JP2023504205A - 角膜病変の治療のための生体分子 - Google Patents

Abstract

本発明は、角膜病変を治療するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明の態様は、生体分子、およびそれを使用して組織の神経支配に影響を与える角膜病変を治療する方法に向けられている。【選択図】図１６

Description

本出願は、２０１９年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／９４５，５８０号の優先権を主張し、その内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載され特許請求される本発明の日付の当業者に既知の最新技術をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

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政府の権益
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ ＥＹ０１９４６５に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、角膜病変を治療するための組成物および方法に関する。具体的には、本発明の態様は、生体分子、およびそれを使用して組織の神経支配に影響を与える角膜病変を治療する方法に向けられている。

発明の背景
ドライアイは、主に加齢の間に視力を乱す。また、関節リウマチ、糖尿病、甲状腺病変、環境条件（例えば、煙または汚染物質への曝露）、コンタクトレンズの長期使用、および屈折矯正手術後にも発生する。滑らかにし、感染を阻止し、透明な眼の表面に栄養を与えて維持する、涙の不足によって、この眼の病変が引き起こされる。角膜の神経支配は、眼の表面の完全性を維持するために必要であり、神経損傷は、涙の生成、まばたき反射を減少させ、上皮の創傷治癒を混乱させ、透明性および視力の喪失をもたらす。

三叉神経節（ＴＧ）ニューロンの眼枝からの感覚神経からの軸索は、辺縁領域を取り巻く角膜実質を貫通し、角膜上皮に到達する前に上皮下神経叢として分岐し、最終的に自由神経終末となる。

屈折矯正手術によって神経損傷が発生した後、角膜神経の完全性が回復するまでに３～１５年かかる場合がある。結果として、角膜感受性が低下し、ドライアイ疾患が発症し、神経障害性疼痛、角膜潰瘍、そして重症の場合には角膜移植の必要性を引き起こす可能性がある。さらにドライアイは、角膜表面の冷却速度を制御し、正常な涙分泌を維持する一過性受容体電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）チャネルなどの低温受容体機能に関連している。実験的な角膜手術のずっと後でも、ＴＲＰＭ８終末の減少が起こり、これらの変化が術後の神経障害性疼痛の一因であることを示している。

本発明は、角膜病変から角膜を保護する方法を提供する。

さらに、本発明は、角膜創傷治癒を促進する方法を提供する。

最後に、本発明は、角膜病変を治療する方法を提供する。

実施形態では、この方法は、治療有効量のＲｖＤ６ｓｉを含む組成物を眼の表面に投与することを含むことができる。

本発明の態様は、角膜病変の治療を必要とする対象において角膜病変を治療する方法を提供する。例えば、この方法は、治療有効量の以下：

を含む組成物を、対象に経眼投与することを含むことができる。

本発明の態様は、角膜病変からの角膜の保護を必要とする対象において角膜病変から角膜を保護する方法をさらに提供する。例えば、この方法は、治療有効量の式Ｉを含む組成物を、対象に経眼投与することを含むことができる。

さらに、本発明の態様は、角膜病変の治癒の促進を必要とする対象において角膜病変の治癒を促進する方法を含むことができる。例えば、方法は、治療有効量の式Ｉを含む組成物を、対象に経眼投与することを含むことができる。

実施形態では、角膜病変の治療は、角膜神経密度の増加、角膜神経密度の回復、軸索成長の修復、Ｒｉｃｔｏｒの誘導、ＴＩＭＰ８遺伝子発現の誘導、創傷治癒、またはそれらの組み合わせを含む。

実施形態では、角膜病変は、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、羞明、神経損傷、神経障害性疼痛、ドライアイ様疼痛、角膜神経栄養性潰瘍、外傷、角膜創傷、または神経栄養性角膜炎を含む。

実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む。

実施形態において、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤は、局所投与に適している。

実施形態では、組成物は局所投与用に製剤化される。

実施形態では、医薬組成物は点眼薬として製剤化される。

実施形態では、組成物は、毎時、毎日、毎週、または毎月投与される。

実施形態では、治療有効量は、約１０ｎｇ～約１０００ｎｇの量を含む。

本発明の他の目的および利点は、その後の記載から容易に明らかになるであろう。

ＰＥＤＦ＋ＤＨＡで治療されたマウスの涙からのＲｖＤ６ｓｉとしてのピーク１の識別を示す。（パネルＡ）傷害、治療、および１６個の角膜から収集された涙サンプルの、時間枠を使用した実験計画。（パネルＢ）７～９．５分のＲＴでのサンプル中の３５９ｍ／ｚ化合物（赤）の総イオン電流（ＴＩＣ）分析。３５９のｍ／ｚで検出された３つのピークがあり、これらはジヒドロキシ－ＤＨＡ生成物とみなされる。この研究では、本発明者らはＲＴが８．２０分のピーク（ピーク１）に焦点を当てる。ＬＴＢ４－ｄ４内部標準（緑色）は８．２５分に溶出した。（パネルＣ）選択したピーク１およびＲｖＤ６標準の完全なフラグメンテーション分析。（パネルＤ）衝突後の断片化された生成物の質量を含むピーク１の構造的解釈（赤い点線は結合の切断を表す）。１～６までの番号が付けられた断片がＭＲＭ検出に使用された。（パネルＥ）ピーク１およびＲｖＤ６の同時注入。この分析では、ピーク１は８．１０分で溶出し、ＲｖＤ６は８．３７分で溶出した（青色のＬＴＢ４－ｄ４内部標準は８．１５分で溶出した）。すべてのプロダクトイオンは、ＲＴの同じ差と一致した。（パネルＦ）２３８．０９ｎｍで最大吸光度を持つピーク１およびＲｖＤ６のＵＶダイオードアレイプロファイル。 図１－１の説明を参照。 追加されたＤＨＡから派生したＲｖＤ６ｓｉを示す。（パネルＡ）衝突後の断片化された生成物の質量を伴うＲｖＤ６ｓｉ－ｄ５の構造（赤い点線は壊れた結合を表す）。ＤＨＡ－ｄ５に由来する５つの重水素は、ＲｖＤ６のｍ／ｚを３５９（左の列）から３６４（右の列）にシフトする。シフトされたプロダクトイオンには、Ｃ２１およびＣ２２（青色）に重水素標識が含まれている。ＭＲＭ検出には、１つのシフトされたプロダクトイオンおよび１つのシフトされていないプロダクトイオンが使用された（赤い点線のボックス）。（パネルＢ）ＤＨＡ－ｄ５（赤い点線のボックス）または通常のＤＨＡ（緑の点線のボックス）から派生したＲｖＤ６ｓｉのＭＲＭ検出。遷移ＭＲＭの検出方法は、各グラフの上部に示される。青色のピークはＬＴＢ４－ｄ４内部標準である。マージウィンドウは、ＤＨＡ－ｄ５またはＤＨＡに由来するＲｖＤ６ｓｉが同じＲＴで溶出されることを示している。これは、これらが同一の化合物であることを意味する。（パネルＣ）ＢからのＲｖＤ６ｓｉ－ｄ５の完全なフラグメンテーション分析。（パネルＤ）増加したＤＨＡ濃度でのＲｖＤ６ｓｉの定量化。遊離ＤＨＡおよびその誘導体（１４－ＨＤＨＡ、１７－ＨＤＨＡ、ＲｖＤ６ｓｉなど）はＤＨＡ濃度の関数として徐々に増加したが、遊離ＡＡおよびその誘導体である１２－ＨＥＴＥと１５－ＨＥＴＥは増加しなかった。 図２－１の説明を参照。 ＲｖＤ６ｓｉの分離を示す。（パネルＡ）分画溶出からのＲｖＤ６ｓｉの検出。涙および培地からのサンプルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって合成されたＲｖＤ６ｓｉの存在を分析する前に、Ｃ１８カラムを備えたＵＰＬＣシステムを使用して溶出時間の６～１２分まで３０秒ごとに収集された。画分６、７、および８がプールされた。（パネルＢ）ＲｖＤ６ｓｉの分離を確認するための、結合された画分６～８の質量分析。３５９ｍ／ｚのＴＩＣは独特のピークを示し、すべてのジヒドロキシ－ＤＨＡ製品（３５９→２９７および３５９→２７９）のスキャンのＭＲＭは、他のジヒドロキシ－ＤＨＡ誘導体がなかったことを確認する。さらに、モノヒドロＤＨＡ（３４３→２９９および３４３→２８１）またはトリヒドロキシＤＨＡ（３７５→２７７）のＭＲＭスキャンは、分離されたＲｖＤ６ｓｉの純度を示すピークを示していない。 ＲｖＤ６が角膜創傷治癒および感受性を促進することを示している。（パネルＡ）創傷治癒実験の実験計画。（パネルＢ）傷害の２０時間後にメチレンブルーで染色された角膜創傷領域の代表的な画像。（パネルＣ）傷害および治療後の計算された創傷閉鎖。（パネルＤ）角膜感受性ならびに角膜およびＴＧ組織の収集の実験図。（パネルＥ）非接触角膜計を使用した、非傷害マウスの記録された角膜感受性の分布（Ｎ＝４０角膜）。（パネルＦ）３日ごとに記録された角膜感受性。ＲｖＤ６ｓｉで治療したマウスは、３、６、および９日目に有意に高い感受性を示したが、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡおよびＲｖＤ６での治療群は、９日目にのみ高い角膜感覚を示した。１２日目に、試験された化合物とビヒクルとの間に差はなかった。統計的ｐ値は、一元配置分散分析と、それに続くＴｕｋｅｙのＨＳＤ（honest significant difference）の、複数のペアワイズ比較から導出される。 図４－１の説明を参照。 ＲｖＤ６が角膜神経の再生を促進することを示している。（パネルＡ）全角膜神経のパンマーカーである抗ＰＧＰ９．５およびマウス角膜の主要な神経ペプチドであるＳＰで染色された、正常な角膜神経のホールマウント画像。ホールマウント画像で破線のボックスでマークされている挿入図は、ＰＧＰ ９．５およびＳＰの二重染色、ならびにＰＧＰ９．５のみおよびＳＰのみによる角膜の増幅された中心領域を示している。（パネルＢおよびＣ）傷害および治療後１２日でのＰＧＰ ９．５（パネルＢ）およびＳＰ（パネルＣ）陽性軸索の代表的なホールマウント画像および計算された神経密度。データはベースラインに対して正規化された（パネルＡの非傷害角膜）。統計的ｐ値は、一元配置分散分析と、それに続くＴｕｋｅｙのＨＳＤの、複数のペアワイズ比較から導出される。 角膜傷害およびＲｖＤ６ｓ治療後のＴＧトランスクリプトームの変化を示している。（パネルＡ）ＴＧ ＲＮＡシーケンスデータの主成分分析は、分析されたサンプルの３つの群の十分にクラスター化された転写プロファイルを示している。（パネルＢ）ビヒクルサンプルを参照としてＲｖＤ６（ピンク）とＲｖＤ６ｓｉ（緑）との間で共有された上方調節および下方調節された遺伝子のベン図。入力された遺伝子は、ＲｖＤ６群とビヒクル群とで大きく異なる（ＦＤＲ＜０．０５）。（パネルＣ）軸索成長円錐分類（ＧＯ－００４４２９５）における２つの有意な増加遺伝子の箱ひげ図。（パネルＤ）炎症および疼痛に関与する遺伝子の変化。（パネルＥおよびＧ）ＲｖＤ６ｓｉの神経再生メカニズムにおけるＲｉｃｔｏｒ遺伝子の関与の証拠。（パネルＥ）ＲｖＤ６ｓｉ対ビヒクルおよびＲｖＤ６＿ｓｔｄ対ビヒクルの上流分析ヒートマップは、重要な遺伝子変化を示している。ＲＩＣＴＯＲは黒い太い矢印でマークされている。（パネルＦ）ＲｖＤ６ｓｉ対ビヒクルの比較におけるＲＩＣＴＯＲの詳細なシグナル伝達経路が中央のパネルに示されている。尖っていない青い矢印は抑制された相互作用を表し、赤い先端の矢印はアクティブ化された相互作用を表し、黄色の矢印はＩＰＡ分析による競合する相互作用を表す。（パネルＧ）Ｒｉｃｔｏｒ遺伝子発現の箱ひげ図。統計的ｐ値は、一元配置分散分析と、それに続くＴｕｋｅｙのＨＳＤの、複数のペアワイズ比較から導出される。 図６－１の説明を参照。 生物学的生産物から単離されたＲｖＤ６ｓｉの高純度を示している。画分６～８のサンプルをプールし、特定のＭＲＭウィンドウを備えたＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して分析し、ＤＨＡ、ＥＰＡ、ＡＡ、およびＨＥＴＥ、ＬＸＡ_４、ＰＧＤ_２、ＰＧＥ_２、ＰＧＦ_２アルファを含むその誘導体を検出した。すべてのＭＲＭウィンドウには、微量のターゲット化合物が表示され、分離されたＲｖＤ６が純粋であることを示している。 Ｅｎｒｉｃｈｒ解析による細胞成分の遺伝子オントロジーを示している。特定の細胞内コンパートメントに位置する多くの群の遺伝子がある。それらの群の中で、軸索成長円錐（ＧＯ：００４４２９５）群を標的とした。 ドライアイおよび眼の神経障害性疼痛に効果的な治療法がないことを示している。 新しいＲｖＤ６立体異性体（ＲｖＤ６ｓｉ、局所塗布）が、マウスの傷害された角膜を修復することを示している。 図１０－１の説明を参照。 新しいＲｖＤ６立体異性体（ＲｖＤ６ｓｉ）が角膜神経の再生を引き起こすことを示している。 ＲｖＤ６異性体が疼痛関連遺伝子の発現を減少させ、三叉神経節のＴＲＰＭ８を増加させることを示している。 図１２－１の説明を参照。 角膜の構造および神経支配を示している。パネルＡは、ヘマトキシリンおよびエオシン組織学的染色後のヒト角膜の解剖学的構造を示している。上皮、ボーマン層、間質、デスメ膜、および内皮の５つの層すべてが示されている。パネルＢは、４５歳の男性ドナーの左眼から得られた完全なヒト角膜上皮神経ネットワークの全体像を示している。パネルＣは、角膜の周辺から中心に収束するまでの上皮神経束の詳細な経過を示している（パネルＢおよびＣは、「Ｅｌｓｅｖｉｅｒ」参考文献５の許可を得て複製されている）。 図１３Ａの説明を参照。 図１３Ａの説明を参照。 間質神経が損傷したマウスの角膜へのＤＨＡ局所治療の１時間後の、ＰＣおよびＰＥへのＤＨＡの取り込みを示している。パネルＡは、マウスの角膜が傷害され、ＤＨＡで１時間局所治療された後、脂質が抽出され、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析されたことを示している（２７）。ｓｎ－１位置にオレイン酸（１８：１）を、ｓｎ－２位置にＤＨＡを含む、ＰＣとＰＥとの割合。ＰＥはＰＣよりもＤＨＡが豊富であった。パネルＢは、角膜傷害およびＰＥＤＦ＋ＤＨＡによる３時間の局所治療後の、ＤＨＡの放出およびモノヒドロキシ－ＤＨＡ誘導体の合成を示している。角膜脂質プロファイルは、質量分析ベースのリピドミック分析によって分析された。 リン脂質のｓｎ－２位置でエステル化された３つの最も豊富な必須脂肪酸ＡＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡに由来する脂質メディエーターを示している。一次触媒酵素であるシクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）ならびに５および１５リポキシゲナーゼ（５－ＬＯＸ、１５－ＬＯＸ）に応じて、炎症および炎症反応の解消に関与する様々な生物活性脂質の合成がある。ＡＡのメディエーターはオレンジ色で、ＥＰＡは緑色で、ＤＨＡは青色で強調表示されている。 ＲｖＤ６ｉの構造を示している新しい異性体は、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡでマウスの傷害した角膜を局所刺激した後に合成され、涙中に放出された。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析し、ＲｖＤ６標準で少なくとも６つの一致した娘イオンが示されたが、保持時間は早くなった（４０）。事後研究では、ピーク保持時間が、キラルカラムで化学合成されたＲ，Ｒ－ＲｖＤ６ｉと一致することが示されている。 ＲｖＤ６ｉが角膜の創傷治癒および感受性を加速することを示している。パネルＡは、上皮および前間質神経を損傷する傷害の２０時間後にメチレンブルーで染色された、マウス角膜創傷領域の代表的な画像を示している。動物は、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡまたはＲｖＤ６ｉを同様の濃度で含む点眼薬を１日３回受けた。画像は解剖顕微鏡で撮影され、Ｐｈｏｔｏｓｈｉｐソフトウェアを使用して定量化された（４０）。パネルＢは、傷害および非接触知覚計を使用したＰＥＤＦ＋ＤＨＡまたはＲｖＤ６ｉ（３回／日）による治療の３、６、および９日後の角膜感受性の回復を示している。ＲｖＤ６ｉで治療したマウスは、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡで治療した角膜よりも早く感受性を回復する。パネルＣは、ＲｖＤ６ｉのＴＧの炎症および疼痛に関与し、ＲＮＡシーケンシングによって分析された遺伝子の発現を示している（４０）。ＣａｌｃｂおよびＴａｃ１遺伝子は下方調節されたが、（パネルＤ）Ｔｒｐｍ８およびＲｉｃｔｏｒ遺伝子は、ＲｖＤ６ｉによる角膜治療によってＴＧニューロンで上方調節された。 図１７－１の説明を参照。 ＰＥＤＦ＋ＤＨＡの組み合わせによって刺激されるシグナル伝達の概略モデルを示している。ＤＨＡは角膜上皮から膜リン脂質に急速に取り込まれ、ＰＥＤＦによる刺激後にｉＰＬＡ２ζ活性を持つＰＥＤＦ－Ｒを放出する。遊離ＤＨＡは、ＮＰＤ１および新規ＲｖＤ６ｉなどのドコサノイドの基質になる。次に、これらのドコサノイドは涙中に放出され、未定義のＧＰＲＣ受容体への自己分泌刺激によって、涙中に分泌されて軸索伸長を促進する神経栄養因子ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、およびＳｅｍａ７Ａの遺伝子ならびにタンパク質の発現を誘導する。ＲｖＤ６ｉは、角膜創傷治癒、角膜感覚および神経回復、ならびに涙分泌を刺激する。このメカニズムには、神経障害性疼痛に関与する遺伝子の神経新生および調節に関連する遺伝子の活性化を伴うＴＧトランスクリプトームの変化が含まれる。ＰＥＤＦまたはＤＨＡ単独での治療はこれらの経路を活性化しないため、角膜神経再生の増加はなかった（１９）。

