を計算する場合、Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers ［U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration,Center for Drug Evaluation and Research (CDER), July 2005］に記載されているような変換表を使用してもよい。当業者は、非ヒトデータに基づいてヒト治療投与量を開発するためにも使用され得る追加のガイダンスを承知している。有効用量は、一般に、活性剤の０．０１ｍｇ／ｋｇ～２０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、活性剤の０．０５ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇである。正確な有効用量は、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重および性別、栄養、投与の時間および頻度、医薬の組み合わせ、反応感受性、および投与に対する耐性／反応、ならびに当技術分野の知識に基づいて特定の患者の投与量および投与経路を決定する際に当業者によって考慮される他の要因に依存する。このような用量は、慣用的な実験を実施することにより、医師の裁量で決定し得る。有効用量は、他の薬剤の使用など、他の治療手順との併用の可能性によっても異なる。
本明細書で使用される場合、「患者」および「対象」とは互換性のある用語であり、ヒトの患者／対象、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類などを指し得る。
「過体重（ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ）」（または「過体重（ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔｎｅｓｓ）」）および「肥満」という用語は、特定の高さで正常または健康であると見なされる体重よりも大きい体重を指す。人のボディマス指数（ＢＭＩ）は、ある人が健康な体重であるか、過体重であるか、または肥満であるかを判断する１つの方法である。ＢＭＩは、身長に対する人の体重に基づく尺度である。ＢＭＩが大きいほど、過体重および肥満による健康問題のリスクが高くなる。過体重とは、ＢＭＩが２５～２９．９であると定義され得る。肥満とは、ＢＭＩが３０以上であると定義され得る。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法および材料を本明細書に記載する。当技術分野で公知の他の適切な方法および材料も使用し得る。材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図したものではない。本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含め、本明細書が優先される。
肥満
肥満は、あらゆる年齢で起こり得る慢性代謝性疾患であり、主に脂肪組織の過剰な蓄積による体重の過度の増加を特徴とする。過体重および肥満は、先進国で最も一般的な栄養関連の問題である。ＷＨＯのデータによると、１８歳以上の成人１９億人以上が太りすぎである。これらのうち、６億人以上が肥満である（世界保健機関、２０１５年）。この疾患の新たに診断された症例の数は毎年増加している。さらに心配なのは、小児肥満のレベルが驚くべき速度で増加していることである。したがって、２０１４年には、５歳未満の約４，０００万人の子供が太りすぎであった。小児期の肥満は成人期の肥満の深刻な予測因子であり、早死や障害のリスクを大幅に高めることを考えると、このような状況は必然的に懸念を引き起こす。
したがって、社会的および職業的所属、居住地、年齢または性別に関係なく、人口の異なるセグメント間でのこの疾患の有病率の増大する動態によって、肥満の問題は社会的に重要な問題というレベルにされ、この解決策として、この病状の予防および処置への早急な対応および革新的なアプローチが必要である。
肥満は、正常な代謝、細胞レベルで食物をエネルギーに変換するプロセスの破壊の結果として発生する。肥満は多因子性疾患であり、その病因および原因は多くの要因の累積的影響と関連しており、ほとんどの身体系の機能の崩壊を伴う。過体重および肥満は、例えば、心血管疾患、高血圧、２型真性糖尿病、特定の癌、脂質異常症、脂肪性肝疾患および肝硬変、骨関節炎ならびに種々の精神障害などを含む、多くの併存疾患および合併症の発症の主なリスク要因である。肥満は、世界中で予防可能な主要な死亡原因の１つであり、成人と小児の割合が増加しており、２１世紀で最も深刻な公衆衛生上の問題の１つと見なされている。
過剰な反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成に起因する酸化ストレスの長期的な活性化、および体の抗酸化剤予備能の枯渇を背景に発生するフリーラジカル反応の強化は、肥満および肥満関連疾患の両方の病因の根底にある重要な病原性因子の１つである。肥満関連障害の発症と進行に関与する別の機構は、慢性炎症過程の誘導に関連している。その低強度は直接的な臨床症状を引き起こさないが、同時に、このプロセスは、機能的活動の変化につながる広範囲の器官および組織をカバーするので、全身的である。
肥満の多因子的性質を考えると、その処置は包括的であり、特定の治療剤、および極端な場合には、外科的介入の使用とともに非薬物アプローチ（食事療法、運動、行動の矯正および食事パターン）の使用を含む段階的戦略に基づくべきである。
既存の治療的抗肥満剤は、幅広いクラスの食欲抑制剤、脂肪吸収阻害剤、およびカロリー燃焼を増大するのを助ける刺激剤に分けられる。この病状の処置に現在広く使用されている医薬品には、多くの深刻な副作用がある。長期間投与するか、または単剤療法として使用した場合には、体重を年間８～１０％しか低減することができない。現在長期使用が承認されている抗肥満薬としては、オルリスタット（ｏｒｌｉｓｔａｔ）（商品名：ＸＥＮＩＣＡＬ）およびシブトラミン（商品名：ＲＥＤＵＣＴＩＬ）（Haslam、D. "Weight management in obesity - past and present." Int J Clin Pract. 2016:206-17）が挙げられる。オルリスタットは、リパーゼ阻害剤として膵臓リパーゼを阻害し、小腸からの脂肪の消化および吸収を低減し、シブトラミンは食欲抑制剤としてノルエピネフリンおよびセロトニンの再取り込みを阻害する。しかし、オルリスタットは、脂溶性ビタミンの吸収不良、腹部不快感、膨満感、油性便などを誘導し、シブトラミンは頭痛、口渇（激しい喉の渇き）、不眠症、便秘などの副作用を引き起こす。
したがって、肥満に対する薬物療法は限定的であり、副作用を伴う。抗肥満薬は、原則として、短期的な改善しか提供せず、持続的な長期的な効果は提供しない。したがって、副作用がなく、長期間使用しても安全である、効果的な抗肥満剤に対する大きな満たされないニーズがある。
先行技術の様々な方法および手段は、繊維、ビタミンおよび他の生物学的に活性な成分（穀物および全粒粉、野菜、果物、ナッツ、葉野菜など）が多く、体に吸収されやすい炭水化物（糖、お菓子、ペストリー、ベーカリー製品、および強力粉で作られたパスタ）が少ない食事をすること（特許ＲＵ２１４７２２８、公開日：２０００年４月１０日）、ならびに身体運動に基づく。ただし、食事の変更は臨床試験の実施には効果的であるが、日常的に食事を維持することが難しいため、実際の生活ではそれほど効果的ではない。さらに、多くの科学者は、食事は肥満の処置には役に立たないと信じている。
有効成分としてオカトラノオ属のつる植物（ｍｏｎｅｙｗｏｒｔ）抽出物（Ｌｙｓｉｍａｃｈｉａｅ ｆｏｅｎｕｍ－ｇｒａｅｃｉ ｈｅｒｂａ）を含む、当技術分野で記載されている肥満の予防および処置のための組成物が存在する（ＲＵ２４７５２５６、公開日：２０１３年２月２０日）。前記抽出物は細胞毒性が低いが、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）［脂肪細胞（ｆａｔ ｃｅｌｌ）］の分化を阻害し、肥満の動物モデルにおいて体重および体脂肪の減少をもたらす。しかし、前記抽出物は十分な効果を提供しない。
別の公知の抗肥満剤は、α－リポ酸およびＮ－アセチルシステインの組み合わせである（ＲＵ２６７０６１２、公開日：２０１８年８月１７日）。α－リポ酸は、酵母などの一部の食品および肝臓などの臓器肉に見出され得る微量成分である。α－リポ酸は、ピルビン酸またはα－ケトグルタル酸の完全な酸化的脱炭酸システムにおいて、チアミンに密接に関連する補酵素として生理学的に作用し、抗酸化剤としても機能する。Ｎ－アセチルシステインは、過酸化物、過酸化物－水素、ヒドロキシルラジカルと直接相互作用して酸化ストレスを軽減するか、またはグルタチオン生合成の出発物質であるシステインを提供することで抗酸化作用を有し、間接的にグルタチオン合成を増加させる。しかし、α－リポ酸は、消化不良（胸やけ、腹痛、悪心、下痢）、低血糖（血糖値の低下）、およびアレルギー反応などの悪影響を誘導し得、Ｎ－アセチルシステインは、高齢者の収縮期圧および拡張期圧の増大を引き起こし得る。
ＷＯ２０１８１４４９１１（公開日：２０１８年８月９日）は、タンパク質、ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ、亜鉛およびマグネシウムを含む減量組成物を記載している。この組成物は、カロリー含有量が低いが、元素の亜鉛は体内にほとんど吸収されないため、肥満の処置に対するそのような組成物の有効性が低下する。前記組成物は、むしろ栄養補助食品として使用され得る。
体重管理のための別の方法は、ＷＯ２０１６１９３０６７（公開日：２０１８年５月１０日）に記載されている。それは、桂皮アルデヒドならびに硫酸亜鉛、乳酸亜鉛およびクエン酸亜鉛からなる群から選択される亜鉛塩を含む組成物の使用を含み、ここで桂皮アルデヒド：亜鉛比は、好ましくは１：０．５～１：０．００５、より好ましくは１：０．０３（モル濃度）である。前記組成物は、インスリン感受性、耐糖能、認知能力、認知、気分および記憶を改善するために推奨される。この組成物はまた、亜鉛塩の使用を提供するが、この元素の生物学的利用能が低いことに起因して、高い効果を達成することはできない。
亜鉛
亜鉛は、人体の適切な代謝状態を確保するために不可欠な微量元素である。全身の２００以上の酵素が亜鉛に依存している。この元素は、酵素の構成要素または酵素の全てのクラスをカバーするそれらの活性の調節因子のいずれかである：トランスフェラーゼ（ＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、チミジンキナーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、カルボキシペプチダーゼおよび他のペプチダーゼ）、ヒドロラーゼ（アルカリホスファターゼ、５－ヌクレオチダーゼ）、アミノペプチダーゼなど）、リアーゼ（アルドラーゼ、炭酸脱水素酵素など）、酸化還元酵素（アルコールデヒドロゲナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼなど）、リガーゼおよびイソメラーゼ。亜鉛がないと、タンパク質、脂肪、炭水化物の代謝は不可能である。
亜鉛はまた、媒介された抗酸化効果を示すことが証明されている。亜鉛は、非常に攻撃的なスーパーオキシドアニオンラジカルの生成を触媒する酵素複合体であるＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤である。さらに、連鎖反応の開始段階でのフリーラジカルの酸化に直接影響を与える可能性がある；これは、Ｃｕ／Ｚｎ含有スーパーオキシドジスムターゼを含む抗酸化防御システムのいくつかの酵素の構造成分である。亜鉛は、タンパク質のチオール基を結合することにより、反応性酸素種による酸化からタンパク質を保護する。この微量元素は、フリーラジカルスカベンジャーとして作用するシステインリッチタンパク質であるメタロチオネインの合成を誘導する。亜鉛は、反応性混合原子価金属酸化物の形成を抑制し、膜構造の安定化に関与する。
亜鉛の代謝的および構造的重要性は、その生物学的活性の広いスペクトルによって決定される。したがって、亜鉛は、細胞の分裂および分化（成長、組織再生、精子形成など）に関連するプロセスの正常な実行に必要であり、核酸の代謝およびタンパク質合成に積極的に関与している。この微量元素は、多不飽和脂肪酸の代謝およびプロスタグランジン変換の反応に重要である。それは顕著な脂肪親和性活性を示し、肝保護特性を有する。Haase H., Rink L. Zinc Signaling. Zinc in Human Health// Amsterdam, Netherlands: IOS Press.2011. 243.
さらに、亜鉛は食細胞とリンパ球の活性の調節因子であり、好中球の走化性に影響を与えるので、免疫反応において非常に重要な役割を果たす。亜鉛含有酵素である５－ヌクレオチダーゼは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の機能状態において非常に重要である。孤立した亜鉛欠乏は、胸腺の萎縮、細胞を介した細胞毒性の阻害、リンパ球の総数の減少など、Ｔ細胞機能の様々なパラメーターに深刻な障害を引き起こす。亜鉛は、下垂体ホルモン、副腎、膵臓、前立腺、および精巣の代謝および活動の刺激に関与している。亜鉛は、インスリンの合成、貯蔵、分泌において明確な役割を果たしている。Haase H., Rink L. Zinc Signaling. Zinc in Human Health// Amsterdam, Netherlands: IOS Press. 2011. 243。
亜鉛はまた、多くの微量元素およびビタミン（鉄、銅、マグネシウム、ビタミンＡ、Ｅ、葉酸など）の吸収に対する相乗剤／アンタゴニストとして作用し、それらの代謝に影響を与える。
まとめると、亜鉛は、人体における様々な重要なプロセスおよび機能に関与している。これらの機能のいくつかの詳細な研究はまだ完全には完了しておらず、この微量元素の作用機構の多くはまだ完全には理解も認識もされていない。しかし、文献に示されている実験的および臨床的研究は、亜鉛が重要な要素の１つであることを示しており、体内でそのレベルが低下することは、多くの最も蔓延している非流行性疾患の発症および進行に関連している。体内の主な代謝プロセスは、亜鉛含有および亜鉛依存性酵素の積極的な関与によって発生するので、その欠乏は多くの重要なプロセスの妨害を引き起こす。
亜鉛の古典的な薬理学的形態（亜鉛塩およびそのキレート）の使用は、この元素の低い生物学的利用能に起因して、亜鉛欠乏を補償する適切な効果を達成することを常に可能にするわけではない。
処置方法および組成物
一態様では、本開示は、肥満および過体重を予防および／または処置するための治療的または予防的に有効な量（用量）で、亜鉛（６４Ｚｎが濃縮された亜鉛である）を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、６４Ｚｎが濃縮された亜鉛は、６４Ｚｎｅ化合物または６４Ｚｎｅ塩の形態である。いくつかの実施形態において、開示された組成物は、６４Ｚｎｅが、２つのアスパラギン酸分子を有するアスパラギン酸塩（化学式－С４Ｈ５Ｏ４Ｎ６４Ｚｎｅ）、硫酸塩、およびクエン酸塩からなる群から選択される塩の形態である。
「６４Ｚｎｅ」という用語は、本明細書では、６４Ｚｎが濃縮された亜鉛を指すために使用される。すなわち、６４Ｚｎが自然界の亜鉛の通常の割合よりも濃縮されるように、６４Ｚｎが濃縮された亜鉛である。
開示された組成物は、６４Ｚｎｅについて濃縮された亜鉛を含有する。軽い同位体６４Ｚｎｅの形態の亜鉛は、天然に存在する亜鉛よりもはるかによく体内に吸収される。特定の実施形態において、開示される組成物は、少なくとも８０％の６４Ｚｎｅ、少なくとも９０％の６４Ｚｎｅ、少なくとも９５％の６４Ｚｎｅ、または少なくとも９９％の６４Ｚｎｅである亜鉛、例えば、８０％の６４Ｚｎｅ、８５％の６４Ｚｎｅ、９０％の６４Ｚｎｅ、９５％の６４Ｚｎｅ、９９％の６４Ｚｎｅ、または９９．９％の６４Ｚｎｅである亜鉛を含有する。
別の態様では、本開示は、治療的または予防的に有効な量の開示された組成物を、それを必要とする対象に投与することによって、肥満および／または過体重を処置および／または予防する方法を提供する。
開示される組成物は、対象の体重を減少させるために、または体重増加を予防もしくは減少させるために、対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、対象は、過体重であっても、または肥満であってもよい。いくつかの実施形態において、対象とは、過体重または肥満になることを回避したい人であり得る。対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類または飼いならされたイヌもしくはネコであってもよい。
６４Ｚｎｅ化合物またはその塩を含む予防的または治療的に有効な量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、過体重または肥満を予防または処置する方法が提供される。治療有効量の６４Ｚｎｅ化合物またはその塩を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象の血清中のトリグリセリド、コレステロールおよび遊離脂肪酸のレベルを低下させる方法が提供される。治療有効量の６４Ｚｎｅ化合物またはその塩を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象の血清および脂肪組織中の炎症誘発性サイトカインのレベルを低下させる方法が提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、希釈剤または賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、希釈剤は水である。さらなる実施形態において、水希釈剤は、重水素枯渇水である。いくつかの実施形態において、６４Ｚｎｅ化合物またはその塩は、２０～１００％の６４Ｚｎｅである。さらなる実施形態において、６４Ｚｎｅ化合物またはその塩は、少なくとも８０％の６４Ｚｎｅである。さらなる実施形態において、６４Ｚｎｅ化合物またはその塩は、少なくとも９５％の６４Ｚｎｅである。いくつかの実施形態では、組成物は、０．０５ｍｇと１１０ｍｇの間の６４Ｚｎｅを含有する。いくつかの実施形態において、組成物は、１と１０ｍｇの間の６４Ｚｎｅを含有する。いくつかの実施形態において、６４Ｚｎｅ化合物またはその塩は、少なくとも９０％の６４Ｚｎｅであり、この組成物は、６４Ｚｎｅが０．１ｍｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在する水溶液である。いくつかの実施形態において、６４Ｚｎｅは、２つのアスパラギン酸分子を有するアスパラギン酸塩（化学式－С４Ｈ５Ｏ４Ｎ６４Ｚｎｅ）、硫酸塩、およびクエン酸塩からなる群から選択される塩の形態である。いくつかの実施形態において、組成物は注射によって投与される。他の実施形態において、組成物は経口投与される。特定の実施形態において、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、およびＩＦＮ－γのうちの１つ以上である。
組成物の製剤化および投与
開示される組成物は、それを必要とする対象に、任意の適切な投与様式、任意の適切な頻度、および任意の適切な有効な投与量で投与され得る。
いくつかの実施形態において、投与される６４Ｚｎｅの総量は、米国で推奨される亜鉛の１日あたりの許容量または摂取量と同じである。いくつかの実施形態において、投与される６４Ｚｎｅの総量は、米国で推奨される亜鉛の１日あたりの許容量または摂取量の１／２倍、２倍、３倍、５倍、または１０倍である。いくつかの実施形態において、６４Ｚｎｅの総量は、米国で推奨される亜鉛の１日あたりの許容量または摂取量の１／２～１０倍の間である。開示される組成物は、１日１回投与される処方された１日量を含んでもよいし、または１日あたり対応する回数投与されるそのいくつかの画分を含んでもよい。開示された組成物はまた、２日ごとに１回、３日ごとに１回、１週間に１回、または他の任意の適切な頻度で投与される６４Ｚｎｅの量を含んでもよい。
開示される組成物は、任意の適切な形態であってもよく、任意の適切なデリバリー手段のために製剤化されてもよい。いくつかの実施形態において、開示される組成物は、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル、液体懸濁液、液体溶液、または任意の他の従来の経口剤形などの経口投与に適した形態で提供される。経口剤形は、即時放出、遅延放出、持続放出、または腸溶放出を提供し得、そして適切な場合、１つ以上のコーティングを含む。いくつかの実施形態において、開示される組成物は、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、または任意の他の注射経路などの注射に適した形態で提供される。いくつかの実施形態において、注射用組成物は、無菌および／または非発熱性の形態で提供され、保存剤および／または他の適切な賦形剤、例えば、スクロース、リン酸ナトリウム二塩基性七水和物もしくは他の適切な緩衝液、ｐＨ調整剤、例えば、塩酸もしくは水酸化ナトリウム、およびポリソルベート８０または他の適切な界面活性剤を含有してもよい。
溶液形態で提供される場合、いくつかの実施形態において、開示される組成物は、ガラスまたはプラスチックボトル、バイアルまたはアンプルで提供され、これらのいずれも、単一または複数の使用のいずれかに適し得る。開示された組成物を含有するボトル、バイアルまたはアンプルは、適切なゲージの１つ以上の針および／または１つ以上のシリンジと一緒にキットの形で提供され得、これらは全て好ましくは無菌である。したがって、特定の実施形態において、適切なガラスまたはプラスチックボトル、バイアルまたはアンプルにパッケージされ、さらに１つ以上の針および／または１つ以上のシリンジを含み得る、上記のような液体溶液を含むキットが提供される。このキットは、使用説明書をさらに備えてもよい。
特定の実施形態において、６４Ｚｎｅの投与量は、対応する要素の様々な権威ある毎日の摂取ガイダンス［例えば、推奨される食事許容量（ＵＳＲＤＡ）、適切な摂取量（ＡＩ）、推奨される食事摂取量（ＲＤＩ）］に比例する。いくつかの実施形態において、軽い同位体投与量は、ガイダンス量の約１／２～約２０倍の間、より好ましくはガイダンス量の約１～約１０倍の間、さらにより好ましくはガイダンス量の約１～約３倍の間である。したがって、特定の実施形態において、毎日投与するための開示された組成物の単回用量は、これらの範囲内の量、例えば、約１／２、約１、約３、約５、約１０、および約２０倍のガイダンス量を含むように製剤化される。これらの量は、一般的に経口摂取または局所適用のためのものである。いくつかの実施形態において、静脈内投与量は、より低く、例えば、ガイダンス量の約１／１０～約１／２である。これらの範囲の下限の用量は、特定の元素または元素のクラスに対する感度が高い人（例えば、腎臓に問題がある人）に適している。亜鉛の場合、１日のガイダンス量は、乳児の２ｍｇから、９歳以上の８～１１ｍｇ（性別による）の範囲である。本出願全体で考察されている１日の投与量は、１日の総投与量を提供するために、分割投与量および１日あたり適切な回数投与される分割投与量に細分化されてもよい（例えば、１日２回投与される１日用量の１／２、１日３回投与される１日用量の１／３など）。表１を参照のこと。
Figure 2023507629000001
開示された組成物は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy［Pharmaceutical Press; 21st revised ed. (2011)］（以下では、「Remington」）に図示される方法などの医薬品産業の一般的実践に従って使用される方法によって生成され得る。
いくつかの実施形態において、開示される組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される媒体または賦形剤を含む。これらとしては、例えば、希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、崩壊剤、可溶化剤、分散剤、保存剤、湿潤剤、保存剤、安定剤、緩衝剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、酒石酸塩）、懸濁剤、乳化剤、および必要に応じて、ＤＭＳＯなどの浸透促進剤が挙げられる。この組成物はまた、適切な補助物質、例えば、可溶化剤、分散剤、懸濁剤および乳化剤も含んでもよい。
特定の実施形態において、組成物は、適切な希釈剤、流動促進剤、潤滑剤、酸味料、安定剤、充填剤、結合剤、可塑剤または放出助剤、および他の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
薬学的に許容される賦形剤の完全な説明は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub., Co., N.J. 1991)または他の標準的な薬学のテキスト、例えば、Handbook of Pharmaceutical Excipients (Shesky et al. eds., 8th ed. 2017年)に見出され得る。
いくつかの実施形態において、開示される組成物は、胃内、経口、静脈内、腹腔内または筋肉内に投与されてもよいが、他の投与経路も可能である。
組成物中の担体および希釈剤として水を使用してもよい。水に加えて、または水の代わりに、他の薬学的に許容される溶媒および希釈剤の使用も許容される。特定の実施形態において、重水素枯渇水が希釈剤として使用される。
タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸のコポリマーなどのゆっくりと代謝される大きな高分子もまた、組成物の担体化合物として使用してもよい。治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロールまたはエタノールなどの液体をさらに含有し得る。さらに、前記組成物は、湿潤剤または乳化剤、緩衝物質などの賦形剤をさらに含み得る。そのような賦形剤としては、とりわけ、当技術分野で従来の希釈剤および担体、ならびに／または細胞への活性化合物の浸透を促進する物質、例えば、ＤＭＳＯ、ならびに保存剤および安定剤が挙げられる。
開示される組成物は、適用の目的に応じて、様々な剤形で提示され得る；特に、注射用の溶液として製剤化してもよい。
開示される組成物は、全身投与され得る。適切な投与経路としては、例えば、経口投与または非経口投与、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、胃内投与、ならびに飲料水を介するものが挙げられる。しかし、剤形に応じて、開示された組成物は他の経路によって投与されてもよい。
特定の実施形態において、６４Ｚｎｅを含む開示された組成物は、動物対象における過体重または肥満を予防および／または処置するために、２．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で胃内に投与される。さらなる実施形態において、開示される組成物は約２ｍｌである。さらなる実施形態において、６４Ｚｎｅの濃縮のレベルは、約９９％以上である。他のさらなる実施形態において、２ｍｌの組成物の６４Ｚｎｅは、２つのアスパラギン酸分子を有するアスパラギン酸亜鉛（化学式－С４Ｈ５Ｏ４Ｎ６４Ｚｎｅ）を含むか、またはそれからなる。開示された組成物の用量は、処置される対象、疾患の重症度、患者の状態、ならびに当技術分野の当業者の知識に基づいて、特定の患者について投与量および投与経路を決定する際に当業者によって考慮される他の要因に応じて変化し得る。
