JP2023070669A - Artificial vascular bed, artificial three-dimensional biological tissue, and method for making artificial three-dimensional biological tissue including vascular network - Google Patents

Artificial vascular bed, artificial three-dimensional biological tissue, and method for making artificial three-dimensional biological tissue including vascular network Download PDF

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友輔 戸部
Yusuke Tobe
順 本間
Jun Honma
秀一 関根
Shuichi Sekine
勝久 坂口
Katsuhisa Sakaguchi
達也 清水
Tatsuya Shimizu
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Abstract

To provide an improved method for the introduction of a vascular network into three-dimensional biological tissue (for example, high-cell-density three-dimensional tissue such as a laminated cell sheet and an organoid).SOLUTION: An artificial vascular bed comprises: a vascular bed part having a mounting face for three-dimensional biological tissue, composed of a composition comprising biocompatible hydrogel; a first channel and a second channel provided inside the vascular bed part; a first gap and a second gap that are in communication with the first channel and the second channel, respectively, and provided at the mounting face; a bridging channel that brings the first gap and the second gap into communication with each other, formed at the mounting face; a first liquid feeding part that is in fluid communication with the first channel, feeding a medium; and a second liquid feeding part that is in fluid communication with the second channel, discharging the medium. There is also provided a method for making artificial three-dimensional biological tissue that comprises a vascular network comprising the artificial vascular bed.SELECTED DRAWING: Figure 1-2

Description

本発明は、人工血管床、人工三次元生体組織及び血管網を備えた人工三次元生体組織の作製方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to an artificial vascular bed, an artificial three-dimensional biological tissue, and a method for producing an artificial three-dimensional biological tissue having a vascular network.

現在、心不全に対する新しい治療法として、筋芽細胞シートや人工多能性幹細胞(iPS細胞)由来の心筋細胞シートを用いた再生医療が始まっている(非特許文献1及び2)。細胞シートが分泌する多数の成長因子により、ホストの心臓において血管新生などを促進し、心機能を改善させるパラクライン効果による治療である。しかし、これらの治療法では機能的な心筋細胞の増加には至らず、重症心不全には適応できないという課題が存在する。そこで本発明者らは、次世代の再生医療として、力学的な拍動補助機能を有する立体心筋組織移植による治療を目指している。ヒトiPS細胞由来の心筋細胞シートを複数枚積層することによって生体外で作製した立体心筋組織を移植するという治療法である。本治療法の実現により、従来のパラクライン効果に加え、心筋細胞自体による力学的なポンプ機能の補助が期待される。 Currently, regenerative medicine using a myoblast sheet or a cardiomyocyte sheet derived from induced pluripotent stem cells (iPS cells) has begun as a new treatment for heart failure (Non-Patent Documents 1 and 2). It is a treatment with a paracrine effect that promotes angiogenesis and the like in the host's heart by means of a large number of growth factors secreted by the cell sheet and improves cardiac function. However, these treatments do not lead to an increase in functional myocardial cells, and there is a problem that they cannot be applied to severe heart failure. Therefore, the present inventors are aiming for treatment by three-dimensional myocardial tissue transplantation having a mechanical pulsatile support function as next-generation regenerative medicine. This is a therapeutic method in which three-dimensional myocardial tissue prepared in vitro by laminating a plurality of human iPS cell-derived cardiomyocyte sheets is transplanted. By realizing this treatment method, in addition to the conventional paracrine effect, it is expected that the mechanical pump function of the myocardial cells themselves will be assisted.

しかしながら、3層以上の細胞シートを作製して得られる積層化組織では、酸素や栄養素の欠乏、および老廃物の蓄積により組織内部が壊死することが報告されている(非特許文献3)。そのため、積層限界を超える立体心筋組織の構築には、栄養供給を担う血管構造を生体外で立体組織内に付与する手法の確立が重要である。 However, it has been reported that a layered tissue obtained by preparing three or more layers of cell sheets undergoes necrosis inside the tissue due to lack of oxygen and nutrients and accumulation of waste products (Non-Patent Document 3). Therefore, in order to construct a three-dimensional myocardial tissue that exceeds the stacking limit, it is important to establish a method for providing a vascular structure that supplies nutrients to the three-dimensional tissue in vitro.

生体外における血管構築研究は、細胞密度の低いハイドロゲルを対象とした研究や、細胞密度の高い立体組織を対象とした研究に大別される。ハイドロゲルを対象とした研究では、3Dプリンティングやマイクロ流体デバイスを用いることによって、ハイドロゲル内に懸濁した内皮細胞から灌流可能な管腔構造を有する血管を構築する手法が数多く報告されている(例えば、非特許文献4及び5)。一方、オルガノイドや細胞シートなどの立体組織を対象とした研究では、生体外で構築した内皮細胞のネットワーク構造を持つ組織を、生体へ移植することにより、実際に血液が灌流される血管を作製する報告が大半である(非特許文献6及び7)。つまり、生体外での管腔を有する血管構築法はハイドロゲル内では確立されている一方、高細胞密度の組織では未確立のままである。 Ex vivo angiogenesis research is broadly divided into research targeting hydrogels with low cell density and research targeting three-dimensional tissues with high cell density. In research on hydrogels, many methods have been reported for constructing blood vessels with a luminal structure that can be perfused from endothelial cells suspended in hydrogels by using 3D printing and microfluidic devices ( For example, Non-Patent Documents 4 and 5). On the other hand, in research on three-dimensional tissues such as organoids and cell sheets, by transplanting tissue with a network structure of endothelial cells constructed in vitro into the living body, blood vessels that are actually perfused with blood are created. Most of the reports are (Non-Patent Documents 6 and 7). Thus, in vitro luminal angiogenesis methods have been established in hydrogels, but remain unestablished in high cell density tissues.

これまでに本発明者らは、コラーゲンゲルや生体の組織を利用した血管床を開発することで、高細胞密度組織である細胞シートへの生体外での血管網導入を可能にした(特許文献1及び2、並びに非特許文献8及び9)。血管床とは培養液の灌流が可能な流路構造を有する立体組織培養の土台である。コラーゲンゲルの中に構築した血管、又は三次元生体組織内血管を利用し、細胞シートを血管床上に生着させた後に培養液を血管床内血管に灌流することによって、培養液内の血管新生因子が血管を介した拡散によって細胞シートに供給され、細胞シート内で血管新生が誘導されることによってシート内への血管導入が達成される。 To date, the present inventors have developed a vascular bed using collagen gel and biological tissue, making it possible to introduce a vascular network in vitro into a cell sheet, which is a tissue with high cell density (Patent document 1 and 2, and Non-Patent Documents 8 and 9). A vascular bed is a base for three-dimensional tissue culture that has a channel structure that allows perfusion of a culture solution. Angiogenesis in the culture solution by perfusing the culture solution into the blood vessels in the vascular bed after engrafting the cell sheet on the vascular bed using the blood vessels constructed in the collagen gel or the blood vessels in the three-dimensional living tissue. Vascular introduction into the sheet is achieved by supplying factors to the cell sheet by diffusion through blood vessels and inducing angiogenesis within the cell sheet.

またポリジメチルシロキサン(PDMS)製のマイクロ流体デバイスを作製し、ハイドロゲル内に構築した血管構造を利用することにより、ハイドロゲル内に懸濁したスフェロイドに灌流可能な血管構造を導入したことを報告している(非特許文献10)。以上の研究より、ハイドロゲルや三次元生体組織内の血管網を利用することで、生体外での高細胞密度の組織への灌流可能な血管網の導入が可能であることが報告されている。 In addition, by fabricating a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) and using the vascular structure built in the hydrogel, we have introduced a vascular structure that can perfuse spheroids suspended in the hydrogel. (Non-Patent Document 10). Based on the above studies, it has been reported that it is possible to introduce a vascular network that can be perfused into high-cell-density tissues in vitro by using hydrogels or vascular networks in three-dimensional living tissues. .

国際公開第2012/036225号WO2012/036225 国際公開第2012/036224号WO2012/036224

Miyagawa S, et al.: Impaired Myocardium Regeneration With Skeletal Cell Sheets-A Preclinical Trial for Tissue-Engineered Regeneration Therapy. Transplantation, 2010Miyagawa S, et al.: Impaired Myocardium Regeneration With Skeletal Cell Sheets-A Preclinical Trial for Tissue-Engineered Regeneration Therapy. Transplantation, 2010 Kawamura M, et al.: Feasibility, Safety, and Therapeutic Efficacy of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Sheets in a Porcine Ischemic Cardiomyopathy Model. Circulation, 2012Kawamura M, et al.: Feasibility, Safety, and Therapeutic Efficacy of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Sheets in a Porcine Ischemic Cardiomyopathy Model. Circulation, 2012 Shimizu T, et al: Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal, 2006Shimizu T, et al: Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal, 2006 Kolesky, D.B., et al.: 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv. Mater. 26, 3124‐3130, 2014Kolesky, D.B., et al.: 3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs. Adv. Mater. 26, 3124-3130, 2014 Nguyen, D.-H.T., et al.: Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 6712-6717, 2013Nguyen, D.-H.T., et al.: Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 6712-6717, 2013 Takebe T, et al.: Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, 481-485, 2013Takebe T, et al.: Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, 481-485, 2013 Sasagawa T, et al.: Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period. J. Biomed. Mater. Res. A. 102, 358-65, 2014Sasagawa T, et al.: Comparison of angiogenic potential between prevascular and non-prevascular layered adipose-derived stem cell-sheets in early post-transplanted period. J. Biomed. Mater. Res. A. 102, 358-65, 2014 Sakaguchi K, et al.: In vitro engineering of vascularized tissue surrogates, Sci. Rep., 1316, 2013Sakaguchi K, et al.: In vitro engineering of vascularized tissue surrogates, Sci. Rep., 1316, 2013 Sekine H, et al.: In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat. Com, 2013Sekine H, et al.: In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat. Com, 2013 Nashimoto Y, et al.: Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integr. Biol., 2017Nashimoto Y, et al.: Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integr. Biol., 2017

ハイドロゲルや三次元生体組織などの血管床内の血管網を利用する、従来技術のインビトロで形成された三次元生体組織(例えば、積層化細胞シートやオルガノイドなどの高細胞密度の立体組織)への血管網の導入法では、血管網の導入までに最低でも5日以上の期間を要したり、また、血管網が導入されたとしても構築される血管の数が著しく少なく、血管網導入効率が悪いという課題があった。また、従来技術では、血管床として用いられるコラーゲンゲル内に構築される新生血管網の位置や、採取される生体組織内の血管の位置を制御することが困難であるため、血管床流路から三次元生体組織までの物理的距離が血管床検体ごとに異なり、血管床自体の質のバラツキが課題であった。 To prior art in vitro formed 3D biomedical tissues (e.g., high cell density conformations such as layered cell sheets and organoids) that utilize vascular networks within vascular beds such as hydrogels and 3D biomedical tissues. In the vascular network introduction method, it takes at least 5 days or more to introduce the vascular network, and even if the vascular network is introduced, the number of blood vessels to be constructed is remarkably small, and the vascular network introduction efficiency There was a problem that it was bad. In addition, in the conventional technology, it is difficult to control the position of the neovascular network constructed in the collagen gel used as the vascular bed and the position of the blood vessels in the biological tissue to be harvested. The physical distance to the three-dimensional living tissue differs for each vascular bed sample, and the quality of the vascular bed itself is inconsistent.

本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、三次元生体組織と血管床内に構築される流路との間の物理的な距離及び形状を制御することにより、三次元生体組織(例えば、積層化細胞シートやオルガノイドなどの高細胞密度の立体組織)内に構築される血管網の質を向上(例えば、血管網の数の増加)させることができ、また、血管網を構築させるまでの期間を短縮させ得るのみならず、再現性よく血管網を構築させ得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の態様を含み得る。 In order to solve the above problems, the present inventors have conducted research and development by adding studies from various angles. As a result, by controlling the physical distance and shape between the three-dimensional biological tissue and the channel constructed in the vascular bed, three-dimensional biological tissue (e.g., high cell density such as layered cell sheets and organoids) can be achieved. It is possible to improve the quality of the vascular network built in a dense three-dimensional tissue) (for example, increase the number of vascular networks), and not only can shorten the period until the vascular network is built, but also can be reproduced. The inventors have found that a vascular network can be constructed with high efficiency, and have completed the present invention. That is, the present invention can include the following aspects.

