JP2023150865A - Novel polypeptide and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞内の標的ポリペプチドの分解の制御に使用される新規ポリペプチド及びその利用に関する。 The present invention relates to novel polypeptides used to control the degradation of target polypeptides within cells and their uses.
タンパク質の分解を誘発するポリペプチドであるデグロンを標的ポリペプチドに付加することによって、細胞内の標的ポリペプチドの量を制御する技術が注目されている。例えば、特許文献１には、ヒト炭酸脱水酵素２由来の不安定化ドメイン（ＤＤ）と標的タンパク質（ＰＯＩ）とを融合することによって、ＰＯＩの分解を制御することが開示されている。 A technique that controls the amount of a target polypeptide in cells by adding a degron, which is a polypeptide that induces protein degradation, to the target polypeptide has been attracting attention. For example, Patent Document 1 discloses that the decomposition of POI is controlled by fusing a destabilizing domain (DD) derived from human carbonic anhydrase 2 with a target protein (POI).
特許文献２には、免疫治療薬の発現を制御する生体回路系が開示されている。当該生体回路系は、刺激と、その刺激に応答する少なくとも１つのエフェクターモジュールを備えることが開示されている。また、当該エフェクターモジュールは、刺激と結合し、刺激に応答する刺激応答エレメント（ＳＲＥ）、及びＳＲＥに作動可能に連結した免疫療法薬を含み得ることも開示されている。 Patent Document 2 discloses a biological circuit system that controls the expression of an immunotherapeutic drug. The biocircuit system is disclosed to include a stimulus and at least one effector module responsive to the stimulus. It is also disclosed that the effector module can include a stimulus-responsive element (SRE) that binds to and responds to a stimulus, and an immunotherapeutic agent operably linked to the SRE.
非特許文献１には、野生型のユビキチン又は特定の残基に変異が導入された変異ユビキチンをリンカーペプチドとして、デグロン（ＤＤ）を標的タンパク質に付加する技術が開示されている。当該融合ポリペプチドが付加された標的ポリペプチドを発現する細胞において、特定の刺激を細胞に与えたときのみＤＤが安定化し、プロテアソームによる標的ポリペプチドの分解が抑制されることが開示されている。 Non-Patent Document 1 discloses a technique for adding a degron (DD) to a target protein using wild-type ubiquitin or a mutant ubiquitin in which mutations are introduced into specific residues as a linker peptide. It has been disclosed that in cells expressing a target polypeptide to which the fusion polypeptide has been added, DD is stabilized only when a specific stimulus is applied to the cells, and degradation of the target polypeptide by proteasomes is suppressed.
特許文献１及び２においては、デグロンを標的ポリペプチドに恒久的に付加されるため、標的ポリペプチドの構造又は機能に影響が生じる可能性が考えられる。 In Patent Documents 1 and 2, since the degron is permanently added to the target polypeptide, there is a possibility that the structure or function of the target polypeptide may be affected.
非特許文献１に開示される技術は、リンカーペプチドを用いてデグロンを標的ポリペプチドから切断することができる技術である。非特許文献１に開示される技術において、リンカーペプチドとして野生型のユビキチンを使用すると、標的ポリペプチドからのデグロンの切断速度が速過ぎて、デグロンを介した標的ポリペプチドの分解が生じないことがある。一方で、標的ポリペプチドからのデグロンの切断速度を遅延させるために、リンカーペプチドとして切断に耐性のある変異が導入された変異ユビキチンを使用すると、分解の制御を保ちながら、標的ポリペプチドの切り出しは達成できる。しかし、一部の標的ポリペプチドはデグロンから切断されずに融合タンパク質として細胞内に残存することがあり、更なる改良が求められている。 The technique disclosed in Non-Patent Document 1 is a technique in which a degron can be cleaved from a target polypeptide using a linker peptide. In the technique disclosed in Non-Patent Document 1, when wild-type ubiquitin is used as the linker peptide, the rate of cleavage of the degron from the target polypeptide is too fast, and degron-mediated degradation of the target polypeptide may not occur. be. On the other hand, in order to retard the rate of cleavage of degron from the target polypeptide, using mutant ubiquitin in which a mutation resistant to cleavage has been introduced as a linker peptide allows for the excision of the target polypeptide while maintaining control of degradation. It can be achieved. However, some target polypeptides may remain in cells as fusion proteins without being cleaved from the degron, and further improvements are required.
本発明は、上述の問題に鑑みてなされたものであり、標的ポリペプチドからのデグロンの切断の制御性が改善された新規デグロンタグの提供等を目的とする。 The present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and aims to provide a novel degron tag with improved controllability of cleavage of degron from a target polypeptide.
本発明者らは上記課題を達成するために、鋭意研究を重ねた結果、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）の切断モチーフを含む特定のペプチドとシグナルペプチドとを標的ポリペプチドに付加することによって、標的ポリペプチドからのデグロン等のシグナルペプチドの切断の制御性を改善することを見出して本発明を完成するに至った。 In order to achieve the above object, the present inventors have conducted extensive research and found that by adding a specific peptide containing a deubiquitinating enzyme (DUB) cleavage motif and a signal peptide to a target polypeptide, The present invention was completed by discovering that the controllability of cleavage of signal peptides such as degron from polypeptides can be improved.
本発明の一態様に係るポリペプチドは、シグナルペプチドと、前記シグナルペプチドに作動可能に連結したリンカーペプチドとを含み、
前記シグナルペプチドがユビキチン－プロテアソーム系で分解されるペプチドであり、
前記リンカーペプチドが、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）の切断モチーフを含む５０以下のアミノ酸長のペプチドである、ポリペプチドである。
A polypeptide according to one aspect of the present invention comprises a signal peptide and a linker peptide operably linked to the signal peptide,
The signal peptide is a peptide that is degraded by the ubiquitin-proteasome system,
The linker peptide is a polypeptide having a length of 50 amino acids or less and containing a cleavage motif of a deubiquitinating enzyme (DUB).
本発明の一態様によれば、標的ポリペプチドからのデグロン等のシグナルペプチドの切断の制御性が改善された新規デグロンタグ等を実現することができる。 According to one aspect of the present invention, a novel degron tag or the like with improved controllability of cleavage of a signal peptide such as a degron from a target polypeptide can be realized.
〔用語等の定義〕
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」又は「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体を意図している。また、「塩基配列」は、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」とも換言でき、特に言及のない限り、デオキシリボヌクレオチドの配列又はリボヌクレオチドの配列を意図している。また、ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖構造であってもよく、一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。
[Definition of terms, etc.]
As used herein, "polynucleotide" can also be referred to as "nucleic acid" or "nucleic acid molecule" and is intended to be a polymer of nucleotides. Furthermore, the term "base sequence" can also be referred to as a "nucleic acid sequence" or a "nucleotide sequence," and unless otherwise specified, a deoxyribonucleotide sequence or a ribonucleotide sequence is intended. Further, the polynucleotide may have a single-stranded or double-stranded structure, and in the case of a single-stranded polynucleotide, it may be a sense strand or an antisense strand.
本明細書において、「タンパク質」は、「ポリペプチド」とも換言できる。 In this specification, "protein" can also be referred to as "polypeptide."
本明細書に記載のタンパク質は、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖及びイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。 The protein described in this specification may be a polypeptide formed by peptide bonding of amino acids, but is not limited to this, and may include a structure other than a polypeptide. Structures other than polypeptides herein include sugar chains and isoprenoid groups, but are not particularly limited.
本明細書において、「Ａ及び／又はＢ」は、Ａ及びＢとＡ又はＢとの双方を含む概念であり、「Ａ及びＢの少なくとも一方」とも換言できる。 In this specification, "A and/or B" is a concept that includes both A and B and A or B, and can also be translated as "at least one of A and B."
本明細書において、「アミノ酸の変異」とは、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加を総称するものである。 As used herein, "amino acid mutation" is a general term for amino acid substitution, deletion, insertion, and/or addition.
〔１．ポリペプチド〕
本発明の一態様に係るポリペプチド（以下、「本ポリペプチド」と示す場合がある）は、シグナルペプチドとリンカーペプチドとを含む。本ポリペプチドを標的ポリペプチドに付加した融合タンパク質を細胞内で発現させることによって、細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御（好ましくは、刺激化合物によって細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御）することができる。標的ポリペプチドの分解を制御する方法については後述する。
[1. polypeptide]
The polypeptide according to one aspect of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "the present polypeptide") includes a signal peptide and a linker peptide. By expressing in cells a fusion protein in which the present polypeptide is added to a target polypeptide, the degradation of the target polypeptide in the cells is controlled (preferably, the degradation of the target polypeptide in the cells is controlled by a stimulating compound). be able to. A method for controlling the degradation of a target polypeptide will be described later.
（シグナルペプチド）
上記シグナルペプチドは、ユビキチン－プロテアソーム系で分解されるペプチドである。シグナルペプチドの例としてデグロン等が挙げられる。
(signal peptide)
The signal peptide is a peptide that is degraded by the ubiquitin-proteasome system. Examples of signal peptides include degron and the like.
デグロンは、タンパク質の分解を誘導するポリペプチドである。デグロンが付加された標的ポリペプチドは、ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼ）に認識され、ポリユビキチンが標的ポリペプチドに付加される。そして、プロテアソームによって標的ポリペプチドが分解される。 Degrons are polypeptides that induce protein degradation. The degron-added target polypeptide is recognized by a ubiquitin ligase (eg, E3 ubiquitin ligase), and polyubiquitin is added to the target polypeptide. The target polypeptide is then degraded by the proteasome.
上記シグナルペプチドとして公知のデグロンを使用することができる。デグロンの例として、FKBP（FK506結合タンパク質）のデグロン（配列番号５６）、ecDHFR（大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ）のデグロン（配列番号５７）、SALL4（Sal-like protein 4）のデグロン（配列番号５８）等が挙げられる。 A known degron can be used as the signal peptide. Examples of degrons include FKBP (FK506 binding protein) degron (SEQ ID NO: 56), ecDHFR (Escherichia coli dihydrofolate reductase) degron (SEQ ID NO: 57), SALL4 (Sal-like protein 4) degron (SEQ ID NO: 58), etc. can be mentioned.
