JP2023177624A - Periodontitis risk estimation method and kit - Google Patents
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Abstract
Description
特許法第３０条第２項適用申請有り （その１） ウェブサイトの掲載日 ２０２２年３月３０日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ａｐｏｌｌｏｎ．ｎｔａ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｐｓ６５／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ａｐｏｌｌｏｎ．ｎｔａ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｐｓ６５／ｓｈｏｒｏｋｕ．ｈｔｍｌ （その２） 頒布日 ２０２２年４月１５日 刊行物 第６５回春季日本歯周病学会学術大会 抄録集Application for application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act (Part 1) Website publication date March 30, 2022 Website address https://web. apollon. nta. co. jp/jsps65/index. html https://web. apollon. nta. co. jp/jsps65/shoroku. html (Part 2) Distribution date: April 15, 2022 Publication: Abstracts of the 65th Spring Academic Conference of the Japanese Society of Periodontology
本開示は、歯周病のリスクを推定する方法、及び当該方法に用いるキット、等に関する。なお、本明細書に記載される全ての文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。 The present disclosure relates to a method for estimating the risk of periodontal disease, a kit used for the method, and the like. In addition, the contents of all documents described in this specification are incorporated into this specification by reference.
歯周病では、まず歯肉炎が起き、その後歯周炎へと進行する。歯肉に限局した炎症が歯肉炎であり、他の歯周組織に及ぶ炎症と組織破壊が生じている症状が歯周炎である。 Periodontal disease begins with gingivitis, which then progresses to periodontitis. Gingivitis is inflammation localized to the gums, and periodontitis is a condition in which inflammation and tissue destruction occurs in other periodontal tissues.
歯周病のリスク、予防、及び治療等については、これまでも多くの検討がなされてきている（例えば特許文献１）。しかし、特許文献１では、歯肉炎と歯周炎とを区別して進行リスクを検討してはいない。なお、歯肉炎の段階で歯周炎への進行リスクを測定できる手段の開発が試みられている（特許文献２）。 Many studies have been made regarding the risk, prevention, treatment, etc. of periodontal disease (for example, Patent Document 1). However, Patent Document 1 does not distinguish between gingivitis and periodontitis and examine the risk of progression. Note that attempts have been made to develop a means for measuring the risk of progression to periodontitis at the stage of gingivitis (Patent Document 2).
歯肉炎の段階であれば、歯周病菌を殺菌するなどすることで元の健康な状態へと回復することも可能である。歯周炎にまで進行した場合は、歯周炎とは異なる処置を行うことが好ましい場合も多い。このため、適切な処置を行うためには、歯周病に罹患しているのか、罹患しているとしても、そのステージが歯肉炎であるのか歯周炎であるのか、を推定若しくは確認することが求められる。そこで、本発明者らは、歯周病罹患の有無や、罹患者のステージ（歯肉炎か歯周炎か）、いうなれば歯周病のリスク、を簡便に推定可能な手法を開発すべく検討を行った。 If the tooth is in the gingivitis stage, it is possible to restore the tooth to its original healthy state by sterilizing the periodontal disease bacteria. When the disease progresses to periodontitis, it is often preferable to perform treatment different from that for periodontitis. Therefore, in order to take appropriate treatment, it is necessary to estimate or confirm whether you are suffering from periodontal disease, and even if you are, whether the stage is gingivitis or periodontitis. is required. Therefore, the present inventors conducted research to develop a method that can easily estimate the presence or absence of periodontal disease, the stage of the patient (gingivitis or periodontitis), and, in other words, the risk of periodontal disease. went.
本発明者らは、口腔内細菌におけるFusobacterium nucleatum（フゾバクテリウム ヌクレアタム：Fn菌）の存在割合と、レッドコンプレックス菌存在割合とを指標とすることで、歯周病の進行度合いの推定が簡便に行い得る可能性を見いだし、さらに検討を重ねた。なお、レッドコンプレックス菌とは、非特許文献１において提唱される概念であり、具体的にはPorphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）をまとめた呼称である。本明細書においては、特に断らない限り、Fn菌とはFusobacterium nucleatum（フゾバクテリウム ヌクレアタム）を指し、また、レッドコンプレックス菌とは、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）を指す。 The present inventors have found that the degree of progression of periodontal disease can be easily estimated by using the proportion of Fusobacterium nucleatum (Fn bacterium) and the proportion of red complex bacteria in oral bacteria as indicators. We discovered the possibility and further considered it. The red complex bacteria is a concept proposed in Non-Patent Document 1, and specifically includes Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola. It is a name. In this specification, unless otherwise specified, Fn bacteria refers to Fusobacterium nucleatum, and red complex bacteria refers to Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema. Refers to denticola (Treponema denticola).
なお、歯周病と口腔内細菌叢の関係については、例えば、プラーク（歯垢）が歯周病の原因になり得ることが知られている。プラーク（歯垢）は、口腔内細菌が凝集したバイオフィルムである。大まかに言えば、次のようにしてプラークは形成される。すなわち、まず歯の表面に「ペリクル」という唾液や生理的歯肉溝浸出液由来のタンパクの薄い膜が形成され、当該ペリクルを介して連鎖球菌などの通性嫌気性菌（初期付着菌）が歯面に付着する。この初期付着菌にさまざまな口腔細菌と共凝集するFusobacterium(フゾバクテリウム)等の媒介細菌が付着し、さらに当該媒介細菌を介して嫌気性菌であるPorphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス・ジンジバリス）等の後期付着菌（特にレッドコンプレックス菌）が付着・凝集し、プラークは成熟する。特に、後期付着菌は歯周病の原因となり、歯周組織の破壊に直接的、間接的に関係することが知られている。 Regarding the relationship between periodontal disease and oral bacterial flora, it is known that, for example, plaque can be a cause of periodontal disease. Plaque is a biofilm made up of aggregated oral bacteria. Broadly speaking, plaque is formed as follows. That is, first, a thin film called a "pellicle" of proteins derived from saliva and physiological gingival crevicular fluid is formed on the tooth surface, and facultative anaerobes such as streptococcus (initial adhering bacteria) enter the tooth surface through this pellicle. Attach to. Vector bacteria such as Fusobacterium, which coagulates with various oral bacteria, adhere to this initial adhering bacteria, and later-stage adhesion of anaerobic bacteria such as Porphyromonas gingivalis occurs through the vector bacteria. Bacteria (especially red complex bacteria) attach and aggregate, and the plaque matures. In particular, late-adherent bacteria are known to cause periodontal disease and are directly or indirectly related to periodontal tissue destruction.
