JP2023092810A - Mutated antibody, and method for producing mutated antibody - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、プロテインAに対する親和性を利用して精製される抗体分子又は低分子抗体分子であって所定の位置にアミノ酸置換変異を導入した変異抗体、及び当該変異抗体の製造方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to antibody molecules or low-molecular-weight antibody molecules that are purified using their affinity for protein A, and which are mutated antibodies in which amino acid substitution mutations are introduced at predetermined positions, and methods for producing the mutated antibodies.
抗原に対する高い特異性と親和性を有する機能性タンパク質である抗体は、動物細胞を用いて調製する。動物細胞で発現した抗体は、分子内のFc領域とプロテインAとの親和性を利用して精製される。ただし、動物細胞を利用した抗体の製造プロセスには、非常に高いコストがかかるという課題がある。そこで、より安価な抗体医薬品を調製するため、標的抗原への結合に関与する抗体重鎖及び軽鎖の可変領域（Variable domain of Heavy chain; VH、Variable domain of Light chain; VL）を含む低分子抗体の開発が進められている。 Antibodies, which are functional proteins with high specificity and affinity for antigens, are prepared using animal cells. Antibodies expressed in animal cells are purified using the affinity between the Fc region and protein A within the molecule. However, the antibody production process using animal cells has the problem of being extremely expensive. Therefore, in order to prepare antibody drugs at a lower cost, small molecules containing antibody heavy chain and light chain variable regions (Variable domain of heavy chain; VH, Variable domain of light chain; VL) involved in binding to target antigens have been developed. Antibody development is underway.
低分子抗体は、Fc領域を有しないためプロテインAを用いて精製できず、通常、タグを付加した分子として合成し、当該タグと金属イオンの相互作用を利用した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（Immobilized metal affinity chromatography;IMAC）により精製される。例えば、低分子抗体の末端に6xヒスチジンタグ(Hisタグ)を付加した場合、ニッケルイオンやコバルトイオンとの相互作用を利用したIMACが使用される。 Low-molecular-weight antibodies cannot be purified using protein A because they do not have an Fc region, and are usually synthesized as tagged molecules and immobilized metal affinity chromatography (immobilized Purified by metal affinity chromatography (IMAC). For example, when a 6x histidine tag (His tag) is added to the end of a low-molecular-weight antibody, IMAC using an interaction with nickel ions or cobalt ions is used.
しかし、IMACによる抗体精製法は、抗体凝集やタグ分解に伴う試料の不均一性、免疫原性の惹起、カラムからの金属イオンの漏出、薬物動態への影響などが懸念されている（非特許文献１：MAbs 2014, 6 (6), 1551-1559及び非特許文献２：Theranostics 2014, 4 (7), 708-720.）。 However, the IMAC antibody purification method raises concerns about sample heterogeneity due to antibody aggregation and tag degradation, immunogenicity, leakage of metal ions from the column, and effects on pharmacokinetics (non-patented). Document 1: MAbs 2014, 6 (6), 1551-1559 and non-patent document 2: Theranostics 2014, 4 (7), 708-720.).
また、低分子抗体の精製には、上述したHisタグ以外にGSTタグ、HAタグ、FLAGタグ、Mycタグなどを使用することができる。しかしながら、GSTタグは酵素基質反応を利用するため特異性が高く、目的タンパク質の可溶性発現を促進する一方で、タグサイズが28kDaと大きいため、精製後のタグ切断が必要であり操作が煩雑になる。さらに、HAタグ、FLAGタグ、Mycタグは短いペプチド配列で高い精製度を可能とする一方で、精製リガンドとしてIgG抗体を用いるため高コストとなることが課題である。 In addition to the His tag described above, a GST tag, HA tag, FLAG tag, Myc tag, and the like can be used for the purification of low-molecular-weight antibodies. However, since the GST tag utilizes an enzyme-substrate reaction, it has high specificity and promotes soluble expression of the target protein. . Furthermore, while the HA tag, FLAG tag, and Myc tag enable a high degree of purification with a short peptide sequence, the use of an IgG antibody as a purification ligand poses a problem of high cost.
ところで、プロテインAは、Fc領域を有する抗体を精製する際に利用されているが、重鎖可変領域（VH領域）サブクラスのなかでVH3に属する一部に対しては親和性を有することが知られている（非特許文献３）。しかしながら、プロテインAと親和性を有するVH領域、プロテインAと親和性を有しないVH領域に関する研究成果は十分ではなく、所定の抗体又は低分子抗体に対してプロテインAとの親和性を改変する技術は知られていなかった。 By the way, protein A is used to purify antibodies having an Fc region, and it is known to have affinity for a portion of the heavy chain variable region (VH region) subclass belonging to VH3. (Non-Patent Document 3). However, research results on VH regions that have affinity for protein A and VH regions that do not have affinity for protein A are not sufficient. was not known.
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、抗体又は低分子抗体におけるプロテインAに対する親和性を改変できる技術を開発し、プロテインAに対する親和性を有しないVH領域に当該親和性を付与し、或いは、プロテインAに対する親和性を有するVH領域に当該親和性を低減させることで、プロテインAに対する親和性を改変した変異抗体、及び当該変異抗体の製造方法を提供することを目的とする。 Therefore, in view of the circumstances described above, the present invention develops a technique capable of modifying the affinity of an antibody or low-molecular-weight antibody for protein A, imparts the affinity to a VH region that does not have an affinity for protein A, or , an object of the present invention is to provide a mutant antibody whose affinity for protein A is altered by reducing the affinity to a VH region that has an affinity for protein A, and a method for producing the mutant antibody.
上述した目的を達成するために、本発明者らが鋭意検討した結果、VH領域における特定のアミノ酸残基がプロテインAに対する親和性に特に深く寄与しており、当該アミノ酸残基を改変することで、プロテインAに対する親和性を改変できるといった知見を見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies by the present inventors in order to achieve the above-mentioned object, it was found that a specific amino acid residue in the VH region significantly contributes to the affinity for protein A, and that by modifying the amino acid residue, , the affinity for protein A can be modified, and the present invention has been completed.
本発明は以下を包含する。
（１） Kabatナンバリングにおける65番目のアミノ酸残基及び/又は82a番目のアミノ酸残基をそれぞれグリシン及びアスパラギンに置換することで、当該65番目がグリシンであり、且つ、当該82a番目がアスパラギンであるVH領域を有する変異抗体。
（２） 更に、Kabatナンバリングにおける16番目のアミノ酸残基をリシン、アルギニン及びグリシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換することで、当該16番目がリシン、アルギニン及びグリシンからなる群から選ばれるアミノ酸である（１）記載の変異抗体。
（３） 上記VH領域を含むscFv、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2又はVHHであることを特徴とする（１）記載の変異抗体。
（４） アミノ酸置換により、Kabatナンバリングにおける19番目のアミノ酸残基がアルギニンであり、70番目がセリンであり、81番目がグルタミン酸であり、82b番目がセリンであることを特徴とする（１）記載の変異抗体。
（５） プロテインAに対する親和性を有する抗体であってKabatナンバリングにおける65番目のアミノ酸残基がグリシンであるVH領域を有する抗体に対し、当該65番目をグリシン以外のアミノ酸残基に置換変異したVH領域を有し、プロテインAに対する親和性が置換変異前と比較して低減した変異抗体。
（６） 上記VH領域を含むscFv、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2又はVHHであることを特徴とする（５）記載の変異抗体。
（７） 上記グリシン以外のアミノ酸残基はアラニンであることを特徴とする（５）記載の変異抗体。
（８） 上記（１）乃至（４）いずれか記載の変異抗体を、プロテインAとの親和性を利用して精製する工程を含む、変異抗体の製造方法。
（９） 上記変異抗体を発現する細胞を培養し、当該細胞又は当該細胞の抽出物を得る工程を更に含み、当該細胞又は当該抽出物に含まれる上記変異抗体を、プロテインAとの親和性を利用して精製することを特徴とする（８）記載の変異抗体の製造方法。
The present invention includes the following.
(1) VH in which the 65th amino acid residue and/or the 82ath amino acid residue in Kabat numbering are substituted with glycine and asparagine, respectively, so that the 65th amino acid residue is glycine and the 82ath amino acid residue is asparagine Mutant antibody with regions.
(2) Furthermore, by substituting the 16th amino acid residue in Kabat numbering with an amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine and glycine, the 16th is an amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine and glycine. A mutant antibody according to (1).
(3) The mutant antibody according to (1), which is scFv, Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 or VHH comprising the VH region.
(4) Characterized by amino acid substitution, wherein the 19th amino acid residue in Kabat numbering is arginine, the 70th is serine, the 81st is glutamic acid, and the 82b is serine. mutated antibody.
(5) A VH in which the 65th amino acid residue in Kabat numbering is substituted with an amino acid residue other than glycine for an antibody having an affinity for protein A and having a VH region in which the 65th amino acid residue in Kabat numbering is glycine. A mutant antibody having a region and having a reduced affinity for protein A compared to that before substitution mutation.
(6) The mutant antibody according to (5), which is scFv, Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 or VHH containing the VH region.
(7) The mutant antibody according to (5), wherein the amino acid residue other than glycine is alanine.
(8) A method for producing a mutated antibody, comprising the step of purifying the mutated antibody according to any one of (1) to (4) above using affinity with protein A.
(9) further comprising the step of culturing the cells expressing the mutated antibody to obtain the cells or an extract of the cells, wherein the mutated antibody contained in the cells or the extract has an affinity for protein A; The method for producing a mutant antibody according to (8), wherein the mutant antibody is purified using
本発明によれば、抗体又は低分子抗体におけるプロテインAに対する親和性を改変することができる。すなわち、本発明に係る変異抗体は、所定のアミノ酸残基の置換変異により、プロテインAに対する親和性を獲得することができる。また、本発明に係る変異抗体は、所定のアミノ酸残基の置換変異により、プロテインAに対する親和性を低減することができる。 According to the present invention, the affinity for protein A in antibodies or small antibodies can be modified. That is, the mutant antibody according to the present invention can acquire affinity for protein A by substitution mutation of predetermined amino acid residues. In addition, the mutant antibody according to the present invention can have reduced affinity for protein A by substitution mutation of predetermined amino acid residues.
また、本発明に係る変異抗体の製造方法では、所定のアミノ酸残基の置換変異により、プロテインAに対する親和性を獲得した変異抗体を、プロテインAとの親和性を利用して精製することができる。 In addition, in the method for producing a mutant antibody according to the present invention, a mutant antibody that has acquired affinity for protein A by substitution mutation of predetermined amino acid residues can be purified using the affinity for protein A. .
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る変異抗体は、抗体又は低分子抗体に含まれる重鎖可変領域（VH領域）の特定のアミノ酸残基を置換変異することで、プロテインAに対する親和性を新たに獲得したもの、又はプロテインAとの親和性が低下したものである。すなわち、本発明に係る変異抗体は、特定の置換変異により、プロテインAに対する親和性が改変したものである。
The present invention will be described in detail below.
Mutant antibody according to the present invention, by substitution mutation of specific amino acid residues of the heavy chain variable region (VH region) contained in the antibody or low-molecular-weight antibody, newly acquired affinity for protein A, or It has a reduced affinity for protein A. That is, the mutant antibody according to the present invention has an altered affinity for protein A due to specific substitution mutations.
プロテインAとの親和性を獲得するための置換変異は、Kabatナンバリングにおける65番目のアミノ酸残基のグリシン残基への置換及び/又は82a番目のアミノ酸残基のアスパラギン残基への置換である。これらいずれか一方又は両方の置換により、Kabatナンバリングにおける65番目がグリシン残基、82a番目がアスパラギン残基となったVH領域を有する抗体又は低分子抗体は、プロテインAとの親和性を獲得することとなる。
Substitutional mutations for gaining affinity with protein A are substitution of glycine residue for amino acid residue 65 and/or substitution of asparagine residue for
さらに、Kabatナンバリングにおける16番目のアミノ酸残基をリシン、アルギニン及びグリシンからなる群から選ばれるアミノ酸とする置換変異により、当該16番目のアミノ酸残基がリシン、アルギニン又はグリシンとなったVH領域を有する抗体又は低分子抗体は、プロテインAに対するより優れた親和性を獲得することができる。 Furthermore, it has a VH region in which the 16th amino acid residue in Kabat numbering is lysine, arginine, or glycine by substitution mutation to an amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine, and glycine. Antibodies or small antibodies can acquire greater affinity for protein A.
