JP2023104355A - Method for measuring memory function - Google Patents

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Shun Katada
幸一 三澤
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Abstract

To provide an objective and low-invasive method for evaluating a subject's memory functions.SOLUTION: A method for measuring memory functions includes the step of measuring, in a biological sample taken from a subject, at least one of the ratios of the numbers of bacterial strains classified as Blautia and Bacteroides to the total number of bacterial strains.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、腸内細菌叢の構成を指標とする記憶機能の測定方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for measuring memory function using the composition of intestinal flora as an index.

実行機能、注意機能、認知柔軟性、記憶機能といった認知機能は、高次脳機能とも呼ばれ、加齢や頭部外傷、脳卒中などによって当該機能が障害されると、日常生活及び社会生活への適応が困難となる場合がある。
高次脳機能の中でも最上位に位置する実行機能は、遂行機能とも言われ、将来の目標達成のために適切な構えを維持する能力と定義され、認知機能の中でも上位に位置し、全ての認知機能が正常に機能するために必須な機能と考えられている(非特許文献1)。また、高次脳機能である認知機能の中の注意制御と認知柔軟性は、新しい行動パターンの促進や、非慣習的な状況における行動の最適化に重要な役割を果たし、人間の目標志向的な行動を支えていると考えられている。さらに、記憶機能は、情報を覚え、維持し、必要に応じて引き出す一連の機能であり、脳における高度な情報処理の基盤ともなっている。
Cognitive functions such as executive function, attention function, cognitive flexibility, and memory function are also called higher brain functions. Adaptation may be difficult.
The executive function, which is positioned at the top of the higher brain functions, is also called the executive function, and is defined as the ability to maintain an appropriate posture in order to achieve future goals. It is considered an essential function for normal cognitive function (Non-Patent Document 1). In addition, attention control and cognitive flexibility, which are higher brain functions, play important roles in promoting new behavioral patterns and optimizing behavior in unconventional situations. believed to support such behavior. Furthermore, the memory function is a series of functions for remembering, maintaining, and retrieving information as needed, and is also the basis for advanced information processing in the brain.

臨床神経学分野において、記憶は、その保持時間に応じて、即時記憶、近時記憶、遠隔記憶に分類される。また、記憶は、その内容に基づいて、イメージなどとして意識上に内容を想起でき、言語などを介して説明することができる陳述記憶と、意識上に内容を想起できず、言語などを介してその内容を説明できない非陳述記憶に分類される。陳述記憶には、エピソード記憶と意味記憶が含まれる。エピソード記憶とは、個人が経験した出来事に関する記憶であって、その出来事を経験したときの状況とともに記憶されるものである。意味記憶とは、知識に相当し、言語とその意味、知覚対象の意味や対象間の関係、社会的約束など、世の中に関する組織化された記憶である。一方、非陳述記憶には、手続き記憶、プライミング、条件反射などが含まれる。手続き記憶とは、運動技能、知覚技能、認知技能など、同じような経験の繰り返しにより形成される記憶を意味する(非特許文献2)。 In clinical neurology, memory is classified into immediate memory, recent memory, and remote memory according to its retention time. In addition, based on the content, memory can be consciously recollected as images, etc., and declarative memory, which can be explained through language, etc., and memory, which cannot be consciously recollected, can be It is classified as non-declarative memory in which the contents cannot be explained. Declarative memory includes episodic memory and semantic memory. Episodic memory is memory related to an event experienced by an individual, and is remembered together with the circumstances under which the event was experienced. Semantic memory corresponds to knowledge, and is organized memory about the world, such as language and its meaning, the meaning of perceptual objects, the relationships between objects, and social promises. On the other hand, non-declarative memory includes procedural memory, priming, and conditioned reflexes. Procedural memory means memory formed by repeating similar experiences, such as motor skills, perceptual skills, and cognitive skills (Non-Patent Document 2).

一般的な意味で記憶という場合、エピソード記憶を意味し、例えば、認知症の診断基準で記憶障害という場合、エピソード記憶の障害を指す。エピソード記憶に関与する脳領域としては、内側側頭葉、間脳(視床・乳頭体)、前脳基底部などが考えられており、これら領域が損傷すると、健忘などの症状が現れる。 When memory is used in a general sense, it means episodic memory. For example, memory impairment in the diagnostic criteria for dementia refers to impairment of episodic memory. Brain regions involved in episodic memory include the medial temporal lobe, diencephalon (thalamus/mammary body), and basal forebrain. Damage to these regions causes symptoms such as amnesia.

