JP2023501319A

JP2023501319A - 神経変性疾患の処置および予防

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Publication number: JP2023501319A
Application number: JP2022525924A
Authority: JP
Inventors: クーパー，マシュー; オーネイル，ルーク
Original assignee: インフレイゾームリミテッド
Priority date: 2019-11-07
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2023-01-18
Also published as: US20220401414A1; WO2021089768A3; WO2021089768A2; EP4076441A2; CN114641287A

Abstract

本発明は、神経変性疾患の処置または予防における使用のための、式（Ｉ）の化合物に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、神経変性疾患の処置または予防における使用のための、式（Ｉ）：

の化合物に関する。

神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症）、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症、ハンチントン病、運動失調、および神経変性プリオン病を含む。

パーキンソン病（ＰＤ）は、ヒトが行う運動および情動応答を制御するために用いられる化学物質であるドパミンの損失につながる、脳内の重要細胞の死により引き起こされる慢性進行性神経変性疾患である。症状は、２、３年にわたるレボドパ治療により制御され得るが、この疾患は依然として進行し、疾患を改良する処置は、現在のところ存在しない。ＮＬＲＰ３を阻害することを介する神経炎症を標的とすることは、この重大なアンメットメディカルニーズに対処する。

世界中でおよそ３０００万の人々が、治癒の知られていないアルツハイマー病（ＡＤ）を有している。アルツハイマー病の病原は、ＮＬＲＰ３活性化に関与する神経炎症と、続く神経細胞死および疾患進行を駆動することが示されているアミロイドβペプチド（Ａβ）の産生および沈着により駆動されると広く考えられている。

本発明は、式（Ｉ）の化合物が血液脳関門を越えること、およびミクログリア中のＮＬＲＰ３炎症応答を阻害することに特に効果的であり、これによりパーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患の効果的処置を提供する、という発見に一部基づく。最も特別には、そのような障害から生じる神経炎症が、式（Ｉ）の化合物の経口投与により効果的に阻害され得る。

本発明の第一の態様において、神経変性疾患の処置または予防における使用のための、式（Ｉ）：

の化合物またはその医薬的に許容できる塩が提供される。

一実施形態において、神経変性疾患は、パーキンソン病である。別の実施形態において、神経変性疾患は、アルツハイマー病である。別の実施形態において、神経変性疾患は、運動ニューロン疾患である。別の実施形態において、神経変性疾患は、ハンチントン病である。別の実施形態において、神経変性疾患は、多系統萎縮症である。別の実施形態において、神経変性疾患は、進行性核上性麻痺である。別の実施形態において、神経変性疾患は、前頭側頭型認知症である。別の実施形態において、神経変性疾患は、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）などの運動失調である。別の実施形態において、神経変性疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、変異型ＣＪＤ、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）またはスクレイピーなどの、神経変性プリオン病である。

一実施形態において、処置または予防は、神経炎症の処置または予防を含む。典型的には、神経炎症の処置または予防は、ＮＬＲＰ３阻害を介して実現される。本明細書で用いられる用語「ＮＬＲＰ３阻害」は、ＮＬＲＰ３の活性レベルの完全な、または部分的な低減を指し、例えば活性ＮＬＲＰ３の阻害および／またはＮＬＲＰ３活性化の阻害を包含する。

一実施形態において、処置または予防は、化合物またはその塩の経口投与を含む。さらなる実施形態において、処置または予防は、化合物またはその塩の１日１回の経口投与を含む。

別の実施形態において、化合物またはその塩は、神経変性疾患に罹患した患者の運動失調の予防における使用のためである。神経変性疾患は、先に列挙されたもののいずれであってもよい。典型的には化合物またはその塩は、パーキンソン病に罹患した患者の運動失調の予防における使用のためであり、最も典型的にはその使用は、化合物またはその塩の経口投与を含む。一実施形態において、化合物またはその塩は、運動失調の発病前に投与される。

さらなる実施形態において、化合物またはその塩は、神経変性疾患に罹患した患者の運動失調の低減における使用のためである。神経変性疾患は、先に列挙されたもののいずれであってもよい。典型的には化合物またはその塩は、パーキンソン病に罹患した患者の運動失調の低減における使用のためであり、最も典型的にはその使用は、化合物またはその塩の経口投与を含む。

一実施形態において、化合物またはその塩は、神経変性疾患に罹患した患者のドパミン作動性神経変性の予防における使用のためである。神経変性疾患は、先に列挙されたもののいずれであってもよい。典型的には化合物またはその塩は、パーキンソン病に罹患した患者のドパミン作動性神経変性の予防における使用のためであり、最も典型的にはその使用は、化合物またはその塩の経口投与を含む。

さらなる実施形態において、化合物またはその塩は、神経変性疾患に罹患した患者においてドパミンレベルの減少を緩徐にすること、停止させること、または逆行させることにおける使用のためである。神経変性疾患は、先に列挙されたもののいずれであってもよい。典型的には化合物またはその塩は、ドパミンレベルの減少を緩徐にすること、または停止させることにおける使用のためである。より典型的には化合物またはその塩は、ドパミンレベルの減少を緩徐にすることにおける使用のためである。一実施形態において、化合物またはその塩は、パーキンソン病に罹患した患者においてドパミンレベルの減少を緩徐にすること、停止させること、または逆行させることにおける使用のためであり、典型的にはその使用は、化合物またはその塩の経口投与を含む。典型的には化合物またはその塩は、パーキンソン病に罹患した患者においてドパミンレベルの減少を緩徐にすること、または停止させることにおける使用のためである。より典型的には化合物またはその塩は、パーキンソン病に罹患した患者においてドパミンレベルの減少を緩徐にすることにおける使用のためである。

一実施形態において、化合物または塩は、一ナトリウム塩などの、ナトリウム塩である。一実施形態において、化合物または塩は、一水和物である。一実施形態において、化合物または塩は、結晶性である。一実施形態において、化合物または塩は、結晶性一ナトリウム一水和物塩である。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、４．３°２θ、８．７°２θ、および２０．６°２θ（全て±０．２°２θ）にピークを含むＸＲＰＤスペクトルを有する。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、ＸＲＰＤスペクトルを有し、その中の１０個の最も強いピークは、４．３°２θ、６．２°２θ、６．７°２θ、７．３°２θ、８．７°２θ、９．０°２θ、１２．１°２θ、１５．８°２θ、１６．５°２θ、１８．０°２θ、１８．１°２θ、２０．６°２θ、２１．６°２θ、および２４．５°２θ（全て±０．２°２θ）から選択される２θ値を有する５個以上のピークを含む。ＸＲＰＤスペクトルは、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載された通り得られてよい。

一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載される通りである。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載される多形体を有する。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載される方法に従って調製される。

典型的には、本発明の第一の態様の任意の実施形態により、処置または予防は、化合物またはその塩を患者に投与することを含む。患者は、任意のヒトまたは他の動物であってよい。典型的には患者は、哺乳動物、より典型的にはヒトまたはウシ、ブタ、ラム、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウスなどの家畜哺乳動物である。最も典型的には患者は、ヒトである。

本発明の第二の態様において、医薬的に許容できる賦形剤と、本発明の第一の態様の化合物または塩とを含む医薬組成物が提供される。一実施形態において、医薬組成物は、経口投与に適する。

本発明の第三の態様において、それを必要とする患者における神経変性疾患の処置または予防のための方法であって、式（Ｉ）：

の化合物またはその医薬的に許容できる塩の治療的または予防的に効果的な量を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法が提供される。

一実施形態において、処置または予防は、神経炎症の処置または予防を含む。典型的には神経炎症の処置または予防は、ＮＬＲＰ３阻害を介して実現される。

別の実施形態において、方法は、神経変性疾患に罹患した患者の運動失調の予防のためである。神経変性疾患は、先に列挙されたもののいずれであってもよい。典型的には方法は、パーキンソン病に罹患した患者の運動失調の予防のためであり、最も典型的には方法は、化合物またはその塩の経口投与を含む。一実施形態において、化合物またはその塩は、運動失調の発病前に投与される。

さらなる実施形態において、方法は、神経変性疾患に罹患した患者の運動失調の低減のためである。神経変性疾患は、先に列挙されたもののいずれであってもよい。典型的には方法は、パーキンソン病に罹患した患者の運動失調の低減のためであり、最も典型的には方法は、化合物またはその塩の経口投与を含む。

一実施形態において、方法は、神経変性疾患に罹患した患者のドパミン作動性神経変性の予防のためである。神経変性疾患は、先に列挙されたもののいずれであってもよい。典型的には方法は、パーキンソン病に罹患した患者のドパミン作動性神経変性の予防のためであり、最も典型的には方法は、化合物またはその塩の経口投与を含む。

