JP2023500055A - 細胞培養ウェルプレートのための方法および装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、一般に、培養中の細胞のための方法、装置、およびシステムに関する。より具体的には、本発明は、新規のマルチウェルプレートおよび濃縮器マスクに関する。本発明はまた、細胞播種および細胞アッセイのためのマルチウェルプレートおよび濃縮器マスクの使用に関する。

Description

〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０１９年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／９２８，１２１号の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、一般に、培養中の細胞のための方法、装置、およびシステムに関する。より具体的には、本発明は、新規のマルチウェルプレートおよび濃縮器マスクに関する。本発明はまた、細胞播種および細胞アッセイのためのマルチウェルプレートおよび濃縮器マスクの使用に関する。

マルチウェルプレートは、細胞の測定を並行しておよび／または同時に行うために広く使用されており、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどのベンダから様々なウェルフォーマットで市販されている。組織培養用のマルチウェルプレートは、６、１２、２４、４８、９６、３８４、および１５３６ウェルフォーマットで利用でき、コーティングされたプレートとコーティングされていないプレートは、それぞれ接着細胞培養と懸濁培養に利用できる。

マルチウェルプレートは、細胞集団の測定を行うためによく使用される。通常、細胞を細胞培養ウェルプレートのウェルに播種するとき、細胞水溶液がウェルにピペッティングされ、細胞が沈降してウェルの底を覆う。播種されたウェルプレートは、細胞の成長と増殖を促進するためにインキュベータに配置されることがよくある。これにより、細胞がウェルの底面全体を覆う。しかし、ウェルの底面全体に細胞を播種することから生じるいくつかの課題があり、その多くは、多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイに関連する空間感度によるものである。

したがって、培養細胞をウェルの中心に集中させて、光学アッセイ感度およびエッジ誘導細胞生物学的効果に関連する熱的不均一性に対する細胞播種バイアスダイを含むがこれらに限定されない空間バイアスを回避することが望ましい場合が多い。

光学的読み取りを伴うアッセイの場合、ウェルの周辺領域からの光伝達の効率は、通常、ウェルの中心からの光伝達よりも劣る。これは、ウェルの側壁付近での光アクセスの減少によるものである。さらに、照明および／またはデータ収集効率は、検出器の視野のエッジで妨げられる。

場合によっては、プレートリーダ戦略を用いて、均一な照明を生成し、ウェル全体からデータの均一な取得を容易にする。しかし、そのような戦略は時間がかかり、非効率的である。他のプレートリーダ戦略は、光伝達が不十分な領域を回避するためにウェルの中心からのみ測定を行うが、このアプローチでは、ウェルの中心の外側で成長している細胞に関連するデータが省略される場合がある。

さらに、細胞がウェルプレートに播種されると、ウェルプレートの外周にあるウェル内の細胞が成長し、プレートの周囲にないウェル内の細胞とは異なる動作をする可能性がある。この現象は一般に「エッジ効果」と呼ばれる。このエッジ効果は重要であるため、マルチウェルプレートの周囲ウェルに細胞を播種しないのが一般的なやり方である。理論に拘束されることなく、エッジ効果は、プレートがインキュベータ内に配置されたときに、プレートの周囲にあるウェル内のウェル培地の加熱差によると考えられている。例えば、細胞は温度勾配に応じてウェルの側壁に集まる傾向がある。ウェルプレートの周囲にあるウェルの場合、温度勾配がより厳しくなり、ウェルの側壁に向かって不均衡な細胞増殖を引き起こす。エッジ効果を示す細胞を光学アッセイ技術で分析すると、ウェル間のばらつきが大きくなる可能性がある。一部のウェルプレートには、エッジ効果を軽減するためにユーザーが培地で埋めるモートが含まれている。培地は、周囲のウェルへの熱および湿度のバッファーとして機能すると考えられている。

ウェルの側壁の近くで成長する細胞およびそのような細胞の光学的検出に関連する物理的および生物学的課題に対処する、マルチウェルプレートで細胞を培養するための装置、方法およびシステムに対する当技術分野における強い必要性が依然として存在する。

本方法および装置のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲と併せて、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

一態様では、本技術は、液体培地中の細胞集団のためのマルチウェルプレートに関する。マルチウェルプレートは、フレーム表面およびフレーム表面から延びるフレーム側面を有するフレームと、各ウェルが開放端、開放端の反対側の閉鎖端、および開放端と閉鎖端との間の少なくとも１つの壁を有する、複数のウェルであって、各ウェルの開放端が、フレーム表面によって取り囲まれ、閉鎖端が、少なくとも１つの壁の間にあり、少なくとも１つの壁に接触するウェル表面を含む、複数のウェルと、１つまたは複数のウェルの閉鎖端のウェル表面上の少なくとも１つの連続リングと、を含む。形状がウェルの閉鎖端に連続境界を含む限り、連続リングは任意の形状であり得ることが想定される。いくつかの実施形態では、連続リングは、円形、楕円形、または丸みを帯びた境界エッジを含む他の形状である。他の実施形態では、連続リングは、正方形、長方形、三角形、または他の幾何学的形状であり得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの連続リングは、ウェル表面上に少なくとも１つの細胞播種領域を画定するように構成される。細胞播種領域の形状は、連続リングの形状によって画定され、連続境界を含む限り、任意の形状であると想定される。いくつかの実施形態では、マルチウェルプレートは、複数の細胞播種領域を画定するように構成された複数の連続リングを含む。

別の態様では、本技術は、液体培地中の細胞をマルチウェルプレートに播種するための濃縮器マスクに関する。濃縮器マスクは、フレーム表面およびフレーム表面から延びるフレーム側面を有するフレームと、フレーム表面から延びる複数の漏斗であって、各漏斗が、第１の開放端および第２の開放端を有する、漏斗と、を含み、第１の開放端がフレーム表面に接続されており、第２の開放端よりも大きな直径を有する。

本技術の他の態様は、培養ウェルの中央部分に細胞を播種する方法に関する。この方法は、細胞を含む液体培地を、各ウェルの閉鎖端の表面上の少なくとも１つの連続リングによって囲まれる少なくとも１つの細胞播種領域にピペッティングすることを含む。

