JP2023503963A - 淋菌感染症に対する免疫原性タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、とりわけ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたは淋菌または髄膜炎菌に関連する疾患及び病態の予防及び治療のためのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＮｅｉｓｓｅｒｉａ属のヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ）タンパク質（配列番号１）の免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態において、免疫原性断片は、タンパク質のＣ末端断片（配列番号２）に対応する。【選択図】図１７

Description

本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたは淋菌関連の疾患及び病態の予防及び治療のための免疫原性ペプチドに関する。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの多剤耐性株の継続的な出現は、淋病の性行為感染症の管理への主要な難題であり（１、２）、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（３）、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（４）、及びＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＡＭＲ）Ｓｔｒａｔｅｇｙ（５）は、早急な措置が必要とされる緊急の公衆衛生の脅威としてＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを優先した。世界中で毎年１億６００万を超える淋病の症例があることが推定され（６）、感染率は上昇している（例えば過去５年にわたって、米国において症例の６７％の増加（７）及びオーストラリアにおいて８０％の増加（８）があった）。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ感染症の転帰は、感染の部位及び性別によって変動し（９、１０中で概説される）、無症候性感染症及び局所症候性感染症が挙げられるが、未診断及び／または未治療で放置されたならば、淋病は、重篤な後遺症（骨盤内炎症性疾患、妊娠及び新生児の合併症、ならびに不妊症等）をもたらし得る。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによる感染症は、ＨＩＶを獲得及び伝染させるリスクも増加させる。

Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの高い有病率、それが引き起こし得る重篤な後遺症、及びその多剤耐性株の治療の困難さの増加に起因して、感染症を予防するワクチンの開発についての緊急の需要がある。しかしながら、淋菌ワクチンの開発には、様々な難題（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ表面構造の高レベルの相変異及び抗原変異、及び感染後の防御免疫がないという事実、すなわち前臨床ワクチン研究を導くための防御についての確立された相関現象がないことを意味することが挙げられる）がある（９、１１中で概説される）。

意外にも、本発明者らは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ナイセリア ゴノルホエアエ）からのＮｅｉｓｓｅｒｉａ（ナイセリア）属のヘパリン結合抗原（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ）（ＮＨＢＡ）タンパク質のＣ末端の断片の投与が、全長タンパク質よりも高いレベルで、特に比較的より低いＮＨＢＡ発現の淋菌株において、殺菌性且つオプソニン化貪食性殺傷を伴う抗体の産生を惹起することができることを見出した。

したがって、広義の形態において、本発明は、ＮＨＢＡタンパク質（配列番号１で示されるもの、または免疫原性であり、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたは淋菌に対する免疫応答を惹起し得る、その断片、バリアント、もしくは誘導体等）に関する。好ましい形態において、ＮＨＢＡタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むＣ末端の断片、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体である。

本発明の第１の態様は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ナイセリア ゴノルホエアエ）の単離されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ（ナイセリア）属のヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ）タンパク質の免疫原性断片を提供する。

好適には、単離されたＮＨＢＡタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。

特定の実施形態において、免疫原性断片は、単離されたＮＨＢＡタンパク質のＣ末端の断片（配列番号２で示されるそのアミノ酸配列、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体等）を含む。

好適には、配列番号２のバリアントまたは誘導体は、その残基３、５、６、９、２０、５０、５７、６０、６１、６９、７１、７５、７６、８３、８８、８９、９１、９２、９３、１１３、１３５、１５０、１５２、１５３、１６７、１７３、１７７、１８０、及び１８１のうちの１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。より詳細には、配列番号２の１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ３Ｖ、Ｉ５Ｍ、Ｐ６Ｌ、Ｐ９Ｓ、Ｇ２０Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ｒ５７Ｓ、Ｇ６０Ａ、Ｅ６１Ｋ、Ａ６９Ｖ、Ｔ７１Ａ、Ｎ７５Ｓ、Ｇ７６Ｒ、Ｍ８３Ｔ、Ｐ８８Ｓ、Ｙ８９Ｃ、Ｓ９１Ｔ、Ｇ９２Ｒ、Ｇ９３Ｓ、Ｓ１１３Ｇ、Ｔ１３５Ｎ、Ｇ１５０Ｄ、Ａ１５２Ｖ、Ｇ１５３Ｄ、Ａ１６７Ｔ、Ｇ１７３Ｓ、Ｇ１７７Ｄ、Ｄ１８０Ｅ、Ｒ１８１Ｑ、及びその任意の組み合わせからなる群から選択され得る。

いくつかの実施形態において、免疫原性断片は、単離されたＮＨＢＡタンパク質の１つもしくは複数のヘパリン結合残基及び／または１つもしくは複数の活性部位残基を含む。他の実施形態において、免疫原性断片は、単離されたＮＨＢＡタンパク質のヘパリン結合残基及び／または活性部位残基を含まない。

第２の態様において、本発明は、第１の態様に従う１つまたは複数の免疫原性断片を含む単離されたタンパク質に存する。

第３の態様において、本発明は、第１の態様の免疫原性断片もしくは第２の態様の単離されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれに相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸に関する。

第４の態様において、本発明は、第３の態様の単離された核酸を含む遺伝子コンストラクトを提供する。

第５の態様において、本発明は、第４の態様の遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞に存する。

第６の態様において、本発明は、第１の態様の単離された免疫原性断片または第２の態様の単離されたタンパク質を産生する方法であって、（ｉ）第５の態様の宿主細胞を培養すること；及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）において培養された前記宿主細胞から前記免疫原性断片またはタンパク質を単離すること、を含む、前記方法に関する。

第７の態様において、本発明は、第１の態様の免疫原性断片または第２の態様の単離されたタンパク質を結合するかまたはそれらに対して作製される抗体または抗体断片を提供する。

第８の態様において、本発明は、第１の態様の１つもしくは複数の免疫原性断片、第２の態様の単離されたタンパク質、第３の態様の単離された核酸、第４の態様の遺伝子コンストラクト、第５の態様の宿主細胞、及び／または第７の態様の抗体もしくは抗体断片を、任意選択で薬学的に許容される希釈物質、担体、または賦形剤と一緒に含む組成物に存する。

好適には、本組成物は、免疫原性組成物（ワクチン等）である。

第９の態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌への免疫応答を対象において惹起する方法であって、第１の態様の１つもしくは複数の免疫原性断片；第２の態様の単離されたタンパク質；第３の態様の単離された核酸；第４の態様の遺伝子コンストラクト；第５の態様の宿主細胞；第７の態様の抗体もしくは抗体断片；及び／または第８の態様の組成物；を対象へ投与して、それによって免疫応答を惹起するステップを含む、前記方法を提供する。

第１０の態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌に対する免疫を対象において誘導する方法であって、第１の態様の１つもしくは複数の免疫原性断片；第２の態様の単離されたタンパク質；第３の態様の単離された核酸；第４の態様の遺伝子コンストラクト；第５の態様の宿主細胞；第７の態様の抗体もしくは抗体断片；及び／または第８の態様の組成物；を対象へ投与して、それによってＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌に対する免疫を対象において誘導するステップを含む、前記方法に関する。

第１１の態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症を対象において治療または予防する方法であって、第１の態様の１つもしくは複数の免疫原性断片；第２の態様の単離されたタンパク質；第３の態様の単離された核酸；第４の態様の遺伝子コンストラクト；第５の態様の宿主細胞；第７の態様の抗体もしくは抗体断片；及び／または第８の態様の組成物；を対象へ投与して、それによってＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症を対象において予防または治療するステップを含む、前記方法に存する。

第１２の態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌が細胞へ結合することを対象において少なくとも部分的に阻害または予防する方法であって、第１の態様の１つもしくは複数の免疫原性断片；第２の態様の単離されたタンパク質；第３の態様の単離された核酸；第４の態様の遺伝子コンストラクト；第５の態様の宿主細胞；第７の態様の抗体もしくは抗体断片；及び／または第８の態様の組成物；を対象へ投与して、それによってＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌が対象の細胞へ結合することを阻害または予防するステップを含む、前記方法を提供する。

第１３の態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症の血清耐性を対象において少なくとも部分的に阻害または低減する方法であって、第１の態様の１つもしくは複数の免疫原性断片；第２の態様の単離されたタンパク質；第３の態様の単離された核酸；第４の態様の遺伝子コンストラクト；第５の態様の宿主細胞；第７の態様の抗体もしくは抗体断片；及び／または第８の態様の組成物；を対象へ投与して、それによってＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症の血清耐性を対象において阻害または低減するステップを含む、前記方法に存する。

第１４の態様において、本発明は、対象から得られた生物学的サンプル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを検出する方法であって、生物学的サンプルを第８の態様の抗体または抗体断片と接触させて、それによって生物学的サンプル中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び／またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを検出するステップを含む、前記方法を提供する。

第１５の態様において、本発明は、第１の態様の１つもしくは複数の免疫原性断片；第２の態様の単離されたタンパク質；第３の態様の単離された核酸；第４の態様の遺伝子コンストラクト；第５の態様の宿主細胞；第７の態様の抗体もしくは抗体断片；及び／または第８の態様の組成物；の使用であって、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌への免疫応答を対象において惹起すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌に対する免疫を対象において誘導すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症を対象において治療もしくは予防すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌が細胞へ結合することを対象において少なくとも部分的に阻害もしくは予防すること；及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症の血清耐性を対象において少なくとも部分的に阻害もしくは低減すること、のための医薬品の製造における、前記使用に関する。

第１６の態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌への免疫応答を対象において惹起すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌に対する免疫を対象において誘導すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症を対象において治療もしくは予防すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌が細胞へ結合することを対象において少なくとも部分的に阻害もしくは予防すること；及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症の血清耐性を対象において少なくとも部分的に阻害もしくは低減すること、のための使用のための、またはそれらのために使用される場合の、第１の態様の１つもしくは複数の免疫原性断片；第２の態様の単離されたタンパク質；第３の態様の単離された核酸；第４の態様の遺伝子コンストラクト；第５の態様の宿主細胞；第７の態様の抗体もしくは抗体断片；及び／または第８の態様の組成物に存する。

好ましくは、前述の態様の対象は、ヒトである。

本明細書において使用される時、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、単数または複数の要素または特色を指すかまたは網羅するように本明細書において使用され、「１つの」または「単一の」要素または特色を意味するかまたは定義するものとして見なされるべきではない。

文脈が別段要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、または類似する用語は、要素または特色の列挙されたリストが、それらの明示されたかまたはリストされた要素を単に含むだけでなく、リストされないかまたは明示されない他の要素または特色を含み得るように、非排他的な包含を意味することが意図される。

アミノ酸配列（免疫原性断片等）の文脈における「～から本質的になること」によって、Ｎ末端またはＣ末端で追加の１、２、または３のアミノ酸と一緒に列挙されるアミノ酸配列が意味される。

淋菌ＮＨＢＡの概要。（ａ）シグナルペプチド領域（白抜きボックス）及びアルギニンリッチ領域（Ａｒｇ；灰色ボックス）を示す、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１からのＮＨＢＡタンパク質の概略図。研究において使用される組み換えタンパク質である、成熟ＮＨＢＡ（ＮＨＢＡ；予測されるシグナルペプチドを欠如する）及びＮＨＢＡのＣ末端の断片（ＮＨＢＡ－ｃ）も示す。（ｂ）Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの１４の主要なＮＨＢＡバリアントのアミノ酸配列のアライメントであり、すべてのバリアント間で同一のアミノ酸を暗灰色垂直線として示し大部分のバリアント間で保存されたアミノ酸を薄灰色として示し、ミスマッチまたはギャップを白色として示した。ＮＨＢＡペプチド数を左側に及びこのバリアントを含有するＰｕｂＭＬＳＴ中の単離体の％を右側に示す。（ｃ）１４の主要なＮＨＢＡバリアントの近隣結合系統樹。この研究において使用される株において存在する４つのＮＨＢＡバリアントに下線を引く。（ｄ）この研究において使用される株において存在する４つのＮＨＢＡバリアントのアミノ酸アライメント。コンセンサス配列（一番下の行で示す）への一致を、ドットによって示す。アルギニンリッチ領域を破線によって示し、ＮＨＢＡ－ｃ断片を線によって示す。 淋菌株のパネルにおけるＮＨＢＡの発現。（ａ）Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）株、ｎｈｂａ：：ｋａｎ突然変異（ΔＮＨＢＡ）株、及び補完された（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）株、ならびに（ｂ）ＳＢＡアッセイ及びＯＰＡアッセイにおいて使用される淋菌株におけるＮＨＢＡ発現のウエスタンブロット分析。使用される血清をブロットの下に示す。 断片沈着によって測定されるＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ上での抗体結合及び補体活性化。ＮＨＢＡ－ＦｒｅｕｎｄまたはＮＨＢＡ－ｃ－Ｆｒｅｕｎｄのいずれかにより免疫されたマウスからの（ａ）ポリクローナル抗血清または（ｂ）精製されたＩｇＧの存在下における、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１の表面上での抗体結合及び抗体媒介性Ｃ３断片沈着のフローサイトメトリー。値は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ細胞及びＣ３断片沈着へ結合する抗体の幾何平均蛍光を表わす。二次抗体のみ（－ｖｅ）、免疫前マウス血清（ＰＩ）、及び補体のみ（Ｃ）の対照が含まれる。 Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対するＮＨＢＡ抗血清の機能的ブロッキング活性。（ａ）α－ＮＨＢＡ抗体によるＮＨＢＡ－ヘパリン相互作用のブロッキング。ＮＨＢＡ－ヘパリン相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を、血清の非存在下（０；白色）、または免疫前血清（ＰＩ；薄灰色）、α－ＮＨＢＡ血清（中間の灰色）、またはα－ＮＨＢＡ－ｃ血清（暗灰色）の存在下において遂行した。データは、抗体の非存在下における結合パーセンテージ（抗体無し対照（白色）を１００％で設定した）として、三重のサンプルについての平均ＮＨＢＡ－ヘパリン結合（＋／－１標準偏差）を表わす。（ｂ～ｃ）Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの上皮細胞への接着のブロッキング。α－ＮＨＢＡ血清及びα－ＮＨＢＡ－ｃ血清処理の淋菌は、無処理対照（０；白色）に比べて、すべての試験された濃度で、（ｂ）子宮頸管上皮細胞及び（ｃ）尿道上皮細胞への接着を有意に低減した（ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を使用して計算した）。免疫前血清（ＰＩ、薄灰色）は細菌接着に影響しなかった（ｐ＞０．０５）。結果を、抗体無し対照に比べた、三重の血清処理サンプルからの接着細菌の平均パーセンテージとして示す（１００％で設定した抗体無し対照についての結果は、子宮頸管細胞及び尿道細胞について、それぞれ４．３３±０．３１×１０^３及び１．３７±０．０６１×１０^３接着ＣＦＵである）。エラーバーは、±１標準偏差を表わす。実験を三重のサンプルにより２回遂行し、代表的な結果を示す。 Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおけるＮＨＢＡの発現。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）株、ｎｈｂａ：：ｋａｎ突然変異（ΔＮＨＢＡ）株、及び補完された（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）株の全細胞溶解物の（Ａ）クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び（Ｂ）ウエスタンブロット分析であり、ブロットの下に示されるα－ＮＨＢＡ抗体によりプロービングした。図２Ａ中で示されるウエスタンブロットの領域を、四角で囲う。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株のパネルの全細胞溶解物の（Ｃ）クマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び（Ｄ）ウエスタンブロット分析。図２Ｂ中で示されるウエスタンブロットの領域を、四角で囲う。 ＮＨＢＡ－ヘパリン相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。免疫前血清（ヘパリン及びＰＩ）、血清無し（ヘパリン）、またはα－ＮＨＢＡ－Ｆｒｅｕｎｄの免疫後血清（ヘパリン及びα－ＮＨＢＡ）の存在下における、組み換えＮＨＢＡのヘパリンへの結合のＳＰＲ分析の代表的なセンサーグラム。応答単位は、経時的なセンサーチップ上の質量変化に起因して産生された任意単位である。時間は秒である。 ＮＨＢＡ配列の特色及び発現。（Ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（Ｎｇ）株１２９１ ＮＨＢＡタンパク質及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｎｍ）株ＭＣ５８ ＮＨＢＡタンパク質の概略図を示し、Ｎ末端で示されるリポボックスモチーフ（灰色ボックス）及びグリシンストレッチ（黒色ボックス）、ならびにＮＨＢＡの中央部中で示されるアルギニンリッチ領域（白色ボックス）がある。各々のタンパク質のアミノ酸（ａａ）長を右側に示す。（Ｂ）Ｎｇ ＮＨＢＡタンパク質及びＮｍ ＮＨＢＡタンパク質を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ中でＣｌｕｓｔａｌＷを使用してアライメントさせ、同一アミノ酸を暗灰色垂直線として示し、ミスマッチを薄灰色線として示し、ギャップを白色として示す。Ｎｇ ＮＨＢＡタンパク質及びＮｍ ＮＨＢＡタンパク質中のアルギニンリッチ領域（四角で囲った）及びその隣接配列のアミノ酸配列を示し、同一アミノ酸を灰色に影を付け、ミスマッチを白色で示す。Ａｒｇリッチ領域の上流の髄膜炎菌のＮａｌＰ、ならびにヒトのラクトフェリン（ｈＬｆ）、カリクレイン（ｈＫｌ）、及びＣ３転換酵素の切断部位を示す。（Ｃ）３７℃で増殖させたＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）株、ＮＨＢＡノックアウト（ΔＮＨＢＡ）株、及び補完された（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）株の全細胞の溶解物の、ポリクローナル抗ＮＨＢＡ抗体を使用したウエスタンブロット。３２℃ ｖｓ ３７℃で増殖させたＷＴにおけるＮＨＢＡ発現のアップレギュレーションも示す。ペリプラズムタンパク質ＮＧＡＧ＿０１２２８を、ローディング対照として示す。（Ｄ）３２℃及び３７℃で増殖させたＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＷＴ株、ΔＮＨＢＡ株、及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株の全細胞のフローサイトメトリーを行い、ポリクローナル抗ＮＨＢＡ抗体を使用して細胞表面上のＮＨＢＡの発現を確認した。陰性（－ｖｅ）対照は、二次抗体のみによるＷＴである。値は、幾何平均蛍光を表わす。 淋菌ＮＨＢＡは、細胞凝集に関与する。（Ａ）６００ｎｍの光学的密度で測定した吸光度による、ＧＣブロス中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）株、ＮＨＢＡノックアウト（ΔＮＨＢＡ）株、及び補完された（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）株の増殖曲線及び沈降曲線。（Ｂ）トリプシン処理の前後の、ＯＤ_６００が１の培養物の１ｍＬあたりのＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅコロニー形成単位（ＣＦＵ）。ＷＴ株及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株のカウント可能なＣＦＵは、トリプシン処理後にそれぞれ２．６倍及び２．４倍増加した（ｐ＝８．１×１０^－５及び５．１×１０^－４）が、ΔＮＨＢＡのＣＦＵは影響されなかった（ｐ＝０．３１）。Ａ及びＢについて、ＷＴに比べて、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｃ）全細胞Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（Ｎｇ）への組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇ結合のフローサイトメトリーによる分析（黒色、Ｎｇのみ；白色、Ｎｇ＋標識ＮＨＢＡ_Ｎｇ）。（Ｄ）Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅへのＮＨＢＡ_Ｎｇの結合を示す全細胞ＥＬＩＳＡタイトレーション曲線（黒色線）。抗体のみの対照曲線（点線）は、全細胞Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅとＨｉｓタグ抗体との間の非特異的相互作用が存在しないことを示す。 淋菌ＮＨＢＡは、ミクロコロニー形成に関与する。スライドガラス（上部パネル）、またはスライドグラス上のヒト尿道上皮細胞単層（下部パネル）上で５時間増殖させた、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）株、ＮＨＢＡノックアウト（ΔＮＨＢＡ）株、及び補完された（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）株の走査電子顕微鏡法。ＷＴ株及びΔＮＨＢＡ＿Ｃの株については、凝集体及びミクロコロニーを観察することができるが、ΔＮＨＢＡ株は、単一コロニーまたは双球菌として観察される。画像を倍率５，０００で捕捉した。各々のボックスの下部のスケールバーは５μｍを表わす。 淋菌ＮＨＢＡは、複数のグリカンへ高親和性で結合する。（Ａ）グリコシルアミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）（ＧＡＧ）及び（Ｂ）非ＧＡＧグリカンへのＮＨＢＡ_Ｎｇの結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。各々のグリカンの名称、構造、及び硫酸化パターン（Ｓ）を、各々のグリカンへ結合するＮＨＢＡ_Ｎｇの解離定数（Ｋ_Ｄ）と一緒に示す。^＊ＮＨＢＡ_Ｎｍ相互作用［１４］のＫ_Ｄも示して、比較を可能にする。ＮＨＢＡ_Ｎｍは、β－Ｇｌｃ６Ｐへのより高い親和性を有する（Ｋ_Ｄ０．０５６＋／－０．０２５μＭ）。ＮＢ、濃度依存的結合は無い。 淋菌組み換えＮＨＢＡは、上皮細胞へ結合する。（Ａ）子宮頸管上皮細胞（ｔＣＸ）へのＮＨＢＡ_Ｎｇの結合を、４０×拡大下で捕捉した共焦点蛍光画像。細胞の（Ｉ）拡張焦点及び（ＩＩ）ｘｙｚ横断面。（ＩＩＩ）抗体のみで処理した細胞（組み換えＮＨＢＡ無し）ならびに（ＩＶ）ＮＨＢＡ_Ｎｇ及び二次抗体により処理した細胞の対照画像。白色矢印は、細胞表面上に局在するタンパク質を示す。（Ｂ）ヒトの子宮頸管上皮細胞（ｔＣＸ）及び尿道上皮細胞（ｔＵＥＣ）への組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇの結合のフローサイトメトリーによる分析。 淋菌ＮＨＢＡは、ヒト血清中での生存及びヒト上皮細胞への接着に寄与する。（Ａ）１０％（ｖ／ｖ）の正常ヒト血清中での６０分後の、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）株、ＮＨＢＡノックアウト（ΔＮＨＢＡ）株、及び補完された（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）株の生存。データは、接種物のパーセンテージとして三重のサンプルについての平均パーセント生存を表わし、ＷＴに比べて示される（１００％で設定した野生型についての結果は、５．５×１０^４コロニー形成単位（ＣＦＵ）である）。ヘパリンの非存在または存在下における血清中でのＷＴの生存間で有意差はなかった。（Ｂ）Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）株、ＮＨＢＡ_Ｎｇノックアウト（ΔＮＨＢＡ）株、及び補完された（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）株による、ヒト子宮頸管（ｔＣＸ）上皮細胞及びヒト尿道（ｔＵＥＣ）上皮細胞へのＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの接着。（Ｃ）無処理（処理無し）の、または組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇ（１～１００μｇ／ｍｌ）もしくは陰性対照（１００μｇ／ｍｌ）としてのＰＮＡにより前処理したｔＣＸ細胞との、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）の接着。データは、接種物のパーセンテージとして三重のサンプルについての平均パーセント接着または浸潤を表わし、ＷＴに比べて示される（１００％で設定したＷＴについての結果は、（Ｂ）１．１×１０^５（ｔＣＸ）及び１．７×１０^５（ｔＵＥＣ）であり、（Ｃ）６．５×１０^４接着ＣＦＵである）。エラーバーは、＋／－１標準偏差を表わす。Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を使用して、無処理ＷＴに比べて、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。実験を少なくとも３度遂行し、代表的な結果を示す。 淋菌ＮＨＢＡの保存。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（Ｎｇ）の８つの最も一般的なＮＨＢＡバリアントのアライメントを、一番上のコンセンサス配列と共に示す。株ＭＣ５８からのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｎｍ）ＮＨＢＡ配列も含まれる（ＮＨＢＡ－３）。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおけるＮＨＢＡの発現。（Ａ）Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）株、ｎｈｂａ：：ｋａｎ突然変異（ΔＮＨＢＡ）株、及び補完された（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）株の全細胞溶解物のクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析であり、α－ＮＨＢＡ抗体及びα－ＮＧＡＧ０１２２８抗体によりプロービングした。図１Ｃ中で示されるウエスタンブロットの領域を、四角で囲う。（Ｂ）Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１ ＷＴ株、ＮＨＢＡ株、及びＮＨＢＡ＿Ｃ株のピリン調製物のクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析であり、α－Ｃ３１１ピリン抗体によりプロービングした。（Ｃ）Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１ ＷＴ株、ＮＨＢＡ株、及びＮＨＢＡ＿Ｃ株のサルコシル外膜タンパク質（ＯＭＰ）調製物のクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥであり、不透明（ｏｐａｃｉｔｙ）（Ｏｐａ）タンパク質及びポリン（Ｐｏｒ）タンパク質を含む主要なＯＭＰを示す。（Ｄ）Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１ ＷＴ株、ΔＮＨＢＡ株、及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株のリポオリゴ糖（ＬＯＳ）調製物の銀染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。（Ｅ）３２℃及び３７℃で増殖させた、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）の全細胞溶解物のクマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析であり、α－ＮＨＢＡによりプロービングした。図１Ｃ中で示されるウエスタンブロットの領域を、四角で囲う。（Ｆ）３２℃及び３７℃で増殖させたＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＷＴ株、ΔＮＨＢＡ株、及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株の全細胞のα－ＮＨＢＡによるフローサイトメトリー。陰性（－ｖｅ）対照は、二次抗体のみによるＷＴである。値は、幾何平均蛍光を表わす。 淋菌ＮＨＢＡは、細胞凝集に関与する。（Ａ）トリプシン（「－」；上部パネル）無しまたはトリプシン処理有り（「＋」；下部パネル）のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）株、ｎｈｂａ：：ｋａｎ突然変異（ΔＮＨＢＡ）株、及び補完された（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）株のグラム染色。（Ｂ）α－ＮＨＢＡ及びペリプラズムタンパク質ＮＧＡＧ＿０１２２８への抗体によりプロービングされた、トリプシン無処理（－）及びトリプシン処理（＋）の全細胞Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１ ＷＴのウエスタンブロット分析。 Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによるグリカン結合。ヒートマップは、アレイ上のグリカンへの全細胞のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１による結合（黒色バー）を示す（３つの独立した実験からの結果の平均）。グリカンは、それぞれの末端糖に基づいてクラスへとクラスター化される。各々のクラス内の結合されたグリカンの数及びパーセンテージを示す。グリカン結合の完全なデータセットを、表４中で示す。 Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１のＮＨＢＡタンパク質の全長（上部パネル）（配列番号１）及びＣ末端の断片（下部パネル）（配列番号２）のアミノ酸配列。 ４１のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＮＨＢＡバリアントの配列番号２のＣ末端の免疫原性断片のコンセンサス配列についてのアミノ酸配列変動。 （上記の通り。） ＮＨＢＡの免疫原性。精製された組み換えＮＨＢＡに対してＮＨＢＡ－ｃ－ＦｒｅｕｎｄまたはＮＨＢＡ－ｃ－Ａｌｕｍのいずれかと共に免疫された各々のマウスからの免疫後血清のＥＬＩＳＡ力価。５匹のマウスの各々についての力価をシンボルにより示し、幾何平均力価（ＧＭＴ）をバーにより示す。 抗ＮＨＢＡの抗体の、血清殺菌活性（ａ、ｃ）及びオプソニン化貪食活性（ｂ）。（ａ、ｃ）抗ＮＨＢＡの血清の血清殺菌活性（ＳＢＡ）。補体の供給源としての正常ヒト血清及び熱非動化マウス血清の２倍の希釈物の存在下におけるＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１の生存を示す。血清は、以下のいずれかである。（ａ）血清無し（０）及び免疫前（ＰＩ）対照血清に比較した、抗ＮＨＢＡ－ｃ血清＋アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄまたはａｌｕｍ）。「補体無し」対照（ＮＣ）も示される（マウス血清のみの１／１００希釈物によりインキュベーションした細菌）；または（ｃ）ＮＨＢＡ－ｃ－ａｌｕｍ血清からの精製された抗ＮＨＢＡの抗体。（ｂ）抗ＮＨＢＡ血清のオプソニン化貪食活性（ＯＰＡ）。ヒト多形核白血球（ＰＭＮ）、正常ヒト血清、及びマウス血清の存在下におけるＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１の生存を、上記の（ａ）におけるように示す。「補体無し」対照（ＮＣ）（マウス血清のみの１／４００希釈物によりインキュベーションした細菌）そして「ＰＭＮのみ」対照（ＰＭＮ）（ＰＭＮは有るがマウス血清無し及び補体無しでインキュベーションした細菌）を示す。ａ～ｃについて、データは、無処理野生型株（０）により得られた結果に比べた、三重のサンプルについての平均生存を表わす（１００％で設定した無処理野生型は、ａ～ｃについて、それぞれ２．５×１０^３、１．６×１０^３、及び３．５×１０^３コロニー形成単位を表わす）。エラーバーは、±１標準偏差を表わす。Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を使用して、血清無し（０）無処理野生型に比べて、生存を比較した。^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ≦０．０１、^＊＊＊、ｐ≦０．００１。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ；ｐ＜０．０００１）及びＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定（無処理野生型対照群（０）ｖｓ ６、２５、または１２．５についてｐ＞０．９；０ ｖｓ ２５、５０、または１００μｇ／ｍＬについてｐ≦０．０００１）を使用して、（ｃ）についても統計分析を遂行した。 ヒト血清中でのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの生存。０～１０％（体積／体積）のヒト血清中での３０分後のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１野生型（ＷＴ）株及びＮＨＢＡノックアウト（ΔＮＨＢＡ）株の生存を示す。試験されたヒト血清は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにより前吸収して、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅと交差反応する任意の抗体を除去した正常ヒト血清である。この枯渇させた血清を、血清殺菌活性（ＳＢＡ）及びオプソニン化貪食性殺傷（ＯＰＡ）アッセイにおける補体供給源として使用する。データは、無処理株（０）により得られた結果に比べた、三重のサンプルについての平均生存を表わす（１００％で設定した無処理ＷＴは、２．８×１０^３コロニー形成単位（ＣＦＵ）を表わし；１００％で設定した無処理ΔＮＨＢＡは、２．５×１０^３ＣＦＵを表わす）。実験を３回遂行し、代表的な結果を示す。Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を使用して、無処理対照に比べて、生存を比較した。^＊＊＊、ｐ≦０．００１。無処理（０）対照に比べて、試験した％血清中でのＷＴの生存に有意差はなかった。 抗ＮＨＢＡ血清の血清殺菌活性（ＳＢＡ）。補体の供給源としての正常ヒト血清及び熱非動化マウス血清の２倍の希釈物の存在下におけるＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１の生存を示す。血清は、抗ＮＨＢＡ－ｃ血清＋Ａｌｕｍ、または抗ＮＨＢＡ抗体を枯渇させた抗ＮＨＢＡ－ｃ血清＋Ａｌｕｍのいずれかである。データは、無処理野生型株（０）により得られた結果に比べた、三重のサンプルについての平均生存を表わす（１００％で設定した無処理野生型は、３．３×１０^３コロニー形成単位を表わす）。エラーバーは、±１標準偏差を表わす。Ｓｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を使用して、白色（０）で示される無処理野生型に比べて、生存を比較した。^＊、Ｐ＜０．０５、^＊＊＊、Ｐ≦０．００１。

