JP2023128529A - METHOD FOR PRODUCING β-Ala-DOPA - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、β-Ala-DOPAの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing β-Ala-DOPA.
哺乳類では、体内や脳内で、L-チロシン（L-4-ヒドロキシフェニルアラニン、L-Tyr）： In mammals, L-tyrosine (L-4-hydroxyphenylalanine, L-Tyr) is produced in the body and brain:
L-ドパは、レボドパ脱炭酸酵素に依り、ドーパミン（Dopamine）： L-dopa is produced by levodopa decarboxylase, which produces dopamine:
本発明者は、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質（YwfE）を用いて、β-アラニンとL-ヒスチジンを基質として、ATP存在下、β-Ala-Hisであるカルノシン（L-Carnosine）の合成や、前記タンパク質を発現させた大腸菌を用いて、カルノシンの合成を開発している（特許文献1）。 The present inventor used a protein with L-amino acid α-ligase activity (YwfE) to produce β-Ala-His carnosine (L-Carnosine) using β-alanine and L-histidine as substrates in the presence of ATP. We are developing the synthesis of carnosine using Escherichia coli in which the protein is expressed (Patent Document 1).
本発明は、β-Ala-DOPAを、効率的に、合成する技術を提供する事を目的とする。 An object of the present invention is to provide a technique for efficiently synthesizing β-Ala-DOPA.
本発明は、以下に示す、β-Ala-DOPAの製造方法を包含する。 The present invention includes the method for producing β-Ala-DOPA shown below.
菌体反応系、又は酵素反応系において、1ステップで、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質に依り、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する技術である。 In a bacterial cell reaction system or an enzymatic reaction system, β-alanine (β-Ala) and L-dopa (L-DOPA) are converted from β-alanine (β-Ala) and L-DOPA in one step by a protein with L-amino acid α-ligase activity. -This is a technology to synthesize Ala-DOPA.
菌体反応系、又は酵素反応系において、2ステップで、先ず、（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質に依り、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とからβ-Ala-Tyr合成し、次いで、（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質に依り、β-Ala-Tyrからβ-Ala-DOPAを合成する技術である。 In a bacterial cell reaction system or an enzymatic reaction system, in two steps, (1) β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) are produced by a protein with L-amino acid α-ligase activity. This technology synthesizes β-Ala-Tyr from β-Ala-Tyr, and then (2) synthesizes β-Ala-DOPA from β-Ala-Tyr using a protein with two-component flavin-dependent monooxygenase activity.
項１．
β-Ala-DOPAの製造方法であって、
L-アミノ酸α-リガーゼ活性に依り、
（1）基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、β-Ala-DOPAの製造方法。
Item 1.
A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
Depending on L-amino acid α-ligase activity,
(1) A method for producing β-Ala-DOPA, which includes a step of synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-dopa (L-DOPA) as substrates.
項２．
β-Ala-DOPAの製造方法であって、
L-アミノ酸α-リガーゼ活性を発現する微生物株を用いて、
（1）基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、前記項1に記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。
A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
Using a microbial strain expressing L-amino acid α-ligase activity,
(1) β-Ala-DOPA according to item 1 above, which includes a step of synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-DOPA as a substrate. manufacturing method.
項３．
前記微生物株は、ペプチダーゼの欠損株である、前記項2に記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。
Item 3.
3. The method for producing β-Ala-DOPA according to
項４．
β-Ala-DOPAの製造方法であって、
L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を用いて、
（1）アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、前記項1に記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。
Item 4.
A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
Using a protein with L-amino acid α-ligase activity,
(1) A step of synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-DOPA as substrates in the presence of adenosine triphosphate (ATP), The method for producing β-Ala-DOPA according to item 1 above.
項５．
抗酸化剤の存在下で行う、前記項1～4の何れかに記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。
5. The method for producing β-Ala-DOPA according to any one of items 1 to 4 above, which is carried out in the presence of an antioxidant.
項６．
β-Ala-DOPAの製造方法であって、
（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性に依り、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、及び
（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性に依り、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、β-Ala-DOPAの製造方法。
Item 6.
A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
(1) A step of synthesizing β-Ala-Tyr from β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) as substrates by L-amino acid α-ligase activity, and (2) Production of β-Ala-DOPA, comprising a step of hydroxylating β-Ala-Tyr obtained in the step (1) using a two-component flavin-dependent monooxygenase activity to synthesize β-Ala-DOPA. Method.
項７．
β-Ala-DOPAの製造方法であって、
（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性を発現する微生物株を用いて、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、及び
（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を発現する微生物株を用いて、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、前記項6に記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。
Section 7.
A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
(1) Synthesize β-Ala-Tyr from β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) as substrates using a microbial strain that expresses L-amino acid α-ligase activity. (2) Using a microbial strain expressing two-component flavin-dependent monooxygenase activity, β-Ala-Tyr obtained in step (1) is hydroxylated to synthesize β-Ala-DOPA. 7. The method for producing β-Ala-DOPA according to item 6 above, which comprises the step of:
項８．
前記微生物株は、ペプチダーゼの欠損株である、前記項7に記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。
8. The method for producing β-Ala-DOPA according to item 7, wherein the microorganism strain is a peptidase-deficient strain.
項９．
β-Ala-DOPAの製造方法であって、
（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を用いて、アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、及び
（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を用いて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）の存在下、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、前記項6に記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。
Item 9.
A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
(1) Using a protein with L-amino acid α-ligase activity, β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) are used as substrates in the presence of adenosine triphosphate (ATP). , a step of synthesizing β-Ala-Tyr, and (2) the step (1) using a protein having two-component flavin-dependent monooxygenase activity in the presence of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). 7. The method for producing β-Ala-DOPA according to item 6, which includes the step of hydroxylating β-Ala-Tyr obtained in the above to synthesize β-Ala-DOPA.
項１０．
抗酸化剤の存在下で行う、前記項6～9の何れかに記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。
10. The method for producing β-Ala-DOPA according to any one of items 6 to 9 above, which is carried out in the presence of an antioxidant.
本発明は、β-Ala-DOPAを、効率的に、合成する事が出来る。 The present invention can efficiently synthesize β-Ala-DOPA.
以下に本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法を詳細に説明する。 The method for producing β-Ala-DOPA of the present invention will be explained in detail below.
本明細書では、「含む」及び「含有」は、「含む（comprise）」、「実質的にのみからなる（consist essentially of）」、及び「のみからなる（consist of）」のいずれも包含する概念である。 As used herein, "comprise" and "containing" include "comprise," "consist essentially of," and "consist of." It is a concept.
本明細書では、数値範囲を「A～B」で示す場合、A以上B以下を意味する。 In this specification, when a numerical range is indicated as "A to B", it means greater than or equal to A and less than or equal to B.
本明細書では、タンパク質のアミノ酸配列は、当業者に周知慣用のアミノ酸の3文字又は1文字に依る表記法で記述される。本明細書では、アミノ酸は、特に記載の無い限り、L体である。本明細書では、変異型タンパク質を表す場合、当業者に周知慣用の方法である野生型タンパク質の変異が導入されるアミノ酸の1文字表記、変異位置を表す数字、及び、変異されたアミノ酸の1文字表記が使用される。 As used herein, amino acid sequences of proteins are described using three-letter or one-letter amino acid notation that is well known and common to those skilled in the art. As used herein, amino acids are in the L form unless otherwise specified. In this specification, when referring to a mutant protein, the one-letter code for the amino acid to which the wild-type protein has been mutated, the number representing the mutation position, and the one-letter code for the amino acid to which the mutation has been introduced, using methods well known and commonly used by those skilled in the art. Text notation is used.
本明細書では、「配列番号XのN末端からY番目のZ1残基（Z1）に相当するアミノ酸残基をZ2残基（Z2）に置換したタンパク質」とは、前記タンパク質のアミノ酸配列と、配列番号Xとを最も高い相同性スコアを与える様にアライメントした時に、配列番号Xのアミノ酸配列のN末端からY番目の位置に相当するZ1残基がZ2残基に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質を表す。 As used herein, "a protein in which the amino acid residue corresponding to the Z 1 residue (Z 1 ) at the Yth position from the N-terminus of SEQ ID NO : When the amino acid sequence and SEQ ID NO : represents a protein with a given amino acid sequence.
「X」及び「Y」は、1以上の整数を表し、「Z1」及び「Z2」は、任意のアミノ酸を表し、「（Z1）」及び「（Z2）」は、夫々のアミノ酸を1文字表記したものである。 “X” and “Y” represent integers of 1 or more, “Z 1 ” and “Z 2 ” represent arbitrary amino acids, and “(Z 1 )” and “(Z 2 )” represent their respective This is a one-letter representation of an amino acid.
［1］1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法は、L-アミノ酸α-リガーゼ活性に依り、（1）基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する工程を含む。本発明は、菌体反応系、又は酵素反応系において、1ステップで、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質に依り、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する技術である。
[1] Method for producing β-Ala-DOPA in one step The method for producing β-Ala-DOPA of the present invention relies on L-amino acid α-ligase activity. (1) β-alanine (β- The method includes the step of synthesizing β-Ala-DOPA from L-DOPA) and L-DOPA. The present invention enables the production of β-alanine (β-Ala) and L-dopa (L-DOPA) in a bacterial cell reaction system or enzymatic reaction system in one step using a protein having L-amino acid α-ligase activity. This is a technology to synthesize β-Ala-DOPA from
L-ドパ（L-DOPA）からの1段階反応は、その反応効率が良い。 The one-step reaction from L-DOPA has good reaction efficiency.
［1-1］菌体を用いる1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法は、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を発現する微生物株を用いて、（1）基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する工程を含む。
[1-1] Method for producing β-Ala-DOPA in one step using bacterial cells The method for producing β-Ala-DOPA of the present invention uses a microbial strain expressing L-amino acid α-ligase activity. (1) Includes the step of synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-DOPA as substrates.
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法では、前記微生物株は、好ましくは、ペプチダーゼの欠損株（形質転換株）である。 In the method for producing β-Ala-DOPA of the present invention, the microorganism strain is preferably a peptidase-deficient strain (transformed strain).
［1-2］酵素反応系による1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法は、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を用いて、（1）アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する工程を含む。
[1-2] Method for producing β-Ala-DOPA in one step using an enzymatic reaction system The method for producing β-Ala-DOPA of the present invention uses a protein having L-amino acid α-ligase activity. ) The process includes the step of synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-DOPA as substrates in the presence of adenosine triphosphate (ATP).
［1-3］L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質
本発明のタンパク質が有するL-アミノ酸α-リガーゼ活性は、例えば、イミダゾールジペプチド合成活性である。
[1-3] Protein having L-amino acid α-ligase activity The L-amino acid α-ligase activity possessed by the protein of the present invention is, for example, imidazole dipeptide synthesis activity.
L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質は、好ましくは、バチルス属細菌であるBacillus subtilis由来のL-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質（野生型YwfE、配列番号1及び配列番号2）である。L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質は、野生型YwfEの変異型YwfEを用いても良い。 The protein having L-amino acid α-ligase activity is preferably a protein having L-amino acid α-ligase activity (wild-type YwfE, SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 ) derived from Bacillus subtilis, which is a bacterium belonging to the genus Bacillus. As the protein having L-amino acid α-ligase activity, mutant YwfE of wild type YwfE may be used.
酵素L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質は、市販品として、協和発酵バイオ株式会社が提供する酵素を用いても良い。 As a protein having enzyme L-amino acid α-ligase activity, an enzyme provided by Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. may be used as a commercially available product.
変異型YwfE（変異型酵素、変異タンパク質）は、好ましくは、野生型L-アミノ酸α-リガーゼ：YwfEのアミノ酸配列の少なくとも1～3個のアミノ酸残基の置換を含む変異タンパク質である。 The mutant YwfE (mutant enzyme, mutant protein) is preferably a mutant protein containing substitutions of at least 1 to 3 amino acid residues in the amino acid sequence of wild-type L-amino acid α-ligase: YwfE.
変異型YwfEは、野生型アミノ酸配列と、好ましくは、80%以上の相同性を有し、より好ましくは、85%以上の相同性を有し、更に好ましくは、90%以上の相同性を有し、特に好ましくは、95%以上の相同性を有し、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質である。 The mutant YwfE preferably has a homology of 80% or more, more preferably a homology of 85% or more, and still more preferably a homology of 90% or more with the wild-type amino acid sequence. However, particularly preferred are proteins that have 95% or more homology and have L-amino acid α-ligase activity.
変異型YwfEは、好ましくは、野生型アミノ酸配列の1或は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質である。 The mutant YwfE preferably consists of an amino acid sequence in which one or more amino acid residues of the wild-type amino acid sequence are deleted, substituted, inserted, and/or added, and has L-amino acid α-ligase activity. It is a protein.
バチルス属由来のYwfEはC末端基質としてL-ヒスチジンをはじめとする多くのアミノ酸を認識してジペプチドを合成する活性を有するL-アミノ酸α-リガーゼである。 YwfE derived from the genus Bacillus is an L-amino acid α-ligase that has the activity of recognizing many amino acids including L-histidine as a C-terminal substrate and synthesizing dipeptides.
本発明により、初めて、野生型YwfE及び変異型YwfEが、N末端側基質がβ-アラニン（β-Ala）で、C末端側基質がL-ドパ（L-DOPA）に対するリガーゼ活性を有し、β-Ala-DOPAを合成出来る事を明らかにした。 The present invention has demonstrated for the first time that wild-type YwfE and mutant YwfE have ligase activity for β-alanine (β-Ala) as the N-terminal substrate and L-DOPA as the C-terminal substrate. , revealed that β-Ala-DOPA can be synthesized.
L-アミノ酸α-リガーゼ活性（ジペプチド合成活性）の評価では、例えば、被験タンパク質、基質であるアミノ酸、アデノシン三リン酸（ATP）を含み、pH5～pH11の緩衝水溶液中で、20℃～50℃の温度で、2時間～150時間の所定の時間反応させた後、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等を用いて、ジペプチド合成活性を評価する。
For evaluation of L-amino acid α-ligase activity (dipeptide synthesis activity), for example, the test protein, the substrate amino acid, and adenosine triphosphate (ATP) are contained in a buffered aqueous solution of
変異型YwfEは、例えば、1個、2個（二重変異型酵素）或いは3個（三重変異型酵素）のアミノ酸残基を置換した変異型酵素である。変異型YwfEとして、野生型YwfEのアミノ酸配列（配列番号1及び配列番号2）のN末端から、108位のアスパラギン（N）残基が、アラニン（A）残基に置換（変異）されている（N108A）酵素（YwfEの1変異型YwfE）を用いる事が出来る（配列番号3）。 Mutant YwfE is, for example, a mutant enzyme in which one, two (double mutant enzyme), or three (triple mutant enzyme) amino acid residues are substituted. As mutant YwfE, the asparagine (N) residue at position 108 from the N-terminus of the wild-type YwfE amino acid sequence ( SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 ) is substituted (mutated) with an alanine (A) residue. (N108A) enzyme (YwfE 1 variant YwfE) can be used ( SEQ ID NO: 3 ).