一方、プロテインAとの親和性を低減するための置換変異は、Kabatナンバリングにおける65番目のグリシン残基の、グリシン以外のアミノ酸への置換である。この置換によって、Kabatナンバリングにおける65番目がグリシン以外のアミノ酸残基となったVH領域を有する抗体又は低分子抗体は、プロテインAとの親和性が低減することとなる。 On the other hand, the substitution mutation for reducing the affinity with protein A is substitution of the 65th glycine residue in Kabat numbering with an amino acid other than glycine. Due to this substitution, an antibody or a low-molecular-weight antibody having a VH region with an amino acid residue other than glycine at position 65 in Kabat numbering has a reduced affinity for protein A.
なお、本明細書において、抗体や低分子抗体を構成するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置はKabatナンバリングに基づく数値で表記している。したがって、本明細書において記載するアミノ酸残基の位置は、本書に添付する配列表に記載されたアミノ酸配列に基づく数値とは異なることに留意する。なお、Kabatナンバリングは、Sequences of proteins of immunological interest、Elvin A. Kabat et al.、NIH publication, no. 91-3242（National Institutes of Health, 1991、5th ed.）に記載のものを採用している。 In this specification, the positions of amino acid residues in the amino acid sequences constituting antibodies and low-molecular-weight antibodies are indicated by numerical values based on Kabat numbering. Therefore, it should be noted that the amino acid residue positions described herein are different from the numerical values based on the amino acid sequences described in the sequence listing attached hereto. For Kabat numbering, those described in Sequences of proteins of immunological interest, Elvin A. Kabat et al., NIH publication, no. 91-3242 (National Institutes of Health, 1991, 5th ed.) are used. .
本明細書で単に「抗体」と記載する場合、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す抗体分子を意味し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び後述する低分子抗体を含む、種々の抗体構造を包含する。一方、本明細書で「抗体又は低分子抗体」と記載する場合において「抗体」は、上述した定義のうち「低分子抗体」を除く抗体分子を意味する。 When simply referred to herein as an "antibody", it is used in the broadest sense and refers to antibody molecules exhibiting the desired antigen-binding activity, including monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (e.g., bispecific antibodies) and small antibodies described below. On the other hand, when the term "antibody or low-molecular-weight antibody" is used herein, the term "antibody" means an antibody molecule other than the "low-molecular-weight antibody" defined above.
「低分子抗体」とは、完全長の抗体分子の一部分を含み、完全長の抗体分子が結合する抗原に対して結合する能力を保持した抗体分子を意味する。低分子抗体は、抗体断片と称する場合もある。低分子抗体としては、特に限定されないが、例えば、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；VHH（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）を挙げることができる。また、低分子抗体は、これら列挙した分子から形構成される多重特異性抗体も含まれる。 By "small antibody" is meant an antibody molecule that contains a portion of a full-length antibody molecule and retains the ability to bind to the antigen to which the full-length antibody molecule binds. Small antibodies are sometimes referred to as antibody fragments. Examples of low-molecular-weight antibodies include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') 2 ; diabodies; linear antibodies; single-chain antibody molecules (e.g., scFv); VHH (variable domain of heavy chain of heavy chain antibody). Low-molecular-weight antibodies also include multispecific antibodies formed from these listed molecules.
本発明において抗体のクラスは、特に限定されず、抗体における5つの主要なクラスであるIgA、IgD、IgE、IgG及びIgMのいずれであってもよい。また、本発明において抗体のサブクラス（アイソタイプ）は特に限定されず、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2等のいずれであってもよい。 In the present invention, the antibody class is not particularly limited, and may be any of the five major classes of antibodies, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM. In the present invention, the antibody subclass (isotype) is not particularly limited, and may be, for example, any of IgG1 , IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgA1 and IgA2 .
なお、scFvは、2つの可変領域を、必要に応じリンカー等を介して、結合させた一本鎖ポリペプチドである。scFvに含まれる2つの可変領域は、通常、1つのVHと1つのVLであるが、2つのVH又は2つのVLであってもよい。一般にscFvポリペプチドは、VH及びVLドメインの間にリンカーを含み、それにより抗原結合のために必要なVH及びVLの対部分が形成される。通常、同じ分子内でVH及びVLの間で対部分を形成させるために、一般に、VH及びVLを連結するリンカーを10アミノ酸以上の長さのぺプチドリンカーとする。しかしながら、本発明におけるscFvのリンカーは、scFvの形成を妨げない限り、このようなペプチドリンカーに限定されるものではない。 A scFv is a single-chain polypeptide in which two variable regions are linked via a linker or the like, if necessary. The two variable regions contained in the scFv are usually one VH and one VL, but may be two VH or two VL. Generally, scFv polypeptides contain a linker between the VH and VL domains to form the VH and VL pairings necessary for antigen binding. Generally, the linker connecting VH and VL is a peptide linker with a length of 10 amino acids or more so as to form a pair between VH and VL within the same molecule. However, scFv linkers in the present invention are not limited to such peptide linkers as long as they do not interfere with scFv formation.
低分子抗体は、特に、二重特異性抗体とすることができる。「二重特異性抗体」は、例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が1本鎖として連結した構造の抗体（例えば、sc(Fv)2）であってもよい。また重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)が連結したscFv（あるいはsc(Fv)2）をFc領域(CH1ドメインを欠いた定常領域)と結合した抗体様分子（例えば、scFv-CH3）であってもよい。 Small antibodies, in particular, can be bispecific antibodies. A “bispecific antibody” may be, for example, an antibody having a structure in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linked as a single chain (eg, sc(Fv) 2 ). Alternatively, an antibody-like molecule (e.g. , scFv -CH3 ).
抗体を構成する各鎖のアミノ末端部分には、抗原認識に主に関与する約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。可変領域では３つのループが重鎖及び軽鎖の各Vドメイン（すなわち、VH及びVL）について集合しており、抗原結合部位を形成する。各ループは、相補性決定領域とも称さる（以下、「CDR」とも称する）。すなわち、各VH及びVLは、３つのCDRと４つのフレームワーク領域（FR）からなり、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。 The amino-terminal portion of each chain that constitutes an antibody includes a variable region of about 100 to 110 or more amino acids primarily involved in antigen recognition. Three loops assemble in the variable region for each of the heavy and light chain V domains (ie, VH and VL) to form the antigen-binding site. Each loop is also called a complementarity determining region (hereinafter also called "CDR"). Thus, each VH and VL consists of three CDRs and four framework regions (FRs), arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. .
本発明において、抗体又は低分子抗体の可変領域は、ヒト由来であってもよく、ヒト以外の哺乳動物由来であってもよく、両者が混在するよう改変されたものであってもよい。ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びウマが挙げられるが、これらに限定されるものではない。同様に、本発明において、抗体又は低分子抗体の定常領域は、ヒト由来であってもよく、ヒト以外の哺乳動物由来であってもよく、両者が混在するよう改変されたものであってもよい。ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びウマが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、本発明において、抗体又は低分子抗体の定常領域と可変領域とが異なる種に由来するものであってもよい。 In the present invention, the variable region of an antibody or low-molecular-weight antibody may be human-derived, non-human mammalian-derived, or modified so that both are mixed. Mammals other than humans include, but are not limited to, for example, mice, rats, rabbits, goats, sheep and horses. Similarly, in the present invention, the constant region of an antibody or low-molecular-weight antibody may be human-derived, may be derived from mammals other than humans, or may be modified so that both are mixed. good. Mammals other than humans include, but are not limited to, for example, mice, rats, rabbits, goats, sheep and horses. Furthermore, in the present invention, the constant region and variable region of the antibody or low-molecular-weight antibody may be derived from different species.
ここで、Kabatナンバリングにおける65番目のアミノ酸残基は、VH領域におけるCDR2に位置する。Kabatナンバリングにおける82a番目のアミノ酸残基は、VH領域におけるFR3に位置する。なお、VHファミリーには、VH1～VH7までの7つ種類が存在する。これら7種類のVH領域（VH1～VH7）を有する抗体の例を表１に示す。 Here, the 65th amino acid residue in Kabat numbering is located in CDR2 in the VH region. The 82a amino acid residue in Kabat numbering is located in FR3 in the VH region. The VH family has seven types, VH1 to VH7. Table 1 shows examples of antibodies having these seven VH regions (VH1 to VH7).
表１に示すVH1～VH7のアミノ酸配列のマルチプルアライメントを図１に示す。なお、表１及び図１において、IgM RF 2A2は、プロテインAとの共結晶構造が明らかとなったVH（VH3に属する）を有している。また、図１のマルチプルアライメントにおいて、枠で囲った位置は、Graille, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000, 97 (10), 5399-5404において、VH3とプロテインAとの共結晶構造から、相互作用に関与すると報告されたアミノ酸残基を示している。具体的には、VH領域における15番目のグリシン残基、17番目のセリン残基、19番目のアルギニン残基、57番目のリシン残基、59番目のチロシン残基、64番目のリシン残基、65番目のグリシン残基、66番目のアルギニン残基、68番目のトレオニン残基、70番目のセリン残基、81番目のグルタミン残基、82a番目のアスパラギン残基、82b番目のセリン残基がプロテインAとの結合に関与することが示唆されている。 A multiple alignment of the amino acid sequences of VH1 to VH7 shown in Table 1 is shown in FIG. In addition, in Table 1 and FIG. 1, IgM RF 2A2 has a VH (belonging to VH3) whose co-crystal structure with protein A has been clarified. In addition, in the multiple alignment of FIG. 1, the framed positions correspond to VH3 and protein A in Graille, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. The amino acid residues reported to be involved in the interaction from the co-crystal structure of are shown. Specifically, the 15th glycine residue, the 17th serine residue, the 19th arginine residue, the 57th lysine residue, the 59th tyrosine residue, the 64th lysine residue in the VH region, 65th glycine residue, 66th arginine residue, 68th threonine residue, 70th serine residue, 81st glutamine residue, 82ath asparagine residue, 82bth serine residue are protein It has been suggested to be involved in binding to A.