本技術の他の態様は、マルチウェルプレートおよび濃縮器マスクを含む細胞播種システムに関する。マルチウェルプレートは、フレーム表面とフレーム表面から延びるフレーム側面とを有するフレームと、各ウェルが開放端、開放端の反対側の閉鎖端、および開放端と閉鎖端との間の少なくとも１つの壁を有する、複数のウェルであって、各ウェルの開放端は、フレーム表面によって取り囲まれ、閉鎖端は、壁の間にあり、壁に接触するウェル表面を含む、複数のウェルと、１つまたは複数のウェルの閉鎖端のウェル表面上の少なくとも１つの連続リングと、を含む。濃縮器マスクは、フレーム表面とフレーム表面から延びるフレーム側面とを有するフレームと、フレーム表面から延びる複数の漏斗と、を含む。各漏斗は、第１の開放端および第２の開放端を有し、第１の開放端はフレーム表面に接続されており、第２の開放端よりも大きな直径を有する。濃縮器マスクおよびマルチウェルプレートの複数の漏斗は、漏斗の第２の開放端が各ウェルの閉鎖端のウェル表面上の連続リングと接触するように、濃縮器マスクの漏斗が複数のウェルに挿入されるときに細胞播種システムを形成する。

本技術の他の態様は、細胞を含む液体培地を細胞播種システムの漏斗の第１の開放端にピペッティングすることにより、マルチウェルプレート上のウェルの中心に細胞を播種する方法に関し、細胞は、ウェル表面上の少なくとも１つの連続リングによって囲まれた領域に沈着する。

ウェルの内側底面上に連続リングを含むウェルを有するマルチウェルプレートの断面を示す断面図である。 図１Ａの図を拡大したものであり、ウェルの内側底面上に連続リングを含むウェルを有するマルチウェルプレートを示している。 細胞をマルチウェルプレートに播種するための濃縮器マスクの概略図である。 図２Ａの断面図であり、マルチウェルプレートに細胞を播種するための濃縮器マスクの断面を示している。 ウェルの内側底面上に連続リングを含むウェルを有するマルチウェルプレートに挿入された濃縮器マスクを含む細胞播種システムの断面図である。 ウェルの内側底面上に連続リングを含むウェルを有する９６ウェルプレートの概略図である。

本教示は、添付の図面の図と併せ読むとき、以下の詳細な説明から最もよく理解される。特徴は必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではない。実用的な場合はいつでも、同様の参照番号は同様の機能を指す。

本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことを理解されたい。定義された用語は、本教示の技術分野で一般的に理解され受け入れられている定義された用語の技術的および科学的意味に追加されるものである。

〔定義〕
本明細書で使用される場合、「実質的な」または「実質的に」という用語は、それらの通常の意味に加えて、当業者の許容範囲または程度内を意味する。

本明細書で使用される場合、「ほぼ」および「約」という用語は、許容範囲内または当業者に相当する量を意味する。「約」という用語は、一般に、示された数値のプラスまたはマイナス１５％を指す。例えば、「約１０」は、８．５～１１．５の範囲を示す。例えば、「ほぼ同じ」は、当業者が、比較される物品が同じであると見なすことを意味する。本開示では、数値範囲は、範囲を定義する数字を含む。

様々な実施形態が説明される前に、本開示の教示は、記載された特定の実施形態に限定されず、それ自体、もちろん、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本教示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを意図しないことも理解されたい。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本教示の実施または試験に使用することができるが、いくつかの例示的な方法および材料がここに記載されている。本明細書で参照されるすべての特許および刊行物は、参照により明示的に組み込まれている。

明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。したがって、例えば、「ウェル」は、１つのウェルおよび複数のウェルを含む。

〔連続リングを有するウェルを備えたマルチウェルプレート〕
少なくとも１つの実施形態では、最新の技術は、細胞培養またはアッセイウェルプレートの各ウェルの底部に成形された連続リングに関する。連続リングは、ウェルの底上に中央の細胞播種領域を作成する。細胞がリングの中心に播種されると、リングは細胞をウェルの中心に拘束するための物理的障壁として機能する。これには、以下に概説するいくつかの利点がある。

さらに、Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＦ機器などの特定のマイクロウェルアッセイ機器と組み合わせると、連続リングが機能してアッセイマイクロチャンバの体積を画定するよう働き、アッセイ感度を向上させる。例えば、いくつかの実施形態では、ウェルの連続リングは、分析機器と接合して、代謝測定を行うことができる、半密封された、一時的な、体積が減少したマイクロチャンバを形成する。

本技術のいくつかの実施形態では、細胞は、連続リングによって形成される境界内で、ウェルの中心に播種される。連続リングは、播種された細胞をウェルの中心に拘束する物理的障壁を提供する。ウェルの側壁から離れたウェルの中心にのみ細胞を播種することにより、ウェルの周囲付近の温度差および／または流体の差による光伝達および細胞播種密度勾配によって引き起こされる影響を緩和させる。細胞はウェルの側壁から距離があるため、照明の違いによる影響も最小限に抑えられる。

他の実施形態では、本技術は、マルチウェルプレートのウェルの底部上の連続リング内側に細胞を播種するための方法に関する。いくつかの実施形態では、液体培地中の細胞は、連続リングによって画定される細胞播種領域に添加される（例えば、ピペッティングされる）。これらの実施形態では、次に、細胞は、例えば、培養によって増殖させることができるが、細胞増殖は、連続リングによって形成される細胞播種領域に制限される。現在説明されているマルチウェルプレート、およびそれを使用する方法は、接着細胞と懸濁細胞の両方と互換性がある。いくつかの他の実施形態では、細胞、組織、またはオルガノイドは、連続リングによって形成された特定の区域に添加（例えば、播種）することができる。

他の実施形態では、細胞は、異なる細胞型の非接触共培養を作成するためなどに、連続リングの内側および外側の両方に播種することができる。いくつかの実施形態では、細胞播種領域は、連続リング（複数可）によって細胞播種領域に制限される細胞培養培地を含む。他の実施形態では、細胞播種領域は、他の細胞播種領域からの細胞培養培地と流体連通している細胞培養培地を含む。

いくつかの実施形態では、本技術のマルチウェルプレートのウェルは、ウェル表面への、懸濁細胞の接着を容易にするため、または接着細胞の接着を改善するために、細胞接着を促進する物質でコーティングされ得る。例えば、ポリカチオン性コーティング、例えば、ポリ－１－リジンは、ウェルの表面への任意の細胞型の接着を促進するために使用され得る。他の実施形態では、コーティングされていないマルチウェルプレートを使用することができる。

追加の実施形態では、本技術は、連続リングの内側または外側のいずれかでの異なる細胞型の非接触細胞共培養の調製および維持に関する。非接触共培養を提供するための連続リングは、その形状がウェルの閉鎖端上に連続境界を含む限り、任意の形状であり得ることも想定される。いくつかの実施形態では、非接触共培養のための連続リングは、円形、楕円形、または丸みを帯びた境界エッジを含む他の形状である。他の実施形態では、非接触共培養のための連続リングは、正方形、長方形、三角形、または他の幾何学的形状であり得る。

