JP2023115041A - Microwell array and micro fluid device - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体分子の分析方法に関する。 The present invention relates to a method for analyzing biomolecules.
近年、半導体回路の製造技術に用いられているエッチング技術やフォトリソグラフィ技術等を用いて形成された、種々の形態の微細な流路構造を有するマイクロウェルアレイが検討されている。
これらのマイクロウェルアレイのウェルは、微小体積の流体中で種々の生化学的又は化学的反応をさせるための化学反応容器として用いられている。
2. Description of the Related Art In recent years, microwell arrays having various forms of fine channel structures formed using etching technology, photolithography technology, or the like used in semiconductor circuit manufacturing technology have been studied.
The wells of these microwell arrays are used as chemical reaction vessels for various biochemical or chemical reactions in microvolume fluids.
マイクロ流体システムの製作のための材料としては、シリコン、ガラス等の硬質の物質、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の種々の高分子樹脂やシリコーンゴム等の軟質の物質等が用いられている。
例えば、特許文献１～３には、このようなマイクロ流体システムを、種々のマイクロチップ、バイオチップとして用いることが記載されている。
Hard materials such as silicon and glass, various polymer resins such as PDMS (polydimethylsiloxane), and soft materials such as silicone rubber are used as materials for fabricating microfluidic systems.
For example,
ところで、近年、微少量の容積を有する微小空間内で酵素反応をおこなうことにより生体物質の検査をおこなう技術が注目されている。
例えば、核酸の検出及び定量における新しいアプローチの一つとして、デジタルＰＣＲ技術が挙げられる。
デジタルＰＣＲ技術とは、試薬と核酸との混合物を無数の微小液滴に分割してＰＣＲ増幅をおこない、核酸を含んだ液滴からは蛍光等のシグナルが検出されるようにしておき、シグナルが検出された液滴を数えることにより定量をおこなう技術である。
By the way, in recent years, attention has been paid to a technique of inspecting a biological substance by performing an enzymatic reaction in a minute space having a very small volume.
For example, one new approach in nucleic acid detection and quantification is digital PCR technology.
Digital PCR technology divides a mixture of reagents and nucleic acids into countless microdroplets to perform PCR amplification, and allows signals such as fluorescence to be detected from droplets containing nucleic acids. It is a technique for quantitative determination by counting the detected droplets.
微小液滴の作製方法として、封止液で分断化することにより微小液滴を作製する方法や、基板上に形成した孔に試薬を入れ、続いて封止液を入れることにより微小液滴を作製する方法（例えば特許文献３を参照。）等が検討されている。 As a method for producing microdroplets, there is a method in which microdroplets are produced by fragmentation with a sealing liquid, and a method in which a reagent is put into a hole formed on a substrate and then a sealing liquid is put in to form microdroplets. A manufacturing method (see, for example, Patent Document 3) and the like are being studied.
しかしながら、従来のマイクロウェルアレイは、水性液体であるＰＣＲ反応液等の試料をウェル内に封入することが困難な場合がある。 However, in conventional microwell arrays, it may be difficult to enclose a sample such as a PCR reaction solution, which is an aqueous liquid, in wells.
そこで、本発明は、ウェル内に水性液体を封入することが容易な生体分子の分析方法を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for analyzing biomolecules in which it is easy to enclose an aqueous liquid in a well.
本発明は、複数のウェルを備え、前記ウェルの開口部の平面積Ｓ２（１０－１２ｍ２）が、ウェル底面積Ｓ１（１０－１２ｍ２）の２．２倍以下であるマイクロウェルアレイ中のウェルに、生体分子を含む水性液体を封入し、ウェル内で酵素反応を行う、生体分子の分析方法である。 The present invention is a microwell array comprising a plurality of wells, wherein the well opening plane area S2 (10 −12 m 2 ) is 2.2 times or less the well bottom area S1 (10 −12 m 2 ). This is a method for analyzing biomolecules, in which an aqueous liquid containing biomolecules is sealed in the inner wells, and an enzymatic reaction is performed in the wells.
本発明によれば、簡便に生体分子を分析することができる。 According to the present invention, biomolecules can be easily analyzed.
以下、本発明に係るマイクロウェルアレイ、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及びマイクロウェルアレイの製造方法の第１実施形態を、図面に基づいて説明する。
図１は、本実施形態におけるマイクロ流体デバイスを示す斜視図（ａ）、および（ａ）におけるｂ－ｂ線断面図（ｂ）であり、図２は、本実施形態におけるマイクロウェルアレイを示す断面図（ａ）、斜視図（ｂ）であり、図３は、本実施形態におけるマイクロウェルアレイの製造方法を示す断面図である。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION A first embodiment of a microwell array, a microfluidic device, a method for enclosing an aqueous liquid in wells of a microwell array, and a method for manufacturing a microwell array according to the present invention will be described below with reference to the drawings.
FIG. 1 is a perspective view (a) showing a microfluidic device according to the present embodiment, and a cross-sectional view (b) along the line bb in (a), and FIG. 2 is a cross-sectional view showing a microwell array according to the present embodiment. 3A and 3B are cross-sectional views showing a method for manufacturing a microwell array according to the present embodiment. Note that the dimensional ratios in each drawing are exaggerated for the sake of explanation, and do not necessarily match the actual dimensional ratios.
［マイクロウェルアレイ］
本実施形態において、本発明は、ウェル表面に親水性部分及び疎水性部分を有する複数のウェルを備える、マイクロウェルアレイを提供する。
後述するように、本実施形態のマイクロウェルアレイは、ウェル内に水性液体を封入することが非常に容易である。
[Microwell array]
In this embodiment, the invention provides a microwell array comprising a plurality of wells having hydrophilic and hydrophobic moieties on the well surface.
As will be described later, the microwell array of this embodiment makes it very easy to enclose an aqueous liquid in the wells.
ここで、封入するとは、マイクロウェルアレイを構成するウェルに水性液体を導入し、さらに、各ウェルに導入された液体同士が互いに混合しない状態に隔離することを意味する。
隔離する方法としては、例えば、ウェルに水性液体を導入した後、ウェルの上部にオイル層を形成すること等が挙げられる。
本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、マイクロウェルアレイを構成するウェルの９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上、例えば１００％に水性液体を容易に封入することができる。
Here, enclosing means introducing an aqueous liquid into the wells constituting the microwell array and isolating the liquids introduced into the wells so that they do not mix with each other.
Methods for isolation include, for example, introducing an aqueous liquid into the well and then forming an oil layer on the top of the well.
According to the microwell array of the present embodiment, 90% or more, such as 95% or more, such as 99% or more, such as 100% of the wells constituting the microwell array can be easily sealed with an aqueous liquid.
本実施形態のマイクロウェルアレイは、ウェル１つあたりの容量が、例えば１フェムトリットル（ｆＬ）～６ナノリットル（ｎＬ）であり、好ましくは１ｆＬ～５ピコリットル（ｐＬ）であり、さらに好ましくは１ｆＬ～３００ｆＬである。
ウェル１つあたりの容量がこのような範囲であると、デジタルＰＣＲやインベーダー反応等の微小空間内でおこなう酵素反応を好適におこなうことができる。
デジタルＰＣＲにより、例えば遺伝子の変異検出等をおこなうことができる。
The microwell array of this embodiment has a volume per well of, for example, 1 femtoliter (fL) to 6 nanoliters (nL), preferably 1 fL to 5 picoliters (pL), more preferably 1 fL to 300 fL.
When the volume per well is in this range, enzyme reactions such as digital PCR and invader reactions, which are performed in microspaces, can be performed favorably.
For example, mutation detection of genes can be performed by digital PCR.
本実施形態のマイクロウェルアレイは、例えば遺伝子の変異検出に封入した水性液体の温度を変化させた場合も、ウェル内に前記液体を保持することができる。
変化させる温度の範囲は、例えば０℃～１００℃であり、好ましくは０℃～８０℃であり、さらに好ましくは２０℃～７０℃である。
ウェルに封入した水性溶液がこのような範囲であると、デジタルＰＣＲやインベーダー反応等の微小空間内でおこなう酵素反応を好適におこなうことができる。
The microwell array of the present embodiment can retain the liquid in the wells even when the temperature of the enclosed aqueous liquid is changed, for example, for gene mutation detection.
