JP2023069732A

JP2023069732A - Soilborne disease control agent plants and soilborne disease control method for plants

Info

Publication number: JP2023069732A
Application number: JP2021181826A
Authority: JP
Inventors: 昌杰姜; Change-Jie Jang; トゥザーウィンキン; Thuzar Win Khin; 福代田中; Fukuyo Tanaka; 香純竹内; Kasumi Takeuchi; 光智衣小林; Michie Kobayashi
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2021-11-08
Filing date: 2021-11-08
Publication date: 2023-05-18

Abstract

To provide a novel soilborne disease control agent for plants comprising microorganisms as an active ingredient.SOLUTION: A soilborne disease control agent for plants comprises Pseudomonas bacteria having 16S rRNA gene consisting of a base sequence having at least 96% sequence identity with the base sequence of SEQ ID NO: 1, Pseudomonas bacteria having 16S rRNA gene consisting of a base sequence having at least 98% sequence identity with the base sequence of SEQ ID NO: 2, or a combination thereof as an active ingredient.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、植物の土壌伝染性病害防除剤及び植物の土壌伝染性病害防除方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a plant soil-borne disease control agent and a plant soil-borne disease control method.

植物の病害保護を目的として、殺菌剤や殺虫剤等の化学農薬が広く一般に使用されている。しかしながら、化学農薬は高い植物保護効果を有する一方で、環境への負荷が高かったり、残留農薬や農薬曝露によって植物や人体に悪影響を及ぼしたりする可能性がある。このような化学農薬の懸念を解消する点から、近年では、植物を病害から保護する効果を有する微生物が生物農薬として利用されている。例えば、特許文献１では、トリコデルマ属に属する微生物を有効成分として含有する黒根腐病の防除用組成物等が報告されている。 Chemical pesticides such as fungicides and insecticides are widely and commonly used for the purpose of protecting plants from disease. However, while chemical pesticides have a high plant-protecting effect, they have a high environmental load and may adversely affect plants and humans due to residual pesticides and exposure to pesticides. In order to eliminate such concerns about chemical pesticides, in recent years, microorganisms that have the effect of protecting plants from diseases have been used as biopesticides. For example, Patent Document 1 reports a composition for controlling black root rot containing, as an active ingredient, a microorganism belonging to the genus Trichoderma.

特開２００６－１５１８９８号公報JP 2006-151898 A

本発明は、微生物を有効成分として含有する新規な植物の土壌伝染性病害防除剤を提供することを目的とする。本発明は、また、微生物を用いた、新規な植物の土壌伝染性病害防除方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a novel plant soil-borne disease control agent containing a microorganism as an active ingredient. Another object of the present invention is to provide a novel method for controlling soil-borne diseases of plants using microorganisms.

本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、配列番号１に示す塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌ＯＦＴ２株及び配列番号２に示す塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌ＯＦＴ５株が、植物の土壌伝染性病害に対して優れた防除効果を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have found a Pseudomonas bacterium OFT2 having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. The inventors have found that the OFT5 strain has an excellent control effect against soil-borne diseases of plants, and have completed the present invention.

すなわち、本発明は、例えば、以下の態様を含む。
［１］配列番号１に示す塩基配列に対して９６％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせを有効成分として含有する、植物の土壌伝染性病害防除剤。
［２］配列番号１に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９９％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせを有効成分として含有する、［１］に記載の土壌伝染性病害防除剤。
［３］土壌伝染性病害の病原微生物が、カロネクトリア属（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ）菌、フィトフソラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）菌、又はこれらの組み合わせを含む、［１］又は［２］に記載の土壌伝染性病害防除剤。
［４］土壌伝染性病害が立枯性病害である、［１］～［３］のいずれかに記載の土壌伝染性病害防除剤。
［５］植物がマメ科植物である、［１］～［４］のいずれかに記載の土壌伝染性病害防除剤。
［６］配列番号１に示す塩基配列に対して９６％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせを土又は植物に付与する工程を含む、植物の土壌伝染性病害防除方法。
［７］配列番号１に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９９％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせを土又は植物に付与する工程を含む、［６］に記載の方法。
［８］土壌伝染性病害の病原微生物が、カロネクトリア属（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ）菌、フィトフソラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）菌、又はこれらの組み合わせを含む、［６］又は［７］に記載の方法。
［９］土壌伝染性病害が立枯性病害である、［６］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］植物がマメ科植物である、［６］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］前記細菌を土又は植物に付与する工程が、前記細菌を含む液体を種子に添加することを含む、［６］～［１０］のいずれかに記載の方法。 That is, the present invention includes, for example, the following aspects.
[1] Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 96% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 98% to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 A plant soil-borne disease control agent containing, as an active ingredient, a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having the above sequence homology, or a combination thereof.
[2] Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 98% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, a sequence of 99% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 The soil-borne disease control agent according to [1], which contains, as an active ingredient, a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a homologous nucleotide sequence, or a combination thereof.
[3] The soil-borne disease control agent according to [1] or [2], wherein the soil-borne disease-causing microorganisms include Calonectria bacteria, Phytophthora bacteria, or a combination thereof.
[4] The soil-borne disease control agent according to any one of [1] to [3], wherein the soil-borne disease is a damping-off disease.
[5] The soil-borne disease control agent according to any one of [1] to [4], wherein the plant is a legume.
[6] Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 96% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, a sequence of 98% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 A method for controlling soil-borne diseases of plants, comprising the step of imparting a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a homologous nucleotide sequence, or a combination thereof, to soil or plants.
[7] Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 98% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, a sequence of 99% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 The method according to [6], which comprises the step of imparting a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a homologous nucleotide sequence, or a combination thereof, to soil or plants.
[8] The method of [6] or [7], wherein the pathogenic microorganism for soil-borne diseases includes Calonectria, Phytophthora, or a combination thereof.
[9] The method according to any one of [6] to [8], wherein the soil-borne disease is a damping-off disease.
[10] The method according to any one of [6] to [9], wherein the plant is a legume.
[11] The method according to any one of [6] to [10], wherein the step of applying the bacterium to soil or plants includes adding a liquid containing the bacterium to seeds.

本発明によれば、微生物を有効成分として含有する新規な植物の土壌伝染性病害防除剤を提供することができる。また、本発明によれば、微生物を用いた新規な植物の土壌伝染性病害防除方法を提供することができる。本発明は細菌を有効成分とするため、非天然の化学農薬のような薬害等の心配がなく、収穫直前まで使用又は実施することが可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a novel plant soil-borne disease control agent containing a microorganism as an active ingredient. Moreover, according to the present invention, a novel method for controlling soil-borne diseases of plants using microorganisms can be provided. Since the present invention uses bacteria as an active ingredient, it can be used or practiced until just before harvest without worrying about phytotoxicity, etc. unlike unnatural chemical pesticides.

試験例１において、２週間栽培した後のダイズ植物個体を比較観察した写真である。1 is a photograph of comparative observation of soybean plant individuals after cultivation for two weeks in Test Example 1. FIG. 試験例１において、病原菌の増殖度（Ｃｉ－ｒＤＮＡ／Ｇｍ－Ａｃｔ１）を比較したグラフである（Ｔｕｋｅｙ’ｓＨＳＤｔｅｓｔ，Ｐ＜０．０５）。1 is a graph comparing the growth rate of pathogenic bacteria (Ci-rDNA/Gm-Act1) in Test Example 1 (Tukey's HSD test, P<0.05). 試験例２において、４週間栽培した後のダイズ植物個体の地上部乾重（ｇ／個体）を比較したグラフである（Ｔｕｋｅｙ’ｓＨＳＤｔｅｓｔ，Ｐ＜０．０５）。2 is a graph comparing dry weights (g/individual) of above ground parts of soybean plant individuals after cultivation for 4 weeks in Test Example 2 (Tukey's HSD test, P<0.05). 試験例３において、７日間培養した後の濾紙上の黒根腐病菌の菌糸コロニーを比較観察した写真である。2 is a photograph showing comparative observation of mycelial colonies of black root rot fungus on filter paper after culturing for 7 days in Test Example 3. FIG. 試験例３において、７日間培養した後の濾紙上の黒根腐病菌の相対増殖度を比較したグラフである。3 is a graph comparing relative growth rates of black root rot fungi on filter paper after culturing for 7 days in Test Example 3. FIG. 試験例３において、７日間培養した後のプレート上の黒根腐病菌の菌糸コロニーを比較観察した写真である。上のプレートは各種シュードモナス属細菌を培養したプレート又はＭｏｃｋであり、下のプレートは黒根腐病菌を接種したプレートである。2 is a photograph showing comparative observation of mycelial colonies of black root rot fungus on a plate after culturing for 7 days in Test Example 3. FIG. The upper plate is a plate or mock cultured with various Pseudomonas bacteria, and the lower plate is a plate inoculated with black root rot. 試験例３において、７日間培養した後のプレート上の黒根腐病菌の相対増殖度を比較したグラフである。3 is a graph comparing relative growth rates of black root rot fungi on plates after culturing for 7 days in Test Example 3. FIG.

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Embodiments for carrying out the present invention will be described in detail below. However, the present invention is not limited to the following embodiments.

［植物の土壌伝染性病害防除剤］
本発明の一実施形態における植物の土壌伝染性病害防除剤は、配列番号１に示す塩基配列に対して９６％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせを有効成分として含有する。 [Plant soil infectious disease control agent]
The plant soil-borne disease control agent in one embodiment of the present invention is a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 96% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, sequence It contains Pseudomonas bacteria having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having 98% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in No. 2, or a combination thereof as an active ingredient.