軽い同位体を購入してもよい。必要な濃縮度のＺｎ－６４酸化物は、例えば、米国テネシー州オークリッジのオークリッジ国立研究所（Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から購入できる。
アスパラギン酸亜鉛は、化学式－С４Ｈ５Ｏ４Ｎ６４Ｚｎｅを有し、２つのアスパラギン酸分子を有する。アスパラギン酸亜鉛の構造は次のとおりである：
Figure 2023507629000002
特定の実施形態において、開示された組成物は、組成物の約２０％～約１００％で６４Ｚｎｅを含む。
６４Ｚｎｅを含む開示された組成物は、当技術分野で従来使用されている塩またはキレート（６４Ｚｎが濃縮されていない）の形態の天然亜鉛を含む組成物よりもはるかによく体内で代謝される。さらに、前記組成物は、肥満の予防および処置において同等のレベルの有効性で、従来の医薬品に固有の毒性効果を低減するのに役立つ。
開示される組成物は、別の薬剤または療法と同時に投与されてもよい。
肥満の予防および処置のための特許請求された組成物の高い有効性は、ラットモデルを含むインビボ実験において実証された。
本発明をよりよく理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示のみを目的としたものであり、どんな方法でも本発明の範囲を制限するものとして解釈されるものではない。
［実施例１］
６４Ｚｎｅと天然に存在する亜鉛との間の比較
身体によるグルコースの吸収および利用に対する６４Ｚｎｅおよび酢酸Ｚｎ－Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２の潜在的効果の比較研究によって、亜鉛同位体が、多数のパラメーターに対して身体によるグルコースの吸収および利用により良い効果を有することが示された。
対照動物［酢酸Ｚｎ（Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２）を注射された動物の群に対して］における体重増加の正の動態を記録した（図１）。
６４Ｚｎｅ中止後７日目に、動物の血中のインスリンレベルは増加した［酢酸Ｚｎ（Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２）を注射された動物の群に対して］（図３）。
実験動物の膵島の面積に有意な増大が観察された（物質の最後の投与後７日目の顕微鏡検査）［酢酸Ｚｎ（Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２）を注射された動物の群と比較して］（図４）。これは正の動態であり、Ｉ型糖尿病の発症と同様に、これらの膵島による合成の問題に起因してインスリンが有意に不足している。得られた結果は、血流中のインスリンレベルを決定した結果と相関している（図３）。
耐糖能試験は、対照群および酢酸Ｚｎ［Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２］を注射された動物群（そのグルコースレベルも、それほど強くはなかったが低下した）と比較して、亜鉛同位体の投与後の動物においてグルコースレベルの低下を示した。これは、亜鉛同位体が血中のインスリンレベルに影響を及ぼし、それが血流からのグルコースの利用に関連する機構の開始につながることを示し得る。インスリンが亜鉛依存性タンパク質であることを考えると、亜鉛の投与は、組織内の受容体に関連するこのタンパク質の活性の増加、または血流中のこのホルモンの量の増加につながると想定され得る。
Figure 2023507629000003
Ｉ型糖尿病モデルで得られた結果によって、この物質がＩ型糖尿病の発症過程に対してより正の効果を有し［対酢酸Ｚｎ（Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２）］、この病状の発症中に血流中の増加したグルコースレベルの毒性効果を低減するために潜在的に使用され得ることが示される。
腎臓および肝臓組織（亜鉛、マンガンおよび銅）における金属の蓄積の分析によって、物質の中止後１日目と７日目の両方で、亜鉛［酢酸Ｚｎ（Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２）または６４Ｚｎｅ］を注射された動物の両方の群において亜鉛のみが有意に増加したことが示された。これによって、動物に注射された亜鉛が蓄積し、体内での利用が増加しなかったことが示されている。他の全ての分析された金属は、動物の対照群と同じ濃度内であった。得られたデータによって、身体による亜鉛および関連する金属の蓄積および利用に対して６４Ｚｎｅの悪影響がないことが示される。
これら全てのデータによって、酢酸Ｚｎ［Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２］と比較して、身体によるグルコースの吸収および利用に対する６４Ｚｎｅのより顕著でより高品質の効果が示唆されている。
この実施例では、酢酸亜鉛（天然亜鉛）を、動物（ラット）の体重１ｋｇあたり３７５０ｍｃｇの亜鉛（金属による）の用量で、実験群の動物に投与した。アスパラギン酸亜鉛の形態の亜鉛－６４も、動物（ラット）の体重１ｋｇあたり３７５０ｍｃｇの亜鉛（金属による）の用量で、実験群の動物に投与された。これらの組成物の投与は、腹腔内経路によるものであった。
［実施例２］
肥満の動物モデルにおける６４Ｚｎｅベースの組成物の人体計測効果
高脂肪食によって誘導される肥満の発症に対する６４Ｚｎｅベースの組成物の効果を評価するために、未処置の肥満の動物モデルおよび６４Ｚｎｅ溶液で処置された肥満の動物モデルにおけるいくつかの人体計測値を評価した。
１９５～２０５±１０ｇの初期体重を有する白色の非血統ラットを実験に使用した。動物は、実験的生物学的クリニック（飼育場）の配置、設備、および維持に関する標準規則［Ｓｔａｎｄａｒｄ ｒｕｌｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ， ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｌｉｎｉｃｓ （ｖｉｖａｒｉｕｍｓ）］に従って、キエフのタラスシェフチェンコ国立大学（Ｔａｒａｓ Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｙｉｖ）の学術研究センター（Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）「生物学医学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」の認定された飼育場で飼育した。この研究は、実験的およびその他の科学的目的に使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ａｎｉｍａｌｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ）（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、１９８６年３月１８日）の国際基準および勧告に準拠して実施され、学術研究センター「生物学医学研究所」の生物倫理委員会（Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって承認された。
結果の統計的処理は、ＯｒｇｉｎＬａｂ Ｏｒｇｉｎ（登録商標）Ｐｒｏ９．１およびＳｔａｔＳｏｆｔ ＳＴａＳｔｉｃａ（登録商標）１０ソフトウェア（Brandt,Z. Statistical methods for analysis of observation. M.:Mir, 1975-312p.）を使用する変動統計および相関分析の方法を使用して実施した。試料の正規分布の仮説は、シャピロ・ウィルク検定を使用して試験した。試料が正規分布の基準を満たしている場合、試料間の差の有意性は、スチューデントのｔ検定を使用して決定された。試料が正規分布の基準を満たしていない場合、試料間の差の有意性は、マン・ホイットニーＵ検定を使用して決定された。ｐ＜０．０５の場合、差は統計的に有意であると見なされた。
実験の開始前に、動物は飼育場の標準的な食事で飼育された。実験動物に肥満を誘導するために、標準飼料（６０％）、ラード（１０％）、鶏卵（１０％）、スクロース（９％）、ピーナッツ（５％）、粉乳（５％）およびヒマワリ油（１％）（１％）からなる高脂肪食を給餌した［X. H. Shen et al., Exp.Biol. and Med. 235: 47-51 (2010)を参照］。飼料は本発明者らによって調製された。実験の最初の４週間は、全ての動物を高脂肪食で飼育し、その後、無作為に２つの実験群に分けた。
－ 第１の群（肥満）の動物は、高脂肪食を食べ続け、実験の次の６週間は水を自由に摂取できた。
－ 第２の群（肥満＋６４Ｚｎｅ溶液）の動物も高脂肪食に従い、実験の次の６週間は水を自由に摂取できたが、３日ごとに、実験が終了するまで、２ｍｌの容量で２．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で胃内に６４Ｚｎｅの溶液を投与された。この溶液は、２．２５ｍｇ／ｍｌの薬学的に許容される亜鉛塩、特にアスパラギン酸亜鉛を含有し、６４Ｚｎによる濃縮レベルは８０パーセント以上であった。特許請求されている組成物の調製には、希釈剤（液体媒体）として標準的なダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（指定製造業者の）（重水素枯渇水ラングウェイに基づく）を使用した。
飼育場で調製した標準的な食事を与えられ、実験全体を通して水を自由に摂取できた動物の群（対照）もあった。
一晩絶食した後、全ての群の動物の体重を週に１回秤量した。動物が消費する飼料の量は毎日決定された。肥満モデルの開発の１０週間の終わりに、亜鉛同位体溶液の最後の投与から２４時間後に、動物をケージから取り出し、断頭した。
ボディマス指数（ＢＭＩ）（体長の二乗（ｃｍ２）に対する体重（ｇ）の比）は、実験の最後に計算された。ＢＭＩの増加は、体内の脂肪組織の蓄積および再分布の結果として発生する肥満の特徴的な形態学的兆候である。ＢＭＩを使用すると、体重の身長（体長）への比率を評価し、それによって体重が不十分、正常、または過剰であるか否かを間接的に評価することが可能になる。さらに、ＢＭＩは、体の組成と脂肪沈着の程度を特徴付ける積分値として使用される。これは、体内の脂肪組織の分布によって、肥満を発症する患者を検査するときに考慮する必要がある、肥満に関連する代謝性合併症のリスクが決定されるためである。ＢＭＩは、肥満の診断基準であるだけでなく、過体重および肥満で発生し得る疾患に対する患者のリスクの優れた尺度でもある。
実験中に得られたデータ（表３）によって、実験の１０週目に、対照動物の平均ボディマス指数が０．６０ｇ／ｃｍ２（この値は、この年齢群の動物の基準範囲内である）であったことが示されている。高脂肪食を食べている動物のＢＭＩは、対照群の動物のＢＭＩ（０．７１ｇ／ｃｍ２）より１．１４倍高かった。実験中に６４Ｚｎｅ溶液を投与されたラットのボディマス指数は、未処置の肥満動物モデルよりも低かったが、対照値（０．６５ｇ／ｃｍ２）よりもわずかに高く、これは、６４Ｚｎｅ溶液が動物の一般代謝状態に正の効果があることを示している。
Figure 2023507629000004
ＢＭＩは体重に基づいて計算されるので、ＢＭＩ値の減少は、６４Ｚｎｅ溶液を与えられた動物のより低い体重に直接関連している可能性がある。したがって、６４Ｚｎｅ溶液の投与が肥満の動物モデルの体重および体重増加に影響を与えるか否かをさらに調査した。得られたデータ（図１）は、実験群の動物による体重増加の動態が有意に異なっていたことを示している。したがって、高脂肪食で維持され、６４Ｚｎｅ溶液を与えられた動物は、高脂肪食のみを与えられた動物よりも体重が減少した。実験の４週目から開始して、両方の群の動物の体重増加に特に顕著な差が観察された。高脂肪食を食べている動物の体重の増加は、実験の終わりまでに１０３％に達したが、６４Ｚｎｅ溶液の胃内注射を受けた動物は、対照群の動物よりもそれほど体重が増えなかった（６２％対５９％）。
体内の多くの神経伝達物質およびホルモン系の協調的作用の破壊に起因する肥満の発症は、食欲制御および満腹感の調節のレベルでの障害につながることが公知である。これらの障害は過剰な食物摂取を促進し、多くの場合、体のエネルギー需要を超えるものと同等の食物エネルギーに対する異常に大きな欲求の状態である過食症の発症を伴う［L. Zhou et al., Cell Metabolism 6: 398(2007)］。
６４Ｚｎｅ溶液で処置された動物の体重増加の可能性のある減少の機構を定義するために、動物によって消費された食物の量を分析した。得られたデータを表３に示す。
全ての実験群について計算されたデータを比較したとき、動物が１日あたり平均して食べた食物の量に特別な差はない。したがって、対照群および肥満モデル群の動物は、１日あたり約３５ｇの食物を消費した。ただし、対照群の動物は標準食で維持され、一方で食事誘導性肥満モデルの群の動物は、カロリー含有量が有意に高い特別に調製された高脂肪食を消費したことに注意する必要がある。
動物が消費する食物のカロリー含有量を十分に考慮して得られた結果の分析は、値の有意差を示している。動物が同じ量の食物を食べたにもかかわらず、特許請求された組成物を投与された食事誘導性肥満モデルの群によって消費された食物のカロリー含有量は、食事誘導性肥満の動物の対照群のカロリー含有量よりも低かった（開示された組成物の投与なし）。さらに、１０週目には、開示された組成物を投与された食事誘導性肥満モデルの群のカロリー含有量は、標準食物を消費した対照群について、および開示された組成物を同時投与した標準食物を消費した群について、ほぼ同じであった。
実験の１０週間の間に動物によって消費された食物のカロリー含有量の動態を図２に示す。
得られたデータは、６４Ｚｎｅベースの組成物が満腹感に影響を与えることを示唆している。これは、食物への自由なアクセスを有するので、開示された方法の開示された組成物で処置された動物は、高脂肪食で維持されるだけの未処置動物と比較して消費する食物が有意に少なかったためである。言い換えれば、６４Ｚｎｅ溶液を投与された動物は、６４Ｚｎｅ溶液を投与されなかった動物よりも、食べる量が少なく、体重が増えなかった。この差は、エネルギー恒常性に対する亜鉛の直接的および間接的な影響の両方によって説明され得る。
このように、６４Ｚｎｅベースの組成物の投与は、１日あたりに消費される食物の量の減少を引き起こし、したがって、肥満の未処置の動物モデルでの同様の値と比較して、動物においてより目立たない体重増加およびそれらのボディマス指数の正常化を伴うことが示された。
［実施例３］
肥満の動物モデルにおける６４Ｚｎｅベースの組成物の生化学的効果
肥満の病理学的変化、特に脂質プロファイルを受ける血液生化学的変数に対する軽亜鉛同位体６４Ｚｎｅの効果を研究するための実験を実施した。この目的のために、実施例２に記載されるように、実験動物において高脂肪食肥満が誘導された。実験のために、以下の動物を使用した：標準的な食事を消費した対照動物；次の６週間高脂肪食を与えられた動物；および高脂肪食を与えられたが、実験の全６週間の間、６４Ｚｎｅベースの組成物（２．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で８０％以上の濃縮度の６４Ｚｎｅを含むアスパラギン酸亜鉛を２ｍｌの容量で胃内に投与した）も投与された動物。実験結果を表４に示す。
Figure 2023507629000005
６４Ｚｎｅベースの組成物は、体内の脂質代謝に正の効果を有することが見出された。高脂肪食を与えられ、６４Ｚｎｅで処置された動物の血清中のトリグリセリド、コレステロールおよび遊離脂肪酸のレベルの減少は、動物の対照群とほぼ同じレベルであった。
［実施例４］
実験動物におけるレドックス状態に対する６４Ｚｎｅの効果
多数の研究によって、肥満がレドックス状態の変化および代謝リスクの増大と密接に関連していることが示されている。脂肪細胞の機能障害を引き起こす要因の１つは酸化ストレスである。酸化ストレスならびにその結果としての組織損傷および細胞死は、多くの慢性的な病的状態の発症の基礎である。フリーラジカルの過剰な生成および／またはそれらの解毒システムの枯渇は、酸化促進と抗酸化との不均衡につながり、それが次に細胞膜脂質およびタンパク質と核酸との構造に影響を及ぼす。フリーラジカルによって媒介される脂質過酸化（ＬＰＯ）は、細胞膜の破壊およびさらなる細胞損傷の重要な原因の１つである。膜脂質の分解は、膜の流動性およびイオンに対する透過性の増大を誘導し、それが全体として細胞の恒常性を破壊する。フリーラジカル酸化の生成物（４－ヒドロキシアルケン、マロンジアルデヒドなど）は、変異原性および細胞毒性が高い。
さらに、酸化ストレスは、前脂肪細胞分化を活性化し、成熟脂肪細胞の肥大を刺激する。蓄積された脂肪組織でのＲＯＳの過剰な産生はさらに、血流中の酸化ストレスの誘導につながり、これが脂肪貯蔵庫から離れた器官への酸化ストレスの伝播に寄与する。
動物における酸化促進－抗酸化バランスは、実施例２に記載されるような肥満モデルを使用して評価された。対照群、肥満の未処置動物モデルの群、および高脂肪食を与えられて６４Ｚｎｅで処置された動物の群を、この実験では使用した。
脂質過酸化生成物の濃度は、酸化プロセスの強度についての結論を引き出すことを可能にする有益な基準として役立つ。一次脂質過酸化生成物（共役ジエンなど）および二次脂質過酸化生成物（特にアルデヒド、マロンアルデヒドなど）があり、これらは酸化分子の炭素骨格の炭素－炭素二重結合の分解の結果として形成される。続いて、ＬＰＯの開始により、リン脂質とマロンアルデヒド様生成物の共役シッフ塩基が形成され、これにより、リン脂質分子の秩序ある配向が乱れ、リポタンパク質の分子間相互作用および基底膜の構成に影響を与える。
上記を考慮して、６４Ｚｎｅで処置された動物における一次ＬＰＯ生成物［共役ジエン（ＣＤ）］、二次ＬＰＯ生成物［ＴＢＡ反応性物質（ＴＢＡＲＳ）］および最終ＬＰＯ生成物［シッフ塩基（ＳＢ）］の濃度を決定した。肥満は、ほとんどの組織を様々な程度で覆い、細胞膜の完全性の破壊および血流への脂質過酸化生成物の流入につながる全身的な酸化ストレスの発生を伴うことを考慮に入れると、酸化促進－抗酸化系の状態を特徴付ける値を、動物の血清で決定した。
肥満モデルは、フリーラジカル脂質酸化の一次生成物の血清レベルが上昇していることが見出された（対照の１．８６倍）（表５）。このような結果は、脂質代謝の乱れ、特に脂肪酸の輸送過程の障害、したがって、反応性酸素種の作用の直接的な基質である遊離脂肪酸およびエステル化脂肪酸の血漿レベルの上昇という観点から説明され得る。
他方、血清中の脂質過酸化生成物の蓄積は、それらの脂質成分の酸化的破壊および血流への脂質過酸化生成物の流入に起因する細胞膜の完全性の侵害の直接的な結果であり得る。
Figure 2023507629000006
したがって、肥満発症の１０週目の脂質過酸化生成物のレベルの上昇は、酸化ストレスが全身性であること、およびこのプロセスが慢性的であることを明確に示し、これらの代謝物は非常に有毒な化合物であり、それらの負の影響は様々なレベルで示され、ＤＮＡ分子の損傷、タンパク質分子およびグリコサミノグリカンの破壊、細胞膜の脂質組成の変化、ならびに膜関連プロセスの破壊につながるので、好ましくない予後マーカーである。
動物への６４Ｚｎｅベースの組成物の投与は、一次、二次および最終ＬＰＯ生成物のレベルを正常化するのを助け、これは、身体の全体的な酸化促進－抗酸化状態に影響を与える６４Ｚｎｅの能力の追加の証拠として役立つ。
現代の概念によれば、反応性酸素種は、脂質過酸化プロセスを活性化するだけでなく、タンパク質分子の酸化的破壊を引き起こし、可溶性および膜結合酵素、受容体およびイオンチャネルの両方の高次構造の破壊を引き起こし、これは最終的にそれらの生物学的活性（例えば、酵素、受容体、輸送）の喪失につながる。タンパク質の酸化により、タンパク質にアミノ酸残基のアルデヒド基およびケトン基（カルボニル基）が形成される。
したがって、酸化的に修飾されたタンパク質の数の増大は、フリーラジカル組織損傷の初期の基準、および体内の抗酸化防御システムの枯渇のマーカーとして見なされ得る。この研究によって、肥満の動物モデルにおける酸化的に修飾されたタンパク質の血清レベルの増大が明らかとなった（表６）。
Figure 2023507629000007
この実験データによって、実験全体を通して高脂肪食を与えられ、６４Ｚｎｅ溶液の注射を受けた動物では、アルデヒド－ジニトロフェニル－ヒドラゾンのレベルがベンチマークを超えたが、肥満の未処置の動物での値と比較して低かったことが示された。ケトン－ジニトロフェニル－ヒドラゾンについては、それらの濃度は対照値の範囲内にとどまった。このような結果は、ＬＰＯ生成物のレベルの低下を示すデータと相関しており、フリーラジカル酸化反応の強度の低下を示唆している。
［実施例５］
肥満の動物モデルにおけるサイトカインプロファイルに対する６４Ｚｎｅベースの組成物の効果
動物におけるサイトカインプロファイルは、実施例２に記載されるような肥満モデルを使用して評価した。対照群、肥満の未処置動物モデルの群、および高脂肪食を与えられ、６４Ｚｎｅで処置された動物の群を、実験で使用した。
肥満の病因は、全身性の慢性炎症過程を伴い、その強度の程度は、炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの血清レベルによって評価され得る。
肥満の動物モデルにおける血清サイトカインプロファイルの分析によって、炎症誘発性サイトカインのレベルの増大が示された（表７）。高脂肪食を与えられ、６４Ｚｎｅ溶液を投与された動物では、抗炎症性サイトカインのレベルの増大のバックグラウンドに対して（これは対照群由来の動物よりもさらに高かった）、炎症誘発性サイトカインの血清レベルが減少した。
Figure 2023507629000008
同位体６４Ｚｎｅについて濃縮された亜鉛のサイトカインプロファイルに対する影響の基本的な機構の１つは、酸化ストレスに感受性の転写因子のその阻害であってもよい。肥満の動物モデルにおけるサイトカインプロファイルに対する６４Ｚｎｅベースの組成物の特定の正常化効果は、肥満における特許請求された組成物の可能な抗炎症性の可能性の証拠として役立ち得る。
したがって、実験データは、肥満の動物モデルにおいて多数の病理学的変数に対する６４Ｚｎｅベースの組成物の正の効果を確認した。特に、実験動物に６４Ｚｎｅベースの組成物を投与すると、ボディマス指数が低下し、体重増加および食物消費量が減少することが実証された；６４Ｚｎｅは、動物の体内の脂質代謝に正の効果があることがわかった；フリーラジカルプロセスの強度の低下に起因する酸化促進－抗酸化ホメオスタシスの正常化が実証された；動物の血清サイトカインプロファイルに影響を与える６４Ｚｎｅの能力が明らかになった。この研究で観察された効果は、肥満の予防および処置のための特許請求された６４Ｚｎｅベースの組成物の有効性を裏付けている。
実施例２－５の場合、亜鉛－６４が濃縮された開示された組成物は、以下の構造式を有する亜鉛塩／化合物を有する：
Figure 2023507629000009
この化合物は、２つの水分子を含有する結晶性水和物である。モル質量は３６４ｇ／ｍｏｌである。２，２Ｈ２Ｏは・２Ｈ２Ｏと見なす必要がある。これは、０，２Ｈ２Ｏは未結合の水であり、粉末を乾燥させるときに蒸発し得るためである。・２Ｈ２Ｏは結晶性水和物であり、分子の一部である。４．５ｍｇのアスパラギン酸亜鉛（２ｍｌの溶液容量であった）を使用し、これは１７．８％の純度の亜鉛－６４を含有していた（金属として）。したがって、４．５ｍｇのアスパラギン酸亜鉛である各用量には、８００ｕｇの亜鉛－６４（金属として）が含有されていた。
［実施例６］
特定の期間にわたって高脂肪食を与えられた実験動物（ラット）における肥満および２型の前糖尿病に関するアスパラギン酸型のＺｎ６４安定同位体
略語のリスト
ＲＯＳ－反応性酸素種
ＡＯＤ－抗酸化防御
ＦＦＡ－遊離脂肪酸
ＧＩ管－胃腸管
ＢＭＩ－ボディマス指数
ＩＤＯ－インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ
ＩＲ－インスリン耐性
ＭＡＯ－モノアミンオキシダーゼ
ＯＭＰ－タンパク質の酸化的修飾
ＯＳ－酸化ストレス
ＳＯＤ－スーパーオキシドジスムターゼ
ＩＬ－インターロイキン
この研究は、実験動物において高脂肪食によって誘導される肥満の発症に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果を評価する。次の課題を設定した。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の、肥満の動物モデルで多くの人体計測（ボディマス指数、体重、体重増加）および生化学的（グルコース濃度、インスリンレベル、アルカリホスファターゼ活性、アルブミン含有量）値に対する影響を調査すること。
高脂肪食を与えられた動物の膵臓および肝臓の形態機能的特性に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果を調査すること。
中枢および末梢セロトニン作動系の機能（トリプトファンおよびセロトニンレベル、トリプトファンヒドロキシラーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ、モノアミンオキシダーゼおよびインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ活性）に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果を、肥満の動物モデルで評価すること。
フリーラジカルプロセス（脂質過酸化の一次、二次および最終生成物のレベル、タンパク質の酸化的修飾の生成物のレベル）および主要な抗酸化酵素（スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ）の活性に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果を、肥満の動物モデルの血清および脂肪組織において、評価すること。
血清および脂肪組織におけるサイトカインプロファイル（炎症誘発性および抗炎症性サイトカインのレベル）、ならびに肥満の動物モデルにおけるレジスチンおよびグレリンレベルに対する、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果を評価すること。
肥満の動物モデルにおける異なる器官間の二価金属（亜鉛、銅、マンガンなど）の分布に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果を調査すること。
材料および方法
肥満モデルの開発
この研究では、白色非血統ラットを使用した。動物は、実験的生物学的クリニック（飼育場）の配置、設備、および維持に関する標準規則に従って、キエフのタラスシェフチェンコ国立大学の学術研究センター生物学医学研究所の認定された飼育場で飼育した。この研究は、実験的およびその他の科学的目的に使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、１９８６年３月１８日）の国際基準および勧告に準拠して実施され、学術研究センター生物学医学研究所の生物倫理委員会によって承認された。Murzin,O．B．, European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes/ O. B. Murzin, //Practical workbook on human phisiology. - Dnipropetrovsk): Publishing House of Dnipropetrovsk University, 2004. -P.135-148.