現在、高次脳機能の検査法の一つとして、FCSRT(Free and Cued Selective Remaining Test)が確立されている。FCSRTは、高次脳機能のうちの記憶機能、特にエピソード記憶に関する記憶機能の検査法として使用されている。しかしながら、認知症専門医や臨床心理士による定期的検査及び患者の定期的通院が必要なこと、被測定者の気分、体調、やる気などにより点数が左右されることなどから、さらに簡便で客観的な検査法や指標の開発が求められている。また、認知症診断においては脳脊髄液検査が有用とされているが侵襲性が課題となっており、低侵襲診断に応用可能な検査法や指標の開発も必要である。 Currently, FCSRT (Free and Cued Selective Remaining Test) has been established as one of testing methods for higher brain functions. FCSRT is used as a test method for memory function among higher brain functions, especially for memory function related to episodic memory. However, it is easier and more objective because it requires regular examinations by dementia specialists and clinical psychologists and regular hospital visits for patients, and the score is affected by the mood, physical condition, motivation, etc. of the subject. Development of inspection methods and indicators is required. Cerebrospinal fluid examination is considered useful in diagnosing dementia, but its invasiveness is a problem, and it is necessary to develop examination methods and indicators that can be applied to minimally invasive diagnosis.

一方、ヒトの消化管内には1000種類以上、100兆個以上の細菌が生息し、腸内細菌叢(フローラ)を形成している。腸内細菌叢の構成は、年齢、食習慣、疾病、微生物感染、ストレス、薬物投与等の種々の要因によって個人ごとに異なっている。最近の研究により、消化器疾患にとどまらず、代謝疾患、免疫疾患、精神疾患等、様々な疾患の発症機序に腸内細菌叢が関与していることが明らかにされつつある。特に、腸内細菌叢の構成が肥満や肥満に起因する代謝疾患と密接に関係している可能性が示唆されている。また、アルツハイマー病モデルマウスにビフィドバクテリウム・ブレーベを摂取させることにより認知機能が改善されたことが報告されているが(特許文献1)、外部から細菌を投与することによる効果を示しているに過ぎず、生体中の腸内細菌叢の構成と認知機能の関係を示すものではない。斯様に、腸内細菌叢の構成と認知機能の関係について詳細は明らかになっていない。 On the other hand, more than 1000 species and more than 100 trillion bacteria live in the human gastrointestinal tract, forming an intestinal flora. The composition of the intestinal microflora varies from individual to individual due to various factors such as age, dietary habits, disease, microbial infection, stress, and drug administration. Recent studies have revealed that the intestinal microbiota is involved in the pathogenesis of various diseases such as metabolic diseases, immune diseases, and psychiatric diseases, in addition to gastrointestinal diseases. In particular, it has been suggested that the composition of the intestinal flora is closely related to obesity and obesity-induced metabolic diseases. In addition, it has been reported that ingesting Bifidobacterium breve to Alzheimer's disease model mice improved cognitive function (Patent Document 1). However, it does not show the relationship between the composition of intestinal microflora in vivo and cognitive function. Thus, the details of the relationship between the composition of the gut microbiota and cognitive function have not been elucidated.

国際公開公報第2017/209156号International Publication No. 2017/209156

福井 俊哉、認知神経科学 (2010) 12: 156-164Toshiya Fukui, Cognitive Neuroscience (2010) 12: 156-164 藤井 俊勝、高次脳機能研究 (2010) 30(1): 19-24Toshikatsu Fujii, Advanced Brain Function Research (2010) 30(1): 19-24

本発明は、被験者の記憶機能を評価するための、客観的で、低侵襲的な方法を提供することに関する。 The present invention relates to providing an objective, minimally invasive method for assessing memory function in a subject.

本発明者らは、斯かる課題に鑑み検討したところ、腸内細菌叢における特定の属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率(属多様性)とFCSRTのスコアとの間に有意な相関又は相関傾向がみられること、被験者の生体試料中の該特定属の多様性を指標として記憶機能を測定することができることを見出した。 The present inventors have studied in view of such problems, and found that between the ratio of the number of bacterial species classified into a specific genus in the intestinal flora to the total number of bacterial species (genus diversity) and the FCSRT score It was found that a significant correlation or correlation tendency was observed, and that the diversity of the specific genus in the subject's biological sample could be used as an index to measure memory function.

すなわち、本発明は、以下の1)に係るものである。
1)被験者から採取された生体試料中のブラウティア(Blautia)属及びバクテロイデス(Bacteroides)属のそれぞれの属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率の1以上を測定する工程を含む、記憶機能の測定方法。
That is, the present invention relates to the following 1).
1) Including the step of measuring the ratio of the number of bacterial strains classified into the respective genera of the genus Blautia and the genus Bacteroides to the total number of bacterial strains in a biological sample collected from a subject to be 1 or more; Method for measuring memory function.

