JP2023145399A - Method for reducing reaction inhibition in nucleic acid amplification - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法に関する。 The present invention relates to a method for reducing reaction inhibition in a nucleic acid amplification reaction.
一般に、生体試料中の核酸を増幅する方法として、界面活性剤、グアニジン等のタンパク質変性剤又はフェノール、クロロホルム等の有機溶媒を使用して生体試料から核酸を抽出（溶出）し、得られた核酸抽出液から核酸を精製してから増幅する方法が知られている（例えば、特許文献１）。タンパク質変性剤及び有機溶媒は核酸増幅反応を阻害するため、この方法では、抽出工程の後にタンパク質変性剤及び有機溶媒を除去するための精製工程が必要である。 Generally, as a method for amplifying nucleic acids in biological samples, nucleic acids are extracted (eluted) from biological samples using protein denaturants such as surfactants and guanidine, or organic solvents such as phenol and chloroform. A method is known in which nucleic acids are purified from an extract and then amplified (for example, Patent Document 1). Since protein denaturants and organic solvents inhibit nucleic acid amplification reactions, this method requires a purification step to remove protein denaturants and organic solvents after the extraction step.
一方、核酸抽出工程の後に精製工程を必ずしも必要としない、核酸の増幅方法も知られている。特許文献２には、ＤＮＡポリメラーゼとシクロデキストリンとバインダーとを少なくとも含有する固相状の試薬を、核酸を含む液体に溶解させる手順と、核酸を増幅する手順と、を含む核酸増幅方法が記載されている。この方法によれば、核酸の抽出にイオン性界面活性剤を用いた場合であっても、固相状試薬に含まれるシクロデキストリンによって、イオン性界面活性剤による核酸増幅反応の阻害を低減することができる。
On the other hand, methods for amplifying nucleic acids that do not necessarily require a purification step after the nucleic acid extraction step are also known.
特許文献２の方法によれば、イオン性界面活性剤による核酸増幅反応の阻害を低減しつつ、精製工程を省略することで核酸の増幅までにかかる時間を短縮できる。しかしながら、この方法では、生体試料に含まれるタンパク質等の生体由来物質によって、核酸増幅反応時に目的の特異的増幅反応が阻害されるという欠点があった。
According to the method of
そこで、本発明は、核酸抽出液を精製せずに増幅反応を行った場合における、生体試料に起因する反応阻害を低減することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to reduce reaction inhibition caused by biological samples when an amplification reaction is performed without purifying a nucleic acid extract.
本発明者らは鋭意検討を行った結果、ドデシルアルコール硫酸エステル塩と、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体との組合せを用いて核酸を抽出することで、核酸抽出液を精製せずに増幅反応を行った場合に、生体試料に起因する反応阻害を低減することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result of extensive research, the present inventors found that by extracting nucleic acids using a combination of dodecyl alcohol sulfate salt and a copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as monomer units, a nucleic acid extract solution The present inventors have discovered that reaction inhibition caused by biological samples can be reduced when an amplification reaction is performed without purifying the sample, leading to the completion of the present invention.
本発明の一側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含み、反応阻害は、生体試料に起因する反応阻害である。 A method for reducing reaction inhibition in a nucleic acid amplification reaction according to one aspect of the present invention includes mixing a biological sample containing a nucleic acid with a dodecyl alcohol sulfate salt and a copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as monomer units. and obtaining a nucleic acid extract, and the reaction inhibition is reaction inhibition caused by the biological sample.
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体は、第一の共重合体、第二の共重合体、第三の共重合体、又は第四の共重合体であってよい。
第一の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８７±４ｃｍ－１、８４２±４ｃｍ－１、８７０±４ｃｍ－１、９５９±４ｃｍ－１、１０５６±４ｃｍ－１、１１６３±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１３８９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７０７±４ｃｍ－１、２９４７±４ｃｍ－１、及び２９９１±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５６±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７５～０．１０３であり、
７８７±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１８６であり、
８４２±４ｃｍ－１で０．０１８～０．０３１であり、
８７０±４ｃｍ－１で０．００９～０．０７８であり、
９５９±４ｃｍ－１で０．３１７～０．９８８であり、
１１６３±４ｃｍ－１で０．６１６～０．７２４であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．１３３～０．１４１であり、
１３８９±４ｃｍ－１で０．０６１～０．０９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．１５８～０．５３３であり、
１７０７±４ｃｍ－１で１．００１～１．２４６であり、
２９４７±４ｃｍ－１で０．０７７～０．０９０であり、
２９９１±４ｃｍ－１で０．０２８～０．０４３である、共重合体である。
第二の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８５±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９６２±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１６２±４ｃｍ－１、１２３２±４ｃｍ－１、１４０４±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１６５２±４ｃｍ－１、１７２２±４ｃｍ－１、２８５３±４ｃｍ－１、及び２９２４±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、共重合体である。
第三の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８６±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９６４±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１５７±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１４０２±４ｃｍ－１、１４７９±４ｃｍ－１、１７２１±４ｃｍ－１、２８７５±４ｃｍ－１、及び２９５７±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７４～０．０８１であり、
７８６±４ｃｍ－１で０．１５７～０．１７２であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０４９～０．０６３であり、
９６４±４ｃｍ－１で０．４６３～０．４６９であり、
１１５７±４ｃｍ－１で０．４５０～０．４５７であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．５４６～０．５６３であり、
１４０２±４ｃｍ－１で０．００４～０．０１７であり、
１４７９±４ｃｍ－１で０．０２６～０．５２０であり、
１７２１±４ｃｍ－１で１．１８６～１．２３４であり、
２８７５±４ｃｍ－１で０．０４７～０．０５４であり、
２９５７±４ｃｍ－１で０．１３８～０．１７１である、共重合体である。
第四の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８４±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９５５±４ｃｍ－１、１０５５±４ｃｍ－１、１１６６±４ｃｍ－１、１２２９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７１７±４ｃｍ－１、及び２９５６±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５５±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０２０～０．０４５であり、
７８４±４ｃｍ－１で０．１６１～０．２１３であり、
８５３±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０１８であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５３～０．０７６であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０３９～０．０６９であり、
９５５±４ｃｍ－１で０．４４２～０．４８１であり、
１１６６±４ｃｍ－１で０．０８０～０．１９７であり、
１２２９±４ｃｍ－１で０．４４３～０．５９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．２０８～０．２２７であり、
１７１７±４ｃｍ－１で０．４６２～０．５３０であり、
２９５６±４ｃｍ－１で０超、０．１０７以下である、共重合体である。
The copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as monomer units may be a first copolymer, a second copolymer, a third copolymer, or a fourth copolymer.
The first copolymer has wave numbers of 748 ± 4 cm -1 , 787 ± 4 cm -1 , 842 ± 4 cm -1 , 870 ± 4 cm -1 , 959 ± 4 cm -1 , and 1056 ± 4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum . −1 , 1163±4cm −1 , 1234±4cm −1 , 1389±4cm −1 , 1481±4cm −1 , 1707±4cm −1 , 2947±4cm −1 , and 2991±4cm −1 It is a polymer, and the peak intensity is 0.075 to 0.103 at 748 ± 4 cm -1 when the peak intensity at 1056 ± 4 cm -1 is 1,
787 ± 4 cm -1 is 0.182 to 0.186,
842 ± 4 cm -1 is 0.018 to 0.031,
870±4cm -1 is 0.009 to 0.078,
959±4cm -1 is 0.317 to 0.988,
1163 ± 4 cm -1 is 0.616 to 0.724,
1234±4cm -1 is 0.133 to 0.141,
1389±4cm -1 is 0.061 to 0.094,
1481±4cm -1 is 0.158 to 0.533,
1707±4cm -1 is 1.001 to 1.246,
2947±4cm -1 is 0.077 to 0.090,
It is a copolymer with a value of 0.028 to 0.043 at 2991±4 cm −1 .
The second copolymer has wave numbers of 748±4 cm -1 , 785±4 cm -1 , 853±4 cm -1 , 874±4 cm -1 , 928±4 cm -1 , and 962±4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum . -1 , 1059±4cm -1 , 1162±4cm -1 , 1232±4cm -1 , 1404±4cm -1 , 1481±4cm -1 , 1652±4cm -1 , 1722± 4cm -1 , 2853±4cm -1 , and a copolymer having a peak at 2924 ± 4 cm -1 , where the peak intensity is 0.030 to 0.046 at 748 ± 4 cm -1 when the peak intensity at 1059 ± 4 cm -1 is 1. can be,
785 ± 4 cm -1 is 0.182 to 0.199,
853±4cm -1 is more than 0 and less than 0.020,
874 ± 4 cm -1 is 0.059 to 0.070,
928 ± 4 cm -1 is 0.052 to 0.062,
962 ± 4 cm -1 is 0.481 to 0.510,
1162 ± 4 cm -1 is 0.156 to 0.229,
1232 ± 4 cm -1 is 0.506 to 0.632,
1404±4cm -1 is 0.003 to 0.018,
1481 ± 4 cm -1 is 0.307 to 0.372,
1652 ± 4 cm -1 is 0.013 to 0.022,
1722 ± 4 cm -1 is 0.582 to 0.647,
2853 ± 4 cm -1 is 0.255 to 0.257,
It is a copolymer with a value of 2924±4 cm −1 of 0.502 to 0.556.
The third copolymer has wave numbers of 748 ± 4 cm -1 , 786 ± 4 cm -1 , 874 ± 4 cm -1 , 964 ± 4 cm -1 , 1059 ± 4 cm -1 , and 1157 ± 4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum. A copolymer having peaks at -1 , 1234±4cm -1 , 1402±4cm -1 , 1479±4cm -1 , 1721±4cm -1 , 2875±4cm -1 , and 2957±4cm -1 , When the peak intensity at 1059 ± 4 cm -1 is taken as 1, the peak intensity is 0.074 to 0.081 at 748 ± 4 cm -1 ,
786 ± 4 cm -1 is 0.157 to 0.172,
874±4cm -1 is 0.049 to 0.063,
964±4cm -1 is 0.463 to 0.469,
1157±4cm -1 is 0.450 to 0.457,
1234±4cm -1 is 0.546 to 0.563,
1402 ± 4 cm -1 is 0.004 to 0.017,
1479±4cm -1 is 0.026 to 0.520,
1721 ± 4 cm -1 is 1.186 to 1.234,
2875 ± 4 cm -1 is 0.047 to 0.054,
It is a copolymer with a value of 0.138 to 0.171 at 2957±4 cm −1 .
The fourth copolymer has wave numbers of 748±4 cm -1 , 784±4 cm -1 , 853±4 cm -1 , 874±4 cm -1 , 928±4 cm -1 , and 955±4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum. -1 , 1055±4cm -1 , 1166±4cm -1 , 1229±4cm -1 , 1481±4cm -1 , 1717±4cm -1 , and a copolymer having peaks at 2956±4cm -1 , When the peak intensity at 1055 ± 4 cm -1 is taken as 1, the peak intensity is 0.020 to 0.045 at 748 ± 4 cm -1 ,
784 ± 4 cm -1 is 0.161 to 0.213,
853 ± 4 cm -1 is 0.013 to 0.018,
874 ± 4 cm -1 is 0.053 to 0.076,
928 ± 4 cm -1 is 0.039 to 0.069,
955 ± 4 cm -1 is 0.442 to 0.481,
1166±4cm -1 is 0.080 to 0.197,
1229±4cm -1 is 0.443 to 0.594,
1481±4cm -1 is 0.208 to 0.227,
1717 ± 4 cm -1 is 0.462 to 0.530,
It is a copolymer with a value of 2956±4 cm −1 of more than 0 and less than 0.107.