さらなる実施形態において、方法は、神経変性疾患に罹患した患者においてドパミンレベルの減少を緩徐にするため、停止させるため、または逆行させるためである。神経変性疾患は、先に列挙されたもののいずれであってもよい。典型的には方法は、ドパミンレベルの減少を緩徐にするため、または停止させるためである。より典型的には方法は、ドパミンレベルの減少を緩徐にするためである。一実施形態において、方法は、パーキンソン病に罹患した患者においてドパミンレベルの減少を緩徐にするため、停止させるため、または逆行させるためであり、典型的には方法は、化合物またはその塩の経口投与を含む。典型的には方法は、パーキンソン病に罹患した患者においてドパミンレベルの減少を緩徐にため、または停止させるためである。より典型的には方法は、パーキンソン病に罹患した患者においてドパミンレベルの減少を緩徐にするためである。

一実施形態において、化合物または塩は、一ナトリウム塩などの、ナトリウム塩である。一実施形態において、化合物または塩は、一水和物である。一実施形態において、化合物または塩は、結晶性である。一実施形態において、化合物または塩は、結晶性一ナトリウム一水和物塩である。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、４．３°２θ、８．７°２θ、および２０．６°２θ（全て±０．２°２θ）にピークを含むＸＲＰＤスペクトルを有する。一実施形態において、結晶性一ナトリウム一水和物塩は、ＸＲＰＤスペクトルを有し、その中の１０個の最も強いピークは、４．３°２θ、６．２°２θ、６．７°２θ、７．３°２θ、８．７°２θ、９．０°２θ、１２．１°２θ、１５．８°２θ、１６．５°２θ、１８．０°２θ、１８．１°２θ、２０．６°２θ、２１．６°２θ、および２４．５°２θ（全て±０．２°２θ）から選択される２θ値を有する５個以上のピークを含む。ＸＲＰＤスペクトルは、全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１９／２０６８７１号に記載された通り得られてもよい。

本発明の第三の態様の任意の実施形態により、患者は、任意のヒトまたは他の動物であってよい。典型的には患者は、哺乳動物、より典型的にはヒトまたはウシ、ブタ、ラム、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウスなどの家畜哺乳動物である。最も典型的には患者は、ヒトである。

実験

試験Ａ－１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の健常な自由行動下の成体雄マウスの左線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物のレベル（平均＋ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。試験Ａ－１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の健常な自由行動下の成体雄マウスの右線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物のレベル（平均＋ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。試験Ｂ－１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の自由行動下の成体雄６－ＯＨＤＡマウスの左線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物のレベル（平均＋ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。試験Ｂ－１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の自由行動下の成体雄６－ＯＨＤＡマウスの右線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物のレベル（平均＋ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。試験Ｃ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）での経口処置は、パーキンソン病の６－ＯＨＤＡモデルにおいて黒質線条体ドパミン作動性神経変性から保護する。Ａ）３ｍｇ／ｋｇｐ．ｏ．がドパミン作動性神経変性から保護することを示す６－ＯＨＤＡ（１２μｇ）処置２１日後に定量されたアンフェタミン誘発同側回転（ｎ＝１０マウス／群）。データを平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。試験Ｃ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）での経口処置は、パーキンソン病の６－ＯＨＤＡモデルにおいて黒質線条体ドパミン作動性神経変性から保護する。Ｂ）薬物処置による線条体ドパミン作動性末端の保持を実証する６－ＯＨＤＡ処置マウスにおける線条体ドパミンならびにその代謝産物ＤＯＰＡＣおよびＨＶＡのレベル（ｎ＝１０マウス／群）。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。試験Ｃ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）での経口処置は、パーキンソン病の６－ＯＨＤＡモデルにおいて黒質線条体ドパミン作動性神経変性から保護する。Ｃ）薬物処置による線条体ドパミン作動性末端の保持を実証する６－ＯＨＤＡ処置マウスにおける線条体ドパミンならびにその代謝産物ＤＯＰＡＣおよびＨＶＡのレベル（ｎ＝１０マウス／群）。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。試験Ｃ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）での経口処置は、パーキンソン病の６－ＯＨＤＡモデルにおいて黒質線条体ドパミン作動性神経変性から保護する。Ｄ）薬物処置による線条体ドパミン作動性末端の保持を実証する６－ＯＨＤＡ処置マウスにおける線条体ドパミンならびにその代謝産物ＤＯＰＡＣおよびＨＶＡのレベル（ｎ＝１０マウス／群）。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。試験Ｄ－式（Ｉ）の化合物での３ｍｇ／ｋｇ経口処置は、ＭＣＣ９５０より大きな有効性でパーキンソン病の６－ＯＨＤＡモデルにおいて黒質線条体ドパミン作動性神経変性から保護する。Ａ）ＭＣＣ９５０と比較して、式（Ｉ）の化合物の３ｍｇ／ｋｇｐ．ｏ．がドパミン作動性神経変性から保護することを示す６－ＯＨＤＡ（１２μｇ）処置２１日後に定量されたアンフェタミン誘発同側回転（ｎ＝１０マウス／群）。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。試験Ｄ－式（Ｉ）の化合物での３ｍｇ／ｋｇ経口処置は、ＭＣＣ９５０より大きな有効性でパーキンソン病の６－ＯＨＤＡモデルにおいて黒質線条体ドパミン作動性神経変性から保護する。Ｂ）薬物処置による線条体ドパミン作動性末端の保持を実証する、式（Ｉ）の化合物またはＭＣＣ９５０で処置された６－ＯＨＤＡマウスの線条体ドパミンのレベル（ｎ＝１０マウス／群）。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。試験Ｅ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）は、初代ミクログリアにおいてＮＬＲＰ３インフラマソームを阻害することにおいてＭＣＣ９５０より高い効力を呈する。Ａ）ＮＬＲＰ３阻害剤ＭＣＣ９５０による、プライミングされたミクログリアにおけるＡＴＰ誘導性ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化の用量依存的阻害。ＡＴＰ（５ｍＭ）でのＭＣＣ９５０阻害のＩＣ_５０は、初代マウスミクログリアでは７．５ｎＭであると決定された。試験Ｅ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）は、初代ミクログリアにおいてＮＬＲＰ３インフラマソームを阻害することにおいてＭＣＣ９５０より高い効力を呈する。Ｂ）式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）による、プライミングされたミクログリアにおけるＡＴＰ誘導性ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化の用量依存的阻害。式（Ｉ）の化合物についてのＡＴＰ（５ｍＭ）での阻害のＩＣ_５０は、初代マウスミクログリアでは４．７４ｎＭであると決定された。試験Ｆ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）による、プライミングされた健常ヒトミクログリアにおけるＡＴＰ誘導性ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化の用量依存的阻害。式（Ｉ）の化合物についてのＡＴＰ（５ｍＭ）での阻害のＩＣ_５０は、１名の健常ドナーから単離された初代ヒトミクログリアでは１４２ｎＭであると決定された。データは、ｎ＝１の健常ドナーおよびｎ＝４の技術的反復測定を表す。エラーバーはＳＥＭ。試験Ｇ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）による、プライミングされたパーキンソン病ヒトミクログリアにおけるＡＴＰ誘導性ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化の用量依存的阻害。式（Ｉ）の化合物についてのＡＴＰ（５ｍＭ）での阻害のＩＣ_５０は、パーキンソン病患者から単離された初代ヒトミクログリアでは１０１ｎＭであると決定された。データは、ｎ＝１のパーキンソン病ドナーおよびｎ＝１４の技術的反復測定を表す。エラーバーはＳＥＭ。試験Ｈ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）での経口処置は、パーキンソン病のＰＦＦ－シヌクレインモデルにおいて運動障害から保護する。Ａ）ＰＦＦ注射後４、６、８および１０か月目のαシヌクレインＰＦＦ注射マウス、ＰＦＦ注射の２４時間前に開始する飲料水中の式（Ｉ）の化合物での予防的処置（０．３ｍｇ／ｍｌ）、または注射の４時間後に開始する治療的処置でのロータロッドテスト（ｎ＝８～１０マウス／群）。ＰＢＳ注射マウスを、生理食塩水として使用した。^＊ｃ．ｆ生理食塩水、＃ｃ．ｆＰＦＦ－シヌクレイン、データは平均±ＳＥＭである。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、ｎｓ＝有意でない、^＊／＃Ｐ＜０．０５、^＊＊／＃＃Ｐ＜０．０１、^＊＊＊／＃＃＃Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊／＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１。試験Ｈ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）での経口処置は、パーキンソン病のＰＦＦ－シヌクレインモデルにおいて運動障害から保護する。Ｂ）４、６、８および１０か月目のαシヌクレインＰＦＦ注射マウスにおいてビームを横断するのにかかる時間として測定されたバランスビームパフォーマンス。ＰＢＳ注射マウスを、生理食塩水として使用した。^＊ｃ．ｆ生理食塩水、＃ｃ．ｆＰＦＦ－シヌクレイン、データは平均±ＳＥＭである。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、ｎｓ＝有意でない、^＊／＃Ｐ＜０．０５、^＊＊／＃＃Ｐ＜０．０１、^＊＊＊／＃＃＃Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊／＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１。試験Ｈ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）の経口投薬は、予防的および治療的設定の両方でＰＦＦ－シヌクレイン注射後１２か月目に得られた血漿試料中の循環ＩＬ－１βの量を低減する（各群でｎ＝４～６）。^＊ｃ．ｆ生理食塩水、＃ｃ．ｆＰＦＦ－シヌクレイン、ｎｓ＝有意でない、データは、平均±ＳＥＭであり、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、^＊＊＊／＃＃＃Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊／＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１。試験Ｈ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）での経口処置は、パーキンソン病のＰＦＦ－シヌクレインモデルにおいて黒質線条体ドパミン作動性神経変性から保護する。Ａ）１２か月目のＰＦＦマウスの同側線条体のドパミン（ｎ＝４～８／群）。^＊ｃ．ｆ生理食塩水、＃ｃ．ｆＰＦＦ－シヌクレイン、データは、平均±ＳＥＭである。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、ｎｓ＝有意でない、^＊／＃Ｐ＜０．０５、^＊＊／＃＃Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊／＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１。試験Ｈ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）での経口処置は、パーキンソン病のＰＦＦ－シヌクレインモデルにおいて黒質線条体ドパミン作動性神経変性から保護する。Ｂ）１２か月目のＰＦＦマウスの同側線条体のＤＯＰＡＣ（ｎ＝４～８／群）。^＊ｃ．ｆ生理食塩水、＃ｃ．ｆＰＦＦ－シヌクレイン、データは、平均±ＳＥＭである。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、ｎｓ＝有意でない、^＊／＃Ｐ＜０．０５、^＊＊／＃＃Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊／＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１。試験Ｈ－式（Ｉ）の化合物（ＣＰＤ）での経口処置は、パーキンソン病のＰＦＦ－シヌクレインモデルにおいて黒質線条体ドパミン作動性神経変性から保護する。Ｃ）１２か月目のＰＦＦマウスの同側線条体のＨＶＡ（ｎ＝４～８／群）。^＊ｃ．ｆ生理食塩水、＃ｃ．ｆＰＦＦ－シヌクレイン、データは、平均±ＳＥＭである。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、ｎｓ＝有意でない、^＊／＃Ｐ＜０．０５、^＊＊／＃＃Ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊／＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１。