（シュードモナス属細菌）
本実施形態の防除剤が含有するシュードモナス属細菌が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の、配列番号１に示す塩基配列に対する配列相同性は、９５％、９５．５％以上、９６％以上、９６．５％、９７％以上、９７．５％、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上又は１００％であってもよい。配列番号１に示す塩基配列は、シュードモナス属細菌ＯＦＴ２株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。シュードモナス属細菌ＯＦＴ２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＥｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＮＩＴＥ））バイオテクノロジーセンター特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に寄託されており、その受託番号は、ＮＩＴＥＰ－０１７４３（受託日：２０１３年１０月３１日）である。本実施形態の防除剤が含有する細菌はシュードモナス属細菌ＯＦＴ２株であってもよい。 (Pseudomonas bacteria)
The nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of the Pseudomonas bacterium contained in the control agent of the present embodiment has a sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of 95%, 95.5% or more, 96% or more, 96. It may be 5%, 97% or more, 97.5%, 98% or more, 98.5% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 100%. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of Pseudomonas bacterium OFT2 strain. The Pseudomonas bacterium OFT2 strain was obtained from the National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Biotechnology Center, Patent Microorganism Depositary Center (NPMD) (2-5 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). 8), and the accession number is NITE P-01743 (Date of accession: October 31, 2013). The bacterium contained in the control agent of the present embodiment may be Pseudomonas bacterium OFT2 strain.

本実施形態の防除剤が含有するシュードモナス属細菌が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の、配列番号２に示す塩基配列に対する配列相同性は、９７％以上、９７．５％、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上又は１００％であってもよい。配列番号２に示す塩基配列は、シュードモナス属細菌ＯＦＴ５株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列である。シュードモナス属細菌ＯＦＴ５株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＮＩＴＥＰ－０２５９３（受託日：２０１７年１２月１４日）である。本実施形態の防除剤が含有する細菌はシュードモナス属細菌ＯＦＴ５株であってもよい。 The sequence homology of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene possessed by the Pseudomonas bacterium contained in the control agent of the present embodiment to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 97% or more, 97.5% or more, 98% or more, 98. It may be 5% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 100%. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene of Pseudomonas bacterium OFT5 strain. The Pseudomonas bacterium OFT5 strain has been deposited at the National Institute of Technology and Evaluation, Biotechnology Center, Patent Microorganisms Depositary, and its accession number is NITE P-02593 (acceptance date: December 14, 2017). . The bacterium contained in the control agent of the present embodiment may be Pseudomonas bacterium OFT5 strain.

シュードモナス属細菌ＯＦＴ２株、シュードモナス属細菌ＯＦＴ５株及び実施例にて比較例として用いているシュードモナス属細菌ＲＨ７株は、例えば、Ｍａｔｓｕｏｋａｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＳｏｉｌ（２０１６），４０７：１７３－１８６に記載されている。 Pseudomonas bacterium OFT2 strain, Pseudomonas bacterium OFT5 strain, and Pseudomonas bacterium RH7 strain used as a comparative example in the examples are described, for example, in Matsuoka et al. , Plant Soil (2016), 407:173-186.

本実施形態の防除剤は、シュードモナス属細菌ＯＦＴ２株、シュードモナス属細菌ＯＦＴ５株、又はこれらの組み合わせを有効成分として含有するものであってもよい。 The control agent of the present embodiment may contain Pseudomonas bacterium OFT2 strain, Pseudomonas bacterium OFT5 strain, or a combination thereof as an active ingredient.

配列番号１に示す塩基配列に対して高い配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌及び配列番号２に示す塩基配列に対して高い配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌は、それぞれが土壌伝染性病害に対して防除効果を有するため、単独で使用しても効果があるが、組み合わせて使用してもよい。 Bacteria having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having high sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having high sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 Each of the bacteria having a control effect on soil-borne diseases is effective even when used alone, but may be used in combination.

シュードモナス属細菌は、自ら単離してきたものを使用してもよく、施設から分譲され
たものを使用してもよく、或いは生物農薬製品として市場で利用可能なシュードモナス属
細菌（即ち、市販品）を使用してもよく、その使用に関しては特に限定されない。 The Pseudomonas bacterium may be one that has been isolated by oneself, one that has been distributed from a facility, or a Pseudomonas bacterium that is commercially available as a biopesticide product (i.e., a commercial product). may be used, and there is no particular limitation regarding its use.

（土壌伝染性病害）
本実施形態の防除剤の対象となる土壌伝染性病害は、土壌中に生存する病原微生物によって発生する病害である限り特に限定されない。土壌中に生存する病原微生物としては、例えば糸状菌（真菌類や卵菌類等）及び細菌等が挙げられる。病原微生物である糸状菌の具体例としては、フィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｓｏｊａｅ）、フィトフトラ・カクトラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｃｔｏｒｕｍ）、フィトフトラ・カプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ）、及びフィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃｉｎｎａｍｏｍｉ）等のフィトフトラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）菌、カロネクトリア・イリシコーラ（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａｉｌｉｃｉｃｏｌａ）等のカロネクトリア属（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ）菌、ピシウム・ウルティマム（Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ）、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、ピシウム・メガラカンタム（Ｐｙｔｈｉｕｍｍｅｇａｌａｃａｎｔｈｕｍ）等のピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属菌、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウムグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ）等のフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属菌、リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）等のリゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属菌、ティエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属菌等が挙げられる。また、糸状菌以外の病原微生物の具体例としては、エルウィニアカロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）等のエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属菌、ラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）等のラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属菌、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）等のペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌、バークホルデリア・グルメ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｇｌｕｍａｅ）等のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属菌、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）等のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌等が挙げられる。本実施形態において、土壌伝染性病害の病原微生物は糸状菌を含むことが好ましく、カロネクトリア属（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ）菌、フィトフソラ属（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）菌、又はこれらの組み合わせを含むことがより好ましく、カロネクトリア・イリシコーラ、フィトフトラ・ソジャ、又はこれらの組み合わせを含むことがさらに好ましい。カロネクトリア・イリシコーラは、ダイズ黒根腐病を引き起こす病原菌であり、広くマメ科植物に感染することが知られているが、ダイズ以外にも、ラッカセイ、ムラサキウマゴヤシ、ツルマメ、チャノキ、ブルーベリー及びアボカド等に感染することが知られている。カロネクトリア・イリシコーラは、ＵＨ２－１株であってもよい。 (Soil infectious disease)
The soil-borne disease targeted by the control agent of the present embodiment is not particularly limited as long as it is caused by pathogenic microorganisms living in soil. Examples of pathogenic microorganisms living in soil include filamentous fungi (fungi, oomycetes, etc.) and bacteria. Specific examples of filamentous fungi that are pathogenic microorganisms include Phytophthora sojae, Phytophthora cactorum, Phytophthora capsici, and Phytophthora cinnamomi. Phytophthora such as omi) ) fungi, Calonectria fungi such as Calonectria iricicola, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Pythium megalatum Pythium ( Pythium) genus fungi, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium solani (Fusarium solani) and other Fusarium genus fungi, Rhizoctonia solani Rhizoctonia genus such as i) fungi, genus Thielaviopsis, and the like. Specific examples of pathogenic microorganisms other than filamentous fungi include Erwinia genus such as Erwinia carotovora, Ralstonia genus such as Ralstonia solanacearum, and Pectobacterium carotovorum. Pectobacterium genus such as (Pectobacterium carotovorum), Burkholderia genus such as Burkholderia glumae, Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tu) mefaciens) and other Agrobacterium ( Agrobacterium) and the like. In the present embodiment, pathogenic microorganisms for soil-borne diseases preferably include filamentous fungi, more preferably Caronectria, Phytophthora, or combinations thereof, such as Caronectria irisicola, More preferably, it contains Phytophthora soja, or a combination thereof. Caronectria irisicola is a pathogenic bacterium that causes soybean black root rot, and is known to infect a wide range of leguminous plants. known to do. Caronectria irisicola may be strain UH2-1.

本実施形態の防除剤の対象となる土壌伝染性病害は、例えば、苗立枯病、ピシウム腐敗病、床替苗根腐病、萎凋病、葉腐病、根腐病、つる割病、立枯病、萎黄病、尻腐病、根腐衰弱病、球果褐変病、腐敗病、葉枯病、乾腐病、株枯病、赤かび病、球根腐敗病、茎腐萎凋病、茎腐病、根腐萎凋病、黒すじ実腐病、半枯病、黒しみ病、パナマ病、褐色腐敗病、フザリウム病、株腐病、紋枯病、芽枯病、くもの巣病、褐色紋枯病、すそ枯病、リゾクトニア病、球茎腐敗病、黒あざ病、せん孔葉枯病、乾性根腐病、大粒白絹病、虎斑病、すそ腐病、実腐病、腰折病、林地根腐病、尻腐病、莢腐敗、皮腐病、褐色あざ病、根朽病、褐色斑点病、白色葉腐病、リゾクトニア葉鞘腐敗病、リゾクトニア根腐病、水耕苗根腐病等が挙げられるが、これらに限定されない。土壌伝染性病害は立枯性病害であってもよい。立枯性病害は、根や地際の茎から感染し、株全体の生育が悪くなり、進行するとやがて株全体が立ち枯れ症状を示す病害の総称である。立枯性病害には、例えば、黒根腐病、茎疫病及び立枯病が含まれる。土壌伝染性病害は、黒根腐病及び／又は茎疫病であってよく、植物がダイズの場合には、ダイズ黒根腐病及び／又はダイズ茎疫病であってもよい。ダイズ黒根腐病は、カロネクトリア・イリシコーラにより引き起こされる病害であり、主に地下部（根）で発病し、生育後期に発生して被害を引き起こす。現時点で、有効な抵抗性品種や完全に発病を抑制できる効果の高い技術は見出されていない。ダイズ茎疫病は、フィトフトラ・ソジャにより引き起こされる病害であり、ダイズ生育全般を通して発生し、主に播種直後から生育初期にかけて被害を引き起こす。 Soil-borne diseases targeted by the control agent of the present embodiment include, for example, seedling damping, Pythium rot, bed-replacement seedling root rot, wilt, leaf rot, root rot, wilt wilt, and plant rot. Blight, wilt, end rot, root rot, conifer browning, rot, leaf blight, dry rot, stock blight, fusarium head blight, bulb rot, stem rot, stem rot disease, root rot, black streak fruit rot, semi-blight disease, black blotch disease, Panama disease, brown rot, fusarium disease, stock rot, sheath blight, bud blight, spider web disease, brown stain Blight, base blight, rhizoctonia, corm rot, black bruise, leaf piercing, dry root rot, large white silk disease, tiger spot, base rot, fruit rot, koshibori disease, forest roots Rot, end rot, pod rot, skin rot, brown bruise, root rot, brown spot, white leaf rot, Rhizoctonia leaf sheath rot, Rhizoctonia root rot, hydroponic seedling root rot, etc. include but are not limited to: The soil-borne disease may be a damping-off disease. Wilting disease is a general term for diseases that are infected from the roots and stems at the ground level, the growth of the entire plant becomes poor, and as the disease progresses, the plant as a whole exhibits symptoms of damping off. Take-off diseases include, for example, black root rot, stem rot and take-off. The soil-borne disease may be black root rot and/or stem late blight, and when the plant is soybean, it may be soybean black root rot and/or soybean stem late blight. Soybean black root rot is a disease caused by Caronectria irisicola, which mainly develops in the underground part (root) and occurs in the late stage of growth to cause damage. At present, neither an effective resistant cultivar nor a highly effective technique capable of completely suppressing the onset of the disease has been found. Soybean stem plague is a disease caused by Phytophthora soja, occurs throughout soybean growth, and causes damage mainly from immediately after seeding to early growth.

