JP2023180317A - Epitope-selective monoclonal antibody making method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、高親和性を有する特異抗体の作製法に関する。 The present invention relates to a method for producing a specific antibody with high affinity.
特定の抗原決定基だけと結合する抗体の集合体をモノクローナル抗体といい、B細胞とミエローマ細胞を融合して得られるハイブリドーマから獲得できる。従来、B細胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドーマを得る方法として、PEG法、HVJ法、パールチェイン法、レーザー法、立体構造特異的ターゲティング(SST)法、B細胞ターゲティング(BCT)法などが知られている(特許文献1~3を参照)。このうち特許文献1には、2種類の細胞をPEG法、HVJ法等によって融合させることによって株化細胞を得る技術が、特許文献2には、交流と直流を組み合わせたパールチェイン法によってハイブリドーマを得る装置に関する技術が、特許文献3には、膜タンパク質の立体構造を認識する抗体を発現するハイブリドーマの作製方法に関する技術が、それぞれ開示されている。
A collection of antibodies that bind only to specific antigenic determinants is called a monoclonal antibody, which can be obtained from hybridomas obtained by fusing B cells and myeloma cells. Conventionally, known methods to obtain hybridomas by fusing B cells and myeloma cells include the PEG method, HVJ method, pearl chain method, laser method, conformation-specific targeting (SST) method, and B cell targeting (BCT) method. (See
しかしながらこれらの手法(特許文献1および2)は、目的抗体を発現するB細胞とミエローマ細胞との融合だけでなく、目的抗体を発現しないB細胞とミエローマ細胞との融合、B細胞同士の融合、ミエローマ細胞同士の融合等も起こるため、得られるハイブリドーマ中における目的ハイブリドーマの割合は数%程度であり、効率が悪かった。
However, these methods (
この問題を解決する技術として、予め目的のB細胞とミエローマ細胞をビオチン/アビジンにより架橋させておき、電気パルスを施し目的のハイブリドーマを得る方法(次世代ハイブリドーマテクノロジー)が開発されている。当該手法は、抗原のB細胞ターゲティングに基づいて、目的の高親和性・高特異性抗体産生B細胞を選択できる特徴があり、電気パルスを処す際にB細胞とミエローマ細胞を1:1の比率で選択融合を行なうことができる。このため、高効率で目的の高性能モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができる(特許文献4)。 As a technique to solve this problem, a method (next generation hybridoma technology) has been developed in which target B cells and myeloma cells are cross-linked in advance with biotin/avidin, and then electrical pulses are applied to obtain the target hybridoma. This method is characterized by the ability to select the desired high-affinity, high-specificity antibody-producing B cells based on the B cell targeting of the antigen, and the method uses a 1:1 ratio of B cells and myeloma cells during electrical pulse treatment. You can perform selective fusion with . Therefore, a target high-performance monoclonal antibody-producing hybridoma can be obtained with high efficiency (Patent Document 4).
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであって、その目的は迅速診断を可能とする特異抗体を産生するハイブリドーマを高効率で作製する方法を提供することである。 The present invention was made in view of the above-mentioned circumstances, and its purpose is to provide a method for highly efficiently producing hybridomas that produce specific antibodies that enable rapid diagnosis.
本発明者は、高効率でモノクローナル抗体を作製し、かつ通常のPEGを用いたハイブリドーマ法では得られにくいマイナーで重要なエピトープに結合するモノクローナル抗体を作製する方法について鋭意検討を行った。その結果、目的のB細胞をビオチン化抗原及びストレプトアビジンを用いてストレプトアビジン化し、ミエローマ細胞をビオチン化してB細胞とミエローマ細胞をビオチン/アビジンにより架橋させておき、電気パルスを施し目的のハイブリドーマを得る方法により、特にB細胞に結合させるビオチン化抗原を作製するときに用いる抗原とビオチンのモル比を特定の範囲に調整することにより、上記目的を達成し得ることを見出し本発明を完成させるに至った。 The present inventors have conducted intensive studies on a method for producing monoclonal antibodies with high efficiency and binding to minor and important epitopes that are difficult to obtain by conventional hybridoma methods using PEG. As a result, the target B cells are streptavidinated using a biotinylated antigen and streptavidin, the myeloma cells are biotinylated, the B cells and myeloma cells are cross-linked with biotin/avidin, and an electric pulse is applied to target the hybridoma. In order to complete the present invention, we have discovered that the above object can be achieved by adjusting the molar ratio of antigen to biotin to a specific range, particularly when producing a biotinylated antigen that binds to B cells. It's arrived.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[1] 以下の1)~4)の工程を含むハイブリドーマ作製方法:
1)B細胞表面に発現された抗原特異的レセプターとビオチン化抗原とを結合させて、B細胞-ビオチン化抗原複合体とした後、ストレプトアビジンを結合してB細胞-ビオチン化抗原-ストレプトアビジン複合体を作製するB細胞修飾工程、
2)ミエローマ細胞とビオチンとを結合してビオチン化ミエローマ細胞を作製するミエローマ細胞修飾工程、
3)前記B細胞-ビオチン化抗原-ストレプトアビジン複合体とビオチン化ミエローマ細胞とをビオチン-アビジン反応により架橋させてB細胞-ミエローマ細胞を得る細胞架橋工程、
4)B細胞-ミエローマ細胞からハイブリドーマを得るハイブリドーマ作製工程。
[2] 前記B細胞修飾工程におけるビオチン化抗原は、抗原に対しビオチンを0.9~7.5倍モル当量添加した条件下で結合させて作製することを特徴とする[1]のハイブリドーマ作製方法。
[3] [1]または[2]のハイブリドーマを作製する方法で得られたハイブリドーマを用いて高親和性を有するモノクローナル抗体を作製する方法。
[4] [1]または[2]のハイブリドーマを作製する方法によって得られたハイブリドーマ。
[5] [4]のハイブリドーマによって作製されたモノクローナル抗体。
[6] [5]のモノクローナル抗体を含む免疫測定試薬。
[7] [5]のモノクローナル抗体を用いた免疫測定方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] Hybridoma production method including the following steps 1) to 4):
1) The antigen-specific receptor expressed on the surface of B cells and biotinylated antigen are combined to form a B cell-biotinylated antigen complex, and then streptavidin is combined to form B cell-biotinylated antigen-streptavidin. B cell modification step to create a complex;
2) myeloma cell modification step of binding myeloma cells and biotin to produce biotinylated myeloma cells;
3) a cell cross-linking step of cross-linking the B cell-biotinylated antigen-streptavidin complex and biotinylated myeloma cells by a biotin-avidin reaction to obtain B cells-myeloma cells;
4) Hybridoma production process to obtain hybridomas from B cells and myeloma cells.
[2] The method for producing a hybridoma according to [1], wherein the biotinylated antigen in the B cell modification step is produced by binding the antigen under conditions in which biotin is added in a molar equivalent of 0.9 to 7.5 times.
[3] A method of producing a monoclonal antibody with high affinity using a hybridoma obtained by the method of producing a hybridoma of [1] or [2].
[4] A hybridoma obtained by the method for producing a hybridoma of [1] or [2].
[5] A monoclonal antibody produced by the hybridoma of [4].
[6] An immunoassay reagent containing the monoclonal antibody of [5].
[7] An immunoassay method using the monoclonal antibody of [5].
本発明によれば、一般的なPEG法では得られにくいマイナーで重要なエピトープに結合するモノクローナル抗体を作製すること、及び高効率でモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製することができる。また、これらハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いることにより、検出試薬または検出方法を提供できる。 According to the present invention, it is possible to produce a monoclonal antibody that binds to a minor and important epitope that is difficult to obtain by the general PEG method, and to produce a hybridoma that produces monoclonal antibodies with high efficiency. Furthermore, by using monoclonal antibodies produced from these hybridomas, detection reagents or detection methods can be provided.
次に、本発明の実施形態について説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。 Next, embodiments of the present invention will be described. The technical scope of the present invention is not limited by these embodiments, and can be implemented in various forms without changing the gist of the invention.
本発明のモノクローナル抗体作製方法は、免疫により特異的な抗体を産生し得る感作B細胞を得る免疫工程、得られたB細胞をビオチン化抗原及びストレプトアビジンで修飾するB細胞修飾工程、B細胞と融合させるミエローマ細胞をビオチンで修飾するミエローマ細胞修飾工程、上記B細胞とミエローマ細胞を架橋させる細胞架橋工程、B細胞とミエローマ細胞を融合しハイブリドーマを産生するハイブリドーマ作製工程、及びモノクローナル抗体を作製するモノクローナル抗体化工程を含む。 The monoclonal antibody production method of the present invention includes an immunization step for obtaining sensitized B cells capable of producing a specific antibody by immunization, a B cell modification step for modifying the obtained B cells with a biotinylated antigen and streptavidin, and a B cell modification step for modifying the obtained B cells with a biotinylated antigen and streptavidin. A myeloma cell modification step of modifying myeloma cells to be fused with biotin, a cell cross-linking step of cross-linking the B cells and myeloma cells, a hybridoma production step of fusing the B cells and myeloma cells to produce a hybridoma, and producing a monoclonal antibody. Includes a monoclonal antibody formation step.