本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからのＮＨＢＡのＣ末端断片が淋菌に対する実質的に改善された免疫原性を実証するという解明に少なくとも部分的に基づく。ＮＨＢＡタンパク質断片による免疫は、殺菌性且つオプソニン化貪食性であり、粘膜上皮細胞への淋菌の接着を阻害し得る抗体を惹起し得る。

本発明の広義の態様は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの単離されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ属のヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ）タンパク質の免疫原性断片（配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含むもの等）に関する。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（淋菌（複数可）としても公知である）は、性行為による泌尿生殖器感染性淋病、そして他の淋菌関連の疾患、障害、及び病態（咽頭淋病、直腸淋、播種性淋菌敗血症、淋菌性敗血症性関節炎、及び新生児淋菌性結膜炎が挙げられる）を引き起こすプロテオバクテリアの１つのタイプである。概して本明細書において使用される時、「Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ」は、当業者によって同定可能なＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのすべての株及び血清型を包含し、本明細書において記載されるものを包含する。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、異なる株の遺伝学的バリアントも包含する。標的生物がＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅかどうかを、当技術分野において公知の複数の方法によって決定することができ、当該方法としては、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅについてＣｈａｋｒａｖｏｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）（参照することによって本明細書に援用される）中で記載される、１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の配列決定が挙げられる。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属のヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ、以前はＧＮＡ２１３２と呼ばれた）は、４ＣＭｅｎＢの構成要素であり、ＮＨＢＡ－ＧＮＡ１０３０融合タンパク質として存在する（１４）。髄膜炎菌ＮＨＢＡ（ＮＨＢＡ_Ｎｍ）は表面に曝露されたリポタンパク質であり、内因的に無秩序で折り畳まれていないと予測される、Ｎ末端領域（残基２００～２５０まで）（１５）、グリカン（ヘパリン、ヘパリン硫酸、及びコンドロイチン硫酸が挙げられる）を結合する、中央のアルギニンリッチ領域（１６～１８）、及び逆平行β－バレルとして折り畳まれる、Ｃ末端領域（１５、１９、２０）の３つの領域からなる。ＮＨＢＡ_Ｎｍは比較的良好に保存されているが、Ｎ末端領域は異なる髄膜炎菌株間で複数の挿入／欠失を含有する（１５）。ＮＨＢＡ_Ｎｍは、多様なＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に対する血清殺菌抗体を誘導し（１７、２１、２２）、これらの抗体はオプソニン化貪食でもあり（２３、２４）、上皮細胞へのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの接着をブロックすることが可能である（１８）。ＮＨＢＡの淋菌ホモログ（ＮＨＢＡ_Ｎｇ）は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株間で高度に保存され（＞９３％の同一性）、４ＣＭｅｎＢ中にあるＮＨＢＡ－２ペプチドバリアントへ６７％の同一性を共有する（１３、２５）。本発明者らは、ＮＨＢＡ_Ｎｇが表面に曝露され、４ＣＭｅｎＢのワクチン接種した人々からの抗体によって認識されることを最近示した（１３）。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＮＨＢＡタンパク質の一例が、配列番号１で示される。

本発明の目的のために、「単離された」によって、その天然状態から取り出されたか、またはさもなければ人間の操作が行われた材料が意味される。単離された材料は、天然状態において通常は当該材料に随伴する構成要素が実質的にもしくは本質的に不含有であり得るか、または天然状態において通常は当該材料に随伴する構成要素と一緒に人工的状態であるように操作され得る。単離された材料は、ネイティブ形態、化学合成形態、または組み換え形態であり得る。

「タンパク質」によって、アミノ酸ポリマーが意味される。当技術分野において良く理解されるように、アミノ酸は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸、Ｄ－アミノ酸またはＬ－アミノ酸であり得る。

「タンパク質」という用語は、５０以下のアミノ酸を有するタンパク質を記載するために典型的に使用される「ペプチド」及び５０を超えるアミノ酸を有するタンパク質を記載するために典型的に使用される「ポリペプチド」）を包含及び網羅する。

「断片」は、タンパク質のアミノ酸配列の１００％未満を構成する、タンパク質のセグメント、ドメイン、一部分、または領域である。

概して、断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、４００、または４２５アミノ酸までのアミノ酸配列（配列番号１で示される全長ＮＨＢＡタンパク質等）を含み得る。

特定の実施形態において、単離されたＮＨＢＡタンパク質の免疫原性断片は、１０～２５０アミノ酸、より好ましくは１５～１９０アミノ酸、及びさらにより好ましくは２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、または１８５アミノ酸までの単離されたＮＨＢＡタンパク質（配列番号１または配列番号２で示されるもの等）を含むか、または当該タンパク質からなる。

ある特定の実施形態において、免疫原性断片は、単離されたＮＨＢＡタンパク質のＣ末端断片を含む。本明細書において使用される時、ＮＨＢＡタンパク質に適用される「Ｃ末端断片」という用語は、ＮＨＢＡタンパク質のＣ末端ドメイン中に所在するか、または当該ドメイン内に含有される、通常少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、または２１０の連続または一続きのアミノ酸を含み得る。

特定の一実施形態において、免疫原性断片は、ＮＨＢＡの細胞外ドメインまたは細胞外に曝露されたドメインを本質的に含む、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むか、当該配列からなるか、当該配列から本質的になるか、または当該配列内に含有される。

別の実施形態において、免疫原性断片は、単離されたＮＨＢＡタンパク質の１つもしくは複数のグリカン結合残基もしくはヘパリン結合残基及び／または１つもしくは複数の活性部位残基を含む。

したがって、免疫原性断片は、配列番号２に対応し配列番号１の断片を構成する、ＮＨＢＡタンパク質の細胞外ドメインまたは細胞外に曝露されたドメインのうちのいくつかまたはすべてを含み得るか、あるいは、免疫原性断片は、そのグリカン結合残基及び／または活性部位残基のうちの少なくとも１つを含むこの細胞外ドメイン配列または細胞外に曝露されたドメイン配列の断片を含み得る。

本発明の文脈において、「免疫原性である」という用語は、本明細書において使用される時、動物へのタンパク質の投与に際して、タンパク質が免疫応答（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはその分子構成要素へのもの等）を生成または惹起する能力または可能性を示す。免疫応答は、Ｂリンパ球媒介性もしくはＴリンパ球媒介性、またはその組み合わせのいずれかであり得ることが想定される。有利には、「免疫原性である」によって、Ｂリンパ球応答を惹起することが可能であることが意味されるが、これに限定されない。「免疫原性である」は、中和抗体応答を惹起することが可能であることも意味する。

「免疫応答を惹起する」によって、細胞性免疫系、抗体、及び／または自然免疫系を包含する免疫系の１つまたは複数の要素の産生または活性を生成または刺激することが意味される。好適には、免疫系の１つまたは複数の要素としては、Ｂリンパ球、抗体、及び好中球が挙げられる。一実施形態において、免疫応答は、粘膜免疫応答である。

本明細書において使用される時、タンパク質「バリアント」は、参照アミノ酸配列と、定義可能なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の関係性を共有する。例えば参照アミノ酸配列は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列であり得る。「バリアント」タンパク質は、異なるアミノ酸によって、参照アミノ酸配列の１つまたは複数のアミノ酸を欠失または置換され得る。いくつかのアミノ酸が、免疫原性の断片及び／またはタンパク質の活性を変化させずに、置換または欠失され得ることは、当技術分野において良く理解される（保存的置換）。したがって、配列番号１または配列番号２の他の残基のうちの１つまたは複数は、バリアントが配列番号１または配列番号２の免疫原性を実質的に保持するように、保存的に修飾され得る（例えばアミノ酸の置換または欠失によって）。好ましくは、タンパク質バリアントは、少なくとも７０％もしくは７５％、好ましくは少なくとも８０％もしくは８５％、またはより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を、参照アミノ酸配列（配列番号１または配列番号２等）と共有する。

「野生型」または「非修飾」のＮＨＢＡタンパク質断片配列（配列番号１または配列番号２のもの等）の修飾が、免疫原性断片の免疫原性を実質的に改善または促進し得ることも意図される。一例として、免疫原性断片は、特定のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株のＮＨＢＡタンパク質配列へ実質的に一致または対応し、それによって、前記株（本明細書において記載されるもの等）への免疫原性断片の免疫原性を改善するように、修飾され得る。したがって、「バリアント」という用語は、本明細書において開示されるか、天然に存在する（例えば対立遺伝子の）バリアント、オルソログ（例えばＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ以外の種（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ等）からの）、及び合成バリアント（突然変異誘発技法を使用してインビトロで産生されたもの等）から産生されるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質またはその断片も包含する。典型的には、修飾は、ＮＨＢＡタンパク質断片の１つまたは複数のアミノ酸の置換を包含する。

バリアントは、対応する野生型タンパク質の生物学的活性を保持し得るか（例えば対立遺伝子バリアントまたは株バリアント、パラログ、及びオルソログ（図１８中で記載されるもの等））、または対応する野生型タンパク質に比較して、生物学的活性を欠如し得るか、もしくは実質的に低減した当該生物学的活性を有し得る。

好適には、免疫原性断片は、配列番号２の残基３、５、６、９、２０、５０、５７、６０、６１、６９、７１、７５、７６、８３、８８、８９、９１、９２、９３、１１３、１３５、１５０、１５２、１５３、１６７、１７３、１７７、１８０、及び１８１のうちの１つまたは複数のアミノ酸置換、または図１８中で示されるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号２の、残基３でのバリン（Ｖ）アミノ酸（Ａ３Ｖ）；残基５でのメチオニン（Ｍ）アミノ酸（Ｉ５Ｍ）；残基６でのロイシン（Ｌ）アミノ酸（Ｐ６Ｌ）；残基９でのセリン（Ｓ）アミノ酸（Ｐ９Ｓ）；残基２０でのグルタミン酸（Ｅ）アミノ酸（Ｇ２０Ｅ）；残基５０でのセリン（Ｓ）アミノ酸（Ｐ５０Ｓ）；残基５７でのセリン（Ｓ）アミノ酸（Ｒ５７Ｓ）；残基６０でのアラニン（Ａ）アミノ酸（Ｇ６０Ａ）；残基６１でのリジン（Ｋ）アミノ酸（Ｅ６１Ｋ）；残基６９でのバリン（Ｖ）アミノ酸（Ａ６９Ｖ）；残基７１でのアラニン（Ａ）アミノ酸（Ｔ７１Ａ）；残基７５でのセリン（Ｓ）アミノ酸（Ｎ７５Ｓ）；残基７６でのアルギニン（Ｒ）アミノ酸（Ｇ７６Ｒ）；残基８３でのスレオニン（Ｔ）アミノ酸（Ｍ８３Ｔ）；残基８８でのセリン（Ｓ）アミノ酸（Ｐ８８Ｓ）；残基８９でのシステイン（Ｃ）アミノ酸（Ｙ８９Ｃ）；残基９１でのスレオニン（Ｔ）アミノ酸（Ｓ９１Ｔ）；残基９２でのアルギニン（Ｒ）アミノ酸（Ｇ９２Ｒ）；残基９３でのセリン（Ｓ）アミノ酸（Ｇ９３Ｓ）；残基１１３でのグリシン（Ｇ）アミノ酸（Ｓ１１３Ｇ）；残基１３５でのアスパラギン（Ｎ）アミノ酸（Ｔ１３５Ｎ）；残基１５０でのアスパラギン酸（Ｄ）アミノ酸（Ｇ１５０Ｄ）；残基１５２でのバリン（Ｖ）アミノ酸（Ａ１５２Ｖ）；残基１５３でのアスパラギン酸（Ｄ）アミノ酸（Ｇ１５３Ｄ）；残基１６７でのスレオニン（Ｔ）アミノ酸（Ａ１６７Ｔ）；残基１７３でのセリン（Ｓ）アミノ酸（Ｇ１７３Ｓ）；残基１７７でのアスパラギン酸（Ｄ）アミノ酸（Ｇ１７７Ｄ）；残基１８０でのグルタミン酸（Ｅ）アミノ酸（Ｄ１８０Ｅ）；残基１８１でのグルタミン（Ｑ）アミノ酸（Ｒ１８１Ｑ）；及びその任意の組み合わせからなる群から選択される。