［1-4］タンパク質をコードする核酸
核酸は、例えば、プライマーを用い、Bacillus subtilis 168等のYwfEタンパク質或いはその類縁タンパク質をコードする微生物の染色体DNAを鋳型とした部位特異的変異法を用いて、部位特異的変異の導入に依り、取得する。
[1-4] Nucleic acid encoding the protein can be obtained by, for example, using primers and site-directed mutagenesis using the chromosomal DNA of a microorganism such as Bacillus subtilis 168 that encodes YwfE protein or its related proteins as a template. Obtained by introducing site-specific mutations.
鋳型遺伝子への目的の変異導入は、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行う。部位特異的変異導入法は、例えば、PCR法、アニーリング法等（村松ら編、「改訂第4版、新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、p.82-88）の任意の手法に依り行う。必要に応じてQuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社、米国）、QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（アジレントテクノロジー社、米国）等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用する。 Introducing a target mutation into a template gene is performed using various site-directed mutagenesis methods well known to those skilled in the art. The site-specific mutagenesis method is carried out by any method such as PCR method, annealing method, etc. (edited by Muramatsu et al., "Revised 4th edition, New Genetic Engineering Handbook", Yodosha, p. 82-88). . If necessary, various commercially available site-directed mutagenesis kits such as QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, USA) and QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, USA) are used.
YwfE遺伝子を含む鋳型DNAは、YwfEタンパク質を産生する細菌から、常法に依り、ゲノムDNAを抽出するか、或はRNAを抽出し逆転写によりcDNAを合成する事に依って調製する。 Template DNA containing the YwfE gene is prepared by extracting genomic DNA from bacteria that produce the YwfE protein, or by extracting RNA and synthesizing cDNA by reverse transcription.
YwfEタンパク質を産生する細菌は、好ましくは、枯草菌（Bacillus subtilis）等のバチルス属細菌であり、例えば、バチルス・エスピーのKSM-S237株（受託番号FERM BP-7875）、KSM-64株（受託番号FERM BP-2886）、KSM-635株（受託番号FERM BP-1485）は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6）等である。 Bacteria that produce YwfE protein are preferably Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis, such as Bacillus sp. KSM-S237 strain (accession number FERM BP-7875), KSM-64 strain (accession number (No. FERM BP-2886) and strain KSM-635 (Accession No. FERM BP-1485) were transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center (Chuo 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan). etc.
バチルス属細菌からのゲノムDNAの調製は、例えば、Pitcher et al., Lett. Appl. Microbiol., 1989, 8: p.151-156に記載の方法等を用いて行う。YwfE遺伝子を含む鋳型DNAは、調製したcDNA或はゲノムDNAから切り出したYwfE遺伝子を含むDNA断片を任意のベクター中に挿入した形で調製する。 Genomic DNA from Bacillus bacteria is prepared using, for example, the method described in Pitcher et al., Lett. Appl. Microbiol., 1989, 8: p.151-156. Template DNA containing the YwfE gene is prepared by inserting a DNA fragment containing the YwfE gene cut out from the prepared cDNA or genomic DNA into an arbitrary vector.
YwfE遺伝子への部位特異的変異の導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行う。変異プライマーは、YwfE遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、且つその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有する塩基配列を含む様に設計ある。 Site-specific mutations are most commonly introduced into the YwfE gene using mutation primers containing the nucleotide mutations to be introduced. The mutation primer anneals to a region in the YwfE gene that includes a nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be replaced, and also generates the substituted amino acid residue in place of the nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be replaced. It is designed to contain a base sequence having a nucleotide sequence (codon) encoding a group.
前記方法で取得した核酸を用いて、野生型YwfE、又はYwfEの1変異型酵素を宿主株で発現させる為のベクター又はプラスミドを調製し、このベクター又はプラスミドを導入した宿主株、即ち、形質転換株を作製し、更に、野生型YwfE、或はYwfEの1変異型酵素を製造する。 A vector or plasmid for expressing wild-type YwfE or YwfE 1 mutant enzyme in a host strain is prepared using the nucleic acid obtained by the above method, and the host strain into which this vector or plasmid is introduced is transformed. A strain is created, and wild-type YwfE or YwfE 1 mutant enzyme is also produced.
組換えDNAを作製する為の発現ベクターは、商業的に利用可能である。これらベクターを入手し、利用する事に依り、核酸挿入ベクターを作製し、核酸挿入ベクターを含む宿主細胞、即ち形質転換細胞の作製に使用する。 Expression vectors for producing recombinant DNA are commercially available. By obtaining and utilizing these vectors, a nucleic acid insertion vector is produced and used to produce a host cell containing the nucleic acid insertion vector, that is, a transformed cell.
ベクター、例えば、宿主細胞にエシェリヒア・コリを用いる場合、好ましくは、pColdI（タカラバイオ社製）、pCDF-1b、pRSF-1b（ノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30［エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30（受託番号FERM BP-5407）依り調製］、等である。 Vectors, for example, when using Escherichia coli as host cells, preferably pColdI (manufactured by Takara Bio), pCDF-1b, pRSF-1b (manufactured by Novagen), pMAL-c2x (manufactured by New England Biolabs), pGEX-4T-1 (manufactured by GE Healthcare Biosciences), pTrcHis (manufactured by Invitrogen), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30 (manufactured by Qiagen), pET-3 (manufactured by Novagen), pBluescript II SK(+), pBluescript II KS(-) (manufactured by Stratagene), pTrS30 [prepared according to Escherichia coli JM109/pTrS30 (accession number FERM BP-5407)], and the like.
前記ベクターを用いる場合のプロモーターは、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであれば良い。プロモーターは、好ましくは、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いる。 When using the above vector, any promoter may be used as long as it functions in a host cell such as Escherichia coli. As the promoter, promoters derived from Escherichia coli, phages, etc., such as trp promoter (Ptrp), lac promoter (Plac), PL promoter, PR promoter, and PSE promoter, are preferably used.
前記ベクターを用いる場合のプロモーターは、親株として、バチルス属に属する微生物を用いる場合、好ましくは、バチルス・サチルスで機能するSPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等である。 When using a microorganism belonging to the genus Bacillus as a parent strain, the promoter used when using the vector is preferably the SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. that function in Bacillus subacillus.
プロモーターは、好ましくは、Ptrpを2つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターである。 The promoter is preferably an artificially designed promoter such as a promoter in which two Ptrps are arranged in series, a tac promoter, a lacT7 promoter, or a let I promoter.
L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を生成する目的において、ベクターを利用する場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターは、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でタンパク質を発現するベクターであれば特に制限は無い。発現ベクターは、試験管内発現であれば、好ましくは、pBESTベクター（プロメガ社製）である。発現ベクターは、大腸菌であれば、好ましくは、pETベクター（インビトロジェン社製）である。発現ベクターは、培養細胞であれば、好ましくは、pME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No.AB009864）である。発現ベクターは、生物個体であれば、好ましくは、pME18Sベクター（Mol Cell Biol.8: 466-472（1988））である。 When using a vector for the purpose of producing a protein having L-amino acid α-ligase activity, an expression vector is particularly useful. The expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses the protein in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an individual organism. The expression vector is preferably pBEST vector (manufactured by Promega) for in vitro expression. If the expression vector is E. coli, it is preferably a pET vector (manufactured by Invitrogen). The expression vector is preferably pME18S-FL3 vector (GenBank Accession No. AB009864) if it is a cultured cell. If the expression vector is an individual organism, it is preferably the pME18S vector (Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)).
ベクターへのDNAの挿入は、常法に依り、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応に依り行う。参考：Current protocols in Molecular Biology Edited by Ausubel et al.(1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11 Insertion of DNA into a vector is performed by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site. Reference: Current protocols in Molecular Biology Edited by Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11
［1-5］宿主株
宿主株に前記核酸挿入ベクターを導入し、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を発現する形質転換された形質転換株を得る。
[1-5] Host strain The nucleic acid insertion vector is introduced into a host strain to obtain a transformed strain that expresses a protein having L-amino acid α-ligase activity.
宿主株は、好ましくは、ペプチダーゼDの欠損株である。 The host strain is preferably a peptidase D-deficient strain.
宿主株は、好ましくは、酵母、真菌、藻類、動物細胞、昆虫細胞、細菌、植物細胞、古細菌等である。 The host strain is preferably yeast, fungi, algae, animal cells, insect cells, bacteria, plant cells, archaea, etc.
宿主株は、好ましくは、サッカロミセス（Saccharomyces）属、ピキア（Pichia）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属、キャンディダ（Candida）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、デバリヨミセス（Debaryomyces）属、ヤロウィア（Yarrowia）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キサントフィロミセス（Xanthophyllomyces）属等に属する酵母を用いる。宿主株は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）、キャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、デバリヨミセス・ハンセニ（Debaryomyces hansenii）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lypolitica）、クリプトコッカス・カバタス（Cryptococcus curvatus）、キサントフィロミセス・デンドロロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous）等を用いる。 The host strain is preferably a strain of the genus Saccharomyces, the genus Pichia, the genus Kluyveromyces, the genus Candida, the genus Schizosaccharomyces, the genus Debaryomyces, Yarrowia Yeast belonging to the genus Yarrowia, Cryptococcus, Xanthophyllomyces, etc. is used. Host strains include, for example, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Candida utilis, Candida glabrata, Schizosaccharomyces pombe, Debaryomyces hansenii, Yarrowia lypolitica, Cryptococcus curvatus, Xanthophyllomyces dendrolous ( Xanthophyllomyces dendrorhous) etc. are used.
宿主株は、好ましくは、エシェリヒア（Escherichia）属、放線菌（Actinomycetes）属、バチルス（Bacillus）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、サーマス（Thermus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属等に属する細菌を用いる。宿主株は、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、セラチア・マーセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）等を用いる。 The host strain is preferably of the genus Escherichia, the genus Actinomycetes, the genus Bacillus, the genus Serratia, the genus Pseudomonas, the genus Corynebacterium, the genus Brevibacterium ( Bacteria belonging to the genus Brevibacterium, Rhodococcus, Lactobacillus, Streptomyces, Thermus, Streptococcus, etc. are used. Host strains include, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Serratia marcescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Rhodococcus Rhodococcus erythropolis, Thermus thermophilus, Streptococcus lactis, Lactobacillus casei, Streptomyces lividans, etc. are used.
宿主株は、好ましくは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus nigar）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）等に属する糸状菌（カビ）を用いる。 As the host strain, preferably used is a filamentous fungus belonging to Aspergillus nigar, Aspergillus oryzae, or the like.
宿主株は、好ましくは、モルティエレラ（Mortierella）属、フザリウム（Fusarium）属、シゾキトリウム（Schizochytrium）属、スラウストキトリウム（Thraustochytrium）属等に属する微生物を用いる。宿主株は、例えば、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）、モルティエレラ・バイニエリ（Mortierella bainieri）、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）カニンガメラ・エレガンス（Cunninghamella elegans）、フザリウム・フジクロイ（Fusarium fujikuroi）、シゾキトリウム・リマシアム（Schizochytrium limacium）、スラウストキトリウム・アウレウム（Thraustochytrium aureum）等を用いる。 As the host strain, microorganisms belonging to the genus Mortierella, Fusarium, Schizochytrium, Thraustochytrium, etc. are preferably used. Host strains include, for example, Mortierella ramanniana, Mortierella bainieri, Mortierella alpina, Cunninghamella elegans, Fusarium fujikuroi, Schizochytrium Schizochytrium limacium, Thraustochytrium aureum, etc. are used.
宿主株への前記核酸挿入ベクターの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクション）、接合、天然の形質転換、エレクトロポレーション、当業者に公知のその他の方法を含む様々な方法に依り、実施する。 Introduction of the nucleic acid insertion vector into the host strain can be carried out by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion, liposome-mediated transfection (lipofection), conjugation, natural transformation, electroporation, This can be done by a variety of methods, including other methods known to those skilled in the art.
宿主株への前記発現ベクターの導入は、商業的に利用可能なトランスフェクション試薬を入手し、これらを利用する事に依り、実施す。参考：Current protocols in molecular biology. 3 vols. Edited by Ausubel F. M. et al., John Wiley & Son, Inc., Current Protocols. The expression vector is introduced into the host strain by obtaining and using commercially available transfection reagents. Reference: Current protocols in molecular biology. 3 vols. Edited by Ausubel F. M. et al., John Wiley & Son, Inc., Current Protocols.
［1-6］β-Ala-DOPAの製造方法
［1-6-1］菌体反応系による1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法では、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質（野生型YwfE、又はYwfEの1変異型YwfE）を発現する微生物株（形質転換株）を用い、培養用培地中で培養する事に依り、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する事が出来る。培養菌体を集菌して、それを生体触媒とした菌体反応系で目的のβ-Ala-DOPAを合成する事が出来る。培養によって得られた発現株を用いて（集菌して）、β-アラニン（β-Ala）及びL-ドパ（L-DOPA）を添加し、目的のβ-Ala-DOPA生産を行い、当該反応液からβ-Ala-DOPAを単離する。
[1-6] Production method of β-Ala-DOPA
[1-6-1] Method for producing β-Ala-DOPA in one step using bacterial cell reaction system In the method for producing β-Ala-DOPA of the present invention, a protein having L-amino acid α-ligase activity (wild type By using a microbial strain (transformed strain) that expresses YwfE or YwfE (YwfE 1 variant YwfE) and culturing it in a culture medium, β-alanine (β-Ala) and L-dopa are used as substrates. β-Ala-DOPA can be synthesized from (L-DOPA). The target β-Ala-DOPA can be synthesized by collecting cultured bacteria and using the bacteria reaction system as a biocatalyst. Using the expression strain obtained by culturing (collecting bacteria), add β-alanine (β-Ala) and L-DOPA to produce the desired β-Ala-DOPA, β-Ala-DOPA is isolated from the reaction solution.
次いで、培地から前記産生されたβ-Ala-DOPAを単離する。 Then, the produced β-Ala-DOPA is isolated from the medium.
培養培地に添加する成分の内、炭素源は、好ましくは、微生物株（形質転換株）が資化し得るものである。炭素源は、好ましくは、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを有する糖蜜、デンプン或いはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いる。 Among the components added to the culture medium, the carbon source is preferably one that can be assimilated by the microorganism strain (transformed strain). As the carbon source, preferably carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, starch or starch hydrolysates, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol are used.
培養培地に添加する成分の内、窒素源は、好ましくは、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸、有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、その消化物等を用いる。 Among the components added to the culture medium, the nitrogen source is preferably inorganic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium salts of organic acids, other nitrogen-containing compounds, and peptone, Meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented microbial cells, digested products thereof, etc. are used.
培養培地に添加する成分の内、無機塩は、好ましくは、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いる。 Among the components added to the culture medium, inorganic salts are preferably potassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and carbonate. Use calcium etc.
細胞培養培地に添加する成分は、他に、好ましくは、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加する。 Other components added to the cell culture medium include preferably nutrients such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acids, various vitamins such as biotin, and the like.