発明の詳細な説明
角膜傷害時にニューロトロフィン色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）によって活性化される、涙中に放出される立体特異的レゾルビンＤ６異性体（ＲｖＤ６ｓｉ）の発見が、本明細書に記載される。新しいＲｖＤ６ｓｉは、眼の表面の完全性を維持する高密度の神経支配を回復することにより、角膜の創傷治癒、感受性、神経再生、および機能回復を促進する。角膜神経傷害を感知し、ＲｖＤ６ｓｉで治療した後、三叉神経節（ＴＧ）のトランスクリプトームは、ｍＴＯＲのラパマイシン非感受性複合体－２（ｍＴＯＲＣ２）であるＲｉｃｔｏｒの遺伝子発現、および軸索成長に関与する遺伝子の発現を増強し、一方、神経障害性疼痛に関連する遺伝子は減少する。新しいＲｖＤ６異性体は、三叉神経節ニューロンへのシグナル伝達を刺激した。新しいＲｖＤ６異性体は、三叉神経節において、軸索の成長を修復し、神経障害性疼痛を軽減する遺伝的プログラムを誘発する。その結果、眼の神経障害性疼痛およびドライアイの軽減が起こる。したがって、ＲｖＤ６ｓｉは、神経栄養性角膜炎およびドライアイ様疼痛を含むがこれらに限定されない、組織の神経支配に影響を与えるような角膜病変のための新しい治療手段を切り開く。

１つ以上の実施形態の詳細な説明が本明細書に提供される。しかしながら、本発明が、様々な形式で具現化され得ることが、理解されるべきである。したがって、本明細書に開示される特定の詳細は、限定として解釈されるべきではなく、特許請求の範囲の根拠として、および当業者に本発明を任意の適切な方法で用いるように教示するための代表的な根拠として解釈されるべきである。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と同様または同等の任意の方法および材料が本開示の実施または試験に使用され得るが、有利な方法および材料がこれから記載されている。

本明細書で引用されるすべての刊行物および特許は、各個別の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示され、刊行物が引用されることに関連する方法および／または資料を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。出版物の引用は、出願日の前の開示のためであり、本開示が事前の開示のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行日は、個別に確認する必要がある実際の刊行日とは異なる場合がある。

本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載および図示された個々の実施形態のそれぞれは、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離または組み合わせることができる別個の構成要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙されたイベントの順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実行することができる。

本開示の実施形態は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内である医学、有機化学、生化学、分子生物学、薬理学、毒物学などの技術を使用する。そのような技術は、文献で完全に説明されている。

単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数の参照を含む。特許請求の範囲および／または明細書において「含む」という用語とともに使用されるときの「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは２つ以上」の意味とも一致する。

「例えば」、「など」、「含む」などの句のいずれかが本明細書で使用される場合は常に、他に明確に記載されない限り、「限定することなく」という句が付随することが理解される。同様に、「一例」、「例示的」などは、非限定的であると理解される。

「実質的に」という用語は、意図した目的に悪影響を与えない記述語からの逸脱を可能にする。記述用語は、「実質的に」という語が明確に列挙されていなくても、「実質的に」という用語によって修飾されることが理解される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」（ならびに同様に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、および「含む（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」）などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、用語の各々は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の一般的な米国特許法の定義と一致して定義され、したがって、「少なくとも以下（ａｔ ｌｅａｓｔ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）」を意味する非限定用語（ｏｐｅｎ ｔｅｒｍ）であると解釈され、追加の特徴、限定、態様などを除外しないとも解釈される。よって、例えば、「ステップａ、ｂ、およびｃを含むプロセス」は、プロセスが少なくともステップａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」という用語が使用される場合は常に、そのような解釈が文脈において無意味でない限り、「１つ以上」と理解される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、本明細書では、おおよそ、大まかに、およそ、またはその領域内を意味するために使用される。「約」という用語が数値範囲とともに使用される場合、それは、記載された数値の上および下の境界を拡張することによってその範囲を変更する。一般に、「約」という用語は、本明細書では、２０パーセント上または下の（高い、または低い）分散によって記載された値を上回る、および下回る数値を修飾するために使用される。

本発明の態様は、対象の角膜を保護する方法に向けられている。例えば、一実施形態では、この方法は、治療有効量のＲｖＤ６ｓｉを含む組成物を対象の眼の表面に投与することを含む。

化合物
本明細書に記載の生体分子の実施形態は、以下の式Ｉの構造：

を有する。

式Ｉは、（４Ｒ、５Ｅ、７Ｚ、１０Ｚ、１３Ｚ、１５Ｅ、１７Ｒ、１９Ｚ）－４，１７－ジヒドロキシドコサ－５，７，１０，１３，１５，１９－ヘキサエン酸を指す。実施形態において、用語レゾルビンＤ６立体特異的異性体（ＲｖＤ６ｓｉ）、ＲｖＤ６異性体、ＲｖＤ６ｓ、ＲｖＤ６ｉ、または立体特異的レゾルビンＤ６異性体、４Ｒ，１７Ｒ－ジヒドロキシ－ＤＨＡは、交換可能に使用することができ、式Ｉなどの生体分子を指すことができる。しかしながら、そのような用語は、必ずしも式Ｉによる生体分子のみに限定されないことを理解されたい。例えば、実施形態において、「ＲｖＤ６異性体」または「ＲｖＤ６立体特異的異性体」という用語は、式Ｉの生体分子に加えて、レゾルビンＤ６の他の異性体を指すことができる。

本明細書で使用される場合、「異性体」という用語は、同じ分子式を有する異なる化合物を指すことができる。本明細書で使用される場合、「立体異性体」という用語は、それらの原子が同じ順序で結合しているが、空間内の原子の配置が異なる異性体を指すことができる。立体異性体は、「エナンチオマー」または「ジアステレオマー」を指す場合がある。本明細書で使用される場合、「エナンチオマー」という用語は、互いに重ね合わせることができない鏡像である立体異性体を指すことができる。本明細書で使用される場合、「ジアステレオマー」という用語は、互いの鏡像ではない立体異性体を指すことができる。本明細書で使用される場合、「立体特異的」という用語は、ある立体異性体の別の立体異性体への化学的または酵素的反応における変換を指すことができる。

角膜は眼の前の透明な外層である。角膜は、対象がはっきりと見えるように、対象の眼の焦点を合わせるのに役立つ。

本発明の態様は、角膜疾患または角膜傷害、およびそれらからの損傷から保護（すなわち、予防）または治療することができる。「角膜疾患」は、様々な要因、例えば、物理的／化学的損傷、刺激、アレルギー、細菌／真菌／ウイルス感染、角膜潰瘍によって引き起こされる角膜炎などによる、角膜の任意の疾患または損傷を指すことができる。それはまた、角膜上皮傷害（例えば、剥離、角膜びらん）、角膜上皮浮腫、角膜火傷、化学物質による角膜腐食、ドライアイなどを指すこともある。「角膜傷害」とは、角膜の擦り傷（引っかき傷）を指す。場合によっては、小さな傷害は自然に治るが、より深い引っかき傷またはその他の傷害は、角膜剥離および視力の問題を引き起こす可能性がある。「角膜損傷」は、例えば、病原体、炎症、物理的刺激（例えば、コンタクトレンズまたはＵＶ）、化学的刺激（例えば、薬物）、神経損傷、蓄積された疲労によって引き起こされる損傷などの角膜へのあらゆる損傷を指すことができるが、それに限定されない。それは、疼痛、赤目、角膜混濁、まぶしさ、異物感などの症状を伴うことがある。本明細書で使用される場合、「疾患」、「傷害」、および「機能不全」という用語は、「病変」と交換可能に使用することができる。

本発明の態様は、角膜病変を予防（すなわち、予防）または治療することができる。

本発明の他の態様は、角膜病変の治癒を促進することができる。「治癒を促進する」または「治癒を加速する」という用語は、無治療と比較して好ましい結果を引き起こすことを指すことができる。良好な結果は、例えば、瘢痕の減少、炎症の減少、正常組織の再成長または瘢痕組織の成長、神経の再成長、神経支配、創傷の閉鎖、感染の減少、および根底にある病変に関連する死亡率／罹患率の減少を含む。