本発明の方法によれば、被験者の記憶機能を、低侵襲的、客観的に且つ簡便に検査することができ、記憶機能低下の早期変化を客観的に評価できる。 According to the method of the present invention, the memory function of a subject can be tested objectively and simply in a minimally invasive manner, and early changes in memory function decline can be objectively evaluated.

本発明において、「記憶機能」とは、情報を覚える「記銘」、脳に情報を維持する「保持」、情報を引き出す、すなわち思い出す「想起」の3つの機能からなる。
本発明における記憶機能は、FCSRT(Free and Cued Selective Reminding Test)により評価することができる。
FCSRTは記憶機能の検査として良く用いられており、記憶をヒントなしに想起する自由再生とヒントを手がかりに想起する手がかり再生により、記憶の記銘力、保持力、想起力を検査する手法である。FCSRTでは、まず学習段階として、異なるカテゴリーの4つの物品が描かれた4枚のカードを用い、16個の物品名を記憶してもらう。記憶後すぐに16個の物品名を想起してもらい、再生された個数を手がかり即時再生とする。介入課題の後、16個の物品名をヒントなしに想起してもらい(自由再生)、想起できない場合は、物品のカテゴリー名を提示し、それをヒントとして想起してもらい(手がかり再生)、それでも想起できない場合は、カテゴリー名と物品名を提示する。かかる試験を3回繰り返す。3回の試験で自由再生された個数の合計を自由再生合計とし、自由再生された個数と手がかり再生された個数の合計を手がかり遅延再生合計とし、(手がかり遅延再生合計-自由再生合計)/(48-自由再生合計)を手がかりインデックスとしてスコア化する。これらスコアは、記憶機能の指標として用いられる。具体的には、手がかり即時再生が記銘力、手がかり遅延再生合計が保持力、自由再生の回を追うごとの向上とそれに対応する手がかり再生の減少が想起力の指標となり得る。
In the present invention, the "memory function" consists of three functions: "memorization" for memorizing information, "retention" for maintaining information in the brain, and "recall" for retrieving information, that is, recalling information.
The memory function in the present invention can be evaluated by FCSRT (Free and Cued Selective Reminding Test).
FCSRT is often used as a test of memory function, and is a method to test the memory's ability to remember, retain, and recall by free recall, in which the memory is recalled without hints, and cued recall, in which the memory is recalled using hints as clues. . In the FCSRT, as a learning stage, 4 cards on which 4 articles of different categories are drawn are used, and 16 article names are memorized. Immediately after memorization, 16 product names are recalled, and the number of items reproduced is used as a clue for immediate reproduction. After the intervention task, participants were asked to recall 16 product names without hints (free recall). If unable to recall, provide the category name and product name. Such tests are repeated three times. The sum of the number of free recalls in three tests was defined as the total free recall, and the sum of the number of free recalled and the number of clues recalled was defined as the total of cue delayed recall, (total cue delayed recall - total free recall)/( 48-free recall total) is scored as the cue index. These scores are used as indices of memory function. Specifically, the immediate recall of cues can be used as an index of memory, the total of delayed recall of cues can be used as an index of retention, and the increase in free recall and the corresponding decrease in recall of cues can be used as an index of recall.

本発明において、「記憶機能の測定」とは、記憶機能の状態又は程度、記憶機能障害の有無の測定を含み、好ましくは、記憶機能の状態の測定である。
ここで、「測定」は、「検出」、「検査」、「判定」、「評価」又は「評価支援」という用語で言い換えることもできる。なお、本明細書において「判定」又は「評価」という用語は、医師による判定や評価を含むものではない。
In the present invention, "measurement of memory function" includes measurement of the state or degree of memory function and the presence or absence of memory dysfunction, preferably measurement of the state of memory function.
Here, "measurement" can also be interchanged with the terms "detection", "inspection", "determination", "evaluation" or "evaluation aid". In addition, the term "judgment" or "evaluation" used herein does not include judgment or evaluation by a doctor.

本発明において、「腸内細菌叢」とは、腸内フローラとも称される、消化管、特に大腸に存在する腸内細菌集団を意味する。腸内細菌叢は、典型的には、糞便の菌叢として測定することができる。 In the present invention, "intestinal flora" means an intestinal bacterial population present in the gastrointestinal tract, particularly the large intestine, also called intestinal flora. Intestinal flora can typically be measured as fecal flora.