第一の共重合体は、図１～３のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有してよく、第二の共重合体は、図４～６のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有してよく、第三の共重合体は、図７～９のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有してよく、第四の共重合体は、図１０～１２のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有してよい。 The first copolymer may have a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of FIGS. The third copolymer may have a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of FIGS. The fourth copolymer may have a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the transformed infrared absorption spectrum, and the fourth copolymer may have a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of FIGS. They may have the same Fourier transform infrared absorption spectra.
生体試料は、唾液、喀痰、又は鼻腔拭い液であってよい。 The biological sample may be saliva, sputum, or nasal swab.
生体試料が唾液又は鼻腔拭い液の場合には、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体として、第一の共重合体、第二の共重合体、又は第三の共重合体を用いてもよい。生体試料が喀痰の場合には、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体として、第一の共重合体又は第四の共重合体を用いてもよい。 When the biological sample is saliva or nasal swab, the copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as a monomer unit is the first copolymer, the second copolymer, or the third copolymer. Combination may also be used. When the biological sample is sputum, the first copolymer or the fourth copolymer may be used as the copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as monomer units.
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体は、好ましくは第一の共重合体である。 The copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as monomer units is preferably the first copolymer.
生体試料をドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合する工程において、核酸抽出液中の第一の共重合体の濃度が０．０１～０．２５％（ｗ／ｖ）となる量の第一の共重合体を混合してもよい。 In the step of mixing a biological sample with a dodecyl alcohol sulfate salt and a copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as monomer units, the concentration of the first copolymer in the nucleic acid extract is 0.01 to 0. .25% (w/v) of the first copolymer may be mixed.
本発明の一側面に係る核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含む。 A method for reducing non-specific amplification in a nucleic acid amplification reaction according to one aspect of the present invention includes converting a biological sample containing a nucleic acid into a copolymer having dodecyl alcohol sulfate salt and 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as monomer units. and the step of obtaining a nucleic acid extract.
核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法において、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８５±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９６２±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１６２±４ｃｍ－１、１２３２±４ｃｍ－１、１４０４±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１６５２±４ｃｍ－１、１７２２±４ｃｍ－１、２８５３±４ｃｍ－１、及び２９２４±４ｃｍ－１にピークを有する第二の共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、第二の共重合体であってよい。第二の共重合体は、図４～６のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有してよい。
In a method for reducing nonspecific amplification in a nucleic acid amplification reaction, a copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as a monomer unit has wave numbers of 748 ± 4 cm −1 and 785 ± 4 cm −1 in a Fourier transform infrared absorption spectrum. 1 , 853 ± 4 cm -1 , 874 ± 4 cm -1 , 928 ± 4 cm -1 , 962 ± 4 cm -1 , 1059 ± 4 cm -1 , 1162 ± 4 cm -1 , 1232 ± 4 cm -1 , 1404 ± 4 cm -1 , A second copolymer having peaks at 1481 ± 4 cm -1 , 1652 ± 4 cm -1 , 1722 ± 4 cm -1 , 2853 ± 4 cm -1 , and 2924 ± 4 cm -1 , the second copolymer having peaks at 1059 ± 4 cm -1 . The peak intensity is 0.030 to 0.046 at 748 ± 4 cm -1 when the peak intensity of is 1,
785 ± 4 cm -1 is 0.182 to 0.199,
853±4cm -1 is more than 0 and less than 0.020,
874 ± 4 cm -1 is 0.059 to 0.070,
928 ± 4 cm -1 is 0.052 to 0.062,
962 ± 4 cm -1 is 0.481 to 0.510,
1162 ± 4 cm -1 is 0.156 to 0.229,
1232 ± 4 cm -1 is 0.506 to 0.632,
1404±4cm -1 is 0.003 to 0.018,
1481 ± 4 cm -1 is 0.307 to 0.372,
1652 ± 4 cm -1 is 0.013 to 0.022,
1722 ± 4 cm -1 is 0.582 to 0.647,
2853 ± 4 cm -1 is 0.255 to 0.257,
The second copolymer may be 0.502 to 0.556 at 2924±4 cm −1 . The second copolymer may have a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of FIGS. 4-6.
核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法において、生体試料は鼻腔拭い液であってよい。 In the method for reducing non-specific amplification in a nucleic acid amplification reaction, the biological sample may be a nasal swab.
核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法において、非特異的増幅は、生体試料に起因する非特異的増幅であってよい。 In the method for reducing non-specific amplification in a nucleic acid amplification reaction, the non-specific amplification may be caused by a biological sample.
本発明によれば、核酸抽出液を精製せずに増幅反応を行った場合における、生体試料に起因する反応阻害を低減することができる。また、本発明によれば、核酸抽出液を精製せずに増幅反応を行った場合における非特異的増幅も低減することができる。 According to the present invention, reaction inhibition caused by a biological sample can be reduced when an amplification reaction is performed without purifying a nucleic acid extract. Furthermore, according to the present invention, non-specific amplification can also be reduced when an amplification reaction is performed without purifying the nucleic acid extract.
本発明の一側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程（以下、抽出工程ともいう。）を含む。反応阻害は、生体試料に起因する反応阻害であり、より具体的には、生体試料中の生体由来物質に起因する反応阻害である。生体由来物質は核酸以外の物質であり、例えばタンパク質が挙げられる。 A method for reducing reaction inhibition in a nucleic acid amplification reaction according to one aspect of the present invention is to combine a biological sample containing a nucleic acid with a dodecyl alcohol sulfate salt and a copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine (MPC) units as monomer units. It includes a step of combining and mixing to obtain a nucleic acid extract (hereinafter also referred to as an extraction step). Reaction inhibition is reaction inhibition caused by a biological sample, and more specifically, reaction inhibition caused by a biologically derived substance in the biological sample. A biologically derived substance is a substance other than a nucleic acid, and includes, for example, a protein.
本明細書において、生体試料とは、生体から採取した試料（検体）又はその懸濁液を意味する。核酸を含む生体試料は特に限定されず、例えば、喀痰、体液、糞便、組織、又はこれらの懸濁液であってよい。体液は、例えば、鼻汁、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、精液、又は羊水であってよい。また、核酸を含む生体試料は、鼻咽頭拭い液、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、又はうがい液であってもよい。 In this specification, a biological sample means a sample (specimen) collected from a living body or a suspension thereof. The biological sample containing the nucleic acid is not particularly limited, and may be, for example, sputum, body fluid, feces, tissue, or a suspension thereof. The body fluid may be, for example, nasal secretions, saliva, blood, serum, plasma, spinal fluid, urine, semen, or amniotic fluid. Furthermore, the biological sample containing the nucleic acid may be a nasopharyngeal swab, a bronchial lavage, a bronchoalveolar lavage, a nasal aspirate, a nasal lavage, a nasal swab, a pharyngeal swab, or a gargle.
生体試料に含まれる核酸の種類は特に限定されない。核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであってよく、一本鎖又は二重鎖であってよい。核酸の由来も限定されず、核酸は、例えば、動物、植物、菌類、細菌類、又はウイルスに由来する核酸であってよい。 The type of nucleic acid contained in the biological sample is not particularly limited. Nucleic acids may be, for example, DNA or RNA, and may be single-stranded or double-stranded. The origin of the nucleic acid is also not limited, and the nucleic acid may be derived from animals, plants, fungi, bacteria, or viruses, for example.
ドデシルアルコール硫酸エステル塩は、ドデシルアルコール硫酸エステルの塩であれば特に限定されず、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）であってよい。 The dodecyl alcohol sulfate salt is not particularly limited as long as it is a salt of dodecyl alcohol sulfate, and may be, for example, sodium dodecyl sulfate (SDS) or lithium dodecyl sulfate (LDS).
ＭＰＣ単位をモノマー単位として有する共重合体（以下、ＭＰＣポリマーという。）としては、日油株式会社製のリピジュア（登録商標）シリーズを用いることができる。ＭＰＣポリマーは、好ましくはＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５として市販されているＭＰＣポリマー（以下、第一の共重合体という。）、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００２として市販されているＭＰＣポリマー（以下、第二の共重合体という。）、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ８０２として市販されているＭＰＣポリマー（以下、第三の共重合体という。）、又はＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０７として市販されているＭＰＣポリマー（以下、第四の共重合体という。）である。これらの製品はいすれも５質量％ＭＰＣポリマー水溶液である。核酸増幅反応における反応阻害を低減する観点からは、第一の共重合体がより好ましい。核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する観点からは、第二の共重合体がより好ましい。ＭＰＣポリマーとして、複数のＭＰＣポリマーを用いてもよい。 As a copolymer having an MPC unit as a monomer unit (hereinafter referred to as an MPC polymer), the Lipidure (registered trademark) series manufactured by NOF Corporation can be used. The MPC polymer is preferably an MPC polymer commercially available as LIPIDURE®-BL405 (hereinafter referred to as the first copolymer), an MPC polymer commercially available as LIPIDURE®-BL1002 (hereinafter referred to as the first copolymer). (referred to as the second copolymer), MPC polymer commercially available as LIPIDURE®-BL802 (hereinafter referred to as the third copolymer), or commercially available as LIPIDURE®-BL407. It is an MPC polymer (hereinafter referred to as the fourth copolymer). All of these products are 5% by mass MPC polymer aqueous solutions. From the viewpoint of reducing reaction inhibition in the nucleic acid amplification reaction, the first copolymer is more preferable. From the viewpoint of reducing non-specific amplification in the nucleic acid amplification reaction, the second copolymer is more preferable. A plurality of MPC polymers may be used as the MPC polymer.
生体試料が唾液又は鼻腔拭い液である場合、ＭＰＣポリマーは、好ましくは第一の共重合体、第二の共重合体、又は第三の共重合体である。生体試料が喀痰である場合、ＭＰＣポリマーは、好ましくは第一の共重合体若しくは第四の共重合体である。 When the biological sample is saliva or nasal swab, the MPC polymer is preferably a first copolymer, a second copolymer, or a third copolymer. When the biological sample is sputum, the MPC polymer is preferably the first copolymer or the fourth copolymer.
第一の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８７±４ｃｍ－１、８４２±４ｃｍ－１、８７０±４ｃｍ－１、９５９±４ｃｍ－１、１０５６±４ｃｍ－１、１１６３±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１３８９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７０７±４ｃｍ－１、２９４７±４ｃｍ－１、及び２９９１±４ｃｍ－１にピークを有する。１０５６±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときの各ピークのピーク強度は、
７４８±４ｃｍ－１で０．０７５～０．１０３であり、
７８７±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１８６であり、
８４２±４ｃｍ－１で０．０１８～０．０３１であり、
８７０±４ｃｍ－１で０．００９～０．０７８であり、
９５９±４ｃｍ－１で０．３１７～０．９８８であり、
１１６３±４ｃｍ－１で０．６１６～０．７２４であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．１３３～０．１４１であり、
１３８９±４ｃｍ－１で０．０６１～０．０９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．１５８～０．５３３であり、
１７０７±４ｃｍ－１で１．００１～１．２４６であり、
２９４７±４ｃｍ－１で０．０７７～０．０９０であり、
２９９１±４ｃｍ－１で０．０２８～０．０４３である。
The first copolymer has wave numbers of 748 ± 4 cm -1 , 787 ± 4 cm -1 , 842 ± 4 cm -1 , 870 ± 4 cm -1 , 959 ± 4 cm -1 , and 1056 ± 4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum . -1 , 1163±4cm -1 , 1234±4cm -1 , 1389±4cm -1 , 1481±4cm -1 , 1707±4cm -1 , 2947±4cm -1 , and 2991±4cm -1 . When the peak intensity at 1056±4cm -1 is set to 1, the peak intensity of each peak is:
748±4cm -1 is 0.075 to 0.103,
787 ± 4 cm -1 is 0.182 to 0.186,
842 ± 4 cm -1 is 0.018 to 0.031,
870±4cm -1 is 0.009 to 0.078,
959±4cm -1 is 0.317 to 0.988,
1163 ± 4 cm -1 is 0.616 to 0.724,
1234±4cm -1 is 0.133 to 0.141,
1389±4cm -1 is 0.061 to 0.094,
1481±4cm -1 is 0.158 to 0.533,
1707±4cm -1 is 1.001 to 1.246,
2947±4cm -1 is 0.077 to 0.090,
It is 0.028 to 0.043 at 2991±4 cm −1 .