角膜病変の例には、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、羞明、神経障害性疼痛、ドライアイ様疼痛、角膜神経栄養性潰瘍、外傷、角膜創傷、神経栄養性角膜炎、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「神経障害性疼痛」という用語は、末梢および／もしくは中枢感覚経路の損傷、または末梢および／もしくは中枢感覚経路の機能不全、ならびに神経系の機能不全に起因する疼痛を指すことができる。

花粉などのアレルギーは、眼を刺激し、アレルギー性結膜炎（ピンクアイと呼ばれることがある）を引き起こす可能性がある。これにより、眼が赤くなり、かゆみを伴い、水っぽくなることがある。

角膜炎は、角膜の炎症（発赤および腫れなど）を指す。コンタクトレンズに関連する感染症は、角膜炎の最も一般的な原因である。

ドライアイは、対象の眼が濡れたままでいるのに十分な涙を流さない場合に発生する。これは不快であり、視力の問題を引き起こす可能性がある。

角膜ジストロフィーは、角膜に物質が蓄積すると視力が曇る原因となる。これらの病気は通常家族で発生する。

眼ヘルペス、スティーブンス・ジョンソン症候群、虹彩角膜内皮症候群、翼状片などを含む、角膜に影響を与える可能性のある多数のあまり一般的ではない疾患もある。本発明の局面は、角膜神経密度、角膜神経の完全性、および／または角膜神経感受性を増加および／または回復する方法を含むことができる。例えば、本発明の実施形態は、治療有効量の式Ｉを含む組成物を経眼投与することによって対象の角膜病変を治療する方法を含むことができ、角膜病変の治療は、角膜神経密度の増加、角膜神経密度の回復、軸索成長の修復、Ｒｉｃｔｏｒ遺伝子発現の誘導、創傷治癒、またはそれらの組み合わせを含む。Ｒｉｃｔｏｒ遺伝子は、傷害後の感覚ニューロンの抗炎症および軸索成長に役割を果たすラパマシン非感受性複合体２（ｍＴＯＲＣ２）の哺乳類標的の重要な構成要素であるＲＩＣＴＯＲタンパク質をコードする。本発明の態様は、角膜神経の再生および／または神経支配の方法をさらに提供することができる。本明細書で使用される場合、「神経再生」という句は、神経細胞を含む細胞の修復または再成長を指すことができる。本明細書で使用される場合、「神経支配」という句は、神経が組織に入るプロセス、および／または角膜組織などの組織に神経を供給するプロセスを指すことができる。

本発明の態様はまた、角膜創傷治癒を促進する方法に向けられる。例えば、一実施形態では、この方法は、治療有効量の式Ｉ（例えば、ＲｖＤ６ｓｉ）を含む組成物を対象に経眼（例えば、眼の表面に）投与することを含む。

「角膜創傷」などの「創傷」は、組織構造の連続性または完全性の物理的破壊を指すことができる。「創傷治癒」は、組織の完全性の回復を指すことがある。これは、組織の完全性の部分的または完全な回復を指すことができることが理解されよう。したがって、創傷の治療は、創傷治癒プロセスに関連する１つ以上の段階またはプロセスの促進、改善、進行、加速、またはその他の方法での進行を指すことができる。

さらに、本発明の態様は、ドライアイを治療する方法に向けられる。「ドライアイ」という用語は、涙および眼の表面（角膜、結膜、眼瞼を含む）の多因子性疾患が、“Ｔｈｅ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｙ Ｅｙｅ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ２００７ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｙ Ｅｙｅ Ｗｏｒｋ Ｓｈｏｐ，”Ｏｃｕｌ Ｓｕｒｆ ２００７，５（２）：７５－９２）によって定義されているように、不快感、視覚障害、涙膜の不安定性の症状を引き起こし、眼の表面に損傷を与える可能性があることを指す。ドライアイは、涙膜の浸透圧の増加および眼の表面の炎症を伴う可能性がある。ドライアイには、ドライアイ症候群、乾性角結膜炎（ＫＣＳ）、機能不全性涙症候群、涙液性角結膜炎、蒸発性涙液欠乏症、水性涙液欠乏症、およびレーシック誘発性神経栄養性上皮症（ＬＮＥ）が含まれる。

「対象」または「患者」という用語は、本発明の態様を、例えば、実験的、診断的、予防的、および／または治療的目的で投与することができる任意の生物を指すことができる。本開示の化合物が投与され得る典型的な対象は、哺乳動物、特に霊長類、特にヒトであろう。獣医用途には、例えば、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ヒツジ、ヤギ、ウシ（ｃｏｗ）、ブタなどのような家畜、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどのような家禽、ならびに飼育動物、特にイヌおよびネコのようなペットなどの、多種多様な対象が適しているであろう。診断または研究用途には、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、および近交系ブタなどのブタなどを含む、多種多様な哺乳動物が適切な対象であろう。「生体対象」という用語は、上記の対象または生きている別の生物を指す。「生体対象」という用語は、生体対象から切り出された部分（例えば、肝臓または他の臓器）だけではなく、対象または生物全体を指すことができる。

本明細書で使用される場合、化合物の「薬学的に許容され得る誘導体」には、それらの塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、ケタール、オルトエステル、ヘミアセタール、ヘミケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物またはプロドラッグが含まれ得る。そのような誘導体は、そのような誘導体化のための既知の方法を使用して、当業者によって容易に調製することができる。生成された化合物は、実質的な毒性作用なしに動物またはヒトに投与することができ、薬学的に活性であるか、またはプロドラッグである。

本明細書で使用される「製剤」は、製品仕様および／または使用条件を含む、特定の最終用途に最適な特性を提供するために選択された化合物、混合物、または溶液の成分の任意のコレクションを指すことができる。製剤という用語は、液体、半液体、コロイド溶液、分散液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ならびに水中油型エマルジョンおよび油中水型エマルジョンを含むナノエマルジョン、ペースト、粉末、ならびに懸濁液を含むことができる。本発明の製剤はまた、担体、賦形剤、結合剤および充填剤などの他の非毒性化合物とともに含まれ得るか、または包装され得る。具体的には、本発明の実施に使用するために企画される許容される担体、賦形剤、結合剤および充填剤は、化合物を経口送達に適合させ、および／または本発明の製剤が商業的に許容され得る貯蔵寿命を示すように安定性を提供するものである。

「投与する」という用語は、硝子体内、眼内、経眼、網膜下、髄腔内、静脈内、皮下、経皮、皮内、頭蓋内、局所などの投与を使用して、治療有効量の製剤または医薬組成物を対象に提供することを指すことができる。本発明の製剤または医薬化合物は、単独で投与することができるが、選択された投与経路および標準的な医薬慣行に基づいて選択される他の化合物、賦形剤、充填剤、結合剤、担体または他のビヒクルとともに投与することができる。

実施形態において、組成物は、「経眼的」に、または「経眼投与」によって投与される。本明細書で使用される場合、「経眼投与」は、注射を伴わない、眼への局所投与を指すことができる。経眼投与の非限定的な例には、溶液（点眼薬）、ゲル、軟膏、およびコロイド状剤形（ナノ粒子、ナノミセル、リポソーム、およびマイクロエマルジョン）の導入が含まれる。経眼投与は当技術分野でよく知られている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧａｕｄａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，“Ｏｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”ＡＡＰＳ Ｊ．１２（３）：３４８－３６０を参照されたい）。

実施形態において、組成物は、「局所的に」、または「局所投与」によって投与される。「局所投与」という用語は、眼の表面などの効果の位置に関係なく、身体の局所領域または身体部分の表面への組成物の適用を指すことができる。局所投与の典型的な部位には、皮膚または粘膜の部位が含まれる。

投与は、注射可能な溶液、局所的な溶液、または眼の溶液などの担体またはビヒクルを介して行うことができる。好適な溶液には、滅菌水溶液もしくは非水溶液を含む注射可能な溶液、または生理食塩水；クリーム；ローション；カプセル；錠剤；顆粒；ペレット；粉末；懸濁液、エマルジョン、もしくはマイクロエマルジョン；パッチ；ミセル；リポソーム；小胞；マイクロインプラントを含むインプラント；点眼薬；他のタンパク質およびペプチド；合成ポリマー；ミクロスフェア；ナノ粒子などが含まれるが、これらに限定されない。

実施形態において、組成物および製剤は、対象の眼の表面などへの局所投与のための溶液、懸濁液および他の剤形として製剤化されるであろう。水溶液は、製剤化の容易さ、生物学的適合性（特に、治療される疾患、例えば角膜疾患および傷害を考慮して）、ならびに冒された眼の表面に溶液を１滴以上滴下することによってそのような組成物を容易に投与する患者の能力に基づいて使用することができる。しかしながら、組成物はまた、懸濁液、粘性もしくは半粘性のゲル、または他のタイプの固体もしくは半固体の組成物であり得る。水に溶けにくい組成物には懸濁液が好ましい場合がある。

本明細書で使用される場合、「局所点眼薬」という用語は、液体、ゲル、または軟膏として、組成物を対象の角膜外面に投与することを指すことができる。「液滴体積」という用語は、液滴に似ている眼科的に許容される液体の量を指すことができる。例えば、液滴体積は、約５μＬ～約１０００μＬ、例えば、約５μＬ～約５００μＬ、例えば、約５μＬ～約２００μＬに対応する液体の体積を指すことができる。実施形態では、液滴体積は、約２０μＬを含むことができる。

製剤または医薬組成物はまた、グルコース、ラクトース、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、キサンタンガム、イナゴマメガム、ガラクトース、オリゴ糖および／または多糖類、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、スターチフラグメント、ケラチン、コロイド状シリカ、ジャガイモデンプン、尿素、デキストラン、デキストリンなどを含むがこれらに限定されない、薬学的に許容される担体、賦形剤、結合剤および充填剤などの他の非毒性化合物を含むか、または包装することができる。具体的には、本発明の実施に使用するための薬学的に許容される担体、賦形剤、結合剤、および充填剤は、本発明の化合物を硝子体内送達、眼内送達、経眼送達、網膜下送達、髄腔内送達、静脈内送達、皮下送達、経皮送達、皮内送達、頭蓋内送達、局所送達などに適合させるものである。さらに、包装材料は、プラスチックポリマーまたはシリコーンなど、生物学的に不活性であるか、または生物活性を欠くことができ、一緒に包装および／または送達される組成物／製剤の有効性に影響を与えることなく、対象によって内部で処理することができる。

本発明の製剤の異なる形態は、異なる個体および単一の個体の異なるニーズの両方に適応するために調整することができる。実施形態では、対象は、１つ以上の角膜病変に罹患している個体であり得る。例えば、対象は、ドライアイ症候群、乾性角膜結膜炎（ＫＣＳ）、機能不全性涙症候群、涙液性角膜結膜炎、蒸発性涙液欠乏症、水性涙液欠乏症、レーシック誘発性神経栄養性上皮症（ＬＮＥ）眼ヘルペス、スティーブンス・ジョンソン症候群、虹彩角膜内皮症候群、翼状片、様々な要因による角膜の損傷、例えば、物理的／化学的刺激、アレルギー、細菌／真菌／ウイルス感染、よって引き起こされる角膜炎、角膜潰瘍、角膜傷害、ドライアイ（ＤＥＤ）、羞明、神経障害性疼痛、ドライアイ様疼痛、角膜神経栄養性潰瘍、外傷、角膜創傷、神経栄養性角膜炎、またはそれらの組み合わせ、を有する個体であり得る。

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、治療される疾患もしくは状態の１つ以上の症状をある程度緩和する、および／または治療される対象が発症する、または発症するリスクのある状態もしくは疾患の１つ以上の症状をある程度予防する、投与される組成物または医薬組成物の実施形態のその量を指すことができる。本明細書で交換可能に使用される場合、「対象」、「個体」、または「患者」は、脊椎動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）を指すことができる。哺乳動物には、ネズミ、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物、およびペットが含まれるが、これらに限定されない。「ペット」という用語は、イヌ、ネコ、モルモット、マウス、ラット、ウサギ、フェレットなどを含むことができる。家畜という用語は、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ロバ、ラマ、アルパカ、七面鳥などを含むことができる。

治療上有効な用量は、当業者に知られている多くの要因に依存する可能性がある。用量は、活性成分の薬力学的特性、およびその様式および投与経路；有効成分の投与時間；治療される対象またはサンプルの同一性、サイズ、状態、年齢、性別、健康、および体重；症状の性質および程度；同時治療の種類、治療の頻度、および望ましい効果；ならびに排出率などの既知の因子によって変動し得る。これらの量は、当業者が容易に決定することができる。

本明細書で使用される場合、「眼科的に有効な量」は、患者に投与されると、角膜疾患もしくは角膜傷害、またはそれらに関連する状態を予防、治療または改善する組成物もしくは医薬組成物の実施形態の量を指すことができる。一例として、「ドライアイを治療するための有効量」は、患者に投与されたときに、ドライアイの疾患もしくは障害、またはそれに関連する状態を予防、治療または改善する量を指すことができる。

「薬学的に許容される賦形剤」、「薬学的に許容される希釈剤」、「薬学的に許容される担体」、または「薬学的に許容されるアジュバント」は、安全であり、非毒性であり、生物学的にも望ましくないものでもない医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤、希釈剤、担体、および／またはアジュバントを指すことができ、獣医用および／またはヒト用医薬品の使用に許容される賦形剤、希釈剤、担体、およびアジュバントを含むことができる。本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体および／またはアジュバント」は、１つ以上のそのような賦形剤、希釈剤、担体、およびアジュバントを含むことができる。