上記シグナルペプチドの範疇には、例えば、上記した何れかのシグナルペプチドと９０％以上のアミノ酸配列同一性を示すシグナルペプチドが含まれる。この配列同一性は、９２％以上であることが好ましく、９５％以上であることが好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることが特に好ましい場合がある。「アミノ酸の変異」の個数の観点では、シグナルペプチドのアミノ酸配列の全長が凡そ１００アミノ酸の場合、アミノ酸変異の数が１０個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下であるシグナルペプチドが、シグナルペプチドの範疇に含まれる。 The category of the above-mentioned signal peptide includes, for example, a signal peptide showing 90% or more amino acid sequence identity with any of the above-mentioned signal peptides. This sequence identity is preferably 92% or more, preferably 95% or more, and may particularly preferably be 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more. In terms of the number of "amino acid mutations," if the total length of the amino acid sequence of the signal peptide is approximately 100 amino acids, the number of amino acid mutations is 10 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, 2 or less, or one or less signal peptides are included in the category of signal peptides.
上記シグナルペプチドの範疇に含まれるFKBPの変異体の例として、L107Pのアミノ酸変異を有するFKBP、F37Vのアミノ酸変異を有するFKBP、F37V及びL107Pのアミノ酸変異を有するFKBP等が挙げられる。例えば、L107Pという表示は、１０７番目に相当するアミノ酸残基がＬ（ロイシン）からＰ（プロリン）に置換していることを示し、他のアミノ酸置換についても同様の表示に従って示す。 Examples of FKBP variants included in the above-mentioned signal peptide category include FKBP having an amino acid mutation of L107P, FKBP having an amino acid mutation of F37V, FKBP having amino acid mutations of F37V and L107P, and the like. For example, the designation L107P indicates that the amino acid residue corresponding to the 107th position is substituted from L (leucine) to P (proline), and other amino acid substitutions are also shown according to the same designation.
上記シグナルペプチドの範疇に含まれるecDHFRの変異体の例として、R12Yのアミノ酸変異を有するecDHFR、G67Sのアミノ酸変異を有するecDHFR、Y100Iのアミノ酸変異を有するecDHFR、R12Y及びG76Sのアミノ酸変異を有するecDHFR、R12Y及びY100Iのアミノ酸変異を有するecDHFR、G76S及びY100Iのアミノ酸変異を有するecDHFR、R12Y、G76S及びY100Iのアミノ酸変異を有するecDHFR等が挙げられる。 Examples of ecDHFR variants included in the above signal peptide category include ecDHFR with an R12Y amino acid mutation, ecDHFR with a G67S amino acid mutation, ecDHFR with a Y100I amino acid mutation, ecDHFR with R12Y and G76S amino acid mutations, Examples include ecDHFR with amino acid mutations of R12Y and Y100I, ecDHFR with amino acid mutations of G76S and Y100I, and ecDHFR with amino acid mutations of R12Y, G76S, and Y100I.
（リンカーペプチド）
上記リンカーペプチドは、上記シグナルペプチドに作動可能に連結している。リンカーペプチドは、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）の切断モチーフを含む。脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）とは、ユビキチンタンパク質又はユビキチン様タンパク質を、基質タンパク質から切断することで脱ユビキチン化をする酵素の総称である。ユビキチンタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に示されるアミノ酸配列である。ユビキチン様タンパク質の例として、ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２及びＳＵＭＯ３等のＳＵＭＯ（small ubiquitin-related modifier）並びにＮＥＤＤ８（Neural precursor cell Expressed Developmentally Down-regulated protein 8）等が挙げられる。
(linker peptide)
The linker peptide is operably linked to the signal peptide. The linker peptide contains a deubiquitinating enzyme (DUB) cleavage motif. Deubiquitinase (DUB) is a general term for enzymes that deubiquitinate ubiquitin proteins or ubiquitin-like proteins by cleaving them from substrate proteins. The amino acid sequence of ubiquitin protein is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2. Examples of ubiquitin-like proteins include SUMO (small ubiquitin-related modifiers) such as SUMO1, SUMO2, and SUMO3, and NEDD8 (Neural precursor cell Expressed Developmentally Down-regulated protein 8).
脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）の切断モチーフの例として、配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＬＲＧＧ）又はＧＧが挙げられ、リンカーペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。 Examples of cleavage motifs for deubiquitinating enzymes (DUBs) include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (LRGG) or GG, and the linker peptide preferably includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
上記リンカーペプチドは、例えば５０以下、４５以下、４０以下、３５以下、３０以下又は２５以下のアミノ酸長のペプチドであり、２０以下のアミノ酸長のペプチドであることが好ましい場合がある。標的ポリペプチドからのデグロン等のシグナルペプチドの切断の制御性がより改善される点等で、リンカーペプチドは、１５以下のアミノ酸長であることが好ましい。また、リンカーペプチドは、５以上のアミノ酸長であることが好ましく、７以上のアミノ酸長であることがより好ましく、８以上のアミノ酸長であることがさらに好ましい。上記リンカーペプチドの好ましい一態様は、ユビキチンタンパク質又はユビキチン様タンパク質の部分配列であり、より好ましい一態様は配列番号１に示されるアミノ酸配列（ＬＲＧＧ）又はＧＧを含むユビキチンタンパク質又はユビキチン様タンパク質の部分配列である。 The linker peptide is, for example, a peptide with a length of 50 or less, 45 or less, 40 or less, 35 or less, 30 or less, or 25 or less amino acids, and is preferably a peptide with a length of 20 or less amino acids. The linker peptide is preferably 15 amino acids or less in length, since the controllability of cleavage of a signal peptide such as a degron from the target polypeptide is further improved. Further, the linker peptide preferably has a length of 5 or more amino acids, more preferably 7 or more amino acids, and even more preferably 8 or more amino acids. A preferred embodiment of the linker peptide is a partial sequence of a ubiquitin protein or a ubiquitin-like protein, and a more preferred embodiment is a partial sequence of a ubiquitin protein or a ubiquitin-like protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (LRGG) or GG. It is.
上記リンカーペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸長であるペプチドであってもよい。上記リンカーペプチドの例を以下に示す。配列番号２に示されるアミノ酸配列はユビキチンのアミノ酸配列である。
・配列番号２に示されるアミノ酸配列の７２～７６番目のアミノ酸配列
（配列番号３）
・配列番号２に示されるアミノ酸配列の７１～７６番目のアミノ酸配列
（配列番号４）
・配列番号２に示されるアミノ酸配列の７０～７６番目のアミノ酸配列
（配列番号５）
・配列番号２に示されるアミノ酸配列の６９～７６番目のアミノ酸配列
（配列番号６）
・配列番号２に示されるアミノ酸配列の６８～７６番目のアミノ酸配列
（配列番号７）
・配列番号２に示されるアミノ酸配列の６７～７６番目のアミノ酸配列
（配列番号８）
・配列番号２に示されるアミノ酸配列の６６～７６番目のアミノ酸配列
（配列番号９）
The linker peptide may be a peptide that is 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 amino acids in length and includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Examples of the above linker peptides are shown below. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of ubiquitin.
・Amino acid sequence from position 72 to 76 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 3)
・Amino acid sequence 71st to 76th of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 4)
・Amino acid sequence 70th to 76th of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 5)
・Amino acid sequence 69th to 76th of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 6)
・Amino acid sequence 68th to 76th of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 7)
・Amino acid sequence 67th to 76th of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 8)
・Amino acid sequence 66th to 76th of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 9)
上記リンカーペプチドの範疇には、例えば、ユビキチンタンパク質又はユビキチン様タンパク質のＣ末端側の２０アミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を示すリンカーペプチドが含まれる。この配列同一性は、９２％以上であることが好ましく、９５％以上であることが好ましく、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であることが特に好ましい場合がある。 The category of the linker peptide includes, for example, a linker peptide that exhibits 90% or more amino acid sequence identity with the C-terminal 20 amino acid sequence of a ubiquitin protein or a ubiquitin-like protein. This sequence identity is preferably 92% or more, preferably 95% or more, and may particularly preferably be 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
本ポリペプチドにおいて、上記リンカーペプチドは、上記シグナルペプチドのＮ末端側に位置していてもよく、Ｃ末端側に位置していてもよい。 In this polypeptide, the linker peptide may be located on the N-terminal side or the C-terminal side of the signal peptide.
本ポリペプチドは、一例では、上記のシグナルペプチド、上記のリンカーペプチド、及び標的ポリペプチド（後述する）がこの順に並んだ融合タンパク質の形態で、細胞内において発現される。本ポリペプチドは、上記シグナルペプチド及び上記リンカーペプチドの他に、アミノ酸長が９以上２０以下であるスペーサーペプチドを含んでいてもよい。スペーサーペプチドを含むことによって、リンカーペプチドとＤＵＢの活性中心との会合時の立体障害をより抑制できる場合がある。スペーサーペプチドは、リンカーペプチドのＮ末端側に位置していてもよく、Ｃ末端側に位置していてもよい。例えば、本ポリペプチドのＮ末端側から、シグナルペプチド－リンカーペプチド－スペーサーペプチドの順に配置されていてもよい。特に、スペーサーペプチドをリンカーペプチドと標的ポリペプチドとの間に位置することによって、リンカーペプチド中のＤＵＢ切断モチーフにＤＵＢの活性中心が会合し易くなる。 In one example, the present polypeptide is expressed in cells in the form of a fusion protein in which the signal peptide described above, the linker peptide described above, and the target polypeptide (described below) are arranged in this order. In addition to the signal peptide and the linker peptide, the present polypeptide may contain a spacer peptide having a length of 9 to 20 amino acids. By including a spacer peptide, it may be possible to further suppress steric hindrance during association of the linker peptide with the active center of DUB. The spacer peptide may be located at the N-terminus or C-terminus of the linker peptide. For example, they may be arranged in the order of signal peptide, linker peptide, and spacer peptide from the N-terminal side of the present polypeptide. In particular, by positioning the spacer peptide between the linker peptide and the target polypeptide, the active center of DUB becomes more likely to associate with the DUB cleavage motif in the linker peptide.
