JP2023181377A - Immunostimulator - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、免疫賦活剤等に関する。 The present invention relates to immunostimulants and the like.
近年、免疫学の医療応用が益々進んでおり、ワクチン、免疫療法等の開発が進んでいる。医療応用する際には、免疫賦活剤が使用されることがある。例えば、免疫賦活剤により、抗原による免疫効果を高めることが可能である。 In recent years, the medical application of immunology has progressed more and more, and the development of vaccines, immunotherapy, etc. is progressing. In medical applications, immunostimulants are sometimes used. For example, it is possible to enhance the immunological effect of an antigen by using an immunostimulant.
免疫賦活剤としては、水酸化アルミニウム等のアルミニウム塩に代表される抗体誘導に優れたもの、CpG核酸に代表される細胞性免疫誘導に優れたものがある。アルミニウム塩
は実際のワクチンに使用されているが、細胞性免疫誘導は出来ない。一方、CpG核酸は実
験的には細胞性免疫誘導できるが、少ない抗原量で効率良く細胞性免疫を誘導できるわけではない。より効果的なワクチンの開発には細胞性免疫の誘導も視野に入れた最適化が重要である。
As immunostimulants, there are those that are excellent in inducing antibodies, such as aluminum salts such as aluminum hydroxide, and those that are excellent in inducing cellular immunity, such as CpG nucleic acids. Aluminum salts are used in actual vaccines, but they cannot induce cellular immunity. On the other hand, although CpG nucleic acids can induce cellular immunity experimentally, they cannot efficiently induce cellular immunity with a small amount of antigen. Optimization that also takes into account the induction of cell-mediated immunity is important for the development of more effective vaccines.
特許文献１には、カチオン性脂質を免疫賦活剤として利用することが開示されている。しかし、特許文献１においては、細胞性免疫の誘導も視野に入れた最適化が不十分である。 Patent Document 1 discloses the use of cationic lipids as immunostimulants. However, in Patent Document 1, optimization taking into consideration the induction of cellular immunity is insufficient.
本発明は、細胞性免疫の誘導作用（特に、CD8T細胞誘導作用及び／又はCD4T細胞誘導作用）がより高い免疫賦活剤を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an immunostimulant that has a higher cell-mediated immunity inducing effect (especially CD8T cell inducing effect and/or CD4T cell inducing effect).
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、（A）カチオン性脂質含有脂質粒
子a、並びにCpGオリゴデオキシヌクレオチド及びアルミニウム塩からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、又は（B）粒径100nm未満のカチオン性脂質含有脂質粒子bを含有する、免疫賦活剤、であれば、上記課題を解決できることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
As a result of intensive research in view of the above problems, the present inventors have found that (A) cationic lipid-containing lipid particles a, containing at least one selected from the group consisting of CpG oligodeoxynucleotides and aluminum salts, or It has been found that (B) an immunostimulant containing cationic lipid-containing lipid particles b with a particle size of less than 100 nm can solve the above problems. As a result of further research based on this knowledge, the present invention was completed.
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。 That is, the present invention includes the following aspects.
項１． （A）カチオン性脂質含有脂質粒子a、並びにCpGオリゴデオキシヌクレオチド
及びアルミニウム塩からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、又は
（B）粒径100nm未満のカチオン性脂質含有脂質粒子bを含有する、
免疫賦活剤。
Item 1. (A) containing cationic lipid-containing lipid particles a and at least one selected from the group consisting of CpG oligodeoxynucleotides and aluminum salts; or (B) cationic lipid-containing lipid particles b having a particle size of less than 100 nm. contains,
Immune stimulant.
項２． 前記カチオン性脂質含有脂質粒子aがナノサイズである、項１に記載の免疫賦
活剤。
Item 2. Item 2. The immunostimulant according to item 1, wherein the cationic lipid-containing lipid particles a are nanosized.
項３． 前記カチオン性脂質含有脂質粒子bの粒径が15～80nmである、項１又は２に記
載の免疫賦活剤。
Item 3. Item 3. The immunostimulant according to item 1 or 2, wherein the cationic lipid-containing lipid particles b have a particle size of 15 to 80 nm.
項４． 前記カチオン性脂質が1,2－ジオレオイルオキシ－3－トリメチルアンモニウム－プロパン（DOTAP）、ジオレオイルジメチルアミノプロパン（DODAP）、N－1－（2,3－
ジオレオイルオキシ）プロピル－N,N,N－トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）からなる群より選択される少なくとも1種である、項１～３のいずれかに記載の免疫賦活剤。
Item 4. The cationic lipid is 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propane (DOTAP), dioleoyldimethylaminopropane (DODAP), N-1-(2,3-
Any one of Items 1 to 3, which is at least one member selected from the group consisting of dioleoyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB). The immunostimulant described.
項５． 前記カチオン性脂質の含有量が、前記脂質粒子を構成する脂質100質量％に対
して80質量％以上である、項１～４のいずれかに記載の免疫賦活剤。
Item 5. Item 5. The immunostimulant according to any one of Items 1 to 4, wherein the content of the cationic lipid is 80% by mass or more based on 100% by mass of the lipid constituting the lipid particle.
項６． 前記カチオン性脂質の含有量が、前記脂質粒子を構成する脂質100質量％に対
して95質量％以上である、項１～５のいずれかに記載の免疫賦活剤。
Item 6. Item 6. The immunostimulant according to any one of Items 1 to 5, wherein the content of the cationic lipid is 95% by mass or more based on 100% by mass of the lipid constituting the lipid particles.
項７． 前記カチオン性脂質含有脂質粒子a、前記CpGオリゴデオキシヌクレオチド、及び前記アルミニウム塩を含有する、項１～６のいずれかに記載の免疫賦活剤。 Section 7. Item 7. The immunostimulant according to any one of Items 1 to 6, comprising the cationic lipid-containing lipid particle a, the CpG oligodeoxynucleotide, and the aluminum salt.
項８． 前記CpGオリゴデオキシヌクレオチドがAタイプCpGオリゴデオキシヌクレオチ
ドである、項７に記載の免疫賦活剤。
Section 8. Item 8. The immunostimulant according to Item 7, wherein the CpG oligodeoxynucleotide is an A-type CpG oligodeoxynucleotide.
項９． 項１～８のいずれかに記載の免疫賦活剤を含有する、医薬。 Item 9. Item 9. A medicament containing the immunostimulant according to any one of Items 1 to 8.
項１０． ワクチン組成物である、項９に記載の医薬。 Item 10. Item 10. The medicament according to item 9, which is a vaccine composition.
項１１． さらに抗原を含有する、項９又は１０に記載の医薬。 Item 11. Item 11. The medicament according to Item 9 or 10, further comprising an antigen.
項１２． 抗ウイルス用である、項９～１１のいずれかに記載の医薬。 Item 12. Item 12. The medicament according to any one of Items 9 to 11, which is for antiviral use.
本発明によれば、細胞性免疫の誘導作用がより高い免疫賦活剤を提供することができる。さらに、本発明によれば、細胞性免疫の誘導作用がより高いワクチン組成物等を提供することもできる。 According to the present invention, it is possible to provide an immunostimulant that has a higher effect of inducing cell-mediated immunity. Furthermore, according to the present invention, it is also possible to provide a vaccine composition etc. that have a higher effect of inducing cell-mediated immunity.
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。 In this specification, the expressions "contain" and "including" include the concepts of "containing", "comprising", "consisting essentially" and "consisting only".
本明細書において、「粒径」は、動的光散乱（DLS）法により測定した散乱光強度基準
の平均粒子径である。
In this specification, "particle size" is an average particle size based on scattered light intensity measured by a dynamic light scattering (DLS) method.
1．免疫賦活剤
本発明は、その一態様において、（A）カチオン性脂質含有脂質粒子a、並びにCpGオリ
ゴデオキシヌクレオチド及びアルミニウム塩からなる群より選択される少なくとも1種を
含有する、又は（B）粒径100nm未満のカチオン性脂質含有脂質粒子bを含有する、免疫賦
活剤（本明細書において、「本発明の免疫賦活剤」と示すこともある。）に係る。以下に、これについて説明する。
1. In one embodiment of the present invention, the immunostimulant contains (A) cationic lipid-containing lipid particles a, and at least one selected from the group consisting of CpG oligodeoxynucleotides and aluminum salts, or (B) particles. The present invention relates to an immunostimulant (herein sometimes referred to as "the immunostimulant of the present invention") containing cationic lipid-containing lipid particles b having a diameter of less than 100 nm. This will be explained below.