肥満モデルを実施する前に、飼育場の標準的な食事で飼育された初期体重１９５～２０５±１０ｇの動物を、この実験では使用した。実験動物に肥満を誘導するために、標準飼料（６０％）、ラード（１０％）、鶏卵（１０％）、スクロース（９％）、ピーナッツ（５％）、粉乳（５％）およびヒマワリ油（１％）からなる高脂肪食を給餌した、Shen X.et al., Experimental Biology and Medicine. -2010. -No.235. -P.47-51。実験の最初の４週間は、全ての動物を高脂肪食で飼育し、その後、無作為に２つの実験群に分けた。
－ 第１の群（肥満）の動物は、高脂肪食を食べ続け、実験の次の６週間の間、水を自由に摂取できた。
－ 第２の群（肥満＋アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の溶液）の動物もまた、それらの高脂肪食に従い、実験の次の６週間の間、水を自由に摂取できた。しかし、３日ごとに、そして実験の終わりまで、動物はアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の溶液を胃内に投与された。各動物に投与されたアスパラギン酸亜鉛の用量は、４．５ｍｇ（動物１匹あたりの物質）であり、これは２ｍｌの溶液の容量で強制経口投与された。
飼育場によって調製された標準的な食事を与えられ、実験全体を通して水を自由に摂取できる動物の群（対照）もいた。
研究された人体計測的および生化学的パラメーターに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果の有無を確認するために、動物の群を形成し（対照＋アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の溶液）、この群は、標準的な飼育場の食事を食べ、実験の全期間にわたって水を自由に摂取できたが、３日ごとに、実験が終了するまで、動物にアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を胃内投与した。各動物に投与されたアスパラギン酸亜鉛の用量は４．５ｍｇ（動物１匹あたりの物質）であり、これは２ｍｌの溶液の容量で強制経口投与された。
一晩絶食した後、全ての群の動物の体重を週に１回秤量した。動物が消費する飼料の量は、毎日決定した。肥満モデルの開発の１０週間の終わりに、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を最後に投与してから２４時間後に、動物をケージから取り出し、断頭した。
ボディマス指数（ＢＭＩ）（体重（ｇ）の体長の二乗（ｃｍ２）に対する比）を、実験の最後に計算した。
血清の調製
全血から動物血清を調製した。フィブリノーゲン関連タンパク質を除去するために、血液を３７℃で３０分間インキュベートした後、血餅を清潔で乾燥したガラス棒でチューブの壁から注意深く分離し、血清の生成を促進した。試料を、２５００ｇで１５分間遠心分離した。得られた上清（血清）を直ちに血液細胞から分離し、凍結し、実験まで－２０℃で保存した。
脂肪組織ホモジネートの調製
実験の終わりに、動物を断頭によって安楽死させた。組織除去中の全ての操作は、１～４℃の温度で実行した。
脂肪組織を冷たいはさみを使用して粉砕し、次にゆるくフィットするテフロン乳棒を備えたホモジナイザーに移した。組織は、冷ホモジナイゼーション緩衝液［１３０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］で約３０ストロークの乳棒を使用してホモジナイズした。このようにして得られた一次ホモジネートを６００ｇで１５分間遠心分離した。上清を注意深く集め、１５，０００ｇで１５分間再遠心分離した。次に、上清を凍結し、実験まで－８０℃で保存した。
脳組織ホモジネートの調製
実験の終わりに、動物を断頭により安楽死させた。臓器除去中の全ての操作は、１～４℃の温度で実行した。
動物の頭を体から分離し、頭蓋骨を注意深く切断した。骨の円蓋から外科用メスで脳を注意深く持ち上げ、全ての頭蓋神経を切断し、頭蓋骨から脳を取り出した。脳は２つの部分に分割し、半球の間に縦方向の切り込みを入れた。
脳組織を、冷たいはさみを使用して粉砕し、次にゆるくフィットするテフロン乳棒を備えたホモジナイザーに移した。その組織を、冷ホモジナイゼーション緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０％スクロースを含む、５０ｍＭのＴｒｉｓ－酢酸塩、ｐＨ７．４）で約３０ストロークの乳棒を使用してホモジナイズした。組織：緩衝液の比率は１：１０であった。このようにして得られたホモジネートを、１５００ｇで２０分間遠心分離した。次に、その上清を注意深く収集して凍結し、実験まで－８０℃で保存した。
十二指腸組織ホモジネートの調製
実験の終わりに、動物を断頭により安楽死させた。臓器除去中の全ての操作は、１～４℃の温度で実行した。
腹部を開いた後、十二指腸を動物の体から取り出し、ペトリ皿で０．９％塩化ナトリウム溶液中で洗浄した。十二指腸粘膜は、外科用メスを使用して機械的に分離し、次いで、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．２５Ｍスクロースを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）でホモジナイズした。組織：緩衝液の比率は１：１０であった。このようにして得られたホモジネートを、１５００ｇで１０分間遠心分離した。次に、その上清を注意深く収集して凍結し、実験まで－８０℃で保存した。
血清中のグルコース濃度の決定
少なくとも２時間絶食した動物の血液中のグルコース濃度を測定した。カテーテルを使用して尾静脈から血液を採取した。グルコース濃度は、ＧＬＵＴＯＦＯＴ－ＩＩグルコースメーター（ウクライナ）を製造業者の指示に従って使用して決定した。Medical test "Glyukofot-II": [user’s manual for "Glyukofot-II-Hemoglan]. - Kiev: Norm, 2008. -12p.試験のストリップは、多孔質親水性膜へのグルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ酵素の吸収を含む、グルコースオキシダーゼ法によるグルコース濃度を決定するために必要な全ての試薬成分を含有していた。着色された複合体の形成は、反応の結果であった。全血をストリップに一滴垂らし、室温で３０秒間放置した。次に、そのストリップを蒸留水で洗浄し、血糖値計に入れた。グルコース濃度は、ｍｍｏｌ／Ｌで表された。
血清および脂肪組織ホモジネート中のインスリン、インターロイキンおよびアディポカインのレベルの決定
インスリン、インターロイキン、およびアディポカインのレベルは、免疫酵素法（Halenova TI et al. RSC Adv. 2016;6: 100046-55）を使用して決定した。この方法は、可溶性タンパク質試験手順に従って、吸着能力を備えたマイクロプレートで実施した。予め０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈した抗原溶液を、プレートウェル内で、４℃で１２時間インキュベートした。このウェルをＴＢＳ緩衝液で３回、最初は０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０ありで、次にＴｗｅｅｎ－２０なしで洗浄することにより、未結合の物質を除去した。非特異的結合部位は、５％スキムミルクの溶液または１％ウシ血清アルブミンの溶液を、プレートウェルに添加して、３７℃で６０分間インキュベートすることによってブロックした。インキュベーション後、そのウェルをＴＢＳを用いて、最初は０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０ありで、次にＴｗｅｅｎ－２０を使用しないで、３回洗浄した。一次抗体を、製造業者の指示に従ってＴＢＳで希釈し、抗原とともに３７℃で６０分間インキュベートした。ＴＢＳワーキング緩衝液で洗浄した後、最初に０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を添加し、次にＴｗｅｅｎ－２０を添加せずに、二次抗体のコンジュゲートをウェルに添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。一次抗体と同様に、二次抗体は製造業者の指示に従ってＴＢＳで希釈した。洗浄手順の後、０．０５Ｍリン酸－クエン酸緩衝液中の基質としてのフェニルジアミン二塩酸塩を各ウェルに添加し、続いて０．３％過酸化水素を添加した。１０分後（発色に必要な反応時間）、２．５ｎのＨ２ＳＯ４を加えた。
４９２ｎｍの波長での吸光度を、μＱｕａｎｔマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。
血清アルカリホスファターゼ活性の決定
動物における血清アルカリホスファターゼ活性は、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ３００生化学的分析器および標準的なＰＬＩＶＡ－Ｌａｃｈｅｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ試験キット（チェコ共和国）を使用して分光光度的に測定した。試験キット／／Ｐｌｉｖａ－Ｌａｃｈｅｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ．－２００８。
アルカリホスファターゼによって触媒されるｐ－ニトロフェニルホスフェートの加水分解による切断の結果として、ｐ－ニトロフェノールが形成され、これは、アルカリ性培地中で強い黄色を生じる。試料の光学密度は、４０５ｎｍの波長で測定した。アルカリホスファターゼ活性は、相対的な単位で表した。
血清アルブミンの決定
動物中の血清アルブミンのレベルは、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ３００生化学分析器および標準のＰＬＩＶＡ－Ｌａｃｈｅｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ試験キット（チェコ共和国）を使用して分光光度的に決定した。試験キット／／Ｐｌｉｖａ－Ｌａｃｈｅｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ．－２００８。
血清スーパーオキシドジスムターゼ活性の決定
スーパーオキシドジスムターゼ活性を測定するために、この酵素がアドレナリンの自己酸化を阻害する能力に基づく方法を用いた。Syrota T.V. Questions of med. clin.-1999.-V.5, No.3.-P.263-272.
血清アリコートを、０．２Ｍの重炭酸塩緩衝液、ｐＨ１０を含有するマイクロプレートウェルに加えた。その反応は、各ウェルに０．１％アドレナリン溶液を加えることによって開始した。試験試料が追加されていない「ブランク」ウェルに、関連する容量の緩衝液を追加した。アドレナリンをウェルに添加してから４分後と８分後に、μＱｕａｎｔマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して３４７ｎｍの波長で光学密度を測定した。酵素活性は、相対単位／分／ｍｇで表された。
カタラーゼ活性の決定
カタラーゼ活性を決定するために、過酸化水素がモリブデン塩と安定した着色複合体を形成する能力に依存する分光光度法を使用した。Korolyuk M. A.et al., Lab. Business. -1988. -No.1.-P.44-67.インキュベーション中、過酸化水素の濃度は、試験試料中のカタラーゼによって媒介される酵素活性に起因して低下した。４％モリブデン酸アンモニウム溶液および０．０３％過酸化水素を使用した。試験試料を０．０３％の過酸化水素に加えることにより反応を開始した。タンパク質の代わりに、適切な容量の蒸留水をブランク試料に追加した。インキュベーション培地に４％モリブデン酸アンモニウム溶液を添加することにより、１０分後に反応を停止させた。μＱｕａｎｔマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、４１０ｎｍの波長で光学密度を測定した。カタラーゼ活性は、較正曲線を使用して計算し、μｍｏｌ Ｈ２Ｏ２／ｍｇタンパク質×分として見積もった。
血清および脂肪組織ホモジネート中の共役ジエンおよびシッフ塩基のレベルの決定
０．１～０．５ｍｇのタンパク質を含有する試験試料のアリコートを、ぴったりと合うガラスホモジナイザーに入れ、これに、ヘプタン／イソプロピルアルコール混合物を１：１の比率で加え、１０分間ホモジナイズした。次に、試料を、ぴったりと合うストッパーで閉じた試験管内で、１０００ｇで１５分間遠心分離した。上清画分を注意深く集め、蒸留水を加えて、ヘプタンおよびイソプロピルアルコールの相を分離した。シッフ塩基のレベルは、分光光度計を使用して、励起波長３６０ｎｍおよび発光波長４２０ｎｍで試料の光学密度を測定することにより、上部ヘプタン相で決定した。シッフ塩基のレベルは、タンパク質１ｍｇあたりの単位数を表した。
共役ジエンのレベルを決定するために、９６％エタノールが添加されたヘプタン相のアリコートを採取し、試料を完全に混合した。試料の光学密度は、分光光度計を使用して２３３ｎｍの波長で測定した。共役ジエンのレベルは、多不飽和高級脂肪酸が酸化されたときに発生する共役ジエンのモル吸光係数（２．２×１０５ｃｍ－１×Ｍ－１）を使用して計算し、タンパク質１ｍｇあたりのｎｍｏｌで見積もった。Nedzvetsky V et al., J Diabetes Metab. 2012;3(8): 1-9.
ＴＢＡ活性産物および脂肪組織ホモジネートの血清レベルの決定
試験試料のアリコートを試料に加え、等量の１７％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えた。試料を、１０００ｇで１５分間遠心分離した。Nedzvetsky V et al., J Diabetes Metab. 2012;3(8): 1-9.上清に０．８％チオバルビツール酸の溶液を加え、沸騰水浴中で１０分間インキュベートした後、発色させた。試料の光学密度は、分光光度計を使用して５３２ｎｍの波長で測定した。ＴＢＡ活性産物の濃度は、タンパク質１ｍｇあたりのｎｍｏｌで表され、モル吸光係数（１．５６×１０５ｃм－１×Ｍ－１）を使用して計算された。
タンパク質の酸化的修飾の生成物のレベルの決定
タンパク質の酸化的修飾の強度の推定は、タンパク質カルボニルとシッフ塩基との間の反応、および中性で塩基性の性質の２，４－ジニトロフェニルヒドラゾンの形成を伴う２，４－ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）に基づく。Vartanyan L.S, Gurevich S.M. Biochemistry.-1989.-Vol.54, No.6.-P.1020-1025.
試験試料のアリコート（０．２ｍｇのタンパク質）を、０．１５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４を含有する試験管に加えた。２０％ＴＣＡ溶液を加えることにより、タンパク質を沈殿させた。試料を１０００ｇで１５分間遠心分離した後、２ＭのＨＣｌ中の２，４－ＤＮＰＨの０．１Ｍ溶液を、変性タンパク質の沈殿物に添加した。室温で１時間インキュベートした後、その沈殿物をエタノール：酢酸エチル（１：１）混合物で３回洗浄して、脂質および２，４－ＤＮＰＨ（カルボニルに結合していない）を除去した。そのように洗浄された沈殿物を乾燥させ、沸騰水浴中の８Ｍ尿素に１０分間溶解させた。
タンパク質の酸化的修飾のアルデヒドおよびケトン生成物を決定するために、光学密度を、それぞれ３５６ｎｍおよび３７０ｎｍの波長で測定した。得られた値は、適切なモル吸光係数を使用して再計算した。
脳および十二指腸ホモジネートおよび血清中のセロトニンおよびトリプトファンのレベルの決定
血清および組織ホモジネートのアリコートを０．４Ｍ過塩素酸と１：５の比率で混合して、タンパク質を沈殿させた。その試料を４℃で６０分間インキュベートした後、４℃の冷蔵遠心分離機で、８００ｇで５分間遠心分離した。相分離後、上清を回収し、２ＭのＫＯＨでｐＨを５～６に調整した。遠心分離により試料を再沈殿させた。その上清を、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．２で予め平衡化したＫＭ－セファロースカラムに適用した。結合した物質は、緩衝液１（０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．２）および緩衝液２（０．０３Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．２）を使用して室温で溶出した。トリプトファンは、緩衝液１を使用して溶出され、セロトニンは、緩衝液２を使用して溶出された。
トリプトファンレベルは、試験試料の代わりに対応する容量の蒸留水を含有するブランク試料に対して、２９５ｎｍの励起波長および５５０ｎｍの吸収波長で、分光蛍光光度計を用いて測定した。
セロトニンレベルは、試験試料の代わりに、対応する量の蒸留水を含有するブランク試料に対して、３５９ｎｍの励起波長および４８５ｎｍの吸収波長で分光蛍光光度計を用いて測定した。Gaitonde M. K.// Biochem. S.-1974.-Vol.139.-P.625-631. Maksymenko E. G., Savchenko V.N.// Visnyk of V. N. Karazin Kharkiv Nat. University. Medicine.-2000.-1, No.494.-P.40-43. H. Weissbach et al.,/J Biol Chem//-1957.-Vol.230, No.2.-P.865-71.
