JP2023038833A - 骨髄由来神経保護型ミクログリア様細胞の選択的誘導方法とその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】神経変性疾患等に神経保護型ミクログリアを利用する治療方法を現実化するために、十分量のミクログリアを容易に及び簡便に得る方法、並びにミクログリア様細胞を含む医薬組成物を提供する。【解決手段】下記の工程１及び２により神経保護型ミクログリアを製造する。工程１：骨髄単核球細胞に対して、ＧＭ－ＣＳＦを作用させる工程工程２：工程１で作用させた後の細胞に対して、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ４を作用させる工程【選択図】なし

Description

本発明は、骨髄由来神経保護型ミクログリア様細胞の選択的誘導方法とその利用に関する。

ミクログリアとは、神経系での免疫反応に関与する細胞として知られている。ミクログリアには、Ｍ１ミクログリア及びＭ２ミクログリアが存在し、前者は炎症を惹起し、組織や細胞を破壊することが知られ、後者は、炎症を抑制し、組織や細胞を保護することが知られている。また、Ｍ１ミクログリアにＩＬ－１０やＩＬ－４を作用させることにより、Ｍ２ミクログリアとなることが知られている。

神経変性疾患等に対して、Ｍ２ミクログリアのような神経保護型ミクログリア様細胞を用いて治療することが有効であると考えられる。また、ミクログリアは、大脳皮質から得ることができることが知られている。

Ｋｏｂａｓｈｉ Ｓ，Ｔｅｒａｓｈｉｍａ Ｔ，Ｋａｔａｇｉ Ｍ，Ｎａｋａｅ Ｙ，Ｏｋａｎｏ Ｊ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｙ，Ｕｒｕｓｈｉｔａｎｉ Ｍ，Ｋｏｊｉｍａ Ｈ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ２－Ｄｅｖｉａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｏｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ Ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０２０ Ｊａｎ８；２８（１）：２５４－２６５．

神経変性疾患等に神経保護型ミクログリアを利用する治療方法を現実するためには、十分量のミクログリアを容易に及び簡便に調製できることが必要となるが、自家移植することを前提に、大脳皮質を原料に所定量のミクログリアを得ることは困難である。

本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、骨髄に含有される単核球細胞に所定の濃度の成長因子を作用させ、特定の培養方法に供することによって、神経保護型の自家移植可能なミクログリアを容易に誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下に示す態様の発明を広く包含する。

項１ Ｍ２ミクログリア様細胞の製造方法であって、下記の工程１及び２を含む製造方法；
工程１：骨髄単核球細胞に対して、ＧＭ－ＣＳＦを作用させる工程
工程２：工程１で作用させた後の細胞に対して、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ４を作用させる工程。

項２ 前記工程１における作用期間が４８～１２０時間である、上記項１に記載の製造方法。

項３ 前記工程２における作用期間が４８～１２０時間である、上記項１又は項２に記載の製造方法。

項４ 工程１及び２において作用させるＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ４の濃度が、２０ｎｇ／ｍｌより大きく、４０ｎｇ／ｍｌ以下である、上記項１～項３の何れか１項に記載の製造方法。

項５ 上記項１～項４の何れか１項に記載の製造方法によって製造された、骨髄単核球由来Ｍ２ミクログリア様細胞。

項６ 中枢神経疾患の治療及び／又は予防のために使用される、上記項５に記載のＭ２ミクログリア様細胞を含む医薬組成物。

項７ 前記中枢神経疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳梗塞、低酸素脳症、脊髄損傷、神経因性疼痛、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、上記項６に記載の医薬組成物。

本発明の製造方法によると、移植に使用する際に十分な量のＭ２ミクログリア様細胞を容易に誘導することができる。また、本発明の製造方法にて製造されたＭ２ミクログリア様細胞は、ＡＬＳに代表される神経変性疾患の治療及び／又は予防のために有効に使用することができる。