[1] 人工血管床であって、
三次元生体組織の載置面を有する、生体適合性ハイドロゲルを含む組成物により形成された血管床部と;
前記血管床部の内部に設けられた第1流路及び第2流路と;
前記第1流路及び前記第2流路とそれぞれ連通し、前記載置面に設けられた第1穴隙及び第2穴隙と;
前記第1穴隙と前記第2穴隙との間を連通し、かつ、前記載置面に形成された橋渡し流路と;
前記第1流路に流体連通し、培地を供給するための第1送液部と;
前記第2流路に流体連通し、培地を排出するための第2送液部と
を備えた、人工血管床。
[2] 前記生体適合性ハイドロゲルが、架橋化された生体適合性ハイドロゲルである、項目1に記載の人工血管床。
[3] 前記生体適合性ハイドロゲルが、フィブリンゲルを含む、項目1に記載の人工血管床。
[4] 前記生体適合性ハイドロゲルが、フィブリンゲル安定化因子を含む、項目3に記載の人工血管床。
[5] 前記第1送液部に接続された培地供給ラインと、
前記培地供給ラインに培地を供給する培地供給槽と、
前記培地供給ラインに培地を送る送液ポンプと、
前記第2送液部に接続された培地排出ラインと、
前記培地排出ラインから排出された培地を貯留する培地排出槽と、
をさらに備える、項目1~4のいずれか1項に記載の人工血管床。
[6] 前記培地供給槽と、前記培地排出槽が同一であり、培地が循環することを特徴とする、項目5に記載の人工血管床。
[1] An artificial vascular bed,
a vascular bed formed of a composition containing a biocompatible hydrogel and having a three-dimensional biological tissue mounting surface;
a first channel and a second channel provided inside the vascular bed;
a first hole and a second hole provided in the mounting surface and communicating with the first channel and the second channel, respectively;
a bridging flow path communicating between the first gap and the second gap and formed in the mounting surface;
a first liquid delivery unit in fluid communication with the first channel for supplying culture medium;
and a second liquid delivery section in fluid communication with the second flow path for discharging culture medium.
[2] The artificial vascular bed according to item 1, wherein the biocompatible hydrogel is a crosslinked biocompatible hydrogel.
[3] The artificial vascular bed according to item 1, wherein the biocompatible hydrogel contains fibrin gel.
[4] The artificial vascular bed according to item 3, wherein the biocompatible hydrogel contains a fibrin gel-stabilizing factor.
[5] a culture medium supply line connected to the first liquid feeding section;
a medium supply tank for supplying a medium to the medium supply line;
a liquid feed pump that feeds the medium to the medium supply line;
a medium discharge line connected to the second liquid feeding section;
a medium discharge tank for storing the medium discharged from the medium discharge line;
The artificial vascular bed according to any one of items 1 to 4, further comprising:
[6] The artificial vascular bed according to item 5, wherein the medium supply tank and the medium discharge tank are the same, and the medium is circulated.

[7] 項目1~6のいずれか1項に記載の人工血管床と、
前記載置面の前記橋渡し流路を覆うように載置された三次元生体組織と
を含む、人工三次元生体組織。
[8] 前記三次元生体組織が、細胞を含むシート状組織又はオルガノイドである、項目7に記載の人工三次元生体組織。
[9] 前記三次元生体組織が、血管内皮細胞を含む、項目7又は8に記載の人工三次元生体組織。
[7] The artificial vascular bed according to any one of items 1 to 6;
and a three-dimensional living tissue mounted on the mounting surface so as to cover the bridging channel.
[8] The artificial three-dimensional biological tissue according to item 7, wherein the three-dimensional biological tissue is a sheet-like tissue containing cells or an organoid.
[9] The artificial three-dimensional biological tissue according to item 7 or 8, wherein the three-dimensional biological tissue contains vascular endothelial cells.

[10] 血管網を備えた人工三次元生体組織の作製方法であって、
三次元生体組織を、項目1~6のいずれか1項に記載の人工血管床の前記載置面の前記橋渡し流路を覆うように載置する工程、
前記第1送液部に培地を供給し、かつ、前記第2送液部から培地を排出しながら灌流培養する工程、
を含む、方法。
[11] 前記三次元生体組織が、細胞を含むシート状組織又はオルガノイドである、項目10に記載の方法。
[12] 前記三次元生体組織が、血管内皮細胞を含む、項目10又は11に記載の方法。
[10] A method for producing an artificial three-dimensional biological tissue having a vascular network, comprising:
A step of placing a three-dimensional biological tissue so as to cover the bridging channel on the placement surface of the artificial vascular bed according to any one of items 1 to 6;
A step of supplying a medium to the first liquid feeding part and performing perfusion culture while discharging the medium from the second liquid feeding part;
A method, including
[11] The method according to item 10, wherein the three-dimensional biological tissue is a sheet-like tissue or organoid containing cells.
[12] The method according to item 10 or 11, wherein the three-dimensional biological tissue contains vascular endothelial cells.

本発明により、三次元生体組織内に構築される血管網の質の向上させることができ(例えば、血管網の数の増加、及び、直径の大きな成熟した血管の形成等)、また、血管網を構築させるまでの期間を短縮させることが可能となる。また、血管床に設けた穴隙、および橋渡し流路を血管床の流路として直接利用する技術であるため、血管床検体ごとの流路構造のバラツキ問題を解決する。従って、再現性良く質の高い血管網を構築させ得ることが可能となる。また、三次元生体組織に対して流体による力学的刺激を直接負荷可能であるため、力学的刺激が高細胞密度の立体組織内での血管新生に及ぼす影響の解明のための実験モデルとして利用可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to improve the quality of a vascular network constructed in a three-dimensional living tissue (for example, increase the number of vascular networks and form mature blood vessels with a large diameter, etc.). It is possible to shorten the period until the construction of In addition, since it is a technique that directly utilizes the holes provided in the vascular bed and the bridging channels as the channels of the vascular bed, it solves the problem of variations in channel structure for each vascular bed sample. Therefore, it is possible to construct a high-quality vascular network with good reproducibility. In addition, it can be used as an experimental model for elucidating the effect of mechanical stimulation on angiogenesis in three-dimensional tissue with high cell density, because it is possible to directly apply mechanical stimulation by fluid to three-dimensional living tissue. is.

一実施態様における本発明の人工血管床の概要を示す図である。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig. 1 is a schematic diagram of an artificial vascular bed of the present invention in one embodiment; 一実施態様における本発明の人工血管床の概要、および三次元生体組織の灌流培養時の概要を示す図である。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing an outline of an artificial vascular bed of the present invention in one embodiment, and an outline of perfusion culture of a three-dimensional living tissue. 一実施態様における本発明の人工血管床の作成手順を示す概略図である1 is a schematic diagram showing the procedure for creating an artificial vascular bed of the present invention in one embodiment. FIG. 一実施態様における本発明の人工血管床を示す図である。FIG. 1 shows an artificial vascular bed of the invention in one embodiment. 一実施態様における本発明の人工血管床に載置した血管内皮網付三次元生体組織(積層化した血管内皮細胞と皮膚線維芽細胞の共培養シート)の蛍光像及び光干渉断層撮影(OCT)画像を示す。Fluorescence image and optical coherence tomography (OCT) of three-dimensional biological tissue with vascular endothelial network (layered co-culture sheet of vascular endothelial cells and skin fibroblasts) placed on the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment Show the image. 人工血管床作製に適したハイドロゲル組成の選定に関する概要図を示す。Schematic diagrams for selecting hydrogel compositions suitable for artificial vascular bed fabrication are shown. 異なるハイドロゲルで構成した人工血管床上で細胞シートを5日間静置培養した際の人工血管床の構造の安定性を評価した結果を示す。上段:巨視的観察像(BF)、下段:断面観察像(OCT)。Fig. 3 shows the results of evaluating the structural stability of artificial vascular beds when cell sheets were statically cultured on artificial vascular beds composed of different hydrogels for 5 days. Upper row: macroscopic observation image (BF), lower row: cross-sectional observation image (OCT). 異なるハイドロゲルで構成した人工血管床上で細胞シートを5日間静置培養した際の人工血管床の構造の安定性を評価した結果を示す。図6-1で得られた画像より表面積及び断面積を定量し、初日(Day0)を基準とした場合の各日における表面積比(左)及び断面積比(右)を示している。Fig. 3 shows the results of evaluating the structural stability of artificial vascular beds when cell sheets were statically cultured on artificial vascular beds composed of different hydrogels for 5 days. The surface area and cross-sectional area were quantified from the images obtained in FIG. 6-1, and the surface area ratio (left) and cross-sectional area ratio (right) are shown for each day based on the first day (Day 0). 一実施態様における本発明の人工血管床を用いた静置培養又は灌流培養の方法、及びその評価方法について示す概略図である。1 is a schematic diagram showing a static culture or perfusion culture method using the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment, and a method for evaluating the same. FIG. 一実施態様における本発明の人工血管床を用いて、GFP陽性のヒト臍帯静脈内皮細胞(GFP-HUVEC)を含む細胞シートを静置培養又は灌流培養した場合の細胞シートの蛍光顕微鏡像を示す。Fig. 2 shows fluorescent microscope images of cell sheets containing GFP-positive human umbilical vein endothelial cells (GFP-HUVEC) that were statically cultured or perfusion cultured using the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment. 一実施態様における本発明の人工血管床を用いて、細胞シートを静置培養又は灌流培養した後の、細胞シートに形成された血管を墨汁の灌流により評価した結果を示す。1 shows the results of evaluating blood vessels formed in a cell sheet by static culture or perfusion culture using the artificial vascular bed of the present invention according to one embodiment, and then perfusion with Indian ink. 一実施態様における本発明の人工血管床を用いて、細胞シートを灌流培養した後の、細胞シートに形成された血管をラット血液の灌流により評価した結果を示す。1 shows the results of evaluation of blood vessels formed in a cell sheet by perfusion with rat blood after perfusion culture of the cell sheet using the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment. 一実施態様における本発明の人工血管床を用いて、細胞シートを静置培養した後のHE染色像を示す。FIG. 2 shows HE-stained images after statically culturing a cell sheet using the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment. 一実施態様における本発明の人工血管床を用いて、細胞シートを静置培養した後の蛍光顕微鏡像を示す。緑:内皮細胞(CD31陽性)、青:核(DAPI)。FIG. 2 shows fluorescence microscopic images after statically culturing a cell sheet using the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment. Green: endothelial cells (CD31 positive), blue: nuclei (DAPI). 一実施態様における本発明の人工血管床を用いて、細胞シートを灌流培養した後のHE染色像を示す。FIG. 2 shows HE-stained images after perfusion culture of a cell sheet using the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment. 一実施態様における本発明の人工血管床を用いて、細胞シートを灌流培養した後の蛍光顕微鏡像を示す。緑:内皮細胞(CD31陽性)、青:核(DAPI)。1 shows a fluorescence microscope image after perfusion culture of a cell sheet using the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment. Green: endothelial cells (CD31 positive), blue: nuclei (DAPI). 従来技術と本発明の血管床との比較した結果を示す概略図である。FIG. 2 is a schematic diagram showing the results of comparison between the prior art and the vascular bed of the present invention; 一実施態様における本発明の人工血管床又は人工三次元生体組織(立体組織)の適用例を示す。An application example of the artificial vascular bed or artificial three-dimensional living tissue (three-dimensional tissue) of the present invention in one embodiment is shown. 一実施態様における本発明の人工血管床を用いて、細胞シートを異なる灌流速度(25μL/min(5日間)又は25μL/min(3日間)→100μL/min(2日間))で灌流培養した後の細胞シートに形成された血管を墨汁の灌流により評価した結果を示す。After perfusion culture of the cell sheet at different perfusion rates (25 μL/min (5 days) or 25 μL/min (3 days) → 100 μL/min (2 days)) using the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment Figure 2 shows the results of evaluating the blood vessels formed in the cell sheet of B. india by ink perfusion. 一実施態様における本発明の人工血管床の例を示す。1 shows an example of a synthetic vascular bed of the present invention in one embodiment. 一実施態様における本発明の人工血管床を用いた段階的積層による立体組織を構築する方法の概略を示す。1 shows an outline of a method for constructing a three-dimensional tissue by stepwise lamination using the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment. 一実施態様における本発明の人工血管床を用いて構築した立体組織のOCT観察像を示す。1 shows an OCT observation image of a three-dimensional tissue constructed using the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment. 一実施態様における本発明の人工血管床を用いて構築した立体組織の拡大像(左:明視野観察像、左:蛍光観察像)を示す。Fig. 2 shows enlarged images (left: bright-field observation image, left: fluorescence observation image) of a three-dimensional tissue constructed using the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment.

以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照にしながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings as necessary. The configuration of the embodiment is an example, and the configuration of the present invention is not limited to the specific configuration of the embodiment.

本明細書において、「第1」「第2」「第3」等の用語は、1つの要素をもう1つの要素と区別するために用いており、例えば、第1の要素を第2の要素と表現し、同様に第2の要素を第1の要素と表現してもよく、これによって本発明の範囲を逸脱するものではない。 As used herein, the terms “first,” “second,” “third,” etc. are used to distinguish one element from another, e.g. , and similarly the second element may be referred to as the first element, without departing from the scope of the invention.

特段の定義がない限り、本明細書で使用する用語(技術的用語および科学的用語)は、当業者が一般に理解している用語と同一の意味を有する。 Unless otherwise defined, all terms (technical and scientific terms) used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art.