本発明の記憶機能の測定方法は、被験者から採取された生体試料中の、ブラウティア(Blautia)属及びバクテロイデス(Bacteroides)属のそれぞれの属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率の1以上を測定する工程を含む。一実施形態において、本発明の方法は、被験者から採取された生体試料中のビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率を測定する工程をさらに含んでいてもよい。 The method for measuring memory function of the present invention is the ratio of the number of bacterial species classified into each of the genera Blautia and Bacteroides to the total number of bacterial species in a biological sample collected from a subject. including measuring one or more. In one embodiment, the method of the present invention further comprises the step of measuring the ratio of the number of bacterial species classified to the genus Bifidobacterium to the total number of bacterial species in a biological sample collected from a subject. You can

本発明において、被験者は特に限定されないが、例えば、加齢にともない記憶機能が低下する中高年齢以上のヒト、記憶機能に特徴的な自覚症状(例えば、新しい出来事を覚えることができない、覚えたはずの出来事をすぐに忘れる、覚えていた出来事を思い出すことができない等)を有するヒト、記憶機能の低下が疑われるヒト等が挙げられる。 In the present invention, the subject is not particularly limited. (e.g., forgetting events immediately, unable to recall previously remembered events, etc.), and people suspected of having impaired memory function.

本発明において、生体試料としては、被験者の腸内細菌が含まれる検体、例えば、糞便や腸管内容物等が挙げられるが、採取容易性及び被験者に対する負担軽減の点から糞便を用いるのが好ましい。 In the present invention, the biological sample includes a specimen containing intestinal bacteria of a subject, such as stool and intestinal contents. From the viewpoint of ease of collection and reduction of the burden on the subject, it is preferable to use stool.

本発明において、生体試料中のある属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率としては、次式:〔ある属に分類される菌種数/総菌種数〕×100(%)により算出される値が好ましく用いられる。斯かる値は、生体試料が由来する被験者の腸内細菌叢における該ある属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率に相当し、該被験者の腸内細菌叢における該ある属の多様性(属多様性)を示すものである。ここで、ある属の多様性が高いとは、腸内細菌叢に該ある属に分類される細菌の種類が多く存在していることを示しており、ある属の多様性の値が大きい程、腸内細菌叢に該ある属に分類される菌種が多様に存在していることになる。 In the present invention, the ratio of the number of bacterial species classified into a certain genus in the biological sample to the total number of bacterial species is calculated by the following formula: [number of bacterial species classified into a certain genus/total number of bacterial species] × 100 (% ) is preferably used. Such a value corresponds to the ratio of the number of bacterial species classified into the genus in the intestinal flora of the subject from whom the biological sample is derived to the total number of bacterial species, and the number of the genus in the intestinal flora of the subject. It shows diversity (genus diversity). Here, the high diversity of a certain genus indicates that there are many types of bacteria classified into that genus in the intestinal flora. , the intestinal microflora contains a variety of bacterial species classified into a certain genus.

生体試料中のある属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率を測定する手段は、特に限定されないが、好適には、16S rRNA遺伝子の塩基配列に基づいて、生体試料中の菌種を解析する方法が挙げられる。
以下、16S rRNA遺伝子の塩基配列に基づいて生体試料中の菌種を分類、同定する方法を説明する。
Although the means for measuring the ratio of the number of bacterial species classified into a certain genus in a biological sample to the total number of bacterial species is not particularly limited, it is preferable to measure the number of bacterial species in the biological sample based on the base sequence of the 16S rRNA gene. A method of analyzing species is included.
A method for classifying and identifying bacterial strains in a biological sample based on the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene will be described below.

1)生体試料からのゲノムDNAの抽出
被験者から採取された生体試料について、公知の溶菌酵素法(BMC Microbiol.,2004,4:16)やビーズ法(Science, 2008,320,1647-1651)等により、核酸を遊離させた後、DNAの分離抽出法として知られている公知の方法、例えば、フェノール-クロロホルム法(Mol.Biol.,1986,191,615-624)やグアニジン法(Science,2005,308:1635-1638)等の汎用法を採用することにより細菌ゲノムDNAの抽出が行われる。
1) Extraction of genomic DNA from biological samples For biological samples collected from subjects, known bacteriolytic enzyme method (BMC Microbiol., 2004, 4:16), bead method (Science, 2008, 320, 1647-1651), etc. After releasing the nucleic acid, known methods known as DNA separation and extraction methods, such as the phenol-chloroform method (Mol. Biol., 1986, 191, 615-624) and the guanidine method (Science, 2005, 308 : 1635-1638) are employed to extract bacterial genomic DNA.