図１Ａは、実施例１における培養手順、及び処理前の骨髄単核球細胞細胞（Ｄａｙ０）及び処理後７日目の分化誘導された細胞（Ｄａｙ７）における透過光写真像（位相差）を示す。図１Ｂは、各ＭｅｔｈｏｄＡ、Ｂ、及びＣにおける培養開始時の骨髄単核球細胞に対する処理後７日目の分化誘導された細胞数（平均）の相対値を示す。＊＊は、ｐ＜０．０１を示す。＃は、ｐ＜０．０５を示す。図１Ｃは、各ＭｅｔｈｏｄＡ、Ｂ及びＣの処理後７日目の分化誘導された細胞における、ＧＡＰＤＨに対するＡｒｇ１及びＮｏｓ２のｍＲＮＡの発現量を示す。＊は、ｐ＜０．０５を示す。 図２Ａは、Ｍｅｔｈｏｄ Ｃにおける、処理前の骨髄単核球細胞細胞（Ｄａｙ０）及び７日目の分化誘導された細胞（Ｄａｙ７）におけるＣＤ１１ｂのフローサイトメトリーの結果を示す。図２Ｂは、Ｍｅｔｈｏｄ Ｃにおける、処理前の骨髄単核球細胞細胞（Ｄａｙ０）及び７日目の分化誘導された細胞（Ｄａｙ７）におけるＣＤ２０６のフローサイトメトリーの結果を示す。図２Ｃは、Ｍｅｔｈｏｄ Ｃにおける、処理前の骨髄単核球細胞細胞（Ｄａｙ０）及び７日目の分化誘導された細胞（Ｄａｙ７）におけるＣＤ８６のフローサイトメトリーの結果を示す。 図３Ａは、実施例２の実験の概略を示す模式図である。図３Ｂは、実施例２の結果を示す。グラフの縦軸は、ＣＴＬ ｍｅｄｉｕｍ－の際に得られた細胞生存数に対する相対値を表す。＊は、ｐ＜０．０５を示す。ｎ．ｓは有意差が無かったことを表す。 図４Ａは、実施例３における、行動学評価実験の結果を示す。＋は、２群間（ＣＴＬ及びＢＭ－ｉＭＧ）の経時的変化を含めた有意差検定結果であり、ｐ＜０．０５を示す。図４Ｂは、実施例３における、マウス重量の移植開始時に対する相対平均値を示す。図４Ｃは、実施例３における、生存曲線（カプランマイヤー）を示す。＋は、２群間（ＣＴＬ及びＢＭ－ｉＭＧ）の有意差検定結果であり、ｐ＜０．０５を示す。 図５は、実施例４にて実験した、実施例３にて製造した移植マウス脊髄における組織染色実験を確認する実験結果を示す。図５Ａは、β－チューブリンの組織免疫染色像である。図５Ｂは、図５Ａに示す結果を定量化したグラフである。図５Ｃは、ＧＦＡＰの組織免疫染色像である。図５Ｄは、図５Ｃに示す結果を定量化したグラフである。＊は、ｐ＜０．０５を示す。＃は、ｐ＜０．０５を示す。 図６は、実施例４の実験結果を示す。具体的に、実施例３にて製造した移植マウス脊髄における組織染色実験を確認結果を示す。図６Ａは、Ｉｂａ１の組織免疫染色像である。図６Ｂは、図６Ａに示す結果を定量化したグラフである。＊は、ｐ＜０．０５を示す。＃は、ｐ＜０．０５を示す。 図７は、実施例５にて実験した、実施例３にて製造した移植マウス脊髄における発現量を確認する実験結果を示す。＊は、ｐ＜０．０５を示す。

以下、本発明について説明する。なお、以下において、数値範囲を示す「～」の標記は「未満」又は「超過」の意味であることを特に断らない限り「以上以下」を示す。つまり、「Ａ～Ｂ」は「Ａ以上Ｂ以下」を意味する。

本明細書において、ある成分を「を含む」又は「を含有する」との表現には、当該成分を含み、さらに他の成分を含んでいてもよいとの意味のほか、当該成分のみを含むとの意味の「のみからなる」、及び当該成分を必須として含むとの意味の「から必須としてなる」の概念も包含される。

本明細書において、「神経保護型ミクログリア様細胞」を「Ｍ２ミクログリア細胞」と呼ぶことがある。

本発明のＭ２ミクログリア様細胞の製造方法は、下記の工程１及び２を含む。
工程１：骨髄単核球細胞に対して、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）を作用させる工程
工程２：工程１で作用させた後の細胞に対して、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ４を作用させる工程。

