JP2023152484A - 乳癌の決定および治療の方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】健常個体および良性乳腺病変を有する対象から、対象中の乳癌を検出するための侵襲性が最小の方法の提供。【解決手段】乳癌を発症している、あるいは乳癌発症のリスクを有すると考えられる対象のサンプルを得、対象から得たサンプル中の、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3pからなる群より選ばれる少なくとも2種のmiRNAの発現レベルを測定し、サンプル中のmiRNAの発現レベルが対照と比べて差異的または無変化であることをもって、対象が乳癌を発症している、あるいは乳癌発症のリスクを有すると決定し、そして乳癌と診断された対象を抗乳癌化合物で治療する。【選択図】なし
Description
特許法第30条第2項適用申請有り 発行社名 エムディーピーアイ 刊行物名 Cancers 2021,13,2130 発行日 2021年4月28日
本発明は、概して分子生物学の分野に関する。特に本発明は、癌の検出のためのバイオマーカーの使用に関する。
乳癌は、最も一般的に診断される癌であり、且つ世界中の女性の癌死の主要な原因である。乳癌のスクリーニングのゴールドスタンダードはマンモグラフィーである。しかし、このモダリティーは、追加の診断的画像方法および組織生検を必要とする、顕著な擬陽性結果をもたらす。米国における702,154例の大規模研究においては、171,829例が異常なスクリーニングマンモグラム結果を示し、2%未満(2,599/171,829)が真の陽性であった。その結果、異常なスクリーニングマンモグラムを示した女性の大部分が、防ぐことが可能であった侵襲的且つ高額な診断方法に付された。さらに、50歳未満の女性では、マンモグラフィーには約22%の擬陰性が見られ、時には良性および悪性腫瘍を正確に区別することができず、患者の適時な治療に2ヶ月以上の遅延を生じることもある。よって、上述した事項故に、健常個体および良性乳腺病変を有する対象から、対象中の乳癌を検出するための侵襲性が最小の方法が必要である。
一様相において、本開示は乳癌の治療方法に関し、当該方法は、乳癌を発症している、あるいは乳癌発症のリスクを有すると考えられる対象のサンプルを得、対象から得たサンプル中の、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3pからなる群より選ばれる少なくとも2種のmiRNAの発現レベルを測定し、サンプル中のmiRNAの発現レベルが対照と比べて差異的または無変化であることをもって、対象が乳癌を発症している、あるいは乳癌発症のリスクを有すると決定し、そして乳癌と診断された対象を抗乳癌化合物で治療する、ことを含む。
一例において、本願で開示する方法は、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、少なくとも10種、少なくとも11種、または12種のmiRNAの測定を含む。他の例においては、本願で開示する方法における2種以上のmiRNAは、miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3pを含む、またはこれらからなる。本願で開示する方法の他の例において、2種以上のmiRNAは、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5pを含む、またはこれらからなる。本願で開示する方法の他の例において、以下のmiRNA: miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、およびmiR-363-3p、が存在するとき、これらがアップレギュレートされる。本願で開示する方法のさらなる例において、miR-338-3pが存在するとき、それがダウンレギュレートされる。さらに他の例において、miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5pが存在するとき、これらmiRNAが無変化である。
他の様相において、本開示は、対象の乳腺病変が悪性であるか、良性であるか決定するための方法に関し、当該方法は、対象から得たサンプル中のmiR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3pからなる群より選ばれる少なくとも2種のmiRNAの発現レベルを測定し、サンプル中のmiRNAの発現レベルが対照と比べて差異的または無変化であることをもって、病変が良性であるか、悪性であるかを決定する。
一例において、本願で開示する方法は、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、少なくとも10種、少なくとも11種、または12種のmiRNAの測定を含む。本願で開示する方法の他の例において、少なくとも2種のmiRNAは、miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3pを含む、またはこれらからなる。本願で開示する方法の他の例において、少なくとも2種のmiRNAは、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5pを含む、またはこれらからなる。本願で開示する方法の他の例において、以下のmiRNA: miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、およびmiR-363-3pが存在するとき、これらがアップレギュレートされる。本願で開示する方法の他の例において、miR-338-3pが存在するとき、それがダウンレギュレートされる。本願で開示する方法の他の例においてmiR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5pが存在するとき、これらmiRNAが無変化である。他の例において、対照は癌の無い対象である。他の例において、対照は、良性の乳腺病変を有する対象である。他の例において、対照は、マンモグラムの結果が正常な対象である。本願で開示する方法の他の例において、miRNAの発現レベルは、濃度、log(濃度)、Ct値、Ct/Cq値、または2のCt/Cq値乗のいずれか1種である。本願で開示する方法の他の例において、miRNAの発現レベルは、リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)で決定される。本願で開示する方法のさらに他の例において、サンプルは組織サンプルまたは体液サンプルである。さらなる例において、体液は、液状生検、羊水、気管支洗浄液、脳脊髄液、間質液、腹水、胸水、唾液、精液、尿、涙、末梢血、全血、血漿、および血清の細胞性および非細胞性成分からなる群より選ばれる。本願で開示する方法の他の例において、対象はマンモグラムの結果に異常があったものである。
本願で開示する方法のさらに別の例において、方法は、直線モデル、ロジスティック回帰分析、サポートベクターマシンアルゴリズム、ロジスティック回帰アルゴリズム、多項ロジスティック回帰アルゴリズム、フィッシャーの線形判別アルゴリズム、二次識別器アルゴリズム、パーセプトロンアルゴリズム、k近傍法、人工神経回路網アルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、決定木アルゴリズム、単純ベイズアルゴリズム、適応性ベイズネットワークアルゴリズム、および複数の学習アルゴリズムを組み合わせた集団学習方法から選ばれる数学的モデルに基づき、選択したmiRNAに基づく予測的スコアを得ることをさらに含む。
さらに別の様相において、本開示は、本願で開示する方法において定義される2種以上のmiRNAの検出に適したプライマーの組み合わせを含むキットに参照する。
発明は、非限定的な例示および添付の図面と合わせて以下の詳細な説明に参照することで、より良く理解される。
定義
本願で使用する「miRNA」という用語は、マイクロRNA、即ち、小さな非コードRNA分子であって、その例のいくつかは約19~25ヌクレオチド(nt)を含み、植物、動物およびいくつかのウイルスから見いだされるものを意味する。miRNAは、RNAサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後制御における機能を有することが知られている。これらの高保存性RNAは、特異的RNAの3’-非翻訳領域(3’-UTR)に結合することで遺伝子発現を制御する。例えば、各miRNAは複数の遺伝子を制御すると考えられ、数百のmiRNA遺伝子が高等真核生物に存在すると予測されている。miRNAは、ゲノム内の複数の異なる遺伝子座から転写される傾向にある。これら遺伝子は、ヘアピン構造を有する長いRNAをコードし、(ドローシャおよびダイサーを含む)一連のRNaseIII酵素による処理によって、通常は長さが22nt以下で3’末端に2ntのオーバーハングを有する2重miRNAを形成する。
本願で使用する「miRNA」という用語は、マイクロRNA、即ち、小さな非コードRNA分子であって、その例のいくつかは約19~25ヌクレオチド(nt)を含み、植物、動物およびいくつかのウイルスから見いだされるものを意味する。miRNAは、RNAサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後制御における機能を有することが知られている。これらの高保存性RNAは、特異的RNAの3’-非翻訳領域(3’-UTR)に結合することで遺伝子発現を制御する。例えば、各miRNAは複数の遺伝子を制御すると考えられ、数百のmiRNA遺伝子が高等真核生物に存在すると予測されている。miRNAは、ゲノム内の複数の異なる遺伝子座から転写される傾向にある。これら遺伝子は、ヘアピン構造を有する長いRNAをコードし、(ドローシャおよびダイサーを含む)一連のRNaseIII酵素による処理によって、通常は長さが22nt以下で3’末端に2ntのオーバーハングを有する2重miRNAを形成する。
本願で使用する「調節」という用語は、RNAまたはタンパク質といった細胞成分の量を外部の変数に応じて細胞が増加または減少させる機構を意味する。細胞成分の増加をアップレギュレーションと呼び、細胞成分の減少をダウンレギュレーションと呼ぶ。「無調節(deregulated)」または「調節不全(dysregulated)」という用語は、本願での使用において、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされることを意味する。ダウンレギュレーションの一例は、ホルモンまたは神経伝達物質等の分子に対する受容体数の細胞における減少であり、これは当該物質に対する細胞感受性を低下させる。この現象は、局所的に活動するネガティブフィードバック機構の一例でもある。アップレギュレーションの一例は、ダイオキシン等の生体異物分子が投与されたときの肝臓細胞内のチトクロームP450酵素の数の増加であり、その結果、当該分子のより多くの分解がもたらされる。アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションは、毒素またはホルモンに対する応答としても生じ得る。例えば、妊娠中のアップレギュレーションの一例は、子宮内の細胞をオキトシンに対してより感受性にするホルモン類である。
本願で使用する「差異的発現」と言いう用語は、対照または他のサンプルと比較した細胞成分の測定によって、例えば、細胞成分の濃度、存在量、または強度の違いを決定することを意味する。このような比較の結果は、絶対値として、即ち、成分はサンプル中に存在するが、対照には存在しない、あるいは相対値として、即ち、成分の発現または濃度の対照と比べた増加または減少として提供することができる。「増加」および「減少」という用語は、それぞれ、本願で使用する「アップレギュレートされる」および「ダウンレギュレートされる」と入れ替え可能である。