The range of temperature to be changed is, for example, 0°C to 100°C, preferably 0°C to 80°C, more preferably 20°C to 70°C.
When the aqueous solution enclosed in the well is in such a range, enzyme reactions such as digital PCR and invader reaction that are performed in microspaces can be performed favorably.
マイクロウェルアレイを用いた解析に酵素反応を利用する場合には、マイクロウェルアレイの材質が酵素反応を阻害しないものであることが好ましい。
あるいは、マイクロウェルアレイの材質（材料）表面に、酵素反応を阻害しない物質をコーティングすることも可能である。
When an enzymatic reaction is used for analysis using a microwell array, it is preferable that the material of the microwell array does not inhibit the enzymatic reaction.
Alternatively, it is possible to coat the surface of the material (material) of the microwell array with a substance that does not inhibit the enzymatic reaction.
マイクロウェルアレイのウェルの形状や大きさに特に制限はないが、例えば、微小液滴中で種々の生化学的な反応をおこなう場合には、１個～数個の生体分子又は担体を収容可能な形状と大きさを有していることが好ましい。
担体は例えばビーズであってもよく、担体には試料である生体分子が結合されていてもよい。
The shape and size of the wells of the microwell array are not particularly limited, but for example, when performing various biochemical reactions in microdroplets, one to several biomolecules or carriers can be accommodated. It is preferable to have a suitable shape and size.
The carrier may be, for example, a bead, and the carrier may be bound to a biomolecule as a sample.
ウェルの形状は、例えば、円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であってもよく、これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であってもよい。 The shape of the well may be, for example, a cylinder, a polyhedron composed of a plurality of faces (eg, a rectangular parallelepiped, a hexagonal prism, an octagonal prism, etc.), an inverted cone, an inverted pyramid (an inverted triangular pyramid, an inverted quadrangular pyramid, an inverted A pentagonal pyramid, an inverted hexagonal pyramid, an inverted polygonal pyramid with seven or more angles, etc., or a combination of two or more of these shapes.
例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であってもよい。
また、逆円錐形、逆角錐形の場合、円錐や角錐の底面がウェルの入り口（開口部）となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状であってもよい。
この場合、マイクロウェルの底部は平坦になる。
For example, one portion may be cylindrical and the rest may be inverted conical.
In the case of an inverted conical shape or an inverted pyramidal shape, the bottom of the cone or pyramid becomes the entrance (opening) of the well, but it may be a shape obtained by cutting a part from the top of the inverted conical shape or inverted pyramidal shape. .
In this case, the bottom of the microwell will be flat.
ウェルの形状が円筒形、直方体である場合、マイクロウェルの底部は通常、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）としてもよい。
マイクロウェルの底部を曲面とすることができるのは、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も同様である。
When the shape of the well is cylindrical or cuboid, the bottom of the microwell is usually flat, but may be curved (convex or concave).
The bottom of the microwell can be curved, as is the case with an inverted cone shape or an inverted pyramid shape with a part cut off from the top.
ウェルの形状が例えば円錐台である場合、図２に示すように、その容積Ｖ（１０－１８ｍ３）とすると、例えばウェルの底面積Ｓ１（１０－１２ｍ２）がＶの１倍以上４．５倍以下であり、好ましくは２倍以上４．３倍以下であり、さらに好ましくは３倍以上４．２倍以下である。
ウェル１つあたりの容積に対し、ウェルの底面積がこのような範囲であると、本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、マイクロウェルアレイを構成するウェルの９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上、例えば１００％に水性液体を容易に封入することができる。
後述するように、発明者らは、このような構成とすることにより、マイクロウェルアレイのウェルに水性液体を封入させることが非常に容易になることを見出した。
If the shape of the well is, for example, a truncated cone, and its volume is V (10 −18 m 3 ) as shown in FIG. It is 4.5 times or less, preferably 2 times or more and 4.3 times or less, and more preferably 3 times or more and 4.2 times or less.
According to the microwell array of the present embodiment, when the bottom area of the wells is in such a range with respect to the volume per well, 90% or more, for example, 95% or more of the wells constituting the microwell array, For example, 99% or more, such as 100%, can be easily encapsulated with an aqueous liquid.
As will be described later, the inventors have found that such a configuration makes it very easy to enclose an aqueous liquid in the wells of the microwell array.
ウェルの形状は例えばウェルの平面積を制御することでも可能である。
例えば、図２に示すように、ウェルの開口部の平面積Ｓ２（１０－１２ｍ２）が、ウェルの底面積Ｓ１の０．５倍以上２．２倍以下であり、好ましくは１倍以上２倍以下であり、さらに好ましくは１．１倍以上１．８倍以下である。
ウェル１つあたりの容積に対し、ウェルの底面積がこのような範囲であると、本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、水性液体を封入させることが非常に容易になる。
The well shape can also be controlled, for example, by controlling the plane area of the well.
For example, as shown in FIG. 2, the plane area S2 (10 −12 m 2 ) of the opening of the well is 0.5 times or more and 2.2 times or less, preferably 1 time or more, the bottom area S1 of the well. It is 2 times or less, more preferably 1.1 times or more and 1.8 times or less.
When the bottom area of the wells is in this range with respect to the volume per well, the microwell array of the present embodiment makes it very easy to enclose an aqueous liquid.
例えば、図２に示すように、前記ウェルの開口部の最大径Ｄ２（μｍ）が、ウェル底面の最大径Ｄ１（μｍ）の０．５倍以上１．５倍以下であり、好ましくは０．７倍以上１．４倍以下であり、さらに好ましくは１倍以上１．３倍以下である。
ウェルの開口部の最大径に対し、ウェルの底面の最大径がこのような範囲であると、本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、水性液体を封入させることが非常に容易になる。
For example, as shown in FIG. 2, the maximum diameter D2 (μm) of the opening of the well is 0.5 to 1.5 times the maximum diameter D1 (μm) of the bottom of the well, preferably 0.5 times. It is 7 times or more and 1.4 times or less, more preferably 1 time or more and 1.3 times or less.
When the maximum diameter of the bottom surface of the well is within such a range with respect to the maximum diameter of the opening of the well, it is very easy to enclose an aqueous liquid according to the microwell array of this embodiment.
例えば、図２に示すように、ウェルの底面から形成される側面の角度θが、例えば３０°以上１０３°以下であり、好ましくは６０°以上１０３°以下であり、さらに好ましくは９０°以上１０３°以下である。
また、側面角度θが、７７°以上であること、または前記ウェルの容積Ｖ（１０－１８ｍ３）の三乗根の値が３．５以上であることができる。
ウェル底面から形成される側面の角度がこのような範囲であると、本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、水性液体を封入させることが非常に容易になる。
For example, as shown in FIG. 2, the angle θ of the side surface formed from the bottom surface of the well is, for example, 30° or more and 103° or less, preferably 60° or more and 103° or less, more preferably 90° or more and 103° or less. ° or less.
Also, the side angle θ may be 77° or more, or the cube root of the well volume V (10 −18 m 3 ) may be 3.5 or more.
When the angle of the side surface formed from the bottom surface of the well is within such a range, the microwell array of this embodiment makes it very easy to enclose an aqueous liquid.
例えば、図２に示すように、ウェルの底面からの高さＨ（μｍ）が、最大径Ｄ１の０．２倍以上１０倍以下であり、好ましくは０．４倍以上５倍以下であり、さらに好ましくは０．６倍以上２倍以下である。
ウェル底面から形成される側面の角度がこのような範囲であると、本実施形態のマイクロウェルアレイによれば、水性液体を封入させることが非常に容易になる。
For example, as shown in FIG. 2, the height H (μm) from the bottom of the well is 0.2 to 10 times the maximum diameter D1, preferably 0.4 to 5 times, More preferably, it is 0.6 times or more and 2 times or less.
When the angle of the side surface formed from the bottom surface of the well is within such a range, the microwell array of this embodiment makes it very easy to enclose an aqueous liquid.