本発明のモノクローナル抗体作製法を最適化BCT(B細胞ターゲティング)法と呼ぶことができる。 The monoclonal antibody production method of the present invention can be called an optimized BCT (B cell targeting) method.
1.モノクローナル抗体の作製
<免疫工程>
目的とする抗原に対して特異的な抗体を産生するB細胞を得るために必要となる動物の免疫方法については特に限定されず、いずれの免疫工程を採用することもできる。例えば、抗原の免疫量、免疫回数、抗原の作製方法、免疫方法、免疫動物、免疫場所、アジュバントの種類、リンパ球の摘出場所などについては、一般的に実施されている方法を使用できる。生物としては、非ヒト哺乳類(例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ラクダなど)、鳥類(例えば、ニワトリなど)などが例示されるが、これらのうちマウスを用いることが好ましい。動物1匹当たりの抗原投与量としては、一般的には、アジュバントを用いないときは0.1mg~10mg、アジュバントを用いるときは10μg~1mgであるが、これらに限定されない。アジュバントとしては、フロイントコンプリートアジュバント(CFA)、フロイントインコンプリートアジュバント(IFA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。抗原の投与方法としては、主として皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、フットパッド等に注入することにより行われる。免疫の間隔・回数は特に限定されず、数日から数週間間隔(好ましくは2~5週間間隔)で、1~10回、好ましくは2~8回の投与を行う。なお、タンパク質をコードする遺伝子(DNA、RNAを含む)を免疫する方法も利用できる。また、生物のリンパ球集団を採取した後に、イン・ビトロ(in vitro)で免疫する生体外免疫法なども適用できる。
1. Production of monoclonal antibodies <immunization process>
There are no particular limitations on the method of immunizing animals necessary to obtain B cells that produce antibodies specific to the antigen of interest, and any immunization process can be employed. For example, commonly used methods can be used for the immunization amount of the antigen, the number of immunizations, the antigen preparation method, the immunization method, the immunized animal, the immunization location, the type of adjuvant, the location of lymphocyte extraction, etc. Examples of living organisms include non-human mammals (e.g., mice, rats, guinea pigs, hamsters, goats, sheep, rabbits, horses, camels, etc.), birds (e.g., chickens, etc.), and among these, mice may be used. is preferred. The antigen dose per animal is generally 0.1 mg to 10 mg when no adjuvant is used, and 10 μg to 1 mg when an adjuvant is used, but is not limited thereto. Examples of the adjuvant include Freund's complete adjuvant (CFA), Freund's in complete adjuvant (IFA), aluminum hydroxide adjuvant, and the like. The antigen is mainly administered by subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, foot pad, or other injection. The interval and number of immunizations are not particularly limited, and administration is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 8 times, at intervals of several days to several weeks (preferably at intervals of 2 to 5 weeks). Note that a method of immunizing with genes encoding proteins (including DNA and RNA) can also be used. In addition, an ex vivo immunization method, in which a lymphocyte population of an organism is collected and then immunized in vitro, can also be applied.
抗原はタンパク質や多糖等の抗原や、単糖、オリゴ糖、アミノ酸、ペプチド、ステロイド骨格を有する物質等の低分子生理活性物質を含むハプテンに加え、これらで構成される細菌、ウイルス、真正細菌、古細菌、藻類、原生生物、菌類、粘菌、真菌、ウイルス、寄生虫等の病原菌等、抗体が結合する物質であれば何ら限定されない。例えば、被測定物質が抗原の場合、例えばCRP(C-反応性蛋白質)、前立腺特異抗原、フェリチン、β-2マイクログロブリン、ミオグロビン、ヘモグロビン、アルブミン、クレアチニン等のタンパク質マーカー、IgG、IgA、IgM等の免疫グロブリン、各種腫瘍マーカー、LDL、HDL、TG等のリポ蛋白、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、RSウイルス(RSV)、ライノウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、アストロウイルス、HAV、HBs、HCV、HIV、EBV等のウイルス抗原、クラミジア・トラコマティス、溶連菌、百日咳菌、ヘリコバクター・ピロリ、レプトスピラ、トレポネーマ・パリダム、トキソプラズマ・ゴンディ、ボレリア、レジオネラ属菌、炭疽菌、MRSA等の細菌抗原、細菌等が産生する毒素、マイコプラズマ脂質抗原、ヒト絨毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミン類、プロスタグランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、農薬、環境ホルモン等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。好ましい例として、CRP、前立腺特異抗原、フェリチン、β-2マイクログロブリン及びヘモグロビン等の抗原が挙げられる。 Antigens include antigens such as proteins and polysaccharides, haptens including low-molecular physiologically active substances such as monosaccharides, oligosaccharides, amino acids, peptides, and substances with steroid skeletons, as well as bacteria, viruses, eubacteria, and The substance is not limited in any way as long as it is a substance to which the antibody binds, such as archaea, algae, protists, fungi, slime molds, fungi, viruses, parasites, and other pathogenic bacteria. For example, when the substance to be measured is an antigen, for example, protein markers such as CRP (C-reactive protein), prostate-specific antigen, ferritin, β-2 microglobulin, myoglobin, hemoglobin, albumin, creatinine, IgG, IgA, IgM, etc. immunoglobulin, various tumor markers, lipoproteins such as LDL, HDL, and TG, influenza A virus, influenza B virus, respiratory syncytial virus (RSV), rhinovirus, rotavirus, norovirus, adenovirus, astrovirus, HAV, Viral antigens such as HBs, HCV, HIV, and EBV; bacterial antigens such as Chlamydia trachomatis, Streptococcus, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, Leptospira, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, Borrelia, Legionella, Bacillus anthrax, and MRSA. , toxins produced by bacteria, mycoplasma lipid antigens, peptide hormones such as human chorionic gonadotropin, steroids such as steroid hormones, physiologically active amines such as epinephrine and morphine, vitamins, prostaglandins, antibiotics such as tetracyclines, etc. , agricultural chemicals, environmental hormones, etc., but are not limited to these. Preferred examples include antigens such as CRP, prostate specific antigen, ferritin, β-2 microglobulin and hemoglobin.
多くの場合に、微生物由来の抗原は、タンパク質、或いは糖鎖を備えたタンパク質などである。微生物由来の抗原には、微生物から精製されたものを用いても良いし、微生物そのものを用いても良い。微生物そのものを用いる場合には、微生物を単離・精製したものを用いても良いし、他の抗原を含む微生物試料を混合物として使用することもできる。 In many cases, antigens derived from microorganisms are proteins or proteins with sugar chains. The antigen derived from a microorganism may be one purified from a microorganism, or the microorganism itself may be used. When using microorganisms themselves, isolated and purified microorganisms may be used, or microorganism samples containing other antigens may be used as a mixture.
<B細胞修飾工程>
B細胞修飾工程においては、B細胞を含む試料(例えば、脾細胞懸濁液、リンパ節懸濁液)に対して、(1)抗原(抗原そのもの、ビオチン化抗原、またはストレプトアビジン化抗原を含む)とB細胞を含む試料とを混合する方法、(2)目的としない特異抗原を含む微生物単体(他の共通抗原を含む)とB細胞を含む試料とを混合して、目的以外のB細胞抗原結合レセプターをブロックする不要B細胞ブロック工程を実施した後、抗原とB細胞を含む試料とを混合する方法などがある。以下、B細胞修飾工程について詳述する。
<B cell modification process>
In the B cell modification step, a sample containing B cells (e.g., splenocyte suspension, lymph node suspension) is subjected to (1) antigens (including the antigen itself, biotinylated antigen, or streptavidinated antigen); ) and a sample containing B cells; (2) a method of mixing a single microorganism containing an unintended specific antigen (including other common antigens) with a sample containing B cells; There is a method in which the antigen and a sample containing B cells are mixed after performing a step of blocking unnecessary B cells by blocking antigen-binding receptors. The B cell modification step will be described in detail below.
B細胞修飾工程においては、B細胞を含む試料(例えば、脾細胞懸濁液、リンパ節懸濁液)を採取し、B細胞をストレプトアビジンで修飾する。ここで、B細胞をストレプトアビジンで修飾するとは、B細胞にストレプトアビジンを結合させることをいい、B細胞-ビオチン化抗原-ストレプトアビジン複合体を形成させればよい(ここで、「-」は結合を示す)。ストレプトアビジンを結合させることをストレプトアビジン化するという。 In the B cell modification step, a sample containing B cells (eg, splenocyte suspension, lymph node suspension) is collected, and the B cells are modified with streptavidin. Here, modifying B cells with streptavidin refers to binding streptavidin to B cells, forming a B cell-biotinylated antigen-streptavidin complex (here, "-" (indicates a bond). The binding of streptavidin is called streptavidinization.
B細胞は目的とする標的抗原(抗原そのもの、ビオチン化抗原、またはストレプトアビジン化抗原を含む)とB細胞を含む試料とを混合する方法で修飾することができる。 B cells can be modified by mixing the desired target antigen (including the antigen itself, biotinylated antigen, or streptavidinated antigen) with a sample containing B cells.