本開示は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
口腔内細菌におけるFusobacterium nucleatum（フゾバクテリウム ヌクレアタム）の存在割合とレッドコンプレックス菌存在割合とを測定するための試薬を備えたキットであって、
前記レッドコンプレックス菌が、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）である、
歯周炎のリスクを推定するためのキット。
項２．
Fusobacterium nucleatum（フゾバクテリウム ヌクレアタム）特異的増幅のためのプライマーセット、レッドコンプレックス菌特異的増幅のためのプライマーセット、及び１６ＳリボソームＲＮＡ特異的増幅のためのプライマーセット、を備えた、
前記レッドコンプレックス菌が、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）である、
歯周炎のリスクを推定するためのキット。
項３．
口腔内細菌におけるFusobacterium nucleatum（フゾバクテリウム ヌクレアタム）存在割合が１％以上若しくは０．２％未満の人のためのキットであって、
口腔内細菌におけるレッドコンプレックス菌存在割合を測定するための試薬を備え、
前記レッドコンプレックス菌が、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）である、
歯周炎のリスクを推定するためのキット。
項４．
口腔内細菌におけるFusobacterium nucleatum（フゾバクテリウム ヌクレアタム）存在割合が１％以上若しくは０．２％未満の人のためのキットであって、
レッドコンプレックス菌特異的増幅のためのプライマーセット、及び１６ＳリボソームＲＮＡ特異的増幅のためのプライマーセット、を備えた、
前記レッドコンプレックス菌が、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）である、
歯周炎のリスクを推定するためのキット。
項５．
ＢＭＩが２５以上の人のための、項１～４のいずれかに記載のキット。
項６．
歯周炎の進行度合いを推定するための、項１～４のいずれかに記載のキット。
This disclosure encompasses, for example, the subject matter described in the following sections.
Item 1.
A kit comprising reagents for measuring the proportion of Fusobacterium nucleatum and the proportion of red complex bacteria in oral bacteria, the kit comprising:
The red complex bacteria are Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola,
A kit for estimating the risk of periodontitis.
Item 2.
A primer set for Fusobacterium nucleatum (Fusobacterium nucleatum)-specific amplification, a primer set for Red Complex bacteria-specific amplification, and a primer set for 16S ribosomal RNA-specific amplification,
The red complex bacteria are Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola,
A kit for estimating the risk of periodontitis.
Item 3.
A kit for people in which the proportion of Fusobacterium nucleatum in oral bacteria is 1% or more or less than 0.2%,
Equipped with reagents for measuring the proportion of red complex bacteria present in oral bacteria,
The red complex bacteria are Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola,
A kit for estimating the risk of periodontitis.
Item 4.
A kit for people in which the proportion of Fusobacterium nucleatum in oral bacteria is 1% or more or less than 0.2%,
Equipped with a primer set for red complex bacteria-specific amplification and a primer set for 16S ribosomal RNA-specific amplification,
The red complex bacteria are Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola,
A kit for estimating the risk of periodontitis.
Item 5.
The kit according to any one of Items 1 to 4 for people with a BMI of 25 or more.
Item 6.
The kit according to any one of Items 1 to 4, for estimating the degree of progression of periodontitis.
歯周病罹患の有無や、罹患者のステージ（歯肉炎か歯周炎か）を簡便に推定可能な手法が提供される。 A method is provided that can easily estimate the presence or absence of periodontal disease and the stage of the patient (gingivitis or periodontitis).
以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。本開示は、歯周病のリスクを推定する方法、及び当該方法に用いるキット、等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本開示は本明細書に開示され当業者が認識できる全てを包含する。 Each embodiment included in the present disclosure will be described in further detail below. The present disclosure preferably includes, but is not limited to, a method for estimating the risk of periodontal disease, a kit used in the method, etc., and the present disclosure is disclosed herein and recognized by those skilled in the art. Inclusive of everything possible.
本発明に包含される歯周病リスク推定方法は、歯周病の進行度合いを推定する方法ということもできる。当該方法により、歯周病罹患の有無や、罹患者のステージ（歯肉炎か歯周炎か）を簡便に推定することができる。 The periodontal disease risk estimation method included in the present invention can also be called a method for estimating the degree of progress of periodontal disease. By this method, it is possible to easily estimate the presence or absence of periodontal disease and the stage of the patient (gingivitis or periodontitis).
当該方法では、口腔内細菌におけるFn菌の存在割合及びレッドコンプレックス菌存在割合を解析することにより、歯周病進行度合いを推定することができる。当該方法を、本開示の方法ということがある。より具体的には、被験者の口腔内細菌におけるFn菌の存在割合が三段階（≧１％、０．２％～１％未満、又は＜０．２％）のいずれに該当するか区分けし、さらに当該各段階においてレッドコンプレックス菌存在割合を三段階（≧１％、０．２％～１％未満、又は＜０．２％）で区分けする（すなわち、合計９群に分類する）ことによって、歯周病の進行度合いを推定することができる。どの区に分けられたかで、歯周病の進行度合いをある程度正確に推定できる。 In this method, the degree of periodontal disease progression can be estimated by analyzing the abundance ratio of Fn bacteria and red complex bacteria in oral bacteria. This method may be referred to as the method of the present disclosure. More specifically, the presence ratio of Fn bacteria in the oral bacteria of the subject is classified into three levels (≧1%, 0.2% to less than 1%, or <0.2%), Furthermore, in each stage, the red complex bacteria abundance ratio is divided into three stages (≧1%, 0.2% to less than 1%, or <0.2%) (that is, classified into a total of 9 groups). The degree of progression of periodontal disease can be estimated. The degree of progression of periodontal disease can be estimated with some degree of accuracy depending on which zone the periodontal disease is divided into.