ウェルが円筒形の場合、生体分子を含む水性液体を封入する目的のためには、ウェルの最大径、高さＨは例えば１０ｎｍ～１００μｍ、好ましくは１００ｎｍ～１０μｍ、さらに好ましくは１μｍ～１０μｍであってもよい。
ウェルの寸法は、ウェルに収容する水性液体の量や、生体分子を付着させたビーズ等の担体の大きさとウェルの寸法の好適な比等を考慮して、１つのマイクロウェルに１つ、もしくは数個の生体分子が収容されるように、適宜決定する。
When the well is cylindrical, for the purpose of enclosing an aqueous liquid containing biomolecules, the maximum diameter of the well, height H, is, for example, 10 nm to 100 μm, preferably 100 nm to 10 μm, more preferably 1 μm to 10 μm. may
The dimensions of the wells are determined by taking into account the amount of aqueous liquid to be accommodated in the wells, the suitable ratio between the size of a support such as beads to which biomolecules are attached and the dimensions of the wells, and the like. It is determined appropriately so that several biomolecules are accommodated.
本実施形態のマイクロウェルアレイを使用して検出する検出対象は、例えば血液等の生体から採取した試料やＰＣＲ産物等であってもよく、人工的に合成された化合物等であってもよい。
例えば、生体分子であるＤＮＡを検出対象とする場合、ウェルは、ＤＮＡが１分子入るような形状と大きさであってもよい。
A detection target to be detected using the microwell array of the present embodiment may be, for example, a sample collected from a living body such as blood, a PCR product, or the like, or an artificially synthesized compound or the like.
For example, when DNA, which is a biomolecule, is to be detected, the well may have a shape and size that allows one molecule of DNA to enter.
本実施形態のマイクロウェルアレイは、ウェルの密度が、例えば１０万～１０００万個／ｃｍ２であり、好ましくは１０万～５００万個／ｃｍ２であり、さらに好ましくは１０万～１００万個／ｃｍ２である。
ウェルの密度がこのような範囲であると、所定数のウェルに試料である水性液体を封入させる操作が容易である。
また、実験結果を解析するためのウェルの観察も容易である。
The microwell array of this embodiment has a well density of, for example, 100,000 to 10,000,000/cm 2 , preferably 100,000 to 5,000,000/cm 2 , more preferably 100,000 to 1,000,000/cm 2 . cm2 .
When the density of the wells is within such a range, the operation of sealing the aqueous liquid sample in a predetermined number of wells is easy.
It is also easy to observe wells for analyzing experimental results.
例えば、セルフリーＤＮＡの変異を測定する場合において、検出対象の変異の野生型に対する存在割合が０．０１％程度である場合、例えば、１００万～２００万個のウェルを使用することが好適である。 For example, when measuring cell-free DNA mutations, if the abundance ratio of the mutation to be detected to the wild type is about 0.01%, it is preferable to use, for example, 1 to 2 million wells. be.
本実施形態のマイクロウェルアレイにおいて、各ウェルは、基板上に親水性材料または疎水性材料を積層して親水層または疎水層を形成する工程と、前記親水層または疎水層を掘削して複数のウェルを形成する工程から作製することができる。
ただし、本実施形態を実現できる条件であれば、マイクロウェルは基板と同一材料とされて、成型加工や切削加工によって形成されてもよい。
In the microwell array of this embodiment, each well includes a step of laminating a hydrophilic material or hydrophobic material on a substrate to form a hydrophilic layer or a hydrophobic layer; It can be produced from the step of forming wells.
However, the microwells may be made of the same material as the substrate and formed by molding or cutting, provided that the present embodiment can be realized.
（基板）
本実施形態のマイクロウェルアレイは、基板上に形成されていてもよい。
基板は、電磁波透過性を有するものであってもよく、有さないものであってもよい。ここで、電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線等が挙げられる。
マイクロウェルアレイが電磁波透過性を有する基板上に形成されていた場合には、マイクロウェルアレイ上でおこなった実験結果を解析するために、電磁波を利用することが可能になる。
例えば、電磁波を照射した結果生じる蛍光、燐光等を基板側から計測することができる。蛍光、燐光等の検出には、例えば蛍光顕微鏡等を利用することができる。
この場合、電磁波は、例えば基板側から照射してもよいし、例えばウェルの入り口側から照射してもよい。
(substrate)
The microwell array of this embodiment may be formed on a substrate.
The substrate may or may not have electromagnetic wave permeability. Here, the electromagnetic waves include X-rays, ultraviolet rays, visible rays, infrared rays, and the like.
When the microwell array is formed on a substrate having electromagnetic wave permeability, electromagnetic waves can be used to analyze the results of experiments performed on the microwell array.
For example, fluorescence, phosphorescence, or the like generated as a result of irradiation with electromagnetic waves can be measured from the substrate side. A fluorescence microscope, for example, can be used to detect fluorescence, phosphorescence, and the like.
In this case, the electromagnetic wave may be applied, for example, from the substrate side, or may be applied, for example, from the entrance side of the well.
例えば、マイクロウェルアレイにおいて、可視光領域である４００～７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を検出する場合には、少なくとも上記可視光領域の光に対して良好な透過性を有する基板を用いればよい。 For example, in a microwell array, when detecting fluorescence having a peak in the wavelength range of 400 to 700 nm, which is the visible light region, at least a substrate having good transparency to light in the visible light region is used. good.
電磁波透過性を有する基板としては、例えば、ガラス、樹脂等が挙げられる。
樹脂基板としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）等が挙げられる。
これらの樹脂は各種添加剤を含んでいてもよく、複数の樹脂が混合されていてもよい。
Examples of the substrate having electromagnetic wave permeability include glass and resin.
Examples of resin substrates include ABS resin, polycarbonate resin, COC (cycloolefin copolymer), COP (cycloolefin polymer), acrylic resin, polyvinyl chloride, polystyrene resin, polyethylene resin, polypropylene resin, polyvinyl acetate, PET (polyethylene terephthalate), PEN (polyethylene naphthalate), and the like.
These resins may contain various additives, and a plurality of resins may be mixed.
実験結果の検出に蛍光や燐光を利用する観点から、上記の基板は、自家蛍光を実質的に有さないものであることが好ましい。ここで、自家蛍光を実質的に有さないとは、基板が、実験結果の検出に使用する波長の自家蛍光を全く有さないか、有していても実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。
例えば、検出対象の蛍光に比べて１／２以下、１／１０以下程度の自家蛍光の強さであれば、実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。
From the viewpoint of utilizing fluorescence or phosphorescence for detection of experimental results, the above substrate preferably does not substantially have autofluorescence. Here, substantially no autofluorescence means that the substrate has no autofluorescence at the wavelength used for detection of experimental results, or does not affect detection of experimental results even if it has. It means that it is as weak as
For example, if the intensity of the autofluorescence is about 1/2 or less, or 1/10 or less of the fluorescence to be detected, it can be said that the intensity is so weak that it does not affect the detection of the experimental results.
電磁波透過性を有し、かつ自家蛍光を全く発しない素材としては、例えば、石英ガラスが挙げられる。
自家蛍光が微弱であり、電磁波を用いた実験結果の検出に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）等が挙げられる。
Quartz glass is an example of a material that is transparent to electromagnetic waves and does not emit autofluorescence at all.
Low-fluorescent glass, acrylic resin, COC (cycloolefin copolymer), COP (cycloolefin polymer), etc., can be cited as examples of materials that have weak autofluorescence and do not interfere with the detection of experimental results using electromagnetic waves.
生体分子の検出に用いる蛍光としては、例えば蛍光分子を内包した蛍光ビーズや、ＤＮＡの二重らせんに特異的に入り込み、蛍光を発するＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等のインターカレーター等に由来するものが挙げられる。 Fluorescence used for detection of biomolecules includes, for example, fluorescent beads encapsulating fluorescent molecules, and intercalators such as SYBR Green that specifically enter the double helix of DNA and emit fluorescence.
ウェルに収容された生体分子から発せられる蛍光の観察は、例えば、倒立顕微鏡を用いて、マイクロウェルアレイの基板側からおこなうことができる。
この蛍光観察により、所定の蛍光を発するマイクロウェルの個数を数えることで、目的分子の数を特定することができる。
Observation of the fluorescence emitted from the biomolecules housed in the wells can be performed from the substrate side of the microwell array using, for example, an inverted microscope.
The number of target molecules can be specified by counting the number of microwells emitting predetermined fluorescence from this fluorescence observation.
