JP2023100385A - Composition for activating ppar and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
特許法第３０条第２項適用申請有り 令和３年１月２８日に、令和２年度北海道大学大学院農学研究院学位論文公開発表会学位論文要旨にて公開した。 令和３年１月２８日に、令和２年度北海道大学大学院農学研究院学位論文公開発表会にて公開した。 令和３年３月２５日に、北海道大学大学院農学院応用生物科学専攻博士後期課程学位論文にて公開した。 令和３年４月１０日に、国立研究開発法人科学技術振興機構のウェブサイトｒｅｓｅａｒｃｈｍａｐにて公開した。 令和３年９月１４日に、国立研究開発法人産業技術総合研究所生物プロセス研究部門の成果発表に関するウェブサイトにてにて公開した。Applied for application of
本発明は、ピネリン酸を含むPPAR活性化用組成物、被験試料のPPAR活性化能を評価する方法、PPAR活性化能が高められた植物を製造する方法、及びピネリン酸の相対的含有量が向上した組成物を製造する方法に関する。 The present invention provides a composition for activating PPAR containing pinelic acid, a method for evaluating the ability of a test sample to activate PPAR, a method for producing a plant with enhanced ability to activate PPAR, and a relative content of pinelic acid. It relates to a method of making improved compositions.
PPAR（ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体、Peroxisome Proliferator Activated Receptor）は、糖代謝及び脂質代謝に関与する遺伝子の発現を調節する転写因子として作用する核内受容体である。PPARにはPPARα、PPARδ及びPPARγの3つのアイソフォームが存在する。PPARαは、脂質代謝に関与する遺伝子の発現を制御する機能を有しており、PPARαを活性化するPPARαアゴニストは、脂肪酸の燃焼を亢進させて血中トリグリセリド濃度を低下させ、さらにHDLコレステロールを増加させることから、脂質代謝異常の治療に使用されている。またPPARγは、脂肪細胞の分化及び糖代謝に関与する遺伝子の発現を制御する機能を有しており、PPARγを活性化するPPARγアゴニストは、インスリン感受性を亢進させて血糖値を低下させることから、糖代謝異常、特に２型糖尿病の治療に使用されている。
PPAR (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) is a nuclear receptor that acts as a transcription factor regulating the expression of genes involved in glucose and lipid metabolism. There are three isoforms of PPAR, PPARα, PPARδ and PPARγ. PPARα has the function of regulating the expression of genes involved in lipid metabolism, and PPARα agonists that activate PPARα promote the burning of fatty acids, lower blood triglyceride levels, and increase HDL cholesterol. Therefore, it is used in the treatment of dyslipidemia. In addition, PPARγ has the function of regulating the expression of genes involved in adipocyte differentiation and glucose metabolism. It is used to treat glucose metabolism disorders, especially
近年、PPARαアゴニスト活性とPPARγアゴニスト活性の両方を併せ持つPPARα/γアゴニストが注目されている。PPARα/γアゴニストは、PPARαによる脂質代謝改善とPPARγによる血糖値低下の両方を実現することができる治療薬として、肥満を伴う２型糖尿病患者の治療への応用が期待されており、様々な化合物の開発が進められている（非特許文献１）。
In recent years, attention has been paid to PPARα/γ agonists having both PPARα agonist activity and PPARγ agonist activity. PPARα/γ agonists are expected to be applied to the treatment of
また、食品に含有されている成分にも、PPARα/γアゴニスト活性を有するものが報告されており（例えば特許文献１及び２等）、これらの食品成分を、医薬としてのみならず、脂質代謝異常と糖代謝異常の両方の予防や改善に高い効果を有する飲食品として利用することも期待されている。
In addition, some ingredients contained in foods have also been reported to have PPARα/γ agonist activity (e.g.,
本発明は、医薬のみならず飲食品として利用可能な、PPARアゴニスト活性を有する物質を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a substance having a PPAR agonistic activity that can be used not only as a medicine but also as food and drink.
本発明者らは、トリヒドロキシ脂肪酸の一種であるピネリン酸（(9S,10E,12S,13S)-9,12,13-トリヒドロキシ-10-オクタデセン酸）が、PPARαアゴニスト活性（以下、PPARα活性化能ともいう）とPPARγアゴニスト活性（以下、PPARγ活性化能ともいう）の両方を併せ持つPPARα/γアゴニストであることを見出した。 The present inventors have found that pinelic acid ((9S,10E,12S,13S)-9,12,13-trihydroxy-10-octadecenoic acid), a kind of trihydroxy fatty acid, has PPARα agonist activity (hereinafter referred to as PPARα activity The present inventors have found that it is a PPARα/γ agonist having both PPARγ agonist activity (hereinafter also referred to as PPARγ activation ability) and PPARγ agonist activity (hereinafter also referred to as PPARγ activation ability).
したがって、以下の発明が提供される。
項１．
ピネリン酸を含む、PPARα及びPPARγの活性化用組成物。
項２．
飲食品組成物、医薬組成物又は医薬部外品組成物である、項１に記載の組成物。
項３．
被験試料中のピネリン酸含有量を指標とした、被験試料のPPARα及びPPARγ活性化能を評価する方法。
項４．
植物体又は植物体の部分に対してピネリン酸産生を増強させるための処理を行う工程を含む、PPARα及びPPARγの活性化能が高められた植物を製造する方法。
項５．
ピネリン酸産生を増強させるための処理が、植物体若しくは植物体の部分に含まれる植物細胞内にピネリン酸生合成酵素をコードする核酸を導入する処理、又は植物体若しくは植物体の部分に含まれる植物細胞内でピネリン酸生合成酵素をコードする内因性遺伝子の発現を増強させる処理である、項４に記載の方法。
項６．
植物体又は植物体の部分に対して突然変異誘発処理を行う工程、
突然変異誘発処理後の植物体若しくは植物体の部分、又はこれらを栽培若しくは培養することによって得られた植物体若しくは植物体の部分に対して、細胞破壊処理又は酸化ストレス処理を行う工程、及び
細胞破壊処理又は酸化ストレス処理後の植物体又は植物体の部分を含む試料中のピネリン酸濃度を、対照濃度と比較する工程
を含む、PPARα及びPPARγの活性化能が高められた植物を製造する方法。
項７．
フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する組成物を、水性媒体中で疎水性担体と接触させる工程、
疎水性担体に吸着した物質をメタノールで溶出する工程、
メタノール溶出液を濃縮後、n-ブタノール中でシリカゲルと接触させる工程、
シリカゲルに吸着した物質を、アルカリ性のn-ブタノール水溶液で溶出する工程、及び
アルカリ性のn-ブタノール水溶液による溶出液を回収する工程
を含む、フラボノール類又はその配糖体に対するピネリン酸の相対的含有量が向上したPPARα及びPPARγの活性化用組成物を製造する方法。
項８．
フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する組成物が、フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する植物体又は植物体の部分に対して細胞破壊処理を行った後、水性媒体で抽出することによって得られる組成物である、項７に記載の方法。
項９．
細胞破壊処理が、フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する植物体、植物体の部分又はそれらの破砕物を凍結乾燥する処理である、項８に記載の方法。
項１０．
フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する植物体又は植物体の部分が、タマネギ又はその可食部である、項８又は９に記載の方法。
項１１．
フラボノール類又はその配糖体が、ケルセチン又はその配糖体である、項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
Accordingly, the following inventions are provided.
A composition for activating PPARα and PPARγ, containing pinelic acid.
A method for evaluating the ability of a test sample to activate PPARα and PPARγ, using the content of pinelic acid in the test sample as an index.
A method for producing a plant having an enhanced ability to activate PPARα and PPARγ, comprising the step of treating a plant body or a part of a plant body to enhance pinelic acid production.
A treatment for enhancing pinelic acid production is a treatment of introducing a nucleic acid encoding a pinelic acid biosynthetic enzyme into a plant cell contained in a plant body or a part of a plant body, or a treatment contained in a plant body or a part of a plant body.
subjecting the plant or plant part to mutagenesis treatment;
a step of subjecting a plant body or a plant body part after a mutagenesis treatment, or a plant body or a plant body part obtained by cultivating or culturing the same, to a cell destruction treatment or an oxidative stress treatment; A method for producing a plant with enhanced ability to activate PPARα and PPARγ, comprising the step of comparing the concentration of pinelic acid in a sample containing a plant body or plant part after destruction treatment or oxidative stress treatment with a control concentration. .
contacting a composition containing flavonols or their glycosides and pinellinic acid with a hydrophobic carrier in an aqueous medium;
a step of eluting the substance adsorbed on the hydrophobic carrier with methanol;
concentrating the methanol eluate and then contacting it with silica gel in n-butanol;
Relative content of pinellinic acid to flavonols or their glycosides, including a step of eluting substances adsorbed on silica gel with an alkaline aqueous n-butanol solution, and a step of recovering the eluate from the alkaline aqueous n-butanol solution. A method for producing a composition for activating PPARα and PPARγ with improved
A composition containing flavonols or their glycosides and pinellinic acid is added to an aqueous medium after subjecting a plant or plant body containing flavonols or its glycosides and pinellinic acid to cell disruption treatment.
Item 11.
Item 11. The method according to any one of
本発明によると、PPARα及び/又はPPARγの活性化が有効な疾患又は状態を処置することができ、また前記処置のための組成物やその原料となる植物を製造することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, diseases or conditions for which PPARα and/or PPARγ activation are effective can be treated, and compositions for such treatments and plants as raw materials thereof can be produced.
以下の説明は、代表的な実施形態又は具体例に基づくことがあるが、本発明はそのような実施形態又は具体例に限定されるものではない。 Although the following description may be based on representative embodiments or examples, the invention is not limited to such embodiments or examples.