図1-1及び図1-2は、一実施態様における本発明の人工血管床を示す模式図である。一実施態様において、本発明は、
人工血管床であって、
三次元生体組織の載置面を有する、生体適合性ハイドロゲルを含む組成物により形成された血管床部と;
前記血管床部の内部に設けられた第1流路及び第2流路と;
前記第1流路及び前記第2流路とそれぞれ連通し、前記載置面に設けられた第1穴隙及び第2穴隙と;
前記第1穴隙と前記第2穴隙との間を連通し、かつ、前記載置面に形成された橋渡し流路と;
前記第1流路に流体連通し、培地を供給するための第1送液部と;
前記第2流路に流体連通し、培地を排出するための第2送液部と
を備えた、人工血管床を提供する。
1-1 and 1-2 are schematic diagrams showing the artificial vascular bed of the present invention in one embodiment. In one embodiment, the invention provides
An artificial vascular bed,
a vascular bed formed of a composition containing a biocompatible hydrogel and having a three-dimensional biological tissue mounting surface;
a first channel and a second channel provided inside the vascular bed;
a first hole and a second hole provided in the mounting surface and communicating with the first channel and the second channel, respectively;
a bridging flow path communicating between the first gap and the second gap and formed in the mounting surface;
a first liquid delivery unit in fluid communication with the first channel for supplying culture medium;
a second fluid delivery section in fluid communication with the second flow path for discharging culture medium.

本明細書において、「人工血管床」とは、三次元生体組織(本明細書において「立体組織」とも称される。)に血管網を構築するために用いられるものであり、従来の血管網が豊富な組織(例えば、国際公開第2012/036224号に示される皮弁などの生体組織)とは区別され、インビトロにおいて作製され得る血管床をいう。 As used herein, the term "artificial vascular bed" is used to construct a vascular network in a three-dimensional biological tissue (also referred to herein as a "three-dimensional tissue"). It refers to a vascular bed that can be created in vitro, as distinct from tissue rich in blood (eg, living tissue such as the skin flap shown in WO2012/036224).

一実施態様において、本発明の人工血管床は、灌流可能な血管網の構築を意図する三次元生体組織(本明細書において「立体組織」とも称される。)を載置するための載置面を有する血管床部を備えている。載置面は、三次元生体組織を載置可能な形状であればよいが、平面状であることが好ましい。 In one embodiment, the artificial vascular bed of the present invention is a mounting for mounting a three-dimensional biological tissue (herein also referred to as a "three-dimensional tissue") intended to construct a perfusable vascular network. It has a vascular bed with a surface. The placement surface may have any shape as long as the three-dimensional living tissue can be placed thereon, but is preferably planar.

血管床部は、生体適合性ハイドロゲルを含む組成物により形成されている。本発明に適用可能な「生体適合性ハイドロゲル」としては、例えば、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの水溶性、水親和性、若しくは水吸収性合成高分子、多糖、タンパク質、核酸などを化学架橋したハイドロゲルが挙げられる。多糖としては、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカン、デンプン、グリコーゲン、アガロース、ペクチン、セルロース等が挙げられる。また、タンパク質としては、コラーゲン及びその加水分解物であるゼラチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、エンタクチン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン(例えば、フィブリノーゲンとトロンビンを反応させたフィブリンゲル)等が挙げられる。これらの生体適合性ハイドロゲルに対し、公知の方法を用いて架橋処理(例えば重合化処理)が行われ、強度が上がった架橋化された生体適合性ハイドロゲルが用いられてもよい。本発明に用いられ得る生体適合性ハイドロゲルとしては、本発明の人工血管床に載置される三次元生体組織(例えば、細胞を含むシート状組織)の収縮に耐えられる力学的特性と高い細胞接着性を有するハイドロゲルであることが好ましく、例えばそれはフィブリンゲルであり、第XIII因子をさらに含むものであってもよい。フィブリンゲルにさらにフィブリンゲル安定化因子が含まれることにより、フィブリンゲルの架橋化が促進され、本発明の人工血管床の載置面に載置された三次元生体組織によって、生体適合性ハイドロゲルが分解されたり、収縮したりすることが防止または遅延し、血管床内の流路の形状が維持される。 The vascular bed is made of a composition containing a biocompatible hydrogel. Examples of "biocompatible hydrogels" applicable to the present invention include water-soluble, water-affinitive, or Examples include hydrogels obtained by chemically cross-linking water-absorbing synthetic polymers, polysaccharides, proteins, nucleic acids, and the like. Examples of polysaccharides include glycosaminoglycans such as hyaluronic acid and chondroitin sulfate, starch, glycogen, agarose, pectin, and cellulose. As proteins, collagen and its hydrolysates gelatin, proteoglycan, fibronectin, vitronectin, laminin, entactin, tenascin, thrombospondin, von Willebrand factor, osteopontin, fibrinogen (for example, fibrinogen and thrombin were reacted fibrin gel) and the like. These biocompatible hydrogels may be subjected to a cross-linking treatment (eg, polymerization treatment) using a known method to obtain cross-linked biocompatible hydrogels with increased strength. Biocompatible hydrogels that can be used in the present invention include mechanical properties that can withstand the contraction of a three-dimensional biological tissue (for example, a sheet-like tissue containing cells) placed on the artificial vascular bed of the present invention, and high cell density. It is preferably an adhesive hydrogel, for example it is a fibrin gel and may additionally contain factor XIII. By further containing a fibrin gel stabilizing factor in the fibrin gel, cross-linking of the fibrin gel is promoted, and a biocompatible hydrogel is formed by the three-dimensional biological tissue mounted on the mounting surface of the artificial vascular bed of the present invention. is prevented or retarded from breaking down or constricting, and the shape of the channel within the vascular bed is maintained.

一実施形態において、本発明の人工血管床の血管床部の内部には、血管床部の外部から培地などの培養に必要な栄養を含む流体を送液可能な第1流路を備えている。また、本発明の人工血管床の血管床部の内部には、載置面の三次元生体組織に供給された、培地などの培養に必要な栄養を含む流体を排出するための第2流路を備えている。 In one embodiment, the interior of the vascular bed of the artificial vascular bed of the present invention is provided with a first channel capable of feeding a fluid containing nutrients necessary for culture, such as a culture medium, from the outside of the vascular bed. . Further, inside the vascular bed portion of the artificial vascular bed of the present invention, there is provided a second channel for discharging a fluid containing nutrients necessary for culture, such as a culture medium, supplied to the three-dimensional biological tissue on the mounting surface. It has

一実施態様において、本発明の人工血管床は、前記第1穴隙と前記第2穴隙との間を連通し、かつ、前記載置面に形成された橋渡し流路を備えている(図1-2参照)。橋渡し流路は、第1穴隙と第2穴隙の間を流体連通し、なおかつ、載置面に沿って解放されている、すなわち開口部を有しており、これによって橋渡し流路を覆うように載置された三次元生体組織に、第1流路から送液される培地が直接供給され得る。この時、三次元生体組織の直下からの大量の生化学因子の供給および灌流による機械刺激が供給されることにより、適用される三次元生体組織の内部に、これまでの人工血管床・生体血管床では達成し得なかった量の機能的な血管網の付与が可能となった。 In one embodiment, the artificial vascular bed of the present invention includes a bridging flow channel formed in the mounting surface and communicating between the first gap and the second gap (Fig. 1-2). The bridging channel provides fluid communication between the first and second gaps and is open or has an opening along the mounting surface, thereby covering the bridging channel. The culture medium fed from the first channel can be directly supplied to the three-dimensional living tissue placed in the manner described above. At this time, by supplying a large amount of biochemical factors from directly under the three-dimensional living tissue and mechanical stimulation by perfusion, the inside of the applied three-dimensional living tissue is replaced with conventional artificial vascular beds and living blood vessels. It has become possible to provide a functional vascular network of an amount that could not be achieved with a bed.

第1流路及び第2流路の断面形状は矩形でも概円であっても良い。円状の場合その直径は、人工血管床に適用される三次元生体組織の形状、厚さなどにより調節され得るために特に限定されない。また、橋渡し流路の幅及び深さは、第1流路から送液された培地を、三次元生体組織の直下に曝露可能な形状であればよく、例えば、約0.01~10mm、好ましくは約0.1~5mm程度の幅及び/又は深さで提供されてもよいが、その幅を大きくすると載置面上の三次元生体組織がその部分で沈み込み、流路の抵抗が増大する場合があるので、そのようにならない程度の幅に調節することがより好ましい。第1流路又は第2流路と、橋渡し流路との連通部分には、載置面と第1流路又は第2流路とそれぞれ連通する、縦穴状の第1穴隙及び第2穴隙が設けられている(図1-1,図1-2)。 The cross-sectional shapes of the first channel and the second channel may be rectangular or substantially circular. In the case of a circular shape, the diameter is not particularly limited because it can be adjusted according to the shape, thickness, etc. of the three-dimensional living tissue applied to the artificial vascular bed. In addition, the width and depth of the bridging channel may be any shape that allows the medium fed from the first channel to be exposed directly below the three-dimensional biological tissue, for example, about 0.01 to 10 mm, preferably may be provided with a width and/or depth of about 0.1 to 5 mm, but if the width is increased, the three-dimensional biological tissue on the mounting surface will sink at that portion, increasing the resistance of the flow path. Therefore, it is more preferable to adjust the width to such an extent that this does not occur. In the communicating portion between the first or second flow path and the bridging flow path, a vertical hole-shaped first gap and a second hole that communicate with the mounting surface and the first or second flow path, respectively. A gap is provided (Fig. 1-1, Fig. 1-2).

一実施態様において、第1流路及び第2流路は、図1-1に示すように略並行に配置してもよく、橋渡し流路の両側に直線状に配置してもよく、橋渡し流路の両側にV字型に配置されてもよく、限定されない。また、他の態様において、橋渡し流路は、第1流路及び第2流路の間に、1つまたは複数設けられてもよい(例えば、図17)。また、他の態様において、「第1流路-橋渡し流路-第2流路」の組み合わせは、1つであってもよく、複数設けられてもよい。また、橋渡し流路は、より複雑な構造、例えば網目状の構造など、第1流路及び第2流路とを連通する形状であればよく、直線状のものに限定されない。さらに、第1及び第2流路の外周を載置面に接する位置に作製する、又は第1及び第2流路として載置面上に溝を作製しても良く、これらの場合第1穴隙及び第2穴隙は設けなくてもよい。 In one embodiment, the first flow channel and the second flow channel may be arranged substantially parallel as shown in FIG. It may be arranged in a V-shape on both sides of the path, but is not limited. In another aspect, one or more bridging channels may be provided between the first channel and the second channel (eg, FIG. 17). In another aspect, the number of combinations of "first flow path-bridge flow path-second flow path" may be one, or a plurality thereof may be provided. Moreover, the bridging channel may have a more complicated structure, such as a mesh-like structure, as long as it communicates with the first channel and the second channel, and is not limited to a linear one. Furthermore, the outer peripheries of the first and second flow paths may be formed at positions in contact with the mounting surface, or grooves may be formed on the mounting surface as the first and second flow paths. The gap and the second hole gap may not be provided.

一実施態様において、本発明の人工血管床は、第1流路に流体連通し、培地を供給するための第1送液部を備えており、また、第2流路に流体連通し、培地を排出するための第2送液部を備えている。一実施態様において、第1流路と第1送液部、及び、第2流路と第2送液部は、それぞれが一体となって形成されるものであってもよく、一部が生体適合性ハイドロゲル以外の物質からなる管(例えば、シリコーンチューブ、金属管、カテーテル、サーフロー針、並びに、ポリエステル(例えばDacron(登録商標)、テフロン(登録商標)(ePTEE)又は合成高分子製の人工血管など)であってもよい。 In one embodiment, the artificial vascular bed of the present invention is in fluid communication with the first channel and includes a first liquid delivery part for supplying a culture medium, and is in fluid communication with the second channel and has a culture medium. is provided with a second liquid feeding unit for discharging the In one embodiment, the first channel and the first liquid feeding part, and the second channel and the second liquid feeding part may be formed integrally, and a part thereof may be Tubing made of materials other than compatible hydrogels (e.g., silicone tubing, metal tubing, catheters, Surfflow needles, and prosthetics made of polyester (e.g., Dacron®, Teflon® (ePTEE) or synthetic polymers) blood vessels, etc.).