脳および十二指腸ホモジネートにおけるトリプトファンヒドロキシラーゼ活性の決定
トリプトファンヒドロキシラーゼ活性は、Donald M. Kuhn et al., Biochemistry.-1980.-Vol.77.-P.4688-4691よって記載されているとおり決定した。組織ホモジネートを室温で解凍し、１２，０００ｇで３０分間遠心分離した。この上清を、さらなる研究で使用した。
インキュベーション培地は、５００ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２０ｍＭのジチオトリエトール、１ｍＭのＣａＣｌ２、４ｍＭのＬ－トリプトファンおよび５０μｇのカタラーゼを含有するエッペンドルフマイクロ遠心チューブで調製し、その後、そこに上清のアリコートを追加した。その試料を、サーモスタット内で、３７℃で１５分間インキュベートした。６ＭのＨＣｌＯ４でタンパク質を沈殿させることにより、反応を停止させた。沈殿したタンパク質を分離するために、その試料を６００ｇで５分間遠心分離した。
試料の光学密度は、分光蛍光光度計を用いて２９５／５４０ｎｍで測定した。インキュベーション培地および蒸留水を含有するブランク試料を対照として使用した。
脳および十二指腸ホモジネートにおけるインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ活性の決定
インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ活性は、Y. Kudo, C.A.R. Boyd, I. L. Sargent et al.//Mol. Human reproduction.-2000.-Vol.6, N4.-P.369-374に記載のとおり決定した。組織ホモジネートを室温で解凍し、１２，０００ｇで３０分間遠心分離した。その上清を、さらなる研究で使用した。
インキュベーション培地は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５ｍＭのＬ－トリプトファン、１０ｍＭのアスコルビン酸塩、０．２ｍＭのメチレンブルー、５０μｇのカタラーゼを含有するエッペンドルフマイクロ遠心チューブで調製し、次いで、ここに上清のアリコートを追加した。その試料をサーモスタット内で、３７℃で３０分間インキュベートした。タンパク質を１０％トリクロロ酢酸で沈殿させることにより反応を停止させた。沈殿したタンパク質を分離するために、その試料を６００ｇで５分間遠心分離した。次いで、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０を上清のアリコートに加えた。
試料の光学密度は、インキュベーション培地および蒸留水を含有するブランク試料に対して分光蛍光光度計を使用して、３６０ｎｍで測定した。
血清モノアミンオキシダーゼ活性の決定
血清モノアミンオキシダーゼ活性は、Balakleevsky A. I.//Lab. business.-1976.-3.-P.151-152によって記載された方法を使用して決定した。この方法は、ＭＡＯの作用下で塩酸ベンジルアミンからベンズアルデヒドを形成することからなる。ベンズアルデヒドは、２，３－ジニトロフェニルヒドラジンと相互作用し、遠心分離によって沈殿させることができる不溶性ヒドラゾンを形成する。次に、ヒドラゾン沈殿物は、アルカリ性培地中でラズベリー色の安定した化合物を形成し、その含有量は分光光度法で決定され得る。
インキュベーション培地は、０．２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、蒸留水、およびベンジルアミン塩酸塩の１％溶液を含有するエッペンドルフマイクロ遠心チューブで調製した。ブランク試料は、塩酸ベンジルアミンを含有していなかった。血清のアリコートを加えることにより反応を開始した。試料をサーモスタット内で、３７℃で３時間インキュベートした。タンパク質を１０％トリクロロ酢酸で沈殿させることにより反応を停止させた。沈殿したタンパク質を分離するために、試料を６００ｇで５分間遠心分離した。２ＭのＨＣｌで調製した２，３－ジニトロフェニルヒドラジンの０．１％溶液を、得られた上清に加えた。その試料を攪拌し、室温で２５分間インキュベートした。その後、その試料を６００ｇで２５分間遠心分離してヒドラゾンを沈殿させた。ヒドラゾン沈殿物に３ＭのＮａＯＨおよび９６％エタノールを順次添加すると、ラズベリー色の発色が観察された。
試料の光学密度は、エタノールに対して４６０ｎｍで励起する分光蛍光光度計を使用して測定した。
膵臓および肝臓組織の形態機能分析
実験の終わりに、動物を断頭により安楽死させた。サイズ０．５～０．５ｃｍに調製した肝臓および膵臓をすぐに固定液に入れた。臓器は、パラホルムアルデヒドの４％溶液で、２５％の温度で７２時間固定した。固定後、小片を水道水ですすいだ。次に、材料を脱水した。これは、臓器の小片をアルコールの濃度を上げて（７０％＞８０％＞９０％＞９６％）通過させ、各濃度で１日放置することで達成された。最後に、水を９６％アルコールに置き換えたら、その材料をジオキサンに１５分間入れ、次にキシレンに１５分間入れた。完全に清澄化した後、その材料をサーモスタット内のパラフィン浴（パラフィンとキシレンの混合物を１：１の比率）に３７℃で３０分間入れた。次に、その材料を、５６℃のサーモスタットで２回のパラフィン交換（３０～３５分）に浸漬し、パラフィンブロックを作製した。
組織の一連の厚さ５μｍの組織切片を、ＭＳ－２スライディングマイクロトームを使用して切断し、タンパク質とグリセロールとの１：１混合物で処置したガラススライド上に置いた。
乾燥した調製物を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。染色する前に、その切片をキシレンを２回交換して５分間、脱ろうし、アルコールの強度を下げながら（それぞれ３分間で９６％＞９０％＞８０％＞７０％）、最後に蒸留水を５分間通過させた。その切片をベーマーのヘマトキシリンで１．５分間染色し、次いで流水で１５～２０分間洗浄し、エオシンで１分間染色した。一旦、染色すれば、その切片をもう一度７０％と９６％のアルコールで脱水し（それぞれ３０秒）、ジオキサンおよびキシレンで２．５分間清澄化した。染色された部分はカナダバルサムで囲まれ、カバーガラスで覆われていた。細胞の核は青紫色で、細胞質はピンク色であった。
肝線維症のレベルを決定するための組織化学的反応を実施するために、ヴァンギーソンのピクロフクシン染色法を使用した。これを行うために、切片を最初に水に浸し、次にベーマーのヘマトキシリンで３～４分間再染色した。次に、切片を蒸留水ですすぎ、Ｖａｎ Ｇｉｅｒｓｏｎのピクロフクシンで３分間染色した。一旦、染色したら、その切片を蒸留水ですすぎ、９６％アルコールで脱水し、ジオキサンおよびキシレンで透明にし、カバーガラスの下でバルサムに入れた。その結果、肝細胞核は、暗褐色、コラーゲン線維は赤色、細胞質は黄色であった。全てのパラメーターは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して測定された。
タンパク質濃度の決定
タンパク質濃度は、ブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して測定した。Bradford MM. Anal Biochem. 1976;86: 193-200.タンパク質濃度を測定するために、１０％ＮａＯＨ、蒸留水、およびブラッドフォード試薬を試料に添加した。ブラッドフォード試薬は、初期溶液（９５％エタノール、８５％Ｈ３ＰＯ４およびクーマシーブリリアントブルー染料）を９５％エタノールおよび８５％Ｈ３ＰＯ４と混合すること、ならびに得られた混合物を蒸留水で所望の容量に調整することによって、調製した。
試験試料の代わりに蒸留水を含有する対照試料に対して、５９５ｎｍで分光光度的に吸光度を測定した。タンパク質濃度は、キャリブレーション曲線を使用して決定し、ｍｇ／ｍｌで表した。
結果の統計的処理
得られた結果の統計処理は、ＯｒｇｉｎＬａｂ Ｏｒｇｉｎ（登録商標）Ｐｒｏ９．１およびＳｔａｔＳｏｆｔ ＳＴａＳｔｉｃａ（登録商標）１０ソフトウェアを使用した変動統計および相関分析の方法を使用して実行した。Brandt Z. Statistical methods for observations. -М.:Mir, 1975.-312p.試料の正常な分布の仮説は、シャピロ・ウィルク検定を使用して試験した。試料が正規分布の基準を満たしている場合、試料間の差の有意性は、スチューデントのｔ検定を使用して決定した。試料が正規分布の基準を満たしていない場合、試料間の差の有意性は、マン・ホイットニーＵ検定を使用して決定された。ｐ＜０．０５の場合、差は統計的に有意であると見なされた。
結果および考察
肥満の動物モデルにおけるアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の生化学的および人体計測的効果
現代の概念によれば、広範囲の生物学的に活性な物質を産生する脂肪組織は、肥満の病因に積極的に関与している。したがって、脂肪沈着の増大によって生じる過体重は、肥満の発症中の代謝障害の結果としてだけでなく、この疾患の経過を引き起こし、非常に複雑にして、多くの肥満関連障害の発症に寄与する重要な因子としても見なされる。
高脂肪食品の摂取によって誘導される肥満の発症に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果を評価するために、肥満の動物モデルおよびアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された動物において、いくつかの人体計測値を評価した。
肥満の発症の特徴的な形態学的徴候は、脂肪組織の蓄積および再分布に起因する体重の有意な増加である。肥満の発症を確認するために、体重（キログラム）を身長（メートル）の二乗で割ったボディマス指数（ＢＭＩ）またはケトレ指数を最初に決定した。Novelli E., Diniz Y., Galhardi C. Anthropometrical parameters and markers of obesity in rats// Laboratory Animals. -2007. -No41. -P.111-119.ＢＭＩによれば、体重と身長の関係を評価し、それによって、体重が不十分、正常、または過剰であるか否かを間接的に評価し得る。さらに、ＢＭＩは、積分値として使用され、これにより、体組成および脂肪沈着の程度を特徴付けることが可能になる。なぜなら、肥満患者を検査するとき考慮する必要がある、肥満に関連する代謝合併症を発症するリスクを、体内の脂肪組織の分布の特性が決定するからである。ＢＭＩは、肥満を分類するだけでなく、肥満関連疾患を発症するリスクを判断するためにも使用される。
実験中に得られたデータ（表８）では、実験の１０週目に、対照動物の平均ボディマス指数が０．６０ｇ／ｃｍ２であり、この値はこの年齢層の動物の基準範囲内であったことが示されている。Novelli E., Diniz Y., Galhardi C. Anthropometrical parameters and markers of obesity in rats// Laboratory Animals. -2007. -No41. -P.111-119.高脂肪食を食べている動物のＢＭＩは、対照群の動物のＢＭＩ（０．７１ｇ／ｃｍ２）より１．１４倍高かった。実験中にアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を投与されたラットの肥満度指数は、肥満動物の肥満度指数よりも低かったが、対照値（０．６５ｇ／ｃｍ２）よりもわずかに高かったことに注意する必要がある。得られた結果によって、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体が、動物の一般的な代謝状態に正の影響を及ぼし、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体が肥満に及ぼす影響の機構を解明することを目的としたさらなる研究の基礎を築くことが示される。
ＢＭＩは体重に基づいて計算されるので、ＢＭＩ値の減少は、アスパラギン酸型でＺｎ－６４安定同位体を投与された動物のより低い体重に直接関連している場合がある。したがって、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与が、肥満の動物モデルの体重および体重増加に影響を与えるか否かをさらに調査した。実験で得られたデータは（図５）、実験群の動物による体重増加の動態が有意に異なっていたことを示している。したがって、高脂肪食で維持され、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を投与された動物は、高脂肪食のみを投与された動物よりも体重増加が少なかった。実験の４週目から開始して、両方の群の動物の体重増加に特に顕著な差が観察された。高脂肪食を食べている動物の体重の増加は、実験の終わりまでに１０３％に達したが、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の胃内注射を受けた動物は、対照群の動物とほぼ同じ体重になった（６２％）。
体の多くの神経伝達物質およびホルモン系の協調的な働きの混乱に起因する肥満の発症は、食欲制御のレベルでの障害および満腹感の調節につながり、過剰な食物摂取を促進し、しばしば過食症（体のエネルギー需要を超える食品エネルギーに相当する異常に大きな欲求の状態である）の発症を伴うことが知られている。L. Zhou, G. Sutton, J. Rochford.// Cell Metabolism. -2007. -Vol. 6, No5. -P.398-405.
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を投与された動物の体重減少の影響の可能な機構を解明するために、動物が消費した食物の量を分析した。表８。
全ての実験群について計算されたデータを比較すると、動物が１日あたり平均して食べた食物の量に特に差がないことが分かる。したがって、対照群および肥満動物群の動物は、１日あたり約３５ｇの食物を消費した。しかし、ここで、対照群の動物は標準食で維持されたが、食事誘導性肥満モデルの群の動物は、カロリー含有量が有意に高い特別に調製された高脂肪食を摂取したことに注意すべきである。
Figure 2023507629000010
動物が消費する食物のカロリー含有量を十分に考慮して得られた結果の分析は、値の有意差を示している。対照群および食事誘導性肥満モデルの群の動物が同じ量の食物を食べたにもかかわらず、食物のカロリー含有量は、ほぼ２倍異なっていた。アスパラギン酸型でＺｎ－６４安定同位体を投与した群から得られた結果は、非常に興味深いようである。したがって、対照群および食事誘導性肥満モデルの群の動物は、それぞれ、より少量の標準食および高脂肪食を食べた。
実験の１０週間の間に動物によって消費された食物のカロリー含有量の動態を図６に示す。
得られたデータは、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体が満腹感に影響を与えることを示唆している。なぜなら、食物への自由なアクセスがあり、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を注射された動物は、高脂肪食でのみ飼育された動物と比較して有意に少ない食物を消費したからである。食事誘導モデルの群の動物と比較して、消費される食物の量の減少、およびその結果として、アスパラギン酸型でＺｎ－６４安定同位体を投与された動物のわずかな体重増加は、エネルギーホメオスタシスに対する亜鉛の直接的および間接的効果の両方によって説明され得る。
したがって、研究のこの段階の結果を要約すると、アスパラギン酸型でＺｎ－６４安定同位体を投与することは、１日あたりに消費される食物の量の減少を引き起こし、したがって、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置されなかった肥満動物の同様の値と比較して、動物におけるより目立たない体重増加、およびそれらのボディマス指数の正規化をともなった。
Ｚｎ欠乏状態の早期発見は、代謝障害の発症および発症を防ぐために最も重要である。亜鉛欠乏の実験的兆候は、血漿（血清）中のそのレベルの低下であるが、血漿亜鉛レベルは不安定であり、多くの要因の影響を受ける。
亜鉛状態を決定するための他のアプローチがある。それらは、特に、亜鉛依存性タンパク質、そしてまず第１に、炭酸脱水素酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、乳酸塩デヒドロゲナーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素、ならびに血清レチノール結合タンパク質であるメタロチオネインの血漿（血清）中での濃度の測定に基づいている。亜鉛欠乏の最も初期のマーカーの１つは、血清アルカリホスファターゼおよび炭酸脱水素酵素の活性の低下である。その結果、粘膜中の炭酸脱水素酵素などの亜鉛含有酵素の含有量が高いことによって引き起こされるストレス潰瘍が、胃腸管で発生する。したがって、肥満の発症が亜鉛状態の変化を伴うか否かを間接的に決定するために、肥満動物およびアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された動物の血清中のアルカリホスファターゼ活性を研究した。
高脂肪食で維持された動物におけるこの酵素の活性の有意な減少が観察された（表９）。したがって、これらの動物の酵素活性は、対照群の動物よりも１．５倍低かった。アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された動物では、アルカリホスファターゼ活性は、食事誘導性肥満モデルの群と対照群の両方よりも高かった。
したがって、得られた結果は、肥満の動物モデルにおける亜鉛欠乏およびアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を投与された動物における正常な血清亜鉛レベルを間接的に確認する。
胃腸管は、全身の亜鉛恒常性を維持する。人体にはこの微量元素の真の貯蔵箇所はない。腸から吸収された亜鉛が血流に入る。全血は約７～８ｍｇ／Ｌの亜鉛を含有し、さらにこの量の約２／３が赤血球によって輸送される。血漿中では、亜鉛の約８０％がアルブミンに結合し、残りの２０％がβ２－マクログロブリンおよびトランスフェリンに結合している。公表されたデータで、この微量元素のレベルが血漿中のアルブミン濃度に依存していることが確認される。Brown, K. H. International Zinc Nutrition Consultative Group (IZiNCG) technical document #1. Assesment of risk of zinc deficiency in populations and options for its control/K. H. Brown, J. A. Rivera, Z. Bhutta [et al.]//Food Nutr. Bull. -2004. -Vol.25. -P.99-203.
したがって、肥満の未処置動物モデル、およびアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された肥満動物におけるアルブミンレベルをさらに調査した。実験から入手可能なデータは、肥満の病因が動物の血清アルブミンレベルの低下を伴うことを示している。同時に、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与は、未処置の肥満動物の値と同様のままであったアルブミン値に影響を与えなかった（表９）。
Figure 2023507629000011
アルブミンが亜鉛の主要な輸送タンパク質として作用することを考慮すると、その濃度の低下は、主要な亜鉛含有タンパク質の合成が起こる肝臓を含む臓器への亜鉛の適時の送達の混乱を引き起こすであろう。
一般に、この結果は、上記で確立されたアルカリホスファターゼ活性の低下と完全に一致している。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体は、体内の脂質代謝に正の効果を有することも見出された。高脂肪食を与えられ、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された動物の血清中のトリグリセリド、コレステロール、および遊離脂肪酸のレベルの低下は、対照群の動物とほぼ同じレベルであった。
代謝障害、主に炭化水素代謝の障害に起因する肥満の病因は、通常、グルコースレベルの増加を伴い、これは、長期間高いままである場合、多くの病理学的プロセスを開始し、インスリン抵抗性および糖尿病の発症を誘導する重要な要因になる。今日では、微量元素、特に亜鉛のレベルの変化と、前糖尿病の発症と、適切な薬理学的矯正がない場合の糖尿病の発症との間に関係があることが証明された事実である。研究結果によれば、体内のほとんどの微量元素の濃度は一定であるが、亜鉛の場合、前糖尿病の女性の血清中のそのレベルの低下が示されている。この元素は、膵臓のベータ細胞でのインスリン合成に重要な役割を果たし、このホルモンに対する組織の感受性を高めることも公知である。Chausmer, A. B. Zinc, insulin and diabetes. J. Am. Coll. Nutr. 1998, 17, 109-115.
上記を考慮して、高脂肪食を食べている動物の血清中のグルコース濃度およびインスリンレベルに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果を調査した。
文献に基づいて、３．５～５．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内の空腹時血中グルコースレベルは正常であると見なされる。この値が一定期間にわたって７．０ｍｍｏｌ／Ｌ以上に増加すると、高血糖の状態と見なされ、真性糖尿病の発症の予測因子となり得る。
対照群の動物およびアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を投与された対照群由来の動物の血清グルコースレベルは、参照値の範囲内であった（表１０）。肥満の発症は、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与によって正常化されたグルコースレベルのわずかな増加を伴った。
グルコースレベルに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果は、細胞内グルコース輸送の増強に寄与する、その同位体が、内部細胞区画から脂肪細胞膜へのグルコース輸送体の移動を刺激する能力に直接関連し得る。アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体は、インスリン受容体βサブユニットのチロシンリン酸化を増加させ、これによってインスリンの非存在下でのグルコース輸送を改善することも判明している。このデータによって、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体が、インスリンシグナル伝達の抑制に関与する酵素であるチロシン－１Ｂ－ホスファターゼの阻害剤として作用し得ることが示されている。
Figure 2023507629000012
肥満におけるグルコース濃度の増加は、膵臓のβ細胞におけるインスリン分泌の減少または体の組織によるその不十分な利用の結果である場合がある。血液および他の体液中の高グルコースレベルは、浸透圧の上昇を引き起こし、浸透圧利尿症（腎臓を介した水分および塩の損失の増加）の発症を引き起こし、それは体の脱水ならびにナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムカチオン、塩素アニオン、リン酸塩および炭化水素酸塩の欠乏につながる。さらに、グルコースレベルの上昇は、タンパク質および脂質の非酵素的グリコシル化を引き起こし、その強度はグルコース濃度に正比例する。この結果、多くの重要なタンパク質の機能が損なわれ、身体に様々な病理学的変化が生じる。Skybchyk V.//Ukrainian medical newspaper.-2006.-No.6.-P.61-68. Campos.//Postgraduate Medicine.-2012.-No.126.-P.90-97.
動物の血清グルコースレベルの変化を考慮して、この研究の次の段階は、インスリンのレベルを決定することであった。さらに、血清インスリンレベルは、インスリン抵抗性および前糖尿病の発症を診断する上で重要なパラメーターである。肥満および代謝症候群では、高インスリン血症は、膵臓のβ細胞におけるインスリンの過剰な産生および分泌によって引き起こされることが多く、これは、インスリン作用に対する末梢組織の感受性の低下に対する代償反応である。しかし、２型真性糖尿病の発症の後期段階では、血清インスリンレベルが大幅に低下し、これは、β細胞がインスリンを産生する能力の低下、プロインスリンのプロセシングおよび成熟インスリンの分泌の障害、ならびにランゲルハンス島における分泌細胞の数およびアミロイドの沈着の低下に直接関係している。同時に、発生中のβ細胞機能障害は、真性糖尿病のさらなる進行を引き起こす。Boden.//Diabetes.-1997.-Vol.46, No3.-P.3-10. Robertson R. P. et al.//Diabetes Mellitus.-2000.-P.125-132.
血清インスリンレベルの増加が肥満動物で見られ、高脂肪食で維持され、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を投与された動物群において、研究されたパラメーターに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の正常化効果が見られた。対照群の動物にアスパラギン酸型でＺｎ－６４安定同位体を投与すると、インスリンレベルがわずかに上昇したことを強調する必要がある。
インスリンレベルに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果は、ランゲルハンス島のβ細胞からのインスリンの合成、沈着および放出のプロセスにおけるこの微量元素の直接の関与と関連しており、同様にインスリンの作用を阻害するその能力とも関連し得る。亜鉛は六量体プロインスリンの形成に関与し、インスリンの結晶化に寄与することが公知である。亜鉛イオンは、輸送複合体へのインスリンの取り込みに寄与し、標的細胞への送達を確実にすることが証明されている。別の可能性のある機構は、１９８０年にＣａｕｌｓｔｏｎおよびＤａｎｄｏｎａによって確立され、彼らは、亜鉛がラット脂肪細胞の脂質生成に強力で刺激的で、独立しており、インスリン作用を補完する効果があることを実証した。この発見は、インスリンの効果を制御する際の亜鉛の関与を確認した。これは、このカチオンが高グルコースレベルに応答してインスリンとともに分泌されるためである。
さらに、亜鉛は、スーパーオキシドジスムターゼなどの抗酸化酵素の構造成分であり、鉄などのレドックス金属の競合物質であるため、インスリンおよび膵臓ベータ細胞をフリーラジカルから保護する上で重要な役割を果たす。亜鉛は、多くの活性酸素代謝物の中和に関与し、ベータ細胞の破壊を防ぎ得ることが公知の膵臓細胞におけるメタロチオネインの発現を刺激する。
インスリンの合成および分泌を確実にするために体内の亜鉛の生理学的レベルを維持することの重要性、ならびに膵臓機能におけるその重要な役割を考えると、膵臓の全体的な形態機能特性に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果をさらに調査した。
肥満の動物モデルの膵臓および肝臓の形態機能的特性に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果
膵臓とは混合腺であり、外分泌機能と内分泌機能の両方を備えている。膵臓の大部分は、腺房に配置された外分泌細胞で構成されている。腺房からの分泌物は、挿入された小葉内および小葉間管および主膵管を通って膵臓から流出する。対照群の動物の外分泌細胞のクラスターである腺房は（図７Ａ～図７Ｆ）、典型的な構造を有している：頂端極の細胞質は顆粒状で明るい好酸性であるが、基底極は強い好塩基性の核を含有する。
ＤＩＯ（肥満群）の動物モデル（図７Ａ～図７Ｆ）では、あまり目立たない好酸球性頂端細胞質を有する腺房が存在し（図７Ａ～図７Ｆ、矢印）、これは、脂質封入体の蓄積、膵臓脂肪変性に起因し得る。
標準食を与えられたラットへのアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与は、外分泌細胞の形態を変化させなかった（図８Ａ～図８Ｆ）。肥満のラットにアスパラギン酸型でＺｎ－６４安定同位体を投与した後（図８Ａ～図８Ｆ）、脂肪変性は見られなかった。
膵臓の内分泌部分は、ランゲルハンスのびまん性に位置する島からなる。誘導された肥満の発症中の内分泌膵臓の機能状態の形態計測研究は、全ての群から得られた値の間に明らかな差を示した（図９）。ランゲルハンス島の断面積は、肥満群の動物で有意に減少し（６０％）、これは、内分泌膵臓の機能的活動の有意な減少を示している。肥満のラットにアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を投与した後、ランゲルハンス島の断面積は肥満群と比較して４３％増加したが、それでも対照レベルに達しなかった（対照値より２９％低い）。標準食を食べたラットにアスパラギン酸型でＺｎ－６４安定同位体を投与すると、対照群と比較してこの値が３９％顕著に減少した。
膵臓の状態の形態学的および機能的指標の間には直接的な関係があるので、得られたデータは、食事誘導性肥満ラットモデルにおける膵臓のホルモン合成活性が有意に低下するが、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与では顕著に増大し、ただし、対照群で観察されたレベルまでは完全には回復しない。さらに、肥満の発症というバックグラウンドに対して、試験物質の投与後の膵臓の外分泌部分の状態の改善が記録され、これは、標準的な食事を与えたラットの外分泌細胞に顕著な影響を与えることなく、脂肪変性の消失によって証明される。
対照ラットの肝臓（図１０Ａ～図１０Ｄ）は、各小葉の軸に沿って走る中心静脈を有する古典的な小葉組織を有する。それぞれいくつかの核小体を含有する、明確に定義された核を有する多角形の肝細胞は、中心静脈から広がる秩序だった肝細胞索に配置される。二核肝細胞も見られる。
肥満群（図１０Ａ～図１０Ｄ）の動物では、肝臓の脂肪変性の徴候である脂質封入体の沈着に起因して、肝細胞の形状が多角形から丸みを帯びたものに変化する。肝細胞索の構造が乱れ、視野内の二核細胞の数が減少する。
肥満を有するラットにアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を投与した結果（図１１Ａ～図１１Ｄ）、肝細胞索の構造が回復し、多角形形態のほとんどの肝細胞は、脂肪変性の兆候を示さなかった。二核細胞がしばしば見られた。標準食（図１１Ａ～図１１Ｄ）を食べているラットにアスパラギン酸型でＺｎ－６４安定同位体を投与しても、肝細胞の形態および肝小葉の構造に変化は生じなかった。
食事誘導性肥満の発症に伴い、肝細胞に有意な形態計測的変化が起こった（図１２Ａ～図１２Ｃ）。したがって、肥満群の動物では、核面積は２５％減少した（これは、核の転写活性の減少の証拠であり、視野内に核がないその暗い色および均質な構造によっても確認される）が、多数の脂質封入体の沈着に起因して、肝細胞の面積は４８％増大した。同時に、核と細胞質との比率が有意に低下し（４５％）、そのレベルが低いことは、細胞の機能的活性が低下したことを示している。
肥満ラットへの試験物質の投与は、それらの形態計測パラメーターを改善した。したがって、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された動物の肝細胞の面積は、未処置の肥満動物モデルと比較して４１％減少し（対照値と比較してわずか１３％の増加であり、これは肝細胞による脂質封入体の沈着の減少の兆候である）およびそれらの核対細胞質の比は、肥満群と比較して３１％増加した（対照群と比較して３０％の減少）。
しかしながら、核面積は、対照値に対して３５％減少している（すなわち、肥満群の値に対して１４％減少しており、これは、核活動に対する、２つの要因（高脂肪食およびアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体）の複合効果の結果である可能性がある）。
標準食で維持されたラットの形態計測パラメーターに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果は、核面積の２６％の減少、肝細胞の面積の１２％の減少、および核と細胞質の比率では１７％の減少からなる。
肝線維症は、結合組織の過剰な増殖、細胞外物質におけるコラーゲンの合成および沈着の増大を特徴とする。対照群の動物から採取した試料（図１３Ａ～図１３Ｄ）では、ほとんどのコラーゲン線維は、小さな小葉間血管によって形成された三管の領域にあった。
肥満群（図１３Ａ～図１３Ｄ）の動物から採取された試料は、対照群と同様に、小葉周囲毛細血管叢およびより大きな小葉間血管によって形成された三管領域におけるコラーゲン線維の数の顕著な増加を示した。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を注射された肥満ラットから採取された試料（図１４）は、未処置の肥満群からの試料と比較した場合、示された場所における同様のレベルのコラーゲン線維の沈着を示す。標準食を与えられたラットへの試験物質の投与は（図１４Ａ～図１４Ｄ）、小葉周囲および小葉間毛細血管叢におけるコラーゲン線維の量に有意な変化を引き起こさなかった。
コラーゲン線維が占める面積の分析（図１５）は、誘導された肥満の発症を伴う有意な変化を示している。肥満群およびアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された群におけるコラーゲン線維沈着物の面積は、対照群と比較して、それぞれ６．２５倍および６倍増加した。未処置の肥満群とアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された肥満群との間に有意差は見られなかった。標準的な食事を食べているラットに試験物質を投与すると、コラーゲン線維の沈着面積が有意に増大した（２倍）。
したがって、得られた結果を要約すると、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体は、肥満の動物モデルの膵臓および肝臓の形態機能特性に正の効果を有すると言うことができる。
肥満の動物モデルにおけるセロトニン作動系に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果
肥満の発症は主にカロリー摂取量の増加および不十分なエネルギー消費の結果であるという証明された事実にもかかわらず、体重増加の新しい病原性機構の探索は依然として今日的な意味を帯びている。
現代の概念によれば、肥満は、その病因に関係なく、行動反応、特に摂食行動に影響を与える中央調節機構の混乱につながる。視床下部では、主にその傍脳室核および外側周縁部の領域で、大脳皮質および皮質下構造から、交感神経系および副交感神経系への多数のインパルスの統合が起こる。この複雑な規制カスケードのリンクの混乱は、食物摂取、脂肪沈着および動員の変化につながり、最終的には肥満の発症につながり得る。
摂食行動、特に食欲の調節に関与し、満腹感に影響を与える重要な神経伝達物質としては、セロトニンが決定的な役割を果たす多くの生物起源のアミンが挙げられる。C. Portas et al., Progress in Neurobiology. -2000. -Vol.60, No.1. -P.13-35.