本開示は、ピネリン酸を有効成分として含む、PPARα及びPPARγの活性化用組成物（以下、PPARα/γ活性化用組成物とも呼ぶ）を提供する。 The present disclosure provides a composition for activating PPARα and PPARγ (hereinafter also referred to as a composition for activating PPARα/γ) containing pinelic acid as an active ingredient.
ピネリン酸は、9,12,13-トリヒドロキシ-10-オクタデセン酸の８つの光学異性体のうちの１つであり、下記式（Ｉ）に示される構造を有する。
ピネリン酸は、多くの植物において産生されることが知られている。植物におけるピネリン酸の生合成経路を下記式（ＩＩ）に示す（Hamberg M. et al., Lipids 2011, vol. 46, pp. 873-878）。植物が損傷や酸化ストレス等の刺激を受けると、9-リポキシゲナーゼが活性化され、リノール酸を基質として9(S)-ヒドロペルオキシ-10(E),12(Z)-オクタデカジエノン酸（9(S)-HPODE）が産生される。9(S)-HPODEはエポキシアルコール合成酵素によって12,13-エポキシ-9-ヒドロキシ-10-オクタデセノエートに変換され、さらにエポキシド加水分解酵素によってピネリン酸に変換される。
ピネリン酸はPPARα活性化能及びPPARγ活性化能を有することから、ピネリン酸を含有する組成物は、PPARα及びPPARγの活性化のために用いることができる。PPARα活性化能及びPPARγ活性化能は、いずれも公知の方法を用いて確認することができる。そのような方法の例としては、PPARα又はPPARγのリガンド結合領域とGAL4との融合タンパクに対する結合をルシフェラーゼの発現で評価するレポーターアッセイ（Forman B. M. et al., Cell, 1995, vol. 83, issue 5, pp. 803-812）、PPARα又はPPARγのリガンド結合領域を含むタンパクを用いたコンペティションバインディングアッセイ（Kliewer S. A. et al., Cell, 1995, vol. 83, issue 5, pp. 813-819）等を挙げることができる。
Since pinelic acid has the ability to activate PPARα and PPARγ, a composition containing pinelic acid can be used for activating PPARα and PPARγ. Both PPARα activation ability and PPARγ activation ability can be confirmed using known methods. Examples of such methods include a reporter assay (Forman B. M. et al., Cell, 1995, vol. 83,
PPARα/γ活性化用組成物は、例えばShirahataらの方法（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2003, vol. 13, no. 5, pp. 937-941）に記載された方法に従って化学合成されたピネリン酸を用いて調製することができる。PPARα/γ活性化用組成物はまた、例えばNagaiらの方法（International Immunopharmacology, 2002, 2, pp. 1183-1193）に従って生薬の半夏から抽出したピネリン酸を用いて調製することもできる。さらに、上記のようにピネリン酸は多くの植物で産生されることから、これらの植物を原料としてPPARα/γ活性化用組成物を調製することもできる。植物から調製されるPPARα/γ活性化用組成物の一つの例は、後述のフラボノール類又はその配糖体に対するピネリン酸の相対的含有量が向上した組成物である。 The composition for activating PPARα/γ is, for example, a method described by Shirahata et al. (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2003, vol. 13, no. 5, pp. 937-941). can be prepared using A composition for activating PPARα/γ can also be prepared, for example, using pinellinic acid extracted from the herbal medicine Hanji according to the method of Nagai et al. (International Immunopharmacology, 2002, 2, pp. 1183-1193). Furthermore, since pinelic acid is produced in many plants as described above, a composition for activating PPARα/γ can be prepared using these plants as raw materials. One example of a composition for activating PPARα/γ prepared from plants is a composition having an increased relative content of pinelic acid relative to flavonols or glycosides thereof, which will be described later.
PPARα/γ活性化用組成物は、インビトロ及びインビボで、PPARに関する研究のためのリサーチツールとして好適に用いることができる。 A composition for activating PPARα/γ can be suitably used as a research tool for research on PPAR in vitro and in vivo.
またPPARα/γ活性化用組成物は、インビボで、PPARα又はPPARγの活性化が有効な疾患又は状態の処置に、特にPPARα及びPPARγの両方の活性化が有効な疾患又は状態の処置に用いることができる。本開示において、疾患又は状態の処置とは、疾患又は状態の治療、寛解、改善又は予防を目的とする全ての介入を意味する。疾患又は状態の処置は、例えば、疾患又は状態の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止等を包含する。 In addition, the PPARα/γ activating composition can be used in vivo for the treatment of diseases or conditions in which activation of PPARα or PPARγ is effective, particularly in the treatment of diseases or conditions in which activation of both PPARα and PPARγ is effective. can be done. In the present disclosure, treatment of a disease or condition means any intervention aimed at curing, ameliorating, ameliorating or preventing the disease or condition. Treatment of a disease or condition includes, for example, slowing or arresting progression of the disease or condition, regression or disappearance of lesions, preventing onset or recurrence, and the like.
PPARαの活性化が有効な疾患又は状態としては、脂質代謝異常、例えば高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、内臓肥満、脂肪肝等を挙げることができ、PPARγの活性化が有効な疾患又は状態としては、糖代謝異常、例えば高血糖症、インスリン抵抗性、２型糖尿病等を挙げることができる。また、PPARα及びPPARγの両方の活性化が有効な疾患又は状態としては、脂質代謝異常と糖代謝異常の両方を伴う疾患又は状態、例えばメタボリックシンドローム、２型糖尿病を伴う糖尿病性脂質異常症等を挙げることができる。
Diseases or conditions for which activation of PPARα is effective include dyslipidemia such as hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, visceral obesity, fatty liver, etc. Diseases or conditions for which activation of PPARγ is effective Examples include glucose metabolism disorders such as hyperglycemia, insulin resistance,
さらに、PPARα及びPPARγは抗炎症作用、神経保護作用及び抗がん作用を有することから、PPARα/γ活性化用組成物は、炎症を伴う疾患又は状態、例えば慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患、創傷等の処置；神経変性又は損傷を伴う疾患又は状態、例えばアルツハイマー型認知症、パーキンソン病、脳梗塞等の処置；及びがんの処置に用いることもできる。 Furthermore, since PPARα and PPARγ have anti-inflammatory, neuroprotective and anticancer effects, the PPARα/γ activating composition can be used to treat diseases or conditions accompanied by inflammation, such as chronic inflammatory diseases, allergic diseases, Treatment of wounds, etc.; treatment of diseases or conditions associated with neurodegeneration or damage, such as Alzheimer's dementia, Parkinson's disease, cerebral infarction, etc.; and treatment of cancer.
PPARα/γ活性化用組成物は、飲食品組成物、医薬組成物又は医薬部外品組成物であり得る。飲食品組成物は、経口又は経管での摂取が可能なものであればよい。飲食品組成物は、ピネリン酸に加えて、他の飲食品成分や、飲食品への添加が許容される添加剤等の成分を含有することができる。本開示において、飲食品組成物は、飲料（飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）、調味料を含む一般的な加工食品、サプリメント、健康食品（機能性飲食品）、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）を幅広く含むものとして理解される。 The PPARα/γ activating composition can be a food/drink composition, a pharmaceutical composition, or a quasi-drug composition. The food and drink composition may be one that can be ingested orally or through a tube. The food/drink composition can contain, in addition to pinelic acid, other food/drink components and components such as additives that can be added to the food/drink. In the present disclosure, food and beverage compositions include beverages (including concentrated beverage concentrates and powders for preparation), general processed foods including seasonings, supplements, health foods (functional foods and beverages), foods with health claims (specified Foods for health use, foods with nutrient function claims, foods with function claims).
ある実施形態において、飲食品組成物は、脂質代謝異常及び／又は糖代謝異常の改善又はそれから科学的に導かれる好ましい作用が表示される保健機能食品（特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品）である。 In one embodiment, the food and drink composition is a food with health claims (food for specified health use, food with function claims, nutrition functional food).
飲食品組成物は、例えば、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類といった成分を添加して任意の形状の飲食品組成物として製造することができる。 Food and drink compositions include, for example, sugars such as dextrin and starch; proteins such as gelatin, soybean protein and corn protein; amino acids such as alanine, glutamine and isoleucine; polysaccharides such as cellulose and gum arabic; By adding components such as oils and fats such as fatty acid triglycerides, it is possible to produce food and drink compositions of any shape.
医薬組成物及び医薬部外品組成物は、ピネリン酸に加えて、薬学的に許容される添加剤、例えば緩衝剤、安定剤、保存剤、賦形剤等を含有することができる。薬学的に許容される添加剤は当業者に周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で適宜選択して使用することができる。 Pharmaceutical compositions and quasi-drug compositions can contain pharmaceutically acceptable additives such as buffers, stabilizers, preservatives, excipients, etc., in addition to pinelic acid. Pharmaceutically acceptable additives are well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected and used by those skilled in the art within the scope of their ordinary ability.
ある実施形態において、PPARα/γ活性化用組成物は、経口摂取用の組成物であり得る。PPARα/γ活性化用組成物は、例えば搾汁（ジュース）、ペースト、乾燥粉末、エキス等の形態であってもよく、飲食品の形態であってもよく、又は製剤化されていてもよい。経口摂取用のPPARα/γ活性化用組成物の製剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤等の経口剤である。 In certain embodiments, the PPARα/γ activating composition can be a composition for oral ingestion. The composition for activating PPARα/γ may be in the form of, for example, juice, paste, dry powder, extract, etc., may be in the form of food or drink, or may be formulated. . Formulations of the composition for activating PPARα/γ for oral intake are oral preparations such as tablets, capsules, powders, granules, fine granules, pills, suspensions, emulsions, liquids, and syrups. be.