図１～３は、後述の実施例６において測定した第一の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。したがって、第一の共重合体は、図１～３のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有するといえる。 1 to 3 are Fourier transform infrared absorption spectra of the first copolymer measured in Example 6 described below. Therefore, it can be said that the first copolymer has a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of FIGS. 1 to 3.
第二の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８５±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９６２±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１６２±４ｃｍ－１、１２３２±４ｃｍ－１、１４０４±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１６５２±４ｃｍ－１、１７２２±４ｃｍ－１、２８５３±４ｃｍ－１、及び２９２４±４ｃｍ－１に特徴的な吸収ピークを有する。１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときの各ピークのピーク強度は、
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である。
The second copolymer has wave numbers of 748±4 cm -1 , 785±4 cm -1 , 853±4 cm -1 , 874±4 cm -1 , 928±4 cm -1 , and 962±4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum . -1 , 1059±4cm -1 , 1162±4cm -1 , 1232±4cm -1 , 1404±4cm -1 , 1481±4cm -1 , 1652±4cm -1 , 1722± 4cm -1 , 2853±4cm -1 , and has a characteristic absorption peak at 2924±4 cm −1 . When the peak intensity at 1059±4cm -1 is set to 1, the peak intensity of each peak is:
748 ± 4 cm -1 is 0.030 to 0.046,
785 ± 4 cm -1 is 0.182 to 0.199,
853±4cm -1 is more than 0 and less than 0.020,
874 ± 4 cm -1 is 0.059 to 0.070,
928 ± 4 cm -1 is 0.052 to 0.062,
962 ± 4 cm -1 is 0.481 to 0.510,
1162 ± 4 cm -1 is 0.156 to 0.229,
1232 ± 4 cm -1 is 0.506 to 0.632,
1404±4cm -1 is 0.003 to 0.018,
1481 ± 4 cm -1 is 0.307 to 0.372,
1652 ± 4 cm -1 is 0.013 to 0.022,
1722 ± 4 cm -1 is 0.582 to 0.647,
2853 ± 4 cm -1 is 0.255 to 0.257,
It is 0.502 to 0.556 at 2924±4 cm −1 .
図４～６は、後述の実施例６において測定した第二の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。したがって、第二の共重合体は、図４～６のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有するといえる。 4 to 6 are Fourier transform infrared absorption spectra of the second copolymer measured in Example 6 described below. Therefore, it can be said that the second copolymer has a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of FIGS. 4 to 6.
第三の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８６±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９６４±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１５７±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１４０２±４ｃｍ－１、１４７９±４ｃｍ－１、１７２１±４ｃｍ－１、２８７５±４ｃｍ－１、及び２９５７±４ｃｍ－１に特徴的な吸収ピークを有する。１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときの各ピークのピーク強度は、
７４８±４ｃｍ－１で０．０７４～０．０８１であり、
７８６±４ｃｍ－１で０．１５７～０．１７２であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０４９～０．０６３であり、
９６４±４ｃｍ－１で０．４６３～０．４６９であり、
１１５７±４ｃｍ－１で０．４５０～０．４５７であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．５４６～０．５６３であり、
１４０２±４ｃｍ－１で０．００４～０．０１７であり、
１４７９±４ｃｍ－１で０．０２６～０．５２０であり、
１７２１±４ｃｍ－１で１．１８６～１．２３４であり、
２８７５±４ｃｍ－１で０．０４７～０．０５４であり、
２９５７±４ｃｍ－１で０．１３８～０．１７１である。
The third copolymer has wave numbers of 748 ± 4 cm -1 , 786 ± 4 cm -1 , 874 ± 4 cm -1 , 964 ± 4 cm -1 , 1059 ± 4 cm -1 , and 1157 ± 4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum. It has characteristic absorption peaks at −1 , 1234±4 cm −1 , 1402±4 cm −1 , 1479±4 cm −1 , 1721±4 cm −1 , 2875±4 cm −1 , and 2957±4 cm −1 . When the peak intensity at 1059±4cm -1 is set to 1, the peak intensity of each peak is:
748±4cm -1 is 0.074 to 0.081,
786 ± 4 cm -1 is 0.157 to 0.172,
874±4cm -1 is 0.049 to 0.063,
964±4cm -1 is 0.463 to 0.469,
1157±4cm -1 is 0.450 to 0.457,
1234±4cm -1 is 0.546 to 0.563,
1402 ± 4 cm -1 is 0.004 to 0.017,
1479±4cm -1 is 0.026 to 0.520,
1721 ± 4 cm -1 is 1.186 to 1.234,
2875 ± 4 cm -1 is 0.047 to 0.054,
It is 0.138 to 0.171 at 2957±4 cm −1 .
図７～９は、後述の実施例６において測定した第三の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。したがって、第三の共重合体は、図７～９のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有するといえる。 7 to 9 are Fourier transform infrared absorption spectra of the third copolymer measured in Example 6 described below. Therefore, it can be said that the third copolymer has a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of FIGS. 7 to 9.
第四の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８４±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９５５±４ｃｍ－１、１０５５±４ｃｍ－１、１１６６±４ｃｍ－１、１２２９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７１７±４ｃｍ－１、及び２９５６±４ｃｍ－１に特徴的な吸収ピークを有する。１０５５±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときの各ピークのピーク強度は、
７４８±４ｃｍ－１で０．０２０～０．０４５であり、
７８４±４ｃｍ－１で０．１６１～０．２１３であり、
８５３±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０１８であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５３～０．０７６であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０３９～０．０６９であり、
９５５±４ｃｍ－１で０．４４２～０．４８１であり、
１１６６±４ｃｍ－１で０．０８０～０．１９７であり、
１２２９±４ｃｍ－１で０．４４３～０．５９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．２０８～０．２２７であり、
１７１７±４ｃｍ－１で０．４６２～０．５３０であり、
２９５６±４ｃｍ－１で０超、０．１０７以下である。
The fourth copolymer has wave numbers of 748±4 cm -1 , 784±4 cm -1 , 853±4 cm -1 , 874±4 cm -1 , 928±4 cm -1 , and 955±4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum. It has characteristic absorption peaks at −1 , 1055±4 cm −1 , 1166±4 cm −1 , 1229±4 cm −1 , 1481±4 cm −1 , 1717±4 cm −1 , and 2956±4 cm −1 . When the peak intensity at 1055±4cm -1 is set to 1, the peak intensity of each peak is:
748 ± 4 cm -1 is 0.020 to 0.045,
784 ± 4 cm -1 is 0.161 to 0.213,
853 ± 4 cm -1 is 0.013 to 0.018,
874 ± 4 cm -1 is 0.053 to 0.076,
928 ± 4 cm -1 is 0.039 to 0.069,
955 ± 4 cm -1 is 0.442 to 0.481,
1166±4cm -1 is 0.080 to 0.197,
1229±4cm -1 is 0.443 to 0.594,
1481±4cm -1 is 0.208 to 0.227,
1717 ± 4 cm -1 is 0.462 to 0.530,
2956±4 cm −1, which is more than 0 and less than 0.107.
図１０～１２は、後述の実施例６において測定した第四の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルである。したがって、第四の共重合体は、図１０～１２のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有するといえる。 10 to 12 are Fourier transform infrared absorption spectra of the fourth copolymer measured in Example 6 described below. Therefore, it can be said that the fourth copolymer has a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of FIGS. 10 to 12.
本明細書に記載されるフーリエ変換赤外吸収スペクトルは、減衰全反射（ＡＴＲ）法を利用したフーリエ変換赤外分光法により測定したスペクトルに対してベースライン補正及びＡＴＲ補正を行ったスペクトルである。ベースライン補正は、具体的には解析ソフトＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（登録商標）ＩＲ（株式会社島津製作所製）を用いて、表１に示す波数を補正点として指定して行うベースライン補正である。ＡＴＲ補正は、具体的には解析ソフトＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（登録商標）ＩＲ（株式会社島津製作所製）を用いて、９９９ｃｍ－１を補正波数として指定して行うＡＴＲ補正である。本明細書に記載されるピーク強度は、上記補正後のスペクトルにおいて、ピークの始点と終点を結んだ線（ベースライン）からピークトップまでの高さ、すなわち、ピークトップからベースラインに引いた垂線における、ベースラインとの交点からピークトップまでの長さを意味する。 The Fourier transform infrared absorption spectrum described in this specification is a spectrum obtained by performing baseline correction and ATR correction on the spectrum measured by Fourier transform infrared spectroscopy using the attenuated total reflection (ATR) method. . Specifically, the baseline correction is performed using the analysis software LabSolutions (registered trademark) IR (manufactured by Shimadzu Corporation) by specifying the wave numbers shown in Table 1 as correction points. Specifically, the ATR correction is performed using analysis software LabSolutions (registered trademark) IR (manufactured by Shimadzu Corporation) by specifying 999 cm −1 as the correction wave number. The peak intensity described in this specification is the height from the line connecting the starting point and ending point of the peak (baseline) to the peak top in the spectrum after the above correction, that is, the perpendicular line drawn from the peak top to the baseline. means the length from the intersection with the baseline to the top of the peak.
本明細書において、「±４」との記載は、その直前に数値が記載されている場合、該直前の数値から４を減じた数値を下限とし、該直前の数値に４を加えた数値を上限とする範囲を示すことを意味する。したがって、例えば、「波数７４８±４ｃｍ－１」は「波数７４４～７５２ｃｍ－１」と同義である。 In this specification, "±4" means that when a numerical value is written immediately before, the lower limit is the value obtained by subtracting 4 from the previous value, and the value obtained by adding 4 to the previous value is the lower limit. It means to indicate the upper limit range. Therefore, for example, "wave number 748±4 cm -1 " is synonymous with "wave number 744 to 752 cm -1 ".