特定の実施形態では、任意の形状の少なくとも１つの連続リングは、ウェル表面上に少なくとも１つの細胞播種領域を画定するように構成される。他の実施形態では、同心リングなどであるがこれに限定されない多数のセットの連続リングは、ウェル表面上に複数の細胞播種領域を画定するように構成される。他の実施形態では、ウェル表面に成形された物理的障壁はリングではなく、代わりに、細胞播種領域のグリッドまたは他の構成を提供するように構成され得る。

ウェル表面上に複数の細胞播種領域が存在する場合、各細胞播種領域は、異なる細胞型、同じ細胞型、細胞型の混合物、または当業者が望む上記の任意の組み合わせを含み得ることが想定される。いずれにせよ、細胞播種領域の形状と数は、連続リングの形状と数によって定義され、細胞播種領域および／または領域に連続境界および／または境界を提供するために、任意の形状、サイズ、および／または構成であることが想定される。

本技術の追加の実施形態は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＦ機器で使用されるプローブなどの光ファイバプローブと組み合わせてマイクロウェルプレートを使用することに関する。これらの実施形態では、ウェルの中心にのみ細胞を播種することにより、放射状に異なる光信号伝達によって引き起こされる光信号の差を最小限に抑える。これにより、測定感度が向上し、ウェル全体でより均一に表現されたシグナル伝達が得られる。

理論に拘束されることなく、ウェルの中心に拘束された細胞は、細胞培養ワークフローおよびアッセイ中に発生するウェル内の温度勾配による影響が少ないと考えられる。さらに、細胞はウェルの中心に拘束されているため、光伝達が最も高い位置に留まり、ウェルの周囲に播種された細胞によって導入される検出感度の向上とアッセイのばらつきの低減が可能になる。

他の実施形態では、連続リングを含むウェルは、シグナル伝達への放射状依存性またはアッセイ細胞播種領域またはアッセイ体積への放射状依存性を有するＡｇｉｌｅｎｔ ＸＦ機器または他のウェルベースの測定アッセイなどのマイクロウェルプレートリーダを使用してより優れたアッセイ感度を可能にするより小さなアッセイマイクロチャンバを形成する。理論に拘束されることなく、連続リングによって形成された細胞播種領域に播種された細胞は、ウェルプレート内のすべてのウェルを、ウェル間の分析および均一性が改善されたアッセイで使用できるようにする、エッジ効果の低減を示すことも考えられる。

図１Ａは、ウェルの内側底面上に連続リングを含むウェルを有する本マルチウェルプレート１０１の実施形態の断面を示す断面図である。この実施形態では、マルチウェルプレート１０１は、フレーム表面１０２、フレーム側面１０３、およびフレームベース１０４を有するフレームによって画定される。この実施形態のフレームはまた、マルチウェルプレート処理のためのフレームタブ１０５を含む。マルチウェルプレート１０１はまた、ウェル壁１０６、開放端１０７および閉鎖端１０８を含む。ウェルの閉鎖端１０８は、細胞播種領域１１０を画定する連続リング１０９をさらに含む。この実施形態では、マルチウェルプレート１０１はまた、周囲ウェルプレートモート１１１を含むが、他の実施形態では、本技術のマルチウェルプレートは、周囲ウェルプレートモートを含まない。図１Ｂは、図１Ａの拡大図であり、ウェルの内側底面上に連続リングを含むウェルを有する本マルチウェルプレートの実施形態を示している。

いくつかの実施形態では、連続リングによって取り巻かれる細胞播種領域は、ウェル表面の総面積の約１０％から約８０％の面積を有する。他の実施形態では、連続リングによって取り巻かれる細胞播種領域は、ウェル表面の総面積の約５５％から約７５％の面積を有する。いくつかの実施形態では、連続リングによって取り巻かれる細胞播種領域は、ウェル表面の総面積の約６０％から約７０％の面積を有する。他の実施形態では、細胞播種面積は、ウェル表面の総面積の約６５％である。他の実施形態では、細胞播種面積は、ウェル表面の総面積の約１０％から約２５％である。

いくつかの実施形態では、連続リングは、約０．０１ｍｍから約２ｍｍの高さを有する。他の実施形態では、連続リングは、約０．１ｍｍから約０．５ｍｍまたは約１ｍｍの高さを有する。他の実施形態では、連続リングは、約０．３ｍｍから約０．８ｍｍの高さを有する。いくつかの実施形態では、連続リングは、高さ約０．２ｍｍの高さを有する。

いくつかの実施形態では、連続リングは、約０．５ｍｍから約６．０ｍｍの内径を有する。他の実施形態では、連続リングは、約１．０ｍｍから約５．０ｍｍの内径を有する。いくつかの実施形態では、連続リングは、約３．０ｍｍから約４．０ｍｍの内径を有する。いくつかの実施形態では、連続リングは、約２．０ｍｍの内径を有する。

本技術のマルチウェルプレートは、標準的なマルチウェルプレートのウェル数および間隔と一致する寸法を有することを含む、任意の様式または向きで構成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本技術のマルチウェルプレートは、少なくとも８個のウェルを含む。他の実施形態では、本技術のマルチウェルプレートは、少なくとも２４個のウェルを含む。いくつかの実施形態では、本技術のマルチウェルプレートは、少なくとも４８個のウェルを含む。他の実施形態では、本技術のマルチウェルプレートは、少なくとも９６個のウェルを含む。他の実施形態では、本技術のマルチウェルプレートは、少なくとも３８４個のウェルを含む。他の実施形態では、本技術のマルチウェルプレートは、少なくとも１５３６個のウェルを含む。

〔細胞播種用濃縮器マスク〕
別の態様として、本技術は、複数の漏斗を含む細胞播種濃縮マスクを提供する。いくつかの実施形態では、複数の漏斗は、漏斗形状のウェルインサートをウェルプレート内のウェルのストリップまたはグリッドに挿入できるように構成される。いくつかの実施形態では、細胞播種濃縮器マスクは、ウェルの底よりも小さいウェル内の領域への細胞播種を拘束するために使用される。いくつかの実施形態では、濃縮器マスクは、フレームと、フレームから延びる複数の漏斗とを含む。他の実施形態では、濃縮器マスクの漏斗は、第１の開放端および第２の開放端を含み、第１の開放端はフレームに接続されており、漏斗の第２の開放端よりも大きな直径を有する。

本技術の細胞播種濃縮マスクは、標準的なピペットおよび技術を使用して、より大きなウェル内の選択された領域に細胞を播種することを可能にする。いくつかの実施形態では、細胞播種濃縮器マスクは、培養中、播種された細胞を中央ウェル領域に制限する。本技術の濃縮器マスクは、接着細胞または懸濁細胞を播種するために使用することができる。