カチオン性脂質は、生理的pHにおいて正味の正電荷を帯びるか、プロトン化可能な基を有し、pKa未満のpHで正に荷電するような、多数の脂質種のうちいずれかである限り、特
に制限されない。カチオン性脂質としては、例えば次に列挙する脂質が挙げられる。3－
β［４N－（1N,8－ジグアニジノスペルミジン）－カルバモイル］コレステロール（BGSC
）；3－β［N,N－ジグアニジノエチル－アミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（BGTC）；N,N1N2N3テトラ－メチルテトラパルミチルスペルミン（cellfectin）；N－t－ブチル－N’－テトラデシル－3－テトラデシル－アミノプロピオン－アミジン（CLONfectin）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）；1,2－ジミリスチルオキ
シプロピル－3－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）；2,3－ジ
オレオイルオキシ－N－［2（スペルミンカルボキサミド）エチル］－N,N－ジメチル－1－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）（DOSPA）；1,3－ジオレオイルオキシ－2
－（6－カルボキシスペルミル）－プロピルアミド（DOSPER）；4－（2,3－ビス－パルミ
トイルオキシ－プロピル）－1－メチル－1H－イミダゾール（DPIM）；N,N,N’,N’－テトラメチル－N,N’－ビス（2－ヒドロキシエチル）－2,3－ジオレオイルオキシ－1,4－ブタン－ジアンモニウムヨージド）（Tfx－50）；N－1－（2,3－ジオレオイルオキシ）プロピル－N,N,N－トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）または他のN－（N,N－1－ジアル
コキシ）－アルキル－N,N,N－三置換アンモニウム界面活性剤；1,2ジオレオイル－3－（4’－トリメチルアンモニオ）ブタノール－sn－グリセロール（DOBT）またはコレステリル（4’トリメチルアンモニア）ブタノエート（ChOTB）（ここで、トリメチルアンモニウム基は、ブタノールスペーサーアームを介して、二重鎖（DOTBの場合）またはコレステリル基（ChOTBの場合）に連結される）；DORI（DL－1,2－ジオレオイル－3－ジメチルアミノ
プロピル－β－ヒドロキシエチルアンモニウム）またはDORIE（DL－1,2－O－ジオレオイ
ル－3－ジメチルアミノプロピル－β－ヒドロキシエチルアンモニウム）（DORIE）またはその類縁体（たとえば、WO93／03709に開示されているものなど）；1,2－ジオレオイル－3－スクシニル－sn－グリセロールコリンエステル（DOSC）；コレステリルヘミコハク酸
エステル（ChOSC）；リポポリアミン、たとえば、ジオクタデシルアミドリシルスペルミ
ン（DOGS）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（DPPES）
、コレステリル－3β－カルボキシル－アミド－エチレントリメチルアンモニウムヨージ
ド、1－ジメチルアミノ－3－トリメチルアンモニオ－DL－2－プロピル－コレステリルカ
ルボキシレートヨージド、コレステリル－3－O－カルボキシアミドエチレンアミン、コレステリル－3－β－オキシスクシンアミド－エチレントリメチルアンモニウムヨージド、1－ジメチルアミノ－3－トリメチルアンモニオ－DL－2－プロピル－コレステリル－3－β
－オキシスクシネートヨージド、2－（2－トリメチルアンモニオ）－エチルメチルアミノエチル－コレステリル－3－β－オキシスクシネートヨージド、3－β－N－（N’,N’－ジメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール（DC－chol）、3－β－N－（ポリエチレンイミン）－カルバモイルコレステロール；O,O’－ジミリスチル－N－リジルアスパルテート（DMKE）；O,O’－ジミリスチル－N－リジル－グルタメート（DMKD）；1,2－ジミ
リスチルオキシプロピル－3－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）；1,2－ジラウロイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン（DLEPC）；1,2－ジミリストイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン（DMEPC）；1,2－ジオレオイル－sn－
グリセロ－3－エチルホスホコリン（DOEPC）；1,2－ジパルミトイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホコリン（DPEPC）；1,2－ジステアロイル－sn－グリセロ－3－エチルホスホ
コリン（DSEPC）；1,2－ジオレオイル－3－トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）；ジオレオイルジメチルアミノプロパン（DODAP）；1,2－パルミトイル－3－トリメチルア
ンモニウムプロパン（DPTAP）；1,2－ジステアロイル－3－トリメチルアンモニウムプロ
パン（DSTAP）、1,2－ミリストイル－3－トリメチルアンモニウムプロパン（DMTAP）；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、(6Z,9Z,28Z,31Z)－ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31－テトラエン－19－イル 4－(ジメチルアミノ)ブタノエート（D-Lin-MC3-DMA）。さらに、表記
のカチオン性脂質いずれかの構造的な変異体および誘導体も企図される。
Cationic lipids are any of a number of lipid species that carry a net positive charge at physiological pH or have protonatable groups that become positively charged at pH below pKa. There are no particular restrictions. Examples of cationic lipids include the following lipids. 3-
β[4N-(1N,8-diguanidinospermidine)-carbamoyl]cholesterol (BGSC
);3-β[N,N-diguanidinoethyl-aminoethane)-carbamoyl]cholesterol (BGTC);N,N1N2N3tetra-methyltetrapalmitylspermine (cellfectin);Nt-butyl-N'-tetradecyl-3 -Tetradecyl-aminopropion-amidine (CLONfectin); dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB); 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide (DMRIE); 2,3-dioleoyloxy- N-[2(sperminecarboxamide)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate) (DOSPA); 1,3-dioleoyloxy-2
-(6-carboxyspermyl)-propylamide (DOSPER); 4-(2,3-bis-palmitoyloxy-propyl)-1-methyl-1H-imidazole (DPIM); N,N,N',N'-tetramethyl-N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-2,3-dioleoyloxy-1,4-butane-diammonium iodide) (Tfx-50); N-1-(2, 3-Dioleoyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA) or other N-(N,N-1-dialkoxy)-alkyl-N,N,N-trisubstituted ammonium surfactants agent; 1,2 dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio)butanol-sn-glycerol (DOBT) or cholesteryl (4'trimethylammonia) butanoate (ChOTB), where the trimethylammonium group connects the butanol spacer arm. linked to the duplex (in the case of DOTB) or the cholesteryl group (in the case of ChOTB); DORI (DL-1,2-dioleoyl-3-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylammonium) or DORIE ( DL-1,2-O-dioleoyl-3-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylammonium) (DORIE) or analogs thereof (such as those disclosed in WO93/03709); 1,2-dioleoyl- 3-succinyl-sn-glycerol choline ester (DOSC); cholesteryl hemisuccinate ester (ChOSC); lipopolyamines such as dioctadecylamide lysylspermine (DOGS) and dipalmitoylphosphatidylethanolamylspermine (DPPES)
, cholesteryl-3β-carboxyl-amide-ethylenetrimethylammonium iodide, 1-dimethylamino-3-trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesterylcarboxylate iodide, cholesteryl-3-O-carboxyamidoethyleneamine, cholesteryl -3-β-oxysuccinamide-ethylenetrimethylammonium iodide, 1-dimethylamino-3-trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesteryl-3-β
-Oxysuccinate iodide, 2-(2-trimethylammonio)-ethylmethylaminoethyl-cholesteryl-3-β-oxysuccinate iodide, 3-β-N-(N',N'-dimethyl aminoethane) carbamoyl cholesterol (DC-chol), 3-β-N-(polyethyleneimine)-carbamoyl cholesterol; O,O'-dimyristyl-N-lysyl aspartate (DMKE); O,O'-dimyristyl-N- Lysyl-glutamate (DMKD); 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide (DMRIE); 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DLEPC); 1,2 -Dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DMEPC); 1,2-dioleoyl-sn-
Glycero-3-ethylphosphocholine (DOEPC); 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DPEPC); 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) ; 1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniumpropane (DOTAP); dioleoyldimethylaminopropane (DODAP); 1,2-palmitoyl-3-trimethylammoniumpropane (DPTAP); 1,2-distearoyl-3- Trimethylammoniumpropane (DSTAP), 1,2-myristoyl-3-trimethylammoniumpropane (DMTAP); Sodium dodecyl sulfate (SDS), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31 -Tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate (D-Lin-MC3-DMA). Additionally, structural variants and derivatives of any of the mentioned cationic lipids are also contemplated.