例えば、第1送液部及び第2送液部として、サーフロー針を用いる場合、血管床部を形成するモールドに生体適合性ハイドロゲルを含む組成物を流し込み、血管床部からはみ出るように第1送液部及び第2送液部としてのサーフロー針を配置する(図2)。その上から、橋渡し流路形成部と、穴隙形成部とを有する流路形成デバイスを用い、穴隙形成部が第1送液部及び第2送液部としてのサーフロー針に接触するように配置し、生体適合性ハイドロゲルを硬化させる。その後、必要に応じて、流路形成デバイスと、サーフロー針を抜去することで人工血管床として使用することができる(図2)。なお、モールドは、培養時には人工血管床と共に使用してもよく、移植などの用途に用いる場合に必要に応じて除去すればよい。また、サーフロー針の外筒の先端部を、穴隙部よりも第1送液部及び第2送液部側にそれぞれ移動させ、なおかつ、サーフロー針の内筒は抜去することにより、サーフロー針の外筒を、第1流路(又は第2流路)と第1送液部(又は第2送液部)として使用することもできる。これにより、灌流培養時の培地供給ライン(又は培地排出ライン)が容易に接続可能となる。また、流路の耐圧性も向上する。 For example, when surfflow needles are used as the first liquid-feeding part and the second liquid-feeding part, a composition containing a biocompatible hydrogel is poured into a mold that forms a vascular bed, and the first needle is protruded from the vascular bed. A surflow needle is arranged as a liquid feeder and a second liquid feeder (FIG. 2). From above, a channel forming device having a bridging channel forming portion and a hole forming portion is used so that the hole forming portion is in contact with the surf needle as the first liquid feeding portion and the second liquid feeding portion. Place and cure the biocompatible hydrogel. After that, if necessary, it can be used as an artificial vascular bed by removing the channel forming device and the surfflow needle (Fig. 2). The mold may be used together with the artificial vascular bed during culture, and may be removed as necessary when used for purposes such as transplantation. Further, by moving the tip of the outer cylinder of the surflow needle toward the first liquid feeding section and the second liquid feeding section from the hole and removing the inner cylinder of the surflow needle, The outer cylinder can also be used as the first flow path (or second flow path) and the first liquid feeding section (or second liquid feeding section). This makes it possible to easily connect a medium supply line (or medium discharge line) during perfusion culture. Moreover, the pressure resistance of the flow path is also improved.

一実施態様において、本発明の人工血管床は、
前記第1送液部に接続された培地供給ラインと、
前記培地供給ラインに培地を供給する培地供給槽と、
前記培地供給ラインに培地を送る送液ポンプと、
前記第2送液部に接続された培地排出ラインと、
前記培地排出ラインから排出された培地を貯留する培地排出槽と、をさらに備えていてもよい。これらの構成によって、継続的又は間歇的に培地を灌流させることが可能となる。送液ポンプとしては、公知のポンプを用いることが可能であり、チューブポンプ(ペリスタポンプ)であってもよく、ピエゾポンプであってもよく、流体を送り出すことができるポンプであれば使用することができる。
In one embodiment, the synthetic vascular bed of the present invention comprises:
a medium supply line connected to the first liquid feeding unit;
a medium supply tank for supplying a medium to the medium supply line;
a liquid feed pump that feeds the medium to the medium supply line;
a medium discharge line connected to the second liquid feeding section;
A medium discharge tank for storing the medium discharged from the medium discharge line may be further provided. These configurations allow continuous or intermittent medium perfusion. A known pump can be used as the liquid-sending pump, and it may be a tube pump (peristaltic pump) or a piezo pump, and any pump that can send out a fluid can be used. can.

一実施態様において、培地供給槽と、培地排出槽が同一であり、培地が循環するものであってもよい。これにより、人工血管床に載置される三次元生体組織から産生される細胞成長因子などの液性成分を、培地交換までの一定時間において、循環させることができる。 In one embodiment, the medium supply tank and the medium discharge tank may be the same, and the medium may be circulated. As a result, liquid components such as cell growth factors produced from the three-dimensional biological tissue placed on the artificial vascular bed can be circulated for a certain period of time until the medium is replaced.

本発明の人工血管床を用いることにより、載置される三次元生体組織、人工血管床、及びそれらの間に灌流可能な血管網が構築され得る。本明細書において、「三次元生体組織」とは、細胞を含む三次元の構造体をいい、例えば、生体から単離された生体組織(例えば、臓器及び組織またはその一部(例えば、皮膚組織(例えば、毛根付随皮膚組織など)、心筋組織、骨格筋組織、平滑筋組織、肝組織、腎組織、消化管組織、眼組織(例えば角膜組織)、脳組織、胸腺組織、精巣組織、膵臓組織、甲状腺組織、乳腺組織、唾液腺組織、肺組織など)、又は、生体組織を構成する細胞を用いて再構築された三次元細胞構造体、例えば、オルガノイドが本発明に適用され得る。本発明に適用し得る生体から単離された生体組織とは、生体から採取された生体組織そのものであってもよく、生体から採取された生体組織を任意の形状に加工した組織片であってもよい。また、本発明に適用し得る三次元細胞構造体とは、細胞を含む懸濁液とゲル溶液又はゲル化剤とを混合させて形成した三次元細胞構造体であってもよく、複数枚の細胞を含むシート状組織(例えば細胞シート)を積層した三次元細胞構造体であってもよく、オルガノイドを載置した、細胞を含むシート状組織であってもよい。 By using the artificial vascular bed of the present invention, a three-dimensional living tissue to be placed, an artificial vascular bed, and a perfused vascular network between them can be constructed. As used herein, "three-dimensional biological tissue" refers to a three-dimensional structure containing cells, for example, biological tissue isolated from a living body (e.g., organs and tissues or parts thereof (e.g., skin tissue (e.g. hair root-associated skin tissue), cardiac muscle tissue, skeletal muscle tissue, smooth muscle tissue, liver tissue, kidney tissue, gastrointestinal tissue, eye tissue (e.g. corneal tissue), brain tissue, thymus tissue, testicular tissue, pancreatic tissue , thyroid tissue, mammary gland tissue, salivary gland tissue, lung tissue, etc.), or a three-dimensional cell structure reconstructed using cells that constitute biological tissue, such as an organoid, can be applied to the present invention. The applicable biological tissue isolated from a living body may be the biological tissue itself collected from the living body, or a tissue piece obtained by processing the biological tissue collected from the living body into an arbitrary shape. In addition, the three-dimensional cell structure applicable to the present invention may be a three-dimensional cell structure formed by mixing a suspension containing cells with a gel solution or a gelling agent. It may be a three-dimensional cell structure in which sheet-like tissues containing cells (for example, cell sheets) are laminated, or a sheet-like structure containing cells on which organoids are placed.

本明細書において、「オルガノイド(Organoid)」とは、臓器又は器官の形成に寄与する前駆細胞等の集合体から、3次元的に試験管内(in vitro)で構築された組織体をいい、当業者にとって最も広義に解釈される「オルガノイド」と同義のものを指す。オルガノイドは、一般に、実際の臓器又は器官よりも小型であり、単純な構造を有するが、解剖学的及び機能的に生体内に存在する臓器又は器官に近い特徴を示す。オルガノイドとしては、例えば、腎オルガノイド、肝臓オルガノイド、消化管オルガノイド(例えば、腸オルガノイド、口腔オルガノイド、胃オルガノイドなど)、眼杯オルガノイド、脳オルガノイド、胸腺オルガノイド、精巣オルガノイド、膵臓オルガノイド、上皮オルガノイド、甲状腺オルガノイド、乳腺オルガノイド、唾液腺オルガノイド及び肺オルガノイド等が挙げられ、また、これらのオルガノイドにがん細胞を含む「がんオルガノイド」なども含まれる。また、本明細書において、オルガノイドとは、生体から採取された臓器および組織またはその一部(例えば、組織片)を含むものであってもよい(例えば、Shamir ER., Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2014 Oct;15(10):647-64を参照)。 As used herein, the term "organoid" refers to a tissue body constructed three-dimensionally in vitro from aggregates such as progenitor cells that contribute to the formation of an organ or organ. Synonymous with "organoid" in the broadest sense of the trade. Organoids are generally smaller than actual organs or organs, have simple structures, but exhibit features that are anatomically and functionally similar to organs or organs that exist in vivo. Organoids include, for example, renal organoids, liver organoids, gastrointestinal organoids (e.g., intestinal organoids, oral organoids, gastric organoids, etc.), optic cup organoids, brain organoids, thymus organoids, testicular organoids, pancreatic organoids, epithelial organoids, and thyroid organoids. , mammary gland organoids, salivary gland organoids, lung organoids, and the like, and “cancer organoids” containing cancer cells in these organoids are also included. In addition, as used herein, organoids may include organs and tissues collected from living organisms or parts thereof (eg, tissue fragments) (eg, Shamir ER., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014 Oct;15(10):647-64).

本発明に適用可能な三次元生体組織、例えばオルガノイドを得る方法としては公知の方法を用いればよく、以下に限定されないが、例えば、腎オルガノイドは、Takasato M.,et al.,Nature.2015,Oct.22,526(7574),pp.564-568;肺オルガノイドは、Unbekandt M.,Kidney Int.,2010,Mar.,77(5),pp.407-416;胸腺オルガノイドは、Sheridan JM.,et al.,Genesis,2009 May,47(5),pp.346-351;精巣オルガノイドは、Sanjo H.,et al.,PLoS One.2018,Feb 12,13(2),e0192884などを参考にすればよい。その他、オルガノイドを形成する方法によって得られた任意のオルガノイドも用いることが可能である。 As a method for obtaining a three-dimensional biological tissue applicable to the present invention, such as an organoid, a known method may be used. , et al. , Nature. 2015, Oct. 22, 526 (7574), pp. 564-568; lung organoids are from Unbekandt M.; , Kidney Int. , 2010, Mar. , 77(5), pp. 407-416; thymic organoids are described in Sheridan JM. , et al. , Genesis, 2009 May, 47(5), pp. 346-351; testicular organoids are described in Sanjo H.; , et al. , PLoS One. 2018, Feb 12, 13(2), e0192884, etc. may be referred to. In addition, any organoids obtained by a method of forming organoids can also be used.

本発明に適用可能な三次元生体組織は、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、魚類の三次元生体組織である。好ましくは、哺乳動物の三次元生体組織であり、例えば、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ネコ、ヤギなどの哺乳動物由来の細胞を含んでいる。 Three-dimensional biological tissues applicable to the present invention are, for example, three-dimensional biological tissues of mammals, birds, amphibians, reptiles, and fish. Preferably, it is a three-dimensional living tissue of mammals, including cells derived from mammals such as mice, rats, humans, monkeys, pigs, dogs, sheep, cats, and goats.

本発明に適用可能な三次元生体組織に含まれる細胞は、生体組織から採取された初代細胞であってもよく、株化された細胞であってもよく、多能性幹細胞若しくは組織幹細胞(例えば、間葉系幹細胞)から分化誘導された細胞であってもよい。 The cells contained in the three-dimensional biological tissue applicable to the present invention may be primary cells collected from the biological tissue, may be established cells, and may be pluripotent stem cells or tissue stem cells (e.g. , mesenchymal stem cells) may be differentiation-induced cells.

本明細書において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力(分化多能性)を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は胚性幹細胞(embryonic stem cell:ES細胞)、胚性癌腫細胞(embryonic carcinoma cell:EC細胞)、栄養芽幹細胞(trophoblast stem cell:TS細胞)、エピブラスト幹細胞(epiblast stem cell:EpiS細胞)、胚性生殖細胞(embryonic germ cell:EG細胞)、多能性生殖細胞(multipotent germline stem cell:mGS細胞)、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell:iPS細胞)、Muse細胞等を含む。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開第2009/123349号に記載の多能性幹細胞を使用することができる。 As used herein, the term “pluripotent stem cell” is intended to collectively refer to stem cells that have the ability to differentiate into cells of any tissue (pluripotency). Pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells), embryonic carcinoma cells (EC cells), trophoblast stem cells (TS cells), Epiblast stem cells (EpiS cells), embryonic germ cells (EG cells), multipotent germline stem cells (mGS cells), induced pluripotent stem cells : iPS cells), Muse cells, etc. Any known pluripotent stem cells can be used, and for example, the pluripotent stem cells described in International Publication No. 2009/123349 can be used.

組織幹細胞や多能性細胞から、任意の三次元生体組織(例えば、オルガノイド)を構築する細胞へと分化させる方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、以下に限定されるわけではないが、腎オルガノイドを構築する細胞は、Takasato M.,et al.,Nature.2015,Oct.22,526(7574),pp.564-568;肝臓オルガノイドを構築する細胞は、Takebe T.,et al.,Nature,2013,Jul,25,499(7459),pp.481-484;消化管オルガノイドを構築する細胞は、Sato T.,et al.,Nature,2009,May 14,459(7244),pp.262-265;眼杯オルガノイドを構築する細胞は、Eiraku M.,et al.,Nature,2011,Apr 7,472(7341)pp.51-56;脳オルガノイドを構築する細胞は、Eiraku M.,et al.,Cell Stem Cell,2008,Nov 6,3(5),pp.519-532及びLancaster MA.,et al.,Nature,2013,Sep 19,501(7467),pp.373-379、肺オルガノイドを構築する細胞は、Yamamoto Y.,et al.,Nat Methods.2017 Nov,14(11),pp.1097-1106;膵臓オルガノイドを構築する細胞は、Raikwar SP.,et al.,PLoS One.2015 Jan 28,10(1),e0116582;甲状腺オルガノイドを構築する細胞は、Ma R.,et al.,Front Endocrinol(Lausanne).2015 Apr 22,6,56.などを参考にすることができる。その他、三次元生体組織を構築する細胞へと分化させる方法によって得られた任意の細胞も用いることが可能である。 As a method for differentiating tissue stem cells or pluripotent cells into cells that construct any three-dimensional biological tissue (eg, organoid), known methods can be used. For example, but not by way of limitation, cells that construct renal organoids are described in Takasato M.; , et al. , Nature. 2015, Oct. 22, 526 (7574), pp. 564-568; , et al. , Nature, 2013, Jul, 25, 499(7459), pp. 481-484; cells that construct gastrointestinal organoids are described by Sato T.; , et al. , Nature, 2009, May 14, 459(7244), pp. 262-265; , et al. , Nature, 2011, Apr 7, 472(7341) pp. 51-56; the cells that make up brain organoids are described by Eiraku M.; , et al. , Cell Stem Cell, 2008, Nov 6, 3(5), pp. 519-532 and Lancaster MA. , et al. , Nature, 2013, Sep 19, 501(7467), pp. 373-379, the cells that make up the lung organoids are described by Yamamoto Y.; , et al. , Nat Methods. 2017 Nov, 14(11), pp. 1097-1106; the cells that make up the pancreatic organoids are described in Raikwar SP. , et al. , PLoS One. 2015 Jan 28, 10(1), e0116582; , et al. , Front Endocrinol (Lausanne). 2015 Apr 22, 6, 56. etc. can be used as a reference. In addition, any cell obtained by a method of differentiating into a cell that constructs a three-dimensional biological tissue can also be used.