いくつかの実施形態では、マルチウェルプレートのウェルは、ウェル表面への、懸濁細胞の接着を容易にするため、または接着細胞の接着を改善するために、細胞接着を促進する物質でコーティングされ得る。例えば、ポリカチオン性コーティング、例えば、ポリ－１－リジンは、ウェルの表面への任意の細胞型の接着を促進するために使用され得る。他の実施形態では、コーティングされていないマルチウェルプレートを使用することができる。

いくつかの実施形態では、複数の漏斗の第２の開放端は、漏斗が挿入されるウェルの底部よりも小さくなるように構成される。これらの実施形態では、濃縮器マスクは、ウェルの周囲壁に近いウェルのエッジではなく、ウェルの中心に細胞を播種するために使用することができる。

特定の実施形態では、本技術は、液体溶液中の細胞が、マルチウェルプレートのウェルに挿入される濃縮器マスク漏斗の第１の開放端にピペッティングされ、細胞が沈降することを可能にする方法に関する。他の実施形態では、細胞がウェルの底の接着性コーティング上に回転するように、マルチウェルプレートを遠心分離機で回転させる。次に、マルチウェルプレートをインキュベータに移して、細胞の成長と増殖を促進する。いくつかの実施形態では、濃縮器マスクは、培養の間、ウェルプレートに留まる。他の実施形態では、濃縮器マスクは、培養の前にウェルプレートから除去され得る。追加の実施形態では、濃縮器マスクは、培養中にウェルプレートに残り、播種された細胞の分析の前に除去される。

本技術の別の実施形態では、漏斗の第２の開放端の遠位端は、ウェルの底との界面を作成する。いくつかの実施形態では、界面は液密シールであるが、他の実施形態では、界面は、ギャップを提供することなどによって、液体の通過または拡散を可能にするが低減する。この実施形態では、細胞溶液は、漏斗の第１の開放端にピペッティングされ、溶液は、漏斗の第２の開放端の内側および外側の両方でウェルを満たす。理論に拘束されることなく、細胞は重力によってウェルの底に沈降し、したがって、ウェルの底の領域に沈着する細胞の数は、その上に懸濁している細胞の数に依存すると考えられる。したがって、この実施形態の細胞濃縮器マスクは、細胞が望ましくないウェルの底の領域の上の体積を物理的に占めるように設計されている。したがって、技術のこの実施形態による細胞の播種の最終結果は、ウェルの中心に高濃度で播種された細胞であるが、ウェル壁に近いウェルの周辺領域には細胞が播種されないか、または低濃度である。

特定の実施形態では、漏斗の第２の開放端の外径は、漏斗が挿入されるウェルの内径と実質的に一致するように構成され、その結果、挿入された漏斗は、圧縮または干渉固定によって定位置に保持される。いくつかの実施形態では、外径は、ウェルまたはその一部の内径との所定のギャップを提供するように構成される。本技術の漏斗は、任意のサイズのウェルに挿入するように構成することができる。さらに、この実施形態では、高濃度の細胞が播種される領域のサイズは、漏斗の第２の開放端の内径、および漏斗がマルチウェルプレートのウェルに挿入されるように構成される方法によって決定される。

追加の実施形態では、本技術は、第２の開放端を有する漏斗を含む細胞濃縮器マスクを提供し、第２の開放端は、遠位エラストマー部分を含む。いくつかの実施形態では、第２の開放端の遠位エラストマー部分は、耐液シールであるウェルの底との界面を作成する。この実施形態では、細胞懸濁液を、漏斗の第１の開放端およびウェルの底部にピペッティングし、漏斗の底から液体細胞溶液で空気を置換することができる。この実施形態では、細胞懸濁液は、漏斗の第２の開放端の内径の内側のウェルの底部にのみ細胞を播種する。この実施形態では、播種された細胞は、漏斗がウェルに挿入された状態でウェルの底に沈降する。次に、マルチウェルプレートをインキュベータに移して、細胞の成長と増殖を促進する。いくつかの実施形態では、濃縮器マスクは、培養の間、ウェルプレートに留まる。他の実施形態では、濃縮器マスクは、培養の前にウェルプレートから除去され得る。追加の実施形態では、濃縮器マスクは、培養中にウェルプレートに残り、播種された細胞の分析の前に除去される。本技術の特定の実施形態では、細胞がウェル壁のエッジ付近のウェルの周囲に存在しない間、濃縮された細胞の領域がウェルの中心に播種される。

いくつかの実施形態では、第２の開放端の遠位エラストマー部分は、Ｏリングの形態の弾力性のある、本質的に流体不透過性の材料などのコンプライアントシール材料を含む。コンプライアントシール材料は、第２の開放端の端に適した任意の形状にすることができる。例えば、コンプライアントシール材料は、トロイダル形状のＯリング、長方形の断面を有するガスケット、金属ガスケット、または別のタイプのコンプライアント材料であり得る。一実施形態では、コンプライアントシール材料は、対向するウェル表面と流体シールを形成するフルオロエラストマー材料または他の材料であり得る。別の実施形態では、コンプライアントシール材料はシリコーンゴムである。いくつかの実施形態では、コンプライアントシール材料は、第２の開放端とウェル表面との間に放射状のシールを作る。他のシール配向を用いることもできると考えられる。コンプライアントシール材料は、使用する温度や他の細胞培養培地の成分や条件に応じて様々なゴム、例えば、フルオロポリマー、ブナｎ、ＥＰＤＭ、または場合によっては、コンプライアントオーバープレーティングを備えた金属性にすることができる。コンプライアントシール材料は、Ｏリングの材料がそれを可能にする場合、化学的に不活性で生物学的に適合性のあるコーティングでコーティングすることもできる。

いくつかの実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、平底細胞培養ウェルと接合するように構成される。他の実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＦウェルなどのディンプルウェルと接合するように構成される。

さらに他の実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、ウェルの底部に成形された連続リングを含む本技術のウェルと接合するように構成される。

したがって、本技術の濃縮器マスクは、より大きなウェル内の中央の細胞播種領域に細胞を播種する方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、濃縮器マスク漏斗は、ウェルの底の中心に細胞播種を濃縮する方法で使用される。いくつかの実施形態では、濃縮器マスクは、所望の細胞濃度で中央ウェルの底の領域の上の細胞の大部分を播種する。他の実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、細胞が望ましくないウェルの底の領域から細胞播種を排除する方法で使用することができる。

いくつかの実施形態では、本技術の細胞播種濃縮マスクは、懸濁液中の細胞がウェル表面に接着するように、遠心分離および表面コーティングと組み合わせて細胞懸濁液と共に使用することができる。特定の実施形態では、濃縮器マスクは、下流の分析の前に除去することができる。