当該方法による区分けによれば、具体的には以下の９区に分けられる。
（１Ａ）Fn菌存在割合が≧１％、レッドコンプレックス菌存在割合が≧１％
（１Ｂ）Fn菌存在割合が≧１％、レッドコンプレックス菌存在割合が０．２％以上１％未満
（１Ｃ）Fn菌存在割合が≧１％、レッドコンプレックス菌存在割合が＜０．２％
（２Ａ）Fn菌存在割合が０．２％以上１％未満、レッドコンプレックス菌存在割合が≧１％
（２Ｂ）Fn菌存在割合が０．２％以上１％未満、レッドコンプレックス菌存在割合が０．２％以上１％未満
（２Ｃ）Fn菌存在割合が０．２％以上１％未満、レッドコンプレックス菌存在割合が＜０．２％
（３Ａ）Fn菌存在割合が＜０．２％、レッドコンプレックス菌存在割合が≧１％
（３Ｂ）Fn菌存在割合が＜０．２％、レッドコンプレックス菌存在割合が０．２％以上１％未満
（３Ｃ）Fn菌存在割合が＜０．２％、レッドコンプレックス菌存在割合が＜０．２％
この区分けにおいて、Fn菌存在割合が高い程、またレッドコンプレックス菌存在割合が高い程、歯周病の進行度合いが高いと推定することができる。最も歯周病進行度合いが高いのは（１Ａ）であり、最も歯周病進行度合いが低いのは（３Ｃ）である。
According to the classification method, it is specifically divided into the following nine districts.
(1A) The percentage of Fn bacteria present is ≧1%, and the percentage of red complex bacteria is ≧1%.
(1B) The proportion of Fn bacteria present is ≧1%, the proportion of red complex bacteria is 0.2% or more and less than 1% (1C) The proportion of Fn bacteria present is ≧1%, the proportion of red complex bacteria is <0.2%
(2A) Fn bacteria presence rate is 0.2% or more and less than 1%, red complex bacteria presence rate is ≧1%
(2B) Fn bacteria presence rate is 0.2% or more and less than 1%, red complex bacteria presence rate is 0.2% or more and less than 1% (2C) Fn bacteria presence rate is 0.2% or more and less than 1%, red complex Bacteria presence rate is <0.2%
(3A) The proportion of Fn bacteria present is <0.2%, the proportion of red complex bacteria present is ≧1%
(3B) The proportion of Fn bacteria present is <0.2%, the proportion of red complex bacteria is 0.2% or more and less than 1% (3C) The proportion of Fn bacteria present is <0.2%, the proportion of red complex bacteria is <0 .2%
In this classification, it can be estimated that the higher the proportion of Fn bacteria and the higher the proportion of red complex bacteria, the higher the degree of progress of periodontal disease. The condition with the highest degree of periodontal disease progression is (1A), and the condition with the lowest degree of periodontal disease progression is (3C).
例えば、Fn菌存在割合による区分けに、レッドコンプレックス菌存在割合ではなくPorphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）の存在割合による区分けを組み合わせても、本開示の方法ほどの正確な推定は難しく、Fn菌存在割合による区分けにレッドコンプレックス菌存在割合による区分けを組み合わせることが本開示の方法の特徴の一つと言うことができる。 For example, even if you combine the classification based on the Fn bacteria abundance ratio with the classification based on the abundance ratio of Porphyromonas gingivalis instead of the red complex bacteria abundance ratio, it is difficult to estimate as accurately as the method of the present disclosure, and it is difficult to estimate the presence of Fn bacteria. It can be said that one of the characteristics of the method of the present disclosure is that the classification based on the ratio is combined with the classification based on the proportion of red complex bacteria present.
また、本開示の方法においては、上記フゾ菌存在割合による区分け及びレッドコンプレックス菌存在割合による区分けの組み合わせ（「基本区分け組み合わせ」ということがある）に、さらに別要因による区分けを組み合わせることもできる。このような別要因としては、ＢＭＩ（Body Mass Index）、デンタルフロス使用有無、歯間ブラシ使用有無、食事を食べる速さ、等が挙げられる。 Furthermore, in the method of the present disclosure, the above-mentioned combination of classification based on Fusobacterium abundance ratio and classification based on Red Complex bacteria abundance ratio (sometimes referred to as "basic classification combination") can be further combined with classification based on another factor. . Such other factors include BMI (Body Mass Index), use of dental floss, use of interdental brushes, speed of eating, and the like.
ＢＭＩについては、２５以上か２５未満かで区分けして、これを基本区分け組み合わせに更に組み合わせることが好ましい。また、デンタルフロス使用有無や、歯間ブラシ使用有無についても、これらの有り無しで区分けして、これを基本区分け組み合わせに更に組み合わせることが好ましい。また、食事を食べる速さについては、自己申告により、速いかそうでない（遅い若しくは普通）かで区分けして、これを基本区分け組み合わせに更に組み合わせることが好ましい。 Regarding BMI, it is preferable to classify it into 25 or more or less than 25 and further combine this into the basic classification combination. Furthermore, it is preferable to classify whether or not dental floss is used and whether to use an interdental brush, and to further combine these into the basic classification combination. Furthermore, it is preferable to self-report the eating speed and classify it into whether it is fast or not (slow or normal), and to further combine this into the basic classification combination.
本開示には、口腔内細菌におけるFn菌存在割合とレッドコンプレックス菌存在割合とを測定するためのキットも包含される。当該キットを、本開示のキットということがある。 The present disclosure also includes a kit for measuring the abundance ratio of Fn bacteria and red complex bacteria in oral bacteria. The kit may be referred to as the kit of the present disclosure.