試験Ａ－健常マウスにおける血液脳関門通過
目的
本試験は、経口投与後の自由行動下の成体雄マウスの左および右線条体における式（Ｉ）の化合物の遊離濃度を決定するために設計された。

動物
成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（２２～２８ｇ、Ｅｎｖｉｇｏ、オランダ）を、実験に用いた。到着後に、動物を、ワイヤーメッシュの天井が付いたポリプロピレンケージ（４０×５０×２０ｃｍ）中にて５匹からなる群で、温度（２２±２℃）および湿度（５５±１５％）制御環境ならびに１２時間明周期（７：００～１９：００）で飼育した。手術後に、動物を、個別に飼育した（ケージ３０×３０×４０ｃｍ）。標準飼料（ＳＤＳＤｉｅｔｓ、ＲＭ１ＰＬ）および国内品質の水道水を随意に利用できた。

手術
マウスに、イソフルランを利用して麻酔をかけた（２％および５００ｍＬ／分Ｏ_２）。Ｆｉｎａｄｙｎｅ（１ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）を、手術前、手術中および術後回復期間に鎮痛のために投与した。ブピバカインとエピネフリンの混合物を、切開部位の局所鎮痛に用いた。

微小透析プローブの植え込み
動物を、定位固定装置（Ｋｏｐｆｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）に配置した。３ｍｍの露出したポリアクリロニトリル膜（ＭＱ－ＰＡＮ３／３）を有するＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析プローブを、左および右線条体に両側性に植え込んだ（プローブのチップに関する座標：０°の角度および０．０ｍｍに設定されたインサイザーバー（ｉｎｃｉｓｏｒｂａｒ）でＡＰ=＋０．８ｍｍ（ブレグマまで）、ＭＬ＝±１．７ｍｍ（正中線まで）、ＤＶ＝－４．０ｍｍ（硬膜まで））。全ての座標は、ＰａｘｉｎｏｓａｎｄＦｒａｎｋｌｉｎ（２００８）による「Ｔｈｅｍｏｕｓｅｂｒａｉｎｉｎｓｔｅｒｅｏｔａｌｉｃｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ」に基づいた。プローブを、ステンレス鋼製ねじおよび歯科用セメントで頭蓋骨に取り付けた。

用量配合剤
式（Ｉ）の化合物の一ナトリウム塩を、５ｍＬ／ｋｇでの経口投薬用に０．２および４ｍｇ／ｍＬ；それぞれ１ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ、の濃度で（非塩形態に関して）滅菌水道水中で配合した。用量配合剤を、表１に示す。各動物に投与された容量を、表２に示す。

実験計画
ＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析プローブを、可撓性ＰＥＥＫチュービング（ＷｅｓｔｅｒｎＡｎａｌｙｔｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＩｎｃ．米国；ＰＫ００５－０２０）で微小灌流ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ）に連結し、流速０．１２μＬ／分の１４７ｍＭＮａＣｌ、３．０ｍＭＫＣｌ、１．２ｍＭＣａＣｌ_２、および１．２ｍＭＭｇＣｌ_２を含有する人工ＣＳＦ（灌流液）のスローフロー（ｓｌｏｗｆｌｏｗ）と、０．８μＬ／分のＵＰ＋０．０２ＭＦＡ＋０．０４％アスコルビン酸のキャリアフロー（ｃａｒｒｉｅｒｆｌｏｗ）で灌流した。最短で２時間の予備安定化の後、微小透析試料を、６０分間隔で収集した。２種のベースライン試料の収集後に、式（Ｉ）の化合物（滅菌水道水中の１または２０ｍｇ／ｋｇ）を、ｔ＝０分に経口投与した。具体的な微小透析試料採取スケジュールを、表３に示す。試料を、自動フラクションコレクター（ＵＶ８３０１５０１、ＴＳＥ、Ｕｎｉｖｅｎｔｏｒ、マルタ）を用いてミニバイアル（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｅｃｈ／ｓｅＡＢ、スウェーデン；４００１０２９）に収集した。実験終了時に、動物を殺処分した。

生物分析
ＭｅｔａＱｕａｎｔプローブからの微小透析試料は、名目容量５５．２μＬの透析物を含有した。ＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析試料中の式（Ｉ）の化合物のレベルを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより定量した。

透析試料を、アセトニトリルと混合し、この混合物の分割量を、自動サンプルインジェクター（ＳＩＬ－２０ＡＤ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、日本）によりＬＣシステムに注入した。較正物質およびインラン（ｉｎ－ｒｕｎ）ＱＣ試料を、微小透析試料と同じ組成の分析用透析物中で調製した。

化合物のクロマトグラフィー分離を、溶離液Ａ（超純水＋０．１％ギ酸）中の溶離液Ｂ（アセトニトリル＋０．１％ギ酸）を流速０．３ｍＬ／分で用いて、勾配溶出実行中の温度４０℃で保持された逆相カラム（１００×３．０ｍｍ、粒子径２．５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）で実施した。

ＭＳ分析を、ＡＰＩ４０００ＭＳ／ＭＳ検出器およびＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙインターフェース（両者ともＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）からなるＡＰＩ４０００ＭＳ／ＭＳシステムを用いて実施した。取得を、５．５ｋＶに設定されたイオン化スプレー電圧でのポジティブイオン化モードで実施した。プローブ温度を、５５０℃に設定した。機器を、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作した。

分析物のＭＲＭトランジションを、表４に示す。適切なインラン検量線を、加重（１／ｘ）回帰を利用してフィットさせ、試料濃度を、これらの検量線を利用して決定した。正確度を、一連の各試料の後に、品質管理試料により検証した。濃度を、Ａｎａｌｙｓｔ（商標）データシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で計算した。

データ評価
式（Ｉ）の化合物の薬物動態データを、実験の際の希釈について修正された微小透析液中の濃度（平均＋ＳＥＭ）として表す。透析物中の式（Ｉ）の化合物の薬物動態データは、回復については修正しなかった。結果を、Ｐｒｉｓｍ５ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ）でプロットした。

結果
図１は、１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の自由行動下の成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの左線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物の絶対レベルを示す。図２は、１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の自由行動下の成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの右線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物の絶対レベルを示す。１ｍｇ／ｋｇを投薬された動物は、化合物投与後５時間目に左および右の両方の線条体透析試料中で１２～１３ｎＭの平均ピークレベルを示した。２０ｍｇ／ｋｇを投薬された動物は、化合物投与後６時間目に左および右の両方の線条体透析試料中で２０１～２４３ｎＭの平均ピークレベルを示した。