別の実施形態において、PPARα/γ活性化用組成物は、非経口摂取用の組成物であり得る。非経口摂取用のPPARα/γ活性化用組成物の製剤は、例えば、注射剤、点滴剤、経腸剤、外用剤等の非経口製剤である。非経口摂取用のPPARα/γ活性化用組成物の投与経路としては、例えば、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、腸管内投与、経皮投与、局所投与等を挙げることができる。 In another embodiment, the PPARα/γ activating composition can be a composition for parenteral intake. Formulations of the PPARα/γ activating composition for parenteral intake are, for example, parenteral preparations such as injections, drip infusions, enteral preparations, and external preparations. The routes of administration of the composition for activating PPARα/γ for parenteral intake include, for example, intravascular administration (preferably intravenous administration), intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, enteral administration, and transdermal administration. , topical administration, and the like.
PPARα/γ活性化用組成物は、PPARα又はそのオルソログ及びPPARγ又はそのオルソログを有する対象、例えば、ヒト及び非ヒト動物、又はこれらに由来する器官、組織若しくは細胞に対して適用することができる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、チンパンジー、アカゲザルを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物等を挙げることができる。 A composition for activating PPARα/γ can be applied to subjects having PPARα or its orthologs and PPARγ or its orthologs, such as humans and non-human animals, or organs, tissues or cells derived therefrom. Examples of non-human animals include rodents including mice, rats, hamsters and guinea pigs, primates including chimpanzees and rhesus monkeys, domestic animals including pigs, cattle, goats, horses and sheep, and pet animals including dogs and cats. can be mentioned.
PPARα/γ活性化用組成物は、PPARα及びPPARγの活性化に有効な量のピネリン酸を含有する。また、医薬組成物であるPPARα/γ活性化用組成物は、PPARα又はPPARγの活性化が有効な疾患又は状態の処置に、特にPPARα及びPPARγの活性化が有効な疾患又は状態の処置に有効な量のピネリン酸を含有する。ここで有効量は、用法、対象の年齢、性別、体重、疾患又は状態の種類及び程度、剤形、投与経路その他の要因に応じて適宜決定することができる。PPARα/γ活性化用組成物は、ピネリン酸以外の有効成分又は生理活性物質を含有してもよい。 The composition for activating PPARα/γ contains an amount of pinelic acid effective in activating PPARα and PPARγ. In addition, the composition for activating PPARα/γ, which is a pharmaceutical composition, is effective in treating diseases or conditions in which activation of PPARα or PPARγ is effective, particularly in treating diseases or conditions in which activation of PPARα and PPARγ is effective. Contains a significant amount of pinelic acid. Here, the effective amount can be appropriately determined depending on the usage, subject's age, sex, body weight, type and degree of disease or condition, dosage form, administration route and other factors. The PPARα/γ activating composition may contain active ingredients or physiologically active substances other than pinelic acid.
ピネリン酸はPPARα活性化能及びPPARγ活性化能を有することから、ある試料に含有されるピネリン酸の量は、当該試料のPPARα活性化能及びPPARγ活性化能の指標となる。したがって、本開示は、被験試料中のピネリン酸含有量を指標とした、被験試料のPPARα活性化能及び／又はPPARγ活性化能を評価する方法を提供する。 Since pinelic acid has the ability to activate PPARα and the ability to activate PPARγ, the amount of pinelic acid contained in a given sample serves as an indicator of the ability to activate PPARα and PPARγ of the sample. Therefore, the present disclosure provides a method for evaluating the PPARα activation ability and/or PPARγ activation ability of a test sample, using the pinelic acid content in the test sample as an index.
被験試料中のピネリン酸は、公知の手法を用いて、例えばBiochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2020 Apr;1865(4):158611に記載されるRP-UHPLC-MS/MSやChiral HPLC-MS/MSによって、又はPlant Physiol. 1996 Mar;110(3):807-815. doi: 10.1104/pp.110.3.807.に記載されるHPLCによって、定量することができる。 Pinelic acid in the test sample is measured using known methods, for example, Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2020 Apr; 1996 Mar;110(3):807-815. doi: 10.1104/pp.110.3.807.
本開示はまた、植物体又は植物体の部分に対してピネリン酸産生を増強させるための処理を行う工程を含む、PPARα活性化能及びPPARγ活性化能が高められた植物を製造する方法を提供する。 The present disclosure also provides a method for producing a plant with enhanced PPARα activation ability and PPARγ activation ability, which comprises the step of treating a plant body or a part of a plant body to enhance pinelic acid production. do.
ピネリン酸産生を増強させるための処理を施される植物に制限はないが、例えば、タマネギ、ジャガイモ、ナタネ、イネ、コムギ、ダイズ、ビート等を挙げることができる。 Plants to be treated for enhancing pinelic acid production are not limited, but examples include onions, potatoes, rapeseeds, rice, wheat, soybeans, and beets.
本開示において、植物体とは植物個体の全体を、植物体の部分とは植物個体の地上及び地下の全ての部分及び器官、例えば芽、葉、幹、茎、根、鱗茎、塊茎、根茎、花、子実体、葯、花粉、胚珠、果実、種子、並びにこれらに由来する細胞、組織、プロトプラスト、カルス等を意味するものと理解される。 In the present disclosure, the plant body refers to the entire plant individual, and the plant body part refers to all above-ground and underground parts and organs of the plant individual, such as buds, leaves, stems, stems, roots, bulbs, tubers, rhizomes, Flowers, fruiting bodies, anthers, pollen, ovules, fruits, seeds, and cells, tissues, protoplasts, callus, etc. derived therefrom are understood to mean.
ピネリン酸産生を増強させるための処理としては、例えば、植物体若しくは植物体の部分に対する、より詳細にはこれらに含まれる植物細胞に対する、ピネリン酸生合成酵素をコードする核酸を導入する処理、又はピネリン酸生合成酵素をコードする内因性遺伝子の発現を増強させる処理等を挙げることができる。 The treatment for enhancing pinelic acid production includes, for example, a treatment of introducing a nucleic acid encoding a pinelic acid biosynthetic enzyme into a plant body or a part of a plant body, more specifically into a plant cell contained therein, or A treatment for enhancing the expression of an endogenous gene encoding a pinelate biosynthetic enzyme can be mentioned.
ピネリン酸生合成酵素は、9-リポキシゲナーゼ、エポキシアルコール合成酵素及びエポキシド加水分解酵素よりなる群から選択される少なくとも１つの酵素である。ピネリン酸生合成酵素をコードする核酸を導入する処理は、例えば、公知の塩基配列情報を参照して製造したピネリン酸生合成酵素をコードするmRNA又はDNAをそのまま、あるいは発現ベクターに組み込んだ形で植物体又は植物体の部分に導入することによって、行うことができる。また、ピネリン酸生合成酵素をコードする内因性遺伝子の発現を増強させる処理は、例えば、ピネリン酸生合成酵素遺伝子のプロモーターを転写能の高い別のプロモーターにゲノム上で置き換えることによって、又はピネリン酸生合成酵素遺伝子の転写を促進させるエンハンサー配列をゲノムに導入することによって、行うことができる。これらの処理は、公知の遺伝子工学的手法を用いて、実験操作マニュアル書等の参考資料に従って、行うことができる。 The pinelate biosynthetic enzyme is at least one enzyme selected from the group consisting of 9-lipoxygenase, epoxyalcohol synthase and epoxide hydrolase. The treatment of introducing a nucleic acid encoding a pinelic acid biosynthetic enzyme is, for example, the mRNA or DNA encoding the pinelic acid biosynthetic enzyme produced with reference to known nucleotide sequence information as it is, or in the form of being incorporated into an expression vector. It can be carried out by introducing into a plant or part of a plant. In addition, the treatment for enhancing the expression of an endogenous gene encoding a pinelic acid biosynthetic enzyme can be performed, for example, by replacing the promoter of the pinelic acid biosynthetic enzyme gene with another promoter with high transcription ability on the genome, or This can be done by introducing into the genome an enhancer sequence that promotes transcription of the biosynthetic enzyme gene. These treatments can be performed using known genetic engineering techniques and according to reference materials such as experimental operation manuals.
植物体又は植物体の部分に上述のようなピネリン酸産生を増強させるための処理を施すことによって、PPARα活性化能及びPPARγ活性化能が高められた植物体又は植物体の部分を製造することができる。また、このようにして得られた植物体を繁殖させることによって、あるいはこのようにして得られた植物体の部分を栽培又は培養することによって、PPARα活性化能及びPPARγ活性化能が高められた植物体又は植物体の部分をさらに製造することができる。 Producing a plant or a plant part having enhanced PPARα activation ability and PPARγ activation ability by subjecting the plant or plant part to a treatment for enhancing the production of pinelic acid as described above. can be done. In addition, by propagating the plant body thus obtained, or by cultivating or culturing the part of the plant body thus obtained, the PPARα activation ability and the PPARγ activation ability were enhanced. Further plants or parts of plants can be produced.
なお、植物においては損傷や酸化ストレス等の外部刺激がトリガーとなってピネリン酸産生が誘導されることから、上記方法によって製造された植物体又は植物体の部分によるPPARα活性化及びPPARγ活性化を達成するには、外部刺激を加えることが求められる。したがって、PPARα活性化能及びPPARγ活性化能が高められた植物とは、外部刺激を受けたときのPPARα活性化能及びPPARγ活性化能が高められた植物と表すこともできる。 In plants, external stimuli such as injury and oxidative stress induce the production of pinelic acid. Achieving this requires the application of an external stimulus. Therefore, a plant with enhanced PPARα activation ability and PPARγ activation ability can also be expressed as a plant with enhanced PPARα activation ability and PPARγ activation ability when receiving an external stimulus.