中枢神経系および末梢神経系の神経化学的不均衡の理論によれば、過食とは、神経伝達物質の不十分な産生または感受性に起因して喜びを得るための代償機構である。
飢餓および満腹感を調節するのに基本的なのは、中枢のセロトニン作動性の系である。実験は、脳内のセロトニン作動性伝達の増大が食物摂取の減少を引き起こしたことを示した。ラット視床下部の脳室周囲核への５－ＨＴの注射は、動物の満腹感をもたらしたが、食物摂取に伴い、視床外側部におけるセロトニンの収量の増大が認められた。視床下部のこれらの２つのセクションは、食欲の調節において反対の機能を果たすと考えられている：外側視床下部のセロトニン作動性伝達の不十分な阻害は、肥満中の過剰な食物摂取の原因であり得、視床下部の脳室周囲核でのセロトニンの放出の増強は、ストレス誘導性食欲減退に寄与し得る。
脳および腸は、動物においてセロトニンを産生する主要な器官である。セロトニンは血液脳関門を通過しないので、セロトニン合成システムは中枢と末梢に分かれており、互いに別々に機能する。少量のホルモンが血漿中にある。
セロトニンの代謝変換には、いくつかの酵素系が関与している。これらの系には、セロトニンの合成および分解のための酵素、ならびにキヌレニン経路に入るトリプトファンの量を決定する酵素が含まれる。A. Meneses, G. Liy-Salmeron.// Annual Review of Neuroscience. -2012. -No.23. -P.543-553. M. Donovan, L. Tecott.// Frontiers in Neuroscience. -2013. -No7. -doi: 10.3389/fnins.2013.00036.
体によって自然に生成される必須アミノ酸であるトリプトファンは、セロトニンの直接の前駆体である。トリプトファンは、他の中性アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン）の輸送に関与していると考えられている、非特異的膜輸送体によって細胞外液からセロトニン作動性ニューロンに輸送される。したがって、ニューロン内のトリプトファンのレベルとその輸送の強度は、トリプトファンの濃度だけでなく、競合する中性アミノ酸の濃度およびトリプトファンの濃度の比率にも依存する。
セロトニンは、２つの酵素系によって触媒される２段階のプロセスを介して合成される。まず、インドール環の５番目の位置でのヒドロキシル化の結果として、トリプトファンはセロトニン合成の直接の前駆体である５－ヒドロキシトリプトファンに変換される。トリプトファンヒドロキシル化の反応は、分子状酸素とコエンザイムとしてのプテリン（テトラヒドロビオプテリン）の両方の存在下で、律速酵素トリプトファンヒドロキシラーゼ（トリプトファン－５－モノオキシゲナーゼ、ＥＣ１．１４．１６．４）によって触媒される。トリプトファンのヒドロキシル化の速度は、基質の利用可能性に直接依存する。セロトニン合成の２番目のステップは、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ（芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ、ＥＣ ４．１．１．２８としても公知）によって触媒される脱炭酸である。
セロトニンおよび他の生物学的に活性なアミンの合成におけるこれらの酵素の関与に加えて、両方の酵素とも、概日周期（サーカディアンリズム）、骨再形成、細胞分化プロセス、免疫応答機構および炎症の調節に積極的に関与している。
セロトニンの不活性化は、酵素分解によって起こり、これは主にモノアミンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．４）によって提供される。ＭＡＯの作用下で、セロトニンは、５－ヒドロキシインドアルデヒドに変換され、これが次に、アルコールデヒドロゲナーゼの作用下で５－ヒドロキシトリプトホールに可逆的に変換され得る。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの作用下で、５－ヒドロキシインダルデヒドは、不可逆的に５－ヒドロキシインドール酢酸に変換され、その後、尿および糞便とともに排泄される。Sandler M.et al, Clinical Pathology. -1981. -No34. -P.292-302. S. Nilsson, N. et al, Acta medica Scandinavica. -1968. -No184. -P.105-108.
放出されると、セロトニンは、セロトニン受容体（ＨＴＲ）に結合することにより、様々な生物学的プロセスに影響を与える。その後、その作用は、セロトニントランスポーター（ＳＥＲＴ、Ｓｌｃ６ａ４）を通じた細胞への取り込みによって終了する。
セロトニンの酸化的脱アミノ化に加えて、セロトニン代謝の他の経路、例えば、アセチル化およびグルクロン酸および硫酸エステル抱合の経路が可能である。メラトニンの形成を伴うセロトニン代謝の経路がある。
医学的研究は、セロトニンの代謝変換の障害がしばしば結果であるだけでなく、過体重および肥満の発症を引き起こす主な要因の１つでもあることを示している。セロトニン代謝の様々な段階のレベルでの分子的および生化学的障害、細胞膜を通じたその輸送、および中枢神経系と末梢の両方でのセロトニン濃度の変化につながる沈着機構は、免疫神経内分泌の不均衡の形成および炎症誘発性反応の維持についての病理学的基礎を規定する機構であり得る。セロトニン作動系の不均衡は、統合失調症、様々な精神病、うつ病、および不安を含めて、身体の多くの病的状態および精神障害の発症の根本的な原因である。抑うつ状態はしばしば食欲の増加を伴い、それは過剰な食物摂取、特に炭水化物が豊富な食物につながる。
最近の研究データでは、亜鉛が５－ＨＴ１Ａ受容体（５－ＨＴ１ＡＲ）を介してセロトニン作動性機能を調節し得ることが示されている；ただし、その作用の正確な機構は不明である。上記を考慮すると、脳の神経ホルモン系が適切に機能するための亜鉛の重要性、セロトニン合成の重要な分子であるトリプトファンの代謝への関与、およびセロトニン作動系に対する亜鉛の調節効果、実験動物におけるセロトニン代謝の一般的な評価を可能にする主な指標をさらに分析した。この目的のために、セロトニンおよびトリプトファンのレベルを決定し、同様に高脂肪食を与え、アスパラギン酸型でＺｎ－６４安定同位体を注射した動物の血清、脳、十二指腸のセロトニン代謝に関与する主要な酵素（トリプトファンヒドロキシラーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ、インドールアミドデヒドロゲナーゼ、およびモノアミンオキシダーゼ）の活性も決定した。
一般に、この研究の結果、末梢および中枢のセロトニン作動性系の両方で発生する肥満動物におけるセロトニン作動性系の有意な不均衡が示され、これは、肥満の発症および進行の誘発機構の１つであり得る。
末梢系では、セロトニンは胃腸粘膜の腸クロマフィン細胞に局在している。体内のこのホルモンの総量の約８０％～９５％が合成されるのはそこである。セロトニンは、松果体腺でも合成される。Cote F. et al, PNAS USA. -2003. -Vol.100. -P.13525-13530. Eddahibi S. The serotonin pathway in pulmonary hypertension./ Еddahibi S., Adnot S.// Arch. Mai. Coeur. Vaiss. -2006. -Vol.99 -P.621-625.
腸で合成されたセロトニンは血小板に貯蔵される；セロトニンはまた、乳腺、肝臓、骨などの他の末梢組織において、ならびに膵臓のβ細胞にも存在する。末梢セロトニンは、腸の動き、血管収縮過程、および血圧の調節に関与している。セロトニンはまた、血漿中のグルコースのレベル、血栓形成、心臓のリズム、および心臓の収縮の強さを調節する。
トリプトファンプールの枯渇のバックグラウンドに対する全ての主要な酵素の活性の低下において明らかな、末梢セロトニン作動系の有意な阻害が確立されている。特定された変化にもかかわらず、肥満の動物モデルの十二指腸のセロトニンレベルは、対照群の値を有意に上回った（表１１）。
これらの結果は、腸のセロトニンが肥満の発症と相関し、肥満の人々の腸内のセロトニンのレベルが著しく増加するという現在の概念と概ね一致している。セロトニンの蓄積は、血清グルコース濃度の上昇を引き起こし、したがって糖尿病および肥満の発症に寄与する。
Figure 2023507629000013
肥満を有する動物における血清セロトニンおよびトリプトファンレベルの分析は、両方の物質の濃度の有意な減少を示し、これは、胃腸粘膜の腸クロマフィン細胞におけるセロトニン合成の反応の阻害の直接的な結果である可能性がある（表１２）。
血中の低セロトニンレベルに寄与する追加の因子は、モノアミンオキシダーゼの活性化である。
末梢セロトニン作動系の調節は、肥満を減少させ、インスリン感受性を増加し得るので、優れた抗肥満治療戦略となり得る。
末梢セロトニンの生理学的レベルを維持することの重要性にもかかわらず、エネルギー恒常性の調節において重要な役割を果たすのは中枢セロトニンである。中枢セロトニンレベルと食物摂取量との間の反比例の関係が確立された。ＣＮＳでは、セロトニンは視床下部と脳幹で合成される。それは気分、睡眠－覚醒サイクルおよび食事を調整するのに役立つ。
トリプトファンヒドロキシラーゼの不可逆的阻害剤であるｐ－クロロフェニルアラニンの脳室内注射を介して脳におけるセロトニン合成を阻害することは、ラットにおいて過食症および体重増加を誘導する。セロトニン再取り込み阻害剤およびモノアミンオキシダーゼ阻害剤は、食物摂取を低減する。したがって、中枢神経系のセロトニンは、食欲不振の神経伝達物質として機能する。
Figure 2023507629000014
ラットにおける肥満の病因は、動物の脳におけるトリプトファンレベルの有意な低下を伴い、これは、血液脳関門を横切る、このアミノ酸の輸送障害によって引き起こされ得る（表１３）。
血液脳関門を通過する芳香族アミノ酸および分枝鎖アミノ酸の輸送は、特定の担体の関与により起こり、競合的であり、したがって、肥満に典型的な、分枝鎖アミノ酸の血清濃度の上昇が、血液脳関門を通過するトリプトファンの輸送に影響を及ぼすことが公知である。C. Newgard, J. An, J. Bain.//Cell Metabolism. -2009. -Vol.9, No.4. -P.311-326. E. del Amo et al.,// european journal of pharmaceutical sciences. -2008. -No.35. -P.161-174.
Figure 2023507629000015
セロトニンとトリプトファンとの間の密接な代謝的関係を考慮すると、後者の欠如の自然な結果は、セロトニンレベルの低下である。
セロトニン作動性伝達の障害は、鬱状態の発生に寄与する要因の１つであり、肥満の主要な原因の１つと見なされ得る。中枢セロトニン作動系の先天性または後天性の欠陥を有する人々は、セロトニンの産生の減少を伴う飢餓に対して主観的な負の反応を発症することが公知である。そのような場合、わずかな飢餓でさえ、鬱状態の発症を誘発し得る。したがって、そのような人々は、彼らの生理学的必要性を超える量の食物を消費する。
したがって、視床下部の腹内側および傍脳室核における低セロトニンレベルは、過剰な食物摂取を誘導し、インスリン分泌過多を引き起こし、これは、このホルモンの作用に対する末梢組織の感受性の低下およびインスリン抵抗性の発症をもたらす。
この研究中に同定されたセロトニン代謝経路に関与する酵素の活性の変化は、脳内のセロトニン貯蔵のさらなる枯渇に寄与する。このように、セロトニンの分解を確実にする酵素であるモノアミンオキシダーゼの活性化のバックグラウンドで起こる、セロトニン合成のプロセスを制限する酵素であるトリプトファンヒドロキシラーゼの活性の低下が観察された。
インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼの活性の増大は、代替のトリプトファン代謝経路の活性化を示しており、これは、このアミノ酸のプールのさらなる枯渇に寄与するだけでなく、多数の神経毒性化合物の形成の供給源としても機能する。
高脂肪食を与えられた動物へのアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与は、ほとんどの実験変数の正常化をもたらした。したがって、トリプトファンレベルの増大に起因する脳内のセロトニンレベルの増大が観察され、したがって、その変換の代替方法の阻害およびモノアミンオキシダーゼによるセロトニン分解速度の低下のバックグラウンドに対するセロトニン合成の活性化が観察される。同様の効果が十二指腸および血清で見られた。
したがって、亜鉛の効果は複雑であり、中枢および末梢のセロトニン作動性システムの両方の機能のレベルで実施される。これらの結果、肥満の発症および肥満関連障害の予防における全体的な代謝状態の改善のために、単剤療法として、または他の薬物と組み合わせて亜鉛製剤を治療的に使用することの妥当性が実証される。
肥満の動物モデルにおける酸化促進－抗酸化バランスに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果
酵素の形成、転写因子の活性化、異種生物の酸化および殺菌保護に必要なフリーラジカル反応は、細胞の正常な機能の基礎である。さらに、それらは遺伝子の発現に関与し、ホルモンおよび細胞シグナルを伝達し、細胞再生のプロセスを調節する。したがって、反応性酸素種と反応性窒素種は人体で自然に生成され、代謝プロセスの重要な副産物である。抗酸化剤は、フリーラジカルのレベルを生理学的限界内に維持する。細胞が適切に機能するためには、抗酸化防御とフリーラジカル酸化との間のバランスが必要である。フリーラジカルの量が抗酸化防御の活性を超えると、酸化ストレスと呼ばれる現象が発生する。
酸化ストレスおよび結果として生じる組織損傷および細胞死は、多くの病的状態に寄与する。フリーラジカルの過剰な生成および／または防御システムの枯渇は、酸化促進と抗酸化との不均衡につながり、これが次に細胞内のタンパク質構造、細胞膜の脂質二重層、および核酸に対する損傷を生じる。脂質二重層は全ての細胞膜の構成要素であるので、フリーラジカルによって媒介される脂質の過酸化は、細胞膜の損傷とそれに続く細胞死の重要な理由の１つである。膜脂質の分解は、細胞膜の流動性およびイオンへの透過性の増大を引き起こし、全体として細胞の恒常性を破壊する。フリーラジカル酸化の生成物（４－ヒドロキシアルケン、マロンジアルデヒドなど）は、変異原性が高く、細胞毒性である。
疫学的、臨床的および動物的研究は、肥満がレドックス状態の変化および代謝リスクの増加と関連していることを示している。この場合、酸化ストレスは結果であるだけでなく、肥満の人々の障害の発症の引き金となり得る。脂肪細胞の機能障害を引き起こす要因の１つは酸化ストレスである。脂肪組織の増大する塊によって最初に生成される過剰な酸化剤は、転写因子ＮＦ－ｋＢおよびＪＮＫおよびｐ３８－ＭＡＰＫキナーゼによって媒介される酸化ストレスシグナル伝達経路に敏感に刺激し、多くのタンパク質キナーゼ（ＰＫＢ、ＰＫＣなど）を活性化する。
さらに、酸化ストレスは、前脂肪細胞の分化を活性化し、成熟脂肪細胞の肥大を刺激する。蓄積された脂肪組織におけるＲＯＳの産生の増加は、血流中の酸化ストレスの誘導をさらにもたらし、脂肪貯蔵庫から離れた器官への酸化ストレスの伝播に寄与する。
脂質代謝の障害および遊離脂肪酸の濃度の上昇とともに、グルコースレベルの上昇は、肥満に特異的な酸化ストレスの形成および進行の機構を決定する。高血糖誘導性の酸化ストレスは、ＲＯＳ形成反応の直接活性化の結果として、および細胞酸化還元ホメオスタシスの妨害の結果として発生すると考えられている。
この研究の次の段階は、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された肥満の動物モデルにおける酸化促進－抗酸化のバランスを評価することを目的とした。
脂質過酸化生成物（ＬＯＰ）の濃度は、酸化プロセスの強度についての結論を引き出すことを可能にする有益な基準として役立つ。一次脂質過酸化生成物（共役ジエン類など）および二次脂質過酸化生成物（特にアルデヒド類、マロンアルデヒドなど）があり、これらは酸化分子の炭素骨格の炭素－炭素二重結合の分解の結果として形成される。続いて、脂質過酸化の開始は、リン脂質およびマロンアルデヒド様生成物の共役シッフ塩基の形成をもたらし、これは、リン脂質分子の秩序ある配向の乱れを引き起こし、リポタンパク質分子間相互作用および基底膜の構成に影響を与える。
上記を考慮して、一次ＬＯＰ－共役ジエン（ＣＤ）、二次生成物－ＴＢＡ反応性物質（ＴＢＡＲＳ）および最終生成物－シッフ塩基（ＳＢ）の濃度を、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置した動物において決定した。肥満は、ほとんどの組織を様々な程度で覆い、細胞膜の完全性の破壊および血流への脂質過酸化生成物の流入につながる全身的な酸化ストレスの発生を伴うことを考慮に入れると、酸化促進－抗酸化系の状態を特徴付ける値は、動物の血清で決定され、分析された。
フリーラジカル脂質酸化の一次生成物の血清レベルの上昇（１．８６倍）は、脂質過酸化の初期段階が、１０週間の実験的肥満の後でも活発に起こることを示唆している（表１４）。この結果は、脂質代謝の乱れ、すなわち脂肪酸の輸送過程の障害、したがって、活性酸素代謝種の作用の直接的な基質である遊離およびエステル化脂肪酸の血漿レベルの上昇の観点から説明され得る。他方では、血清中の脂質過酸化生成物の蓄積は、それらの脂質成分の酸化的破壊および血流への脂質酸化生成物の透過性に起因する、細胞膜の完全性の侵害の直接的な結果であり得る。
肥満の発症における酸化ストレスの増加に寄与し得る追加の要因は、ＲＯＳ産生に関与する酵素であるＭＡＯ（この研究の前の段階で実証された）の有意な活性化である。
Figure 2023507629000016
ＣＤのレベルの増大は、二次ＰＯＬ、すなわち、ＴＢＡ反応性物質の蓄積を伴った。したがって、肥満がある動物のＴＢＡ反応性物質の血清レベルは、対照値と比較して４．８倍高かった。ＴＢＡ反応性物質のＦｅ＋２アスコルビン酸依存性の蓄積の場合、この値は対照動物の群で得られた結果を２０倍上回り、これは、肥満動物における酸化促進と抗酸化との不均衡に対する脂質過酸化プロセスの開始の非酵素的反応の有意な寄与を示唆している。
アルデヒドＰＯＬの濃度のそのような有意な増大は、これらの物質がタンパク質に結合して安定な付加物を形成し得るので、好ましくないマーカーと見なされる。それらの形成は、タンパク質の機能に影響を与え得る。さらに、このように修飾されたタンパク質は、免疫学的特性を有し、自己抗体産生を生じ得る。
一次および二次生成物のレベルの変化は、脂質過酸化の最終生成物であって、マロンジアルデヒドなどのアルデヒド、またはケトンと、タンパク質のアミノ基との縮合の結果として形成され、かつ後者の構造的および機能的特徴の障害につながるシッフ塩基の蓄積を伴った。得られたデータ（表）によると、肥満の動物の血清ではシッフ塩基のレベルの有意な増大が観察された。したがって、この値は対照動物の群よりも４倍高かった。脂質過酸化の最終産物のレベルは、酸化的ホメオスタシス障害の期間を特徴付け、したがって、この研究でこの値が有意に増加していることを考えると、フリーラジカル反応の長期的な活性化が考察され得る。
したがって、肥満発症の１０週目の脂質過酸化生成物のレベルの上昇は、酸化ストレスが全身性であること、およびこのプロセスが慢性的であることを明確に示しており、これらの代謝物は非常に有毒な化合物であり、かつ負の影響が様々なレベルで示され、ＤＮＡ分子の損傷、タンパク質分子およびグリコサミノグリカンの破壊、細胞膜の脂質組成の変化、および膜関連プロセスの破壊につながるので、好ましくない予後マーカーである。
脂質過酸化プロセスの活性化は、ＲＯＳの濃度の増加を間接的に示し得る。過剰なＲＯＳは、ＰＫＣ、ＡＫＴ／ＰＫＢ、ｍＴＯＲ、ＧＳＫ－３、およびｐ３８ＭＡＰＫなどの多くのセリン－スレオニンキナーゼを直接活性化し得る。これらの相乗的に作用するプロテインキナーゼは、ＩＲＳ分子のセリンおよびスレオニン残基の選択的リン酸化によって細胞のインスリン感受性を低下させ、このホルモンに対するインスリン依存性細胞の耐性の発達に寄与する。
動物へのアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与は、一次、二次および最終ＬＯＰのレベルを正常化するのに役立ち、これは、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体が身体の全体的な酸化促進－抗酸化状態に影響を与える能力の追加の証拠として役立つ。
現代の概念によれば、反応性酸素種は、脂質過酸化プロセスを活性化するだけでなく、タンパク質分子の酸化的破壊を引き起こし、可溶性および膜結合酵素、受容体およびイオンチャネルの高次構造の破壊を引き起こし、これは、最終的に、それらの生物学的活性（酵素、受容体、輸送など）の喪失につながる。タンパク質の酸化的修飾および構造的に修飾された分子の蓄積は、新しい抗体の産生に潜在的に寄与し得る重要な要因であり、したがって自己免疫反応を引き起こす。Berlett B.S., Stadtman E. R. J. Biol. Chem. -1997. -V.272, No.33.-P.20313-20316.
ＲＯＳの作用下で、タンパク質の本来のコンフォメーションが乱され、大きなタンパク質凝集体の形成、またはその逆、タンパク質分子の断片化が生じる。ヒドロキシルラジカルは、ほとんどの場合、タンパク質の凝集を引き起こし、スーパーオキシドアニオンと組み合わせて、低分子量のフラグメントの形成を伴う断片化を引き起こす。脂質ラジカルはまた、タンパク質分子の断片化を引き起こし得る。カルボニル基（アミノ酸残基のアルデヒドまたはケトン基）の形成は、酸化的タンパク質損傷のマーカーとして役立ち得る。
現代の概念によれば、タンパク質中の全てのアミノ酸残基が修飾され得るが、トリプトファン、チロシン、ヒスチジンおよびシステイン残基が最も感受性が高い。ＲＯＳは、タンパク質を構成するアミノ酸の官能基を攻撃し、隣接するアミノ酸残基と相互作用し得る一次アミノ酸ラジカルの形成をもたらす。一般に、タンパク質高分子に対するＲＯＳの有害な影響の複雑な状況に直面している。チロシン酸化の結果として形成されるラジカルは、互いに相互作用して、タンパク質にビチロシン架橋を形成し得る。ビチロシン架橋は、プロテアーゼの作用に対するタンパク質の耐性を高め、体内に機能的に不活性なタンパク質を蓄積するための前提条件を作り出す。トリプトファンの酸化は、共有架橋の形成にも関連しており、これはタンパク質分子の凝集を引き起こす追加の要因である。Rojas V. C. et al., Arch. Med. Res. -1996. -V.27, No1. -P.1-6. Archakov A.I., Mokhosoev I. M． Modification of proteins with active oxygen and their decomposition//Biochemistry. -1989. -Vol.54, No2. -P.179-185.