図１に示した「VH3(bind)」のアミノ酸配列を配列番号１とし、「VH1」のアミノ酸配列を配列番号２とし、「VH2」のアミノ酸配列を配列番号３とし、「VH3」のアミノ酸配列を配列番号４とし、「VH4」のアミノ酸配列を配列番号５とし、「VH5」のアミノ酸配列を配列番号６とし、「VH6」のアミノ酸配列を配列番号７とし、「VH7」のアミノ酸配列を配列番号８とした。
The amino acid sequence of "VH3 (bind)" shown in FIG. is SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of "VH4" is SEQ ID NO: 5, the amino acid sequence of "VH5" is SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence of "VH6" is SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of "VH7" is the
本発明では、上述のように、プロテインAに対する親和性を獲得するため、プロテインAに対する親和性を有しない抗体又は低分子抗体に対して、VH領域の65番目をグリシン残基とし、且つ82a番目をアスパラギン残基とするように置換変異を導入する。また、当該置換変異に加えて、本発明では、上述のように、プロテインAに対する更に優れた親和性を獲得するため、VH領域の16番目をリシン、アルギニン又はグリシン残基とする置換変異を導入する。さらに、本発明では、これら置換変異に加えて更なる置換変異を導入しても良い。例えば、これら置換変異に加えて、VH領域における15番目がグリシン残基、17番目がセリン残基、19番目がアルギニン残基、57番目がリシン残基、59番目がチロシン残基、64番目がリシン残基、66番目がアルギニン残基、68番目がトレオニン残基、70番目がセリン残基、81番目がグルタミン残基、82b番目がセリン残基となるよう、１以上の置換変異を導入しても良い。
In the present invention, as described above, in order to acquire affinity for protein A, for antibodies or low-molecular-weight antibodies that do not have affinity for protein A, the 65th glycine residue in the VH region and the 82a is an asparagine residue. Further, in addition to the substitution mutation, in the present invention, as described above, in order to acquire even better affinity for protein A, a substitution mutation is introduced in which the 16th position of the VH region is a lysine, arginine or glycine residue. do. Furthermore, in the present invention, further substitution mutations may be introduced in addition to these substitution mutations. For example, in addition to these substitution mutations, the 15th glycine residue, 17th serine residue, 19th arginine residue, 57th lysine residue, 59th tyrosine residue, and 64th tyrosine residue in the VH region Lysine residue, arginine residue at position 66, threonine residue at position 68, serine residue at
また、本発明では、上述のように、プロテインAに対する親和性を低減するため、プロテインAに対する親和性を有する抗体又は低分子抗体に対して、65番目のグリシン残基をグリシン以外のアミノ酸残基となるように置換変異を導入するが、当該置換変異に加えて、VH領域における15番目がグリシン残基以外のアミノ酸残基、17番目がセリン残基以外のアミノ酸残基、19番目がアルギニン残基以外のアミノ酸残基、57番目がリシン残基以外のアミノ酸残基、59番目がチロシン残基以外のアミノ酸残基、64番目がリシン残基以外のアミノ酸残基、66番目がアルギニン残基以外のアミノ酸残基、68番目がトレオニン残基以外のアミノ酸残基、70番目がセリン残基以外のアミノ酸残基、81番目がグルタミン残基以外のアミノ酸残基、82a番目がアスパラギン残基以外のアミノ酸残基、82b番目がセリン残基以外のアミノ酸残基となるよう、１以上の置換変異を導入しても良い。
Further, in the present invention, as described above, in order to reduce the affinity for protein A, the 65th glycine residue is replaced with an amino acid residue other than glycine for antibodies or low-molecular-weight antibodies that have affinity for protein A. In addition to the substitution mutation, the 15th in the VH region is an amino acid residue other than a glycine residue, the 17th is an amino acid residue other than a serine residue, and the 19th is an arginine residue. 57th amino acid residue other than lysine residue, 59th amino acid residue other than tyrosine residue, 64th amino acid residue other than lysine residue, 66th non-arginine residue 68th is an amino acid residue other than a threonine residue, 70th is an amino acid residue other than a serine residue, 81st is an amino acid residue other than a glutamine residue, 82a is an amino acid other than an asparagine residue One or more substitution mutations may be introduced so that
ここで、プロテインAに対する親和性を低減するため、置換後の65番目のグリシン残基をグリシン以外のアミノ酸残基する形態において、置換後のアミノ酸残基は、特に限定されず、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、ピロリシン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン及びチロシンの何れであってもよい。特に、置換後の65番目のグリシン残基を置換する場合、これら列挙したアミノ酸の中で最も側鎖の小さいアラニンとした場合でもプロテインAに対する親和性を低減することができる。 Here, in order to reduce the affinity for protein A, in the form of replacing the 65th glycine residue after substitution with an amino acid residue other than glycine, the amino acid residue after substitution is not particularly limited, and alanine, cysteine, Aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, pyrrolysine, proline, glutamine, arginine, serine, threonine, selenocysteine, valine, tryptophan and tyrosine. In particular, when the 65th glycine residue after substitution is substituted, even if alanine, which has the smallest side chain among the listed amino acids, is used, the affinity for protein A can be reduced.
以上のような置換変異は、従来公知の方法により導入することができる。すなわち、本発明に係る変異抗体は、遺伝子組換え技術を適用して製造することができる。 Substitution mutations such as those described above can be introduced by conventionally known methods. That is, the mutant antibody according to the present invention can be produced by applying gene recombination technology.
まず、置換変異を導入する抗体又は低分子抗体をコードする核酸に対して、目的とする置換変異が導入されたアミノ酸配列をコードするよう改変する。より具体的に、置換変異導入前のアミノ酸残基に相当するコドンを、置換変異によって導入されるアミノ酸残基のコドンになるように核酸を改変する。通常、目的のアミノ酸残基をコードするコドンとなるように、コドンを構成する核酸の少なくとも1塩基を置換するような遺伝子操作又は変異処理を行う。このような核酸の改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発法、PCR変異導入法等を用いて、適宜実施することができる。 First, a nucleic acid encoding an antibody or low-molecular-weight antibody into which substitution mutations are to be introduced is modified so as to encode an amino acid sequence into which the desired substitution mutations have been introduced. More specifically, the nucleic acid is modified so that the codons corresponding to the amino acid residues before the introduction of the substitutional mutations become the codons of the amino acid residues to be introduced by the substitutional mutations. Generally, genetic manipulation or mutation treatment is performed to replace at least one base of the nucleic acid that constitutes the codon so as to obtain a codon that encodes the desired amino acid residue. Such modification of nucleic acids can be appropriately carried out using techniques known to those skilled in the art, such as site-directed mutagenesis, PCR mutagenesis, and the like.
置換変異を導入したアミノ酸配列をコードする核酸は、通常、適当なベクターへ保持（挿入）され、宿主細胞へ導入される。当該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター（Stratagene）などを使用できる。特に、本発明に係る変異抗体を生産するためにベクターが用いられる場合には、発現ベクターを使用することが好ましい。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されるものではなく、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol.(1988) 8, 466-472）などが好ましい。 A nucleic acid encoding an amino acid sequence into which a substitution mutation has been introduced is usually retained (inserted) in an appropriate vector and introduced into a host cell. The vector is not particularly limited as long as it stably retains the inserted nucleic acid. For example, if E. coli is used as a host, pBluescript vector (Stratagene) can be used as a cloning vector. In particular, it is preferred to use an expression vector when a vector is used to produce the mutated antibodies of the invention. The expression vector is not particularly limited as long as it expresses the polypeptide in vitro, in Escherichia coli, in cultured cells, or in organisms. For example, for in vitro expression, pBEST vector (Promega), pET vector (Invitrogen) for E. coli, pME18S-FL3 vector for cultured cells (GenBank Accession No. AB009864), pME18S vector for organisms (Mol Cell Biol. (1988) 8, 466-472), etc. preferable.
宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ブレビバチルス菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。 Host cells are not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose. Examples of cells for expressing polypeptides include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Brevibacillus), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells (eg, Examples include Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells (eg CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells. Vectors can be introduced into host cells by, for example, calcium phosphate precipitation, electrical pulse perforation (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), lipofection, microbes. It can be carried out by a known method such as an injection method.
宿主細胞において発現した変異抗体（抗体又は低分子抗体）を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、又は細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的の抗体に組み込むことができる。変異抗体（抗体又は低分子抗体）の回収は、培地に分泌される場合は培地から回収することができる。変異抗体（抗体又は低分子抗体）が細胞内に産生される場合は、細胞を回収した後、細胞を溶解し、得られた溶解液から回収することができる。 Appropriate secretion signals can be incorporated into the antibody of interest to secrete the mutant antibody (antibody or small antibody) expressed in the host cell into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space, or into the extracellular environment. can. Recovery of the mutated antibody (antibody or small antibody) can be recovered from the medium if it is secreted into the medium. If the mutated antibody (antibody or small antibody) is produced intracellularly, it can be recovered from the resulting lysate after the cells are harvested.
本発明に係る変異抗体を精製するためには、通常の方法を適用できるが、例えば、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法が挙げられる。 To purify the mutated antibodies of the invention, conventional methods can be applied, such as ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, Known methods include affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography.
特に、上述した置換変異により、プロテインAに対する親和性を有するようになった場合、プロテインAを利用したアフィニティークロマトグラフィーを使用することが好ましい。また、上述した置換変異により、プロテインAに対する親和が低下した場合、プロテインAを利用したアフィニティークロマトグラフィー以外のアフィニティークロマトグラフィー、その他、上述した方法を使用することが好ましい。 In particular, affinity chromatography using protein A is preferably used when the substitution mutation described above results in affinity for protein A. In addition, when the substitution mutation described above reduces the affinity for protein A, affinity chromatography other than affinity chromatography using protein A and other methods described above are preferably used.
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to the following examples.
以下の実施例及び比較例では、ヒト上皮増殖因子受容体(EGFR)とTリンパ球表面抗原CD3を標的とした低分子二重特異性抗体（以下、Ex3 sc1）をモデルとした。Ex3 sc1については、MAbs, 10(6), 854-863 (2018)を参照することができる。Ex3 sc1の抗EGFR抗体528のVH(5H)及び抗CD3抗体OKT3のVH(OH)は、それぞれVH1サブクラス及びVH3サブクラスに属する。OHはVH3サブクラスに属するものの、Ex3はプロテインAに対する結合能を有していない。 In the following examples and comparative examples, a low-molecular-weight bispecific antibody (hereinafter referred to as Ex3 sc1) targeting human epidermal growth factor receptor (EGFR) and T lymphocyte surface antigen CD3 was used as a model. For Ex3 sc1, refer to MAbs, 10(6), 854-863 (2018). VH(5H) of Ex3 sc1 anti-EGFR antibody 528 and VH(OH) of anti-CD3 antibody OKT3 belong to VH1 subclass and VH3 subclass, respectively. Although OH belongs to the VH3 subclass, Ex3 does not have protein A binding ability.
〔比較例１〕
図２に、プロテインAとの共結晶構造が明らかとなったVH3と、Ex3 sc1のVH(5H)と、Ex3 sc1のVH(OH)のアライメントを示した。図２において、プロテインAに親和性を有するVH3における、プロテインAとの相互作用に関与する残基であるG15、S17、R19、K57、Y59、K64、G65、R66、T68、S70、Q80、N82a及びS82bを枠で囲っている。図２に示す「VH3（binding to Protein A）」のアミノ酸配列を配列番号９に示し、Trastuzumab VHのアミノ酸配列を配列番号１０に示し、anti-EGFR VH(5H)のアミノ酸配列を配列番号１１に示し、anti-CD3 VH(OH)のアミノ酸配列を配列番号１２に示した。
[Comparative Example 1]
FIG. 2 shows the alignment of VH3 whose co-crystal structure with protein A has been clarified, VH(5H) of Ex3 sc1, and VH(OH) of Ex3 sc1. In FIG. 2, G15, S17, R19, K57, Y59, K64, G65, R66, T68, S70, Q80, N82a, which are residues involved in interaction with protein A in VH3 having affinity for protein A and S82b are boxed. The amino acid sequence of "VH3 (binding to protein A)" shown in FIG. and the amino acid sequence of anti-CD3 VH(OH) is shown in SEQ ID NO:12.
CDRのアミノ酸配列を改変した場合には抗原結合能の低下を招く可能性があることを考慮し、FRに位置するアミノ酸残基を変異導入箇所とした。すなわち、本比較例では、5HのK19R、T70S、E81Q、S82aN及びR82bS、OHのD82aN変異をEx3 sc1に導入することとした。これら6箇所の変異を導入したEx3 sc1の6重変異体を「Ex3 sc1-6m」と称する。 Considering the possibility that the antigen-binding ability may be reduced when the amino acid sequence of the CDRs is altered, the amino acid residues located in the FRs were selected as sites for mutation. That is, in this comparative example, the K19R, T70S, E81Q and S82aN mutations of 5H and the D82aN mutations of R82bS and OH were introduced into Ex3 sc1. The Ex3 sc1 hexa-mutant introduced with these six mutations is referred to as "Ex3 sc1-6m".
5HのK19R及びT70Sと、OHのD82aNは、Quick change法による部位特異的変異導入、5HのE81Q、S82aN及びR82bS はオーバーラップPCRにより変異導入を行うこととした。部位特異的変異導入に使用したプライマーを表２に示し、オーバーラップPCRに使用したプライマーを表３に示した。表２及び３において変異導入箇所に下線を付した。 5H K19R and T70S and OH D82aN were site-directed mutagenesis by the Quick change method, and 5H E81Q, S82aN and R82bS were mutagenized by overlap PCR. Table 2 shows the primers used for site-directed mutagenesis, and Table 3 shows the primers used for overlap PCR. Mutation sites in Tables 2 and 3 are underlined.