外部刺激としては、例えば、植物体又は植物体の部分に含まれる植物細胞を破壊する処理（以下、細胞破壊処理とも呼ぶ。）や、植物体又は植物体の部分に酸化ストレスを与える処理（以下、酸化ストレス処理とも呼ぶ。）を挙げることができる。 External stimuli include, for example, a treatment to destroy plant cells contained in the plant body or plant body parts (hereinafter also referred to as cell destruction treatment), and a treatment to apply oxidative stress to the plant body or plant body parts (hereinafter referred to as , also called oxidative stress treatment).
細胞破壊処理としては、例えば、植物体又は植物体の部分を切断、破砕、ホモジナイズ、凍結乾燥又は凍結融解する処理を挙げることができる。また、酸化ストレス処理としては、酸素ガスを添加して攪拌処理する方法、過酸化水素、次亜塩素酸又はエチレンオキサイドを用いた薬剤処理、UV照射等を挙げることができる。 The cell disruption treatment includes, for example, cutting, crushing, homogenizing, freeze-drying or freeze-thawing of a plant body or a part of a plant body. Examples of the oxidative stress treatment include a method of adding oxygen gas and stirring, a chemical treatment using hydrogen peroxide, hypochlorous acid or ethylene oxide, and UV irradiation.
PPARα活性化能及びPPARγ活性化能が高められた植物は、突然変異誘発処理によっても製造することができる。本開示は、植物体又は植物体の部分に対して突然変異誘発処理を行う工程；突然変異誘発処理後の植物体若しくは植物体の部分、又はこれらを栽培若しくは培養することによって得られた植物体若しくは植物体の部分に対して、細胞破壊処理又は酸化ストレス処理を行う工程；及び細胞破壊処理又は酸化ストレス処理後の植物体又は植物体の部分を含む試料中のピネリン酸濃度を、対照濃度と比較する工程を含む、PPARα及びPPARγの活性化能が高められた植物を製造する方法を提供する。 Plants with enhanced PPARα activation ability and PPARγ activation ability can also be produced by mutagenesis treatment. The present disclosure includes a step of subjecting a plant or plant part to a mutagenesis treatment; a plant or a plant part after mutagenesis treatment, or a plant obtained by cultivating or culturing these or a step of subjecting the plant part to cell destruction treatment or oxidative stress treatment; Provided is a method for producing a plant with enhanced ability to activate PPARα and PPARγ, including the step of comparing.
突然変異誘発処理は、公知の突然変異誘発処理であればよく、その例としては、メタンスルホン酸エチル等の化学物質を用いた化学的処理や、γ線、X線、重イオンビーム（窒素イオンビーム、炭素イオンビーム、ネオンイオンビーム、アルゴンイオンビーム等）といった放射線を用いた物理的処理を挙げることができる。 The mutagenesis treatment may be any known mutagenesis treatment, examples of which include chemical treatments using chemical substances such as ethyl methanesulfonate, gamma rays, X-rays, heavy ion beams (nitrogen ion physical treatments using radiation such as beams, carbon ion beams, neon ion beams, argon ion beams, etc.).
突然変異誘発処理を施した植物体又は植物体の部分は、そのまま次工程で用いてもよく、あるいはそれらを栽培又は培養することによって得られた新たな植物体又は植物体の部分を次工程で用いてもよい。次工程である細胞破壊処理又は酸化ストレス処理は、ピネリン酸産生を誘導するための処理であり、その詳細は、上で述べたとおりである。 Plants or plant parts that have been subjected to mutagenesis treatment may be used as they are in the next step, or new plants or plant parts obtained by cultivating or culturing them may be used in the next step. may be used. The cell destruction treatment or oxidative stress treatment, which is the next step, is a treatment for inducing pinelic acid production, and the details thereof are as described above.
突然変異誘発処理によってピネリン酸産生能が増強されると、細胞破壊処理又は酸化ストレス処理後の植物体又は植物体の部分を含む試料のピネリン酸濃度は増加する。したがって、当該試料中のピネリン酸濃度を対照濃度と比較することによって、当該植物体又は植物体の部分のピネリン酸産生能が高められていること、すなわちPPARα及びPPARγの活性化能が高められていることを確認することができる。ここで対照濃度は、突然変異誘発処理を行わない植物体又は植物体の部分に対して細胞破壊処理又は酸化ストレス処理を行い、処理後の植物体又は植物体の部分を含む試料のピネリン酸濃度を測定することによって決定することができる。あるいは、対照濃度は、予め決定した、所望のPPARα及びPPARγの活性化能に対応したピネリン酸濃度であってもよい。 When the mutagenesis treatment enhances the ability to produce pinelic acid, the pinelic acid concentration in the sample containing the plant body or plant body part after the cell disruption treatment or the oxidative stress treatment increases. Therefore, by comparing the pinelic acid concentration in the sample with the control concentration, it is confirmed that the ability of the plant or part of the plant to produce pinelic acid is enhanced, that is, the ability to activate PPARα and PPARγ is enhanced. can confirm that there is Here, the control concentration is the pinelic acid concentration of the sample containing the plant body or the plant body part after the cell destruction treatment or oxidative stress treatment is performed on the plant body or the plant body part that is not subjected to the mutagenesis treatment. can be determined by measuring the Alternatively, the control concentration may be a predetermined pinelic acid concentration corresponding to the desired ability to activate PPARα and PPARγ.
本開示はさらに、フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する組成物を、水性媒体中で疎水性担体と接触させる工程；疎水性担体に吸着した物質をメタノールで溶出する工程；メタノール溶出液を濃縮後、n-ブタノール中でシリカゲルと接触させる工程；シリカゲルに吸着した物質を、アルカリ性のn-ブタノール水溶液で溶出する工程；及びアルカリ性のn-ブタノール水溶液による溶出液を回収する工程を含む、フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する組成物から、フラボノール類又はその配糖体に対するピネリン酸の相対的含有量が向上した組成物を製造する方法を提供する。フラボノール類又はその配糖体に対するピネリン酸の相対的含有量が向上した組成物は、ピネリン酸が濃縮された結果としてPPARα及びPPARγの活性化能が増強されていることから、PPARα及びPPARγの活性化用組成物として利用することができる。 The present disclosure further provides a step of contacting a composition containing flavonols or their glycosides and pinellinic acid with a hydrophobic carrier in an aqueous medium; a step of eluting the substance adsorbed to the hydrophobic carrier with methanol; A step of contacting the silica gel after concentrating the liquid in n-butanol; a step of eluting the substance adsorbed on the silica gel with an alkaline n-butanol aqueous solution; and a step of collecting the eluate from the alkaline n-butanol aqueous solution. , a method for producing a composition containing flavonols or their glycosides and pinellinic acid with an improved relative content of pinelic acid relative to flavonols or their glycosides. A composition in which the relative content of pinelic acid relative to flavonols or their glycosides is improved has enhanced ability to activate PPARα and PPARγ as a result of the concentration of pinelic acid. It can be used as a cosmetic composition.
フラボノール類又はその配糖体とピネリン酸とは化学的性質が類似しており、分離精製が難しい。これらの背景から、フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する組成物から、フラボノール類又はその配糖体に対するピネリン酸の相対的含有量が向上した組成物を製造することは困難であったところ、本発明者らは、上記工程を組み合わせることによって、この課題を解決したものである。 Flavonols or their glycosides and pinellinic acid have similar chemical properties and are difficult to separate and purify. Against this background, it is difficult to produce a composition having an improved relative content of pinelic acid relative to flavonols or their glycosides from a composition containing flavonols or their glycosides and pinelic acid. However, the present inventors have solved this problem by combining the above steps.
フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する組成物（以下、原料組成物と呼ぶ。）において、フラボノール又はその配糖体の含有量に制限はないが、原料組成物の乾燥重量1 gあたりのフラボノール類又はその配糖体の含有量は、ピネリン酸含有量の１倍以上、２倍以上、又は４倍以上であってもよく、８倍以上であってもよい。フラボノールとしては、ケルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、ガランギン、フィセチン等を挙げることができるが、ケルセチンが好ましい。 In a composition containing flavonols or their glycosides and pinellinic acid (hereinafter referred to as raw material composition), the content of flavonols or their glycosides is not limited, but the dry weight of the raw material composition is 1 g. The content of flavonols or glycosides thereof per unit may be 1-fold or more, 2-fold or more, 4-fold or more, or 8-fold or more of the pinelic acid content. Examples of flavonols include quercetin, kaempferol, myricetin, galangin, fisetin and the like, with quercetin being preferred.
原料組成物において、ピネリン酸の含有量に制限はないが、原料組成物の乾燥重量1 gあたり、例えば10μg以上、好ましくは30μg以上、より好ましくは100μg以上、さらに好ましくは300μg以上のピネリン酸含有量であり得る。 Although the content of pinelic acid in the raw material composition is not limited, for example, 10 μg or more, preferably 30 μg or more, more preferably 100 μg or more, and still more preferably 300 μg or more of pinelic acid per 1 g of the dry weight of the raw material composition. can be an amount.
ある実施形態において、原料組成物は、植物由来の組成物である。原料組成物の由来となる植物は、フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する植物であればよく、その例としては、タマネギ、大豆、そば、ナタネ、茶葉、ホウレンソウ、パセリ、ブロッコリー、リンゴ、モロヘイヤ等を挙げることができる。原料組成物の由来となる植物の好適な例は、有色タマネギである。 In some embodiments, the source composition is a plant-derived composition. The plant from which the raw material composition is derived may be any plant containing flavonols or their glycosides and pinellinic acid. Apples, mulukhiyah and the like can be mentioned. A suitable example of the plant from which the raw material composition is derived is colored onions.