本開示のキットは、口腔内細菌におけるFn菌存在割合とレッドコンプレックス菌存在割合とを測定するための試薬を備える。これは、本開示のキットには、口腔内細菌におけるFn菌存在割合とレッドコンプレックス菌存在割合とを測定する際に必要となる少なくとも１種の試薬が備わっているという意味であり、特に断らない限り、当該キットに備えられた試薬のみで口腔内細菌におけるFn菌存在割合とレッドコンプレックス菌存在割合とを測定できるという意味ではない。但し、本開示のキットは、（α）Fn菌存在割合を測定する際に必要となる試薬を少なくとも１種、及び（β）レッドコンプレックス菌存在割合を測定する際に必要となる試薬を少なくとも１種、備える。（α）試薬と（β）試薬は同一試薬であっても異なる試薬であってもよい。 The kit of the present disclosure includes reagents for measuring the abundance ratio of Fn bacteria and the abundance ratio of red complex bacteria in oral bacteria. This means that the kit of the present disclosure is equipped with at least one type of reagent necessary for measuring the abundance ratio of Fn bacteria and the abundance ratio of red complex bacteria in oral bacteria, and unless otherwise specified. However, this does not mean that the abundance ratio of Fn bacteria and red complex bacteria in oral bacteria can be measured using only the reagents provided in the kit. However, the kit of the present disclosure includes (α) at least one reagent necessary for measuring the proportion of Fn bacteria present, and (β) at least one reagent necessary for measuring the proportion of red complex bacteria present. Prepare the seeds. The (α) reagent and the (β) reagent may be the same reagent or different reagents.
（α）試薬としては、例えば、Fn菌特異的増幅のためのプライマーセット（「（α）プライマーセット」ということがある）が挙げられる。また、（β）試薬としては、例えば、レッドコンプレックス菌特異的増幅のためのプライマーセット（「（β）プライマーセット」ということがある）が挙げられる。なお、レッドコンプレックス菌特異的増幅のためのプライマーセットとは、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）のそれぞれを特異的に増幅可能な３組のプライマーセットのことである。また、これに加えて、本開示のキットは、１６ＳリボソームＲＮＡ特異的増幅のためのプライマーセットを備えることが好ましい。当該プライマーセットの増幅産物量は、口腔内細菌における総細菌量の指標となる。例えば、このようなプライマーセットを用いて、口腔内細菌叢を反映するサンプル（例えば唾液）中の核酸に対してＰＣＲ（好ましくリアルタイムＰＣＲ）を行い、得られる１６ＳリボソームＲＮＡ由来増幅産物量、Fn菌核酸由来増幅産物量、及びレッドコンプレックス菌核酸由来増幅産物量、から、口腔内細菌におけるFn菌存在割合とレッドコンプレックス菌存在割合とを算出することができる。 Examples of the (α) reagent include a primer set for Fn bacteria-specific amplification (sometimes referred to as “(α) primer set”). Further, examples of the (β) reagent include a primer set for red complex bacteria-specific amplification (sometimes referred to as a “(β) primer set”). The primer set for red complex bacteria-specific amplification is three sets that can specifically amplify each of Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola. This refers to the primer set. In addition, the kit of the present disclosure preferably includes a primer set for 16S ribosomal RNA-specific amplification. The amount of amplification products of the primer set is an indicator of the total amount of oral bacteria. For example, using such a primer set, PCR (preferably real-time PCR) is performed on nucleic acids in a sample (e.g. saliva) that reflects the oral flora, and the amount of 16S ribosomal RNA-derived amplification products obtained, Fn bacteria From the amount of nucleic acid-derived amplification products and the amount of red complex bacteria nucleic acid-derived amplification products, the abundance ratio of Fn bacteria and the abundance ratio of red complex bacteria in oral bacteria can be calculated.
本開示のキットは、Fn菌及びレッドコンプレックス菌の特異的なＤＮＡ断片が結合したチップを備えてもよい。当該チップに口腔内細菌叢を反映するサンプル（例えば唾液）中の核酸（ＤＮＡ）を適用することにより、Fn菌及びレッドコンプレックス菌由来のゲノムが、チップのＤＮＡ断片と結合することで、フゾ菌及びレッドコンプレックス菌の量を測定することができる。当該チップは、（α）試薬と（β）試薬とが同一試薬である場合の一例であるといえる。なお、口腔内細菌の総菌数としては、例えば口腔内細菌カウンタにより測定することができる。このようなカウンタとしては、例えば NP-BCM01-A（パナソニック株式会社）が挙げられる。 The kit of the present disclosure may include a chip to which specific DNA fragments of Fn bacteria and Red complex bacteria are bound. By applying nucleic acids (DNA) from a sample (e.g. saliva) that reflects the oral flora to the chip, the genomes derived from Fn bacteria and red complex bacteria combine with the DNA fragments on the chip, thereby creating a fusogenic effect. The amount of bacteria and red complex bacteria can be measured. This chip can be said to be an example of a case where the (α) reagent and the (β) reagent are the same reagent. Note that the total number of oral bacteria can be measured using, for example, an oral bacteria counter. An example of such a counter is NP-BCM01-A (Panasonic Corporation).
本開示はまた、口腔内細菌におけるFn菌存在割合が１％以上、０．２％以上１％未満、若しくは０．２％未満の人のためのキットであって、口腔内細菌におけるレッドコンプレックス菌存在割合を測定するための試薬を備えたキットも包含する。当該キットも、歯周炎のリスク（歯周炎の進行度合い）を推定するために好ましく用いることができる。これは、上記の通り、Fn菌存在割合及びレッドコンプレックス菌存在割合によって区分けすることにより、より正確に歯周炎のリスクを推定することができるようになるためである。なお、当該キットを、本開示のレッドコンプレックス菌用キットということがある。 The present disclosure also provides a kit for a person in which the percentage of Fn bacteria present in oral bacteria is 1% or more, 0.2% or more and less than 1%, or less than 0.2%, the kit comprising Fn bacteria in oral bacteria. Also included are kits that include reagents for determining the abundance. The kit can also be preferably used to estimate the risk of periodontitis (the degree of progression of periodontitis). This is because, as mentioned above, the risk of periodontitis can be estimated more accurately by classifying the proportions of Fn bacteria and red complex bacteria. Note that the kit may be referred to as the kit for red complex bacteria of the present disclosure.