１つの特定の実施形態において、バリアントタンパク質またはバリアントペプチドはそのＮ末端及び／またはＣ末端で１つまたは複数の残基（リジン残基等）を含み得る。複数のリジン残基（例えばポリリジン）は、リジン残基の線状配列であり得るかまたはリジン残基の分岐鎖配列であり得る。これらの追加のリジン残基は、ペプチド溶解度の増加を容易にし得る。

それぞれのタンパク質及び核酸間の配列関係性を記載するために本明細書において概して使用される用語としては、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、及び「実質的な同一性」が挙げられる。それぞれの核酸／タンパク質が各々、（１）核酸／タンパク質によって共有される完全な核酸／タンパク質配列の１つまたは複数の部分のみ、及び（２）核酸／タンパク質間で多様性のある１つまたは複数の部分、を含み得るので、配列比較は、典型的には、配列類似性の局所的な領域を同定及び比較するために「比較ウィンドウ」にわたって配列を比較することによって、遂行される。「比較ウィンドウ」は、参照配列に比較される、典型的には６、９、または１２の連続した残基の概念的セグメントを指す。比較ウィンドウは、それぞれの配列の最適なアライメントのために、参照配列に比較して、約２０％以下の添加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。比較ウィンドウをアライメントさせるための最適な配列のアライメントは、アルゴリズムのコンピューター実装（ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓによるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ、参照することによって本明細書に援用される）によって、または選択された様々な方法のうちの任意のものによっても生成された検査及び最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高いパーセンテージ相同性をもたらす）によって、遂行され得る。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５ ３３８９（参照することによって本明細書に援用される）によって開示されるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムも参照され得る。配列分析の詳細な考察は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ ＮＹ，１９９５－１９９９）のユニット１９．３中で見出され得る。

「配列同一性」という用語は、標準的なアルゴリズムを使用する適切なアライメントを考慮して、配列が比較ウィンドウにわたって同一である程度を考慮して、正確なヌクレオチドまたはアミノ酸の一致数を含むように、その最も広義の意味で本明細書において使用される。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアライメントさせた配列を比較し、同一核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）が両方の配列中で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を出し、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。例えば、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータープログラム（Ｗｉｎｄｏｗｓ用のバージョン２．５；Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡから入手可能）によって計算された「一致パーセンテージ」を意味すると理解され得る。

本発明は、本明細書において開示される免疫原性断片の誘導体も提供する。好適には、免疫原性断片は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む。

本明細書において使用される時、「誘導体」は、例えば他の化学部分とのコンジュゲーションまたは複合体化によって、当技術分野において理解される、翻訳後修飾（例えばリン酸化、アセチル化、及び同種のもの）、糖鎖付加の修飾（例えば糖鎖付加の添加、除去、または改変）、脂質付加、及び／または追加のアミノ酸配列の組入れによって、変更された分子（タンパク質、その断片またはバリアント等）である。１つの特定の誘導体は、ジフテリア毒素（ＤＴ）への免疫原性断片のコンジュゲーションによるものである。これは、Ｃ末端システイン残基の添加によって促進され得る。

追加のアミノ酸配列は、融合タンパク質を生成する融合パートナーアミノ酸配列を含み得る。一例として、融合パートナーアミノ酸配列は、単離された融合タンパク質の検出及び／または精製を補助し得る。非限定例としては、金属結合（例えばポリヒスチジン）融合パートナー、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、蛍光タンパク質配列（例えばＧＦＰ）、エピトープタグ（ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、及び赤血球凝集素タグ等）が挙げられる。

他の追加のアミノ酸配列は、担体タンパク質（ジフテリアトキソイド（ＤＴ）またはその断片等）、またはＣＲＭタンパク質断片（国際公開ＷＯ２０１７／０７０７３５中で記載されるもの等）であり得る。特定の実施形態において、本明細書において記載される免疫原性断片または単離されたタンパク質は、担体タンパク質へ、コンジュゲート、カップル、またはそうでなければ連結される。

本発明によって企図される他の誘導体としては、側鎖への修飾、ペプチドまたはタンパク質合成の間の非天然アミノ酸及び／またはそれらの誘導体の取り込み、及び架橋物質の使用、ならびに本発明の免疫原性タンパク質、断片、及びバリアントを立体配座的に制約する他の方法が挙げられるがこれらに限定されない。

この点に関して、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより広範囲な方法論について、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＮＹ １９９５－２００８）のチャプター１５を参照する。

関連する態様において、本発明は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＮＨＢＡの１つまたは複数の免疫原性断片を含む単離されたタンパク質を提供する。好適には、単離されたタンパク質は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの全長ＮＨＢＡまたは野生型ＮＨＢＡではない。

１つの特定の実施形態において、本発明は、複数の免疫原性断片を含む本明細書において記載される単離されたタンパク質（「ポリトープ」タンパク質の形態で等）を企図する。例えば、前記免疫原性断片は、単独でまたは反復として存在してもよく、それにはタンデム反復断片も含まれる。異種アミノ酸配列（例えば「スペーサー」アミノ酸）も、前記単離されたタンパク質中に存在する１つまたは複数の免疫原性断片の間に含まれ得る。

なおさらなる実施形態において、本態様の発明は、（ｉ）本明細書において記載される免疫原性断片、またはそのセグメント、ドメイン、部分、もしくは領域（例えばそのエピトープまたは抗原決定基）、及び包括的にその断片、バリアント、または誘導体；ならびに（ｉｉ）任意選択で１つまたは複数の追加のアミノ酸配列、からなる単離されたタンパク質またはペプチドを提供する。この点に関して、追加のアミノ酸配列は、好ましくは、前述のタンパク質の列挙されたアミノ酸配列のＮ末端及び／またはＣ末端で存在し得る異種アミノ酸配列であるが、これに限定されない。

本明細書において記載される免疫原性断片及び／または単離されたタンパク質、包括的にその断片、バリアント、及び誘導体は、ペプチド断片を産生するための、化学合成、組み換えＤＮＡ技術、及びタンパク質分解性切断が挙げられるがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の手段によって産生され得る。

化学合成は、固相合成及び液相合成を包含する。かかる方法は当技術分野において周知であるが、ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＶＡＣＣＩＮＥＳ Ｅｄ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）のチャプター９、及びＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ ＵＳＡ １９９５－２００８）のチャプター１５中で提供される化学合成技法の例が参照される。この点に関して、国際公開ＷＯ９９／０２５５０及び国際公開ＷＯ９７／４５４４４も参照される。

組み換えタンパク質は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）の特にセクション１６及びセクション１７；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ ＵＳＡ １９９５－２００８）の特にチャプター１０及びチャプター１６；及びＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ ＵＳＡ １９９５－２００８）の特にチャプター１、５、及び６中で記載される標準的なプロトコルを使用して、当業者によって好都合に調製され得る。典型的には、組み換えタンパク質調製は、好適な宿主細胞中でのタンパク質をコードする核酸の発現を包含する。

別の態様において、本発明は、本明細書において開示される免疫原性断片及び単離されたタンパク質をコードする核酸配列またはそれに相補的なヌクレオチド配列を含む核酸配列をコードするかまたは当該核酸配列に相補的である、単離された核酸を企図する。

本発明の単離された免疫原性タンパク質、単離された免疫原性断片、バリアント、誘導体、及びポリトープをコードするヌクレオチド配列は、ＮＨＢＡの完全なゲノム核酸配列から容易に推定され得る。

この態様は、前記単離された核酸の断片、バリアント、及び誘導体も包含する。

「核酸」という用語は、本明細書において使用される時、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡを示す。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡを包含する。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及び自己触媒ＲＮＡを包含する。核酸は、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドでもあり得る。核酸は、典型的にはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵ塩基を含むヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。しかしながら、ヌクレオチド配列は、他の塩基（イノシン、メチリイシトシン（ｍｅｔｈｙｌｙｃｙｔｏｓｉｎｅ）、メチルイノシン、メチルアデノシン、及び／またはチオウリジン等）を含み得るが、これらに限定されない。

したがって、特定の実施形態において、単離された核酸はｃＤＮＡである。

「ポリヌクレオチド」は、８０以上の連続したヌクレオチドを有する核酸である一方で、「オリゴヌクレオチド」は、８０未満の連続したヌクレオチドを有する。

「プローブ」は、例えばノーザンブロッティングまたはサザンブロッティング中の相補的な配列の検出の目的のために、好適には標識された一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。

「プライマー」は、通常好ましくは１５～５０の連続したヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、それは相補的な核酸「鋳型」にアニールすることが可能であり、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ、逆転写酵素、またはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）等）の作用により鋳型依存性様式で延長される。

一実施形態において、本発明は、本発明の単離された免疫原性断片またはタンパク質をコードする、単離された核酸のバリアントを提供する。

一実施形態において、核酸バリアントは、本発明の単離されたタンパク質または免疫原性断片のバリアントをコードする。

好適には、核酸バリアントは、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、好ましくは少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、または７５％、より好ましくは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、または８５％、及びさらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％の本発明の単離された核酸とのヌクレオチド配列同一性を共有する。

本発明は、コドン配列冗長性の利用によって修飾された核酸も企図する。より特定の例において、コドン使用は、特定の生物体または細胞タイプ中で核酸の発現を最適化するように修飾され得る。

本発明は、本発明の単離された核酸における修飾プリン（例えばイノシン、メチルイノシン、及びメチルアデノシン）及び修飾ピリミジン（例えばチオウリジン及びメチルシトシン）の使用をさらに提供する。

ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＮＹ，１９９５－２００８）のチャプター２及びチャプター３中で記載されるもの等の標準的なプロトコルを使用して、本発明の単離された核酸を好都合には調製することができることは、当業者によって良く認識されるだろう。

さらに別の実施形態において、相補的な核酸は、高ストリンジェンシー条件下で本発明の核酸へハイブリダイズする。

「ハイブリダイズする及びハイブリダイゼーション」は、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ－ＲＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを産生するために少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列の対合を表わすように、本明細書において使用される。相補的なヌクレオチド配列を含むハイブリッド配列が、塩基対を介して生じる。

「ストリンジェンシー」は、本明細書において使用される時、ハイブリダイゼーション間の温度及びイオン強度の条件ならびに特定の有機溶媒及び／またはデタージェントの存在または非存在を指す。ストリンジェンシーが高いほど、ハイブリダイズするヌクレオチド配列間の相補性の要求されるレベルは高いだろう。

「ストリンジェントな条件」は、高頻度の相補的な塩基を有する核酸のみがハイブリダイズする条件を示す。

ストリンジェントな条件は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、前掲（参照することによって本明細書に援用される）のチャプター２．９及びチャプター２．１０中で記載されるもの等、当技術分野において周知である。当業者は、様々な因子を操作して、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化することができることも認識するだろう。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度のハイブリダイゼーションを確実にするように供され得る。

相補的なヌクレオチド配列は、ヌクレオチドがマトリックス（好ましくはニトロセルロース等の合成膜）上で固定化されるステップ、ハイブリダイゼーションステップ、及び典型的には標識されたプローブまたは他の相補的な核酸を使用する検出ステップを包含する、ブロット技法によって同定され得る。サザンブロッティングは、相補的なＤＮＡ配列を同定するために使用され；ノーザンブロッティングは、相補的なＲＮＡ配列を同定するために使用される。ドットブロッティング及びスロットブロッティングは相補的なＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡのポリヌクレオチド配列を同定するために使用され得る。かかる技法は当業者に周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、前掲中の２．９．２０～２．９．１ページで記載される。かかる方法によれば、サザンブロッティングは、ＤＮＡ分子をサイズに従ってゲル電気泳動法によって分離し、サイズ分離したＤＮＡを合成膜へ転写し、膜結合ＤＮＡを相補的なヌクレオチド配列へハイブリダイズすることを包含する。代替のブロッティングステップは、プラークハイブリダイゼーションまたはコロニーハイブリダイゼーションのプロセスを介して等で、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー中の相補的な核酸を同定する場合に使用される。この手順の他の典型例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）のチャプター８～１２中で記載される。

固定化核酸へハイブリダイズされた標識核酸を検出する方法は、当業者に周知である。かかる方法としては、オートラジオグラフィー、化学発光、蛍光、及び比色定量の検出が挙げられる。

核酸は、核酸配列増幅法も使用して、単離され得るか、検出され得るか、及び／または組み換えＤＮＡ技術が行われ得る。

熱的方法及び等温方法の両方をカバーする好適な核酸増幅技法は、当業者に周知であり、当該方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；ローリングサークル複製（ＲＣＲ）；核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、Ｑ－βレプリカーゼ増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、及びヘリカーゼ依存性増幅（ＲＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において使用される時、「増幅産物」は、核酸増幅によって生成された核酸産物を指す。

核酸増幅技法としては、当技術分野において周知であるように、ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、及び競合ＰＣＲ等の特定の定量的技法及び半定量的技法が挙げられ得る。

別の態様において、本発明は、（ｉ）本明細書において記載される単離された核酸；または（ｉｉ）それに相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸、を含む、遺伝子コンストラクトを提供する。

好適には、遺伝子コンストラクトは、当技術分野において良く理解されるように、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母、またはバクテリア人工染色体の遺伝子エレメントの形態であるか、または当該エレメントを含む。遺伝子コンストラクトは、本発明の核酸またはコードされたタンパク質の組み換えＤＮＡ技術による操作及び／または発現のための、細菌または他の宿主細胞中での単離された核酸の維持及び伝播に好適であり得る。

宿主細胞発現の目的のために、遺伝子コンストラクトは発現コンストラクトである。好適には、発現コンストラクトは、発現ベクター中で１つまたは複数の追加の配列へ作動可能に連結された本発明の核酸を含む。「発現ベクター」は、自己複製染色体外ベクター（プラスミド等）または宿主ゲノムの中へ組み込まれるベクターのいずれかであり得る。

「作動可能に連結された」によって、好ましくは転写を開始、調節、またはそうでなければ制御するように、前記追加ヌクレオチド配列は本発明の核酸に対して位置することが意味される。

調節ヌクレオチド配列は、概して発現のために使用される宿主細胞について適切である。多数のタイプの適切な発現ベクター及び好適な調節配列は、様々な宿主細胞について当技術分野において公知である。

典型的には、前記１つまたは複数の調節性のヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列及び転写終結配列、翻訳開始配列及び翻訳終結配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。

当技術分野において公知であるような構成的プロモーターまたは誘導可能プロモーターが、本発明によって企図される。

本発明の組み換えアレルゲン性タンパク質が上述されるように融合タンパク質として発現されるように、発現コンストラクトは、融合パートナーをコードする追加ヌクレオチド配列（典型的には発現ベクターによって提供される）も含み得る。

特定の実施形態において、遺伝子コンストラクトは、対象（ヒト等）への投与に好適である。好ましい形態において、遺伝子コンストラクトは、対象（ヒト等）のＤＮＡワクチン接種に好適である。

好適には、ＤＮＡワクチン接種は、１つまたは複数のプラスミドＤＮＡ発現コンストラクトを経由するものである。プラスミドは、典型的には、ウイルスプロモーター（ＳＶ４０、ＲＳＶ、またはＣＭＶプロモーター等）を含む。イントロン Ａは、ｍＲＮＡの安定性を改善し、それによってタンパク質発現を増加させるために含まれ得る。プラスミドは、マルチプルクローニング部位、強いポリアデニル化シグナル／転写終結シグナル（ウシ成長ホルモンまたはウサギβ－グロブリンのポリアデニル化配列等）をさらに含み得る。プラスミドは、ＨＩＶのｒｅｖ増加させたエンベロープ発現の有無にかかわらず、Ｍａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルスのシス作用性転写エレメント（ＭＰＶ－ＣＴＥ）をさらに含んでもよい。発現を改善し得る追加の修飾としては、エンハンサー配列、合成イントロン、アデノウイルス三分節リーダー（ＴＰＬ）配列の挿入、及び／またはポリアデニル化配列及び／または転写終結配列への修飾が挙げられる。ＤＮＡワクチンプラスミドの非限定例は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから商業的に入手可能なｐＶＡＣである。

ＤＮＡワクチン学を記載する有益な参照は、ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｖｏｌｕｍｅ １２７ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｓｅｒｉｅｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００６）である。

さらなる態様において、本発明は、本明細書において記載される核酸分子または遺伝子コンストラクトにより形質転換された宿主細胞を提供する。

発現に好適な宿主細胞は、原核生物または真核生物のものであり得る。例えば、好適な宿主細胞としては、哺乳動物細胞（例えばＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｊｕｒｋａｔ細胞）、酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バキュロウイルス発現系有りまたは無しで利用される昆虫細胞（例えばＳｆ９、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、植物細胞（例えばＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、または細菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ等）が挙げられ得るがこれらに限定されない。宿主細胞（原核生物または真核生物であっても）の中への遺伝子コンストラクトの導入は、例えばＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５－２００９）の特にチャプター９及びチャプター１６中で記載されるように、当技術分野において周知である。

さらに別の態様において、本発明は、本明細書において記載される単離された免疫原性断片または単離されたタンパク質を産生する方法であって、（ｉ）以前に形質転換された上述の宿主細胞を培養すること；及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）において培養された前記宿主細胞から前記断片またはタンパク質を単離すること、を含む、前記方法を提供する。

組み換えタンパク質は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）の特にセクション１６及びセクション１７；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５－２００９）の特にチャプター１０及びチャプター１６；及びＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５－２００９）の特にチャプター１、５、及び６中で記載される標準的なプロトコルを使用して、当業者によって好都合に調製され得る。

さらなる態様において、本発明は、本明細書において記載される免疫原性断片及び／または単離されたタンパク質と結合する及び／またはそれらに対して作製される抗体または抗体断片を提供する。

好適には、前記抗体または抗体断片は、前記単離された免疫原性断片及び／またはタンパク質と特異的に結合する。

いくつかの実施形態において、抗体は、１つまたは複数のグリカン及び／または基質分子（ＧＡＧ、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びコンドロイチン等）へのＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＮＨＢＡの結合を、低減、消失、阻害、または抑制し得る。他の実施形態において、抗体は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅが細胞（対象中の上皮細胞等）へ結合または接着する能力を、低減、消失、阻害、または抑制し得る。さらなる実施形態において、抗体は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅが対象中の血清耐性を誘導する能力を、低減、消失、阻害、または抑制し得る。ある特定の実施形態において、抗体は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ細胞の補体依存性溶解及び／またはオプソニン化貪食性殺傷を誘導または媒介する。

好適には、抗体または抗体断片は、配列番号２またはバリアント中で示されるアミノ酸配列、その断片、または誘導体を含む、単離された免疫原性ペプチドと特異的に結合する。いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、全長ＮＨＢＡタンパク質に対して作製された抗体よりも実質的に高い親和性で、配列番号２内に含有される最小のエピトープ配列と結合する。この文脈において、「実質的により高い親和性」によって、ＮＨＢＡタンパク質の特定の濃度で、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍高い親和性が意味される。

抗体及び抗体断片は、ポリクローナルもしくはモノクローナル、ネイティブ、または組み換えであり得る。抗体断片は、Ｆｃ断片、Ｆａｂ断片、もしくはＦ（ａｂ）２断片を含む、及び／または一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）を含み得る。かかるｓｃＦｖは、例えば米国特許第５，０９１，５１３号、欧州特許第２３９，４００号、またはＷｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３による論文中でそれぞれ記載される方法に従って、調製され得る。抗体としては、多価組み換え抗体断片（複数のｓｃＦｖｓを含む、ダイアボディ及びトリアボディ及び／またはテトラボディ等）、そして二量体化活性化デミボディ（例えばＷＯ／２００７／０６２４６６）も挙げられ得る。一例として、かかる抗体は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０ ６４４４；またはＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ，２００９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５６２ １７７中で記載される方法に従って調製され得る。抗体産生、精製、及び使用へ適用可能な周知のプロトコルは、例えばＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ＮＹ，１９９１－１９９４）及びＨａｒｌｏｗ，Ｅ．＆ Ｌａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８の２章中で見出され得る。

ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に周知である。使用され得る例示的なプロトコルは、例えばＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、前掲、及びＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，１９８８、前掲中で記載される。一例として、ポリクローナル抗体は、精製もしくは組み換えＮＨＢＡタンパク質、またはその免疫原性断片（例えば配列番号２）に対して、産生種（ウマ等）において作製され、後続して投与前に精製され得る。

モノクローナル抗体は、例えばＫｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５によって論文中で元々記載されるような標準的な方法、または例えばＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、前掲中で記載される例えば最近の修飾を使用して本発明の単離されたタンパク質、断片、バリアント、または誘導体のうちの１つまたは複数により接種された産生種に由来する脾臓または他の抗体産生細胞の不死化によって、産生され得る。ある特定の実施形態において、モノクローナル抗体またはその断片は、組み換え形態であり得る。このことは、モノクローナル抗体が非ヒト哺乳動物の脾臓細胞によって最初に産生されるならば、モノクローナル抗体または断片を「ヒト化する」ために特に有利であり得る。

本発明の抗体及び抗体断片は、本明細書において記載される単離された免疫原性断片及び／またはタンパク質の親和性クロマトグラフィー精製に特に好適であり得る。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、前掲のチャプター９．５中で記載される親和性クロマトグラフィー手順が参照され得る。

いくつかの実施形態において、抗体または抗体断片は、淋菌感染症への「受動」免疫を提供するために、哺乳動物へ投与され得る。

別の実施形態において、本明細書において記載されるＮＨＢＡの単離された免疫原性断片及び／またはタンパク質を結合するかまたはそれらに対して作製される抗体または抗体断片は、細胞表面に発現されたＮＨＢＡを検出するために、使用され得る。

本発明のある特定のさらなる態様及び実施形態は、動物（より具体的にはヒト）において淋菌関連の疾患、障害、または病態に対して、予防、治療、及び／または免疫する組成物及び／または方法を提供する。