有色タマネギは、外皮の色が有色のタマネギであり、具体的には、赤タマネギ及び黄タマネギが挙げられる。有色タマネギは、フラボノール類の一種であるケルセチンの配糖体を多量に含有することが知られている。有色タマネギは、例えば、可食部である鱗茎の生重量100gあたり、ケルセチン配糖体を70mg以上、好ましくは90mg以上、より好ましくは120mg以上、さらに好ましくは150mg以上含有するものであり得る。そのような有色タマネギの例としては、可食部生重量100gあたりケルセチン配糖体を200mg程度含有する品種を挙げることができる（岡本ら、園芸学会雑誌、2006年、第75巻、第１号、pp. 100-108）。 A colored onion is an onion with a colored outer skin, and specifically includes a red onion and a yellow onion. Colored onions are known to contain a large amount of glycosides of quercetin, one of flavonols. Colored onions may contain, for example, 70 mg or more, preferably 90 mg or more, more preferably 120 mg or more, and even more preferably 150 mg or more of quercetin glycosides per 100 g fresh weight of the edible bulb. Examples of such colored onions include cultivars containing about 200 mg of quercetin glycosides per 100 g of edible fresh weight (Okamoto et al., Horticultural Society Journal, 2006, Vol. 75, No. 1 , pp. 100-108).
有色タマネギは、長日系品種であることが好ましい。長日系品種は、日長が約14時間以上の長日条件下で結球する品種であり、北海道で栽培される春播きタマネギは長日系品種に該当する。また、有色タマネギは、以下の(a)～(d)の特徴のうち、少なくとも１つ以上を有することが好ましい。
(a) Brix値が約9.0～12. 0％
(b) 栽培適応緯度が北緯約38～45度または南緯約38～45度
(c) 乾物率が約9～12％
(d) 貯蔵可能期間が6か月程度
The colored onion is preferably a long-day variety. Long-day cultivars are cultivars that form heads under long-day conditions with a day length of about 14 hours or longer, and spring-sown onions cultivated in Hokkaido correspond to long-day cultivars. In addition, the colored onion preferably has at least one or more of the following characteristics (a) to (d).
(a) Brix value about 9.0 to 12.0%
(b) Cultivation adaptation latitude is about 38 to 45 degrees north latitude or about 38 to 45 degrees south latitude
(c) about 9-12% dry matter
(d) Storage period is about 6 months
好適な有色タマネギの例としては、赤タマネギではアメリカスパニッシュタイプの赤タマネギとアメリカ東部タイプの赤タマネギとのF1、具体例としてはさらさらレッド（登録商標）を挙げることができ、黄タマネギではヨーロッパラインズバーガータイプの黄タマネギとアメリカ東部タイプの黄タマネギとのF1を挙げることができる。 Examples of suitable colored onions include, for red onions, F1 of American Spanish type red onions and American eastern type red onions, a specific example is Sarasara Red (registered trademark), and for yellow onions, European lines. One can cite the F1 Burger-type yellow onion and the Eastern-type yellow onion.
ある実施形態において、原料組成物は、フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する植物体又は植物体の部分に対して細胞破壊処理を行って得られる組成物であり、好ましくは、フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する植物体又は植物体の部分に対して細胞破壊処理を行った後、水性媒体で抽出することによって得られる組成物である。ここで用いられる植物体又は植物体の部分の好ましい例は、タマネギ又はその可食部である。 In one embodiment, the raw material composition is a composition obtained by subjecting a plant or plant part containing flavonols or their glycosides and pinelic acid to cell disruption treatment, preferably flavonol This is a composition obtained by subjecting a plant or plant part containing the genus or its glycoside and pinelic acid to cell disruption treatment followed by extraction with an aqueous medium. A preferred example of the plant or plant part used herein is an onion or its edible part.
原料組成物の製造における細胞破壊処理は、上でPPARα及びPPARγの活性化能が高められた植物を製造する方法において述べられたとおりである。細胞破壊処理は、好ましくは、フラボノール類又はその配糖体及びピネリン酸を含有する植物体、植物体の部分又はそれらの破砕物を凍結乾燥する処理である。細胞破壊処理後の植物体又は植物体の部分は、そのまま、又は切断若しくは破砕等の手段によって適当な大きさにした後、水性媒体による抽出に供することができる。 The cell disruption treatment in the production of the raw material composition is as described above in the method for producing a plant with enhanced ability to activate PPARα and PPARγ. The cell disruption treatment is preferably a treatment of freeze-drying a plant body containing flavonols or their glycosides and pinellinic acid, a plant body part, or a crushed product thereof. The plant body or plant body part after the cell disruption treatment can be subjected to extraction with an aqueous medium as it is or after being cut or crushed to an appropriate size.
本開示において、水性媒体は、水又は水を溶媒とする溶液であり、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、HEPES緩衝液・等を挙げることができる。 In the present disclosure, the aqueous medium is water or a solution using water as a solvent, and examples thereof include water, physiological saline, phosphate-buffered saline, Tris-HCl buffer, HEPES buffer, and the like.
抽出は、植物体又は植物体の部分を水性媒体に浸漬し、一定時間静置又は振とうすることによって行われる。使用される水性媒体の量及び抽出時間は、植物体又は植物体の部分の大きさや抽出温度、振とう速度等に応じて適宜調節される。水性媒体の量は、例えば植物体又は植物体の部分の乾燥重量1 gあたり0.1 ml～500 ml、好ましくは1 ml～100 ml、より好ましくは2 ml～50 ml、さらに好ましくは3 ml～30 mlである。抽出時間は、その下限が、例えば１時間、2時間、4時間、好ましくは8時間、より好ましくは16時間であればよい。抽出時間の上限に制限はなく、抽出液の変質や腐敗が生じない程度の長さ、例えば7日間、好ましくは4日間、より好ましくは3日間である。 Extraction is carried out by immersing the plant body or parts of the plant body in an aqueous medium and allowing it to stand or shake for a certain period of time. The amount of aqueous medium used and the extraction time are appropriately adjusted according to the size of the plant or plant parts, the extraction temperature, the shaking speed, and the like. The amount of the aqueous medium is, for example, 0.1 ml to 500 ml, preferably 1 ml to 100 ml, more preferably 2 ml to 50 ml, and even more preferably 3 ml to 30 ml per 1 g dry weight of the plant or plant part. ml. The lower limit of the extraction time may be, for example, 1 hour, 2 hours, 4 hours, preferably 8 hours, and more preferably 16 hours. There is no upper limit to the extraction time, and it is a length that does not cause deterioration or putrefaction of the extract, such as 7 days, preferably 4 days, and more preferably 3 days.
抽出温度は、水性媒体が凍結しない程度の温度、例えば2℃から40℃程度の範囲内であればよく、好ましくは2℃～25℃、より好ましくは2℃～8℃、例えば4℃である。 The extraction temperature may be a temperature at which the aqueous medium does not freeze, for example, within the range of about 2°C to 40°C, preferably 2°C to 25°C, more preferably 2°C to 8°C, for example 4°C. .
水性媒体による抽出後、デカンテーションやろ過等によって液相を回収し、任意選択で濃縮又は乾燥させることによって、原料組成物を調製することができる。 After extraction with an aqueous medium, a raw material composition can be prepared by recovering the liquid phase by decantation, filtration, or the like, and optionally concentrating or drying.
本開示の製造方法は、原料組成物を水性媒体中で疎水性担体と接触させる工程を含む。疎水性担体としては、逆相クロマトグラフィー用の担体として一般的に用いられるものを使用することができる。疎水性担体としては、例えば、オクタデシル基化学結合型（C18）、オクチル基（C8）、エチル基（C2）、シクロヘキシル基（CH）、フェニル基（PH）等の疎水性官能基が化学結合したシリカゲルを挙げることができる。好ましい疎水性担体は、C18シリカゲルである。 The manufacturing method of the present disclosure includes the step of contacting the raw material composition with a hydrophobic carrier in an aqueous medium. As the hydrophobic carrier, those generally used as carriers for reversed-phase chromatography can be used. Examples of hydrophobic carriers include chemically bonded hydrophobic functional groups such as octadecyl group (C18), octyl group (C8), ethyl group (C2), cyclohexyl group (CH), and phenyl group (PH). Silica gel may be mentioned. A preferred hydrophobic carrier is C18 silica gel.
次いで、疎水性担体に吸着した物質をメタノールで溶出する工程が行われる。この工程においては、原料組成物と接触させた疎水性担体から液相を除去し、任意選択で新たな水性媒体で洗浄した後、疎水性担体をメタノールと接触させることで吸着物質を溶出することができる。 Next, a step of eluting the substance adsorbed on the hydrophobic carrier with methanol is performed. In this step, the liquid phase is removed from the hydrophobic carrier that has been contacted with the raw material composition, optionally washed with a new aqueous medium, and then the adsorbed substance is eluted by contacting the hydrophobic carrier with methanol. can be done.
その後、メタノール溶出液を濃縮後、n-ブタノール中でシリカゲルと接触させる工程が行われる。この工程においては、疎水性担体に吸着された物質を溶解したメタノール溶出液から、濃縮操作によりメタノールを除去し、残留物をn-ブタノールに溶解してシリカゲルと接触させることで、n-ブタノールに溶解した物質をシリカゲルに吸着させることができる。 Then, after concentrating the methanol eluate, a step of contacting with silica gel in n-butanol is performed. In this step, methanol is removed by concentrating the methanol eluate in which the substances adsorbed to the hydrophobic carrier are dissolved, and the residue is dissolved in n-butanol and contacted with silica gel to obtain Dissolved substances can be adsorbed onto silica gel.
続いて、シリカゲルに吸着した物質を、アルカリ性のn-ブタノール水溶液で溶出する工程が行われる。この工程においては、n-ブタノール溶液と接触させたシリカゲルから液相を除去し、任意選択で新たなn-ブタノールで洗浄した後、シリカゲルをアルカリ性のn-ブタノール水溶液と接触させることで吸着物質を溶出することができる。アルカリ性のn-ブタノール水溶液は、n-ブタノールとアルカリ性の水性媒体との混合液である。 Subsequently, a step of eluting the substances adsorbed on the silica gel with an alkaline n-butanol aqueous solution is performed. In this step, the liquid phase is removed from the silica gel contacted with the n-butanol solution, optionally washed with fresh n-butanol, and then the adsorbent is removed by contacting the silica gel with an alkaline aqueous n-butanol solution. can be eluted. The alkaline n-butanol aqueous solution is a mixture of n-butanol and an alkaline aqueous medium.