生体分子は、例えば、ウェルに収容する前に、目的分子を特異的に標識する蛍光標識で処理しておくとよい。
あるいは、対象分子を特異的に認識するビーズを用いて、対象分子を補足した後に、ビーズをウェルに収容し、対象分子を特異的に標識し得る蛍光標識と接触させて、目的分子をウェル内で蛍光標識してもよい。
The biomolecules may, for example, be treated with a fluorescent label that specifically labels the molecule of interest prior to placement in the wells.
Alternatively, after trapping the target molecule using beads that specifically recognize the target molecule, the beads are accommodated in wells and brought into contact with a fluorescent label capable of specifically labeling the target molecule. may be fluorescently labeled with
基板の厚みは、適宜決定することができるが、たとえば基板側から蛍光顕微鏡を用いて蛍光を観察する場合には、例えば５ｍｍ以下、例えば２ｍｍ以下、あるいは１．６ｍｍ以下であることが好ましい。 The thickness of the substrate can be determined as appropriate, but is preferably 5 mm or less, for example 2 mm or less, or 1.6 mm or less when fluorescence is observed from the substrate side using a fluorescence microscope.
本実施形態のマイクロウェルアレイを使用した生体分子の観察には、蛍光以外にも、例えば濁度等を利用することもできる。
濁度は、例えば４００～１０００ｎｍ程度の波長の光の透過性により測定することができる。
Observation of biomolecules using the microwell array of this embodiment can also utilize, for example, turbidity in addition to fluorescence.
Turbidity can be measured, for example, by the transmittance of light with a wavelength of about 400-1000 nm.
（親水性樹脂）
親水性部分を形成する樹脂（以下「親水性樹脂」という場合がある。）としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、樹脂の構成成分の分子が、親水性を発現する親水性基を有するものが挙げられる。
親水性基としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン基、スルホニル基、アミノ基、アミド基、エーテル基、エステル基等が挙げられる。
(Hydrophilic resin)
The resin forming the hydrophilic portion (hereinafter sometimes referred to as "hydrophilic resin") is not particularly limited as long as the effect of the present invention is achieved. Those having a group are mentioned.
Hydrophilic groups include, for example, hydroxyl groups, carboxyl groups, sulfone groups, sulfonyl groups, amino groups, amide groups, ether groups, ester groups and the like.
より具体的には、シロキサンポリマー；エポキシ樹脂；ポリエチレン樹脂；ポリエステル樹脂；ポリウレタン樹脂；ポリアクリルアミド樹脂；ポリビニルピロリドン樹脂；ポリアクリル酸共重合体等のアクリル樹脂；カチオン化ポリビニルアルコール、シラノール化ポリビニルアルコール、スルホン化ポリビニルアルコール等のポリビニルアルコール樹脂；ポリビニルアセタール樹脂；ポリビニルブチラール樹脂；ポリエチレンポリアミド樹脂；ポリアミドポリアミン樹脂；ヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド－ポリプロピレンオキサイド共重合体等のポリアルキレンオキサイド誘導体；無水マレイン酸共重合体；エチレン－酢酸ビニル共重合体；スチレン－ブタジエン共重合体；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、適宜選択して使用することができる。
親水性樹脂は、熱可塑性樹脂であってもよく、熱硬化性樹脂であってもよく、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。
More specifically, siloxane polymer; epoxy resin; polyethylene resin; polyester resin; polyurethane resin; polyacrylamide resin; polyvinyl alcohol resin such as sulfonated polyvinyl alcohol; polyvinyl acetal resin; polyvinyl butyral resin; polyethylene polyamide resin; polyamide polyamine resin; cellulose derivatives such as hydroxymethyl cellulose and methyl cellulose; Oxide derivatives; maleic anhydride copolymers; ethylene-vinyl acetate copolymers; styrene-butadiene copolymers;
The hydrophilic resin may be a thermoplastic resin, a thermosetting resin, a resin that is cured by an active energy ray such as an electron beam or UV light, or an elastomer. .
なお、親水性部分（親水性部分の材質）は、ＪＩＳ Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度未満とされることも可能である。 The hydrophilic portion (material of the hydrophilic portion) may have a contact angle of less than 70 degrees measured according to the static drop method specified in JIS R3257-1999.
また、前述する基板が存在する場合には、基板と疎水層とを密着させる機能も有していてもよい。
例えば、熱硬化性のシランカップリング剤等を基板に塗布し、熱硬化させてシロキサンポリマーを形成することにより、親水層を形成してもよい。
Moreover, when the aforementioned substrate is present, it may also have a function of adhering the substrate and the hydrophobic layer.
For example, the hydrophilic layer may be formed by applying a thermosetting silane coupling agent or the like to the substrate and thermally curing it to form a siloxane polymer.
（疎水性樹脂）
疎水性部分を形成する樹脂（以下「疎水性樹脂」という場合がある。）としては、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、ノボラック樹脂；アクリル樹脂；メタクリル樹脂；スチレン樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリオレフィン樹脂；ポリアミド樹脂；ポリイミド樹脂；ポリアセタール樹脂；ポリカーボネート樹脂；ポリフェニレンスルフィド樹脂；ポリスルフォン樹脂；フッ素樹脂；シリコーン樹脂；ユリヤ樹脂；メラミン樹脂；グアナミン樹脂；フェノール樹脂；セルロース樹脂；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、ＪＩＳ Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上であるものを適宜選択して使用することができる。
疎水性樹脂は、熱可塑性樹脂であってもよく、熱硬化性樹脂であってもよく、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。
(hydrophobic resin)
The resin that forms the hydrophobic portion (hereinafter sometimes referred to as "hydrophobic resin") is not particularly limited as long as the effect of the present invention is achieved, but examples include novolak resins; acrylic resins; methacrylic resins; styrene resins; Vinyl resin; Vinylidene chloride resin; Polyolefin resin; Polyamide resin; Polyimide resin; Polyacetal resin; Polycarbonate resin; from among the above resin combinations, etc., those having a contact angle of 70 degrees or more as measured according to the sessile drop method specified in JIS R3257-1999 can be appropriately selected and used.
The hydrophobic resin may be a thermoplastic resin, a thermosetting resin, a resin that is cured by an active energy ray such as an electron beam or UV light, or an elastomer. .
疎水性部分は、例えばレジストで形成されていてもよい。レジストは、微細構造を形成しやすい観点から、フォトレジストであってもよい。フォトレジストは、例えば、感光性のノボラック樹脂であってもよい。 The hydrophobic portion may be made of resist, for example. The resist may be a photoresist from the viewpoint of easy formation of fine structures. The photoresist may be, for example, a photosensitive novolak resin.
［マイクロ流体デバイス］
本実施形態において、本発明は、流路と、前記流路内に配置された上記のマイクロウェルアレイとを備える、マイクロ流体デバイスを提供する。
このようなマイクロ流体デバイスを用いることにより、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入することが容易になる。
[Microfluidic device]
In this embodiment, the present invention provides a microfluidic device comprising a channel and the above-described microwell array arranged in the channel.
Using such a microfluidic device facilitates encapsulation of an aqueous liquid within the wells of a microwell array.
図１（ａ）は、マイクロ流体デバイスの１実施形態を示す斜視図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）におけるｂ－ｂ線断面図である。
本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１０００は、底部部材１１００と、蓋部材１２００と、流路１３００と、流路１３００の一端に設けられた流路入口１２１０と、流路１３００の他端に設けられた流路出口１２２０と、流路１３００の側面を形成する封止部材１４００と、流路１３００の内部に配置されたマイクロウェルアレイｍとを備える。
流路１３００に流体を送液する場合には、例えば、シリンジ等を用いて、流路入口１２１０から流体を導入し、流路出口１２２０から排出するとよい。
FIG. 1(a) is a perspective view showing one embodiment of a microfluidic device. FIG. 1(b) is a cross-sectional view taken along line bb in FIG. 1(a).
The
When the fluid is sent to the
マイクロウェルアレイｍの構造については後述する。
マイクロウェルアレイｍの基板１１０と、マイクロ流体デバイス１０００の底部部材１１００は一体であってもよい。
The structure of the microwell array m will be described later.