１つのかかる態様において、本発明は、淋菌関連の疾患、障害、または病態を予防または治療するための組成物に存し、（ｉ）本明細書において記載される１つまたは複数の免疫原性断片及び／またはタンパク質；（ｉｉ）本明細書において記載される１つまたは複数の単離されたタンパク質；（ｉｉｉ）本明細書において記載される１つまたは複数の単離された核酸；（ｉｖ）本明細書において記載される１つまたは複数の遺伝子コンストラクト；及び／または（ｖ）免疫原性断片または単離されたタンパク質（本明細書において記載されるもの等）を結合するかまたはそれらに対して作製される１つまたは複数の抗体または抗体断片を、任意選択で薬学的に許容される希釈物質、担体、または賦形剤と一緒に含み得る。

「薬学的に許容される担体、希釈物質、または賦形剤」によって、全身投与において安全に使用され得る、固体または液体の充填物質、希釈物質、またはカプセル化物質が意味される。特定の投与経路に依存して、当技術分野において周知の様々な担体が使用され得る。これらの担体は、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化物質、等張食塩水及び塩（塩酸塩、臭化物、及び硫酸塩を包含する鉱酸塩等）、有機酸（酢酸塩、プロピオン酸塩、及びマロン酸塩等）、ならびにパイロジェン不含有水を含む群から選択され得る。

薬学的に許容される担体、希釈物質、及び賦形剤を記載する有益な参照文献は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）（参照することによって本明細書に援用される）である。

一実施形態において、本発明の医薬組成物は、免疫原性組成物である。より詳細には、免疫原性組成物は、好適にはワクチンである。

本明細書において概して使用される時、「免疫する」「ワクチン接種する」、及び「ワクチン」という用語は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによる後続する感染が少なくとも部分的に予防または最小限にされる、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対する防御免疫応答を惹起する方法及び／または組成物を指す。

したがって、かかる組成物は、対象への投与に際して、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ細菌への、少なくとも部分免疫及び好ましくは防御免疫を生成する目的のために、または免疫応答、好ましくは防御免疫応答を生成するために、送達され得るが、これらに限定されない。

「防御免疫」によって、抗原（複数可）への応答性が前記抗原の迅速な結合及び／または消失を導き、したがって動物（ヒト対象等）における後続するＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌の感染を少なくとも部分的に寛解または予防するのに十分な免疫のレベルが意味される。

「防御免疫応答」によって、動物（ヒト対象等）における現在及び／または将来のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌の感染の重症度、症状、態様、または特徴を予防または低減させるのに十分な免疫応答のレベルが意味される。

別の特定の実施形態において、免疫原性組成物は、対象の受動免疫のための本明細書において開示される１つまたは複数の抗体を含む。

好適なワクチンは、タンパク質性ワクチンの形態であり得、特に、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＮＨＢＡタンパク質の１つまたは複数の免疫原性断片、または本明細書において記載されるそれらの断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。

本発明の免疫原性組成物及び／またはワクチンが、「免疫学的に許容される担体、希釈物質、または賦形剤」を含み得ることは上記の内容によって認識されるだろう。

有益な担体は、当技術分野において周知であり、例えばチログロブリン；アルブミン（ヒト血清アルブミン等）；毒素、トキソイド、または破傷風、ジフテリア、百日咳、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属からの毒素の任意の突然変異交差反応性物質（ＣＲＭ）；ポリアミノ酸（ポリ（リジン：グルタミン酸）等）；インフルエンザ；ロタウイルスＶＰ６、パルボウイルスＶＰ１及びＶＰ２；Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質；Ｂ型肝炎ウイルス組み換えワクチン、ならびに同種のものを含む。代替的に、担体タンパク質または他の免疫原性タンパク質の、断片またはエピトープが使用され得る。例えば、細菌毒素、トキソイド、またはＣＲＭのＴ細胞エピトープが使用され得る。この点に関して、米国特許第５，７８５，９７３号（参照することによって本明細書に援用される）が参照され得る。

「免疫学的に許容される担体、希釈物質または賦形剤」としては、その範囲内で、水、重炭酸バッファー、リン酸緩衝食塩水、もしくは食塩水、及び／または当技術分野において周知のアジュバントが挙げられる。当技術分野において理解されるように、「アジュバント」は、ワクチン組成物の免疫原性及び有効性を促進する１つまたは複数の物質から構成される組成物を意味する。

好ましくは、免疫応答を惹起する目的のために、特定の免疫剤は、本明細書において記載される免疫原性断片または単離されたタンパク質と組み合わせて、またはそれらとコンジュゲートして、使用され得る。「免疫剤」という用語は、その範囲内に、担体、送達剤、免疫刺激物質、及び／または当技術分野において周知のアジュバントを包含する。当技術分野において理解されるように、免疫刺激物質及びアジュバントは、組成物の免疫原性及び／または有効性を促進する１つまたは複数の物質を指すかまたはそれらを含む。

好適なアジュバントまたは免疫刺激物質の非限定例としては、スクアラン及びスクアレン（または植物起源または動物起源の他の油）；ブロックコポリマー；デタージェント（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）；Ｑｕｉｌ（登録商標）Ａ、鉱物油（ＤｒａｋｅｏｌまたはＭａｒｃｏｌ等）、植物油（落花生油等）；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等）由来アジュバント；Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅ等）由来アジュバント；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ桿菌またはＢＣＧ）；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原；破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；界面活性物質（ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ－ジコクタデシル（ｄｉｃｏｃｔａｄｅｃｙｌ）－Ｎ’，Ｎ’ビス（２－ヒドロキシエチル－プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、及びプルロニックポリオール等）ポリアミン（ピラン、デキストラン硫酸塩、ポリＩＣカルボポール等）；ペプチド（ムラミルジペプチド及び誘導体、ジメチルグリシン、タフトシン等）；油エマルション；及びミネラルゲル（リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバン等）；インターロイキン（インターロイキン２及びインターロイキン１２等）；モノカイン（インターロイキン１等）；腫瘍壊死因子；インターフェロン（γインターフェロン等）；組み合わせ（サポニン水酸化アルミニウムまたはＱｕｉｌ Ａ水酸化アルミニウム等）；リポソーム；ＩＳＣＯＭ（登録商標）アジュバント及びＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバント；マイコバクテリアの細胞壁抽出物；合成糖ペプチド（ムラミルジペプチドまたは他の誘導体等）；アブリジン；リピドＡ誘導体；デキストラン硫酸塩；ＤＥＡＥデキストラン単独、またはリン酸アルミニウムと共に；カルボキシポリメチレン（Ｃａｒｂｏｐｏｌ’ＥＭＡ等）；アクリルコポリマーエマルション（Ｎｅｏｃｒｙｌ Ａ６４０等）（例えば米国特許第５，０４７，２３８号）；油中水型乳化物質（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０等）；ポリオウイルス、牛痘、または動物ポックスウイルスのタンパク質；またはそれらの混合物が挙げられる。

サブユニットワクチンに関して、かかるワクチンの例は、ＩＳＣＯＭ（国際公開ＷＯ９７／４５４４４中で記載されるもの等）により製剤化され得る。

油中水型製剤の形態でのワクチンの例としては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（国際公開ＷＯ９７／４５４４４中で記載されるもの等）が挙げられる。

任意の好適な手順が、ワクチン組成物の産生のために企図される。例示的な手順としては、例えばＮｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９９７，Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）（参照することによって本明細書に援用される）中で記載されるものが挙げられる。

代替的に、ワクチンは、核酸ワクチン及び特にＤＮＡワクチンの形態であり得る。ＤＮＡワクチン学を記載する有益な参照文献は、ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｖｏｌｕｍｅ １２７ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｓｅｒｉｅｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００６）であり、参照することによって本明細書に援用される。

いくつかの実施形態において、本発明の単離された免疫原性タンパク質及び／または断片は、精製された形態でのワクチンとして使用され得るか、免疫原性担体タンパク質へ融合され得るか、生ワクチン送達系（弱毒化ウイルス、ウイルス様粒子、または生弱毒化細菌が挙げられる）によって発現され得る。

他の実施形態において、本発明の組成物及びワクチンは、本発明の１つまたは複数の単離された免疫原性タンパク質または免疫原性断片を発現するように誘導され得る、弱毒化細菌または不活性化細菌の形態でヒトへ投与され得る。弱毒化細菌の非限定例としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種（例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ変種ＴｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）が挙げられる。代替的に、他の腸内病原菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ属の種またはＥ．ｃｏｌｉ等）は、弱毒化形態で使用され得る。弱毒化サルモネラ菌株は、芳香族アミノ酸生合成経路における遺伝子を不活性化することによって（Ａｌｄｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３５ ４３５）、芳香族アミノ酸生合成経路における２つの遺伝子の中へ（米国特許５，７７０，２１４中で記載されるもの等）、またはｈｔｒＡ等の他の遺伝子中に（米国特許５，９８０，９０７中で記載されるもの等）、またはｏｍｐＲ等の外膜タンパク質をコードする中に（米国特許５，８５１，５１９中で記載されるもの等）、突然変異を導入することによって、構築された。

一実施形態において、抗原組成物は、外膜小胞（ＯＭＶ）を含む。ＯＭＶは、グラム陰性細菌において天然に存在し、タンパク質、脂質（多くはＬＰＳ）、及びペリプラズム内容物からなる非複製球状ナノ粒子である。好適には、ＯＭＶは、任意の細菌種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの種（例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）またはＥ．ｃｏｌｉの培養された株等）の天然に分泌されたかまたは界面活性剤で抽出された外膜から調製され得る。ＯＭＶは、当技術分野において公知の任意の方法によって得られ得る（例えばＧｅｒｒｉｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａｄｖ．３５：５６５－５７４；Ｓｅｍｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ８５（２）ｅ００８９８－１６を参照）。特定の実施形態において、本開示の免疫原性断片及び／または単離されたタンパク質は、表面曝露、非表面曝露、ＯＭＶへの結合、またはＯＭＶへの非結合（すなわち単純な混和）のためにＯＭＶにより製剤化され得る。免疫原性断片及び／または単離されたタンパク質ならびにＯＭＶは、グラム陰性細菌によって同時に産生され得、その結果、ＯＭＶは、ＯＭＶの表面上にまたは内腔中にロードされた免疫原性断片及び／または単離されたタンパク質と共に産生される。代替的に、免疫原性断片及び／または単離されたタンパク質は、ＯＭＶ中の融合タンパク質へ結合する抗原上の親和性タグを使用する共有結合等によって、ＯＭＶの産生後にＯＭＶへ結合され得る（例えばＡｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＡＣＳ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，７（４４）：２４９６３－２４９７２を参照）。なおさらに、免疫原性断片及び／または単離されたタンパク質は、ＯＭＶが産生された後に、ＯＭＶの内腔へロードされ得るか、またはＯＭＶが産生された後に、ＯＭＶと単純に混合され得る。本開示の免疫原性断片及び／または単離されたタンパク質と共にアジュバントとして使用される例示的なＯＭＶは、任意のグラム陰性細菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが挙げられるがこれらに限定されない）から産生されたＯＭＶを包含する。ＯＭＶが由来する細菌種は、単独、または他のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ抗原及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原と組み合わせて、それが由来する前記ＯＭＶ内の、ＮＨＢＡタンパク質の発現またはアップレギュレートされた発現のために遺伝的に修飾され得ることが、さらに想定される。

輸送機能または免疫原性機能を含有するタンパク質、ペプチド、断片、または融合タンパク質の発現は、細胞質、細胞壁中であるか、細胞表面上に曝露されるか、または分泌形態で産生される、免疫原性タンパク質、ペプチド、または断片の産生をもたし得る。

別の態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌への免疫応答を対象において惹起する方法であって、本明細書において記載される１つもしくは複数の免疫原性断片；本明細書において記載される単離されたタンパク質；本明細書において記載される単離された核酸；本明細書において記載される遺伝子コンストラクト；本明細書において記載される宿主細胞；本明細書において記載される抗体もしくは抗体断片；及び／または前述の態様の組成物；を対象へ投与して、それによって免疫応答を惹起するステップを含む、前記方法に関する。

好適には、方法は、淋菌関連の疾患、障害、または病態を対象において予防するかまたは予防的もしくは治療的に処置するために、前記対象における免疫応答を惹起または促進する。

関連する態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌に対する免疫を対象において誘導する方法であって、本明細書において記載される１つもしくは複数の免疫原性断片；本明細書において記載される単離されたタンパク質；本明細書において記載される単離された核酸；本明細書において記載される遺伝子コンストラクト；本明細書において記載される宿主細胞；本明細書において記載される抗体もしくは抗体断片；及び／または本明細書において記載される組成物；を対象へ投与して、それによってＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌に対する免疫を対象において誘導するステップを含む、前記方法を提供する。

好適には、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ細菌への免疫応答または免疫は、淋菌関連の疾患、障害、または病態に罹る動物を予防する。追加で、異なるＮｅｉｓｓｅｒｉａ属の種にわたるＮＨＢＡタンパク質についてのタンパク質配列（特にＣ末端配列）中で観察された相同性に起因して、方法は、さらなるＮｅｉｓｓｅｒｉａ属の種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ等）に対して動物を免疫するためにも使用され得ることは当業者によって認識されるだろう。

さらなる態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症を対象において治療または予防する方法であって、本明細書において記載される１つもしくは複数の免疫原性断片；本明細書において記載される単離されたタンパク質；本明細書において記載される単離された核酸；本明細書において記載される遺伝子コンストラクト；本明細書において記載される宿主細胞；本明細書において記載される抗体もしくは抗体断片；及び／または本明細書において記載される組成物；を対象へ投与して、それによってＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症を対象において予防または治療するステップを含む、前記方法に存する。

先行する２つの態様に類似して、方法は、さらなるＮｅｉｓｓｅｒｉａ属の種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが挙げられるがこれらに限定されない）について動物を治療するためにも使用され得る。

本明細書において使用される時、「治療すること」（または「治療する」もしくは「治療」）は、発症し始めた後に、淋菌関連または髄膜炎菌関連の疾患、障害、または病態の徴候または症状を寛解する治療介入を指す。「寛解すること」という用語は、淋菌関連または髄膜炎菌関連の疾患、障害、または病態に関して、任意の観察可能で有益な治療の効果を指す。治療は、対象にとって有益であることが絶対的である必要はない。有益な効果は、任意の方法または当業者に公知の基準を使用して決定され得る。

本明細書において使用される時、「予防すること」（または「予防する」もしくは「予防」）は、症状、態様、または特徴を予防または低減するような、淋菌関連または髄膜炎菌関連の疾患、障害、または病態の症状、態様、または特徴の開始前に開始される手順（治療有効量の、本発明の１つまたは複数の免疫原性タンパク質、及び／またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む組成物の投与等）を指す。かかる予防が、対象にとって有益であることが絶対的である必要がないことを理解されたい。「予防的」処置は、淋菌関連または髄膜炎菌関連の疾患、障害、または病態の症状、態様、または特徴を発症するリスクを減少させる目的のために、淋菌関連または髄膜炎菌関連の疾患、障害、または病態の徴候を呈しないかまたは初期の徴候のみを呈する対象へ施される処置である。

「治療有効量」という用語は、規定された薬剤（本明細書において記載される単離された免疫原性断片、単離されたタンパク質、及び抗体または抗体断片等）の、その薬剤により治療されている対象において所望される効果を達成するのに十分な量を記載する。例えば、これは、淋菌関連または髄膜炎菌関連の疾患、障害、または病態（淋菌または髄膜炎菌の感染症を包含する）を、低減、緩和、及び／または予防するのに必要な、本明細書において記載される単離された免疫原性断片、単離されたタンパク質、及び／または抗体もしくは抗体断片を含む組成物の量であり得る。いくつかの実施形態において、「治療有効量」は、淋菌関連または髄膜炎菌関連の疾患、障害、または病態の症状を低減または消失させるのに十分である。他の実施形態において、「治療有効量」は、所望される生物学的効果を達成するのに十分な量（例えば淋菌感染症及び／または髄膜炎菌感染症を阻害または予防するように、対象において防御免疫応答を惹起するのに十分な量）である。

理想的には、薬剤の治療有効量は、対象において実質的な細胞毒性効果を引き起こさずに、所望される結果を誘導するのに十分な量である。淋菌関連または髄膜炎菌関連の疾患、障害、または病態（淋菌感染症または髄膜炎菌感染症等）を、低減、緩和、及び／または予防するために有用な薬剤の有効量は、治療されている対象、任意の関連の疾患、障害、及び／または病態のタイプ及び重症度（例えば淋菌関連または髄膜炎菌関連の疾患、障害、もしくは病態のタイプ、及び／またはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株）、ならびに治療組成物の投与の様式に依存するだろう。

本発明の文脈において、「淋菌関連の疾患、障害、または病態」によって、任意の淋菌感染症またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ感染症（上述されるもの等の、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによるかかる感染からもたらされる任意の臨床病理学を包含する）が意味される。

追加で、「髄膜炎菌関連の疾患、障害、または病態」によって、任意の髄膜炎菌感染症またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染症（脳膜炎、発疹、敗血症、発熱、悪心、嘔吐、及び下痢等の、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによるかかる感染からもたらされる任意の臨床病理学を包含する）が意味される。

さらに別の態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌が細胞へ結合または接着することを対象において少なくとも部分的に阻害または予防する方法であって、本明細書において記載される１つもしくは複数の免疫原性断片；本明細書において記載される単離されたタンパク質；本明細書において記載される単離された核酸；本明細書において記載される遺伝子コンストラクト；本明細書において記載される宿主細胞；本明細書において記載される抗体もしくは抗体断片；及び／または本明細書において記載される組成物；を対象へ投与して、それによって対象の細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌結合を阻害または予防するステップを含む、前記方法を提供する。

宿主細胞への細菌の接着が、宿主粘膜表面でのコロニー形成の成功のための初期ステップ及び先行条件であることが認識されるだろう。特定の実施形態において、細胞は、上皮細胞（膣上皮細胞、子宮頸管上皮細胞、子宮内膜上皮細胞、咽頭上皮細胞、及び尿道上皮細胞等）である。

さらに別の態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症の血清耐性を対象において少なくとも部分的に阻害または低減する方法であって、本明細書において記載される１つもしくは複数の免疫原性断片；本明細書において記載される単離されたタンパク質；本明細書において記載される単離された核酸；本明細書において記載される遺伝子コンストラクト；本明細書において記載される宿主細胞；本明細書において記載される抗体もしくは抗体断片；及び／または本明細書において記載される組成物；を対象へ投与して、それによってＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症の血清耐性を対象において阻害または低減するステップを含む、前記方法に関する。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、世界中のヒトの性感染症の頻度の高い原因である。数パーセントの淋菌感染症は、一般的に播種性淋菌感染症（ＤＧＩ）と称される重篤な生命を脅かす合併症をもたらし得る。病原性、及び正常ヒト血清の補体依存性殺菌効果への耐性（すなわち血清耐性）は、このグラム陰性菌双球菌について、厳密に相関するように思われる。

好適には、本発明の前述の方法は、動物（哺乳動物等）で遂行される。一実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。

５つの前述の態様の方法における投与のための組成物が、本発明の１つまたは複数の免疫原性断片及び／または単離されたタンパク質、及び／または本明細書において記載される免疫原性断片及び／または単離されたタンパク質に対して作製された、本発明の１つまたは複数の抗体または抗体断片を含み得るが、必ずしもこれらに限定されないことが認識されるだろう。したがって、ある特定の実施形態において、かかる組成物は、ＮＨＢＡタンパク質（例えば配列番号１）のＣ末端断片（配列番号２中で示されるもの等）と結合し得るかまたはそれに対して作製される、１つまたは複数の抗体または１つまたは複数の抗体断片を含み得る。

「投与する」ことまたは「投与」によって、特定の選ばれた経路による対象の中への本明細書において開示される組成物の導入が意味される。

任意の安全な投与経路が、本発明の組成物を患者に提供するために用いられ得る。例えば、経口投与、直腸投与、非経口投与、舌下投与、頬側投与、静脈内投与、関節内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、吸入による投与、眼内投与、腹腔内投与、脳室内投与、膣内投与、及び経皮投与が用いられ得る。

投薬形態としては、錠剤、分散物、懸濁物、注射、溶液、シロップ、トローチ、カプセル、鼻用スプレー、坐薬、エアロゾル、経皮パッチ、及び同種のものが挙げられる。これらの投薬形態としては、この目的のために特異的にデザインされた制御放出デバイスの注入もしくは植え込み、またはこの様式で追加で作用するように修飾される植え込みの他の形態も挙げられ得る。治療剤の制御放出は、例えば疎水性ポリマー（アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸、及びポリグリコール酸、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロース等の特定のセルロース誘導体が挙げられる）により同じものをコーティングすることによって達成され得る。加えて、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソーム、及び／またはマイクロスフェアの使用によって達成され得る。

経口投与または非経口投与について好適な本発明の組成物は、不連続単位（所定の量の１つまたは複数の本発明の治療剤を各々が含有する、カプセル、分包、機能性食品／飼料、または錠剤等）として、粉末もしくは顆粒として、または水性液体、非水性液体、水中油型エマルション、もしくは油中水型液体エマルションでの溶液もしくは懸濁物として提示され得る。かかる組成物は調剤方法のうちの任意のものによっても調製され得るが、すべての方法は、上で記載される１つまたは複数の薬剤を、１つまたは複数の必須成分を構成する担体と会合させるステップを含む。概して、組成物は、本発明の薬剤を液体担体または微粉固体担体または両方と均一に密に混合し、次いで必要であるならば、産物を所望される体裁へと形作ることによって調製され得る。