以上により、Ex3 sc1-6mの構造遺伝子を得ることができた。詳細は割愛するが、得られたEx3 sc1-6mの構造遺伝子は、ブレビバチルス菌用発現ベクターpROXb3（株式会社プロテイン・エクスプレス）へ挿入した。得られた発現ベクターを用いてブレビバチルス菌S5を形質転換した。形質転換ブレビバチルスS5をMTN寒天培地（ハイポリペプトン(10g)、酵母エキス BSP-B(2g)、カツオ肉エキス(5g)、3MM stock(1% FeSO4・7H2O、1% MnSO4・7H2O及び0.1% ZnSO4・7H2O、1mL)、滅菌水で0.95Lとし、滅菌後20%グルコース溶液を5%量添加した培地）に播種後、37℃、24時間インキュベートした。得られたコロニーを2mLの2SL培地(ネオマイシン：Nm(+)、終濃度50μg/mL)に植菌し、30℃、120rpmで24時間浸とう培養（前培養）を行った。なお、2SL培地は、Phytone Peptone(40g)、酵母エキス BSP-B(5g)、3MM stock(1mL)、滅菌水で0.9Lとし、pH7.2に調整した培地である。 As a result, the structural gene of Ex3 sc1-6m was obtained. Although details are omitted, the resulting Ex3 sc1-6m structural gene was inserted into an expression vector pROXb3 (Protein Express Co., Ltd.) for Brevibacillus. The resulting expression vector was used to transform Brevibacillus S5. Transformed Brevibacillus S5 was cultured on MTN agar medium (high polypeptone (10 g), yeast extract BSP-B (2 g), bonito meat extract (5 g), 3MM stock (1% FeSO 4 7H 2 O, 1% MnSO 4 7H 2 O and 0.1% ZnSO 4 .7H 2 O, 1 mL), sterilized water to make 0.95 L, and sterilized medium supplemented with 5% 20% glucose solution)), and incubated at 37° C. for 24 hours. The resulting colonies were inoculated into 2 mL of 2SL medium (neomycin: Nm(+), final concentration of 50 μg/mL) and subjected to immersion culture (preculture) at 30° C. and 120 rpm for 24 hours. The 2SL medium is Phytone Peptone (40 g), yeast extract BSP-B (5 g), 3MM stock (1 mL), sterilized water to make 0.9 L, and adjusted to pH 7.2.
続いて、終濃度が0.1MとなるようL-(+)-アルギニンを添加した2SL培地(ネオマイシン：Nm(+)、終濃度50μg/mL)に前培養液を1%量植菌し、30℃、120rpmで48 時間本培養を行った。培養液を4℃、5,000xgで20分間遠心分離することで培養上清と沈殿に分画後、培養上清中のタンパク質を硫酸アンモニウムを用いた塩析により濃縮した。まず、培養上清の60%の質量にあたる硫酸アンモニウムを量り取り、溶かしやすくなるようすりこぎ棒で粒子を細かくした。低温室で泡立てないよう注意しながら培養上清をスターラーバーで撹拌し、その間に硫酸アンモニウムを少しずつ添加した。2時間の攪拌後、4℃、5,000xg、20分間遠心分離し、得られた沈殿に対し4mL程度の1xPBSを加え、沈殿を溶解させた。その後、残存の硫酸アンモニウムを取り除くため、1xPBS を用いた透析を3回行った。4℃、15,000xg、10分間遠心分離して得られた上清を回収し、1mLのNi Sepharoseを充填したカラムを用いた Ni2+アフィニティークロマトグラフィーにより精製を行った。得られたフラクションについてSDS-PAGE解析を行った。結果を図示しないが、いずれにおいても150mM及び200mMイミダゾール存在下で理論分子量付近にバンドが見られ、溶出が確認された。そこでこれらの溶出液を限外濾過により濃縮後、ゲル濾過クロマトグラフィーを行い、Ex3 sc1及びEx3 sc1-6mをそれぞれ精製した。
Subsequently, 1% of the preculture solution was inoculated into 2SL medium (neomycin: Nm(+),
本比較例では、精製したEx3 sc1及びEx3 sc1-6mについて、プロテインAへの親和性を評価した。本評価では、先ず、0.1mLのrProtein A Sepharose Fast Flowをポリプレップクロマトグラフィー用カラムに充填後、6CVのMQ及び50mM Tris-HCl/200mM NaCl(pH8.0)を用いてカラムを平衡化した。その後、精製したサンプルを0.2nmol/200μLアプライし、2CVの1xPBS を用いたWash操作によりカラム未結合のタンパク質を溶出させた。その後、0.1MのGly-HCl(pH3.0)を2CVずつ計3度添加することで、カラムに結合したタンパク質を溶出させた。その際、溶出したサンプルを回収するマイクロチューブには予め溶出液の5%量の1M Tris-HCl(pH9.2)を添加しておき、溶出液の中和を行った。 In this comparative example, affinity to protein A was evaluated for purified Ex3 sc1 and Ex3 sc1-6m. In this evaluation, 0.1 mL of rProtein A Sepharose Fast Flow was first packed into a column for polyprep chromatography, and then the column was equilibrated with 6 CV of MQ and 50 mM Tris-HCl/200 mM NaCl (pH 8.0). After that, 0.2 nmol/200 μL of the purified sample was applied, and the column-unbound protein was eluted by Wash operation using 2 CV of 1×PBS. After that, 0.1 M Gly-HCl (pH 3.0) was added 2 CV three times in total to elute the protein bound to the column. At that time, 1M Tris-HCl (pH 9.2) of 5% of the eluate was added in advance to the microtube for collecting the eluted sample to neutralize the eluate.
結果を図示しないが、変異を導入していないEx3 sc1はプロテインAに対して結合しないことが知られており、カラムにアプライしたEx3 sc1のうち大半がFlow Through及びWash画分で溶出した。一方、プロテインAへの結合能付与を企図し、計6箇所に変異を導入したEx3 sc1-6mについても、Flow Through及びWash画分での溶出が見られ、その挙動はEx3 sc1とほぼ同様であった。 Although the results are not shown, it is known that non-mutated Ex3 sc1 does not bind to protein A, and most of the Ex3 sc1 applied to the column was eluted in the Flow Through and Wash fractions. On the other hand, Ex3 sc1-6m, which was mutated at a total of 6 sites with the intention of imparting binding ability to protein A, also eluted in the Flow Through and Wash fractions, and its behavior was almost the same as that of Ex3 sc1. there were.
以上より、本比較例で作製したEx3 sc1-6mに導入した6箇所の変異箇所のみではプロテインAへの親和性を向上させることはできず、更なる変異導入が必要であると考えられた。 Based on the above, it was considered that the affinity to protein A could not be improved with only the six mutation sites introduced into Ex3 sc1-6m prepared in this comparative example, and further mutation introduction was necessary.
〔実施例１〕
比較例１の結果、プロテインAに親和性を有するVH3のアミノ酸配列に基づいて、FR領域に6箇所変異を導入してもプロテインAに対する親和性は向上しないことが明らかとなった。そこで、プロテインAとの相互作用に重要な残基のうち、相補性決定領域（CDR）に位置するアミノ酸残基に着目し、分子グラフィックツールPyMOLにより共結晶構造（PDB:1EDD）におけるプロテインAとVHの相互作用界面を解析した。
[Example 1]
As a result of Comparative Example 1, it was clarified that introduction of six mutations into the FR region based on the amino acid sequence of VH3 having affinity for protein A does not improve the affinity for protein A. Therefore, we focused on the amino acid residues located in the complementarity determining regions (CDR) among the important residues for interaction with protein A, and used the molecular graphics tool PyMOL to identify protein A and protein A in the co-crystal structure (PDB: 1EDD). The interaction interface of VH was analyzed.
プロテインAとの結合に重要な残基のうち、CDRに位置するアミノ酸残基はK57、Y59、K64及びG65である（図１及び２）。このうちY59及びK64は、プロテインAと結合する能力を有しないEx3 sc1においても保存されている。また、57番目のアミノ酸残基について、K、R及びTのいずれかであれば、プロテインAと結合可能であることが報告されている（Crauwels, M.et al., Biotechnol. 2020, 57 (September 2019), 20-28）。 Among the residues important for protein A binding, the amino acid residues located in the CDRs are K57, Y59, K64 and G65 (Figs. 1 and 2). Of these, Y59 and K64 are conserved in Ex3 sc1, which does not have the ability to bind protein A. In addition, it has been reported that if the 57th amino acid residue is K, R or T, it can bind to protein A (Crauwels, M. et al., Biotechnol. 2020, 57 ( September 2019), 20-28).
そこで、65番目のアミノ酸残基について、PyMOLを用いた相互作用界面を解析した。その結果、共結晶構造中の抗体2A2と同様に、G65の場合、プロテインAとの結合に干渉する様子は見られなかった（図３）。一方、D65及びN65へと変異を加えた場合、それぞれの側鎖がプロテインAのN43の側鎖と衝突する様子が確認された（図４）。そこで、本実施例では、CDRに位置するVH領域の65番目のアミノ酸残基に置換変異を導入することを検討した。具体的には、CDRに位置するVH領域の65番目のアミノ酸残基がプロテインAとの結合における立体障害とならないよう、比較例１で作製したEx3 sc1-6mにおける5HにおけるN65G置換変異と、OHにおけるD65G置換変異を導入することとした。 Therefore, we analyzed the interaction interface using PyMOL for the 65th amino acid residue. As a result, similar to antibody 2A2 in the co-crystal structure, G65 did not appear to interfere with protein A binding (Fig. 3). On the other hand, when mutations were added to D65 and N65, it was confirmed that each side chain collided with the N43 side chain of protein A (Fig. 4). Therefore, in this example, introduction of a substitution mutation to the 65th amino acid residue of the VH region located in the CDR was examined. Specifically, the N65G substitution mutation at 5H in Ex3 sc1-6m prepared in Comparative Example 1 and the OH It was decided to introduce the D65G substitution mutation in
比較例１で作製したEx3 sc1-6mの構造遺伝子及び機能評価のコントロールとしてEx3 sc1遺伝子を鋳型に、5HにN65G置換変異及びOHにD65G置換変異を行った。具体的には、Quick change法によりベクター構築を行うため、表４に示すプライマーを設計した。表４において、変異導入箇所に下線を付した。 Using the Ex3 sc1 gene as a template for the structural gene of Ex3 sc1-6m prepared in Comparative Example 1 and a control for functional evaluation, N65G substitution mutation was performed in 5H and D65G substitution mutation was performed in OH. Specifically, the primers shown in Table 4 were designed for vector construction by the Quick change method. In Table 4, mutagenesis sites are underlined.
設計したプライマーを用い、N65G及びD65Gの単変異導入を行った。Ex3 sc1-6mに対してこれら２箇所の変異を導入したEx3 sc1の８重変異体を「Ex3 sc1-8m」と称する。また、Ex3 sc1に対してこれら２箇所の変異を導入したEx3 sc1の２重変異体を「Ex3 sc1-2m」と称する。そして、本実施例１で構築したEx3 sc1-8mの構造遺伝子と、Ex3 sc1-2mの構造遺伝子を、比較例１と同様にそれぞれpROXb3ベクターへと挿入した。 Single mutations of N65G and D65G were introduced using the designed primers. An Ex3 sc1 octuple mutant in which these two mutations are introduced into Ex3 sc1-6m is referred to as "Ex3 sc1-8m". A double mutant of Ex3 sc1 in which these two mutations are introduced into Ex3 sc1 is referred to as "Ex3 sc1-2m". Then, the Ex3 sc1-8m structural gene and the Ex3 sc1-2m structural gene constructed in Example 1 were inserted into the pROXb3 vector in the same manner as in Comparative Example 1, respectively.
そして、Ex3 sc1-8m及びEx3 sc1-2mとも比較例１と同様な方法で発現を確認することができ、比較例１と同様な方法でそれぞれ精製した。そして、精製したEx3 sc1-8m及びEx3 sc1-2mについて、比較例１と同様な方法で、プロテインAへの親和性を評価した。結果を図５に示した。図５中のAがEx3 sc1-8mの結果を示し、BがEx3 sc1-2mの結果を示している。なお、図５は、SDS-PAGE を行った後にCBB（Rapid CBB KANTO）で染色したゲルの写真である。 The expression of both Ex3 sc1-8m and Ex3 sc1-2m could be confirmed by the same method as in Comparative Example 1, and they were each purified by the same method as in Comparative Example 1. Then, the purified Ex3 sc1-8m and Ex3 sc1-2m were evaluated for affinity to protein A in the same manner as in Comparative Example 1. The results are shown in FIG. A in FIG. 5 shows the results of Ex3 sc1-8m, and B shows the results of Ex3 sc1-2m. FIG. 5 is a photograph of a gel stained with CBB (Rapid CBB Kanto) after SDS-PAGE.