「医薬組成物」または「製剤」は、哺乳動物、特にヒトなどの対象への投与に適した組成物または医薬組成物を含むことができ、活性剤または成分と薬学的に許容される担体または賦形剤との組み合わせを指すことができ、組成物を、インビトロ、インビボ、もしくはエクスビボでの診断的、治療的、または予防的使用に適したものにする。医薬組成物は、経眼投与などの意図された投与経路、および開業医が望む効果と適合性があるように製剤化することができる。

実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のＲｖＤ６異性体および治療有効量の１つ以上の追加の活性剤を含むことができる。そのような医薬組成物（すなわち、ＲｖＤ６異性体および追加の活性剤）は、組み合わせ組成物と呼ぶことができる。適切な追加の活性剤には、１つ以上の抗酸化剤、抗アレルギー剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、鎮痛剤、保湿剤、潤滑剤、または解熱剤が含まれるが、これらに限定されない。例えば、１つ以上の抗酸化剤は、合成抗酸化剤、天然抗酸化剤、またはそれらの組み合わせであり得る。実施形態では、抗酸化剤は、ＲｖＤ６異性体の二重結合を保護することができる。

「医薬組成物」は無菌であり得、対象内で望ましくない応答を誘発する可能性のある汚染物質がないことが可能である（例えば、医薬組成物中の化合物は、医薬グレードである）。医薬組成物は、経口、局所、静脈内、頬側、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内、筋肉内、皮下を含む多くの異なる投与経路を介して、ステント溶出装置、カテーテル溶出装置、血管内バルーン、吸入などによって、それを必要とする対象または患者に投与するように設計することができる。

「投与」という用語は、本開示の組成物を対象に導入することを指すことができる。組成物の１つの投与経路は局所投与である。別の投与経路は経眼投与である。実施形態において、組成物は、眼の表面に投与することができる。しかしながら、経口、静脈内、皮下、腹膜、動脈内、吸入、膣、直腸、鼻、脳脊髄液への導入、静脈もしくは動脈のいずれかの血管内、または体の区画への点滴注入などの任意の投与経路を使用することができる。

実施形態では、組成物は１時間ごとに投与される。例えば、組成物は、約１時間ごと、約２時間ごと、約３時間ごと、約４時間ごと、約５時間ごと、約６時間ごと、約８時間ごと、約１０時間ごと、約１２時間ごと、約１６時間ごと、約１８時間ごと、約２０時間ごと、または約２４時間ごとに連続的に投与される。

実施形態では、組成物は毎日投与することができる。例えば、組成物は、毎日、約２日ごと、約３日ごと、約５日ごと、または約７日ごとに投与することができる。

実施形態では、組成物は毎週投与することができる。例えば、組成物は、約毎週、約１０日ごと、約２週間ごと、約１８日ごと、約３週間ごと、または約２５日ごとに投与することができる。

実施形態では、組成物は毎月投与することができる。例えば、組成物は、約毎月、約２か月ごと、約３か月ごと、約４か月ごと、約５か月ごと、約６か月ごと、約７か月ごと、約８か月ごと、約９か月ごと、約１０か月ごと、約１１か月ごと、または約１２か月ごとに投与することができる。実施形態では、組成物は、１年に１回、または１年に２回以上投与することができる。

実施形態では、組成物は、角膜病変の症状が最初に現れたときに投与することができ、症状が軽減または軽減したとき、または症状が軽減または軽減した後の期間、組成物の投与を中止することができる。

投与の頻度は、使用される製剤、治療または予防される特定の状態、および患者／対象の病歴によって変動し得る。一般に、効果的な治療を提供するのに十分な最小用量を使用することが好ましい。本明細書に記載の角膜病変など、治療または予防される状態に適した定量的または試験方法を使用して、治療の有効性について患者を監視することができ、それは当業者に日常的である。

実施形態において、投与される組成物の投与量は、約１０ｎｇ～約１０００ｎｇを含む。例えば、投与される組成物の投与量は、約２０ｎｇ～約５００ｎｇ、例えば、約５０ｎｇ～約１００ｎｇであり得る。実施形態において、投薬量は、約５０ｎｇ～約８０ｎｇを含むことができる。

本明細書で使用される場合、「治療」および「治療すること」は、状態、疾患または障害と闘う目的で、疾患または障害の症状のうちの１つ以上が改善されたか、または他の方法で有益に変化する任意の方法で、対象者の管理およびケアを指すことができる。この用語は、症状もしくは合併症を軽減または緩和する；状態、疾患または障害の進行を遅らせる；状態、疾患もしくは障害を治癒または排除する；および／または状態、疾患もしくは障害を予防する目的での活性化合物の投与など、患者が苦しんでいる所与の状態に対する治療の全範囲を含むことができ、「予防すること」または「予防」は、状態、疾患または障害の発症を妨げることを目的とした患者の管理およびケアを指し、症状もしくは合併症の発症のリスクを予防または低減するための活性化合物の投与を含むことができる。

治療される患者は、ヒトなどの哺乳動物であり得る。治療はまた、本明細書で提供されるような疾患を治療するための使用など、本明細書での組成物の任意の医薬使用を包含する。

実施例は、本発明のより完全な理解を促進するために以下に提供される。以下の実施例は、本発明を作製および実施する例示的な様式を例示する。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例に開示されている特定の実施形態に限定されず、代わりの方法を使用して同様の結果を得ることができるため、例示のみを目的としている。

実施例Ａ
ドコサノイドシグナル伝達は、角膜神経再生、涙分泌、創傷治癒、および神経因性疼痛への影響を調節する。
角膜は、主に三叉神経節（ＴＧ）の眼神経枝の感覚神経によって密に神経支配されている。これらの神経は角膜の恒常性を維持するために重要であり、神経損傷は、創傷治癒の低下、角膜潰瘍および乾燥眼疾患（ＤＥＤ）の増加、ならびに神経障害性疼痛につながる可能性がある。糖尿病、老化、ウイルス感染および細菌感染などの病変、ならびに視力を矯正するためのコンタクトレンズおよび手術の長期使用は、神経損傷を引き起こす可能性がある。ＤＥＤ（多機能性疾患）を軽減する効果的な治療法はなく、ω－３補給を使用したいくつかの臨床試験では、不明確で時には否定的な結果が示されている。角膜神経損傷の動物モデルを使用して、本発明者らは、角膜を色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）とドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）で処理すると、神経再生、創傷治癒、および涙分泌が増加することを示す。このメカニズムには、カルシウム非依存性ホスホリパーゼＡ２（ｉＰＬＡ２ζ）の活性化が含まれ、これにより、組み込まれたＤＨＡがリン脂質から放出され、ドコサノイドであるニューロプロテクチンＤ１（ＮＰＤ１）および新しいレゾルビン立体異性体ＲｖＤ６ｉの合成が促進される。ＮＰＤ１は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、およびセマフォリン７Ａ（Ｓｅｍａ７Ａ）の合成を刺激する。傷害した角膜のＲｖＤ６ｉ治療は、ＴＧの遺伝子発現を調節し、神経新生の亢進、神経障害性疼痛の減少および感受性の増加をもたらす。まとめると、これらの結果は、角膜の恒常性を再確立するための治療組成物および方法を検証する。

角膜の解剖学
透明な角膜は、光を通過させて網膜に投射することにより、ヒトの眼の屈折力の７０％を占める。さらに、角膜は、免疫応答を調節し、病原体が眼球に侵入するのを防ぐための重要な障壁にもなる。解剖学的に、角膜は、上皮、ボーマン層、間質または実質固有層、デスメ膜、および内皮の５つのサブレイヤーに分割できる（１、２）（図１３パネルＡ）。

上皮は、角質化されていない扁平上皮細胞の５～７層で構成され、表層上皮細胞、中間翼細胞、および増殖率の高い最も内側の基底上皮細胞の３つの形態学的細胞タイプに分類される（２）。ほこり、水、バクテリアなどの異物の眼への通過を遮断し、酸素および細胞栄養素を吸収する滑らかな表面を提供する、密着結合によって、上皮細胞は接続されている。さらに、上皮の最外層は涙膜と接触しているため、眼の表面の水分を維持し、乾燥による損傷（ドライアイ、ＤＥ）から保護する。角膜上皮細胞は、角膜輪部上皮から基底層への幹細胞の移動を伴う「ターンオーバー」を定期的に受ける。これらの基底細胞は表面に向かって移動し、２～３層の翼細胞を生成し、次いで、最終的な分化と落屑を開始する。平均して、ヒト角膜上皮細胞のターンオーバー時間は７～１０日である（３）。

ボーマン層は、上皮を間質から分離する薄い無細胞層である。主にコラーゲンＩＶおよびラミニンが含まれている。これらのタンパク質の構成は、組織の透明性を維持するために重要である。

間質層は、静止状態の角膜実質細胞と、ラメラと呼ばれる高度に秩序化されたコラーゲンタイプ１フィブリルとプロテオグリカンで主に構成されるよく組織化された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で構成され、また、角膜の最大部分（角膜の厚さの約９０％）を構成する。間質は、散乱を防ぐ方法でコラーゲン原線維を通る光の通過を促進することにより、角膜への構造的支持および透明性を提供する。角膜実質細胞（コラーゲン線維の間に位置する平らな細胞）は、角膜実質の主要な固有細胞である。

デスメ膜は、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンＩＶおよびＶＩＩ、ならびにプロテオグリカンで構成される内皮によって合成された無細胞の薄層である。デスメ膜の損傷は、角膜浮腫および視力喪失を引き起こす。

角膜の最後の層は、房水と接触している内皮である。これは、角膜実質の脱水を調節するために体液を汲み上げる役割を担う細胞の単層である。内皮ポンプがないと、間質浮腫が発生し、不透明感および視力低下を引き起こす。ヒトの角膜内皮細胞は増殖能力が非常に低く、加齢に伴う細胞密度の低下をもたらす。

角膜の重要な特徴は、その密な神経支配である（図１３パネルＢ）。ほとんどの角膜神経線維は感覚神経起源であり、主に三叉神経節（ＴＧ）の眼神経枝のニューロンに由来する（４～６）。解剖学的に、角膜神経ネットワークは、間質神経が放射状に角膜輪部に入るときに発生する。角膜の透明性を維持するために、到着する神経はミエリン鞘を失い、シュワン細胞だけに囲まれている。間質では、太い枝が小さな神経枝に分かれている。ほとんどの枝は周辺のボーマン層を貫通し、上皮の中心に伸びて上皮神経ネットワークを形成し（図１３パネルＣ）、神経終末の密なネットワークに生命を与える。

角膜神経は涙分泌およびまばたきを刺激して、眼の表面の完全性を維持する（７）。角膜神経支配の変化は、加齢、糖尿病、関節リウマチおよびシェーグレン症候群などの免疫疾患、ウイルスおよび細菌感染、コンタクトレンズの長期使用、ならびにレーザーインサイチュ角膜切除術（ＬＡＳＩＫ）および光屈折角膜切除術（ＰＲＫ）などの屈折矯正手術で発生する（８～１３）。神経損傷による合併症は、感受性を低下させ、涙分泌およびまばたきを減少させ、その結果、重症の場合に神経障害性疼痛および角膜潰瘍を引き起こすＤＥ疾患（ＤＥＤ）を引き起こす。感覚神経が豊富であるため、角膜は人体における疼痛の強力な発生源でもある。

角膜関連の損傷に対するＰＥＤＦ＋ＤＨＡ治療。レゾルビンＤ６立体異性体の発見。
前述のように、損傷後、角膜神経密度はゆっくりと不完全に回復し、感受性およびＤＥ症状が低下した。本発明者らの研究室の研究では、神経成長因子（ＮＧＦ）をω－３脂肪酸ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）と組み合わせて使用すると、ウサギでの実験的ＰＲＫ後の角膜神経密度の回復が速くなることが示されている（１４）。当時、このメカニズムは、強力な抗炎症作用および神経保護作用を持つドコサノイドであるＤＨＡ由来の脂質メディエーターであるニューロプロテクチンＤ１（ＮＰＤ１）によって媒介される可能性があった（１５）。網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞でのＮＰＤ１の合成は、いくつかの成長因子によって刺激され、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）はＮＧＦよりも１０倍強力である（１６）。ＰＥＤＦは、血管新生、神経細胞の生存、および細胞分化に関連するプロセスを調節する、広範囲に作用する神経栄養および神経保護因子であり（１７）、傷害後に角膜上皮から放出される（１８）。その後の研究では、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡによる治療は、実験的手術のウサギおよびマウスの角膜モデル、ならびに糖尿病および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）感染などの病変において、炎症を軽減し、角膜創傷治癒および神経再生を刺激することが示されている（１９～２３）。この行動には、ＰＥＤＦおよびＤＨＡの両方による治療が必要である（１９）。ＰＥＤＦの４４アミノ酸フラグメントは神経保護活性を持ち、一方、隣接する３４アミノ酸ペプチドは抗血管新生活性を持っている（２４、２５）。角膜実質解剖のウサギモデルで、２つのペプチドの効果をＰＥＤＦタンパク質全体およびＤＨＡで比較すると、本発明者らは、３４－ｍｅｒ－ＰＥＤＦとは異なり、４４ｍｅｒ－ＰＥＤＦ＋ＤＨＡは炎症を軽減し、涙分泌および角膜感受性を増加させ、また、ＰＥＤＦ受容体（ＰＥＤＦ－Ｒ）を活性化することにより角膜神経の再生を促進することを見出した（２１）。この膜貫通型受容体は、角膜で発現し、ＤＨＡを放出するカルシウム非依存性ホスホリパーゼＡ２（ｉＰＬＡζ）活性を持ち（２６、２７）、ＤＨＡ補給による膜リン脂質のｓｎ－２位置に豊富に存在する。