カチオン性脂質としては、免疫賦活作用の観点から、好ましくはDOTAP、DODAP、DOTMA
、DDAB等が挙げられ、特に好ましくはDOTAPが挙げられる。
From the viewpoint of immunostimulatory effect, preferred cationic lipids include DOTAP, DODAP, and DOTMA.
, DDAB, etc., and particularly preferably DOTAP.
カチオン性脂質は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The cationic lipids may be used alone or in combination of two or more.
カチオン性脂質含有脂質粒子aは、カチオン性脂質を含有する脂質粒子である限り特に
制限されない。カチオン性脂質含有脂質粒子aの粒径は、特に制限されない。該粒径は、
好ましくはナノサイズであり、具体的には例えば10～700nm、好ましくは10～400nm、より好ましくは10～200nm、さらに好ましくは10～150nmであり、特に好ましくは100nm未満で
ある。本発明においては、カチオン性脂質含有脂質粒子aの内、粒径100nm未満のものを「カチオン性脂質含有脂質粒子b」と示すこともある。また、カチオン性脂質含有脂質粒子a、カチオン性脂質含有脂質粒子bのどちらについても言及する場合、「カチオン性脂質含
有脂質粒子」と示すこともある。カチオン性脂質含有脂質粒子bの粒径は、好ましくは15
～80nm、より好ましくは15～60nmである。
The cationic lipid-containing lipid particles a are not particularly limited as long as they are lipid particles containing cationic lipids. The particle size of the cationic lipid-containing lipid particles a is not particularly limited. The particle size is
Preferably, it is nano-sized, specifically, for example, 10 to 700 nm, preferably 10 to 400 nm, more preferably 10 to 200 nm, even more preferably 10 to 150 nm, and particularly preferably less than 100 nm. In the present invention, among the cationic lipid-containing lipid particles a, those having a particle size of less than 100 nm may be referred to as "cationic lipid-containing lipid particles b." Furthermore, when referring to both cationic lipid-containing lipid particles a and cationic lipid-containing lipid particles b, they may also be referred to as "cationic lipid-containing lipid particles." The particle size of the cationic lipid-containing lipid particles b is preferably 15
~80 nm, more preferably 15-60 nm.
カチオン性脂質含有脂質粒子は、粒子を構成する脂質として、カチオン性脂質以外の他の脂質（リン脂質、糖脂質等の両親媒性脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等）を含有するものであってもよい。ただ、本発明において、免疫賦活作用の観点から、他の脂質の含有量はより少ない方が好ましい。例えば、カチオン性脂質の含有量が、前記脂質粒子を構成する脂質100質量％に対して80質量％以上であることが好ましく、90質量％以
上であることがより好ましく、95質量％以上であることがさらに好ましく、99質量％以上であることがよりさらに好ましく、100質量％であることが特に好ましい。
Cationic lipid-containing lipid particles are particles that contain other lipids other than cationic lipids (amphipathic lipids such as phospholipids and glycolipids, sterols, saturated or unsaturated fatty acids, etc.) as the lipid constituting the particles. It may be. However, in the present invention, from the viewpoint of immunostimulatory effect, it is preferable that the content of other lipids is smaller. For example, the content of cationic lipids is preferably 80% by mass or more, more preferably 90% by mass or more, and more preferably 95% by mass or more based on 100% by mass of the lipids constituting the lipid particles. It is more preferably 99% by mass or more, even more preferably 100% by mass.
他の脂質は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The other lipids may be used alone or in combination of two or more.
カチオン性脂質含有脂質粒子は、脂質以外にも他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば膜安定化剤、荷電物質、抗酸化剤、膜タンパク質、ポリエチレングリコール（PEG）、抗体、ペプチド、糖鎖等が挙げられる。 The cationic lipid-containing lipid particles may contain other components in addition to lipids. Other components include, for example, membrane stabilizers, charged substances, antioxidants, membrane proteins, polyethylene glycol (PEG), antibodies, peptides, sugar chains, and the like.
抗酸化剤は、膜の酸化防止のために含有させることができ、膜の構成成分として必要に応じて使用される。膜の構成成分として使用される抗酸化剤としては、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、トコフェロール、酢酸トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、ビタミンE、アスコルビン酸、L-アスコルビン酸ステアリン酸エステ
ル、パルミチン酸アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エリソルビン酸、クエン酸等が例示される。
An antioxidant can be included to prevent oxidation of the membrane, and is used as a component of the membrane as necessary. Antioxidants used as membrane components include, for example, butylated hydroxytoluene, propyl gallate, tocopherol, tocopherol acetate, concentrated mixed tocopherols, vitamin E, ascorbic acid, L-ascorbic acid stearate, palmitic acid. Examples include ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium sulfite, sodium edetate, erythorbic acid, and citric acid.
膜タンパク質は、膜への機能付加又は膜の構造安定化を目的として含有させることができ、膜構成成分として必要に応じて使用される。膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質、アルブミン、組換えアルブミン等が挙げられる。 Membrane proteins can be included for the purpose of adding functionality to the membrane or stabilizing the structure of the membrane, and are used as membrane constituents as necessary. Examples of membrane proteins include superficial membrane proteins, integral membrane proteins, albumin, and recombinant albumin.
他の成分の含有量は、カチオン性脂質含有脂質粒子100質量％に対して、例えば10％以
下、好ましくは5％以下、より好ましくは2％以下、さらに好ましくは1％以下である。
The content of other components is, for example, 10% or less, preferably 5% or less, more preferably 2% or less, still more preferably 1% or less, based on 100% by mass of the cationic lipid-containing lipid particles.
他の成分は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The other components may be used alone or in combination of two or more.
カチオン性脂質含有脂質粒子は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The cationic lipid-containing lipid particles may be used alone or in combination of two or more types.
カチオン性脂質含有脂質粒子は、通常、水系溶液中で形成されている。水系溶液としては、例えば各種緩衝液が挙げられる。水系溶液のpHは、好ましくは6.8以上、より好まし
くは7.0以上、さらに好ましくは7.2以上である。該pHの上限は、例えば9、8.5、8、7.8、7.6である。
Cationic lipid-containing lipid particles are usually formed in an aqueous solution. Examples of the aqueous solution include various buffer solutions. The pH of the aqueous solution is preferably 6.8 or higher, more preferably 7.0 or higher, and still more preferably 7.2 or higher. The upper limit of the pH is, for example, 9, 8.5, 8, 7.8, 7.6.
カチオン性脂質含有脂質粒子は、脂質粒子の公知の方法に従って又は準じて製造することができる。カチオン性脂質含有脂質粒子は、好適には、脂質（カチオン性脂質含む）を含有するアルコール溶液と、水系溶液とを混合する工程（工程1）を含む方法によって、
製造することができる。
Cationic lipid-containing lipid particles can be produced according to or analogously to known methods for producing lipid particles. The cationic lipid-containing lipid particles are preferably produced by a method including a step (step 1) of mixing an alcoholic solution containing lipids (including cationic lipids) and an aqueous solution.
can be manufactured.
アルコール溶液の溶媒であるアルコールとしては、カチオン性脂質を溶解可能なアルコールである限り特に制限されない。アルコールとしては、エタノールが好ましく挙げられる。 The alcohol used as a solvent for the alcohol solution is not particularly limited as long as it can dissolve cationic lipids. As the alcohol, ethanol is preferably mentioned.
アルコール溶液中の脂質濃度は、例えば0.1～20質量％、好ましくは0.1～10質量％、より好ましくは0.5～3.0質量％である。 The lipid concentration in the alcohol solution is, for example, 0.1 to 20% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight, and more preferably 0.5 to 3.0% by weight.
水系溶液は、通常、溶媒である水の他に、例えば緩衝剤が含まれ得る。水系溶液のpHは、好ましくは6.8以上、より好ましくは7.0以上、さらに好ましくは7.2以上である。該pH
の上限は、例えば9、8.5、8、7.8、7.6である。
An aqueous solution usually includes, for example, a buffer in addition to water, which is a solvent. The pH of the aqueous solution is preferably 6.8 or higher, more preferably 7.0 or higher, and still more preferably 7.2 or higher. The pH
The upper limits of are, for example, 9, 8.5, 8, 7.8, and 7.6.