上記するＭ２ミクログリア様細胞とは、特に限定されないが、例えば、ＣＤ２０６、Ａｒｇ１、ＩＲＦ４、ＦＩＺＺ等のマーカーを発現する細胞を挙げることができる。

上記工程１における骨髄単核球細胞とは、骨髄に含有される造血幹細胞から誘導される単核系細胞である限り、特に限定されない。例えば、骨髄単核球細胞は、骨髄から赤血球、血小板及び顆粒球系細胞を濃度勾配法等により除去して得られる、リンパ球、単球系である白血球、及びそれらの前駆細胞、間葉系幹細胞等の未分化な細胞集団を含む造血系細胞の集合体を挙げることができる。より具体的には、Ｔ細胞／ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ等の免疫担当細胞、およびそれらの前駆細胞や、血管内皮、骨、軟骨等へと分化する能力を持つ間葉系幹細胞を挙げることができる。

上記工程１における「作用させる工程」とは、本発明の効果を発揮する範囲に限り、特に限定されない。例えば、培養に供する培地に、作用させる物質を含有させて所定期間の培養を実施する態様を挙げることができる。

上記工程１における骨髄単核球細胞の由来は、本発明の効果を発揮する限りにおいて、特に限定されない。具体的に、ラット、マウス等のげっ歯類動物、ブタ、サル、ヒト等を挙げることができる。中でも、治療対象（例えば、ヒト）に移植する際に適合する動物とすることが好ましい。

上記工程１における作用時間は、本発明の効果を発揮する限りにおいて、特に限定されない。例えば、４８～１２０時間とすることができる。好ましくは、６０～１０８時間、より好ましくは６０～９６時間である。工程１における作用時間を４８時間以上とすることによって、移植に必要な細胞数を確保できる。工程１における作用時間を１２０時間以下とすることによって、神経細胞保護作用を発揮しない分画の増殖を避けることができる。

上記工程２における作用時間も、本発明の効果を発揮する限りにおいて、特に限定されない。例えば、４８～１２０時間とすることができる。好ましくは、６０～１０８時間であり、より好ましくは７２～９６時間である。工程２における作用時間を４８時間以上とすることによって、神経細胞保護型ミクログリアへ効率よく誘導でき、工程２における作用時間を１２０時間以下とすることによって、移植に適した、安定した神経細胞保護型のミクログリアを得ることができる。

上記工程１及び２にて作用させるＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ４の濃度は、本発明の効果を発揮する限りにおいて、特に限定されない。例えば、２０ｎｇ／ｍｌを超える濃度で、４０ｎｇ／ｍｌ以下となる濃度とすることができる。好ましくは、３０ｎｇ／ｍｌを超える（又は以上となる）濃度で、４０ｎｇ／ｍｌ以下となる濃度とすることができる。ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ４の濃度を２０ｎｇ／ｍｌを超える濃度とすることによって、培養細胞のほぼ半数以上を神経細胞保護型のミクログリアに分化誘導でき、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ４の濃度を４０ｎｇ／ｍｌ以下とすることによって、さらに効率よく神経細胞保護型のミクログリアを得ることができる。なお、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ４の濃度は同一であっても異なっていてもよく、ＧＭ－ＣＳＦの濃度は工程１及び２において同一であっても異なっていてもよい。

上記工程１及び２では、培地中でＧＭ－ＣＳＦ又はＩＬ４を作用させることができる。具体的な培地は、本発明の効果を発揮する限りにおいて、特に限定されない。例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭ、ＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）等の基礎培地を挙げることができる。これらの中でも、未分化な細胞を効率よく分化させることに鑑みてＳｔｅｍＳｐａｎを使用することが好ましい。このＳｔｅｍＳｐａｎには、インスリン、トランスフェリン、２－メルカプトエタノール等が含有される。

上記の培地には、ＦＢＳやＦＣＳ等の細胞培養に使用される公知の血清が含有されていてもよいし、ペニシリン／ストレプトマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ゲンタマイシン、Ｇ４１８等の抗生物質が含有されていてもよい。

なお、上記血清は、非動化血清とすることもできるし、血清に変えて、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、２－メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）等の血清代替物を使用することもできる。

また、上記の培地には、通常、細胞培養に使用される公知の成分を、本発明の効果を発揮できる範囲において、適宜使用することもできる。例えば、Ｌ－グルタミン等のアミノ酸、アスコルビン酸等のビタミン、ビオチン、グルコース、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、増殖因子、サイトカイン、無機塩類等の栄養添加物を挙げることができる。