本開示のレッドコンプレックス菌用キットは、上記（β）試薬を備える。よって、例えば、（β）プライマーセットや、レッドコンプレックス菌の特異的なＤＮＡ断片が結合したチップを備えていてもよい。また、当該チップは、前記フゾ菌及びレッドコンプレックス菌の特異的なＤＮＡ断片が結合したチップであってもよい。またあるいは、レッドコンプレックス菌が産生する酵素BANA分解酵素を利用して、コンプレックス菌の量を測定することができる歯周病原因菌酵素活性測定試薬を備えることも好ましい。このような試薬としては、市販品を利用することもでき、例えばアドチェック（アドテック株式会社製）に備わる試薬の１部又は全部を利用することもできる。 The kit for red complex bacteria of the present disclosure includes the above (β) reagent. Therefore, for example, it may be equipped with a (β) primer set or a chip to which a specific DNA fragment of a red complex bacterium is bound. Further, the chip may be a chip to which specific DNA fragments of the Fusobacteria and Red complex bacteria are bound. Alternatively, it is also preferable to include a periodontal disease-causing bacteria enzyme activity measuring reagent that can measure the amount of red complex bacteria by using the enzyme BANA degrading enzyme produced by red complex bacteria. As such a reagent, a commercially available product can be used, and for example, a part or all of the reagent provided in Adcheck (manufactured by Adtech Corporation) can also be used.
本開示のキットや、本開示のレッドコンプレックス菌用キットは、上述の区分けについての説明における別要因で先に区分けされた人のためにも、好ましく用いることができる。例えば、ＢＭＩが２５以上若しくは２５未満の人のために、これらのキットを好ましく用いることができる。 The kit of the present disclosure and the kit for red complex bacteria of the present disclosure can also be preferably used for people who have been previously classified due to other factors in the explanation of classification above. For example, these kits can be preferably used for people with a BMI of 25 or more or less than 25.
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件の任意の組み合わせを全て包含する。 Note that in this specification, the term "comprising" includes "consisting essentially of" and "consisting of." Additionally, the present disclosure encompasses any and all combinations of the features described herein.
また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。 Further, the various characteristics (properties, structures, functions, etc.) described for each embodiment of the present disclosure described above may be combined in any manner in order to specify the subject matter covered by the present disclosure. That is, the present disclosure encompasses all subject matter consisting of any and all combinations of the combinable features described herein.
以下、例を示して本開示の実施形態をより具体的に説明するが、本開示の実施形態は下記の例に限定されるものではない。なお、特に断らない限り、Fn菌とは、Fusobacterium nucleatum（フゾバクテリウム ヌクレアタム）のことである。また、レッドコンプレックス菌とは、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）をまとめた呼称である。 Hereinafter, embodiments of the present disclosure will be described in more detail by showing examples, but the embodiments of the present disclosure are not limited to the following examples. Note that unless otherwise specified, Fn bacteria refers to Fusobacterium nucleatum. Moreover, the red complex bacteria is a collective name for Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola.
各被験者（成人男性及び女性、合計６１１人）から唾液を採取し、次世代シークエンサーにより口腔内細菌叢を解析した。具体的には、各唾液中に存在する口腔内細菌由来のＤＮＡをシークエンスして、各口腔内細菌の存在割合を解析した。 Saliva was collected from each subject (adult male and female, 611 people in total), and the oral flora was analyzed using a next-generation sequencer. Specifically, DNA derived from oral bacteria present in each saliva was sequenced to analyze the abundance ratio of each oral bacteria.
被験者から回収した唾液検体から、QIAamp DNA Mini Kit（キアゲン）を用いて、DNAの抽出を行った。シークエンスライブラリーは16S rDNAのV3-V4領域をターゲットとして２つのステップのPCR法により増幅されたDNA溶液を用いた。まず第1ステップは、DNA溶液に含まれる細菌の16S rRNA遺伝子のV３～V４可変領域を増幅させた。具体的な方法は、下記のプライマーセットと２×KAPA HiFi HotStart Ready Mix （Kapa Biosystems）を用いて、PCR法により、核酸増幅反応を行った。反応液の組成は、下記に示した。増幅反応は、95℃で3分間加温させ、95℃-30秒、62.3℃-30秒、72℃-30秒を1サイクルとし、これを25回繰り返し、その後72℃-5分間加温させた。 DNA was extracted from the saliva samples collected from the subjects using the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). The sequence library used a DNA solution amplified by a two-step PCR method targeting the V3-V4 region of 16S rDNA. The first step was to amplify the V3-V4 variable region of the bacterial 16S rRNA gene contained in the DNA solution. Specifically, a nucleic acid amplification reaction was performed by PCR using the following primer set and 2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix (Kapa Biosystems). The composition of the reaction solution is shown below. For the amplification reaction, heat at 95°C for 3 minutes, one cycle of 95°C for 30 seconds, 62.3°C for 30 seconds, and 72°C for 30 seconds, repeat this 25 times, and then heat at 72°C for 5 minutes. Ta.