水系溶液とアルコール溶液との混合比（水系溶液／アルコール溶液、v/v）は、例えば20/1～1/1、好ましくは4/1～2/1である。 The mixing ratio of the aqueous solution and alcoholic solution (aqueous solution/alcoholic solution, v/v) is, for example, 20/1 to 1/1, preferably 4/1 to 2/1.
混合は、脂質粒子が可能な態様である限り特に制限されないが、通常は、ボルテックス等で激しく撹拌する。或いは、マイクロ流路を用いた反応系で行う場合は、反応系内で混合される。 Mixing is not particularly limited as long as the lipid particles are mixed, but is usually vigorously stirred using a vortex or the like. Alternatively, when performing the reaction in a reaction system using a microchannel, they are mixed within the reaction system.
工程1は、通常、室温下又は加温下で実行される。工程1の温度は、例えば15℃～60℃、好ましくは15℃～45℃である。 Step 1 is usually performed at room temperature or under heating. The temperature in step 1 is, for example, 15°C to 60°C, preferably 15°C to 45°C.
本発明の免疫賦活剤は、カチオン性脂質含有脂質粒子に加えて、さらにCpGオリゴデオ
キシヌクレオチドを含有することが好ましい。これにより、免疫賦活作用（特に、CD4T細胞誘導作用）が大きく向上し得る。CpGオリゴデオキシヌクレオチドとしては、特に制限
されず、例えばAタイプ、Bタイプ、Cタイプ、Pタイプ等が挙げられる。これらの中でも、後述のアルミニウム塩を組み合わせた際の免疫賦活作用がより高いという観点から、Aタ
イプが好ましい。
It is preferable that the immunostimulant of the present invention further contains a CpG oligodeoxynucleotide in addition to the cationic lipid-containing lipid particles. This can greatly improve the immunostimulatory effect (particularly the CD4T cell inducing effect). CpG oligodeoxynucleotides are not particularly limited, and include, for example, A type, B type, C type, P type, and the like. Among these, type A is preferred from the viewpoint of higher immunostimulatory effect when combined with an aluminum salt described below.
AタイプCpGオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）は、形質細胞様樹状細胞からのI型IFN
（特に、IFN－α）の産生を誘導する機能を有するODNであり、この限りにおいて特に制限されない。典型的には、AタイプCpG ODNは、中心塩基配列（CG（非メチル化））を中心とした回文配列からなるコア部と、その片側に配置されるGオリゴマー部を含む。コア部の
塩基長は、特に制限されないが、例えば5～30、好ましくは7～20、より好ましくは9～15
、さらに好ましくは10～14である。コア部の塩基配列としては、中心塩基配列（CG）を中心とした回文配列である限り特に制限されない。コア部のヌクレオシド間の結合は、全てホスホジエステル結合である。Gオリゴマーの塩基長は、特に制限されず、例えば2～10である。該塩基長は、好ましくは3～8、より好ましくは5～7、さらに好ましくは6である。Gオリゴマーは、コア部の3´側に配置されることが好ましい。コア部において、上記Gオリゴマーが配置される側の反対側には、他の塩基が存在しなくともよいし、他の塩基部が配置されていてもよい。他の塩基としては、好ましくはGのみからなる塩基／塩基配列が挙
げられる。該塩基／塩基配列の塩基長は、特に制限されず、例えば1～10、好ましくは1～4、より好ましくは2である。コア部以外の部位（Gオリゴマー部、他の塩基部）において
は、末端（3´末端、5´末端）から数個（例えば2～5、好ましくは2～3、より好ましくは2）のヌクレオシドが、隣接するヌクレオシドとホスホロチオエート結合していることが
好ましい。なお、ホスホロチオエート結合以外の結合部分は、通常、ホスホジエステル結
合である。
Type A CpG oligodeoxynucleotides (ODNs) induce type I IFN from plasmacytoid dendritic cells.
(In particular, it is an ODN that has the function of inducing the production of IFN-α), and is not particularly limited as far as this is concerned. Typically, an A-type CpG ODN includes a core region consisting of a palindromic sequence centered on a central base sequence (CG (unmethylated)) and a G oligomer region located on one side of the core region. The base length of the core part is not particularly limited, but for example, 5 to 30 bases, preferably 7 to 20 bases, more preferably 9 to 15 bases.
, more preferably 10 to 14. The base sequence of the core region is not particularly limited as long as it is a palindromic sequence centered on the central base sequence (CG). All bonds between nucleosides in the core are phosphodiester bonds. The base length of the G oligomer is not particularly limited, and is, for example, 2 to 10 bases. The base length is preferably 3 to 8, more preferably 5 to 7, and even more preferably 6. The G oligomer is preferably placed on the 3' side of the core portion. In the core part, on the side opposite to the side where the G oligomer is placed, no other base may be present, or another base part may be placed. Other bases preferably include bases/base sequences consisting only of G. The base length of the base/base sequence is not particularly limited, and is, for example, 1 to 10, preferably 1 to 4, more preferably 2. In sites other than the core part (G oligomer part, other base parts), several (for example, 2 to 5, preferably 2 to 3, more preferably 2) nucleosides from the ends (3' end, 5' end) is preferably phosphorothioate bonded to an adjacent nucleoside. Note that the bonding moiety other than the phosphorothioate bond is usually a phosphodiester bond.
CpGオリゴデオキシヌクレオチドの含有量は、カチオン性脂質含有脂質粒子の構成脂質100質量部に対して、例えば1～100質量部、好ましくは10～100質量部、より好ましくは10
～20質量部である。
The content of CpG oligodeoxynucleotide is, for example, 1 to 100 parts by mass, preferably 10 to 100 parts by mass, more preferably 10 parts by mass, based on 100 parts by mass of the constituent lipids of the cationic lipid-containing lipid particles.
~20 parts by mass.
CpGオリゴデオキシヌクレオチドは、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであ
ってもよい。
One type of CpG oligodeoxynucleotide may be used alone, or a combination of two or more types may be used.
本発明の免疫賦活剤は、カチオン性脂質含有脂質粒子に加えて、さらにアルミニウム塩を含有することが好ましい。これにより、特にCpGオリゴデオキシヌクレオチドも組み合
わされている場合に、免疫賦活作用（特に、CD4T細胞誘導作用）が大きく向上し得る。アルミニウム塩としては、アジュバントとして使用されているものである限り特に制限されず、例えば水酸化アルミニウム、リン酸化アルミニウム等が挙げられる。
It is preferable that the immunostimulant of the present invention further contains an aluminum salt in addition to the cationic lipid-containing lipid particles. This can greatly improve the immunostimulatory effect (particularly the CD4T cell inducing effect), especially when CpG oligodeoxynucleotides are also combined. The aluminum salt is not particularly limited as long as it is used as an adjuvant, and examples thereof include aluminum hydroxide, aluminum phosphate, and the like.
アルミニウム塩の含有量は、カチオン性脂質含有脂質粒子の構成脂質100質量部に対し
て、例えば10～100質量部、好ましくは20～100質量部、より好ましくは40～100質量部で
ある。
The content of the aluminum salt is, for example, 10 to 100 parts by mass, preferably 20 to 100 parts by mass, and more preferably 40 to 100 parts by mass, based on 100 parts by mass of the constituent lipids of the cationic lipid-containing lipid particles.
アルミニウム塩は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The aluminum salts may be used alone or in combination of two or more.
本発明の免疫賦活剤は、上記した物質以外にも、さらに他の物質を含み得る。 The immunostimulant of the present invention may further contain other substances in addition to the substances described above.
他の物質の含有量は、本発明の免疫賦活剤100質量％に対して、例えば10％以下、好ま
しくは5％以下、より好ましくは2％以下、さらに好ましくは1％以下である。
The content of other substances is, for example, 10% or less, preferably 5% or less, more preferably 2% or less, still more preferably 1% or less, based on 100% by mass of the immunostimulant of the present invention.
他の成分は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。 The other components may be used alone or in combination of two or more.
本発明の免疫賦活剤は、カチオン性脂質含有脂質粒子をそのまま、或いは該粒子に上記した成分／物質を添加することにより、得ることができる。添加の際には、特段の処理は必要ない。 The immunostimulant of the present invention can be obtained from cationic lipid-containing lipid particles as they are, or by adding the above-mentioned components/substances to the particles. No special treatment is required upon addition.