本明細書において、「実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトル」とは、完全に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルだけでなく、測定時に通常生じる誤差の範囲でピークの波数及び／又は強度が異なるフーリエ変換赤外吸収スペクトルも意味する。ここで、実施例６において示されるように、ピークの波数には±４ｃｍ－１の範囲でばらつきが生じ得るため、「実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトル」は、例えば、ピークの波数が±４ｃｍ－１の範囲で異なるフーリエ変換赤外吸収スペクトルであってよい。また、第一～第四の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルおいては、波数１０５５～１０５９ｃｍ－１付近のピークのピーク強度を１としたときの他のピークのピーク強度（本明細書中、「ピーク強度比」ともいう。）に、±３×標準偏差の範囲でばらつきが生じ得る。したがって、「実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトル」は、例えば、ピーク強度比が±３×標準偏差の範囲で異なるフーリエ変換赤外吸収スペクトルであってよく、具体的には、ピーク強度比が実施例６の表８～１１に示すピーク強度比の範囲内で図１～１２とは異なるフーリエ変換赤外吸収スペクトルであってよい。なお、後述するように、表８は第一の共重合体のピークを示し、表９は第二の共重合体のピークを示し、表１０は第三の共重合体のピークを示し、表１１は第四の共重合体のピークを示す。 In this specification, "substantially the same Fourier transform infrared absorption spectrum" means not only a completely identical Fourier transform infrared absorption spectrum, but also a peak wave number and/or intensity within the error range that normally occurs during measurement. also means a different Fourier transform infrared absorption spectrum. Here, as shown in Example 6, since the wave number of the peak can vary within the range of ±4 cm -1 , "substantially the same Fourier transform infrared absorption spectrum" is defined by the wave number of the peak, for example. may be Fourier transform infrared absorption spectra that differ within a range of ±4 cm −1 . In addition, in the Fourier transform infrared absorption spectra of the first to fourth copolymers, when the peak intensity of the peak near the wave number 1055 to 1059 cm -1 is set to 1, the peak intensity of other peaks (hereinafter referred to as (also referred to as “peak intensity ratio”) may vary within a range of ±3× standard deviation. Therefore, "substantially the same Fourier transform infrared absorption spectra" may be, for example, Fourier transform infrared absorption spectra in which the peak intensity ratio differs within the range of ±3 x standard deviation, and specifically, the peak intensity The Fourier transform infrared absorption spectra may differ from those in FIGS. 1 to 12 within the range of the peak intensity ratios shown in Tables 8 to 11 of Example 6. As will be described later, Table 8 shows the peaks of the first copolymer, Table 9 shows the peaks of the second copolymer, Table 10 shows the peaks of the third copolymer, and Table 8 shows the peaks of the second copolymer. 11 indicates the peak of the fourth copolymer.
核酸抽出液中のドデシルアルコール硫酸エステル塩の濃度は、核酸を抽出できる濃度であれば特に制限されず、例えば、０．０１～１％（ｗ／ｖ）、０．１～１％（ｗ／ｖ）、又は０．２～１％（ｗ／ｖ）であってよい。抽出工程において混合するドデシルアルコール硫酸エステル塩の量は、核酸抽出液中のドデシルアルコール硫酸エステル塩の濃度が上記濃度範囲となる量であってよい。 The concentration of dodecyl alcohol sulfate salt in the nucleic acid extraction solution is not particularly limited as long as it can extract nucleic acids; for example, 0.01 to 1% (w/v), 0.1 to 1% (w/v). v), or 0.2 to 1% (w/v). The amount of dodecyl alcohol sulfate salt mixed in the extraction step may be such that the concentration of dodecyl alcohol sulfate salt in the nucleic acid extract falls within the above concentration range.
核酸抽出液中のＭＰＣポリマーの濃度は、例えば、０．０１～４．０％（ｗ／ｖ）であってよく、０．０２～２．０％（ｗ／ｖ）であってよい。ＭＰＣポリマーとして第一の共重合体を用いる場合、核酸抽出液中の第一の共重合体の濃度は、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）以上であり、０．０２５％（ｗ／ｖ）以上、０．０３％（ｗ／ｖ）以上、０．０５％（ｗ／ｖ）以上、０．０６％（ｗ／ｖ）以上、又は０．１％（ｗ／ｖ）以上であってもよい。核酸抽出液中の第一の共重合体の濃度は、例えば、０．２５％（ｗ／ｖ）以下、０．２％（ｗ／ｖ）以下、０．１％（ｗ／ｖ）以下、０．０６％（ｗ／ｖ）以下、０．０５％（ｗ／ｖ）以下、又は０．０３％（ｗ／ｖ）以下であってよい。核酸抽出液中の第一の共重合体の濃度は、例えば、０．０１～０．２５％（ｗ／ｖ）、０．０２～０．２％（ｗ／ｖ）、０．０２５～０．１％（ｗ／ｖ）、又は０．０３～０．１％（ｗ／ｖ）であってよい。抽出工程において混合するＭＰＣポリマーの量は、核酸抽出液中のＭＰＣポリマーの濃度が上記濃度範囲となる量であってよい。 The concentration of MPC polymer in the nucleic acid extract may be, for example, 0.01 to 4.0% (w/v), or 0.02 to 2.0% (w/v). When using the first copolymer as the MPC polymer, the concentration of the first copolymer in the nucleic acid extract is preferably 0.01% (w/v) or more, more preferably 0.02% (w/v). /v) or more, 0.025% (w/v) or more, 0.03% (w/v) or more, 0.05% (w/v) or more, 0.06% (w/v) or more , or 0.1% (w/v) or more. The concentration of the first copolymer in the nucleic acid extract is, for example, 0.25% (w/v) or less, 0.2% (w/v) or less, 0.1% (w/v) or less, It may be 0.06% (w/v) or less, 0.05% (w/v) or less, or 0.03% (w/v) or less. The concentration of the first copolymer in the nucleic acid extract is, for example, 0.01 to 0.25% (w/v), 0.02 to 0.2% (w/v), 0.025 to 0. .1% (w/v), or 0.03 to 0.1% (w/v). The amount of MPC polymer mixed in the extraction step may be such that the concentration of MPC polymer in the nucleic acid extract falls within the above concentration range.
生体試料、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及びＭＰＣポリマーを混合する順番は特に限定されず、各成分を任意の順番で混合することができる。また、各成分を同時に混合してもよい。一実施形態において、ドデシルアルコール硫酸エステル塩及びＭＰＣポリマーを予め混合して後述の核酸抽出試薬を調製しておき、かかる核酸抽出試薬を生体試料と混合してもよい。 The order of mixing the biological sample, dodecyl alcohol sulfate salt, and MPC polymer is not particularly limited, and each component can be mixed in any order. Alternatively, each component may be mixed simultaneously. In one embodiment, a nucleic acid extraction reagent described below may be prepared by mixing dodecyl alcohol sulfate salt and MPC polymer in advance, and such nucleic acid extraction reagent may be mixed with a biological sample.
抽出工程の温度は特に限定されず、例えば、０～１００℃又は１５～３０℃であってよい。 The temperature of the extraction step is not particularly limited, and may be, for example, 0 to 100°C or 15 to 30°C.
本側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸増幅反応を行うための公知の試薬を核酸抽出液に混合する工程をさらに含んでよい。核酸増幅反応を行うための公知の試薬としては、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸合成酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）、及びプライマーが挙げられる。核酸増幅反応を行うためのその他の公知の試薬としては、例えば、酵素反応に好適な条件を与える緩衝剤、酵素又は鋳型を安定化するジチオトレイトール（ＤＴＴ）等の保護剤、増副産物を検出するためのプローブ、並びに核酸を効率的に増幅させる上で有用なシクロデキストリンが挙げられる。 The method for reducing reaction inhibition in a nucleic acid amplification reaction according to this aspect may further include the step of mixing a known reagent for performing a nucleic acid amplification reaction with the nucleic acid extract. Known reagents for performing nucleic acid amplification reactions include, for example, reverse transcriptase, nucleic acid synthases such as DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphates (dNTPs: dATP, dTTP, dCTP, and dGTP), and primers. . Other known reagents for carrying out nucleic acid amplification reactions include, for example, buffers that provide suitable conditions for enzyme reactions, protective agents such as dithiothreitol (DTT) that stabilize enzymes or templates, and detection of amplification products. Examples include probes for amplifying nucleic acids as well as cyclodextrins useful for efficiently amplifying nucleic acids.
本側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸抽出液中の核酸を増幅する工程（以下、増幅工程ともいう。）をさらに含んでよい。核酸の増幅は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）法、ＬＡＭＰ（ループ媒介等温増幅）法、ＲＴ－ＬＡＭＰ（逆転写ＬＡＭＰ）法、ＴＲＣ（転写－逆転写協奏反応）法等、従来公知の核酸増幅法を用いて行うことができる。 The method for reducing reaction inhibition in a nucleic acid amplification reaction according to this aspect may further include a step of amplifying nucleic acids in a nucleic acid extract (hereinafter also referred to as an amplification step). Nucleic acids can be amplified using PCR (polymerase chain reaction), RT-PCR (reverse transcription PCR), LAMP (loop-mediated isothermal amplification), RT-LAMP (reverse transcription), and TRC (transcription-reverse transcription concerted reaction). ) method, etc., using conventionally known nucleic acid amplification methods.
増幅工程は、シクロデキストリンの存在下で行うことが好ましい。シクロデキストリンとしては、例えば、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン、及びこれらの誘導体が挙げられる。シクロデキストリンの誘導体とは、水酸基の一部がＯＲ基に置換された分子であり、Ｒは、例えば、炭化水素基又はヒドロキシアルキル基である。一例として、シクロデキストリンは、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（Ｈｐ－β－ＣＤ）であってよい。シクロデキストリンの量は、例えば、核酸抽出液中のドデシルアルコール硫酸エステル塩１質量部に対して８質量部以上であってよい。シクロデキストリンは、ドデシルアルコール硫酸エステル塩を包接する作用を有するため、核酸増幅反応にドデシルアルコール硫酸エステル塩が及ぼす影響を低減することができる。 Preferably, the amplification step is performed in the presence of cyclodextrin. Examples of the cyclodextrin include α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-cyclodextrin, and derivatives thereof. A cyclodextrin derivative is a molecule in which some of the hydroxyl groups are substituted with OR groups, and R is, for example, a hydrocarbon group or a hydroxyalkyl group. As an example, the cyclodextrin may be hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Hp-β-CD). The amount of cyclodextrin may be, for example, 8 parts by mass or more per 1 part by mass of dodecyl alcohol sulfate in the nucleic acid extract. Since cyclodextrin has the effect of including the dodecyl alcohol sulfate salt, it is possible to reduce the influence of the dodecyl alcohol sulfate salt on the nucleic acid amplification reaction.
本側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、核酸の抽出にドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーを用いるため、核酸を増幅する前に核酸抽出液から核酸を分離及び精製する必要がない。したがって、核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法は、抽出工程と増幅工程との間に、核酸抽出液から核酸を分離又は精製する工程を含まなくてよい。本方法によれば、核酸を分離又は精製する工程を割愛することができるため、簡便、迅速かつ高効率に核酸を増幅することができる。 Since the method for reducing reaction inhibition in a nucleic acid amplification reaction according to this aspect uses a dodecyl alcohol sulfate salt and an MPC polymer for nucleic acid extraction, it is necessary to separate and purify the nucleic acid from the nucleic acid extract before amplifying the nucleic acid. do not have. Therefore, the method for reducing reaction inhibition in a nucleic acid amplification reaction does not need to include a step of separating or purifying the nucleic acid from the nucleic acid extract between the extraction step and the amplification step. According to this method, the step of separating or purifying nucleic acids can be omitted, so that nucleic acids can be amplified simply, rapidly, and with high efficiency.
