JP2022554412A - ウィスコットアルドリッチ症候群（ｗａｓ）を治療するための、造血幹細胞中のレンチウイルスベクター - Google Patents

ウィスコットアルドリッチ症候群（ｗａｓ）を治療するための、造血幹細胞中のレンチウイルスベクター Download PDF

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Abstract

特定の実施形態では、ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）を治療するためのレンチウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、ベクターは、ＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの効果的な断片を含む核酸構築物を含む発現カセットを含み、上記プロモーターは、最大６００ｂｐの長さを有し、ＨＳ１ｐｒｏの配列；及び、ＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの効果的な断片に作動可能に連結されたウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸を含有する。

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１９年１１月１１日に出願された、ＵＳＳＮ６２／９３３，８７５に対する優先権及び利益を主張し、あらゆる目的のためその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
政府支援の記述
［該当なし］
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０２０年１１月９日に作成され、８２．１ｋｂのサイズを有する、「ＵＣＬＡ－Ｐ２２０Ｐ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というテキストファイルとして、本明細書と共に提供される。テキストファイルの内容は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）は、ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子内での変異により引き起こされる、Ｘ連鎖一次免疫不全である。ＷＡＳを有する患者は、獲得性及び先天性免疫の両方において、深刻な不良を有し、生命を脅かすウイルス、及び細菌感染症に、非常に影響を受けやすい。患者はまた、過度に深刻な湿疹、微小血小板減少症もまた患い、自己免疫及びがんが進行するリスクが非常に高い。
ＷＡＳは、その遺伝によるＸ連鎖潜性パターンが原因で、オスにおいて大部分が生じ、１００万人当たり、１～１０人のオスに影響を及ぼす。最初の兆候は一般的に、点状出血及び紫斑であり、血小板の数が少ないこと（即ち、血小板減少症）により生じる。自然発生する鼻血及び血性下痢もまた一般的であり、湿疹は典型的には、生まれてから最初のひと月の間に進行する。再発性の細菌感染症は典型的には、３ヶ月で進行する。ＷＡＳを有する子どもの大部分では、少なくとも１つの自己免疫疾患が進行し、がん（多くの場合、リンパ腫及び白血病）が、患者の最大３人に１人において進行する。免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）の量が典型的には減少し、ＩｇＡ及びＩｇＥが典型的には増加して、ＩｇＧの量は通常であるか、減少するか、または増加することができる。血小板減少症に加えて、ＷＡＳ患者は血小板が異常に小さく（即ち、微小血小板減少症を有し）、約３０％が、好酸球の数の増加（即ち、好酸球増加症）もまた有する。
ＷＡＳの治療は、典型的には、感染症を管理するための予防用抗生物質及び抗ウイルス療法を伴う。血小板輸液及び脾摘を使用して、血小板減少症（血小板の数が少ないこと）を治療する。加えて、過剰な出血により生じる貧血を治療するために、輸血が必要となり得、防御ヘルメットを使用して、頭部損傷により生じ得る脳出血を予防することができる。免疫抑制治療を、自己免疫の症状に対して利用する。
ＷＡＳを有する患者は、異常Ｔ及びＢリンパ球機能を有するため、ウイルスのワクチンストレスが疾患を引き起こす可能性があるが故に、彼らには通常、生ウイルスワクチンは投与されない。ニワトリポックス感染症の合併症が場合により発生し、これは、抗ウイルス剤、高用量の免疫グロブリン代償療法、または、水痘帯状疱疹免疫グロブリン（ＶＺＩＧ）の曝露の後の初期治療により予防され得る。他の「非生」ワクチン接種を、ＷＡＳを有する患者に安全に与えることができるが、これらは、予防レベルの抗体を生じさせるわけではない。
潜在的な治癒療法は、ＨＬＡ一致ドナーに由来する、同種異系造血幹細胞移植である。しかし、この治療法は、好適に一致するドナーを利用することができないが故に、多くの患者にとっての有効なオプションではない。
代替の治癒療法は、エクスビボ遺伝子療法による、自己造血幹細胞（ＨＳＣ）移植である。本アプローチにおいて、患者は、自身のドナーとして機能し、免疫合併症のリスクが排除される。本アプローチの実装の成功は、対象となる遺伝子の機能的コピーを導入するための、または、患者のＨＳＣにおける病原性変異を修正するための、レンチウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲベースの治療法を開発することにかかっている。
以前のウイルスベースの治療法では、ＣＭＭＰ－ＷＡＳγレトロウイルスベクターを使用した。この治療法では、全ての患者における機能及び血小板の数が回復された。しかし、患者の９分の７では、挿入性がん遺伝子によって、急性白血病が発生した（例えば、Ｂｒａｕｎ（２０１４） Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．６（２２７）：２２７ｒａ３３を参照されたい）。
別の治療法では、内因性ＷＡＳ遺伝子の、１．６ｋｂのプロモーター断片によりもたらされる、より安全なＳＩＮレンチウイルスベクターを使用する。このベクターを使用すると、約６／７の患者が、遺伝子療法の後に臨床改善を示した。Ｔ、Ｂ、及びＮＫ細胞は機能的であり、通常の免疫細胞の数が回復した。加えて、感染症の重症度及び頻度が低下し、深刻な湿疹が解決された。しかし、血小板の数、及び血小板の平均サイズは、通常の値を下回ったままであった。患者は依然として微小血小板減少症を有したままであり、深刻な出血が発症するリスクを維持したままであった。
ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）を治療するための、新規のレンチウイルスベクター（複数可）（ＬＶ）の開発を、本明細書に記載する。本明細書に記載するベクターは、巨核球中での、現在のレンチウイルスベクターよりも良好な（高い）発現を示し、ＷＡＳ患者中で、通常のレベルまで血小板の数を回復することができると考えられている。加えて、本明細書に記載するベクターは、他の全ての造血性細胞株において、ＷＡＳ遺伝子を発現する以前のＳＩＮ ＬＶと同様の発現度を維持すると考えられており、故に、Ｔ、Ｂ及びＮＫ細胞の数、及び機能を回復可能であると考えられている。
したがって、本明細書で想倒する様々な実施形態は、以下のうちの１つ以上を含むことができるが、これらに限定されない：
実施形態１：ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）の治療のための組み換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）であって、上記ベクターが、