上記混合液におけるアルカリ性の水性媒体としては、アンモニア水や、アルカリ金属水酸化物の水溶液等を使用することができる。アルカリ金属水酸化物の水溶液の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウムを挙げることができる。アルカリ性の水性媒体は、好ましくはアンモニア水である。アンモニア水におけるアンモニアの濃度は、10～50% v/vの間で適宜設定することができ、例えば15～45% v/v、20～40% v/v、25～35% v/vである。n-ブタノールとアルカリ性の水性媒体との混合液は、n-ブタノールとアルカリ性の水性媒体とを、20：1～1：1程度、例えば10：1～1：1、好ましくは8：1～2：1、より好ましくは6：1～4: 1比率で混合することにより調製することができる。 As the alkaline aqueous medium in the mixed solution, ammonia water, an aqueous solution of an alkali metal hydroxide, or the like can be used. Examples of aqueous alkali metal hydroxide solutions include sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, and lithium hydroxide. The alkaline aqueous medium is preferably aqueous ammonia. The concentration of ammonia in ammonia water can be appropriately set between 10 and 50% v/v, for example, 15 to 45% v/v, 20 to 40% v/v, and 25 to 35% v/v. be. A mixture of n-butanol and an alkaline aqueous medium contains n-butanol and an alkaline aqueous medium at a ratio of about 20:1 to 1:1, for example, 10:1 to 1:1, preferably 8:1 to 2. :1, more preferably 6:1 to 4:1 ratio.
アルカリ性のn-ブタノール水溶液による溶出で得られた溶出液は、ピネリン酸が濃縮され、フラボノール類又はその配糖体が除去されていることから、この溶出液を回収し、任意選択で濃縮することで、フラボノール類又はその配糖体に対するピネリン酸の相対的含有量が向上した組成物を製造することができる。ここで「フラボノール類又はその配糖体に対するピネリン酸の相対的含有量が向上した」とは、原料組成物と比較して、製造された組成物において、フラボノール類又はその配糖体の含有量に対するピネリン酸の相対的含有量が向上したことを意味する。ピネリン酸の相対的含有量の向上は、原料組成物、製造された組成物のそれぞれのフラボノール類又はその配糖体の含有量とピネリン酸の含有量を測定し、フラボノール類又はその配糖体の含有量に対するピネリン酸の含有量の比を算出し、原料組成物における前記比と、製造された組成物における前記比を比較することによって、確認することができる。 Since the eluate obtained by elution with an alkaline aqueous solution of n-butanol is concentrated in pinellinic acid and the flavonols or their glycosides are removed, the eluate can be collected and optionally concentrated. can produce a composition with an improved relative content of pinelic acid to flavonols or their glycosides. Here, "the relative content of pinelic acid with respect to flavonols or glycosides thereof is improved" means that the content of flavonols or glycosides thereof in the produced composition is higher than that in the raw material composition. This means that the relative content of pinelic acid relative to To improve the relative content of pinelic acid, the raw material composition, the content of flavonols or their glycosides and the content of pinelic acid in each of the manufactured compositions are measured, and the flavonols or their glycosides It can be confirmed by calculating the ratio of the content of pinelic acid to the content of and comparing the ratio in the raw material composition and the ratio in the manufactured composition.
上記の各工程における分離精製の条件及び操作は、特に記載がないかぎり、使用される疎水性担体及び溶媒の種類、原料組成物及び吸着物質の量等の要因を考慮して、逆相系の固相抽出又はカラムクロマトグラフィーにおいて一般的な条件の範囲内で、一般的に用いられる手法を用いて行うことができる。 Unless otherwise specified, the conditions and operations for separation and purification in each of the above steps are those of the reversed-phase system, taking into consideration factors such as the type of hydrophobic carrier and solvent used, the amount of raw material composition and adsorbed substance, etc. It can be carried out using a technique generally used within the range of general conditions in solid phase extraction or column chromatography.
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail by the following examples, but the invention is not limited to these.
実施例において、ルシフェラーゼリガンドアッセイは以下の手順で実施した。
Gal4のDNA結合ドメイン（Gal4-DBD）とPPARα、PPARδ又はPPARγのリガンド結合ドメイン（NR-LBD）とのキメラタンパク質を発現するプラスミドであるpGal4DBD/PPARα LBD、pGal4DBD/PPARδ LBD又はpGal4DBD/PPARγ LBD、Gal4 DNA応答配列とホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミド（pGal4-Luc）及び内部標準用としてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の上流に遺伝子構成的発現プロモーター（CMV）を連結した内部標準プラスミド（pGL4.75hRluc-CMV）を重量比1:0.9:0.1の割合で混合し、Opti-MEMに10 μg/ml（総DNA量）の濃度で溶解してプラスミド混合液を調製した。
In the examples, the luciferase ligand assay was performed by the following procedure.
pGal4DBD/PPARα LBD, pGal4DBD/PPARδ LBD or pGal4DBD/PPARγ LBD, which are plasmids expressing chimeric proteins of Gal4 DNA-binding domain (Gal4-DBD) and PPARα, PPARδ or PPARγ ligand-binding domain (NR-LBD); A reporter plasmid (pGal4-Luc) containing a Gal4 DNA response element and firefly luciferase gene, and an internal standard plasmid (pGL4.75hRluc-CMV) in which a gene constitutive expression promoter (CMV) is ligated upstream of the Renilla luciferase gene as an internal standard. were mixed at a weight ratio of 1:0.9:0.1 and dissolved in Opti-MEM at a concentration of 10 μg/ml (total DNA amount) to prepare a plasmid mixture.
アフリカミドリザル腎由来細胞株CV-1を2 x 105 cells/wellとなるよう、6 well plateに播種し、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（10% ウシ胎児血清（FBS））中で、庫内温度37°C、CO2濃度5％のインキュベーター内で１日培養した。遺伝子導入試薬（X-tremeGENE HP; Roche）を1/43量添加して、15分間静置後、プラスミド混合液を200 μlずつ各ウェルに添加し、6時間培養することによって遺伝子を導入した。 African green monkey kidney-derived cell line CV-1 was seeded in a 6-well plate at 2 x 10 5 cells/well and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (10% fetal bovine serum (FBS)). It was cultured for one day in an incubator with a temperature of 37°C and a CO 2 concentration of 5%. 1/43 volume of a gene introduction reagent (X-tremeGENE HP; Roche) was added and allowed to stand for 15 minutes, then 200 μl of the plasmid mixture was added to each well and cultured for 6 hours to introduce genes.
遺伝子導入細胞をトリプシンにより分散し、96 well plateに2.0 x 104 cells/wellとなるよう再度播種した。この際、培養液をphenol red不含DMEM培地（10%活性炭処理済FBS）に交換した。1時間後、被験試料を含むphenol red不含DMEM培地を各ウェルに添加し、CO2インキュベーター中で細胞を48時間培養した。陰性コントロールとして最終濃度0.5% DMSO、2.5% EtOH又は10％水を、陽性コントロールとしてWY14643（PPARαアゴニスト）、GW501516（PPARδアゴニスト）又はピオグリダゾン（PPARγアゴニスト）を添加した培地を用いて、細胞を同様に培養した。 The transfected cells were dispersed with trypsin and seeded again in a 96-well plate at 2.0 x 104 cells/well. At this time, the culture medium was replaced with phenol red-free DMEM medium (10% activated charcoal-treated FBS). After 1 hour, phenol red-free DMEM medium containing the test sample was added to each well, and the cells were cultured in a CO 2 incubator for 48 hours. Cells were similarly treated using medium supplemented with a final concentration of 0.5% DMSO, 2.5% EtOH or 10% water as a negative control, and WY14643 (PPARα agonist), GW501516 (PPARδ agonist) or pioglidazone (PPARγ agonist) as a positive control. cultured.
なお、被験試料の希釈は、試験例１の水抽出物、実施例１の水抽出物及び水画分は水で、実施例２のピネリン酸はエタノールで、その他はDMSOで行った。また、試料の試験濃度は、事前のCV-1細胞に対する細胞毒性試験により、細胞毒性を示さない最も高い濃度から順次希釈することで設定した。ただし、その最も高い濃度が前回までの抽出物での試験濃度よりも高くなった場合は、前回の抽出物を用いて試験を行った際の最も高い濃度を基準にして順次希釈し試験濃度を設定した。 The test samples were diluted with water for the water extract of Test Example 1, the water extract and the water fraction of Example 1, ethanol for the pinelic acid of Example 2, and DMSO for the others. In addition, the test concentration of the sample was set by serially diluting from the highest concentration that does not show cytotoxicity in a previous cytotoxicity test on CV-1 cells. However, if the highest concentration is higher than the test concentration of the extract up to the previous time, serially dilute the test concentration based on the highest concentration when the test was performed using the previous extract. set.