培養は、通常、通気撹拌、振盪（しんとう）培養等の好気条件下で行う。 Cultivation is usually carried out under aerobic conditions such as aeration, agitation, and shaking cultivation.
培養温度は、微生物株（形質転換株）の生育し得る温度であれば特に制限は無い。 The culture temperature is not particularly limited as long as it is a temperature at which the microbial strain (transformed strain) can grow.
培養途中のpHは、微生物株（形質転換株）が生育し得るpHであれば特に制限は無い。培養中のpH調整は、酸或はアルカリを添加して行う。 There is no particular restriction on the pH during the culture as long as it is a pH at which the microbial strain (transformed strain) can grow. pH adjustment during culture is performed by adding acid or alkali.
抗酸化剤を添加する事
L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を用いて、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する際に、好ましくは、抗酸化剤（好ましくは、アスコルビン酸を適宜（5mM～50mM程度）添加する。
Adding antioxidants
Preferably when synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-dopa (L-DOPA) as substrates using a protein with L-amino acid α-ligase activity. An antioxidant (preferably ascorbic acid) is added as appropriate (about 5mM to 50mM).
抗酸化剤（好ましくは、アスコルビン酸）を添加する事に依り、主にL-ドパ（L-DOPA）の酸化防止をする。抗酸化剤を添加する事に依り、基質であるL-ドパ（L-DOPA）の褐変及び重合化を抑制する事が出来、基質の減少を抑制する事が出来る。抗酸化剤は、また、目的化合物であるβ-Ala-DOPAの酸化分解を抑制する事も可能である。 By adding an antioxidant (preferably ascorbic acid), oxidation of L-DOPA is mainly prevented. By adding an antioxidant, it is possible to suppress the browning and polymerization of L-DOPA, which is the substrate, and the decrease in the substrate can be suppressed. Antioxidants can also inhibit the oxidative decomposition of the target compound, β-Ala-DOPA.
本発明の何れの方法においても、抗酸化剤（アスコルビン酸等）を添加する事に依り、目的物であるβ-Ala-DOPAを安定生産（生産収率の向上）する事が可能である。 In any method of the present invention, by adding an antioxidant (such as ascorbic acid), it is possible to stably produce (improve production yield) the target product, β-Ala-DOPA.
ペプチダーゼ活性を欠失する事
本発明は、初めて、β-Ala-DOPAがペプチダーゼD（pepD）によって分解されて事を明らかにした。そこで、本発明の菌体を用いる製造方法では、pepDを欠損する形質転換株を使用する事に依り、β-Ala-DOPAの分解を抑制する事が出来る。宿主株として、例えば、エシェリヒア・コリB株系列BL21(DE)株を使用し、ペプチダーゼD（pepD）を欠損させる事に依り、β-Ala-DOPAの分解を抑制し、β-Ala-DOPAを高効率で製造する事が出来る。
Deletion of peptidase activity The present invention revealed for the first time that β-Ala-DOPA is degraded by peptidase D (pepD). Therefore, in the production method using bacterial cells of the present invention, the decomposition of β-Ala-DOPA can be suppressed by using a transformed strain lacking pepD. For example, the Escherichia coli B strain BL21 (DE) strain is used as a host strain, and by deleting peptidase D (pepD), the degradation of β-Ala-DOPA is suppressed, and β-Ala-DOPA is It can be manufactured with high efficiency.
菌体反応系による1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
β-Ala-DOPAは、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とを基質として、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質が、触媒として働き、縮合反応する事に依り、産生される。
Production method of β-Ala-DOPA in one step using bacterial cell reaction system β-Ala-DOPA is produced by using β-alanine (β-Ala) and L-dopa (L-DOPA) as substrates. A protein with α-ligase activity acts as a catalyst and is produced through a condensation reaction.
従って、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とを含む培養用培地で、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を発現する微生物株（形質転換株）を培養後、必要な基質を添加することで合成されるβ-Ala-DOPAを単離精製する事に依り、β-Ala-DOPAを製造し、取得する事が出来る。 Therefore, a microbial strain (transformed strain) expressing a protein with L-amino acid α-ligase activity is cultured in a culture medium containing β-alanine (β-Ala) and L-DOPA. After that, β-Ala-DOPA can be produced and obtained by isolating and purifying the β-Ala-DOPA synthesized by adding the necessary substrate.
製造方法では、添加するβ-アラニン（β-Ala）及びL-ドパ（L-DOPA）の量は、各々、一例として、0.5g／L～100g／L程度である。 In the production method, the amounts of β-alanine (β-Ala) and L-DOPA (L-DOPA) to be added are each about 0.5 g/L to 100 g/L, for example.
培養は、通常、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。 Cultivation is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration agitation culture.
培養温度は、好ましくは、15℃～40℃である。 The culture temperature is preferably 15°C to 40°C.
培養時間は、好ましくは、5時間～7日間である。 The culture time is preferably 5 hours to 7 days.
培養中のpHは、好ましくは、pH3～pH9に保持する。pHの調整は、無機或は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。 The pH during culturing is preferably maintained at pH3 to pH9. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
高収率での変換反応（基質のβ-アラニン（β-Ala）及びL-ドパ（L-DOPA）からの目的ジペプチドであるβ-Ala-DOPAを合成する事）を達成する為には、高発現した菌体を集菌後に反応系（休止菌体反応）で反応する事が好ましい。 In order to achieve a high-yield conversion reaction (synthesis of the target dipeptide β-Ala-DOPA from the substrates β-alanine (β-Ala) and L-dopa (L-DOPA)), It is preferable to collect highly expressed bacterial cells and then react in a reaction system (resting bacterial cell reaction).
緩衝液中に生成、蓄積したβ-Ala-DOPAの単離・精製は、当業者に慣用の活性炭、イオン交換樹脂等を用いる方法、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行う。 Isolation and purification of β-Ala-DOPA produced and accumulated in the buffer solution can be carried out by methods commonly used by those skilled in the art, such as using activated carbon, ion exchange resin, etc., extraction with organic solvents, crystallization, thin layer chromatography, high performance liquid This is done by chromatography, etc.
微生物株（形質転換株）を用いた菌体反応では、集菌した微生物株（形質転換株）を生体触媒として緩衝液中で反応させる事が可能である。また、工業化を踏まえた大きなスケールでの生産では、緩衝液ではなくアルカリによる下限コントロールにて反応中のpHを制御する事が好ましい。 In a bacterial reaction using a microbial strain (transformed strain), it is possible to carry out the reaction in a buffer using the collected microbial strain (transformed strain) as a biocatalyst. In addition, in large-scale production based on industrialization, it is preferable to control the pH during the reaction by lower limit control using an alkali rather than a buffer solution.
［1-6-2］酵素反応系による1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法では、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質（野生型YwfE、或は変異型YwfE）を用い、アデノシン三リン酸（ATP）の共存下、緩衝液中で反応させる事に依り、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する事が出来る。
[1-6-2] Method for producing β-Ala-DOPA in one step using an enzymatic reaction system In the method for producing β-Ala-DOPA of the present invention, a protein having L-amino acid α-ligase activity (wild type YwfE Alternatively, by using mutant YwfE) and reacting it in a buffer solution in the presence of adenosine triphosphate (ATP), β-alanine (β-Ala) and L-dopa (L- β-Ala-DOPA can be synthesized from (DOPA).
次いで、産生されたβ-Ala-DOPAを、緩衝液から単離する。 The produced β-Ala-DOPA is then isolated from the buffer.
緩衝液は、好ましくは、当業者に慣用のリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等である。 Buffers are preferably phosphate buffers, borate buffers, citrate buffers, acetate buffers, Tris-HCl buffers, etc., commonly used by those skilled in the art.
酵素反応系による製造方法では、アデノシン三リン酸（ATP）を用いる。 The production method using an enzyme reaction system uses adenosine triphosphate (ATP).
酵素反応系による1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
β-Ala-DOPAは、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とを基質として、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質が、触媒として働き、縮合反応する事に依り、合成される。
Production method of β-Ala-DOPA in one step using enzymatic reaction system β-Ala-DOPA is produced by using β-alanine (β-Ala) and L-dopa (L-DOPA) as substrates. -Proteins with ligase activity act as catalysts and are synthesized through condensation reactions.
従って、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とを含む緩衝液に、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を添加し、所定の時間反応後、合成されるβ-Ala-DOPAを単離精製する事に依り、β-Ala-DOPAを製造し、取得する事が出来る。 Therefore, a protein with L-amino acid α-ligase activity is added to a buffer containing β-alanine (β-Ala) and L-DOPA, and after a predetermined reaction time, the protein is synthesized. β-Ala-DOPA can be produced and obtained by isolating and purifying β-Ala-DOPA.
製造方法では、添加するβ-アラニン（β-Ala）及びL-ドパ（L-DOPA）の量は、各々、一例として、0.5g／L～100g／L程度である。 In the production method, the amounts of β-alanine (β-Ala) and L-DOPA (L-DOPA) to be added are each about 0.5 g/L to 100 g/L, for example.
抗酸化剤を添加する事
L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を用いて、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する際に、好ましくは、抗酸化剤（好ましくは、アスコルビン酸を適宜（5mM～50mM程度））添加する。
Adding antioxidants
Preferably when synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-dopa (L-DOPA) as substrates using a protein with L-amino acid α-ligase activity. Add an antioxidant (preferably ascorbic acid as appropriate (about 5mM to 50mM)).
酵素反応系による製造方法では、基質に対して、当量以上のアデノシン三リン酸（ATP）を添加する。 In the production method using an enzyme reaction system, an equivalent or more amount of adenosine triphosphate (ATP) is added to the substrate.
酵素による合成反応は、水性媒体中、好ましくは、pH5～pH11であり、より好ましくは、pH6～pH10である。
The enzymatic synthesis reaction is carried out in an aqueous medium, preferably at
酵素による合成反応は、水性媒体中、好ましくは、20℃～50℃であり、より好ましくは、25℃～45℃の条件である。 The enzymatic synthesis reaction is carried out in an aqueous medium, preferably at 20°C to 50°C, more preferably at 25°C to 45°C.
酵素による合成反応は、水性媒体中、好ましくは、2時間～72時間であり、より好ましくは、6時間～36時間行う。 The enzymatic synthesis reaction is preferably carried out in an aqueous medium for 2 to 72 hours, more preferably for 6 to 36 hours.
緩衝液中に生成、蓄積したβ-Ala-DOPAの単離・精製は、当業者に慣用の活性炭、イオン交換樹脂等を用いる方法、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行う。 Isolation and purification of β-Ala-DOPA produced and accumulated in the buffer solution can be carried out by methods commonly used by those skilled in the art, such as using activated carbon, ion exchange resin, etc., extraction with organic solvents, crystallization, thin layer chromatography, high performance liquid This is done by chromatography, etc.
［2］2ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法は、（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性に依り、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、及び（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性に依り、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程を含む。本発明は、菌体反応系或いは酵素反応系において、2ステップで、先ず、（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質に依り、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とからβ-Ala-Tyr合成し、次いで、（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質に依り、β-Ala-Tyrからβ-Ala-DOPAを合成する技術である。
[2] Method for producing β-Ala-DOPA in two steps The method for producing β-Ala-DOPA of the present invention relies on (1) L-amino acid α-ligase activity, and uses β-alanine (β- A process of synthesizing β-Ala-Tyr from (Ala) and L-tyrosine (L-Tyr), and (2) a process of synthesizing β-Ala-Tyr from two-component flavin-dependent monooxygenase activity, It includes a step of hydroxylating Ala-Tyr and synthesizing β-Ala-DOPA. In the present invention, in a bacterial cell reaction system or an enzymatic reaction system, in two steps, (1) first, β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L -Tyr) and then (2) synthesize β-Ala-DOPA from β-Ala-Tyr using a protein with two-component flavin-dependent monooxygenase activity. .
β-Ala-DOPAの製造方法では、原料のコストの観点で、L-チロシン（L-Tyr）からの2段階反応は、圧倒的に安価である。L-チロシン（L-Tyr）をジペプチド化した後に、そのチロシン（Tyr）をドパ（DOPA）に変換する事で、不安定なドパ（DOPA）（遊離）を経る事無く、効率的にβ-Ala-DOPAを製造する事が可能である。 In the production method of β-Ala-DOPA, the two-step reaction from L-tyrosine (L-Tyr) is overwhelmingly cheaper in terms of raw material cost. After dipeptideizing L-tyrosine (L-Tyr), the tyrosine (Tyr) is converted to dopa (DOPA) efficiently without going through the unstable DOPA (free) state. It is possible to produce β-Ala-DOPA.
［2-1］菌体系（in vivo）の2ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法は、（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性を発現する微生物株（形質転換株）を用いて、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、及び（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を発現する微生物株（形質転換株）を用いて、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程を含む。
[2-1] Method for producing β-Ala-DOPA in two steps using a bacterial system (in vivo) The method for producing β-Ala-DOPA of the present invention involves (1) expressing L-amino acid α-ligase activity; A step of synthesizing β-Ala-Tyr from β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) as substrates using a microbial strain (transformed strain), and (2) two components A step of hydroxylating β-Ala-Tyr obtained in the above step (1) to synthesize β-Ala-DOPA using a microorganism strain (transformed strain) expressing flavin-dependent monooxygenase activity. include.
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法では、微生物株は、好ましくは、ペプチダーゼの欠損株である（形質転換株）。2ステップで、菌体反応系を使う場合、ペプチダーゼ欠損に関して、PepDのターゲットは最終目的物のβ-Ala-DOPAであり、ペプチダーゼ欠損株を共通の形質転換株とする事が好ましい。 In the method for producing β-Ala-DOPA of the present invention, the microorganism strain is preferably a peptidase-deficient strain (transformed strain). When using a two-step bacterial reaction system, the target of PepD is the final target β-Ala-DOPA with respect to peptidase deficiency, and it is preferable to use a peptidase-deficient strain as a common transformant.
［2-2］酵素反応系による2ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法は、（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を用いて、アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、及び（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を用いて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）の存在下、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化（水酸基を導入）し、β-Ala-DOPAを合成する工程を含む。
[2-2] Method for producing β-Ala-DOPA in two steps using an enzyme reaction system The method for producing β-Ala-DOPA of the present invention includes (1) using a protein having L-amino acid α-ligase activity. , a step of synthesizing β-Ala-Tyr from β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) as substrates in the presence of adenosine triphosphate (ATP), and (2) β-Ala-Tyr obtained in step (1) is hydroxylated (introducing a hydroxyl group) using a protein with component-type flavin-dependent monooxygenase activity in the presence of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). ) and includes a step of synthesizing β-Ala-DOPA.
［2-3］L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質
［2-3-1］タンパク質
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法では、工程（1）において、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質（野生型YwfE、或いはYwfEの変異型）を発現する微生物株（形質転換株）を用い、培養用培地中で培養する事に依り、当該タンパク質を調製し、アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、反応基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する。
[2-3] Protein with L-amino acid α-ligase activity
[2-3-1] Protein In the method for producing β-Ala-DOPA of the present invention, in step (1), a protein (wild type YwfE or mutant type of YwfE) having L-amino acid α-ligase activity is expressed. The protein is prepared by culturing it in a culture medium using a microbial strain (transformed strain), and β-alanine (β-Ala ) and L-tyrosine (L-Tyr) to synthesize β-Ala-Tyr.