また、上記側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法においては、ドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーを組み合わせることで、増幅反応における反応阻害を低減できるだけでなく、非特異的増幅を低減することもできる。したがって、本発明の別の一側面は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩及びＭＰＣポリマーと混合して、核酸抽出液を得る工程（抽出工程）を含む、核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法であるといえる。非特異的増幅は、生体試料に起因する非特異的増幅であってよく、より具体的には、生体試料中の生体由来物質に起因する非特異的増幅であってよい。生体由来物質は核酸以外の物質であり、例えばタンパク質が挙げられる。 Furthermore, in the method for reducing reaction inhibition in a nucleic acid amplification reaction according to the above aspect, by combining a dodecyl alcohol sulfate salt and an MPC polymer, not only reaction inhibition in the amplification reaction can be reduced, but also non-specific amplification can be reduced. You can also do that. Therefore, another aspect of the present invention provides a non-specific method in a nucleic acid amplification reaction, which includes a step (extraction step) of mixing a biological sample containing a nucleic acid with a dodecyl alcohol sulfate salt and an MPC polymer to obtain a nucleic acid extract (extraction step). It can be said that this is a method of reducing physical amplification. Non-specific amplification may be non-specific amplification caused by a biological sample, and more specifically may be non-specific amplification caused by a biological substance in the biological sample. A biologically derived substance is a substance other than a nucleic acid, and includes, for example, a protein.
抽出工程の詳細は、上述のとおりである。ただし、生体試料が鼻腔拭い液である場合、ＭＰＣポリマーは、より好ましくは第二の共重合体である。 Details of the extraction process are as described above. However, when the biological sample is a nasal swab, the MPC polymer is more preferably the second copolymer.
本側面に係る核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法は、核酸増幅反応を行うための公知の試薬を核酸抽出液に混合する工程をさらに含んでよく、かつ／又は核酸抽出液中の核酸を増幅する工程（増幅工程）をさらに含んでよい。これらの工程の詳細は、上述のとおりである。 The method for reducing non-specific amplification in a nucleic acid amplification reaction according to this aspect may further include the step of mixing a known reagent for performing a nucleic acid amplification reaction with a nucleic acid extract, and/or It may further include a step of amplifying the nucleic acid (amplification step). Details of these steps are as described above.
本側面に係る核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法においては、上記側面に係る核酸増幅反応における反応阻害を低減する方法同様、核酸を増幅する前に核酸抽出液から核酸を分離及び精製する必要がない。したがって、核酸増幅反応における非特異的増幅を低減する方法は、抽出工程と増幅工程との間に、核酸抽出液から核酸を分離又は精製する工程を含まなくてよい。本方法によれば、核酸を分離又は精製する工程を割愛することができるため、簡便、迅速かつ高効率に核酸を増幅することができる。 In the method for reducing non-specific amplification in a nucleic acid amplification reaction according to this aspect, like the method for reducing reaction inhibition in a nucleic acid amplification reaction according to the above aspect, nucleic acids are separated and purified from a nucleic acid extract before amplifying the nucleic acids. There's no need to. Therefore, the method for reducing non-specific amplification in a nucleic acid amplification reaction does not need to include a step of separating or purifying the nucleic acid from the nucleic acid extract between the extraction step and the amplification step. According to this method, the step of separating or purifying nucleic acids can be omitted, so that nucleic acids can be amplified simply, rapidly, and with high efficiency.
本発明の別の一側面は、核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩及びＭＰＣポリマーと混合して、核酸抽出液を得る工程（抽出工程）を含む、核酸を抽出する方法である。抽出工程の詳細は、上述のとおりである。 Another aspect of the present invention is a method for extracting nucleic acids, which includes the step of mixing a biological sample containing nucleic acids with a dodecyl alcohol sulfate salt and an MPC polymer to obtain a nucleic acid extract (extraction step). Details of the extraction process are as described above.
本発明の別の一側面は、核酸を抽出する上記方法により核酸抽出液を得る工程（抽出工程）と、核酸抽出液中の核酸を増幅する工程（増幅工程）とを含む、核酸を増幅する方法である。増幅工程の詳細は、上述のとおりである。 Another aspect of the present invention is a method for amplifying nucleic acids, which includes the steps of obtaining a nucleic acid extract by the above method for extracting nucleic acids (extraction step), and amplifying nucleic acids in the nucleic acid extract (amplification step). It's a method. Details of the amplification step are as described above.
本側面に係る核酸を増幅する方法は、抽出工程と増幅工程との間に、核酸増幅反応を行うための公知の試薬を核酸抽出液に混合する工程を含んでよい。この工程の詳細は、上述のとおりである。また、本側面に係る核酸を増幅する方法は、抽出工程と増幅工程との間に、核酸抽出液から核酸を分離又は精製する工程を含まなくてよい。 The method for amplifying a nucleic acid according to this aspect may include a step of mixing a known reagent for performing a nucleic acid amplification reaction with a nucleic acid extract between the extraction step and the amplification step. The details of this step are as described above. Furthermore, the method for amplifying a nucleic acid according to this aspect may not include a step of separating or purifying the nucleic acid from the nucleic acid extract between the extraction step and the amplification step.
上記側面に係る核酸を抽出する方法及び核酸を増幅する方法によれば、核酸抽出液を精製せずに増幅反応を行った場合における、生体試料に起因する反応阻害、及び非特異的増幅を低減することができる。 According to the method for extracting a nucleic acid and the method for amplifying a nucleic acid according to the above aspect, reaction inhibition caused by a biological sample and non-specific amplification are reduced when an amplification reaction is performed without purifying a nucleic acid extract. can do.
本発明の別の一側面は、ドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーとを含む、核酸抽出試薬である。ドデシルアルコール硫酸エステル塩及びＭＰＣポリマーの詳細は、上述のとおりである。 Another aspect of the invention is a nucleic acid extraction reagent comprising a dodecyl alcohol sulfate salt and an MPC polymer. Details of the dodecyl alcohol sulfate salt and the MPC polymer are as described above.
核酸抽出試薬中のドデシルアルコール硫酸エステル塩の濃度は、核酸を抽出できる濃度であれば特に制限されず、例えば、０．０１～１％（ｗ／ｖ）、０．１～１％（ｗ／ｖ）、又は０．２～１％（ｗ／ｖ）であってよい。 The concentration of dodecyl alcohol sulfate salt in the nucleic acid extraction reagent is not particularly limited as long as it can extract nucleic acids; for example, 0.01-1% (w/v), 0.1-1% (w/v). v), or 0.2 to 1% (w/v).
核酸抽出試薬中のＭＰＣポリマーの濃度は、例えば、０．０１～４．０％（ｗ／ｖ）であってよく、０．０２～２．０％（ｗ／ｖ）であってよい。ＭＰＣポリマーとして第一の共重合体を用いる場合、核酸抽出試薬中の第一の共重合体の濃度は、例えば、０．０１～０．２５％（ｗ／ｖ）、０．０２～０．２％（ｗ／ｖ）、０．０２５～０．１％（ｗ／ｖ）、又は０．０３～０．１％（ｗ／ｖ）であってよい。 The concentration of MPC polymer in the nucleic acid extraction reagent may be, for example, 0.01-4.0% (w/v), or 0.02-2.0% (w/v). When using the first copolymer as the MPC polymer, the concentration of the first copolymer in the nucleic acid extraction reagent is, for example, 0.01-0.25% (w/v), 0.02-0. 2% (w/v), 0.025-0.1% (w/v), or 0.03-0.1% (w/v).
核酸抽出試薬を使用することのできる生体試料は、核酸を含む生体試料であれば特に限定されず、上述の生体試料を用いることができる。核酸抽出試薬は、例えば、唾液、喀痰、又は鼻腔拭い液中の核酸を抽出するための試薬であってよい。 The biological sample to which the nucleic acid extraction reagent can be used is not particularly limited as long as it contains a nucleic acid, and the above-mentioned biological samples can be used. The nucleic acid extraction reagent may be, for example, a reagent for extracting nucleic acids in saliva, sputum, or nasal swabs.
上記側面に係る核酸抽出試薬は、ドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーとを含む組成物であるが、本発明の別の一側面において、ドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーは、別々の試薬として提供されてもよい。すなわち、本発明の別の一側面は、ドデシルアルコール硫酸エステル塩とＭＰＣポリマーとを含む、核酸抽出用キットである。 The nucleic acid extraction reagent according to the above aspect is a composition containing a dodecyl alcohol sulfate salt and an MPC polymer, but in another aspect of the present invention, the dodecyl alcohol sulfate salt and the MPC polymer are provided as separate reagents. may be done. That is, another aspect of the present invention is a kit for nucleic acid extraction containing a dodecyl alcohol sulfate salt and an MPC polymer.
以下の試験例において、「％」は、別段の記載がない限り（質量／容量）％、すなわち％（ｗ／ｖ）を指す。リピジュア（登録商標）の濃度は、リピジュア（登録商標）に含まれるＭＰＣポリマーの濃度で示した。 In the following test examples, "%" refers to % (mass/volume), ie % (w/v), unless otherwise specified. The concentration of Lipidure (registered trademark) is indicated by the concentration of MPC polymer contained in Lipidure (registered trademark).
以下の試験例において、検体抽出液の調製は室温（２０～２５℃）にて行い、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応液の調製は氷上にて行った。ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の鋳型として用いたＲＮＡは、配列番号１に示すＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のＭ遺伝子を組み込んだ人工遺伝子を転写することにより作製した。検体と混合したリピジュア（登録商標）（ＭＰＣポリマーの５質量％水溶液）は、すべて日油株式会社製である。ＲＴ－ＬＡＭＰ反応に用いたＬＡＭＰマスターミックスは、ＬＡＭＰプレミックス（緩衝液、ＭｇＳＯ４、ｄＮＴＰ、プライマーミックス、プローブ、ＡＭＶ逆転写酵素、及びＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含む）に、Ｈｐ－β－ＣＤを加え、撹拌及び遠心することで調製した。表２にプライマーミックスに含まれるプライマー及びプローブの配列並びに終濃度を示す。ただし、表２中のＬＦプライマー及びＬＢプライマーは、実施例１及び２では使用しなかった。プローブの３’末端はＢＯＤＩＰＹ（登録商標） ＦＬで標識した。 In the following test examples, sample extracts were prepared at room temperature (20 to 25°C), and RT-LAMP reaction solutions were prepared on ice. RNA used as a template for the RT-LAMP reaction was produced by transcribing an artificial gene incorporating the M gene of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2) shown in SEQ ID NO: 1. Lipidure (registered trademark) (5% by mass aqueous solution of MPC polymer) mixed with the specimen was manufactured by NOF Corporation. The LAMP master mix used for the RT-LAMP reaction was prepared by adding Hp-β-CD to the LAMP premix (containing buffer, MgSO 4 , dNTPs, primer mix, probe, AMV reverse transcriptase, and Bst DNA polymerase). , stirred and centrifuged. Table 2 shows the sequences and final concentrations of the primers and probes contained in the primer mix. However, the LF primer and LB primer in Table 2 were not used in Examples 1 and 2. The 3' end of the probe was labeled with BODIPY (registered trademark) FL.
ＲＴ－ＬＡＭＰ反応は、リアルタイムＰＣＲ装置ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（ロシュ社製）を用いて、６３℃で５０分行った。実施例２以外の実施例では、プローブの消光による蛍光強度の減少をモニタリングし（励起波長４６５ｎｍ、検出波長５１０ｎｍ）、所定の蛍光強度に減少するまでに要する時間（検出時間）を算出した。 The RT-LAMP reaction was performed at 63° C. for 50 minutes using a real-time PCR device LightCycler® 480 Instrument II (manufactured by Roche). In Examples other than Example 2, the decrease in fluorescence intensity due to probe quenching was monitored (excitation wavelength 465 nm, detection wavelength 510 nm), and the time required for the fluorescence intensity to decrease to a predetermined level (detection time) was calculated.