発現カセットであって、
ＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの効果的な断片をコードする核酸であって、上記プロモーターが、最大６００ｂｐの長さを有し、ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）を含有する、上記核酸と、
ＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの上記効果的な断片に作動可能に連結されたウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸と、
を含む、上記発現カセットを含む、上記ベクター。
実施形態２：ＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの上記効果的な断片の配列が、ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなる、実施形態１に記載のベクター。
実施形態３：上記発現カセットが、スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）、またはその効果的な断片を含む、実施形態１～２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態４：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１（配列番号３＋配列番号４）、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれらからなる、実施形態３に記載のベクター。
実施形態５：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１（配列番号３＋配列番号４）、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）からなる、実施形態４に記載のベクター。
実施形態６：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれらからなる、実施形態３に記載のベクター。
実施形態７：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）からなる、実施形態６に記載のベクター。
実施形態８：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）を含むか、またはこれからなる、実施形態３に記載のベクター。
実施形態９：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の２つ目の半分（配列番号４）を含むか、またはこれからなる、実施形態３及び８のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１０：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント２（配列番号５）を含むか、またはこれからなる、実施形態３、及び８～９のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１１：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント３（配列番号６）を含むか、またはこれからなる、実施形態３、及び８～１０のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１２：上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）を含むか、またはこれからなる、実施形態３、及び８～１１のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１３： 上記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれからなる、実施形態３、及び８～１２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１４：上記発現カセットが、エンハンサーエレメントＨＳ３（配列番号９）、またはその効果的な断片を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１５：上記発現カセットが、エンハンサーエレメントＨＳ３の効果的な断片を含み、上記断片が、ＨＳ３コア配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなる、実施形態１４に記載のベクター。
実施形態１６：上記発現カセットが、エンハンサーエレメントＨＳ３の効果的な断片を含み、上記断片が、ＨＳ３コア配列（配列番号１０）からなる、実施形態１５に記載のベクター。
実施形態１７：上記発現カセットが、エンハンサーエレメントＨ９（配列番号１１）、またはその効果的な断片を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１８：上記発現カセットが、エンハンサーエレメントＥ９の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメントＥ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなる、実施形態１７に記載のベクター。
実施形態１９：上記発現カセットが、エンハンサーエレメントＥ９の効果的な断片を含み、上記断片が、エンハンサーエレメントＥ９コア配列（配列番号１２）からなる、実施形態１８に記載のベクター。
実施形態２０：上記発現カセットが、スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）；及び、ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなるＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの断片を含む、実施形態１～２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２１：上記ベクターが、図１８に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、実施形態２０に記載のベクター。
実施形態２２：上記ベクターが、配列番号１５に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、実施形態２０に記載のベクター。
実施形態２３：上記発現カセットが、
Ｅ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＥ９配列；
ＨＳ３コア配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＨＳ３配列；
スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）；及び
ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）を含むか、またはこれからなるＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの断片
を含む、実施形態１～２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２４：上記ベクターが、図１９に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、実施形態２３に記載のベクター。