示された通り、結果は、経口投与後に血液脳関門を越える式（Ｉ）の化合物の能力を実証する。式（Ｉ）の化合物は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化の高度に効果的な阻害剤であることを過去に実証されている（全体として参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１６／１３１０９８号参照）。その上、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症）、ハンチントン病、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症、運動失調、および神経変性プリオン病などの障害の処置に関連づけられている（Ｗａｌｓｈｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓ，１５：８４－９７，２０１４；Ｄｅｍｐｓｅｙｅｔａｌ．，ＢｒａｉｎＢｅｈａｖＩｍｍｕｎ，６１：３０６－３１６，２０１７；Ｆａｎｇｚｈｏｕｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌＥｘｐＮｅｕｒｏｌ，７７（１１）：１０５５－１０６５，２０１８；Ｉｓｉｎｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５７５：６６９－６７３，２０１９；Ｋｏｊｉｃｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，９：３１９５，２０１８；およびＳｈｉｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍ，９：７３，２０１２参照、全てが全体として参照により本明細書に組み入れられる）。そのため、式（Ｉ）の化合物は、神経変性疾患の処置または予防に効果的であろうと考えられる。

試験Ｂ－パーキンソン病の６－ＯＨＤＡマウスモデルにおける血液脳関門通過
目的
本試験は、６－ヒドロキシドパミン（６－ＯＨＤＡ）同側病変を有する自由行動下の成体雄マウスの左および右線条体における式（Ｉ）の化合物の遊離濃度を評定するために設計された。

動物
成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（２３～２８ｇ、Ｅｎｖｉｇｏ、オランダ）を、実験に用いた。到着後に、動物を、ワイヤーメッシュの天井が付いたポリプロピレンケージ（４０×５０×２０ｃｍ）中にて５匹からなる群で、温度（２２±２℃）および湿度（５５±１５％）制御環境、ならびに１２時間明周期（７：００～１９：００）で飼育した。手術後に、動物を、個別に飼育した（ケージ３０×３０×４０ｃｍ）。標準飼料（ＳＤＳＤｉｅｔｓ、ＲＭ１ＰＬ）および国内品質の水道水を随意に利用できた。

６－ＯＨＤＡ病変
動物を、定位固定装置（Ｋｏｐｆｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）に配置した。生理食塩水２μＬ中の６－ＯＨＤＡ１０μｇを、ハミルトンシリンジ用針を用いて右線条体に緩やかに注射した（針のチップに関する座標：０°の角度および０．０ｍｍに設定されたインサイザーバーバーでＡＰ=－０．５ｍｍ（ブレグマまで）、ＭＬ＝－２．０ｍｍ（正中線まで）、ＤＶ＝－４．０ｍｍ（硬膜まで））。

微小透析プローブの植え込み
同様の外科的手順で、３ｍｍの露出したポリアクリロニトリル膜（ＭＱ－ＰＡＮ３／３）を有するＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析プローブのガイドを、左および右線条体に両側性に植え込んだ（プローブのチップに関する座標：０°の角度および０．０ｍｍに設定されたインサイザーバーでＡＰ=＋０．８ｍｍ（ブレグマまで）、ＭＬ＝±１．７ｍｍ（正中線まで）、ＤＶ＝－４．０ｍｍ（硬膜まで））。全ての座標は、ＰａｘｉｎｏｓａｎｄＦｒａｎｋｌｉｎ（２００８）による「Ｔｈｅｍｏｕｓｅｂｒａｉｎｉｎｓｔｅｒｅｏｔａｌｉｃｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ」に基づいた。プローブを、ステンレス鋼製ねじおよび歯科用セメントで頭蓋骨に取り付けた。

用量配合剤
式（Ｉ）の化合物の一ナトリウム塩を、５ｍＬ／ｋｇでの経口投薬用に０．２および４ｍｇ／ｍＬ；それぞれ１ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ、の濃度で滅菌水道水中で配合した。用量配合剤を、表５に示す。各動物に投与された容量を、表６に示す。

実験計画
病変およびガイド手術からの回復後の１０日目に、ＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析プローブを、可撓性ＰＥＥＫチュービング（ＷｅｓｔｅｒｎＡｎａｌｙｔｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＩｎｃ．米国；ＰＫ００５－０２０）で微小灌流ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ）に連結し、流速０．１２μＬ／分の１４７ｍＭＮａＣｌ、３．０ｍＭＫＣｌ、１．２ｍＭＣａＣｌ_２、および１．２ｍＭＭｇＣｌ_２を含有する人工ＣＳＦ（灌流液）のスローフローと、０．８μＬ／分のＵＰ＋０．０２ＭＦＡ＋０．０４％アスコルビン酸のキャリアフローで灌流した。最短で２時間の予備安定化の後、微小透析試料を、６０分間隔で収集した。２種のベースライン試料の収集後に、式（Ｉ）の化合物（滅菌水道水中の１または２０ｍｇ／ｋｇ）を、ｔ＝０分に経口投与した。具体的な微小透析試料採取スケジュールを、表７に示す。試料を、自動フラクションコレクター（ＵＶ８３０１５０１、ＴＳＥ、Ｕｎｉｖｅｎｔｏｒ、マルタ）を用いてミニバイアル（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｅｃｈ／ｓｅＡＢ、スウェーデン；４００１０２９）に収集した。実験終了時に、動物を殺処分した。

生物分析
ＭｅｔａＱｕａｎｔプローブからの微小透析試料は、名目容量５５．２μＬの透析物を含有し、さらなる試料調製を行わずに使用された。

ＭｅｔａＱｕａｎｔ微小透析試料中の式（Ｉ）の化合物のレベルを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより定量した。透析試料の分取物を、アセトニトリルと混合し、この混合物の分割量を、自動サンプルインジェクター（ＳＩＬ－２０ＡＤ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、日本）により、ＬＣシステムに注入した。較正物質およびインランＱＣ試料を、微小透析試料と同じ組成の分析用透析物中で調製した。

分析物のＭＲＭトランジションを、表８に示す。適切なインラン検量線を、加重（１／ｘ）回帰を利用してフィットさせ、試料濃度を、これらの検量線を利用して決定した。正確度を、一連の各試料の後に、品質管理試料により検証した。濃度を、Ａｎａｌｙｓｔ（商標）データシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で計算した。

データ評価
式（Ｉ）の化合物の薬物動態データを、実験の際の希釈について修正された微小透析液中の濃度（平均＋ＳＥＭ）として表す。化合物の薬物動態データは、回復については修正しなかった（式（Ｉ）の化合物の回復は、ＢＯＬｋｅｙ１３４４については６１％である）。結果を、Ｐｒｉｓｍ５ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ）でプロットした。

結果
図３は、１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の自由行動下の成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの左線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物の絶対レベルを示す。図４は、１または２０ｍｇ／ｋｇの化合物の経口投与後の自由行動下の成体雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの右線条体からのＭｅｔａＱｕａｎｔ透析物中の式（Ｉ）の化合物の絶対レベルを示す。

１ｍｇ／ｋｇを投薬された動物は、化合物投与後５時間目に左および右の両方の線条体透析試料中で式（Ｉ）の化合物の１７～１９ｎＭの平均ピークレベルを示した。２０ｍｇ／ｋｇを投薬された動物は、化合物投与後６時間目に左および右の両方の線条体透析試料中で式（Ｉ）の化合物の２８０～３００ｎＭの平均ピークレベルを示した。

したがって、経口投与後に血液脳関門を越える式（Ｉ）の化合物の能力は、健常なマウスと、パーキンソン病の動物モデルの罹患したマウスの両方で類似していることが認められ得る。

試験Ｃ－パーキンソン病の６－ＯＨＤＡマウスモデルにおける経口有効性
目的
パーキンソン病の６－ＯＨＤＡマウスモデルにおける式（Ｉ）の化合物の経口有効性を決定することである。

処置
８週齢Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（オーストラリア、パースのＡＲＣから得た）を、ＳＰＦ環境制御施設において１２時間の明周期下で飼育し、試験開始前２週間は試料および水を随意に提供した。式（Ｉ）の化合物による処置では、マウスに、経口強制投与を介して投薬した。各群１０匹のマウスに、定位手術の前日（２４時間前）に始めて、３または１ｍｇ／ｋｇを投薬し、その後殺処分までＱＤとした。

６－ＯＨＤＡ（Ｓｉｇｍａ）を、手術の直前に調製した。アスコルビン酸（０．２％）を含有する滅菌生理食塩水（０．９％）溶液を、ビヒクルとして用いて、６－ＯＨＤＡを溶解した。アスコルビン酸は不活性形態への酸化を予防するため、アスコルビン酸を用いて６－ＯＨＤＡを安定化した。右線条体中に最終濃度１２μｇを注射するために、６ｍｇ／ｍｌの作業原液を作製し、最終容量２μｌを注射した。