＜実施例１＞増幅阻害に対するＭＰＣポリマーの効果
（１）鼻腔拭い液
健常人から鼻腔拭い液を採取したドライスワブを、４００μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液３．８μＬを、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ８０２、又はＢＬ１００２を含む０．１５％ＳＤＳ溶液１１．３μＬに添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。表３に示す濃度は、増幅反応を阻害しない濃度である。別途、０．２％ＳＤＳ溶液３．８μＬを０．１５％ＳＤＳ溶液１１．３μＬに混合して、対照を調製した。
<Example 1> Effect of MPC polymer on amplification inhibition (1) Nasal swab A dry swab obtained from a nasal swab from a healthy person was suspended in 400 μL of 0.2% SDS solution with stirring, and the sample suspension was Obtained. 3.8 μL of the specimen suspension was added to 11.3 μL of a 0.15% SDS solution containing LIPIDURE®-BL405, BL802, or BL1002 to obtain a specimen extract. The concentration of Lipidure (registered trademark) in the sample extract is as shown in Table 3. The concentrations shown in Table 3 are concentrations that do not inhibit the amplification reaction. Separately, a control was prepared by mixing 3.8 μL of 0.2% SDS solution with 11.3 μL of 0.15% SDS solution.
（２）唾液
健常人から採取した唾液３４μＬを、３１６μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液２４μＬに、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ８０２、又はＢＬ１００２を６．０μＬ添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。別途、精製水３４μＬを３１６μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に混合し、得られた溶液２４μＬに精製水６．０μＬ添加し、対照を調製した。
(2) Saliva 34 μL of saliva collected from a healthy person was suspended in 316 μL of 0.2% SDS solution with stirring to obtain a sample suspension. 6.0 μL of LIPIDURE (registered trademark)-BL405, BL802, or BL1002 was added to 24 μL of the sample suspension to obtain a sample extract. The concentration of Lipidure (registered trademark) in the sample extract is as shown in Table 3. Separately, 34 μL of purified water was mixed with 316 μL of 0.2% SDS solution, and 6.0 μL of purified water was added to 24 μL of the resulting solution to prepare a control.
（３）喀痰
健常人から採取した喀痰１２．２μＬを、８７．８μＬの０．２３％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液４．０μＬに、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５又はＢＬ４０７を含む０．２５％ＳＤＳ溶液１６．０μＬを添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。別途、精製水１２．２μＬを８７．８μＬの０．２３％ＳＤＳ溶液に混合し、得られた溶液４．０μＬに０．２５％ＳＤＳ溶液１６．０μＬを混合して、対照を調製した。
(3) Sputum 12.2 μL of sputum collected from a healthy person was suspended in 87.8 μL of 0.23% SDS solution with stirring to obtain a sample suspension. 16.0 μL of a 0.25% SDS solution containing LIPIDURE®-BL405 or BL407 was added to 4.0 μL of the sample suspension to obtain a sample extract. The concentration of Lipidure (registered trademark) in the sample extract is as shown in Table 3. Separately, 12.2 μL of purified water was mixed with 87.8 μL of 0.23% SDS solution, and 4.0 μL of the resulting solution was mixed with 16.0 μL of 0.25% SDS solution to prepare a control.
（４）ＲＴ－ＬＡＭＰ反応
上記（１）～（３）の検体抽出液又は対照４．０μＬ、鋳型ＲＮＡ（鼻腔拭い液及び唾液に対しては５００コピー、喀痰に対しては２０００コピー）を含む溶液１．０μＬ、及びＬＡＭＰマスターミックス５．０μＬを混合し、得られた反応液（４．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、リピジュア（登録商標）を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。
(4) RT-LAMP reaction Contains 4.0 μL of the sample extract from (1) to (3) above or control, and template RNA (500 copies for nasal swabs and saliva, 2000 copies for sputum) 1.0 μL of the solution and 5.0 μL of the LAMP master mix were mixed, and the resulting reaction solution (containing 4.0% Hp-β-CD) was subjected to RT-LAMP reaction. For comparison, an RT-LAMP reaction was similarly performed using a reaction solution not containing Lipidure (registered trademark).
結果を図１３に示す。図１３の（ａ）は鼻腔拭い液を含む反応液の結果を示し、図１３の（ｂ）は唾液を含む反応液の結果を示し、図１３の（ｃ）は喀痰を含む反応液の結果を示す。検体を含む反応液では、検体を含まない対照の反応液と比べて検出に長い時間を要していた。これは、検体中の生体由来物質により目的の増幅反応が阻害されたことを示す。また、リピジュア（登録商標）を添加することによって、検体を含む反応液での検出時間が短縮された。これは、リピジュア（登録商標）の添加によって、検体中の生体由来物質による目的の増幅反応の阻害が低減されたことを示す。 The results are shown in FIG. FIG. 13(a) shows the results of the reaction solution containing nasal swab, FIG. 13(b) shows the results of the reaction solution containing saliva, and FIG. 13(c) shows the results of the reaction solution containing sputum. shows. In the reaction solution containing the analyte, detection took a longer time than in the control reaction solution not containing the analyte. This indicates that the target amplification reaction was inhibited by the biological substance in the sample. Furthermore, by adding Lipidure (registered trademark), the detection time in the reaction solution containing the specimen was shortened. This indicates that the addition of Lipidure (registered trademark) reduced the inhibition of the desired amplification reaction by biological substances in the specimen.
＜実施例２＞非特異的増幅に対するＭＰＣポリマーの効果
健常人から鼻腔拭い液を採取したドライスワブを、４００μＬの０．２％ＳＤＳ溶液に攪拌しながら懸濁し、検体懸濁液を得た。検体懸濁液１．５μＬを、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ８０２、又はＢＬ１００２を含む０．１６％ＳＤＳ溶液１３．５μＬに添加し、検体抽出液を得た。検体抽出液中のリピジュア（登録商標）の濃度は表３に示すとおりである。別途、０．２％ＳＤＳ溶液１．５μＬを０．１６％ＳＤＳ溶液１３．５μＬに混合して、対照を調製した。検体抽出液又は対照５．０μＬ及びＬＡＭＰマスターミックス５．０μＬを混合し、得られた反応液（４．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、リピジュア（登録商標）を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。なお、非特異的増幅の程度を調べるために、ＬＡＭＰマスターミックスには、反応液中の濃度が０．１０μＭとなるようにＳＹＴＯ（商標） ６３ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎを添加し、ＳＹＴＯの蛍光強度をモニタリングした（励起波長６１８ｎｍ、検出波長６６０ｎｍ）。
<Example 2> Effect of MPC polymer on non-specific amplification A dry swab obtained from a nasal swab from a healthy person was suspended in 400 μL of a 0.2% SDS solution with stirring to obtain a sample suspension. 1.5 μL of the specimen suspension was added to 13.5 μL of a 0.16% SDS solution containing LIPIDURE®-BL405, BL802, or BL1002 to obtain a specimen extract. The concentration of Lipidure (registered trademark) in the sample extract is as shown in Table 3. Separately, a control was prepared by mixing 1.5 μL of 0.2% SDS solution with 13.5 μL of 0.16% SDS solution. 5.0 μL of sample extract or control and 5.0 μL of LAMP master mix were mixed, and the resulting reaction solution (containing 4.0% Hp-β-CD) was subjected to RT-LAMP reaction. For comparison, an RT-LAMP reaction was similarly performed using a reaction solution not containing Lipidure (registered trademark). In order to examine the degree of non-specific amplification, SYTO (trademark) 63 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain was added to the LAMP master mix so that the concentration in the reaction solution was 0.10 μM, and the fluorescence intensity of SYTO was was monitored (excitation wavelength 618 nm, detection wavelength 660 nm).
結果を図１４に示す。図１４の（ａ）は鼻腔拭い液を含む反応液の結果を示し、図１４の（ｂ）は鼻腔拭い液を含まない対照の反応液の結果を示す。図１４の（ａ）が示すように、検体にＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００２を添加した場合は、リピジュア（登録商標）を添加しなかった場合と比べて非特異的増幅反応が遅延した。これは、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００２の添加によって、非特異的増幅反応が低減されたことを示す。 The results are shown in FIG. FIG. 14(a) shows the results of the reaction solution containing the nasal swab, and FIG. 14(b) shows the results of the control reaction solution not containing the nasal swab. As shown in FIG. 14(a), when LIPIDURE (registered trademark)-BL1002 was added to the sample, the non-specific amplification reaction was delayed compared to when LIPIDURE (registered trademark) was not added. This indicates that non-specific amplification reactions were reduced by the addition of LIPIDURE®-BL1002.
＜実施例３＞ＭＰＣポリマー濃度の変化による影響
健常人から採取した唾液（２検体）又は精製水１１μＬに、０．００～０．２５％（ｗ／ｖ）のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５（第一の共重合体）を含む１．２％ＳＤＳ溶液７０μＬを添加し、検体抽出液を得た。鋳型ＲＮＡ２００コピーを含む溶液０．３μＬ、検体抽出液１０．０μＬ、及びＬＡＭＰマスターミックス１４．７μＬを混合し、得られた反応液（８．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。下式のとおり、唾液検体に起因する検出時間の遅延を算出した：
遅延時間（分）＝（唾液を含む反応液での検出時間）－（精製水を含む反応液での検出時間）
<Example 3> Effects of changes in MPC polymer concentration 0.00 to 0.25% (w/v) of LIPIDURE (registered trademark)-BL405 ( 70 μL of a 1.2% SDS solution containing the first copolymer) was added to obtain a sample extract. 0.3 μL of a solution containing 200 copies of template RNA, 10.0 μL of sample extract, and 14.7 μL of LAMP master mix were mixed, and the resulting reaction solution (containing 8.0% Hp-β-CD) was subjected to RT-LAMP reaction. I did it. The detection time delay due to the saliva sample was calculated as follows:
Delay time (minutes) = (Detection time in reaction solution containing saliva) - (Detection time in reaction solution containing purified water)
結果を図１５に示す。０．０１６～０．２５％（ｗ／ｖ）のいずれ濃度でも、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５を含まない場合と比較して、遅延時間が減少していた。この結果は、０．０１６～０．２５％（ｗ／ｖ）のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５の添加によって、唾液検体中の生体由来物質による目的の増幅反応の阻害が低減されたことを示す。 The results are shown in FIG. At any concentration from 0.016 to 0.25% (w/v), the lag time was reduced compared to the case without LIPIDURE®-BL405. This result indicates that the addition of 0.016 to 0.25% (w/v) LIPIDURE®-BL405 reduced the inhibition of the desired amplification reaction by biological substances in the saliva sample. .
＜実施例４＞検体量の変化による影響
健常人から採取した唾液１０μＬに、０．０６３％（ｗ／ｖ）のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５（第一の共重合体）を含む０．２％ＳＤＳ溶液を５０μＬ～４００μＬ添加して、検体抽出液を得た。検体抽出液に鋳型ＲＮＡ５１２８コピーを含む溶液６．４μＬを添加した。鋳型ＲＮＡと検体抽出液との混合溶液１０．０μＬ及びＬＡＭＰマスターミックス１５．０μＬを混合し、得られた反応液（４．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。
<Example 4> Effect of change in sample amount 10 μL of saliva collected from a healthy person contained 0.2 μL of saliva containing 0.063% (w/v) of LIPIDURE (registered trademark)-BL405 (first copolymer). A specimen extract was obtained by adding 50 μL to 400 μL of %SDS solution. 6.4 μL of a solution containing 5128 copies of template RNA was added to the sample extract. 10.0 μL of a mixed solution of template RNA and sample extract and 15.0 μL of LAMP master mix were mixed, and the resulting reaction solution (containing 4.0% Hp-β-CD) was subjected to RT-LAMP reaction. For comparison, an RT-LAMP reaction was similarly performed using a reaction solution that did not contain LIPIDURE (registered trademark)-BL405.