上記スペーサーペプチドは、公知のペプチドタグを含むペプチドであってもよい。ペプチドタグの例として、ＡＧＩＡ、ＦＬＡＧ、ＨＡ及びｃ－Ｍｙｃ等が挙げられる。スペーサーペプチドの例として、配列番号５９に示されるアミノ酸配列であるペプチド等が挙げられる。配列番号５９に示されるアミノ酸配列の１番目～９番目のアミノ酸配列は、ペプチドタグであるＡＧＩＡのアミノ酸配列に相当する。 The spacer peptide may be a peptide containing a known peptide tag. Examples of peptide tags include AGIA, FLAG, HA, and c-Myc. Examples of spacer peptides include the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 59. The 1st to 9th amino acid sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 59 correspond to the amino acid sequence of AGIA, which is a peptide tag.
〔２．融合タンパク質〕
本ポリペプチドと他のポリペプチド（標的ポリペプチド）とを融合させることにより、融合タンパク質を構築することができ、本融合タンパク質も、本発明の範疇に含まれる。本ポリペプチドを融合させる他のポリペプチドの種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在するポリペプチド等を挙げることができる。他のポリペプチドのアミノ酸長は、例えば、１００以上、２００以上、５００以上又は１０００以上であってもよい。
[2. Fusion protein]
A fusion protein can be constructed by fusing this polypeptide with another polypeptide (target polypeptide), and this fusion protein is also included in the scope of the present invention. The type of other polypeptide to which the present polypeptide is fused is not particularly limited, but includes, for example, polypeptides localized within cells. The amino acid length of the other polypeptide may be, for example, 100 or more, 200 or more, 500 or more, or 1000 or more.
標的ポリペプチドは、上記リンカーペプチドに対して、共有結合によって、直接又は間接的に連結されている。融合タンパク質において、標的ポリペプチドは、上記リンカーペプチドのＮ末端側に位置していてもよく、Ｃ末端側に位置していてもよい。例えば、本融合タンパク質のＮ末端側から、シグナルペプチド－リンカーペプチド－標的ポリペプチドの順に配置されていてもよい。 The target polypeptide is directly or indirectly linked to the linker peptide by a covalent bond. In the fusion protein, the target polypeptide may be located at the N-terminus or C-terminus of the linker peptide. For example, they may be arranged in the order of signal peptide, linker peptide, and target polypeptide from the N-terminal side of the fusion protein.
本融合タンパク質の取得方法については特に制限はなく、例えば、遺伝子組換え技術により作製してもよい。遺伝子組換え技術により融合タンパク質を作製する場合、例えば、本ポリヌクレオチドのリンカーペプチドのポリヌクレオチドと他のポリペプチドのポリヌクレオチドとを連結することによって、所望の融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを得ることができる。このポリヌクレオチドを適当な発現系に導入することにより、本融合タンパク質を産生することができる。 There are no particular restrictions on the method for obtaining this fusion protein, and for example, it may be produced by genetic recombination technology. When producing a fusion protein by genetic recombination technology, for example, by linking the polynucleotide of the linker peptide of the present polynucleotide and the polynucleotide of another polypeptide, a polynucleotide containing a base sequence encoding the desired fusion protein is produced. Nucleotides can be obtained. The present fusion protein can be produced by introducing this polynucleotide into an appropriate expression system.
〔３．ポリヌクレオチド〕
本発明の一態様に係るポリヌクレオチド（以下、「本ポリヌクレオチド」と示す場合がある）は、本ポリペプチドまたは本融合タンパク質をコードする塩基配列を含む。
[3. polynucleotide]
A polynucleotide according to one aspect of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "the present polynucleotide") includes a base sequence encoding the present polypeptide or the present fusion protein.
本ポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態、又はＤＮＡの形態で存在し得る。ＲＮＡの形態とは、例えば、ｍＲＮＡである。ＤＮＡの形態とは、例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡである。ＤＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。 The polynucleotide can exist in the form of RNA or in the form of DNA. The form of RNA is, for example, mRNA. The form of DNA is, for example, cDNA or genomic DNA. DNA may be double-stranded or single-stranded.
本ポリヌクレオチドを取得する（単離する）方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ホスホロアミダイト法等の核酸合成法に従って合成してもよい。 The method for obtaining (isolating) the present polynucleotide is not particularly limited, but it may be synthesized, for example, according to a nucleic acid synthesis method such as the phosphoramidite method.
また、本ポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の核酸増幅法を用いる方法を挙げることができる。例えば、当該ポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側及び３’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅する。これによって、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。 Further, as a method for obtaining the present polynucleotide, a method using a nucleic acid amplification method such as PCR can be mentioned. For example, primers are prepared from the 5' and 3' sequences (or their complementary sequences) of the cDNA of the polynucleotide, and these primers are used to perform PCR, etc. using genomic DNA or cDNA as a template. to amplify the DNA region sandwiched between both primers. Thereby, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide according to the present invention can be obtained.
〔４．ベクター〕
本発明の一態様に係るベクター（以下、「本ベクター」と示す場合がある）は、本ポリヌクレオチドを含む。すなわち、本ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）は、適当なベクター中に挿入されたベクターとして利用に供することもできる。当該ベクターの種類は、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、或いは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
[4. vector〕
The vector according to one aspect of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "the present vector") contains the present polynucleotide. That is, the present polynucleotide (eg, DNA) can also be used as a vector inserted into an appropriate vector. The type of vector may be, for example, a vector that replicates autonomously (such as a plasmid), or one that is integrated into the genome of the host cell when introduced into the host cell and is replicated together with the integrated chromosome. It may be.
上記ベクターは、好ましくは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明に係るポリヌクレオチドは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、スプライスシグナル、及びターミネーター等）が機能的に連結されている。 The vector described above is preferably an expression vector. In the expression vector, the polynucleotide according to the present invention is functionally linked with elements necessary for transcription (eg, promoter, enhancer, ribosome binding site, splice signal, terminator, etc.).
ベクターの例として、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクター；プラスミドベクター、バクテリアベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、及びコスミドベクター等の非ウイルスベクター；等が挙げられる。 Examples of vectors include viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, and lentivirus vectors; non-viral vectors such as plasmid vectors, bacterial vectors, phage vectors, phagemid vectors, and cosmid vectors; etc. It will be done.
本ベクターは、本ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの他に、標的ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。或いは、本ベクターは、本ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドに隣接して、外来配列を挿入可能な挿入部位を備えていてもよい。この挿入部位には、例えば、任意の標的ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが挿入される。 In addition to the polynucleotide containing the base sequence encoding the present polypeptide, the present vector may further contain a polynucleotide containing the base sequence encoding the target polypeptide. Alternatively, the present vector may be provided with an insertion site into which a foreign sequence can be inserted, adjacent to the polynucleotide containing the base sequence encoding the present polypeptide. For example, a polynucleotide containing a base sequence encoding an arbitrary target polypeptide is inserted into this insertion site.
本ベクターの構築は、例えば、公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。 The present vector can be constructed using, for example, known genetic engineering techniques.
〔５．形質転換体〕
本ポリヌクレオチド又は本ベクター（本発明の一態様に係る核酸構築物と総称する）を適当な宿主細胞に導入することによって形質転換体を作製することができる。
[5. Transformant]
A transformant can be produced by introducing the present polynucleotide or the present vector (collectively referred to as the nucleic acid construct according to one aspect of the present invention) into an appropriate host cell.
宿主細胞としては、例えば、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、及び高等真核細胞等が挙げられる。 Examples of host cells include bacterial cells, yeast cells, fungal cells, and higher eukaryotic cells.
細菌細胞の例としては、バチルス又はストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト法、又はコンピテント細胞を用いる方法等により行えばよい。 Examples of bacterial cells include Gram-positive bacteria such as Bacillus or Streptomyces or Gram-negative bacteria such as E. coli. Transformation of these bacterial cells may be performed, for example, by the protoplast method or a method using competent cells.
酵母細胞の例としては、サッカロマイセス又はシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)又はサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)等が挙げられる。本発明の核酸構築物の酵母宿主への導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。 Examples of yeast cells include cells belonging to Saccharomyces or Schizosaccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae or Saccharomyces kluyveri. Examples of methods for introducing the nucleic acid construct of the present invention into yeast hosts include electroporation, spheroblast method, lithium acetate method, and the like.
酵母細胞以外の真菌細胞の例は、糸状菌、例えば、アスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、又はトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、本発明の核酸構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。核酸構築物の宿主染色体への組み込みは、例えば、相同組換え又は異種組換えにより行うことができる。 Examples of fungal cells other than yeast cells are cells belonging to filamentous fungi, such as Aspergillus, Neurospora, Fusarium, or Trichoderma. When using a filamentous fungus as a host cell, transformation can be performed by integrating the nucleic acid construct of the present invention into the host chromosome to obtain a recombinant host cell. Integration of the nucleic acid construct into the host chromosome can be performed, for example, by homologous recombination or heterologous recombination.
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。 When using insect cells as host cells, the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-introduced into the insect cells to obtain the recombinant virus in the insect cell culture supernatant, and then the recombinant virus is further introduced into the insect cells. can be infected and the protein expressed. Examples of the co-introduction method include the calcium phosphate method and the lipofection method.
哺乳動物細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞又はＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳動物細胞の形質転換には、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。 Examples of mammalian cells include HEK293 cells, HeLa cells, COS cells, BHK cells, CHL cells, or CHO cells. For the transformation of mammalian cells, for example, an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method, etc. can be used.
上記の形質転換体は、導入された核酸構築物の発現を可能にする条件下で、適切な培養培地中で培養する。 The transformants described above are cultured in a suitable culture medium under conditions that allow expression of the introduced nucleic acid construct.
なお、形質転換体は、細胞に限定されない。すなわち、形質転換体は、例えば、本発明の一態様に係る核酸構築物で形質転換された組織、器官、及び個体であってもよい。ただし、細胞以外の形質転換体は、非ヒト由来のものであることが好ましい場合があり、特に個体は非ヒト由来のものであることが好ましい。 Note that transformants are not limited to cells. That is, the transformant may be, for example, a tissue, an organ, or an individual transformed with the nucleic acid construct according to one embodiment of the present invention. However, it may be preferable that the transformant other than the cell is derived from a non-human, and it is particularly preferable that the individual is derived from a non-human.
〔６．利用方法〕
（薬学的組成物としての利用）
本発明はまた、上記融合タンパク質、当該融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は当該ポリヌクレオチドをコードするベクターを含む薬学的組成物を提供する。
[6. How to Use〕
(Use as a pharmaceutical composition)
The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the above fusion protein, a polynucleotide comprising a base sequence encoding the fusion protein, or a vector encoding the polynucleotide.