本方法は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＦアッセイによる分析などの細胞の分析をさらに含むことができる。

本技術のいくつかの方法では、方法は、ピペッティング作用などによって、濃縮器マスク／ウェルの底の界面に閉じ込められた空気を除去することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、約５．０μｌから約２０μｌの培地を濃縮器マスクにピペッティングすることができる。他の実施形態では、約１０μｌから約１５μｌの培地を濃縮器マスクにピペッティングすることができる。いくつかの実施形態では、約１２．５μｌの培地を濃縮器マスクにピペッティングすることができる。したがって、最新の技術の方法は、重大なピペッティングエラーを導かない体積を使用して実行することができる。

本技術のいくつかの実施形態では、播種されたマルチウェルプレートは、細胞増殖のためにインキュベータに移され得る。これらの実施形態のいくつかでは、濃縮器マスクは、細胞の培養中に定位置に留まることができる。したがって、本技術の特定の実施形態は、低接着性細胞と適合性がある。本技術の他の実施形態は、高接着性細胞の培養に関する。

他の実施形態では、濃縮器マスクおよびそれを使用する方法は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＦウェルプレートなどの市販のマルチウェルプレートと互換性がある。追加の実施形態では、濃縮器マスクおよびそれを使用する方法は、内側の底部ウェル表面に連続リングを含む最新の技術のマルチウェルプレートと互換性がある。

図２Ａは、細胞をマルチウェルプレートに播種するための濃縮器マスクの概略図である。この実施形態では、濃縮器マスク２０１は、フレーム表面２０２およびフレーム側面２０３によって画定される。この実施形態では、フレームはまた、マルチウェルプレート上への濃縮器マスクの整列および積み重ねのためのフレームタブ２０４を含む。複数の漏斗２０５がフレームから延びる。漏斗は、第１の開放端２０６および第２の開放端２０７を含み、第１の開放端２０６は、第２の開放端２０７よりも大きな直径を有する。いくつかの実施形態では、漏斗の遠位端２０８は、エラストマー部分を含む。いくつかの実施形態では、漏斗２０５は、ウェルの底部と漏斗の遠位端２０８との間に耐液界面が作成されるウェルに挿入される。図２Ｂは、図２Ａの断面概略図であり、マルチウェルプレートに細胞を播種するための濃縮器マスクの断面を示す。

本技術の濃縮器マスクは、標準化されたマルチウェルプレートと互換性があり、それに適合するように漏斗の適切な数および間隔を有することを含む、任意の様式または向きで構成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、少なくとも８個の漏斗を含む。他の実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、少なくとも１２個の漏斗を含む。他の実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、少なくとも２４個の漏斗を含む。いくつかの実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、少なくとも４８個の漏斗を含む。他の実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、少なくとも９６個の漏斗を含む。他の実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、少なくとも３８４個の漏斗を含む。他の実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、少なくとも１５３６個の漏斗を含む。

いくつかの実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、約０．５ｍｍから約６．０ｍｍの内径を有する漏斗を含むように構成される。いくつかの他の実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、約１．０ｍｍから約５．０ｍｍの内径を有する漏斗を含むように構成される。他の実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、約３．０ｍｍから約４．０ｍｍの内径を有する漏斗を含むように構成される。他の実施形態では、本技術の濃縮器マスクは、約２．０ｍｍの内径を有する漏斗を含むように構成される。

〔マルチウェルプレートと濃縮器マスクを含む細胞播種システム〕
本技術はまた、本明細書に記載されるような連続リングマルチウェルプレートと組み合わせて使用される、本明細書に記載されるような濃縮器マスクを含む細胞播種システムに関する。この実施形態では、濃縮器マスクの複数の漏斗は、マルチウェルプレートの複数のウェルに適合するように構成される。

本技術の細胞播種システムは、フレーム表面とフレーム表面から延びるフレーム側面とを有するフレームと、各ウェルが開放端、開放端の反対側の閉鎖端、および開放端と閉鎖端との間の少なくとも１つの壁を有する、複数のウェルであって、各ウェルの開放端は、フレーム表面によって取り囲まれ、閉鎖端は、壁の間にあり、壁に接触するウェル表面を含む、複数のウェルと、各ウェルの閉鎖端のウェル表面上に少なくとも１つの連続リングと、を含むマルチウェルプレートを含む。

細胞播種システムはまた、フレーム表面とフレーム表面から延びるフレーム側面とを有するフレームと、フレーム表面から延びる複数の漏斗であって、各漏斗は、第１の開放端および第２の開放端を有する、複数の漏斗と、を含む濃縮器マスクを含み、第１の開放端はフレーム表面に接続されており、第２の開放端よりも大きな直径を有する。

本技術の細胞播種システムでは、濃縮器マスクの複数の漏斗は、漏斗の第２の開放端が各ウェルの閉鎖端のウェル表面上の連続リングと接触するように、マルチウェルプレートの複数のウェルに適合するように構成される。いくつかの実施形態では、遠位端の底部分は、連続リングの上部に接触する。いくつかの実施形態では、遠位端の側面部分は、連続リングの側面部分と接触する。

図３は、ウェルの閉鎖端のウェル表面上に連続リングを含むウェルを有するマルチウェルプレートに挿入された濃縮器マスクを含む、細胞播種システムの断面概略図である。この実施形態では、細胞播種システム３０１は、濃縮器マスク２０１の漏斗がマルチウェルプレート１０１のウェルに挿入されるように、一緒に適合するように構成された濃縮器マスク２０１およびマルチウェルプレート１０１によって形成される。細胞播種システム３０１は、マルチウェルフレーム表面１０２、マルチウェルフレーム側面１０３、およびマルチウェルフレームベース１０４を備える。この実施形態では、マルチウェルフレームは、プレート処理のためのマルチウェルフレームタブ１０５も含む。マルチウェルプレートは、ウェルを画定するウェル壁１０６（見えない）と、この実施形態では、周囲ウェルプレートモート１１１とを備える。マルチウェルプレートウェルはまた、連続リング１０９を含む開放端（見えない）および閉鎖端１０８を含む。連続リング１０９は、閉鎖ウェル端１０８の中央部分上に細胞播種領域１１０を形成する。