本明細書において、「細胞を含むシート状組織」とは、生体から採取した生体組織や、細胞を含む薄膜状の組織をいう。細胞を含むシート状組織は、生体から採取した組織そのものや、生体から採取した組織をシート状に加工し、複数層(例えば、3層、4層、5層、6層、7層、8層、9層、10層、20層、25層、30層、またはそれ以上)積層した三次元生体組織であってもよい。また、細胞を含むシート状組織は、細胞を含む懸濁液とゲルとを混合させて形成したシート状組織であってもよく、刺激応答性培養皿(例えば、温度応答性培養皿)を用いて作製した細胞シートであってもよい。さらにまた、細胞を含むシート状組織とは、膜状のゲルの上面に、細胞群を直接播種し、培養することにより形成されるものであってもよい。 As used herein, the term "sheet-like tissue containing cells" refers to a biological tissue collected from a living body or a thin film-like tissue containing cells. The sheet-shaped tissue containing cells is the tissue itself collected from the living body, or the tissue collected from the living body is processed into a sheet and formed into multiple layers (for example, 3 layers, 4 layers, 5 layers, 6 layers, 7 layers, 8 layers). , 9 layers, 10 layers, 20 layers, 25 layers, 30 layers, or more). Further, the sheet-like tissue containing cells may be a sheet-like tissue formed by mixing a suspension containing cells and a gel, and a stimulus-responsive culture dish (for example, a temperature-responsive culture dish) is used. It may be a cell sheet prepared by Furthermore, the sheet-like tissue containing cells may be formed by directly seeding and culturing a group of cells on the upper surface of a membrane-like gel.

本明細書において、「細胞シート」とは、複数の任意の細胞を含む細胞群を細胞培養基材上で培養し、細胞培養基材上から剥離することで得られる1層又は複数層のシート状の細胞群をいう。細胞シートを得る方法としては、例えば、温度、pH、光等の刺激によって分子構造が変化する高分子を被覆した刺激応答性培養基材上で細胞を培養し、温度、pH、光等の刺激の条件を変えて刺激応答性培養基材表面を変化させることで、細胞同士の接着状態は維持しつつ、刺激応答性培養基材から細胞をシート状に剥離する方法や、任意の培養基材上で細胞培養し、物理的にピンセット等により剥離して得る方法等が挙げられる。細胞シートを得るための刺激応答性培養基材としては、0~80℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した温度応答性培養基材が知られている。温度応答性培養基材上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで細胞をシート状の細胞群として剥離させることができる。 As used herein, the term “cell sheet” refers to a single-layer or multi-layer sheet obtained by culturing a cell group containing a plurality of arbitrary cells on a cell culture substrate and peeling off from the cell culture substrate. It refers to a group of cells with a shape. As a method for obtaining a cell sheet, for example, cells are cultured on a stimulus-responsive culture substrate coated with a polymer whose molecular structure changes with stimuli such as temperature, pH and light, and then subjected to stimuli such as temperature, pH and light. By changing the conditions to change the surface of the stimulus-responsive culture substrate, while maintaining the adhesion state between cells, a method of exfoliating cells from a stimulus-responsive culture substrate in a sheet form, or any culture substrate a method of culturing the cells on the surface and physically peeling them off with tweezers or the like. As stimulus-responsive culture substrates for obtaining cell sheets, temperature-responsive culture substrates coated with a polymer whose hydration force changes in the temperature range of 0 to 80° C. are known. Cells are cultured on a temperature-responsive culture substrate in a temperature range where the hydration force of the polymer is weak, and then the temperature of the culture solution is changed to a state where the hydration force of the polymer is strong. It can be exfoliated as a group of cells.

細胞シートを得るために用いられる温度応答性培養基材は、細胞が培養可能な温度域でその表面の水和力を変化させる基材であることが好ましい。その温度域は、一般に細胞を培養する温度、例えば33℃~40℃であることが好ましい。細胞シートを得るために用いられる培養基材に被覆される温度応答性高分子は、ホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平2-211865号公報に記載されているポリマーが挙げられる。 The temperature-responsive culture substrate used to obtain the cell sheet is preferably a substrate that changes the hydration force of its surface in the temperature range where cells can be cultured. The temperature range is preferably the temperature at which cells are generally cultured, eg, 33°C to 40°C. The temperature-responsive polymer coated on the culture substrate used to obtain the cell sheet may be either a homopolymer or a copolymer. Examples of such polymers include polymers described in JP-A-2-211865.

刺激応答性高分子、特に温度応答性高分子としてポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)を用いた場合を例(温度応答性培養皿)に説明する。ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)は31℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で31℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集して白濁する。逆に31℃未満の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明は、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆されて固定されたものである。したがって、31℃以上の温度であれば、培養基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が培養基材表面に固定されているため、培養基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、31℃未満の温度では、培養基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が培養基材表面に被覆されているため、培養基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着し、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できない表面となる。そのため、該基材を31℃未満に冷却すると、細胞が基材表面から剥離する。細胞が培養面一面にコンフルエントになるまで培養されていれば、該基材を31℃未満に冷却することによって細胞シートを回収できる。温度応答性培養基材は、同一の効果を有するものであれば限定されるものではないが、例えば、セルシード社(東京、日本)が市販するUpCell(登録商標)や、一般社団法人細胞シート再生医療推進機構(東京、日本)から提供されるスマート温度応答性培養皿SSCWなどが挙げられる。 A case where poly(N-isopropylacrylamide) is used as a stimulus-responsive polymer, particularly a temperature-responsive polymer, will be described as an example (temperature-responsive culture dish). Poly(N-isopropylacrylamide) is known as a polymer having a lower critical solution temperature of 31° C. If it is in a free state, it undergoes dehydration in water at a temperature of 31° C. or higher, causing the polymer chains to aggregate and become cloudy. Conversely, at temperatures below 31°C, the polymer chains are hydrated and dissolved in water. In the present invention, the surface of a substrate such as a petri dish is coated with the polymer and fixed. Therefore, at a temperature of 31°C or higher, the polymer on the surface of the culture substrate is also dehydrated, but since the polymer chains are fixed on the surface of the culture substrate, the surface of the culture substrate appears to be hydrophobic. become. Conversely, at temperatures below 31° C., the polymer on the surface of the culture substrate hydrates, but the surface of the culture substrate exhibits hydrophilicity because polymer chains are coated on the surface of the culture substrate. The hydrophobic surface at this time is a suitable surface to which cells can adhere and proliferate, and the hydrophilic surface is a surface to which cells cannot adhere. Therefore, when the substrate is cooled below 31° C., the cells are detached from the substrate surface. If the cells are cultured until they become confluent on the entire culture surface, the cell sheet can be collected by cooling the substrate to less than 31°C. The temperature-responsive culture substrate is not limited as long as it has the same effect. Smart temperature-responsive culture dish SSCW provided by Medical Promotion Organization (Tokyo, Japan) and the like.

一実施態様において、本発明は、上記の人工血管床と、前記載置面の前記橋渡し流路を覆うように載置された三次元生体組織と、を含む、人工三次元生体組織が提供され得る。本発明により得られる人工三次元生体組織は、例えば、流路形状や灌流条件の検討を通して、高細胞密度の三次元生体組織内での力学的刺激と血管新生の関係性を明らかにする血管新生研究モデルとして利用することができる他、経血管的に薬剤の投与を可能とし、例えば、形態変化やその代謝産物の増減などを指標とすることで評価可能となる新しい創薬試験モデルとしても利用することができる。また、第1送液部と第2送液部とが、それぞれ動脈又は静脈として吻合可能な人工三次元生体組織として提供され得る(例えば、図14参照)。 In one embodiment, the present invention provides an artificial three-dimensional living tissue comprising the artificial blood vessel bed described above and a three-dimensional living tissue mounted on the mounting surface so as to cover the bridging channel. obtain. The artificial three-dimensional biological tissue obtained by the present invention, for example, is angiogenesis, which clarifies the relationship between mechanical stimulation and angiogenesis in a three-dimensional biological tissue with high cell density through examination of channel shape and perfusion conditions. In addition to being used as a research model, it can also be used as a new drug discovery test model that enables transvascular drug administration and can be evaluated, for example, by using morphological changes and changes in metabolites as indicators. can do. Also, the first liquid-feeding part and the second liquid-feeding part can each be provided as an artificial three-dimensional living tissue that can be anastomosed as an artery or a vein (see FIG. 14, for example).

一実施態様において、本発明は、
三次元生体組織を、上述の人工血管床の前記載置面の前記橋渡し流路を覆うように載置する工程、
前記第1送液部に培地を供給し、かつ、前記第2送液部から培地を排出しながら灌流培養する工程、
を含む、血管網を備えた人工三次元生体組織の作製方法を提供する。
In one embodiment, the invention provides
placing the three-dimensional biological tissue so as to cover the bridging channel on the placement surface of the artificial vascular bed;
A step of supplying a medium to the first liquid feeding part and performing perfusion culture while discharging the medium from the second liquid feeding part;
To provide a method for fabricating an artificial three-dimensional living tissue with a vascular network, comprising:

培地を供給又は排出する速度は、人工血管床に載置される三次元生体組織に栄養及び酸素を供給可能であり、血管新生を促進可能な速度であればよく、適宜調節することが可能である。 The speed of supplying or discharging the medium may be any speed that can supply nutrients and oxygen to the three-dimensional biological tissue placed on the artificial vascular bed and promote angiogenesis, and can be adjusted as appropriate. be.

本発明に適用される三次元生体組織は、血管内皮細胞を含むものであることが好ましく、それは採取された三次元生体組織に含まれる血管内皮細胞であってもよく、外的に添加される血管内皮細胞であってもよい。 The three-dimensional biological tissue applied to the present invention preferably contains vascular endothelial cells, which may be vascular endothelial cells contained in the collected three-dimensional biological tissue, or externally added vascular endothelial cells. It may be a cell.

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を限定することを意図するものではない。 The present invention will be described in more detail below based on examples, but these are not intended to limit the invention.

<実施例1>
本発明の人工血管床は3Dプリンタで作製した流路形成デバイスの構造をハイドロゲル表面に転写することで作製した。第1および第2流路を構築するために、20Gのサーフローの外筒、および内針を挿入した流路形成デバイスであるシリコーンモールド内にハイドロゲルを注入後、3Dプリンタ製のデバイスを被せて30分間室温で静置することでゲル化させた。ゲル化確認後、3Dプリンタ製のデバイス、およびサーフローを抜去することによって前記穴隙構造、および前記橋渡し流路を有するハイドロゲル人工血管床を作製した(図2)。
<Example 1>
The artificial vascular bed of the present invention was produced by transferring the structure of a channel forming device produced by a 3D printer onto the hydrogel surface. In order to construct the first and second flow paths, after injecting hydrogel into a silicone mold, which is a flow path forming device with a 20 G surflow outer cylinder and an inner needle inserted, a device made by a 3D printer is covered. It was gelled by standing at room temperature for 30 minutes. After confirming the gelation, the hydrogel artificial vascular bed having the pore structure and the bridging channel was fabricated by removing the 3D printer device and SURFLOW (Fig. 2).

3Dプリンタ製のデバイス構造をハイドロゲル表面に転写することにより、第1および第2流路へと繋がる直径500μmの2本の穴隙構造(第1穴隙及び第2穴隙)、および2つの穴隙構造を繋ぐ幅300μm、深さ800μm、長さ5mmの橋渡し流路を表面に有するハイドロゲル人工血管床を作製した(図3)。またハイドロゲル人工血管床はサーフローの内針のみを完全に抜去し、外筒は完全に抜去せず留置しておくことによって、血管床流路への送液が容易に可能である。穴隙構造、および橋渡し流路部を光干渉断層撮影(OCT)(Santec Corporation、Japan)によって観察し、ハイドロゲル表面に上記構造を実現できていることを確認した(図3)。 By transferring the device structure made by a 3D printer to the hydrogel surface, two hole structures (first hole and second hole) with a diameter of 500 μm leading to the first and second flow paths, and two A hydrogel artificial vascular bed having bridging channels with a width of 300 µm, a depth of 800 µm, and a length of 5 mm connecting the pore structures was fabricated (Fig. 3). In addition, in the hydrogel artificial vascular bed, only the inner needle of SURFLOW is completely removed, and the outer tube is left in place without being completely removed, so that the liquid can be easily fed to the vascular bed channel. The pore structure and the bridging channel part were observed by optical coherence tomography (OCT) (Santec Corporation, Japan), and it was confirmed that the above structure was realized on the hydrogel surface (Fig. 3).