本願で使用する「対照」という用語は、実験において参照点を示すために使用されるサンプルを意味する。例えば、対象が特定の疾患を有するか否かを確認するために後に使用するマーカーの開発および検証に使用することができる。本文脈においては、対照は、試験される対象を対照と比較することで、対象が悪性乳腺病変を有するか否かを示すための参照点として使用することができる。よって一例においては、対照は健康な対象であり、健康な対象とは、即ち、疾患を有さない対象である。いくつかの例において、対象は癌の無い対象であり得る。他の例示においては、対照は良性乳腺病変を有する対象であり得る。「無疾患の」および「癌の無い」という用語は、本発明の文脈において入れ替え可能である点に着目されたい。
本願で使用する「HER」または「Her2」という用語は、正常な細胞増殖に関与するヒト上皮増殖因子受容体(HER/EGFR/ERBB)ファミリーの一員であるヒト上皮増殖因子2を意味する。これは乳房および卵巣の細胞を含む、ある種の癌細胞から見いだされた。最適な処置を決定するための一助として、体から除去した癌細胞におけるHER2/neuの存在を試験することができる。HER2/neuは、受容体チロシンキナーゼの一種である。c-erbB-2、ヒトEGF受容体2、およびヒト上皮増殖因子受容体2とも呼ばれる。
本願で使用する「ルミナルA」または「LA」とは、多数の遺伝子マーカーに基づく乳癌の副分類を意味する。乳癌は、エストロゲン受容体(ER)陽性、プロジェステロン受容体(PR)陽性および/またはホルモン受容体(HR)陰性であるといった多数の特徴に加えて、ルミナルAまたはルミナルBであることを決定することができる。ルミナルA癌の臨床的定義は、ER陽性およびPR陽性であり、HER2陰性の癌である。ルミナルA乳癌は、ホルモン療法の恩恵を受けやすく、化学療法からも恩恵を受け得る。ルミナルB癌は、ER陽性、PR陰性、およびHER2陽性の癌である。ルミナルB乳癌は、化学療法の恩恵を受けやすく、ホルモン療法およびHER2を標的とした治療の恩恵を受け得る。
本願で使用する「三重陰性」または「TN」という用語は、試験によって、ホルモン上皮増殖因子受容体2(HER-2)、エストロゲン受容体(ER)、およびプロジェステロン受容体(PR)を欠失している(または陰性である)と判明した乳癌を意味する。三重陰性癌は、「基底様」癌と呼ばれることも知られている。三重陰性乳癌内の腫瘍細胞は必要な受容体を欠失していることから、一般的な治療、例えば、エストロゲン、プロジェステロン、およびHER-2を標的とするホルモン療法および薬剤は効果がない。三重陰性乳癌の治療に化学療法を用いることは、未だに効果的な選択の1つである。実際、三重陰性乳癌は、初期ステージでは他の多くの形態の癌と比べて化学療法に対してより良く応答する。
本願で使用する「(統計的)分類」という用語は、所属するカテゴリー群がわかっている観測(またはインスタンス)を含む訓練用データセットに基づき、新規な観測がどのカテゴリー群(亜集団)に属するかを同定する問題を意味する。一例は、観測された特徴(性別、血圧、特定の症状の有無等)によって表される対象について診断を下すことである。機械学習の用語においては、分類は、教師あり学習のインスタンス、即ち、正しく同定された観測の訓練用セットが提供された学習、と考えられている。対応する教師無し学習手順はクラスタリングとして知られ、いくつかの固有の類似性または距離に基づきデータをカテゴリー群にグループ分けすることを含む。多くの場合、個別の観測を、説明変数または性質等として知られる定量可能な性質のセットに解析する。これらの性質は、種々に、分類別(例:血液型の「A」、「B」、「AB」または「O」)、順序別(例:「大」、「中」または「小」)、整数値(例:eメール中の部分単語の出現回数)または実数値(例:血圧の測定値)である。他の分類子は、類似性または距離関数によって観測を以前の観測と比較することで機能する。分類を実装した、特に具体的に実装したアルゴリズムは、分類子として知られる。「分類子」という用語は、ときには分類アルゴリズムに実装された、入力データを分類にマッピングする数学的関数も意味する。
本願で使用する「事前学習」または「教師あり(機械)学習」という用語は、ラベル付き訓練データから関数を推論(inferring)する機械学習タスクを意味する。訓練データは訓練用サンプル(training examples)のセットからなるものでもよい。教師あり学習では、各サンプルは、入力物体(典型的にはベクター)と所望の出力値(教師信号とも呼ばれる)とのペアである。教師あり学習アルゴリズム、即ち、訓練されるべきアルゴリズムは、訓練データを解析し、新しいサンプルのマッピングに使用することのできる推定関数を作成する。最適なシナリオは、アルゴリズムによるまだ見ぬインスタンスのクラスラベルの正しい決定を可能にする。これには、訓練データから未知の状況を「論理的に」一般化する学習アルゴリズムが必要である。
本願で使用する「スコア」および/または「予測スコア」という用語は、数学的に、例えば、当業界で知られるコンピューターモデル、一例としてSMVが挙げられるが、これに限定されるものではない、によって決定することのできる整数または数であって、統計的分類を目的として使用される多数の数式および/またはアルゴリズムから選ばれるいずれかを用いて計算されるものを意味する。このようなスコアは、可能な結果のスペクトルから一の結果を挙げるために使用される。このようなスコアの関連性および統計学的有意性は、結果のスペクトルを確立するために使用した裏付けデータセットのサイズおよび品質に依存する。例えば、盲試料をアルゴリズムに入力すると、代わりに、盲試料の解析によって提供される情報に基づくスコアが計算される。これは、当該盲試料のスコアの生成をもたらす。このスコアに基づき、例えば、盲試料を得た対象が癌であるか否かの程度について決定を下すことができる。スペクトルの両極端は、提供されるデータに基づき論理的に定義するか、実験者の要求に応じて任意に決定することができる。いずれの場合も、盲試料の試験前にスペクトルを定義する必要がある。その結果、このような盲試料によって生成されるスコア、例えば、「45」という数字は、1から50の尺度で定義され、「1」が癌無しであると定義され、「50」が癌有りであると定義されるスペクトルに基づき、対応する対象が癌であることを示し得る。
本願で使用する「乳腺病変」という用語は、乳房の異常組織の領域を意味し、結節とも呼ばれる。乳腺病変は良性または悪性であり得る。
本願で使用する「良性乳腺病変」という用語は乳房組織における組織病理学的変化によって示される病態であって、乳房組織が侵襲または転移しないものを意味する。当業界において、良性乳腺病変は外科的切除によって処置されることが認められており、外科手術は治癒的であると考えられている。「良性乳腺病変」としては、乳房嚢胞、炎症病変、乳腺炎、膿瘍形成、肉芽腫、乳管拡張症(形質細胞性乳腺炎、面疱乳腺炎)、乳輪下膿瘍、脂肪腫、脂肪壊死、線維嚢胞変化、乳管上皮過形成(増殖性乳疾患)、異型乳管過形成、若年型乳頭腫、線維腺腫、腺腫瘍、および硬化性乳管増生症、乳腺の偽血管腫様過形成、頭腺腫、腺筋上皮腫、多形性腺腫、妊娠中および産後の良性病変、乳房の顆粒細胞腫瘍、ならびに乳房の限局性類殿粉瘤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本願で使用する「悪性乳腺病変」という用語は、制御不能の分裂および複製を生じる可能性のある乳房組織をもたらし得る乳房組織の変化を意味する。いくつかの悪性病変は侵襲し、そして近傍の組織および/または宿主の他の領域に入り込む。いくつかの例において、このような転移は血管系およぶリンパ系を巻き込むことが観察され得る。本願で使用する「悪性乳腺病変」という用語は、「乳癌」という用語と同義である。一般的な悪性乳腺病変としては、腺管癌、髄様癌、膠様(粘液性)癌、管状癌(高分化)癌、腺様嚢胞癌、乳頭癌、嚢胞内癌、微小乳頭突起癌、分泌性乳癌、アポクリン腺癌、小葉癌、丹毒様癌、パジェット病、化生性癌、乳房の扁平上皮癌、乳房の放射線および化学療法誘導性変化、葉状腫瘍、ならびに乳房の肉腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本願において使用する「治療」という用語は、形はどうであれ、病的な状態または症状を改善する、疾患の確立を防止する、あるいは疾患または他の望ましくない症状の進行を防止、妨害、遅延または逆転させる任意のそして全ての用途を意味する。治療は、個別にまたは他の治療的様式と組み合わせて使用することができる。このような治療としては、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、放射線療法、幹細胞移植、外科手術、および標的療法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本願で使用する「抗乳癌化合物」という用語は、ラロキシフェン塩酸塩、タモキシフェンクエン酸塩、アベマシクリブ、パクリタキセル、トラスツズマブエムタンシン(ado-trastuzumab emtansine)、アルペリシブ、アナストロゾール、パミドロン酸二ナトリウム、エキセメスタン、アテゾリズマブ、カペシタビン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、fam-トラスツズマブデルクステカン-nxki、エベロリムス、フルオロウラシル、トレミフェン、レトロゾール、フルベストラント、ゲムシタビン塩酸塩、ゴセレリン酢酸塩、エリブリンメシル酸塩、トラスツズマブ、ヒアルロニダーゼ-oysk、ハーセプチントラスツズマブ、パルボシクリブ、イクサベピロン、ペムブロリズマブ、リボシクリブ、ラパチニブトシル酸塩、オラパリブ、マルゲツキシマブ-cmkb、酢酸メゲストロール、メトトレキサートナトリウム、ネラチニブマレイン酸塩、ペルツズマブ、ヒアルロニダーゼ-zzxf、サシツズマブゴビテカン-hziy、タラゾパリブトシル酸塩、チオテパ、ツカチニブ、およびビンブラスチン硫酸塩を含み得るが、これらに限定されるものではない。
本発明の詳細な説明
乳癌スクリーニングの標準であるにもかかわらず、マンモグラフィーは擬陽性結果の発生率が高く、良性乳腺病変を乳癌から区別するには効果がない。これは、統計学的に信頼可能であり、侵襲性が最小である、早期乳癌の治療および管理のためのスクリーニング方法の必要性を表している。液状生検は侵襲性が最小の臨床モダリティーを提供することで癌の診断、治療およびモニタリングを可能にし、それによってリアルタイムで個別の分子プロファイリングを可能にしてきた。
乳癌スクリーニングの標準であるにもかかわらず、マンモグラフィーは擬陽性結果の発生率が高く、良性乳腺病変を乳癌から区別するには効果がない。これは、統計学的に信頼可能であり、侵襲性が最小である、早期乳癌の治療および管理のためのスクリーニング方法の必要性を表している。液状生検は侵襲性が最小の臨床モダリティーを提供することで癌の診断、治療およびモニタリングを可能にし、それによってリアルタイムで個別の分子プロファイリングを可能にしてきた。
本願で開示するように、乳癌を患っているか否か、またはその発症リスクがあるか否かを決定するための、miRNA発現レベルを用いる又はこれに基づく方法が記載されている。一例においては、対照と比べて対象が悪性乳腺病変を患っているか否か、またはその発症リスクがあるか否かを決定するための、miRNA発現レベルおよび/または予測スコアを使用する方法が記載されている。本願には、対照と比べて対象が乳癌を患っているか否か、またはその発症リスクがあるか否かを決定するための、miRNAパネルを使用する方法がさらに開示されている。さらなる例としては、対照と比べて対象が悪性乳腺病変を患っているか否か、またはその発症リスクがあるか否かを決定するための、miRNAパネルを使用する方法が記載されている。