The
また、マイクロウェルアレイｍの親水層１１２０及び疎水層１１３０は、マイクロ流体デバイス１０００の底部部材１１００上に一体成型されていてもよい。
すなわち、マイクロウェルアレイｍは、マイクロ流体デバイス１０００の底部部材１１００上に形成されていてもよい。
Also, the
That is, the microwell array m may be formed on the
底部部材１１００及び蓋部材１２００の材質としては、上述したマイクロウェルアレイの基板の材質と同様のものを使用することができる。
また、封止部材１４００の材質としては、特に制限されないが、例えばシリコーンゴム、アクリル発泡体からなる芯材フィルムの両面にアクリル系粘着剤が積層された両面粘着テープ等が挙げられる。
As the material of the
The material of the sealing
［マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法］
本実施形態において、本発明は、流路と、前記流路内に配置された上記のマイクロウェルアレイとを備える、マイクロ流体デバイスの前記流路に水性液体を送液し、前記マイクロウェルアレイのウェルに前記水性液体を導入する工程と、前記流路に封止液を送液し、前記ウェルに導入された前記水性液体の上層に封止液の層を形成させ、前記水性液体を前記ウェル内に封入する工程を備える、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法を提供する。
[Method for Encapsulating Aqueous Liquid in Wells of Microwell Array]
In this embodiment, the present invention is a microfluidic device comprising a channel and the above-described microwell array arranged in the channel. introducing the aqueous liquid into the well; feeding a sealing liquid into the flow channel to form a layer of the sealing liquid on top of the aqueous liquid introduced into the well; A method for encapsulating an aqueous liquid within wells of a microwell array is provided, comprising the step of encapsulating within.
ここで、水性液体とは、水、検出対象である生体分子を含有する緩衝液等の生体試料、酵素反応液等を意味する。
生体試料とは一般的に水性液体である。
水性液体とは、例えば、生体試料を鋳型とし、検出試薬としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを含むＰＣＲ反応溶液等であってもよい。
また、水性液中には界面活性剤などを含むことで、ウェル内に液体を封入しやすくしてもよい。
Here, the aqueous liquid means water, a biological sample such as a buffer solution containing biomolecules to be detected, an enzyme reaction solution, or the like.
A biological sample is generally an aqueous liquid.
The aqueous liquid may be, for example, a PCR reaction solution using a biological sample as a template and containing SYBR Green as a detection reagent.
Further, the aqueous liquid may contain a surfactant or the like to make it easier to enclose the liquid in the well.
また、封止液とは、マイクロウェルアレイの各ウェルに導入された液体どうしが互いに混合しない状態に隔離するために用いる液体を意味し、例えば、オイル類を用いることができる。
オイルとしては、例えばシグマ社製の商品名「ＦＣ４０」や、３Ｍ社製の商品名「ＨＦＥ－７５００」、ＰＣＲ反応等に用いられるミネラルオイル等を用いることができる。
従来のマイクロウェルアレイでは、ミネラルオイルを封止液に利用することは困難な場合があるが、上述したマイクロウェルアレイであれば、ミネラルオイルを封止液に利用しても、ウェルに水性液体を封入することができる。
The term "sealing liquid" means a liquid used to isolate the liquids introduced into the wells of the microwell array so that they do not mix with each other. For example, oils can be used.
As the oil, for example, the trade name “FC40” manufactured by Sigma, the trade name “HFE-7500” manufactured by 3M, mineral oil used for PCR reaction and the like can be used.
In conventional microwell arrays, it may be difficult to use mineral oil as the sealing liquid, but with the above-described microwell array, even if mineral oil is used as the sealing liquid, the wells can be filled with an aqueous liquid. can be enclosed.
封止液は、マイクロウェルアレイの疎水層の材質に対する接触角が５～８０度であることが好ましい。
封止液の接触角がこの範囲であると、マイクロウェルアレイのウェルに水性液体を封入することができる。
封止液の接触角は、例えば、ＪＩＳ Ｒ３２５７－１９９９に規定された静滴法に準じて、水の代わりに封止液を用いて測定すればよい。
The sealing liquid preferably has a contact angle of 5 to 80 degrees with respect to the material of the hydrophobic layer of the microwell array.
When the contact angle of the sealing liquid is within this range, the aqueous liquid can be sealed in the wells of the microwell array.
The contact angle of the sealing liquid can be measured, for example, using the sealing liquid instead of water according to the sessile drop method specified in JIS R3257-1999.
マイクロウェルアレイの疎水層を形成する材料と封止液の組み合わせを適宜選択することにより、上述した具体的なオイル以外の液体も封止液として使用することができる。 Liquids other than the specific oil described above can be used as the sealing liquid by appropriately selecting the combination of the material forming the hydrophobic layer of the microwell array and the sealing liquid.
続いて、図１に基づいて、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法を説明する。
まず、シリンジ等を用いて、マイクロ流体デバイス１０００の流路入口１２１０からＰＣＲ反応溶液、インベーダー反応溶液等の水性液体を送液する。
その結果、流路１３００の内部に配置されたマイクロウェルアレイｍの各ウェル内に水性液体が導入される。
Next, based on FIG. 1, a method of enclosing an aqueous liquid in wells of a microwell array will be described.
First, an aqueous liquid such as a PCR reaction solution or an invader reaction solution is sent from the
As a result, the aqueous liquid is introduced into each well of the microwell array m arranged inside the
次に、シリンジ等を用いて、流路入口１２１０から封止液を送液する。
その結果、流路１３００の内部に配置されたマイクロウェルアレイｍの各ウェルのウェル入り口近傍に封止液の層が形成され、ウェル内に水性液体が封入される。
マイクロウェルアレイｍが上述した構成を備えていることにより、本実施形態の方法によって、マイクロウェルアレイｍの各ウェルに水性液体を容易に封入することができる。
Next, a syringe or the like is used to feed the sealing liquid from the
As a result, a layer of the sealing liquid is formed in the vicinity of the well entrance of each well of the microwell array m arranged inside the
Since the microwell array m has the structure described above, the method of the present embodiment can easily enclose an aqueous liquid in each well of the microwell array m.
マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入した後、例えば、サーマルサイクラー等を用いてＰＣＲ反応やインベーダー反応等の酵素反応等をおこなうとよい。 After encapsulating the aqueous liquid in the wells of the microwell array, for example, a thermal cycler or the like may be used to perform an enzymatic reaction such as a PCR reaction or an invader reaction.
［マイクロウェルアレイの製造方法］
（第１実施形態）
本実施形態においては、電磁波透過性を有する基板上に疎水性材料を積層して疎水層を形成する工程と、前記疎水層を掘削して複数のウェルを形成する工程と、を備える、マイクロウェルアレイの製造方法を提供する。
[Method for producing microwell array]
(First embodiment)
In this embodiment, a microwell comprising a step of laminating a hydrophobic material on a substrate having electromagnetic wave permeability to form a hydrophobic layer, and a step of excavating the hydrophobic layer to form a plurality of wells. A method for manufacturing an array is provided.
ここで、図３を参照しながら、本実施形態のマイクロウェルアレイ１００の製造方法について説明する。
図３は、第１実施形態のマイクロウェルアレイ１００の製造方法を示す断面図である。
Here, a method for manufacturing the
FIG. 3 is a cross-sectional view showing a method for manufacturing the
本実施形態のマイクロウェルアレイ１００の製造方法では、まず、図３に示すように、基板１１０の表面１１５に疎水層１２０を形成する。
基板１１０は、例えばガラス基板であってよい。
このとき、ガラス基板の表面にＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシラザン）を含む溶液を塗布してもよい。
これにより基板１１０への疎水層１２０の密着が良好になる。
In the method of manufacturing the
At this time, a solution containing HMDS (hexamethyldisilazane) may be applied to the surface of the glass substrate.
This improves adhesion of the
疎水性樹脂として、フォトレジストを使用してもよい。
この場合、フォトレジストをスピンコート等により疎水層１２０上に塗布する。そして、スピンコート後、フォトレジストに熱を加えてプリベークをおこない、固化させて疎水層１２０を生成する。
A photoresist may be used as the hydrophobic resin.