本発明のタンパク質が有するL-アミノ酸α-リガーゼ活性は、前記説明の通りである。 The L-amino acid α-ligase activity of the protein of the present invention is as explained above.
野生型YwfE及び変異型YwfEは、N末端側基質がβ-アラニン（β-Ala）で、C末端側基質がL-チロシン（L-Tyr）に対するリガーゼ活性を有し、β-Ala-Tyrを合成する事が出来る。 Wild-type YwfE and mutant YwfE have β-alanine (β-Ala) as the N-terminal substrate and ligase activity for L-tyrosine (L-Tyr) as the C-terminal substrate. It can be synthesized.
野生型YwfE、或はYwfEの変異型は、アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する為の酵素として使用される。 Wild-type YwfE or mutant YwfE converts β-Ala- from β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) as substrates in the presence of adenosine triphosphate (ATP). Used as an enzyme to synthesize Tyr.
［2-3-2］タンパク質をコードする核酸
本発明のL-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸は、前記説明の通りである。
[2-3-2] Nucleic acid encoding a protein The nucleic acid encoding a protein having L-amino acid α-ligase activity of the present invention is as described above.
［2-3-3］核酸挿入ベクター
本発明のL-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子及び適切な発現配列を含む核酸挿入ベクターは、前記説明の通りである。
[2-3-3] Nucleic acid insertion vector The nucleic acid insertion vector containing the gene encoding the protein having L-amino acid α-ligase activity of the present invention and an appropriate expression sequence is as described above.
［2-3-4］核酸挿入ベクターを導入する宿主株
本発明の核酸挿入ベクターを宿主株に導入し、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を発現する形質転換された形質転換株は、前記説明の通りである。
[2-3-4] Host strain into which the nucleic acid insertion vector is introduced The nucleic acid insertion vector of the present invention is introduced into a host strain, and the transformed strain that expresses a protein having L-amino acid α-ligase activity is As explained above.
［2-4］二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質
二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質は（HpaBC）は、フラビン依存性のヒドロキシラーゼ（HpaB：4-Hydroxyphenylacetate (4HPA) 3-monooxygenase）とフラビンレダクターゼ活性を有するタンパク質(HpaC：NAD(P)H-flavin oxidoreductase)との二成分から構成されるモノオキシゲナーゼである。
[2-4] Protein with two-component flavin-dependent monooxygenase activity Protein with two-component flavin-dependent monooxygenase activity (HpaBC) is a flavin-dependent hydroxylase (HpaB: 4-Hydroxyphenylacetate (4HPA)). It is a monooxygenase composed of two components: a protein with flavin reductase activity (HpaC: NAD(P)H-flavin oxidoreductase).
配列番号4：HpaBアミノ酸配列
HpaB：Pseudomonas aeruginosa PA01、-HpaB（520aa）
配列番号5：HpaB（1,563bp）
配列番号8：HpaCアミノ酸配列
HpaC：Pseudomonas aeruginosa PA01、-HpaC（179aa）
配列番号9：HpaC（513bp）
SEQ ID NO: 4: HpaB amino acid sequence
HpaB: Pseudomonas aeruginosa PA01, -HpaB (520aa)
Sequence number 5: HpaB (1,563bp)
SEQ ID NO: 8: HpaC amino acid sequence
HpaC: Pseudomonas aeruginosa PA01, -HpaC (179aa)
Sequence number 9: HpaC (513bp)
本発明のβ-Ala-DOPAの製造方法では、工程（2）では、二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質（好ましくは、HpaBC, EC : 1.14.14.9.）を発現する微生物株（形質転換株）を用い、培養用培地中で培養する事に依り、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化（-OH基：水酸基導入）し、β-Ala-DOPAを合成する。 In the method for producing β-Ala-DOPA of the present invention, in step (2), a microbial strain (preferably HpaBC, EC: 1.14.14.9.) expressing a protein (preferably HpaBC, EC: 1.14.14.9.) having two-component flavin-dependent monooxygenase activity is used. By culturing in a culture medium using a transformed strain, β-Ala-Tyr obtained in step (1) is hydroxylated (-OH group: hydroxyl group introduction) and β-Ala-DOPA Synthesize.
［2-5］β-Ala-DOPAの製造方法
菌体系の2ステップのβ-Ala-DOPAの製造方法では、
（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性を発現する微生物株（形質転換株）を用いて、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程を進め、
次いで、（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を発現する微生物株（形質転換株）を用いて、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程を進めても良い。
[2-5] Production method of β-Ala-DOPA In the two-step production method of β-Ala-DOPA using bacterial system,
(1) Using a microbial strain (transformed strain) that expresses L-amino acid α-ligase activity, β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) are used as substrates to -Proceed with the process of synthesizing Tyr,
Next, (2) β-Ala-Tyr obtained in step (1) is hydroxylated using a microbial strain (transformed strain) that expresses two-component flavin-dependent monooxygenase activity to produce β-Ala. -You may proceed with the step of synthesizing DOPA.
［2-5-1］菌体反応系による2ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
工程（1）：基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程
工程（1）では、β-Ala-DOPAの製造方法の内、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質（野生型YwfE、或はYwfEの変異型）を発現する微生物株（形質転換株）を用い、培養用培地中で培養する事に依り、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する。
[2-5-1] Two-step production method of β-Ala-DOPA using bacterial cell reaction system
Step (1): Synthesizing β-Ala-Tyr from β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) as substrates Step (1) involves the production of β-Ala-DOPA. Among the methods, a microorganism strain (transformed strain) expressing a protein (wild type YwfE or mutant type of YwfE) having L-amino acid α-ligase activity is used and cultured in a culture medium. β-Ala-Tyr is synthesized from β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) as substrates.
工程（1）では、培養用培地で、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を発現する微生物株（形質転換株）を培養後、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とを含む反応液で合成されるβ-Ala-Tyrを単離精製する事に依り、β-Ala-Tyrを製造し、取得する。 In step (1), after culturing a microbial strain (transformed strain) expressing a protein with L-amino acid α-ligase activity in a culture medium, β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L- β-Ala-Tyr is produced and obtained by isolating and purifying β-Ala-Tyr synthesized with a reaction solution containing (Tyr).
製造方法では、添加するβ-アラニン（β-Ala）及びL-チロシン（L-Tyr）の量は、各々、一例として、0.5g／L～100g／L程度である。 In the production method, the amounts of β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) to be added are each about 0.5 g/L to 100 g/L, for example.
高収率での変換反応（基質のβ-アラニン（β-Ala）及びL-チロシン（L-Tyr）からの目的ジペプチドであるβ-Ala-Tyrを合成する事）を達成する為には、高発現した菌体を集菌後に反応系（休止菌体反応）で反応する事が好ましい。 In order to achieve a high-yield conversion reaction (synthesis of the target dipeptide β-Ala-Tyr from the substrates β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr)), It is preferable to collect highly expressed bacterial cells and then react in a reaction system (resting bacterial cell reaction).
工程（2）：前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程
工程（2）では、β-Ala-DOPAの製造方法の内、二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質（好ましくは、HpaBC（HpaBCはHpaB（EC 1.14.14.9）とHpaC（Flavin reductase:EC 1.5.1.36）とから成る複合酵素））を発現する微生物株（形質転換株）を用い、培養用培地中で培養する事に依り、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化（水酸基導入）し、β-Ala-DOPAを合成する。
Step (2): A step in which β-Ala-Tyr obtained in step (1) is hydroxylated to synthesize β-Ala-DOPA. In step (2), in the method for producing β-Ala-DOPA, A microbial strain expressing a protein having two-component flavin-dependent monooxygenase activity (preferably HpaBC (HpaBC is a complex enzyme consisting of HpaB (EC 1.14.14.9) and HpaC (Flavin reductase: EC 1.5.1.36))) (transformed strain) and cultured in a culture medium to hydroxylate (introduce hydroxyl group) the β-Ala-Tyr obtained in step (1) and synthesize β-Ala-DOPA. .
HpaBCは、エシェリヒア（Escherichia）属細菌由来のHpaBC、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌由来のHpaBC等を用いる事が出来る。 As HpaBC, HpaBC derived from bacteria of the genus Escherichia, HpaBC derived from bacteria of the genus Pseudomonas, etc. can be used.
工程（2）では、β-Ala-Tyrを含む培養用培地で、二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を発現する微生物株（形質転換株）を培養する事に依り、β-Ala-DOPAを製造する。合成されるβ-Ala-DOPAを単離精製しても良い。 In step (2), β-Ala -Produces DOPA. The synthesized β-Ala-DOPA may be isolated and purified.
培養は、通常、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。 Cultivation is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration agitation culture.
培養温度は、好ましくは、15℃～40℃である。 The culture temperature is preferably 15°C to 40°C.
培養時間は、好ましくは、5時間～7日間である。 The culture time is preferably 5 hours to 7 days.
培養中のpHは、好ましくは、pH3～pH9に保持する。pHの調整は、無機或は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。 The pH during culturing is preferably maintained at pH3 to pH9. The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
高収率での変換反応（基質のβ-Ala-Tyrからの目的ジペプチドであるβ-Ala-DOPAを合成する事）を達成する為には、高発現した菌体を集菌後に反応系（休止菌体反応）で反応する事が好ましい。 In order to achieve a high-yield conversion reaction (synthesis of the target dipeptide β-Ala-DOPA from the substrate β-Ala-Tyr), it is necessary to collect highly expressed bacterial cells and then use the reaction system ( It is preferable to react by a resting bacterial cell reaction).
抗酸化剤を添加する事
β-Ala-DOPAを合成する際に、好ましくは、抗酸化剤（好ましくは、アスコルビン酸を適宜（5mM～50mM程度）添加する。抗酸化剤（好ましくは、アスコルビン酸）を添加する事に依り、目的化合物であるβ-Ala-DOPAの酸化分解を抑制する事が可能である。
Adding an antioxidant When synthesizing β-Ala-DOPA, it is preferable to add an antioxidant (preferably ascorbic acid as appropriate (approximately 5mM to 50mM)).Antioxidant (preferably ascorbic acid) ), it is possible to suppress the oxidative decomposition of the target compound, β-Ala-DOPA.
緩衝液中に生成、蓄積したβ-Ala-DOPAの単離・精製は、当業者に慣用の活性炭、イオン交換樹脂等を用いる方法、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行う。 Isolation and purification of β-Ala-DOPA produced and accumulated in the buffer solution can be carried out by methods commonly used by those skilled in the art, such as using activated carbon, ion exchange resin, etc., extraction with organic solvents, crystallization, thin layer chromatography, high performance liquid This is done by chromatography, etc.
菌体反応系による製造方法では、集菌した微生物株（形質転換株）を生体触媒として緩衝液中で反応させる事が可能である。また、工業化を踏まえた大きなスケールでの生産では、緩衝液ではなくアルカリによる下限コントロールにて反応中のpHを制御する事が好ましい。 In the production method using a bacterial cell reaction system, it is possible to react the collected microbial strain (transformed strain) in a buffer solution as a biocatalyst. In addition, in large-scale production based on industrialization, it is preferable to control the pH during the reaction by lower limit control using an alkali rather than a buffer solution.
［2-5-2］酵素反応系による2ステップでのβ-Ala-DOPAの製造方法
工程（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を用いて、アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、
工程（1）では、β-Ala-DOPAの製造方法の内、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質（野生型YwfE、或いはYwfEの変異型）を用い、アデノシン三リン酸（ATP）の共存下、緩衝液中で反応する事に依り、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する。工程（1）において、アデノシン三リン酸（ATP）を添加する。
[2-5-2] Two-step production method of β-Ala-DOPA using enzyme reaction system
Step (1) Using a protein with L-amino acid α-ligase activity, β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) are combined as substrates in the presence of adenosine triphosphate (ATP). A step of synthesizing β-Ala-Tyr from
In step (1), in the method for producing β-Ala-DOPA, a protein with L-amino acid α-ligase activity (wild-type YwfE or a mutant form of YwfE) is used, and adenosine triphosphate (ATP) is coexisting. Below, β-Ala-Tyr is synthesized from β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) as substrates by reaction in a buffer solution. In step (1), adenosine triphosphate (ATP) is added.
酵素反応系による製造方法では、基質に対して、当量以上のアデノシン三リン酸（ATP）を添加する。 In the production method using an enzyme reaction system, an equivalent or more amount of adenosine triphosphate (ATP) is added to the substrate.
工程（1）では、β-Ala-Tyrは、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とを基質として、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質が、触媒として働き、アデノシン三リン酸（ATP）の共存下、縮合反応する事に依り、合成される。 In step (1), β-Ala-Tyr is produced by a protein with L-amino acid α-ligase activity acting as a catalyst using β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) as substrates. , is synthesized through a condensation reaction in the presence of adenosine triphosphate (ATP).
製造方法では、添加するβ-アラニン（β-Ala）及びL-チロシン（L-Tyr）の量は、各々、一例として、0.5g／L～100g／L程度である。 In the production method, the amounts of β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) to be added are each about 0.5 g/L to 100 g/L, for example.
工程（1）では、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とを含む緩衝液に、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を添加し、所定の時間インキュベーション後、合成されるβ-Ala-Tyrを単離精製する事に依り、β-Ala-Tyrを製造し、取得する事が出来る。 In step (1), a protein having L-amino acid α-ligase activity is added to a buffer containing β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr), and after incubation for a predetermined time, β-Ala-Tyr can be produced and obtained by isolating and purifying the synthesized β-Ala-Tyr.
工程（2）：二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を用いて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）の存在下、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程
工程（2）では、β-Ala-DOPAの製造方法の内、二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質（好ましくは、HpaBC）を用い、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）の存在下、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する。工程（2）において、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）を添加する。
Step (2): β-Ala-Tyr obtained in the step (1) in the presence of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) using a protein having two-component flavin-dependent monooxygenase activity, In the process step (2) of hydroxylating and synthesizing β-Ala-DOPA , a protein having two-component flavin-dependent monooxygenase activity (preferably HpaBC) is used in the method for producing β-Ala-DOPA. , β-Ala-Tyr obtained in the step (1) is hydroxylated in the presence of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) to synthesize β-Ala-DOPA. In step (2), reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) is added.
酵素反応系による製造方法では、基質に対して、当量以上の還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）を添加する。 In the production method using an enzyme reaction system, an equivalent or more amount of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) is added to the substrate.
工程（2）では、β-Ala-DOPAは、β-Ala-Tyrを基質として、二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質が、触媒として働き、水酸化する事に依り、合成される。 In step (2), β-Ala-DOPA is synthesized by hydroxylation of β-Ala-Tyr as a substrate by a protein with two-component flavin-dependent monooxygenase activity acting as a catalyst. .
工程（2）では、添加するβ-Ala-Tyrの量は、一例として、0.1g／L～100g／L程度である。 In step (2), the amount of β-Ala-Tyr added is, for example, about 0.1 g/L to 100 g/L.