（植物）
本実施形態において病害防除される対象となる植物は、特に限定されないが、農産物であることが好ましい。農産物の種類としては、例えば、野菜、穀物、果物、花、及び豆類等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。また、その具体例としては、マメ科植物（ダイズ、ツルマメ等のダイズ属植物、ムラサキウマゴヤシ（アルファルファ）等のウマゴヤシ属植物、ササゲ、アズキ等のササゲ属植物、インゲンマメ等のインゲンマメ属植物、エンドウ等のエンドウ属植物、シカクマメ等のシカクマメ属、ソラマメ等のソラマメ属植物、ナタマメ等のナタマメ属植物、ラッカセイ等のラッカセイ属植物、レンズマメ等のヒラマメ属植物）、ゴマ科植物（ゴマ等のゴマ属植物）、ツツジ科植物（ツツジ等のツツジ属植物、ブルーベリー、ヒルベリー、ツルコケモモ等のスノキ属植物）、クスノキ科植物（アボカド等のワニナシ属植物）、ツバキ科植物（チャノキ等のツバキ属植物）、ウリ科植物（キュウリ、メロン等のキュウリ属植物、スイカ等のスイカ属植物、カボチャ、ズッキーニ等のカボチャ属植物、ヒョウタン、ユウガオ等のユウガオ属植物、ヘチマ等のヘチマ属植物、トウガン等のトウガン属植物、テッポウウリ等のエクバリウム属植物、ツルレイシ（ニガウリ、ゴーヤ）等のツルレイシ属植物等）、ナス科植物（ナス、トマト、ジャガイモ等のナス属植物、ピーマン、トウガラシ等のトウガラシ属植物）、サトイモ科植物（サトイモ等のサトイモ属植物）、ヒルガオカ科植物（サツマイモ等のサツマイモ属植物）、ヤマノイモ科植物（ナガイモ、ヤマノイモ等の属植物）、アブラナ科植物（カブ等のアブラナ属植物、ダイコン、ハツカダイコン等のダイコン属植物、ワサビ等のワサビ属植物、ホースラディッシュ等のセイヨウワサビ属植物）、キク科植物（レタス等のアキノノゲシ属植物、ゴボウ等のゴボウ属植物、シュンギク等のシュンギク属植物）、シソ科植物（シソ等のシソ属植物）、ショウガ科植物（ショウガ等のショウガ属植物）、セリ科植物（ニンジン等のニンジン属植物、セリ等のセリ属植物、パセリ、セロリ等のオランダミツバ属植物）、ネギ科植物（ラッキョウ、ニラ、ネギ等のネギ属植物）、アブラナ科植物（キャベツ、カラシナ、ハクサイ、コマツナ、タカナ、チンゲンサイ等のアブラナ属植物、ダイコン等のダイコン属植物）、ヒユ科植物（ホウレンソウ等のホウレンソウ属植物）、イネ科植物（イネ等のイネ属植物、コムギ等のコムギ属植物、トウモロコシ等のトウモロコシ属植物、オオムギ等のオオムギ属植物）等が挙げられる。本実施形態において病害防除される対象となる植物は、マメ科植物、ツバキ科植物、ツツジ科植物又はクスノキ科植物であってよく、ダイズ属植物、ラッカセイ属植物、ツバキ属植物、スノキ属植物又はワニナシ属植物であってもよく、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａ）、ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅｓｏｊａ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ブルーベリー及びアボカド（Ｐｅｒｓｅａａｍｅｒｉｃａｎａ）であってもよい。また、本実施形態において病害防除される対象となる植物は、マメ科植物であってよく、ダイズ属植物又はラッカセイ属植物であってもよく、ダイズであってもよい。病害防除される対象となる植物がマメ科植物である場合には、本実施形態の防除剤に含まれる細菌により、生育向上効果も得られる。したがって、病害防除される対象となる植物がマメ科植物である場合には、本実施形態の防除剤は、植物の土壌伝染性病害防除及び生育促進剤であってもよい。 (plant)
Plants targeted for disease control in the present embodiment are not particularly limited, but are preferably agricultural products. Types of agricultural products include, but are not particularly limited to, vegetables, grains, fruits, flowers, legumes, and the like. Specific examples thereof include leguminous plants (soybean, wild soybean and other soybean plants, alfalfa and other plants of the genus Medicago, cowpeas, azuki beans and other cowpea plants, common bean plants such as kidney beans, peas, etc. pea plants, winged bean such as winged bean, fava bean plant such as fava bean, soybean plant such as jack bean, peanut plant such as groundnut, lentil plant such as lentil), sesame family plant (sesame plant such as sesame ), Ericaceous plants (Rhododendron plants such as azaleas, Vaccinium plants such as blueberries, leeches, and cranberries), Lauraceae plants (Alligator plants such as avocado), Camellia plants (Camellia plants such as tea trees), gourds Plants belonging to the family (Cucumber genus plants such as cucumbers and melons, Watermelon genus plants such as watermelons, Pumpkin genus plants such as pumpkins and zucchini, Gourds, Milkweed plants such as gourds, Loofah genus plants such as luffa, and Starch genus plants such as Togan , Ecvalium genus plants such as Easter melon, Momordica genus plants such as bitter melon, bitter gourd, etc.), Solanaceous plants (Solanaceous plants such as eggplants, tomatoes, potatoes, etc., Capsicum plants such as green peppers, peppers, etc.), Taro plants (plants of the genus Taro such as taro), plants of the genus Convolvulaceae (plants of the genus Ipomoea such as sweet potatoes), plants of the family Dioscoreaceae (plants of the genus such as Chinese yam and Dioscorea), plants of the Brassicaceae family (plants of the genus Brassica such as turnips, radish, radish, etc.) Japanese radish plants, Wasabi plants such as wasabi, Horseradish plants such as horseradish), Asteraceae plants (Lactuca plants such as lettuce, Burdock plants such as burdock, Chrysanthemum plants such as Chrysanthemum), Labiatae plants (plants of the genus Perilla such as perilla), plants of the family Zingiberaceae (plants of the genus Zingiber such as ginger), plants of the Umbelliferae family (plants of the genus Ginseng such as carrots, plants of the genus Apiaceae such as parsley, plants of the genus Apis such as parsley and celery), Allium family plants (allium plants such as shallots, chives, leeks, etc.), cruciferous plants (cabbage, mustard, Chinese cabbage, Japanese mustard spinach, takana, bok choy, etc., radish plants such as Japanese radish), Amaranthaceae plants (spinach) plants belonging to the genus Spinach), plants belonging to the family Gramineae (plants belonging to the genus Poaceae such as rice, plants belonging to the genus Wheat such as wheat, plants belonging to the genus Maize such as corn, and plants belonging to the genus Barley such as barley). Plants targeted for disease control in the present embodiment may be leguminous plants, Theaceae plants, Ericaceae plants or Lauraceae plants, plants of the genus Soybean, plants of the genus Arachis, plants of the genus Camellia, plants of the genus Vaccinium or It may be a alligator plant, such as soybean (Glycine max), peanut (Arachis hypogaea), alfalfa (Medicago sativa), wild bean (Glycine soja), tea tree (Camellia sinensis), blueberry and avocado (Persea americana) be good too. In addition, the plant to be disease-controlled in the present embodiment may be a leguminous plant, a plant belonging to the genus Soybean or a plant belonging to the genus Groundnut, or a soybean. When the plant to be disease-controlled is a leguminous plant, the bacteria contained in the control agent of the present embodiment also provide a growth-enhancing effect. Therefore, when the plant targeted for disease control is a leguminous plant, the control agent of the present embodiment may be a plant soil-borne disease control and growth promoter.

本明細書において「土壌伝染性病害防除」とは、植物が土壌伝染性病害の病原微生物に感染することを防ぐか、若しくは感染しても病徴が軽減されることを意味する。土壌伝染性病害が防除されているか否かは、当業者に公知の方法により判断することができるが、例えば、植物における病原微生物の有無や増殖率、植物の病徴の有無やその程度、植物の生育（例えば、地上部乾燥重量）等に基づき判断することができる。 As used herein, the term "soil-borne disease control" means to prevent a plant from being infected with a pathogenic microorganism of a soil-borne disease, or to alleviate the disease symptoms even if infected. Whether or not soil infectious diseases have been controlled can be determined by methods known to those skilled in the art. can be determined based on the growth (for example, the dry weight of the above-ground part).