細胞播種システム３０１の濃縮器マスク２０１は、フレーム表面２０２およびフレーム側面２０３を備える。濃縮器マスクはまた、複数の漏斗２０５を含む。漏斗は、第１の開放端２０６および第２の開放端２０７を含む。濃縮器マスク２０１は、漏斗の第２の開放端２０７がマルチウェルプレート１０１のウェルに挿入されるように構成される。この実施形態では、漏斗の第２の開放端２０７は、ウェルの閉鎖端１０８のウェル表面上の連続リング１０９に接触するように構成される。いくつかの実施形態では、第２の開放端２０７は、遠位部分２０８を含む。いくつかの実施形態では、第２の開放端２０７と連続リング１０９との間の界面は、液密シールを作成する。特定の実施形態では、第２の開放端２０７と連続リング１０９との間の界面は、液密シールを形成しない。細胞播種システムはまた、プレート処理のためのマルチウェルプレートフレームタブ１０５を含む。細胞播種システムはまた、濃縮器マスク２０１をマルチウェルプレート１０１に整列および挿入するための濃縮器マスクフレームタブ２０４を含む。

本技術はまた、マルチウェルプレートのウェルの中心に細胞を播種するために細胞播種システム３０１を使用する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞を含む液体培地を細胞播種システムの第１の開放漏斗端２０６に添加することを含み、その結果、細胞は、ウェルの閉鎖端１０８のウェル表面上の少なくとも１つの連続リング１０９によって画定される細胞播種領域１１０に沈着される。いくつかの実施形態では、播種された細胞播種システム３０１は、細胞増殖のためにインキュベータに移され得る。特定の実施形態では、濃縮器マスク２０１は、マルチウェルプレート１０１から除去することができる。他の実施形態では、濃縮器マスク２０１は、細胞播種システム３０１のマルチウェルプレート２０１に挿入されたままであり得る。いくつかの実施形態では、濃縮器マスク２０１は、培養の前にマルチウェルプレート１０１から除去される。他の実施形態では、濃縮器マスク２０１は、細胞が増殖のために培養されている間、マルチウェルプレート１０１に挿入されたままであり得る。いくつかの実施形態では、濃縮器マスク２０１は、細胞の分析の前にマルチウェルプレート１０１から除去することができる。他の実施形態では、濃縮器マスク２０１は、細胞の分析中にマルチウェルプレート１０１に留まることができる。いくつかの実施形態では、細胞の分析は、光学的読み取りを含む。

本技術は、６、１２、２４、４８、９６、３８４、および１５３６ウェルフォーマットに関しており、互換性がある。図４は、本技術の９６ウェルプレートの概略図であり、ウェルの内側底面上に連続リングを含むウェルを有する。この実施形態では、マルチウェルプレート４０１は、フレーム表面１０２、フレーム側面１０３、およびフレームベース１０４を有するフレームによって画定される。マルチウェルプレート４０１は、ウェル壁１０６、開放端１０７、および閉鎖端１０８（見えない）も含む。ウェルの閉鎖端１０８は、細胞播種領域１１０を画定する連続リング１０９をさらに含む。この実施形態では、マルチウェルプレート４０１は、プレート処理のための周囲ウェルプレートモートまたはフレームタブを含まないが、他の実施形態では、本技術のマルチウェルプレートは、処理のための周囲ウェルプレートモートおよびフレームタブを含む。

〔代謝測定〕
いくつかの実施形態では、本方法、装置、およびシステムは、マイクロ呼吸測定の領域などで細胞生物学を測定するのに有用であり、これには、動物全体で行われる呼吸測定とは対照的に、少数の細胞の生体エネルギー状態または代謝状態を定量的に測定することが含まれる。過去には、マイクロ呼吸測定は、細胞代謝を測定するためにミリリットルの細胞培養とクラーク電極を利用した顕微鏡ガラスフローセルを使用して実行されていた。この手法は、微視的、容易、または高スループットではない。Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅのフラックスアナライザとアッセイは、８、２４、９６のプラスチック細胞培養プレートで簡単に実行できる包括的なアッセイを導入することにより、マイクロ呼吸測定の技術を向上させた。結果として得られた技術は、様々な刺激剤、阻害剤、カスタムドラッグを導入し、酸素消費量とプロトン生成量の変化を測定することにより、解糖経路と酸化的リン酸化経路の両方の複雑な特性評価を可能にした。マイクロ呼吸測定に関する追加の詳細は、米国特許出願第１５／８９６，２５５号に提供されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

本発明の別の態様として、本方法、装置、およびシステムは、培養中の個々の細胞型の代謝測定に使用される。いくつかの実施形態では、本方法、装置、およびシステムは、非接触共培養における細胞の分析に使用することができる。システムは、本明細書に記載されるようなマルチウェルプレートを含むことができる。例えば、本明細書に記載のマルチウェルプレートは、連続リングによって囲まれた細胞播種領域の内側に第１の細胞型を配置し、連続リングとウェル壁の間、連続リングの外側に第２の細胞型を配置することによって、非接触共培養を維持するために使用することができる。いくつかの実施形態では、非接触共培養における異なる細胞型は、互いに流体連通している。他の実施形態では、非接触共培養の異なる細胞タイプは、互いに流体連通していない。

本発明の追加の態様は、任意の形状の複数の連続リングを含み、連続リングは、異なる細胞を異なる細胞播種領域／セグメントに播種することにより、非接触共培養の調製および維持のための任意のサイズ、形状または構成の多数の細胞播種領域またはセグメントを提供する。さらに、本技術の特定の態様は、リングではないが、細胞播種領域のグリッドまたは代替構成を提供するように構成される、ウェル表面上の成形された物理的障壁を含む。本技術の非接触共培養が、異なる細胞型を異なる細胞播種領域に播種することによって生成される場合、本方法、装置、およびシステムを使用して、所与の時間で１つの細胞播種領域／セグメントから独立して代謝測定値を取得することができる。あるいは、本方法の装置およびシステムを使用して、所与の時間に２つ以上、またはすべての細胞播種領域／セグメントから代謝測定値を取得することができる。非接触共培養に関する追加の詳細は、米国特許出願第１５／８９６，２５５号に提供されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

本方法、装置およびシステムでは、１つまたは複数のセンサを使用して、細胞集団の生理学的特性を測定することができる。センサは、蛍光センサ、発光センサ、ＩＳＦＥＴセンサ、表面プラズモン共鳴センサ、光回折原理に基づくセンサ、ウッドの異常原理に基づくセンサ、音響センサ、またはマイクロ波センサであり得る。本技術は、特定の細胞アッセイ、測定またはセンサに限定されず、代わりに、任意の所望の細胞分析アプローチと組み合わせて当業者によって使用され得る。したがって、本システム、装置、および方法は、本明細書に記載のウェル内のサンプルの１つまたは複数の特性を測定するように配置された前述のセンサの１つまたは複数を含むことができる。