本発明の一態様に係る薬学的組成物は、上記融合タンパク質、当該融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は当該ポリヌクレオチドをコードするベクター以外の他の成分をさらに含んでいてもよい。当該他の成分は特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塩類、緩衝剤、安定剤、保存剤、賦形剤、抗酸化剤、粘度調整剤、着色剤、香味料、及び甘味料等が挙げられる。薬学的組成物が水溶液として形成される場合、純水（滅菌水）、生理食塩液、又はリン酸緩衝生理食塩液等を担体として使用し得る。薬学的組成物が他の適切な溶液として形成される場合、生体内に導入されることができる有機エステル、例えばグリコール、グリセロール、又はオリーブ油等を担体として使用し得る。 The pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention may further contain components other than the above fusion protein, a polynucleotide containing a base sequence encoding the fusion protein, or a vector encoding the polynucleotide. . The other components are not particularly limited, but include, for example, pharmaceutically acceptable carriers, lubricants, preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, salts for adjusting osmotic pressure, buffers, stabilizers, preservatives, Excipients, antioxidants, viscosity modifiers, colorants, flavorings, sweeteners, and the like. When the pharmaceutical composition is formed as an aqueous solution, pure water (sterile water), saline, phosphate buffered saline, or the like may be used as a carrier. When the pharmaceutical composition is formed as another suitable solution, organic esters that can be introduced into the body, such as glycols, glycerol, or olive oil, may be used as carriers.
本発明の一態様に係る薬学的組成物は、使用説明書と共に、容器、パック、又はディスペンサー等に収容されてもよい。 The pharmaceutical composition according to one aspect of the present invention may be housed in a container, pack, dispenser, or the like, along with instructions for use.
本発明の一態様に係る薬学的組成物は、細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御する刺激化合物と組み合わせられた組合せ物として提供されてもよい。刺激化合物は、例えば、デグロンとしてdegradation tag（dtag）を使用したDrug-off型システム、または、デグロンとして不安定化ドメインを使用したDrug-on型システム等として知られているデグロン技術の中で用いられている刺激化合物の中から、上記のシグナルペプチドの種類に応じて選択すればよい。 Pharmaceutical compositions according to one aspect of the invention may be provided in combination with a stimulating compound that controls the degradation of a target polypeptide within a cell. Stimulatory compounds are used in degron technologies known as, for example, drug-off systems using degradation tags (dtags) as degrons, or drug-on systems using destabilizing domains as degrons. The stimulatory compounds may be selected from among the available stimulatory compounds according to the type of signal peptide described above.
本発明の一態様に係る薬学的組成物の別態様としては、採取された細胞に上記融合タンパク質を発現させるように処置させた細胞であり、上記融合タンパク質を発現させた当該細胞を対象に投与することで、疾患を治療及び／又は予防することができる。前記態様において、採取された細胞は、投与対象となる個体から採取された同種同系の細胞（自家細胞）でもよく、投与対象とは異なる個体から採取された異種同系の細胞（他家細胞）でもよい。 Another embodiment of the pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention is a collected cell treated to express the fusion protein, and the cell expressing the fusion protein is administered to a subject. By doing so, diseases can be treated and/or prevented. In the above embodiment, the collected cells may be allogeneic cells (autologous cells) collected from an individual to be administered, or xenogeneic cells (allogeneic cells) collected from an individual different from the administration target. good.
いずれの態様においても、上記融合タンパク質を細胞内で発現させる際に、特定の細胞小器官に局在するように局在用の移行シグナルを当該融合タンパク質に付加してもよい。 In either embodiment, when the fusion protein is expressed in cells, a localization signal may be added to the fusion protein so that it localizes to a specific organelle.
「治療」の一側面には、対象となる疾患に関連する少なくとも１つの症状について、軽減若しくは緩和すること、進行を遅延すること、及び治癒すること等が包含される。「予防」の一側面には、対象となる疾患に関連する少なくとも１つの症状について発症を防止すること等が包含される。 One aspect of "treatment" includes alleviating or alleviating, delaying progression, curing, and the like of at least one symptom associated with the target disease. One aspect of "prevention" includes preventing the onset of at least one symptom associated with a target disease.
治療及び／又は予防の対象となる生物としては、例えば、ヒト及び非ヒト動物が挙げられ、より具体的には、魚類、鳥類及び哺乳類等の脊椎動物が挙げられる。哺乳類としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ及びネコ等の愛玩動物（ペット）；ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ及びウマ等の家畜；又はヒトが挙げられる。 Examples of organisms targeted for treatment and/or prevention include humans and non-human animals, and more specifically vertebrates such as fish, birds, and mammals. Examples of mammals include laboratory animals such as mice, rats, rabbits, guinea pigs, and primates other than humans; companion animals (pets) such as dogs and cats; livestock such as pigs, cows, goats, sheep, and horses; or humans. It will be done.
治療又は予防される疾患としては、例えば、がん、腫瘍、神経系疾患（中枢神経系疾患、抹消神経系疾患）、感染（ウイルス感染、細菌感染等）性疾患、自己免疫疾患又はアレルギー疾患、及び炎症性疾患などが挙げられる。 Examples of diseases to be treated or prevented include cancer, tumors, nervous system diseases (central nervous system diseases, peripheral nervous system diseases), infectious diseases (viral infections, bacterial infections, etc.), autoimmune diseases or allergic diseases, and inflammatory diseases.
投与経路・方法は特に限定されず、対象とする疾患に応じて適宜選択することができる。患部に直接投与してもよいし、間接的に投与してもよい。また、本発明の融合タンパク質を発現させた細胞を投与することでもよい。一例において、投与経路としては、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内及び子宮内等の経路が挙げられ、局所投与、遺伝子銃を用いる方法等も挙げられる。 The administration route and method are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the target disease. It may be administered directly to the affected area or indirectly. Alternatively, cells expressing the fusion protein of the present invention may be administered. In one example, routes of administration include, for example, oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, and Examples include intrauterine routes, local administration, and methods using a gene gun.
用量及び投与回数は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、疾患の具体的な種類等に応じて適宜選択することができる。 The dose and frequency of administration can be appropriately selected depending on the severity of symptoms, age, sex, body weight, mode of administration, specific type of disease, etc.
（研究ツールとしての利用）
本発明はまた、上記ポリヌクレオチド又はベクターを含む研究用試薬を提供する。研究用試薬は、上記ポリヌクレオチド又はベクター以外の他の成分をさらに含んでいてもよい。当該他の成分は、上述の（薬学的組成物としての利用）で説明したものを参照可能である。
(Use as a research tool)
The present invention also provides research reagents containing the above polynucleotides or vectors. The research reagent may further contain components other than the polynucleotide or vector described above. For the other components, those explained in the above (Use as a pharmaceutical composition) can be referred to.
研究用試薬は、使用説明書と共に、容器、パック、又はディスペンサー等に収容されてもよい。 Research reagents may be contained in containers, packs, dispensers, etc., along with instructions for use.
本発明の一態様に係る研究用試薬は、細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御する刺激化合物と組み合わせられた組合せ物として提供されてもよい。刺激化合物は、例えば、デグロンとしてdegradation tag（dtag）を使用したDrug-off型システム、または、デグロンとして不安定化ドメインを使用したDrug-on型システム等として知られているデグロン技術の中で用いられている刺激化合物の中から、上記のシグナルペプチドの種類に応じて選択すればよい。 Research reagents according to one aspect of the invention may be provided in combination with stimulating compounds that control the degradation of target polypeptides within cells. Stimulatory compounds are used in degron technologies known as, for example, drug-off systems using degradation tags (dtags) as degrons, or drug-on systems using destabilizing domains as degrons. The stimulatory compounds may be selected from among the available stimulatory compounds according to the type of signal peptide described above.
〔７．細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御する方法〕
本発明の一態様に係る細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御する方法（以下、「本発明の一態様に係る方法」と示す場合がある）は、接触工程を含む。
[7. Method for controlling the degradation of target polypeptides in cells]
The method for controlling the degradation of a target polypeptide in cells according to one embodiment of the present invention (hereinafter sometimes referred to as "the method according to one embodiment of the present invention") includes a contacting step.
上記接触工程において、標的ポリペプチドと本ポリペプチドとの融合タンパク質を発現する細胞と刺激化合物とを接触させる。刺激化合物を接触させた細胞に融合タンパク質を発現させてもよいし、融合タンパク質を発現させた細胞に刺激化合物を接触させてもよい。 In the above contact step, cells expressing a fusion protein of the target polypeptide and the present polypeptide are brought into contact with a stimulating compound. The fusion protein may be expressed in cells that have been contacted with a stimulating compound, or the stimulating compound may be contacted with cells that have expressed the fusion protein.
細胞内における融合タンパク質の発現は、恒常的なものであってもよく、一過性のものでもよい。また、誘導性のものであってもよい。恒常的に発現させる場合には、恒常的な発現を行うプロモーターが融合タンパク質の遺伝子上流に連結したポリヌクレオチドを用いればよい。一過性に発現させる場合には、例えばＤＮＡではなくＲＮＡを細胞に導入して発現させればよい。誘導により発現させる場合には、誘導性のプロモーターが融合タンパク質の遺伝子上流に連結したポリヌクレオチドを用いればよい。そして、融合タンパク質を発現させる際に、誘導因子（例えば、ＩＰＴＧ等）を細胞に取り込ませればよい。 Expression of the fusion protein within cells may be constant or transient. Alternatively, it may be inductive. For constitutive expression, a polynucleotide in which a promoter for constitutive expression is linked upstream of the gene of the fusion protein may be used. In the case of transient expression, for example, RNA rather than DNA may be introduced into cells and expressed. In the case of expression by induction, a polynucleotide in which an inducible promoter is linked upstream of the gene of the fusion protein may be used. Then, when expressing the fusion protein, an inducing factor (eg, IPTG, etc.) may be incorporated into the cells.
対象となる細胞としては、〔５．形質転換体〕で列挙された細胞が挙げられる。 Target cells include [5. Transformants].