48時間の培養後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）にて洗浄し、デュアルルシフェラーゼアッセイに供した。アッセイは、Dual-LuciferaseR Reporter Assay System（Promega）の標準プロトコールに従って実施し、プレートリーダー（Luminescencer、AB-2350EX、ATTO）にてホタルルシフェラーゼ活性（Fluc）及びウミシイタケルシフェラーゼ活性（Rluc）を測定した。両活性の比率（Fluc / Rluc）をリガンド活性（活性化能）として評価に用いた。アッセイは1つの試料について3ウェルを用いて実施し、3ウェルの平均値をデータとして採用した。 After 48 hours of culture, cells were washed with phosphate buffered saline (PBS) and subjected to dual luciferase assay. The assay was performed according to the standard protocol of the Dual-Luciferase R Reporter Assay System (Promega), and firefly luciferase activity (Fluc) and Renilla luciferase activity (Rluc) were measured using a plate reader (Luminescencer, AB-2350EX, ATTO). . The ratio of both activities (Fluc/Rluc) was used for evaluation as the ligand activity (activation ability). The assay was performed using 3 wells per sample, and the average value of the 3 wells was used as the data.
データは、(n =3 の平均相対値 ± 標準偏差 (SD))で示した。統計的有意性は分散分析（One-way ANOVA）を実施し、その後有意差が見られた場合はボンフェローニ検定を実施した。p < 0.05未満のp値は統計的に有意であるとした（図中、* p <0.05、** p <0.01、*** p <0.001）。解析にはEZR version 1.41を使用した。 Data are presented as (mean relative ± standard deviation (SD) for n = 3). Analysis of variance (One-way ANOVA) was performed for statistical significance, followed by Bonferroni test when significant differences were observed. A p-value less than p<0.05 was considered statistically significant (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 in figures). EZR version 1.41 was used for the analysis.
試験例１ タマネギ水抽出物のPPARα活性化能、PPARδ活性化能及びPPARγ活性化能の評価
タマネギは、北海道栗山町で栽培されたケルセチン高含有タマネギ「さらさらレッド（登録商標）」を使用した。タマネギの皮を剥き、先端と根の部分を除去して可食部を得た。可食部を電動スライサーで2 mm程度の厚みにスライスし、大型凍結乾燥機（RLEII-205, KYOWAC, Tokyo, Japan）に入れ、24時間乾燥して凍結乾燥試料を得た。4 gの凍結乾燥試料を40 mLの超純水に浸漬し、4℃で1日間静置による抽出を行った。抽出液をガーゼとろ紙でろ過し、水抽出物をろ液として得た。
Test Example 1 Evaluation of PPARα, PPARδ and PPARγ Activation Abilities of Onion Aqueous Extract As the onion, quercetin-rich onion ``Sarasara Red (registered trademark)'' cultivated in Kuriyama-cho, Hokkaido was used. The onion was peeled, and the tip and root were removed to obtain the edible part. The edible part was sliced with an electric slicer to a thickness of about 2 mm, placed in a large freeze dryer (RLEII-205, KYOWAC, Tokyo, Japan) and dried for 24 hours to obtain a freeze-dried sample. 4 g of the freeze-dried sample was immersed in 40 mL of ultrapure water, and extracted by standing at 4° C. for 1 day. The extract was filtered through gauze and filter paper to obtain a water extract as the filtrate.
200倍希釈又は50倍希釈した水抽出物（それぞれ0.5%、2%）を用いて、ルシフェラーゼリガンドアッセイを行った（図１）。タマネギ水抽出物は、PPARα及びPPARγを濃度依存的に活性化したが、PPARδの活性化は有意には観察されなかった。 Luciferase ligand assays were performed using 200-fold or 50-fold diluted aqueous extracts (0.5% and 2%, respectively) (Fig. 1). The aqueous onion extract activated PPARα and PPARγ in a concentration-dependent manner, but did not significantly activate PPARδ.
タマネギ水抽出物にはケルセチン配糖体が含まれるが、ケルセチン及びその配糖体は、PPARα活性化能は有するものの、PPARγ活性化能は有さないことが知られている。ケルセチン、ケルセチン-4'-O-グルコシド、ケルセチン-3,4'-O-ジ-グルコシド、及び陽性コントロールとしてピオグリタゾン（10μM; 図中、Pio.又はPo.と表す）に対してルシフェラーゼリガンドアッセイを実施したところ、ケルセチン及びその配糖体はPPARγ活性化能を有さないことが再確認された（図２）。このことから、タマネギ水抽出物には、PPARγ活性化能を有するケルセチン及びその配糖体以外の物質が含まれていることが示唆された。 Aqueous onion extracts contain quercetin glycosides, and it is known that quercetin and its glycosides have the ability to activate PPARα but not the ability to activate PPARγ. Luciferase ligand assays were performed against quercetin, quercetin-4′-O-glucoside, quercetin-3,4′-O-di-glucoside, and pioglitazone (10 μM; designated as Pio. or Po. in the figure) as a positive control. As a result, it was reconfirmed that quercetin and its glycosides do not have the ability to activate PPARγ (Fig. 2). This suggests that the onion water extract contains substances other than quercetin and its glycosides, which have the ability to activate PPARγ.
実施例１ タマネギ水抽出物からのピネリン酸の単離精製、並びにそのPPARα及びPPARγ活性化能の評価
試験例１と同様にして、タマネギ可食部13 kg（生重量）から調製した凍結乾燥試料（1.2 kg）を超純水（8 L）に浸漬し、4℃で3日間静置による抽出を行った。抽出液をガーゼとろ紙でろ過し、水抽出物（図３中の（A）、乾燥重量で600 g）をろ液（6 L）として得た。この水抽出物には、乾燥重量1 gあたり25.2 mgのケルセチン及びその配糖体が含まれていた。水抽出物をC18-COSMOSILカラムクロマトグラフィー（COSMOSIL 75C18-OPN（NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan）600 g, 20×8cm）に供し、水で洗浄し、洗浄液を水画分（図３中の（C）、乾燥重量で530 g）として回収した。次に、C18-COSMOSILカラムに吸着した物質をメタノール（MeOH）で溶出した（MeOH画分、図３中の（B）、乾燥重量で47.0 g）。MeOH画分を濃縮後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Wakogel 60Nシリカゲル（FUJIFILM Wako, Tokyo, Japan）800 g, 20×10 cm）に供し、n-ブタノール（n-BuOH）/水酸化アンモニウム（4 : 1、合計6.0 L）で溶出した（BuOH画分、図３中の（D）、乾燥重量で3.5 g）。次に、シリカゲルカラムに吸着した物質をMeOHで溶出した（MeOH画分、図３中の（E）、乾燥重量で40.5 g）。
Example 1 Isolation and purification of pinelic acid from an aqueous onion extract and evaluation of its ability to activate PPARα and PPARγ Freeze-dried sample prepared from 13 kg (fresh weight) of edible onion in the same manner as in Test Example 1 (1.2 kg) was immersed in ultrapure water (8 L) and extracted by standing at 4°C for 3 days. The extract was filtered through gauze and filter paper to obtain a water extract ((A) in FIG. 3, 600 g in dry weight) as filtrate (6 L). This aqueous extract contained 25.2 mg of quercetin and its glycosides per gram of dry weight. The water extract was subjected to C18-COSMOSIL column chromatography (COSMOSIL 75C18-OPN (NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan) 600 g, 20 × 8 cm), washed with water, and the washings were separated into the water fraction ((C ), 530 g dry weight). Next, the substance adsorbed on the C18-COSMOSIL column was eluted with methanol (MeOH) (MeOH fraction, (B) in FIG. 3, 47.0 g in dry weight). After concentrating the MeOH fraction, the residue was subjected to silica gel column chromatography (Wakogel 60N silica gel (FUJIFILM Wako, Tokyo, Japan) 800 g, 20 × 10 cm), n-butanol (n-BuOH) / ammonium hydroxide ( 4:1, 6.0 L in total) (BuOH fraction, (D) in FIG. 3, 3.5 g in dry weight). Next, the substance adsorbed on the silica gel column was eluted with MeOH (MeOH fraction, (E) in FIG. 3, 40.5 g in dry weight).
n-BuOH画分を濃縮した後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（6×60cm）に供し、n-BuOH /水酸化アンモニウム（5：1、合計7.5 L）で溶出した。得られた合計84の画分をTLCプレート（シリカゲル60 F254プレート（厚さ0.2 mm、Merck, Darmstadt, Germany））にスポットし、n-BuOH /水酸化アンモニウム（5：1）の混合溶媒を用いて展開した。これらのTLCプレートに展開された化合物の呈色は、リンモリブデン酸、バニリン酸/ドロクロル酸、ニンヒドリンを用いた。得られた合計84の画分を、上記のTLCプロファイルに基づいて、10の画分（画分1～10、図３中の（F））に統合した。
After concentrating the n-BuOH fraction, the residue was subjected to silica gel column chromatography (6×60 cm) and eluted with n-BuOH/ammonium hydroxide (5:1, total 7.5 L). A total of 84 fractions obtained were spotted on a TLC plate (silica gel 60 F254 plate (0.2 mm thickness, Merck, Darmstadt, Germany)) and washed with a mixed solvent of n-BuOH/ammonium hydroxide (5:1). expanded. Phosphomolybdic acid, vanillic acid/dorochloric acid, and ninhydrin were used to color the compounds developed on these TLC plates. A total of 84 fractions obtained were combined into 10 fractions (
取得した各画分に対して、ルシフェラーゼリガンドアッセイを実施した。（B）MeOH画分及び（D）BuOH画分は、濃度依存的にPPARγを活性化した。さらに、PPARγの強い活性化が、画分1、画分4、画分5及び画分6において観察された（図４F）。
A luciferase ligand assay was performed on each fraction obtained. (B) MeOH fraction and (D) BuOH fraction activated PPARγ in a concentration-dependent manner. Furthermore, strong activation of PPARγ was observed in
一方、糖が含まれる（C）水画分、及びタマネギに含まれるケルセチン配糖体（ケルセチン-4'-O-グルコシド及びケルセチン-3,4'-O-ジグルコシド）が含まれると推測される（E）MeOH画分は、PPARγをほとんど活性化しなかった（図４B-E）。 On the other hand, it is presumed that the (C) water fraction containing sugars and quercetin glycosides (quercetin-4'-O-glucoside and quercetin-3,4'-O-diglucoside) contained in onions are contained. (E) The MeOH fraction hardly activated PPARγ (Fig. 4B-E).