子牛の角膜に関する研究では、組織内の主要なリン脂質としてホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびスフィンゴミエリンが特定された（２８）。これらのリン脂質の中で、ＰＣは最も豊富で、上皮に最も多く含まれている。同様の観察結果がヒト（２９）およびウサギの角膜（３０）で報告された。ウサギでは、オレイン酸（１８：１）は、すべての角膜層のリン脂質中でエステル化された主要な脂肪酸（リン脂質の総脂肪酸の約５０％）であり、これにパルミチン酸（１６：０）が続き、約１６～１８％含む。リン脂質中でエステル化された多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）に関しては、高い割合（総脂肪酸の約９％）がアラキドン酸（ＡＡ）に対応するが、リン脂質中でエステル化されたエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびＤＨＡの割合ははるかに低い（総脂肪酸の約１．６％）（３０）。

間質神経が損傷したマウス角膜のＤＨＡ局所治療は、１８：１－ＤＨＡを含むＰＣおよびＰＥ分子種における脂肪酸の急速な取り込みをもたらし（２７）、このことは、ＰＵＦＡの添加が脂質膜組成物中のＤＨＡの有意な濃縮をもたらしたことを実証している（図１４パネルＡ）。

組織の損傷は、ＡＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡなどのＰＵＦＡをｓｎ－２位置から放出するホスホリパーゼＡ２を活性化する（３１、３２）。本発明者らの研究室および他の研究室からのいくつかの初期の研究は、角膜が傷害に反応し、シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）の活性化によってプロスタグランジン（ＰＧ）の合成（３３～３６）、ならびにリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）の活性化によってヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）およびリポキシンＡ４（ＬＸＡ４）の合成（３７～３９）を増加させることを実証した。膜脂質中のＤＨＡの濃度は非常に低いため（図１４パネルＡ）および（３０）、本発明者らは、ＰＥＤＦで処理された角膜へのＤＨＡの添加が、強力な抗炎症作用を有するＤＨＡの脂質誘導体（ドコサノイド）の合成を増加させるために重要であることを見出した（１９、４０、４１）。したがって、角膜をＰＥＤＦ＋ＤＨＡで処理することによってＰＥＤＦ－ＲのｉＰＬＡ２ζを活性化すると、角膜から放出される遊離ＤＨＡが３０００倍より多く増加する（図１４パネルＢ）。

遊離ＤＨＡは、次に、より安定したヒドロキシＤＨＡ誘導体（ＨＤＨＡ）に急速に変換される１４－および１７－ヒドロペルオキシＤＨＡ（ＨｐＤＨＡ）の合成の基質になる（図１４パネルＢ）。これらの結果により、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡ処理がＤＨＡに由来するドコサノイドの形成を刺激することを確認した。

図１５は、ＡＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡから生じる生物活性脂質のスキームを示す。多くのＡＡ脂質メディエーターおよび一部のＥＰＡ脂質メディエーターは強力な炎症誘発性を有するが、すべての既知のＤＨＡメディエーター（ドコサノイド）は炎症を保護および解決するように作用する（４２、４３）。それらは、ＮＰＤ１およびその他のプロテクチン、マレシン、およびＤシリーズのレゾルビン（４３）、ならびにプロテクチン（ＰＣＴＲ）、マレシン（ＭＣＴＲ）およびレゾルビン（ＲＣＴＲ）のより新しいスルフィドコンジュゲートを含む、ファミリーで命名された特殊のプロレゾルビンメディエーター（ＳＰＭ）の一部を構成する。ＳＰＭを生成する合成メカニズムには、リポキシゲナーゼ（一次触媒としての１５－ＬＯＸおよび二次触媒としての５ＬＯＸを含む）、シクロオキシゲナーゼ（アスピリンの存在下）、およびシトクロムＰ４５０酵素が含まれる（４４）。ＤＨＡ脂質メディエーターのシグナル伝達メカニズム、特にそれらの受容体の同定に関する情報はまだ限られている（表１）。既知の受容体のほとんどは、Ｇタンパク質共役型受容体のファミリーに属している。さらに、いくつかのドコサノイドは同じ受容体を共有しているが、それらの活性化は特定の生物学的活性を発揮する（４３）。

（表１）ドコサノイドの報告された受容体のリスト

本発明者らは、ＲｖＤ６ｉ（図１６）と呼ばれるレゾルビンＤ６（ＲｖＤ６）の立体異性体である新しいドコサノイドを発見した。これは、傷害およびＰＥＤＦ＋ＤＨＡによる治療後にマウスの涙で放出される（４０）。この新しい脂質のフラグメンテーションパターンは、ＲｖＤ６と一致する少なくとも６つの一致するプロダクトイオンを示している。レゾルビンＤ６はいくつかの組織で発見されており、健康な個体の血漿での研究では、ＲｖＤ６が加齢とともに減少するバイオマーカーであることが示された（５０）。ＲｖＤ６は、ヒトの歯根膜から分離された幹細胞からも放出され、これは組織の再生に重要である（５１）。しかし、ＲｖＤ６は正常なヒトの涙では検出されない（５２）。ＰＥＤＦ＋ＤＨＡおよびＲｖＤ６による治療と比較して、新しいＲｖＤ６ｉは角膜の創傷治癒および感受性を促進し、より高い生物活性を実証した（図１６パネルＡおよびＢ）。

ドライアイ疾患に対するＤＨＡの使用。
４０歳を超える成人の５％～４０％がＤＥＤに冒され（５３、５４）、米国では推定１，６４０万人が冒されている（５５）。最近のドライアイワークショップ（ＤＥＷＳ ＩＩ）では、ドライアイは「涙膜の恒常性の喪失を特徴とし、涙膜の不安定性および高浸透圧、眼の表面の炎症および損傷、ならびに神経感覚異常が病因的役割を有する眼の症状を伴う、眼の表面の多因子性疾患」と定義された（５４）。

過去１０年以内に、ω－３脂肪酸ＤＨＡおよびＥＰＡ補給を使用した様々な病因のＤＥＤ患者の臨床試験が数多く行われ、食事性脂肪酸は涙腺と血漿リン脂質に組み込まれる可能性があるという議論があった（５６）。しかし、ＤＥＤにおけるＰＵＦＡ補給の効果は物議を醸している。いくつかの研究は改善を示したが、他の研究はわずかな効果を示した。表２に、過去１０年間に実施された、様々な病因のＤＥＤを治療するためにＤＨＡによる補給が使用された臨床試験をまとめた。

（表２）ω－３ＦＡ治療を使用したＤＥＤの過去１０年間の臨床試験の要約

下線は、局所点眼薬を使用した臨床試験を示している。

３２９人がＥＰＡおよびＤＨＡの１２か月の補給を受け、１７０人の患者がプラセボとして精製オリーブオイルで治療された、合計４９９人の患者を含んだ、最も重要な試験の１つであるＤＲＥＡＭ研究（６９）は、改善が見られなかったことを示した。この研究は、ＤＥＤの治療におけるＤＨＡの利点についての疑念を高める。このため、このレビューでは、本発明者らは、ＤＨＡ補給の結果を説明する、可能性のある問題を指摘する。

１つの懸念はＤＨＡ補給の形態である。ほとんどの研究では、天然の濃縮魚油を採用した。しかし、魚油組成の分析は、ＰＵＦＡが主にトリグリセリドでエステル化されていることを示した。食事からのＤＨＡは、主にＰＣである膜リン脂質のｓｎ－２位置でエステル化される前に、肝臓に取り込まれる必要がある（７１）。次に、ＤＨＡリン脂質は、血流に放出される前に、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）または他のリポタンパク質にパッケージ化される（７１、７２）。したがって、魚油からのＤＨＡまたはＥＰＡの補給は、眼の表面、特に角膜に到達するのは非常に少ない。これは、主に長鎖ＰＵＦＡを有するＰＣを含むオキアミ油が、魚油よりもラットの血液および脳で高い吸収率を示した以前の研究によって裏付けられている（７３）。オキアミオイルを使用してＤＥＤを治療する研究は、小規模な臨床試験（群当たり１８人の参加者）の１つだけであり、ここでＤｅｉｎｅｍａらは、治療の９０日後の魚油よりもオキアミオイル補給で、低い眼表面疾患指数およびＩＬ－１７Ａレベルを示した（６７）および表２。

さらに、角膜は無血管であることに注意することが重要である。そのため、角膜の細胞膜に食事の脂肪酸が組み込まれる可能性は低い。これは、ラットに経口投与された^１４Ｃ標識ＤＨＡを使用した研究によって裏付けられており、眼のコンパートメントに到達したＤＨＡの割合は非常に少ない（経口投与量の０．０３％未満）ことが示された（７４）。この量のうち、網膜が網膜下血管からＤＨＡの大部分を取り込むため、角膜に入る可能性のある量は非常に少ない。したがって、涙腺でのＰＵＦＡ濃縮は、角膜での有益な治療を確実にするのに不十分である。

本発明者らの知る限り、局所ＤＨＡを使用した臨床試験は１つだけである（（７０）および表２）。

この試験は、ＡＡ、ＤＨＡ、およびＥＰＡがＤＥＤ患者の涙中に見られ、ω－６（ＡＡ）：ω－３（ＤＨＡ＋ＥＰＡ）の比率が涙膜の機能不全の重症度と相関することを示す、以前の研究に基づいていた（７５）。小規模な試験（ＤＨＡで局所的に治療された１９人の患者）は、オメガ－３脂肪酸を含む点眼薬による治療が、点眼後１時間まで涙膜の脂質層の厚さを増加させることを示した（７０）。

最後に、本発明者らの動物実験は、ＤＨＡが角膜リン脂質、主にＰＥおよびＰＣに急速に組み込まれ、神経密度を高めることを示している。神経密度の低下は、神経を再生するためにＰＥＤＦおよびＤＨＡの両方を必要とする、ＤＥＤにおける十分に実証された変化である。治療はＤＨＡを放出し、ＲｖＤ６ｉの合成を刺激し、このドコサノイドは創傷治癒および感受性を高め（図１７パネルＡおよびＢ）、理論に拘束されることを望まないが、ＤＨＡよりもＤＥＤのよりよい治療的使用である（４０）。

炎症の減少および角膜創傷治癒、神経再生、ならびに涙分泌の増加におけるドコサノイドの有効性は、傷害、感染、糖尿病、角膜血管新生、および移植のいくつかの異なるモデルで明確に実証されている（表３）。これらの結果は、強力な薬物としてのドコサノイドの作用を強調している。

（表３）角膜損傷にＰＥＤＦ＋ＤＨＡまたはドコサノイドを使用したインビボ試験

下線は当研究室の研究を示している。

ＲｖＤ６ｉは、ＴＧの神経新生および疼痛に関与する遺伝子を調節する。
以前の研究では、ＰＥＤＦおよびＤＨＡによる角膜治療もドコサノイドＮＰＤ１の合成を刺激したことが示されている。しかし、合成量はＲｖＤ６ｉよりはるかに少ない（１９、４０）。傷害した角膜にＮＰＤ１を加えると、軸索の成長を刺激するニューロトロフィンＮＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、およびセマフォリンＡ２（Ｓｅｍａ７Ａ）の遺伝子発現およびタンパク質レベルが増加する（２７）。これらのタンパク質は涙中に分泌され、角膜神経終末の受容体を活性化して、下流のシグナル伝達を促進し、ＴＧのニューロンに逆行する。

ＲＮＡシーケンスを使用して、マウスの傷害した角膜からのＴＧの遺伝子発現を分析し、本発明者らは、角膜に局所的に適用されたＰＥＤＦ＋ＤＨＡの産物であるＲｖＤ６ｉが、ＴＧ、染色体９オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ｏｒｆ７２）、および糖タンパク質ＭＧＡ（Ｇｐｍ６Ａ）における２つの興味深い遺伝子の発現を誘導することを明らかにしている（４０）。これらの遺伝子は、神経新生および成長円錐の形成を刺激する（８１，８２）。