他の例において、本開示は、本願に開示する群から選ばれる少なくとも2種のmiRNAの発現レベルを測定することを含む、対象が乳癌を患っている否かを決定するための方法であって、サンプル中のmiRNA発現の、対照と比較して差異的な発現によって、対象が乳癌を有すると決定する方法を記載する。本願は、対照が良性または悪性の乳腺病変を患っている否かを決定するための方法であって、対象から得られたサンプル中の、本願に開示する群から選ばれる少なくとも2種のmiRNAの発現レベルを測定することを含み、サンプル中のmiRNA発現の、対照と比較して差異的な発現によって、対象が乳癌を有すると決定する方法をさらに開示する。
いくつかの例において、本開示は、対象の乳腺病変が悪性または良性であるかを決定するための方法であって、対象から得られたサンプル中の、本願に開示する群から選ばれる少なくとも1種またはそれ以上のmiRNAの発現レベルを測定することを含み、サンプル中のmiRNA発現の、対照と比較して差異的な発現または無変化のmiRNA発現レベルによって病変が良性か悪性化を決定する方法をさらに開示する。
本願で開示する方法は、本願で開示する少なくとも2種のmiRNAで実施可能であることが見いだされた。これは、例えば、本発明の方法が2種、3種、4種、5種または6種のmiRNAを用いて例示的に実施されたことを示す表1と表2に示されている。したがって、一例において、本開示は、対象が乳癌を患っているか否かを決定するための方法であって、本願で開示する群から選ばれる少なくとも2種のmiRNAの発現レベルの測定を含む方法を記載する。
表1. 2~6種のmiRNAの組み合わせを含む多変量パネルの例示的な平均AUC。miRNAの内の1種を固定し、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5pから選ばれる1~5種の追加のmiRNAを組み合わせた。
表2. 2~6種のmiRNAの組み合わせを含む多変量パネルの例示的な中央AUC。miRNAの内の1種を固定し、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5pから選ばれる1~5種の追加のmiRNAを組み合わせた。
記載した方法は、本願の実施例に記載した多施設の2つのコホート研究によって同定された、選択したmiRNAの発現レベルによって実施することができる。同定されたmiRNAは、例えば、図1Cおよび表3から見出すことができる。
いくつかの例において、本願で開示する方法は、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、少なくとも10種、少なくとも11種、または12種のmiRNAの測定を含む。
一例において、少なくとも2種のmiRNAは、以下の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。miR-451a、miR-195-5p;miR-451a、miR-126-5p;miR-451a、miR-423-3p;miR-451a、miR-192-5p;miR-451a、miR-17-5p;miR-451a、miR-125b-5p;miR-451a、miR-660-5p;miR-451a、miR-25-3p;miR-451a、miR-143-3p;miR-451a、miR-363-3p;miR-451a、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-126-5p;miR-195-5p、miR-423-3p;miR-195-5p、miR-192-5p;miR-195-5p、miR-17-5p;miR-195-5p、miR-125b-5p;miR-195-5p、miR-660-5p;miR-195-5p、miR-25-3p;miR-195-5p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-423-3p;miR-126-5p、miR-192-5p;miR-126-5p、miR-17-5p;miR-126-5p、miR-125b-5p;miR-126-5p、miR-660-5p;miR-126-5p、miR-25-3p;miR-126-5p、miR-143-3p;miR-126-5p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-192-5p;miR-423-3p、miR-17-5p;miR-423-3p、miR-125b-5p;miR-423-3p、miR-660-5p;miR-423-3p、miR-25-3p;miR-423-3p、miR-143-3p;miR-423-3p、miR-363-3p;miR-423-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p;miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-192-5p、miR-660-5p;miR-192-5p、miR-25-3p;miR-192-5p、miR-143-3p;miR-192-5p、miR-363-3p;miR-192-5p、miR-338-3p;miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-17-5p、miR-660-5p;miR-17-5p、miR-25-3p;miR-17-5p、miR-143-3p;miR-17-5p、miR-363-3p;miR-17-5p、miR-338-3p;miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-660-5p、miR-25-3p;miR-660-5p、miR-143-3p;miR-660-5p、miR-363-3p;miR-660-5p、miR-338-3p;miR-25-3p、miR-143-3p;miR-25-3p、miR-363-3p;miR-25-3p、miR-338-3p;miR-143-3p、miR-363-3p;miR-143-3p、miR-338-3p;またはmiR-363-3p、miR-338-3p。
一例において、少なくとも3種のmiRNAは、以下の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-192-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-17-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-192-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-17-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-192-5p;miR-451a、miR-423-3p、miR-17-5p;miR-451a、miR-423-3p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-423-3p、miR-660-5p;miR-451a、miR-423-3p、miR-25-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-451a、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-192-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-192-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-192-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-192-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-192-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-660-5p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-25-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-423-3p、miR-192-5p;miR-195-5p、miR-423-3p、miR-17-5p;miR-195-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p;miR-195-5p、miR-423-3p、miR-660-5p;miR-195-5p、miR-423-3p、miR-25-3p;miR-195-5p、miR-423-3p、miR-143-3p;
miR-195-5p、miR-423-3p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-423-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-660-5p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-25-3p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-195-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-25-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-143-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-660-5p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-25-3p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-143-3p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-126-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-126-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;
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miR-195-5p、miR-423-3p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-423-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-660-5p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-25-3p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-195-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-195-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-25-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-143-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-660-5p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-25-3p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-143-3p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-126-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-126-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;