上記工程１及び２における作用は、所定の容器内で上記培地に培養する態様とすることができる。斯かる容器とは、本発明の効果を発揮できる限りにおいて、特に限定されない。例えば、シャーレ、フラスコ、培養プレート、ボトル、バッグ等を挙げることができる。

上記工程１及び２における作用温度は、本発明の効果を発揮する限りにおいて、特に限定されない。例えば、３５～３９℃とすることができ、より好ましくは３６～３８℃である。また、上記工程１及び２における作用環境も本発明の効果を発揮する限りにおいて、特に限定されない。例えば大気中とすることもできるし、ＣＯ_２環境下とすることもできる。好ましくは、５％のＣＯ_２環境下とすることである。また、酸素濃度は、特に限定されず、例えば、約２０％の酸素濃度とすることができる。

なお、上記の培地は、培養の途中で新しい培地に、適宜交換することができる。このような交換間隔は、本発明の効果を発揮する限りにおいて、特に限定されない。例えば、１日、１．５日、２日、２．５日、３日、３．５日、４日おきとすることができる。なお、このような培地交換は、培地の全てを交換してもよいし、一部の培地の交換としてもよい。

本発明の製造方法にて得られるＭ２ミクログリア様細胞は、中枢神経疾患の治療及び／又は予防のために使用される医薬組成物とすることができる。すなわち、前記医薬組成物は、本発明の製造方法にて得られるＭ２ミクログリア様細胞を含有する。なお、上記医薬組成物に含有されるＭ２ミクログリア様細胞は、これを製造する時に使用した培養培地及び／又はその培養上清と共に含有されることもできる。すなわち、本発明の医薬組成物は、本発明の製造方法にて得られるＭ２ミクログリア様細胞の培養培地及び／又はその培養上清を有効成分とすることもできる。

上記中枢神経疾患とは、特に限定されない。例えば、脳梗塞、低酸素脳症、脊髄損傷、神経因性疼痛、脳炎、脊髄炎、及び神経変性疾患等を挙げることができる。前記神経変性疾患とは、特に限定されない。例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、及び筋萎縮性硬化症等を挙げることができる。

上記医薬組成物に含有される上記Ｍ２ミクログリア様細胞の量は、特に限定されない。例えば、１００質量部の医薬組成物に対して、０．００１～１００質量部とすることができる。このような医薬組成物には、上記Ｍ２ミクログリア様細胞の他に、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤、界面活性剤、親水性ポリマー、キレート剤等を含有されることができる。また、上記Ｍ２ミクログリア様細胞の足場として、細胞外基質や細胞外マトリクスを含有することもできる。

上記医薬組成物の投与経路又は投与経路は、本発明の効果を発揮する範囲に限り、特に限定されない。例えば、組織内直接投与、髄腔内投与、経静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与等を挙げることができる。

上記医薬組成物の投与対象は、特に限定されない。例えば、上記する中枢神経疾患に罹患するホ乳類動物、又は罹患する可能性があるホ乳類動物を挙げることができる。このようなホ乳類動物は、特に限定されない。例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジサル、ヒト等を挙げることができる。これらの中でも、ヒトであることが好ましい。

上記医薬組成物の投与量は、本発明の効果を所望する投与対象の年齢、所望する効果の程度等によって変化するので、一概に決定することはできない。例えば、投与対象が体重６０ｋｇのヒト男性であれば、一回当たりの投与量として、医薬組成物に含有されるＭ２ミクログリア様細胞が、１０^４～１０^１０細胞となるような量の医薬組成物を投与することができる。

以下に、本発明を更に詳細に説明するための実施例を示す。但し、本発明が、下記に実施例に示す範囲に限定されないのはいうまでもない。

下記の実施例における統計分析は、平均値±ＳＤで表される。複数のデータ間の比較については、一元配置分散分析及びＳｃｈｅｆｆｅテストを使用した。また、行動分析では、二元配置分散分析にてデータの分析を行った。カプランマイヤー曲線の統計分析には、ログランク検定を使用した。０．０５未満のＰ値は有意であると解釈する。これらの統計分析は、ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓバージョン２５（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍａｃｈｉｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ジャクソンラボラトリーズ社）から全骨髄細胞を回収した。その後、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓｇｒａｄｉｅｎｔ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を使用して、全骨髄細胞から単核細胞を単離した。そして、これらの単離した単核細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ又はＩＬ－４と共に、無血清増殖培地であるＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）（ステムセルテクノロジーズ社）で、以下に示す３パターンの培養方法により、７日間培養した。