2)ゲノムDNA中の16S rRNA遺伝子の配列決定
次に、抽出した細菌ゲノムDNAに含まれる16S rRNA遺伝子の配列が決定される。すなわち、各菌種に特徴的な16S rRNA遺伝子の配列が決定され、その配列データに基づいて腸内細菌叢の構造が解析される。このため、該菌叢構造を反映するように、配列決定を行うべき16S rRNA遺伝子の領域を選択する必要があるが、迅速に解析を行い、配列の読み取りエラーを排除すべく、各菌種の配列の特徴が反映される限り、短い領域の配列を決定して比較することが望ましい。
配列決定を行うべき16S rRNA遺伝子の領域は、PCRによって増幅されるが、この場合のプライマーは、菌種間で普遍的に保存されている領域に設定することが好ましい。斯かるプライマーとしては、これらに限定されるものではないが、例えば表1に示すものが挙げられ、ForwardとReverseを所望の領域が増幅されるように適宜組み合わせて用いることができる(BMC Microbiology, 2012, 12:66)。
2) Sequencing of 16S rRNA gene in genomic DNA Next, the sequence of the 16S rRNA gene contained in the extracted bacterial genomic DNA is determined. That is, the sequence of the 16S rRNA gene characteristic to each bacterial species is determined, and the structure of the intestinal flora is analyzed based on the sequence data. Therefore, it is necessary to select the region of the 16S rRNA gene to be sequenced so as to reflect the bacterial flora structure. As long as the features of the sequences are reflected, it is preferable to determine and compare the sequences of short regions.
The region of the 16S rRNA gene to be sequenced is amplified by PCR, and the primers in this case are preferably set to regions that are universally conserved among bacterial strains. Examples of such primers include, but are not limited to, those shown in Table 1. Forward and reverse can be used in appropriate combination so that the desired region is amplified (BMC Microbiology, 2012, 12:66).

Figure 2023104355000001
Figure 2023104355000001

増幅されたPCR産物を精製後、配列決定が行われる。配列決定は既知の如何なる方法をも用いることができるが、例えば、次世代型超高速シークエンス装置、例えば、MiSeq(Illumina社)等を使用すると、迅速に配列決定することができる。
細菌の16S rRNA遺伝子上には、塩基配列が菌種間で保存されずに、変化に富む領域(V1~V9)が存在することが知られている。したがって、斯かる領域の少なくとも1つ、例えば、V1及びV2を含む領域、又はV3及びV4を含む領域の塩基配列を決定することが望ましい。V1及びV2を含む領域は、例えば、27F及び338Rのプライマーセットにより増幅することができ、V3及びV4を含む領域は、例えば、338F及び907Rのプライマーセットにより増幅することができる。
After purification of the amplified PCR products, sequencing is performed. Any known method can be used for sequencing. For example, rapid sequencing can be achieved by using a next-generation ultra-high-speed sequencing device such as MiSeq (Illumina).
It is known that the 16S rRNA gene of bacteria has a highly variable region (V1 to V9) whose base sequence is not conserved among bacterial strains. Therefore, it is desirable to determine the nucleotide sequence of at least one such region, eg, the region containing V1 and V2, or the region containing V3 and V4. A region containing V1 and V2 can be amplified, for example, with a primer set of 27F and 338R, and a region containing V3 and V4 can be amplified, for example, with a primer set of 338F and 907R.

取得された配列データの解析は、得られた塩基配列のデータ群について、Qiime(Quantitative Insights Into Microbial Ecology)等の解析ソフトを用いて行うことができ、配列からの菌種の同定は、The Ribosomal Database Project(Lan, Y et al, Using the RDP classifier to predict taxonomic novelty and reduce the search space for finding novel organisms. PLoS One 2012. 7:e32491.)の体系に従って行うことができる。また、微生物同定データベース(テクノスルガ・ラボ社)、NCBI nucleatide database、NCBI 16S microbial rRNA database、Greengenes database、SILVAといった遺伝子配列データベースに対するBLAST アルゴリズムを用いた相同性検索によっても可能である(J.Mol.Biol.,1990,215(3):403-410)。
配列データの解析において、特定の菌種の塩基配列と少なくとも97%の同一性を有する塩基配列データが少なくとも1コピーあれば、該特定の菌種(又は近縁種)が存在すると判断することができる。
Analysis of the obtained sequence data can be performed using analysis software such as Qiime (Quantitative Insights Into Microbial Ecology) for the data group of the obtained base sequence. It can be performed according to the system of Database Project (Lan, Y et al, Using the RDP classifier to predict taxonomic novelty and reduce the search space for finding novel organisms. PLoS One 2012. 7:e32491.). It is also possible by homology search using the BLAST algorithm against gene sequence databases such as microorganism identification database (Techno Suruga Labo), NCBI nucleotide database, NCBI 16S microbial rRNA database, Greengenes database, and SILVA (J. Mol. Biol., 1990, 215(3):403-410).
In sequence data analysis, if there is at least one copy of nucleotide sequence data that has at least 97% identity with the nucleotide sequence of a specific bacterial strain, it can be determined that the specific bacterial strain (or related species) exists. can.