工程（2）では、β-Ala-Tyrを含む緩衝液に、二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を添加し、所定の時間インキュベーション後、β-Ala-DOPAを製造し、取得する事が出来る。 In step (2), a protein having two-component flavin-dependent monooxygenase activity is added to a buffer containing β-Ala-Tyr, and after incubation for a predetermined time, β-Ala-DOPA is produced and obtained. I can do things.
合成反応は、水性媒体中、好ましくは、pH5～pH11であり、より好ましくは、pH6～pH10である。
The synthesis reaction is preferably carried out in an aqueous medium between
合成反応は、水性媒体中、好ましくは、20℃～50℃であり、より好ましくは、25℃～45℃の条件である。 The synthesis reaction is carried out in an aqueous medium, preferably at 20°C to 50°C, more preferably at 25°C to 45°C.
合成反応は、水性媒体中、好ましくは、2時間～72時間であり、より好ましくは、6時間～36時間行う。 The synthesis reaction is carried out in an aqueous medium, preferably for 2 hours to 72 hours, more preferably for 6 hours to 36 hours.
抗酸化剤を添加する事
β-Ala-DOPAを合成する際に、好ましくは、抗酸化剤（好ましくは、アスコルビン酸を適宜（5mM～50mM程度）添加する。抗酸化剤（好ましくは、アスコルビン酸）を添加する事に依り、目的化合物であるβ-Ala-DOPAの酸化分解を抑制する事が可能である。
Adding an antioxidant When synthesizing β-Ala-DOPA, it is preferable to add an antioxidant (preferably ascorbic acid as appropriate (approximately 5mM to 50mM)).Antioxidant (preferably ascorbic acid) ), it is possible to suppress the oxidative decomposition of the target compound, β-Ala-DOPA.
緩衝液中に生成、蓄積したβ-Ala-DOPAの単離・精製は、当業者に慣用の活性炭、イオン交換樹脂等を用いる方法、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行う。 Isolation and purification of β-Ala-DOPA produced and accumulated in the buffer solution can be carried out by methods commonly used by those skilled in the art, such as using activated carbon, ion exchange resin, etc., extraction with organic solvents, crystallization, thin layer chromatography, high performance liquid This is done by chromatography, etc.
実施例は、本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。 The examples are illustrative of embodiments of the invention and should not be construed as limiting the scope of the invention.
以下の実施例において、ポリヌクレオチド（DNA、mRNA）の調製、PCR、塩基配列決定、微生物株（形質転換株）、タンパク質の発現、タンパク質の精製、HPLC分析等は、当業者に周知慣用の方法を用いて行う。 In the following examples, preparation of polynucleotides (DNA, mRNA), PCR, base sequencing, microbial strains (transformed strains), protein expression, protein purification, HPLC analysis, etc. are performed using methods well known and commonly used by those skilled in the art. This is done using
例えば、Sambrook、J.及びRussell、D. W.、Molecular Cloning A Laboratory Manual 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press （2012）等を参照する。 For example, see Sambrook, J. and Russell, D. W., Molecular Cloning A Laboratory Manual 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012), etc.
［1］YwfEへの部位特異的変異の導入
YwfE遺伝子（配列番号1、1419bp、472残基)を組み込んだpETベクターを鋳型として、Quick Change Site-Directed Mutagenesis（Strategene、米国）を用いて目的の変異を導入した（図1）。
[1] Introduction of site-specific mutations to YwfE
Using a pET vector incorporating the YwfE gene ( SEQ ID NO: 1 , 1419 bp, 472 residues) as a template, the desired mutation was introduced using Quick Change Site-Directed Mutagenesis (Strategene, USA) (Figure 1).
PCR反応は、表1（組成）及び表2（PCRサイクル）に示す反応条件で実施した。PCR反応では、KOD-Plus-Neo-DNA polymerase（Toyobo Co., Ltd.、大阪）を用いた。 The PCR reaction was carried out under the reaction conditions shown in Table 1 (composition) and Table 2 (PCR cycle). KOD-Plus-Neo-DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd., Osaka) was used in the PCR reaction.
プライマーを使用し、YwfEタンパク質のN末端から108番目のアスパラギン（N）残基をアラニン（A）残基に置換したYwfEタンパク質をコード（配列番号3）するポリヌクレオチドN108Aの部位特異的変異を導入したプラスミドを得た。 Using primers, site-directed mutation of polynucleotide N108A encoding YwfE protein ( SEQ ID NO: 3 ) in which the 108th asparagine (N) residue from the N-terminus of YwfE protein was replaced with alanine (A) residue was introduced. A plasmid was obtained.
PCR反応後、得られたPCR産物について、DNAシークエンサー（アプライドバイオシステムズ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社、東京）で解析し、部位特異的変異が導入されたかを確認した。 After the PCR reaction, the obtained PCR product was analyzed using a DNA sequencer (Applied Biosystems, Life Technologies Japan Co., Ltd., Tokyo) to confirm whether site-specific mutations had been introduced.
大腸菌から抽出されたベクターは、Damメチラーゼにより、Dpn Iサイトがメチル化されている一方、PCR産物は、Dpn Iサイトがメチル化されていない。これを利用する事に依り、鋳型ベクターと、PCR産物とを区別出来る。簡潔には、PCR後の反応液に含まれる鋳型ベクターを除去する為に、精製したPCR産物をDpn Iで37℃、2時間処理した。 In the vector extracted from E. coli, the Dpn I site is methylated by Dam methylase, whereas in the PCR product, the Dpn I site is not methylated. By utilizing this, template vectors and PCR products can be distinguished. Briefly, in order to remove the template vector contained in the reaction solution after PCR, the purified PCR product was treated with Dpn I at 37°C for 2 hours.
制限酵素反応は、表3に示した反応条件で実施した。 The restriction enzyme reaction was performed under the reaction conditions shown in Table 3.
制限酵素Dpn Iでの消化後、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿に依り、精製した部位特異的変異導入プラスミドを、TE緩衝液pH8.0に溶解した。 After digestion with the restriction enzyme Dpn I, the site-directed mutagenesis plasmid purified by phenol/chloroform treatment and ethanol precipitation was dissolved in TE buffer pH 8.0.
［2］部位特異的変異導入プラスミドによる大腸菌JM109の形質転換
大腸菌JM109のコンピテントセルと、部位特異的変異導入プラスミドとをともに、42℃で熱処理した。その後、SOC培地を加えて培養し、カナマイシン50μg／mL含有LB寒天培地に植菌し、37℃で終夜培養した。
[2] Transformation of E. coli JM109 using the site-directed mutagenesis plasmid Both competent cells of E. coli JM109 and the site-directed mutagenesis plasmid were heat-treated at 42°C. Thereafter, SOC medium was added and cultured, and the cells were inoculated onto an LB agar medium containing 50 μg/mL of kanamycin and cultured at 37° C. overnight.
生育したコロニーから1つのコロニーを選択し、カナマイシン含有LB培地3mLに懸濁し、37℃で5時間培養した。培養後、アルカリSDS法に依り、形質転換株から部位特異的変異導入プラスミドを抽出した。抽出した部位特異的変異導入プラスミドをフェノール・クロロホルム処理とエタノール沈殿により精製し、TE緩衝液（pH8.0）に溶解した。 One colony was selected from the grown colonies, suspended in 3 mL of LB medium containing kanamycin, and cultured at 37°C for 5 hours. After culturing, the site-directed mutagenic plasmid was extracted from the transformed strain by the alkaline SDS method. The extracted site-directed mutagenesis plasmid was purified by phenol/chloroform treatment and ethanol precipitation, and dissolved in TE buffer (pH 8.0).
［3］精製酵素の調製
部位特異的変異導入プラスミドによる大腸菌BL21の形質転換
精製した部位特異的変異導入プラスミドを用いて、ヒートショック法により大腸菌BL21の形質転換を行った。大腸菌BL21のコンピテントセルと部位特異的変異導入プラスミドとを共に、42℃で熱処理した。その後、SOC培地を加えて培養し、カナマイシン50μg／mL含有LB寒天培地に植菌し、37℃で終夜培養した。
[3] Preparation of purified enzyme
Transformation of E. coli BL21 with the site-directed mutagenesis plasmid E. coli BL21 was transformed by the heat shock method using the purified site-directed mutagenesis plasmid. Both the E. coli BL21 competent cells and the site-directed mutagenesis plasmid were heat-treated at 42°C. Thereafter, SOC medium was added and cultured, and the cells were inoculated onto an LB agar medium containing 50 μg/mL of kanamycin and cultured at 37° C. overnight.
コロニーを形成した大腸菌を、YwfE発現形質転換株とした。 The E. coli that formed colonies was used as a transformed strain expressing YwfE.
IPTGによる発現誘導
生育したYwfE発現形質転換株のコロニーから1つのコロニーを選択し、試験管中でカナマイシン含有LB培地3mLに懸濁して、37℃で5時間、前培養を行った。次に、500mLバッフル付エルレンマイヤーフラスコ中のカナマイシン含有LB培地200mLに前培養液2mLを添加した。37℃、120rpmで2時間本培養した後、100mM IPTG 200μLを添加した。IPTG添加後の培養液を25℃、120rpmで終夜培養した。
One colony was selected from the colonies of the YwfE-expressing transformant grown under the induction of expression by IPTG , suspended in 3 mL of kanamycin-containing LB medium in a test tube, and precultured at 37°C for 5 hours. Next, 2 mL of the preculture solution was added to 200 mL of kanamycin-containing LB medium in a 500 mL baffled Erlenmeyer flask. After main culture at 37°C and 120 rpm for 2 hours, 200 μL of 100 mM IPTG was added. The culture solution after adding IPTG was cultured overnight at 25°C and 120 rpm.
終夜培養後、5,000×g、10分間の遠心分離を行って集菌し、菌体ペレットを100mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）で懸濁して洗菌した。この操作を2回繰り返して培地成分を除去した。洗菌後、菌体ペレットを-80℃で凍結保存した。 After culturing overnight, the cells were collected by centrifugation at 5,000 x g for 10 minutes, and the cell pellet was washed by suspending it in 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). This operation was repeated twice to remove medium components. After washing, the bacterial pellet was stored frozen at -80°C.
酵素精製
解凍した菌体ペレットに、BugBuster（BugBusterTM Protein Extraction Reagent、メルクKGaA社、独国）とリゾチームとを添加し、タンパク質を抽出した。菌体破砕液は遠心分離によって、沈殿（不溶性画分）と上清（無細胞抽出液）とに分離した。無細胞抽出液をHis GraviTrap（GEヘルスケア社、米国）を用いて、適用した。溶出した溶液を、PD-10カラム（GEヘルスケア社）を用いて、脱塩した。
Enzyme purification BugBuster (BugBusterTM Protein Extraction Reagent, Merck KGaA, Germany) and lysozyme were added to the thawed bacterial pellet to extract proteins. The cell suspension was separated into a precipitate (insoluble fraction) and a supernatant (cell-free extract) by centrifugation. Cell-free extracts were applied using His GraviTrap (GE Healthcare, USA). The eluted solution was desalted using a PD-10 column (GE Healthcare).
精製酵素の濃度測定
精製した酵素の濃度を、クマシーブリリアントブルーを用いた呈色反応後、マイクロプレートリーダーMODEL550（Bio-Rad社、米国）に依り、測定した。検量線法により595nmの吸光度の測定値から精製した酵素濃度を決定した。
Measurement of Concentration of Purified Enzyme The concentration of the purified enzyme was measured using a microplate reader MODEL550 (Bio-Rad, USA) after a color reaction using Coomassie Brilliant Blue. The purified enzyme concentration was determined from the measured value of absorbance at 595 nm using the calibration curve method.
［4］β-Ala-DOPA或はβ-Ala-Tyr合成活性評価（HPLC分析）
β-Ala-DOPA或はβ-Ala-Tyrの標品を使用した。β-Ala-DOPA或はβ-Ala-Tyrの合成量は、Nα-(5-fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-alanineamide（FDAA）誘導体化法を用いたHPLC分析を実施し、検量線法に依り、定量した。HPLC分析は、表4（溶離液組成）及び表5（グラジエントプログラム）に示した条件で定法に従って実施した。
[4] Evaluation of β-Ala-DOPA or β-Ala-Tyr synthesis activity (HPLC analysis)
A standard product of β-Ala-DOPA or β-Ala-Tyr was used. The amount of β-Ala-DOPA or β-Ala-Tyr synthesized was determined by HPLC analysis using the Nα-(5-fluoro-2,4-dinitrophenyl)-L-alanineamide (FDAA) derivatization method. Quantification was performed using the line method. HPLC analysis was performed according to a standard method under the conditions shown in Table 4 (eluent composition) and Table 5 (gradient program).
＜分析条件＞
使用機器：HITACHI L-7000 シリーズ（株式会社日立製作所、東京）
使用カラム：WH-C18A（4×150mm）（株式会社日立ハイテクノロジーズ、東京）
サンプル注入量：10μL
流速：0.5mL／分
カラム温度：40℃
UV検出波長：340nm
<Analysis conditions>
Equipment used: HITACHI L-7000 series (Hitachi, Ltd., Tokyo)
Column used: WH-C18A (4 x 150mm) (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo)
Sample injection volume: 10μL
Flow rate: 0.5mL/min Column temperature: 40℃
UV detection wavelength: 340nm
酵素は、野生型酵素（YwfE）（配列番号2）、及びYwfE単変異型酵素N108A（配列番号3）を用いた。 The enzymes used were a wild-type enzyme (YwfE) ( SEQ ID NO: 2 ) and a YwfE single mutant enzyme N108A ( SEQ ID NO: 3 ).
反応終了後、HPLCを用いて、β-Ala-DOPA或はβ-Ala-Tyrを分析した。 After the reaction was completed, β-Ala-DOPA or β-Ala-Tyr was analyzed using HPLC.
統計学的検定は、統計検定ソフト：EZR
（http://www.jichi.ac.jp/saitama-sct/SaitamaHP.files/statmed.htm）
を用い、野生型酵素によって生成されるβ-Ala-DOPA或いはβ-Ala-Tyrの濃度、及び各変異型酵素に依り、生成されるβ-Ala-DOPA或いはβ-Ala-Tyrの濃度を、一元配置分散分析（ANOVA）及びDunnettの検定法に依り、p値0.05を有意水準としてpost hoc解析した（各群n=3）。
For statistical tests, use statistical test software: EZR
(http://www.jichi.ac.jp/saitama-sct/SaitamaHP.files/statmed.htm)
The concentration of β-Ala-DOPA or β-Ala-Tyr produced by the wild-type enzyme, and the concentration of β-Ala-DOPA or β-Ala-Tyr produced by each mutant enzyme, using Post hoc analysis was performed using one-way analysis of variance (ANOVA) and Dunnett's test, with a p value of 0.05 as the significance level (n=3 for each group).