タンパク質の酸化的修飾は、体内のタンパク質代謝において重要な役割を果たす。酸化タンパク質の蓄積は、タンパク質の合成および分解、ならびに酸化タンパク質を選択的に破壊する多触媒プロテアーゼの活性化を調節する要因の１つと見なされている。タンパク質分子への酸化的損傷の程度は、カルボニル誘導体、特に中性の性質のアルデヒド－およびケトン－ジニトロフェニル－ヒドラゾンの蓄積によって評価され得る。３５６ｎｍの波長で検出されるアルデヒド－ジニトロフェニル－ヒドラゾンは、タンパク質の酸化分解の初期マーカーであり、フリーラジカルの作用下でのタンパク質分子への損傷の初期段階を示すが、一方、ケトン－ジニトロフェニル－ヒドラゾンは、３７０ｎｍで検出され、タンパク質への酸化的損傷の後期マーカーと見なされる。
脂質過酸化生成物とは異なり、カルボニル誘導体ははるかに安定であるため、これにより、タンパク質の酸化的修飾の生成物を、組織における酸化的損傷のマーカーと見なすことが可能になる。
したがって、修飾されたタンパク質の数の増加は、フリーラジカルによる組織の損傷の初期の基準および体内の抗酸化防御系の枯渇のマーカーと見なされ得る。
これらの研究によって、肥満の動物モデルにおける酸化的に修飾されたタンパク質の血清レベルの増大が明らかになり（表１５）、これは酸化ストレスの発生の活発な段階、およびフリーラジカルの形成の増強を伴う代謝障害を示すアルデヒド－ジニトロフェニル－ヒドラゾンのレベルのより顕著な変化を伴った。一般に、脂質過酸化プロセスの強化を背景にした肥満を有する動物の血清中の酸化的に修飾されたタンパク質中のカルボニル誘導体の濃度の上昇は、長期の酸化ストレスの議論の余地のない証拠と見なすことができる。したがって、得られたデータを考慮すると、肥満の発症は、タンパク質のフリーラジカル酸化の活性化を伴うと言うことができ、これは、３５６および３７０ｎｍで吸収ピークを有するタンパク質の酸化的修飾によって形成されるカルボニル誘導体の量の増加で明らかになる。
Figure 2023507629000017
活性酸素種によるタンパク質分子の修飾のプロセスは、病的状態だけでなく起こる。したがって、生理学的条件では、これらの損傷した「使用済み」分子のタンパク質分解の速度とそれらの合成の速度との間のバランスを反映して、細胞内に一定レベルの酸化的に修飾されたタンパク質がある。場合によっては、タンパク質分解酵素が修飾タンパク質分子を天然のものよりもはるかに速く分解するので、酸化的不活性化は、プロテアーゼの作用に対するタンパク質の感受性を高めるマーカー段階である。したがって、肥満を有する動物におけるカルボニル誘導体のレベルの上昇は、酸化ストレスの発生を示すだけでなく、構造的に修飾されたタンパク質、特に、このプロセスの実施を確実にするタンパク質分解酵素の分解の制御および調節の機構において、重大な障害の証拠も与え得る。
実験全体を通して高脂肪食を与えられ、アスパラギン酸型でＺｎ－６４安定同位体の注射を受けた動物では、アルデヒド－ジニトロフェニル－ヒドラゾンのレベルは、ベンチマークを超えたが、肥満を有する未処置の動物における値と比較して低かった。ケトン－ジニトロフェニル－ヒドラゾンについてと同様、それらの濃度は対照値の範囲内にとどまった。このような結果は、ＬＯＰのレベルの低下を示すデータと相関しており、フリーラジカル酸化反応の強度の低下を示唆し得る。
現代の概念によれば、細胞において、ＲＯＳによるタンパク質の修飾とともに、アルデヒドによるタンパク質分子の修飾からなる、カルボニル誘導体の形成のためのいわゆる非酸化経路が存在する。したがって、Ｂｕｒｃｈａｍ Ｐ．Ｃ．らの実験では、ＭＤＡを含む様々なアルデヒドとのタンパク質のインキュベーションが、濃度依存的に酸化的に修飾されたタンパク質の数の増加を誘導することが示された。アスパラギン酸型でＺｎ－６４安定同位体を肥満動物に投与すると、ＬＯＰのレベルが低下したので、タンパク質の酸化的修飾の程度の観察された低下は、カルボニル誘導体の非酸化的形成の阻害に部分的に関連しているようである。
同定された全体的な酸化状態に対する亜鉛の正の効果の基礎は、連鎖反応の開始段階でのフリーラジカル酸化のプロセスに対するその直接的な影響、および抗酸化酵素の活性中心へのその包含の両方であり得る。この微量元素の膜安定化効果（これは、その抗酸化作用の機構の１つでもある可能性がある）についても言及することが重要である。抗酸化剤としての亜鉛の役割は、二硫化物構造の形成を防ぐ分子内安定剤として作用するその能力によって確認されている。さらに、亜鉛は、フリーラジカルの形成を誘発する銅イオンおよび鉄イオンを競合的に置き換える。
フリーラジカルプロセスは、複雑な多成分および多レベルのシステムである抗酸化防御（ＡＯＤ）によって制御および調節される。生理学的に正常な状態では、フリーラジカル酸化反応のレベルとこの系の活動との間の平衡が維持され、これにより、脂質の過酸化プロセスを定常的でかなり低いレベルに維持することが保証される。
抗酸化防御系は、非酵素的および酵素的ユニットからなる。非酵素的抗酸化剤は主に酸素および窒素のフリーラジカルの急速な不活性化を提供するが、酵素的抗酸化剤は、身体の長期防御の最終系と呼ばれる。
スーパーオキシドジスムターゼ（ＥＣ１．１５．１．１）は、ＡＯＤの重要な酵素の１つである。この酵素は、過酸化水素と三重項酸素の反応性の低い分子への不均化によるスーパーオキシドアニオンラジカルの中和反応を触媒する。ＳＯＤは、好気性細胞の酸素依存性フリーラジカル反応の連鎖を断ち切る、最も活性の高い抗酸化酵素の中で唯一のものである。Poberezkina N. B., Osinskaya L. F. Biological role of superoxide dismutase// Ukr. biohim journal. -1989. -Vol.61, No2. -P.14-27. Dudochnik L.B., Tikhaze A. K., Alesenko A. V. et al. Change in the activity of superoxide dismutase and glutahione peroxidase in the process of lipid peroxidation intensification in liver ischemia// Bul. exp. biol. Med. -1981 .-Vol.XCI, No4. -P.451-453.
反応性酸素種の代謝におけるＳＯＤの主要な役割、および酸化ストレスの誘導と発生に対するスーパーオキシドアニオンラジカルの有意な寄与を考慮して、アスパラギン酸型のＺｎ－６４の安定同位体で処置および未処置の肥満の動物モデルの血清中のＣｕ－Ｚｎ依存性ＳＯＤの活性を調べた。
この実験において、ＳＯＤ活性の統計的に有意な減少が、高脂肪食を食べた動物において見出された。実験動物にアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を投与すると、未処置の肥満動物モデルの値と比較だけでなく、対照と比較してもＳＯＤ活性が増加した（表１６）。
Figure 2023507629000018
肥満の病因に特徴的な特定の亜鉛欠乏を考慮に入れれば、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の溶液の投与後のこの酵素の活性の回復は、体でのその酵素レベルの中和ならびに亜鉛依存性酵素、特にＳＯＤの調節および合成におけるその積極的な関与の結果であり得る。
ＳＯＤ活性の低下は、フリーラジカルおよびＬＯＰによるその成分の漸進的な損傷に起因する抗酸化防御システムの特定の枯渇の結果として見ることができる。したがって、現代の概念によれば、脂質酸化の有毒な二次生成物の過剰な蓄積が、抗酸化系のＳＯＤおよび他の酵素の活性の阻害を引き起こすので、この酵素の活性は、ＬＯＰプロセスの強度と密接に関連している。タンパク質の酸化的分解におけるＲＯＳの関与に関する文献レビューおよびデータ分析は、ＳＯＤの酵素活性の低下が、酵素分子の酸化的修飾に起因し得ることを示唆している。ＳＯＤは金属含有酵素であるため、タンパク質に損傷を与える酸素ラジカルが、酵素の活性中心で直接形成され得る。この場合、水素およびスーパーオキシド由来のフェントンおよびハーバー・ワイスの反応で形成されるヒドロキシルラジカルＯＨ－は、酵素を不活性化する直接的な薬剤として機能する。したがって、Ｓａｌｏ Ｄ．Ｃ．らの実験は、酸素ラジカルを含有する培地でのスーパーオキシドジスムターゼのインキュベーションが、酵素分子の切断をもたらし、追加のタンパク質画分の形成をもたらすことを示している。著者らは、Ｈ２Ｏ２に曝露されたときのスーパーオキシドジスムターゼの酸化的不活性化による結果を説明している。このような見方は、酵素の活性中心にある銅原子がフリーラジカルの形成を加速する能力と一致している。ＳＯＤの不活性化にいくつかの一般的な酸化状態を持つ金属が関与することを支持する別の議論は、Ｍｎ２＋含有スーパーオキシドジスムターゼが、Ｈ２Ｏ２とインキュベートしたときに酸化分解を受けにくいという事実である。
この系における重要な抗酸化酵素はカタラーゼであり、これは、スーパーオキシドジスムターゼによるスーパーオキシドアニオンラジカルの転位の結果として形成される過酸化水素を中和するので、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置および未処置の肥満の動物モデルにおけるこの酵素の活性を評価した。ＳＯＤ活性の低下と同様に、未処置の肥満動物におけるカタラーゼ活性の阻害が観察された。
脂質過酸化プロセスの活性化の背景に対する両方の酵素の活性の低下は、フリーラジカルプロセスのさらなるエスカレーションに寄与する負の予後事象と見なされる。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与は、肥満の未処置動物モデルの群から得られた結果と比較した場合、カタラーゼの活性のわずかな増加を引き起こし、これは、以前に確立された酸化促進－抗酸化のバランスの正常化と一般に相関した。
試験物質の投与後の研究された抗酸化酵素の活性の正常化は、このイオンの他の形態に関する文献データと一致している。したがって、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の予備投与は、エタノール中毒におけるラット肝細胞におけるＳＯＤおよびカタラーゼの活性の増加をもたらすことが示された。
明らかにされた主要な抗酸化酵素の活性に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の正の効果は、第１に、亜鉛（これらの酵素の適切な機能的活性を保証する必要な構造元素）の濃度の増加に起因するそれらの合成の増加によって説明され得る。
酸化促進－抗酸化のバランスに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の正常化効果に関して得られた結果は、この同位体の有意な抗酸化能を確認している。亜鉛は、フリーラジカル反応を直接妨害し得る典型的な抗酸化剤には属していないが、全体的な酸化促進－抗酸化のバランスに間接的な影響を及ぼす。したがって、亜鉛は、攻撃的なスーパーオキシドアニオンラジカルの形成に関与する酵素の群である、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害剤である。
タンパク質のスルフヒドリル基と直接相互作用する亜鉛は、活性酸素種による酸化からそれらを保護し、ラジカルのトラップとして機能するシステインリッチ金属結合タンパク質であるメタロチオネインの合成を誘導し、反応性混合原子価金属酸化物の形成を阻害するのに役立ち、膜安定化効果を示す。食事中の亜鉛欠乏は、血漿および他のいくつかの器官におけるビタミンＥの濃度を低下させ、それが体の一般的な抗酸化剤の貯留に影響を与えることが見出された。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の抗酸化特性を実施するための別の機構は、細胞膜を安定化するその能力に関連しており、これは、進行性の酸化ストレスにおいて特に重要である。亜鉛の膜保護効果の考えられる原因は、重金属の無害化および膜の安定化に直接関与するメタロチオネインの合成の誘導におけるその媒介的役割によって説明され得る。メタロチオネインのレベルが上昇すると、膜の完全性が維持され、アルキル化剤の作用から細胞が保護され得る。
亜鉛は、リン脂質の合成（ＰＳシンターゼ、ＰＳデカルボキシラーゼ、ＰＥＡメチルトランスフェラーゼおよびリン脂質メチルトランスフェラーゼの活性化と、ＰＨＩシンテターゼの活性の同時減少）およびそれらの非対称分布に影響を与えることにより、細胞膜を安定化し得ることが見出された。
したがって、特に、酸化ストレスの発症と密接に関連する全身性慢性疾患の病因を有する患者にとって、フリーラジカル反応の強度を制御し、身体の適切な抗酸化状態を維持することの重要性を考慮すれば、その疾患の基本的な治療における追加の手段としてのアスパラギン酸型のＺｎ－６４の安定した同位体の使用は、全体的な代謝状態の改善に寄与し得る。
肥満の動物モデルにおけるサイトカインプロファイル、レジスチンおよびグレリンのレベルに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果
脂肪組織は、体のエネルギー貯蔵所であるだけでなく、視床下部、下垂体、膵臓、肝臓、骨格筋、腎臓、内皮、免疫系などを含む、多くの組織および器官の応答を調節する内分泌、パラクリンおよびオートクリンシグナルの複合体を通じて代謝の調節に積極的に関与する器官でもあることは疑いの余地がない。したがって、脂肪組織は、サイトカインを含む５０以上のタンパク質因子、ホルモン、および成長因子を分泌する。ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γなどの炎症誘発性サイトカイン、ならびにＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＧＦなどの抗炎症性サイトカインがある。Mohamed-Ali V., Pinkney J., Coppacf S. Adipose tissue as endocrine and paracrine organ//Int J Obes Relat Meabol Disord 1998; 22: 1145-1158.
脂肪細胞における反応性酸素種の過剰産生の結果の１つは、シグナル伝達カスケードの開始であり、その質量が増加する脂肪組織に浸潤するマクロファージによる炎症誘発性サイトカインの産生の増大をもたらす。そのような障害の結果は、肥満を発症した人の体に全身性の慢性炎症を形成することである。活発に考察されている現代の概念によれば、肥満および肥満関連疾患の病因における重要な関連の１つであると考えられているのは、脂肪組織における無症候性の慢性炎症である。脂肪組織の慢性炎症は、細胞浸潤、線維症、微小循環の変化、アディポカイン分泌障害および脂肪組織代謝障害、ならびにＣ反応性タンパク質、フィブリノーゲン、および白血球などの非特異的炎症マーカーの血中濃度の上昇を特徴とする。Rajala M., Scherer E.// Endocrinology 2003; 144: 3765-3773.
脂肪組織中だけでなく、血清中の炎症誘発性サイトカインのレベルの増加は、脂肪組織における炎症過程の結果として起こる。
細胞間およびシステム間相互作用を調節する内因性の生物学的に活性なメディエーターとしてのサイトカインは、細胞の成長、分化、機能的活性、およびアポトーシスを調節することにより、その細胞の生存に影響を及ぼす。それらは、生理学的条件下で、病理学的影響に応じて、免疫、内分泌および神経系の作用の調整を確実にする。サイトカインはリンパ球、単球および組織マクロファージによって産生されると以前は信じられていた。しかし、最近の研究の結果によって、肥満では、任意の炎症過程と同様に、好中球、Ｔリンパ球、そして次に常在性マクロファージの脂肪組織への浸潤が初期段階で起こり、それが炎症の初期機構を決定することが示されている。マクロファージは、脂肪細胞の肥大に寄与し、それはそれらの機能的活性の増加およびサイトカインの合成の増加を伴い、炎症応答のさらなる強化をもたらすことが示されている。肥大した脂肪細胞は、ケモカインとその受容体を強力に分泌し、新しい好中球、マクロファージ、リンパ球の流入を刺激して、脂肪細胞のさらなる肥大、保存、炎症応答の強化に寄与する。脂肪細胞はマクロファージによるサイトカインの分泌を増加させ、マクロファージは次に脂肪細胞に作用し、脂肪組織細胞の肥大および活性化を引き起こす。リンパ球およびマクロファージのような肥大した脂肪細胞は、サイトカインを産生し、補体を活性化して、一連の炎症過程を引き起こすことがわかっている。結果として、炎症は安定して全身的になる。さらに、トランス－４－オキシ－２－ノネナールおよびマロンジアルデヒドなどの脂質過酸化生成物は、単球およびマクロファージの化学誘引物質である。蓄積された脂肪組織における脂質過酸化のプロセスの強化は、肥満の脂肪組織へのマクロファージの誘引および浸潤に寄与し、したがって、炎症反応の開始に積極的に寄与する。
結果として、増加する脂肪組織量は、脂肪細胞および脂肪組織に組み込まれたマクロファージの両方によって合成される炎症誘発性サイトカインの恒常的な供給源であり、これは、慢性炎症過程の形成および体内の炎症の維持をもたらす。その低強度は直接的な臨床症状を引き起こさないが、同時に、この過程は本質的に全身性であり、これは広範な器官および組織に影響を与え、それらの代謝の変化を引き起こし、それらの機能および免疫系反応を損なうことを意味する。
上記を前提として、研究の次の段階は、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与が、肥満動物のサイトカインプロファイルに影響を与えるか否かを調べることであった。この目的のために、実験動物の脂肪組織および血清中の主な炎症誘発性（ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ）および抗炎症性（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＴＧＦ）サイトカインの濃度を決定し、これによって、脂肪組織の炎症過程の強度について結論を出し、そのような炎症過程が全身性であるか否かを評価することが可能になった。
得られた結果によれば、肥満の発症は、高脂肪食を与えられた動物の脂肪組織における分析された全ての炎症誘発性サイトカイン（表１７）のレベルの増加を伴い、これは、炎症過程の活性化を示す。
次に、長期の炎症過程は、様々な合併症の発症につながる可能性があり、インスリン抵抗性および糖尿病の危険因子となり得る。サイトカインは、インスリン作用に対する細胞の感受性を低下させるだけでなく、炎症過程を強め、炎症性中間体の蓄積を増加大させ、組織の損傷および臓器の機能障害を引き起こす。J. Hirosumi et al.//Nature. -2002. -Vol.420, No6913. -P.333-336. C. Jiang, W. Wang, J. Tang.//Journal of Endocrinological Investigation. -2013. -Vol.36, No11. -P.986-992.
Figure 2023507629000019
上記のものを含む高レベルの炎症誘発性サイトカインは、β細胞のアポトーシスを引き起こし得ることが証明されている。高濃度のＩＬ－１２は、その発現がＩＦＮ－γによって活性化され、膵臓へのＣＤ８ ＋リンパ球の浸潤、および急性膵炎の発症を引き起こす。ＩＬ－１βは、これらの細胞の表面にある特定の受容体に結合することにより、ＮＦ－κＢ媒介アポトーシスの活性化を引き起こし、これがＤＮＡの断片化および細胞の機能的活性の喪失を引き起こす。さらに、ＩＬ－１βは、末梢組織のインスリン耐性の発達に寄与する要因の１つと見なすこともできる。ＩＬ－１βは、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）－１のセリン残基をリン酸化することにより、インスリンシグナル伝達に影響を与えるＩκＢキナーゼ－βを活性化することが示されている。さらに、ＩＬ－１βは、肝臓の脂質生成を活性化し、脂肪細胞におけるトリグリセリドおよび遊離脂肪酸のレベルの増加に寄与することにより、間接的にインスリンの作用に対する耐性を高め得る。
ＩＬ－６は、末梢血中の脂肪組織量の増加に正比例して蓄積されることが示されている。脂肪細胞は、免疫系に次いで２番目に大きなＩＬ－６の供給源である：循環しているＩＬ－６の３５％は、脂肪細胞によって合成される。血中の濃度は、ボディマス指数に正比例し、肥満で増加する。同時に、体重の減少は、ＩＬ－６の血中濃度の低下を伴う。過剰になると、ＩＬ－６は、インスリン受容体サブユニットの１つの合成を抑制することによってインスリン耐性を悪化させる。内臓脂肪組織の脂肪分解を活性化することにより、ＩＬ－６は、脂肪性肝疾患および全身性アテローム性動脈硬化症の進行性の発症に寄与する。さらに、ＩＬ－６は、肥満に関連する別の要因であるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の産生の増加を誘導する。V. Rotter et al.//the Journal of Biological Chemistry. -2003. -No.278. -P.45777-45784. Fantuzzi G./Journal of Allergy and Clinical Immunology. -2005. -Vol.115, No.5. -P.911-919.
レベルの制御機構の１つ、したがって、炎症誘発性サイトカインの生物学的効果は、抗炎症性サイトカインの群によって実施される。これらのサイトカインは、特定の遺伝子の転写に影響を与えることによって炎症誘発性サイトカインの合成を阻害し、インターロイキンＲＡＩＬの受容体アンタゴニストの合成を誘導し、可溶性受容体の産生を増強し、細胞上の炎症誘発性受容体の密度を低下し得る。したがって、炎症誘発性サイトカインのプロファイルに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果の考えられる機構を明らかにするために、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、およびＴＧＦのレベルを決定した。
肥満動物における抗炎症性サイトカインのレベルのわずかな減少のバックグラウンドに対して、炎症誘発性サイトカインのレベルの検出された変化が起こった。同時に、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された動物では、抗炎症性サイトカインのレベルは、未処置の肥満動物モデルよりも高かっただけでなく、対照群の動物よりも高かった。
試験物質で処置された対照群の動物に変化がないことは、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の長期使用が安全であり、病的状態の発症によってのみ治療効果を示し得ることを示唆するということが強調されるべきである。
上記のように、肥満の病因は、全身性の慢性炎症過程を伴い、その強度は、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの血清レベルによって評価され得る。
肥満を有する動物の血清中のサイトカインプロファイルの分析（表１８）は、脂肪組織から得られたデータと比較してより顕著である、炎症誘発性サイトカインのレベルの増加を示した。抗炎症性サイトカインＩＬ－４のレベルに統計的に有意な変化は見られなかった。肥満動物におけるＩＬ－１０の血清レベルのわずかな増大は、代謝障害に対する身体の特定の代償反応と見なされ得る。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された動物において、抗炎症性サイトカインのレベルの増加のバックグラウンドに対して、炎症誘発性サイトカインのレベルの減少があり、これは、対照群の動物においてさらに高かった。
Figure 2023507629000020
サイトカインプロファイルに対する亜鉛の効果の基本的な機構の１つは、酸化ストレスに感受性のある転写因子のその阻害であり得る。亜鉛はまた、ＩＬ－６およびＩＬ－８などの炎症誘発性サイトカインをコードする遺伝子を部分的にブロックする場合がある。
肥満の動物モデルにおけるサイトカインプロファイルに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の特定の正常化効果は、肥満における研究された試験物質の可能な抗炎症能の証拠として役立つ場合がある。
したがって、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された動物の血清および脂肪組織中の炎症誘発性サイトカインのレベルの減少は、部分的には、抗炎症性サイトカインのレベルの増加に起因する場合がある。脂肪組織の量とそれが産生する炎症誘発性サイトカインのレベルとの間の密接な関係の存在を考慮すると、サイトカインプロファイルに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の明らかにされた正の効果が、主に体重に影響を及ぼし、したがって脂肪組織の量に影響を及ぼすように見える。
サイトカインに加えて、脂肪細胞は、エネルギー代謝の調節に関与する多くの生物学的に活性な物質を分泌する。そのような物質の１つは、レジスチンまたは脂肪細胞特異的分泌因子（ＡＤＳＦ／ＦＩＺＺ３）である。炎症の機構の刺激、内皮の活性化、および血管平滑筋細胞の増殖へのレジスチンの関与によって、レジスチンをマーカーまたは疾患の発症における病因としてさえ見ることが可能になる。この脂肪由来ホルモンは、脂肪代謝にフィードバック効果をもたらす：一方で、その濃度は脂肪細胞の分化とともに増加し、他方では、レジスチンは脂肪生成を抑制する。レジスチンは、インスリン抵抗性の原因の１つとして、肥満と糖尿病の発症との間の関連であり得る。文献データによると、レジスチンレベルは、ＩＩ型糖尿病および肥満に対する感受性の予測因子として使用され得る。レジスチンは、インスリンの作用に対する末梢組織の感受性を低下し得、したがって、インスリン抵抗性の発達を刺激し得ることが示されている。レジスチンは、ＮＦ－κＢ依存性の発現ならびに炎症誘発性サイトカインおよび接着分子（ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を含む）の放出を活性化する。Faantuzzi G. /Journal of Allergy and Clinical Immunology. -2005. -Vol.115, No5. -P.911-919. C. Jiang et al.,//Journal of Endocrinological Investigation. -2013. -Vol.36, No11. -P.986-992.