ここで、抗原は混合するB細胞が認識する抗原を用いる。前記B細胞は前記抗原に特異的なレセプターを有しており、該抗原特異的レセプターに抗原が結合する。抗原そのものを用いる場合は、B細胞の抗原特異的レセプターに抗原を結合させ、該抗原にビオチンを結合させてビオチン化し、さらにビオチンにストレプトアビジンを結合させてストレプトアビジン化する。この結果、B細胞-抗原-ビオチン-ストレプトアビジン複合体が形成される。抗原としてビオチンを結合させたビオチン化抗原を用いてもよく、この場合は、ビオチン化抗原にストレプトアビジンを結合させて、抗原をストレプトアビジン化することにより、B細胞-ビオチン化抗原-ストレプトアビジン複合体が形成される。なお、ビオチン化抗原を用いて作製した複合体もB細胞-抗原-ビオチン-ストレプトアビジン複合体と表すことができる。さらに、抗原として、抗原-ビオチン-ストレプトアビジンの複合体を形成しているストレプトアビジン化抗原を用いてもよい。この場合は、抗原をB細胞に結合させることにより、B細胞-ビオチン化抗原-ストレプトアビジン複合体が形成される。 Here, the antigen used is an antigen recognized by the mixed B cells. The B cell has a receptor specific for the antigen, and the antigen binds to the antigen-specific receptor. When using the antigen itself, the antigen is bound to an antigen-specific receptor of a B cell, biotin is bound to the antigen to form biotinylation, and streptavidin is further bound to biotin to form streptavidin. As a result, a B cell-antigen-biotin-streptavidin complex is formed. A biotinylated antigen to which biotin is bound may be used as the antigen. In this case, the B cell-biotinylated antigen-streptavidin complex is formed by binding streptavidin to the biotinylated antigen and converting the antigen to streptavidin. A body is formed. Note that a complex prepared using a biotinylated antigen can also be expressed as a B cell-antigen-biotin-streptavidin complex. Furthermore, a streptavidinated antigen forming an antigen-biotin-streptavidin complex may be used as the antigen. In this case, by binding the antigen to B cells, a B cell-biotinylated antigen-streptavidin complex is formed.
抗原のビオチン化は、例えば、抗原が有するアミノ基とビオチンをアミド結合により結合させればよい。このためには例えばN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを有するビオチンであるNHS-ビオチンと抗原を混合すればよい。抗原をビオチン化するとき、抗原に対しビオチンを0.9~7.5倍モル当量、好ましくは3.75~7.5倍モル当量添加した条件で行えばよい。NHS-ビオチンを用いるときは、抗原に対しNHS-ビオチンを0.9~7.5倍モル当量、好ましくは3.75~7.5倍モル当量添加して行えばよい。抗原のビオチン化は、pH6.5~9.0、好ましくはpH6.8~7.5で行えばよく、例えば、PBS中で行えばよい。ビオチン化反応は、室温で10~100分間、好ましくは10~60分間、さらに好ましくは20~40分間回転させて行えばよく、最後にグリシンを最終濃度数十mM、例えば20mMになるように添加してビオチン化反応を停止すればよい。 To biotinylate an antigen, for example, an amino group possessed by the antigen and biotin may be bonded through an amide bond. For this purpose, for example, the antigen may be mixed with NHS-biotin, which is biotin having an N-hydroxysuccinimide (NHS) ester. When biotinylating an antigen, biotin may be added in an amount of 0.9 to 7.5 times the molar equivalent, preferably 3.75 to 7.5 times the molar equivalent of the antigen. When using NHS-biotin, NHS-biotin may be added in an amount of 0.9 to 7.5 times the molar equivalent, preferably 3.75 to 7.5 times the molar equivalent, relative to the antigen. Biotinylation of the antigen may be performed at pH 6.5 to 9.0, preferably pH 6.8 to 7.5, and may be performed, for example, in PBS. The biotinylation reaction may be carried out at room temperature with rotation for 10 to 100 minutes, preferably 10 to 60 minutes, more preferably 20 to 40 minutes, and finally glycine is added to a final concentration of several tens of mM, for example 20 mM. to stop the biotinylation reaction.
B細胞は、脾臓細胞に多く含まれるので、B細胞を含む脾臓細胞をストレプトアビジン化すればよい。本発明において、脾臓細胞をストレプトアビジン化することを、B細胞をストレプトアビジン化するという。また、脾臓細胞からB細胞を単離して用いてもよい。 Since spleen cells contain many B cells, spleen cells containing B cells may be converted to streptavidin. In the present invention, streptavidinization of spleen cells is referred to as streptavidinization of B cells. Alternatively, B cells may be isolated from spleen cells and used.
また、目的とする標的抗原以外の抗原を認識するB細胞をあらかじめ除去することができる。例えば、目的とする抗原以外の抗原を含む微生物単体(他の共通抗原を含む)とB細胞を含む試料とを混合すればよい。このように、目的とする抗原を含まない共通抗原を添加することにより、目的とする抗原以外のB細胞の抗原特異的レセプターを、該レセプターに抗原を結合させることによりブロックすることができる。このように、不要なB細胞の抗原特異的レセプターをブロックし、目的以外のB細胞を取り除く工程、すなわち不要B細胞ブロック工程を実施した後、目的とする標的抗原(抗原そのもの、ビオチン化抗原、またはストレプトアビジン化抗原を含む)とB細胞を含む試料とを混合すればよい。不要なB細胞の抗原特異的レセプターをブロックする工程によれば、目的外のB細胞が除去されるので、特異性がより高い抗体を発現するB細胞が得られやすくなる。 Furthermore, B cells that recognize antigens other than the intended target antigen can be removed in advance. For example, a single microorganism containing antigens other than the target antigen (including other common antigens) may be mixed with a sample containing B cells. In this way, by adding a common antigen that does not contain the target antigen, antigen-specific receptors of B cells other than the target antigen can be blocked by binding the antigen to the receptors. In this way, after carrying out the step of blocking the antigen-specific receptors of unnecessary B cells and removing non-target B cells, that is, the step of blocking unnecessary B cells, the desired target antigen (antigen itself, biotinylated antigen, or streptavidinated antigen) and a sample containing B cells may be mixed. By blocking the antigen-specific receptors of unnecessary B cells, undesired B cells are removed, making it easier to obtain B cells that express antibodies with higher specificity.
なお、上記工程において、抗原は、予めビオチン化させておくことが好ましい。このようにすれば、B細胞-ビオチン化抗原が得られるので、これにストレプトアビジンを結合させることにより、後の細胞架橋工程において使用されるB細胞-ビオチン化抗原-ストレプトアビジン複合体を得るための工程を円滑に進められる。また、上記工程において、微生物由来抗原を予めストレプトアビジン化させておいてもよい。ストレプトアビジン化により、B細胞-ストレプトアビジン化抗原が得られるので、後の細胞架橋工程を円滑に進められる。
B細胞の修飾は、DMEM等の公知の細胞培養液中で行えばよい。
In addition, in the above step, it is preferable that the antigen be biotinylated in advance. In this way, B cell-biotinylated antigen is obtained, and by binding streptavidin to this, a B cell-biotinylated antigen-streptavidin complex to be used in the subsequent cell crosslinking step is obtained. The process can proceed smoothly. Furthermore, in the above step, the microorganism-derived antigen may be converted into streptavidin in advance. Streptavidinization yields B cell-streptavidinated antigen, which facilitates the subsequent cell cross-linking step.
Modification of B cells may be performed in a known cell culture medium such as DMEM.
<ミエローマ細胞修飾工程>
B細胞側に付加されたストレプトアビジンを利用して、細胞架橋を行うために、ミエローマ細胞にビオチンを結合しビオチン化する。こうして、ビオチン化ミエローマ細胞を作製することで、B細胞-ビオチン化抗原-ストレプトアビジン複合体、またはB細胞-ストレプトアビジン化抗原との細胞架橋工程に資する。ミエローマ細胞のビオチン化は、例えば、ミエローマ細胞が有するアミノ基とビオチンをアミド結合により結合させればよい。このためには例えばN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを有するビオチンであるNHS-ビオチンとミエローマ細胞を混合すればよい。ミエローマ細胞のビオチン化は、pH6.5~9.0、好ましくはpH6.8~7.5で行えばよい。
<Myeloma cell modification process>
Using streptavidin added to the B cell side, myeloma cells are bound to biotin and biotinylated in order to perform cell cross-linking. In this way, the production of biotinylated myeloma cells contributes to the cell crosslinking step with the B cell-biotinylated antigen-streptavidin complex or the B cell-streptavidinated antigen. For biotinylation of myeloma cells, for example, an amino group possessed by myeloma cells and biotin may be bonded through an amide bond. For this purpose, for example, NHS-biotin, which is biotin containing N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, may be mixed with myeloma cells. Biotinylation of myeloma cells may be carried out at pH 6.5 to 9.0, preferably pH 6.8 to 7.5.
ミエローマ細胞は、生物から単離したB細胞と融合させることで、B細胞を不死化させると共に、B細胞が持っている抗体産生能を維持できる細胞であれば、いずれのものも使用できる。一般的には、マウス由来のミエローマ細胞がよく使用される。例えば、SP2/0, PAI, P3x63Ag8.653 等が例示されるが、特に限定されない。なお、免疫工程において使用した生物に応じて、細胞架橋工程において使用するミエローマ細胞も、その生物に適した細胞種に馴化したものを使用できる。
ミエローマ細胞の修飾は、PBS等の公知の緩衝液中で行えばよい。
Any myeloma cells can be used as long as they can immortalize B cells by fusing them with B cells isolated from living organisms and maintain the ability of B cells to produce antibodies. Generally, myeloma cells derived from mice are often used. Examples include SP2/0, PAI, P3x63Ag8.653, etc., but are not particularly limited. Note that, depending on the organism used in the immunization step, the myeloma cells used in the cell crosslinking step may be adapted to a cell type suitable for that organism.