miR-126-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p;miR-423-3p、miR-192-5p、miR-25-3p;miR-423-3p、miR-192-5p、miR-143-3p;miR-423-3p、miR-192-5p、miR-363-3p;miR-423-3p、miR-192-5p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-423-3p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-423-3p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-423-3p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-423-3p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-423-3p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-423-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-192-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-192-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-192-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-192-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-192-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-192-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-17-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;
miR-17-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-17-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-17-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-17-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-17-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-17-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-17-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-17-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-125b-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-125b-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-125b-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-660-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-660-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-660-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;またはmiR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p。
一例において、少なくとも4種のmiRNAは、以下の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-192-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-17-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-192-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-192-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-192-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-192-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-192-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;
miR-451a、miR-195-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-25-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-451a、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-338-3p;
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一例において、少なくとも5種のmiRNAは、以下の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p;
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一例において、少なくとも6種のmiRNAは、以下の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;
miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-17-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;
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miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;またはmiR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p。
一例において、少なくとも7種のmiRNAは、以下の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;
miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-660-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;
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miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-423-3p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;またはmiR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p。
一例において、少なくとも8種のmiRNAは、以下の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;
miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;
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一例において、少なくとも9種のmiRNAは、以下の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;
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miR-195-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;またはmiR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p。
一例において、少なくとも10種のmiRNAは、以下の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-338-3p;
miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;
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miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-195-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;またはmiR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p。
一例において、少なくとも11種のmiRNAは、以下の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-195-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;miR-451a、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p;またはmiR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p。
一例において、少なくとも12種のmiRNAは、以下の組み合わせであるが、これらに限定されるものではない。miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3p。
従って、さらなる例示において、本発明の方法で開示する少なくとも2種のmiRNAは、miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、miR-338-3p、およびmiR-17-5pからなる群より選択される。
一例において、本発明の方法で開示するmiRNAは、以下の全てであり得る。miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5p。
他の例において、miRNAは以下の全てであり得る。miR-195-5p、miR-451a、miR-125-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3p。
本願に開示したように、miRNAの発現レベルは当業界で知られる方法によって決定することができる。このような例示的な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、またはリアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の例において、本願に開示したmiRNAの発現レベルは、濃度、log(濃度)、Ct値、Ct/Cq値、または2のCt/Cq値乗といった単位を用いて提供されるが、、これらに限定されるものではない。