2．用途
本発明の免疫賦活剤は、細胞性免疫の誘導作用（特に、CD8T細胞誘導作用及び／又はCD4T細胞誘導作用）（例えばIFN－γ誘導作用）をより高く発揮することができる。さらに
は、抗体誘導能をもより高く発揮することも可能である。このため、本発明の免疫賦活剤は、その免疫賦活作用を利用した種々の用途、例えば医薬、試薬等（本明細書において、「本発明の薬剤」と示すこともある。）に、より具体的には、ワクチン組成物、抗ウイルス用薬剤等に利用が可能である。
2. Uses The immunostimulant of the present invention can exhibit a higher cellular immunity inducing effect (particularly CD8T cell inducing effect and/or CD4T cell inducing effect) (eg, IFN-γ inducing effect). Furthermore, it is also possible to exhibit even higher antibody-inducing ability. Therefore, the immunostimulant of the present invention can be used more specifically for various uses utilizing its immunostimulatory action, such as medicines, reagents, etc. (herein sometimes referred to as "drug of the present invention"). Specifically, it can be used in vaccine compositions, antiviral drugs, etc.
本発明の薬剤は、本発明の免疫賦活剤を含有する限りにおいて特に制限されず、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではない。他の成分としては、薬理作用を有する成分のほか、添加剤も含まれる。添加剤としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。 The drug of the present invention is not particularly limited as long as it contains the immunostimulant of the present invention, and may further contain other components as necessary. Other ingredients are not particularly limited as long as they are pharmaceutically acceptable ingredients. Other ingredients include ingredients that have pharmacological effects as well as additives. Examples of additives include bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, humectants, colorants, fragrances, Examples include chelating agents.
本発明の薬剤は、好適には抗原を含有する。抗原は、免疫系を有する哺乳動物に（直接あるいは、たとえばDNAワクチンなどでの発現時に）導入されると、この哺乳動物の免疫
系によって認識され、免疫応答を誘発できるあらゆる作用剤（たとえば、タンパク質、ペ
プチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸またはそれらの組み合わせ）をいう。本明細書で定義する場合、抗原誘発免疫応答は、液性であっても細胞性であってもよいし、両方であってもよい。作用剤は、免疫グロブリン（抗体）またはT細胞抗原受容体（TCR）などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用できるときに、「抗原性」であるとされる。
The agent of the invention preferably contains an antigen. An antigen is any agent (e.g. protein , peptides, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids, nucleic acids, or combinations thereof). As defined herein, an antigen-induced immune response may be humoral, cellular, or both. An agent is said to be "antigenic" when it is capable of specifically interacting with antigen recognition molecules of the immune system, such as immunoglobulins (antibodies) or T cell antigen receptors (TCRs).
いくつかの実施形態では、1種類以上の抗原は、タンパク質に基づく抗原である。他の
実施形態では、1種類以上の抗原は、ペプチドに基づく抗原である。さまざまな実施形態
において、1種類以上の抗原は、がん抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、および病原体抗原
からなる群から選択される。「微生物抗原」とは、本明細書で使用する場合、微生物の抗原であり、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生虫、感染性真菌を含むが、これらに限定されるものではない。微生物抗原は、インタクトな微生物ならびにその天然単離物、断片または誘導体のほか、天然に生じる微生物抗原と同一または類似であり、好ましくは、（天然に生じる微生物抗原が由来する）対応の微生物に特異的な免疫応答を誘導する合成化合物であってもよい。一実施形態では、抗原は、がん抗原である。一実施形態では、抗原は、ウイルス抗原である。もうひとつの実施形態では、抗原は、細菌抗原である。さまざまな実施形態において、抗原は、病原体抗原である。いくつかの実施形態では、病原体抗原は、合成抗原または組換え抗原である。
In some embodiments, the one or more antigens are protein-based antigens. In other embodiments, the one or more antigens are peptide-based antigens. In various embodiments, the one or more antigens are selected from the group consisting of cancer antigens, viral antigens, bacterial antigens, and pathogen antigens. A "microbial antigen" as used herein is an antigen of a microorganism, including, but not limited to, infectious viruses, infectious bacteria, infectious parasites, and infectious fungi. Microbial antigens include intact microorganisms as well as natural isolates, fragments or derivatives thereof, as well as naturally occurring microbial antigens that are identical or similar and preferably specific to the corresponding microorganism (from which the naturally occurring microbial antigen is derived). It may also be a synthetic compound that induces a positive immune response. In one embodiment, the antigen is a cancer antigen. In one embodiment, the antigen is a viral antigen. In another embodiment, the antigen is a bacterial antigen. In various embodiments, the antigen is a pathogen antigen. In some embodiments, the pathogen antigen is a synthetic or recombinant antigen.
抗原としては、好ましくはウイルス抗原が挙げられる。抗原の由来ウイルスとしては、特に制限されないが、例えばインフルエンザウイルス（例えばA型、B型等）、風疹ウイルス、エボラウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、アルボウイルス、RSウイルス、SARSウイルス、肝炎ウイルス（例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス等）、黄熱ウイルス、エイズウイルス、狂犬病ウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、ニパウイルス、リッサウイルス等のエンベロープウイルス（エンベロープを有するウイルス）； アデノウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、ヒトパピローマウイルス、ポリオウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ヒトパルボウイルス、脳心筋炎ウイルス、ライノウイルス等の非エンベロープウイルス（エンベロープを有さないウイルス）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはエンベロープウイルスが挙げられ、より好ましくはインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス等が挙げられる。 Preferably, the antigen includes a viral antigen. The virus from which the antigen is derived is not particularly limited, but includes, for example, influenza virus (e.g. type A, type B, etc.), rubella virus, Ebola virus, coronavirus, measles virus, varicella/shingles virus, herpes simplex virus, mumps virus, Enveloped viruses such as arbovirus, respiratory syncytial virus, SARS virus, hepatitis virus (e.g., hepatitis B virus, hepatitis C virus, etc.), yellow fever virus, AIDS virus, rabies virus, hantavirus, dengue virus, Nipah virus, lyssavirus, etc. non-enveloped viruses (viruses without an envelope) such as adenovirus, norovirus, rotavirus, human papillomavirus, poliovirus, enterovirus, coxsackievirus, human parvovirus, encephalomyocarditis virus, and rhinovirus. It will be done. Among these, envelope viruses are preferred, and influenza viruses, herpes viruses, and the like are more preferred.
本発明の薬剤の使用態様は、特に制限されず、その種類に応じて適切な使用態様を採ることができる。本発明の薬剤は、その用途に応じて、例えばin vitroで使用する（例えば、培養細胞の培地に添加する。）こともできるし、in vivoで使用する（例えば、動物に
投与する。）こともできる。
The mode of use of the drug of the present invention is not particularly limited, and an appropriate mode of use can be adopted depending on the type thereof. Depending on the intended use, the drug of the present invention can be used, for example, in vitro (e.g., added to the culture medium of cultured cells) or in vivo (e.g., administered to animals). You can also do it.
本発明の薬剤の適用対象は特に限定されないが、哺乳動物では、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ等が挙げられる。また、細胞としては、動物細胞等が挙げられる。細胞の種類も特に制限されず、例えば血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。 The subject to which the drug of the present invention can be applied is not particularly limited, but examples of mammals include humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer. Furthermore, examples of cells include animal cells. The type of cells is not particularly limited, and examples include blood cells, hematopoietic stem cells/progenitor cells, gametes (sperm, eggs), fibroblasts, epithelial cells, vascular endothelial cells, nerve cells, hepatocytes, keratinocytes, and muscle cells. , epidermal cells, endocrine cells, ES cells, iPS cells, tissue stem cells, cancer cells, etc.
本発明の薬剤は、任意の剤形、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口製剤形態や、注射用製剤（例えば、点滴注射剤（例えば点滴静注用製剤等）、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤）、外用剤（例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤）、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等の非経口製剤形態を採ることができる。 The drug of the present invention can be in any dosage form, such as tablets (including orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, troches, jelly drops, etc.), pills, granules, fine granules, powders, Oral preparations such as hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, and syrups), and jelly preparations, as well as injectable preparations (e.g. preparations, etc.), intravenous injections, intramuscular injections, subcutaneous injections, intradermal injections), external preparations (e.g. ointments, poultices, lotions), suppository inhalants, eye preparations, eye ointments, drops. Parenteral preparation forms such as nasal preparations, ear drops, and liposome preparations can be adopted.