・方法Ａ：終濃度４０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含有する培地による７日間の培養
・方法Ｂ：終濃度４０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び終濃度４０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を含有する培地による７日間の培養
・方法Ｃ：終濃度４０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦを含有する培地により３日間の培養の後、終濃度４０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び終濃度４０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を含有する培地による４日間の培養

これらのすべての方法において、培養培地を培養開始から３日目に新しいものと交換した。そして、培養開始から７日後に培養細胞は光学顕微鏡によって観察した。そして、これらの細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡ（ライフテクノロジー社）にて１０分間処理して、細胞数を計測した。その結果を図１Ａ及びＢに示す。

図１Ｂに示すように、方法Ａ及びＣでは、７日後の細胞数が顕著に増加していたのに対して、方法Ｂにおける７日後の細胞数の増加の程度は、方法Ａ及びＣより少なかった。この結果から、ＩＬ－４にて初期から刺激することで、十分な細胞数が得られないことが考察される。

また、培養開始から７日後の細胞にて発現するＡｒｇ１及びＮｏｓ２のｍＲＮＡの発現量を、定量ＲＴ－ＰＣＲにて確認した。具体的には、これらの細胞から、ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ社）により、全ＲＮＡを抽出した。これらの全ＲＮＡから、ＴＡＫＡＲＡ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ試薬キット（タカラバイオ社）を用いて逆転写を行った後に、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）及びＬｉｇｈｔ－Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（ロシュ・ダイアグノスティックス社）にて、定量ＲＴ－ＰＣＲを行った。定量ＲＴ－ＰＣＲにて使用したプライマーの塩基配列は、以下の表１に示す通りである。なお、内部標準として、ＧＡＰＤＨを使用した。その結果を図１Ｃに示す。

図１Ｃに示す結果から、方法Ａでは、Ｍ２ミクログリアマーカーであるＡｒｇ１の発現も、Ｍ１ミクログリアマーカーである、Ｎｏｓ２の発現も共に認められなかった。他方、方法Ｂ及びＣでは、Ａｒｇ１の発現もＮｏｓの発現も認められ、特にＡｒｇ１は、方法Ｂよりも方法Ｃのほうが、より発現量が高いことが明らかとなり、Ｎｏｓ２は、方法Ｃよりも方法Ｂのほうが、より発現量が高いことが明らかとなった。この結果から、Ｍ２ミクログリアは、方法Ｃで最も誘導されており、Ｍ１ミクログリアは、方法Ｂで最も誘導されていることが考察される。

また、培養開始から７日後の細胞におけるＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０６、及びＣＤ８６の発現量を、フローサイトメトリーにて確認した。具体的に、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ及び ＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）にて測定し、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１１ｂ抗体（ＢＤバイオサイエンス社）、ＰＥ標識抗ＣＤ８６抗体（ＢＤバイオサイエンス社）、及びアレクサフローラ６４７標識抗ＣＤ２０６抗体（バイオレジェンド社）を使用した。この結果を図２に示す。

図２に示す結果から、培養開始から７日後の方法Ｃの細胞において、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２０６、及びＣＤ８６の発現の増加が認められた。ＣＤ１１ｂ陽性であることから、ミクログリアが８０％以上の割合で誘導されており、その内訳は、Ｍ２ミクログリアマーカーであるＣＤ２０６陽性が半数以上を占めたことが明らかとなった。その一方で、ＣＤ８６陽性のミクログリアは、２０％未満であったことが明らかとなった。

神経細胞の損傷からの回復の程度を確認する実験を行った。先ず、上記方法Ｃで骨髄由来単核細胞を培養し、その上清を馴化培地として回収した（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ）。また、４０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び４０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４を含有するＳｔｅｍｓｐａｎ培地（細胞を含まない）を、３７℃、ＣＯ_２環境下で４日間インキュベートし、これをＣＴＬ Ｍｅｄｉｕｍとした。

ＮＳＣ－３４細胞（ＣＥＬＬｕｔｉｏｎｓ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ高グルコース培地（富士フイルム和光純薬社）に３×１０^４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種して３時間培養した。この上清をＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ又はＣＴＬ Ｍｅｄｉｕｍを４０％含むように混合したＤＭＥＭ高グルコース培地に変更した。その後、神経細胞死を誘発するために、４００μＭのＮＯＣ－１８（１－ヒドロキシ－２－オキソ－３，３－ビス（２－アミノエチル）－１－トリアゼンを添加し、ＣＯ_２環境下で３７℃、４８時間インキュベートした。その後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（同仁化学研究所社）により、細胞数を計測した。結果を図３Ｂに示す。