本明細書において、塩基配列に関する「少なくとも97%の同一性」とは、97%以上、好ましくは98%以上、より好ましくは99%以上、さらに好ましくは100%の同一性をいう。 As used herein, "at least 97% identity" with respect to nucleotide sequences means identity of 97% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or more, and still more preferably 100%.

後記実施例に示すとおり、ブラウティア属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率(すなわち、ブラウティア属の多様性)は、記憶機能の検査として汎用されているFCSRTのスコアと良好な相関関係あるいは相関する傾向が認められた。すなわち、FCSRTの手がかりインデックススコアは、ブラウティア属の多様性と有意に正に相関し、手がかり遅延再生合計スコアは、ブラウティア属の多様性と正に相関する傾向を有する。バクテロイデス属の多様性は、FCSRTスコアと相関する傾向が認められた。すなわち、FCSRTの自由再生合計スコアは、バクテロイデス属の多様性と正に相関する傾向を有する。ビフィドバクテリウム属の多様性は、FCSRTスコアと良好な相関関係あるいは相関する傾向が認められた。すなわち、FCSRTの手がかり即時再生スコア及び手がかり遅延再生合計スコアは、それぞれ、ビフィドバクテリウム属の多様性と有意に正に相関し、手がかりインデックススコアは、ビフィドバクテリウム属の多様性と正に相関する傾向を有する。
また、これら3属の多様性を説明変数とし、手がかり即時再生スコア及び手がかり遅延再生合計スコアのそれぞれを目的変数として重回帰分析を行ったところ、有意な回帰式が得られた。
したがって、被験者の生体試料中のブラウティア属及びバクテロイデス属のそれぞれの属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率の1以上を測定し、それを基準値と比較することにより、当該被験者の記憶機能を測定できる。また、さらに、ビフィドバクテリウム属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率を測定し、それを基準値と比較することにより、当該被験者の記憶機能をより精度よく測定できる。
As shown in the examples below, the ratio of the number of bacterial species classified to the genus Brautia to the total number of bacterial species (that is, the diversity of the genus Brautia) has a good correlation with the score of FCSRT, which is widely used as a test of memory function. A relationship or correlation trend was observed. That is, FCSRT cued index scores tend to be significantly positively correlated with Brautia diversity, and cued delayed recall total scores tend to be positively correlated with Brautia diversity. Bacteroides diversity tended to correlate with FCSRT scores. That is, the FCSRT free-reproduction total score tends to be positively correlated with Bacteroidetes diversity. Bifidobacterium diversity was well correlated or tended to correlate with FCSRT scores. That is, the FCSRT cued immediate recall score and cued delayed recall total score were each significantly positively correlated with Bifidobacterium diversity, and the cued index score was positively correlated with Bifidobacterium diversity. tend to correlate.
In addition, multiple regression analysis was performed using the diversity of these three genera as an explanatory variable and the cue immediate recall score and cue delayed recall total score as objective variables, and a significant regression equation was obtained.
Therefore, by measuring 1 or more of the ratio of the number of bacterial species classified into each genus of Brautia and Bacteroides to the total number of bacterial species in the biological sample of the subject and comparing it with the reference value, the subject can measure the memory function of Furthermore, by measuring the ratio of the number of bacterial species classified into the genus Bifidobacterium to the total number of bacterial species and comparing it with a reference value, the memory function of the subject can be measured with higher accuracy.

多様性算出の対象となる腸内細菌属は、ブラウティア属及びバクテロイデス属から選択される1以上の属であればよい。また、測定精度の観点から、ブラウティア属及びバクテロイデス属から選択される1以上の属に加えてビフィドバクテリウム属について多様性を算出することが好ましく、ブラウティア属、バクテロイデス属及びビフィドバクテリウム属の3属について多様性を算出することがより好ましい。2以上の属の多様性を算出する場合、各々の属について多様性を算出すればよい。 The enteric bacterium genus that is the target of diversity calculation may be one or more genera selected from the genus Brautia and the genus Bacteroides. Also, from the viewpoint of measurement accuracy, it is preferable to calculate diversity for Bifidobacterium in addition to one or more genera selected from Brautia and Bacteroides, Brautia, Bacteroides and Bifidobacterium It is more preferable to calculate the diversity for the three genera. When calculating the diversity of two or more genera, the diversity should be calculated for each genus.