実施形態２５：上記ベクターが、配列番号１６に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、実施形態２３に記載のベクター。
実施形態２６：上記発現カセットが、
Ｅ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＥ９配列；
ＨＳ３コア配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＨＳ３配列；
エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１（配列番号３＋配列番号４）、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）；ならびに
ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）を含むか、またはこれからなるＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの断片
を含む、実施形態１～２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態２７：上記ベクターが、図２０に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、実施形態２６に記載のベクター。
実施形態２８：上記ベクターが、配列番号１７に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、実施形態２６に記載のベクター。
実施形態２９：上記発現カセットが、
Ｅ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＥ９配列；
ＨＳ３コア配列（配列番号１０）；エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれらからなるエンハンサーエレメントＨＳ３；ならびに
ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）を含むか、またはこれからなるＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの断片
を含む、実施形態１～２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態３０：上記ベクターが、図２１に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、実施形態２９に記載のベクター。
実施形態３１：上記ベクターが、配列番号１８に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、実施形態２９に記載のベクター。
実施形態３２：ＷＡＳｐタンパク質をコードする核酸をコードする上記核酸が、ＷＡＳ ｃＤＮＡ、またはコドン最適化ＷＡＳ遺伝子である、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態３３：ＷＡＳｐタンパク質をコードする核酸をコードする上記核酸が、ＷＡＳ ｃＤＮＡ（配列番号１３）である、実施形態３２に記載のベクター。
実施形態３４：ＷＡＳｐタンパク質をコードする核酸をコードする上記核酸が、コドン最適化ＷＡＳである、実施形態３２に記載のベクター。
実施形態３５：ＷＡＳＰをコードする上記核酸の配列が、ｊＣＡＴコドン最適化ＷＡＳ、ＧｅｎｅＡｒｔ最適化ＷＡＳ、及びＩＤＴ最適化ＷＡＳからなる群から選択される、コドン最適化ＷＡＳである、実施形態３４に記載のベクター。
実施形態３６：上記ベクターが、Ψ領域ベクターゲノムパッケージングシグナルを含む、実施形態１～３５のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態３７：上記ベクターが、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む５’ＬＴＲを含む、実施形態１～３６のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態３８：上記ベクターが、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む、実施形態１～３７のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態３９：上記ベクターが中央ポリプリン帯を含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態４０： 上記ベクターが、翻訳後制御エレメントを含む、実施形態１～３９のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態４１：翻訳後制御エレメントが、修飾されたウッドチャック転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）である、実施形態４０に記載のベクター。
実施形態４２：上記ベクターが、組み換えにより、野生型レンチウイルスを再構成することができない、実施形態１～４１のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態４３：上記ベクターが、巨核球中で高い発現を示す、実施形態１～４２のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態４４：ＷＡＳを有する哺乳類に投与されたときに、上記ベクターが、Ｔ、Ｂ、及びＮＫ細胞の数、及び機能を回復させる、実施形態１～４３のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態４５：実施形態１～４４のいずれか１つに記載のベクターを形質導入した宿主細胞。
実施形態４６：細胞が幹細胞である、実施形態４５に記載の宿主細胞。
実施形態４７：上記細胞が、骨髄由来の、及び／または臍帯血液由来の、及び／または末梢血由来の幹細胞である、実施形態４６に記載の宿主細胞。
実施形態４８：上記細胞がヒト造血前駆細胞である、実施形態４５に記載の宿主細胞。
実施形態４９：ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４＋細胞である、実施形態４８に記載の宿主細胞。
実施形態５０：対象におけるウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）の治療方法であって、上記方法が、
上記対象由来の幹細胞及び／または前駆細胞に、実施形態１～４４のいずれか１つに記載のベクターを形質導入することと、
上記対象由来の上記形質導入細胞（複数可）を上記対象に移植することであって、上記対象由来の細胞または誘導体が、上記ＷＡＳｐタンパク質を発現する、上記移植することと、
を含む、上記方法。
実施形態５１：上記細胞が幹細胞である、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５２：上記細胞が、骨髄由来の幹細胞である、実施形態５０に記載の宿主細胞。
実施形態５３：細胞がヒト造血幹細胞及びヒト造血前駆細胞である、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５４：ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４＋細胞である、実施形態５３に記載の方法。
実施形態５５：以下のうちの１つ以上を含む、組み換え核酸：