多くの場合、角膜神経を損傷する眼の病変は、神経障害性疼痛を引き起こす（８３）。さらに、ＤＥＤの症状があり、神経障害性疼痛を経験しているかなりの数の患者が存在する。これは、角膜とＴＧとの関係が活発であることを示している（８４）。ＲｖＤ６ｉで治療した角膜では、疼痛に関与する２つの遺伝子が減少した。角膜神経で発現する最も豊富な神経ペプチドの１つであるサブスタンスＰ（ＳＰ）をコードするＴａｃ１（４、８５、８６）、およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）をコードするＣａｌｃｂである（角膜神経にも豊富）（４，２０）（図１７パネルＣ）。両方の神経ペプチドは、神経性の炎症および疼痛に重要な役割を果たす（８７、８８）。さらに、ＲｖＤ６ｉによる角膜治療は、一過性受容体電位メラスタチン８（Ｔｒｍｐ８）の遺伝子発現を増加させた（図１７パネルＤ）。ＴＲＰＭ８イオンチャネルは、眼の表面の濡れを調節し、慢性的な疼痛に鎮痛効果をもたらすクールなセンサーである（８９～９３）。前間質のレベルで神経が損傷したマウスモデルでの本発明者らの研究は、角膜ＴＲＰＭ８陽性神経線維が３か月の傷害後に正常密度の５０％にしか達しないことを示し、これは、ＴＲＰＭ８の減少がＤＥ様疼痛の一因である可能性があることを示している（９４）。したがって、傷害およびＲｖＤ６ｉによる治療後の、ＳＰおよびＣＧＲＰの発現の減少、ならびにＴＲＰＭ８の発現の増加は、新しいドコサノイドが角膜を疼痛から保護できることを示している。また、研究により、ＮＧＦによる局所治療によって引き起こされる角膜神経再生の増加の副作用として眼の疼痛が示されているため（９５）、角膜神経栄養性潰瘍などの眼の表面の損傷を治療するための組成物および方法も提供する。ＲｖＤ１およびＲｖＤ５を使用した研究では、脛骨骨折のマウスモデルにおける疼痛の軽減は示されたが、ＲｖＤ３およびＲｖＤ４は効果がなかった（９６）。これらの違いは、その受容体の異なる発現に起因する可能性がある。骨粗鬆症のマウスモデルでは、ＲｖＤの前駆体である１７Ｒ－ヒドロキシＤＨＡは、おそらくＡＸＬ受容体の活性化によって疼痛の行動を減少させる（９７）。もう１つの重要な発見は、ＲｖＤ６ｉがＴＧにおけるＲｉｃｔｏｒの遺伝子発現の強力な誘導因子であるということである（４０）（図１７パネルＤ）。ＲＩＣＴＯＲは、ラパマシン非感受性複合体２（ｍＴＯＲＣ２）の哺乳類標的の重要な構成要素であり、傷害後の感覚ニューロンの抗炎症および軸索成長に役割を果たす（９８）。

ＰＥＤＦおよびＤＨＡによって刺激されたドコサノイドのシグナル伝達経路の要約スキームを図１８に示す。

結論
角膜の神経支配は、眼の表面の恒常性および組織の透明度を維持する上で極めて重要な役割を果たす（７）。角膜神経への損傷は、涙の生成およびまばたき反射の減少を引き起こし、上皮の創傷治癒を損ない、透明性および視力の喪失をもたらす可能性がある（８～１３）。したがって、角膜神経機能および修復に関するより良い知識は、角膜神経支配に影響を与える病変の治療的戦略を向上させるであろう。理論に縛られることを望まないが、新しいメディエーターＲｖＤ６ｉなどのＤＨＡ由来のドコサノイドは、角膜関連の炎症を軽減する治療法である。神経再生を促進し、ＴＧの神経障害性疼痛の構成要素の遺伝子発現を調節するこの脂質の効果は、屈折矯正手術後のＤＥ患者の治療、および角膜神経密度を減少させるいくつかの病変への併用治療における新しい代替手段を提供する可能性がある。将来のヒトの臨床試験は、ＤＥおよび眼の表面の疾患に対するこれらの新しい治療法の最適な投与量、投与方法、有効性、および安全性を検証することである。

この実施例で引用されている参考文献

実施例１
序章
ドライアイは、主に加齢の間に視力を乱す。また、関節リウマチ、糖尿病、甲状腺病変、環境条件（例えば、煙または汚染物質への曝露）、コンタクトレンズの長期使用、屈折矯正手術後にも発生する。この病変は、滑らかにし、感染を阻止し、透明な眼の表面に栄養を与え、維持する、涙の不足によって引き起こされる。角膜神経支配は、眼の表面の完全性を維持するために必要であり（１）、神経損傷は、涙産生、まばたき反射を減少させ、上皮創傷治癒を混乱させ、透明性および視力の喪失をもたらす（２～５）。このため、ドライアイと角膜神経損傷との間には強い関係がある。

三叉神経節（ＴＧ）ニューロンの眼枝からの感覚神経からの軸索は、辺縁領域を取り巻く角膜実質を貫通し、角膜上皮に到達する前に上皮下神経叢として分岐し、最終的に自由神経終末となる（６～８）。

屈折矯正手術（例えば、レーザー支援のインサイチュ角膜切除術、レーシック、または光屈折角膜切除術、ＰＲＫ）によって神経損傷が発生した後、角膜神経の完全性を回復するのに３～１５年かかる（９～１１）。結果として、角膜感受性が低下し、ドライアイ疾患が発症し、神経障害性疼痛、角膜潰瘍、および重症の場合は角膜移植の必要性を引き起こす可能性がある（１２～１４）。さらに、ドライアイは、冷受容体機能、主に角膜表面の冷却速度を制御しかつ正常な涙分泌を維持する、一過性受容体電位メラスタチン８（ＴＲＰＭ８）チャネル（１５）に関連している（１６～１８）。実際、実験的な角膜手術のずっと後でさえ、ＴＲＰＭ８終末の減少が起こり、これらの変化が術後の神経障害性疼痛の一因であることを示している（１９）。

ニューロトロフィン色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）およびω－３脂肪酸ファミリーメンバーのドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の局所治療は、実験手術後のウサギおよびマウスの角膜、ならびに糖尿病および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）感染症などの病変において、神経再生を促進し、神経再成長を刺激する（２０～２４）。さらに、ＰＥＤＦはＰＥＤＦ受容体（ＰＥＤＦ－Ｒ）のＣａ^２＋非依存性ホスホリパーゼＡ２（ｉＰＬＡ２ζ）活性を活性化し、膜リン脂質からＤＨＡを放出し、これは、屈折矯正手術のウサギモデルにおいて角膜神経再生を誘発するニューロプロテクチンＤ１（ＮＰＤ１）を含む生物活性ドコサノイド（２５）に変換され得る（２０）。ここでは、本発明者らは、眼の表面にＰＥＤＦ＋ＤＨＡによって発揮されるシグナル伝達メカニズムの一部である新しい脂質メディエーターの発見を報告する。さらに、本発明者らは、ＴＧ遺伝子が角膜傷害を感知し、特定のトランスクリプトミクスシグネチャーで角膜ＲｖＤ６ｓｉ治療に応答することを見出した。本発明者らは、ＲｖＤ６ｓｉの局所塗布が角膜保護であり、ドライアイおよび眼の神経障害性疼痛の新しいメカニズムおよび治療手段を明らかにしていることを実証する。

マウスの涙からの新しいレゾルビンＤ６ｓｉの同定
ＰＥＤＦ＋ＤＨＡの生物活性は本発明者らの研究室によって明らかにされた（２０～２４）。角膜神経再生に対するＰＥＤＦ＋ＤＨＡ作用の機構的関連性は、ｉＰＬＡ２ζの活性化、および神経栄養因子脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）の発現増加、ならびに涙中に出された軸索成長ガイダンスセマフォリン７ａ（Ｓｅｍａ７Ａ）によって明らかになった（２５）。ＰＥＤＦ活性化によるＤＨＡの放出後にどのドコサノイドが産生されるかを定義するために、マウス角膜に傷害を与えて、治療し、涙を集め、脂質を抽出してＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した（図１）。３５９ｍ／ｚのトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）は、４時間の治療後の涙中のすべてのジヒドロキシＤＨＡ異性体を表しており、３つのピークは保持時間（ＲＴ）８．２０、８．７４、および９．２０分で明確に定義された（図１）。内部標準ＬＴＢ４－ｄ４（緑色）は８．２５分に溶出した。本発明者らは、完全にフラグメンテーションすると、親イオン３５９ｍ／ｚを示す、８．２０分に溶出されるピーク（ピーク１）に焦点を当てた。これは、少なくとも６つの一致するプロダクトイオン（娘イオン）を、炭素番号４および１７に２つのヒドロキシ基を有するＲｖＤ６標準と比較する（図１）。ピーク１を同じ濃度のＲｖＤ６と同時注入した場合、ピーク１は、６つの主要な多重反応モニタリング（ＭＲＭ）チャネル３５９－＞２９７、２７９、２３９、１９９、１５９、および１０１でＲｖＤ６より０．２７分早く溶出した（図１）。ピーク１およびＲｖＤ６のＵＶスペクトルは、２３８ｎｍで最大吸光度（λｍａｘ）を示し、両方の化合物が共役ジエン構造を持っていることを示している（図１）。まとめると、本発明者らのデータは、ピーク１が、ＲｖＤ６と完全なフラグメンテーションパターン、ならびに少なくとも６つの一致する娘イオン、ＤＨＡバックボーンおよびＵＶスペクトルの、Ｃ４およびＣ１７に２つのヒドロキシ基を共有するが、異なったＲＴを有する、ＲｖＤ６立体特異的異性体（ＲｖＤ６ｓｉ）であることを示している。

ＲｖＤ６ｓｉはＤＨＡに由来する
新しいＲｖＤ６ｓｉが追加されたＤＨＡに由来するかどうかを検証するために、エクスビボでの角膜器官培養モデルが採用された（１６個の角膜／サンプル）。傷害した角膜を、ＤＨＡまたは重水素標識ＤＨＡ（ＤＨＡ－ｄ５）およびＰＥＤＦの存在下で４時間培養し、培地から脂質を抽出して分析した。重水素（Ｄ）の５つの原子がＤＨＡバックボーンの端に接続されているため（２１番目および２２番目のＣ）、ＲｖＤ６ｓｉ－ｄ５の総質量は３６５Ｄａにシフトした（［Ｍ－Ｈ］ｍ／ｚはＭＳの結果で３６４である）一方、そのプロダクトイオンの一部はフラグメンテーション後に変化しなかった（図２）。ＭＲＭ検出方法は、ＤＨＡ－ｄ５全体の構造を捕獲するように設計された。ＲｖＤ６ｓｉ－ｄ５は、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡによって産生されたＲｖＤ６ｓｉと同様のＲＴの培地で検出された（図２）。ＲｖＤ６ｓｉ－ｄ５の完全なフラグメンテーションにより、構造も確認された（図２）。さらに、ＲｖＤ６ｓｉの起源は、増加したＤＨＡ濃度の関数として増強された合成を伴う、添加されたＤＨＡの３つの異なる濃度で検証された（図２）。可能性のあるアラキドン酸（ＡＡ）－およびＤＨＡ－ヒドロキシ誘導体（ＨＤＨＡ）を分析すると、結果は、１４－および１７－ＨＤＨＡなどのＤＨＡ生成物の比例した増加を示したが、ＡＡおよびそのヒドロキシル誘導体１２－および１５－ＨＥＴＥは変化しなかった。これらのデータは、新しいＲｖＤ６ｓｉが外因性ＤＨＡに由来することを示している。

インビボでのＲｖＤ６ｓｉの単離および特性化
新しいＲｖＤ６ｓｉの２Ｄ構造はＲｖＤ６と一致したが、ＲＴが異なると、生物活性が異なる可能性がある。試験に十分なＲｖＤ６ｓｉを得るために、６０匹のマウスに傷害を与え、３０分ごとに４時間ＰＥＤＦ＋ＤＨＡで治療し、涙を集めた。翌日、マウスを安楽死させ、角膜を分離し、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡを含む培地で４時間インキュベートした。涙および角膜培地から抽出された脂質を組み合わせて、Ｃ１８カラムを使用してＵＰＬＣで分析し、６～１２分まで３０秒ごとに画分を収集した。新しいＲｖＤ６ｓｉの可用性を検出するために、すべての画分をリピドミック分析にかけた。明確に検出可能な量のＲｖＤ６ｓｉを含む画分６～８をプールした（図３）。本発明者らの標的とした脂質メディエーターの純度は、インビボで試験される前にリピドミック分析によって決定した。単離されたＲｖＤ６ｓｉは、他のＤＨＡ誘導体（図３）、ＡＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、およびそれらの誘導体（図７）の汚染が非常に少ないことを示した。

ＲｖＤ６ｓｉは、角膜の創傷治癒および傷害後の角膜感受性の回復を促進する
研究によると、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡは、実験的手術後のウサギ（２０、２１）、ならびに正常マウスおよび糖尿病マウス（２４、２５）の角膜創傷治癒を促進することを示している。角膜創傷治癒を刺激するＲｖＤ６ｓ（ＲｖＤ６またはＲｖＤ６ｓｉのいずれか）の能力を検証した。マウスの右眼に傷害を与え、動物を、ビヒクル、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡ、ＲｖＤ６、およびＲｖＤ６ｓｉの４つの群に分けた（図４）。傷害の２０時間後、すべての薬物治療マウスは、ビヒクルよりも角膜創傷治癒が速かったが、最大の増加は、ＲｖＤ６ｓｉで治療された動物で見られた（図４）。