図５に示すように、N65G及びD65Gのみの変異を導入したEx3 sc1-2mを用いた際、0.1M Gly-HCl(pH3.0)によるElution画分での溶出も僅かにみられたものの、主にFlow Through及びWashで溶出していた。この挙動は、比較例１で作製したEx3 sc1とほぼ同様であった。これに対して、相互作用の向上と立体障害の回避を目指して8箇所に変異を導入したEx3 sc1-8mを用いた際、Flow Through画分やWashでの溶出は見られず、Ex3 sc1-8m に由来するバンドは全てElution画分でのみ確認された。比較例１で示したように、Ex3 sc1-6mがプロテインAカラムへ結合しなかったのに対して、Ex3 sc1-8mがプロテインAカラムへ結合したことから、立体障害の回避を目指したN65G及びD65Gの変異導入の有効性が示された。 As shown in FIG. 5, when Ex3 sc1-2m introduced with only N65G and D65G mutations was used, slight elution was observed in the Elution fraction with 0.1 M Gly-HCl (pH 3.0), Mainly eluted in Flow Through and Wash. This behavior was almost the same as Ex3 sc1 produced in Comparative Example 1. On the other hand, when using Ex3 sc1-8m, in which eight mutations were introduced to improve interaction and avoid steric hindrance, there was no elution in the Flow Through fraction or Wash, and Ex3 sc1- All bands derived from 8m were confirmed only in the Elution fraction. As shown in Comparative Example 1, Ex3 sc1-6m did not bind to the protein A column, whereas Ex3 sc1-8m bound to the protein A column. The effectiveness of D65G mutation introduction was demonstrated.
本実施例の結果から、相互作用の向上と立体障害の回避を目指した変異導入を組み合わせることで、プロテインAへの親和性を向上可能であると結論づけた。 From the results of this example, it was concluded that the affinity for protein A can be improved by combining mutagenesis aimed at improving interaction and avoiding steric hindrance.
〔実施例２〕
実施例１でプロテインAとの親和性を獲得できたEx3 sc1-8mについて、「細胞結合性評価試験」及び「細胞傷害活性試験」を実施した。
[Example 2]
For Ex3 sc1-8m, which was able to acquire affinity with protein A in Example 1, "cell binding evaluation test" and "cytotoxic activity test" were carried out.
＜細胞結合性評価試験＞
細胞結合性評価試験では、EGFR陽性のTFK-1細胞5.0x105個及びCD3陽性のT-LAK細胞5.0x105個を標的細胞とした。細胞はエッペンチューブに分注し上清を吸引した後、20pmolの各抗体（Ex3 sc1又はEx3 sc1-8m）を添加し、氷上で30分間静置した。サンプルについては、液量がサンプル間で同じになるようにした。次に、PBSを用いた洗浄を2回行った。洗浄については、900μLのPBSを添加し、300xg、5分間の遠心分離後に上清を吸引除去することで行った。続いて一次抗体として100倍に希釈した抗Ex3 Dbウサギ血清を100μL添加し、再度氷上で30分間静置した。PBSによる洗浄を2回行った後、Alexa Fluor 594標識抗ウサギIgG抗体1μg/50μLを50μL添加し、氷上で30分間静置した。最後に、計2回の洗浄を行った後、300μLのPBSを加え、メッシュを通し不純物等を取り除き、フローサイトメーターによって蛍光強度を測定した。
<Cell binding evaluation test>
In the cell binding evaluation test, 5.0x10 5 EGFR-positive TFK-1 cells and 5.0x10 5 CD3-positive T-LAK cells were used as target cells. The cells were dispensed into Eppendorf tubes, the supernatant was aspirated, 20 pmol of each antibody (Ex3 sc1 or Ex3 sc1-8m) was added, and the cells were allowed to stand on ice for 30 minutes. For the samples, the liquid volume was kept the same between samples. Next, washing with PBS was performed twice. Washing was performed by adding 900 μL of PBS, centrifuging at 300×g for 5 minutes, and then aspirating the supernatant. Subsequently, 100 μL of 100-fold diluted anti-Ex3 Db rabbit serum was added as a primary antibody, and the plate was allowed to stand again on ice for 30 minutes. After washing with PBS twice, 50 μL of Alexa Fluor 594-labeled anti-rabbit IgG antibody (1 μg/50 μL) was added and allowed to stand on ice for 30 minutes. Finally, after washing twice in total, 300 μL of PBS was added, impurities and the like were removed through a mesh, and fluorescence intensity was measured with a flow cytometer.
TFK-1細胞及びT-LAK細胞に対する細胞結合評価の結果を図６に示した。図６においてAはTFK-1細胞に対する細胞結合評価の結果を示し、BはT-LAK細胞に対する細胞結合評価の結果を示している。各グラフは、縦軸が細胞数、横軸が蛍光強度を示しており、ピークが右側にシフトするほど、標的細胞に対して強く結合することを意味する。 FIG. 6 shows the results of cell binding evaluation to TFK-1 cells and T-LAK cells. In FIG. 6, A shows the results of evaluation of cell binding to TFK-1 cells, and B shows the results of evaluation of cell binding to T-LAK cells. In each graph, the vertical axis indicates the number of cells and the horizontal axis indicates fluorescence intensity, and the more the peak shifts to the right, the stronger the binding to the target cell.
図６に示すように、いずれの細胞を用いた場合にも、Ex3 sc1及びEx3sc1-8mのヒストグラムは同程度シフトしていることが判る。すなわち、Ex3 sc1に対して合計8箇所の変異を導入しても、変異を導入する前と同様の細胞結合能を維持できることが明らかとなった。 As shown in FIG. 6, it can be seen that the histograms of Ex3 sc1 and Ex3 sc1-8m shift to the same extent when any cell is used. That is, it was clarified that the same cell-binding ability as before the introduction of the mutations could be maintained even if a total of eight mutations were introduced into Ex3 sc1.
＜細胞傷害活性試験＞
細胞傷害活性試験では、MTSアッセイによるがん細胞傷害活性を評価した。先ず、静置培養しているTFK-1細胞の培地上清を吸引除去し、TrypL Express Enzyme (1X), no phenol redを1mL加え、37℃、5% CO2のインキュベーターに5分程度静置した。フラスコを軽くたたき振動を与えることで細胞を剥がし、9mLの１xPBSを加えピペッティングにより細胞を剥がした。細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離した。上清を吸引除去し、RPMI1640（10% FBS、PC/SM 含有）を10mL添加し、ピペッティングにより懸濁させた。細胞懸濁液10μLを等量のトリパンブルーで染色し、セルカウンターを用いて細胞数の測定を行った。続いて、96穴プレートにTFK-1細胞を1wellあたり5.0x103cells/100μLになるように播種するため、リザーバーに1.2x106cells分取し、培地量が12mLになるように懸濁した。その後、96穴プレートの各wellに100μLずつ細胞懸濁液を播種した。37℃、5% CO2濃度で24時間インキュベート後、上清を吸引除去した。次に、T-LAK細胞を1wellあたり2.0x104cells/50μL、またはMilliQ水あるいはRPMI1640培地を100μLずつ加えた。T-LAK細胞を添加したwellには、濃度を5点振った各サンプルを50μLずつ加え、プレートを37℃、5% CO2濃度で24時間インキュベートした。上清を除去し、1xPBSで3 回洗浄を行った後、MTS試薬（CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay）をRPMI1640培地11mLに対し1mL加え、懸濁したものを1wellあたり100μLずつ加えた。37℃、5% CO2濃度で40分～1時間程度インキュベートし、プレートリーダーを用いて490nm (reference;655nm)の吸光度を測定した。RPMI1640のみ加えたwellの吸光度が 0.8程度になるまでインキュベートを行い、検出されたデータを用いてがん細胞傷害活性を算出した。
<Cytotoxic activity test>
In the cytotoxic activity test, cancer cytotoxic activity was evaluated by MTS assay. First, aspirate the medium supernatant of statically cultured TFK-1 cells, add 1 mL of TrypL Express Enzyme (1X), no phenol red, and leave in an incubator at 37°C, 5% CO 2 for about 5 minutes. bottom. The flask was lightly tapped and shaken to detach the cells, 9 mL of 1xPBS was added, and the cells were detached by pipetting. The cell suspension was centrifuged at 300 xg for 5 minutes. The supernatant was removed by aspiration, 10 mL of RPMI1640 (containing 10% FBS and PC/SM) was added, and suspended by pipetting. 10 μL of the cell suspension was stained with an equal volume of trypan blue, and the cell count was determined using a cell counter. Subsequently, in order to seed TFK-1 cells in a 96-well plate at 5.0×10 3 cells/100 μL per well, 1.2×10 6 cells were collected in a reservoir and suspended in a medium volume of 12 mL. After that, 100 µL of the cell suspension was seeded in each well of a 96-well plate. After incubation for 24 hours at 37° C. and 5% CO 2 concentration, the supernatant was aspirated off. Next, 2.0×10 4 cells/50 μL of T-LAK cells or 100 μL of MilliQ water or RPMI1640 medium were added per well. 50 μL of each sample with five concentrations was added to the wells containing T-LAK cells, and the plate was incubated at 37° C. and 5% CO 2 for 24 hours. After removing the supernatant and washing with 1×PBS three times, 1 mL of MTS reagent (CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay) was added to 11 mL of RPMI1640 medium, and the suspension was added at 100 μL per well. After incubation at 37° C. and 5% CO 2 concentration for about 40 minutes to 1 hour, absorbance at 490 nm (reference; 655 nm) was measured using a plate reader. Incubation was carried out until the absorbance of the wells to which only RPMI1640 was added reached about 0.8, and the detected data was used to calculate the cancer cytotoxic activity.
MTS 試薬には還元されると培地に可溶な有色のホルマザン産物に変換されるテトラゾリウム塩と電子受容体であるPESが含まれる。テトラゾリウム塩は生細胞の脱水素酵素由来のNADHまたはNADPHにより還元され、490nmに吸収をもつ有色のホルマザン産物にかわるため生細胞数とホルマザン産物の量には比例関係が生じる。この原理を利用して、以下の式を用いてがん細胞傷害活性を算出した。
がん細胞傷害活性[%]=(1-(A-C))/(B-C)×100
式中、A：サンプルを添加したwellの吸光度の平均値、B：培地のみを添加したwell（ポジティブコントロール）、C：MQを添加したwell（ネガティブコントロール）である。
The MTS reagent contains a tetrazolium salt and an electron acceptor, PES, which upon reduction converts to a colored formazan product that is soluble in the medium. The tetrazolium salt is reduced by NADH or NADPH derived from dehydrogenase in living cells, and changes to a colored formazan product that absorbs at 490 nm. Therefore, there is a proportional relationship between the number of living cells and the amount of formazan product. Utilizing this principle, the cancer cytotoxic activity was calculated using the following formula.
Cancer cytotoxic activity [%]=(1-(AC))/(BC)×100
In the formula, A: average absorbance of sample-added wells, B: wells with medium alone added (positive control), C: wells with MQ added (negative control).
MTSアッセイによるがん細胞傷害活性試験の結果を図７に示す。図７に示すように、Ex3 sc1及びEx3 sc1-8mいずれの抗体においても、抗体濃度依存的ながん細胞傷害活性の上昇が確認された。すなわち、8箇所の変異導入前後でがん細胞傷害活性に差は見られなかったことから、導入した8箇所の変異がEx3 sc1が誘導する機能に影響を及ぼさないことが明らかとなった。 FIG. 7 shows the results of the cancer cytotoxic activity test by MTS assay. As shown in FIG. 7, both the Ex3 sc1 and Ex3 sc1-8m antibodies were confirmed to increase cancer cytotoxic activity in an antibody concentration-dependent manner. In other words, no difference was observed in the cancer cytotoxic activity before and after the introduction of the 8 mutations, indicating that the 8 mutations introduced did not affect the functions induced by Ex3 sc1.
〔実施例３〕
本実施例では、実施例１及び２で使用したEx3 sc1の構成ドメインである抗CD3抗体OKT3を用いて、OKT3のVH(OH)に対してプロテインAとの親和性に必須なアミノ酸置換変異を検討した。本実施例で使用したOKT3のVH(OH)は、VH3サブクラスに属するものの、プロテインAに対する親和性は有しないことが知られている。
[Example 3]
In this example, using the anti-CD3 antibody OKT3, which is the constituent domain of Ex3 sc1 used in Examples 1 and 2, the VH(OH) of OKT3 was subjected to amino acid substitution mutations essential for affinity with protein A. investigated. Although the VH(OH) of OKT3 used in this example belongs to the VH3 subclass, it is known to have no affinity for protein A.