ＷＡＳ遺伝子の最小内因性プロモーターを含む、もしくはこれからなる核酸配列であって、上記最小内因性プロモーターが、ＨＳ１ｐｒｏ（配列番号１）を含むか、もしくはこれからなる、上記配列；及び／または
スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）、もしくはその効果的な断片を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の２つ目の半分（配列番号４）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント２（配列番号５）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント３（配列番号６）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
エンハンサーエレメントＨＳ３（完全）（配列番号９）もしくはその効果的な断片を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
エンハンサーエレメントＨＳ３コア（配列番号１０）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
エンハンサーエレメントＥ９（完全）（配列番号１１）もしくはその効果的な断片を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
エンハンサーエレメントＥ９コア（配列番号１２）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列。
実施形態５６：上記核酸が、ＷＡＳ遺伝子の最小内因性プロモーターを含む、またはこれからなる核酸配列であって、上記最小内因性プロモーターが、ＨＳ１ｐｒｏ（配列番号１）を含むか、またはこれからなる、上記配列を含む、実施形態５５に記載の核酸。
実施形態５７：上記核酸が、スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）、またはその効果的な断片を含むか、またこれからなる核酸配列を含む、実施形態５５に記載の核酸。
実施形態５８：上記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、実施形態５５に記載の核酸。
実施形態５９：上記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の２つ目の半分（配列番号４）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、実施形態５５及び５８のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態６０：上記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント２（配列番号５）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、実施形態５５、及び５８～５９のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態６１：上記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント３（配列番号６）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、実施形態５５、及び５８～６０のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態６２：上記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、実施形態５５、及び５８～６１のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態６３：上記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、実施形態５５、及び５８～６２のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態６４：上記核酸が、エンハンサーエレメントＨＳ３（完全）（配列番号９）またはその効果的な断片を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、実施形態５５、及び５８～６３のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態６５：上記核酸が、エンハンサーエレメントＨＳ３コア（配列番号１０）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、実施形態５５、及び５８～６４のいずれか１つに載の核酸。
実施形態６６：上記核酸が、エンハンサーエレメントＥ９（完全）（配列番号１１）またはその効果的な断片を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、実施形態５５、及び５８～６５のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態６７：上記核酸が、エンハンサーエレメントＥ９コア（配列番号１２）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、実施形態５５、及び５８～６６のいずれか１つに載の核酸。
実施形態６８：上記核酸が発現カセットを含む、実施形態５５～６７のいずれか１つに記載の核酸。
実施形態６９：上記発現カセットが、哺乳類細胞に形質導入されたときにＷＡＳｐを発現するのに効果的である、実施形態６８に記載の核酸。
実施形態７０：上記核酸が、実施形態１～４４のいずれか１つに記載のベクターを含む、実施形態５５に記載の核酸。
定義。
「プロモーター」とは、遺伝子（例えば、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子）の転写を開始するために必要な、核酸中の制御配列を意味する。
「エンハンサー」とは、転写因子と呼ばれる特定のタンパク質により結合されたときに、会合する遺伝子の転写を向上させる制御性ＤＮＡ配列を意味する。
プロモーターに関して使用する場合の「効果的な断片」（例えば、ＷＡＳプロモーターの効果的な断片）とは、当該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の転写を開始するのに十分な完全長プロモーターの断片を意味する。
エンハンサーに関して使用する場合の「効果的な断片」（例えば、ＷＡＳエンハンサーの効果的な断片）とは、転写因子により結合されたときに、作用可能に結合した遺伝子の発現の制御をもたらすのに十分な完全長エンハンサーの断片を意味する。特定の実施形態では、制御は、完全長エンハンサーによりもたらされる発現レベル及び／またはリネージに匹敵するものである。
用語「作用可能に連結された」とは、別の核酸配列との機能的関係に置かれた核酸配列を意味する。例えば、プロモーターは、遺伝子に、当該プロモーターが当該遺伝子の転写を開始させる位置に、当該プロモーターが配置されるときに、作動可能に連結される。エンハンサーは、遺伝子に、当該エンハンサーが、適切な転写因子により結合されたときに、当該遺伝子の発現を制御（例えば、上方制御）可能となるときに、作動可能に連結される。