角膜感受性を、角膜傷害および治療後３、６、９および１２日目に評価した（図４）。Ｂｅｌｍｏｎｔｅ非接触知覚計を使用して、マウス角膜の感覚を測定する新しい方法を導入した。図４は、１００．４５～１１０．０５ｍｌの空気／分（α＝０．０５）の流量での角膜基底感覚の記録値（ｎ＝４０個の角膜）からのガウス分布曲線を示している。Ｂｅｌｍｏｎｔｅ非接触知覚計の動作流量は２０～２００ｍｌ／分であるため、この範囲の通常の角膜感受性は角膜感覚を評価するために重要であることに注意することが重要である。マウスの１００．４５～１１０．０５ｍｌの正常な角膜感受性の範囲は、傷害および治療後の回復に成功したとみなし、測定値を正規化するために使用した。傷害後３日および６日にＲｖＤ６ｓｉで治療された動物では、角膜感覚のより速い回復があった（図４）。９日までに、３つの治療はビヒクルと比較して感受性を増加させ、そして１２日で、研究された群のいずれにも有意差はなかった。

ＲｖＤ６ｓｉは角膜神経の再生を促進する。
ＰＥＤＦ＋ＤＨＡは、傷害動物モデルの角膜神経再生を刺激する（２０～２５）。ＰＥＤＦ＋ＤＨＡの作用の根底にある脂質メディエーターとしてのＲｖＤ６ｓｉの生物学的活性を確認することが重要であった。これを検証するために、マウスに傷害を与えて、治療した（図４に記載）。分離された角膜は、総ニューロンマーカーであるＰＧＰ９．５およびＳＰ神経ペプチド抗体で染色した。値を正規化するために、それぞれＰＧＰ９．５およびＳＰに陽性の非傷害角膜神経の密度を使用した（図５）。サブスタンスＰは、哺乳類の角膜の主要な神経ペプチドである（２６～２８）。さらに、本発明者らのグループの以前の研究では、角膜感受性とＳＰ陽性神経との間に相関関係があることが示されている（２９）。

傷害および治療の１２日後の総角膜神経密度は、ビヒクル治療群では正常角膜の４５．９±６．８％であり、ＲｖＤ６ｓｉ治療角膜では６２．６±４．２％（ｐ＜０．０５）で有意に高かった（図５）。ＰＥＤＦ＋ＤＨＡおよびＲｖＤ６治療も、神経密度をそれぞれ５９．９±６３％および５９．７±１１．２％に増加させた。ＲｖＤ６ｓｉと、ＲｖＤ６と、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡとの間に有意差はなかった。同様に、傷害後１２日でのＳＰ陽性神経の密度は、ビヒクル処置群と比較して、ＲｖＤ６ｓｉ、ＲｖＤ６およびＰＥＤＦ＋ＤＨＡ治療でより高かった（図５）。この結果は、処理された角膜における角膜感受性のより速い回復を確認し（図４）、角膜神経再生を増強するＰＥＤＦ＋ＤＨＡのメカニズムにおける主要なメディエーターとしてのＲｖＤ６ｓｉの生物学的機能を強化した。

三叉神経節におけるＲｖＤ６ｓｉによるトランスクリプトーム選択的調節
角膜感覚神経はＴＧニューロンに由来するため、本発明者らは、角膜傷害がＴＧおよびｔで感知され、次いで遺伝子発現応答を誘発するかどうかを検証したいと考えた。したがって、ＴＧは、傷害の１２日後に採取し、ＲｖＤ６ｓｉまたはＲｖＤ６による治療、または対照として使用されるビヒクルによる治療（図４）、次いで、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析を行った。品質管理は、マッピングされた読み取りが８４．６３～９３．００％の範囲であり、サンプル当たり約２０，０００個の発現遺伝子があることを示した。主成分分析（ＰＣＡ）は、ＲｖＤ６ｓｉまたはＲｖＤ６治療群からビヒクル治療群の良好な分離を示した（図６）。２つのＲｖＤ６は、対照と比較して、５８個の上方制御された遺伝子および３６個の下方制御された遺伝子を共有した（図６）。ＲｖＤ６ｓｉ対ビヒクルおよびＲｖＤ６対ビヒクルの上方調節された遺伝子を分類するために、遺伝子濃縮分析を使用して、ＲｖＤ６ｓｉが細胞区画位置の違いを示し（図８）、軸索成長円錐遺伝子（遺伝子オントロジー番号００４４２９５）を活性化することを実証した。箱ひげ図は、このクラスのＲｖＤ６ｓｉによって活性化された２つの遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２およびＧｐｍ６ａを示している（図６）。また、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡの添加によって刺激される角膜の神経ペプチドおよびイオンチャネル受容体に関連する特定の遺伝子を検出した（１９、２１、２４）（図６Ｄ）。ＲＮＡ－ｓｅｑは、ＲｖＤ６またはＲｖＤ６ｓｉがサブスタンスＰ（ＳＰ）をコードするタキキニン前駆体１（Ｔａｃ１）およびカルシトニン関連ポリペプチドベータ（Ｃａｌｃｂ）の２つの主要な神経ペプチドの遺伝子発現を低下させることを確立した。これらの神経ペプチド、特にＣａｌｃｂは、片頭痛およびその他の原発性頭痛における主要な疼痛誘発性メディエーターであることに注意することが重要である（３０）。対照的に、ＲｖＤ６ｓｉは、一過性受容体電位メラスタチン８（Ｔｒｐｍ８）チャネル、およびニューロピリン１（Ｎｒｐ１）、クラスＩＩＩ／ＩＶセマフォリンを含むいくつかの因子の補助受領体、血管内皮増殖因子の特定のアイソフォーム、ならびにトランスフォーミング成長因子ベータの発現を選択的に亢進した（３１）。

さらなる分析により、ラパマイシン非感受性哺乳動物標的複合体－２（ｍＴＯＲＣ２）の一部である転写因子Ｒｉｃｔｏｒ（図６）のＲｖＤ６ｓｉによる強力な誘導が明らかになった（図６）。ＲｖＤ６ｓｉによって変更されたＲＩＣＴＯＲによって調節された３９個の遺伝子があった。その中で、３７個（９５％）の遺伝子が、公開されたデータから収集されたＩＰＡの知識と一致したが、Ｅｇｒ１およびＰｓｍｅ３の２つの遺伝子だけが予測に適合しなかった（黄色の矢印）（図６）。ＩＰＡ分析の対象となるすべての遺伝子は、ビヒクル治療群と比較して有意に異なることに注意することが重要である（ＤＥＳｅｑ２分析ではＦＤＲ＜０．０５）。このため、下流の遺伝子の９５％がＩＰＡの知識と一致した。Ｒｉｃｔｏｒのシグナル伝達は、ＲｖＤ６ｓｉによってＴＧにおいて明らかに刺激される（図６）。

考察
本発明者らの研究室の研究では、ウサギおよびマウスの術後モデルにおける角膜創傷治癒および神経再生のためのＰＥＤＦ＋ＤＨＡの使用が実証されている（２０～２５）。これには、ＰＥＤＦ－ＲのｉＰＬＡ２ζ活性の活性化が、リン脂質からＤＨＡを放出する、という観察が含まれ、ドコサノイドが角膜で合成される可能性があることを示唆している（２５）。ここでは、その受容体上のＰＥＤＦの活性化時にＤＨＡに由来する涙中の新しいレゾルビンＤ６ｓｉの生物活性の発見、同定、および特性評価について報告する。ＲｖＤ６ｓｉの完全なＭＳ／ＭＳフラグメンテーションは、６つの特徴的なイオンをＲｖＤ６およびＵＶダイオードアレイプロファイルと一致させる（図１）。生物学的活性は、それが角膜ＰＲＫ模倣手術後のＰＥＤＦ＋ＤＨＡよりも強力に、角膜創傷治癒および感受性回復を増強することを明らかにした（図４）。これらの結果は、ＲｖＤ６ｓｉがＰＥＤＦ＋ＤＨＡの作用のシグナル伝達メカニズムに寄与する主要な脂質メディエーターであることを示している。さらに、ＲｖＤ６ｓおよびＰＥＤＦ＋ＤＨＡ治療は、傷害および治療の１２日後の角膜神経支配において同様の増強を示す（図６）。

レゾルビンＤ６は、ヒト多形核好中球（３２）を使用して記述され、皮膚（３３）、脳（３４）、脳脊髄液（３５）、および血漿（３６）で検出された。しかし、これはＲｖＤ６および新規な立体異性体の生物学的機能を示す最初のレポートである。モノ－、ジ－、およびトリ－ヒドロキシＤＨＡ誘導体が、網膜におけるＤＨＡの酸素化代謝物の酵素媒介生成物として検出された場合、ＤＨＡからの強力な生物活性メディエーターの形成が提案された（３７）。光受容体膜がリン脂質のｓｎ－２位置でエステル化された高いＤＨＡ含有量を持っている網膜とは異なり（３８）、角膜はその位置でより多くのＡＡを含んでいる（２５、３９）。このため、エイコサノイドではなくドコサノイドを合成するには、外因性ＤＨＡの添加が必要である。さらに、角膜をＤＨＡまたはＰＥＤＦのみで治療した場合、ＲｖＤ６ｓｉは検出されなかった。これは、角膜をＰＥＤＦ＋ＤＨＡで治療した場合にのみ新しいＲｖＤ６ｓｉが検出されることを示している。この観察結果は、ＲｖＤ６もその立体異性体もヒトの涙サンプルで検出されなかったことを示す以前の研究と一致している（４０）。ＲｖＤ６ｓｉは主に器官培養の角膜の涙または媒体に見られたため、これは、ＲｖＤ６ｓｉが機能するために細胞外コンパートメントに分泌される必要があることを示している。生物学的活性は受容体を介して誘発され、次に細胞のシグナル伝達および転写因子を調節し、結果として角膜の神経栄養遺伝子を上方調節する（２５）。ＲｖＤ６ｓｉは、オートクリン方式で作用し、かつ／または涙を介して拡散し、眼の表面の他の細胞でパラクリンシグナルとして作用する可能性がある。

角膜神経のほとんどは、ＴＧに局在するニューロンに由来する（６）。したがって、バイアスのないＲＮＡシーケンスを使用して、本発明者らは、ＲＶＤ６およびＲｖＤ６ｓｉがＴＧ内の少数の上方調節された遺伝子を共有していることをここで解読した。これは、それらの生物活性のシグナル伝達メカニズムに違いがあることを示している。ＲＮＡ－ｓｅｑデータは、神経新生および成長円錐形成を刺激する２つの遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２およびＧｐｍ６ＡのＲｖＤ６ｓｉによる強力な活性化を明らかにしている（４１、４２）。角膜神経障害性疼痛は神経損傷後に発生する可能性があるため、疼痛に関連する遺伝子も発見した（４３）。疼痛に関与する２つの遺伝子の発現が、ＲｖＤ６ｓｉで治療された角膜で減少した。角膜神経で発現される最も豊富な神経ペプチドの１つであるＳＰをコードするＴａｃ１（２６～２８）。ＳＰは、炎症誘発性効果を発揮し、前臨床試験はそれらの作用を慢性疼痛に関連付けた（４４）。もう１つはカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）をコードするＣａｌｃｂで、これは角膜神経にも豊富に存在し（２１）、神経性の炎症および疼痛に重要な役割を果たす（３０）。このカテゴリーのもう１つの重要な遺伝子はＴｒｍｐ８である。ＴＲＰＭ８チャネルは、眼の表面の濡れを調節し、慢性的な疼痛に鎮痛効果をもたらす（１７、４６～４９）。神経が損傷したマウスでの以前の研究では、ＴＲＰＭ８陽性神経線維は傷害後３か月までに通常の密度の５０％にしか達しないことが示され、ＴＲＰＭ８神経終末の減少がドライアイのような疼痛の一因である可能性があることを示している（１９）。傷害およびＲｖＤ６ｓｉによる治療後のＴｒｐｍ８の発現の増加は、新しい脂質が角膜を疼痛から保護できることを示している。さらに、坐骨神経傷害のラットモデルで機械的異痛症を軽減することが示されているのはＳＥＭＡ３Ａの補助受容体であるため、Ｎｒｐ１の選択的増加も興味深い（５０）。

本発明者らの結果は、ＲｖＤ６ｓｉがＴＧでＲｉｃｔｏｒ遺伝子発現を強力かつ選択的に誘導することを明らかにしている。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の調節因子として、ＲＩＣＴＯＲはｍＴＯＲＣ２の重要な構成要素であり、細胞の増殖および修復に明らかに関与している。これと一致して、ＲｉｃｔｏｒまたはｍＴＯＲＣ２の削除は、後根神経節損傷後のマウスの感覚軸索再生を阻害した（５１）。

結論として、本発明者らのデータは、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡ治療後に、損傷した角膜によって産生された新しいＲｖＤ６ｓｉが、角膜の創傷治癒および神経再生に必要であることを示している。この脂質メディエーターは、角膜からＴＧニューロンに伝達するシグナル伝達を活性化し、応答として、軸索の成長を促進し、神経障害性疼痛を軽減し、ドライアイの封じ込めを促進する特定の遺伝子シグネチャーを調節する。本発明者らの調査結果は、ドライアイ、角膜神経栄養性潰瘍、神経栄養性角膜炎、神経障害性疼痛などの角膜障害神経疾患にＲｖＤ６ｓｉを使用した組成物および方法を提供する。

動物
１０週齢の雄ＣＤ１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入し、Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡのＬｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｗ ＯｒｌｅａｎｓのＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅの動物管理施設で、３０ルクスで１２時間の暗／明サイクルで維持した。動物は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈのガイドラインに従って取り扱われ、実験プロトコルは、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｎｅｗ ＯｒｌｅａｎｓのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。