［5］1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造
菌体反応系による1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造では、L-アミノ酸α-リガーゼ活性（野生型YwfE、或はYwfEの1変異型YwfE）を発現する宿主細胞を用いて、（1）基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する工程を含む。
[5] One-step production of β-Ala-DOPA In one-step production of β-Ala-DOPA using a bacterial cell reaction system, L-amino acid α-ligase activity (wild-type YwfE or one mutant of YwfE) is required. (1) Synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-DOPA (L-DOPA) as substrates using host cells expressing YwfE type YwfE) .
宿主株は、好ましくは、ペプチダーゼの欠損株である。 The host strain is preferably a peptidase-deficient strain.
宿主株（大腸菌）を用いる菌体反応系では、糖を供給することでATP無添加系とする事が出来る。菌体反応系では、宿主が有するペプチダーゼ（PepD）の欠損変異を有した宿主株を用いる事に依り、β-AlaとDOPAから、β-Ala-DOPAを高収率に合成する事が出来る。 In a bacterial cell reaction system using a host strain (E. coli), an ATP-free system can be created by supplying sugar. In the bacterial cell reaction system, β-Ala-DOPA can be synthesized in high yield from β-Ala and DOPA by using a host strain with a deletion mutation of the host's peptidase (PepD).
酵素反応系による1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造では、L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質（YwfE、野生型或いはその変異型酵素）を用いて、（1）アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する工程を含む。 In the one-step production of β-Ala-DOPA using an enzymatic reaction system, a protein with L-amino acid α-ligase activity (YwfE, wild type or its mutant enzyme) is used to produce (1) adenosine triphosphate ( The method includes the step of synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-DOPA as substrates in the presence of ATP).
酵素系の1ステップのβ-Ala-DOPAの製造は、好ましくは、抗酸化剤（好ましくは、アスコルビン酸（10mM））の存在下で行う。L-ドパ（L-DOPA）の性質として、酸化分解による褐変反応や重合化が有る。基質として、L-ドパ（L-DOPA）を使用する際に、抗酸化剤（好ましくは、アスコルビン酸（10mM～20mM程度））を添加する事に依り、L-ドパ（L-DOPA）の褐変或は重合化を抑制する事が出来、L-ドパ（L-DOPA）を安定に維持する事が出来、L-ドパ（L-DOPA）の減少を抑止する事が出来る。 The enzymatic one-step production of β-Ala-DOPA is preferably carried out in the presence of an antioxidant, preferably ascorbic acid (10 mM). The properties of L-DOPA include browning reactions and polymerization due to oxidative decomposition. When using L-DOPA as a substrate, by adding an antioxidant (preferably ascorbic acid (about 10mM to 20mM)), L-DOPA can be The browning or polymerization of L-DOPA can be suppressed, L-DOPA can be maintained stably, and the decrease of L-DOPA can be suppressed.
［5-1］酵素反応系による1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造
アスコルビン酸に依る酸化防止の効果
酵素系では、アスコルビン酸を5mM～20mMの濃度で添加する事に依り、基質のL-ドパ（L-DOPA）に対して、目的物のβ-Ala-DOPAを、変換率90%を超える収率で合成する事が出来た（図3）。
[5-1] Production of β-Ala-DOPA in one step using an enzymatic reaction system
Antioxidant effect of ascorbic acid In enzyme systems, by adding ascorbic acid at a concentration of 5mM to 20mM, the target substance β-Ala-DOPA is added to the substrate L-DOPA. was successfully synthesized with a conversion rate of over 90% (Figure 3).
［5-2］菌体反応系による1ステップでのβ-Ala-DOPAの製造
PepD欠損変異株の使用に依る効果
大腸菌組換え株を用いる菌体系では、若干の糖を添加することでATP無添加反応系とする事が出来る。大腸菌組換え株を用いる菌体反応系では、好ましくは、ペプチダーゼ（PepD）の欠損変異を施した宿主を用いる。
[5-2] Production of β-Ala-DOPA in one step using bacterial cell reaction system
Effects of using a PepD-deficient mutant strain In a bacterial system using a recombinant E. coli strain, it is possible to create an ATP-free reaction system by adding a small amount of sugar. In a bacterial cell reaction system using a recombinant E. coli strain, a host mutated to lack peptidase (PepD) is preferably used.
菌体反応系では、ペプチダーゼ（PepD）の欠損変異を施した大腸菌組換え株を用いる事に依り、基質のL-ドパ（L-DOPA）に対して、目的物のβ-Ala-DOPAを、変換率50%を超える収率で合成する事が出来た（図4）。 In the bacterial cell reaction system, by using a recombinant E. coli strain with a deletion mutation of peptidase (PepD), the target substance β-Ala-DOPA can be converted to the substrate L-DOPA. , we were able to synthesize it with a yield exceeding 50% conversion (Figure 4).
使用菌体量の増加に依る効果
菌体系では、菌体量を増加させる事に依り、基質のL-ドパ（L-DOPA）に対して、目的物のβ-Ala-DOPAを、変換率70%を超える収率で合成する事が出来た。
Effect by increasing the amount of bacteria used In the bacterial system, by increasing the amount of bacteria used, the conversion rate of the target substance β-Ala-DOPA for the substrate L-DOPA can be increased. We were able to synthesize it with a yield of over 70%.
アスコルビン酸に依る酸化防止の効果
菌体反応系では、アスコルビン酸を5mM～20mMの濃度で添加する事に依り、基質のL-ドパ（L-DOPA）に対して、目的物のβ-Ala-DOPAを、変換率60%を超える収率で合成する事が出来た（図5）。また、菌体量を増量する等、反応条件最適化によって、最終的に収率（変換率）を76%程度にまで上昇させる事が可能である。
Antioxidant effect of ascorbic acid In the bacterial cell reaction system, by adding ascorbic acid at a concentration of 5mM to 20mM, the target substance β-Ala is added to the substrate L-DOPA. -DOPA was successfully synthesized with a conversion rate of over 60% (Figure 5). Furthermore, by optimizing the reaction conditions, such as increasing the amount of bacterial cells, it is possible to ultimately increase the yield (conversion rate) to about 76%.
［6］2ステップでのβ-Ala-DOPAの製造
菌体反応系による2ステップでのβ-Ala-DOPAの製造では、L-アミノ酸α-リガーゼ活性（野生型YwfE、或はYwfEの変異型）及び二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を共発現する株を用いて、先ず、（1）基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、次いで、（2）前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化（水酸基を導入）し、β-Ala-DOPAを合成する工程を含む。
[6] Production of β-Ala-DOPA in two steps In the production of β-Ala-DOPA in two steps using a bacterial cell reaction system, L-amino acid α-ligase activity (wild-type YwfE or YwfE mutant ) and a strain co-expressing two-component flavin-dependent monooxygenase activity. The process includes a step of synthesizing Ala-Tyr, and then (2) a step of hydroxylating (introducing a hydroxyl group) β-Ala-Tyr obtained in the step (1) to synthesize β-Ala-DOPA.
L-アミノ酸α-リガーゼ活性を発現する微生物株（形質転換株）に、基質として、β-AlaとTyrを添加し、β-Ala-Tyrを生産する事が出来る。二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼを発現する微生物株（形質転換株）に、基質として、β-Ala-Tyrを添加し、β-Ala-DOPAを生産する事が出来る。二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ及びこれを発現する株については前記説明の通りである。L-アミノ酸α-リガーゼ活性（YwfE）と二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ（HaBC）の2つの酵素を同時に発現する菌を用いる事に依り、2ステップの反応を同時に行う事が出来る。 β-Ala-Tyr can be produced by adding β-Ala and Tyr as substrates to a microbial strain (transformed strain) that expresses L-amino acid α-ligase activity. By adding β-Ala-Tyr as a substrate to a microbial strain (transformed strain) expressing a two-component flavin-dependent monooxygenase, β-Ala-DOPA can be produced. The two-component flavin-dependent monooxygenase and the strain expressing it are as described above. By using a bacterium that simultaneously expresses two enzymes: L-amino acid α-ligase activity (YwfE) and two-component flavin-dependent monooxygenase (HaBC), two-step reactions can be performed simultaneously.
微生物株は、好ましくは、ペプチダーゼの欠損株（形質転換株）である。 The microorganism strain is preferably a peptidase-deficient strain (transformed strain).
微生物株（大腸菌等）を用いる菌体反応系では、若干の糖を添加することでATP無添加系とする事が出来る。菌体系では、菌体が持つペプチダーゼ（PepD）の欠損変異を有した形質転換株を用いる事に依り、β-AlaとDOPAから、β-Ala-DOPAを高収率に合成する事が出来る。 In bacterial cell reaction systems using microbial strains (such as Escherichia coli), an ATP-free system can be achieved by adding a small amount of sugar. In the bacterial system, β-Ala-DOPA can be synthesized in high yield from β-Ala and DOPA by using a transformed strain with a deletion mutation of the peptidase (PepD) possessed by the bacterial body.
酵素反応系による2ステップでのβ-Ala-DOPAの製造では、先ず、（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を用いて、アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、次いで、（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を用いて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）の存在下、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程を含む。 In the two-step production of β-Ala-DOPA using an enzymatic reaction system, (1) a protein with L-amino acid α-ligase activity is used as a substrate in the presence of adenosine triphosphate (ATP); A step of synthesizing β-Ala-Tyr from β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr), and then (2) using a protein with two-component flavin-dependent monooxygenase activity. , the step of hydroxylating β-Ala-Tyr obtained in the step (1) in the presence of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) to synthesize β-Ala-DOPA.
工程（1）のL-アミノ酸α-リガーゼ活性（野生型YwfE、或いはYwfEの変異型）に依るジペプチドの合成には、ATPを必要とする為に、酵素反応系ではATPの供給が必要である。工程（2）のβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAへの変換には、二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ(HpaBC)を用いる。酵素反応系ではNADHの供給が必要である。 Since ATP is required for the synthesis of dipeptide using L-amino acid α-ligase activity (wild-type YwfE or YwfE mutant) in step (1), ATP must be supplied in the enzymatic reaction system. . Two-component flavin-dependent monooxygenase (HpaBC) is used to hydroxylate and convert β-Ala-Tyr into β-Ala-DOPA in step (2). Enzyme reaction systems require a supply of NADH.
［6-1］菌体反応系による2ステップでのβ-Ala-DOPAの製造
工程（1）β-Ala-Tyrの合成
工程（1）では、L-アミノ酸α-リガーゼ活性（YwfE、ジペプチド合成酵素）を有する酵素YwfEの部位特異的変異型酵素YwfE（N108A）を発現する大腸菌組換え株を用いて、β-Ala-Tyrの合成を行った。
[6-1] Production of β-Ala-DOPA in two steps using bacterial cell reaction system
Step (1) Synthesis of β-Ala-Tyr In Step (1), Escherichia coli expressing a site-specific mutant enzyme YwfE (N108A) of the enzyme YwfE having L-amino acid α-ligase activity (YwfE, dipeptide synthase) is used. β-Ala-Tyr was synthesized using the recombinant strain.
チロシン含有ジペプチド（β-Ala-Tyr）生産用
宿主：E. coli BL21 (DE3)
プラスミド情報
ベクター：pET-21a (+)
インサート：ywfE (Bacillu subtilis ATCC 15245由来L-アミノ酸リガーゼ)
発現酵素の一次配列：YwfE改変酵素N108A (C末端側His-tag)
Host for producing tyrosine-containing dipeptide (β-Ala-Tyr) : E. coli BL21 (DE3)
Plasmid information Vector: pET-21a (+)
Insert: ywfE (L-amino acid ligase from Bacillus subtilis ATCC 15245)
Primary sequence of expressed enzyme: YwfE modified enzyme N108A (C-terminal His-tag)
LC-MSに依る定量を行うと、12.5mMのβ-Ala（基質）から、4.73mMのβ-Ala-Tyr（目的化合物）を合成した事を確認する事が出来た。 Quantification by LC-MS confirmed that 4.73mM β-Ala-Tyr (target compound) was synthesized from 12.5mM β-Ala (substrate).
培養スケールを、300μLから3mLに挙げた処、9.23mMのβ-Ala-Tyr（目的化合物）に合成収量を上昇させる事が出来た（変換率が73.8%）。 By increasing the culture scale from 300 μL to 3 mL, we were able to increase the synthesis yield to 9.23 mM β-Ala-Tyr (target compound) (conversion rate was 73.8%).
反応容器の変更に依り、通気・攪拌条件が重要である事が示唆され、スケールアップには、ジャーファメンターの使用が好適である。 It is suggested that aeration and stirring conditions are important due to changes in the reaction vessel, and the use of a jar fermenter is suitable for scale-up.
工程（2）β-Ala-DOPAの合成（大腸菌を用いた菌体反応系による方法）
工程（2）は、β-Ala-Tyrからβ-Ala-DOPAへの変換プロセスである。
Step (2) Synthesis of β-Ala-DOPA (method using bacterial cell reaction system using E. coli)
Step (2) is a conversion process from β-Ala-Tyr to β-Ala-DOPA.
予備検討として、L-ドパ（L-DOPA）飽和水溶液を30℃で20hr放置すると、pH6.5以上では褐変を起こす現象が確認された。 As a preliminary study, when a saturated aqueous solution of L-DOPA was left at 30°C for 20 hours, it was confirmed that browning occurred at pH 6.5 or higher.
二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ(HpaBC)を高発現する大腸菌組換え株を用いて、基質として、β-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成した。 Using a recombinant Escherichia coli strain that highly expresses two-component flavin-dependent monooxygenase (HpaBC), β-Ala-Tyr was hydroxylated as a substrate to synthesize β-Ala-DOPA.
DOPA含有ジペプチド（β-Ala-DOPA）生産用
宿主：E. coli BL21 (DE3)
プラスミド情報
ベクター：pETDuet-1
インサート：hpaBC (Pseudomonas aeruginosa PAO1由来二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ)
発現酵素の一次配列：HpaB及びHpaCの共発現
LC-MSに依る定量を行うと、β-Ala-Tyr（基質）の減少が定量され、β-Ala-DOPA（目的化合物）の生成した事を確認する事が出来た（収率は16.7%）。
Host for DOPA-containing dipeptide (β-Ala-DOPA) production : E. coli BL21 (DE3)
Plasmid information Vector: pETDuet-1
Insert: hpaBC (two-component flavin-dependent monooxygenase from Pseudomonas aeruginosa PAO1)
Primary sequence of expressed enzyme: co-expression of HpaB and HpaC
When quantitative analysis was performed using LC-MS, the decrease in β-Ala-Tyr (substrate) was quantified, and it was confirmed that β-Ala-DOPA (target compound) was produced (yield: 16.7%). ).
アスコルビン酸を添加した反応系では、pH8.0というアルカリ下で、褐変も無く、反応が進み、良好にL-ドパ（L-DOPA）がβ-Ala化されたと考えられる。 In the reaction system to which ascorbic acid was added, the reaction proceeded without browning under an alkaline pH of 8.0, and it is thought that L-DOPA was successfully converted to β-Ala.