外科的手順
マウスに、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）麻酔を用いて麻酔をかけ、マウスを、特別にマウスに適合されたノーズバーおよびアイバーを備えた定位固定装置に配置した。病変を、５μｌハミルトンシリンジを用いて実施して、ビヒクルまたは６－ＯＨＤＡ（１２μｇ）のどちらかを以下のブレグマに対する座標で定位脳地図に従って右背側線条体中に送達した：ＡＰ：－１．２ｍｍ；ＭＬ：－１．７ｍｍ；ＤＶ：３．５ｍｍ（ＰａｘｉｎｏｓａｎｄＦｒａｎｋｌｉｎ（２００８）による「Ｔｈｅｍｏｕｓｅｂｒａｉｎｉｎｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ」）。頭蓋骨に１ｍｍの穿頭孔を開けた後、２μｌ容量の溶液を、標的部位に０．５μｌ／分の速度で輸注した。針を、注射後少なくとも５分間定位置に保持して、穿刺経路に沿った逆流を最小限に抑えた。マウスに、滅菌リンゲル液を皮下注射を投与して回復を容易にし、マウスを、麻酔から完全に回復するまでヒートパッド上に置いた。

アンフェタミン誘発回転
アンフェタミン誘発同側回転を、術後２１日目に実施した。マウスに、２ｍｇ／ｋｇＤ－アンフェタミンを注射し、マウスを、丸いガラスボールに入れた。５分の馴化後に、１０分間にわたる正味の同側回転を、記録し、カウントした。定量を、処置群を伏せられた研究者により、記録ビデオから実施した。

線条体ドパミンおよび代謝産物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定量
マウスを、アンフェタミンテストの１週間後（２８日目）に殺処分し、線条体組織を、顕微解剖し、計量し、－８０℃で瞬間冷凍した。線条体組織からの神経伝達物質を、抽出し、クロロギ酸エチルを用いて誘導体化した。線条体ドパミン（ＤＡ）およびその代謝産物（ＤＯＰＡＣおよびＨＶＡ）を、過去に記載された通り、高感度液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて、内部標準３，４－ジヒドロキシベンジルアミン（ＤＨＢＡ）の存在下でそれらの安定な誘導体形態で定量した（Ｐａｒｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２０１３，ｖｏｌ．３６，ｐｐ．２５２－８）。ＡＰＩ３２００（ＡＢＳＣＩＥＸ）トリプル四重極ＱＴＲＡＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを、多重反応モードでポジティブ（＋１）イオン化の下、ＡｇｉｌｅｎｔシリーズＨＰＬＣシステムと連結されたＴｕｒｂｏＶイオン源と共に用いた。試料を、移動相Ａ（ｍｉｌｉＱ水中の０．１％ギ酸）および移動相Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）を用いる流速５００μｌでのバイナリ勾配条件下にて、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＳｙｎｅｒｇｉＦｕｓｉｏｎ－ＲＰ８０Å分析カラム（１５０×４．６ｍｍ；４μｍ）でクロマトグラフィーにかけた。定量では、分析物あたり１トランジションをモニタリングし、分析物あたり２トランジションを、定性目的でモニタリングした。

結果
この試験では、３および１ｍｇ／ｋｇの式（Ｉ）の化合物の有効性を比較した。結果を図５に示す。３ｍｇ／ｋｇでは、アンフェタミン誘発同側回転からの有意な保護効果が見出された。６－ＯＨＤＡ病変後２８日目の線条体ドパミンおよびその代謝産物ＤＯＰＡＣおよびＨＶＡの定量はさらに、３ｍｇ／ｋｇの式（Ｉ）の化合物で処置されたマウスがドパミンの損失から有意に保護されたことを裏付けた。したがって、式（Ｉ）の化合物の連日経口投与が実験的パーキンソン病における黒質線条体ドパミン作動性神経変性から保護すると結論づけることができる。

試験Ｄ－パーキンソン病の６－ＯＨＤＡマウスモデルにおけるＭＣＣ９５０との比較
目的および手順
ＭＣＣ９５０は、以下の式：

を有する過去に報告されたＮＬＲＰ３阻害剤である（全体として参照により本明細書に組み入れられるＣｏｌｌｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，ｖｏｌ．２１（３），ｐｐ．２４８－２５５参照）。

試験Ｄの狙いは、３ｍｇ／ｋｇでマウス同側性６－ＯＨＤＡモデルにおいて、式（Ｉ）の化合物の神経保護有効性をＭＣＣ９５０と比較することであった。アンフェタミン誘発同側回転および線条体ドパミン（ＤＡ）レベルを、試験Ｃで用いられたものと同一のプロトコルを利用して、各薬物３ｍｇ／ｋｇで定位手術の前日（２４時間前）に開始し、その後殺処分まで連日投与された各群１０匹のマウスで評価した。

結果
結果を図６に示す。３ｍｇ／ｋｇでは、アンフェタミン誘発同側回転からの有意な保護効果が、両方の薬物で見出された。しかし式（Ｉ）の化合物で処置されたマウスは、ＭＣＣ９５０に比較してより少ない同側回転を有した（図６Ａ）。具体的には、アンフェタミン誘発回転の７５％低減が、６－ＯＨＤＡ非処置群に対するＭＣＣ９５０での５５％低減に比較して式（Ｉ）の化合物で観察された。これらの挙動は、線条体ドパミンの量にも反映されている。６－ＯＨＤＡ病変後２８日目の線条体ドパミンの定量（図６Ｂ）はさらに、式（Ｉ）の化合物３ｍｇ／ｋｇで処置されたマウスがＭＣＣ９５０に比較して改善された有効性でドパミンの損失から有意に保護されたことを裏付けた。それゆえ式（Ｉ）の化合物がパーキンソン病の６－ＯＨＤＡマウスモデルにおいてＭＣＣ９５０を上回る改善された有効性を有することを認めることができる。

試験Ｅ－初代ミクログリア中のＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害におけるＭＣＣ９５０との比較
目的
カノニカルＮＬＲＰ３活性化因子であるＡＴＰで活性化されたＬＰＳでプライミングされたミクログリアにおいて式（Ｉ）の化合物およびＭＣＣ９５０のＩＣ_５０を決定することである。

初代ミクログリア培養物
初代ミクログリア培養物を、Ｃ５７ＢＬ／６生後１日目（Ｐ１）の子供マウスから調製し、過去に記載された通りカラムフリーの磁気分離システムにより精製した（全体として参照により本明細書に組み入れられるＧｏｒｄｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１，ｖｏｌ．１９４（２）、ｐｐ．２８７－２９６参照）。初代ミクログリアを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地(１０％熱非働化ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭＬ－グルタミン、１００μＭ非必須アミノ酸、および２ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ－Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ)中で保持した。細胞をその後、５％ＣＯ_２インキュベータ中にて３７℃で保持した。

ＩＣ_５０決定のためのＩＬ－１β ＥＬＩＳＡ
マウスＩＬ－１βキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ００８）を用いて、上昇する濃度のＭＣＣ９５０および式（Ｉ）の化合物で予め処置され、ＡＴＰ５ｍＭで１時間活性化された、ＬＰＳでプライミングされたミクログリア（２００ｎｇ／ｍｌで３時間）の上清中のＩＬ－１βレベルを測定した。

結果
結果を図７に示す。ＭＣＣ９５０は、７．５ｎＭのＩＣ_５０を得たが（図７Ａ）、式（Ｉ）の化合物は、同様の条件下で４．７ｎＭの効力を呈した（図７Ｂ）。したがって式（Ｉ）の化合物は、初代ミクログリア中のＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害においてＭＣＣ９５０と比較して高い効力を呈する。

試験Ｆ－健常な脳からの初代ヒトミクログリア中のＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害
目的
カノニカルＮＬＲＰ３活性化因子であるＡＴＰで活性化されたＬＰＳでプライミングされたミクログリアにおいて式（Ｉ）の化合物のＩＣ_５０を決定することである。

ヒト脳試料
ヒト脳材料を、臨床的に充分に証明されかつ神経学的に確認された症例および非神経学的対照からの死後材料を供給するＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓＢｒａｉｎＢａｎｋ（ＮＢＢ；オランダアムステルダム）の迅速剖検システムを介して得た。剖検を、同意書がＮＢＢにより得られているドナーについて、実施した。１例の健常脳組織試料を、この実験で用いた。