本発明の一態様に係る方法において、本ポリヌクレオチドを細胞に導入する工程をさらに含んでいてもよい。本ポリヌクレオチドは、ベクターの形態で導入されてもよい。具体的な導入方法は、〔５．形質転換体〕で記載された方法が挙げられる。それゆえ、本発明はさらに、細胞内において融合タンパク質を発現させる細胞を製造する方法を提供する。該製造方法は、本ポリヌクレオチド（すなわち、本融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド）又は本ベクターを細胞に導入する工程を含む。 The method according to one aspect of the present invention may further include the step of introducing the present polynucleotide into cells. The present polynucleotide may be introduced in the form of a vector. For specific introduction methods, see [5. Transformants]. Therefore, the present invention further provides a method of producing a cell that expresses a fusion protein within the cell. The production method includes the step of introducing the present polynucleotide (ie, the polynucleotide containing the base sequence encoding the present fusion protein) or the present vector into cells.
上記融合タンパク質におけるシグナルペプチドが不安定化ドメイン（例えば、FKBP及びDHFR等）の場合、不安定化ドメインの安定化化合物を刺激化合物として細胞に接触させればよい。当該刺激化合物によって不安定化ドメインが安定化されることによって、標的ポリペプチドの分解が抑制され、細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御する。FKBPの安定化化合物の例として、Shield-1又はその薬学的に許容される塩等が挙げられる。DHFRの安定化化合物の例として、トリメトプリム（TMP）又はその薬学的に許容される塩等が挙げられる。 When the signal peptide in the above fusion protein is a destabilizing domain (eg, FKBP, DHFR, etc.), cells may be contacted with a stabilizing compound of the destabilizing domain as a stimulating compound. By stabilizing the destabilizing domain by the stimulating compound, degradation of the target polypeptide is suppressed, thereby controlling the degradation of the target polypeptide within the cell. Examples of FKBP stabilizing compounds include Shield-1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Examples of DHFR stabilizing compounds include trimethoprim (TMP) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
上記融合タンパク質におけるシグナルペプチドが例えばSALL4である場合、サリドマイド又はその誘導体（例えば、ポマリドミド等）等の分解促進化合物を細胞と接触させることにより、標的ポリペプチドの分解が誘導され、細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御する。 When the signal peptide in the above fusion protein is, for example, SALL4, the degradation of the target polypeptide is induced by contacting cells with a degradation-promoting compound such as thalidomide or its derivatives (e.g., pomalidomide, etc.), and the target polypeptide in the cells is Controls peptide degradation.
〔８．キット〕
本発明の一態様に係るキットは、本発明の一態様に係る、ポリペプチド、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター及び形質転換体からなる群より選択される少なくとも１種以上を含む。当該キットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。本ポリペプチド及び本ポリヌクレオチド等の試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液等を用いることができる。
[8. kit〕
A kit according to one aspect of the present invention includes at least one selected from the group consisting of polypeptides, fusion proteins, polynucleotides, vectors, and transformants according to one aspect of the present invention. The kit can be prepared using commonly used materials and techniques known per se. Reagents such as the present polypeptide and the present polynucleotide can be prepared in a form suitable for storage by dissolving them in an appropriate solvent. As the solvent, water, ethanol, various buffer solutions, etc. can be used.
また、本発明の一態様に係るキットは、複数の異なる試薬を、適切な容量及び／又は形態で混合していてもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、当該キットには、例えば、融合タンパク質を細胞内で発現させるための手順等を記載した指示書を含んでもよい。紙若しくはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、又は、磁気テープ、コンピューター等の読み取り可能なディスク若しくはＣＤ－ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよい。 Furthermore, the kit according to one aspect of the present invention may include a plurality of different reagents mixed in appropriate volumes and/or forms, or may be provided in separate containers. The kit may also include instructions describing, for example, the procedure for expressing the fusion protein in cells. It may be written or printed on paper or other media, or it may be attached to an electronic medium such as a magnetic tape, a computer readable disk, or a CD-ROM.
〔まとめ〕
本発明の一態様に係るポリペプチドは、シグナルペプチドと、前記シグナルペプチドに作動可能に連結したリンカーペプチドとを含み、前記シグナルペプチドがユビキチン－プロテアソーム系で分解されるペプチドであり、前記リンカーペプチドが、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）の切断モチーフを含む５０以下のアミノ酸長のペプチドである。
〔summary〕
A polypeptide according to one aspect of the present invention includes a signal peptide and a linker peptide operably linked to the signal peptide, the signal peptide is a peptide that is degraded by the ubiquitin-proteasome system, and the linker peptide is a peptide that is degraded by the ubiquitin-proteasome system. , is a peptide with a length of 50 amino acids or less that contains a cleavage motif of deubiquitinating enzyme (DUB).
本発明の一態様に係るポリペプチドにおいて、前記リンカーペプチドが配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。 In the polypeptide according to one aspect of the present invention, the linker peptide may include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
本発明の一態様に係るポリペプチドにおいて、前記リンカーペプチドが５以上２０以下のアミノ酸長であってもよい。 In the polypeptide according to one aspect of the present invention, the linker peptide may have a length of 5 to 20 amino acids.
本発明の一態様に係るポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドをコードする塩基配列を含む。 A polynucleotide according to one aspect of the present invention includes a base sequence encoding the polypeptide.
本発明の一態様に係るベクターは、前記ポリヌクレオチドを含む。 A vector according to one aspect of the present invention includes the polynucleotide described above.
本発明の一態様に係るベクターは、上記のシグナルペプチドと上記のリンカーペプチドと標的ポリペプチドとがこの順に並んだ融合タンパク質を発現させるためのベクターであって、任意の標的ポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを挿入可能な挿入部位をさらに含んでいてもよい。 A vector according to one aspect of the present invention is a vector for expressing a fusion protein in which the above-mentioned signal peptide, above-mentioned linker peptide, and target polypeptide are arranged in this order, and includes bases encoding any target polypeptide. It may further contain an insertion site into which a polynucleotide containing the sequence can be inserted.
本発明の一態様に係るキットは、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを含む。 A kit according to one aspect of the present invention includes the polynucleotide or the vector.
本発明の一態様に係る細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御する方法は、標的ポリペプチドと上記ポリペプチドとの融合タンパク質を発現する細胞と刺激化合物とを接触させる接触工程を含み、前記リンカーペプチドに対して標的ポリペプチドが直接又は間接的に連結している。 A method for controlling the degradation of a target polypeptide in a cell according to one aspect of the present invention includes a contacting step of contacting a stimulating compound with a cell expressing a fusion protein of the target polypeptide and the above-mentioned polypeptide; A target polypeptide is directly or indirectly linked to the peptide.
本発明の一態様に係る細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御する方法において、前記シグナルペプチドが不安定化ドメインを含み、前記刺激化合物が前記不安定化ドメインを安定化させることによって、標的ポリペプチドの分解を抑制する安定化化合物であってもよい。 In the method for controlling the degradation of a target polypeptide in a cell according to one aspect of the present invention, the signal peptide comprises a destabilizing domain, and the stimulating compound stabilizes the destabilizing domain, thereby stabilizing the target polypeptide. It may also be a stabilizing compound that inhibits degradation of the peptide.
本発明の一態様に係る細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御する方法において、前記刺激化合物が、標的ポリペプチドの分解を誘導する分解促進化合物であってもよい。 In the method for controlling the degradation of a target polypeptide in cells according to one aspect of the present invention, the stimulating compound may be a degradation-promoting compound that induces degradation of the target polypeptide.
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 The present invention is not limited to the embodiments described above, and various modifications can be made within the scope of the claims, and embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. are also included within the technical scope of the present invention.
〔材料と方法〕
（１．化合物）
本実施例で使用したすべての化合物は、以下の会社から購入した：Shield-1（AOBIOUS, Cat# AOB1848）；トリメトプリム（TMP）（SIGMA, Cat# T7883）；ポマリドマイド（Tokyo Chemical Industry, Cat# P2074）。
[Materials and methods]
(1. Compound)
All compounds used in this example were purchased from the following companies: Shield-1 (AOBIOUS, Cat# AOB1848); Trimethoprim (TMP) (SIGMA, Cat# T7883); Pomalidomide (Tokyo Chemical Industry, Cat# P2074) ).
（２．細胞株及び細胞培養）
マウス線維芽細胞様細胞株であるＮＩＨ／３Ｔ３（RIKEN BRC, Cat# RCB1862）、フェニックスルエコトロピックパッケージング（phoenix ecotropic packaging）細胞株、及びヒト上皮細胞株であるＨｅＬａを、１０％熱不活性ウシ胎児血清（Gibco, Cat# 10270-106）、１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（LONZA, Cat# 17-602E）が添加されたＤＭＥＭ（Sigma-Aldrich, Cat# D5796）において培養を行った。すべての細胞株を、加湿環境下、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。
(2. Cell lines and cell culture)
The mouse fibroblast-like cell line NIH/3T3 (RIKEN BRC, Cat# RCB1862), the phoenix ecotropic packaging cell line, and the human epithelial cell line HeLa were 10% heat inactivated. in DMEM (Sigma-Aldrich, Cat# D5796) supplemented with fetal bovine serum (Gibco, Cat# 10270-106), 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin (LONZA, Cat# 17-602E). Culture was performed. All cell lines were maintained at 37 °C and 5% CO2 in a humidified environment.