上記の組成物は、投薬製剤と適合性のある様式で及び薬学的に有効量で投与され得る。患者へ投与される用量は、本明細書の文脈において、適切な期間にわたって患者における有益な応答を達成するのに十分であるべきである。投与される薬剤（複数可）の量は、年齢、性別、体重、及びその全身の健康病態、医師の判断に依存するであろう因子を包含する、治療される対象に依存し得る。

前述の方法及び組成物の特定の実施形態において、免疫原性断片または単離されたタンパク質は、ＮＨＢＡタンパク質に由来するさらなる免疫原性断片もしくはタンパク質、または当技術分野において公知のさらなるＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅタンパク質もしくはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質（表面発現ＭｅｔＱタンパク質（Ｓｅｍｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．２０１７）、ＭｓｒＡＢ、ＡｎｉＡ、及びＢｅｘｓｅｒｏワクチン（ＧＳＫ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）中に存在するそれらの４つの抗原成分のうちの１つまたは複数（すなわちＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄの伝染性株（ＭｅＮＺＢ、それはＰｏｒＡを提供する）からの、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）、ＮｅｉｓｓｅｒｉａアドへジンＡ（ＮａｄＡ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属のヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ）、及び外膜小胞）等）と組み合わせて投与され得る。この点に関して、本明細書において記載される免疫原性断片または単離されたタンパク質は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのために多重抗原ワクチンの構成要素として含まれ得る。いくつかの実施形態において、ＮＨＢＡの免疫原性断片または単離されたタンパク質、及びさらなる免疫原性断片またはタンパク質は、単一のキメラペプチドとして提供され得る。この実施形態において、本明細書において記載される免疫原性断片または単離されたタンパク質は、さらなる免疫原性断片またはタンパク質のＮ末端またはＣ末端であり得る。

最終的な態様において、本発明は、動物から得られた生物学的サンプル中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを検出する方法であって、生物学的サンプルを本明細書において記載される抗体または抗体断片と接触させて、それによって生物学的サンプル中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを検出するステップを含む、前記方法を提供する。好適には、ＮＨＢＡタンパク質は、生物学的サンプル中の１つまたは複数のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ細胞及び／またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細胞の細胞外表面上で検出される。

ある特定の実施形態において、生物学的サンプルは、動物から採取された１つまたは複数の体液、細胞、組織、器官、または器官サンプルを含む、病理学サンプルであり得る。非限定例としては、血液、血漿、血清、リンパ球、尿、糞便、羊水、子宮頸管サンプル、脳脊髄液、組織生検、骨髄、気管支肺胞洗浄液、喀痰、及び皮膚が挙げられる。

好適には、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び／またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの検出は、抗体または抗体断片とＮＨＢＡタンパク質との間の検出可能な複合体を形成するステップを包含する。そのように形成された複合体は、当技術分野において公知の任意の技法、アッセイ、または手段によって検出され得、免疫ブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、免疫蛍光法、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、磁気ビーズ分離、及びバイオセンサーベースの検出系（表面プラズモン共鳴等）が挙げられるが、これらに限定されない。

検出を容易にするために、抗体は直接標識され得るか、または標識二次抗体が使用され得る。追加で、小分子は、直接標識され得る。

標識は、クロモゲン、触媒、ビオチン、ジゴキシゲニン、酵素、フルオロフォア、化学発光分子、放射性同位体、薬物、磁気ビーズ、及び／または直接的な視覚的標識を含む群から選択され得る。

直接的な視覚的標識の事例において、コロイド性の金属粒子もしくは非金属粒子、色素粒子、酵素もしくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、またはシグナル産生物質を含有する他の小胞、及び同種のものが使用され得る。

フルオロフォアは、当技術分野において周知のように、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ色素、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＬ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙ５、Ｃｙ３、またはＲフィコエリトリン（ＲＰＥ）であり得る。

酵素は、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－ガラクトシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼであり得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、検出方法は、「ハイスループット」診断検査、または商業的な病理検査室による手順もしくは病院において遂行される手順等で遂行され得る。

淋菌関連の疾患、障害、または病態の疾患進行及び／または重症度を動物において特徴づけることにおいて、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのかかる検出方法が可能性のある有用性を有し得ることは、さらに認識されるだろう。追加で、かかる方法は、抗ＮＨＢＡの治療のための動物を選択するために（いわゆる「コンパニオン診断」によって等）使用され得る。

概して本明細書において使用される時、「患者」、「個体」、及び「対象」という用語は、本明細書において開示される治療または組成物の任意の哺乳動物レシピエントの文脈において、使用される。したがって、本明細書において開示される方法及び組成物は、医学的及び／または獣医学的な適用を有し得る。好ましい形態において、哺乳動物は、ヒトである。本明細書において記載される方法の１つまたは複数のステップは、インビトロで実行され得る。

本発明が完全に理解され効果的に実践され得るように、以下の非限定実施例が参照される。

実施例１
序論
最近のいくつかの進歩は、淋菌ワクチン開発の実行可能性を支持する。最近の観察研究から、非常によく関連する細菌Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対するワクチン（外膜小胞（ＯＭＶ）の髄膜炎菌ＢワクチンＭｅＮＺＢ）が、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅによる感染症に対して３１％の有効性を有することが示唆された［１２］。より新しい４構成要素の髄膜炎菌Ｂワクチン（ＭｅＮＺＢ ＯＭＶ構成要素＋３つの組み換えタンパク質抗原を含有する４ＣＭｅｎＢ（Ｂｅｘｓｅｒｏとして市販される））は、ＮＨＢＡを包含するＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅタンパク質への交差反応性のある抗体を誘導することが示されている［１３］。

この実施例において、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＮＨＢＡの配列変動及び発現の詳細な分析を遂行し、ＮＨＢＡ_Ｎｇに対して作製された抗体のレベル、タイプ、及び機能活性を調査して、淋菌ワクチン候補としての全長タンパク質及びタンパク質のＣ末端断片の能力を評価する。

結果
ＮＨＢＡは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて高度に保存される
本発明者らは、ＮＨＢＡがＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて保存されていることを以前に示し［１３］、本明細書において本発明者らは、入手可能な淋菌単離体及びゲノム配列におけるＮＨＢＡの配列バリアントをさらに調査する。ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な淋菌ゲノムに対する、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１からの１２８１ヌクレオチドのｎｈｂａ遺伝子（それは４２７アミノ酸のＮＨＢＡをコードする）によるｂｌａｓｔｎ検索（図１Ａ）から、ｎｈｂａが、すべての５９４ゲノム中に存在し、９４．１～１００％の核酸同一性があることが明らかにされた。ＰｕｂＭＬＳＴデータベースに対する類似するｂｌａｓｔｎ検索から、４，４２４の単離体中でｎｈｂａ遺伝子が存在し、８５．１～１００％の同一性があることが明らかにされた。このＢＬＡＳＴ検索においてｎｈｂａへの一致を有しなかった１，２２８の単離体は、注釈付きの１６Ｓ及びｐｏｒＢ遺伝子も欠損し、これらの単離体については、不完全な配列が入手可能であることが示された。このことから、６０を超える異なる国から１９６０年～２０２０年に収集された、時間的及び地理的に多様性のある淋菌株のパネルにおいて、ｎｈｂａが広く分布し、高度に保存されることが確認される。

２０２０年４月６日の時点で、ＰｕｂＭＬＳＴデータベースにおいて、注釈付きのＮＨＢＡタンパク質を有する３，５４６のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ単離体に４２の固有のＮＨＢＡ＿ペプチドバリアントがある。これらのバリアントは、９７．５～１００％のアミノ酸同一性を共有する。ＰｕｂＭＬＳＴ単離体の７０．３％において存在する２つの優勢なＮＨＢＡバリアントがあり、それらは、ＮＨＢＡ－５４２（株の３９．７％に存在し、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１が含まれる）及びＮＨＢＡ－４７５（株の３０．４％において存在し、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＷＨＯのＰ及びＷＨＯ Ｘが含まれる）である。全体として、１４の主要なＮＨＢＡバリアントのうちの１つが単離体の９７．８％において存在する一方で、残りの２８のＮＨＢＡペプチドバリアントは稀であり、１～１０の単離体に存在する（表５）。これらの１４の最もよくみられるバリアントのアライメントから、Ｎ末端及びＣ末端が保存の最高レベルを有し、アルギニンリッチ領域の上流に存在する変動する中央部があることが示される（図１Ｂ、バリアントは存在量が減少していく順序で並べられる）。これらのＮＨＢＡバリアントの系統発生的関係性を図１Ｃ中で示し、ＮＨＢＡ多様性の代表的な株のパネルを後続するアッセイにおいて使用した。Ｃ末端の配列が保存されていること（図１Ｂ）髄膜炎菌ＮＨＢＡ Ｃ末端領域の構造が特徴づけられていること［１５、１９、２０］、及びＣ末端領域はより曝露される可能性が高く、ワクチン誘導抗体へ接近可能であることを考慮して、後続する調査は、組み換え全長ＮＨＢＡ及びＣ末端ＮＨＢＡ断片（ＮＨＢＡ－ｃ）の両方に集中した（図１Ａ）。

組み換え全長ＮＨＢＡ及びＣ末端ＮＨＢＡ断片は免疫原性であり、様々な淋菌株からのＮＨＢＡバリアントを認識する抗体を誘導する
淋菌ＮＨＢＡの免疫原性を調査するために、組み換え全長ＮＨＢＡ＋Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント、またはＮＨＢＡ－ｃ断片＋Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントもしくは水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）により免疫されたマウスからの血清を、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットによって査定した。全細胞ＥＬＩＳＡを使用して、本発明者らは、ＮＨＢＡ及びＮＨＢＡ－ｃの両方のマウス血清がＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ野生型（ＷＴ）株及びＮＨＢＡ補完（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）株の表面上のネイティブなＮＨＢＡを検出でき、ＮＨＢＡ変異株（ΔＮＨＢＡ）については有意に低減された力価であることを示す（表１）。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ野生型及び突然変異の全細胞溶解物に対するウエスタンブロットによるＮＨＢＡ抗血清の分析から、抗血清が特異的にＮＨＢＡを認識することが確認された（図２Ａ）。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株のパネル中のＮＨＢＡの発現及びＮＨＢＡ抗血清の交差反応性を、ウエスタンブロット分析によって確認した（図２Ｂ）。ＮＨＢＡ発現は株間で変動し、高い、中間の、及び低いＮＨＢＡ発現体を、後続するアッセイにおいて使用した。

組み換えＮＨＢＡによるＥＬＩＳＡは、ＮＨＢＡにより免疫されたマウス中での優位なＩｇＧ１アイソタイプ応答の存在を示した（表１）。しかしながら、アイソタイプ及びサブクラスの比は異なる配合間で異なり、ＮＨＢＡ－ｃ－Ｆｒｅｕｎｄ（ＩｇＧ１＞ＩｇＭ＝ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ３）及びＮＨＢＡ－ｃ－Ａｌｕｍ（ＩｇＧ１＞ＩｇＭ＞ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ３）よりも、ＮＨＢＡ－Ｆｒｅｕｎｄはより高いレベルのＩｇＧ３及びより低いレベルのＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ（ＩｇＧ１＞ＩｇＭ＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ２ａ）を有する。全体として、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンの結果から、淋菌ＮＨＢＡが免疫原性であり、抗ＮＨＢＡの抗血清が、異なるＮＨＢＡバリアントを発現する複数のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株の表面上のＮＨＢＡを認識し得ることが確認される。

ＮＨＢＡ抗体は、Ｃ３断片沈着を増進する
ＮＨＢＡ抗血清が、補体カスケードの活性化を増進するかどうかを調査するために、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの表面の上へのＣ３断片沈着を、フローサイトメトリーを使用して調査した。ＮＨＢＡ－Ｆｒｅｕｎｄのマウス血清及びＮＨＢＡ－ｃ－Ｆｒｅｕｎｄのマウス血清そしてこれらの血清から精製されたＮＨＢＡ特異的ＩｇＧを試験し、それらのすべては、免疫前血清または対照処理細菌に比べた平均蛍光強度の増加によって証明されるように、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１と結合する（図３Ａ～Ｂの上部パネル）。ヒト補体＋全血清または精製ＩｇＧのいずれかによりインキュベーションされた細菌は、補体のみの対照に比べて、著しくＣ３断片沈着を増加させた（ＮＨＢＡについて、それぞれ７．１倍及び５．２倍の増加；ＮＨＢＡ－ｃについて、それぞれ４．８倍及び４．７倍の増加；図３Ａ～Ｂの下部パネル）。

ＮＨＢＡ抗体は、殺菌活性及びオプソニン化貪食活性を有する
ＮＨＢＡ抗体及びＮＨＢＡ－ｃ抗体が、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの補体依存性溶解及びオプソニン化貪食性殺傷を媒介する能力を、それぞれ血清殺菌活性（ＳＢＡ）アッセイ及びオプソニン化貪食性殺傷（ＯＰＡ）アッセイを使用して試験した。異なるＮＨＢＡバリアントを含有し、変動するＮＨＢＡ発現レベルの有る５つの淋菌株を試験した。ＳＢＡアッセイのために、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを、ＮＨＢＡマウス血清またはＮＨＢＡ－ｃマウス血清によりインキュベーションし、その後ヒト補体の活性源を添加し、細菌生存を測定した。ＮＨＢＡ－Ｆｒｅｕｎｄの血清及びＮＨＢＡ－ｃ－Ｆｒｅｕｎｄの血清の両方は、濃度依存的様式で血清殺菌活性を惹起し、１００～１６００の範囲のＳＢＡ力価であった（免疫前血清の力価＜５０に比較して）（図２０Ａ；表２）。ＯＰＡアッセイのために、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅをＮＨＢＡ抗体またはＮＨＢＡ－ｃ抗体によりオプソニン化し、ヒト補体の存在下においてインキュベーションし、ヒトＰＭＮは用量依存的様式で殺傷され、１００～６，４００の範囲のＯＰＡ力価であった（免疫前血清の力価＜５０に比較して）（図２０Ｂ；表２）。ヒトワクチンにおいて頻繁に使用されるアジュバント（Ａｌｕｍ）により製剤化されたＮＨＢＡ（ＮＨＢＡ－ｃ－Ａｌｕｍ）に対して作製された血清も、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＳＢＡ及びＯＰＡ殺傷を誘導し、ＮＨＢＡ－ｃ－Ｆｒｅｕｎｄの血清によって観察されたものについてのものに類似する力価であった（図２０Ａ、Ｂ；表２）。ＮＨＢＡ－ｃ－ａｌｕｍにより免疫されたマウスからの精製ＮＨＢＡ免疫グロブリンは、濃度依存的ＳＢＡ殺傷を媒介した（図２０Ｃ）。さらに、抗ＮＨＢＡ抗体を枯渇させたＮＨＢＡ－ｃ－ａｌｕｍ血清において、殺傷は観察されず（図２２）、ＮＨＢＡについての免疫応答の特異性が確認される。

ＮＨＢＡ抗体は、ヘパリンへのＮＨＢＡの結合及び宿主細胞への淋菌接着を低減する
ＮＨＢＡ抗血清及びＮＨＢＡ－ｃ抗血清が、ＮＨＢＡの機能的役割を阻害できるかどうかを調査するために、ＮＨＢＡ抗血清の存在及び非存在下において、組み換えＮＨＢＡ及びその予測された基質ヘパリンによる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの競合的結合実験を遂行した。抗血清の非存在下において、淋菌ＮＨＢＡは、ヘパリンを結合する。免疫前血清は、ヘパリンがＮＨＢＡと相互作用する能力に対する効果を有しなかったが、全長ＮＨＢＡにより免疫されたマウスからの血清は、ヘパリン結合を８５．７％低減した（Ｐ＝０．０００１）（図４Ａ；図６）。しかしながら、ＮＨＢＡ－ｃ血清は、ヘパリンとＮＨＢＡとの間の相互作用を有意に阻害することができなかった（結合の１１％の低減；Ｐ＝０．１）（図４Ａ；図６）。

淋菌ＮＨＢＡは表面に曝露され［１３］、髄膜炎菌ＮＨＢＡと類似するアドへジン機能を有する可能性が高い［１８］。したがって、ＮＨＢＡ抗血清及びＮＨＢＡ－ｃ抗血清が、ヒト細胞への淋菌接着を低減できるかどうかを調査した。インビトロの感染アッセイを、抗血清によりプレインキュベーションしたＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅと、形質転換された子宮頸管（ｔＣＸ）上皮細胞及び尿道（ｔＵＥＣ）上皮細胞を用いて遂行した。ＮＨＢＡ血清及びＮＨＢＡ－ｃ血清は、抗体無し対照に比べて、濃度依存的様式でｔＣＸ及びｔＵＥＣの両方への接着を低減することが可能であるが、免疫前血清はそうではない。例えば、ＮＨＢＡ血清の１：２０希釈物は、ｔＣＸ細胞及びｔＵＥＣ細胞における淋菌接着を、それぞれ１９倍及び６倍減少させる。同様に、ｃＮＨＢＡ抗血清の１：２０希釈物は、ｔＣＸ細胞及びｔＵＥＣ細胞における細菌接着を、それぞれ８倍及び５倍低減させる（図４Ｂ～Ｃ）。

考察
抗微生物物質耐性のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの脅威に照らして、淋菌ワクチンの開発を支援するために、可能性のあるワクチン候補の同定及び特徴評価についての必要性が増加している。本明細書において淋菌ＮＨＢＡを特徴づけ、当該ＮＨＢＡが、広く分布し地理的及び時間的に多様性のあるＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株において保存されること、及び全長ＮＨＢＡまたはＮＨＢＡのＣ末端断片のいずれかに対して作製された抗体が、殺菌性且つオプソニン化貪食性殺傷を媒介することを示す。これらの抗体は、ヒト上皮細胞へのＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの接着を低減し、ＮＨＢＡのグリカン結合活性を阻害することもできる。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅについての防御の公知の相関現象は現在ない（［９］中で概説される）が、ＮＨＢＡが、２つの従来の免疫殺傷メカニズムを介してＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを殺傷することが可能な抗体を惹起し、そして感染における重要なステージの機能的ブロッキングを媒介する能力は、淋菌ワクチンにおいて使用される可能性を支持する。

淋菌ＮＨＢＡは高度に保存され、現在までに調査されたＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株において≧９７．５％のアミノ酸同一性があり、大多数の株は、限られた数のＮＨＢＡバリアントのうちの１つを発現する（例えば７０．３％は２つの主要なバリアントのうちの１つを発現し、９１．３％は７つのバリアントのうちの１つを発現する）。本発明者らは、ＮＨＢＡ発現が株間で、さらに同じＮＨＢＡバリアントを発現する株（例えばＷＨＯ Ｘ及びＷＨＯのＰ）間でさえ変動することも示す。しかしながら、本発明者らは、ＮＨＢＡバリアント５４２（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１からの）に対して作製された抗血清が、交差反応性があり、同種及び異種のＮＨＢＡバリアントを発現する株、ならびに高い、中間の、及び低いＮＨＢＡ発現の株を殺傷することが可能であることを示す。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株は異なる優勢なＮＨＢＡバリアントを含有する［１３］が、本発明者らの知見は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＮＨＢＡについての知見と一致し、ＮＨＢＡ－２（４ＣＭｅｎＢ中で見出される）への抗体の免疫反応は、ＮＨＢＡバリアントに関係なく、米国で流行している株の９９．５％（４４２株）について観察される［２６］。

Ｆｒｅｕｎｄまたは水酸化アルミニウムのいずれかによりアジュバント効果を与えられた場合に、ＮＨＢＡ断片及びＮＨＢＡ－ｃ断片はマウスにおいて免疫原性であった。全体として、ＩｇＧ１優位な抗体応答はすべての事例において惹起されたが、他のアイソタイプ及びサブクラスのパターンの変動は、異なる抗原及びアジュバントの組み合わせについて観察された。さらに、ＮＨＢＡ－ｃは、全長ＮＨＢＡに比較して総ＩｇＧ力価を低下させたが、調査されたパネル中の大部分の株に対して、類似するかまたはより高いＳＢＡ力価及びＯＰＡ力価を惹起した。免疫グロブリンのアイソタイプ及びサブクラスは、補体を活性化し、殺菌活性及びオプソニン化貪食活性を媒介する能力が異なることが公知であるが、この能力は抗原性標的間で変動する。例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＰｏｒＡ抗原を標的化するマウス抗体は、血清殺菌活性についてはＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ２ａ＞＞ＩｇＧ１及びオプソニン化貪食活性についてはＩｇＧ３＞ＩｇＧ２ｂ＝ＩｇＧ２ａ＞＞ＩｇＧ１の階層を有する［２７］。同様に、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ抗原ＭｓｒＡ／Ｂに対するマウス抗体は、Ｆｒｅｕｎｄによってアジュバント効果を与えられた場合に、水酸化アルミニウムに比較して、より高い力価のＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３を有し、ＭｓｒＡ／Ｂ－Ｆｒｅｕｎｄの抗血清は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＳＢＡ及びＯＰＡ殺傷を媒介したが、ＭｓｒＡ／Ｂ－Ａｌｕｍ抗血清はしなかった［２８］。本発明者らによるデータは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの抗ＮＨＢＡ ＳＢＡ及びＯＰＡ媒介性殺傷において、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂが優位な役割を果たすことを示唆するが、これは、これらの抗体のより高い総レベルが、ＮＨＢＡ－Ｆｒｅｕｎｄに比較して、ＮＨＢＡ－ｃ－Ｆｒｅｕｎｄによって惹起されたからである。さらに、ＮＨＢＡ－ｃ－Ａｌｕｍは、ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ３を惹起し、試験されたすべての５つの淋菌株に対して、ＳＢＡ及びＯＰＡを媒介した。このことは、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ３を惹起しなかったＭｓｒＡ／Ｂ－Ａｌｕｍとは異なり、抗ＭｓｒＡ／Ｂ－Ａｌｕｍは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの殺傷を媒介しなかった［２８］。抗体レベル及び機能におけるこの差異は、抗原特異的なものであり得るか、または異なる研究において使用される異なる免疫用量及びスケジュールと関連し得る（ＮＨＢＡ、０、２１、及び２８日目に２５μｇ ｖｓ ＭｓｒＡ／Ｂ、０、２１、２８、及び４２日目に５μｇ）。