Modification of myeloma cells may be performed in a known buffer such as PBS.
<細胞架橋工程>
細胞架橋工程では、上記方法で作製したストレプトアビジン化B細胞とビオチン化ミエローマ細胞を混合し、B細胞側に付加されたストレプトアビジンと、ミエローマ細胞側に付加されたビオチンとを用いることにより、両細胞を効率的に架橋させる。この際、ストレプトアビジン化B細胞とビオチン化ミエローマ細胞の混合比(細胞数)は、ビオチン化ミエローマ細胞1に対して、ストレプトアビジン化B細胞を1~10、好ましくは2~6、さらに好ましくは3~5、特に好ましくは4の割合で混合すればよい。
細胞の架橋は、DMEM等の公知の細胞培養液中で行えばよい。
両細胞を架橋させたものをB細胞-ミエローマ細胞複合体と呼ぶ。
<Cell crosslinking process>
In the cell crosslinking step, streptavidinated B cells prepared by the above method and biotinylated myeloma cells are mixed, and by using streptavidin added to the B cells and biotin added to the myeloma cells, both Efficiently crosslink cells. At this time, the mixing ratio (number of cells) of streptavidinated B cells and biotinylated myeloma cells is 1 to 10, preferably 2 to 6, more preferably 2 to 6, streptavidinated B cells to 1 biotinylated myeloma cell. They may be mixed at a ratio of 3 to 5, particularly preferably 4.
Cell crosslinking may be performed in a known cell culture medium such as DMEM.
The cross-linked structure of both cells is called a B cell-myeloma cell complex.
<ハイブリドーマ作製工程>
B細胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドーマを得る方法として、化学的方法、物理学的方法、生物学的方法のいずれかにより2つの異なる細胞を細胞融合法で1つの細胞に結合させる方法が挙げられる。具体的にはPEG法、HVJ法、パールチェイン法、レーザー法、立体構造特異的ターゲティング(SST)法、B細胞ターゲティング(BCT)法が挙げられ、いずれの方法で細胞を融合させてもよい。
<Hybridoma production process>
A method for obtaining hybridomas by fusing B cells and myeloma cells is to combine two different cells into one cell using cell fusion using chemical, physical, or biological methods. It will be done. Specific examples include the PEG method, HVJ method, pearl chain method, laser method, conformation-specific targeting (SST) method, and B cell targeting (BCT) method, and cells may be fused using any of these methods.
PEG法は、ポリエチレングリコール(PEG)を用いて細胞融合を行う方法であり、例えば、DMEMに懸濁した感作Bリンパ球を含む脾臓細胞(5.0x107から1.0x108)とマウスミエローマ細胞を10:1の割合(脾臓細胞:ミエローマ細胞)で混ぜ、1000 rpm(200 g)で10分間遠心分離をした。上清を除去した後、細胞ペレットに1 mL 50 %(wt/vol)ポリエチレングリコール4000を1分かけて滴下し、細胞を融合させることにより行う。
The PEG method is a method of cell fusion using polyethylene glycol (PEG), for example, spleen cells (5.0x10 7 to 1.0x10 8 ) containing sensitized B lymphocytes suspended in DMEM and mouse myeloma cells. The cells were mixed at a ratio of 10:1 (spleen cells: myeloma cells) and centrifuged at 1000 rpm (200 g) for 10 minutes. After removing the supernatant, 1
SST法、BCT法によりハイブリドーマを得るときの条件は、一般的には、グルコース、シュークロース、マンニトールなどの糖で浸透圧を調整した低塩濃度の緩衝液で細胞融合を行う。たとえば、0.25 M シュークロース、2 mM リン酸緩衝液(pH 7.2)、0.1 mM塩化カルシウム、0.1 mM塩化マグネシウムの緩衝液を例示できるが、浸透圧を調整するための糖の種類と濃度、緩衝能を持たせるための緩衝液の種類と濃度、pH、塩化カルシウムと塩化マグネシウムの濃度は、細胞融合される細胞の性質に応じて適当に最適化される。細胞および緩衝液の状態に応じて変化できるが、通常の電気パルスを用いた細胞融合で使用される程度のパルス強度を用いることができる。例えば、1 kV/cm~4 kV/cmの範囲内、好ましくは2 kV/cm~3 kV/cm、より好ましくは2 kV/cm~2.5 kV/cmの強度で行う。パルスの回数は、1~10回程度で実施する。パルス幅(パルス時間)は、通常、10μsを使用する。電気パルスは、たとえばelectro square porator ECM2001(BTX社製)を用いて行うことができる。ハイブリドーマを得るときの条件は、一般的に実施されている方法を使用できる。 The conditions for obtaining hybridomas by the SST method and BCT method are generally to perform cell fusion in a low salt concentration buffer solution whose osmotic pressure is adjusted with sugars such as glucose, sucrose, and mannitol. For example, a buffer solution of 0.25 M sucrose, 2 mM phosphate buffer (pH 7.2), 0.1 mM calcium chloride, and 0.1 mM magnesium chloride can be used, but the type and concentration of sugar and buffering capacity to adjust the osmotic pressure are important. The type and concentration of the buffer solution, pH, and concentration of calcium chloride and magnesium chloride are appropriately optimized depending on the properties of the cells to be fused. Pulse intensities similar to those used in cell fusion using conventional electrical pulses can be used, although this can vary depending on cell and buffer conditions. For example, the intensity is within the range of 1 kV/cm to 4 kV/cm, preferably 2 kV/cm to 3 kV/cm, more preferably 2 kV/cm to 2.5 kV/cm. The number of pulses is approximately 1 to 10 times. The pulse width (pulse time) is usually 10 μs. The electric pulse can be generated using, for example, an electro square porator ECM2001 (manufactured by BTX). As conditions for obtaining hybridomas, commonly used methods can be used.
細胞融合後の細胞の取り扱いについては、通常のハイブリドーマを作製した後の取り扱いと同様に、すなわち細胞融合後の細胞をHAT培地での選別後にHT培地で培養し、ハイブリドーマを樹立する。培養上清中に存在する抗体の性能は通常行われている方法(例えば、ELISA法、免疫蛍光抗体法など)でスクリーニングできる。 The cells after cell fusion are handled in the same way as normal hybridomas are handled, that is, the cells after cell fusion are sorted in HAT medium and then cultured in HT medium to establish hybridomas. The performance of antibodies present in the culture supernatant can be screened by commonly used methods (eg, ELISA, immunofluorescence antibody method, etc.).
<モノクローナル抗体化工程>
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する工程をモノクローナル抗体化といい、樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を使用できる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを、通常用いられる培地、たとえば10%ウシ胎児血清(FBS)含有RPMI-1640培地、MEM培地、又は無血清培地中で、通常の培養条件(例えば37℃、5% CO2濃度)で7~14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内に、ハイブリドーマをたとえば約1×107個の投与量で投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させた後、1~2週間後に腹水を採取する。抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの方法を選択し、又はこれらを組み合わせることにより精製できる。
<Monoclonal antibody formation process>
The process of collecting monoclonal antibodies from established hybridomas is called monoclonal antibodyization, and as a method for collecting monoclonal antibodies from established hybridomas, normal cell culture methods, ascites formation methods, etc. can be used. In the cell culture method, hybridomas are grown in a commonly used medium, such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), MEM medium, or serum-free medium, under normal culture conditions (for example, 37°C, 5% CO 2 concentration) for 7 to 14 days, and antibodies are obtained from the culture supernatant. In the case of the ascites formation method, hybridomas are intraperitoneally administered to an animal of the same species as the mammal derived from myeloma cells, for example, at a dose of about 1 x 10 7 cells, and after multiplying the hybridomas in large quantities, 1 to 2 Collect ascitic fluid after a week. When the antibody needs to be purified, it can be purified by selecting a method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, or affinity chromatography, or by a combination of these methods.