In this case, a photoresist is applied onto the
続いて、疎水層１２０を掘削して、ウェルを形成する。掘削は、例えばフォトレジストの現像によっておこなうことができる。
具体的には、疎水層１２０上にパターンマスクを取り付け、その上から紫外線等を照射して感光させる。
Subsequently, the
Specifically, a pattern mask is attached on the
フォトレジストとしては、例えばポジ型のものを使用する。ポジ型のフォトレジストは、光が当たると分解し、現像液に溶解するタイプである。そのため、パターンマスクとしては、マイクロウェルを形成したい箇所に、目的のパターンの穴が開いているようなデザインのものを使用する。
露光時間や条件は、使用するフォトレジストのデータシートを参照して適宜決定するとよい。
For example, a positive photoresist is used as the photoresist. A positive photoresist is a type that decomposes when exposed to light and dissolves in a developer. Therefore, the pattern mask used is designed to have holes of the desired pattern at the locations where microwells are to be formed.
The exposure time and conditions may be appropriately determined with reference to the data sheet of the photoresist used.
続いて、用いたフォトレジストに適した現像液を用いて現像をおこない、マイクロウェルアレイ１００を形成する。現像時間は、使用するフォトレジストのデータシートを参照して適宜決定する。
現像後、リンス液で現像を止め、洗浄する。リンス液としては、例えば純水等を使用すればよい。
続いて、必要に応じてポストベークをおこない、フォトレジストを安定化させる。
以上の操作により、図２に示すような本実施形態のマイクロウェルアレイ１００を製造することができる。
Subsequently, development is performed using a developer suitable for the photoresist used, and the
After development, the development is stopped with a rinse solution and washed. Pure water, for example, may be used as the rinsing liquid.
Subsequently, post-baking is performed as necessary to stabilize the photoresist.
By the above operation, the
なお、上記のウェルを形成する工程は、ドライエッチングをおこない、疎水層１２０を掘削して複数のウェルを形成する工程であってもよい。ドライエッチングとは、イオンを高速で対象物にぶつけて、その運動エネルギーを利用してエッチングをおこなう方法である。
以上の方法により、基板１１０の表面が露出したウェルを有するマイクロウェルアレイを製造することができる。
Note that the step of forming the wells may be a step of performing dry etching and excavating the
By the above method, a microwell array having wells in which the surface of the
［水性液体の分析方法］
本実施形態においては、水性液体が封入された、上記のマイクロウェルアレイのウェルに電磁波を照射する工程と、ウェルから放出される蛍光又は燐光を検出する工程と、を備える、水性液体の分析方法を提供する。
[Aqueous liquid analysis method]
In the present embodiment, a method for analyzing an aqueous liquid, comprising the steps of irradiating the wells of the microwell array containing the aqueous liquid with electromagnetic waves, and detecting fluorescence or phosphorescence emitted from the wells. I will provide a.
本実施形態の分析方法により、マイクロウェルアレイを構成するウェルのうち、何個のウェルが蛍光又は燐光を発しているかを計測することができる。
例えば、マイクロウェルアレイ内でＰＣＲ反応をおこない、ＰＣＲ増幅が見られたウェルにおけるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光を検出することにより、増幅が見られたウェルの割合を算出することができる。
According to the analysis method of this embodiment, it is possible to measure how many wells emit fluorescence or phosphorescence among the wells constituting the microwell array.
For example, by performing a PCR reaction in a microwell array and detecting SYBR Green fluorescence in wells in which PCR amplification was observed, the ratio of wells in which amplification was observed can be calculated.
本実施形態の分析方法は、例えば、蛍光顕微鏡を用いておこなってもよい。
また、電磁波の照射は、マイクロウェルアレイの基板側からおこなってもよく、ウェル側からおこなってもよく、その他の任意の方向からおこなってもよい。
また、電磁波の照射の結果発生する蛍光又は燐光の検出は、マイクロウェルアレイの基板側からおこなってもよく、ウェル側からおこなってもよく、その他の任意の方向からおこなってもよいが、例えば蛍光顕微鏡を用いて蛍光又は燐光を検出する場合には、マイクロウェルアレイの基板側からおこなうことが簡便である。
The analysis method of this embodiment may be performed using, for example, a fluorescence microscope.
Electromagnetic wave irradiation may be performed from the substrate side of the microwell array, may be performed from the well side, or may be performed from any other direction.
Fluorescence or phosphorescence generated as a result of irradiation with electromagnetic waves may be detected from the substrate side of the microwell array, from the well side, or from any other direction. When fluorescence or phosphorescence is detected using a microscope, it is convenient to detect from the substrate side of the microwell array.
次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail by showing experimental examples, but the present invention is not limited to the following experimental examples.
＜実験例１＞
上述した第１実施形態の製造方法にしたがって、実験例１のマイクロウェルアレイを作製した。
図４は、実験例１のマイクロウェルアレイの構造を示す断面図である。
<Experimental example 1>
A microwell array of Experimental Example 1 was fabricated according to the manufacturing method of the first embodiment described above.
4 is a cross-sectional view showing the structure of the microwell array of Experimental Example 1. FIG.
実験例１のマイクロウェルアレイは、開口部直径Ｄ２約４．９２μｍ、底面部直径Ｄ１約３．８２μｍ、高さＨ約３μｍの円錐台のウェルを有しており、基板１１０としては、ガラス基板を使用した。
また、疎水性樹脂１２０として、ポジ型フォトレジスト（型番「ＰＦＩ８９－Ｂ４」）住友化学社製を使用した。
The microwell array of Experimental Example 1 has truncated conical wells with an opening diameter D2 of about 4.92 μm, a bottom diameter D1 of about 3.82 μm, and a height H of about 3 μm. It was used.
As the
＜実験例２＞
実験例１と同様にして、実験例２のマイクロウェルアレイを作製した。
実験例２のマイクロウェルアレイは、開口部直径Ｄ２約６．９６μｍ、底面部直径Ｄ１約６．４６μｍ、高さＨ約３μｍの円錐台のウェルを有しており、基板１１０としては、ガラス基板を使用した。
また、疎水性樹脂１２０として、ポジ型フォトレジスト（型番「ＰＭＥＲ Ｐ－ＨＡ １００ＰＭ」、東京応化工業社製）を使用した。
また密着剤にはＨＭＤＳを使用した。
<Experimental example 2>
A microwell array of Experimental Example 2 was prepared in the same manner as in Experimental Example 1.
The microwell array of Experimental Example 2 has truncated conical wells with an opening diameter D2 of about 6.96 μm, a bottom diameter D1 of about 6.46 μm, and a height H of about 3 μm. It was used.
Also, as the
HMDS was used as the adhesion agent.
＜実験例３＞
実験例１、２と同様にして、実験例３のマイクロウェルアレイを作製した。
実験例３のマイクロウェルアレイは、開口部直径Ｄ２約５．３２μｍ、底面部直径Ｄ１約４．０８μｍ、高さＨ約３μｍの円錐台のウェルを有しており、基板１１０としては、ガラス基板を使用した。
また、疎水性樹脂１２０として、ポジ型フォトレジスト（型番「ＭＩＣＲＯ ＰＯＳＩＴ Ｓ１８１８」ローム＆ハース社製）を使用した。
<Experimental example 3>
A microwell array of Experimental Example 3 was prepared in the same manner as in Experimental Examples 1 and 2.
The microwell array of Experimental Example 3 has truncated conical wells with an opening diameter D2 of about 5.32 μm, a bottom diameter D1 of about 4.08 μm, and a height H of about 3 μm. It was used.
Also, as the
実験施例１、２，３のマイクロウェルアレイ１００を備えるマイクロ流体デバイスを組み立てた。
続いて、上記のマイクロ流体デバイスに、シリンジを用いて、蛍光物質であるＦＩＴＣを適量溶解し、界面活性剤を適量含む水性液体を送液した。
その後、上記のマイクロ流体デバイスに、シリンジを用いてオイル（型番「ＦＣ４０」、シグマ社製）を送液した。
A microfluidic device comprising the
Subsequently, an aqueous liquid containing an appropriate amount of surfactant dissolved in an appropriate amount of fluorescent substance FITC was fed to the microfluidic device using a syringe.
After that, oil (model number “FC40”, manufactured by Sigma) was sent to the microfluidic device using a syringe.