本開示で実施する統計解析に到達するために、種々の統計学的方法および計算を適応することができる。本願で開示するデータの統計学的特徴、例えば、信頼性、頑健性およびばらつきは、当業界で開示されている種々の手法を用いて表すことができる。当業者は、本願で提供するデータに基づき、当業界で知られる方法および手段を用いて必要な統計学的な関連情報を計算することが可能である。このような統計学的な関連情報としては、p値、予測値、FDR修正p値、AUC値、log倍率変化値、正規化値、平均値、中央値、および/または相関係数が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本願に開示するように、miRNAは以下のいずれか一の基準に基づき選択することができる:受信者動作特性曲線下面積(AUC-ROC)値、曲線下面積(AUC)値、p値、偽陽性率(FDR)修正p値、予測値、またはこれらの組み合わせ。
例えば、本開示の文脈において、選択した例示的なmiRNAに対してここで開示したように、さらなる1種、または2種、または3種、または4種、または5種のmiRNAと例示的に組み合わせた例示的な固定したmiRNAについて、平均および中央曲線下面積(AUC)値を表1および表2に示した。
他の例において、本開示は、患者が乳癌を患っているか否かを決定するための方法であって、本願に開示する群から選ばれる少なくとも2種のmiRNAの発現レベルを測定することを含み、対照と比べたサンプル中のmiRNAの差異的発現をもって、対象が乳癌を発症していると決定する。
さらなる例において、本開示は乳癌の治療方法に参照し、当該方法は、乳癌を発症している、あるいは乳癌発症のリスクを有すると考えられる対象のサンプルを得、対象から得たサンプル中の、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3pからなる群より選ばれる少なくとも2種のmiRNAの発現レベルを測定し、サンプル中のmiRNAの発現レベルが対照と比べて差異的または無変化であることをもって、対象が乳癌を発症している、あるいは乳癌発症のリスクを有すると決定し、そして乳癌と診断された対象を抗乳癌化合物で治療することを含む。
いくつかの例において、本開示は対象の乳腺病変が悪性であるか、良性であるかを決定するための方法に参照し、当該方法は、対象から得たサンプル中の、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3pからなる群より選ばれる少なくとも1種のmiRNAの発現レベルを測定し、サンプル中のmiRNAの発現レベルが対照と比べて差異的または無変化であることをもって、前記病変が良性であるか、悪性であるかを決定することを含む。本願に開示したmiRNAの1種または複数種の差異的比較の結果は、本願に開示するように、miRNAの発現状態がアップレギュレートされている、またはダウンレギュレートされている、または無変化であると称される状態のいずれかに結論づけることができる。少なくとも1種、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも10種、少なくとも11種または少なくとも12種のmiRNAの発現状態を組み合わせた結果は、従って、対象が乳癌を発症しているか、対象が乳癌を発症するまたは発生するリスクにあるか、あるいは癌ではないという診断または確定の結果となる。このような診断または確定は、対照と比べて特定のmiRNAの発現がアップレギュレートまたはダウンレギュレートされることに基づき行うことができる。一例において、本開示において選択したmiRNAの発現レベルが対象と比べて「ダウンレギュレートされている」と示されるとき、対象は乳癌を発症していると診断される。他の例において、本開示において選択したmiRNAの発現レベルが対象と比べて「アップレギュレートされている」と示されるとき、対象は乳癌を発症していると診断される。本願で差異的に発現されると開示したmiRNAに加えて、本願で開示したmiRNAには、対照と比べて差異的に発現されないmiRNAも含まれる。これら差異的に発現されないmiRNAが本発明に含まれる理由は、差異的に発現されないmiRNAが、サンプルサイズを適宜増加させた統計解析の予想される結果に対して、本願で実施する統計解析の頑健性を向上させることが示されたためである。従って、一例において、本願で開示する方法は、対照と比べたときに対象において発現レベル変化しない少なくとも1種のmiRNAの発現レベルの測定をさらに含む。
本願で例示するように、「ダウンレギュレートされる」という用語は、選択したmiRNAの発現レベルが陰性のLog2値(倍率変化)を示すこと意味し得る。いくつかの例において、「アップレギュレートされる」という用語は、選択したmiRNAの発現レベルが陽性のLog2値(倍率変化)を示すことを意味し得る。いくつかの例において、「無変化」という用語は、選択したmiRNAの発現レベルのLog2値(倍率変化)が0と等しいことを意味し得る。いくつかのさらなる例において、「無変化」という用語は、対照と比べて、選択したmiRNAの発現レベルが有意に差異的ではないLog2値(倍率変化)であることを意味し得る。当業者は、統計的違いの有意性を決定するための適切な統計学的方法を同定し、統計的有意性の適切なカットオフ閾値を使用することができる。いくつかのさらなる例示において、統計的違いの有意性は、FDR修正p値によって測定することができる。別のさらなる例示において、「無変化」という用語は、選択したmiRNAの発現レベルのFDR修正p値が、対照と比べて、0.05以上であることを意味する。いくつかの例において、選択したmiRNAの「アップレギュレーション」または「ダウンレギュレーション」または「無変化」の発現レベルが、本願で開示した表3に列挙されている。いくつかのさらなる例においては、選択したmiRNAの「アップレギュレーション」または「ダウンレギュレーション」または「無変化」の発現レベルが、図1Cに示される。
いくつかのさらなる例においては、「アップレギュレートされる」または「ダウンレギュレートされる」という用語は、選択したmiRNAの発現レベルのLog2値(倍率変化)が、対照と比べて有意に高いまたは低いことを意味する。当業者は、統計的違いの有意性を決定するための適切な統計学的方法を同定し、統計的有意性の適切なカットオフ閾値を使用することができる。いくつかのさらなる例示において、統計的違いの有意性は、FDR修正p値によって測定することができる。別のさらなる例示において、「アップレギュレートされる」または「ダウンレギュレートされる」という用語は、選択したmiRNAの発現レベルのFDR修正p値が、対照と比べて、0.05未満であることを意味する。
いくつかの例において、存在する場合には、以下のmiRNAはアップレギュレートされる:miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、およびmiR-363-3p。
いくつかの例において、存在する場合には、miR-338-3pはダウンレギュレートされる。
いくつかの例において、存在する場合には、以下のmiRNAは無変化である:miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5p。
本願で開示する方法においては、問題となるサンプルが核酸配列を含む限り、対象から得た任意のサンプルを使用することができる。より具体的には、サンプルはmiRNAを含むべきである。一例において、サンプルは、癌を有するか、有していない対象から得る。他の例において、サンプルは癌を有する対象から得る。他の例において、サンプルは癌無しの対象から得る。さらに他の例において、サンプルは、乳癌無しの対象から得る。さらなる例において、サンプルは病気ではない対象から得る。他の例において、サンプルは良性乳腺病変を有する患者から得る。いくつかの例において、サンプルは異常なマンモグラム結果を示した患者から得る。
生検サンプル、例えば、細針生検(FNA)等は、本願に記載した方法を実施するために必要なmiRNAを含有し得る。しかしこのようなサンプルは、本願に記載した方法に従って作業するためには更なる操作を必要とする。さらに、本願の開示に基づくと、本願に記載した同定方法が適応できないこともあるため、天然では固体ではないサンプルが好ましい。さらに、比較として、公知の方法を用いて実施する解析、例えば、生検サンプルの組織学的解析は、擬陽性を生じやすい。これら組織学的解析は、例えば、組織病理学者によって実施されるため、サンプルの解析の際に実施者による偏見が反映される可能性がある。これは、腫瘍生検サンプルの組織学的解析において、同じ分析方法を使用する二人の異なる人物によって異なる結果が得られ得ることを意味する。従って、本発明に記載する方法は、生体または細胞外の流体の使用を開示する。
本願に記載するサンプルは、上述したように、体液のサンプルまたは細胞外流体のサンプルであり得るが、これらに限定されるものではない。生体のまたは細胞外の流体の例としては、羊水、母乳、気管支洗浄液、脳脊髄液、初乳、間質液、腹水、胸水、唾液、精液、尿、涙、全血、血漿、赤血球、白血球および血清中の細胞成分および非細胞成分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一例において、体液は血清である。いくつかの例において、サンプルは組織サンプルまたは体液サンプルである。いくつかのさらなる例において、サンプルは、液状生検、羊水、気管支洗浄液、脳脊髄液、間質液、胸水、唾液、精液、尿、涙、末梢血、全血、血漿、および血清中の細胞成分および非細胞成分を含むまたはからなる群より選ばれる。一例において、サンプルは血清サンプルである。
一例において、本開示は、乳癌の治療方法であって、乳癌を発症している、あるいは乳癌発症のリスクを有すると考えられる対象のサンプルを得、対象から得た前記サンプル中の本願で開示したmiRNAからなる群より選ばれる少なくとも2種のmiRNAの発現レベルを測定し、サンプル中のmiRNAの発現レベルが対照と比べて差異的または無変化であることをもって、対象が乳癌を発症している、あるいは乳癌発症のリスクを有すると決定し、そして乳癌と診断された対象を抗乳癌化合物で治療することを含む、方法に参照する。
いくつかの例において、乳癌を発症している、あるいは乳癌発症のリスクを有すると決定された対象を治療するための方法としては、バイオマーカー試験、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、放射線療法、幹細胞移植、外科手術、および標的療法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
乳癌を発症していると決定された対象を治療するための抗乳癌化合物の例としては、ラロキシフェン塩酸塩、タモキシフェンクエン酸塩、アベマシクリブ、パクリタキセル、トラスツズマブエムタンシン、アルペリシブ、アナストロゾール、パミドロン酸二ナトリウム、エキセメスタン、アテゾリズマブ、カペシタビン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、fam-トラスツズマブデルクステカン-nxki、エベロリムス、フルオロウラシル、トレミフェン、レトロゾール、フルベストラント、ゲムシタビン塩酸塩、ゴセレリン酢酸塩、エリブリンメシル酸塩、トラスツズマブ、ヒアルロニダーゼ-oysk、ハーセプチントラスツズマブ、パルボシクリブ、イクサベピロン、ペムブロリズマブ、リボシクリブ、ラパチニブトシル酸塩、オラパリブ、マルゲツキシマブ-cmkb、酢酸メゲストロール、メトトレキサートナトリウム、ネラチニブマレイン酸塩、ペルツズマブ、ヒアルロニダーゼ-zzxf、サシツズマブゴビテカン-hziy、タラゾパリブトシル酸塩、チオテパ、ツカチニブ、およびビンブラスチン硫酸塩を含み得るが、これらに限定されるものではない。