（３．ＤＮＡ構築物）
本実施例において、レトロウイルスｐＢＭＮベクター及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）を使用した。本実施例において使用したｃＤＮＡ配列を以下に示す：DHFR DD Y100I；FKBP DD L106P；sfGFP（superfolder緑色蛍光タンパク質、GenBank: AB971579）、Ub(K0)（Homo sapiens Ubiquitin-K0, Addgene plasmid #17603）；PPARγ（ヒトペルオキシソーム増殖剤応答性レセプターγ２（human peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2）, Addgene plasmid #11439)；Src（Homo sapiens proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src, RIKEN BRC plasmid #HGY098867）。sGFP-UbC (4-20 aa)-NsiI-DHFR DD Y100I及びDHFR Y100I-NsiI-sfGFPをコードするプラスミドをそれぞれ標準のクローニング法によって構築した（表１－１及び１－２並びに表２－１及び２－２）。簡単に説明すると、ＤＮＡインサート及びバックボーンベクターをＢａｍＨＩ及びＮｓｉＩ酵素（New England Laboratory）によって消化させ、Ligand high Ver.2（TOYOBO, Cat# LGK-201）によってライゲーションした。DHFR DD Y100I-UbC (5-11 aa)-GATC-sfGFPをコードするプラスミドは、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（TOYOBO, Cat# SMK-101）を使用した部位特異的変異導入（site-directed mutagenesis）によって構築した（表１－１及び１－２並びに３）。DHFR DD Y100I/FKBP DD L106P-UbC (5-11 aa)-sfGFP、FKBP DD L106P-UbC 10 aa-PPARγ、FKBP DD L106P-UbC 11 aa-Src-HA及びSALL4 degron-UbC 11 aa-sfGFPをコードするプラスミドをそれぞれ、IRES-mCherryをコードするレトロウイルスｐＢＭＮベクター又はｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにおいて、大腸菌（E. coli）由来シームレスライゲーションクローニング抽出物（ＳＬｉＣＥ；Seamless ligation cloning extract）を使用したシームレスＤＮＡクローニング法によって構築した。表２中、DHFR DD Y100I-Ub*G75V及びFKBP DD L106P-Ub*G75C-sfGFPは、非特許文献１に記載されているものを使用した。なお、本実施例で使用したDHFRは、ecDHFRである。
(3. DNA construct)
In this example, a retroviral pBMN vector and pcDNA3.1(+) were used. The cDNA sequences used in this example are shown below: DHFR DD Y100I; FKBP DD L106P; sfGFP (superfolder green fluorescent protein, GenBank: AB971579), Ub(K0) (Homo sapiens Ubiquitin-K0, Addgene plasmid #17603); PPARγ (human peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2), Addgene plasmid #11439; Src (Homo sapiens proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src, RIKEN BRC plasmid #HGY098867). Plasmids encoding sGFP-UbC (4-20 aa)-NsiI-DHFR DD Y100I and DHFR Y100I-NsiI-sfGFP were constructed by standard cloning methods (Tables 1-1 and 1-2 and Tables 2-1 and 2-2). Briefly, the DNA insert and backbone vector were digested with BamHI and NsiI enzymes (New England Laboratory) and ligated with Ligand high Ver.2 (TOYOBO, Cat# LGK-201). The plasmid encoding DHFR DD Y100I-UbC (5-11 aa)-GATC-sfGFP was subjected to site-directed mutagenesis using KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO, Cat# SMK-101). (Tables 1-1, 1-2, and 3). DHFR DD Y100I/FKBP DD L106P-UbC (5-11 aa)-sfGFP, FKBP DD L106P-UbC 10 aa-PPARγ, FKBP DD L106P-UbC 11 aa-Src-HA and SALL4 degron-UbC 11 encodes aa-sfGFP The plasmids encoding the IRES-mCherry were transformed into seamless DNA using E. coli-derived seamless ligation cloning extract (SLiCE) in the retroviral pBMN vector or pcDNA3.1(+) vector encoding IRES-mCherry, respectively. Constructed by cloning method. In Table 2, DHFR DD Y100I-Ub*G75V and FKBP DD L106P-Ub*G75C-sfGFP were those described in Non-Patent Document 1. Note that the DHFR used in this example is ecDHFR.
（４．ＳＬｉＣＥ抽出物の調製）
１ｍＬのＬＢ培地で３７℃において前培養した、大腸菌ＪＭ１０９（E. coli JM109）コンピテントセル（Takara Bio, Cat# 9052）を５０ｍＬの２×ＹＴ培地に移した。ＯＤ６００が２．０～３．０に到達するまで、２３０ｒｐｍで３７℃において５～６時間細胞を培養した。培養懸濁液を５，０００×ｇで４℃において１０分間遠心分離し、５０ｍＬのよく冷えた（ice-cold）滅菌水で洗浄した。細胞を５，０００×ｇで４℃において５分間遠心分離した。０．３～０．４ｇの湿細胞（wet cell）を１．２ｍＬのCelLytic B Cell Lysis Reagent （Sigma-Aldrich, Cat# B73686）に穏やかに再懸濁し、室温において１０分間インキュベーションした。次に、細胞溶解物を１９，０００×ｇで４℃において２分間遠心分離した。上清を１．５ｍＬのチューブに移して不溶性物質を除去し、等量のよく冷えた８０％（ｖ／ｖ）グリセロールを加え、穏やかに混合した。４０μＬの各ＳＬｉＣＥ抽出物を０．２ｍＬの８連ＰＣＲチューブに等分（aliquot）した。ＳＬｉＣＥ抽出物を液体窒素浴において瞬間凍結させ、－８０℃において保存した。
(4. Preparation of SLiCE extract)
E. coli JM109 competent cells (Takara Bio, Cat# 9052) precultured in 1 mL of LB medium at 37°C were transferred to 50 mL of 2×YT medium. Cells were cultured for 5-6 hours at 37° C. at 230 rpm until OD600 reached 2.0-3.0. The culture suspension was centrifuged at 5,000 xg for 10 minutes at 4°C and washed with 50 mL of ice-cold sterile water. Cells were centrifuged at 5,000 xg for 5 minutes at 4°C. 0.3-0.4 g of wet cells were gently resuspended in 1.2 mL of CelLytic B Cell Lysis Reagent (Sigma-Aldrich, Cat# B73686) and incubated for 10 minutes at room temperature. Cell lysates were then centrifuged at 19,000 xg for 2 minutes at 4°C. The supernatant was transferred to a 1.5 mL tube to remove insoluble material, and an equal volume of chilled 80% (v/v) glycerol was added and mixed gently. 40 μL of each SLiCE extract was aliquoted into eight 0.2 mL PCR tubes. SLiCE extracts were snap frozen in a liquid nitrogen bath and stored at -80°C.
（５．ＳＬｉＣＥ反応）
ＳＬｉＣＥ反応は、ＤＮＡ断片の５末端及び３末端に存在する重複配列（１５～２０塩基）を結合させる相同組換えに基づく。プライマー（表１と４）及びKOD One PCR Master Mix（TOYOBO, Cat# KMM-101）を使用し、製造業者の指示書に従って線状ｐＢＭＮＤＮＡ及びインサートＤＮＡ断片を増幅した。表４中、FKBP DD L106P-NsiI-Hrasは、非特許文献１に記載されているものを使用した。標準ＳＬｉＣＥ反応液は次の成分から構成される：１００ｎｇのＰＣＲ増幅線状ベクター；インサートＤＮＡ（インサートＤＮＡ：ベクター＝１：１（モル比））；１μＬの１０×ＳＬｉＣＥ緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭジチオトレイトール、０．２μｍフィルターでろ過）；１μＬのＳＬｉＣＥ抽出液；及び、滅菌蒸留水（全量１０μＬに調整）。ＳＬｉＣＥ反応混合物を３７℃において１５分間インキュベーションした。５μＬのＳＬｉＣＥ反応液を５０μＬのCompetent high DH5α（TOYOBO, Cat#DNA-903）に移した。形質転換させた大腸菌細胞を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上に広げ、３０℃において２０時間インキュベーションした。
(5. SLiCE reaction)
The SLiCE reaction is based on homologous recombination that joins overlapping sequences (15 to 20 bases) present at the 5 and 3 ends of DNA fragments. Primers (Tables 1 and 4) and KOD One PCR Master Mix (TOYOBO, Cat# KMM-101) were used to amplify linear pBMN DNA and insert DNA fragments according to the manufacturer's instructions. In Table 4, FKBP DD L106P-NsiI-Hras described in Non-Patent Document 1 was used. The standard SLiCE reaction solution consists of the following components: 100 ng of PCR-amplified linear vector; insert DNA (insert DNA:vector = 1:1 (molar ratio)); 1 μL of 10× SLiCE buffer (500 mM Tris-HCl). (pH 7.5), 100 mM MgCl 2 , 10 mM ATP, 10 mM dithiothreitol, filtered with a 0.2 μm filter); 1 μL of SLiCE extract; and sterile distilled water (adjusted to a total volume of 10 μL). The SLiCE reaction mixture was incubated at 37°C for 15 minutes. 5 μL of SLiCE reaction solution was transferred to 50 μL of Competent high DH5α (TOYOBO, Cat#DNA-903). The transformed E. coli cells were spread on LB agar medium containing 50 μg/mL ampicillin and incubated at 30° C. for 20 hours.
（６．トランスフェクション及び形質導入）
レトロウイルスは、TransIT-LT1（Mirus, Cat# V2300）を使用して、フェニックスルエコトロピックパッケージング細胞にｐＢＭＮプラスミドをトランスフェクションすることによって産生した。トランスフェクションしてから４８時間後、レトロウイルスを含む上清を採取し、０．４５μｍフィルターでろ過した。４μｇ／ｍＬのポリブレン（Nacalai tesque, Cat# 12996-81）が添加されたウイルス上清と共に細胞を３７℃において４時間インキュベート後、４８時間増殖培地で培養し、ウイルスインテグレーションを可能にした。
(6. Transfection and transduction)
Retrovirus was produced by transfecting the pBMN plasmid into Phoenix le ecotropic packaging cells using TransIT-LT1 (Mirus, Cat# V2300). Forty-eight hours after transfection, the supernatant containing the retrovirus was collected and filtered through a 0.45 μm filter. Cells were incubated for 4 hours at 37° C. with virus supernatant supplemented with 4 μg/mL polybrene (Nacalai tesque, Cat# 12996-81) and then cultured in growth medium for 48 hours to allow virus integration.
pcDNA3.1(+)-AGIA-SALL4 degron-UbC 11 aa-sfGFPをHily-max（Dojindo, Cat# H357）を使用してＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、ビヒクル又はポマリドミド（１０μＭ）と共に培養した。トランスフェクションしてから２日後に細胞溶解物を回収し、イムノブロッティングに使用した。 pcDNA3.1(+)-AGIA-SALL4 degron-UbC 11 aa-sfGFP was transfected into HeLa cells using Hily-max (Dojindo, Cat# H357) and cultured with vehicle or pomalidomide (10 μM). Cell lysates were collected 2 days after transfection and used for immunoblotting.