続いて、画分5（414 mg）をCHCl3 / MeOH /水酸化アンモニウム（10：1：0.1）の混合溶媒を用いた分取TLCを行い、リンモリブデン酸による呈色を指標にRf = 0.30の化合物を含むシリカゲルを収集し、化合物1（60 mg）を純粋な形の白色固体として得た。化合物1の構造解析を、Thermo Scientific Q Exactive機器装置（Thermo Fisher Scientific Inc. Massachusetts, U.S.）を用いた高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（HRESIMS）、核磁気共鳴装置（Bruker, Massachusetts, U.S.）を用いた1H-NMR分析（測定条件500 MHz）及び13C-NMR分析（測定条件125 MHz）によって行い、またP-2200旋光計（JASCO, Tokyo, Japan）を用いて旋光度を測定した。
Subsequently, fraction 5 (414 mg) was subjected to preparative TLC using a mixed solvent of CHCl 3 /MeOH/ammonium hydroxide (10:1:0.1), and Rf = 0.30 with coloration by phosphomolybdic acid as an index. The silica gel containing the compound was collected to give compound 1 (60 mg) as a white solid in pure form. Structural analysis of
化合物1のNMRスペクトルデータ（500 MHz, CD3OD）を表１に示す。また、化合物1及び(10E)-9,12,13-trihydroxyoctadec-10-enoic acidの立体異性体における絶対配置と1H-NMRスペクトルデータ及び比旋光度との関係を表２に示す。これらの結果から、化合物1は、(9S,10E,12S,13S)-9,12,13-トリヒドロキシ-10-オクタデセン酸、すなわちピネリン酸であると同定された。また、化合物1は画分1～10から合計で200 mg得られたことから、（A）の水抽出物は、乾燥重量1 gあたり約0.3 mgのピネリン酸を有することが確認された。
また、図３中の（B）MeOH画分、（D）BuOH画分及び（E）MeOH画分をTLCプレートにそれぞれスポットし、n-BuOH/酢酸/水（4：2：1）又はn-BuOH/水酸化アンモニウム（5：1）の混合溶媒を用いて展開した。これらのTLCプレートに展開された化合物の呈色は、バニリン硫酸、ニンヒドリン、ギブスを用いた。 In addition, (B) MeOH fraction, (D) BuOH fraction and (E) MeOH fraction in FIG. It was developed with a mixed solvent of -BuOH/ammonium hydroxide (5:1). Vanillin sulfate, ninhydrin, and Gibbs were used to color the compounds developed on these TLC plates.
展開溶媒としてn-BuOH/酢酸/水を用いたTLCでは、ケルセチン及びその配糖体（ケルセチン4’-O-グルコシド及びケルセチン3,4’-O-グルコシド）は、（B）MeOH画分と（E）MeOH画分に含まれ、（D）BuOH画分には含まれないことが確認された（図５左）。この結果から、（B）MeOH画分にはピネリン酸とケルセチン及びその配糖体の両方が含まれるものの、（B）MeOH画分をシリカゲルに吸着させてBuOHで溶出することによってピネリン酸は（D）BuOH画分に分離され、一方でケルセチン及びその配糖体はシリカゲルに吸着した状態で留まること、またその後のMeOHでの溶出によってシリカゲルに吸着していたケルセチン及びその配糖体が溶出されたものと考えられた。
In TLC using n-BuOH/acetic acid/water as a developing solvent, quercetin and its glycosides (quercetin 4'-O-glucoside and
展開溶媒としてn-BuOH/水酸化アンモニウムを用いたTLCでは、ケルセチン及びその配糖体（ケルセチン4’-O-グルコシド及びケルセチン3,4’-O-グルコシド）はいずれも展開されなかった（図５右）。このことから、ケルセチン及びその配糖体はアルカリ性のn-ブタノール水溶液下では固定相であるシリカゲルに対する高い親和性を示すことが再確認された。
Neither quercetin nor its glycosides (
実施例２ ピネリン酸のPPARα及びPPARγ活性化能
（１）ピネリン酸のPPARγ活性化能
実施例１で単離精製したピネリン酸を用いてルシフェラーゼリガンドアッセイを行い、PPARγ活性化能を測定した。ピネリン酸はPPARγを濃度依存的に活性化し、1000μMで非常に高い活性を示した（図６A）。
Example 2 PPARα and PPARγ Activating Ability of Pinelic Acid (1) PPARγ Activating Ability of Pinelic Acid Using the pinelic acid isolated and purified in Example 1, a luciferase ligand assay was performed to measure the PPARγ activating ability. Pinelic acid activated PPARγ in a concentration-dependent manner, showing a very high activity at 1000 μM (Fig. 6A).
また、PPARγ選択的阻害剤であるT0070907（図中、T0.と表す）の存在下でのピネリン酸のPPARγ活性化能を測定した。T0070907との同時処理では、ピオグリタゾンによるPPARγの活性化が阻害されただけでなく、ピネリン酸によるPPARγの活性化も有意に阻害された（図６B）。 In addition, the ability of pinelic acid to activate PPARγ in the presence of a PPARγ selective inhibitor T0070907 (represented as T0 in the figure) was measured. Co-treatment with T0070907 not only inhibited the activation of PPARγ by pioglitazone, but also significantly inhibited the activation of PPARγ by pinellinic acid (Fig. 6B).
次いで、ピネリン酸とピオグリタゾンとを組み合わせたルシフェラーゼリガンドアッセイを行うことで、両者の競合を評価した。ピネリン酸は、ピオグリタゾンによるPPARγの活性化に影響を与えず（図６C）、ピオグリタゾンを競合阻害しないことが示された。 A luciferase ligand assay was then performed combining pinelic acid and pioglitazone to assess their competition. Pinelic acid did not affect the activation of PPARγ by pioglitazone (Fig. 6C), indicating that it does not competitively inhibit pioglitazone.
（２）ピネリン酸のPPARα活性化能
ピネリン酸を用いてルシフェラーゼリガンドアッセイを行い、PPARα活性化能を測定した。ピネリン酸はPPARαを濃度依存的に活性化し、1000μMで非常に高い活性を示した（図７A）。
(2) PPARα Activating Ability of Pinelic Acid A luciferase ligand assay was performed using pinelic acid to measure the PPARα activating ability. Pinellinic acid activated PPARα in a concentration-dependent manner and showed a very high activity at 1000 µM (Fig. 7A).
また、PPARα選択的阻害剤であるGW647130（図中、GW.と表す）の存在下でのピネリン酸のPPARγ活性化能を測定した。GW647130との同時処理では、陽性コントロールであるWY-14643によるPPARαの活性化が阻害されただけでなく、ピネリン酸によるPPARαの活性化も有意に阻害された（図７B）。 In addition, the ability of pinelic acid to activate PPARγ in the presence of GW647130 (indicated as GW. in the figure), which is a PPARα selective inhibitor, was measured. Co-treatment with GW647130 not only inhibited PPARα activation by the positive control WY-14643, but also significantly inhibited PPARα activation by pinellinic acid (Fig. 7B).
次いで、ピネリン酸とWY-14643とを組み合わせたルシフェラーゼリガンドアッセイを行うことで、両者の競合を評価した。ピネリン酸は、WY-14643によるPPARαの活性化を低下させたことから（図７C）、WY-14643を競合的に阻害することが示された。
Next, a luciferase ligand assay combining pinelic acid and WY-14643 was performed to evaluate competition between the two. Pinelic acid decreased the activation of PPARα by WY-14643 (Fig. 7C), indicating that it competitively inhibited WY-14643.
Claims (11)
突然変異誘発処理後の植物体若しくは植物体の部分、又はこれらを栽培若しくは培養することによって得られた植物体若しくは植物体の部分に対して、細胞破壊処理又は酸化ストレス処理を行う工程、及び
細胞破壊処理又は酸化ストレス処理後の植物体又は植物体の部分を含む試料中のピネリン酸濃度を、対照濃度と比較する工程
を含む、PPARα及びPPARγの活性化能が高められた植物を製造する方法。 subjecting the plant or plant part to mutagenesis treatment;
a step of subjecting a plant body or a plant body part after a mutagenesis treatment, or a plant body or a plant body part obtained by cultivating or culturing the same, to a cell destruction treatment or an oxidative stress treatment; A method for producing a plant with enhanced ability to activate PPARα and PPARγ, comprising the step of comparing the concentration of pinelic acid in a sample containing a plant body or plant part after destruction treatment or oxidative stress treatment with a control concentration. .
疎水性担体に吸着した物質をメタノールで溶出する工程、
メタノール溶出液を濃縮後、n-ブタノール中でシリカゲルと接触させる工程、
シリカゲルに吸着した物質を、アルカリ性のn-ブタノール水溶液で溶出する工程、及び
アルカリ性のn-ブタノール水溶液による溶出液を回収する工程
を含む、フラボノール類又はその配糖体に対するピネリン酸の相対的含有量が向上したPPARα及びPPARγの活性化用組成物を製造する方法。 contacting a composition containing flavonols or their glycosides and pinellinic acid with a hydrophobic carrier in an aqueous medium;
a step of eluting the substance adsorbed on the hydrophobic carrier with methanol;
concentrating the methanol eluate and then contacting it with silica gel in n-butanol;
Relative content of pinellinic acid to flavonols or their glycosides, including a step of eluting substances adsorbed on silica gel with an alkaline aqueous n-butanol solution, and a step of recovering the eluate from the alkaline aqueous n-butanol solution. A method for producing a composition for activating PPARα and PPARγ with improved
The method according to any one of claims 7 to 10, wherein the flavonols or its glycoside is quercetin or its glycoside.
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