本実施形態の防除剤は組成物であり、形態は、液体、固体、ゲル、ペースト等であってよく、使用状況等に応じて適宜設定することができる。当該形態が液体である場合は、吹き付け、滴下、又は浸漬等の操作によって、シュードモナス属細菌を土又は植物（種子を含む）に付与することができる。当該形態が固体である場合は、土の上又は土の中に当該固体を置くことによって付与してもよいし、植物体の表面に当該固体を接触させることによって付与してもよい。当該形態がゲル又はペーストである場合には、土の上又は土の中に当該ゲル又はペーストを置くことによって付与してもよいし、植物体の表面に当該ゲル又はペーストを付与してもよいし、種子の表面にゲル又はペーストを付与（例えば、コーティング）してもよい。 The control agent of the present embodiment is a composition, and its form may be liquid, solid, gel, paste, or the like, and can be appropriately set according to usage conditions and the like. When the form is liquid, the Pseudomonas bacterium can be imparted to soil or plants (including seeds) by operations such as spraying, dripping, or immersion. When the form is solid, it may be imparted by placing the solid on or in the soil, or by bringing the solid into contact with the surface of the plant body. When the form is a gel or paste, it may be applied by placing the gel or paste on or in the soil, or the gel or paste may be applied to the surface of the plant body. Alternatively, a gel or paste may be applied (eg, coated) to the seed surface.

本実施形態の防除剤に含まれるシュードモナス属細菌の量は、適用する植物の種類、剤形の種類及び付与方法等に応じて適宜設定することができる。防除剤の細菌濃度は、特に限定されるわけではないが、例えば、ＯＤ_６００＝０．２～０．８、０．２～０．４、０．４～０．６、又は０．６～０．８であってよい。２種以上の細菌を用いる場合には、上記細菌濃度はすべての細菌の合計の濃度を意味する。 The amount of Pseudomonas bacterium contained in the control agent of the present embodiment can be appropriately set according to the type of plant to be applied, the type of dosage form, the application method, and the like. The bacterial concentration of the control agent is not particularly limited, but for example, OD ₆₀₀ =0.2-0.8, 0.2-0.4, 0.4-0.6, or 0.6- It may be 0.8. When two or more bacteria are used, the concentration of bacteria means the total concentration of all bacteria.

本実施形態の防除剤は、濃縮物の状態であってもよい。その場合の濃縮倍率は特に限定されず、例えば、２～１０００倍、５～１００倍、又は１０～５０倍とすることができる。本実施形態の防除剤が濃縮物である場合は、水等の溶媒を用いて適宜希釈を行い、その希釈物を土又は植物に付与することができる。本実施形態の防除剤中のシュードモナス属細菌の含有量は、濃縮倍率に応じて設定することができる。 The control agent of this embodiment may be in the form of a concentrate. The concentration ratio in that case is not particularly limited, and can be, for example, 2 to 1000 times, 5 to 100 times, or 10 to 50 times. When the control agent of the present embodiment is a concentrate, it can be appropriately diluted with a solvent such as water, and the diluted product can be applied to soil or plants. The content of Pseudomonas bacteria in the control agent of the present embodiment can be set according to the concentration ratio.

本実施形態の防除剤は、土に混ぜ込む必要はなく、種子又はその周辺に直接滴下するだけで防除効果が得られる。その場合、例えば、防除剤の細菌濃度はＯＤ_６００＝０．２～０．８、０．２～０．４、０．４～０．６、又は０．６～０．８であってよく、これを１種子当たり０．１ｍＬ～２０ｍＬ、０．５ｍＬ～１０ｍＬ、又は１ｍＬ～５ｍＬ滴下することができる。 The control agent of the present embodiment does not need to be mixed with soil, and the control effect can be obtained by simply dropping it directly onto the seeds or their surroundings. In that case, for example, the bacterial concentration of the control agent may be OD ₆₀₀ =0.2-0.8, 0.2-0.4, 0.4-0.6, or 0.6-0.8. , which can be dropped from 0.1 mL to 20 mL, from 0.5 mL to 10 mL, or from 1 mL to 5 mL per seed.

本実施形態の防除剤は、液体、固体、ゲル又はペーストに細菌が含まれたものであってもよい。液体としては、例えば、水、液体培地、緩衝液等が挙げられる。本実施形態の防除剤は、液体に含まれた細菌がカプセル化されたカプセルであってもよい。固体としては、例えば、固体培地等が挙げられる。ゲルとしては、例えば、培地ゲル等が挙げられる。培地としては、例えば、ＴｒｙｐｔｉｃＳｏｙＢｒｏｔｈ（ＴＳＢ）寒天平板培地、ＹＰ培地、キングＢ培地（栄研化学社）等が挙げられる。 The control agent of this embodiment may be liquid, solid, gel or paste containing bacteria. Liquids include, for example, water, liquid media, buffer solutions, and the like. The control agent of this embodiment may be a capsule in which bacteria contained in a liquid are encapsulated. Examples of solids include solid media and the like. Gels include, for example, medium gels and the like. Examples of the medium include Tryptic Soy Broth (TSB) agar plate medium, YP medium, and King B medium (Eiken Chemical Co., Ltd.).

本実施形態の防除剤へのシュードモナス属細菌の添加方法は特に限定されず、そのまま添加してもよい。例えば、当業者に公知の方法でシュードモナス属細菌を培養し、液体培地であれば遠心分離等で回収し、固体培地であれば形成コロニーを白金耳等で回収して、本実施形態の防除剤に添加することができる。或いは、液体中に保存していた状態から公知の方法で凍結乾燥処理を行い、シュードモナス属細菌を固体物として本実施形態の防除剤に添加してもよい。また、本実施形態の防除剤は、細菌を培養した培地（培養液、固体培地）そのものであってもよく、培地から単離／精製した細菌を水等に懸濁させた懸濁液であってもよい。具体例としては、シュードモナス属細菌を培養した培養液における沈殿を回収し、水に懸濁したものを本実施形態の防除剤としてもよい。 The method of adding the Pseudomonas bacterium to the control agent of the present embodiment is not particularly limited, and the Pseudomonas bacterium may be added as it is. For example, Pseudomonas bacterium is cultured by a method known to those skilled in the art, and if it is a liquid medium, it is collected by centrifugation or the like, and if it is a solid medium, the formed colonies are collected with a platinum loop or the like, and the control agent of the present embodiment is collected. can be added to Alternatively, the Pseudomonas bacterium may be added to the control agent of the present embodiment as a solid by subjecting it to a freeze-drying treatment by a known method from the state of being stored in a liquid. In addition, the control agent of the present embodiment may be a medium (culture solution, solid medium) in which bacteria are cultured, or a suspension in which bacteria isolated/purified from a medium are suspended in water or the like. may As a specific example, a precipitate in a culture solution in which Pseudomonas bacteria are cultured may be recovered and suspended in water to be used as the control agent of the present embodiment.

また、本実施形態の防除剤は、賦形剤、増粘剤、結合剤、安定化剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、着色剤、着香剤等の添加剤を含んでいてもよい。各種の添加剤は、特に限定されないが、生物農薬の技術分野において公知の材料を用いることができ、その配合量は、当業者の公知技術に基づいて適宜調整することができる。 In addition, the control agent of the present embodiment may contain additives such as excipients, thickeners, binders, stabilizers, preservatives, pH adjusters, colorants and flavoring agents. Various additives are not particularly limited, but materials known in the technical field of biopesticides can be used, and the amount to be added can be appropriately adjusted based on the known techniques of those skilled in the art.

本明細書において、「配列同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのＤＮＡ塩基配列をアラインさせた場合の最適なアラインメントにおける、オーバーラップする全ＤＮＡ塩基配列に対する同一ＤＮＡ塩基の割合（％）を意味する。アラインメントの作成には、例えば、ＭｕｌｔｉｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔ（ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）を用いることができ、配列同一性の算出には、例えば、ＰｅｒｃｅｎｔＩｄｅｎｔｉｔｙＭａｔｒｉｘ（Ｃｌｕｓｔａｌ２．１）を用いることができる。 As used herein, the term "sequence identity" refers to identity with respect to the entire overlapping DNA base sequence in the optimal alignment when two DNA base sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art. Means the ratio (%) of DNA bases. For creating alignments, for example, Multiple Sequence Alignment (Clustal Omega: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) can be used, and for calculating sequence identity, for example, A Percent Identity Matrix (Clustal 2.1) can be used.

［植物の土壌伝染性病害防除方法］
本発明の一実施形態における植物の土壌伝染性病害防除方法は、配列番号１に示す塩基配列に対して９６％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌、又はこれらの組み合わせを土又は植物に付与する工程を含む。 [Method for controlling soil-borne diseases of plants]
A method for controlling soil-borne diseases of plants in one embodiment of the present invention includes a bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 96% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2. A step of imparting bacteria having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having 98% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in 2, or a combination thereof to soil or plants.

本実施形態の防除方法において、土又は植物に付与するシュードモナス属細菌が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の、配列番号１に示す塩基配列に対する配列相同性は、９６％以上、９６．５％、９７％以上、９７．５％、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上又は１００％であってもよい。 In the control method of the present embodiment, the sequence homology of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene possessed by Pseudomonas bacteria imparted to soil or plants to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 96% or more, 96.5%, 97%. % or more, 97.5% or more, 98% or more, 98.5% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 100%.

本実施形態の防除方法において、土又は植物に付与するシュードモナス属細菌が有する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の、配列番号２に示す塩基配列に対する配列相同性は、９７％以上、９７．５％、９８％以上、９８．５％以上、９９％以上、９９．５％以上又は１００％であってもよい。 In the control method of the present embodiment, the sequence homology of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene possessed by Pseudomonas bacteria imparted to soil or plants to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 97% or more, 97.5%, 98%. % or more, 98.5% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 100%.

本実施形態の防除方法において用いられるシュードモナス属細菌、防除対象となる土壌伝染性病害、病害防除される対象となる植物等については、上述したとおりである。 The Pseudomonas bacterium, the soil-borne disease to be controlled, the plant to be controlled, and the like used in the control method of the present embodiment are as described above.