実施例２において検証したOHに導入したD82aN変異は、プロテインAのS33と水素結合を形成するためプロテインAとの相互作用に重要である。一方、65番目のグリシンはプロテインAとの結合に重要な残基であることが知られているが、グリシン以外に許容されるアミノ酸について実験的に評価した知見はほとんどない。そこで本実施例では、OKT3 scFvのOHにおけるD65及びD82aに対して変異導入を行うことで、VH3サブクラスに属するVHにおけるプロテインAとの結合に重要なアミノ酸残基を検証した。 The D82aN mutation introduced into OH verified in Example 2 forms a hydrogen bond with S33 of protein A and is therefore important for interaction with protein A. On the other hand, glycine at position 65 is known to be an important residue for binding to protein A, but there are few experimental findings on acceptable amino acids other than glycine. Therefore, in this example, amino acid residues important for binding to protein A in VH belonging to the VH3 subclass were verified by mutagenizing D65 and D82a in OH of OKT3 scFv.
本実施例では、OKT3 scFvの構造遺伝子をコードしたpRAベクターを鋳型に、OHのD65及びD82aに対して変異導入を試みた。具体的には、それぞれの単変異体（OKT3 scFv-D65G及びOKT3 scFv-D82aN）と、D82aN変異を導入した単変異体に対してD65を異なる三種類のアミノ酸へ置換した二重変異体（OKT3 scFv-D65G/D82aN、OKT3 scFv-D65A/D82aN、及び OKT3 scFv-D65N/D82aN）を作製した。それぞれ Quick change 法によりベクター構築を行うため、表５に示すプライマーを設計した。表５において変異導入箇所に下線を付した。 In this example, mutations were introduced into D65 and D82a of OH using the pRA vector encoding the OKT3 scFv structural gene as a template. Specifically, each single mutant (OKT3 scFv-D65G and OKT3 scFv-D82aN) and a double mutant (OKT3 scFv-D65G/D82aN, OKT3 scFv-D65A/D82aN, and OKT3 scFv-D65N/D82aN). The primers shown in Table 5 were designed for vector construction by the Quick change method. Mutation-introduced sites in Table 5 are underlined.
設計したプライマーを用い、OKT3 scFvのOHに対して、目的の単変異（D65G又はD82aN）、及び二重変異（D65G/D82aN、D65A/D82aN又はD65N/D82aN）を導入した発現ベクターをそれぞれ構築した。N65G及びD65Gの単変異導入を行った。OKT3 scFvのOHに対してD65Gの単変異を導入した変異体を「OKT3 scFv-D65G」と称し、D82aNの単変異を導入した変異体を「OKT3 scFv-D82aN」と称する。また、OKT3 scFvのOHに対してD65G/D82aN、D65A/D82aN又はD65N/D82aNの二重変異を導入した変異体を、それぞれ「OKT3 scFv-D65G/D82aN」、「OKT3 scFv-D65A/D82aN」及び「OKT3 scFv-D65N/D82aN」と称する。 Using the designed primers, expression vectors introduced with the desired single mutation (D65G or D82aN) and double mutation (D65G/D82aN, D65A/D82aN or D65N/D82aN) for OH of OKT3 scFv were constructed. . Single mutations of N65G and D65G were introduced. A mutant in which a D65G single mutation is introduced to the OH of OKT3 scFv is referred to as "OKT3 scFv-D65G", and a mutant in which a single D82aN mutation is introduced is referred to as "OKT3 scFv-D82aN". In addition, mutants introduced with double mutations of D65G/D82aN, D65A/D82aN or D65N/D82aN for the OH of OKT3 scFv were selected as "OKT3 scFv-D65G/D82aN", "OKT3 scFv-D65A/D82aN" and Called "OKT3 scFv-D65N/D82aN".
そして、本実施例１と異なり、前段で構築した発現ベクターを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。形質転換した大腸菌DH5αの培養上清を用い、Ni2+アフィニティークロマトグラフィーを利用して作製した変異体を精製した。何れの変異体についても比較例１と同様な方法で発現及び精製を確認することができた。そして、本実施例で精製することができたOKT3 scFv-D65G、OKT3 scFv-D82aN、OKT3 scFv-D65G/D82aN、OKT3 scFv-D65A/D82aN及びOKT3 scFv-D65N/D82aN、並びに変異導入前のOKT3 scFv（コントロール）について、比較例１及び実施例１と同様に、プロテインAとの親和性を評価した。結果を図８に示した。図８中のAがOKT3 scFv（コントロール）の結果を示し、BがOKT3 scFv-D65Gの結果を示し、CがOKT3 scFv-D82aNの結果を示し、DがOKT3 scFv-D65G/D82aNの結果を示し、EがOKT3 scFv-D65A/D82aNの結果を示し、FがOKT3 scFv-D65N/D82aNの結果を示している。 Then, unlike Example 1, E. coli DH5α was transformed using the expression vector constructed in the previous step. The culture supernatant of transformed E. coli DH5α was used to purify the generated mutants using Ni 2+ affinity chromatography. Expression and purification could be confirmed in the same manner as in Comparative Example 1 for any of the mutants. Then, OKT3 scFv-D65G, OKT3 scFv-D82aN, OKT3 scFv-D65G/D82aN, OKT3 scFv-D65A/D82aN and OKT3 scFv-D65N/D82aN that could be purified in this example, and OKT3 scFv before mutation introduction (Control) was evaluated for affinity with protein A in the same manner as in Comparative Example 1 and Example 1. The results are shown in FIG. In FIG. 8, A shows the results of OKT3 scFv (control), B shows the results of OKT3 scFv-D65G, C shows the results of OKT3 scFv-D82aN, and D shows the results of OKT3 scFv-D65G/D82aN. , E indicates the results of OKT3 scFv-D65A/D82aN, and F indicates the results of OKT3 scFv-D65N/D82aN.
図８に示したように、変異導入前のOKT3 scFvでは、Flow Through及びWash画分での溶出が見られた。また、OKT3 scFv-D65G及びOKT3 scFv-D82aNの単変異体においても、Flow Through及びWash 画分での溶出が見られ、その挙動がOKT3 scFvとほぼ同様であった。この結果は、相互作用の向上や立体障害の回避のみを目指した変異導入を行ったEx3 sc1-6mや Ex3 sc1-2mでの結果と一致していた。これらの結果を総合的すると、これらの単変異導入ではOKT3 scFvにプロテインAに対する親和性を付与できないことが理解できた。 As shown in FIG. 8, the OKT3 scFv before mutation was eluted in the Flow Through and Wash fractions. In addition, single mutants of OKT3 scFv-D65G and OKT3 scFv-D82aN also eluted in the Flow Through and Wash fractions, and their behavior was almost the same as that of OKT3 scFv. This result was consistent with the results of Ex3 sc1-6m and Ex3 sc1-2m, which were mutated only to improve interaction and avoid steric hindrance. Taking these results together, it was understood that introduction of these single mutations could not confer affinity for protein A to OKT3 scFv.
一方、図８に示したように、これら二つの変異を導入した二重変異体OKT3 scFv-D65G/D82aNでは、Flow ThroughやWash画分でのバンド強度が減少し、Elution画分でのバンド強度が増加した。この結果は、相互作用の向上及び立体障害の回避を目指した変異導入を組み合わせたEx3 sc1-8mの結果と一致しており、D65G変異による立体障害の回避に加え、D82aN変異による水素結合の形成がプロテインAに対する親和性向上に寄与することを示している。 On the other hand, as shown in FIG. 8, in the double mutant OKT3 scFv-D65G/D82aN introduced with these two mutations, the band intensity in the Flow Through and Wash fractions decreased, and the band intensity in the Elution fraction decreased. increased. This result is consistent with the results of Ex3 sc1-8m, which combined mutations aimed at improving interaction and avoiding steric hindrance. contributes to the improvement of affinity for protein A.
また、図８に示したように、D65を、側鎖を持つアミノ酸の中で最小の側鎖を持つアラニン（側鎖; -CH3）や、側鎖の極性を中性にしたアスパラギン（側鎖; -CH2-CO-NH2）に置換しても、Flow ThroughやWash画分での溶出がみられ、Elution画分での溶出が見られなかった。この結果は、プロテインAとの親和性を獲得するには、VH領域における65番目のアミノ酸残基をグリシンとすることが必須であり他のアミノ酸への許容度がないことを示している。言い換えると、VH領域における65番目のアミノ酸残基をグリシンとすることでプロテインAと親和性を有するようになった抗体又は低分子抗体において、当該グリシンを他のアミノ酸残基に置換することで、プロテインAに対する親和性を低下又は喪失させることができる。 In addition, as shown in FIG. 8, D65 can be replaced with alanine (side chain; -CH 3 ), which has the smallest side chain among amino acids with side chains, or asparagine (side chain; -CH 2 -CO-NH 2 ), elution was observed in the Flow Through and Wash fractions, but no elution was observed in the Elution fraction. This result indicates that glycine is essential for the 65th amino acid residue in the VH region and that other amino acids are not tolerated in order to obtain affinity with protein A. In other words, in an antibody or low-molecular-weight antibody that has affinity for protein A by setting the 65th amino acid residue in the VH region to glycine, by replacing the glycine with another amino acid residue, Affinity for protein A can be reduced or lost.
〔実施例４〕
本実施例では、実施例１で作製したEx3 sc1の８重変異体「Ex3 sc1-8m」からc-Mycタグ及びHisタグを除去し、プロテインAとの親和性を利用した精製について検討した。本実施例では、実施例１で作製した「Ex3 sc1-8m」からc-Mycタグ及びHisタグを除去したEx3 sc1-8m-tag(-)を作製した。
[Example 4]
In this example, c-Myc tag and His tag were removed from the Ex3 sc1 octuple mutant "Ex3 sc1-8m" prepared in Example 1, and purification using protein A affinity was examined. In this example, Ex3 sc1-8m-tag(-) was prepared by removing the c-Myc tag and His tag from "Ex3 sc1-8m" prepared in Example 1.
実施例１で作製したEx3 sc1-8mをpROXb3ベクターに挿入してなるpROX3-Ex3 sc1-8mからc-Mycタグ及びHisタグを除去するため、NcoIの制限酵素サイトを含むFwプライマーとEx3 sc1-8mのC末端に終止コドン及びHindIIIの制限酵素サイトを付加するための Revプライマーを設計した。設計したプライマーを表６に示す。 In order to remove the c-Myc tag and His tag from the pROX3-Ex3 sc1-8m prepared by inserting the Ex3 sc1-8m prepared in Example 1 into the pROXb3 vector, the Fw primer containing the NcoI restriction enzyme site and the Ex3 sc1- A Rev primer was designed to add a stop codon and a HindIII restriction enzyme site to the C-terminus of 8m. Table 6 shows the designed primers.
これらプライマーセットを用いたPCRによってEx3 sc1-8m-tag(-)を増幅し、実施例１と同様にpROX3ベクターに挿入した。比較例１と同様に、得られた発現ベクターを用いてブレビバチルス菌S5を形質転換し、SDS-PAGE及びWestern blotting解析によりEx3 sc1-6mの発現を確認した。 Ex3 sc1-8m-tag(-) was amplified by PCR using these primer sets and inserted into the pROX3 vector in the same manner as in Example 1. Brevibacillus strain S5 was transformed with the resulting expression vector in the same manner as in Comparative Example 1, and expression of Ex3 sc1-6m was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting analysis.
続いて、フラスコを用いて形質転換ブレビバチルス菌S5を培養し、比較例１と同様にして培養上清からEx3 sc1-8m-tag(-)の精製を試みた。また、実験のコントロールとして、Ex3 sc1及びEx3 sc1-8mも同様に調製を行った。なおEx3 sc1-8m-tag(-)及びEx3 sc1はそれぞれ300mLずつ、Ex3 sc1-8mは600mLで培養を行った。 Subsequently, the transformed Brevibacillus S5 was cultured using a flask, and purification of Ex3 sc1-8m-tag(-) from the culture supernatant was attempted in the same manner as in Comparative Example 1. In addition, Ex3 sc1 and Ex3 sc1-8m were similarly prepared as experimental controls. 300 mL each of Ex3 sc1-8m-tag(-) and Ex3 sc1, and 600 mL of Ex3 sc1-8m were cultured.