全体として、本発明は、淋菌ワクチンにおいて抗原としての使用を支持するＮＨＢＡの複数の重要な特色を記載し、単独でまたは別の抗原との融合タンパク質として使用され得る最適化された抗原として、ＮＨＢＡのＣ末端断片を使用する可能性を強調するものである。

方法
細菌株及び増殖条件
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１、ＦＡ１０９０、ＷＨＯ Ｇ、ＷＨＯ Ｐ、及びＷＨＯ Ｘを、この研究において使用した。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを、５％のＣＯ_２により３７℃または３２℃で、１％（ｖ／ｖ）のＩｓｏＶｉｔａｌｅＸ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含むＧＣアガー（Ｏｘｏｉｄ）上で増殖させた。アッセイにおいて使用された大多数の淋菌集団は、位相差顕微鏡を使用するコロニーの視覚的検査によって決定されるように、線毛で覆われ、不透明タンパク質を発現した。

配列分析
配列をＭａｃＶｅｃｔｏｒによりアライメントさせ、アミノ酸同一性及び類似性のパーセンテージを計算した（ＢＬＯＳＵＭ９０、閾値０）。ＮＨＢＡバリアントの近隣結合系統樹（最適な系統樹（ｂｅｓｔ ｔｒｅｅ）、非補正（「ｐ」））を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒにより構築した。淋菌株間のｎｈｂａ及びコードされたＮＨＢＡタンパク質の存在及び保存を、ＧｅｎＢａｎｋ中の５９４の淋菌ゲノム及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ Ｍｕｌｔｉ Ｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｉｎｇウェブサイト（ＰｕｂＭＬＳＴ；ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｌｓｔ．ｏｒｇ／ｎｅｉｓｓｅｒｉａ／）中の５６５２のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ単離体に対して、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＥＥＨ６１８５７．１；ゲノム遺伝子座タグＮＧＡＧ＿００７２５）からのｎｈｂａにより、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌプログラム（ＢＬＡＳＴ）を使用して、２０１９年９月１９日の時点で決定した。ＮＨＢＡについて以前に確立されたＰｕｂＭＬＳＴ命名法（ＮＥＩＳ２１０９によってコードされた）を使用し、固有のペプチド配列ごとに固有の同定番号を割り当てる（例えばＮＨＢＡ＿ペプチド２［ＮＨＢＡ－２］は４ＣＭｅｎＢ中にあり、ＮＨＢＡ＿ペプチド５４２［ＮＨＢＡ－５４２］はＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１中にある）。

Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＮＨＢＡ変異株の構築
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１ ｎｈｂａ遺伝子を、５’－ＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＡＧＴＧＴＧＡＴＴＧＣ－３’（配列番号３）プライマー及び５’－ＴＣＡＡＴＣＣＣＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＣ－３’（配列番号４）プライマーを使用して増幅し、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中へクローニングした。カナマイシン耐性遺伝子（ｐＵＣ４Ｋａｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、５’－ｇｇａｔｃｃＣＣＧＧＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＣＴＧＡＴＴＣＣ－３’（配列番号５）プライマー及び５’－ｇｇａｔｃｃＧＣＧＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣ－３’（配列番号６）プライマーによるインバースＰＣＲを使用して、ｎｈｂａオープンリーディングフレームの中央へ導入されたＢａｍＨＩ制限部位の中へ挿入した（ｎｈｂａ遺伝子の中へのカナマイシン耐性遺伝子のサブクローニングのために導入されたＢａｍＨＩ制限酵素部位を、小文字で示す）。ｎｈｂａ：：ｋａｎコンストラクトをＮｃｏＩにより直線化し、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１の中へ形質転換して、１２９１ ｎｈｂａ：：ｋａｎ株（ΔＮＨＢＡ）を生成した。補完プラスミドｐＣＴＳ３２を使用して、インタクトなｎｈｂａ遺伝子（５’－ＧＧＣＡＴＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡＣＡＡＴＡ－３’（配列番号７）プライマー及び５’－ＴＣＡＡＴＣＣＣＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＣ－３’プライマー（配列番号８）を使用して増幅した）をΔＮＨＢＡ株の中へ導入することによって、補完された株（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）を生成した［２９］。ｎｈｂａ遺伝子の成功した欠失及び後続の補完を、ＰＣＲ及びウエスタンブロットによって確認した。

組み換えタンパク質発現
予測されたシグナルペプチドを欠く全長組み換えＮＨＢＡのクローニング及び発現は、以前に記載された［１３］。ＮＨＢＡのＣ－断片（ＮＨＢＡ－ｃ）の発現のために、プライマー５’－ＡＴＴＡｃｔｃｇａｇＴＣＧＣＴＴＣＣＧＧＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣ－３’（配列番号９）及びプライマー５’－ＴＧＡＡｇｇａｔｃｃＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＴＣ－３’（ＸｈｏＩ部位及びＢａｍＨＩ部位をそれぞれのプライマー中で小文字で示す）（配列番号１０）を使用してＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１から増幅されたｃＮＨＢＡを含有するｐＥＴ１９ｂプラスミドにより、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。発現を、ＯＤ_６００が０．４の培養物への１ｍＭ ＩＰＴＧの添加、及び２０℃で２４時間のインキュベーションによって誘導した。以前に記載されるように［１３］、タンパク質を、ＴＡＬＯＮ親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して精製した。

ポリクローナル抗体の生成
５匹の３週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ、ＷＡ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の群を、２５μｇの組み換えタンパク質により、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント（Ｍｅｒｃｋ）または水酸化アルミニウム（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ；ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）と共に、０、２１、２８及び４２日目に皮下免疫した。末梢血を５６日目に収集し、遠心分離を介して血清を収集した。免疫前血清を、免疫前に各々のマウスから収集した。この研究は、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｒｐｏｓｅｓの推奨に従って、及びＧｒｉｆｆｉｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＥＣ）からの承認により実行された。

ポリクローナルＮＨＢＡ抗体を、組み換えＮＨＢＡを備えた親和性クロマトグラフィーを使用してマウス血清から精製した。ＮＨＢＡを、製造者の指示を使用してＮ－ヒドロキシスクシンイミジル－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｍｅｒｃｋ）へカップルし、ＰＢＳで１／２希釈したマウス血清によりインキュベーションした。結合された抗体を、０．１Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ３．０）により溶出させた。溶出させたサンプルを、Ａｍｉｃｏｎ－Ｕｌｔｒａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｓｐｉｎ ｕｎｉｔ（Ｍｅｒｃｋ）を使用してＰＢＳへとバッファー交換した。抗体濃度をＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）により決定した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
以前に記載されるように［１３、３０、３１］、１００μｌのコーティングバッファー（０．５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６）中の１００ｎｇの精製組み換えタンパク質により室温で１時間コーティングした９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐ（ＮＵＮＣ）プレートを使用して、ＥＬＩＳＡを三重検体で遂行した。ＥＬＩＳＡ力価は、平均陰性（一次抗体を除くすべての試薬）＋３標準偏差より大きい、４５０ｎｍでの吸光度の最も高い血清希釈である。

血清殺菌活性（ＳＢＡ）アッセイ及びオプソニン化貪食性殺傷（ＯＰＡ）アッセイ
以前に記載されるように［３０、３１］、ＳＢＡアッセイ及びＯＰＡアッセイを遂行した。簡潔には、およそ１ｘ１０^３のコロニー形成単位（ＣＦＵ）のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを、熱非動化した（５６℃、６０分間）抗ＮＨＢＡマウス血清または免疫前マウス血清の連続希釈物中で、３７℃で１５分間インキュベーションした。ＳＢＡアッセイを、補体供給源（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにより前吸収した１０％（ｖ／ｖ）の正常ヒト血清［３０］）を添加し（図２１）、続いて３７℃、５％のＣＯ_２で３０分間インキュベーションすることによって開始した。ＯＰＡアッセイを、補体供給源及び約１×１０^５の多形核白血球（ＰＭＮ）を添加し、続いて３７℃、５％のＣＯ_２で９０分間インキュベーションすることによって開始した。各々のウェルの内容物の連続希釈物をＧＣアガー上でプレーティングし、一晩増殖させた。力価は、アッセイにおいて５０％を超える殺傷を誘導した最も高い抗体希釈である。統計分析を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定を使用して遂行した。各々の実験を、各々の実験において三重サンプルで３回遂行した。

フローサイトメトリー分析
以前に記載されるように［２８］、フローサイトメトリーを使用して、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及びＣ３断片沈着へ結合する抗体を測定した。簡潔には、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１（約１×１０^７ＣＦＵ）を、ＨＢＳＳ^＋（０．１５ｍＭのＣａＣｌ_２及び０．５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含有するハンクス平衡塩類溶液）中の、熱非動化マウス血清の１：１００希釈物または７０μｇ／ｍＬの精製ＮＨＢＡ抗体によりプレインキュベーションした。抗体処理細菌を洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ）の１：２００希釈物、または３７℃で１５分間Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにより前吸収した５％の正常ヒト血清によりインキュベーションし、その後に、Ｃ３断片を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＣ３ｃ抗体（ＢｉｏＲａｄ）の１：２００希釈物による細菌のインキュベーションによって検出した。データを、ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して捕捉し、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ＳＰＲ競合アッセイを、Ｐａｌｌ Ｐｉｏｎｅｅｒ ＦＥを使用して遂行した。以前に記載されるように［３０］、ＯｎｅＳｔｅｐアッセイビルダー中のＮｅｘｔＳｔｅｐインジェクションを使用して、競合アッセイを遂行した。免疫前及び免疫後のＮＨＢＡマウス血清を第１のインジェクションとして（Ａ）及びヘパリンを第２のインジェクションとして（Ｂ）使用した。ＮＨＢＡへのヘパリン（５０μＭの最大のＯｎｅＳｔｅｐ濃度）の結合を、血清有り及び無しと、ならびに免疫前または免疫後の血清の１：２００希釈物と比較した。データを、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージを使用して収集し、Ｑｄａｔ分析ソフトウェアを使用して分析した。パーセンテージブロッキングを、血清無しのヘパリンインジェクション（インジェクションＡ＝バッファー；Ｂ＝ヘパリン）ｖｓ血清を差し引いた（インジェクションＡ＝免疫前／免疫後の血清；Ｂ＝バッファー）、血清の存在下におけるヘパリンの結合（インジェクションＡ＝免疫前／免疫後の血清；Ｂ＝ヘパリン）の相対的なＲＭａｘに基づいて計算した。

上皮細胞接着アッセイ
以前に記載されるように［３１］、淋菌接着アッセイを以下の修飾により遂行した。簡潔には、ｔＣＸ細胞及びｔＵＥＣ細胞の単層を、熱非動化マウス血清の連続希釈物により室温で３０分間最初にプレインキュベーションしたおよそ１×１０^５ＣＦＵにより感染させた（３７℃で１０分間）。感染に続いて、細胞単層を暖めたＨＢＳＳにより３回洗浄して、非接着細菌を除去し、ウェル内容物をＧＣアガーの上へプレーティングした。結果を３つの重複したウェルからの平均ＣＦＵとして計算し、抗体無しの対照に比べた接着細菌のパーセンテージとして示した。統計分析を、ＡＮＯＶＡ及びＳｔｕｄｅｎｔの両側ｔ検定により遂行した。各々の実験を３回遂行した。

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１６ Ｍｕｂａｉｗａ， Ｔ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｂｅｘｓｅｒｏ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ Ｂ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＮＨＢＡ ｉｓ ａ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ８， ６５１２ （２０１８）．
１７ Ｓｅｒｒｕｔｏ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＧＮＡ２１３２， ａ ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０７， ３７７０－３７７５ （２０１０）．
１８ Ｖａｃｃａ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ （ＮＨＢＡ） Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１， ｅ０１６２８７８ （２０１６）．
１９ Ｍａｒｉｔａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ＮＨＢＡ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ａ ｂｒｏａｄｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３， ｅ０２０１９２２ （２０１８）．
２０ Ｍａｒｉｔａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆａｂｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｂｅｘｓｅｒｏ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＮＨＢＡ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ Ｃｏｍｍｕｎ ７３， ３０５－３１４ （２０１７）．
２１ Ｐｉｚｚａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ ｂｙ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７， １８１６－１８２０ （２０００）．
２２ Ｇｉｕｌｉａｎｉ， Ｍ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３， １０８３４－１０８３９ （２００６）．
２３ Ｗｅｌｓｃｈ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｇｅｎｏｍｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ２１３２， ａ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ， ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １８８， １７３０－１７４０ （２００３）．
２４ Ｐｌｅｓｔｅｄ， Ｊ． Ｓ． ＆ Ｇｒａｎｏｆｆ， Ｄ． Ｍ． Ｖａｃｃｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｇｒｏｕｐ Ｂ． Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５， ７９９－８０４ （２００８）．
２５ Ｍｕｚｚｉ， Ａ．， Ｍｏｒａ， Ｍ．， Ｐｉｚｚａ， Ｍ．， Ｒａｐｐｕｏｌｉ， Ｒ． ＆ Ｄｏｎａｔｉ， Ｃ． Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ． ＭＢｉｏ ４， ｅ００１６３－００１１３ （２０１３）．
２６ Ｒａｊａｍ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （ＭＡＴＳ）－Ｂａｓｅｄ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ Ｂ Ｃｏｖｅｒａｇｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ＭｅｎＢ－４Ｃ Ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ． ｍＳｐｈｅｒｅ ２ （２０１７）．
２７ Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎ， Ｔ． Ｅ．， Ｋｏｌｂｅｒｇ， Ｊ．， Ａａｓｅ， Ａ．， Ｈｅｒｓｔａｄ， Ｔ． Ｋ． ＆ Ｈｏｉｂｙ， Ｅ． Ａ． Ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｉｓｏｔｙｐｅｓ ｄｉｆｆｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｎｄ ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｈｅｎ ｒｅａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｐ１．１６ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎ ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰｏｒＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ． Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５９， ３４－３９ （２００４）．
２８ Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｈ Ｄｏｍａｉｎｓ ６ ａｎｄ ７ Ｆｕｓｅｄ ｔｏ ＩｇＧ１ Ｆｃ Ａｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇａｉｎｓｔ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１， ２７００－２７０９ （２０１８）．
２９ Ｓｔｅｉｃｈｅｎ， Ｃ． Ｔ．， Ｓｈａｏ， Ｊ． Ｑ．， Ｋｅｔｔｅｒｅｒ， Ｍ． Ｒ． ＆ Ａｐｉｃｅｌｌａ， Ｍ． Ａ． Ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ ｃｅｒｖｉｃｉｔｉｓ： ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｂｉｏｆｉｌｍ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ １９８， １８５６－１８６１ （２００８）．
３０ Ｊｅｎ， Ｆ． Ｅ． Ｃ．， Ｓｅｍｃｈｅｎｋｏ， Ｅ． Ａ．， Ｄａｙ， Ｃ． Ｊ．， Ｓｅｉｂ， Ｋ． Ｌ． ＆ Ｊｅｎｎｉｎｇｓ， Ｍ． Ｐ． Ｔｈｅ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ （ＭｓｒＡ／Ｂ） Ｉｓ ａ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｘｐｏｓｅｄ， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ， Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０ （２０１９）．
３１ Ｓｅｍｃｈｅｎｋｏ， Ｅ． Ａ．， Ｄａｙ， Ｃ． Ｊ． ＆ Ｓｅｉｂ， Ｋ． Ｌ． ＭｅｔＱ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ Ｉｓ ａ Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｔｈａｔ Ｅｌｉｃｉｔｓ Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ８５ （２０１７）．

実施例２
淋菌のＮｅｉｓｓｅｒｉａ属のヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ）は、ミクロコロニー形成に関与し、血清耐性及び上皮細胞への接着に寄与する
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属のヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ）は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（それはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに密接に関連する）によって引き起こされる侵襲性疾患に対して防御するために認可された４構成要素の髄膜炎菌血清群Ｂワクチン（４ＣＭｅｎＢ、商品名Ｂｅｘｓｅｒｏ）中に存在する［９］。ＮＨＢＡの淋菌ホモログはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株において表面に曝露され、高度に保存され（＞９３％の同一性）、４ＣＭｅｎＢ中に存在する髄膜炎菌ＮＨＢＡバリアント２（ＮＨＢＡ－２）への６７％の同一性を共有し［１０］、４ＣＭｅｎＢをワクチン接種された人々からヒト血清によって認識される［１１］。

髄膜炎菌ＮＨＢＡは、株ＭＣ５８（ＮＨＢＡ－３を発現する）において最も大規模に研究され、アルギニンリッチ領域（Ａｒｇ領域）を介してグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヘパリンを結合する能力に基づいて命名され、ヘパリンへのＮＨＢＡ結合は、血清に対する髄膜炎菌の耐性を増加させ［１２］、ヘパラン硫酸との相互作用は、上皮細胞への結合を媒介する［１３］。ＮＨＢＡは、他の複数のグリカンを結合し、最も高い親和結合がコンドロイチン硫酸に対して観察される［１４］。髄膜炎菌ＮＨＢＡは、ヒトラクトフェリン［１２］、カリクレイン［１５］ 、及びＣ３転換酵素［１６］、そして髄膜炎菌ＮａｌＰ［１２］を含む複数のプロテアーゼの標的である。ＮａｌＰはアルギニンリッチ領域の後でＮＨＢＡを切断し、ＮａｌＰを発現するＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの高病原性株は、血管透過性を増加させるＮＨＢＡ断片を放出することが推測された［１７］。ＮＨＢＡ－２はまたより低い温度（３２℃ ｖｓ ３７℃）で発現が増加し［１８］、バイオフィルム形成において役割を果たす［１９］。淋菌ＮＨＢＡはまだ特徴づけられていないが、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、ＮａｌＰを発現せず［２０］、そのＮＨＢＡは短縮されたＡｒｇ領域を有し［１０］、当該ＮＨＢＡが、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに比較して、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて異なる役割を果たし得ることを示す。この実施例において、病因におけるその役割を記載し、淋菌治療標的またはワクチン候補としてその可能性のある使用を支持するために、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおけるＮＨＢＡの機能を調査する。

方法
配列分析
ＮＨＢＡ配列（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１アクセッションＥＥＨ６１８５７．１；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８ ＡＡＦ４２５８６．１）を、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ中のＣＬＵＳＴＡＬによりアライメントさせた。ＮＨＢＡについてのＰｕｂＭＬＳＴ命名法を使用し、各々の固有のペプチド配列に識別番号を割り当てる（例えばＮＨＢＡ＿ペプチド５４２［ＮＨＢＡ－５４２］はＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１中にある）。

Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの増殖及び表現型の特徴評価
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１を、５％のＣＯ_２により３２℃または３７℃で、１％（ｖ／ｖ）のＩｓｏＶｉｔａｌｅＸ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含むＧＣアガー（Ｏｘｏｉｄ）またはＧＣブロス上で培養した。カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を、ノックアウト株及び補完された株のためにそれぞれ使用した。大多数の淋菌集団は、位相差顕微鏡によって決定されるように、線毛で覆われ、不透明タンパク質を発現した。増殖速度及び凝集の実験をＧＣブロス中で遂行し、６００ｎｍでの光学的密度（ＯＤ_６００）を１時間ごとに測定した［２１、２２］。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析から、これらの株における、ピリン（ΔＮＨＢＡ及びΔＮＨＢＡ＿Ｃに比較して、ＷＴにおいてわずかに少ないピリン；図１４Ｂ）、Ｐｏｒ及びＯｐａを包含する主要な外膜タンパク質（図１４Ｃ）、ならびにリポオリゴ糖（ＬＯＳ）（図１４Ｄ）の類似する分子量及び存在量も示された。指示される場合に、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを、凝集分析のために０．２５％のトリプシン中で５分間トリプシン処理した。

Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＮＨＢＡ変異株及び組み換えＮＨＢＡの構築
ｎｈｂａ遺伝子（ＮＧＡＧ＿００７２５）を、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１から増幅し（プライマー５’－ＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＡＧＴＧＴＧＡＴＴＧＣ－３’（配列番号３）；プライマー５’－ＴＣＡＡＴＣＣＣＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＣ－３’（配列番号４））、ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中へクローニングした。カナマイシン耐性遺伝子（ｐＵＣ４Ｋａｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、インバースＰＣＲ（プライマー５’－ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＧＡＧＡＴＴＣＣＧＣＴＧＡＴＴＣＣ－３’（配列番号５）；プライマー５’－ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＡＣＣＴＣＣＴＣＧＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣ－３’（配列番号６）；ＢａｍＨＩ部位に下線を引いた）を使用して、ｎｈｂａの中央へ導入されたＢａｍＨＩ部位の中へ挿入した。ｎｈｂａ：：ｋａｎコンストラクトを直線化し、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１の中へ形質転換して、ｎｈｂａ：：ｋａｎ（ΔＮＨＢＡ）を生成した。補完プラスミドｐＣＴＳ３２を使用して、インタクトなｎｈｂａ遺伝子（プライマー５’－ＧＧＣＡＴＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡＣＡＡＴＡ－３’（配列番号７）；プライマー５’－ＴＣＡＡＴＣＣＣＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧＣ－３’（配列番号８））をΔＮＨＢＡの中へ導入することによって、補完された株（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）を生成した［２３］。ｎｈｂａ遺伝子の欠失及び後続の補完を、ＰＣＲ及びウエスタンブロットによって確認した。

Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ １２９１ ｎｈｂａ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１中のｐＥＴ１９ｂの中へクローニングし、以前に記載されるように［１１］、全長成熟ＮＨＢＡ（シグナル配列無し）組み換えタンパク質を発現させ精製した。

ポリクローナル抗ＮＨＢＡの生成
５匹の３週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の群を、２５μｇの組み換えＮＨＢＡにより、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント（Ｍｅｒｃｋ）と共に、０、２１、２８、及び４２日目に皮下免疫した。末梢血を５６日目に収集し、遠心分離を介して血清を収集した。この研究は、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。

ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、及びフローサイトメトリー
以前に記載されるように［２４］、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ全細胞溶解物からのＮＨＢＡ発現のウエスタンブロット分析（４～１２％ビス－トリスＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して分離した）を、マウス抗ＮＨＢＡにより遂行した。以前に記載されるように［２４］、ウサギ抗ＮＧＡＧ＿０１２２８を使用して、ペリプラズムタンパク質を検出した。

全細胞Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅへのＨｉｓタグ組み換えＮＨＢＡ結合のＥＬＩＳＡ分析を、標準的なプロトコル［１１、２５］に従って、ＨＲＰコンジュゲートＨｉｓタグ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、室温で３０分間のインキュベーション後に測定した。

Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの表面上のＮＨＢＡ発現を、細菌（約１０^８ＣＦＵ）によるフローサイトメトリーによって測定し（以前に記載されるように（［２４、２６］）、当該細菌は、抗ＮＨＢＡ（１：２００、３０分間）によりインキュベーションし、ＰＢＳにより３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（１：２００、１時間；Ｔｈｅｒｍｏ）によりインキュベーションし、洗浄し、次いでホルムアルデヒド（２．５％、１５分間）中で固定したものである。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（約１０^７ＣＦＵ）またはヒトのｔＣＸ細胞及びｔＵＥＣ細胞（約５×１０^５細胞）へのＦＩＴＣ標識淋菌ＮＨＢＡ（１００μｇ／ｍＬ）の結合を、３７℃で２０分間インキュベーション後に測定した。すべてのサンプルを、ＣｙＡｎ ＡＤＰフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。データ分析を、ＦｌｏｗＪｏを使用して遂行した。

顕微鏡法
蛍光顕微鏡法を使用して、ｔＣＸ細胞（ガラスのカバースリップ上で完全なコンフルエンスまで培養した）と３７℃で２０分間インキュベーションした淋菌ＮＨＢＡ（１００μｇ／ｍＬ）の相互作用を測定した。細胞を３回洗浄して、未結合のタンパク質を除去し、ホルムアルデヒド（２．５％、１５分間）中で固定した。ＮＨＢＡ_Ｎｇを、抗ＮＨＢＡ（１：１０００）［１１］ 及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗マウスＩｇＧ（１：２００；Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、検出した。細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ファロイジン（Ｔｈｅｒｍｏ）、及びＤＡＰＩで核を対比染色した。ガラスのカバースリップを、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して顕微鏡用スライド上にマウントし、画像をＮｉｋｏｎ Ａ１Ｒ共焦点顕微鏡で捕捉し、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ（Ｎｉｋｏｎ）を使用してデータを分析した。

約１×１０^６ＣＦＵのＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにより３７℃で５時間インキュベーションしたｔＵＥＣ細胞を使用して、淋菌ミクロコロニー形成を調査した。細胞単層を３回洗浄して（ＨＢＳＳ）非接着細菌を除去し、２％のグルタルアルデヒド及び５％のホルムアルデヒド水溶液中で３０分間固定し、以前に記載されるように［２７］走査電子顕微鏡法を遂行し、ＪＣＭ－５０００ ＮｅｏＳｃｏｐｅ（商標）（ＪＥＯＬ）を使用して画像捕捉した。

グリカン結合分析
以前に記載されるように［１４、２８］、グリカンアレイ実験を、組み換えＮＨＢＡ（１μｇ）及びＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓグリカンアレイ（ｖ３．０）により遂行した。陽性結合は、３つの独立した反復において、調整されたバックグラウンドの＞１倍を超える平均蛍光（スライドバックグラウンドの平均＋３標準偏差）のスポットへ割り当てられた（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｐ＜０．００１）。

以前に記載されるように［１４、２５］、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を、シリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのアミンカップリングによってフローセル２～４に固定化された組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇ（１００μｇ／ｍｌ）を備えたＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して遂行した。フローセル１を参照細胞として使用し、エタノールアミンのみにより固定化した。単一サイクルキネティクスを使用して、１００μＭ～１ｎＭの濃度での１：５希釈系列において実行されたグリカンとの相互作用の親和性（Ｋ_Ｄ）を計算した。結果を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００ソフトウェア２．０．２を使用して分析した。

正常ヒト血清（ＮＨＳ）生存アッセイ
以前に記載されるように［２４］、血清媒介性殺傷に対するＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの耐性を試験し、約１０^４ＣＦＵを、３７℃で６０分間１０％（ｖ／ｖ）でインキュベーションし、後続してＧＣアガー上でプレーティングした。細菌を、指示される場合に、６μＭのヘパリンにより３０分間プレインキュベーションした。細菌生存を、非処理対照と比べたパーセントＣＦＵ（３つの重複したウェルからの平均）として計算した。

接着アッセイ
以前に記載されるように［２６］、淋菌接着アッセイを、約１０^５ＣＦＵで、Ｅ６／Ｅ７形質転換初代ヒト子宮頸管（ｔＣＸ）細胞及び尿道上皮性（ｔＵＥＣ）細胞により１時間遂行した。接着ブロッキングアッセイを、組み換え淋菌ＮＨＢＡ（１～１００μｇ／ｍＬ）またはピーナッツアグルチニンレクチン（１００μｇ／ｍｌのＰＮＡ；ｔＣＸ細胞と結合しない陰性対照［２６］）により前処理し、その後にＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにより１０分間感染させた細胞において、同様に遂行した。結果を、野生型と比べたパーセント接着細菌（３つの重複したウェルからの平均）、及び非処理対照に比べた接着細菌のパーセントとして計算した接着ブロッキングとして報告した。接着及び血清生存アッセイを分離した３回の機会で三重検体で遂行し、統計分析をＡＮＯＶＡ及びＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定により遂行した。

結果
淋菌ＮＨＢＡの配列特色及び発現
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株によって発現される主要なＮＨＢＡバリアントはＮＨＢＡ－５４２であり、ＰｕｂＭＬＳＴデータベース中の淋菌単離体の＞４０％（株１２９１が含まれる）中に存在する［１１］。ＮＨＢＡ－５４２（本明細書においてＮＨＢＡ_Ｎｇと称される）は、４２６アミノ酸長であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株ＭＣ５８からの良く特徴づけられたＮＨＢＡ－３（本明細書においてＮＨＢＡ_Ｎｍと称される）において記載されているものに類似する配列特色（Ｎ末端中のリポボックスモチーフ及びポリグリシンストレッチ、ならびにタンパク質の中央部中のアルギニンリッチ領域が挙げられる）を含有する（図７Ａ）。しかしながら、挿入／欠失に起因して、ＮＨＢＡ_ＮｇとＮＨＢＡ_Ｎｍとの間に複数の差異がある（図７Ｂ）。淋菌ｎｈｂａ遺伝子のＮ末端半分は、ＮＨＢＡ－３に比較して６３アミノ酸の欠失を有し、これは主要な淋菌バリアント中で一貫する（図１３）。ＮＨＢＡ_ＮｇのＡｒｇ領域は、ＮＨＢＡ_Ｎｍに比較して短縮している。この領域は、Ｎｍ株［１２］と主要なＮｇ ＮＨＢＡバリアントとの間で高度に保存される（図１３；示されたバリアントは、３０６８の単離体のうちの９４％中で存在する［１１］）。

淋菌ＮＨＢＡの特徴づけを容易にするために、組み換えＨｉｓタグタンパク質（ＮＨＢＡ－５４２）をＥ．ｃｏｌｉ中で生成し、ポリクローナル抗ＮＨＢＡ抗体をマウスにおいて作製した。加えて、ＮＨＢＡのアイソジェニック突然変異を、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１中のｎｈｂａ遺伝子のオープンリーディングフレームの中へのカナマイシン耐性カセットの挿入によって生成し（ΔＮＨＢＡ）、この突然変異を、ゲノムの中へのｎｈｂａ遺伝子の単一コピーをトランスで再導入することによって補完した（ΔＮＨＢＡ＿Ｃ）。全細胞溶解物のウエスタンブロット分析から、抗ＮＨＢＡ血清によって５８～８０ｋＤａで単一バンドが検出され、野生型株におけるＮＨＢＡの発現が確認された。補完された株は、野生型と類似するレベルのＮＨＢＡを発現した一方で、ＮＨＢＡ発現は、変異株において検出されなかった（図７Ｃ；図１３）。ＮＨＢＡは、全細胞Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＷＴ及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株の表面上でもフローサイトメトリーによって検出された（図７Ｃ）。３２℃及び３７℃での対数増殖中期へのＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株の増殖から、より高い発現がより低い温度で観察され、淋菌ＮＨＢＡの発現が温度調節であることが明らかにされた（図７Ｂ及びＣ、図１４）。

淋菌ＮＨＢＡは、細胞凝集及びミクロコロニー形成に関与する
増殖におけるＮＨＢＡ_Ｎｇの役割をインビトロで調査するために、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株１２９１野生型、ΔＮＨＢＡ株、及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株を、ＧＣブロス及びＧＣアガーにより増殖させた。株はすべて光学的密度に関して同等な増殖速度及び最適増殖レベルを有していたが、ΔＮＨＢＡ変異株は、ＷＴ及びΔＮＨＢＡ＿Ｃの株に比較して、有意に低減した沈降速度を有していた（図８Ａ）。さらに、光学的密度を等しくしたサンプル（ＯＤ_６００＝１）をＧＣアガーの上へプレーティングした場合に、ＷＴ株またはΔＮＨＢＡ＿Ｃ株に比較して、ΔＮＨＢＡ株については、およそ３倍高い数の生存能力のあるＣＦＵがあった（図８Ｂ）。これらのサンプルのトリプシンによる処理は、すべての３つの株について等しくなったＣＦＵカウントをもたらし（ＷＴ及びΔＮＨＢＡ＿Ｃのカウント可能なＣＦＵは、それぞれ２．６倍及び２．４倍増加したが、ΔＮＨＢＡのＣＦＵは影響されなかった）（図８Ｂ）、表現型が、細胞分離の欠陥ではなく細胞凝集に起因することを指摘する。３つの染色のグラム染色分析±トリプシン処理から、無処理ＷＴ株及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株における細胞凝集体の存在が確認された（図１５Ａ）。さらに、ウエスタンブロット分析から、トリプシン処理は、細菌表面からのＮＨＢＡを消化するが、ペリプラズム対照タンパク質を変更しなかったことが示された（図１５Ｂ）。この知見に従って、後続する実験において使用されるΔＮＨＢＡサンプルの体積を、ＣＦＵ数を等しくするように調整した。淋菌線毛及び不透明タンパク質は、細菌凝集体の形成において以前に暗示され、位相差顕微鏡から、ＷＴ株、ΔＮＨＢＡ株、及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株が、線毛形成及び不透明性に関して同一のコロニー形態を共有することが確認された。

ＮＨＢＡ_Ｎｇが、凝集を促進するように淋菌表面と直接相互作用するかどうかを決定するために、組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇによるフローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡを使用した。フローサイトメトリー分析から、全細胞Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅへのＦＩＴＣ標識組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇの結合が示された（図８Ｃ）。このことは、全細胞ＥＬＩＳＡを使用して確認され、組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇは濃度依存的様式でＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを結合した（図８Ｄ）。

細菌－細菌相互作用及び淋菌凝集体の形成におけるＮＨＢＡの役割をさらに研究するために、ΔＮＨＢＡがミクロコロニーを形成する能力を調査した。ＷＴ株またはΔＮＨＢＡ＿Ｃ株とは異なり、ΔＮＨＢＡ株は、５時間の増殖後に、ガラスのカバースリップスライドの表面またはヒト尿道上皮単層上にミクロコロニーを形成することが可能ではなかった（図９）。ＮＨＢＡ_Ｎｇの自己会合特性が淋菌バイオフィルムの確立において役割を果たすかどうかを調査するために、バイオフィルムアッセイも遂行した。しかしながら、２４～２６時間にわたる静的条件下で、バイオフィルム形成の差異は、ＷＴ株、ΔＮＨＢＡ株、及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株について観察されなかった（データ不掲載）。

ＮＨＢＡ_Ｎｇは、高親和性で複数のグリカンへ結合する
淋菌ＮＨＢＡのグリカン結合プロファイルを、ヒト細胞で見出されるグリカンを代表する３６８の構造を提示するアレイ（類似する構造を有するが、鎖長、化学的リンケージ、またはスペーサーサイズが異なる、異性体及び／またはグリカンを含む）によるグリカンアレイ解析を使用して決定した。ＮＨＢＡ_Ｎｇは、ＧＡＧヘパリン、ヘパラン硫酸、及びコンドロイチン硫酸を含むアレイ（図１６；表４）上で、３９のグリカン構造へ結合した。ＮＨＢＡ_Ｎｇは、ラクト－Ｎ－ビオースコア構造及びＮ－アセチルラクトサミンコア構造（すなわちＬＮｎＴ）（それらのシアル化及びフコシル化されたバリアント（すなわちｓＬｅＸ）を包含する）、そしてＮ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、グルコシル、及びマンノシルグリカンの限定的なセットを含有する複数の構造とも結合した。

グリカンと組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇの相互作用のキネティクスを特徴づけるために、アレイ上で結合した、選択されたＧＡＧ（図１０Ａ）及び非ＧＡＧグリカン（図１０Ｂ）を使用して、ＳＰＲ分析を遂行した。すべての試験されたＮＨＢＡ_Ｎｇ－グリカン相互作用の最も高い計算された親和性は、ヘパリン（Ｋ_Ｄ４．４ｎＭ）、続いてコンドロイチン硫酸（Ｋ_Ｄ７３ｎＭ）によるものであった。様々な硫酸化パターンによる反復多糖から構成されるＧＡＧ構造は、高度に不均質である。ＮＨＢＡ_Ｎｇが、特異的な硫酸化立体配置を備えたグリカンと優先的に結合するかどうかを決定するために、３つのタイプのコンドロイチン硫酸（Ａ、Ｂ、及びＣ）による実験を遂行した。ＮＨＢＡ_Ｎｇはコンドロイチン硫酸Ｃ（コンドロイチン６－硫酸）のみと結合し、濃度依存的結合は、コンドロイチン硫酸Ａ（コンドロイチン４－硫酸）またはコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）について観察されなかった。しかしながら、ＮＨＢＡ_Ｎｇがヘパラン硫酸とより低い親和性（Ｋ_Ｄ２．７９μＭ）で結合することも示される。非ＧＡＧグリカンに関して、ＮＨＢＡ_Ｎｇは、α２－６シアル化五糖（ＬＳＴｃ）（Ｋ_Ｄ０．２４μＭ）と、その異性体ＬＳＴｂ（Ｋ_Ｄ２．２６μＭ）及びＬＮｎＴ（Ｋ_Ｄ４．８９μＭ）の非シアル化バリアントよりも、高い親和性で結合する。さらに、ＮＨＢＡ_Ｎｇは、シアリルＬｅｗｉｓ Ｘ（Ｋ_Ｄ３．６５μＭ）についてよりも、Ｌｅｗｉｓ Ｘ（Ｋ_Ｄ０．６８μＭ）へ５倍大きい親和性を有する。濃度依存的結合は、ヒアルロナン（非硫酸化ＧＡＧ）またはＨ－二糖について観察されず、これらは、グリカンアレイ上でＮＨＢＡ_Ｎｇによって結合されず、陰性対照として使用された。

淋菌ＮＨＢＡは、上皮細胞へ結合する
ＮＨＢＡ_Ｎｍは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用によってそのＡｒｇ領域を介して上皮細胞へ結合する［１３］。ＮＨＢＡ_Ｎｇも上皮細胞と相互作用するかどうかを調査するために、共焦点顕微鏡及びフローサイトメトリー分析を、組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇならびに子宮頸管上皮細胞及び尿道上皮細胞により遂行した。共焦点顕微鏡のために、組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇ（ｒＮＨＢＡ_Ｎｇ）をヒト子宮頸管上皮性（ｔＣＸ）細胞と共にインキュベーションし、マウス抗ＮＨＢＡ一次抗体及びＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８二次抗体を使用して検出した。ｔＣＸ細胞へのＮＨＢＡ_Ｎｇの結合が観察され（白色矢印、図１１Ａ（Ｉ））、タンパク質シグナルは細胞の表面に局在していた（白色矢印、図１１Ａ（ＩＩ））。ｔＣＸ細胞への一次抗体（図１１Ａ（ＩＩＩ））または二次抗体（図１１Ａ ＩＶ）の非特異的結合は観察されなかった。フローサイトメトリーによる分析から、ＮＨＢＡ_Ｎｇが子宮頸管上皮細胞及び尿道上皮細胞と結合することがさらに確認された（図１１Ｂ）。

ＮＨＢＡは、淋菌の血清生存及び上皮細胞への接着に寄与する
グリカン、淋菌細胞、及びヒト上皮細胞のＮＨＢＡ_Ｎｇ相互作用の機能的役割を調査するために、血清生存及び上皮細胞接着アッセイを遂行した。正常ヒト血清の１０％（ＷＴ株について致死量以下の血清濃度）中のＷＴ株、ΔＮＨＢＡ株、及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株により遂行された血清生存アッセイから、ΔＮＨＢＡ株が、ＷＴ株及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株と比べて、およそ５倍低減した生存であったことが示された（図１２Ａ）。ヒト血清への曝露前のヘパリンによる淋菌の前処理は、ΔＮＨＢＡ変異株の生存を、ＷＴ株及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株のものへ匹敵するレベルへ増加させた。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、ヘパリンと相互作用する複数のタンパク質（例えばＯｐａ［２９］）を発現し、それらはΔＮＨＢＡ株における血清耐性の回復を導き得る。

Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ感染におけるＮＨＢＡ_Ｎｇの役割を調査するために、ヒトの子宮頸管上皮細胞及び尿道上皮細胞、ならびにＷＴ株、ΔＮＨＢＡ株、及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株によるインビトロの感染アッセイを遂行した。上皮細胞による感染アッセイについては、ΔＮＨＢＡ突然変異は、ＷＴと比べて、ｔＣＸ細胞及びｔＵＥＣ細胞のそれぞれ１１倍及び１２倍低減した接着であった（図１２Ｂ）。組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇまたは陰性対照タンパク質ＰＮＡのいずれかにより前処理した細胞による接着アッセイも遂行した。ＮＨＢＡ_Ｎｇ処理細胞への淋菌接着は、濃度依存的様式（すなわち１００及び１０μｇ／ｍＬのＮＨＢＡ_Ｎｇで、それぞれ２．５及び１．７倍）で低減したが、１００μｇ／ｍＬのＰＮＡ（これらの細胞を結合しない陰性対照）による細胞の処理は、細菌接着に対する効果を有していなかった（図１２Ｃ）。

考察
性行為感染症の淋病は、感染率の上昇及び抗微生物物質耐性の増加に起因して、公衆衛生上の懸念が高まっている。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、主として粘膜表面でコロニーを形成し、淋菌の伝染、コロニー形成、及び病因は、複雑な多因子性のプロセスである［３０中で概説される］。淋菌感染症のすべてのステージの理解の増加は、新しい治療及び予防の戦略の開発を支援するために要求される。この研究において、グリカンとＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅとヒト上皮細胞との相互作用に関して、淋菌ＮＨＢＡを特徴づけ、ミクロコロニー形成、ヒト血清への耐性、及び上皮細胞への接着における関与を明らかにする。

ＮＨＢＡは、髄膜炎菌血清群Ｂワクチン４ＣＭｅｎＢの開発の一部分としてリバースワクチン学を介してＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて最初に同定され［３１、３２］、その機能的役割はそれ以来詳細に特徴づけられてきた［１２～１６］。淋菌ＮＨＢＡタンパク質と髄膜炎菌ＮＨＢＡタンパク質との間の比較的高いレベルの配列同一性（約６７％同一性［１１］）にもかかわらず、ＮＨＢＡ配列と２つの病原性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種に見られる病態との間の複数の差異があり、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＮＨＢＡの詳細な分析を促した。ＮＨＢＡは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓよりもＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいてより保存され［１１］、本明細書において、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＮ末端中の６３アミノ酸欠失及び短縮されたＡｒｇ領域がすべての主要な淋菌ＮＨＢＡバリアントにおいて保存されていることが確認される。それゆえ、本明細書において示されたデータは、大部分のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ株におけるＮＨＢＡの役割をおそらく代表する。