ミクログリア単離法
ヒト成人ミクログリア細胞を、Ｂｓｉｂｓｉらにより過去に記載された通り単離および培養した（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ＆ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００２，ｖｏｌ．６１（１１），ｐｐ．１０１３－１０２１）。手短に述べると、ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓＢｒａｉｎＢａｎｋ（オランダアムステルダム）で、組織試料を、皮質下白質から切り出し、培地を含む試験管中で４℃で貯蔵した。試料をその後、培地を含む試験管中でＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（オランダライデン)に運搬した。目視できる血管を、除去し、脳組織を、ＰＢＳで洗浄した。０．２５％トリプシン中での２０分間消化の後、細胞懸濁液を、穏やかに研和し、１０％ＦＣＳおよび抗生物質サプリメントを含有するＤＭＥＭ／ＨＡＭ－Ｆ１２培地で洗浄した。１００μｍフィルターに通した後、ミエリンを、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配遠心分離により除去した。赤血球を、ＰＢＳ中の１５５ｍＭＮＨ_４Ｃｌ、１ｍＭＫＨＣＯ_３および０．２％ＢＳＡと氷上で１５分間インキュベートすることにより溶解した。次に、細胞懸濁液を、非コーティング９６ウェルプレートに４００００～１０００００細胞／ウェルの密度で播種した。ミクログリア細胞の増殖および生存を促進するために、組換えヒトＧＭ－ＣＳＦを、播種の際およびその後３日ごとに最終濃度２０ｎｇ／ｍｌで培地に添加した。３～５日後に、培養物を、培地で洗浄して細胞片を除去し、これをアッセイ０日目と定義した。培養されたミクログリア細胞の純度を、ミクログリア同定マーカ（Ｉｂａ１）および活性化マーカ（ＣＤ４５）についての免疫染色により検証した。加えて培養物を、アストロサイト（ＧＦＡＰ発現）および神経細胞（ＮｅｕＮ発現）を含む潜在的に混入する細胞集団についてチェックした。ＱＣプレートを、実験開始の同日に４％ホルムアルデヒドで固定した。

ＩＣ_５０決定のためのＩＬ－１β ＥＬＩＳＡ
０日目にミエリンおよび細胞片を、培地での洗浄により除去した。２および３日目に（Ｔ＝０時間）、培地を、１００ｎｇ／ｍｌＬＰＳ８０μｌ（無血清培地中で調製）と交換して、ミクログリアをプライミングした。Ｔ＝＋１．５時間に、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ、０．３ｎＭ、０．０６４ｎＭの式（Ｉ）の化合物（ＰＢＳ中）を、添加した。３０分後に、５ｍＭＡＴＰ（無血清培地中の最終濃度）を、培養物に添加した。惹起後の異なる時点で、上清を、別の９６ウェルプレートに収集し、－２０℃で貯蔵した（分析される試料をＡＴＰ添加後２時間目に収集した）。ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ（登録商標））サイトカインイムノアッセイ（Ｕ－ＰＬＥＸＨｕｍａｎＫｉｔ）を用いて、キット（ＭＳＤ＃Ｋ１５１ＴＵＫ－２）と共に提供された製造業者の使用説明書に従い、各条件からの細胞上清中のＩＬ－１βの濃度を定量した。手短に述べると、ＭＳＤプレートを、振とう台の上で、Ｄｉｌｕｅｎｔ１００で希釈された捕捉抗体により室温で２時間コートした。プレートを、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、２５μＬ／ウェルのＤｉｌｕｅｎｔ４３、ならびに２５μＬ／ウェルの未希釈試料および標準曲線濃度を、技術的に二重で添加し、振とうしながら（５００ｒｐｍ）４℃で一晩インキュベートした。プレートを、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、Ｄｉｌｕｅｎｔ３で希釈されたＭＳＤＳｕｌｆｏ－Ｔａｇコンジュゲート化検出抗体を、各ウェルに添加し、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートをその後、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、水で１：２希釈されたＭＳＤＲｅａｄＢｕｆｆｅｒ－Ｔ４ｘ（界面活性剤含む）１５０μｌを、各ウェルに添加した。プレートを、ＭＳＤｓｅｃｔｏｒｉｍａｇｅｒｍｏｄｅｌ６０００を用いて読み取り、濃度を、ＭＳＤｄｉｓｃｏｖｅｒｙｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（登録商標）ｖｅｒｓｉｏｎ４を用いて計算した。試料を、ＭＳＤＳＥＣＴＯＲＳ６００リーダで分析し、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹＷＯＲＬＢＥＮＣＨでＭＳＤプレートから作成された複合データセットを解析した。

結果
上清中のＩＬ－１β濃度を、ＭＳＤキットに含まれる組換えＩＬ－１βの標準曲線を利用して逆算した。図８に示される通り、式（Ｉ）の化合物は、１４２ｎＭのＩＣ_５０を得ており、したがって化合物がヒトミクログリア中のＩＬ－１β産生を阻害するのに効果的であることを実証する。

試験Ｇ－パーキンソン病の脳からの初代ヒトミクログリア中のＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害
目的
カノニカルＮＬＲＰ３活性化因子であるＡＴＰで活性化されたＬＰＳでプライミングされたヒトミクログリア中の式（Ｉ）の化合物のＩＣ_５０を、疾患の状況において決定することである。

ヒト脳試料
ヒト脳材料を、臨床的に充分に証明されかつ神経学的に確認された症例および非神経学的対照からの死後材料を供給するＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓＢｒａｉｎＢａｎｋ（ＮＢＢ；オランダアムステルダム）の迅速剖検システムを介して得た。剖検を、同意書がＮＢＢにより得られているドナーについて実施した。３例のパーキンソン病の脳を、これらの実験で用いた。

ＩＣ_５０決定のためのＩＬ－１β ＥＬＩＳＡ
０日目にミエリンおよび細胞片を、培地での洗浄により除去した。２および３日目に（Ｔ＝０時間）、培地を、１００ｎｇ／ｍｌＬＰＳ８０μｌ（無血清培地中で調製）と交換して、ミクログリアをプライミングした。Ｔ＝＋１．５時間に、１０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ、０．３ｎＭ、０．０６４ｎＭの式（Ｉ）の化合物（ＰＢＳ中）を添加した。３０分後に、５ｍＭＡＴＰ（最終濃度、無血清培地中）を培養物に添加した。惹起後の異なる時点で、上清を、別の９６ウェルプレートに収集し、－２０℃で貯蔵した（分析される試料をＡＴＰ添加後２時間目に収集した）。ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ（登録商標））サイトカインイムノアッセイ（Ｕ－ＰＬＥＸＨｕｍａｎＫｉｔ）を用いて、キット（ＭＳＤ＃Ｋ１５１ＴＵＫ－２）と共に提供された製造業者の使用説明書に従い、各条件からの細胞上清中のＩＬ－１βの濃度を定量した。手短に述べると、ＭＳＤプレートを、振とう台の上で、Ｄｉｌｕｅｎｔ１００で希釈された捕捉抗体により室温で２時間コートした。プレートを、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、２５μＬ／ウェルのＤｉｌｕｅｎｔ４３、ならびに２５μＬ／ウェルの未希釈試料および標準曲線濃度を、技術的に二重で添加し、振とうしながら（５００ｒｐｍ）４℃で一晩インキュベートした。プレートを、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、Ｄｉｌｕｅｎｔ３で希釈されたＭＳＤＳｕｌｆｏ－Ｔａｇコンジュゲート化検出抗体を、各ウェルに添加し、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートをその後、０．０５％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、水で１：２希釈されたＭＳＤＲｅａｄＢｕｆｆｅｒ－Ｔ４ｘ（界面活性剤含む）１５０μｌを、各ウェルに添加した。プレートを、ＭＳＤｓｅｃｔｏｒｉｍａｇｅｒｍｏｄｅｌ６０００を用いて読み取り、濃度を、ＭＳＤｄｉｓｃｏｖｅｒｙｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（登録商標）ｖｅｒｓｉｏｎ４を用いて計算した。試料を、ＭＳＤＳＥＣＴＯＲＳ６００リーダで分析し、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹＷＯＲＬＢＥＮＣＨでＭＳＤプレートから作成された複合データセットを解析した。

結果
上清中のＩＬ－１β濃度を、ＭＳＤキットに含まれる組換えＩＬ－１βの標準曲線を利用して逆算した。図９に示される通り、式（Ｉ）の化合物は、１０１ｎＭのＩＣ_５０を得ており、したがって化合物が疾患の状況におけるヒトミクログリア中のＩＬ－１β産生を阻害するのに効果的であることを実証する。