得られた培養上清について、全量のEx3 sc1及び半量のEx3 sc1-8mは、1mLのNi Sepharoseを充填したカラムを用いたNi2+アフィニティークロマトグラフィーにより、半量のEx3 sc1-8mと全量のEx3 sc1-8m-tag(-)は、1mLのrProteinA Sepharoseを充填したカラムを用いたプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。Ni2+アフィニティークロマトグラフィーでの溶出は、1xPBS 中のイミダゾール濃度を0mM、10mM、50mM、150mM、200mM、300mM、500mMと上昇させることで行い、それぞれ50CV、100CV、20CV、10CV、10CV、10CV、10CVで行った。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーでの溶出は、20CVの1xPBS及び5CVの0.1M Glycine buffer(pH4.0)によるWashを行った後、0.1M Glycine buffer(pH3.0)を用いて3CVずつ計5回の溶出を行った。SDS-PAGE で溶出画分の精製度を確認後、目的タンパク質のバンドが明瞭に観察された溶出液を限外濾過により濃縮し、Superdex 200 Increase 10/300 GLカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーによりモノマー画分を分画した。さらに、目的タンパク質付近の分子量のピークについて SDS-PAGE を行うことで目的のタンパク質が精製されたかを評価した。目的抗体が含まれるフラクションを限外濾過により濃縮後、フィルター滅菌処理を行い、その後の評価に用いた。
About the obtained culture supernatant, the total amount of Ex3 sc1-8m and the half amount of Ex3 sc1-8m were separated by Ni 2+ affinity chromatography using a column filled with 1 mL of Ni Sepharose to obtain half the amount of Ex3 sc1-8m and the total amount of Ex3 sc1-8m. sc1-8m-tag(-) was purified by Protein A affinity chromatography using a column packed with 1 mL of rProteinA Sepharose. Elution by Ni 2+ affinity chromatography was performed by increasing the concentration of imidazole in 1xPBS from 0 mM, 10 mM, 50 mM, 150 mM, 200 mM, 300 mM, and 500 mM, respectively, to 50 CV, 100 CV, 20 CV, 10 CV, 10 CV, 10 CV, I went with 10CV. Elution by protein A affinity chromatography was performed by washing with 20 CV of 1xPBS and 5 CV of 0.1 M Glycine buffer (pH 4.0), followed by a total of 5 cycles of 3 CV each using 0.1 M Glycine buffer (pH 3.0). Elution was performed. After confirming the purity of the eluted fractions by SDS-PAGE, the eluate in which the target protein band was clearly observed was concentrated by ultrafiltration and subjected to gel filtration chromatography using a
Ni2+アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、得られたフラクションについて SDS-PAGE 解析を行った結果を図９に示し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、得られたフラクションについてSDS-PAGE解析を行った結果を図１０に示した。 Purification by Ni 2+ affinity chromatography and SDS-PAGE analysis of the obtained fractions are shown in FIG. The results are shown in FIG.
図９に示したように、Ni2+アフィニティークロマトグラフィーでは、Ex3 sc1及びEx3 sc1-8mのいずれの抗体においても、150mM及び200mMイミダゾール存在下での溶出が確認された。図１０に示したように、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーでは、Ex3 sc1-8m及び Ex3 sc1-8m-tag(-)のいずれの抗体においても、0.1M Gly-HCl(pH3.0)による画分での溶出が確認された。各抗体の溶出が確認されたフラクションを限外濾過により濃縮後、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。ゲル濾過クロマトグラフィーのクロマトグラムを図１１に示した。Ni2+アフィニティークロマトグラフィーで精製したEx3 sc1及びEx3 sc1-8mは理論分子量付近にピークが見られた。一方、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製したEx3 sc1-8m及びEx3 sc1-8m-tag(-)は理論分子量よりも低分子量側にピークがシフトしたが、これは操作上の問題と考えられた。特にEx3 sc1-8m-tag(-)では、人工タグがないことにより低分子量側にピークがシフトする様子が見られた。これらのピークについてSDS-PAGEによる精製確認を行ったところ、それぞれの理論分子量付近にほぼ単一のバンドが確認されたことから、目的抗体が高純度で精製されたことが示唆された。 As shown in FIG. 9, Ni 2+ affinity chromatography confirmed elution in the presence of 150 mM and 200 mM imidazole for both Ex3 sc1 and Ex3 sc1-8m antibodies. As shown in FIG. 10, protein A affinity chromatography showed that both Ex3 sc1-8m and Ex3 sc1-8m-tag(-) antibodies elution was confirmed. Fractions in which elution of each antibody was confirmed were concentrated by ultrafiltration and then subjected to gel filtration chromatography. A chromatogram of gel filtration chromatography is shown in FIG. Ex3 sc1 and Ex3 sc1-8m purified by Ni 2+ affinity chromatography showed peaks near theoretical molecular weights. On the other hand, the peaks of Ex3 sc1-8m and Ex3 sc1-8m-tag(-) purified by protein A affinity chromatography shifted toward lower molecular weight than the theoretical molecular weight, which was thought to be due to operational problems. Especially for Ex3 sc1-8m-tag(-), the absence of the artificial tag caused the peak to shift to the lower molecular weight side. Purification of these peaks was confirmed by SDS-PAGE, and almost a single band was confirmed near the theoretical molecular weight of each, suggesting that the target antibody was highly purified.
そこで、各 Ex3 sc1において、SDS-PAGE で明瞭なバンドが観察されたフラクションを限外濾過により濃縮後、以降の評価に用いることとした。本実施例では、実施例２と同様に、細胞結合性評価試験及び細胞傷害活性試験を行った。 Therefore, for each Ex3 sc1, we decided to use the fractions in which a clear band was observed by SDS-PAGE after concentration by ultrafiltration for subsequent evaluation. In this example, as in Example 2, a cell binding evaluation test and a cytotoxic activity test were performed.
細胞結合性評価試験の結果を図１２に示した。図１２に示すように、本実施例で調製した各Ex3 sc1のTFK-1細胞又はT-LAK細胞に対する細胞結合評価の結果から、いずれの細胞を用いた際にも、抗体の精製手法やタグの有無にかかわらずヒストグラムは同程度シフトしていた。このことから、Ex3 sc1に対して合計8箇所の変異を導入した抗体を、Hisタグ等を利用せず、プロテインAとの親和性を利用して精製した場合であっても、変異を有さないEx3 sc1やタグを有するEx3 sc1-8mと同様な細胞結合能を有することが明らかとなった。 The results of the cell binding evaluation test are shown in FIG. As shown in FIG. 12, from the results of evaluating the cell binding of each Ex3 sc1 prepared in this example to TFK-1 cells or T-LAK cells, when using any cell, the antibody purification method and tag Histograms were shifted to the same extent with or without . From this, even if an antibody with a total of 8 mutations introduced into Ex3 sc1 is purified using affinity with protein A without using a His tag, etc., it does not contain mutations. It was found that Ex3 sc1 without tag and Ex3 sc1-8m with tag have similar cell-binding ability.
細胞傷害活性試験の結果を図１３に示した。図１３に示すように、本実施例で調製した各Ex3 sc1を用いたMTSアッセイによるがん細胞傷害活性の結果から、いずれの抗体においても、抗体濃度依存的ながん細胞傷害活性の上昇が確認された。このことから、Ex3 sc1に対して合計8箇所の変異を導入した抗体を、Hisタグ等を利用せず、プロテインAとの親和性を利用して精製した場合であっても、変異を有さないEx3 sc1やタグを有するEx3 sc1-8mと同様ながん細胞傷害活性を有することが明らかとなった。 The results of the cytotoxic activity test are shown in FIG. As shown in FIG. 13, from the results of cancer cytotoxic activity by MTS assay using each Ex3 sc1 prepared in this example, all antibodies show an antibody concentration-dependent increase in cancer cytotoxic activity. confirmed. From this, even if an antibody with a total of 8 mutations introduced into Ex3 sc1 is purified using affinity with protein A without using a His tag, etc., it does not contain mutations. It was found that Ex3 sc1 without tag and Ex3 sc1-8m with tag have similar cancer cytotoxic activity.
また、Ex3 sc1-8mに比べてEx3 sc1-8m-tag(-)がやや高いがん細胞傷害活性を示し、0.1～10pMの濃度範囲で再評価を行った際にも同様の傾向が確認された（図１４）。この結果は、HL型のEx3 DbやEx3 sc2の末端の人工タグを除去した際にがん細胞傷害活性が増加するという以前の報告（Asano, R.et al., FEBS J. 2010, 277 (2), 477-487）と一致する。上記のようにタグの有無が細胞結合能には影響しないことが確認されているため、タグを有しない構成の場合にがん細胞傷害活性が増強された理由は明らかではないが、細胞内へのシグナル伝達効率やサイトカイン産生効率などに影響を与え、結果としてがん細胞傷害活性に影響した可能性が考えられた。 In addition, Ex3 sc1-8m-tag(-) showed slightly higher cancer cytotoxic activity than Ex3 sc1-8m, and the same tendency was confirmed when re-evaluation was performed in the concentration range of 0.1 to 10 pM. (Fig. 14). This result is consistent with previous reports that removal of artificial tags at the ends of HL-type Ex3 Db and Ex3 sc2 increases cancer cytotoxic activity (Asano, R. et al., FEBS J. 2010, 277 ( 2), 477-487). As mentioned above, it has been confirmed that the presence or absence of a tag does not affect cell-binding ability. It was considered possible that it affected the signal transduction efficiency and cytokine production efficiency, etc., and as a result, affected the cancer cytotoxic activity.
〔実施例５〕
本実施例では、上述したD65G変異及び/又はD82aN変異によるプロテインAに対する親和性向上に効果に加え、更に他の置換変異によってプロテインAに対する親和性を更に向上させることを検討した。本実施例では、実施例１～４に利用したEx3 sc1と同様に、がん細胞表面のEGFR及びT細胞表面のCD3を標的とする、低分子二重特異性抗体であるEx3 ta6を利用した（Asano, R.et al., MAbs 2018, 10 (6), 854-863.）。両者の違いは構成するドメイン連結順であり、Ex3 sc1はN末端からOL-5H-5L-OHとなっており、Ex3 ta6はN末端からOH-OL-5H-5Lとなっている。これらは、構成する4ドメインはそれぞれ同じアミノ酸配列を有するが、連結順の違いから両者は異なる立体構造を有すると考えられる。
[Example 5]
In this example, in addition to the effect of improving the affinity for protein A by the D65G mutation and/or the D82aN mutation described above, further improvement of the affinity for protein A by other substitution mutations was investigated. In this example, similar to Ex3 sc1 used in Examples 1 to 4, Ex3 ta6, a low-molecular-weight bispecific antibody that targets EGFR on the surface of cancer cells and CD3 on the surface of T cells, was used. (Asano, R. et al., MAbs 2018, 10 (6), 854-863.). The difference between the two is the order of constitutive domain linkage, Ex3 sc1 is OL-5H-5L-OH from the N-terminus, and Ex3 ta6 is OH-OL-5H-5L from the N-terminus. Although the four domains constituting these domains have the same amino acid sequence, they are thought to have different three-dimensional structures due to the difference in the order of linkage.
本実施例では、他の置換変異としてN末端から16番目のアラニンを置換対象のアミノ酸残基とし、当該アラニンをリシン、アルギニン及びグリシンに置換変異することを企図した。 In this example, as another substitution mutation, the 16th alanine from the N-terminus was used as an amino acid residue to be substituted, and substitution mutation of the alanine to lysine, arginine and glycine was planned.
[ベクターpRA1/528 scFv-HL-WTの構築]
ベクターpRA1にEx3 ta6を挿入してなるpRA1/Ex3 ta6を鋳型とし、下記表７に示したプライマーを用いたPCRにより528 scFv-HL-WTの構造遺伝子断片を増幅した。
[Construction of vector pRA1/528 scFv-HL-WT]
A structural gene fragment of 528 scFv-HL-WT was amplified by PCR using pRA1/Ex3 ta6, which is obtained by inserting Ex3 ta6 into vector pRA1, as a template and the primers shown in Table 7 below.