角膜の傷害および治療
ケタミン（２００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹腔内注射してマウスを麻酔し、傷害した右眼に塩酸プロパラカイン溶液（０．５％）を１滴塗布した。前述のように（１９、２９）、角膜の中心を２ｍｍのトレフィンで境界を定め、角膜さびリング除去具（Ａｌｇｅｒｂｒｕｓｈ ＩＩ；Ａｌｇｅｒ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．、Ｌａｇｏ Ｖｉｓｔａ，ＴＸ，ＵＳＡ）を使用して、手術顕微鏡下で上皮および前間質をゆっくり除去した。術後感染を防ぐために、０．３％のトブラマイシン点眼液（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）を１滴眼に塗布した。同じ研究者（Ｊ．Ｈ．）がすべての手術を行った。その後、各実験計画で説明されているように、１０μｌのＰＥＤＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＤＨＡ（５０ｎＭ）、またはＤＨＡ由来の脂質メディエーターを局所的に適用した。

脂質分析
５マイクロリットルの滅菌ＰＢＳをマウスの眼の結膜嚢に注入し、３０秒後、１ｇ／Ｌのブチル化ヒドロキシトルエンを含む１ｍＬの氷冷ＭｅＯＨに涙を採取し、２ｍｌのＣＨＣｌ_３、ならびに重水素標識脂質ＡＡ－ｄ８（５ｎｇ／μｌ）、ＰＧＤ２－ｄ４（１ｎｇ／μｌ）、ＥＰＡ－ｄ５（１ｎｇ／μｌ）、１５－ＨＥＴＥ－ｄ８（１ｎｇ／μｌ）、およびＬＴＢ４－ｄ４（１ｎｇ／μｌ）の内部標準混合物５μｌを添加した。サンプルを３０分間超音波処理し、－８０℃で一晩保存した。翌日、サンプルを遠心分離し、上澄みを回収し、ペレットを１ｍｌのＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ（２：１）で洗浄し、遠心分離した後、上澄みを合わせた。水、ｐＨ３．５を１：５の比率で上澄みに加え、ボルテックスし、遠心分離し、上相のｐＨを１Ｎ ＨＣｌで３．５～４．０に調整した。下相を回収し、Ｎ_２で乾燥させた後、１ｍｌのＭｅＯＨに再懸濁し、－８０℃で保存した。

角膜器官培養実験では、２ｍＬの培地を収集し、１４，０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離して細胞の破片を除去した。脂質は、ＢｌｉｇｈｔおよびＤｙｅｒの方法（５２）によって抽出した。簡単に説明すると、３．７５ｍｌのＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ（１：２）の混合物を、１ｍｌのサンプルおよび５μｌの重水素標識脂質の内部標準混合物に添加した。サンプルをボルテックスし、－８０℃で一晩保存した。次に、２相を作るために、２．５ｍｌのＣＨＣｌ_３を加えてボルテックスし、次に２．５ｍＬの水（ｐＨ３．５）を加えてボルテックスし、上相のｐＨを１Ｎ ＨＣｌで３．５～４．０に調整した。下相をＮ_２下で乾燥させ、１ｍｌのＭｅＯＨに再懸濁し、－８０℃で保存した。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、フロースルーニードルを備えたＡｃｑｕｉｔｙ Ｉクラス超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を備えたＸｅｖｏ ＴＱ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で実施した。説明したように（２５、５３）、サンプルをＮ_２で乾燥し、２０μｌのＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（２：１）に再懸濁し、ＣＯＲＴＥＣＳ Ｃ１８ ２．７μｍ ４．６×１００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒ、ＭＡ）に注入した。カラム温度を０．６ｍｌ／分のフローで４５℃に設定した。最初の移動相は、４５％溶媒Ａ（Ｈ_２Ｏ＋０．０１％酢酸）および５５％溶媒Ｂ（ＭｅＯＨ＋０．０１％酢酸）、次に、最初の１０分に向けて１５％溶媒Ａへの勾配、次いで１８分に向けて２％溶媒Ａへの勾配、２５分まで均一濃度で実行する２％溶媒Ａ、次に４５％溶媒Ａへ勾配を戻して３０分まで再平衡化、からなった。脂質標準（Ｃａｙｍａｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して、チューニングおよび最適化を行い、各化合物の検量線を作成した。ＲｖＤ６［４Ｓ、１７Ｓ－ジヒドロキシ－５Ｅ、７Ｚ、１０Ｚ、１３Ｚ、１５Ｅ、１９Ｚ－ドコサヘキサエン酸］標準物が提供された

マウスの涙および角膜からのレゾルビンＤ６ｓｉの産生
マウスの角膜（ｎ＝６０）を損傷し、ＰＥＤＦ＋ＤＨＡで４時間局所的に治療した。涙をＭｅＯＨに集め、－８０℃で保存した。２４時間後、マウスを安楽死させ、損傷した角膜を切り出し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中のＰＥＤＦ＋ＤＨＡで４時間培養した。培地を回収し、上記のように脂質を抽出した。プールされた涙および角膜培養培地からの脂質は、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒ，ＭＡ）を使用してＵＰＬＣ分離にかけた。注射後６～１２分に１２個の画分（３０秒／画分）を収集した。すべてのサンプルが分画されるまで、２５μｌのサンプル／ランでこの手順を少なくとも８回繰り返した。各画分をＮ２下で乾燥し、１ｍＬのＭｅＯＨに再懸濁した。各画分の１０μｌにＲｖＤ６ｓｉが存在することは、記載されているＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムを使用して確認した。高純度で高濃度のＲｖＤ６ｓｉを含む画分をプールし、インビボでの実験で必要になるまで－８０℃で保存した。

角膜創傷治癒
傷害および治療の２０時間後にマウスを安楽死させ、角膜を０．５％メチレンブルーで２０秒間染色し、次にＰＢＳで２分間洗浄した。写真は、付属のデジタルカメラ（ＤＸＭ １２００；Ｎｉｋｏｎ）を介して、解剖顕微鏡（ＳＭＺ １５００；Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で撮影された。創傷領域に対応する画像は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＣ ２０１４ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して定量化された。

角膜感受性の測定
非接触角膜知覚計は、角膜感覚閾値を決定するための標準的なＣｏｃｈｅｔ－Ｂｏｎｎｅｔ知覚計よりも信頼性の高い方法として説明されている（５４）。したがって、角膜感覚の測定には、Ｂｅｌｍｏｎｔｅの非接触角膜知覚計（５５）をいくつかの変更を加えて使用した。簡単に言うと、ある研究者がマウスを持って、角膜から３ｍｍの距離に空気出力針を置いた。別の研究者が空気流量を制御した。測定は毎分８０ｍｌの空気流量で開始し、マウスまばたきし始めるまで１０単位ずつ徐々に増加した。マウスがまばたきしたとき、空気流量が最終的な角膜感受性指数として記録された。

角膜神経分析
傷害および治療の１２日後、マウスを安楽死させ、眼を取り出し、Ｚａｍｂｏｎｉの固定液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｄｉ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、室温で４５分間固定した。次に、角膜を切り出し、さらに１５分間固定した後、ＰＢＳで３回洗浄した。非特異的結合をブロックするために、角膜を１０％正常ヤギ血清および０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＰＢＳで、室温で１時間インキュベートした。その後、角膜を一次抗体、ウサギモノクローナル抗ＰＧＰ９．５（１：５００）、（ａｂ１０８９８６；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）、およびラットモノクローナル抗サブスタンス－Ｐ（ＳＰ；１：１００）（ｓｃ－２１７１５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）で、室温で２４時間、絶えず振とうしながらインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、角膜を、対応する二次抗体であるヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８（１：１０００）およびヤギ抗ラットＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８（１：１０００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、４℃で２４時間インキュベートした。内皮側を上にしてスライドに平らに取り付けられ、蛍光顕微鏡（Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＤＰ８０；Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で検査された各角膜に、４つの放射状カットを行った。画像をマージして、角膜神経ネットワークの全体像を構築した。角膜神経密度は、前述のようにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＣ ２０１４（Ａｄｏｂｅ）を使用して測定した（２６、２９）。

三叉神経節ＲＮＡシーケンシング
傷害した眼側（ｎ＝５）に対応するＴＧを採取し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して氷上でホモジナイズするまではＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に保存した。ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を製造元の説明に従って使用して、全ｍＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの純度および濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定し、サンプルは使用するまで－８０℃で保存した。適合したＳｍａｒｔ－ｓｅｑ２プロトコルを使用してＲＮＡシーケンスを実行した（５６）。簡単に説明すると、１ｎｇの全ＲＮＡをＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０ＶＮおよびテンプレートスイッチングオリゴ（ＴＳＯ）プライマーで逆転写した。全ｃＤＮＡはＩＳＰＣＲプライマーを使用して増幅し、ライブラリーはＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して作成した。ライブラリーは同じモル濃度を使用してプールし、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ Ｋｉｔ ｖ２（７５サイクル、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してシーケンスした。デマルチプレックス処理後、Ｒ ｖ３．６．１用のＲＳｕｂｒｅａｄパッケージｖ１．３４．６を使用して、ＲＮＡ－ｓｅｑデータをＧＥＮＣＯＤＥ ＧＲＣｍ３８マウス一次ゲノムアセンブリ（リリースＭ２２、ｇｅｎｃｏｄｅｇｅｎｅｓ．ｏｒｇ／ｍｏｕｓｅ／）にアラインメントした（５７）。シーケンシングデータアラインメント用に出力されたＢＡＭファイルは、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ関数（Ｕｂｕｎｔｕ ＬＴＳ １６．４オペレーティングシステムの（Ｓｕｂｒｅａｄ ｖ１．６．５）を使用してカウントした（５８）。次に、生の計数データを、Ｒ用のＤＥＳｅｑ２パッケージを使用して差次的遺伝子発現分析に供した（５９）。調整されたｐ値は、誤検出率（ＦＤＲ）とみなした。ＲｖＤ６ｓｉ対ビヒクルとＲｖＤ６対ビヒクルとの間で大幅に変更された遺伝子（ＦＤＲ＜０．０５）は、Ｅｎｒｉｃｈｒ（６０）を使用した濃縮分析、およびＩＰＡ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ－ｐａｔｈｗａｙ－ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用した経路分析に供した。

統計分析
データは、３回以上の独立した実験の平均±ＳＤとして表される。データは、一元配置分散分析とそれに続く９５％信頼水準でのＴｕｋｅｙのHSD事後検定によって分析され、異なる群を比較し、ｐ＜０．０５の場合に有意であるとみなされた。すべての統計分析は、Ｓｔａｔａ １４（ＳｔａｔａＣｏｒｐ、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を使用して実行された。グラフは、Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＢｉｏ Ｖｉｎｃｉ（ＢｉｏＴｕｒｉｎｇ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して作成した。シーケンシングデータの場合、ＤＥ－Ｓｅｑ２分析ではマルチサンプル比較が提供されないため、ＤＥ－Ｓｅｑ２からの正規化されたカウントをＡＮＯＶＡ検定の入力として使用した。

アクセッション番号
この研究の結果を裏付ける完成したＲＮＡ－Ｓｅｑデータは、アクセッションコードＧＳＥ１３８６８５でＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓに寄託されている。

この実施例１で引用されている参考文献

実施例２
－次のような新しいＲｖＤ６異性体の発見：
－角膜の創傷治癒、感受性、および神経再生を促進する。
－三叉神経節ニューロンに戻る「有益な」シグナル伝達を刺激する。
－三叉神経節において、軸索の成長を修復し、神経障害性疼痛を軽減する遺伝子プログラムを誘発させる。
－このＲｖＤ６異性体は、神経栄養性角膜炎およびドライアイ様疼痛のための新しい治療法をもたらす。

同等物
当業者であれば、ルーチンの実験以上のものを使用せずに、本明細書に具体的に記載された特定の物質および手順に対する多数の同等物を認識するであろう、または確認できるであろう。そのような同等物は、本発明の範囲内であると考えられ、以下の請求項によってカバーされる。

Claims (11)

1. 角膜病変の治療を必要とする対象において角膜病変を治療する方法であって、治療有効量の以下：
   

   

   を含む組成物を、前記対象に経眼投与する段階を含む、方法。
2. 角膜病変からの角膜の保護を必要とする対象において角膜病変から角膜を保護する方法であって、治療有効量の式Ｉを含む組成物を、前記対象に経眼投与する段階を含む、方法。
3. 角膜病変の治癒の促進を必要とする対象において角膜病変の治癒を促進する方法であって、治療有効量の式Ｉを含む組成物を、前記対象に経眼投与する段階を含む、方法。
4. 角膜病変を治療する段階が、角膜神経密度を増加すること、角膜神経密度を回復すること、軸索成長を修復すること、Ｒｉｃｔｏｒを誘導すること、ＴＩＭＰ８遺伝子発現を誘導すること、創傷治癒、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記角膜病変が、ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、羞明、神経損傷、神経障害性疼痛、ドライアイ様疼痛、角膜神経栄養性潰瘍、外傷、角膜創傷、または神経栄養性角膜炎を含む、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記組成物が、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤が、局所投与に適している、請求項６に記載の方法。
8. 前記組成物が、局所投与用に製剤化される、請求項１、２または３に記載の方法。
9. 前記医薬組成物が、点眼薬として製剤化される、請求項６に記載の方法。
10. 前記組成物が、毎時、毎日、毎週、または毎月投与される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
11. 治療有効量が、約１０ｎｇ～約１０００ｎｇの量を含む、請求項１に記載の方法。

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