結果を図１６に示す。唾液１０μＬとＳＤＳ溶液を４００μＬと鋳型ＲＮＡ６．４μＬとを混合して得られた混合溶液中の唾液量（１倍）から、唾液量を１．９倍～６．３倍増加させることで、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５が未添加の場合は検出時間が遅くなり、目的の増幅反応の阻害が増大したことが示唆された。一方、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５を添加することで、唾液量が増加しても検出時間はほとんど変わらず、目的の増幅反応の阻害が低減されていた。 The results are shown in FIG. By increasing the amount of saliva by 1.9 to 6.3 times from the amount of saliva in the mixed solution obtained by mixing 10 μL of saliva, 400 μL of SDS solution, and 6.4 μL of template RNA, LIPIDURE (registered trademark)-BL405 was not added, the detection time was delayed, suggesting that inhibition of the desired amplification reaction was increased. On the other hand, by adding LIPIDURE (registered trademark)-BL405, the detection time hardly changed even when the amount of saliva increased, and inhibition of the target amplification reaction was reduced.
＜実施例５＞ＬＤＳの使用による影響
健常人から採取した唾液１１μＬに、０．０６３％（ｗ／ｖ）のＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５（第一の共重合体）を含む１．２％ＬＤＳ溶液７０μＬを添加して、検体抽出液を得た。ＬＤＳは２社（Ａ社及びＢ社）から購入した。鋳型ＲＮＡ２５０コピーを含む溶液０．３μＬ、検体抽出液９．０μＬ、及びＬＡＭＰマスターミックス１５．７μＬを混合し、得られた反応液（８．０％Ｈｐ－β－ＣＤ含む）についてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５を含まない反応液を用いて、同様にＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。
<Example 5> Effects of using LDS 11 μL of saliva collected from a healthy person contained 1.2% of LIPIDURE®-BL405 (first copolymer) containing 0.063% (w/v). 70 μL of LDS solution was added to obtain a specimen extract. LDS was purchased from two companies (Company A and Company B). 0.3 μL of a solution containing 250 copies of template RNA, 9.0 μL of sample extract, and 15.7 μL of LAMP master mix were mixed, and the resulting reaction solution (containing 8.0% Hp-β-CD) was subjected to RT-LAMP reaction. I did it. For comparison, an RT-LAMP reaction was similarly performed using a reaction solution that did not contain LIPIDURE (registered trademark)-BL405.
結果を図１７に示す。ＬＤＳを用いた場合もＳＤＳを用いた場合と同様に、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５の添加により目的の増幅反応の阻害が低減された。 The results are shown in FIG. When LDS was used as well as when SDS was used, the addition of LIPIDURE (registered trademark)-BL405 reduced the inhibition of the desired amplification reaction.
＜実施例６＞ＭＰＣポリマーの分析
フーリエ変換赤外分光光度計ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１Ｓ（株式会社島津製作所製）を用いて、ＡＴＲ法によりＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５、ＢＬ１００２、ＢＬ８０２、及びＢＬ４０７それぞれのフーリエ変換赤外吸収スペクトルを測定した。具体的には、上記リピジュアの原液を、ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１Ｓのプリズム面に２μＬ滴下し、自然乾燥させて密着させ、以下の条件で各リピジュアにつき３回ずつ測定を行った。
・測定モード：ＡＢＳ
・積算回数：４０回
・アポダイズ関数：Ｈａｐｐ－Ｇｅｎｚｅｌ
・測定波数範囲：４００～４０００ｃｍ－１
<Example 6> Analysis of MPC polymer Using a Fourier transform infrared spectrophotometer IRAffinity-1S (manufactured by Shimadzu Corporation), Fourier analysis of each of LIPIDURE (registered trademark)-BL405, BL1002, BL802, and BL407 was performed by the ATR method. A converted infrared absorption spectrum was measured. Specifically, 2 μL of the above Lipidure stock solution was dropped onto the prism surface of IRAffinity-1S, air-dried to bring it into close contact, and each Lipidure was measured three times under the following conditions.
・Measurement mode: ABS
・Number of integration: 40 times ・Apodization function: Happ-Genzel
・Measurement wave number range: 400 to 4000cm -1
解析ソフトＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（登録商標）ＩＲ（株式会社島津製作所製）を用いてスペクトルのベースライン補正及びＡＴＲ補正を行った。ベースライン補正は、表１に示す波数を補正点として指定して行った。ＡＴＲ補正は、９９９ｃｍ－１を補正波数として指定して行った。補正後のスペクトルにおけるピークを解析した。ＭＰＣポリマーに特徴的なピークが観察された波数範囲７００～３０００ｃｍ－１での補正後のスペクトルを図１～１２に示す。図１～３は第一の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０５）のスペクトルであり、図４～６は第二の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ１００２）のスペクトルであり、図７～９は第三の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ８０２）のスペクトルであり、図１０～１２は第四の共重合体（ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）－ＢＬ４０７）のスペクトルである。また、補正後のスペクトルにおいて、波数１０５５～１０５９ｃｍ－１付近のピークのピーク強度を１としたときの他のピークのピーク強度（ピーク強度比）を算出した。波数範囲７００～３０００ｃｍ－１におけるピークの解析結果を表４～７に示す。 Baseline correction and ATR correction of the spectrum were performed using analysis software LabSolutions (registered trademark) IR (manufactured by Shimadzu Corporation). Baseline correction was performed by specifying the wave numbers shown in Table 1 as correction points. ATR correction was performed by specifying 999 cm −1 as the correction wave number. The peaks in the corrected spectrum were analyzed. Figures 1 to 12 show the corrected spectra in the wave number range of 700 to 3000 cm -1 where peaks characteristic of MPC polymers were observed. 1 to 3 are spectra of the first copolymer (LIPIDURE®-BL405), and FIGS. 4 to 6 are spectra of the second copolymer (LIPIDURE®-BL1002), 7 to 9 are spectra of the third copolymer (LIPIDURE®-BL802), and FIGS. 10 to 12 are spectra of the fourth copolymer (LIPIDURE®-BL407). In addition, in the corrected spectrum, when the peak intensity of the peak near the wave number 1055 to 1059 cm −1 is set to 1, the peak intensities of other peaks (peak intensity ratio) were calculated. Tables 4 to 7 show the analysis results of peaks in the wave number range of 700 to 3000 cm −1 .
各ＭＰＣポリマーの各ピークについて波数の平均値を算出し、平均値と測定値を比較したところ、測定値の平均値からのばらつきは±４ｃｍ－１以内であった。したがって、第一～第四の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルの測定においては、ピークの波数に±４ｃｍ－１の範囲でばらつきが生じるといえる。また、各ＭＰＣポリマーの各ピークについて３回の測定におけるピーク強度比から標準偏差を算出した。第一～第四の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルの測定においては、ピーク強度比に概ね±３×標準偏差の範囲でばらつきが生じるといえる。これらの結果から、第一～第四の共重合体のフーリエ変換赤外吸収スペクトルは、表８～１１に示すピークを有するといえる。表８は第一の共重合体のピークを示し、表９は第二の共重合体のピークを示し、表１０は第三の共重合体のピークを示し、表１１は第四の共重合体のピークを示す。表８～１１中、「波数」は上記で算出した平均波数±４の値を示し、「ピーク強度比」は上記の「ピーク強度比±３×標準偏差」の数値範囲を示す。ただし、ピーク強度比－３×標準偏差の値が負の値の場合は、ピーク強度比の下限を「０超」と記載した。また、波数１０５５～１０５９ｃｍ－１付近のピークのピーク強度は「１」と記載した。 When the average value of the wave number was calculated for each peak of each MPC polymer and the average value and the measured value were compared, the variation of the measured value from the average value was within ±4 cm −1 . Therefore, in the measurement of the Fourier transform infrared absorption spectra of the first to fourth copolymers, it can be said that the wave number of the peak varies within a range of ±4 cm −1 . Further, the standard deviation was calculated from the peak intensity ratio in three measurements for each peak of each MPC polymer. In the measurement of the Fourier transform infrared absorption spectra of the first to fourth copolymers, it can be said that the peak intensity ratio varies within a range of approximately ±3×standard deviation. From these results, it can be said that the Fourier transform infrared absorption spectra of the first to fourth copolymers have the peaks shown in Tables 8 to 11. Table 8 shows the peaks of the first copolymer, Table 9 shows the peaks of the second copolymer, Table 10 shows the peaks of the third copolymer, and Table 11 shows the peaks of the fourth copolymer. The peak of coalescence is shown. In Tables 8 to 11, "wave number" indicates the average wave number ±4 calculated above, and "peak intensity ratio" indicates the numerical range of "peak intensity ratio ±3 x standard deviation" above. However, if the value of peak intensity ratio -3 x standard deviation was a negative value, the lower limit of the peak intensity ratio was described as "more than 0". In addition, the peak intensity of the peak near the wave number 1055 to 1059 cm −1 was written as “1”.
Claims (12)
核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含み、
反応阻害は、生体試料に起因する反応阻害である、方法。 A method for reducing reaction inhibition in a nucleic acid amplification reaction, the method comprising:
A step of mixing a biological sample containing a nucleic acid with a dodecyl alcohol sulfate salt and a copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as monomer units to obtain a nucleic acid extract,
A method, wherein the reaction inhibition is a reaction inhibition caused by a biological sample.