いくつかの例において、本願で開示する本発明の方法は、選択したmiRNAに基づく数学的スコアを得る工程を含む。「予測スコア」という用語は、本願の定義において、統計的分類を目的とすることが当業界で知られる他種の計算式および/またはアルゴリズムのいずれか1種を用いて計算することのできる数学的スコアを意味する。論理に拘束されるものではないが、バイオマーカースコアが高いほど、対象が乳癌を発症している確率も高いと考えられる。
このような計算式および/またはアルゴリズムの例としては、サポートベクターマシンアルゴリズム、ロジスティック回帰アルゴリズム、多項ロジスティック回帰アルゴリズム、フィッシャーの線形判別アルゴリズム、二次分類器アルゴリズム、パーセプトロンアルゴリズム、k近傍法アルゴリズム、人工ニューラルネットワークアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、決定木アルゴリズム、ナイーブベイズアルゴリズム、アダプティブベイズネットワークアルゴリズム、および複数アルゴリズムを組み合わせたアンサンブル学習法からなる群より選ばれる(統計)分類アルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の例において、対照の発現レベルを用いて分類アルゴリズムの事前学習を行う。他の例において、分類アルゴリズムは対象の発現レベルを対照のそれと比較し、そして対象が対照群のいずれか1つに属する尤度を同定する数学的スコアを返す。いくつかのさらなる例においては、本願に開示する方法は、直線モデル、ロジスティック回帰、サポートベクターマシンアルゴリズム、ロジスティック回帰アルゴリズム、多項ロジスティック回帰アルゴリズム、フィッシャーの線形判別アルゴリズム、二次分類器アルゴリズム、パーセプトロンアルゴリズム、k近傍法アルゴリズム、人工ニューラルネットワークアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、決定木アルゴリズム、ナイーブベイズアルゴリズム、アダプティブベイズネットワークアルゴリズム、および複数アルゴリズムを組み合わせたアンサンブル学習法から選ばれる数学モデルによって、選択したmiRNAに基づく予測スコア得る工程を含む。
さらなる例において、本開示は、本願で開示する方法で定義したmiRNAの検出に適したプライマーの組み合わせを含むキットに参照する。実施例として、例示的な6種のmiRNAバイオマーカーパネルの性能を表4に示した。実施例に示したように、例示的な6種のmiRNAバイオマーカーパネルは、乳癌を有していない対象を陰性と認定し、擬陽性率を減少させる能力を説明している。さらに、例示的な6種のmiRNAバイオマーカーパネルは、乳癌を発症している対象を陽性と認定し、わずかな擬陰性結果しか示していない。
悪性および良性の乳腺病変で発現されるmiRNAの同定
良性乳腺病変の対象と乳癌の対象とを区別するための候補血清miRNAバイオマーカーを発見コホート(表5)の解析によって同定した。324種のmiRNAの絶対発現レベルを72人の乳癌対象でプロファイリングし、良性乳腺病変である197人の対象のそれと比較した。解析した324種のmiRNAの内、179種のmiRNAは、全対象において血清1ml当たり500コピー以上の発現が観察された。
良性乳腺病変の対象と乳癌の対象とを区別するための候補血清miRNAバイオマーカーを発見コホート(表5)の解析によって同定した。324種のmiRNAの絶対発現レベルを72人の乳癌対象でプロファイリングし、良性乳腺病変である197人の対象のそれと比較した。解析した324種のmiRNAの内、179種のmiRNAは、全対象において血清1ml当たり500コピー以上の発現が観察された。
3つの戦略を用いた、miRNAバイオマーカー署名の同定および評価
(1)差異的に発現された個別のmiRNAバイオマーカー
本願で開示した方法に用いるためのmiRNAバイオマーカー署名を同定し、評価するために、3種の戦略(図1A)を使用した。初めに、悪性および良性の乳腺病変間で差異的に発現されたmiRNAを、正規化miRNA発現の倍率変化および統計試験に基づき同定した。発現された179種のmiRNAの内、8種のmiRNAは、良性乳腺病変を有する対象と比べて、乳癌の症例において有意に高い(7種のmiRNAがFDR修正P<0.05)または低い(1種のmiRNAがFDR修正P<0.05)(図1B、1C)ことが判明した。これら全8種の差異的に調節されたmiRNAは、バイオマーカーとして個別に使用したとき、0.607から0.642のAUCで良性乳腺病変から乳癌を区別することができた(図1C)。
(1)差異的に発現された個別のmiRNAバイオマーカー
本願で開示した方法に用いるためのmiRNAバイオマーカー署名を同定し、評価するために、3種の戦略(図1A)を使用した。初めに、悪性および良性の乳腺病変間で差異的に発現されたmiRNAを、正規化miRNA発現の倍率変化および統計試験に基づき同定した。発現された179種のmiRNAの内、8種のmiRNAは、良性乳腺病変を有する対象と比べて、乳癌の症例において有意に高い(7種のmiRNAがFDR修正P<0.05)または低い(1種のmiRNAがFDR修正P<0.05)(図1B、1C)ことが判明した。これら全8種の差異的に調節されたmiRNAは、バイオマーカーとして個別に使用したとき、0.607から0.642のAUCで良性乳腺病変から乳癌を区別することができた(図1C)。
(2)絞り込んだ検索を通じて構築したマルチmiRNAバイオマーカーパネル
2番目に、本願に記載した8種の個別に差異的に発現されたmiRNAバイオマーカーに絞り込み、2から8種のmiRNAを含む例示的なマルチmiRNAバイオマーカーパネルを構築した。例示的なバイオマーカーパネルを、悪性と良性の乳腺病変を区別する際のそれぞれのAUCに基づき評価した。最大AUCは、絞り込んだ7種のmiRNAバイオマーカーパネルおよび8種のmiRNAバイオマーカーパネルのそれぞれで達成され、それぞれのAUCは0.877であった。
2番目に、本願に記載した8種の個別に差異的に発現されたmiRNAバイオマーカーに絞り込み、2から8種のmiRNAを含む例示的なマルチmiRNAバイオマーカーパネルを構築した。例示的なバイオマーカーパネルを、悪性と良性の乳腺病変を区別する際のそれぞれのAUCに基づき評価した。最大AUCは、絞り込んだ7種のmiRNAバイオマーカーパネルおよび8種のmiRNAバイオマーカーパネルのそれぞれで達成され、それぞれのAUCは0.877であった。
(3)無作為検索を通じて構築したマルチmiRNAバイオマーカーパネル
3番目に、悪性および良性の乳腺病変で発現されている全miRNAの無作為検索によって、2から8種のmiRNAを含むマルチmiRNAパネルを構築した。絞り込んだ検索と同様の交差検証手順を通じて、無作為の2種のmiRNAから8種のmiRNAのバイオマーカーパネルを構築した。これらの無作為マルチmiRNAパネルを使用して得られた最大中央AUCは0.818であり、バイオマーカーパネル内のmiRNAの数を2種から8種に増加させるにつれてAUCは向上した(図2C)。無作為マルチmiRNAバイオマーカーパネルを検証コホートで立証すると、0.774という最も高いAUCが無作為の例示的な6種のmiRNAバイオマーカーパネルで達成された(図2D)。
3番目に、悪性および良性の乳腺病変で発現されている全miRNAの無作為検索によって、2から8種のmiRNAを含むマルチmiRNAパネルを構築した。絞り込んだ検索と同様の交差検証手順を通じて、無作為の2種のmiRNAから8種のmiRNAのバイオマーカーパネルを構築した。これらの無作為マルチmiRNAパネルを使用して得られた最大中央AUCは0.818であり、バイオマーカーパネル内のmiRNAの数を2種から8種に増加させるにつれてAUCは向上した(図2C)。無作為マルチmiRNAバイオマーカーパネルを検証コホートで立証すると、0.774という最も高いAUCが無作為の例示的な6種のmiRNAバイオマーカーパネルで達成された(図2D)。
例示的なmiRNAバイオマーカー署名の選択
本願で開示した3つの戦略によって同定したmiRNAバイオマーカー署名の評価に基づき、例示的なパネルとして、無作為の6種のmiRNAバイオマーカーパネルを選択した(表3)。この例示的な選択パネルのAUCは発見コホートにおいて0.785であり、検証コホートにおいては0.774であった(図3A)。例示的な6種のmiRNAパネルは、乳癌と良性乳腺病変との間で差異的に調節される2種のmiRNAを含み、これらはmiR-195-5pおよびmiR-451a(FDR調節P値<0.05)であった。
本願で開示した3つの戦略によって同定したmiRNAバイオマーカー署名の評価に基づき、例示的なパネルとして、無作為の6種のmiRNAバイオマーカーパネルを選択した(表3)。この例示的な選択パネルのAUCは発見コホートにおいて0.785であり、検証コホートにおいては0.774であった(図3A)。例示的な6種のmiRNAパネルは、乳癌と良性乳腺病変との間で差異的に調節される2種のmiRNAを含み、これらはmiR-195-5pおよびmiR-451a(FDR調節P値<0.05)であった。
例示的なmiRNAバイオマーカー署名の性能
適切なバイオマーカースコアのカットオフ値を有する6種のmiRNAバイオマーカーパネルを用いて乳癌と良性乳腺病変とを区別することが可能であることを立証したので、6種のmiRNAパネルを用いて、正常マンモグラムの対象を試験した。6種のmiRNAバイオマーカーパネルが乳癌を有する対象を良性乳腺病変の対象または正常なスクリーニングマンモグラムの対象から同定する際のAUCは0.881であった(図3B)。AUC曲線からは、特異度が89.8%、感受性が41.1%、陽性予測値(PPV)が60%、および陰性予測値(NPV)が80.4%という結果を提供する、高特異度バイオマーカースコアのカットオフ値が同定された(表4)。同じAUC曲線からは、感受性が79.5%、特異度が62.2%、PPVが43.9%、およびNPVが89.1%という結果を提供する、代わりの高感受性バイオマーカースコアも同定された(表4)。発見コホートおよび検証コホートの両方の145の乳癌症例において、6種のmiRNAバイオマーカースコアは、腫瘍のサイズ、ステージ、および関連リンパ節の増加に伴い増加した(図3C)。
適切なバイオマーカースコアのカットオフ値を有する6種のmiRNAバイオマーカーパネルを用いて乳癌と良性乳腺病変とを区別することが可能であることを立証したので、6種のmiRNAパネルを用いて、正常マンモグラムの対象を試験した。6種のmiRNAバイオマーカーパネルが乳癌を有する対象を良性乳腺病変の対象または正常なスクリーニングマンモグラムの対象から同定する際のAUCは0.881であった(図3B)。AUC曲線からは、特異度が89.8%、感受性が41.1%、陽性予測値(PPV)が60%、および陰性予測値(NPV)が80.4%という結果を提供する、高特異度バイオマーカースコアのカットオフ値が同定された(表4)。同じAUC曲線からは、感受性が79.5%、特異度が62.2%、PPVが43.9%、およびNPVが89.1%という結果を提供する、代わりの高感受性バイオマーカースコアも同定された(表4)。発見コホートおよび検証コホートの両方の145の乳癌症例において、6種のmiRNAバイオマーカースコアは、腫瘍のサイズ、ステージ、および関連リンパ節の増加に伴い増加した(図3C)。
本開示は、異常なスクリーニングマンモグラムを示した女性の間で悪性と良性の乳腺病変を区別することのできる、東南アジア人口のコホートの乳癌のために同定したmiRNAバイオマーカーを用いる方法について説明する。miRNAは、発見コホートにおける3種の異なるmiRNAバイオマーカー署名同定戦略によって評価した後に同定し、検証コホートで実証した。6種のmiRNA(miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5p)を含む例示的な血清バイオマーカーのAUCは0.774であり、高い陰性予測値(>80%)を示し、腫瘍のサイズ、ステージ、および関連するリンパ節数の増加によってより高い予測スコアを生成した。加えて、本願の結果は、本願に開示するバイオマーカーパネルが、悪性乳腺病変を有する女性と、良性乳腺病変を有する女性または正常なマンモグラムの健康な女性とを区別することのできるより高い診断性能(AUCが0.881)を有していることを示した。