したがって、全ての実験群からの肥満の動物モデルの脂肪組織および血清中のレジスチンのレベルを調査した。実験で得られた結果によれば、このアディポカインのレベルは増加する傾向があり、脂肪組織でより顕著であった（表１９）。
Figure 2023507629000021
レジスチンが脂肪細胞の成熟の促進剤であり、脂肪組織における断熱因子の形成のオートクリン調節因子として作用することを考慮すると、このアディポカインのレベルのわずかな増加でさえ、脂肪組織の成長および肥満関連代謝障害の進行に寄与するであろう。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を注射された肥満の動物モデルにおけるレジスチンのレベルは、対照値の範囲内であった。
レジスチンは主に前脂肪細胞によって分泌され、程度は少ないが内臓脂肪組織の成熟脂肪細胞によって分泌されるので、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の正の効果は、それが動物の体重、したがって高脂肪食で維持された動物の脂肪量の蓄積に影響を与える能力によって説明され得る。
食欲の調節に直接関与する別の因子は、主に胃底を裏打ちするＰ／Ｄ１細胞によって分泌され、程度は低いが、視床下部、下垂体、性腺、およびランゲルハンス島のε－細胞などの他の器官によって分泌される親油性ホルモンであるグレリンである。このペプチドは、空腹感とエネルギー代謝の調節に重要な役割を果たし、食物摂取を刺激し、肥満の発症を引き起こす。グレリン受容体は、レプチン受容体であるＯｂ－Ｒｂと同じ視床下部構造、ならびに弓状核および腹内側核に局在している。その高レベルは、長期的な体重増加に寄与する可能性がある。体内のグレリンレベルの閾値が下がると、食欲が低下する。F. Ferrini et al.,//Current Neuropharmacology. -2009. -Vol.7, No1. -P.37-49. J. Camina et al.,//Endocrine. -2003. -Vol.22, No1. -P.5-12.
過去数年にわたって実施された研究は、神経ペプチドＹおよびエンドカナビノイド系の関与を伴う視床下部に対するこのホルモンの影響を通じて、体内のエネルギーバランスの調節におけるグレリンの重要性を明らかにした。
グレリン発現は、低血糖に応答して増強され、高血糖の間は阻害される。これは、グレリンが絶食に対する身体の代謝反応およびホルモン反応を、インスリンの関与および適切な血清グルコース濃度を維持する機構と組み合わせていることを示し得る。グレリンは、食欲不振、脂肪生成、および体細胞向性の特性を有し、レプチンアンタゴニストとして作用し、食物の必要性を高める。グレリンに対する能動的免疫は体重減少を引き起こすことが示されている。グレリンの食欲増進効果は、ニューロペプチド－Ｙニューロンの活動を増加させ、プロオピオメラノコルチンニューロンを阻害する能力にある。
グレリン受容体は、中枢神経系（下垂体、視床下部）および他の器官（膵臓、腸、胃）の両方に位置している。このペプチドは、空腹感およびエネルギー代謝の調節に重要な役割を果たし、食物摂取を刺激し、肥満の発症を引き起こす。そのレベルは、空腹時、体重減少、カロリーの高い食物摂取および低血糖症で増大する。食事による体重減少後のグレリンの血漿レベルの上昇は、グレリンが体重の長期調節に役割を果たすという仮説と一致している。グレリンのレベルは、肥満、２型糖尿病、高血圧の人では減少する。
損なわれたエネルギー恒常性と肥満の発症との間の密接な関係を考慮して、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を用いて処置および未処置の肥満の動物モデルにおけるグレリンの血清レベルを分析した。
このデータは、肥満の発症がこのホルモンのレベルの低下を伴い、対照群の動物へのアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与もまたその血清レベルでの低下を引き起こしたことを示している（図１６）。一般に、循環中のグレリンのレベルは正のエネルギーバランス、総体重および脂肪組織量、脂肪細胞サイズおよびレプチンレベルと逆相関することが公知であるので、そのようなデータは文献で提供される情報と一致している。例えば、食欲不振の患者でのグレリンのレベルは、肥満を発症する患者よりも高い。試験物質を注射した肥満の動物モデルでは、グレリンのレベルは、対照群の動物で決定されたレベルと同様であった。M. Kojima, K. Kangawa.// Physiological Reviews. -2005 -Vol.85, No2. -P.495-522.
したがって、このデータは、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体が、脂肪細胞の機能状態に対して正常化効果を有し、これが、生理学的に正常な状態へのサイトカインバランスの回復をもたらし得ることを示唆している。
肥満の動物モデルの器官における二価金属イオンのレベル
生理学的および病理生理学的プロセスにおける亜鉛の関与は、体内の亜鉛のレベルに大きく依存する。亜鉛は全ての細胞と器官に見られるが、１つまたは別の器官でのその濃度はかなり異なり、器官の特定の活動に依存する。人体の亜鉛貯留は非常に少なく、約１．５～３ｇの量である。この数字は多くの要因（人の年齢および性別、胃腸粘膜の状態、関連する病気、妊娠など）に依存する。亜鉛はほとんど全ての組織に見られる。亜鉛貯留の約６２～６３％は骨格筋にある。多くの研究者によって提供されたデータによると、亜鉛は次のように人体に分布している（μｇ／ｇ）：皮膚、副腎－６、卵巣－１２、脳－１３、リンパ節－１４、消化管－２１、心臓－２７、腎臓－３７、肝臓－３８、筋肉－４８、骨－６６、前立腺－８７、精子－１２５。全血は約２．５～５．３μｇ／ｍｌの亜鉛を含有する。血漿中の亜鉛は少ない（０．７～１．２μｇ／ｍｌ、これは体内の亜鉛の総量の約０．２～１％である）。赤血球の破壊に起因して、血清中の亜鉛のレベルは血漿中よりもわずかに高くなる（１．１～１．３μｇ／ｍｌ）。
亜鉛およびいくつかの二価金属（銅およびマンガン）のレベルは、肥満を有する動物の骨格筋、腎臓および肝臓において、ならびにこれらの金属のレベルに対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果において決定された。
分析のための銅およびマンガンの選択は、それらの並外れた重要性および主要な代謝過程への関与によって説明される。さらに、研究された金属は、互いの消化率および生物学的利用能に影響を与えるので、それらの１つの異常なレベルは、多くの場合、上記の他の金属のレベルの変化の結果または原因である。ほとんどの場合、それらは互いに競合する。したがって、例えば、食品中に大量に存在する鉄は、亜鉛の吸収を約２分の１に減少させる。銅の存在はまた、輸送金属酵素との競合的関連に起因して、胃腸管における亜鉛の吸収を減少させる。
Figure 2023507629000022
銅は、必須の微量元素に属する。成人の体は約１１０～１５０ｍｇの銅を含有する。この量の半分は筋肉にある。それより少ない銅の貯留は肝臓、脳半球の灰白質および骨髄に集中している。この重要な微量元素は、酵素およびタンパク質（主にセルロプラスミン）に見出される。後者は、多くの生物学的に活性な物質の酸化を触媒し、様々な組織および器官への銅の送達を確実にする金属酵素である。銅はチトクロームオキシダーゼ、チロシナーゼ、銅オキシダーゼの特異的活性化因子であることが公知である。銅は、タンパク質代謝の酵素であるアルギナーゼおよびアミノペプチダーゼを活性化し、治癒過程に必要な核酸の合成を促進する。この生体物質は、血液形成、ヘモグロビン合成、チトクローム系の機能の過程に関与しており、血球間質の一部である。微量投与に使用される銅は、骨格筋および肝臓のグリコーゲンレベルを増加させる。それはインスリン様の活性を示し、グルコースの酸化を促進し、グリコーゲンの分解を阻害する。銅は肝臓の中和機能を強化し、ミネラル代謝を正常化する。銅は多くの酵素の一部であり、それらの機能を決定し、それらの作用を調節する。それは全てのオキシダーゼの一部であり、それ自体が体内のレドックス反応の重要な要素である。これらの酵素は、細胞の呼吸およびフリーラジカルの影響からの細胞の保護のプロセスに必要であり、ミエリンの合成、結合組織の生合成、および腺の代謝に関与している。銅の抗酸化活性は、スーパーオキシドジスムターゼの構造形成への関与と関連している。
マンガンは、身体の適切な代謝状態を確実にするために必要な必須の微量元素である。その最高レベルは、脳半球の骨、肝臓、灰白質に見られる。この生体物質にはインスリンのような効果があり、血中グルコースレベルを低下させ、グリコーゲンの合成を増加させる。マンガンは血液形成を刺激することがわかっている。それは高い酸化活性および顕著な脂肪親和性（コリン様）作用を有する。この微量元素は、脂肪およびタンパク質の代謝、ならびに多くのビタミンの合成に影響を有する。さらに、それは最も重要な酵素システムの一部である。マンガン塩はアドレナリンの高血圧作用を弱め、アドレナリン高血糖の減少を誘導する。マンガンにはコレステロール低下作用および抗硬化作用がある。
得られた結果（表２０）によれば、肥満の発症において、器官間で亜鉛が再分布する傾向があった。したがって、亜鉛レベルは腎臓でわずかに増加し、肝臓および筋肉で減少した。アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された動物の筋肉の亜鉛レベルの増加は、一方で、正常な生理学的状態の全ての亜鉛貯留のほとんどが骨格筋にあることを考えると、非常に自然であり、他方で、これは、試験物質を投与された肥満動物における亜鉛の輸送および沈着の過程において目に見える機能障害がないことの間接的な確認と見なされ得る。
より重要なのは、肥満の動物モデルの肝臓における亜鉛レベルの減少である。結局のところ、肝臓は亜鉛含有タンパク質の合成のための主要な場所である。したがって、この器官の亜鉛貯留の減少は、亜鉛依存性および亜鉛含有酵素の不足に関連する障害の発症および進行に寄与するであろう。肝臓の亜鉛レベルを低下させることの結果の１つは、この研究の前の段階で特定された肥満動物のスーパーオキシドジスムターゼの血清活性の低下であり得る。
高脂肪食を与えられ、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体を注射された動物の肝臓中の亜鉛レベルは、なお対照群の動物よりもわずかに高かった。これは、亜鉛ホメオスタシスの回復を示している。
銅に関しては、筋肉においてはそのレベルの増加および腎臓においてはそのレベルの減少に向かう傾向があった。銅濃度の最も顕著な変化は、この微量元素の代謝に主要な役割を果たす器官である肝臓で観察された。
亜鉛は腸での吸収過程において銅の競争相手であり、高濃度の場合、体内で銅欠乏症を発症し得ることを強調しておく必要がある。したがって、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体で処置された動物の銅レベルに有意な変化がないことで、この元素の用量レベルが適切に選択されたことが示されている。
これらの結果は、肥満の発症および進行に直接関与する主要な系に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の正の効果を示唆している。
一般に、結果を要約すると、肥満の動物モデルに投与されたアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体は、その機能障害が身体に最も深刻な結果をもたし得る、多くの系に及ぶ複雑な効果を示す。
全ての体組織、特に脂肪組織の適切な生理学的状態を確実にするために亜鉛ホメオスタシスを保存することの重要性を考慮すると、肥満におけるアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の正の効果に関する得られたデータは、肥満の病因の間に減少した亜鉛レベルの回復と部分的に関連しているようである。
亜鉛の生理学的役割に関する蓄積されたデータによれば、そのレベルの増大は、生化学的シフトのカスケードを引き起こし得、これが、最終的に、その全体的な正の効果を決定する。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の調節効果の実施のためのいくつかの潜在的な機構が存在する。まず第１に、それは亜鉛依存性酵素および転写因子の合成の強化である。フリーラジカルプロセスの強化および酸化ストレスの進行のバックグラウンドに対して、亜鉛（これらの酵素の必要な構造成分）の利用可能性に起因して主要な抗酸化酵素の数を増やすことが、適切な抗酸化剤の貯留を維持するのに役立つ。重要な事実は、多くの抗酸化剤、抗炎症性サイトカイン、および細胞シグナル伝達カスケードの調節に積極的に関与し、基本的なプロセスの調節に関与する因子の合成を誘導する亜鉛の能力である。したがって、文献データによれば、脂肪細胞における脂肪分解を刺激することによって脂肪沈着の減少に寄与する、亜鉛－アルファ－糖タンパク質（ＺＡＧ）のレベルは、肥満において有意に減少する。さらに、脂肪細胞、特に褐色脂肪組織の分化のプロセスは、その多くが亜鉛を含有する転写因子の群によって厳密に決定および制御される。
したがって、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体が肥満の病因に及ぼす影響の包括的な分析の結果によって、この微量元素が、生物学的に活性な化合物の開発に使用される有望な添加剤として、慢性的な炎症過程、抗酸化剤貯留の全身的枯渇、およびセロトニン作動性系の機能の障害を伴う病状の処置だけでなく、全身性代謝障害に関連する疾患の予防のためでもあることが示される。
結論
初めて、食事誘導性肥満モデルにおける肥満の発症および進行の主要な病原性関連に対するアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の効果に関する包括的な研究を実施した。得られた結果は、過体重および肥満患者の治療における補助治療薬としてのアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の使用の妥当性の事実上の根拠を提供する。
高脂肪食で飼育された動物へのアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与は、ボディマス指数の低下を伴い、肥満の未処置の動物モデルと比較して体重および消費される食物の量を減少させるのに役立つことが示されている。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体は、高脂肪食を与えられた動物の体内の脂質代謝に正の効果を有することが見出された。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体は、未処置の肥満の動物モデルと比較して、高脂肪を与えられた動物の膵臓および肝臓の形態機能特性に正の効果を有することが見出された。
高脂肪食を与えられた動物に投与されたアスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体は、セロトニン代謝に関与する主要酵素の活性に調節効果を及ぼし、これは、未処置の肥満動物モデルの値と比較して中枢および末梢セロトニンのレベルを回復するのに役立つことが見出された。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与は、抗酸化酵素（スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラーゼ）の活性の増加を介した抗酸化防御の活性化のバックグラウンドに対して、フリーラジカルプロセスの強度の減少に起因して高脂肪食を与えられた動物における酸化促進－抗酸化ホメオスタシスの正常化（脂質過酸化生成物およびタンパク質酸化修飾のレベルの低下）に寄与することが示されている。
高脂肪食で維持された動物の血清および脂肪組織中のサイトカインプロファイルに影響を与える、すなわち炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－γ）のレベルを、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＴＧＦ）のレベルのわずかな増加のバックグラウンドに対して低下させる、アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の能力が示されており、これは一般に、全身性炎症の強度の低下を一般に示している。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体は、肥満を有する動物の脂肪組織および血清中のレジスチンのレベル、ならびにグレリンの血清レベルに対して目に見える影響を及ぼさないことが見出された。
アスパラギン酸型のＺｎ－６４安定同位体の投与は、肥満の動物モデルにおいて、筋肉、腎臓、および肝臓の間で二価金属イオン（亜鉛、銅、マンガン）の再分布を引き起こし、それらの生理学的レベルの回復に寄与することが見出された。
［実施例７］
腹腔内投与による実験動物（ラット）の血中のインスリンレベルの変動に対する実験薬の効果
第１の群は、生理食塩水を注射された動物（体重約１８０～２２０グラム）から構成されていた。
動物の数：８（群あたり４匹の動物）；２ポイントのサンプリング－薬剤投与後２日目、および生理食塩水の最後の注射後７日目（４×２＝８）。
第２の群は、同位体が自然に分布している酢酸亜鉛を注射された動物（体重は約１８０～２２０グラム）から構成されていた。現在の用量は亜鉛によって計算された。各動物には、動物の体重１ｋｇあたり３７５０μｇの亜鉛が注射された。実験動物に対する亜鉛の影響を評価するための比較群。酢酸亜鉛は、ほとんどの動物実験および糖尿病実験で使用される標準的な亜鉛化合物である。
動物の数：８（１群あたり４匹の動物）；２ポイントのサンプリング－薬物投与後２日目、および生理食塩水の最後の注射後７日目（４×２＝８）。
第３の群は、アスパラギン酸（Ｚｎ６４）型の亜鉛同位体を注射された動物（体重は約１８０～２２０グラム）から構成された。現在の用量は亜鉛によって計算された。各動物には、動物の体重１ｋｇあたり３７５０μｇの亜鉛を注射した。
動物の数：８（１群あたり４匹の動物）；２ポイントのサンプリング－薬物投与後２日目、および生理食塩水の最後の注射後７日目（４×２＝８）。
実験のスキーム：
動物はケージに入れられ（ケージごとに４匹）、食物／水へは自由なアクセスであった。動物がケージに入れられてから３日後、実験薬（天然亜鉛すなわち同位体軽亜鉛）を注射する。投与は１日おきに１匹あたり７回の注射で行われる（腹腔内投与法）。各動物への注射薬の投与量は、動物体重１ｋｇあたり３７５０μｇという亜鉛の比率に基づいて計算された。最後の注射後、動物の半分は、空腹状態に保たれ（１２時間）、水は自由に摂取させる。この期間が終了すると、動物は実験から除外する。動物の半分は、さらに７日間、食べ物／水を自由に摂取し続ける。最後の注射から６日目、動物は空腹状態に保たれ（１２時間）、水を自由に摂取できる。この期間が終了すると、動物は実験から除外される。
研究材料
動物研究活動を管理する動物福祉規則の順守
第１回国民生物倫理会議（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ）（Ｋｉｅｖ，Ｕｋｒａｉｎｅ，２００１年）によって承認され、「実験的およびその他の科学的目的に使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約」（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ，１９８６）の規定に同意した、動物を扱う一般原則（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｗｏｒｋｉｎｇ ｗｉｔｈ Ａｎｉｍａｌｓ）に従って動物を使用して生物医学研究を実施するための国際勧告に、実験動物での作業中に従った。ラットでの実験作業は、キエフのタラスシェフチェンコ国立大学の飼育場で行った。動物での研究は、この機関の科学評議会によって承認され、次に、当時採択された現在のウクライナの法律と調整された、実験動物を用いた実験作業の規則によって規制された。
ラットにおける研究成績の条件
２～３ヶ月齢で体重１２０～３００ｇの白色ラットについて研究を行った。実験動物は、水を自由に摂取できる標準的な飼育場の食事で飼育された。実験中、動物はプラスチック製のケージで自然な昼夜の光モードで、室温１９～２４℃、湿度５０％以下に保たれた。実験の前に、動物は研究室で７日間順応させられた。
ラットの血清の調製
ラット血清は全血から調製した。付随するタンパク質およびフィブリノーゲンを除去するために、全血を３７℃で３０分間静置した後、試料を２５００ｇで１５分間遠心分離した。得られた上清（血清）を直ちに血球から分離し、さらなる分析のために－２０℃で凍結した。
腎臓および肝臓ホモジネートの調製
全腎臓、肝臓および筋肉ホモジネートを以下のように調製した。臓器切除およびホモジナイゼーションは、１～４℃の温度で実施した。組織のホモジナイザーションは、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で行った。使用した緩衝液の容量（ｍｌ）は、単離された臓器の質量（グラム）の５倍であった。単離された肝臓は、シリンジを使用して門脈を介して冷却生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）で灌流した。細かく刻んだ肝臓を、細かく粉砕したテフロン乳棒を備えたホモジナイザーに移し、冷却した緩衝液中でホモジナイズした。分離された一対の腎臓を、冷やした生理食塩水で灌流して、脂肪組織から放出し、はさみで細かく刻んだ。細かく刻んだ組織を、細かく粉砕したテフロン乳棒を備えたホモジナイザーに移し、冷却した緩衝液でホモジナイズした。全腎臓および肝臓ホモジネートを６００ｇで１５分間遠心分離した。ミンチを落ち着けた後、液体をデカントし、１５，０００ｇで１５分間再度遠心分離した。これらの２つの手順により、核とミトコンドリアの破片を取り除くことができた。調製したホモジネートのアリコートを、窒素中で凍結した（Rybalchenko V. K., Koganov M. M. Structure and function of membrane 1988. -312 pp）。
１．動物血清中のインスリンレベルを決定するための方法：
酵素結合免疫吸着アッセイ
（ラットの血清中のインスリンレベルは、可溶性タンパク質に使用される一般的な方法に基づく酵素免疫測定法を使用して決定された。これは、可溶性タンパク質の吸着能力を有する９６ウェルマイクロプレートで実施した［Crowther J. R. ELISA Guidebook/J. R. Crowther.-Totowa, New Jersey: Humana Press Inc., 2001. -P.436］。
血清は、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で１～１０の希釈として調製した。１００μｌ容量の試料をマイクロプレートウェル内で４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を含む緩衝液で洗浄して、未結合の物質を除去した。非特異的結合部位を、５％脱脂ミルクブロッキング溶液でブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、マイクロプレートの別々のウェルに一次ウサギ抗インスリン抗体をロードし、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、マイクロプレートウェルを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した適切な二次抗体をロードし、３７℃でさらに１時間インキュベートした。二次抗体の結合は、０．０１３％Ｈ２Ｏ２を含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で調製した０．４ｍｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに１００μｌのＯＰＤ溶液を加えることによって視覚化した。光学密度は４９２ｎｍで測定した。インスリン濃度は、所定の条件下で生成された較正曲線および既知の濃度のヒトインスリンを使用して計算した。
ラット肝臓および血清におけるスーパーオキシドジスムターゼ活性の決定
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、ＥＣ１．１５．１．１）活性を測定するために、アドレナリン自己酸化のプロセスを阻害する酵素の能力に基づく方法を使用する。
試験試料（肝臓および腎臓のホモジネート）の１０μｌのアリコートをマイクロプレートウェルに入れた。２００μｌの０．２Ｍの重炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０．６５）を各ウェルに加えた。各ウェルにアドレナリンの０．１％溶液１０μｌを加えることにより反応を開始した。ブランク試料には酵素源は追加されていない。光学密度は、アドレナリンを添加してから４分後と８分後にマイクロプレートリーダーを使用して波長３４７ｎｍで測定した。
生成物の蓄積量または基質量の減少に基づいて酵素活性を測定する古典的な方法は、アドレナリンの酸化生成物である、反応生成物の較正曲線を構築することが不可能であるため、ＳＯＤには適用できない。この酵素の活性は、以下の式を使用して算出された従来の単位／分＊タンパク質（ｍｇ）で表された：
Figure 2023507629000023
ここで、Ｘは、８分でのブランク試料の光学密度と４分での同じブランク試料の光学密度との間の差に等しい、試験試料を含まないブランク試料の光学密度である；Ｙは、８分でのブランク試料の光学密度と４分での同じブランク試料の光学密度との間の差に等しい、試験試料を含むブランク試料の光学密度である；ａはブランク試料中のタンパク質の量（ｍｇ）である；４は、消光の決定の間のインキュベーション期間、４分である；５０／１００は、従来の単位への変換である［Sirota T. V. Novel approach to the study of adrenaline auto-oxidation and its use for the measurements of superoxide dismutase activity//Vopr Med Khim -1999. -45(3). -P.263-272］。