第一の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８７±４ｃｍ－１、８４２±４ｃｍ－１、８７０±４ｃｍ－１、９５９±４ｃｍ－１、１０５６±４ｃｍ－１、１１６３±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１３８９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７０７±４ｃｍ－１、２９４７±４ｃｍ－１、及び２９９１±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５６±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７５～０．１０３であり、
７８７±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１８６であり、
８４２±４ｃｍ－１で０．０１８～０．０３１であり、
８７０±４ｃｍ－１で０．００９～０．０７８であり、
９５９±４ｃｍ－１で０．３１７～０．９８８であり、
１１６３±４ｃｍ－１で０．６１６～０．７２４であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．１３３～０．１４１であり、
１３８９±４ｃｍ－１で０．０６１～０．０９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．１５８～０．５３３であり、
１７０７±４ｃｍ－１で１．００１～１．２４６であり、
２９４７±４ｃｍ－１で０．０７７～０．０９０であり、
２９９１±４ｃｍ－１で０．０２８～０．０４３である、共重合体であり、
第二の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８５±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９６２±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１６２±４ｃｍ－１、１２３２±４ｃｍ－１、１４０４±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１６５２±４ｃｍ－１、１７２２±４ｃｍ－１、２８５３±４ｃｍ－１、及び２９２４±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、共重合体であり、
第三の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８６±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９６４±４ｃｍ－１、１０５９±４ｃｍ－１、１１５７±４ｃｍ－１、１２３４±４ｃｍ－１、１４０２±４ｃｍ－１、１４７９±４ｃｍ－１、１７２１±４ｃｍ－１、２８７５±４ｃｍ－１、及び２９５７±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５９±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０７４～０．０８１であり、
７８６±４ｃｍ－１で０．１５７～０．１７２であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０４９～０．０６３であり、
９６４±４ｃｍ－１で０．４６３～０．４６９であり、
１１５７±４ｃｍ－１で０．４５０～０．４５７であり、
１２３４±４ｃｍ－１で０．５４６～０．５６３であり、
１４０２±４ｃｍ－１で０．００４～０．０１７であり、
１４７９±４ｃｍ－１で０．０２６～０．５２０であり、
１７２１±４ｃｍ－１で１．１８６～１．２３４であり、
２８７５±４ｃｍ－１で０．０４７～０．０５４であり、
２９５７±４ｃｍ－１で０．１３８～０．１７１である、共重合体であり、
第四の共重合体は、フーリエ変換赤外吸収スペクトルにおいて、波数７４８±４ｃｍ－１、７８４±４ｃｍ－１、８５３±４ｃｍ－１、８７４±４ｃｍ－１、９２８±４ｃｍ－１、９５５±４ｃｍ－１、１０５５±４ｃｍ－１、１１６６±４ｃｍ－１、１２２９±４ｃｍ－１、１４８１±４ｃｍ－１、１７１７±４ｃｍ－１、及び２９５６±４ｃｍ－１にピークを有する共重合体であって、１０５５±４ｃｍ－１でのピーク強度を１としたときのピーク強度が
７４８±４ｃｍ－１で０．０２０～０．０４５であり、
７８４±４ｃｍ－１で０．１６１～０．２１３であり、
８５３±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０１８であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５３～０．０７６であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０３９～０．０６９であり、
９５５±４ｃｍ－１で０．４４２～０．４８１であり、
１１６６±４ｃｍ－１で０．０８０～０．１９７であり、
１２２９±４ｃｍ－１で０．４４３～０．５９４であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．２０８～０．２２７であり、
１７１７±４ｃｍ－１で０．４６２～０．５３０であり、
２９５６±４ｃｍ－１で０超、０．１０７以下である、共重合体である、請求項１に記載の方法。 The copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as monomer units is a first copolymer, a second copolymer, a third copolymer, or a fourth copolymer,
The first copolymer has wave numbers of 748 ± 4 cm -1 , 787 ± 4 cm -1 , 842 ± 4 cm -1 , 870 ± 4 cm -1 , 959 ± 4 cm -1 , and 1056 ± 4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum . −1 , 1163±4cm −1 , 1234±4cm −1 , 1389±4cm −1 , 1481±4cm −1 , 1707±4cm −1 , 2947±4cm −1 , and 2991±4cm −1 It is a polymer, and the peak intensity is 0.075 to 0.103 at 748 ± 4 cm -1 when the peak intensity at 1056 ± 4 cm -1 is 1,
787 ± 4 cm -1 is 0.182 to 0.186,
842 ± 4 cm -1 is 0.018 to 0.031,
870±4cm -1 is 0.009 to 0.078,
959±4cm -1 is 0.317 to 0.988,
1163 ± 4 cm -1 is 0.616 to 0.724,
1234±4cm -1 is 0.133 to 0.141,
1389±4cm -1 is 0.061 to 0.094,
1481±4cm -1 is 0.158 to 0.533,
1707±4cm -1 is 1.001 to 1.246,
2947±4cm -1 is 0.077 to 0.090,
2991 ± 4 cm −1 is 0.028 to 0.043, a copolymer;
The second copolymer has wave numbers of 748±4 cm -1 , 785±4 cm -1 , 853±4 cm -1 , 874±4 cm -1 , 928±4 cm -1 , and 962±4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum . -1 , 1059±4cm -1 , 1162±4cm -1 , 1232±4cm -1 , 1404±4cm -1 , 1481±4cm -1 , 1652±4cm -1 , 1722± 4cm -1 , 2853±4cm -1 , and a copolymer having a peak at 2924 ± 4 cm -1 , where the peak intensity is 0.030 to 0.046 at 748 ± 4 cm -1 when the peak intensity at 1059 ± 4 cm -1 is 1. can be,
785 ± 4 cm -1 is 0.182 to 0.199,
853±4cm -1 is more than 0 and less than 0.020,
874 ± 4 cm -1 is 0.059 to 0.070,
928 ± 4 cm -1 is 0.052 to 0.062,
962 ± 4 cm -1 is 0.481 to 0.510,
1162 ± 4 cm -1 is 0.156 to 0.229,
1232 ± 4 cm -1 is 0.506 to 0.632,
1404±4cm -1 is 0.003 to 0.018,
1481 ± 4 cm -1 is 0.307 to 0.372,
1652 ± 4 cm -1 is 0.013 to 0.022,
1722 ± 4 cm -1 is 0.582 to 0.647,
2853 ± 4 cm -1 is 0.255 to 0.257,
2924 ± 4 cm −1 is 0.502 to 0.556, a copolymer,
The third copolymer has wave numbers of 748 ± 4 cm -1 , 786 ± 4 cm -1 , 874 ± 4 cm -1 , 964 ± 4 cm -1 , 1059 ± 4 cm -1 , and 1157 ± 4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum. A copolymer having peaks at -1 , 1234±4cm -1 , 1402±4cm -1 , 1479±4cm -1 , 1721±4cm -1 , 2875±4cm -1 , and 2957±4cm -1 , When the peak intensity at 1059 ± 4 cm -1 is taken as 1, the peak intensity is 0.074 to 0.081 at 748 ± 4 cm -1 ,
786 ± 4 cm -1 is 0.157 to 0.172,
874±4cm -1 is 0.049 to 0.063,
964±4cm -1 is 0.463 to 0.469,
1157±4cm -1 is 0.450 to 0.457,
1234±4cm -1 is 0.546 to 0.563,
1402 ± 4 cm -1 is 0.004 to 0.017,
1479±4cm -1 is 0.026 to 0.520,
1721 ± 4 cm -1 is 1.186 to 1.234,
2875 ± 4 cm -1 is 0.047 to 0.054,
2957 ± 4 cm −1 is 0.138 to 0.171, a copolymer,
The fourth copolymer has wave numbers of 748±4 cm -1 , 784±4 cm -1 , 853±4 cm -1 , 874±4 cm -1 , 928±4 cm -1 , and 955±4 cm in the Fourier transform infrared absorption spectrum. -1 , 1055±4cm -1 , 1166±4cm -1 , 1229±4cm -1 , 1481±4cm -1 , 1717±4cm -1 , and a copolymer having peaks at 2956±4cm -1 , When the peak intensity at 1055 ± 4 cm -1 is taken as 1, the peak intensity is 0.020 to 0.045 at 748 ± 4 cm -1 ,
784 ± 4 cm -1 is 0.161 to 0.213,
853 ± 4 cm -1 is 0.013 to 0.018,
874 ± 4 cm -1 is 0.053 to 0.076,
928 ± 4 cm -1 is 0.039 to 0.069,
955 ± 4 cm -1 is 0.442 to 0.481,
1166±4cm -1 is 0.080 to 0.197,
1229±4cm -1 is 0.443 to 0.594,
1481±4cm -1 is 0.208 to 0.227,
1717 ± 4 cm -1 is 0.462 to 0.530,
2. The method according to claim 1, wherein the copolymer has a copolymer having a coefficient of 2956±4 cm −1 of greater than 0 and less than or equal to 0.107.
第二の共重合体が、図４～６のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有し、
第三の共重合体が、図７～９のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有し、
第四の共重合体が、図１０～１２のいずれかに示すフーリエ変換赤外吸収スペクトルと実質的に同一のフーリエ変換赤外吸収スペクトルを有する、請求項２に記載の方法。 The first copolymer has a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of FIGS.
the second copolymer has a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of FIGS.
The third copolymer has a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of FIGS.
3. The method of claim 2, wherein the fourth copolymer has a Fourier transform infrared absorption spectrum that is substantially the same as the Fourier transform infrared absorption spectrum shown in any of Figures 10-12.
生体試料が喀痰であり、かつ２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体が、第一の共重合体若しくは第四の共重合体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。 The biological sample is saliva or nasal swab, and the copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as a monomer unit is the first copolymer, the second copolymer, or the third copolymer. Claims 1 to 3, wherein the biological sample is sputum, and the copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as monomer units is the first copolymer or the fourth copolymer. The method described in any one of the above.
核酸を含む生体試料を、ドデシルアルコール硫酸エステル塩、及び２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単位をモノマー単位として有する共重合体と混合して、核酸抽出液を得る工程を含む、方法。 A method for reducing non-specific amplification in a nucleic acid amplification reaction, the method comprising:
A method comprising the step of mixing a biological sample containing a nucleic acid with a dodecyl alcohol sulfate salt and a copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as monomer units to obtain a nucleic acid extract.
７４８±４ｃｍ－１で０．０３０～０．０４６であり、
７８５±４ｃｍ－１で０．１８２～０．１９９であり、
８５３±４ｃｍ－１で０超、０．０２０以下であり、
８７４±４ｃｍ－１で０．０５９～０．０７０であり、
９２８±４ｃｍ－１で０．０５２～０．０６２であり、
９６２±４ｃｍ－１で０．４８１～０．５１０であり、
１１６２±４ｃｍ－１で０．１５６～０．２２９であり、
１２３２±４ｃｍ－１で０．５０６～０．６３２であり、
１４０４±４ｃｍ－１で０．００３～０．０１８であり、
１４８１±４ｃｍ－１で０．３０７～０．３７２であり、
１６５２±４ｃｍ－１で０．０１３～０．０２２であり、
１７２２±４ｃｍ－１で０．５８２～０．６４７であり、
２８５３±４ｃｍ－１で０．２５５～０．２５７であり、
２９２４±４ｃｍ－１で０．５０２～０．５５６である、第二の共重合体である、請求項８に記載の方法。 A copolymer having 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine units as a monomer unit has wave numbers of 748 ± 4 cm -1 , 785 ± 4 cm -1 , 853 ± 4 cm -1 , 874 ± 4 cm -1 , in the Fourier transform infrared absorption spectrum. 928±4cm -1 , 962±4cm -1 , 1059±4cm -1 , 1162±4cm -1 , 1232±4cm -1 , 1404±4cm -1 , 1481±4cm -1 , 1652±4cm -1 , 1722± A second copolymer having peaks at 4 cm -1 , 2853 ± 4 cm -1 , and 2924 ± 4 cm -1 , with a peak intensity of 748 ± when the peak intensity at 1059 ± 4 cm -1 is taken as 1. 0.030 to 0.046 at 4 cm −1 ,
785 ± 4 cm -1 is 0.182 to 0.199,
853±4cm -1 is more than 0 and less than 0.020,
874 ± 4 cm -1 is 0.059 to 0.070,
928 ± 4 cm -1 is 0.052 to 0.062,
962 ± 4 cm -1 is 0.481 to 0.510,
1162 ± 4 cm -1 is 0.156 to 0.229,
1232 ± 4 cm -1 is 0.506 to 0.632,
1404±4cm -1 is 0.003 to 0.018,
1481 ± 4 cm -1 is 0.307 to 0.372,
1652 ± 4 cm -1 is 0.013 to 0.022,
1722 ± 4 cm -1 is 0.582 to 0.647,
2853 ± 4 cm -1 is 0.255 to 0.257,
9. The method of claim 8, wherein the second copolymer has a molecular weight of 0.502 to 0.556 at 2924±4 cm −1 .
The method according to any one of claims 8 to 10, wherein the non-specific amplification is a non-specific amplification caused by a biological sample.
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