［プライマーセット］
フォワードプライマー：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG
リバースプライマー：GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC
[Primer set]
Forward primer: TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG
Reverse primer: GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC
［反応液の組成］
・DNA抽出された検体 10.5 μL
・16S V3 Forward primer 5μM 1.0 μL
・16S V4 Reverse primer 5μM 1.0 μL
・2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12.5 μL
25.0 μL
[Composition of reaction solution]
・DNA extracted sample 10.5 μL
・16S V3 Forward primer 5μM 1.0μL
・16S V4 Reverse primer 5μM 1.0μL
・2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12.5 μL
25.0μL
増幅された検体を、遊離プライマーとプライマーダイマーを取り除くために、マグネットビーズAMPureXP (ベックマンコールター)を用いて精製した。 The amplified specimen was purified using magnetic beads AMPureXP (Beckman Coulter) to remove free primers and primer dimers.
第2ステップとして、各検体を識別するために、各検体にデュアルインデックスおよびイルミナシークエンスアダプターを付加した。 As a second step, dual index and Illumina sequencing adapters were added to each specimen to identify each specimen.
精製して得られたPCR産物25μLを鋳型として、第2プライマーセット(Nextera XT Index Kit)を用いてデュアルインデックスおよびイルミナシークエンスアダプターを付加した。具体的な方法は、Nextera XT インデックスプライマー(イルミナ社)と２×KAPA HiFi HotStart Ready Mix（Kapa Biosystems）を用いて、PCR法により、核酸増幅反応を行った。反応液の組成は、下記に示した。増幅反応は、95℃で3分間加温させ、95℃-30秒、55℃-30秒、72℃-30秒を1サイクルとし、これを8回繰り返し、その後72℃-5分間加温させた。 Using 25 μL of the purified PCR product as a template, dual index and Illumina sequencing adapters were added using the second primer set (Nextera XT Index Kit). Specifically, a nucleic acid amplification reaction was performed by PCR using Nextera XT index primer (Illumina) and 2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix (Kapa Biosystems). The composition of the reaction solution is shown below. The amplification reaction was performed by heating at 95°C for 3 minutes, followed by 1 cycle of 95°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, and 72°C for 30 seconds, which was repeated 8 times, followed by heating at 72°C for 5 minutes. Ta.
［反応液の組成］
・第１ステップで得られた検体 5.0 μL
・Nextera XT Index Primer 1 5.0 μL
・Nextera XT Index Primer 2 5.0 μL
・2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix 25.0 μL
50.0 μL
[Composition of reaction solution]
・5.0 μL of sample obtained in the first step
・Nextera XT Index Primer 1 5.0 μL
・Nextera XT Index Primer 2 5.0 μL
・2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix 25.0 μL
50.0μL
増幅された検体を、遊離プライマーとプライマーダイマーを取り除くために、マグネットビーズAMPureXP (ベックマンコールター)を用いて精製した。精製後のPCR産物については、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit (Life Technologies社製)によりDNA濃度を測定した。それぞれの検体は、同じ濃度で希釈した後に、混合し、MiSeq v3 Reagent kit(イルミナ社)を用いて、MiSeqにてシークエンス解析を実施した。 The amplified specimen was purified using magnetic beads AMPureXP (Beckman Coulter) to remove free primers and primer dimers. The DNA concentration of the purified PCR product was measured using Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit (manufactured by Life Technologies). After diluting each sample to the same concentration, they were mixed, and sequence analysis was performed on MiSeq using MiSeq v3 Reagent kit (Illumina).
シークエンス解析によって得られたDNA配列は、QIIME（解析ソフト）を用いて、HOMD（Human Oral Microbial Database）データベースと97％以上相同性があった配列をピックアップして、相対的な細菌数として、検体毎に算出した。 Using QIIME (analysis software), sequences with 97% or more homology to the HOMD (Human Oral Microbial Database) database are picked up from the DNA sequence obtained through sequence analysis, and the relative number of bacteria in the sample is determined. Calculated for each.
また、各被験者が歯科検診を受けて得られたＣＰＩ(Community Periodontal Index)を用いて、口腔細菌叢との関連性について解析を行った。 In addition, using the CPI (Community Periodontal Index) obtained from each subject's dental checkup, we analyzed the relationship with oral bacterial flora.
なお、ＣＰＩは、歯周疾患の状態を示す指標として広く用いられており、歯と歯肉との間にできる隙間である歯周ポケットに、プローブ（探針）を差し込んで、歯肉出血・歯周ポケット・歯石の３指標により、コード０～４の５段階で評価される。
コード０：健全
コード１：出血
コード２：歯石沈着
コード３：浅い（４～５ｍｍ程度）歯周ポケット
コード４：深い（６ｍｍ以上）歯周ポケット
The CPI is widely used as an indicator of the state of periodontal disease, and a probe is inserted into the periodontal pocket, which is the gap between the teeth and the gums, to detect gingival bleeding and periodontal disease. It is evaluated on a five-point scale from code 0 to 4 based on the three indicators of pockets and tartar.
Code 0: Healthy code 1: Bleeding code 2: Tartar deposition code 3: Shallow (approximately 4 to 5 mm) periodontal pocket Code 4: Deep (more than 6 mm) periodontal pocket
口腔内細菌におけるFn菌存在割合（≧１％、０．２％～１％未満、又は＜０．２％）及びレッドコンプレックス菌存在割合（≧１％、０．２％～１％未満、又は＜０．２％）と、歯周病の状態（健康、歯肉炎、又は歯周炎）との関連性を解析した結果を、表１ａを示す。また、レッドコンプレックス菌存在割合の代わりに、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）の存在割合を解析に使用した場合の結果を、表１ｂに示す。なお、以下の表において「０．２～１％」は特に断らない限り「０．２％以上１％未満」を示す。 Fn bacteria presence rate (≧1%, 0.2% to less than 1%, or <0.2%) and red complex bacteria presence rate (≧1%, 0.2% to less than 1%, or Table 1a shows the results of an analysis of the relationship between periodontal disease (health, gingivitis, or periodontitis) and periodontal disease status (health, gingivitis, or periodontitis). Furthermore, Table 1b shows the results when the abundance ratio of Porphyromonas gingivalis was used in the analysis instead of the red complex bacteria abundance ratio. In the table below, "0.2 to 1%" means "0.2% or more and less than 1%" unless otherwise specified.