「組み換え」とは、当該技術分野における使用と一致して使用され、単一の配列の一部として、自然には一緒に存在しない部分、または、自然に存在する配列と比較して再配列されている部分を含む核酸配列を意味する。組み換え核酸は、人の手を伴うプロセスにより作製される、及び／または、人の手により（例えば、複製、増幅、転写などの、１つ以上のサイクルにより）作製された核酸から生成される。組み換えウイルスは、組み換え核酸を含むウイルスである。組み換え細胞は、組み換え核酸を含む細胞である。
本明細書で使用する場合、用語「組み換えレンチウイルスベクター」または「組み換えＬＶ」とは、人の介入及び操作の結果として、ＬＶ、及び複数の追加のセグメントから組み立てられた、人工的に作製されたポリヌクレオチドを意味する。
「有効量」とは、未治療の患者と比較して、疾患の症状を緩和または排除するのに必要な剤、または、当該剤を含む組成物の量を意味する。疾患の治療的処置のために、本明細書に記載の方法を実施するために使用する組成物（複数可）の有効量は、患者の投与様式、年齢、体重、及び総体的な健康に応じて変化する。究極的には、担当医師または獣医が、適切な量及び投薬レジメンを決定するだろう。そのような量は、「有効」量と呼ばれる。
Ａは、エレメントＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ３、及びＨＳ４の様々な組み合わせの制御活性を評価するために使用した、例示的なＬＶ構築物を示す。Ｂは、Ｅ３エレメントとＨＳ１の組み合わせを評価するために使用した構築物を示す。 ＷＡＳベクターを形質導入したＭＥＧ－０１細胞における発現レベルを示す。 Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞株）におけるＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 ＲＡＭＯｓ細胞（Ｂ細胞株）におけるＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 ＷＡＳ遺伝子を制御する決定的なエンハンサーエレメントを識別するために使用した構築物を示す。Ａは、それぞれ、内因性の最小ＷＡＳプロモーター（ＨＳ１ｐｒｏ）の上流でクローニングされた、推定のエンハンサーエレメントを含有する１０個の新規の構築物である。Ｂは、血小板の数を正常なレベルに回復可能であり、対照として使用したγレトロウイルスベクター（ＣＭＭＰ－ｍＣｉｔ）である。 ＭＥＧ－０１（巨核芽球細胞株）における、ＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞株）におけるＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 ＲＡＭＯｓ細胞（Ｂ細胞株）におけるＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球の「プロ巨核球」における、ＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球の「巨核球」における、ＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球の「血小板」における、ＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球の「プロ巨核球」における、ＷＡＳベクターを示す。 ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球の「巨核球」における、ＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球の「血小板」における、ＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球の「巨核球」における、Ｅ２の５つのサブエレメントのそれぞれを含むＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球の「巨核球」における、５つのＥ２断片のそれぞれを含むＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球の「血小板」における、５つのＥ２断片のそれぞれを含むＷＡＳベクターの発現レベルを示す。 Ｅ２（全てスリム）ベクター（Ｅ２（全てスリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ）の概略図を示す。 Ｅ９（スリム）及びＨＳ３（スリム）エレメントが付加されている、Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２（全スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥベクターの概略図を示す。 Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２（１，４，５スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（エレメント２のコアサブエレメント２、及びエレメント２のコアサブエレメント３が欠失されている）の概略図を示す。Ｅ９ｓｌｉｍＨＳ３ｓｌｉｍＥ２１４５ｓｌｉｍＨＳ１ｐｒｏ。 Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２（１の最初の半分及び５スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（エレメント２のコアサブエレメント１の２つ目の半分、エレメント２のコアサブエレメント２及びエレメント２のコアサブエレメント３、ならびに、エレメント２のコアサブエレメント４が欠失されている）の概略図を示す。 ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球における、候補ベクターの発現を示す。 ＣＢ ＣＤ３４＋分化血小板における、候補ベクターの発現を示す。 不死化した、ＷＡＳ患者のＢ細胞株における、コドン最適化のスクリーニングを示す。 不死化した、ＷＡＳ患者のＴ細胞株における、コドン最適化のスクリーニングを示す。 ＷＡＳＶｅｃのコドン最適化版により産生された力価を示す。
様々な実施形態では、ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）の治療（または予防）に供されるレンチウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、ベクターは、ベクターのサイズを低下させ、発現レベル及び力価を増加させるように最適化される。加えて、様々な実施形態では、例えば、本明細書に記載するネイティブＷＡＳ遺伝子の発現パターンを再利用するためのベクター。
特に、（一般に利用可能なデータベース：Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｅｎｃｏｄｅ、Ｅｎｓｅｍｎｂｌ、ＦＡＮＴＯＭ、ＶＩＳＴＡ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｂｒｏｗｓｅｒ、ＧｅｎｅＨａｎｃｅｒを使用する）バイオインフォマティクス分析を利用して、ネイティブＷＡＳ遺伝子の内因性制御エレメントを明らかにした。１１０万個の塩基対ウィンドウ内に含まれる、１３個の推定される内因性エンハンサーエレメントを識別した。
推定の制御エレメントのそれぞれを実験で確認するために、レンチウイルスライブラリーを構築した。ＭＥＧ－０１細胞（巨核球細胞株）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞株）、ＲＡＭＯｓ（Ｂ細胞株）、加えて、臍帯血ＣＤ３４＋分化巨核球において、各エレメントのエンハンサー活性を確認した。