本発明の最適化BCT法によれば、従来のPEG法やビオチンを抗原に対し約30倍モル当量添加した条件でビオチン化する従来のBCT法で作製したモノクローナル抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体を作製することができる。本発明の方法でタンパク質抗原をビオチン化した場合、ビオチンは抗原のN末端アミノ基やリジン残基に結合しやすいので、ビオチンによりN末端アミノ酸やリジン残基がブロックされる。この結果、ビオチン化抗原は、N末端アミノ酸やリジン残基を含むエピトープを認識する抗原特異的レセプター以外の抗原特異的レセプターに結合する。従って、細胞架橋工程において、N末端アミノ酸やリジン残基を含むエピトープ以外のエピトープを認識する抗体を産生し得るB細胞がミエローマ細胞と架橋し複合体を形成するので、N末端アミノ酸やリジン残基を含むエピトープ以外のエピトープを認識する抗体を産生し得るハイブリドーマが産生される。すなわち、PEG法によるハイブリドーマ作製法では得られにくい特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが産生される。また、システイン残基のスルフヒドリル基(-SH)を市販のスルフヒドリル基ビオチン化試薬を用いてビオチン化することもできる。この場合、システイン残基を含むエピトープ以外のエピトープを認識する抗体を産生し得るB細胞がミエローマ細胞と架橋し複合体を形成するので、システイン基を含むエピトープ以外のエピトープを認識する抗体を産生し得るハイブリドーマが産生される。すなわち、PEG法によるハイブリドーマ作製法では得られにくい特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが産生される。本発明の最適化BCT法を用いることにより、モノクローナル抗体が認識するエピトープのバリエーションが多くなる。また、本発明の最適化BCT法で得られたモノクローナル抗体は、従来のPEG法で作製したモノクローナル抗体よりも高い親和性を有している。本発明の方法により、特定のエピトープに対するモノクローナル抗体を得ることができるということができる。本発明の方法をエピトープ選択的モノクローナル抗体作製法と呼ぶことができる。 According to the optimized BCT method of the present invention, a monoclonal antibody that recognizes an epitope that is not recognized by a monoclonal antibody produced by the conventional PEG method or the conventional BCT method, which is biotinylated under the conditions of adding about 30 times the molar equivalent of biotin to the antigen. Antibodies can be produced. When a protein antigen is biotinylated by the method of the present invention, biotin easily binds to the N-terminal amino group or lysine residue of the antigen, so the N-terminal amino acid or lysine residue is blocked by biotin. As a result, biotinylated antigens bind to antigen-specific receptors other than those that recognize epitopes containing N-terminal amino acids and lysine residues. Therefore, in the cell cross-linking process, B cells that can produce antibodies that recognize epitopes other than epitopes containing N-terminal amino acids and lysine residues cross-link with myeloma cells and form a complex. Hybridomas are produced that are capable of producing antibodies that recognize epitopes other than those containing . That is, hybridomas are produced that produce monoclonal antibodies with specificity that is difficult to obtain by hybridoma production using the PEG method. Furthermore, the sulfhydryl group (-SH) of cysteine residue can also be biotinylated using a commercially available sulfhydryl group biotinylation reagent. In this case, B cells that can produce antibodies that recognize epitopes other than epitopes containing cysteine residues crosslink with myeloma cells and form a complex, producing antibodies that recognize epitopes other than epitopes containing cysteine groups. A hybridoma is produced. That is, hybridomas are produced that produce monoclonal antibodies with specificity that is difficult to obtain by hybridoma production using the PEG method. By using the optimized BCT method of the present invention, variations in epitopes recognized by monoclonal antibodies are increased. Moreover, the monoclonal antibodies obtained by the optimized BCT method of the present invention have higher affinity than monoclonal antibodies produced by the conventional PEG method. It can be said that by the method of the present invention, monoclonal antibodies directed against specific epitopes can be obtained. The method of the present invention can be referred to as an epitope-selective monoclonal antibody production method.
2.免疫測定試薬及び免疫測定方法
本発明においては、上記モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を用いることにより、免疫測定試薬及び免疫測定方法を提供することができる。以下、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、「モノクローナル抗体」は、「モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片」を意味する。抗原結合性断片は、標的抗原に結合する断片であり、Fab、F(ab’)2、scFv、Fab’、一本鎖免疫グロブリン等を含む。
2. Immunoassay Reagent and Immunoassay Method In the present invention, an immunoassay reagent and an immunoassay method can be provided by using the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof. Hereinafter, unless the context clearly indicates otherwise, "monoclonal antibody" means "monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof." Antigen-binding fragments are fragments that bind to target antigens, and include Fab, F(ab') 2 , scFv, Fab', single chain immunoglobulin, and the like.
試薬は、抗体を安定的に保持するためのバッファー等を含んでもよい。その他の成分は使用する免疫学的測定法に応じて当業者が適宜決定することができる。 The reagent may include a buffer and the like for stably retaining the antibody. Other components can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the immunoassay method used.
免疫学的測定法としては、例えば免疫染色法(蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む)、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素等による検出方法とを組み合わせた方法(ウエスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む)、酵素免疫測定吸着法(ELISA)、ドット・ブロッティング法、ラテックス凝集法(LA:LatexAgglutination-TurbidimetricImmunoassay)、イムノクロマト法等が挙げられる。 Examples of immunological measurement methods include immunostaining (including fluorescent antibody method, enzyme antibody method, heavy metal-labeled antibody method, and radioisotope-labeled antibody method), electrophoretic separation and fluorescence, enzymes, radioisotope, etc. (including Western blotting and two-dimensional fluorescence electrophoresis), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), dot blotting, latex agglutination (LA), and immunochromatography. etc.
試薬は、被測定物質の有無等を確認することが必要な被験者由来の検体に添加される。検体は、被測定物質を含むものであれば特に限定されないが、血液、血清、血漿、尿、便、唾液、組織液、髄液、ぬぐい液等の体液等又はその希釈物が挙げられ、血液、血清、血漿、尿、便、髄液又はこれらの希釈物が好ましい。 The reagent is added to a sample from a subject whose presence or absence of a substance to be measured needs to be confirmed. The specimen is not particularly limited as long as it contains the substance to be measured, but examples include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, feces, saliva, tissue fluid, cerebrospinal fluid, swabbing fluid, etc., or diluted products thereof; Serum, plasma, urine, stool, spinal fluid or dilutions thereof are preferred.
第二の実施形態において、本発明は、上記の試薬を含むキット、を提供する。キットは診断、研究等のために使用されうる。キットは、その使用目的に応じて、試薬としての上記モノクローナル抗体のみならず、上記モノクローナル抗体を固定化するための担体や、二次抗体を含んでもよい。このような担体としては不溶性担体が好ましく、例えば、ポリエチレンやポリスチレン等のラテックス粒子、アルミナ粒子、シリカ粒子、金コロイド、磁性粒子等の粒子がその例として挙げられる。より具体的には、ELISA法(直接法、間接法、サンドイッチ法等)であればマイクロプレート、ラテックス凝集法であればラテックス等が不溶性担体として使用され得る。抗体と抗原の非特異反応を防ぐ観点から、ブロッキング剤をキットに含めるのが好ましい。 In a second embodiment, the invention provides a kit comprising the reagents described above. Kits can be used for diagnostics, research, etc. Depending on the purpose of use, the kit may contain not only the monoclonal antibody described above as a reagent but also a carrier for immobilizing the monoclonal antibody and a secondary antibody. Such a carrier is preferably an insoluble carrier, and examples thereof include latex particles such as polyethylene and polystyrene particles, alumina particles, silica particles, gold colloids, and magnetic particles. More specifically, a microplate can be used as the insoluble carrier for the ELISA method (direct method, indirect method, sandwich method, etc.), and latex or the like can be used for the latex aggregation method. From the viewpoint of preventing non-specific reactions between antibodies and antigens, it is preferable to include a blocking agent in the kit.
例えば、間接法に使用するキットには、例えば、試薬としての、抗原に結合する一次抗体、一次抗体に結合する二次抗体、酵素反応のための基質、検量線作成またはコントロール実験に使用するための標準抗原等が含まれる。二次抗体は検出のために標識されていてもよい。 For example, a kit used for an indirect method may include, for example, a primary antibody that binds to the antigen as a reagent, a secondary antibody that binds to the primary antibody, a substrate for an enzyme reaction, and a kit for use in creating a standard curve or in a control experiment. This includes standard antigens, etc. The secondary antibody may be labeled for detection.
本発明において、上記モノクローナル抗体を用いて抗原を定量又は半定量する場合でも、定量や半定量は必然的に「測定」を伴うので、本発明における「測定」に包含される。すなわち、本発明において、免疫測定の「測定」には、定量、半定量、検出のいずれもが包含される。 In the present invention, even when quantifying or semi-quantifying an antigen using the monoclonal antibody, quantitative determination or semi-quantitative determination necessarily involves "measurement" and is therefore included in "measurement" in the present invention. That is, in the present invention, "measurement" in immunoassay includes quantitative determination, semi-quantitative determination, and detection.
本発明の上記モノクローナル抗体を含む検出用試薬は免疫測定器具を含む。また、本発明の上記モノクローナル抗体を含む検出用キットは前記免疫測定器具を含む。該キットは、他にブロッシャー、検体採取器具等を含んでいてもよい。 The detection reagent containing the monoclonal antibody of the present invention includes an immunoassay device. Further, a detection kit containing the above-mentioned monoclonal antibody of the present invention includes the above-mentioned immunoassay device. The kit may also include a brochure, a sample collection device, and the like.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically explained with reference to the following examples, but the present invention is not limited by these examples.
<材料>
ヒトミオグロビン(hMyo)はOriental Yeastから購入した。N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)-ビオチンおよびポリエチレングリコール(PEG)4000はシグマアルドリッチより購入した。ストレプトアビジン(StAv)、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、完全フロイントアジュバント(CFA)及び不完全フロイントアジュバント(IFA)は富士フィルム和光純薬株式会社から購入した。HRPを結合した抗マウスIgG(H+L)抗体は、BioSource Internationalから購入した。Alexa Fluor 488で標識したヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体は、Thermo Fisher Scientificより購入した。BALB/cAJclマウスはクレアジャパンより購入した。
<Materials>
Human myoglobin (hMyo) was purchased from Oriental Yeast. N-hydroxysuccinimide (NHS)-biotin and polyethylene glycol (PEG) 4000 were purchased from Sigma-Aldrich. Streptavidin (StAv), N,N-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), complete Freund's adjuvant (CFA), and incomplete Freund's adjuvant (IFA) were purchased from Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Anti-mouse IgG (H+L) antibody conjugated with HRP was purchased from BioSource International. Goat anti-mouse IgG (H+L) antibody labeled with Alexa Fluor 488 was purchased from Thermo Fisher Scientific. BALB/cAJcl mice were purchased from Claire Japan.