基準値は、例えば、上記属の多様性と記憶機能の状態との関連づけから以下のように設定することができる。
記憶機能の状態をFCSRTにより評価する。その評価結果に基づき、記憶機能が正常と判断される被験体から構成される健常群と、記憶機能が低いと判断される被験体から構成される記憶機能障害群を作成する。これとは別途、前述の方法により上記属の多様性を算出する。そして記憶機能の評価結果と上記属の多様性との相関性に基づき、記憶機能の状態を評価するのに適した基準値が決定される。具体的には、各群に属するヒトの上記属の多様性の統計解析結果に基づき、各群を特徴づける上記属の多様性の数値範囲を決定する。この数値範囲は、各群の平均値を中心とした上下の一定範囲に設定することにより決定する。ここで「一定範囲」とは、標準偏差(SD)等の統計数値や、1/2SD値、1/3SD値などを用いてもよいし、予め設定した任意の数値を用いてもよい。又は各群の中央値を中心とした上下の一定範囲に設定することもできる。ここで「一定範囲」とは、第1四分位点や第3四分位点などを用いてもよいし、予め設定した任意の数値を用いてもよい。
2以上の属の多様性を算出する場合は、各々の属について基準値を設定することが好ましい。
そして、例えば、被験者から得られた上記属の多様性が記憶機能障害群の上記属の多様性の範囲内に属する場合には、当該被験者は「記憶機能が低下している」、「記憶機能障害がある」又は「記憶機能障害がある可能性が高い」と評価できる。
For example, the reference value can be set as follows based on the relationship between the diversity of the genus and the state of memory function.
The status of memory function is assessed by FCSRT. Based on the evaluation results, a healthy group consisting of subjects judged to have normal memory function and a memory impairment group consisting of subjects judged to have poor memory function are created. Separately, the diversity of the genus is calculated by the method described above. Then, based on the correlation between the evaluation result of memory function and the diversity of the genus, a reference value suitable for evaluating the state of memory function is determined. Specifically, based on the results of statistical analysis of the diversity of the genera of humans belonging to each group, the numerical range of the diversity of the genera that characterizes each group is determined. This numerical range is determined by setting a certain range above and below the average value of each group. Here, the "fixed range" may be a statistical value such as standard deviation (SD), a 1/2 SD value, a 1/3 SD value, or the like, or may be an arbitrary numerical value set in advance. Alternatively, it can be set within a certain range above and below the median value of each group. Here, the “fixed range” may be the first quartile, the third quartile, or the like, or may be an arbitrary numerical value set in advance.
When calculating the diversity of two or more genera, it is preferable to set a reference value for each genera.
Then, for example, when the diversity of the genus obtained from the subject belongs to the range of the diversity of the genus of the memory impairment group, the subject has "decreased memory function", "memory function It can be evaluated as "possible memory impairment" or "high possibility of memory impairment".

斯くして、本発明の方法によれば、被験者の記憶機能の状態や程度を、非侵襲で、簡便かつ的確に評価することができる。 Thus, according to the method of the present invention, the state and degree of memory function of a subject can be evaluated noninvasively, simply, and accurately.

以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically by showing examples.

試験例 FCSRTにより評価された記憶機能と腸内細菌の多様性の相関解析
〔1.試験概要〕
(試験手順)
65歳以上75歳未満の男女40名(平均年齢69±4歳)を対象に、記憶機能の評価としてFCSRTの測定を行った。また、記憶機能の測定の前日又は当日に採便キット(テクノスルガ・ラボ社)を用いて糞便を採取した。DNA抽出及びシーケンス解析はテクノスルガ・ラボ社に委託し、糞便中の菌種を同定した。同定された菌種から各菌属の多様性(属多様性)を算出し、FCSRTのスコア(手がかりインデックス、自由再生合計、手がかり即時再生、手がかり遅延再生合計)との関連性を解析した。本明細書における腸内細菌の属多様性とは、試料に含まれる総菌種数の中で、特定の属に分類される菌種が存在する割合を表している。つまり、属多様性が高いとは、試料の中に含まれるある種の属に分類される菌種の種類が多く存在していることを示しており、属多様性の値が大きいことは、すなわちその属に分類される菌種が多様に存在していることを示す指標となる。
Test example Correlation analysis between memory function evaluated by FCSRT and diversity of intestinal bacteria
[1. Test overview]
(Procedure of test)
Forty males and females aged 65 to 75 (average age 69±4) were subjected to FCSRT measurement to evaluate memory function. In addition, stool was collected using a stool collection kit (Techno Suruga Labo, Inc.) on the day before or on the day of measurement of memory function. DNA extraction and sequence analysis were entrusted to Technosuruga Labo, Inc., and the bacterial strains in feces were identified. The diversity of each genus (genus diversity) was calculated from the identified bacterial species, and the relationship with FCSRT scores (cue index, total free recall, immediate cue recall, total cue delayed recall) was analyzed. The genus diversity of intestinal bacteria as used herein refers to the ratio of bacterial species classified into a specific genus to the total number of bacterial species contained in a sample. In other words, a high genus diversity indicates that there are many types of fungal species classified into a certain genus contained in the sample. In other words, it serves as an indicator of the existence of a variety of fungal species classified into that genus.