本発明の薬剤の投与経路としては、所望の効果が得られる限り特に制限されず、経口投与、経管栄養、注腸投与等の経腸投与； 経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与等の非経口投与等が挙げられる。 The route of administration of the drug of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect is obtained, and includes oral administration, tube feeding, enteral administration such as enema administration; intravenous administration, transarterial administration, intramuscular administration; Examples include parenteral administration such as intracardiac administration, subcutaneous administration, intradermal administration, and intraperitoneal administration.
本発明の薬剤中の本発明の免疫賦活剤の含有量は、使用態様、適用対象、適用対象の状態等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100重量％、好ましく
は0.001～50重量％とすることができる。
The content of the immunostimulant of the present invention in the drug of the present invention depends on the mode of use, the subject of application, the condition of the subject, etc., and is not limited to, for example, 0.0001 to 100% by weight, preferably It can be 0.001 to 50% by weight.
本発明の薬剤を動物に投与する場合の投与量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、本発明の免疫賦活剤の重量として、一般に経口投与の場合には一日あたり0.1～1000 mg/kg体重、好ましくは一日あたり0.5～500 mg/kg体重であり、非経口投
与の場合には一日あたり0.01～100 mg/kg体重、好ましくは0.05～50 mg/kg体重である。
上記投与量は、年齢、病態、症状等により適宜増減することもできる。
The dosage when administering the drug of the present invention to animals is not particularly limited as long as it is an effective amount that exhibits the medicinal effect. 0.1 to 1000 mg/kg body weight per day, preferably 0.5 to 500 mg/kg body weight per day, and in the case of parenteral administration 0.01 to 100 mg/kg body weight per day, preferably 0.05 to 50 mg/kg body weight per day. kg weight.
The above dosage can be adjusted as appropriate depending on age, pathological condition, symptoms, etc.
本発明の免疫賦活剤は、医薬及び試薬以外にも、例えば食品添加剤、食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、化粧品などの組成物（本明細書において、「本発明の組成物」と示すこともある。）の成分として、用いることができる。より具体的には、免疫賦活用のこれらの組成物として、用いることができる。 In addition to medicines and reagents, the immunostimulant of the present invention can be used in compositions such as food additives, food compositions (including health foods, health promoters, and nutritional supplements (supplements, etc.)), cosmetics, etc. In the specification, it can be used as a component of the "composition of the present invention". More specifically, these compositions can be used for immunostimulation.
本発明の組成物の形態は、特に限定されず、用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。 The form of the composition of the present invention is not particularly limited, and depending on the application, it can take any form commonly used in each application.
本発明の組成物の形態としては、用途が食品添加剤、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などが挙げられる。 The composition of the present invention may be in the form of a food additive, health promoter, nutritional supplement (supplement, etc.), for example, a tablet (orally disintegrating tablet, chewable tablet, effervescent tablet, troche), etc. , jelly-like drops, etc.), pills, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including suspensions and syrups), and jelly preparations. It will be done.
本発明の組成物の形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳などの飲料、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、乳製品（例えば、粉末状、液状、ゲル状、固形状等）、パン、菓子（例えば、クッキー等）などが挙げられる。 When the composition of the present invention is used as a food composition, liquid, gel or solid foods such as juices, soft drinks, tea, soups, beverages such as soy milk, salad oil, dressings, yogurt, etc. Examples include jelly, pudding, sprinkles, powdered milk for infants, cake mixes, dairy products (eg, powder, liquid, gel, solid, etc.), bread, confectionery (eg, cookies, etc.).
本発明の組成物は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、食品添加剤、食品組成物、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）、化粧品などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。 The composition of the present invention may further contain other components as necessary. Other ingredients are not particularly limited as long as they can be incorporated into food additives, food compositions, health promoters, nutritional supplements (supplements, etc.), cosmetics, etc. For example, bases, carriers, etc. , solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, colorants, fragrances, chelating agents and the like.
その他、本発明の組成物に関しては、本発明の薬剤と同様である。 Other aspects of the composition of the present invention are the same as those for the drug of the present invention.
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be described in detail below based on Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
試験例1．カチオン性脂質含有脂質粒子の免疫賦活作用
カチオン性脂質含有脂質粒子の免疫賦活作用を調べた。具体的には以下のようにして行
った。
Test example 1. Immunostimulatory effect of lipid particles containing cationic lipid The immunostimulatory effect of lipid particles containing cationic lipid was investigated. Specifically, it was performed as follows.
＜試験例1-1．脂質粒子の調製＞
溶質としてDOTAP（Lipoid社）のみを含有（DOTAP濃度1.0質量％）するエタノール溶液
と25mM Sodium Acetate(pH4.0)とを、NanoAssemblr（Precision NanoSystems社製）を用
いて1：3（エタノール溶液：Sodium Acetate、混合比）、15 mL/minで混合してリピッド
ナノ粒子（Lipid nanoparticle:LNP）化し、透析（5%グルコース水溶液）を行い、脂質粒子（DOTAP（037）又はDOTAP-Nano（037））を得た。
<Test example 1-1. Preparation of lipid particles>
An ethanol solution containing only DOTAP (Lipoid) as a solute (DOTAP concentration 1.0% by mass) and 25mM Sodium Acetate (pH 4.0) were mixed at 1:3 (ethanol solution: Sodium Acetate, mixing ratio), mixed at 15 mL/min to form lipid nanoparticles (LNP), and dialyzed (5% glucose aqueous solution) to form lipid particles (DOTAP (037) or DOTAP-Nano (037)). Obtained.
＜試験例1-2．免疫賦活試験＞
脂質粒子（DOTAP-Nano（037）又はDOTAP-Roche）と、抗原としてclassII 応答（CD4T細胞）を誘導するOVA（オボアルブミン）とを10：1（脂質：抗原、質量比）で混合してワクチン組成物を調製した。得られたワクチン組成物を、マウスの皮下（尻尾の付け根）に免疫（1匹あたり、脂質100ug）した。7日後に脾臓細胞を回収し、classI 応答（CD8T細胞）を誘導する257-264ペプチド（Eurofins社製）257-264ペプチド、又はOVAで刺激し、1日後の細胞上清中のIFN-γ量をELISA法で定量した。
<Test example 1-2. Immune activation test>
A vaccine is prepared by mixing lipid particles (DOTAP-Nano (037) or DOTAP-Roche) with OVA (ovalbumin), which induces class II responses (CD4T cells) as an antigen, at a ratio of 10:1 (lipid:antigen, mass ratio). A composition was prepared. Mice were immunized subcutaneously (at the base of the tail) with the obtained vaccine composition (100 ug of lipid per mouse). After 7 days, spleen cells were collected and stimulated with 257-264 peptide (manufactured by Eurofins) 257-264 peptide (manufactured by Eurofins), which induces class I responses (CD8T cells), or OVA, and the amount of IFN-γ in the cell supernatant after 1 day. was quantified by ELISA method.
刺激に257-264ペプチドを使用した場合の結果を図１Ａに示し、刺激にOVAを使用した場合の結果を図１Ｂに示す。カチオン性脂質含有脂質粒子の使用により、IFN-γ量が顕著に上昇した。このことから、カチオン性脂質含有脂質粒子が免疫賦活作用（細胞性免疫誘導作用）を有することが分かった。 The results when the 257-264 peptide was used for stimulation are shown in FIG. 1A, and the results when OVA was used for stimulation are shown in FIG. 1B. The use of cationic lipid-containing lipid particles significantly increased the amount of IFN-γ. From this, it was found that the cationic lipid-containing lipid particles have an immunostimulating effect (cell-mediated immunity inducing effect).
試験例2．免疫賦活作用に対する粒径の影響1
粒径が異なる2種類のカチオン性脂質含有脂質粒子の免疫賦活作用を調べた。具体的に
は以下のようにして行った。
Test example 2. Effect of particle size on immunostimulatory effect 1
The immunostimulatory effects of two types of cationic lipid-containing lipid particles with different particle sizes were investigated. Specifically, it was performed as follows.