<方法>
[1]ミエローマ細胞の培養
PAI、P3X63 Ag8.653 (X63)およびSP2/0のマウスミエローマ細胞は、10% FBS、2 mM Lグルタミン(日水製薬株式会社)、100 μg/mL硫酸カナマイシン(明治製菓株式会社)を添加した完全RPMI1640培地で、37 ℃、5 %炭酸ガスインキュベーター内で培養した。
<Method>
[1] Culture of myeloma cells
PAI, P3X63 Ag8.653 (X63), and SP2/0 mouse myeloma cells were supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), and 100 μg/mL kanamycin sulfate (Meiji Seika Co., Ltd.). The cells were cultured in complete RPMI1640 medium at 37°C in a 5% carbon dioxide incubator.
[2]免疫方法
免疫には5~7週齢のBALB/cマウスを使用した。hMyo抗原とCFAを1:1(v/v)の割合で混合し油中水型(w/o)エマルションを作製した。50 μgの抗原を含む油中水型(w/o)エマルションを腹腔内に注射した。2週間後、hMyo抗原とIFAを1:1(v/v)の比率で混合しIFA中の抗原を2回目の免疫に使用した。最終免疫は、融合の3~5日前に行った。
[2] Immunization method BALB/c mice aged 5 to 7 weeks were used for immunization. A water-in-oil (w/o) emulsion was prepared by mixing hMyo antigen and CFA at a ratio of 1:1 (v/v). A water-in-oil (w/o) emulsion containing 50 μg of antigen was injected intraperitoneally. Two weeks later, hMyo antigen and IFA were mixed at a ratio of 1:1 (v/v), and the antigen in IFA was used for the second immunization. The final immunization was performed 3-5 days before fusion.
[3]脾臓細胞の準備
最終免疫を行ったマウスをイソフルランで充満させたガラスビンの中に入れ、吸入麻酔した。マウスが麻酔にかかったことを確認した後、注射針で解剖台に固定した。マウスの腹部を、70 %エタノールを含ませた脱脂綿で消毒した後、ピンセットで腹部中央付近の外皮をつまみ上げ、解剖用ハサミで外皮に切り込みを入れ、切り口を心臓近くまで広げた。次に、肋骨近くの内皮をピンセットでつまみ、心臓が見えるまで開胸し5 ml用注射器を用いて心臓から採血した。その後、心臓採血したマウスを70 %エタノールが入ったビーカー内に浸して無菌化し、クリーンベンチ内に敷いたアルミホイルの上に置いた。脾臓を摘出するために、マウスの左脇腹に解剖用ハサミで外皮に切れ目を入れ、脾臓が見えるところまで外皮を押し広げた。そして、脾臓が露出するように内皮を切った。次にピンセットで脾臓付近の脂肪をつかみ、脾臓と一緒に持ち上げ、ハサミで脾臓の周りの脂肪を切り取りマウスより摘出した。脾臓摘出のための一連の操作は、すべて無菌的に行った。摘出した脾臓は、DMEM+ [Dulbecco’s Modified Eagle’s medium(DMEM、日水製薬社)+100 μg/ml硫酸カナマイシン(明治製菓社)]を10 ml入れた15 mlコニカルチューブに入れ、クリーンベンチに運んだ。摘出した脾臓は、すぐに10 mlのDMEM+とともに空のシャーレに移し、少し洗浄した後、すぐにDMEM+を10 ml入れた別のシャーレに移し、洗浄しながら周りの脂肪をハサミとピンセットを用いて取り除いた。この洗浄をあと3回繰り返し行った。また、最後のシャーレにステンレスメッシュをセットし、そこに脾臓を置いてラバーポリスマンで穏やかに砕いた。次に、脾細胞懸濁液を50 mlコニカルチューブに移した。さらに、ステンレスメッシュをセットしているシャーレを10 mlのDMEM+で洗浄し、その液を回収し、先ほどの50 mlコニカルチューブに加えた。この操作をチューブ内の液量が40 mlになるまで繰り返し、その懸濁液を2,000 rpm(800 g)で5分間遠心分離した後、細胞沈殿を5 mlのred blood cell lysing buffer(SIGMA社)で懸濁し、氷中で5分間静置することで赤血球を溶血させた。その後、素早くDMEM+を45 ml加え、合計50 mlにして混和し、2,000 rpm(800 g)で5分間遠心分離した後、得られた細胞沈殿を2.5 mlのDMEM+で懸濁することで脾臓細胞を調製した。
[3] Preparation of spleen cells The final immunized mouse was placed in a glass bottle filled with isoflurane and anesthetized by inhalation. After confirming that the mouse was anesthetized, it was fixed on a dissecting table with a syringe needle. After disinfecting the mouse abdomen with absorbent cotton soaked in 70% ethanol, the outer skin near the center of the abdomen was picked up with tweezers, an incision was made in the outer skin with dissecting scissors, and the incision was extended to the vicinity of the heart. Next, the endothelium near the ribs was pinched with forceps, the chest was opened until the heart was visible, and blood was collected from the heart using a 5 ml syringe. Thereafter, the mice from which heart blood was collected were sterilized by immersing them in a beaker containing 70% ethanol, and placed on aluminum foil placed in a clean bench. To remove the spleen, a cut was made in the integument on the left flank of the mouse using dissecting scissors, and the integument was expanded until the spleen was visible. Then, the endothelium was cut to expose the spleen. Next, the fat near the spleen was grabbed with forceps, lifted up along with the spleen, and the fat around the spleen was cut with scissors and removed from the mouse. A series of operations for splenectomy were all performed aseptically. The removed spleen was placed in a 15 ml conical tube containing 10 ml of DMEM + [Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) + 100 μg/ml kanamycin sulfate (Meiji Seika Co., Ltd.]] and transported to a clean bench. . Immediately transfer the removed spleen to an empty Petri dish with 10 ml of DMEM + , wash it a little, then immediately transfer it to another Petri dish containing 10 ml of DMEM + , and remove the surrounding fat with scissors and tweezers while washing. It was removed using This washing was repeated three more times. In addition, a stainless steel mesh was set in the final Petri dish, and the spleen was placed there and gently crushed with a rubber policeman. The splenocyte suspension was then transferred to a 50 ml conical tube. Furthermore, the Petri dish containing the stainless steel mesh was washed with 10 ml of DMEM + , and the liquid was collected and added to the 50 ml conical tube. Repeat this operation until the volume in the tube reaches 40 ml, centrifuge the suspension at 2,000 rpm (800 g) for 5 minutes, and transfer the cell pellet to 5 ml of red blood cell lysing buffer (SIGMA). The red blood cells were hemolyzed by suspending them in water and leaving them on ice for 5 minutes. Then, quickly add 45 ml of DMEM + to make a total of 50 ml, mix, and centrifuge at 2,000 rpm (800 g) for 5 minutes. Cells were prepared.
[4]ビオチン化抗原の作製
ヒトミオグロビン(hMyo)をPBS pH7.2に溶解し,最終濃度が1 mg/mLとなるようにした。NHS-ビオチン(1 mg/1 mL DMSO)を0.9, 3.75, 4, 7.5, 30倍モル当量でhMyo溶液に加え、室温で30分間穏やかに回転させてビオチン化した。ビオチン化後、グリシンを最終濃度20 mMになるように添加し、反応を停止させた。
[4] Preparation of biotinylated antigen Human myoglobin (hMyo) was dissolved in PBS pH 7.2 to a final concentration of 1 mg/mL. NHS-biotin (1 mg/1 mL DMSO) was added to the hMyo solution at 0.9, 3.75, 4, 7.5, and 30 times molar equivalents and biotinylated by gentle rotation at room temperature for 30 minutes. After biotinylation, glycine was added to a final concentration of 20 mM to stop the reaction.