パネル内の6種のmiRNAの中の3種のmiRNAであるmiR-451a、miR-195-5p、およびmiR-126-5pは、良性乳腺病変と比べて悪性乳腺病変において、統計学的に有意にアップレギュレートされていた。
本願開示を見た当業者は、本発明を実施することができる。次に本発明の使用に関する代表的な例を示す:乳癌を発症しているか、乳癌ではないかが不明の対象からサンプルを得て解析し、そしてmiRNAのセットについて差異的発現を決定する。この差異的発現データを、次に、本願で提供し、当業者には理解可能なデータである、差異的発現レベルと比較する。任意で、提供するデータセットの有意性および精度を高めるために適切な更なる統計的パラメーターも考慮する、さらなる数学的スコアを決定してもよい。これら情報に基づき、当業者は、次に問題となっている対象が癌無しであるか、癌を有しているかを決定することができる。同様に、本願開示に基づき、乳腺病変を有することが知られる対象が良性病変であるか乳癌であるかを決定することもできる。
本願で具体的に示す開示は、本願で具体的に開示しない1以上の因子、1以上の限定無しに、適切に実施してもよい。よって、例えば、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「含有する(containing)」等は拡張して限定無しに読み取るべきである。さらに本願で使用する用語及び語句は、限定ではなく表現として使用されており、これら用語及び語句の使用に、ここに示し、説明する要件やその部分の同等物を排除する意図はなく、請求する発明の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。したがって、本発明が好ましい態様によって具体的に開示されているものの、ここに開示する発明に内包される任意の要件、修飾および変化は、当業者によって実行可能であり、そのような修飾や変化は本発明の範囲内であることを理解されたい。
ここで本開示について広く、一般的に記載した。一般開示に含まれるそれぞれの狭い種および下位概念のグループも発明の一部を形成する。これは限定付きの発明の一般記載または属から発明を除く陰性限定を含み、これは取り除いたものが本願に具体的に記載されているか否かは関係ない。
他の態様は、以下の請求項および非限定的な例に含まれる。加えて、発明の要件または様相がマーカッシュグループとして記載されているとき、当業者は、マーカッシュグループの各メンバーまたはメンバーの下位グループによっても本発明が説明されることを認識する。
ここに開示されるのは、個別の発見および検証コホート(各コホートのn=269)の使用、およびリアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR) miRNAプロファイリングによって構築された例示的なバイオマーカーパネルとの使用を示す例示的な研究である。このプロファイリングの次に、要件選択アルゴリズムを含む2分割交差検証手法と、ロジスティック回帰予測モデルが続く。
対象コホート
本研究は、シンガポールの3カ所、具体的には、国立大学病院(NUH)、タン・トク・セン病院(TTSH)、および国立癌センターシンガポール(NCCS)において、2016年から2018年に異常なマンモグラムが検出された対象597人を含んでいた。シンガポールは、中国人、マレーシア人、インド人および他の人種を含む多民族人口を有し、中国人が大部分である74%を示す。対象の臨床病理学的特徴を表5に示した。末梢血サンプルを生検または外科手術の前に回収した。597人の対象の内、166人は、組織病理学的検査によって乳癌(悪性乳腺病変)を有することが確認された。良性乳腺病変を有する対象から得た合計393サンプルおよび悪性病変を有する対象から得た145サンプルを解析した(図1)。597人の対象から得たサンプルの内、59のサンプルは、サンプル中の血清miRNAへの赤血球細胞miRNAによるコンタミネーションを生じる試料溶血故に、解析から除いた。合計して538のサンプルが品質管理に合格した。これらサンプルを、良性乳腺病変を有する197人の対象および72人の乳癌を有する対象を含む発見コホートと、196例の良性乳腺病変および73の乳癌例を含む検証コホートとに均等に分割した。「正常」対照として、シンガポール・ヘルス・ポリクリニック(SingHealth Polyclinics)の定期的なスクリーニングにおいて正常なスクリーニングマンモグラム(即ち、悪いまたは異常な結果を示さないマンモグラム)を示した100人の対象から血液サンプルを回収した。研究は、全ての研究拠点において、施設内倫理委員会の承認を得、全研究参加者から同意書を得た。
本研究は、シンガポールの3カ所、具体的には、国立大学病院(NUH)、タン・トク・セン病院(TTSH)、および国立癌センターシンガポール(NCCS)において、2016年から2018年に異常なマンモグラムが検出された対象597人を含んでいた。シンガポールは、中国人、マレーシア人、インド人および他の人種を含む多民族人口を有し、中国人が大部分である74%を示す。対象の臨床病理学的特徴を表5に示した。末梢血サンプルを生検または外科手術の前に回収した。597人の対象の内、166人は、組織病理学的検査によって乳癌(悪性乳腺病変)を有することが確認された。良性乳腺病変を有する対象から得た合計393サンプルおよび悪性病変を有する対象から得た145サンプルを解析した(図1)。597人の対象から得たサンプルの内、59のサンプルは、サンプル中の血清miRNAへの赤血球細胞miRNAによるコンタミネーションを生じる試料溶血故に、解析から除いた。合計して538のサンプルが品質管理に合格した。これらサンプルを、良性乳腺病変を有する197人の対象および72人の乳癌を有する対象を含む発見コホートと、196例の良性乳腺病変および73の乳癌例を含む検証コホートとに均等に分割した。「正常」対照として、シンガポール・ヘルス・ポリクリニック(SingHealth Polyclinics)の定期的なスクリーニングにおいて正常なスクリーニングマンモグラム(即ち、悪いまたは異常な結果を示さないマンモグラム)を示した100人の対象から血液サンプルを回収した。研究は、全ての研究拠点において、施設内倫理委員会の承認を得、全研究参加者から同意書を得た。
採血および血清の処理
静脈穿刺を用いて末梢血サンプル(20ml)をプレーンな血清チューブ(米国、ニュージャージー州、フランクリンレイク、Becton Dickinson社製のvacutainer(登録商標)プラス・プラスチック血清チューブ)に回収した。血液サンプルは、室温で30~60分間凝固させ、4℃において、3000rpmで10分間遠心分離した。遠心分離後、-80℃で直ちに保存するためにクライオチューブに血清を分注した。
静脈穿刺を用いて末梢血サンプル(20ml)をプレーンな血清チューブ(米国、ニュージャージー州、フランクリンレイク、Becton Dickinson社製のvacutainer(登録商標)プラス・プラスチック血清チューブ)に回収した。血液サンプルは、室温で30~60分間凝固させ、4℃において、3000rpmで10分間遠心分離した。遠心分離後、-80℃で直ちに保存するためにクライオチューブに血清を分注した。
RNAの単離
200μlの各血清サンプルから、miRNeasy血清/血漿キット(オランダ国、ヴェンロ、Qiagen社)を用いて総RNAを抽出した。以下の変更以外は製造者の推奨に従って実施した。(A)サンプルRNA単離の前にサンプル溶解バッファー(QIAzol溶解試薬、オランダ国、ヴェンロ、Qiagen社)に、高、中、低のRNAレベルを表す3種で1セットの専用のスパイク・イン対照(シンガポール国、MiRXES社)を添加した。スパイク・イン対照は、(miRBaseバージョン21内の2588の注釈付き成熟ヒトmiRNAのいずれとも異なる)独自の配列を有する20ヌクレオチドのRNAである。これら対照RNAは、RNA単離の効率のモニタリング、およびRNA単離の際の技術的ばらつきを正規化するために使用された。(B)RNA単離収率を上げるために、バクテリオファージMS2のRNAをサンプル溶解バッファー(1μg/mlのQIAzol)に添加した。(C)サンプルをクロロホルムと混合した後、室温、18,000×gで15分間遠心分離した。(D)RNAを25μlのRNase不含水に溶出させた。
200μlの各血清サンプルから、miRNeasy血清/血漿キット(オランダ国、ヴェンロ、Qiagen社)を用いて総RNAを抽出した。以下の変更以外は製造者の推奨に従って実施した。(A)サンプルRNA単離の前にサンプル溶解バッファー(QIAzol溶解試薬、オランダ国、ヴェンロ、Qiagen社)に、高、中、低のRNAレベルを表す3種で1セットの専用のスパイク・イン対照(シンガポール国、MiRXES社)を添加した。スパイク・イン対照は、(miRBaseバージョン21内の2588の注釈付き成熟ヒトmiRNAのいずれとも異なる)独自の配列を有する20ヌクレオチドのRNAである。これら対照RNAは、RNA単離の効率のモニタリング、およびRNA単離の際の技術的ばらつきを正規化するために使用された。(B)RNA単離収率を上げるために、バクテリオファージMS2のRNAをサンプル溶解バッファー(1μg/mlのQIAzol)に添加した。(C)サンプルをクロロホルムと混合した後、室温、18,000×gで15分間遠心分離した。(D)RNAを25μlのRNase不含水に溶出させた。
miRNA発現のRT-qPCR検出
各血液サンプル中のmiRNA発現を定量するためにRT-qPCRのワークフローを使用した。miRNA特異的逆転写(RT)プライマーを製造社(MiRXES社)の説明書に従って使用し、Veriti(商標)サーマルサイクラー(米国、マサチューセッツ州、ウォルサム、Applied Biosystems社)で血清RNAを逆転写した。各miRNAに特異的なRTプライマーを用いてマルチプレックスなRT反応を実施した。発見のために、非特異的交差およびプライマー-プライマー相互作用を最小にするために、324種のRTプライマーを6のマルチプレックスプライマープール(プール当たり50~60プレックス)に分けた。各RNAサンプルについて、それぞれ2μlの単離RNAで6のマルチプレックスRT反応を実施した。各miRNAの標準曲線用の合成テンプレート(107~102コピーの6-log希釈系列)および非テンプレート対照(ヌクレアーゼ不含水をMS2スパイクしたもの)を血清RNAサンプルと同時に逆転写した。
各血液サンプル中のmiRNA発現を定量するためにRT-qPCRのワークフローを使用した。miRNA特異的逆転写(RT)プライマーを製造社(MiRXES社)の説明書に従って使用し、Veriti(商標)サーマルサイクラー(米国、マサチューセッツ州、ウォルサム、Applied Biosystems社)で血清RNAを逆転写した。各miRNAに特異的なRTプライマーを用いてマルチプレックスなRT反応を実施した。発見のために、非特異的交差およびプライマー-プライマー相互作用を最小にするために、324種のRTプライマーを6のマルチプレックスプライマープール(プール当たり50~60プレックス)に分けた。各RNAサンプルについて、それぞれ2μlの単離RNAで6のマルチプレックスRT反応を実施した。各miRNAの標準曲線用の合成テンプレート(107~102コピーの6-log希釈系列)および非テンプレート対照(ヌクレアーゼ不含水をMS2スパイクしたもの)を血清RNAサンプルと同時に逆転写した。