図５は、本実験例のマイクロ流体デバイスにオイルを送液した後の状態を示す断面図である。
マイクロ流体デバイス１０００は、マイクロウェルアレイを保持する底部部材１１１０と、蓋部材１２００と、マイクロ流路１３００とを備えていた。
本実験例においては、底部部材１１１０は、実験例１のマイクロウェルアレイ１００の基板１１０と一体になっている。
すなわち、実験例１のマイクロウェルアレイ１００は、底部部材１１１０を基板１１０として形成されたものであった。
FIG. 5 is a cross-sectional view showing a state after oil is sent to the microfluidic device of this experimental example.
The
In this experimental example, the bottom member 1110 is integrated with the
That is, the
実験例１，２，３のマイクロ流体デバイス１０００に、水性液体４４０として、界面活性剤を適量含むＦＩＴＣ溶液を送液すると、マイクロウェルアレイ１００のウェル内に水性液体４４０が導入された。
When a FITC solution containing an appropriate amount of surfactant was sent as the
続いて、マイクロ流体デバイス１０００にオイル４５０を送液すると、図５に示すように、マイクロウェルアレイ１００のウェル内に水性液体４４０を保持した状態で、ウェルのウェル入り口近傍にオイル４５０の層が形成された。
すなわち、マイクロウェルアレイ１００のウェル内に水性液体４４０が封入された。
各ウェルは、微小体積の水性液体４４０中で種々の生化学的又は化学的反応を行う化学反応容器として機能する。
Subsequently, when the
That is, the
Each well functions as a chemical reaction vessel that performs various biochemical or chemical reactions in a minute volume of
図６は、オイルを送液した後の、実験例１のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
その結果、図６に示すように、実験例１のマイクロウェルアレイのウェルのパターンに、規則正しくＦＩＴＣの蛍光が観察された。
図６において、白く見える部分が蛍光を発しているウェルであり、黒い部分は基板である。
この結果は、実験例１のマイクロウェルアレイの各ウェルに、ＦＩＴＣ溶液を封入することができたことを示す。
FIG. 6 is a photograph showing the result of fluorescence microscopic observation of the microwell array of Experimental Example 1 from the substrate side after the oil was delivered.
As a result, as shown in FIG. 6, FITC fluorescence was observed regularly in the well pattern of the microwell array of Experimental Example 1.
In FIG. 6, the white portion is the fluorescent well, and the black portion is the substrate.
This result indicates that the FITC solution could be enclosed in each well of the microwell array of Experimental Example 1.
なお、実験例１のマイクロウェルアレイにおいて、疎水性樹脂として使用したノボラック樹脂は自家蛍光を有するが、その蛍光値は十分に低く、検出対象であるＦＩＴＣの蛍光値と十分な差があるため、ＦＩＴＣの蛍光の検出には支障がない。 In the microwell array of Experimental Example 1, the novolac resin used as the hydrophobic resin has autofluorescence, but the fluorescence value is sufficiently low and sufficiently different from the fluorescence value of FITC, which is the detection target. There is no problem in detecting the fluorescence of FITC.
図７は、オイルを送液した後の、実験例２のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
その結果、図７に示すように、実験例２のマイクロウェルアレイのウェルのパターンに、規則正しくＦＩＴＣの蛍光が観察された。
図７において、白く見える部分が蛍光を発しているウェルであり、黒い部分は基板である。
この結果は、実験例２のマイクロウェルアレイの各ウェルに、ＦＩＴＣ溶液を封入することができたことを示す。
FIG. 7 is a photograph showing the result of fluorescence microscopic observation of the microwell array of Experimental Example 2 from the substrate side after the oil was delivered.
As a result, as shown in FIG. 7, FITC fluorescence was observed regularly in the well pattern of the microwell array of Experimental Example 2.
In FIG. 7, the white portion is the fluorescent well, and the black portion is the substrate.
This result indicates that the FITC solution could be enclosed in each well of the microwell array of Experimental Example 2.
図８は、オイルを送液した後の、実験例３のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
その結果、図８に示すように、実験例３のマイクロウェルアレイのウェルのパターンに、規則正しくＦＩＴＣの蛍光が観察された。
図８において、白く見える部分が蛍光を発しているウェルであり、黒い部分は基板である。
この結果は、実験例３のマイクロウェルアレイの各ウェルに、ＦＩＴＣ溶液を封入することができたことを示す。
FIG. 8 is a photograph showing the result of fluorescence microscopic observation of the microwell array of Experimental Example 3 from the substrate side after the oil was delivered.
As a result, as shown in FIG. 8, FITC fluorescence was observed regularly in the well pattern of the microwell array of Experimental Example 3.
In FIG. 8, the white portion is the fluorescent well, and the black portion is the substrate.
This result indicates that the FITC solution could be enclosed in each well of the microwell array of Experimental Example 3.
＜実験例４＞
実験例１～３と同様にして、実験例４のマイクロウェルアレイを作製した。
実験例４のマイクロウェルアレイは、開口部直径Ｄ２約４．１０μｍ、底面部直径Ｄ１約２．３２μｍ、高さＨ約３μｍの円錐台のウェルを有しており、基板１１０としては、ガラス基板を使用した。
また、疎水性樹脂１２０として、ネガ型フォトレジスト（型番「ＺＰＮ１１５０－９０」日本ゼオン社製）を使用した。
<Experimental example 4>
A microwell array of Experimental Example 4 was prepared in the same manner as in Experimental Examples 1-3.
The microwell array of Experimental Example 4 has truncated conical wells with an opening diameter D2 of about 4.10 μm, a bottom diameter D1 of about 2.32 μm, and a height H of about 3 μm. It was used.
Also, as the
＜実験例５＞
実験例１～４と同様にして、実験例５のマイクロウェルアレイを作製した。
実験例５のマイクロウェルアレイは、開口部直径Ｄ２約４．３４μｍ、底面部直径Ｄ１約２．８８μｍ、高さＨ約３μｍの円錐台のウェルを有しており、基板１１０としては、ガラス基板を使用した。
また、疎水性樹脂１２０として、ネガ型フォトレジスト（型番「ＺＰＮ１１５０－９０」）を使用した。
<Experimental example 5>
A microwell array of Experimental Example 5 was prepared in the same manner as in Experimental Examples 1-4.
The microwell array of Experimental Example 5 has truncated conical wells with an opening diameter D2 of about 4.34 μm, a bottom diameter D1 of about 2.88 μm, and a height H of about 3 μm. It was used.
Also, as the
実験例１～３と同様にして、実験例４，５のマイクロウェルアレイ１００を備えるマイクロ流体デバイスを組み立てた。
Microfluidic devices having the
続いて、上記のマイクロ流体デバイスに、シリンジを用いて、蛍光物質であるＦＩＴＣを適量溶解し、界面活性剤を適量含む水性液体を送液した。
その後、上記のマイクロ流体デバイスに、シリンジを用いてオイル（型番「ＦＣ４０」、シグマ社製）を送液した。
Subsequently, an aqueous liquid containing an appropriate amount of surfactant dissolved in an appropriate amount of fluorescent substance FITC was fed to the microfluidic device using a syringe.
After that, oil (model number “FC40”, manufactured by Sigma) was sent to the microfluidic device using a syringe.
図９は、本実験例のマイクロ流体デバイスにオイルを送液した後の状態を示す断面図である。
図１０は、オイルを送液した後の、実験例４のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
その結果、図１０に示すように、実験例４のマイクロウェルアレイにおいては、複数のウェルにまたがって蛍光が観測され、ウェルのパターンに沿った規則正しいＦＩＴＣの蛍光は観察されなかった。
この結果は、実験例４のマイクロウェルアレイには、ＦＩＴＣ溶液を封入することができなかったことを示す。
FIG. 9 is a cross-sectional view showing a state after oil is sent to the microfluidic device of this experimental example.
FIG. 10 is a photograph showing the result of fluorescence microscopic observation of the microwell array of Experimental Example 4 from the substrate side after the oil was delivered.
As a result, as shown in FIG. 10, in the microwell array of Experimental Example 4, fluorescence was observed across a plurality of wells, and regular FITC fluorescence along the well pattern was not observed.
This result indicates that the FITC solution could not be encapsulated in the microwell array of Experimental Example 4.