配列番号1：野生型YwfE
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
ATG GAG AGA AAA ACA GTA TTG GTC ATC GCT GAT CTT GGA GGC TGC CCG CCG CAC ATG TTT
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
TAT AAA AGC GCT GCT GAA AAA TAT AAC CTG GTC AGC TTT ATT CCA AGA CCT TTT GCA ATT
41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
ACA GCC TCC CAT GCA GCA TTG ATT GAA AAA TAC TCG GTC GCG GTC ATA AAA GAT AAA GAC
61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
TAT TTT AAG AGT TTA GCT GAT TTT GAA CAC CCT GAT TCC ATT TAT TGG GCG CAT GAA GAT
81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
CAT AAC AAG CCT GAG GAA GAG GTC GTC GAG CAA ATC GTC AAG GTT GCC GAA ATG TTT GGG
101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
GCG GAT GCC ATC ACA ACA AAC AAT GAA TTA TTC ATT GCT CCG ATG GCG AAA GCC TGT GAA
121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140
CGT CTG GGC TTG AGA GGT GCC GGC GTG CAG GCA GCC GAA AAT GCC AGA GAT AAA AAT AAA
141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160
ATG AGG GAC GCT TTT AAT AAG GCC GGA GTC AAA TCG ATC AAA AAC AAA CGA GTC ACA ACT
161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180
CTT GAA GAT TTC CGT GCT GCT CTT GAA GAG ATC GGC ACA CCT CTT ATC TTA AAG CCT ACA
181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200
TAC TTA GCG AGT TCT ATC GGT GTA ACG CTG ATT ACG GAC ACT GAG ACG GCA GAA GAT GAA
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220
TTT AAC AGA GTC AAT GAC TAT CTG AAA TCA ATT AAC GTG CCA AAG GCG GTT ACG TTT GAA
221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240
GCG CCG TTT ATC GCT GAA GAA TTT TTA CAG GGT GAG TAC GGA GAC TGG TAT CAA ACA GAA
241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260
GGG TAC TCC GAC TAT ATC AGT ATA GAA GGC ATC ATG GCT GAC GGT GAG TAT TTC CCG ATC
261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280
GCC ATT CAT GAT AAA ACG CCG CAA ATC GGG TTT ACA GAG ACA TCC CAC ATT ACG CCG TCC
281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300
ATT CTG GAT GAA GAG GCA AAA AAG AAA ATT GTC GAA GCT GCC AAA AAG GCA AAT GAA GGG
301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320
CTT GGA CTG CAA AAT TGC GCA ACA CAT ACA GAG ATC AAG CTA ATG AAA AAC AGA GAA CCG
321 322 323 324 325 326 327 328 329 310 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340
GGT TTA ATA GAG TCG GCA GCC AGA TTT GCC GGC TGG AAT ATG ATC CCC AAT ATT AAA AAG
341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360
GTC TTT GGC CTT GAT ATG GCG CAA TTA TTA TTA GAT GTC CTC TGT TTC GGA AAA GAC GCC
361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380
GAT CTG CCG GAC GGA TTA TTG GAT CAA GAG CCT TAT TAT GTT GCC GAC TGC CAT TTG TAC
381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400
CCG CAG CAT TTC AAA CAA AAT GGC CAA ATT CCT GAA ACT GCT GAG GAT TTG GTC ATT GAA
401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420
GCG ATC GAT ATT CCG GAC GGG CTT TTA AAA GGG GAT ACT GAA ATC GTT TCT TTT TCG GCC
421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440
GCA GCA CCA GGC ACT TCA GTT GAT TTG ACA TTG TTT GAA GCT TTC AAT TCC ATT GCT GCA
441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460
TTT GAA CTG AAA GGC AGT AAT TCA CAG GAT GTG GCT GAA TCA ATC AGA CAA ATT CAG CAG
461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471 472 END
CAT GCG AAG CTG ACG GCA AAG TAT GTG CTG CCA GTA TGA
SEQ ID NO: 1: Wild type YwfE
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
ATG GAG AGA AAA ACA GTA TTG GTC ATC GCT GAT CTT GGA GGC TGC CCG CCG CAC ATG TTT
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
TAT AAA AGC GCT GCT GAA AAA TAT AAC CTG GTC AGC TTT ATT CCA AGA CCT TTT GCA ATT
41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
ACA GCC TCC CAT GCA GCA TTG ATT GAA AAA TAC TCG GTC GCG GTC ATA AAA GAT AAA GAC
61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80
TAT TTT AAG AGT TTA GCT GAT TTT GAA CAC CCT GAT TCC ATT TAT TGG GCG CAT GAA GAT
81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100
CAT AAC AAG CCT GAG GAA GAG GTC GTC GAG CAA ATC GTC AAG GTT GCC GAA ATG TTT GGG
101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120
GCG GAT GCC ATC ACA ACA AAC AAT GAA TTA TTC ATT GCT CCG ATG GCG AAA GCC TGT GAA
121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140
CGT CTG GGC TTG AGA GGT GCC GGC GTG CAG GCA GCC GAA AAT GCC AGA GAT AAA AAT AAA
141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160
ATG AGG GAC GCT TTT AAT AAG GCC GGA GTC AAA TCG ATC AAA AAC AAA CGA GTC ACA ACT
161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180
CTT GAA GAT TTC CGT GCT GCT CTT GAA GAG ATC GGC ACA CCT CTT ATC TTA AAG CCT ACA
181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200
TAC TTA GCG AGT TCT ATC GGT GTA ACG CTG ATT ACG GAC ACT GAG ACG GCA GAA GAT GAA
201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220
TTT AAC AGA GTC AAT GAC TAT CTG AAA TCA ATT AAC GTG CCA AAG GCG GTT ACG TTT GAA
221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240
GCG CCG TTT ATC GCT GAA GAA TTT TTA CAG GGT GAG TAC GGA GAC TGG TAT CAA ACA GAA
241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260
GGG TAC TCC GAC TAT ATC AGT ATA GAA GGC ATC ATG GCT GAC GGT GAG TAT TTC CCG ATC
261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280
GCC ATT CAT GAT AAA ACG CCG CAA ATC GGG TTT ACA GAG ACA TCC CAC ATT ACG CCG TCC
281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300
ATT CTG GAT GAA GAG GCA AAA AAG AAA ATT GTC GAA GCT GCC AAA AAG GCA AAT GAA GGG
301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320
CTT GGA CTG CAA AAT TGC GCA ACA CAT ACA GAG ATC AAG CTA ATG AAA AAC AGA GAA CCG
321 322 323 324 325 326 327 328 329 310 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340
GGT TTA ATA GAG TCG GCA GCC AGA TTT GCC GGC TGG AAT ATG ATC CCC AAT ATT AAA AAG
341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360
GTC TTT GGC CTT GAT ATG GCG CAA TTA TTA TTA GAT GTC CTC TGT TTC GGA AAA GAC GCC
361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377 378 379 380
GAT CTG CCG GAC GGA TTA TTG GAT CAA GAG CCT TAT TAT GTT GCC GAC TGC CAT TTG TAC
381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400
CCG CAG CAT TTC AAA CAA AAT GGC CAA ATT CCT GAA ACT GCT GAG GAT TTG GTC ATT GAA
401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420
GCG ATC GAT ATT CCG GAC GGG CTT TTA AAA GGG GAT ACT GAA ATC GTT TCT TTT TCG GCC
421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440
GCA GCA CCA GGC ACT TCA GTT GAT TTG ACA TTG TTT GAA GCT TTC AAT TCC ATT GCT GCA
441 442 443 444 445 446 447 448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460
TTT GAA CTG AAA GGC AGT AAT TCA CAG GAT GTG GCT GAA TCA ATC AGA CAA ATT CAG CAG
461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471 472 END
CAT GCG AAG CTG ACG GCA AAG TAT GTG CTG CCA GTA TGA
配列番号2：野生型YwfEのアミノ酸配列
1 MERKTVLVIA DLGGCPPHMF YKSAAEKYNL VSFIPRPFAI TASHAALIEK 50
51 YSVAVIKDKD YFKSLADFEH PDSIYWAHED HNKPEEEVVE QIVKVAEMFG 100
101 ADAITTNNEL FIAPMAKACE RLGLRGAGVQ AAENARDKNK MRDAFNKAGV 150
151 KSIKNKRVTT LEDFRAALEE IGTPLILKPT YLASSIGVTL ITDTETAEDE 200
201 FNRVNDYLKS INVPKAVTFE APFIAEEFLQ GEYGDWYQTE GYSDYISIEG 250
251 IMADGEYFPI AIHDKTPQIG FTETSHITPS ILDEEAKKKI VEAAKKANEG 300
301 LGLQNCATHT EIKLMKNREP GLIESAARFA GWNMIPNIKK VFGLDMAQLL 350
351 LDVLCFGKDA DLPDGLLDQE PYYVADCHLY PQHFKQNGQI PETAEDLVIE 400
401 AIDIPDGLLK GDTEIVSFSA AAPGTSVDLT LFEAFNSIAA FELKGSNSQD 450
451 VAESIRQIQQ HAKLTAKYVL PV 472
SEQ ID NO: 2: Amino acid sequence of wild type YwfE
1 MERKTVLVIA DLGGCPPHMF
51 YSVAVIKDKD YFKSLADFEH
101 ADAITTNNEL FIAPMAKACE RLGLRGAGVQ AAENARDKNK MRDAFNKAGV 150
151 KSIKNKRVTT LEDFRAALEE IGTPLILKPT YLASSIGVTL ITDTETAEDE 200
201 FNRVNDYLKS INVPKAVTFE APFIAEEFLQ GEYGDWYQTE GYSDYISIEG 250
251 IMADGEYFPI AIHDKTPQIG FTETSHITPS ILDEEAKKKI VEAAKKANEG 300
301 LGLQNCATHT EIKLMKNREP GLIESAARFA GWNMIPNIKK VFGLDMAQLL 350
351 LDVLCFGKDA DLPDGLLDQE PYYVADCHLY PQHFKQNGQI PETAEDLVIE 400
401 AIDIPDGLLK GDTEIVSFSA AAPGTSVDLT LFEAFNSIAA FELKGSNSQD 450
451 VAESIRQIQQ HAKLTAKYVL PV 472
配列番号3：YwfEのN108A変異導入したアミノ酸配列
1 MERKTVLVIA DLGGCPPHMF YKSAAEKYNL VSFIPRPFAI TASHAALIEK 50
51 YSVAVIKDKD YFKSLADFEH PDSIYWAHED HNKPEEEVVE QIVKVAEMFG 100
101 ADAITTNAEL FIAPMAKACE RLGLRGAGVQ AAENARDKNK MRDAFNKAGV 150
151 KSIKNKRVTT LEDFRAALEE IGTPLILKPT YLASSIGVTL ITDTETAEDE 200
201 FNRVNDYLKS INVPKAVTFE APFIAEEFLQ GEYGDWYQTE GYSDYISIEG 250
251 IMADGEYFPI AIHDKTPQIG FTETSHITPS ILDEEAKKKI VEAAKKANEG 300
301 LGLQNCATHT EIKLMKNREP GLIESAARFA GWNMIPNIKK VFGLDMAQLL 350
351 LDVLCFGKDA DLPDGLLDQE PYYVADCHLY PQHFKQNGQI PETAEDLVIE 400
401 AIDIPDGLLK GDTEIVSFSA AAPGTSVDLT LFEAFNSIAA FELKGSNSQD 450
451 VAESIRQIQQ HAKLTAKYVL PVLEHHHHHH 480
SEQ ID NO: 3: YwfE N108A mutation-introduced amino acid sequence
1 MERKTVLVIA DLGGCPPHMF
51 YSVAVIKDKD YFKSLADFEH
101 ADAITTNAEL FIAPMAKACE RLGLRGAGVQ AAENARDKNK MRDAFNKAGV 150
151 KSIKNKRVTT LEDFRAALEE IGTPLILKPT YLASSIGVTL ITDTETAEDE 200
201 FNRVNDYLKS INVPKAVTFE APFIAEEFLQ GEYGDWYQTE GYSDYISIEG 250
251 IMADGEYFPI AIHDKTPQIG FTETSHITPS ILDEEAKKKI VEAAKKANEG 300
301 LGLQNCATHT EIKLMKNREP GLIESAARFA GWNMIPNIKK VFGLDMAQLL 350
351 LDVLCFGKDA DLPDGLLDQE PYYVADCHLY PQHFKQNGQI PETAEDLVIE 400
401 AIDIPDGLLK GDTEIVSFSA AAPGTSVDLT LFEAFNSIAA FELKGSNSQD 450
451 VAESIRQIQQ HAKLTAKYVL PVLEHHHHHH 480
配列番号4：HpaBアミノ酸配列
1 MKPEDFRASA TRPFTGEEYL ASLRDDREIY IYGDRVKDVT SHPAFRNAAA 50
51 SMARLYDALH DPQSKEKLCW ETDTGNGGYT HKFFRYARSA DELRQQRDAI 100
101 AEWSRLTYGW MGRTPDYKAA FGSALGANPG FYGRFEDNAK TWYKRIQEAC 150
151 LYLNHAIVNP PIDRDKPVDQ VKDVFISVDE EVDGGIVVSG AKVVATNSAL 200
201 THYNFVGQGS AQLLGDNTDF ALMFIAPMNT PGMKLICRPS YELVAGIAGS 250
251 PFDYPLSSRF DENDAILVMD KVFIPWENVL IYRDFERCKQ WFPQGGFGRL 300
301 FPMQGCTRLA VKLDFITGAL YKALQCTGSL EFRGVQAQVG EVVAWRNLFW 350
351 SLTDAMYGNA SEWHGGAFLP SAEALQAYRV LAPQAYPEIK KTIEQVVASG 400
401 LIYLPSGVRD LHNPQLDKYL STYCRGSGGM GHRERIKILK LLWDAIGSEF 450
451 GGRHELYEIN YAGSQDEIRM QALRQAIGSG AMKGMLGMVE QCMGDYDENG 500
501 WTVPHLHNPD DINVLDRIRQ 520
SEQ ID NO: 4: HpaB amino acid sequence
1 MKPEDFRASA TRPFTGEEYL
51 SMARLYDALH DPQSKEKLCW
101 AEWSRLTYGW MGRTPDYKAA FGSALGANPG FYGRFEDNAK TWYKRIQEAC 150
151 LYLNHAIVNP PIDRDKPVDQ VKDVFISVDE EVDGGIVVSG AKVVATNSAL 200
201 THYNFVGQGS AQLLGDNTDF ALMFIAPMNT PGMKLICRPS YELVAGIAGS 250
251 PFDYPLSSRF DENDAILVMD KVFIPWENVL IYRDFERCKQ WFPQGGFGRL 300
301 FPMQGCTRLA VKLDFITGAL YKALQCTGSL EFRGVQAQVG EVVAWRNLFW 350
351 SLTDAMYGNA SEWHGGAFLP SAEALQAYRV LAPQAYPEIK KTIEQVVASG 400
401 LIYLPSGVRD LHNPQLDKYL STYCRGSGGM GHRERIKILK LLWDAIGSEF 450
451 GGRHELYEIN YAGSQDEIRM QALRQAIGSG AMKGMLGMVE QCMGDYDENG 500
501 WTVPHLHNPD DINVLDRIRQ 520
配列番号5：HpaB
atgaaacccg aagatttccg tgcctctgcc acccgtccgt tcaccggcga ggagtacctc gccagcctgc
gcgacgaccg tgagatctac atctacggcg accgcgtcaa ggacgtcacc agccaccccg ccttccgcaa
cgcggccgcc tccatggccc ggctctacga cgccctgcac gatccgcaga gcaaggaaaa gctctgctgg
gagaccgata ccggcaacgg cggctatacc cacaagttct tccgctacgc gcgcagcgcc gacgaactgc
gccagcagcg cgacgccatc gccgagtggt cgcggctgac ctacggctgg atgggccgca ccccggacta
caaggccgcc ttcggcagcg ccctcggcgc caacccgggc ttctacgggc gtttcgagga caacgcgaaa
acctggtaca agcgcatcca ggaagcctgc ctgtacctca accatgccat cgtcaacccg ccgatcgacc
gcgacaagcc ggtggaccag gtcaaggacg tgttcatctc ggtggacgag gaagtcgacg gcggcatcgt