＜試験例2-1．脂質粒子の調製1＞
試験例1-1と同一条件で脂質粒子（DOTAP-Nano（041））を得た。
<Test example 2-1. Preparation of lipid particles 1>
Lipid particles (DOTAP-Nano (041)) were obtained under the same conditions as Test Example 1-1.
＜試験例2-2．脂質粒子の調製2＞
DOTAP Liposomal Transfection Reagent（Roche社製）を脂質粒子（DOTAPのみから構成される粒子）を使用した。この脂質粒子は、MES（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid）緩衝液（pH6.3）中で調製されているので、この脂質粒子の緩衝液をDOTAP-Nanoと同じ
緩衝液（PBS）に置換して、使用した（DOTAP-Roche）。
<Test example 2-2. Preparation of lipid particles 2＞
DOTAP Liposomal Transfection Reagent (manufactured by Roche) was used with lipid particles (particles composed only of DOTAP). This lipid particle is prepared in MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) buffer (pH 6.3), so the buffer solution for this lipid particle is the same buffer solution (PBS) as for DOTAP-Nano. It was replaced and used (DOTAP-Roche).
＜試験例2-3．粒径の測定＞
DOTAP-Nano（041）とDOTAP-Rocheの粒径（散乱光強度基準）を動的光散乱（DLS）法に
より測定した。さらに、これらの脂質粒子とモデルワクチン抗原であるOVAとを10：1（脂質：OVA、質量比）で混合した後、同様して動的光散乱（DLS）法により測定した。
<Test example 2-3. Measurement of particle size>
The particle size (based on scattered light intensity) of DOTAP-Nano (041) and DOTAP-Roche was measured using the dynamic light scattering (DLS) method. Furthermore, these lipid particles and OVA, which is a model vaccine antigen, were mixed at a ratio of 10:1 (lipid: OVA, mass ratio), and then similarly measured using the dynamic light scattering (DLS) method.
結果を図２Ａに示す。DOTAP-Nano（041）の粒径は40nmであり、DOTAP-Rocheの粒径は130nmであった。また、OVAとの混合により、粒径が大きく変化した。このことから、脂質粒子と抗原（OVA）とが複合体を形成していると考えられる。 The results are shown in Figure 2A. The particle size of DOTAP-Nano (041) was 40 nm and that of DOTAP-Roche was 130 nm. Furthermore, the particle size changed significantly when mixed with OVA. From this, it is considered that the lipid particles and the antigen (OVA) form a complex.
＜試験例2-4．免疫賦活試験＞
刺激に257-264ペプチド（classI 応答（CD8T細胞）を誘導）のみを使用する以外は、試験例1-2と同様にして行った。
<Test example 2-4. Immune activation test>
The same procedure as Test Example 1-2 was conducted except that only the 257-264 peptide (which induces a class I response (CD8T cells)) was used for stimulation.
結果を図２Ｂに示す。粒径が100nm未満であるDOTAP-Nano（041）の方が顕著に強い免疫賦活作用を有することが分かった。 The results are shown in Figure 2B. It was found that DOTAP-Nano (041), which has a particle size of less than 100 nm, has a significantly stronger immunostimulatory effect.
試験例3．免疫賦活作用に対する粒径の影響2
粒径が異なる3種類のカチオン性脂質含有脂質粒子の免疫賦活作用を調べた。具体的に
は以下のようにして行った。
Test example 3. Effect of particle size on immunostimulatory effect 2
The immunostimulatory effects of three types of cationic lipid-containing lipid particles with different particle sizes were investigated. Specifically, it was performed as follows.
＜試験例3-1．脂質粒子の調製1＞
1：2（エタノール溶液：Sodium Acetate、混合比）、12 mL/min以外は、試験例1-1と同一条件で脂質粒子（DOTAP-Nano（050））を得た。試験例2-3と同様にして粒径を測定した結果、その粒径は50nmであった。
<Test example 3-1. Preparation of lipid particles 1>
Lipid particles (DOTAP-Nano (050)) were obtained under the same conditions as in Test Example 1-1, except for 1:2 (ethanol solution: Sodium Acetate, mixing ratio) and 12 mL/min. As a result of measuring the particle size in the same manner as Test Example 2-3, the particle size was 50 nm.
＜試験例3-2．脂質粒子の調製2＞
1：3（エタノール溶液：Sodium Acetate、混合比）、12 mL/min以外は、試験例1-1と同一条件で脂質粒子（DOTAP-Nano（051））を得た。試験例2-3と同様にして粒径を測定した結果、その粒径は30nmであった。
<Test example 3-2. Preparation of lipid particles 2>
Lipid particles (DOTAP-Nano (051)) were obtained under the same conditions as in Test Example 1-1, except for 1:3 (ethanol solution: Sodium Acetate, mixing ratio) and 12 mL/min. The particle size was measured in the same manner as Test Example 2-3, and the particle size was 30 nm.
＜試験例3-3．脂質粒子の調製3＞
1：4（エタノール溶液：Sodium Acetate、混合比）、12 mL/min以外は、試験例1-1と同一条件で脂質粒子（DOTAP-Nano（052））を得た。試験例2-3と同様にして粒径を測定した結果、その粒径は20nmであった。
<Test example 3-3. Preparation of lipid particles 3>
Lipid particles (DOTAP-Nano (052)) were obtained under the same conditions as in Test Example 1-1, except for 1:4 (ethanol solution: Sodium Acetate, mixing ratio) and 12 mL/min. The particle size was measured in the same manner as Test Example 2-3, and the particle size was 20 nm.
＜試験例3-4．免疫賦活試験＞
刺激に257-264ペプチド（classI 応答（CD8T細胞）を誘導）のみを使用する以外は、試験例1-2と同様にして行った。
<Test example 3-4. Immune activation test>
The same procedure as Test Example 1-2 was conducted except that only the 257-264 peptide (which induces a class I response (CD8T cells)) was used for stimulation.
結果を図３に示す。本試験例の条件では、粒子サイズがより小さくなるにつれて免疫賦活作用が上昇する傾向が見られた。 The results are shown in Figure 3. Under the conditions of this test example, there was a tendency for the immunostimulatory effect to increase as the particle size became smaller.
試験例4．脂質粒子とCpG核酸との組合せ
脂質粒子にCpG核酸を組み合わせた場合の免疫賦活作用を調べた。具体的には以下のよ
うにして行った。
Test example 4. Combination of lipid particles and CpG nucleic acid The immunostimulatory effect of the combination of lipid particles and CpG nucleic acid was investigated. Specifically, it was performed as follows.
脂質粒子（DOTAP-Nano（037））、CpG核酸（A型（D35又はA2216）、B型（K3）、C型（2395）、又はP型（21889））、及び抗原としてOVA（classII 応答（CD4T細胞）を誘導）を10：1：1（脂質：CpG核酸：抗原、質量比）で混合してワクチン組成物を調製した以外は
、試験例1-2と同様にして免疫賦活試験を行った。
lipid particles (DOTAP-Nano (037)), CpG nucleic acids (type A (D35 or A2216), type B (K3), type C (2395), or type P (21889)), and OVA as an antigen (class II response ( The immunostimulation test was conducted in the same manner as in Test Example 1-2, except that the vaccine composition was prepared by mixing 10:1:1 (lipid:CpG nucleic acid:antigen, mass ratio) of inducing CD4T cells). Ta.
結果を図４に示す。脂質粒子にCpG核酸を組み合わせることにより、免疫賦活作用が10
倍以上に高まることが分かった。
The results are shown in Figure 4. By combining CpG nucleic acid with lipid particles, the immunostimulatory effect is increased by 10%.
It was found that the increase was more than doubled.
試験例5．脂質粒子とCpG核酸とアルミニウム塩との組合せ
脂質粒子にCpG核酸を組み合わせ、さらにアルミニウム塩を組合せた場合の免疫賦活作
用を調べた。具体的には以下のようにして行った。
Test example 5. Combination of Lipid Particles, CpG Nucleic Acid, and Aluminum Salt The immunostimulatory effect of a combination of lipid particles, CpG nucleic acid, and aluminum salt was investigated. Specifically, it was performed as follows.