図３Ｂに示す結果から、方法ＣによりＭ２ミクログリア様細胞の培養培地は、神経細胞死の誘導から回復する作用を発揮する事が明らかとなった。この結果から、誘導したＭ２ミクログリア様細胞より培養液中に分泌された成分に神経細胞保護効果があることが考察される。

上記方法Ｃにより骨髄単核細胞から誘導したＭ２ミクログリア様細胞を、ＡＬＳモデルマウスに移植した実験を行った。

具体的には、骨髄単核細胞として、ＧＦＰ－ｔｇマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（ＵＢＣ－ＧＦＰ）^{３０Ｓｃｈａ／Ｊ}：ジャクソンラボラトリーズ社）から、実施例１に示す方法と同様に骨髄単核細胞を回収し、その後、単核細胞を単離した。これを上記Ｃの方法により、Ｍ２ミクログリア様細胞を誘導し、この１．０×１０^５細胞／μｌのＰＢＳ懸濁液を移植用に準備した。

次いで、１０週齢の雄のＡＬＳモデルマウス（ｈＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ：ジャクソンラボラトリーズ社）に、０．３ｍｇ／ｋｇのメデトミジン、４ｍｇ／ｋｇのミダゾラム、及び５ｍｇ／ｋｇのブトルファノールを腹腔内注射により麻酔した。その後、麻酔したマウスのレベル１２～１３胸椎間の脊髄の片側に、上記に調製した１μｌのＭ２ミクログリア様細胞の懸濁液をゆっくりと注入し、その後、もう片方の脊髄から、これと同量の懸濁液を同様に注入した。コントロールとして、Ｍ２ミクログリア様細胞に代えてＰＢＳを注入したＡＬＳモデルマウスを準備した。これらのマウスに水及び専用飼料を自由に与え、１２時間の明暗サイクルで飼育した。

移植したＡＬＳモデルマウスの運動能力を、週に１回、Ｒｏｔａ－Ｒｏｄテスト（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、Ｃｏｍｅｒｉｏ－Ｖａｒｅｓｅ）により分析し、同じ頻度にて体重を測定した。上記するＲｏｔａ－Ｒｏｄテストは、５～５０ｒｐｍ／分（加速の程度は、９ｒｐｍ／分^２）の範囲で、５分間行い、各マウスの５回の試行の３つの中央値の平均を計算した。

また、生理学的死亡は、Ｒｏｔａ－Ｒｏｄテストの結果が「０秒」を示したこと、又は各マウスが最大から１５％を超える体重減少を示したと定義し、これをカプランメイヤー法として分析した。これらの結果を、図４に示す。なお、マウス実験のプロトコルは、滋賀医科大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認され、そのガイドラインに従って実施した。

図４Ａに示す結果から、方法Ｃにより骨髄単核細胞から誘導したＭ２ミクログリア様細胞を移植したＡＬＳモデルマウス（ＢＭ－ｉＭＧ：黒線）は、コントロール（ＣＴＬ：灰線）よりも運動能力の低下が有意に抑制されており、図４Ｂに示す結果から、黒線に示すＢＭ－ｉＭＧのほうが、灰線に示すコントロールよりも体重の減少も緩やかとなっていることがわかり、図４Ｃに示すように、ＢＭ－ｉＭＧの生存曲線が良好であるとの結果が得られた。

上記移植後３週間又は末期における脊髄の組織染色実験、具体的にβ３チューブリン、ＧＦＡＰ、及びＩｂａ－１の組織染色実験を常法に従って行った。具体的に使用した抗体を以下に示す。
・ウサギ抗β３チューブリン抗体（セルシグナリングテクノロジー社）
・ウサギ抗ＧＦＡＰ抗体（セルシグナリングテクノロジー社）
・ウサギ抗Ｉｂａ－１抗体（富士フイルム和光純薬社）