上述したシュードモナス属細菌は土又は植物に対して付与されるが、その付与に関する方法及び手段は、本実施形態の防除方法の効果が得られる限りにおいて特に限定されない。 The Pseudomonas bacterium described above is applied to soil or plants, but the method and means for the application are not particularly limited as long as the effect of the control method of the present embodiment can be obtained.

シュードモナス属細菌を付与する際の形態は、液体であってもよいし、固体であってもよい。当該形態が液体である場合は、吹き付け、滴下、又は浸漬等の操作によって、シュードモナス属細菌を土又は植物に付与することができる。例えば、シュードモナス属細菌を懸濁した水（懸濁液）を準備して、その準備した懸濁液を土又は植物に接触させることにより付与操作を行うことができる。土に付与する場合、例えば、植物の種を播種する土又は植物が植えられている土にシュードモナス属細菌を含む液体を混ぜ込んでもよい。浸漬操作の場合には、容器を別途準備して、当該液体が入った容器の中に土又は植物が入った穴あき容器を入れて作業を行ってもよい。シュードモナス属細菌の形態が固体である場合は、土の上又は土の中に当該固体を置くことによって付与してもよいし、或いは植物体の表面に当該固体を接触させることによって付与してもよい。 The form in which the Pseudomonas bacterium is applied may be either liquid or solid. When the form is a liquid, the Pseudomonas bacterium can be applied to soil or plants by operations such as spraying, dripping, or immersion. For example, the application operation can be performed by preparing water (suspension) in which Pseudomonas bacteria are suspended and bringing the prepared suspension into contact with soil or plants. When applied to soil, for example, the liquid containing the Pseudomonas bacterium may be mixed into the soil in which plant seeds are sown or in which plants are planted. In the case of the immersion operation, a container may be separately prepared and a perforated container containing soil or plants may be placed in the container containing the liquid. When the Pseudomonas bacterium is in a solid form, it may be applied by placing the solid on or in the soil, or by contacting the solid with the surface of the plant body. good.

本明細書において「土」とは、植物が生育可能な土壌を意味する。本実施形態の防除方法で用いられる土は、例えば、培土、培養土、育苗土、又は育苗培土等の名称で示されるものであってよい。また、何らの処理も行われていない山野の土をそのまま用いてもよい。土の粒度も特に限定されず、植物が生育可能である限りいかなる土であってもよい。本発明では、バーミキュライト等の人工の土壌改良用の土を用いてもよいが、種々の土の中でも育苗培土を用いることが特に好ましい。育苗培土は、栽培のベースとなる肥料を含む土であり、床土に分類される。 As used herein, "soil" means soil in which plants can grow. The soil used in the control method of the present embodiment may be indicated by names such as culture soil, culture soil, seedling soil, or seedling culture soil, for example. In addition, Yamano soil that has not undergone any treatment may be used as it is. The particle size of the soil is also not particularly limited, and any soil may be used as long as the plant can grow. In the present invention, artificial soil for improving soil such as vermiculite may be used, but among various soils, it is particularly preferable to use nursery soil. Raising seedling soil is soil containing fertilizer that serves as a base for cultivation, and is classified as bed soil.

本実施形態の防除方法において、植物を含む土とは、植物が土の中、或いは土の上に存在する状態の土であることを意味する。植物が土の中に存在する場合、当該植物はその全体が土に埋入されていてもよく、或いは植物の一部が土に埋入され、残りの部分が土の外に出ている状態であってもよい。本実施形態の防除方法において付与対象とされる土は、植物の近辺の土（例えば、植物から１０ｃｍ以内の範囲にある土）であることが好ましい。 In the control method of the present embodiment, soil containing plants means soil in which plants are present in or on the soil. When the plant exists in the soil, the plant may be entirely embedded in the soil, or the plant may be partly embedded in the soil and the rest may be outside the soil. may be The soil to be applied in the control method of the present embodiment is preferably soil in the vicinity of the plant (for example, soil within 10 cm from the plant).

病害防除される対象となる植物の状態は特に限定されず、種子若しくは幼苗、又は既に植物が生育した状態であってよいが、好ましくは種子又は幼苗であり、より好ましくは種子である。種子や幼苗といった生育初期の段階であることにより、土壌伝染性病害の罹りはじめを抑制することができ、より効果的に植物における土壌伝染性病害の防除を行うことができる。また、植物の組織が幼若であることにより、シュードモナス属細菌が植物体上に定着しやすくなり、その点でも土壌伝染性病害の防除をより効果的に行うことができる。なお、既に植物が生育した状態である場合は、植物の根、葉、茎、枝、又は幹等のいずれの部位に対してもシュードモナス属細菌の付与を行うことができる。 The state of the plant to be disease-controlled is not particularly limited, and may be a seed, a young seedling, or an already grown plant, preferably a seed or a young seedling, more preferably a seed. By being in the early stage of growth such as seeds and young seedlings, it is possible to suppress the beginning of soil infectious diseases, and to more effectively control soil infectious diseases in plants. In addition, since the plant tissue is immature, Pseudomonas bacteria are likely to settle on the plant body, and in this respect, soil-borne diseases can be controlled more effectively. When the plant is already grown, Pseudomonas bacterium can be applied to any part of the plant, such as the root, leaf, stem, branch, trunk, or the like.

土又は植物に付与するシュードモナス属細菌の量は、特に限定されず、付与形態や対象とする植物の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、土に対してシュードモナス属細菌を付与する場合は、例えば、１ｃｍ^３の土に対して１回あたり１０^４～１０^２０ＣＦＵ、又は１０^６～１０^１０ＣＦＵの細菌数で付与することができる。シュードモナス属細菌の付与量は、これらを含む製剤中の濃度と当該製剤の付与量によって調整することができる。また、例えば、植物に対してシュードモナス属細菌を付与する場合は、植物１個体に対して１回あたり１０^４～１０^２０ＣＦＵ、好ましくは１０^６～１０^１０ＣＦＵの細菌数で付与することができる。シュードモナス属細菌の付与量は、これらを含む製剤中の濃度と当該製剤の付与量によって調整することができる。本実施形態の防除方法は、シュードモナス属細菌を含む製剤を種子又はその周辺に直接滴下するだけでも防除効果が得られることを特徴とする。したがって、本実施形態の防除方法において、シュードモナス属細菌を土又は植物に付与する工程は、当該細菌を含む液体を種子に添加することを含むものであってよい。その場合、例えば、１種子に対して１回あたり２×１０^８～４×１０^８、４×１０^８～８×１０^８、又は８×１０^８～２×１０^９の細菌数で添加することができる。例えば、当該細菌を含む液体のＯＤ_６００が０．３～０．５になるように液体を準備し、当該液体０．５ｍＬ～３ｍＬを種子に添加してもよい。当該細菌を含む液体を種子に添加することは、例えば、当該細菌を含む液体を種子上に滴下することであってもよく、当該細菌を含む液体により種子をコーティングすることであってもよい。当該細菌を含む液体により種子をコーティングする場合、例えば、１種子に対して１回あたり２×１０^８～４×１０^８、４×１０^８～８×１０^８、又は８×１０^８～２×１０^９の細菌数で付与することができる。当該細菌を含む液体の種子若しくはその周辺への直接滴下、又は当該細菌を含む液体による種子コーティングを含む、当該細菌を含む液体の種子への添加は、少量のシュードモナス属細菌により防除効果を得られるため、大量のシュードモナス属細菌を必要とする土に混ぜ込む場合と比較して、準備が簡易であり、コスト面でも有利である。 The amount of Pseudomonas bacterium to be applied to soil or plants is not particularly limited, and can be appropriately set according to the form of application, the type of target plant, and the like. For example, when Pseudomonas bacteria are applied to soil, for example, 10 ⁴ to 10 ²⁰ CFU or 10 ⁶ to 10 ¹⁰ CFU bacteria can be applied per 1 cm ³ of soil. . The amount of Pseudomonas bacterium to be applied can be adjusted by the concentration in the preparation containing these and the amount of the preparation to be applied. In addition, for example, when Pseudomonas bacteria are applied to plants, the number of bacteria per individual plant can be 10 ⁴ to 10 ²⁰ CFU, preferably 10 ⁶ to 10 ¹⁰ CFU. . The amount of Pseudomonas bacterium to be applied can be adjusted by the concentration in the preparation containing these and the amount of the preparation to be applied. The control method of the present embodiment is characterized in that a control effect can be obtained by simply dropping a preparation containing Pseudomonas bacteria directly onto seeds or their surroundings. Therefore, in the control method of this embodiment, the step of imparting Pseudomonas bacteria to soil or plants may include adding a liquid containing the bacteria to seeds. In that case, for example, 2×10 ⁸ to 4×10 ⁸ , 4×10 ⁸ to 8×10 ⁸ , or 8×10 ⁸ to 2×10 ⁹ bacteria should be added per seed. can be done. For example, a liquid containing the bacteria may be prepared so that the OD ₆₀₀ of the liquid is 0.3 to 0.5, and 0.5 mL to 3 mL of the liquid may be added to the seeds. Adding the liquid containing the bacterium to the seed may be, for example, dropping the liquid containing the bacterium onto the seed, or coating the seed with the liquid containing the bacterium. When seeds are coated with a liquid containing the bacteria, for example, 2×10 ⁸ to 4×10 ⁸ , 4×10 ⁸ to 8×10 ⁸ , or 8×10 ⁸ to 2× per seed per time. A bacterial count of 10 ⁹ can be applied. Addition of a liquid containing the bacterium to the seeds, including direct dropping of the liquid containing the bacterium on the seeds or their surroundings, or coating of the seeds with the liquid containing the bacterium, can provide a control effect with a small amount of Pseudomonas spp. Therefore, the preparation is simple and advantageous in terms of cost as compared with the case of mixing a large amount of Pseudomonas bacteria into soil.