（７．イムノブロッティング及び抗体）
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ラジオ免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ；radio-immunoprecipitation assay）緩衝液（Sigma-Aldrich, Cat# R0278）を使用して溶解した。細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜（Millipore, Cat# IPFL00010）に移した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（ウサギ, 7074S, Cell Signaling Technology）（マウス, 7076S, Cell Signaling Technology）及びイモビロン（Millipore, Cat# WBKLS0500）を使用して検出を行った。一次抗体は次に示す抗体を使用した：anti-GFP (mouse, 632380, Takara Bio), anti-HA (rabbit, 3724, Cell Signaling Technology)；anti-GAPDH（マウス, 6C5, Abcam）；及び、anti-PPARγ（81B8）（ウサギ, M7556, Cell Signaling Technology）。化学発光シグナルはOdyssey Fc Imaging System（LI-COR）によって記録した。
(7. Immunoblotting and antibodies)
Cells were washed twice with PBS and lysed using radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer (Sigma-Aldrich, Cat# R0278). Cell lysates were separated by SDS-PAGE and transferred to PVDF membranes (Millipore, Cat# IPFL00010). Detection was performed using horseradish peroxidase-labeled secondary antibodies (rabbit, 7074S, Cell Signaling Technology) (mouse, 7076S, Cell Signaling Technology) and Immobilon (Millipore, Cat# WBKLS0500). The following primary antibodies were used: anti-GFP (mouse, 632380, Takara Bio), anti-HA (rabbit, 3724, Cell Signaling Technology); anti-GAPDH (mouse, 6C5, Abcam); -PPARγ (81B8) (Rabbit, M7556, Cell Signaling Technology). Chemiluminescent signals were recorded by Odyssey Fc Imaging System (LI-COR).
〔結果〕
（評価例１：従来技術との比較）
従来技術の融合タンパク質又は本技術の融合タンパク質を細胞に発現させ、FKBP DDの安定化リガンドであるShield-1と当該細胞との接触前後におけるsfGFPの量及び切断効率について比較した。本技術の融合タンパク質（FKBP DD-UbC (5-11 aa)-sfGFP）は、シグナルペプチドとしてFKBP（以下、「FKBP DD」と示す場合がある）、リンカーペプチドとしてＵｂのＣ末端の５～１１個のアミノ酸配列（配列番号２～８）、標的ポリペプチドとしてsfGFPを使用した。従来技術の融合タンパク質は、FKBP DD-Ub*G75V-sfGFP、FKBP DD-Ub*G75S-sfGFP及びFKBP DD-Ub*G75C-sfGFPである。Ub*G75Xは、Ｕｂの７５番目のグリシン（Ｇ）をＸで示すアミノ酸に置換されたＵｂを示す。
〔result〕
(Evaluation example 1: Comparison with conventional technology)
The fusion protein of the prior art or the fusion protein of the present technology was expressed in cells, and the amount and cleavage efficiency of sfGFP were compared before and after contact with the cells and Shield-1, a stabilizing ligand for FKBP DD. The fusion protein of this technology (FKBP DD-UbC (5-11 aa)-sfGFP) consists of FKBP (hereinafter sometimes referred to as "FKBP DD") as a signal peptide and the C-terminal 5-11 of Ub as a linker peptide. amino acid sequences (SEQ ID NOs: 2 to 8), and sfGFP was used as the target polypeptide. Prior art fusion proteins are FKBP DD-Ub*G75V-sfGFP, FKBP DD-Ub*G75S-sfGFP and FKBP DD-Ub*G75C-sfGFP. Ub*G75X indicates Ub in which glycine (G) at position 75 of Ub is substituted with the amino acid indicated by X.
各融合タンパク質を発現させた細胞を含む培地に、１μＭのShield-1を添加し、３７℃において２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を回収し、イムノブロッティングによって、融合タンパク質及び遊離したsfGFPの量を測定した。 1 μM Shield-1 was added to the medium containing cells expressing each fusion protein, and incubated at 37° C. for 24 hours. After incubation, cells were harvested and the amount of fusion protein and free sfGFP was measured by immunoblotting.
従来技術の結果を図１、本技術の結果を図２に示す。図１及び２中、full-lengthは各融合タンパク質の全長、liberated又はnative formはShield-1によって遊離したsfGFPを示す。「3T3」は融合タンパク質を発現させていない細胞の結果、「DD-GFP」はFKBP DD-sfGFP（リンカーペプチドを含まない融合タンパク質）を発現させた細胞の結果を示す。切断効率は、sfGFPのシグナル強度（liberated又はnative form）／全シグナル強度×１００によって算出した。 The results of the conventional technique are shown in FIG. 1, and the results of the present technique are shown in FIG. In FIGS. 1 and 2, full-length indicates the full length of each fusion protein, and liberated or native form indicates sfGFP released by Shield-1. "3T3" indicates the results of cells that did not express the fusion protein, and "DD-GFP" indicates the results of cells that expressed FKBP DD-sfGFP (fusion protein that does not contain a linker peptide). The cleavage efficiency was calculated by sfGFP signal intensity (liberated or native form)/total signal intensity×100.
図１及び図２に示すように、特に、ＵｂのＣ末端の７個以上のアミノ酸配列をリンカーペプチドとして含む本技術の融合タンパク質は、切断効率が８４％以上となり、切断効率が従来技術よりも向上していることが分かった。 As shown in Figures 1 and 2, in particular, the fusion protein of the present technology, which contains a sequence of seven or more amino acids at the C-terminus of Ub as a linker peptide, has a cleavage efficiency of 84% or more, which is higher than that of the conventional technology. I found that it was improving.
（評価例２：リンカーペプチドの長さによる切断効率の影響）
次に、リンカーペプチドの長さを変化させることによる、切断効率の影響について検討した。リンカーペプチドとして、配列番号２の５７～７６番目のアミノ酸からなる配列（２０アミノ酸長）、配列番号２の４７～７６番目のアミノ酸からなる配列（３０アミノ酸長）、又は、配列番号２の３５～７６番目のアミノ酸からなる配列（４２アミノ酸長）を使用した。
(Evaluation Example 2: Effect of length of linker peptide on cleavage efficiency)
Next, we investigated the effect of changing the length of the linker peptide on cleavage efficiency. As a linker peptide, a sequence consisting of amino acids 57th to 76th of SEQ ID NO: 2 (20 amino acids long), a sequence consisting of amino acids 47th to 76th of SEQ ID NO: 2 (30 amino acids long), or 35th to 76th of SEQ ID NO: 2 A sequence consisting of the 76th amino acid (42 amino acids long) was used.
各融合タンパク質（FKBP DD-UbC 20aa-sfGFP、FKBP DD-UbC 30aa-sfGFP、FKBP DD-UbC 42aa-sfGFP）を評価例１と同様の手順で、細胞で発現させてShield-1を添加した。イムノブロッティングによる測定結果を図３に示す。 Each fusion protein (FKBP DD-UbC 20aa-sfGFP, FKBP DD-UbC 30aa-sfGFP, FKBP DD-UbC 42aa-sfGFP) was expressed in cells in the same manner as in Evaluation Example 1, and Shield-1 was added. The measurement results by immunoblotting are shown in FIG. 3.
図３に示すように、いずれの長さのリンカーペプチドでも、切断効率が高かった。一方、FKBP DD-UbC 30aa-sfGFP及びFKBP DD-UbC 42aa-sfGFPを発現させた細胞では、遊離したsfGFPの量（native form）がFKBP DD-UbC 20aa-sfGFPを発現させた細胞よりも低かった。これは、リンカーペプチドの切断によってsfGFPが遊離する事と並行して、デグロンタグを介した融合タンパク質の分解も相当程度に生じているためと考えられる。以上から、リンカーペプチドの切断によるsfGFPの遊離を優位に生じさせるためには、リンカーペプチドの長さは例えば約２０アミノ酸以下が好ましいことが示唆された。 As shown in FIG. 3, the cleavage efficiency was high for linker peptides of any length. On the other hand, in cells expressing FKBP DD-UbC 30aa-sfGFP and FKBP DD-UbC 42aa-sfGFP, the amount of free sfGFP (native form) was lower than in cells expressing FKBP DD-UbC 20aa-sfGFP. . This is thought to be because, in parallel with the release of sfGFP by cleavage of the linker peptide, a considerable degree of degradation of the fusion protein occurs via the degron tag. From the above, it was suggested that the length of the linker peptide is preferably about 20 amino acids or less, for example, in order to preferentially release sfGFP by cleavage of the linker peptide.
（評価例３：安定化リガンド濃度又は処理時間による切断効率の影響）
次に、安定化リガンド（Shield-1又はTMP）の濃度又は処理時間を変化させることによる、切断効率の影響について検討した。本評価例では、融合タンパク質として、FKBP DD-UbC 11aa-sfGFP又はDHFR DD-UbC 11aa-sfGFPを使用した。DHFR DD-UbC 11aa-sfGFPは、シグナルペプチドとして、DHFR（以下、「DHFR DD」と示す場合がある）を使用している。図４～７に示す濃度又は処理時間に変更した以外は、評価例１と同様の手順で、融合タンパク質を細胞で発現させて安定化リガンドを添加した。融合タンパク質としてFKBP DD-UbC 11aa-sfGFP（安定化化合物：Shield-1）を細胞に発現させたときのイムノブロッティングによる測定結果を図４及び６に示す。融合タンパク質としてDHFR DD-UbC 11aa-sfGFP（安定化化合物：TMP）を細胞に発現させたときのイムノブロッティングによる測定結果を図５及び７に示す。
(Evaluation Example 3: Effect of stabilizing ligand concentration or treatment time on cleavage efficiency)
Next, we investigated the effect of changing the concentration or treatment time of the stabilizing ligand (Shield-1 or TMP) on cleavage efficiency. In this evaluation example, FKBP DD-UbC 11aa-sfGFP or DHFR DD-UbC 11aa-sfGFP was used as the fusion protein. DHFR DD-UbC 11aa-sfGFP uses DHFR (hereinafter sometimes referred to as "DHFR DD") as a signal peptide. The fusion protein was expressed in cells and the stabilizing ligand was added in the same manner as in Evaluation Example 1, except that the concentrations and treatment times shown in FIGS. 4 to 7 were changed. Figures 4 and 6 show the results of immunoblotting when FKBP DD-UbC 11aa-sfGFP (stabilizing compound: Shield-1) was expressed as a fusion protein in cells. Figures 5 and 7 show the measurement results by immunoblotting when cells expressed DHFR DD-UbC 11aa-sfGFP (stabilizing compound: TMP) as a fusion protein.