また、表１ａ及び表１ｂでは、解析結果を人数で示しているところ、割合（各群に振り分けられた人数を１００％とした時の百分率）で示した結果を、表２ａ及び表２ｂに示す。 In addition, Tables 1a and 1b show the analysis results in terms of number of people, whereas Tables 2a and 2b show the results in percentages (percentages when the number of people assigned to each group is 100%). .
これらの結果から明らかなように、まず口腔内細菌におけるFn菌存在割合を三段階（≧１％、０．２％～１％未満、又は＜０．２％）で分類し、さらに、このそれぞれの段階において、レッドコンプレックス菌存在割合を三段階（≧１％、０．２％～１％未満、又は＜０．２％）で分類すると、歯周病の状態（健康、歯肉炎、又は歯周炎）との関連性をよく表すことが分かった。つまり、Fn菌存在割合が高いほど、且つ、レッドコンプレックス菌割合が高いほど、歯周病の状態は悪くなる相関が得られた（表１ａ及び表２ａ）。一方で、レッドコンプレックス菌存在割合の代わりにPorphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）の存在割合を解析に使用した場合には、前述したような相関は得られなかった（表２ａ及び表２ｂ）。 As is clear from these results, we first categorized the proportion of Fn bacteria in oral bacteria into three levels (≧1%, 0.2% to less than 1%, or <0.2%), and then If the percentage of red complex bacteria is classified into three stages (≧1%, 0.2% to less than 1%, or <0.2%), the state of periodontal disease (healthy, gingivitis, or It was found that the relationship with periitis) was well expressed. In other words, a correlation was obtained in which the higher the percentage of Fn bacteria present and the higher the percentage of red complex bacteria, the worse the state of periodontal disease was (Tables 1a and 2a). On the other hand, when the abundance ratio of Porphyromonas gingivalis was used in the analysis instead of the abundance ratio of Red Complex bacteria, the above-mentioned correlation was not obtained (Tables 2a and 2b).
以上のことから、口腔内細菌におけるFn菌存在割合及びレッドコンプレックス菌存在割合を組み合わせて用いることで、被験者の歯周病リスクを推定することができると示唆された。 From the above, it was suggested that the risk of periodontal disease in subjects could be estimated by using a combination of the Fn bacteria abundance ratio and the Red Complex bacteria abundance ratio in oral bacteria.
またさらに、Fn菌存在割合の三段階（≧１％、０．２％～１％未満、又は＜０．２％）のそれぞれの段階において、ＢＭＩ（Body Mass Index）により更に分類（ＢＭＩが２５以上又は２５未満）して解析した。結果を表３ａ、３ｂ、及び３ｃに示す。なお、表３ａ～３ｃについては、上側に人数での解析結果を、下側に当該結果を割合（各群に振り分けられた人数を１００％とした時の百分率）で示した結果を、それぞれ示す。 Furthermore, in each of the three stages of Fn bacteria abundance ratio (≧1%, 0.2% to less than 1%, or <0.2%), it is further classified according to BMI (Body Mass Index) (BMI is 25%). or above or below 25). The results are shown in Tables 3a, 3b and 3c. In addition, for Tables 3a to 3c, the upper side shows the analysis results based on the number of people, and the lower side shows the results expressed as a percentage (percentage when the number of people assigned to each group is 100%). .
Fn菌存在割合の三段階（≧１％、０．２％～１％未満、又は＜０．２％）のそれぞれの段階において、ＢＭＩ（Body Mass Index）により更に分類（ＢＭＩが２５以上又は２５未満）して解析することにより、さらに好ましく被験者の歯周病リスクを推定することができるケースが得られた。例えば、Fn菌存在割合が０．２％～１％未満、又は＜０．２％であって、且つＢＭＩが２５未満である場合には、健康又は歯肉炎であることが多く、歯周炎まで進行している可能性は低いことが分かった。 In each of the three levels of Fn bacteria abundance ratio (≧1%, 0.2% to less than 1%, or <0.2%), it is further classified according to BMI (Body Mass Index) (BMI is 25 or more or 25% or more). A case was obtained in which it was possible to more preferably estimate the subject's periodontal disease risk by analyzing the results. For example, if the percentage of Fn bacteria is 0.2% to less than 1% or <0.2% and the BMI is less than 25, it is likely to be healthy or gingivitis, and periodontitis. It was found that there was a low possibility that the disease had progressed to that point.
またさらに、同様にして、Fn菌存在割合の三段階（≧１％、０．２％～１％未満、又は＜０．２％）のそれぞれの段階において、デンタルフロスの使用有無、歯間ブラシの使用有無、あるいは、食事を食べる速さ（自己申告）、により、さらに分類して解析した。結果を表４ａ～４ｃ、５ａ～５ｃ、及び６ａ～６ｃに、それぞれに示す。 Furthermore, in the same way, in each of the three stages of Fn bacteria abundance ratio (≧1%, 0.2% to less than 1%, or <0.2%), the use of dental floss and interdental brushing were determined. The analysis was further categorized according to the use or non-use of meals, or the speed at which food was eaten (self-reported). The results are shown in Tables 4a-4c, 5a-5c, and 6a-6c, respectively.
またさらに、Fn菌存在割合の三段階（≧１％、０．２％～１％未満、又は＜０．２％）のそれぞれの段階において、ＢＭＩ（Body Mass Index）により更に分類（ＢＭＩが２５以上又は２５未満）し、これ加えて、食事を食べる速さ（自己申告）、により、さらに分類して、解析した。結果を表７ａ～７ｃに示す。 Furthermore, in each of the three stages of Fn bacteria abundance ratio (≧1%, 0.2% to less than 1%, or <0.2%), it is further classified according to BMI (Body Mass Index) (BMI is 25%). In addition to this, they were further categorized and analyzed based on the speed at which they ate meals (self-reported). The results are shown in Tables 7a-7c.