さらなる実験を行い、エンハンサー及びＷＡＳ内因性プロモーターの、必要な（コア）領域（複数可）を識別し、ＷＡＳ遺伝子の好適な発現を実現するのに必要な、最小プロモーターと減少（スリム）エンハンサーエレメントの組み合わせを識別した。確認したエンハンサーエレメントを使用して、ＷＡＳの治療のための、我々のリード候補レンチウイルスベクターを設計した。
したがって、特定の実施形態では、ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）の治療のための組み換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）が提供され、ベクターは、ＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの効果的な断片をコードする核酸を含む発現カセットを含み、プロモーターは、最大６００ｂｐの長さを有し、ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）；及び、ＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの効果的な断片に作動可能に連結されたウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸を含有する。特定の実施形態では、ＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの効果的な断片は、ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなる。
特定の実施形態では、発現カセットは、スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）、またはその効果的な断片を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、断片は、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１（配列番号３＋配列番号４）、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれらからなる。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、断片は、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１（配列番号３＋配列番号４）、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）からなる。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、断片は、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれらからなる。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、断片は、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）からなる。
特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、断片は、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメントの最初の半分（配列番号３）、及び／またはエンハンサーエレメント２の効果的な断片を含むか、またはこれらからなり、断片は、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメントの２つ目の半分（配列番号４）、及び／またはエンハンサーエレメント２の効果的な断片を含むか、またはこれらからなり、断片は、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント２（配列番号５）、及び／またはエンハンサーエレメント２の効果的な断片を含むか、またはこれらからなり、断片は、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント３（配列番号６）、及び／またはエンハンサーエレメント２の効果的な断片を含むか、またはこれらからなり、断片は、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）、及び／またはエンハンサーエレメント２の効果的な断片を含むか、またはこれらからなり、断片は、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれからなる。
特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメントＨＳ３（配列番号９）、またはその効果的な断片を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメントＨＳ３の効果的な断片を含み、断片は、ＨＳ３コア配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなる。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメントＨＳ３の効果的な断片を含み、断片は、ＨＳ３コア配列（配列番号１０）からなる。
特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメントＥ９（配列番号１１）、またはその効果的な断片を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメントＥ９の効果的な断片を含み、断片は、エンハンサーエレメントＥ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなる。特定の実施形態では、発現カセットは、エンハンサーエレメントＥ９の効果的な断片を含み、断片は、エンハンサーエレメントＥ９コア配列（配列番号１２）からなる。
特定の実施形態では、発現カセットは、スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）；及び、ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなるＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの断片を含む。特定の実施形態では、本ベクターは、図１８に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列は、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられている。特定の実施形態では、本ベクターは、配列番号１５に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列は、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられている。