シュードモナス属細菌を付与する時期は、植物の播種前、播種時、及び播種後（育苗期、定植期等を含む）のいずれであってもよく、特に限定されないが、好ましくは植物の播種時又は播種直後である。 The timing of imparting the Pseudomonas bacterium may be before sowing of the plant, at the time of sowing, or after sowing (including the seedling raising period, the fixed planting period, etc.), and is not particularly limited, but preferably at the time of sowing the plant or Immediately after seeding.

植物の播種前にシュードモナス属細菌を付与する場合、その具体的な時期は特に限定されないが、例えば、播種前７日以内、播種前６日以内、播種前５日以内、播種前４日以内、播種前３日以内、播種前２日以内、播種前１日以内、播種前１２時間以内、播種前６時間以内、播種前３時間以内、播種前１時間以内、播種前３０分以内、播種前１０分以内、播種前５分以内、播種前１分以内、又は播種前３０秒以内であってよい。 When the Pseudomonas bacterium is applied before sowing the plant, the specific time is not particularly limited, but for example, within 7 days before sowing, within 6 days before sowing, within 5 days before sowing, within 4 days before sowing, Within 3 days before seeding, Within 2 days before seeding, Within 1 day before seeding, Within 12 hours before seeding, Within 6 hours before seeding, Within 3 hours before seeding, Within 1 hour before seeding, Within 30 minutes before seeding, Before seeding It may be within 10 minutes, within 5 minutes before seeding, within 1 minute before seeding, or within 30 seconds before seeding.

植物の播種時にシュードモナス属細菌を付与する場合、その具体的な時期は特に限定されないが、例えば、シュードモナス属細菌を予め接触させた種子を土にまいてもよい。 When the Pseudomonas bacterium is applied at the time of seeding of the plant, the specific timing is not particularly limited, but for example, the seeds pre-contacted with the Pseudomonas bacterium may be sown in the soil.

植物の播種後に付与する場合、その付与時期は、例えば、播種後７日以内、播種後６日以内、播種後５日以内、又は播種後４日以内としてもよく、或いは、播種後２日以内、播種後１日以内、播種後１２時間以内、播種後６時間以内、播種後３時間以内、播種後１時間以内、播種後３０分以内、播種後１０分以内、播種後５分以内、播種後１分以内、又は播種後３０秒以内としてもよい。本明細書において、播種直後とは、播種後１０分以内をいう。本実施形態の防除方法では、植物の生育初期の段階でシュードモナス属細菌と植物とが接触することが好ましいため、そのような観点から上記の付与時期と植物播種時期との間の期間は短い方が好ましく、例えば、少なくとも播種前後３日以内、或いは少なくとも播種前後１日以内に付与を行うのが好ましい。本実施形態の植物の播種後に付与する場合、植物が土壌伝染性病害に感染する前に付与することが好ましいが、植物が土壌伝染性病害に感染した後に付与してもよい。植物が土壌伝染性病害により致命的なダメージを受ける前であれば防除効果が期待できる。 When the plant is applied after sowing, the time of application may be, for example, within 7 days after sowing, within 6 days after sowing, within 5 days after sowing, or within 4 days after sowing, or within 2 days after sowing. , Within 1 day after seeding, Within 12 hours after seeding, Within 6 hours after seeding, Within 3 hours after seeding, Within 1 hour after seeding, Within 30 minutes after seeding, Within 10 minutes after seeding, Within 5 minutes after seeding, Seeding It may be within 1 minute after seeding or within 30 seconds after seeding. As used herein, "immediately after seeding" means within 10 minutes after seeding. In the control method of the present embodiment, it is preferable that the Pseudomonas bacterium and the plant come into contact with each other at an early stage of plant growth. From this point of view, the period between the time of application and the time of sowing the plant should be short. For example, it is preferable to apply within at least 3 days before and after seeding, or at least within 1 day before and after seeding. When the plant of the present embodiment is applied after sowing, it is preferably applied before the plant is infected with a soil-borne disease, but may be applied after the plant is infected with a soil-borne disease. A control effect can be expected if the plants are not fatally damaged by soil-borne diseases.

配列番号１に示す塩基配列に対して高い配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌と、配列番号２に示す塩基配列に対して高い配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌の組み合わせを付与する場合、いずれの細菌を先に付与してもよい。すなわち、配列番号１に示す塩基配列に対して高い配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌を先に付与し、次いで配列番号２に示す塩基配列に対して高い配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌を付与してもよいし、或いは配列番号２に示す塩基配列に対して高い配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌を先に付与し、次いで配列番号１に示す塩基配列に対して高い配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌を付与してもよく、２種の細菌を同時に付与してもよい。２種の細菌を同時に付与する場合、例えば、２種の細菌を含む組成物（例えば、上述した防除剤）を付与してもよい。 A bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence with high sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a 16S rRNA consisting of a nucleotide sequence having high sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. When applying a combination of bacteria with genes, either bacterium may be applied first. That is, a bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having high sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is first provided, and then high sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. Alternatively, a bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a high sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is first provided. Then, a bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a high sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 may be imparted, or two kinds of bacteria may be imparted at the same time. When applying two types of bacteria at the same time, for example, a composition containing two types of bacteria (eg, a control agent as described above) may be applied.

本実施形態の方法における具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。 The specific aspects and the like in the method of the present embodiment can be applied without limitation to the specific aspects and the like described above.

［植物の土壌伝染性病害防除用キット］
本発明は、一実施形態として、配列番号１に示す塩基配列に対して９６％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせを含む、植物の土壌伝染性病害防除用キットも提供する。 [Kit for controlling soil-borne diseases of plants]
As one embodiment of the present invention, a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 96% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, against the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 Also provided is a kit for controlling soil-borne diseases of plants, containing a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 98% or more with a bacterium belonging to the genus Pseudomonas, or a combination thereof.

本実施形態のキットにおいて用いられるシュードモナス属細菌、防除対象となる土壌伝染性病害、病害防除される対象となる植物は、上述したとおりである。 The Pseudomonas bacterium, the soil-borne disease to be controlled, and the plant to be controlled are as described above.

本実施形態のキットにおけるシュードモナス属細菌は調製物であってもよく、その形態は特に限定されない。本実施形態のキットが、配列番号１に示す塩基配列に対して高い配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌と、配列番号２に示す塩基配列に対して高い配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌の両方を含む場合、双方が同一の製剤に含まれていてもよいし、別個の製剤にそれぞれ分けて含まれていてもよい。別個の製剤に分けられている場合、当該製剤は異なる種類の剤形であってもよいし、同一種類の剤形であってもよい。 The Pseudomonas bacterium in the kit of the present embodiment may be a preparation, and its form is not particularly limited. The kit of this embodiment comprises a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a high sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and a Pseudomonas bacterium having a high sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. When both Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a unique nucleotide sequence are included, both may be contained in the same formulation, or may be separately contained in separate formulations. When separated into separate formulations, the formulations may be in different types of dosage forms or may be in the same type of dosage form.

本実施形態のキットにおいて用いられる製剤の形態は特に限定されず、液体、固体、ゲル、ペースト等のいずれの形態であってもよい。また、製剤中のシュードモナス属細菌の含有量も特に限定されず、上述した本実施形態の防除剤又は防除方法に準じて任意に設定することができる。 The form of the formulation used in the kit of the present embodiment is not particularly limited, and may be in any form such as liquid, solid, gel, paste, and the like. In addition, the content of Pseudomonas bacteria in the preparation is not particularly limited, and can be arbitrarily set according to the control agent or control method of the present embodiment described above.

本実施形態のキットにおいて用いられる製剤は、シングルユースとして一回当たりの使用量が個別に包装されていてもよいし、複数回（例えば、２回、３回、４回、５回、１０回、又はそれ以上）の使用量を含んだ形態で包装されていてもよい。使用される容器も特に限定されず、製剤の使用量等に応じて適宜設定することができる。 The formulation used in the kit of the present embodiment may be individually packaged for single use, or may be used multiple times (e.g., 2, 3, 4, 5, 10 times). , or more). The container to be used is also not particularly limited, and can be appropriately set according to the amount of the formulation used.

本実施形態のキットは、シュードモナス属細菌の使用に関する取扱説明書及び／又は本キットを用いた防除方法に関する取扱説明書を含んでいてもよい。 The kit of the present embodiment may contain an instruction manual on the use of Pseudomonas bacteria and/or an instruction manual on the control method using the kit.

本実施形態のキットは、植物の土壌伝染性病害防除用として用いられる。対象とする植物や土壌伝染性病害は特に限定されるものではなく、その具体例としては上記の内容と同様である。本実施形態のキットは、生物農薬又は微生物農薬としても使用することができる。 The kit of the present embodiment is used for controlling soil-borne diseases of plants. Target plants and soil-borne diseases are not particularly limited, and specific examples thereof are the same as those described above. The kit of this embodiment can also be used as a biopesticide or microbial pesticide.

上述した本実施形態は、土壌伝染性病害防除に使用するための、配列番号１に示す塩基配列に対して９６％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせと捉えることもできる。また、本実施形態は、土壌伝染性病害防除剤の製造における、配列番号１に示す塩基配列に対して９６％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせの使用と捉えることもできる。 The above-described present embodiment is a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 96% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, for use in soil infectious disease control. It can also be regarded as a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having 98% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a combination thereof. In addition, this embodiment provides a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 96% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the production of a soil infectious disease control agent. It can also be regarded as the use of Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having 98% or more sequence homology with the nucleotide sequence shown in No. 2, or a combination thereof.

［マメ科植物の生育向上剤及び生育向上方法］
本発明は、一実施形態として、配列番号１に示す塩基配列に対して９６％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせを含む、マメ科植物の生育向上剤も提供する。 [Growth improver and method for improving growth of leguminous plants]
As one embodiment of the present invention, a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 96% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, for the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 The present invention also provides a growth enhancer for leguminous plants containing Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 98% or more, or a combination thereof.

また、本発明は、一実施形態として、配列番号１に示す塩基配列に対して９６％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせを土又は植物に付与する工程を含む、マメ科植物の生育向上方法も提供する。 Further, as one embodiment of the present invention, a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 96% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 Also provided is a method for improving the growth of leguminous plants, comprising the step of imparting Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having 98% or more sequence homology with Pseudomonas bacterium, or a combination thereof to soil or plants. .