PCR後の反応溶液5μLを用いて電気泳動により目的DNAの増幅を確認し、残りの反応溶液はFastGeneゲル/PCR精製キットを用いてPCR産物精製を行った。精製したDNA断片及びpRA1/EgA1をNocI及びSacIIで消化した。処理後の反応溶液全量を用いて電気泳動後、ゲルの切り出しとFastGeneゲル/PCR精製キットによる目的DNAの抽出を行った。抽出した528 scFv-HL-WTの構造遺伝子断片がpRA1ベクター断片の4倍以上のモル比で計5μLになるように混合後、DNA Ligation kit Ver.2.1のSolution Iを5μL添加し、16℃で1時間インキュベートすることでライゲーション反応を行った。ライゲーション後の反応溶液全量を用いて50μLの大腸菌DH5αを形質転換した。振盪培養は20分間行い、LB寒天培地 (Amp(+); f.c. 100μg/mL)上で37℃、一晩培養した。プレートに生えたコロニーを爪楊枝でつつき、3mLのLB培地 (Amp(+); f.c. 100μg/mL) を入れた試験管に添加した。37℃、140rpmで18時間振盪培養を行い、FastGeneプラスミドミニキットを用いてプラスミドの抽出を行った。溶出には、70℃に加温した50μLのMQを用いた。また、抽出したプラスミドについて、ユーロフィンジェノミクス株式会社のDNAシーケンスサービスを利用し、ベクターが構築されたことを確認した。 Amplification of the target DNA was confirmed by electrophoresis using 5 μL of the reaction solution after PCR, and the remaining reaction solution was subjected to PCR product purification using FastGene gel/PCR purification kit. The purified DNA fragment and pRA1/EgA1 were digested with NocI and SacII. After electrophoresis using the total amount of the reaction solution after treatment, the gel was excised and the target DNA was extracted using the FastGene gel/PCR purification kit. After mixing the extracted structural gene fragment of 528 scFv-HL-WT at a molar ratio of 4 times or more that of the pRA1 vector fragment to make a total of 5 μL, add 5 μL of Solution I of DNA Ligation kit Ver.2.1 and heat at 16°C. A ligation reaction was performed by incubating for 1 hour. 50 μL of E. coli DH5α was transformed using the total amount of the reaction solution after ligation. Shaking culture was performed for 20 minutes, and cultured overnight at 37° C. on LB agar medium (Amp(+); f.c. 100 μg/mL). A colony growing on the plate was picked with a toothpick and added to a test tube containing 3 mL of LB medium (Amp(+); f.c. 100 μg/mL). Shaking culture was performed at 37°C and 140 rpm for 18 hours, and plasmid extraction was performed using the FastGene Plasmid Mini Kit. 50 μL of MQ heated to 70° C. was used for elution. In addition, it was confirmed that the vector was constructed for the extracted plasmid using the DNA sequencing service of Eurofins Genomics.
[変異体ベクターpRA1/528 scFv-HL-6mの構築]
528 scFv-HLの六重変異体528 scFv-HL-6mを構築するために、528 VHにK19R、N65G、T70S、E81Q、D82aN及びR82bSの変異が導入されたベクターpRA1/Ex3 ta6-8mを鋳型とし、上記表７に示したプライマーを用いて上記と同様に528 scFv-HL-6mの構造遺伝子断片を増幅した。また、上記と同様にして528 scFv-HL-6mの構造遺伝子断片を挿入したpRA1ベクターを構築した。
[Construction of mutant vector pRA1/528 scFv-HL-6m]
To construct the hexa-mutant 528 scFv-HL-6m of 528 scFv-HL, a vector pRA1/Ex3 ta6-8m in which 528 VH was mutated with K19R, N65G, T70S, E81Q, D82aN and R82bS was used as a template. , and the primers shown in Table 7 above were used to amplify the structural gene fragment of 528 scFv-HL-6m in the same manner as described above. In addition, a pRA1 vector into which the 528 scFv-HL-6m structural gene fragment was inserted was constructed in the same manner as described above.
[変異体ベクターpRA1/528 scFv-HL-7mの構築]
上記で構築したpRA1/528 scFv-HL-6mを鋳型とし、Quick change法によりN末端から16番目のアラニンをリシン、アルギニン及びグリシンに置換変異するためのプライマーを設計した（表８）。表８に示したプライマーの配列において、変異導入箇所に下線を付した。
[Construction of mutant vector pRA1/528 scFv-HL-7m]
Using pRA1/528 scFv-HL-6m constructed above as a template, primers were designed for substitution mutation of alanine at
上記プライマーセットを用いたPCRの後、反応液にDpnIを1μL加え、37℃で2時間インキュベートすることで変異の入っていないメチル化DNAを消化した後、80℃で15分間インキュベートすることでDpnIを失活させた。得られた反応溶液5μLを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。振盪培養は30分間行い、LB寒天培地(Amp(+); f.c. 100μg/mL)上で37℃、一晩培養した。プレートに生えたコロニーを爪楊枝でつつき、3mLのLB培地(Amp(+); f.c. 100μg/mL)を入れた試験管に添加した。37℃、140rpmで18時間振盪培養を行い、FastGeneプラスミドミニキットを用いてプラスミドの抽出を行った。溶出には、70℃に加温した50μLのMQを用いた。抽出したプラスミドについて、ユーロフィンジェノミクス株式会社のDNA シーケンスサービスを利用し、変異が導入されたこと確認した。 After PCR using the above primer set, add 1 μL of DpnI to the reaction mixture and incubate at 37°C for 2 hours to digest unmutated methylated DNA. was deactivated. E. coli DH5α was transformed using 5 µL of the obtained reaction solution. Shaking culture was performed for 30 minutes, and cultured overnight at 37° C. on LB agar medium (Amp(+); f.c. 100 μg/mL). A colony growing on the plate was picked with a toothpick and added to a test tube containing 3 mL of LB medium (Amp(+); f.c. 100 μg/mL). Shaking culture was performed at 37°C and 140 rpm for 18 hours, and plasmid extraction was performed using the FastGene Plasmid Mini Kit. 50 μL of MQ heated to 70° C. was used for elution. It was confirmed that the mutation had been introduced into the extracted plasmid using the DNA sequencing service of Eurofins Genomics.
528 scFv-HL-6mに対してA16Kを導入した7重変異を挿入したベクターをpRA1/528 scFv-HL-7m (A16K)とし、A16Rを導入した7重変異を挿入したベクターをpRA1/528 scFv-HL-7m (A16R)とし、A16Gを導入した7重変異を挿入したベクターをpRA1/528 scFv-7m (A16G)とした。 528 scFv-HL-6m is pRA1/528 scFv-HL-7m (A16K), which is a 7-fold mutation introduced with A16K, and pRA1/528 scFv is a vector into which a 7-fold mutation is introduced with A16R. -HL-7m (A16R), and the vector into which the 7-fold mutation introduced with A16G was inserted was designated as pRA1/528 scFv-7m (A16G).
[528 scFv-HL-WT、6m、7mの調製]
上記で構築したベクターpRA1/528 scFv-HL-WT、pRA1/528 scFv-HL-6m、pRA1/528 scFv-HL-7m (A16K)、pRA1/528 scFv-HL-7m (A16R)、pRA1/528 scFv-7m (A16G)をそれぞれ0.5μL用い、2.5μLの大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、LB寒天培地(Amp(+); f.c. 100μg/mL)上で28℃、一晩培養した。獲得したコロニーをLB培地3mL(Amp(+); f.c. 100μg/mL)に植菌し、28℃、170rpmで20時間振盪培養した。オートインダクション用培地100mLにOD600=0.03となるように前培養液を加え、500mLバッフル付きフラスコで20℃、170rpmで40時間培養した。培養液を4℃、4,800xg、20分遠心後、得られた培養上清を孔径5.0μm、3.0μm、1.0μmのメンブレンフィルターに順に通し、1mLのNi Sepharoseを充填したカラムを用いたNi2+アフィニティークロマトグラフィーにより精製を行った。溶出はPBS中のイミダゾール濃度を1mM、10mM、50mM、300mM、300mM、1000mMと上昇させることで行い、それぞれ5CVで行った。
[Preparation of 528 scFv-HL-WT, 6m, 7m]
Vectors pRA1/528 scFv-HL-WT, pRA1/528 scFv-HL-6m, pRA1/528 scFv-HL-7m (A16K), pRA1/528 scFv-HL-7m (A16R), pRA1/528 constructed above Using 0.5 μL of each scFv-7m (A16G), 2.5 μL of E. coli BL21 (DE3) was transformed and cultured overnight at 28° C. on LB agar medium (Amp(+);
SDS-PAGEの結果を図１５に示した。変異が導入されていない野生型（図１５中「WT」）では29.5kDaに、6重変異を導入した変異体（図１５中「6M」）では29.4kDaに、6重変異にA16Kを導入した7重変異体（図１５中「A16K」）では29.5kDaに、6重変異にA16Rを導入した7重変異体（図１５中「A16R」）では29.5kDaに、6重変異にA16Gを導入した7重変異体（図１５中「A16G」）では29.4kDaにバンドが観察されることとなる。図１５に示すように、300mMイミダゾールを用いた画分に目的のバンドが明瞭に観察された。 The results of SDS-PAGE are shown in FIG. A16K was introduced into the 6-fold mutation at 29.5 kDa in the wild type (“WT” in FIG. 15) where no mutation was introduced, and at 29.4 kDa in the mutant (“6M” in FIG. 15) into which the 6-fold mutation was introduced. 29.5 kDa in the 7-fold mutant ("A16K" in Figure 15), 29.5 kDa in the 7-fold mutant ("A16R" in Figure 15) in which A16R was introduced into the 6-fold mutation, and A16G was introduced into the 6-fold mutation. A band is observed at 29.4 kDa in the 7-fold mutant (“A16G” in FIG. 15). As shown in FIG. 15, the target band was clearly observed in the fractions using 300 mM imidazole.
次に当該画分の溶出液を限外濾過により濃縮し、Superdex 200 Increase 10/300 GLカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、280nmにおける吸光が観察された画分についてSDS-PAGEを行うことで目的のタンパク質が精製されたかを評価した（図示せず）。目的抗体が含まれるフラクションをフィルター滅菌処理し、その後の評価に用いた。
Next, the eluate of the relevant fractions is concentrated by ultrafiltration, purified by gel filtration chromatography using a
[プロテインAカラムへの結合性評価]
0.1mLのrProtein A Sepharose Fast Flowをポリプレップクロマトグラフィー用カラムに充填後、6CVのMQ及び50mM Tris-HCl/200mM NaCl(pH8.0)を用いてカラムを平衡化した。精製したサンプル(5.0μM)を200μLアプライし、2CVのPBSを用いたWash操作を計2回行うことによりカラム未結合のタンパク質を溶出させた。その後、2CVの0.1M Gly-HCl(pH3.0)を3度、さらに2CVのIgG Elution Bufferを１度添加することで、カラムに結合したタンパク質を溶出させた。その際、溶出したサンプルを回収するマイクロチューブには予め溶出液の5%量の1M Tris-HCl(pH9.2)を添加しておき、溶出液の中和を行った。
[Evaluation of binding property to protein A column]
After packing 0.1 mL of rProtein A Sepharose Fast Flow into a polyprep chromatography column, the column was equilibrated with 6 CV of MQ and 50 mM Tris-HCl/200 mM NaCl (pH 8.0). 200 μL of the purified sample (5.0 μM) was applied, and washing operation using 2 CV of PBS was performed twice in total to elute the column-unbound protein. Thereafter, 2 CV of 0.1 M Gly-HCl (pH 3.0) was added three times and 2 CV of IgG Elution Buffer was added once to elute the protein bound to the column. At that time, 1M Tris-HCl (pH 9.2) of 5% of the eluate was added in advance to the microtube for collecting the eluted sample to neutralize the eluate.
結果を図１６に示した。図１６中、変異が導入されていない野生型に関する結果を「WT」とし、6重変異を導入した変異体に関する結果を「6m」とし、6重変異にA16Kを導入した7重変異体に関する結果を「7M(A16K)」とし、6重変異にA16Rを導入した7重変異体に関する結果を「7M(A16R)」とし、6重変異にA16Gを導入した7重変異体に関する結果を「7M(A16G)」とした。図１６から判るように、6重変異に対して更にA16K、A16R又はA16Gを導入した7重変異は、野生型や6重変異と比較してプロテインAに対する親和性が向上することがわかった。本実施例の結果より、D65G変異及び/又はD82aN変異によるプロテインAとの親和性向上効果は、A16K、A16R又はA16Gにより更に向上することが示された。 The results are shown in FIG. In FIG. 16, the result for the wild type in which no mutation was introduced is "WT", the result for the mutant with the 6-fold mutation is "6m", and the result for the 7-fold mutant with A16K introduced into the 6-fold mutation. is "7M(A16K)", the result for the 7-fold mutant in which A16R is introduced into the 6-fold mutation is "7M(A16R)", and the result for the 7-fold mutant in which A16G is introduced into the 6-fold mutation is "7M( A16G)”. As can be seen from FIG. 16, it was found that the 7-fold mutation in which A16K, A16R or A16G was further introduced into the 6-fold mutation improved the affinity for protein A compared to the wild-type and 6-fold mutation. The results of this example showed that the effect of improving the affinity with protein A by the D65G mutation and/or the D82aN mutation was further improved by A16K, A16R or A16G.
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