本方法、装置およびシステムは、細胞培養および分析に関する様々な分野で使用することができる。このような分野には、生物学的研究、創薬、および臨床診断が含まれるが、これらに限定されない。例えば、創薬ツールとして、このデバイスを使用して、共培養、タンパク質分泌、または細胞内／細胞外イオン交換における細胞代謝への影響について、様々な分子をスクリーニングすることができる。本方法、装置およびシステムはまた、従来のアッセイが実施される前および後の両方で、共培養を含む培養中の細胞の健全性を決定するために使用され得、それによりそのようなアッセイの性能を改善する。

〔細胞集団〕
本方法および装置で使用される細胞集団は、任意の目的の細胞を含み得る。そのような細胞には、細菌、真菌、酵母、原核細胞、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、および／または不死化細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞の少なくとも一部は、血管の表面に付着していてもよい。細胞の少なくとも一部を培地に懸濁させることができる。細胞の少なくとも一部は、生体組織、オルガノイド、スフェロイド、または培養組織を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞の少なくとも一部は、ウェルの閉鎖端または壁に接着している。

既知の細胞株は、本方法、装置、およびシステムにおける細胞型として使用することができる。例えば、本技術と組み合わせて使用できる既知の細胞株には、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ、ＨｅＬａ－Ｓ３、Ｈｕｈｌ、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃｌ、ＰＣ－３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ－２、ＣＩＲ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３スイス、３Ｔ３－Ｌ１、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－１細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯＤｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ－Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａｌｃｌｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯｌ、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ １－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－１ＯＡ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ６、ＭＴＤ－１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ、およびそれらのトランスジェニック品種が含まれるがこれに限定されない。細胞株は、当業者に既知の様々な供給源から入手可能である（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナッサス）を参照のこと）。これらまたは他の細胞株は、本方法および装置では、第１の細胞型または第２の細胞型として用いることができる。いくつかの実施形態では、第１の細胞型は、対象（ヒト患者など）から採取された細胞集団にあり、第２の細胞型は、既知の細胞株である。

〔例示的な実施形態〕
１．液体培地中の細胞集団用のマルチウェルプレートであって、
フレーム表面およびフレーム表面から延びるフレーム側面を有するフレームと、
各ウェルが開放端、開放端の反対側の閉鎖端、および開放端と閉鎖端との間の少なくとも１つの壁を有する、複数のウェルであって、各ウェルの開放端は、フレーム表面によって取り囲まれ、閉鎖端は、少なくとも１つの壁の間にあり、少なくとも１つの壁に接触するウェル表面を含む、複数のウェルと、
１つまたは複数のウェルの閉鎖端のウェル表面上の少なくとも１つの連続リングと、を含む、マルチウェルプレート。
２．少なくとも１つの連続リングが、ウェル表面上に少なくとも１つの細胞播種領域を画定するように構成され、これは、蓋、プランジャ、または別の要素と協働してアッセイマイクロチャンバを形成することができる、実施形態１のマルチウェルプレート。
３．マルチウェルプレートが、複数の細胞播種領域を画定するように構成された複数の連続リングを含む、実施形態１のマルチウェルプレート。
４．少なくとも１つの連続リングが、約０．０１ｍｍから約２ｍｍの高さを有する、前述の実施形態のいずれかのマルチウェルプレート。
５．少なくとも１つの連続リングが、約０．５ｍｍから約６．０ｍｍの内径、例えば、約２．０ｍｍの内径を有する、前述の実施形態のいずれかのマルチウェルプレート。
６．液体培地中の細胞をマルチウェルプレートに播種するための濃縮器マスクであって、
フレーム表面およびフレーム表面から延びるフレーム側面を有するフレームと、
フレーム表面から延びる複数の漏斗であって、各漏斗が、第１の開放端および第２の開放端を有する、漏斗と、を含み、
第１の開放端がフレーム表面に接続されており、第２の開放端よりも大きな直径を有する、濃縮器マスク。
７．第２の開放端が、遠位エラストマー部分を含む、実施形態６の濃縮器マスク。
８．濃縮器マスクが、少なくとも８個の漏斗を含む、実施形態６または７の濃縮器マスク。
９．漏斗が、約０．５ｍｍから約６．０ｍｍの内径、例えば、約２．０ｍｍの内径を有する、実施形態６から８の濃縮器マスク。
１０．培養ウェルの中央部分に細胞を播種する方法であって、
実施形態１から５のいずれかのウェル表面上の少なくとも１つの細胞播種領域に細胞を含む液体培地を添加することを含む、方法。
１１．培養ウェルをインキュベータに移し、細胞を播種した後に培養する、実施形態１０の方法。
１２．培養された細胞が、インキュベータによって誘発されたエッジ効果を実質的に含まないか、または全く示さない、実施形態１１の方法。
１３．マルチウェルプレートと濃縮器マスクを含む、細胞播種システムであって、
マルチウェルプレートが、フレーム表面とフレーム表面から延びるフレーム側面とを有するフレームと、各ウェルが開放端、開放端の反対側の閉鎖端、および開放端と閉鎖端との間の少なくとも１つの壁を有する、複数のウェルであって、各ウェルの開放端が、フレーム表面によって取り囲まれ、閉鎖端が、壁の間にあり、壁に接触するウェル表面を含む、複数のウェルと、各ウェルの閉鎖端のウェル表面上に少なくとも１つの連続リングと、を含み、
濃縮器マスクが、フレーム表面とフレーム表面から延びるフレーム側面とを有するフレームと、フレーム表面から延びる複数の漏斗であって、各漏斗が、第１の開放端および第２の開放端を有し、第１の開放端がフレーム表面に接続されており、第２の開放端よりも大きな直径を有する、漏斗を含み、
複数の漏斗が、複数のウェルに適合するように構成され、その結果、漏斗の第２の開放端が、１つまたは複数のウェルの閉鎖端のウェル表面上の連続リングとの界面を形成する、細胞播種システム。
１４．第２の開放端と連続リングとの間の界面が、液体の拡散を低減するのに十分に小さいギャップである、実施形態１３のシステム。
１５．第２の開放端が、遠位エラストマー部分を含む、実施形態１３のシステム。
１６．界面が、第２の開放端の遠位エラストマー部分と連続リングとの間の物理的接触であり、それによって液密シールを形成する、実施形態１５のシステム。
１７．マルチウェルプレートに細胞を播種する方法であって、
細胞を含む液体培地を、実施形態１３の細胞播種システムの第１の開放端に添加することを含み、細胞が、ウェル表面上の少なくとも１つの連続リングによって囲まれた領域に沈着する、方法。
１８．細胞を播種した後、マルチウェルプレートをインキュベータに移す、実施形態１７の方法。培養された細胞は、インキュベータによって誘発されたエッジ効果を全く示さないか、または実質的に含まないと考えられる。
１９．マルチウェルプレートをインキュベータに配置する前に、濃縮器マスクをマルチウェルプレートから除去する、実施形態１８の方法。
２０．光学的測定値を得るためにマルチウェルプレート内の細胞を分析することをさらに含む、実施形態１７の方法。