(DNA抽出)
採取した糞便は保存液中で保管し、テクノスルガ・ラボ社へ輸送し、DNA精製装置(GENE PREP STAR PI-480、倉敷紡績社)によりDNA抽出を実施した。
(DNA extraction)
The collected feces were stored in a preservative solution, transported to Technosuruga Labo, Inc., and subjected to DNA extraction using a DNA purifier (GENE PREP STAR PI-480, Kurashiki Boseki Co., Ltd.).

(シーケンス解析)
16S rDNA V3~V4領域を解析対象としPCRを行い、次世代シーケンサーMiSeq(Illumina社)により配列決定、テクノスルガ・ラボ社の微生物同定データベースを用いて解析を行った。
(sequence analysis)
The 16S rDNA V3-V4 region was subjected to PCR, sequence determination was performed using the next-generation sequencer MiSeq (Illumina), and analysis was performed using Techno Suruga Lab's microorganism identification database.

(各菌属の多様性の算出)
シーケンス解析結果より各菌属の多様性(当該属に属する種の多寡を示す値、〔サンプル中の属内の菌種数/総菌種数〕×100(%))を算出し、解析対象40名において多様性の平均値が1%を超える20属を相関解析の対象とした。
(Calculation of diversity of each fungal genus)
From the results of sequence analysis, the diversity of each bacterial genus (value indicating the amount of species belonging to the genus, [number of bacterial species within the genus in the sample/total number of bacterial species] × 100 (%)) is calculated and analyzed. Twenty genera with an average diversity exceeding 1% in 40 individuals were included in the correlation analysis.

(データ解析)
測定されたFCSRTのスコアと各菌属の多様性について、スピアマンの順位相関分析及び重回帰分析を行った(統計解析ソフトはSPSS 24.0を使用)。
(data analysis)
Spearman's rank correlation analysis and multiple regression analysis were performed on the measured FCSRT score and the diversity of each fungal genus (SPSS 24.0 was used as statistical analysis software).

〔2.結果〕
相関分析の結果、20属中3属(ブラウティア属、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属)の多様性とFCSRTのスコアとの間に有意な相関(P<0.05)又は相関傾向(P<0.1)があることが明らかになった(表1)。またこれら3属の多様性を説明変数、FCSRTのスコア(手がかり即時再生、手がかり遅延再生合計)を目的変数とし重回帰分析を行った結果、有意な回帰式が得られた。重回帰モデルの自由度調整済み重相関係数を表2に示す。FCSRTは記憶機能の指標として用いられるテストであることから、これら3属の多様性は記憶機能評価のマーカーとなることが示された。
[2. result〕
As a result of correlation analysis, there was a significant correlation (P < 0.05) or a tendency to correlate (P < 0.1) (Table 1). Multiple regression analysis was performed using the diversity of these three genera as an explanatory variable and the FCSRT score (immediate cue recall, total delayed cue recall) as an objective variable, resulting in a significant regression equation. Table 2 shows the multiple correlation coefficient adjusted for degrees of freedom of the multiple regression model. Since the FCSRT is a test used as an index of memory function, it was shown that the diversity of these three genera serves as a marker for evaluating memory function.

Figure 2023104355000002
Figure 2023104355000002

Claims (4)

被験者から採取された生体試料中のブラウティア属及びバクテロイデス属のそれぞれの属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率の1以上を測定する工程を含む、記憶機能の測定方法。 A method for measuring memory function, comprising the step of measuring a ratio of the number of bacterial strains classified into each of the genera Brautia and Bacteroides to the total number of bacterial strains in a biological sample collected from a subject. さらにビフィドバクテリウム属に分類される菌種数の総菌種数に対する比率が測定される、請求項1記載の方法。 2. The method according to claim 1, further comprising measuring the ratio of the number of bacterial species classified into the genus Bifidobacterium to the total number of bacterial species. ブラウティア属、バクテロイデス属及びビフィドバクテリウム属のそれぞれに分類される菌種数の総菌種数に対する比率が測定される、請求項1又は2記載の方法。 3. The method according to claim 1 or 2, wherein the ratio of the number of bacterial species classified into each of the genera Brautia, Bacteroides and Bifidobacterium to the total number of bacterial species is measured. 被験者から採取された生体試料が糞便試料である、請求項1~3のいずれか1項記載の方法。
The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the biological sample collected from the subject is a stool sample.
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