ミクログリアは、脳および脊髄に存在し、中枢神経系の能動免疫防御の主要な形態として作用する。ミクログリア中の炎症応答は、パーキンソン病（全体として参照により本明細書に組み入れられるＨｏ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２０１９，ｖｏｌ．１１７５，ｐｐ．３３５－３５３；およびＧｏｒｄｏｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１８，ｖｏｌ．１０（４６５）参照）、アルツハイマー病（全体として参照により本明細書に組み入れられるＨｅｍｏｎｎｏｔｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．ＡｇｉｎｇＮｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１９，ｖｏｌ．１１，ａｒｔｉｃｌｅ２３３参照）、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症）（全体として参照により本明細書に組み入れられるＲｏｄｒｉｇｕｅｚｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６，ｖｏｌ．２３（４２），ｐｐ．４７５３－４７７２；およびＢｒｉｔｅｓｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１４，ｖｏｌ．８，ａｒｔｉｃｌｅ１１７参照）、ハンチントン病（全体として参照により本明細書に組み入れられるＹａｎｇｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．ＡｇｉｎｇＮｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１７，ｖｏｌ．９，ａｒｔｉｃｌｅ１９３；およびＰａｖｅｓｅｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００６，ｖｏｌ．６６（１１）、ｐｐ．１６３８－１６４３参照）、多系統萎縮症（全体として参照により本明細書に組み入れられるＫｕｂｌｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．，２０１９，ｖｏｌ．３４（４），ｐｐ．５６４－５６８；およびＩｓｈｉｚａｗａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２００４，ｖｏｌ．６３（１），ｐｐ．４３－５２参照）、進行性核上性麻痺（全体として参照により本明細書に組み入れられるＦｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｂｏｔｒａｎｅｔａｌ．，ＰａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍＲｅｌａｔＤｉｓｏｒｄ．，２０１１，ｖｏｌ．１７（９），ｐｐ．６８３－６８８；およびＩｓｈｉｚａｗａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２００１，ｖｏｌ．６０（６），ｐｐ．６４７－５７参照）、前頭側頭型認知症（全体として参照により本明細書に組み入れられるＰａｓｑｕａｌｅｔｔｉｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＮｅｕｒｏｌｏｇｙａｎｄＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｐｏｒｔｓ，２０１５，ｖｏｌ．１５，ａｒｔｉｃｌｅ１７；Ｂａｃｈｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１８，ｖｏｌ．１２，ａｒｔｉｃｌｅ４８８；およびＣａｇｎｉｎｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２００４，ｖｏｌ．５６（６），ｐｐ．８９４－７参照）、運動失調（全体として参照により本明細書に組み入れられるＫｏｊｉｃｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，９：３１９５，２０１８参照）、および神経変性プリオン病（全体として参照により本明細書に組み入れられるＳｈｉｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍ，９：７３，２０１２参照）などの障害に関連づけられている。本明細書に提示された結果は、（ｉ）式（Ｉ）の化合物がミクログリア中のＮＬＲＰ３の高度に強力な阻害剤であること、および（ｉｉ）それが経口投与後に血液脳関門を越えることによりそのようなミクログリアに到達し得ること、の両方を実証する。そのため、式（Ｉ）の化合物は、神経変性疾患の処置または予防に効果的であろうと考えられる。

試験Ｈ－パーキンソン病のプレフォームドフィブリル（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄｆｉｂｒｉｌｓ）（ＰＦＦ）マウスモデルにおける経口有効性
目的
予防的および治療的投薬スケジュールを利用して、パーキンソン病（ＰＤ）の慢性進行性モデルであるプレフォームドフィブリル（ＰＦＦ）マウスモデルにおいて式（Ｉ）の化合物の経口有効性を決定することである。

処置
８週齢Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（オーストラリアパースのＡＲＣから得た）を、ＳＰＦ環境制御施設において１２時間の明周期下で飼育し、試験開始前２週間は飼料および水を随意に提供した。式（Ｉ）の化合物（または対照動物では水のみ）を、飲料水中で０．３ｍｇ／ｍｌでマウスに投与した。動物を、表９に記載される群に分別し、各コホートで１０匹で開始した。予防的投薬では、処置を、ＰＦＦ－シヌクレイン注射の１日前に開始した。治療的投薬では、処置を、ＰＦＦ－シヌクレインでの疾患誘導の４か月後に開始した。

細線維αシヌクレインの調製
組換えヒトαシヌクレインを、ｒＰｅｐｔｉｄｅＩｎｃ．から得て、インビトロフィブリル作製を、過去に発表された報告に概説された通り、連日の音波処理サイクルを用いて細線維凝集体を破壊しながら、７日間オービタルミキサー（４００ｒｐｍ）で撹拌しつつ３７℃でインキュベーションすることにより、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で実施した（全体として参照により本明細書に組み入れられるＬｕｋｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，ｖｏｌ．３３８（６１０９），ｐｐ．９４９－５３；およびＺｈａｎｇｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１９，ｖｏｌ．１９４８，ｐｐ．４５－５７参照）。細線維αシヌクレイン種の生成を、使用前に透過型電子顕微鏡およびチオフラビンＴ蛍光により確認した。

外科的手順
マウスに、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）麻酔を用いて麻酔をかけ、マウスを、特別にマウスに適合されたノーズバーおよびアイバーを備えた定位固定装置に配置した。病変を、５μｌハミルトンシリンジを用いて実施して、ビヒクルまたはヒトＰＦＦ－シヌクレイン（８μｇ）のどちらかを以下のブレグマに対する座標で定位脳地図に従って右背側線条体中に送達した：ＡＰ：＋０．５ｍｍ；ＭＬ：－２．０ｍｍ；ＤＶ：－３．０ｍｍ（ＰａｘｉｎｏｓａｎｄＦｒａｎｋｌｉｎ（２００８）による「Ｔｈｅｍｏｕｓｅｂｒａｉｎｉｎｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ」）。頭蓋骨に１ｍｍの穿頭孔を開けた後、２μｌ容量の溶液を、標的部位に０．２μｌ／分の速度で輸注した。針を、注射後少なくとも５分間定位置に保持して、穿刺経路に沿った逆流を最小限に抑えた。マウスに、滅菌リンゲル液を皮下注射により投与して回復を容易にし、マウスを、麻酔から完全に回復するまでヒートパッド上に置いた。

挙動テスト
全ての挙動テストを、明暗周期の明期の間に実施した。各テストの前に、マウスを、少なくとも３０分の馴化期間の間テストルームに移動させた。挙動テストに用いられる機器および道具を、７０％エタノールで徹底して浄化し、トライアル間は滅菌水ですすいで臭いを最小限に抑えた。

バランスビームテスト
マウスを、０．５ｃｍ幅、１ｍ長のバランスビーム装置でテストした。バランスビームは、５０ｃｍ高の透明Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ構造と、軌道の終末にある暗い休憩ボックスからなった。マウスを、午前に３回ビームで訓練し、少なくとも１５分のトライアル間休憩期間を設けた。マウスを、暗い休憩ボックス中に少なくとも１０秒間放置した後、ホームケージに戻した。マウスをその後、訓練セッションの少なくとも２時間後の午後に再テストした。テストセッションの間、マウスの成績を記録した。テストは、３回のトライアルと、少なくとも１０分のトライアル間休憩時間からなった。ビームを横断するまでの潜時を、この３回のテストの間に記録した。マウスを、ＰＦＦまたはビヒクル注射後４、６、８および１０か月目にテストした。

ロータロッドテスト
加速ロータロッドテストを、２日間訓練および馴化させて連続３日にわたり実施した。１日３回のトライアルを、５分間で５～４０ＲＰＭの加速される速度にてロータロッド（ＵｇｏＢａｓｉｌｅ）装置を用いて実施した。少なくとも３０分の休憩時間を、トライアル間に与えた。落下潜時を、各時間に記録した。回転するロッド上に５分より長く乗ることができた各マウスを、取り出し、その潜時を、３００秒と記録した。実施されたトライアル３回の平均を、提示する。マウスを、ＰＦＦまたはビヒクル注射後４、６、８および１０か月目にテストした。

血漿ＩＬ－１β ＥＬＩＳＡ決定
マウスＩＬ－１βキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ００８）を用いて、カリング時点（１２か月）でのマウスからの血漿試料中のＩＬ－１β濃度を測定した。血漿試料を、製造業者の使用説明書に従って５分の１に希釈した。

線条体ドパミンおよび代謝産物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定量
１２か月目にマウスを、殺処分し、線条体組織を、顕微解剖し、計量し、－８０℃で瞬間冷凍した。線条体組織からの神経伝達物質を抽出し、クロロギ酸エチルを用いて誘導体化した。線条体ドパミン（ＤＡ）およびその代謝産物（ＤＯＰＡＣおよびＨＶＡ）を、過去に記載された通り、高感度液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて、内部標準３，４－ジヒドロキシベンジルアミン（ＤＨＢＡ）の存在下でそれらの安定な誘導体形態で定量した（Ｐａｒｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２０１３，ｖｏｌ．３６，ｐｐ．２５２－８）。ＡＰＩ３２００（ＡＢＳＣＩＥＸ）トリプル四重極ＱＴＲＡＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムを、多重反応モードでポジティブ（＋１）イオン化の下、ＡｇｉｌｅｎｔシリーズＨＰＬＣシステムと連結されたＴｕｒｂｏＶイオン源と共に用いた。試料を、移動相Ａ（ｍｉｌｉＱ水中の０．１％ギ酸）および移動相Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）を用いる流速５００μｌでのバイナリ勾配条件下にて、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＳｙｎｅｒｇｉＦｕｓｉｏｎ－ＲＰ８０Å分析カラム（１５０×４．６ｍｍ；４μｍ）でクロマトグラフィーにかけた。定量では、分析物あたり１トランジションをモニタリングし、分析物あたり２トランジションを、定性目的でモニタリングした。