〔例１〕
細胞を、連続リングを含む本技術のマルチウェルプレートに播種、増殖、分析した。これらの細胞を、連続リングを含まない標準ウェルを含むマルチウェルプレートに播種、増殖、分析した対照細胞と比較した。試験した連続リングの壁の高さは０．２ｍｍ、内径は２．０ｍｍであった。同じ数の細胞（４，５００）を両方のウェルタイプで分析した。

細胞を播種して増殖させた後、Ａｇｉｌｅｎｔ ＸＦｐ機器を使用して酸素消費速度（ＯＣＲ）を測定した。速度は、光学的測定値を得ることによって測定した。結果は、同じ数の細胞（４，５００）が、連続リングを含まない標準ウェルで培養された細胞と比較して、連続リングを含むウェルで培養された場合に３倍高いシグナル強度を生成したことを示した。

本開示を考慮して、方法および装置は、本教示に沿って実施することができることに留意されたい。さらに、様々な構成要素、材料、構造、およびパラメータは、例示および例としてのみ含まれており、限定的な意味では含まれていない。本開示を考慮して、本教示は、他の用途に実施することができ、これらの用途を実施するための構成要素、材料、構造、および機材は、添付の特許請求の範囲内に留まりながら決定することができる。

Claims (20)

1. 液体培地中の細胞集団用のマルチウェルプレートであって、
   フレーム表面および前記フレーム表面から延びるフレーム側面を有するフレームと、
   各ウェルが開放端、前記開放端の反対側の閉鎖端、および前記開放端と前記閉鎖端との間の少なくとも１つの壁を有する、複数のウェルであって、前記各ウェルの前記開放端は、前記フレーム表面によって取り囲まれ、前記閉鎖端は、前記少なくとも１つの壁の間にあり、前記少なくとも１つの壁に接触するウェル表面を含む、複数のウェルと、
   １つまたは複数の前記ウェルの前記閉鎖端の前記ウェル表面上の少なくとも１つの連続リングと、を含む、マルチウェルプレート。
2. 前記少なくとも１つの連続リングが、前記ウェル表面上に少なくとも１つの細胞播種領域を画定するように構成される、請求項１に記載のマルチウェルプレート。
3. 前記マルチウェルプレートが、複数の細胞播種領域を画定するように構成された複数の連続リングを含む、請求項１に記載のマルチウェルプレート。
4. 前記少なくとも１つの連続リングが、約０．０１ｍｍから約２ｍｍの高さを有する、請求項１に記載のマルチウェルプレート。
5. 前記少なくとも１つの連続リングが、約０．５ｍｍから約６．０ｍｍの内径を有する、請求項１に記載のマルチウェルプレート。
6. 液体培地中の細胞をマルチウェルプレートに播種するための濃縮器マスクであって、
   フレーム表面および前記フレーム表面から延びるフレーム側面を有するフレームと、
   前記フレーム表面から延びる少なくとも１つの漏斗であって、第１の開放端および第２の開放端を含む、少なくとも１つの漏斗と、を含み、
   前記第１の開放端が前記フレーム表面に接続されており、前記第２の開放端よりも大きな直径を有する、濃縮器マスク。
7. 前記第２の開放端が、遠位エラストマー部分を含む、請求項６に記載の濃縮器マスク。
8. 前記濃縮器マスクが、少なくとも８個の漏斗を含む、請求項６に記載の濃縮器マスク。
9. 前記漏斗が、約０．５ｍｍから約６．０ｍｍの内径を有する、請求項６に記載の濃縮器マスク。
10. 培養ウェルの中央部分に細胞を播種する方法であって、
    請求項２の前記ウェル表面上の前記少なくとも１つの細胞播種領域に細胞を含む液体培地を添加することを含む、方法。
11. 細胞を播種した後、前記培養ウェルを培養することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記培養された細胞が、インキュベータによって誘発されたエッジ効果を実質的に含まない、請求項１１に記載の方法。
13. マルチウェルプレートと濃縮器マスクとを含む、細胞播種システムであって、
    前記マルチウェルプレートが、フレーム表面と前記フレーム表面から延びるフレーム側面とを有するフレームと、各ウェルが、開放端、前記開放端の反対側の閉鎖端、および、前記開放端と前記閉鎖端との間に少なくとも１つの壁を有する、複数のウェルであって、前記各ウェルの前記開放端が、前記フレーム表面によって取り囲まれ、前記閉鎖端が、前記壁の間にあり、前記壁に接触するウェル表面を含む、複数のウェルと、前記各ウェルの前記閉鎖端の前記ウェル表面上に少なくとも１つの連続リングと、を含み、
    前記濃縮器マスクが、フレーム表面と前記フレーム表面から延びるフレーム側面とを有するフレームと、前記フレーム表面から延びる少なくとも１つの漏斗と、を含み、前記少なくとも１つの漏斗が、第１の開放端および第２の開放端を有し、前記第１の開放端が前記フレーム表面に接続されており、前記第２の開放端よりも大きな直径を有し、
    前記少なくとも１つの漏斗が、前記複数のウェルのうちの少なくとも１つに適合するように構成され、その結果、前記漏斗の前記第２の開放端が、１つまたは複数の前記ウェルの前記閉鎖端の前記ウェル表面上の前記連続リングとの界面を形成する、細胞播種システム。
14. 前記第２の開放端と前記連続リングとの間の前記界面が、液体の拡散を低減するのに十分なギャップである、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記第２の開放端が、遠位エラストマー部分を含む、請求項１３に記載のシステム。
16. 前記第２の開放端の前記遠位エラストマー部分と前記連続リングとの間の前記界面が液密シールを形成する、請求項１５に記載のシステム。
17. マルチウェルプレートに細胞を播種する方法であって、
    細胞を含む液体培地を、請求項１３に記載の前記細胞播種システムの前記第１の開放端に添加することを含み、前記細胞が、前記ウェル表面上の前記少なくとも１つの連続リングによって囲まれた領域に沈着する、方法。
18. 細胞を播種した後、前記マルチウェルプレートをインキュベータに移す、請求項１７に記載の方法。
19. 前記マルチウェルプレートを前記インキュベータに移す前に、前記濃縮器マスクを前記マルチウェルプレートから除去する、請求項１８に記載の方法。
20. 光学的測定値を得るために前記マルチウェルプレート内の前記細胞を分析することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。

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