<実施例2>
本発明の人工血管床上に積層する血管内皮網を有する細胞シートは、GFP陽性のヒト臍帯静脈内皮細胞(GFP-HUVEC)、およびヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)の共培養により作製した。GFP-HUVECとNHDFを9:1の比率で1.0 × 10 cells /mLの濃度に調製した細胞懸濁液を直径35mmの温度応答性培養皿(Up Cell(登録商標)、セルシード社、東京、日本))、もしくはスマート温度応答性培養皿SSCW(一般社団法人細胞シート再生医療推進機構、東京、日本)に合計2mL播種し、37℃のインキュベーター内で3日間静置培養することで、血管内皮網付細胞シートを作製した。細胞シートは、20℃環境のインキュベーター内で30分から1時間静置培養することによって、温度応答性培養皿より回収した。
<Example 2>
A cell sheet having a vascular endothelial network layered on the artificial vascular bed of the present invention was produced by co-culturing GFP-positive human umbilical vein endothelial cells (GFP-HUVEC) and human dermal fibroblasts (NHDF). A cell suspension prepared by mixing GFP-HUVEC and NHDF at a ratio of 9:1 to a concentration of 1.0 × 10 6 cells/mL was placed in a temperature-responsive culture dish (Up Cell (registered trademark), CellSeed Inc., 35 mm in diameter). Tokyo, Japan)) or a smart temperature-responsive culture dish SSCW (General Incorporated Association Cell Sheet Regenerative Medicine Promotion Organization, Tokyo, Japan). A vascular endothelial reticulated cell sheet was prepared. The cell sheet was collected from the temperature-responsive culture dish by static culture in an incubator at 20° C. for 30 minutes to 1 hour.

本発明の人工血管床上での培養を行う立体組織は、血管内皮網付細胞シートを3層積層することで作製した。まず、1枚目の細胞シートを直径100mmの培養皿上に37℃、1時間の静置培養を行うことによって接着させた。続いて、2枚目の細胞シートを1枚目の細胞シート上に積層し、37℃、30分間の培養によって細胞シート同士を接着させた。3枚目の細胞シートも同様に、37℃、30分間の培養によって接着させ、血管内皮網付きの3枚の細胞シートを積層化した組織を得た。積層化組織をOHPフィルムにより人工血管床上へ移動し、穴隙構造、および橋渡し流路を覆うように載置させたのち、37℃、1時間の静置培養により人工血管床上へと生着させた。 The three-dimensional tissue for culturing on the artificial vascular bed of the present invention was prepared by laminating three layers of vascular endothelial meshed cell sheets. First, a first cell sheet was allowed to adhere to a culture dish having a diameter of 100 mm by static culture at 37° C. for 1 hour. Subsequently, a second cell sheet was layered on the first cell sheet, and cultured at 37° C. for 30 minutes to allow the cell sheets to adhere to each other. The third cell sheet was similarly adhered by culturing at 37° C. for 30 minutes to obtain a tissue in which three cell sheets with vascular endothelial networks were layered. The layered tissue was transferred onto the artificial vascular bed with an OHP film, placed so as to cover the pore structure and the bridging channels, and then left to stand on the artificial vascular bed at 37° C. for 1 hour. rice field.

培養3日目の細胞シートを蛍光顕微鏡によって観察した結果、血管内皮細胞のネットワーク構造の形成を確認した。また積層化組織を本発明の人工血管床の穴隙構造、および橋渡し流路を覆うように載置した状態で静置培養を1時間行った後、OCTを使用した断面構造の観察を行った結果、細胞シートが穴隙構造、および橋渡し流路の直上に生着していることが確認でき、穴隙構造、および橋渡し流路を直接培養液の灌流路とする人工血管床を実現した(図4)。 As a result of observing the cell sheet on day 3 of culture with a fluorescence microscope, formation of a network structure of vascular endothelial cells was confirmed. In addition, the layered tissue was placed so as to cover the pore structure of the artificial vascular bed of the present invention and the bridging channels, and after static culture for 1 hour, the cross-sectional structure was observed using OCT. As a result, it was confirmed that the cell sheet was engrafted directly above the pore structure and the bridging channel, and an artificial vascular bed was realized in which the pore structure and the bridging channel were directly used as perfusion channels for the culture solution ( Figure 4).

<実施例3>
本発明の人工血管床作製に利用可能なハイドロゲルの組成を検討した。本人工血管床は、人工血管床の橋渡し流路と細胞シートの間に構築される空間を直接流路として利用する。そのため、人工血管床上に積層した細胞シートによってハイドロゲルが収縮、もしくは分解されてしまうと、血管床流路である穴隙構造や橋渡し流路が破綻してしまう可能性がある。血管床流路が破綻すれば、灌流培養が困難となるだけでなく、細胞シート、および血管床内流路の距離の制御が困難になり、細胞シート直下への培養液の灌流が生体外での高細胞密度の組織への血管付与手法として有効であるか評価できない。したがって、細胞によるゲルの収縮、および分解によって、構造が変化しにくいハイドロゲルが3次元マイクロ流体システムを利用した人工血管床の作製に適正なハイドロゲルであると考えた(図5)。
<Example 3>
The compositions of hydrogels that can be used to fabricate the artificial vascular bed of the present invention were examined. This artificial vascular bed utilizes the space constructed between the bridging channel of the artificial vascular bed and the cell sheet as a direct channel. Therefore, if the hydrogel shrinks or decomposes due to the cell sheet laminated on the artificial vascular bed, there is a possibility that the pore structure and bridging channels that are vascular bed channels will collapse. If the vascular bed channel collapses, not only will it be difficult to perform perfusion culture, but it will also be difficult to control the distance between the cell sheet and the channel in the vascular bed. It is not possible to evaluate whether it is effective as a technique for adding blood vessels to tissues with high cell density. Therefore, we considered that a hydrogel that is resistant to structural changes due to gel contraction and degradation by cells would be suitable for fabricating an artificial vascular bed using a three-dimensional microfluidic system (Fig. 5).

本発明の人工血管床作製に適正なゲルの検討として、血管新生研究に使用されるハイドロゲルであるコラーゲンゲル、又はフィブリンゲルを候補として選択した。コラーゲンゲル(4mg/mL collagen, 0.3mmol/L NaHCO,及び0.2mmoL/L HEPES)、フィブリンゲル(5mg/mL Fibrinogen, 0.5U/mL thrombin,及び5mM CaCl)、そして第XIII因子を含むフィブリンゲル(0.5U/mL thrombin, 5mM CaCl, 40U/mL Factor XIII)の3種類のゲルを用いて穴隙構造を有する人工血管床を作製した。それぞれのハイドロゲルで作った血管床に三層の細胞シートを移植し、得られた組織をVEC1で5日間静置培養した。光学顕微鏡による血管床上面の観察、および光干渉断層計による橋渡し流路断面の観察を5日間毎日実施した。各ハイドロゲル血管床の構造の安定性は、血管床の上面の表面積、および橋渡し流路の断面積をそれぞれ測定し、3層の細胞シートを移植した直後の面積に対する5日間の変化の比率を計算することで評価した。 As a suitable gel for the artificial vascular bed fabrication of the present invention, collagen gel or fibrin gel, which are hydrogels used in angiogenesis research, were selected as candidates. collagen gel (4 mg/mL collagen, 0.3 mmol/L NaHCO3 , and 0.2 mmol/L HEPES), fibrin gel (5 mg/mL Fibrinogen, 0.5 U/mL thrombin, and 5 mM CaCl2 ), and factor XIII An artificial vascular bed having a pore structure was prepared using three types of gels: fibrin gel (0.5 U/mL thrombin, 5 mM CaCl 2 , 40 U/mL Factor XIII) containing Three layers of cell sheets were transplanted into each hydrogel vascular bed, and the resulting tissue was statically cultured in VEC1 for 5 days. Observation of the upper surface of the vascular bed with an optical microscope and observation of the bridging channel cross section with an optical coherence tomography were carried out every day for 5 days. The stability of the structure of each hydrogel vascular bed was measured by measuring the surface area of the upper surface of the vascular bed and the cross-sectional area of the bridging channel, respectively, and calculating the ratio of the change during 5 days to the area immediately after the three-layered cell sheet was implanted. evaluated by calculation.

図6-1は、各ハイドロゲルで構成した人工血管床上で3層の細胞シートを静置培養した際の明視野観察像、および橋渡し流路の断面像をそれぞれ示す。コラーゲンゲルで作製した血管床の上面は、培養1日目に大きく収縮し、その後4日間にわたって収縮し続けた。さらに、橋渡し流路の断面観察より、培養1日目において橋渡し流路がほぼ消失していることが確認された。また、フィブリンゲルで作製した血管床については、培養1日目に上面と橋渡し流路の収縮が確認された。その後、上面は培養1日目から5日目まで変化がなかったが、橋渡し流路はその後4日間にわたって収縮し続けることを確認した。一方、第XIII因子を含むフィブリンゲルで作製した血管床の観察結果より、5日間の培養期間中、上面、および橋渡し流路共に構造を維持していることが確認された。それぞれの面積の経時的な変化比率を評価した結果、第XIII因子を含むフィブリンゲルは、人工血管床の上面、および橋渡し流路の構造を最もよく保持できるハイドロゲルであることがわかった(図6-2)。 FIG. 6-1 shows bright-field observation images and cross-sectional images of bridging channels, respectively, when a three-layer cell sheet was statically cultured on an artificial vascular bed composed of each hydrogel. The upper surface of the vascular bed made of collagen gel contracted significantly on the first day of culture, and continued to contract over the following 4 days. Furthermore, from observation of the cross section of the bridging channel, it was confirmed that the bridging channel had almost disappeared on the first day of culture. In addition, contraction of the upper surface and the bridging channel was confirmed on the first day of culture for the vascular bed made of fibrin gel. After that, it was confirmed that the upper surface did not change from the 1st day to the 5th day of culture, but the bridging channel continued to shrink over the next 4 days. On the other hand, observation results of the vascular bed made of fibrin gel containing factor XIII confirmed that the structure of both the upper surface and the bridging channel was maintained during the 5-day culture period. As a result of evaluating the rate of change in each area over time, it was found that the fibrin gel containing factor XIII is the hydrogel that can best retain the structure of the upper surface of the artificial vascular bed and the bridging channel (Fig. 6-2).

以上の結果より、穴隙構造、橋渡し流路を直接流路とする本発明の人工血管床の作製のための、細胞によって構造が変化されにくい第XIII因子を含むフィブリンゲルの作製法を明らかにした。 From the above results, a method for producing a fibrin gel containing factor XIII whose structure is difficult to be changed by cells for producing an artificial vascular bed of the present invention with a pore structure and bridging channels as direct channels was clarified. bottom.

<実施例4>
第XIII因子を含むフィブリンゲルで作製した本発明の人工血管床上での細胞シートの静置培養、および灌流培養による、生体外における積層化細胞シート組織内への管腔を伴う血管付与効果を検証した。前述のプロトコルにより構築した血管内皮網付細胞シート3層の積層化組織を人工血管床の穴隙構造上に生着させたのち、37℃、CO 5%環境下において静置培養、および灌流培養を実施した。灌流培養では、第1流路からマイクロチューブポンプを用いて内皮細胞用培地VEC1(Kohjin Bio, Japan)を流量25μL/minで灌流し、橋渡し流路を通過した培地を第2流路からチャンバ内に流出させることによって、細胞シート直下への灌流を行った。チャンバ内に流出して貯まった培地は、細胞シート表面が大気に触れない程度まで毎日廃液することで管理した。また静置培養では、細胞シート直下への灌流は実施せず、チャンバ内に培養液をマイクロチューブポンプでVEC1を流量25μL/minで灌流し、同様に毎日廃液を行って培地量をコントロールすることにより、灌流培養の際に使用する培地と同様の量を使用した。
<Example 4>
Verification of the in vitro effect of imparting blood vessels with lumens to the layered cell sheet tissue by static culture and perfusion culture of the cell sheet on the artificial vascular bed of the present invention made of fibrin gel containing factor XIII bottom. After engrafting the layered tissue of three layers of the vascular endothelial mesh-attached cell sheet constructed according to the protocol described above on the pore structure of the artificial vascular bed, static culture and perfusion were carried out at 37° C. in a 5% CO 2 environment. Culture was performed. In the perfusion culture, the endothelial cell medium VEC1 (Kohjin Bio, Japan) is perfused from the first channel using a microtube pump at a flow rate of 25 μL / min, and the medium that has passed through the bridging channel is discharged from the second channel into the chamber. Perfusion directly below the cell sheet was performed by flowing out to the bottom of the cell sheet. The medium that flowed out and accumulated in the chamber was managed by draining the liquid every day until the surface of the cell sheet did not come into contact with the air. In static culture, perfusion directly below the cell sheet should not be performed, and VEC1 should be perfused into the chamber with a microtube pump at a flow rate of 25 μL/min. Therefore, the same amount of medium as that used for perfusion culture was used.