耐糖能の決定
実験開始の１６時間前に水にだけアクセスできた動物を耐糖能試験に使用した。ラットを４０ｍｇ／ｋｇの用量でチオペンタールナトリウムの腹腔内注射で麻酔した。同じ実験群内で５匹の動物を使用した。血糖の基礎レベルをラットで決定し、その後、動物に３ｇ／ｋｇの用量で２ｍｌのグルコース水溶液を与えた。グルコースの濃度は、実験開始から６０分後に決定した。採血は尾静脈を介して行った［Gorbulinska O. V. Sugar-lowering effects of water extracts of yakon (Smallanthus sonchifolius poepp.&endl.) /O. V. Gorbulinska, M. R. Khokhla, L. T. Mishenko et al.// Biological Studios -2014. -8(2). -P.57-64.］結果は図１６Ａ－図１６Ｅを参照のこと。
分析された全てのデータによれば、対照群（生理食塩水を注射されたラット）とラットに亜鉛を投与された群との間に信頼できる差はない。これは２つの要因に起因し得る－亜鉛溶液が誤って投与された（経口ではなく腹腔内）か、またはインタクトなラットを使用したので、それらは、体内の亜鉛の量が増加した場合に、島の系のバランスをインスリンの過剰産生に向けてシフトできない、補償機構を有する場合がある。なぜなら、これは、それに伴う全ての低血糖を引き起こす場合があるからである。
同時に、亜鉛の同位体を投与された群において、ラットの体重の有意な増加が観察された。１型糖尿病の人は体重が減少することが多いので、これは肯定的な結果である。得られたデータは、亜鉛の同位体が体重増加の動態に正の影響を有し得ることを示し得る。
動物の実験群の血清中のインスリンレベルの分析は、以下の結果を示した：実験全体の間のインスリンレベルの有意な変化は、動物の対照群において認められなかった。酢酸亜鉛を注射された動物の群では、薬物中止後の最初の日にインスリンレベルの有意な増加が観察され、その後、インタクト／対照動物の値までインスリンレベルが低下する。亜鉛同位体を注射された群では逆の状況が観察される。薬物中止後の初日、インスリンレベルはインタクトな動物の群よりもわずかに高く、中止後７日目に、この群の動物のインスリンレベルの有意な増加が観察された。図１７。
この結果、酢酸亜鉛と比較して、亜鉛同位体は、血清中のインスリンレベルに対してより長期の効果を有するか、または沈着部位からよりゆっくりと放出され、これはまた、インスリンレベルを増加させる、より遅い効果を引き起こすことが示される。
スーパーオキシドジスムターゼ活性の分析は、動物の全ての実験群において、血清中のその活性に有意な変化を示さなかった。これは、注入された亜鉛調製物がこの酵素の活性に及ぼす影響がないか、または亜鉛調製物の誤った投与に起因する（最も可能性が高い）可能性がある。図１８Ａ～図１８Ｂ。
ランゲルハンス島の顕微鏡研究は、亜鉛同位体の投与後の正の動態を示した－対照群および酢酸亜鉛を注射された群と比較して、島面積の有意な増大。図１９。
得られた結果は、実験動物の血清中のインスリンレベルの分析からの結果と相関している。顕微鏡の結果は、亜鉛調製物、特に亜鉛同位体の投与が膵島の面積の増加につながることを示しており、これは次にこれらの島によるインスリン産生の増大の可能性を示し得る。Ｉ型糖尿病の発症は、これらの膵島によるその合成の問題に起因して重大なインスリン欠乏と関連しているので、これは正しい方向への動きである。図２０Ａ～図２０Ｆ。
Figure 2023507629000024
血流中のグルコース濃度の動態に対する亜鉛同位体の潜在的な影響を決定するために、耐糖能試験を実施した。実験手順：実験動物には、生理食塩水溶液または生理食塩水溶液（５ｍｇ／ｋｇ）中の亜鉛のいずれかを、２ｍｌの量で胃内注射する。その後、前述の注射の６０分後、グルコースの基礎レベルを測定し、同じ投与経路を使用して、グルコース溶液を２ｍｌの容量で３ｇ／ｋｇの量で注射する。血糖値は、グルコース溶液を注入してから６０分後に再度測定される。グルコースレベルの低下の差は、血流中のグルコースレベルの動態に対する注入されたエフェクターの正の効果を示している。
耐糖能試験によって、対照群と比較して、亜鉛同位体を投与した後のグルコース濃度の低下が示された。これは、血流中のインスリンレベルに対する亜鉛同位体の投与の影響を示している可能性があり、その結果、グルコースから血液を取り除くことに関連する機構が引き起こされる。インスリンが亜鉛依存性タンパク質であることを考えると、亜鉛の投与は、組織内の受容体と比較してこのタンパク質の活性の増大または血流中のこのホルモンの量の増大のいずれかを引き起こすと想定され得る。
肝臓組織における金属（亜鉛、マンガンおよび銅）の蓄積の分析によって、薬物中止後１日目および中止後７日の両方で、亜鉛調製物を投与された動物の両方の群において、亜鉛レベルのみが有意に増加することが示された。これは、動物に投与された亜鉛が蓄積され、その除去が増加しないことを示している。他の全ての分析された金属は、動物の対照群で観察されたそれらの濃度の範囲内にある。図２１Ａ～図２１Ｃ。
腎臓組織（亜鉛、マンガンおよび銅）における金属の蓄積の分析によって、薬物中止後１日目および中止後７日の両方で、亜鉛調製物を投与された動物の両方の群において、亜鉛レベルのみが有意に増加することが示された。これによって、動物に投与された亜鉛が蓄積され、その除去が増加しないことが示されている。他の全ての分析された金属は、動物の対照群で観察されたそれらの濃度の範囲内にある。図２２Ａ～図２２Ｃ。図２３Ａ～図２３Ｆ。
実験動物（ラット）におけるＩ型糖尿病に対する試験物質（Ｚｎ６４アスパラギン酸）の潜在的効果に関する研究報告
経口投与
第１の群－対照。動物の体重約１４０～１５０グラム（動物の初期体重）。
動物の数：５（雄）。５匹全ての動物を１つのケージに群で収容し、食べ物と水を自由に摂取できるようにした。実験の開始時に、各動物に１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を腹腔内に単回注射した。２４時間後、７回分の試験物質を動物に経口投与した。投与の頻度－１日おき。投与量－動物１匹あたり８００μｇの亜鉛。
最後の投与後、動物を１２時間絶食させ、水を自由に摂取させた。この期間が満了すると、動物は実験から除外された。
第２の群－糖尿病。動物の体重約１４０～１５０グラム（動物の初期体重）。
動物の数：１０（雄）。動物はケージに４匹ずつ収容し、食物と水を自由に摂取できるようにした。動物に糖尿病を誘導するために、各動物に、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した動物重量１００ｇあたり６ｍｇのストレプトゾトシン溶液を腹腔内に単回注射した。投与量－動物１匹あたり８００μｇの亜鉛。絶食した動物は、糖尿病の誘導の２日後に十分なレベルの血糖について試験した。実験には、血中グルコース濃度が＞２０ｍｍｏｌ／ｌの範囲内のラットを使用した。
第３の群－糖尿病＋亜鉛：動物の体重約１４０～１５０グラム（動物の初期体重）。
動物の数：１０（雄性）。動物はケージに４匹ずつ収容され、食物と水を自由に摂取できるようにした。動物に糖尿病を誘導するために、各動物に、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した動物体重１００ｇあたり６ｍｇの用量のストレプトゾトシン溶液を腹腔内に単回注射した。絶食した動物は、糖尿病の誘導の２日後に十分なレベルの血糖について試験した。この実験には、血中グルコース濃度が＞２０ｍｍｏｌ／ｌの範囲内のラットを使用した。
２４時間後、試験物質の７回の投与を動物に経口投与した。投与の頻度は１日おき。
投与量－動物１匹あたり８００μｇの亜鉛。
研究材料
動物研究活動を管理する動物福祉規則の順守
この実験に使用された実験動物は、動物を含む臨床的および生物学的研究に関する国際基準および勧告に準拠し、第１回国民生物倫理会議（Ｋｙｉｖ、Ｕｋｒａｉｎｅ、２００１年）によって承認された人道的動物取り扱いの基本原則（Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈａｎｄｌｉｎｇ）に準拠して維持され、これは実験的およびその他の科学的目的に使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、１９８６年３月１８日）の基準に沿ったものである。動物を含む全ての実験は、ウクライナの適用法に準拠して開発され、同機関の学術委員会によって承認された動物試験規則に従って、キエフのタラスシェフチェンコ国立大学の飼育場で実施された。
実験動物の維持の条件
体重１２０～１３０ｇの生後２～３ヶ月の白色ラットをこの実験に使用した。実験動物には標準的な飼育場の食事を与え、水は自由に摂取できた。この実験中、動物はプラスチック製のケージに収容され、環境制御は、１２時間の明暗サイクルで１９～２４℃および５０％の相対湿度の条件を維持するように設定された。実験開始前の７日間、全ての動物を環境に順応させた。
ラットの血清中のグルコース濃度の決定
全血中のグルコース濃度は、ＧｌｕｃｏＤｒ Ａｔｏ ＡＧＭ－４０００血中グルコース計（Ａｌｌｍｅｄｉｃｕｓ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．，Ｋｏｒｅａ）を使用するグルコースオキシダーゼ法によって測定した。全ての手順は、製造業者の指示に従って実行した。
ラットにおけるＩ型実験的糖尿病の誘導
Ｉ型実験的糖尿病は、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した動物体重１００ｇあたり６ｍｇの用量でのストレプトゾトシン溶液の単回腹腔内注射によって誘導された。対照群のラットには、前述の方法で１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を投与した。全血中グルコース濃度は、ラットの糖尿病誘導の２日後に測定した。動物は、２２～３２ｍｍｏｌ／Ｌに達する血中グルコースレベルで糖尿病であると見なされた（M. Zafar, S. Naqvi//Int. J. Morphol. -2010. -Vol.28, No1. -P.135-142.）。
ラットの血清の調製
ラット血清は全血から調製した。付随するタンパク質およびフィブリノーゲンを除去するために、全血を３７℃で３０分間静置した後、その試料を２５００ｇで１５分間遠心分離した。得られた上清（血清）を直ちに血球から分離し、さらなる分析のために－２０℃で凍結した。
ラットの血液中の糖化ヘモグロビンの決定
ラットの全血中の糖化ヘモグロビンのレベルを、確立された手順に従って分光光度的に測定した。アッセイは、Ｌａｃｈｅｍａ（チェコ共和国）によって製造された標準的なアッセイキットを使用して実行した。
糖化ヘモグロビン測定法は、安定型のグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が１－デオキシ－１－（Ｎ－バリル）フルクトースを含有し、これがリン酸で脱水されて、４３３ｎｍでの吸収スペクトルを有する着色複合体を形成するという事実に基づく。不安定な形態のグリコヘモグロビンも胎児ヘモグロビンも、糖化ヘモグロビンの決定を妨害しない。
総ヘモグロビンを分光光度法で測定した。２０μｌの全血を５ｍｌの形質転換溶液と混合した。変換溶液に対して５４０ｎｍの波長で吸光度を読み取った。総ヘモグロビン画分は、次の式を使用してメーカーの推奨に従って算出した。
Figure 2023507629000025
ここで、Ｈｂは総ヘモグロビンであり、Ａは試験試料の光学密度である。総ヘモグロビンの量はｇ／Ｌで表される。
溶血物は、抗凝固剤である、１：１０に希釈されたクエン酸Ｎａの３．８％溶液を、新たに収集された血液に添加することによって調製された。安定化した血液１ｍｌを採取し、１０００ｇで１０分間遠心分離して、血漿を除去した。得られた赤血球沈殿物に３ｍｌの生理食塩水を加え、上記のように、その混合物を穏やかに攪拌し、再度遠心分離した。３ｍｌの蒸留水を沈殿物に加え、よく混合した混合物を室温で１０分間放置させた。さらに遠心分離した後、１．５ｍｌの上清（溶血物）を分離し、０．２５ｍｌの８５％リン酸溶液と混合した。試験管をゴム栓で閉じ、沸騰水浴中で３０分間加熱した。脱水時に、チューブを流水で１０分間冷却した。トリクロロ酢酸の２．４５Ｍ溶液０．５ｍｌを、各チューブに加えた。チューブの内容物を振とうし、１０００ｇで２０分間遠心分離した。別のセットのドライチューブにピペットで移した上清の１ｍｌアリコートに、２．５μＭのチオバルビツール酸溶液を添加した。チューブの内容物を完全に混合し、３７℃で４０分間インキュベートした。対照試料についても同じ操作を行い、酸の代わりに水をＣ１に加え、酸および異なる試料の溶血物の混合物をＣ２に添加した。試料の光学密度は、蒸留水に対して４４３ｎｍの波長で、分光光度計で測定した。
グリコヘモグロビンの濃度は、以下の式を使用して算出した：
Figure 2023507629000026
ここで、Ａ１は試験試料の光学密度であり、Ａ２は試薬の対照試料の光学密度であり、Ａ３は正の対照試料の光学密度であり、Ｋはフルクトース検量線に従って算出した角度の接線であり、Ｈｂは総ヘモグロビン含有量である。
グリコヘモグロビンの濃度は、ヘモグロビン１ｇあたりのフルクトースのμモルとして表された（糖化ヘモグロビン／アッセイキット／／Ｐｌｉｖａ－ｌａｃｈｅｍａ ｄｉｇａｎｏｓｔｉｃａ．－２００８．－１０００３２５８．）。
ラット血清中のインスリンレベルの決定
ラットの血清中のインスリンレベルは、可溶性タンパク質に使用される一般的な方法に基づく酵素免疫測定法を使用して決定された。これは、可溶性タンパク質の吸着能力を備えた９６ウェルマイクロプレートで実行した。
血清は、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で１～１０の希釈として調製された。１００μｌの容量で試料を、マイクロプレートウェル内で、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を含む緩衝液で洗浄して、未結合の物質を除去した。非特異的結合部位を、５％の脱脂ミルクブロッキング溶液でブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、マイクロプレートの別々のウェルに、一次ウサギ抗インスリン抗体をロードし、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、マイクロプレートウェルを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した適切な二次抗体をロードし、３７℃でさらに１時間インキュベートした。二次抗体の結合は、０．０１３％Ｈ２Ｏ２を含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で調製した０．４ｍｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに１００μｌのＯＰＤ溶液を加えることによって視覚化した。ペルオキシダーゼ反応は、１００μｌの１ＭＨ２ＳＯ４を添加することにより１０分後に停止した。光学密度は４９２ｎｍで測定した。インスリン、サイトカイン、およびＩｇＧの濃度は、ブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して決定された血清中の総タンパク質濃度に関連する相対単位で表した。
タンパク質濃度の決定
タンパク質濃度は、染料クーマシーブリリアントブルーＧ－２５０の吸収シフトに基づくブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して測定した。
タンパク質濃度を測定するために、１０μｌの３０％ＮａＯＨ、７０μｌの蒸留水、および２ｍｌのブラッドフォード試薬を各試料に加えた。１００ｍｌのブラッドフォード試薬を調製するために、６ｍｌのストック溶液、３ｍｌの９５％エタノール、６ｍｌの８８％Ｈ３ＰＯ４および３５ｍｇのクーマシーブリリアントブルー染料を混合し、得られた混合物を、蒸留水を含む１００ｍｌの容量に調整した。ストック溶液は、１０ｍｌの９５％エタノール、２０ｍｌの８８％Ｈ３ＰＯ４、および３５ｍｇのクーマシーブリリアントブルーを含有していた。
次に、２～５分で可視であった吸光度を、生体物質の代わりに２０μｌの蒸留水を含有する対照試料に対して、５９５ｎｍで分光光度的に測定した。各試験試料のタンパク質濃度は、検量線を使用して決定して、ｍｇ／ｍｌで表した。
結果の統計的処理
得られた結果の統計的処理は、変動統計の方法を使用して実施し、相関分析は、Ｏｒｉｇｎｏ Ｐｒｏ７．０およびＳＰＳＳ １６ソフトウェアを使用して実施した。主要な統計値は、平均（Ｍ）と平均の標準誤差（ｍ）の計算によって得た。変数間の差は、パラメトリック統計手法（ＡＮＯＶＡ）を使用して評価した。スチューデントのｔ検定を使用して、２つの試料間の差の統計的有意性を評価した。р＜０．０５の場合、差は統計的に有意であると見なした。
結果
ラットの実験群におけるＩ型糖尿病の発症に対するＺｎ６４アスパラギン酸の潜在的効果を調べた研究では、以下の結果が示された（表２２）。Ｉ型糖尿病の発症を特徴付ける主なパラメーター、すなわち、グルコース、糖化ヘモグロビンおよびインスリンの濃度が、試験物質の投与後に改善することが実証された。グルコースレベル（２６％）および糖化ヘモグロビン（３０％）の有意な減少が記録された。血清インスリンレベルが１３％増加したこともわかった。得られた結果によって、この試験物質がＩ型糖尿病の経過に正の効果をもたらし、この病状の発症中に血流中のグルコースレベルの上昇による毒性作用を軽減する予防薬として使用され得ることが示され得る。
Figure 2023507629000027
サイトカインは、外部の細胞外刺激に応答して産生され、非特異的保護反応と特異的免疫との間の相互作用を介して体内で特定の免疫応答の形成および調節に関与する、低分子の非特異的抗原および糖タンパク質の大きな不均一な群によって表される内因性の生物学的に活性なポリペプチドメディエーターである。ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γなどの炎症誘発性サイトカインは、特定の免疫応答の開始に関与するが、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＧＦ）は、抗炎症反応の発生に関与し、炎症誘発性インターロイキンの合成を阻害する。
Figure 2023507629000028
レベルの制御機構の１つ、したがって、炎症誘発性サイトカインの生物学的効果は、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＧＦβを含む抗炎症性サイトカインの群によって実施される。サイトカインの不均衡は、炎症過程の発生の基礎であるだけでなく、免疫応答のさらなる形態、特にそれが主に細胞性または体液性の免疫応答であるか否かも決定する。これらのサイトカインは、プロデューサー細胞の特定の遺伝子の転写に影響を与えることによって炎症誘発性サイトカインの合成を阻害し、インターロイキン１受容体アンタゴニストの合成を誘導し、可溶性受容体の産生を増強し、細胞上の炎症誘発性受容体の密度を低下し得る。したがって、ＩＬ－４およびＩＬ－１０は、ＰＧЕ２、スーパーおよびニトロキシドラジカルの生成を阻害し、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦの形成をブロックし、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γの合成をリンパ球において阻害する。
Figure 2023507629000029
この研究の結果は、サイトカインプロファイルに対するＺｎ６４アスパラギン酸の特定の正の効果を示し、これは、Ｉ型糖尿病の発症中に体内で起こる炎症過程を正常化する因子と見なされ得る。
研究の結果の要約
グルース代謝および関連するプロセスに対する試験物質の潜在的効果に関する本研究は、Ｉ型糖尿病を発症している患者の体内のグルコース代謝を正常化するためのその使用の見通しを示した。おそらくそれは独立した薬剤として使用されても、そして他の薬と組み合わせて使用されてもよい。
試験物質の腹腔内投与経路は、グルコース代謝の潜在的な調節因子として適切ではない。経口投与ははるかに優れた効果を示し、対照動物のグルコースレベルの低下をもたらした。
この結果、酢酸亜鉛（天然亜鉛）と比較して、亜鉛同位体が、血清中のインスリンレベルに対してより長期の効果を有するか、またはその沈着部位からよりゆっくりと放出され、これはまた、インスリンレベルの増加の影響をより遅らせるということが示される。
顕微鏡検査の結果は、亜鉛調製物、特に亜鉛同位体の投与が膵島の面積の増加をもたらすことを示しており、これは次に、これらの島によるインスリン産生を増加させる可能性を示し得る。１型糖尿病の発症は、これらの膵島による合成の問題に起因する重大なインスリン欠乏と関連しているので、これは正しい方向への動きである。得られた結果は、実験動物の血清中のインスリンレベルの分析からの結果と相関している。
耐糖能試験は、対照群と比較して、亜鉛同位体６４Ｚｎの投与後のグルコースレベルの有意な減少を示した。これは、投与された試験物質が血流中のインスリンレベルに影響を及ぼしていることを示している可能性があり、その結果、血液からグルコースを除去することに関連する誘発機構が生じる。インスリンが亜鉛依存性タンパク質であることを考えると、亜鉛の投与は、組織内の受容体と比較したこのタンパク質の活性の増大、または血流中のこのホルモンの量の増大のいずれかを引き起こすと想定され得る。
Ｉ型糖尿病モデルを使用して得られた結果、この試験物質がＩ型糖尿病の経過に正の効果を有し、この病理の発達の間の血流中の血糖値上昇の毒性の影響を低下する予防剤として用いられ得ることが示され得る。
この研究の結果は、サイトカインプロファイルに対するＺｎ６４アスパラギン酸の特定の正の効果が示され、これは、Ｉ型糖尿病の発症中に体内で起こる炎症過程を正常化する因子と見なされ得る。
安定したシステムの数学的モデル、質量分析実験データ、および文献情報源の分析に基づいて、タンパク質のアミノ酸キラリティの変化とそれに続くタンパク質の高次構造の違反およびＤＮＡの欠陥は、安定した同位体置換を理由とするらせんの歪みの結果である。同じ化学元素の同位体組成が、生体分子のソレノイド／ヘリカル構造における化学結合形成に影響を与えることを示唆する強力な証拠がある。生体分子の高次構造における同位体誘導性の変化は、病状の発症を表すように思われる。しかし、そのような変更の最も重要な機能は、その可逆性である。生体分子の高次構造は、それらが作られている元素の同位体比を変調することで修正され得る。タンパク質の完全な高次構造は、完全な健康／若々しいホメオスタシスを意味する。それは、細胞、組織、器官、および生物の病理学的変化に対する複雑な影響を可能にし、免疫系、内分泌系、および神経系が全て変性疾患に対して動員される。同位体選択療法は、分子シグネチャーに基づく治療戦略の後の次のステップになり得る。
本発明は、その詳細な説明と併せて説明されてきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明することを意図し、限定することを意図しないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変は、添付の特許請求の範囲内にある。したがって、本発明の特定の特徴のみが示され、説明されてきたが、多くの改変および変更が当技術分野の当業者に生じるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨の範囲内にあるような全てのそのような改変および変更を網羅することを意図していることを理解されたい。

Claims (11)

  1. ６４Ｚｎｅ化合物またはその塩を含む予防的または治療的に有効な量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、過体重または肥満を予防または処置する方法であって、６４Ｚｎｅ化合物またはその塩は少なくとも８０％の６４Ｚｎｅである、方法。
  2. 組成物が希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 希釈剤が重水素枯渇水である、請求項２に記載の方法。
  4. ６４Ｚｎｅ化合物またはその塩が少なくとも９５％の６４Ｚｎｅである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ６４Ｚｎｅ化合物またはその塩が少なくとも９９％の６４Ｚｎｅである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 組成物が０．０５ｍｇと１１０ｍｇの間の６４Ｚｎｅを含有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 組成物が１ｍｇと１０ｍｇの間の６４Ｚｎｅを含有する、請求項６に記載の方法。
  8. ６４Ｚｎｅ化合物またはその塩が少なくとも９０％の６４Ｚｎｅであり、組成物が、６４Ｚｎｅが０．１ｍｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在する水溶液である、請求項１に記載の方法。
  9. ６４Ｚｎｅが、２つのアスパラギン酸分子を有するアスパラギン酸塩（化学式－С４Ｈ５Ｏ４Ｎ６４Ｚｎｅ）、硫酸塩、およびクエン酸塩からなる群から選択される塩の形態である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 組成物が注射によって投与される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 組成物が経口投与される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
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