図６Ａは、コントロール（Ｂｕｆｆｅｒ ＣＴＬ）の脊髄と共に、方法Ｃにより製造したＭ２ミクログリア様細胞を移植したＡＬＳモデルマウス（ＢＭ－ｉＭＧ ｃｅｌｌｓ）の脊髄をＤＡＰＩ染色と共に、β３チューブリンにて染色した結果を示す。この結果から算出した神経細胞数を図５Ｂに示す。また、図５Ｃに、Ｂｕｆｆｅｒ ＣＴＬとＢＭ－ｉＭＧ ｃｅｌｌｓとの脊髄を、ＤＡＰＩ染色と共に、ＧＦＡＰにて染色した結果を示す。この結果から算出したＧＦＡＰ陽性強度を図５Ｄに示す。

そして、図６Ａに、Ｂｕｆｆｅｒ ＣＴＬとＢＭ－ｉＭＧ ｃｅｌｌｓとの脊髄を、ＤＡＰＩ染色と共に、Ｉｂａ－１にて染色した結果を示す。この結果から算出したＩｂａ－１陽性細胞数を図６Ｂに示す。

これらの結果から、ＢＭ－ｉＭＧ ｃｅｌｌｓでは、末期における神経細胞数の減少を抑制することができる事が明らかとなった。また、ＢＭ－ｉＭＧ ｃｅｌｌｓでは、末期におけるＧＦＡＰ陽性強度が抑制されていることが明らかとなった。そして、ＢＭ－ｉＭＧ ｃｅｌｌｓでは、末期におけるＩｂａ－１陽性細胞数が減少していることが明らかとなった。これらの結果から、上記する細胞移植により、脊髄内での神経細胞保護効果、アストログリオーシスの抑制効果、及びミクログリアの集積抑制効果が認められるとが考察される。

次いで、上記移植後３週間又は末期における脊髄の、Ｎｏｓ２、Ａｒｇ１、ＣＤ８６、Ｍｒｃ１、ＴＮＦα、及びＩＬ－６の発現量を測定する実験を行った。具体的に、移植後３週間又は末期における脊髄から、実施例２と同様にして全ＲＮＡを回収し、定量ＲＴ－ＰＣＲにて発現量を確認した。定量ＲＴ－ＰＣＲにて使用したプライマーの塩基配列は、以下の表２に示す通りである。また、Ｎｏｓ２及びＡｒｇ１のプライマー配列は、上記表１と同じである。なお、内部標準として、β-aｃｔｉｎを使用した。この結果を図７に示す。

図７に示す結果から、方法Ｃにより骨髄単核細胞から誘導したＭ２ミクログリア様細胞を脊髄に移植したマウス（ＢＭ－ｉＭＧ）では、末期におけるＮｏｓ２の発現量がコントロール（ＣＴＬ）よりも減少していることが明らかとなり、Ａｒｇ１の発現量が、コントロールよりも上昇していることが明らかとなった。また、Ｍｒｃ１の発現量も、コントロールよりも上昇していることが明らかとなった。そして、ＢＭ－ｉＭＧでは、ＩＬ－６の発現量も、コントロールよりも減少していることが明らかとなった。ＣＤ８６とＴＮＦαの発現量は、変化なかった。これらの結果から、ＢＭ－ｉＭＧでは、炎症マーカーであるＮｏｓ２とＩＬ－６が減少し、細胞保護マーカーであるＡｒｇ１とＣＤ２０６遺伝子であるＭｒｃ１との発現量が上昇していることから、脊髄内での炎症を抑制し、移植したことが細胞保護的に働いていることが考察される。

Claims (7)

1. Ｍ２ミクログリア様細胞の製造方法であって、下記の工程１及び２を含む製造方法；
   工程１：骨髄単核球細胞に対して、ＧＭ－ＣＳＦを作用させる工程
   工程２：工程１で作用させた後の細胞に対して、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ４を作用させる工程。
2. 前記工程１における作用期間が４８～１２０時間である、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記工程２における作用期間が４８～１２０時間である、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 工程１及び２において作用させるＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ４の濃度が、２０ｎｇ／ｍｌより大きく、４０ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項１～３の何れか１項に記載の製造方法。
5. 請求項１～４の何れか１項に記載の製造方法によって製造された、骨髄単核球由来Ｍ２ミクログリア様細胞。
6. 中枢神経疾患の治療及び／又は予防のために使用される、請求項５に記載のＭ２ミクログリア様細胞を含む医薬組成物。
7. 前記中枢神経疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳梗塞、低酸素脳症、脊髄損傷、神経因性疼痛、又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項６に記載の医薬組成物。

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