＜試験例5-1．免疫賦活試験1＞
脂質粒子（DOTAP-Nano（037））、CpG核酸（A型（D35））、アルミニウム塩（水酸化アルミニウム）、及び抗原としてOVAを10：1：4：1（脂質：CpG核酸：アルミニウム塩：抗
原、質量比）で混合してワクチン組成物を調製した以外は、試験例1-2と同様にして免疫
賦活試験を行った。
<Test example 5-1. Immune activation test 1>
Lipid particles (DOTAP-Nano (037)), CpG nucleic acid (type A (D35)), aluminum salt (aluminum hydroxide), and OVA as antigen at 10:1:4:1 (lipid: CpG nucleic acid: aluminum salt: An immunostimulation test was conducted in the same manner as in Test Example 1-2, except that a vaccine composition was prepared by mixing the antigens (antigen, mass ratio).
刺激にOVA323-339ペプチド（Eurofins社製、classII 応答（CD4T細胞）を誘導）を使用
した場合の結果を図５Ａに示し、刺激にOVAを使用した場合の結果を図５Ｂに示す。脂質
粒子とCpG核酸との組合せに対してさらにアルミニウム塩を組み合わせることにより、免
疫賦活作用が顕著に高まることが分かった。また、別の試験より、アルミニウム塩を組み合わせる場合においては、免疫賦活作用の観点からA型のCpG核酸が望ましいことも分かった。
The results when OVA323-339 peptide (manufactured by Eurofins, which induces class II response (CD4T cells)) was used for stimulation are shown in FIG. 5A, and the results when OVA was used for stimulation are shown in FIG. 5B. It was found that the immunostimulatory effect was significantly enhanced by further combining an aluminum salt with the combination of lipid particles and CpG nucleic acid. In addition, from another test, it was found that type A CpG nucleic acid is preferable from the viewpoint of immunostimulatory effect when an aluminum salt is used in combination.
＜試験例5-2．免疫賦活試験2（抗体誘導試験）＞
試験例5-1において、免疫から7日後に血清を回収し、OVAに対する抗体価をELISA法で定量した。
<Test example 5-2. Immune activation test 2 (antibody induction test)>
In Test Example 5-1, serum was collected 7 days after immunization, and the antibody titer against OVA was determined by ELISA.
Total IgGの定量結果を図５Ｃに示し、IgG1の定量結果を図５Ｄに示し、IgG2cの定量結果を図５Ｅに示す。脂質粒子とCpG核酸との組合せに対してさらにアルミニウム塩を組み
合わせることにより、免疫賦活作用（抗体誘導能）が顕著に高まることが分かった。
The quantitative results of Total IgG are shown in FIG. 5C, the quantitative results of IgG1 are shown in FIG. 5D, and the quantitative results of IgG2c are shown in FIG. 5E. It was found that by further combining an aluminum salt with the combination of lipid particles and CpG nucleic acid, the immunostimulatory effect (antibody inducing ability) was significantly enhanced.
＜試験例5-3．免疫賦活試験3（アルミニウム塩の種類）＞
アルミニウム塩として水酸化アルミニウム以外にもリン酸化アルミニウムを使用する以外は、試験例5-1と同様にして行った。その結果、いずれのアルミニウム塩を使用した場
合でも、免疫賦活作用は同程度であることが分かった。
<Test example 5-3. Immune activation test 3 (type of aluminum salt)>
Test Example 5-1 was conducted in the same manner as in Test Example 5-1 except that aluminum phosphate was used in addition to aluminum hydroxide as the aluminum salt. As a result, it was found that the immunostimulatory effect was the same no matter which aluminum salt was used.
試験例6．インフルエンザウイルス抗原への応用
アジュバントとして脂質粒子（DOTAP-Nano（037））又は水酸化アルミニウムと、抗原
としてclassII 応答（CD4T細胞）を誘導するインフルエンザウイルススプリットワクチン抗原とを100：0.04（アジュバント：抗原、質量比）で混合してワクチン組成物を調製し
た。得られたワクチン組成物を、マウスの皮下（尻尾の付け根）に免疫（1匹あたり、ア
ジュバント100ug）した。7日後に脾臓細胞を回収し、インフルエンザウイルススプリットワクチン抗原で刺激し、1日後の細胞上清中のIFN-γ量をELISA法で定量した。
Test example 6. Application to influenza virus antigen Lipid particles (DOTAP-Nano (037)) or aluminum hydroxide as an adjuvant and influenza virus split vaccine antigen that induces a class II response (CD4T cells) as an antigen were mixed at 100:0.04 (adjuvant: antigen, A vaccine composition was prepared by mixing the two by weight (mass ratio). Mice were immunized subcutaneously (base of the tail) with the obtained vaccine composition (100 ug of adjuvant per mouse). After 7 days, spleen cells were collected and stimulated with influenza virus split vaccine antigen, and 1 day later, the amount of IFN-γ in the cell supernatant was quantified by ELISA.
また、免疫から7日後に血清を回収し、インフルエンザウイルススプリットワクチン抗
原に対する抗体価（IgG2a）をELISA法で定量した。
In addition, serum was collected 7 days after immunization, and the antibody titer (IgG2a) against the influenza virus split vaccine antigen was quantified by ELISA.
IFN-γ量の測定結果を図６Ａに示し、抗体価の測定結果を図６Ｂに示す。脂質粒子が他のアジュバントに比べて顕著に高い免疫賦活作用を発揮することが示された。 The results of measuring the amount of IFN-γ are shown in FIG. 6A, and the results of measuring the antibody titer are shown in FIG. 6B. It was shown that lipid particles exert a significantly higher immunostimulatory effect than other adjuvants.
試験例7．ヘルペスウイルス抗原への応用
アジュバントとして脂質粒子（DOTAP-Nano（037））、CpG核酸（A型（D35））、又は水酸化アルミニウムと、抗原としてHHV-6Bとを100：10（アジュバント：抗原、質量比）で
混合してワクチン組成物を調製した。得られたワクチン組成物を、マウスの皮下（尻尾の付け根）に免疫（1匹あたり、アジュバント100ug）した。7日後に脾臓細胞を回収し、p43ペプチドで刺激し、1日後の細胞上清中のIFN-γ量をELISA法で定量した。
Test example 7. Application to herpesvirus antigen Lipid particles (DOTAP-Nano (037)), CpG nucleic acid (type A (D35)), or aluminum hydroxide as an adjuvant and HHV-6B as an antigen at a ratio of 100:10 (adjuvant: antigen, A vaccine composition was prepared by mixing the two by weight (mass ratio). Mice were immunized subcutaneously (base of the tail) with the obtained vaccine composition (100 ug of adjuvant per mouse). After 7 days, spleen cells were collected and stimulated with p43 peptide, and 1 day later, the amount of IFN-γ in the cell supernatant was quantified by ELISA.
結果を図７に示す。脂質粒子が他のアジュバントに比べて顕著に高い免疫賦活作用を発揮することが示された。 The results are shown in FIG. It was shown that lipid particles exert a significantly higher immunostimulatory effect than other adjuvants.
Claims (12)
ニウム塩からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、又は
（B）粒径100nm未満のカチオン性脂質含有脂質粒子bを含有する、
免疫賦活剤。 (A) containing cationic lipid-containing lipid particles a and at least one selected from the group consisting of CpG oligodeoxynucleotides and aluminum salts; or (B) cationic lipid-containing lipid particles b having a particle size of less than 100 nm. contains,
Immune stimulant.
疫賦活剤。 The immunostimulant according to claim 1 or 2, wherein the cationic lipid-containing lipid particles b have a particle size of 15 to 80 nm.
ルオキシ）プロピル－N,N,N－トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）からなる群より選択される少なくとも1種
である、請求項１～３のいずれかに記載の免疫賦活剤。 The cationic lipid is 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium-propane (DOTAP), dioleoyldimethylaminopropane (DODAP), N-1-(2,3-dioleoyloxy)propyl- The immunostimulant according to any one of claims 1 to 3, which is at least one selected from the group consisting of N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA) and dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB).
％以上である、請求項１～４のいずれかに記載の免疫賦活剤。 The immunostimulant according to any one of claims 1 to 4, wherein the content of the cationic lipid is 80% by mass or more based on 100% by mass of the lipid constituting the lipid particle.
％以上である、請求項１～５のいずれかに記載の免疫賦活剤。 The immunostimulant according to any one of claims 1 to 5, wherein the content of the cationic lipid is 95% by mass or more based on 100% by mass of the lipid constituting the lipid particle.
請求項７に記載の免疫賦活剤。 the CpG oligodeoxynucleotide is an A-type CpG oligodeoxynucleotide;
The immunostimulant according to claim 7.
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