上記の解析においては、唾液中に存在する口腔内細菌由来のＤＮＡを次世代シークエンサーによりシークエンスして、各口腔内細菌の存在割合を解析したが、他の方法によっても唾液中に存在する各細菌の存在割合を解析することができる。 In the above analysis, DNA derived from oral bacteria present in saliva was sequenced using a next-generation sequencer to analyze the abundance ratio of each oral bacteria. It is possible to analyze the abundance ratio of
フゾ菌及びレッドコンプレックス菌の量については、例えば、リアルタイムＰＣＲ法や、チェッカーボードＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション法を用いることができる。 As for the amount of Fusobacterium and Red Complex bacteria, for example, real-time PCR method or checkerboard DNA-DNA hybridization method can be used.
より具体的には、次のようにして、唾液中に存在する各細菌の存在割合を解析することができる。 More specifically, the abundance ratio of each bacteria present in saliva can be analyzed as follows.
Real-time PCR法
Real-time PCR法の検出には、SYBR Green I(Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)によるインターカレーター法を採用する。１ウェルごとに反応液は、2×Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) を使用し、50℃2分、95℃10分の後、40サイクル（95℃15秒、60℃1分）の増幅反応を行う。
Real-time PCR method
For detection using the Real-time PCR method, an intercalator method using SYBR Green I (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) is used. For each well, the reaction mixture was incubated at 50°C for 2 minutes, 95°C for 10 minutes, and then incubated for 40 cycles (95°C for 15 seconds, 60°C for 1 minute) using 2x Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Perform the amplification reaction.
なお、上記プライマーセットを用いて各種菌をリアルタイムＰＣＲで解析可能であることは、既に報告されている（例えば上記非特許文献２「Therapeutics and Clinical Risk Management 201713 307-314」、非特許文献３「Oral Diseases. 2020;26, 122-130」等を参照）。 In addition, it has already been reported that various bacteria can be analyzed by real-time PCR using the above primer set (for example, the above-mentioned non-patent document 2 "Therapeutics and Clinical Risk Management 201713 307-314", non-patent document 3 " Oral Diseases. 2020;26, 122-130, etc.)
Checkerboard DNA-DNA hybridization法
Fn菌及びレッドコンプレックス菌の特異的なＤＮＡ断片が結合したチップに、唾液検体２００μＬからQIAamp DNA Mini Kit（キアゲン）を用いてＤＮＡ抽出したサンプルを流し込み、サンプル中のFn菌及びレッドコンプレックス菌由来のゲノムが、チップのＤＮＡ断片と結合することで、フゾ菌及びレッドコンプレックス菌の量を測定する。
Checkerboard DNA-DNA hybridization method
A sample of DNA extracted from 200 μL of saliva sample using QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) is poured into a chip to which specific DNA fragments of Fn bacteria and red complex bacteria are bound, and the DNA fragments derived from Fn bacteria and red complex bacteria in the sample are poured into the chip. By combining the genome with the DNA fragment on the chip, the amount of Fusobacteria and Red Complex bacteria is measured.
酵素反応法
総菌数については、口腔内細菌カウンタ NP-BCM01-A（パナソニック株式会社）により測定することができる。
The total bacterial count using the enzyme reaction method can be measured using an oral bacteria counter NP-BCM01-A (Panasonic Corporation).
また、歯周病原因菌酵素活性測定キットであるアドチェック（アドテック株式会社）などにより、レッドコンプレックス菌が産生する酵素BANA分解酵素を利用して、コンプレックス菌の量を測定することができる。総菌数との結果により、レッドコンプレックス菌の割合を算出することができる。 Additionally, the amount of periodontal disease-causing bacteria enzyme activity measurement kit AdCheck (Adtech Co., Ltd.) can be used to measure the amount of complex bacteria using the enzyme BANA degrading enzyme produced by red complex bacteria. Based on the result and the total number of bacteria, the percentage of red complex bacteria can be calculated.
Claims (6)
前記レッドコンプレックス菌が、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）である、
歯周炎のリスクを推定するためのキット。 A kit comprising reagents for measuring the proportion of Fusobacterium nucleatum and the proportion of red complex bacteria in oral bacteria, the kit comprising:
The red complex bacteria are Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola,
A kit for estimating the risk of periodontitis.
前記レッドコンプレックス菌が、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）である、
歯周炎のリスクを推定するためのキット。 A primer set for Fusobacterium nucleatum (Fusobacterium nucleatum)-specific amplification, a primer set for Red Complex bacteria-specific amplification, and a primer set for 16S ribosomal RNA-specific amplification,
The red complex bacteria are Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola,
A kit for estimating the risk of periodontitis.
口腔内細菌におけるレッドコンプレックス菌存在割合を測定するための試薬を備え、
前記レッドコンプレックス菌が、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）である、
歯周炎のリスクを推定するためのキット。 A kit for people in which the proportion of Fusobacterium nucleatum in oral bacteria is 1% or more or less than 0.2%,
Equipped with reagents for measuring the proportion of red complex bacteria present in oral bacteria,
The red complex bacteria are Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola,
A kit for estimating the risk of periodontitis.
レッドコンプレックス菌特異的増幅のためのプライマーセット、及び１６ＳリボソームＲＮＡ特異的増幅のためのプライマーセット、を備えた、
前記レッドコンプレックス菌が、Porphyromonas gingivalis（ポルフィロモナス ジンジバリス）、Tannerella forsythia（タンネレラ フォーサイシア）、及びTreponema denticola（トレポネーマ デンティコラ）である、
歯周炎のリスクを推定するためのキット。 A kit for people in which the proportion of Fusobacterium nucleatum in oral bacteria is 1% or more or less than 0.2%,
Equipped with a primer set for red complex bacteria-specific amplification and a primer set for 16S ribosomal RNA-specific amplification,
The red complex bacteria are Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola,
A kit for estimating the risk of periodontitis.
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