本明細書のグリカンアレイ解析において、組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇは、複数のＧＡＧ（ヘパリン、ヘパラン硫酸及びコンドロイチン硫酸等）を含む、３９のグリカンへ結合した。本発明者らは、ＮＨＢＡ_Ｎｍが２８のグリカンと相互作用することを以前に示し［１４］、ＳＰＲ分析から、ＮＨＢＡ_Ｎｇ及びＮＨＢＡ_Ｎｍが共通して少なくとも４つのグリカン（ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、Ｇｌｃ－６Ｐ）と結合することが確認されたが、タンパク質間の重要な差異は、ＮＨＢＡ_Ｎｇが、ＮＨＢＡ_Ｎｍよりも、ヘパリンについてより高い結合親和性、ならびにコンドロイチン硫酸及びグルコース６－リン酸についてより低い親和性を有するということである。これはおそらく、ＧＡＧへのＮＨＢＡ_Ｎｍの結合に関与することが公知のＡｒｇ領域中の差異に起因する［１２、１３］。さらに、Ｎｇ ＮＨＢＡ_Ｎｇは、典型的には宿主細胞の表面上で見出すことができる、Ｌｅｗｉｓ Ｘ及びシアリルＬｅｗｉｓ Ｘ抗原、ラクトＮ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）及びグリカンアレイ上のそのシアル化されたバリアントと相互作用するが、ＮＨＢＡ_Ｎｍはしない。ＮａｌＰによるＮＨＢＡ_Ｎｍの髄膜炎菌性の切断は、Ａｒｇリッチ領域を含有し、血管透過性を増加させる［１７］、Ｃ２と呼ばれるＣ末端断片を放出する［１２］。追加で、ヒトプロテアーゼのラクトフェリン及びカリクレインは、Ａｒｇ領域の下流でＮＨＢＡ_Ｎｍを切断し［１２、１５］、血清Ｃ３転換酵素は、放出されたＮＨＢＡ Ｃ２断片を切断し、Ａｒｇ領域を除去し、細胞に対するタンパク質の毒性効果を打ち消すことができる［１６］。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅはｎａｌＰ遺伝子を有していない［２０］ので、ＮＨＢＡ_ＮｇはＡｒｇ領域の上流で切断されなかった。ＮＨＢＡ_Ｎｇはヒトラクトフェリンによって切断されず（データ不掲載）、カリクレイン及びＣ３転換酵素によって切断は調査されていない。しかしながら、ＮａｌＰの非存在に起因して、ＮＨＢＡ_Ｎｇがこれらのヒト酵素によって切断されても、機能的Ａｒｇ領域は、グリカン結合と関連する役割を媒介し得る淋菌表面へ結合されたままだろう。

淋菌ΔＮＨＢＡ変異株は、ＷＴ株及びΔＮＨＢＡ＿Ｃ株と比べて複数の表現型を提示し、当該表現型としては、ヒト血清中での生存の減少、凝集及びミクロコロニー形成の減少、そして子宮頸管上皮細胞及び尿道上皮細胞への接着の減少が挙げられる。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは播腫性疾患をめったに引き起こすことはないが、血清殺傷に耐える能力は広汎に研究されており、ポリン［３０～３２］、ＬＯＳ［３３］、及びＯｐａ［２８］を包含する因子によって媒介されることが見出されており、血清因子及び補体因子が生殖路及び他の粘膜表面中で存在するので、粘膜感染の時に関係がある［３４～３６］。ＮＨＢＡ_Ｎｍも血清生存に関与し、血清アッセイ前のヘパリンの添加は、血清感受性の非カプセル化親髄膜炎菌株の生存の増加をもたらすが、ΔＮＨＢＡ変異株はそうではない［１２］。ヘパリンは複数の補体因子と相互作用し［３７］、ＮＨＢＡ_Ｎｍによる補体調節タンパク質のヘパリン媒介性の動員は、血清耐性のための作用機序であることが提案された［１２］。本発明者らは、ΔＮＨＢＡ突然変異に比べたＷＴ株の表面への補体調節タンパク質のより高いレベルの動員に関与するＮＨＢＡ_Ｎｇについての類似する作用機序を提案する。たとえＮＨＢＡ_Ｎｇは、ＮＨＢＡ_Ｎｍよりもヘパリンについて高い親和性を有していても、試験された血清条件下でのＷＴの比較的高いレベルの生存、そしてアッセイへのヘパリンの添加後の淋菌ΔＮＨＢＡ突然変異の耐性の回復を説明する、血清耐性において役割を果たす追加の淋菌ヘパリン結合タンパク質（Ｏｐａ［２８］等）がある。

粘膜上皮への淋菌接着は、感染の確立において重要な第１のステップであり、初期の接着に続いて、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅコロニー形成は、上皮細胞表面上の着実な細菌凝集体及びミクロコロニーの形成に依存する［３０中で概説される］。初期の接着及びミクロコロニー形成の両方は、ＩＶ型線毛、不透明（Ｏｐａ）タンパク質、及びリポオリゴ糖（ＬＯＳ）を包含する、淋菌因子によって媒介される［２３、４２～４４］。しかしながら、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、線毛またはＯｐａの非存在下においてでさえも凝集体を形成し、ＧＣ凝集を促進する未知の宿主因子の存在が示唆される［４５］。ΔＮＨＢＡ突然変異は、野生型に比べて、子宮頸管上皮細胞及び尿道上皮細胞への接着の減少、そして凝集及びミクロコロニー形成の減少を提示したので、ＮＨＢＡ_Ｎｇが、淋菌感染症の確立において重要な役割を果たすことが示される。さらに、組み換えＮＨＢＡ_Ｎｇは上皮細胞及び淋菌細胞の両方と直接相互作用し、ＮＨＢＡ_Ｎｇは濃度依存的様式で上皮細胞への接着をブロックすることが可能である。これは、Ｈｅｃ１Ｂ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞とのＮＨＢＡ_Ｎｍの相互作用を媒介する上皮細胞上の宿主グリカンとのＮＨＢＡ相互作用の結果の可能性が高い［１３］。淋菌ＮＨＢＡは３２℃ ｖｓ ３７℃でアップレギュレートされ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおけるＮＨＢＡ調節と一致しており［１８］、咽頭におけるこれらの生物体による接着の時に、このニッチのより低い温度に起因して特に妥当であり得る。

ＮＨＢＡ_Ｎｇ媒介性バクテリア間相互作用、及びミクロコロニー形成におけるＮＨＢＡ_Ｎｇの役割は、ＬＯＳの一部分として淋菌細胞の表面上に存在するＬＮｎＴとの相互作用によって促進され得る［４６］。淋菌ミクロコロニーは宿主微絨毛と相互作用し、宿主細胞骨格の再構成及び皮質プラーク形成を導く［４７～５１］。ミクロコロニーは淋菌の抗生物質耐性の増加においても関与し［４５］、細菌凝集体の形成は精漿への曝露後に促進され、それは細菌伝染に影響を及ぼす［５２］。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ凝集体の形成は細胞表面上での剪断力への耐性のためにも重要であり［５３］、それはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにとっても重要であり得る。しかしながら、髄膜炎菌ＮＨＢＡが現在までに凝集に関与することが報告されていないことに注目することは興味深い［１３、５４、５５］。

要約すると、淋菌感染症及び病因の複数のステージの間のＮＨＢＡの役割が強調される。それゆえ、ＮＨＢＡ－自己及びＮＨＢＡ－宿主の相互作用の標的化は、有益な治療アプローチ及びワクチンアプローチであり得る。

本明細書を通して、目的は、本発明を任意の一実施形態または特定の特色の集合に限定すること無しに、本発明の好ましい実施形態を記載することであった。したがって、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱せずに、例示的な特定の実施形態において様々な修飾及び変化が行われ得ることは、当業者によって認識されるだろう。

本明細書において言及される、すべてのコンピュータープログラム、アルゴリズム、特許文献及び科学文献、ならびにタンパク質及び核酸配列またはアクセッション番号は、参照することによって本明細書に援用される。

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１８． Ｌａｐｐａｎｎ Ｍ， Ｏｔｔｏ Ａ， Ｂｒａｕｅｒ Ｍ， Ｂｅｃｈｅｒ Ｄ， Ｖｏｇｅｌ Ｕ， Ｊｏｈｓｗｉｃｈ Ｋ． Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｍｏｄｅｒａｔｅ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｎ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０１６；８４：３４８４－９５．
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３３． Ｒａｍ Ｓ， Ｃｕｌｌｉｎａｎｅ Ｍ， Ｂｌｏｍ ＡＭ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｃ４ｂ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏ ｐｏｒｉｎ： ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００１；１９３：２８１－９５．
３４． Ｒａｍ Ｓ， ＭｃＱｕｉｌｌｅｎ ＤＰ， Ｇｕｌａｔｉ Ｓ， Ｅｌｋｉｎｓ Ｃ， Ｐａｎｇｂｕｒｎ ＭＫ， Ｒｉｃｅ ＰＡ． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｔｏ ｌｏｏｐ ５ ｏｆ ｐｏｒｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １Ａ： ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｎｏｎｓｉａｌｙｌａｔｅｄ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９８；１８８：６７１－８０．
３５． Ｎｇａｍｐａｓｕｔａｄｏｌ Ｊ， Ｒａｍ Ｓ， Ｇｕｌａｔｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｗｉｔｈ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｅｖａｓｉｏｎ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８；１８０：３４２６－３５．
３６． Ｇｕｌａｔｉ Ｓ， Ｃｏｘ Ａ， Ｌｅｗｉｓ ＬＡ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ ｉｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ ｌａｃｔｏ－Ｎ－ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｐｅｃｉｅｓ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ Ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２００５；７３：７３９０－７．
３７． ＭｃＱｕｉｌｌｅｎ ＤＰ， Ｇｕｌａｔｉ Ｓ， Ｒａｍ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｉｍｕｌａｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｅｃｔｓ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９９９；１７９：１２４－３５．
３８． Ｂｉｓｃｈｏｆ Ｐ， Ｐｌａｎａｓ－Ｂａｓｓｅｔ Ｄ， Ｍｅｉｓｓｅｒ Ａ， Ｃａｍｐａｎａ Ａ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ３ （Ｃ３）． Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９９４；９：１６５２－９．
３９． Ｐｒｉｃｅ ＲＪ， Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ Ｂ． Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｍｕｃｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｐｅｒｍ－ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ １９７９；３２：６１－６．
４０． Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＧＦ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａ ａｎｄ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｍｕｃｕｓ． Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９８８；３：２８９－３００．
４１． Ｙｕ Ｈ， Ｍｕｎｏｚ ＥＭ， Ｅｄｅｎｓ ＲＥ， Ｌｉｎｈａｒｄｔ ＲＪ． Ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００５；１７２６：１６８－７６．
４２． Ｚｏｌｌｎｅｒ Ｒ， Ｏｌｄｅｗｕｒｔｅｌ ＥＲ， Ｋｏｕｚｅｌ Ｎ， Ｍａｉｅｒ Ｂ． Ｐｈａｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｇｏｖｅｒｎ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｉｅｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１７；７：１２１５１．
４３． Ｓｔｅｉｎ ＤＣ， ＬｅＶａｎ Ａ， Ｈａｒｄｙ Ｂ， Ｗａｎｇ ＬＣ， Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ Ｌ， Ｓｏｎｇ Ｗ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｏｐａｃｉｔｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ａｃｒｏｓｓ Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１５；１０：ｅ０１３４３４２．
４４． ＬｅＶａｎ Ａ， Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＬＩ， Ｍａｈｌｅ ＡＣ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｓｔｒａｉｎ ＭＳ１１ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ａｌｌ ｏｐａ ｇｅｎｅｓ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２０１２；１９４：６４６８－７８．
４５． Ｗａｎｇ ＬＣ， Ｌｉｔｗｉｎ Ｍ， Ｓａｈｉｈｏｌｎａｓａｂ Ｚ， Ｓｏｎｇ Ｗ， Ｓｔｅｉｎ ＤＣ． Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｉｔｓ Ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ （Ｂａｓｅｌ） ２０１８；７．
４６． Ｍａｎｄｒｅｌｌ ＲＥ， Ｇｒｉｆｆｉｓｓ ＪＭ， Ｍａｃｈｅｒ ＢＡ． Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ （ＬＯＳ） ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ａｎｄ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｈａｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ＬＯＳ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８８；１６８：１０７－２６．
４７． Ｌｅｅ ＳＷ， Ｈｉｇａｓｈｉ ＤＬ， Ｓｎｙｄｅｒ Ａ， Ｍｅｒｚ ＡＪ， Ｐｏｔｔｅｒ Ｌ， Ｓｏ Ｍ． ＰｉｌＴ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＰＩ（３，４，５）Ｐ３－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｒｏｓｓｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ａｎｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００５；７：１２７１－８４．
４８． Ｈｉｇａｓｈｉ ＤＬ， Ｌｅｅ ＳＷ， Ｓｎｙｄｅｒ Ａ， Ｗｅｙａｎｄ ＮＪ， Ｂａｋｋｅ Ａ， Ｓｏ Ｍ． Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ： ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｃｏｒｔｉｃａｌ ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２００７；７５：４７４３－５３．
４９． Ｍｅｒｚ ＡＪ， Ｓｏ Ｍ． Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｉｌｉａｔｅｄ， Ｏｐａ－ ａｎｄ Ｏｐｃ－ ｇｏｎｏｃｏｃｃｉ ａｎｄ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ ｔｏ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｃｔｉｎ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９７；６５：４３４１－９．
５０． Ｍｅｒｚ ＡＪ， Ｅｎｎｓ ＣＡ， Ｓｏ Ｍ． Ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｉ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｅ ｅｌｉｃｉｔ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９９；３２：１３１６－３２．
５１． Ｄｉｅｔｒｉｃｈ Ｍ， Ｂａｒｔｆｅｌｄ Ｓ， Ｍｕｎｋｅ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ｂｙ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｕｓ ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１１；１３：１１６８－８２．
５２． Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＭＴ， Ｄｅｗｅｎｔｅｒ Ｌ， Ｍａｉｅｒ Ｂ， Ｓｅｉｆｅｒｔ ＨＳ． Ｓｅｍｉｎａｌ ｐｌａｓｍａ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ａ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｓｔａｔｅ． ＭＢｉｏ ２０１４；５：ｅ０１００４－１３．
５３． Ｍｉｋａｔｙ Ｇ， Ｓｏｙｅｒ Ｍ， Ｍａｉｒｅｙ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｒｅｓｉｓｔ ｓｈｅａｒ ｓｔｒｅｓｓ． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ２００９；５：ｅ１０００３１４．
５４． Ｓｅｉｂ Ｋ， Ｏｒｉｅｎｔｅ Ｆ， Ａｄｕ－Ｂｏｂｉｅ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１０；２８：２４１６－２７．

５５． Ｓｅｒｒｕｔｏ Ｄ， Ｓｐａｄａｆｉｎａ Ｔ， Ｃｉｕｃｃｈｉ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＧＮＡ２１３２， ａ ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１０；１０７：３７７０－５．

Claims (24)

1. Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの単離されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ属のヘパリン結合抗原（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ）（ＮＨＢＡ）タンパク質の免疫原性断片。
2. 前記単離されたＮＨＢＡタンパク質が、配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む、請求項１に記載の免疫原性断片。
3. 前記単離されたＮＨＢＡタンパク質のＣ末端断片を含むかまたは前記Ｃ末端断片中に含有される、請求項１または請求項２に記載の免疫原性断片。
4. 配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含むか、それらの中に含有されるか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる、先行請求項のいずれか１項に記載の免疫原性断片。
5. 前記バリアントまたは誘導体が、配列番号２の残基３、５、６、９、２０、５０、５７、６０、６１、６９、７１、７５、７６、８３、８８、８９、９１、９２、９３、１１３、１３５、１５０、１５２、１５３、１６７、１７３、１７７、１８０、及び１８１のうちの１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項４に記載の免疫原性断片。
6. 配列番号２の前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、Ａ３Ｖ、Ｉ５Ｍ、Ｐ６Ｌ、Ｐ９Ｓ、Ｇ２０Ｅ、Ｐ５０Ｓ、Ｒ５７Ｓ、Ｇ６０Ａ、Ｅ６１Ｋ、Ａ６９Ｖ、Ｔ７１Ａ、Ｎ７５Ｓ、Ｇ７６Ｒ、Ｍ８３Ｔ、Ｐ８８Ｓ、Ｙ８９Ｃ、Ｓ９１Ｔ、Ｇ９２Ｒ、Ｇ９３Ｓ、Ｓ１１３Ｇ、Ｔ１３５Ｎ、Ｇ１５０Ｄ、Ａ１５２Ｖ、Ｇ１５３Ｄ、Ａ１６７Ｔ、Ｇ１７３Ｓ、Ｇ１７７Ｄ、Ｄ１８０Ｅ、Ｒ１８１Ｑ、及び任意のその組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の免疫原性断片。
7. 前記単離されたＮＨＢＡタンパク質の１つもしくは複数のヘパリン結合残基及び／または１つもしくは複数の活性部位残基を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の免疫原性断片。
8. 請求項１～７のいずれか１項に記載の１つまたは複数の免疫原性断片を含む、単離されたタンパク質。
9. 請求項１～７のいずれか１項に記載の免疫原性断片もしくは請求項８に記載の単離されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれに相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
10. 請求項９に記載の単離された核酸を含む、遺伝子コンストラクト。
11. 請求項１０に記載の遺伝子コンストラクトを含む、宿主細胞。
12. 請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された免疫原性断片または請求項８に記載の単離されたタンパク質を産生する方法であって、（ｉ）請求項１１に記載の宿主細胞を培養すること；及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）において培養された前記宿主細胞から前記免疫原性断片またはタンパク質を単離すること、を含む、前記方法。
13. 請求項１～７のいずれか１項に記載の免疫原性断片または請求項８に記載の単離されたタンパク質を結合するかまたはそれらに対して作製される、抗体または抗体断片。
14. 請求項１～７のいずれか１項に記載の１つもしくは複数の免疫原性断片、請求項８に記載の単離されたタンパク質、請求項９に記載の単離された核酸、請求項１０に記載の遺伝子コンストラクト、請求項１１に記載の宿主細胞、及び／または請求項１３に記載の抗体もしくは抗体断片を、任意選択で薬学的に許容される希釈物質、担体、または賦形剤と一緒に含む組成物。
15. 免疫原性組成物である、請求項１４に記載の組成物。
16. ワクチンである、請求項１５に記載の組成物。
17. Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌への免疫応答を対象において惹起する方法であって、請求項１～７のいずれか１項に記載の１つもしくは複数の免疫原性断片；請求項８に記載の単離されたタンパク質；請求項９に記載の単離された核酸；請求項１０に記載の遺伝子コンストラクト；請求項１１に記載の宿主細胞；請求項１３に記載の抗体もしくは抗体断片；及び／または請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物；を前記対象へ投与して、それによって前記免疫応答を惹起するステップを含む、前記方法。
18. Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌に対する免疫を対象において誘導する方法であって、請求項１～７のいずれか１項に記載の１つもしくは複数の免疫原性断片；請求項８に記載の単離されたタンパク質；請求項９に記載の単離された核酸；請求項１０に記載の遺伝子コンストラクト；請求項１１に記載の宿主細胞；請求項１３に記載の抗体もしくは抗体断片；及び／または請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物；を前記対象へ投与して、それによって前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌に対する免疫を前記対象において誘導するステップを含む、前記方法。
19. Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症を対象において治療または予防する方法であって、請求項１～７のいずれか１項に記載の１つもしくは複数の免疫原性断片；請求項８に記載の単離されたタンパク質；請求項９に記載の単離された核酸；請求項１０に記載の遺伝子コンストラクト；請求項１１に記載の宿主細胞；請求項１３に記載の抗体もしくは抗体断片；及び／または請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物；を前記対象へ投与して、それによって前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症を前記対象において予防または治療するステップを含む、前記方法。
20. Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌が細胞へ結合することを対象において少なくとも部分的に阻害または予防する方法であって、請求項１～７のいずれか１項に記載の１つもしくは複数の免疫原性断片；請求項８に記載の単離されたタンパク質；請求項９に記載の単離された核酸；請求項１０に記載の遺伝子コンストラクト；請求項１１に記載の宿主細胞；請求項１３に記載の抗体もしくは抗体断片；及び／または請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物；を前記対象へ投与して、それによって前記対象の細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌結合を阻害または予防するステップを含む、前記方法。
21. Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症の血清耐性を対象において少なくとも部分的に阻害または低減する方法であって、請求項１～７のいずれか１項に記載の１つもしくは複数の免疫原性断片；請求項８に記載の単離されたタンパク質；請求項９に記載の単離された核酸；請求項１０に記載の遺伝子コンストラクト；請求項１１に記載の宿主細胞；請求項１３に記載の抗体もしくは抗体断片；及び／または請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物；を前記対象へ投与して、それによって前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症の血清耐性を前記対象において阻害または低減するステップを含む、前記方法。
22. 対象から得られた生物学的サンプル中のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを検出する方法であって、前記生物学的サンプルを請求項１３に記載の抗体または抗体断片と接触させて、それによって前記生物学的サンプル中のＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを検出するステップを含む、前記方法。
23. 請求項１～７のいずれか１項に記載の１つもしくは複数の免疫原性断片；請求項８に記載の単離されたタンパク質；請求項９に記載の単離された核酸；請求項１０に記載の遺伝子コンストラクト；請求項１１に記載の宿主細胞；請求項１３に記載の抗体もしくは抗体断片；及び／または請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物；の使用であって、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌への免疫応答を対象において惹起すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌に対する免疫を対象において誘導すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症を対象において治療もしくは予防すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌が細胞へ結合することを対象において少なくとも部分的に阻害もしくは予防すること；あるいはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症の血清耐性を対象において少なくとも部分的に阻害もしくは低減すること、のための医薬品の製造における、前記使用。
24. Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌への免疫応答を対象において惹起すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌に対する免疫を対象において誘導すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症を対象において治療もしくは予防すること；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌が細胞へ結合することを対象において少なくとも部分的に阻害もしくは予防すること；あるいはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ菌及び／またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌の感染症の血清耐性を対象において少なくとも部分的に阻害もしくは低減すること、のための使用のための、またはそれらのために使用される場合の、請求項１～７のいずれか１項に記載の１つもしくは複数の免疫原性断片；請求項８に記載の単離されたタンパク質；請求項９に記載の単離された核酸；請求項１０に記載の遺伝子コンストラクト；請求項１１に記載の宿主細胞；請求項１３に記載の抗体もしくは抗体断片；及び／または請求項１４～１６のいずれか１項に記載の組成物。

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