[5]BCT法
(1)最適化BCT法
感作Bリンパ球を保有する脾臓細胞(5.0×107から1.0×108)を2.5 mL DMEM+に懸濁させた。別の2.5 mLのDMEM+に溶解した最適化ビオチン化抗原50 μg(3.75~7.5倍モル当量)を、上記脾臓細胞懸濁液2.5 mLと混合し、4℃で2時間穏やかに回転させた。その後、細胞懸濁液を2,000 rpm(800 g)で5分間遠心し、10 mL DMEM+で洗浄した。脾臓細胞ペレットを2.5 mL DMEM+に再懸濁した。200 μgのストレプトアビジンを含む別の2.5 mL DMEM+を脾臓細胞懸濁液に加え、4℃で1時間穏やかに回転させた。最後に、細胞懸濁液を2,000 rpm(800 g)で5分間遠心し、10 mL DMEM+で洗浄した。脾臓細胞ペレットを5 mL DMEM+に再懸濁した。ここで、B細胞-抗原-ビオチン-ストレプトアビジン複合体が形成された。ミエローマ細胞(2.0×107から4.0×107)を800 rpm(130 g)で5分間遠心分離して集め、10 mL滅菌PBS(PBS+)で洗浄した。ミエローマ細胞ペレットを5 mL PBS+に懸濁し、10 μL NHS-ビオチン(30 μL DMFあたり1 mg)を含む5 mL PBSと混合し、37 ℃で30分間緩やかに回転させた。ビオチン化したミエローマ細胞を800 rpm(130 g)で5分間遠心分離してペレット化し、10 mL DMEM+で洗浄した。B細胞-抗原-ビオチン-ストレプトアビジン複合体を含む脾臓細胞懸濁液を、ビオチン化ミエローマ細胞と4:1(脾臓細胞ミエローマ細胞)の割合で混合し、1000 rpm(200 g)で10分間遠心分離して5 mL DMEM+に再懸濁した。この細胞混合物を室温で0.5~1時間穏やかに回転させた。ビオチンとストレプトアビジンの強い特異的な相互作用により、Bリンパ球はビオチン化ミエローマ細胞に結合した。B細胞-ミエローマ細胞複合体は、0.25 Mスクロース、2 mM NaH2PO4/Na2HPO4(pH = 7.2)、0.1 mM MgCl2および0.1 mM CaCl2からなる等張スクロースバッファーの1~2mLに再懸濁された。B細胞-ミエローマ細胞複合体は、電気パルス(10 μsec、2.0 kV/cmから3.0 kV/cm、1秒間隔で4サイクル)により選択的に融合された。融合したハイブリドーマ細胞は、HAT選択培地で2週間、HT培地でさらに2週間培養した。
(2)従来のBCT法
従来のBCT法は、30倍モル当量のビオチン化抗原を使用した以外は、基本的に最適化BCT技術と同じプロトコルで実施した。
[5] BCT method (1) Optimized BCT method Spleen cells (5.0×10 7 to 1.0×10 8 ) containing sensitized B lymphocytes were suspended in 2.5 mL DMEM + . 50 μg of optimized biotinylated antigen (3.75-7.5 times molar equivalent) dissolved in another 2.5 mL of DMEM + was mixed with 2.5 mL of the above splenocyte suspension and gently rotated for 2 hours at 4°C. The cell suspension was then centrifuged at 2,000 rpm (800 g) for 5 min and washed with 10 mL DMEM + . The splenocyte pellet was resuspended in 2.5 mL DMEM + . Another 2.5 mL DMEM + containing 200 μg of streptavidin was added to the splenocyte suspension and gently rotated for 1 h at 4 °C. Finally, the cell suspension was centrifuged at 2,000 rpm (800 g) for 5 min and washed with 10 mL DMEM + . The splenocyte pellet was resuspended in 5 mL DMEM + . Here, a B cell-antigen-biotin-streptavidin complex was formed. Myeloma cells (2.0×10 7 to 4.0×10 7 ) were collected by centrifugation at 800 rpm (130 g) for 5 min and washed with 10 mL sterile PBS (PBS + ). Myeloma cell pellets were suspended in 5 mL PBS + , mixed with 5 mL PBS containing 10 μL NHS-biotin (1 mg per 30 μL DMF), and gently rotated for 30 min at 37 °C. Biotinylated myeloma cells were pelleted by centrifugation at 800 rpm (130 g) for 5 min and washed with 10 mL DMEM + . Splenocyte suspension containing B cell-antigen-biotin-streptavidin complexes was mixed with biotinylated myeloma cells at a ratio of 4:1 (spleen cell myeloma cells) and centrifuged at 1000 rpm (200 g) for 10 min. Separate and resuspend in 5 mL DMEM + . The cell mixture was gently rotated for 0.5-1 hour at room temperature. B lymphocytes bound to biotinylated myeloma cells due to the strong and specific interaction of biotin and streptavidin. B cell-myeloma cell complexes were added to 1-2 mL of isotonic sucrose buffer consisting of 0.25 M sucrose, 2 mM NaH2PO4 / Na2HPO4 (pH = 7.2 ), 0.1 mM MgCl2 , and 0.1 mM CaCl2 . resuspended. B cell-myeloma cell complexes were selectively fused by electrical pulses (10 μsec, 2.0 kV/cm to 3.0 kV/cm, 4 cycles at 1 second intervals). The fused hybridoma cells were cultured in HAT selection medium for 2 weeks and HT medium for an additional 2 weeks.
(2) Conventional BCT method The conventional BCT method was basically performed using the same protocol as the optimized BCT technique, except that a 30-fold molar equivalent of biotinylated antigen was used.
[6]PEG法
DMEM+に懸濁した感作Bリンパ球を含む脾臓細胞(5.0x107から1.0x108)とマウスミエローマ細胞を10:1の割合(脾臓細胞:ミエローマ細胞)で混ぜ、1,000 rpm(200 g)で10分間遠心分離をした。上清を除去した後、細胞ペレットに1 mL 50%(wt/vol)ポリエチレングリコール4000を1分かけて滴下し、細胞を融合させた。10 mL DMEM+を添加した後、1,000 rpm(200 g)で10分間遠心し、上清を完全に除去した。その後、HAT選択培地で2週間、HT培地でさらに2週間培養した。
[6] PEG method
Mix spleen cells ( 5.0x107 to 1.0x108 ) containing sensitized B lymphocytes suspended in DMEM + and mouse myeloma cells at a ratio of 10:1 (spleen cells: myeloma cells) at 1,000 rpm (200 g). Centrifuged for 10 minutes. After removing the supernatant, 1
[7]ハイブリドーマ細胞のクローニング
限界希釈法を用いて、ハイブリドーマ細胞を9、3、1、0.5細胞/wellに希釈し、96 wellプレートに播種し,37 ℃、5 %炭酸ガスインキュベーター内で培養した。
[7] Cloning of hybridoma cells Using the limiting dilution method, hybridoma cells were diluted to 9, 3, 1, and 0.5 cells/well, seeded in a 96-well plate, and cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37°C. .
[8]ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)法
抗原を0.1M NaHCO3で1~10 μg/mlに希釈し、96 wellプレートに50 μl/wellずつ加え、4 ℃で一晩静置することにより、抗原をプレートに吸着させた。次に、プレートをPBSで3回洗浄し、1%ゼラチン(1g/100ml PBS)を350 μl/well加えて37℃で2時間インキュベートしブロッキングを行った。その後、PBST(PBS+0.05% Triton X-100)で3回洗浄し、一次抗体としてハイブリドーマ細胞の培養上清を50 μl/well加えて37℃で1時間インキュベートした。続いてPBSTで3回洗浄後、PBSTで10,000倍に希釈した二次抗体(HRPを結合した抗マウスIgG(H+L)抗体)を50 μl/well加え、37 ℃で1時間インキュベートした。最後に、PBSTで5回洗浄後、発色剤[0.1M sodium citrate buffer(pH5.2)+o-phenylene diamine(1mg/ml)+0.02% H2O2]を100 μl/well加えて37℃で10分間インキュベートし、1M H2SO4を50 μl/well加えて反応を停止した。プレートリーターを用いてOD490nmの測定を行った。
[8] ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) method Dilute the antigen to 1-10 μg/ml with 0.1M NaHCO 3 , add 50 μl/well to a 96-well plate, and leave it at 4°C overnight. , the antigen was adsorbed onto the plate. Next, the plate was washed three times with PBS, 350 μl/well of 1% gelatin (1 g/100 ml PBS) was added, and blocking was performed by incubating at 37° C. for 2 hours. Thereafter, the wells were washed three times with PBST (PBS + 0.05% Triton Subsequently, after washing three times with PBST, 50 μl/well of a secondary antibody (HRP-conjugated anti-mouse IgG (H+L) antibody) diluted 10,000 times with PBST was added and incubated at 37° C. for 1 hour. Finally, after washing 5 times with PBST, add 100 μl/well of coloring agent [0.1M sodium citrate buffer (pH 5.2) + o-phenylene diamine (1 mg/ml) + 0.02% H 2 O 2 ] at 37°C. After incubating for 10 minutes, 50 μl/well of 1M H 2 SO 4 was added to stop the reaction. OD490nm was measured using a plate reader.
[9]エピトープマッピング
抗hMyo抗体のエピトープを同定するために、hMyo抗原ペプチドを用いたエピトープマッピングを実施した。hMyoの配列(配列番号1)に基づき、5アミノ酸残基ずつオーバーラップする10アミノ酸残基のペプチドを1番から30番まで用意し、そのN末端をビオチン化した。ビオチン化したペプチドをストレプトアビジンコートした96 wellプレートに固定化した。一次抗体として、PEG法および最適化BCT法で作製した抗hMyo抗体を使用してELISA法を実施した。図1にhMyo抗原のペプチド配列を示した。マウスとヒトで異なるアミノ酸は太い黒枠と太字で示されている。
[9] Epitope Mapping In order to identify the epitope of the anti-hMyo antibody, epitope mapping was performed using the hMyo antigen peptide. Based on the sequence of hMyo (SEQ ID NO: 1), peptides of 10 amino acid residues overlapping by 5 amino acid residues were prepared from No. 1 to No. 30, and their N-terminals were biotinylated. The biotinylated peptide was immobilized on a streptavidin-coated 96-well plate. ELISA was performed using an anti-hMyo antibody prepared by the PEG method and the optimized BCT method as the primary antibody. Figure 1 shows the peptide sequence of hMyo antigen. Amino acids that differ between mice and humans are shown in thick black frames and bold type.