図１１は、オイルを送液した後の、実験例５のマイクロウェルアレイを基板側から蛍光顕微鏡観察した結果を示す写真である。
その結果、図１１に示すように、実験例５のマイクロウェルアレイにおいては、複数のウェルにまたがって蛍光が観測され、ウェルのパターンに沿った規則正しいＦＩＴＣの蛍光は観察されなかった。
この結果は、実験例５のマイクロウェルアレイには、ＦＩＴＣ溶液を封入することができなかったことを示す。
FIG. 11 is a photograph showing the result of fluorescence microscopic observation of the microwell array of Experimental Example 5 from the substrate side after the oil was delivered.
As a result, as shown in FIG. 11, in the microwell array of Experimental Example 5, fluorescence was observed across a plurality of wells, and regular FITC fluorescence along the well pattern was not observed.
This result indicates that the FITC solution could not be encapsulated in the microwell array of Experimental Example 5.
この結果は、実験例４，５のマイクロウェルアレイには、ＦＩＴＣ溶液を封入することができなかったことを示す。
すなわち、ある大きさ以上で底面が送液した液体に接着していないマイクロウェルが形成されている場合、水性溶液を保持することが困難となり、オイルを送液した際に、ウェル内の水性溶液が全てオイルに置き換わってしまうことが明らかとなった。
This result indicates that the FITC solution could not be enclosed in the microwell arrays of Experimental Examples 4 and 5.
That is, when a microwell having a size larger than a certain size and the bottom surface not adhering to the sent liquid is formed, it becomes difficult to retain the aqueous solution, and when the oil is sent, the aqueous solution in the well becomes was completely replaced by oil.
また、ウェル内の体積Ｖの溶液が、ある大きさ以上でウェル底面に接しているウェルを備えるマイクロウェルアレイは、水性溶液をウェル内に封入するために非常に有用であることを示す。 In addition, it is shown that a microwell array having wells in which the volume V of the solution in the well is in contact with the bottom surface of the well over a certain size is very useful for enclosing an aqueous solution in the well.
各実験例における、寸法を表１に示す。 Table 1 shows the dimensions in each experimental example.
ウェルの形状としては、表１に示すように、図２に示した容積Ｖ（１０－１８ｍ３）、底面積Ｓ１（１０－１２ｍ２）、開口部の平面積Ｓ２（１０－１２ｍ２）、開口部の最大径Ｄ２（μｍ）、底面の最大径Ｄ１（μｍ）、ウェルの底面から形成される側面の角度θ、高さＨ（μｍ）に対して、次のことがわかった。 As for the shape of the well, as shown in Table 1, the volume V (10 −18 m 3 ), the bottom area S1 (10 −12 m 2 ), the plane area S2 (10 −12 m 2 ), the following was found for the maximum diameter D2 (μm) of the opening, the maximum diameter D1 (μm) of the bottom, the angle θ of the side surface formed from the bottom of the well, and the height H (μm). .
容積Ｖが１ｆＬ～６ｎＬ／ウェルであり、かつ、容積Ｖの仮数部が底面積Ｓ１（１０－１２ｍ２）の仮数部の１倍以上４．５倍以下、２倍以上４．３倍以下であり、３倍以上４．２倍以下となることが好ましい。 The volume V is 1 fL to 6 nL/well, and the mantissa part of the volume V is 1 to 4.5 times, 2 to 4.3 times, the mantissa part of the base area S1 (10 −12 m 2 ) and preferably 3 times or more and 4.2 times or less.
平面積Ｓ２（１０－１２ｍ２）が、底面積Ｓ１の０．５倍以上２．２倍以下、１倍以上２倍以下、１．１倍以上１．８倍以下であることが好ましい。 The plane area S2 (10 −12 m 2 ) is preferably 0.5 times or more and 2.2 times or less, 1 time or more and 2 times or less, or 1.1 times or more and 1.8 times or less the bottom area S1.
開口部の最大径Ｄ２（μｍ）が、底面の最大径Ｄ１（μｍ）の０．５倍以上１．５倍以下、０．７倍以上１．４倍以下、１倍以上１．３倍以下であることが好ましい。 The maximum diameter D2 (μm) of the opening is 0.5 to 1.5 times, 0.7 to 1.4 times, 1 to 1.3 times the maximum diameter D1 (μm) of the bottom surface. is preferably
側面角度θが、３０°以上１０３°以下、６０°以上１０３°以下、９０°以上１０３°以下であることが好ましい。あるいは、側面角度θが、７７°以上であり、かつ前記ウェルの容積Ｖ（１０－１８ｍ３）の仮数部の三乗根の値が３．５以上であることができる。 The side angle θ is preferably 30° or more and 103° or less, 60° or more and 103° or less, or 90° or more and 103° or less. Alternatively, the side angle θ may be 77° or more, and the cube root of the mantissa of the well volume V (10 −18 m 3 ) may be 3.5 or more.
高さＨ（μｍ）が、最大径Ｄ１の０．２倍以上１０倍以下、は０．４倍以上５倍以下、０．６倍以上２倍以下であることが好ましい。 The height H (μm) is preferably 0.2 times or more and 10 times or less, 0.4 times or more and 5 times or less, or 0.6 times or more and 2 times or less the maximum diameter D1.
本発明によれば、ウェル内に水性液体を封入することを容易とできる。
また、上記のマイクロウェルアレイの製造方法、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及び水性液体の分析方法を提供することができる。
例えば、生体由来のＤＮＡやＲＮＡ等の検出により診断を行う場合等に、微小な空間内へ試薬とともに核酸を入れることが可能となる。
According to the present invention, it is possible to easily enclose the aqueous liquid in the well.
In addition, it is possible to provide the method for manufacturing the microwell array, the microfluidic device, the method for encapsulating an aqueous liquid in the wells of the microwell array, and the method for analyzing the aqueous liquid.
For example, when making a diagnosis by detecting DNA, RNA, or the like derived from a living body, nucleic acids can be put into a minute space together with a reagent.
さらに、本発明の活用例として、微小な空間内で核酸の検出を行うことで、従来よりも高精度に遺伝子変異を検出できる。この技術は疾病原因となる遺伝子の早期検出や、より正確な診断を行うことが可能となる。 Furthermore, as an application example of the present invention, gene mutation can be detected with higher accuracy than before by detecting nucleic acids in a minute space. This technology enables early detection of disease-causing genes and more accurate diagnosis.
１００，ｍ…マイクロウェルアレイ
１１０，１１００…基板
１１５…表面
１１２０…親水層
１２０，１１３０…疎水層
１０００…マイクロ流体デバイス
１１００…底部部材
１２００…蓋部材
１３００…マイクロ流路
１２１０…流路入口
１２２０流路出口
１４００…封止部材
ｍ…マイクロウェルアレイ
４４０…水性液体
４５０…オイル
100,
本発明は、マイクロウェルアレイおよびマイクロ流体デバイスに関する。 The present invention relates to microwell arrays and microfluidic devices .
そこで、本発明は、ウェル内に水性液体を封入することが容易なマイクロウェルアレイおよびマイクロ流体デバイスを提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a microwell array and a microfluidic device in which it is easy to enclose an aqueous liquid in the wells.
本発明は、ウェル表面に疎水性部分を有する複数のウェルを備えるマイクロウェルアレイである。
ウェルの開口部の平面積Ｓ２（１０
－１２
ｍ
２
）は、ウェル底面積Ｓ１（１０
－１２
ｍ
２
）の１．１倍以上１．８倍以下であり、ウェルの開口部を含む面に対してウェルの側面がなす角度θが、７７°以上９０°以下である。
The present invention is a microwell array comprising a plurality of wells having hydrophobic moieties on the well surfaces.
The plane area S2 (10 −12 m 2 ) of the well opening is 1.1 to 1.8 times the well bottom area S1 (10 −12 m 2 ), and the surface including the well opening The angle θ formed by the side surfaces of the well is 77° or more and 90° or less.
Claims (1)
前記ウェル内で酵素反応を行う、
生体分子の分析方法。 Said wells in a microwell array comprising a plurality of wells, wherein the well opening plane area S2 (10 −12 m 2 ) is 2.2 times or less the well bottom area S1 (10 −12 m 2 ) enclosing an aqueous liquid containing biomolecules in the
performing an enzymatic reaction in the well;
Methods for analyzing biomolecules.
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2023
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