マメ科植物の生育が向上しているか否かについては、当業者に公知の方法により判断することができるが、例えば、上記特定のシュードモナス属細菌による処理を受けたマメ科植物における地上部乾燥重量が、上記特定のシュードモナス属細菌による処理を受けていないマメ科植物と比較して増加してれば、マメ科植物の生育が向上していると判断することができる。 Whether or not the growth of leguminous plants is improved can be determined by methods known to those skilled in the art. is increased compared to leguminous plants that have not been treated with the specific Pseudomonas bacterium, it can be determined that the growth of the leguminous plant is improved.

上述した本実施形態は、マメ科植物の生育向上に使用するための、配列番号１に示す塩基配列に対して９６％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせと捉えることもできる。また、本実施形態は、マメ科植物の生育向上剤の製造における、配列番号１に示す塩基配列に対して９６％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、配列番号２に示す塩基配列に対して９８％以上の配列相同性を有する塩基配列からなる１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するシュードモナス属細菌、又はこれらの組み合わせの使用と捉えることもできる。 The present embodiment described above is a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 96% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, for use in improving the growth of leguminous plants. , a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having 98% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a combination thereof. In addition, this embodiment provides a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a sequence homology of 96% or more to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, in the production of a growth enhancer for leguminous plants. It can also be regarded as the use of Pseudomonas bacteria having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having 98% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, or a combination thereof.

マメ科植物、シュードモナス属細菌については、上述したとおりである。本実施形態の生育向上剤及び生育向上方法における具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。例えば、生育向上剤の具体的な態様等は、［植物の土壌伝染性病害防除剤］にて上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。具体例としては、生育向上剤の形態は、［植物の土壌伝染性病害防除剤］にて上述した防除剤の形態を適用することができる。また、生育向上方法の具体的な態様等は、［植物の土壌伝染性病害防除方法］にて上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。具体例としては、「シュードモナス属細菌を土又は植物に付与する工程」は、［植物の土壌伝染性病害防除方法］にて上述した「シュードモナス属細菌を土又は植物に付与する工程」の態様を適用することができる。 Leguminous plants and Pseudomonas bacteria are as described above. The specific aspects and the like in the growth enhancer and the growth enhancement method of the present embodiment can be applied without limitation to the above-described specific aspects and the like. For example, as the specific aspects of the growth enhancer, the specific aspects described above in [Agent for controlling plant soil-borne disease] can be applied without limitation. As a specific example, as the form of the growth enhancer, the form of the control agent described above in [Agent for controlling plant soil-borne disease] can be applied. In addition, as specific aspects of the method for improving growth, the specific aspects described above in [Method for controlling soil-borne diseases of plants] can be applied without limitation. As a specific example, the "step of imparting Pseudomonas bacteria to soil or plants" is an aspect of the "step of imparting Pseudomonas bacteria to soil or plants" described above in [Method for controlling soil-borne disease of plants]. can be applied.

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

［試験例にて使用する細菌及び糸状菌の準備］
試験例にて病害防除効果を検討する細菌（シュードモナス属細菌）及び病原微生物として使用する糸状菌（黒根腐病菌）は、以下のように培養した。 [Preparation of bacteria and filamentous fungi used in test examples]
Bacteria (bacteria belonging to the genus Pseudomonas) whose disease-controlling effects are to be examined in Test Examples and filamentous fungi (bacteria of the genus Pseudomonas) used as pathogenic microorganisms were cultured as follows.

シュードモナス属細菌（ＯＦＴ２株及びＯＦＴ５株）をそれぞれＴｒｙｐｔｉｃＳｏｙＢｒｏｔｈ（ＴＳＢ）液体培地に植菌して２８℃で一晩振盪培養した。遠心分離によって回収したシュードモナス属細菌を滅菌水に懸濁した（ＯＤ_６００＝０．４）。 Pseudomonas bacteria (OFT2 strain and OFT5 strain) were each inoculated into Tryptic Soy Broth (TSB) liquid medium and cultured overnight at 28°C with shaking. Pseudomonas bacteria collected by centrifugation were suspended in sterile water (OD ₆₀₀ =0.4).

黒根腐病菌（カロネクトリア・イリシコーラＵＨ２－１株）をＰｏｔａｔｏＤｅｘｔｒｏｓｅＡｇａｒ（ＰＤＡ）平板培地に移植し、２５℃で数日間培養した。その後、接種用培地（こむぎ麸：バーミキュライト：水＝１：１：３）に移植し、２５℃で２週間培養し、ダイズ幼苗への接種源として用いた。 Black root rot fungus (Caronectria irisicola UH2-1 strain) was transferred to a Potato Dextrose Agar (PDA) plate medium and cultured at 25° C. for several days. After that, it was transplanted to an inoculation medium (wheat flour:vermiculite:water=1:1:3), cultured at 25° C. for 2 weeks, and used as an inoculum for soybean seedlings.

［試験例１ダイズ黒根腐病の発病に対する効果］
黒根腐病菌（カロネクトリア・イリシコーラＵＨ２－１株、１％ｗ／ｖ）を混和した汚染土壌にダイズ（エンレイ）種子を播種した。播種時にダイズ種子上に、無菌培養液（Ｍｏｃｋ）を１種子当たり１ｍＬ、又はシュードモナス属細菌ＯＦＴ－２株若しくはＯＦＴ－５株（ＯＤ_６００＝０．４）を１種子当たり１ｍＬ滴下した。 [Test Example 1 Effect on the onset of soybean black root rot]
Soybean (enrei) seeds were sown in contaminated soil mixed with black root rot fungus (Caronectria irisicola UH2-1 strain, 1% w/v). At the time of seeding, 1 mL of sterile culture solution (Mock) or 1 mL of Pseudomonas bacterium OFT-2 or OFT-5 (OD ₆₀₀ =0.4) was dropped per seed on soybean seeds.

温室内（２５℃）で２週間栽培した後のダイズ植物個体を比較観察した写真を図１に示す。図１は、２週間栽培後の図中、「Ｕｎ－ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ」は黒根腐病菌を含まない土壌で栽培した無処理の個体、「Ｍｏｃｋ」は無菌培養液を接種した個体、「ＯＦＴ２」はＯＦＴ－２株を接種した個体、「ＯＦＴ－５」はＯＦＴ－５株を接種した個体をそれぞれ示す。なお、「Ｍｏｃｋ」、「ＯＦＴ２」及び「ＯＦＴ－５」は、黒根腐病菌を混和した土壌で栽培している。 FIG. 1 shows a photograph of comparative observation of soybean plant individuals after two weeks of cultivation in a greenhouse (25° C.). In FIG. 1, after 2 weeks of cultivation, “Un-inoculated” is an untreated individual cultivated in soil that does not contain black root rot fungus, “Mock” is an individual inoculated with a sterile culture medium, and “OFT2” is OFT. Individuals inoculated with the -2 strain and "OFT-5" indicate individuals inoculated with the OFT-5 strain, respectively. "Mock", "OFT2" and "OFT-5" are cultivated in soil mixed with black root rot fungus.

また、温室内（２５℃）で２週間栽培した後の「Ｍｏｃｋ」、「ＯＦＴ２」及び「ＯＦＴ－５」のそれぞれの個体からＤＮＡを抽出し、定量ＰＣＲ法により植物体ゲノムに対する病原菌ゲノムの相対値（Ｃｉ－ｒＤＮＡ／Ｇｍ－Ａｃｔ１）を算出して病原菌の増殖度を比較した（Ｔｕｋｅｙ’ｓＨＳＤｔｅｓｔ，Ｐ＜０．０５）。図２は、その結果を示すグラフである。定量ＰＣＲ法に用いたプライマーは次の通りである。黒根腐病菌ｒＤＮＡ：ＴＣＣＡＴＴＧＣＣＴＣＴＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＣ（配列番号４）／ＧＣＧＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＡＣＣＣＧ（配列番号５）；ダイズＡＣＴＩＮ１：ＧＡＧＣＴＡＴＧＡＡＴＴＧＣＣＴＧＡＴＧＧ（配列番号６）／ＣＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＡＧＣ（配列番号７）。 In addition, DNA was extracted from each individual of "Mock", "OFT2" and "OFT-5" after 2 weeks of cultivation in a greenhouse (25 ° C), and the relative pathogen genome to the plant genome was measured by quantitative PCR. Values (Ci-rDNA/Gm-Act1) were calculated to compare pathogen growth rates (Tukey's HSD test, P<0.05). FIG. 2 is a graph showing the results. The primers used for the quantitative PCR method are as follows. Black root rot fungus rDNA: TCCATTGCCTCTATTTCCTGC (SEQ ID NO: 4)/GCGTAAAGATTTTTCCAACCCG (SEQ ID NO: 5); Soybean ACTIN1: GAGCTATGAATTGCCTGATGG (SEQ ID NO: 6)/CGTTTCATGAATTCCAGTAGC (SEQ ID NO: 7).

これにより、「Ｍｏｃｋ」個体と比較して、「ＯＦＴ２」及び「ＯＦＴ－５」個体は、幼苗の生育が改善し、それに相応して病原菌の増殖も抑制され、黒根腐病の発病が著しく低減されたことが分かった。 As a result, compared to the "Mock" individual, the "OFT2" and "OFT-5" individuals have improved growth of seedlings, correspondingly suppresses the growth of pathogenic bacteria, and significantly reduces the onset of black root rot. I found out it was done.

［試験例２ダイズに対する生育促進効果］
滅菌土壌にダイズ（エンレイ）種子を播種し、種子上に無菌培養液（Ｍｏｃｋ）を１種子当たり１ｍＬ、又はシュードモナス属細菌ＯＦＴ－２株若しくはＯＦＴ－５株を（ＯＤ_６００＝０．４）１種子当たり１ｍＬ滴下した。 [Test Example 2 Growth promoting effect on soybeans]
Soybean (enrei) seeds are sown in sterilized soil, and 1 mL of sterile culture medium (Mock) is added per seed, or Pseudomonas bacterium OFT-2 strain or OFT-5 strain (OD ₆₀₀ = 0.4) 1 1 mL was added dropwise per seed.