結果
挙動の結果を図１０に示す。ＰＦＦ－Ｓｙｎマウスは、進行性運動障害および線条体ドパミンの損失を発症し、注射の４か月後に有意な変化を有する。ＰＦＦ注射前の２４時間（予防的）からのおよびＰＦＦ注射後の４か月（治療的）からの式（Ｉ）の化合物（０．３ｍｇ／ｍｌ）の飲水投与はいずれも、ロータロッドで改善された成績をもたらした（図１０Ａ）。類似の結果が、バランスビームテストで得られた（図１０Ｂ）。

血漿中の循環ＩＬ－１βのプロファイルを特徴づけるために、ＩＬ－１βを、ＰＦＦ－シヌクレイン注射後１２か月目にＥＬＩＳＡを通して測定した。図１１に示された結果は、予防的および治療的処置の両方がＰＦＦ－シヌクレイン群に比較して循環ＩＬ－１βの有意な減少をもたらしたことを実証する。式（Ｉ）の化合物での予防的処置で観察された減少は、治療的投薬群で観察された減少より大きかった。

線条体ドパミンの（ＤＡ）およびその代謝産物（ＤＯＰＡＣおよびＨＶＡ）のレベルの分析結果を、図１２に示す。

ＰＦＦモデルを用いた過去の試験は、注射された側での線条体ドパミンの低減を伴う、黒質中のドパミン作動性ニューロンの進行性損失があることを示した（全体として参照により本明細書に組み入れられるＺｈａｎｇｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１９，ｖｏｌ．１９４８，ｐｐ．４５－５７；およびＧｏｒｄｏｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１８，ｖｏｌ．１０（４６５）参照）。これらの報告と一致して、未処置のＰＦＦ－ｓｙｎマウスにおいて、１２か月目の線条体ドパミンおよびドパミン代謝産物の実質的低減が観察された。対照的に、予防的および治療的設定の両方で式（Ｉ）の化合物で処置されたＰＦＦ－ｓｙｎマウスは、有意に高い線条体ドパミン濃度を有し（それぞれＰ＜０．０２およびＰ＜０．０５；図１２Ａ）、この薬物がαシヌクレインの病理学により誘導されるドパミン作動性神経変性から保護したことを示す。処置されたマウスはまた、非処置ＰＦＦマウスに比較して有意に高いドパミン代謝産物ＤＯＰＡＣ（図１２Ｂ）およびＨＶＡ（図１２Ｃ）を有した。

したがって、パーキンソン病のＰＦＦマウスモデルにおける式（Ｉ）の化合物の経口投与は、治療的および予防的能力の両方において効果的処置をもたらすと結論づけることができる。予防的処置群は特に、運動障害およびドパミン損失に対して優れた有効性を示した。とりわけＰＦＦ－シヌクレイン注射後４か月目に開始する治療的処置群はまた、ＰＦＦ－シヌクレイン群に比較して、運動機能の有意な改善を示し、式（Ｉ）の化合物での処置がこのモデルにおいてさらなるドパミン作動性神経変性を停止させ得ることを示した。興味深いことに、実験終了時（１２か月目）のドパミンおよびそれらの代謝産物の測定は、予防的および治療的処置レジメンの両方での神経保護を実証した。このことは、４か月目の明白な運動障害にかかわらず、式（Ｉ）の化合物が、依然としてドパミン損失のさらなる下降を予防し得ることを示唆する。結果は、パーキンソン病患者、特に能動的運動症状および／またはドパミン損失を有する患者における処置が有益であることを立証する、好材料を提供する。

Claims

神経変性疾患の処置または予防における使用のための、式（Ｉ）：

の化合物またはその医薬的に許容できる塩。
前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項１に記載の使用のための化合物または塩。
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病である、請求項１に記載の使用のための化合物または塩。
前記神経変性疾患が、運動ニューロン疾患である、請求項１に記載の使用のための化合物または塩。
前記神経変性疾患が、ハンチントン病である、請求項１に記載の使用のための化合物または塩。
前記神経変性疾患が、多系統萎縮症である、請求項１に記載の使用のための化合物または塩。
前記神経変性疾患が、進行性核上性麻痺である、請求項１に記載の使用のための化合物または塩。
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症である、請求項１に記載の使用のための化合物または塩。
前記神経変性疾患が、運動失調である、請求項１に記載の使用のための化合物または塩。
前記神経変性疾患が、神経変性プリオン病である、請求項１に記載の使用のための化合物または塩。
前記処置または予防が、神経炎症の処置または予防を含む、いずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
前記処置または予防が、前記化合物または前記その塩の経口投与を含む、いずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
前記化合物または塩が、ナトリウム塩である、いずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
前記化合物または塩が、一ナトリウム塩である、いずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
前記化合物または塩が、一水和物である、いずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
前記化合物または塩が、結晶性である、いずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
前記化合物または塩が、結晶性一ナトリウム一水和物塩である、任意の前記請求項に記載の使用のための化合物または塩。
４．３°２θ、８．７°２θ、および２０．６°２θ（全て±０．２°２θ）にピークを含むＸＲＰＤスペクトルを有する、請求項１７に記載の使用のための化合物または塩。
ＸＲＰＤスペクトルを有しその中の１０個の最も強いピークが４．３°２θ、６．２°２θ、６．７°２θ、７．３°２θ、８．７°２θ、９．０°２θ、１２．１°２θ、１５．８°２θ、１６．５°２θ、１８．０°２θ、１８．１°２θ、２０．６°２θ、２１．６°２θ、および２４．５°２θ（全て±０．２°２θ）から選択される２θ値を有する５個以上のピークを含む、請求項１７または１８に記載の使用のための化合物または塩。
医薬的に許容できる賦形剤といずれかの前記請求項に記載の使用のための化合物または塩とを含む医薬組成物。
経口投与に適する、請求項２０に記載の医薬組成物。
それを必要とする患者における神経変性疾患の処置または予防のための方法であって、式（Ｉ）：

の化合物またはその医薬的に許容できる塩の治療的または予防的に効果的な量を前記それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項２２に記載の方法。
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病である、請求項２２に記載の方法。
前記神経変性疾患が、運動ニューロン疾患である、請求項２２に記載の方法。
前記神経変性疾患が、ハンチントン病である、請求項２２に記載の方法。
前記神経変性疾患が、多系統萎縮症である、請求項２２に記載の方法。
前記神経変性疾患が、進行性核上性麻痺である、請求項２２に記載の方法。
前記神経変性疾患が、前頭側頭型認知症である、請求項２２に記載の方法。
前記神経変性疾患が、運動失調である、請求項２２に記載の方法。
前記神経変性疾患が、神経変性プリオン病である、請求項２２に記載の方法。
前記処置または予防が、神経炎症の処置または予防を含む、請求項２２～３１のいずれか１項に記載の方法。
前記処置または予防が、前記化合物または前記その塩の経口投与を含む、請求項２２～３２のいずれか１項に記載の方法。
前記化合物または塩が、ナトリウム塩である、請求項２２～３３のいずれか１項に記載の方法。
前記化合物または塩が、一ナトリウム塩である、請求項２２～３４のいずれか１項に記載の方法。
前記化合物または塩が、一水和物である、請求項２２～３５のいずれか１項に記載の方法。
前記化合物または塩が、結晶性である、請求項２２～３６のいずれか１項に記載の方法。
前記化合物または塩が、結晶性一ナトリウム一水和物塩である、請求項２２～３７のいずれか１項に記載の方法。
前記結晶性一ナトリウム一水和物塩が、４．３°２θ、８．７°２θ、および２０．６°２θ（全て±０．２°２θ）にピークを含むＸＲＰＤスペクトルを有する、請求項３８に記載の方法。
前記結晶性一ナトリウム一水和物塩が、ＸＲＰＤスペクトルを有しその中の１０個の最も強いピークが４．３°２θ、６．２°２θ、６．７°２θ、７．３°２θ、８．７°２θ、９．０°２θ、１２．１°２θ、１５．８°２θ、１６．５°２θ、１８．０°２θ、１８．１°２θ、２０．６°２θ、２１．６°２θ、および２４．５°２θ（全て±０．２°２θ）から選択される２θ値を有する５個以上のピークを含む、請求項３８または３９に記載の方法。