図４及び５に示すように、安定化リガンドの濃度が高くなるほど、タンパク質の発現量が向上した。また、図６及び７に示すように、安定化リガンドの処理時間（培地への安定化リガンド添加後のインキュベーション時間）が長くなるほど、タンパク質の発現量が向上した。 As shown in FIGS. 4 and 5, the higher the concentration of the stabilizing ligand, the higher the protein expression level. Furthermore, as shown in FIGS. 6 and 7, the longer the stabilizing ligand treatment time (incubation time after addition of the stabilizing ligand to the medium), the more the protein expression level improved.
（評価例４：標的ポリペプチドの種類による切断効率の影響）
標的ポリペプチドを、ｈＲＰＡ（ヒト複製タンパク質Ａ（human replication protein A）のサブユニット）、ＰＰＡＲγ又はＳｒｃとしたときの切断効率について測定した。ｈＲＰＡ及びＳｒＣのＣ末端にＨＡタグを付加して評価を行った。
(Evaluation Example 4: Effect of type of target polypeptide on cleavage efficiency)
The cleavage efficiency was measured when the target polypeptide was hRPA (a subunit of human replication protein A), PPARγ, or Src. Evaluation was performed by adding an HA tag to the C-terminus of hRPA and SrC.
各融合タンパク質（FKBP DD-UbC 11aa-hRPA-HA、FKBP DD-UbC 10aa-PPARγ、FKBP DD-UbC 11aa-Src-HA）を評価例１と同様の手順で、細胞で発現させてShield-1を添加した。イムノブロッティングによる測定結果を図８～１０に示す。 Each fusion protein (FKBP DD-UbC 11aa-hRPA-HA, FKBP DD-UbC 10aa-PPARγ, FKBP DD-UbC 11aa-Src-HA) was expressed in cells using the same procedure as in Evaluation Example 1 to generate Shield-1. was added. The measurement results by immunoblotting are shown in FIGS. 8 to 10.
図８～１０に示すように、標的ポリペプチドがＳｒｃの場合は切断効率が高かった。一方、ＰＰＡＲγの場合は切断効率が低かった。これらの結果から、標的ポリペプチドの種類によっては、リンカー配列を改善する必要があることが示唆された。 As shown in Figures 8 to 10, when the target polypeptide was Src, the cleavage efficiency was high. On the other hand, in the case of PPARγ, the cleavage efficiency was low. These results suggested that it is necessary to improve the linker sequence depending on the type of target polypeptide.
（評価例５：シグナルペプチドの種類による切断効率の影響）
次に、シグナルペプチドをSALL4（SALL4 degron）に変えて、融合タンパク質の切断効率を測定した。SALL4 degronが付加された標的ポリペプチドを細胞内で発現後、サリドマイド又はその誘導体を細胞と接触させることにより、標的ポリペプチドの分解が誘導されることが知られている。
(Evaluation Example 5: Effect of signal peptide type on cleavage efficiency)
Next, the signal peptide was changed to SALL4 (SALL4 degron) and the cleavage efficiency of the fusion protein was measured. It is known that after expressing a target polypeptide to which SALL4 degron has been added in cells, the degradation of the target polypeptide is induced by contacting the cells with thalidomide or its derivatives.
融合タンパク質（SALL4degron-UbC 11 aa-sfGFP）を発現させた細胞を含む培地に、刺激化合物として１０μＭのポマリドミドを添加し、３７℃において７２時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を回収し、イムノブロッティングによって、融合タンパク質及び遊離したsfGFPの量を測定した。測定結果を図１１に示す。 To the medium containing cells expressing the fusion protein (SALL4degron-UbC 11 aa-sfGFP), 10 μM pomalidomide was added as a stimulating compound and incubated at 37° C. for 72 hours. After incubation, cells were harvested and the amount of fusion protein and free sfGFP was measured by immunoblotting. The measurement results are shown in FIG.
図１１に示すように、シグナルペプチドをSALL4 degronとしたときも、切断効率を維持することを確認した。 As shown in FIG. 11, it was confirmed that the cleavage efficiency was maintained even when SALL4 degron was used as the signal peptide.
（評価例６：スペーサーペプチドの挿入による切断効率の影響）
評価例４の結果から、標的ポリペプチドの種類によっては、標的ポリペプチドのＮ末端の構造が、ＤＵＢの活性中心とリンカーペプチドとの会合を阻害している可能性が考えられる。そこで、リンカーペプチドと標的ポリペプチドとの間にスペーサーペプチドを挿入することによって、切断効率に変化が生じるかを検討した。融合タンパク質として、以下の融合タンパク質を調製した。
・FKBP DD L106P-Ub 11 aa-GSK3β
Ｎ末端側から、シグナルペプチドであるFKBP DD L106P、リンカーペプチドであるUb 11aa、及び標的ポリペプチドであるGSK3β（グリコーゲン合成酵素キナーゼ３β）が連結された融合タンパク質。
・FKBP DD L106P-Ub 11 aa-AGIA-spacer-GSK3β
Ｎ末端側から、シグナルペプチドであるFKBP DD L106P、リンカーペプチドであるUb 11aa、スペーサーペプチドであるAGIA-spacer（配列番号５９）、及び標的ポリペプチドであるGSK3βが連結された融合タンパク質。
・FKBP DD L106P-Ub 11 aa-AGIA-GSK3β
Ｎ末端側から、シグナルペプチドであるFKBP DD L106P、リンカーペプチドであるUb 11aa、配列番号５９の１～１０番目のアミノ酸配列、及び標的ポリペプチドであるGSK3βが連結された融合タンパク質。
(Evaluation example 6: Effect of insertion of spacer peptide on cleavage efficiency)
From the results of Evaluation Example 4, it is considered that depending on the type of target polypeptide, the N-terminal structure of the target polypeptide may inhibit the association between the active center of DUB and the linker peptide. Therefore, we investigated whether inserting a spacer peptide between the linker peptide and the target polypeptide would change the cleavage efficiency. The following fusion proteins were prepared as fusion proteins.
・FKBP DD L106P-Ub 11 aa-GSK3β
A fusion protein in which a signal peptide FKBP DD L106P, a linker peptide Ub 11aa, and a target polypeptide GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) are linked from the N-terminal side.
・FKBP DD L106P-Ub 11 aa-AGIA-spacer-GSK3β
A fusion protein in which a signal peptide FKBP DD L106P, a linker peptide Ub 11aa, a spacer peptide AGIA-spacer (SEQ ID NO: 59), and a target polypeptide GSK3β are linked from the N-terminal side.
・FKBP DD L106P-Ub 11 aa-AGIA-GSK3β
A fusion protein in which a signal peptide FKBP DD L106P, a linker peptide Ub 11aa, amino acid sequences 1 to 10 of SEQ ID NO: 59, and a target polypeptide GSK3β are linked from the N-terminal side.
各融合タンパク質を評価例１と同様の手順で、細胞で発現させてShield-1を添加した。イムノブロッティングによる測定結果を図１２～１４に示す。図１２はFKBP DD L106P-Ub 11 aa-GSK3βに関する結果、図１３はFKBP DD L106P-Ub 11 aa-AGIA-spacer-GSK3βに関する結果、図１４はFKBP DD L106P-Ub 11 aa-AGIA-GSK3βに関する結果である。 Each fusion protein was expressed in cells in the same manner as in Evaluation Example 1, and Shield-1 was added. The measurement results by immunoblotting are shown in FIGS. 12 to 14. Figure 12 shows the results for FKBP DD L106P-Ub 11 aa-GSK3β, Figure 13 shows the results for FKBP DD L106P-Ub 11 aa-AGIA-spacer-GSK3β, and Figure 14 shows the results for FKBP DD L106P-Ub 11 aa-AGIA-GSK3β. It is.
図１２～１４に示すように、スペーサーペプチドを融合タンパク質に挿入することによって、切断効率が改善された。配列番号５９の１～１０番目のアミノ酸配列は、スペーサーペプチドであるAGIAのアミノ酸配列（配列番号５９の１～９番目のアミノ酸配列に相当）にロイシンが付加されたアミノ酸配列である。図１４の結果から、スペーサーペプチドであるAGIAのアミノ酸配列であっても切断効率が改善されることが当然予想される。 As shown in Figures 12-14, the cleavage efficiency was improved by inserting a spacer peptide into the fusion protein. The 1st to 10th amino acid sequences of SEQ ID NO: 59 are an amino acid sequence in which leucine is added to the spacer peptide AGIA amino acid sequence (corresponding to the 1st to 9th amino acid sequences of SEQ ID NO: 59). From the results in FIG. 14, it is naturally expected that the cleavage efficiency will be improved even with the amino acid sequence of AGIA, which is a spacer peptide.
本発明は、ライフサイエンス分野における研究ツール及び細胞治療又は遺伝子治療等の治療等に利用することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used as a research tool in the life science field and as a treatment such as cell therapy or gene therapy.
Claims (10)
前記シグナルペプチドがユビキチン－プロテアソーム系で分解されるペプチドであり、
前記リンカーペプチドが、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）の切断モチーフを含む５０以下のアミノ酸長のペプチドである、ポリペプチド。 a signal peptide and a linker peptide operably linked to the signal peptide;
The signal peptide is a peptide that is degraded by the ubiquitin-proteasome system,
A polypeptide, wherein the linker peptide is a peptide having a length of 50 amino acids or less and containing a cleavage motif for a deubiquitinating enzyme (DUB).
前記リンカーペプチドに対して標的ポリペプチドが直接又は間接的に連結している、細胞内の標的ポリペプチドの分解を制御する方法。 a contacting step of contacting a stimulating compound with a cell expressing a fusion protein of a target polypeptide and a polypeptide according to any one of claims 1 to 3;
A method for controlling the degradation of a target polypeptide within a cell, wherein the target polypeptide is linked directly or indirectly to the linker peptide.
前記刺激化合物が前記不安定化ドメインを安定化させることによって、標的ポリペプチドの分解を抑制する安定化化合物である、請求項８に記載の方法。 the signal peptide comprises a destabilizing domain;
9. The method of claim 8, wherein the stimulating compound is a stabilizing compound that inhibits degradation of the target polypeptide by stabilizing the destabilizing domain.
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