5日間の培養後、蛍光観察による血管内皮細胞の形態評価、送液部からのラット血液の灌流による血管構造の可視化、およびHE染色、CD31を用いた免疫染色による組織学的評価を行い、細胞シート内への管腔を伴う血管構造の付与が達成されているかどうか評価した(図7)。 After culturing for 5 days, the morphology of vascular endothelial cells was evaluated by fluorescence observation, the vascular structure was visualized by perfusion of rat blood from the liquid feeding part, and histological evaluation was performed by HE staining and immunostaining using CD31. It was evaluated whether the impartation of a vascular structure with a lumen into the sheet had been achieved (Fig. 7).

人工血管床上の細胞シートの直上から蛍光顕微鏡を用いて観察し、GFP-HUVECの形態を評価した(図8)。 The morphology of GFP-HUVEC was evaluated by observing with a fluorescence microscope directly above the cell sheet on the artificial vascular bed (Fig. 8).

灌流培養、および静置培養を5日間実施した検体それぞれについて、培養前後の弱拡大像(図8左及び真中)、および培養後の組織の強拡大像(図8右)を示した。いずれの条件においても、培養前よりも培養後の組織内の方が血管内皮細胞のネットワーク化が促進されていることが観察された。また、灌流培養を実施した検体では、静置培養の検体と比較して穴隙構造部に細胞が集積している様子が確認された。さらに強拡大の観察像から、灌流培養を実施した組織内では、内皮細胞のネットワーク構造が静置培養の構造と比較して太く、管腔を形成している様子が確認された。 Low-magnification images before and after culture (left and middle in FIG. 8) and high-magnification images of the tissue after culture (right in FIG. 8) are shown for each of the specimens that underwent perfusion culture and static culture for 5 days. Under any conditions, it was observed that the networking of vascular endothelial cells was promoted more in the tissue after culture than before culture. In addition, it was confirmed that in the perfusion-cultured specimen, cells were accumulated in the pore structure portion compared to the static culture specimen. Furthermore, from observation images at high magnification, it was confirmed that the network structure of endothelial cells was thicker and formed lumens in the perfusion-cultured tissue compared to the static culture structure.

<実施例5>
細胞シート内への血管付与効果を検証するため、墨汁の灌流による血管構造の可視化を行った。墨汁を生理食塩水で2倍希釈した墨汁を、灌流培養時と同様の流量25μL/minで1時間灌流することにより、細胞シート内に灌流可能な管腔を伴う血管構造が付与されているか評価した。また、墨汁の灌流にはシリンジポンプを使用した(図9)。
<Example 5>
In order to verify the effect of adding blood vessels to the cell sheet, we visualized the blood vessel structure by perfusion of Indian ink. By perfusing India India ink, diluted twice with physiological saline, for 1 hour at a flow rate of 25 μL/min, which is the same as in the perfusion culture, it was evaluated whether a vascular structure with a perfusable lumen was provided in the cell sheet. bottom. In addition, a syringe pump was used for perfusion of Indian ink (Fig. 9).

静置培養、および灌流培養によって作製した組織への1時間の墨汁灌流後の観察像を図9に示す。静置培養で作製した組織では、図中下側の第1流路から灌流した墨汁は穴隙構造から橋渡し流路を通過し、第2流路へと流出していく様子が観察され、細胞シート内への血管構造の付与は認められなかった。また、組織内には血管内皮細胞のネットワーク構造が形成されていたが、墨汁の灌流が認められず、静置培養では灌流可能な血管網の導入ができないことが明らかとなった。一方、灌流培養で作製した組織では、第1流路上の穴隙構造、および橋渡し流路を起点として形成された組織内の血管構造を通り、組織の上面に墨汁が流出していることを確認した。また、墨汁が流入した血管網を蛍光観察した結果、GFP陽性の血管内皮細胞で構成された血管内腔に墨汁が導入されていることを確認し、灌流可能な血管網が付与されていることを認めた。 FIG. 9 shows observation images after 1-hour ink perfusion of tissues prepared by static culture and perfusion culture. In the tissue prepared by static culture, it was observed that the ink perfused from the first flow path in the lower part of the figure passed through the bridging flow path from the pore structure and flowed out to the second flow path. No vascular structure was observed in the sheet. In addition, although a network structure of vascular endothelial cells was formed in the tissue, perfusion of Indian ink was not observed, and it was clarified that static culture could not introduce a perfusable vascular network. On the other hand, in the tissue prepared by perfusion culture, it was confirmed that India ink flowed out to the upper surface of the tissue through the pore structure on the first channel and the vascular structure in the tissue formed starting from the bridging channel. bottom. In addition, as a result of fluorescence observation of the blood vessel network into which India ink has flowed, it was confirmed that India ink was introduced into the vascular lumen composed of GFP-positive vascular endothelial cells. admitted.

灌流培養によって作製した組織にシリンジポンプを使用して生理食塩水でラット血液を2倍希釈した調整血液を1時間灌流した。灌流後の組織の観察像を図10に示した。第1流路から流入した調製血液が、細胞シート内の網目状の構造を通り、上部に流出したことを確認した。さらに、上段右の点線部を血流スコープ(TOKU Capillaro)で観察した結果、調製血液中の赤血球が細胞シート内の網目状の構造内を流れている様子を確認した(図10下段左)。以上の結果より、前記載置面の前記橋渡し流路(可能でしたら穴隙も)を利用した人工血管床上での灌流培養によって、細胞シート内に巨視的観察で確認可能なレベルの血管網が形成され、さらに付与された血管は赤血球の灌流が可能であることを確認した。 The tissue prepared by perfusion culture was perfused for 1 hour with conditioned blood obtained by diluting rat blood twice with physiological saline using a syringe pump. An observation image of the tissue after perfusion is shown in FIG. It was confirmed that the prepared blood that flowed in from the first channel passed through the mesh-like structure in the cell sheet and flowed out to the top. Furthermore, as a result of observing the dotted line portion on the upper right with a blood flow scope (TOKU Capillaro), it was confirmed that erythrocytes in the prepared blood flowed through the mesh-like structure in the cell sheet (FIG. 10, lower left). Based on the above results, perfusion culture on the artificial vascular bed using the bridging channels (and, if possible, the holes) of the mounting surface creates a vascular network at a level that can be confirmed by macroscopic observation in the cell sheet. It was confirmed that the formed and added blood vessels were capable of perfusion of erythrocytes.

<実施例6>
静置培養、および灌流培養を実施した検体の組織切片を作製し、HE染色、およびCD31を用いた蛍光免疫染色による組織学的評価を行った。培養終了後の組織を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィンに包埋した。その後、穴隙構造部、および橋渡し流路部において組織切片を作製し、HE染色を行った。さらに、組織内における血管内皮細胞の分布を評価するために、血管内皮細胞の抗体であるCD31を用いた免疫染色を実施した。また、組織断面の観察像は、灌流培養での送液部、流出部を考慮し、Inflow部、Bridge部、Outflow部と呼称し、それぞれの部分において弱拡大、強拡大での観察像を示した。
<Example 6>
Tissue sections were prepared from specimens subjected to static culture and perfusion culture, and histological evaluation was performed by HE staining and fluorescent immunostaining using CD31. The cultured tissue was fixed with 4% paraformaldehyde and then embedded in paraffin. After that, tissue sections were prepared in the pore structure part and the bridging channel part, and HE staining was performed. Furthermore, in order to evaluate the distribution of vascular endothelial cells in the tissue, immunostaining using CD31, which is an antibody for vascular endothelial cells, was performed. In addition, observation images of tissue cross sections are referred to as inflow, bridge, and outflow parts in consideration of the liquid supply part and outflow part in perfusion culture, and each part is shown at low magnification and high magnification. rice field.

静置培養でのHE染色像(図11)および、CD31を用いた免疫染色の結果(図11-2)より、いずれの箇所においても静置培養では細胞シート内に管腔を有する血管付与はできていないことが確認された。 From the HE-stained image in static culture (Fig. 11) and the results of immunostaining using CD31 (Fig. 11-2), in static culture at any point, blood vessels having a lumen in the cell sheet were not added. It was confirmed that it did not.

一方、灌流培養を実施した検体のHE染色像(図12-1)では、Outflow部、Bridge部において細胞が顕著に増殖している様子を確認した。さらに強拡大の観察像より、いずれの部位においても赤の矢印で示すような赤血球を含む管腔構造が多数形成されていることを確認した。 On the other hand, in the HE-stained image (FIG. 12-1) of the sample subjected to perfusion culture, it was confirmed that the cells proliferated significantly in the Outflow area and the Bridge area. Furthermore, from observation images at high magnification, it was confirmed that a large number of luminal structures containing erythrocytes, as indicated by red arrows, were formed in all sites.

また、血管内皮細胞の分布を評価するため、CD31を用いた蛍光免疫染色を行った(図12-2)。その結果、緑色で染色された血管内皮細胞により構成された管腔構造が組織内に均一、かつ密に存在することを確認した。また、血管内皮細胞で構成された管腔構造内に赤血球が含まれていることを確認した。これより、赤血球を含む組織内の多数の管腔構造は、内皮細胞で構成された管腔を伴う血管であることを明らかにした。 In addition, in order to evaluate the distribution of vascular endothelial cells, fluorescence immunostaining using CD31 was performed (Fig. 12-2). As a result, it was confirmed that a luminal structure composed of vascular endothelial cells stained green was uniformly and densely present in the tissue. In addition, it was confirmed that erythrocytes were contained within the luminal structure composed of vascular endothelial cells. This revealed that many luminal structures in tissues containing erythrocytes are blood vessels with lumens composed of endothelial cells.

以上の結果より、本発明の人工血管床による細胞シート直下への灌流培養手法は、生体外での高細胞密度の組織への大量の機能的な血管付与手法として有効であることを明らかにした。 From the above results, it was clarified that the method of perfusion culture directly under the cell sheet using the artificial vascular bed of the present invention is effective as a method of providing a large amount of functional blood vessels to a tissue with a high cell density in vitro. .

本発明の人工血管床が、従来の血管床より多くの血管付与効果を示した要因として、細胞シート近位からの大量の生化学因子の供給、および灌流による機械刺激が考えられる(図13)。従来の血管床では、細胞シート生着面の近位や遠位にあるゲル内の新生血管、または筋肉組織内の血管からのサイトカインなどの生化学因子の拡散により、組織内で血管新生を誘導した。一方、本発明では、細胞によって構造が変化されにくいフィブリンゲルに設けた穴隙構造、および橋渡し流路を直接血管床流路として利用することで、細胞シート直下への安定的な培養液の供給を実現した。これにより、細胞シート生着面近位からのより大量のサイトカインの安定的な供給が可能となった。さらに、培養液の灌流によって細胞シートに直接与えられるせん断流などの血管新生誘導に寄与すると考えられている機械刺激を与えることを可能とした。上記の複合的な要因により、生体外において高細胞密度の組織へのこれまでにない血管付与を実現できたと考えられる。また、フィブリンゲルに設けた穴隙構造を直接流路として利用するという特性上、血管床流路形状のバラツキはなく、組織に対する生化学因子の安定的な供給、および灌流による機械刺激を与えることが可能であるため、血管付与手法として高い再現性を有する(図13)。 The artificial vascular bed of the present invention exhibited a greater vascularity than the conventional vascular bed, and the supply of a large amount of biochemical factors from the proximal region of the cell sheet and the mechanical stimulation due to perfusion are thought to be factors (Fig. 13). . In conventional vascular beds, neovascularization within the gel proximal or distal to the cell sheet engraftment surface or diffusion of biochemical factors such as cytokines from blood vessels within muscle tissue induces angiogenesis within the tissue. bottom. On the other hand, in the present invention, the pore structure provided in the fibrin gel, whose structure is difficult to be changed by cells, and the bridging channel are used directly as the vascular bed channel, thereby stably supplying the culture solution directly below the cell sheet. realized. This made it possible to stably supply a larger amount of cytokine from the vicinity of the cell sheet engraftment surface. Furthermore, it was possible to apply mechanical stimuli such as shear flow directly to the cell sheet by perfusion of the culture medium, which are thought to contribute to the induction of angiogenesis. It is believed that the combination of factors described above made it possible to provide unprecedented blood vessels to tissues with high cell density in vitro. In addition, since the pore structure provided in the fibrin gel is used as a direct channel, there is no variation in the shape of the vascular bed channel, and it is possible to stably supply biochemical factors to the tissue and to give mechanical stimulation by perfusion is possible, it has high reproducibility as a technique for imparting blood vessels (Fig. 13).