温室内（２５℃）で４週間栽培した後のダイズ植物個体から地上部を地際から刈り取り、７０℃の乾燥機内で３日間乾燥させた後、常温になるまで放冷してから秤量し、地上部乾重（ｇ／個体）を算出して比較した（Ｔｕｋｅｙ’ｓＨＳＤｔｅｓｔ，Ｐ＜０．０５）。 After cultivating for 4 weeks in a greenhouse (25°C), the aerial part was cut from the ground level, dried in a dryer at 70°C for 3 days, allowed to cool to room temperature, and then weighed. Dry weight above ground (g/individual) was calculated and compared (Tukey's HSD test, P<0.05).

結果を図３に示す。「Ｍｏｃｋ」は無菌培養液を接種した個体、「ＯＦＴ２」はＯＦＴ－２株を接種した個体、「ＯＦＴ－５」はＯＦＴ－５株を接種した個体をそれぞれ示す。ＯＦＴ－２株及びＯＦＴ－５株の接種により、ダイズ植物の地上部乾燥重量が増加したことから、これらの細菌によるダイズ植物への生育促進効果が認められた。 The results are shown in FIG. "Mock" indicates individuals inoculated with sterile culture medium, "OFT2" indicates individuals inoculated with OFT-2 strain, and "OFT-5" indicates individuals inoculated with OFT-5 strain. Inoculation of the OFT-2 and OFT-5 strains increased the dry weight of the above-ground parts of the soybean plants, confirming that these bacteria have the effect of promoting the growth of the soybean plants.

［試験例３培地上の黒根腐病菌の生育に対する増殖抑制効果］
シュードモナス属細菌が生成する水溶性物質による黒根腐病菌の生育に対する増殖抑制効果を以下のように試験した。 [Test Example 3 Growth inhibitory effect on growth of black root rot fungus on medium]
The effect of inhibiting the growth of black root rot fungi by water-soluble substances produced by Pseudomonas bacteria was tested as follows.

シュードモナス属細菌ＯＦＴ－２株若しくはＯＦＴ－５株を培養したＴＳＢ寒天培地、又は無菌培地（Ｍｏｃｋ）に等量の滅菌水を加えて破砕し、３，０００ｒｐｍで２０分遠心分離して水溶性上清画分を調製した。水溶性画分はフィルター（０．２２μｍ）除菌後に滅菌濾紙（９０ｍｍ）に染み込ませ、その濾紙上に黒根腐病菌（直径５ｍｍ）をスポット接種して２５℃で７日間培養し、菌糸コロニーの直径を定規により測定した。ＯＦＴ－２又はＯＦＴ－５／Ｍｏｃｋ×１００により黒根腐病菌の増殖度を算出し、黒根腐病菌の相対増殖度はＭｏｃｋに対する相対値で表した（Ｔｕｋｅｙ’ｓＨＳＤｔｅｓｔ，Ｐ＜０．０５）。 Pseudomonas spp. OFT-2 or OFT-5 strain was cultured on TSB agar medium or aseptic medium (Mock), added with an equal amount of sterilized water, crushed, centrifuged at 3,000 rpm for 20 minutes, and water-soluble. A clear fraction was prepared. The water-soluble fraction was filtered (0.22 μm) and sterilized, and then impregnated with sterile filter paper (90 mm). The diameter was measured with a ruler. The growth rate of the black root rot fungus was calculated by OFT-2 or OFT-5/Mock×100, and the relative growth rate of the black root rot fungus was expressed as a relative value to the mock (Tukey's HSD test, P<0.05). .

７日間培養した後の濾紙上の黒根腐病菌の菌糸コロニーの写真を図４に示す。また、黒根腐病菌の相対増殖度を比較したグラフを図５に示す。ＯＦＴ－２株及びＯＦＴ－５株が生成する水溶性画分に黒根腐病菌の増殖抑制効果があることが分かった。 FIG. 4 shows a photograph of mycelial colonies of black root rot fungus on filter paper after culturing for 7 days. Moreover, the graph which compared the relative growth degree of a black root rot fungus is shown in FIG. It was found that the water-soluble fractions produced by the OFT-2 and OFT-5 strains have the effect of inhibiting the growth of the black root rot fungus.

また、シュードモナス属細菌が生成する揮発性化合物の効果は以下のように行なった。シュードモナス属細菌ＯＦＴ－２株、ＯＦＴ－５株若しくはＲＨ７株を培養した寒天培地プレート又は無菌の寒天培地プレート（Ｍｏｃｋ）と、黒根腐病菌（カロネクトリア・イリシコーラＵＨ２－１株）（直径５ｍｍ）を接種した寒天培地プレートとを準備した。ＲＨ７株のｒＲＮＡ遺伝子配列は配列番号３で示され、ＯＦＴ－２株及びＯＦＴ－５株のｒＲＮＡ遺伝子配列に対してそれぞれ９４．１４％及び９６．５９％の配列同一性を有する。なお、この配列同一性は、ＭｕｌｔｉｐｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔ（ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）及びＰｅｒｃｅｎｔＩｄｅｎｔｉｔｙＭａｔｒｉｘ（Ｃｌｕｓｔａｌ２．１）を用いて算出したものである。シュードモナス属細菌又はＭｏｃｋプレートと、黒根腐病菌を接種した寒天培地プレートとを、培地表面が内側で向き合うように２枚のプレートを合わせて密封し、２５℃で７日間培養した。７日間培養した後の菌糸コロニーの直径を定規により測定した。ＯＦＴ－２又はＯＦＴ－５／Ｍｏｃｋ×１００により黒根腐病菌の増殖度を算出し、黒根腐病菌の相対増殖度はＭｏｃｋに対する相対値で表した。 Further, the effect of volatile compounds produced by Pseudomonas bacteria was examined as follows. Pseudomonas bacterium OFT-2 strain, OFT-5 strain or RH7 strain was cultured on an agar plate or a sterile agar plate (mock), and inoculated with black root rot fungus (Caronectoria irisicola UH2-1 strain) (5 mm in diameter). An agar medium plate was prepared. The rRNA gene sequence of the RH7 strain is shown in SEQ ID NO: 3 and has 94.14% and 96.59% sequence identity to the rRNA gene sequences of the OFT-2 and OFT-5 strains, respectively. The sequence identity was calculated using Multiple Sequence Alignment (Clustal Omega: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) and Percent Identity Matrix (Clustal 2.1). be. A pseudomonas bacterium or a mock plate and an agar medium plate inoculated with black root rot were put together and sealed so that the medium surfaces faced each other, and cultured at 25° C. for 7 days. The diameter of mycelial colonies after 7 days of culture was measured with a ruler. The growth rate of black root rot fungus was calculated using OFT-2 or OFT-5/Mock×100, and the relative growth rate of black root rot fungus was expressed as a value relative to Mock.

７日間培養した後のプレート上の黒根腐病菌の菌糸コロニーの写真を図６に示す。上のプレートはシュードモナス属細菌を培養したプレート又はＭｏｃｋであり、下のプレートは黒根腐病菌を接種したプレートである。また、黒根腐病菌の相対増殖度を比較したグラフを図７に示す。これにより、ＯＦＴ－２株及びＯＦＴ－５株が生成する揮発性化合物により黒根腐病菌の増殖が抑制されていることが分かった。一方、同じシュードモナス属細菌であるＲＨ７株が生成する揮発性化合物には、黒根腐病菌の増殖抑制効果は認められなかった。 FIG. 6 shows a photograph of mycelial colonies of the black root rot fungus on the plate after culturing for 7 days. The upper plate is a plate or mock cultured with Pseudomonas bacteria, and the lower plate is a plate inoculated with black root rot fungus. Moreover, the graph which compared the relative growth rate of a black root rot fungus is shown in FIG. As a result, it was found that the proliferation of the black root rot fungus was suppressed by the volatile compounds produced by the OFT-2 and OFT-5 strains. On the other hand, the volatile compounds produced by the RH7 strain, which is also a bacterium belonging to the genus Pseudomonas, did not have the effect of inhibiting the growth of the black root rot fungus.

Claims

Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having 96% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and 98% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 A plant soil-borne disease control agent containing, as an active ingredient, a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a base sequence having a Pseudomonas bacterium, or a combination thereof.

Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having 98% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and 99% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 2. The soil-borne disease control agent according to claim 1, which contains, as an active ingredient, a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having the above-described base sequence, or a combination thereof.

The soil-borne disease control agent according to claim 1 or 2, wherein the pathogenic microorganism for soil-borne diseases includes Calonectria bacteria, Phytophthora bacteria, or a combination thereof.

The soil-borne disease control agent according to any one of claims 1 to 3, wherein the soil-borne disease is a damping-off disease.

The soil-borne disease control agent according to any one of claims 1 to 4, wherein the plant is a leguminous plant.

Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having 96% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and 98% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 A method for controlling soil-borne diseases of plants, comprising the step of imparting to soil or plants Pseudomonas bacteria having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having a Pseudomonas bacterium, or a combination thereof.

Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a nucleotide sequence having 98% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and 99% or more sequence homology to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 7. The method according to claim 6, comprising the step of imparting a Pseudomonas bacterium having a 16S rRNA gene consisting of a base sequence having a Pseudomonas bacterium or a combination thereof to soil or plants.

8. The method of claim 6 or 7, wherein the soil-borne disease pathogenic microorganism comprises Calonectria, Phytophthora, or a combination thereof.

The method according to any one of claims 6 to 8, wherein the soil-borne disease is a damping-off disease.

A method according to any one of claims 6 to 9, wherein the plant is a legume.

The method according to any one of claims 6 to 10, wherein the step of applying the Pseudomonas bacterium to soil or plants comprises adding a liquid containing the bacterium to seeds.