合成miRNA標準から得たものも含む全cDNAを、Veriti(商標)サーマルサイクラー上で、増強プライマープール(Augmentation Primer Pools)(MiRXES社)による14サイクルのPCR反応を用いて予備増殖した。次にmiRNA特異的qPCRアッセイおよびID3EAL miRNA qPCRマスターミックスを製造社(MiRXES社)の説明書に従って使用し、単一qPCRを実施した。qPCR反応を次にViiA(商標)qPCRシステム(384ウェルの構成、Applied Biosystems社)上で技術的に2回繰り返した。
生の閾値のサイクル(Ct)値を、自動ベースライン設定および閾値を0.5としたViiA(商標)7 RUOソフトウエアを用いて計算した。RT-qPCR効率および潜在的cDNA増幅バイアスは、合成miRNA標準のCt値を分析して求めた。合成miRNA標準曲線の使用は、各サンプルで発現されるmiRNAのコピー数を絶対的に定量することを可能にする。各miRNAの絶対的発現(存在するコピーの数)は、RT-qPCR効率におけるばらつきを補正した後にサンプルのCt値を合成miRNA標準曲線に内挿することで計算した。
バイオマーカーの発見
包括的幾何平均正規化法(global geometric mean normalization method)でmiRNA発現を正規化し、統計学的に有意なP値とlog2変換倍率変化を有するmiRNAを同定するために用いた。悪性および良性の乳腺病変間の個別のmiRNAの発現レベルを比較するために正規化したmiRNA発現値を使用した。miRNA発現変化の統計学的有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定した。P値は、偽陽性率(FDR)による修正を用いる多重仮説検定のために補正した。我々は悪性病変と良性病変との間で差異的に発現されるmiRNAを同定するために、FDR修正P値<0.05を使用した。
包括的幾何平均正規化法(global geometric mean normalization method)でmiRNA発現を正規化し、統計学的に有意なP値とlog2変換倍率変化を有するmiRNAを同定するために用いた。悪性および良性の乳腺病変間の個別のmiRNAの発現レベルを比較するために正規化したmiRNA発現値を使用した。miRNA発現変化の統計学的有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定した。P値は、偽陽性率(FDR)による修正を用いる多重仮説検定のために補正した。我々は悪性病変と良性病変との間で差異的に発現されるmiRNAを同定するために、FDR修正P値<0.05を使用した。
バイオマーカーパネルの構築および最適化
発見コホート内のmiRNAバイオマーカーパネルを構築し、最適化するために、特徴量選択アルゴリズムとロジスティック回帰予測モデルを組み込んだ二重交差検証工程を使用した。サンプルを同じサイズの二重交差検証用の訓練セットと試験セットに分離した。予測モデルの性能は受信者動作特性(ROC)曲線に基づく曲線下面積(AUC)を用いて評価した。2から8種のmiRNAを含む各バイオマーカーパネルについて200回の二重交差検証工程を実施した。各バイオマーカーパネルに含めるmiRNAバイオマーカーの選択にシーケンシャル・フォワード・フローティング選択(SFFS)アルゴリズムを使用した。バイオマーカーパネルに含まれるmiRNAの発現レベルを与えられたときに対象が乳癌であると診断される確率と相関する、6種のmiRNAバイオマーカースコアを計算するための予測モデルを訓練するために、ロジスティック回帰モデルを使用した。
発見コホート内のmiRNAバイオマーカーパネルを構築し、最適化するために、特徴量選択アルゴリズムとロジスティック回帰予測モデルを組み込んだ二重交差検証工程を使用した。サンプルを同じサイズの二重交差検証用の訓練セットと試験セットに分離した。予測モデルの性能は受信者動作特性(ROC)曲線に基づく曲線下面積(AUC)を用いて評価した。2から8種のmiRNAを含む各バイオマーカーパネルについて200回の二重交差検証工程を実施した。各バイオマーカーパネルに含めるmiRNAバイオマーカーの選択にシーケンシャル・フォワード・フローティング選択(SFFS)アルゴリズムを使用した。バイオマーカーパネルに含まれるmiRNAの発現レベルを与えられたときに対象が乳癌であると診断される確率と相関する、6種のmiRNAバイオマーカースコアを計算するための予測モデルを訓練するために、ロジスティック回帰モデルを使用した。
Claims (24)
- 乳癌の治療方法であって、
乳癌を発症している、あるいは乳癌発症のリスクを有すると考えられる対象のサンプルを得、
前記対象から得た前記サンプル中の、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3pからなる群より選ばれる少なくとも2種のmiRNAの発現レベルを測定し、
前記サンプル中の前記miRNAの発現レベルが対照と比べて差異的または無変化であることをもって、前記対象が乳癌を発症している、あるいは乳癌発症のリスクを有すると決定し、そして
乳癌と診断された対象を抗乳癌化合物で治療する
ことを含む、方法。 - 前記方法が、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、少なくとも10種、少なくとも11種、または12種のmiRNAの測定を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも2種のmiRNAが、miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3pを含む、またはこれらからなる、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも2種のmiRNAが、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5pを含む、またはこれらからなる、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 以下のmiRNA: miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、およびmiR-363-3pが存在するとき、これらmiRNAがアップレギュレートされる、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- miR-338-3pが存在するとき、これはダウンレギュレートされる、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5pが存在するとき、これらmiRNAが無変化である、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 対象の乳腺病変が悪性であるか、良性であるかを決定するための方法であって、
対象から得たサンプル中の、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3pからなる群より選ばれる少なくとも2種のmiRNAの発現レベルを測定し、
前記サンプル中の前記miRNAの発現レベルが対照と比べて差異的または無変化であることをもって、前記病変が良性であるか、悪性であるかを決定する
ことを含む、方法。 - 少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、少なくとも6種、少なくとも7種、少なくとも8種、少なくとも9種、少なくとも10種、少なくとも11種、または12種のmiRNAの測定を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記少なくとも2種のmiRNAが、miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、miR-363-3p、およびmiR-338-3pを含む、またはこれらからなる、請求項8または9に記載の方法。
- 前記少なくとも2種のmiRNAが、miR-451a、miR-195-5p、miR-126-5p、miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5pを含む、またはこれらからなる、請求項8~10のいずれか一項に記載の方法。
- miR-451a、miR-195-5p、miR-125b-5p、miR-126-5p、miR-660-5p、miR-25-3p、miR-143-3p、およびmiR-363-3pが存在するとき、これらmiRNAがアップレギュレートされる、請求項8~11のいずれか一項に記載の方法。
- miR-338-3pが存在するとき、これがダウンレギュレートされる、請求項8~12のいずれか一項に記載の方法。
- miR-423-3p、miR-192-5p、およびmiR-17-5pが存在するとき、これらmiRNAが無変化である、請求項8~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照が、癌の無い対象である、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照が、良性の乳腺病変を有する対象である、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対照が、マンモグラムの結果が正常な対象である、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記miRNAの発現レベルが、濃度、log(濃度)、Ct値、Ct/Cq値、または2のCt/Cq値乗のいずれかである、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記miRNAの発現レベルが、リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)で決定される、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サンプルが組織サンプルまたは体液サンプルである、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液が、液状生検、羊水、気管支洗浄液、脳脊髄液、間質液、腹水、胸水、唾液、精液、尿、涙、末梢血、全血、血漿、および血清の細胞性および非細胞性成分からなる群より選ばれる、請求項20に記載の方法。
- 前記対象がマンモグラムの結果が異常であったものである、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、直線モデル、ロジスティック回帰分析、サポートベクターマシンアルゴリズム、ロジスティック回帰アルゴリズム、多項ロジスティック回帰アルゴリズム、フィッシャーの線形判別アルゴリズム、2次識別器アルゴリズム、パーセプトロンアルゴリズム、k近傍法、人工神経回路網アルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、決定木アルゴリズム、単純ベイズアルゴリズム、適応性ベイズネットワークアルゴリズム、および複数の学習アルゴリズムを組み合わせた集団学習方法から選ばれる、miRNAに基づき選択した数学的モデルに基づく予測的スコアを得ることをさらに含む、請求項8~22のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~23のいずれか一項に記載の方法において定義される少なくとも2種のmiRNAの検出に適したプライマーの組み合わせを含むキット。
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---|---|---|---|
JP2022062524A JP2023152484A (ja) | 2022-04-04 | 2022-04-04 | 乳癌の決定および治療の方法 |
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