[10]エピトープビニングアッセイ
エピトープビニングアッセイは、Octet 384 Red system (Sartorius)を用いて実施した。すべてのステップは、各ウェルに100 μLの溶液を含む384 wellプレートで、30℃、1,000 rpmで振とうして行われた。抗体と抗原の希釈と洗浄には、PBSを使用した。一次モノクローナル抗体(1st Ab 200nM)を抗マウスIgG Fc capture(AMC)バイオセンサーに200秒間ロードし、その後30秒間洗浄した。その後、反応に無関係なマウスIgG抗体(333 nM)をAMCバイオセンサーに加え、300秒間AMCバイオセンサーをブロッキングし、60秒間の洗浄を行った。hMyo抗原(200 nM)と二次モノクローナル抗体(2nd Ab 200 nM)は、あらかじめ室温で4時間プレミックスしておいた。hMyo抗原が2nd Abに完全に飽和した後、最終ステップで200秒反応させた。
[10] Epitope binning assay Epitope binning assay was performed using Octet 384 Red system (Sartorius). All steps were performed in 384-well plates containing 100 μL of solution in each well at 30°C with shaking at 1,000 rpm. PBS was used for diluting and washing antibodies and antigens. The primary monoclonal antibody (1st Ab 200 nM) was loaded onto the anti-mouse IgG Fc capture (AMC) biosensor for 200 seconds, followed by a 30 second wash. Then, a mouse IgG antibody (333 nM) irrelevant to the reaction was added to the AMC biosensor to block the AMC biosensor for 300 seconds, followed by a 60 second wash. hMyo antigen (200 nM) and secondary monoclonal antibody (2nd Ab 200 nM) were premixed at room temperature for 4 hours. After the hMyo antigen was completely saturated with the 2nd Ab, the reaction was performed for 200 seconds in the final step.
<結果>
評価結果1:
エピトープマッピング結果
抗hMyoモノクローナル抗体のエピトープマッピングを行い、各モノクローナル抗体のエピトープを解析した。結果を表1に示した。PEG法で作製した抗hMyoモノクローナル抗体のエピトープの多くはペプチド番号9または8-9であり、最適化BCT法で作製したモノクローナル抗体はペプチド番号5と15であった。このように、両者のモノクローナル抗体はエピトープが全く異なるものであった。しかしながら、PEG法および最適化BCT法の免疫で得られたマウス抗血清のエピトープを同様に調べた結果では、抗血清はペプチド番号8-9領域に強く反応した(表2)。PEG法によるランダム融合で得られたモノクローナル抗体については、ペプチド番号8-9領域に抗体産生Bリンパ球が多く存在するために、抗血清が強く反応する部位と同じ部位が優先的に樹立されたと考えられる。逆に、最適化BCT法では、ペプチド番号9または8-9以外と反応するモノクローナル抗体が選択的に産生された。結果として、PEG法では決して得られないペプチド番号15に反応するモノクローナル抗体を樹立することができた。この要因は、最適化BCT法において、B細胞選択に使用したビオチン化抗原が関係している。ビオチン化hMyo抗原をLC-MS分析したところ、主にN末端アミノ基と42番目と63番目のリジン残基がビオチン化されていることがわかった(図1)。42番目のリジン残基はペプチド番号8と9に含まれる部位であり、このビオチン化は最適化BCT法においてペプチド番号8-9へ結合する抗体産生B細胞の選択を阻害した。その結果、最適化BCT法のペプチド番号8および9以外の配列に結合するモノクローナル抗体が優先的に作製可能となった。
<Results>
Evaluation result 1:
Epitope mapping results Epitope mapping of anti-hMyo monoclonal antibodies was performed, and the epitope of each monoclonal antibody was analyzed. The results are shown in Table 1. Most of the epitopes of the anti-hMyo monoclonal antibodies produced by the PEG method were
評価結果2:
エピトープビニングアッセイ結果
最適化BCT法とPEG法から得られたモノクローナル抗体を用いてhMyo抗原をサンドイッチできる組み合わせをエピトープビニングアッセイで測定した。エピトープビニングアッセイによる測定の模式図を図2Aに示した。簡単に説明すると、抗マウスIgG Fc Capture (AMC)バイオセンサーで一次モノクローナル抗体を補捉した後(ステップ1)、センサーグラムを洗浄した(ステップ2)。その後、反応に無関係なマウスIgG抗体をAMCセンサーに添加してブロッキングを行い(ステップ3)、洗浄を行った(ステップ4)。最後に、hMyo抗原をプレミックスした二次モノクローナル抗体を添加し、反応させた(ステップ5)。エピトープビニングアッセイの典型的な測定パターンを図2Bに示した。ステップ5において、モノクローナル抗体の組み合わせがhMyo抗原をサンドイッチできた場合、モノクローナル抗体の親和性に応じて、センサーグラムは定量的に増加したことがわかる。測定結果のBinding rate (nm)から反応の強弱を0.50 nm < sss、0.45 nm < ss < 0.50 nm、0.40 nm < s < 0.45 nm、0.15 nm < w < 0.40 nm、No response < 0.15 nmとして定義した。エピトープビニングアッセイの測定結果を図3にマトリックスにより示した。図3中、「1st mAb」及び「2nd mAb」の欄の「5」、「9」、「15」、「17」は上記のペプチド番号を示す。同じエピトープを保有する抗体ペアは、「No response (無反応)」で示し、異なるエピトープを保有する抗体ペアは、抗原をサンドイッチすることができ、「w」、「s」、「ss」、「sss」で示した。また、未知のエピトープに対する抗体のペアは、抗原をサンドイッチできる場合とそうでない場合があった。ここには、すべての組み合わせを示してはいないが、PEG法では数多くのモノクローナル抗体を作製できたが、そのほとんどが同じエピトープ(ペプチド9または8-9)を保有していたため、サンドイッチできる組み合わせが少なかった。一方で、最適化BCT法で作製したモノクローナル抗体は、希少なペプチド5やPEG法では得られなかった15に結合するエピトープを保有しており、一次抗体または両方に最適化BCT法のモノクローナル抗体を使用した場合、sssやssの強い反応性を確認できた。その中でも、共に最適化BCT法で獲得した一次抗体4F-1-5Mと二次抗体H4-2-B2の組み合わせは最も強い反応性を示した。最適化BCT法で得られるモノクローナル抗体は、高い親和性を有していることが判明した。
Evaluation result 2:
Epitope binning assay results Combinations that can sandwich hMyo antigen using monoclonal antibodies obtained from the optimized BCT method and PEG method were determined by epitope binning assay. A schematic diagram of measurement by epitope binning assay is shown in FIG. 2A. Briefly, after capturing the primary monoclonal antibody with an anti-mouse IgG Fc Capture (AMC) biosensor (step 1), the sensorgram was washed (step 2). Thereafter, a mouse IgG antibody unrelated to the reaction was added to the AMC sensor for blocking (Step 3), followed by washing (Step 4). Finally, a secondary monoclonal antibody premixed with hMyo antigen was added and reacted (Step 5). A typical measurement pattern of the epitope binning assay is shown in FIG. 2B. In
これらの結果に基づき、本発明により、一般的なPEG法では得られにくいマイナーで重要なエピトープに結合するモノクローナル抗体を高効率で作製することに成功し、さらに、それらのモノクローナル抗体は高親和性を有している有望なものであると結論づける。 Based on these results, the present invention has succeeded in producing monoclonal antibodies with high efficiency that bind to minor and important epitopes that are difficult to obtain with the general PEG method, and furthermore, these monoclonal antibodies have high affinity. We conclude that it is a promising product with the following characteristics.
本発明の方法で得たモノクローナル抗体を高感度な物質測定に用いることができる。 Monoclonal antibodies obtained by the method of the present invention can be used for highly sensitive substance measurements.
Claims (7)
1)B細胞表面に発現された抗原特異的レセプターとビオチン化抗原とを結合させて、B細胞-ビオチン化抗原複合体とした後、ストレプトアビジンを結合してB細胞-ビオチン化抗原-ストレプトアビジン複合体を作製するB細胞修飾工程、
2)ミエローマ細胞とビオチンとを結合してビオチン化ミエローマ細胞を作製するミエローマ細胞修飾工程、
3)前記B細胞-ビオチン化抗原-ストレプトアビジン複合体とビオチン化ミエローマ細胞とをビオチン-アビジン反応により架橋させてB細胞-ミエローマ細胞を得る細胞架橋工程、
4)B細胞-ミエローマ細胞からハイブリドーマを得るハイブリドーマ作製工程。 Hybridoma production method including the following steps 1) to 4):
1) The antigen-specific receptor expressed on the surface of B cells and biotinylated antigen are combined to form a B cell-biotinylated antigen complex, and then streptavidin is combined to form B cell-biotinylated antigen-streptavidin. B cell modification step to create a complex;
2) myeloma cell modification step of binding myeloma cells and biotin to produce biotinylated myeloma cells;
3) a cell cross-linking step of cross-linking the B cell-biotinylated antigen-streptavidin complex and biotinylated myeloma cells by a biotin-avidin reaction to obtain B cells-myeloma cells;
4) Hybridoma production process to obtain hybridomas from B cells and myeloma cells.
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