本研究によって開発した人工血管床は、生体外での立体組織灌流培養の新たなプラットフォーム技術としての活用が期待される。3Dプリンタを活用することによって、フィブリンゲル表面に任意に自在な穴隙構造、および橋渡し流路のデザインが可能であり、かつ本流路は細胞を含まない流路構造であるため、検体差がほとんどない安定的な流路構造を有する血管床を容易に作製可能である。本血管床上に、これまで様々な細胞での臨床研究の実績のある細胞シートを生着させ灌流培養を実施することにより、実際に灌流が可能な血管網を付与した状態での立体組織の作製が可能である。また、細胞シート上にオルガノイド等を始めとした細胞シート以外の組織工学的技術によって作製された立体組織を生着させることによって、生着させた立体組織への生体外での血管付与、および灌流培養が可能であると期待される。これにより、三次元生体組織に対して流体による力学的刺激を直接負荷可能であるため、力学的刺激が高細胞密度の立体組織内での血管新生に及ぼす影響の解明のための実験モデルとして利用可能である。また、付与した血管への薬剤の灌流による生体外で構築した立体組織を用いた創薬試験モデルや、生体外で構築した立体組織を用いた移植治療の研究モデルとしての利用が考えられ、生体外での立体組織構築研究の様々な用途での応用が期待される。 The artificial vascular bed developed in this research is expected to be used as a new platform technology for three-dimensional tissue perfusion culture in vitro. By utilizing a 3D printer, it is possible to freely design the pore structure and bridging channel on the fibrin gel surface, and since the main channel has a channel structure that does not contain cells, there is almost no sample difference. A vascular bed having a stable flow path structure without a flow path can be easily produced. On this vascular bed, by engrafting a cell sheet that has a proven track record of clinical research with various cells and performing perfusion culture, a three-dimensional tissue with a vascular network that can actually be perfused is created. is possible. In addition, by engrafting a three-dimensional tissue such as an organoid on a cell sheet produced by a tissue engineering technique other than a cell sheet, the engrafted three-dimensional tissue can be provided with blood vessels in vitro and perfused. It is expected that culturing is possible. As a result, it is possible to directly apply mechanical stimulation by fluid to three-dimensional living tissue, so it can be used as an experimental model for clarifying the effect of mechanical stimulation on angiogenesis in three-dimensional tissue with high cell density. It is possible. In addition, it can be used as a drug discovery test model using a three-dimensional tissue constructed in vitro by perfusion of a drug into the applied blood vessel, or as a research model for transplantation treatment using a three-dimensional tissue constructed in vitro. It is expected to be applied to various uses of three-dimensional tissue construction research outside.

<実施例7>
本発明の応用例の一例として、灌流培養時の灌流量の変更が血管新生へと与える影響の有無を確認することによって、血管新生研究モデルとしての利用が可能か検討した。灌流量を25μL/minで5日間の灌流培養を実施した検体を条件1、灌流量を25μL/minで3日間、その後灌流量を4倍の100μL/minに上昇させて2日間灌流培養を実施した検体を条件2とし、各条件で培養した検体に墨汁を灌流することにより、付与された灌流可能な血管構造を比較したところ、灌流量を上昇させた条件2において、より密に、そしてより広範囲に血管網の付与が認められた(図15)。以上の結果より、灌流量の変更は血管新生に与える影響があることが確認された。つまり、本モデルは生体外において高細胞密度の立体組織への効率的な血管新生に必要な生化学条件、力学的条件を明らかにするための血管新生研究モデルとして利用可能であることが示唆された。
<Example 7>
As an example of the application of the present invention, the possibility of use as an angiogenesis research model was investigated by confirming the presence or absence of the influence of changes in the perfusion amount during perfusion culture on angiogenesis. The specimen was perfused cultured for 5 days at a perfusion rate of 25 μL / min under condition 1, the perfusion rate was increased to 25 μL / min for 3 days, and then the perfusion rate was increased four times to 100 μL / min for 2 days. The specimen cultured under each condition was treated as condition 2, and the perfused vascular structure was compared by perfusing India ink into the specimen cultured under each condition. An extensive vascular network was observed (Fig. 15). From the above results, it was confirmed that changing the perfusion rate has an effect on angiogenesis. In other words, it is suggested that this model can be used as an angiogenesis research model for clarifying the biochemical and mechanical conditions necessary for efficient angiogenesis into high-cell-density three-dimensional tissues in vitro. rice field.

<実施例8>
本手法の特徴として、Three Dimentsional Computer-Aided Design(3DCAD)を用いた設計により作製したデバイスの構造をフィブリンゲル表面に転写することによって血管床の流路を構築しているため、容易に様々な流路を構築可能である。そのため、立体組織に対して血管新生位置をデザインすることや、複数本流路を設けることで、より広範囲における血管新生誘導を可能にすることが期待される。また、細胞によって構造が変化されにくいフィブリンゲルを採用しているため、数値流体解析を導入することにより、複数本化した際のそれぞれの流路に流れる培養液の速度なども把握することができ、それに応じて適宜流路の設計変更を行うことで流量を制御した複数本流路を構築可能である。図16は、複数の流路を設けた人工血管床の例を示す。
<Example 8>
As a feature of this method, the structure of the device produced by the design using Three Dimensional Computer-Aided Design (3D CAD) is transferred to the surface of the fibrin gel to construct the flow path of the vascular bed, so it can be easily used in various ways. A channel can be constructed. Therefore, it is expected that angiogenesis can be induced in a wider range by designing the position of angiogenesis in a three-dimensional tissue or by providing a plurality of channels. In addition, since fibrin gel is used, the structure of which is difficult to change due to cells, by introducing computational fluid dynamics analysis, it is possible to grasp the speed of the culture solution flowing through each channel when multiple channels are used. By appropriately changing the design of the flow path accordingly, it is possible to construct a plurality of flow paths in which the flow rate is controlled. FIG. 16 shows an example of an artificial vascular bed with multiple channels.

<実施例9>
立体組織構築法としての本発明の有用性を示すため、開発した人工血管床を用いた細胞シートの段階的積層による立体組織構築が可能であるか検証した。「段階的積層」とは、培養液の拡散によって維持可能な3層の細胞シートを1セットとし、一定期間を置いて繰り返し人工血管床上に移植することで、血管を段階的に細胞シートに導入し,立体組織を構築する手法である(図17)。
<Example 9>
In order to demonstrate the usefulness of the present invention as a three-dimensional tissue construction method, it was verified whether three-dimensional tissue construction by stepwise lamination of cell sheets using the developed artificial vascular bed is possible. “Stepwise lamination” means that a set of three layers of cell sheets that can be maintained by the diffusion of the culture medium is set and repeatedly transplanted onto the artificial vascular bed at regular intervals, thereby gradually introducing blood vessels into the cell sheet. This is a technique for constructing a three-dimensional structure (Fig. 17).

本実施例では、実施例2と同様の方法により作製した細胞シートを用いた。人工血管床上で3層の細胞シートを5日間灌流培養した後、次のセットの3層の細胞シートを移植、追加で3日間の灌流培養を実施した。培養後の組織断面をOCTで観察した結果、追加で積層した3層の細胞シート内にも管腔構造の形成が認められた(図18)。さらに、培養後の組織に対して墨汁を灌流した結果、墨汁の灌流が認められる大量の血管網が6層の細胞シートに導入されていることを明らかにした(図19)。以上の結果から、本発明の人工血管床を用いた段階的積層により、灌流可能な血管網を有する立体組織が構築可能であることが示された。これより、段階的積層数を3、6、9、12層と増やすことで、従来作製が困難であるミリメートルオーダーの立体組織構築に応用可能であると期待される。つまり、本手法は生体外における立体組織構築手法として有用であることが示唆された。 In this example, a cell sheet prepared by the same method as in Example 2 was used. After the 3-layer cell sheet was perfusion cultured on the artificial vascular bed for 5 days, the next set of 3-layer cell sheets was transplanted, and additional 3-day perfusion culture was performed. As a result of observing the cross section of the tissue after culturing by OCT, formation of a tubular structure was also observed in the additionally laminated three-layered cell sheet (Fig. 18). Furthermore, as a result of perfusion of India ink into the cultured tissue, it was clarified that a large amount of vascular network, in which perfusion of India ink was observed, was introduced into the six-layered cell sheet (Fig. 19). From the above results, it was shown that by stepwise lamination using the artificial vascular bed of the present invention, a three-dimensional tissue having a vascular network capable of perfusion can be constructed. From this, it is expected that by increasing the number of stepwise lamination to 3, 6, 9, and 12 layers, it will be possible to apply to construction of millimeter-order three-dimensional structures, which has been difficult to fabricate conventionally. In other words, it was suggested that this method is useful as a three-dimensional tissue construction method in vitro.

Claims (12)

人工血管床であって、
三次元生体組織の載置面を有する、生体適合性ハイドロゲルを含む組成物により形成された血管床部と;
前記血管床部の内部に設けられた第1流路及び第2流路と;
前記第1流路及び前記第2流路とそれぞれ連通し、前記載置面に設けられた第1穴隙及び第2穴隙と;
前記第1穴隙と前記第2穴隙との間を連通し、かつ、前記載置面に形成された橋渡し流路と;
前記第1流路に流体連通し、培地を供給するための第1送液部と;
前記第2流路に流体連通し、培地を排出するための第2送液部と
を備えた、人工血管床。
An artificial vascular bed,
a vascular bed formed of a composition containing a biocompatible hydrogel and having a three-dimensional biological tissue mounting surface;
a first channel and a second channel provided inside the vascular bed;
a first hole and a second hole provided in the mounting surface and communicating with the first channel and the second channel, respectively;
a bridging flow path communicating between the first gap and the second gap and formed in the mounting surface;
a first liquid delivery unit in fluid communication with the first channel for supplying culture medium;
and a second liquid delivery section in fluid communication with the second flow path for discharging culture medium.
前記生体適合性ハイドロゲルが、架橋化された生体適合性ハイドロゲルである、請求項1に記載の人工血管床。 2. The artificial vascular bed according to claim 1, wherein the biocompatible hydrogel is a crosslinked biocompatible hydrogel. 前記生体適合性ハイドロゲルが、フィブリンゲルを含む、請求項1に記載の人工血管床。 2. The artificial vascular bed of claim 1, wherein said biocompatible hydrogel comprises fibrin gel. 前記生体適合性ハイドロゲルが、フィブリンゲル安定化因子を含む、請求項3に記載の人工血管床。 4. The artificial vascular bed of claim 3, wherein said biocompatible hydrogel comprises a fibrin gel stabilizing factor. 前記第1送液部に接続された培地供給ラインと、
前記培地供給ラインに培地を供給する培地供給槽と、
前記培地供給ラインに培地を送る送液ポンプと、
前記第2送液部に接続された培地排出ラインと、
前記培地排出ラインから排出された培地を貯留する培地排出槽と、
をさらに備える、請求項1~4のいずれか1項に記載の人工血管床。
a medium supply line connected to the first liquid feeding unit;
a medium supply tank for supplying a medium to the medium supply line;
a liquid feed pump that feeds the medium to the medium supply line;
a medium discharge line connected to the second liquid feeding section;
a medium discharge tank for storing the medium discharged from the medium discharge line;
The artificial vascular bed according to any one of claims 1 to 4, further comprising:
前記培地供給槽と、前記培地排出槽が同一であり、培地が循環することを特徴とする、請求項5に記載の人工血管床。 6. The artificial vascular bed according to claim 5, wherein the medium supply tank and the medium discharge tank are the same, and the medium is circulated. 請求項1~6のいずれか1項に記載の人工血管床と、
前記載置面の前記橋渡し流路を覆うように載置された三次元生体組織と
を含む、人工三次元生体組織。
The artificial vascular bed according to any one of claims 1 to 6;
and a three-dimensional living tissue mounted on the mounting surface so as to cover the bridging channel.
前記三次元生体組織が、細胞を含むシート状組織又はオルガノイドである、請求項7に記載の人工三次元生体組織。 8. The artificial three-dimensional biological tissue according to claim 7, wherein the three-dimensional biological tissue is a sheet-like tissue containing cells or an organoid. 前記三次元生体組織が、血管内皮細胞を含む、請求項7又は8に記載の人工三次元生体組織。 The artificial three-dimensional biological tissue according to claim 7 or 8, wherein the three-dimensional biological tissue contains vascular endothelial cells. 血管網を備えた人工三次元生体組織の作製方法であって、
三次元生体組織を、請求項1~6のいずれか1項に記載の人工血管床の前記載置面の前記橋渡し流路を覆うように載置する工程、
前記第1送液部に培地を供給し、かつ、前記第2送液部から培地を排出しながら灌流培養する工程、
を含む、方法。
A method for producing an artificial three-dimensional biological tissue having a vascular network, comprising:
A step of placing a three-dimensional biological tissue so as to cover the bridging channel of the placement surface of the artificial vascular bed according to any one of claims 1 to 6;
A step of supplying a medium to the first liquid feeding part and performing perfusion culture while discharging the medium from the second liquid feeding part;
A method, including
前記三次元生体組織が、細胞を含むシート状組織又はオルガノイドである、請求項10に記載の方法。 11. The method according to claim 10, wherein the three-dimensional biological tissue is a sheet-like tissue or organoid containing cells. 前記三次元生体組織が、血管内皮細胞を含む、請求項10又は11に記載の方法。 12. The method of claim 10 or 11, wherein the three-dimensional biological tissue comprises vascular endothelial cells.
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