cgtcagcggc gccaaggtgg tcgccacgaa ttccgcgctg acccactaca acttcgtcgg ccagggttcg
gcgcaactgc tcggcgacaa caccgacttc gccctgatgt tcatcgcgcc gatgaacacc cccggcatga
agctgatctg ccgcccctcc tacgaactgg tggcgggtat cgccggatcg ccgttcgact acccgctgtc
cagccgtttc gacgagaacg acgcgatcct ggtgatggac aaggtgttca tcccctggga gaacgtactg
atctaccgcg acttcgagcg ctgcaagcag tggttccccc agggtggctt cggccggctg ttcccgatgc
agggctgcac ccgcctggcg gtcaagctcg acttcatcac cggcgccctc tacaaggccc tgcaatgcac
cggctccctg gagttccgcg gcgtgcaggc gcaggtcggc gaagtggtgg cctggcgcaa cctgttctgg
tcgctgaccg acgccatgta cggcaacgcc agcgaatggc acggcggcgc cttcctgccc agcgccgagg
ccctgcaggc ctaccgcgtg ctggcgccgc aggcctaccc ggagatcaag aagaccatcg agcaggtggt
cgccagcggc ctgatctacc tgccctccgg cgttcgcgac ctgcacaatc cgcaactcga caagtatctc
Tccacctatt gccgcggctc cggcggcatg ggccaccggg agcggatcaa gatcctcaag ctgctctggg
acgccatcgg cagcgagttc ggcggccgcc acgagctgta cgagatcaac tacgccggca gccaggacga
gatccgcatg caggccctgc gccaggcgat cggcagcggg gcgatgaagg gcatgctcgg catggtcgag
cagtgcatgg gcgactacga cgagaacggc tggaccgtgc cgcacctgca caacccggac gacatcaacg
tgctcgatcg catccgccaa tga
Sequence number 5: HpaB
atgaaacccg aagatttccg tgcctctgcc acccgtccgt tcaccggcga ggagtacctc gccagcctgc
gcgacgaccg tgagatctac atctacggcg accgcgtcaa ggacgtcacc agccacccg ccttccgcaa
cgcggccgcc tccatggccc ggctctacga cgccctgcac gatccgcaga gcaaggaaaa gctctgctgg
gagaccgata ccggcaacgg cggctatacc cacaagttct tccgctacgc gcgcagcgcc gacgaactgc
gccagcagcg cgacgccatc gccgagtggt cgcggctgac ctacggctgg atgggccgca ccccggacta
caaggccgcc ttcggcagcg ccctcggcgc caacccggggc ttctacgggc gtttcgagga caacgcgaaa
acctggtaca agcgcatcca ggaagcctgc ctgtacctca accatgccat cgtcaacccg ccgatcgacc
gcgacaagcc ggtggaccag gtcaaggacg tgttcatctc ggtggacgag gaagtcgacg gcggcatcgt
cgtcagcggc gccaaggtgg tcgccacgaa ttccgcgctg acccactaca acttcgtcgg ccagggttcg
gcgcaactgc tcggcgacaa caccgacttc gccctgatgt tcatcgcgcc gatgaacacc cccggcatga
agctgatctg ccgcccctcc tacgaactgg tggcgggtat cgccggatcg ccgttcgact acccgctgtc
cagccgtttc gacgagaacg acgcgatcct ggtgatggac aaggtgttca tcccctggga gaacgtactg
atctaccgcg acttcgagcg ctgcaagcag tggttccccc agggtggctt cggccggctg ttcccgatgc
agggctgcac ccgcctggcg gtcaagctcg acttcatcac cggcgccctc tacaaggccc tgcaatgcac
cggctccctg gagttccgcg gcgtgcaggc gcaggtcggc gaagtggtgg cctggcgcaa cctgttctgg
tcgctgaccg acgccatgta cggcaacgcc agcgaatggc acggcggcgc cttcctgccc agcgccgagg
ccctgcaggc ctaccgcgtg ctggcgccgc aggcctaccc ggagatcaag aagaccatcg agcaggtggt
cgccagcggc ctgatctacc tgccctccgg cgttcgcgac ctgcacaatc cgcaactcga caagtatctc
Tccacctatt gccgcggctc cggcggcatg ggccaccggg agcggatcaa gatcctcaag ctgctctggg
acgccatcgg cagcgagttc ggcggccgcc acgagctgta cgagatcaac tacgccggca gccaggacga
gatccgcatg caggccctgc gccaggcgat cggcagcggg gcgatgaagg gcatgctcgg catggtcgag
cagtgcatgg gcgactacga cgagaacggc tggaccgtgc cgcacctgca caacccggac gacatcaacg
tgctcgatcg catccgccaa tga
配列番号6：HpaBプライマー（forward）
forward ： 5' -ttctcatgaaacccgaagatttccgtgcct-3’
SEQ ID NO: 6: HpaB primer (forward)
forward: 5'-ttctcatgaaacccgaagatttccgtgcct-3'
配列番号7：HpaBプライマー（reverse）
reverse ：5’-cgcggatcctcattggcggatgcgatcgag-3’
SEQ ID NO: 7: HpaB primer (reverse)
reverse: 5'-cgcggatcctcattggcggatgcgatcgag-3'
配列番号8：HpaCアミノ酸配列
1 MSQLEPRQQA FRNAMAHLSA AVNVITSNGP AGRCGITATA VCSVTDSPPT 50
51 LMLCINRNSE MNTVFKANGR LCVNVLSGEH EEVARHFAGM TEVPMERRFA 100
101 LHDWREGLAG LPVLHGALAN LQGRIAEVQE IGTHSVLLLE LEDIQVLEQG 150
151 DGLVYFSRSF HRLQCPRRAA 170
SEQ ID NO: 8: HpaC amino acid sequence
1 MSQLEPRQQA FRNAMAHLSA
51 LMLCINRNSE MNTVFKANGR
101 LHDWREGLAG LPVLHGALAN LQGRIAEVQE IGTHSVLLLE LEDIQVLEQG 150
151 DGLVYFSRSF HRLQCPRRAA 170
配列番号9：HpaC
1 atgtcccagc tcgaacccag gcagcaagcc ttccgcaacg ccatggcgca tctttcggcg
61 gcggtcaacg tgatcaccag caacggcccg gccggacgct gcgggatcac cgccaccgcg
121 gtctgctcgg tcaccgacag cccgccgacg ctgatgctct gcatcaaccg caacagcgag
181 atgaacacgg tgttcaaggc caacggtcga ctctgcgtga acgtcctcag cggcgaacat
241 gaagaggtgg cccgccactt cgccggcatg accgaggtcc cgatggaacg ccgcttcgcc
301 ctccacgact ggcgcgaggg cctcgccggg ttgccggtgc tgcacggcgc cctggccaac
361 ctgcagggac gcatcgccga ggtccaggag atcggcaccc actcggtgct gttgctggaa
421 ctggaggaca tccaggtcct cgaacagggc gacggcctgg tctacttcag ccgcagcttc
481 catcgcctgc aatgcccccg gcgggcggcc tga
Sequence number 9: HpaC
1 atgtcccagc tcgaacccag gcagcaagcc ttccgcaacg ccatggcgca tctttcggcg
61 gcggtcaacg tgatcaccag caacggcccg gccggacgct gcgggatcac cgccaccgcg
121 gtctgctcgg tcaccgacag cccgccgacg ctgatgctct gcatcaaccg caacagcgag
181 atgaacacgg tgttcaaggc caacggtcga ctctgcgtga acgtcctcag cggcgaacat
241 gaagaggtgg cccgccactt cgccggcatg accgaggtcc cgatggaacg ccgcttcgcc
301 ctccacgact ggcgcgaggg cctcgccggg ttgccggtgc tgcacggcgc cctggccaac
361 ctgcagggac gcatcgccga ggtccaggag atcggcaccc actcggtgct gttgctggaa
421 ctggaggaca tccaggtcct cgaacagggc gacggcctgg tctacttcag ccgcagcttc
481 catcgcctgc aatgccccccg gcgggcggcc tga
配列番号10：HpaCプライマー（forward）
forward ：5′-ttccatatgtcccagctcgaacccaggcag-3′
SEQ ID NO: 10: HpaC primer (forward)
forward: 5′-ttccatatgtcccagctcgaacccaggcag-3′
配列番号11：HpaCプライマー（reverse）
reverse ： 5′-ttcggtacctcaggccgcccgccgggggca-3′
SEQ ID NO: 11: HpaC primer (reverse)
reverse: 5′-ttcggtacctcaggccgcccgccgggggca-3′
本発明に依り、効率的に、L-ドパ（L-DOPA）をβ-Alaと結合させて、β-Ala-DOPAを合成する事が出来る。本発明に依り合成されるβ-Ala-DOPAは、人の体内での安定性が向上する（体内での分解が抑制される）と考えられ、本発明に依り、ペプチド本体またはその代謝物が脳機能改善に寄与する可能性を有したβ-Ala-DOPAを、効率良く合成する事を期待出来る。 According to the present invention, β-Ala-DOPA can be synthesized by efficiently combining L-DOPA with β-Ala. β-Ala-DOPA synthesized according to the present invention is thought to have improved stability in the human body (decomposition within the body is suppressed), and according to the present invention, the peptide itself or its metabolites are It is expected that β-Ala-DOPA, which has the potential to contribute to improving brain function, can be efficiently synthesized.
本発明に依り、安定的に、β-Ala-DOPAを供給する事が出来る。本発明に依り合成されるβ-Ala-DOPAを、少量の使用で、長期間の効果を有するDOPA誘導体として、医薬品としての使用する事に期待が出来る。 According to the present invention, β-Ala-DOPA can be stably supplied. β-Ala-DOPA synthesized according to the present invention can be expected to be used as a drug as a DOPA derivative that has long-term effects even when used in small amounts.
Claims (10)
L-アミノ酸α-リガーゼ活性に依り、
（1）基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、β-Ala-DOPAの製造方法。 A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
Depending on L-amino acid α-ligase activity,
(1) A method for producing β-Ala-DOPA, which includes a step of synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-dopa (L-DOPA) as substrates.
L-アミノ酸α-リガーゼ活性を発現する微生物株を用いて、
（1）基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、請求項1に記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。 A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
Using a microbial strain expressing L-amino acid α-ligase activity,
(1) β-Ala-DOPA according to claim 1, comprising the step of synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-DOPA as substrates. manufacturing method.
L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を用いて、
（1）アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-ドパ（L-DOPA）とから、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、請求項1に記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。 A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
Using a protein with L-amino acid α-ligase activity,
(1) A step of synthesizing β-Ala-DOPA from β-alanine (β-Ala) and L-DOPA as substrates in the presence of adenosine triphosphate (ATP), The method for producing β-Ala-DOPA according to claim 1.
（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性に依り、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、及び
（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性に依り、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、β-Ala-DOPAの製造方法。 A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
(1) A step of synthesizing β-Ala-Tyr from β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) as substrates by L-amino acid α-ligase activity, and (2) Production of β-Ala-DOPA, which includes a step of hydroxylating β-Ala-Tyr obtained in the step (1) using a two-component flavin-dependent monooxygenase activity to synthesize β-Ala-DOPA. Method.
（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性を発現する微生物株を用いて、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、及び
（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を発現する微生物株を用いて、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、請求項6に記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。 A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
(1) Synthesize β-Ala-Tyr from β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) as substrates using a microbial strain that expresses L-amino acid α-ligase activity. (2) Using a microbial strain expressing two-component flavin-dependent monooxygenase activity, β-Ala-Tyr obtained in step (1) is hydroxylated to synthesize β-Ala-DOPA. 7. The method for producing β-Ala-DOPA according to claim 6, comprising the step of:
（1）L-アミノ酸α-リガーゼ活性を有するタンパク質を用いて、アデノシン三リン酸（ATP）の存在下、基質として、β-アラニン（β-Ala）とL-チロシン（L-Tyr）とから、β-Ala-Tyrを合成する工程、及び
（2）二成分型フラビン依存性モノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を用いて、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）の存在下、前記工程（1）で得られるβ-Ala-Tyrを、水酸化し、β-Ala-DOPAを合成する工程
を含む、請求項6に記載のβ-Ala-DOPAの製造方法。 A method for producing β-Ala-DOPA, comprising:
(1) Using a protein with L-amino acid α-ligase activity, β-alanine (β-Ala) and L-tyrosine (L-Tyr) are used as substrates in the presence of adenosine triphosphate (ATP). , a step of synthesizing β-Ala-Tyr, and (2) the step (1) using a protein having two-component flavin-dependent monooxygenase activity in the presence of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH). 7. The method for producing β-Ala-DOPA according to claim 6, comprising the step of hydroxylating β-Ala-Tyr obtained in the above step to synthesize β-Ala-DOPA.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022032913A JP2023128529A (en) | 2022-03-03 | 2022-03-03 | METHOD FOR PRODUCING β-Ala-DOPA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022032913A JP2023128529A (en) | 2022-03-03 | 2022-03-03 | METHOD FOR PRODUCING β-Ala-DOPA |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023128529A true JP2023128529A (en) | 2023-09-14 |
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ID=87972389
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|---|---|---|---|
| JP2022032913A Pending JP2023128529A (en) | 2022-03-03 | 2022-03-03 | METHOD FOR PRODUCING β-Ala-DOPA |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2023128529A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117659116A (en) * | 2023-12-05 | 2024-03-08 | 珠海瑞德林生物有限公司 | Preparation method of tyrosine oligopeptide |
| CN117659116B (en) * | 2023-12-05 | 2024-05-10 | 珠海瑞德林生物有限公司 | Preparation method of tyrosine oligopeptide |
-
2022
- 2022-03-03 JP JP2022032913A patent/JP2023128529A/en active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117659116A (en) * | 2023-12-05 | 2024-03-08 | 珠海瑞德林生物有限公司 | Preparation method of tyrosine oligopeptide |
| CN117659116B (en) * | 2023-12-05 | 2024-05-10 | 珠海瑞德林生物有限公司 | Preparation method of tyrosine oligopeptide |
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