特定の実施形態では、発現カセットは、Ｅ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＥ９配列；ＨＳ３コア配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＨＳ３配列、スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）；及び、ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなるＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの断片を含む。特定の実施形態では、本ベクターは、図１９に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列は、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられている。特定の実施形態では、本ベクターは、配列番号１６に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列は、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられている。
特定の実施形態では、発現カセットは、Ｅ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＥ９配列；ＨＳ３コア配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＨＳ３配列、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１（配列番号３＋配列番号４）、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）；ならびに、ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなるＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの断片を含む。特定の実施形態では、本ベクターは、図２０に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列は、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられている。特定の実施形態では、本ベクターは、配列番号１７に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列は、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられている。
特定の実施形態では、発現カセットは、Ｅ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＥ９配列；ＨＳ３コア配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＨＳ３配列、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）；ならびに、ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなるＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの断片を含む。特定の実施形態では、本ベクターは、図２１に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列は、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられている。特定の実施形態では、本ベクターは、配列番号１８に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列は、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられている。
臨床用途のためには、ｍＣｉｔｒｉｎｅレポーターを、ＷＡＳｐタンパク質をコードする核酸で置き換えることができることが理解されよう。このような核酸は、ＷＡＳ ｃＤＮＡ、またはコドン最適化ＷＡＳ遺伝子（例えば、ｊＣＡＴ最適化ＷＡＳ）である。特定の実施形態では、ＷＡＳＰをコードする核酸の配列は、ｊＣＡＴコドン最適化ＷＡＳ、ＧｅｎｅＡｒｔ最適化ＷＡＳ、及びＩＤＴ最適化ＷＡＳからなる群から選択される、コドン最適化ＷＡＳである。
レンチウイルスベクターに対する、本明細書で記載する発現カセットは、本使用に限定される必要はなく、ＷＡＳｐの発現が所望される場合において、本質的に任意の他の作成物（例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築物）に組み込むことが可能であることもまた理解されよう。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載する発現カセット構成要素のいずれかを含む核酸構築物が想倒される。
Figure 2022554412000002
Figure 2022554412000003
Figure 2022554412000004
Figure 2022554412000005
Figure 2022554412000006
Figure 2022554412000007
様々な実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、例えば、インスレーター（例えば、３’ＬＴＲ中のＦＢインスレーター）の存在を含むことができる、様々な「安全性」特徴を有することができる。加えて、または代替的に、特定の実施形態では、ＨＩＶ ＬＴＲは、代替のプロモーター（例えば、ＣＭＶ）で置換されており、パッケージングの間にＨＩＶ ＴＡＴタンパク質を含めることなく、より高い力価のベクターが得られる。他の強力なプロモーター（例えば、ＲＳＶなど）もまた、使用することができる。
上述のとおり、様々な実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターで典型的に発見されるエレメントのうちの、いずれか１つ以上を含有する。このようなエレメントとしては、例えば、後述するような、Ψ領域ベクターゲノムパッケージングシグナル、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、ポリプリン帯（例えば、中央ポリプリン帯、３’ポリプリン帯など）、翻訳後制御エレメント（例えば、修飾ウッドチャック転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ））、インスレーターなどが挙げられるが、これらに限定される必要はない。
様々な実施形態では、ベクターは、組み換えによる野生型レンチウイルスの再構成が実質的に不可能な、ＳＩＮベクターである。
様々な実施形態では、本明細書に記載するベクターは、ＭＥＧ－０１細胞（巨核球細胞株）、及び／またはＪｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞株）、及び／またはＲＡＭＯｓ細胞（Ｂ細胞株）における高い発現を示す。特定の実施形態では、本明細書に記載するベクターは、「プロ巨核球」、巨核球、及び血小板を含む、ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球における高い発現を示す。
上に示すように、実施例１において、本明細書に記載するベクターは、高い力価にて細胞を形質導入し、また、ＷＡＳｐタンパク質をコードする核酸の、高レベルでの発現をもたらすのに効果的であるであると考えられている。
これらの結果を鑑みると、本明細書に記載するＬＶ、例えば、ＷＡＳＰをコードする核酸を発現する、組み換えＴＡＴ独立ＳＩＮ ＬＶを使用して、対象（例えばヒト、及び非ヒト哺乳類）において、ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）を効果的に治療することができると考えられる。これらのベクターを、治療のために、幹細胞（例えば、造血幹細胞及び造血前駆細胞）の改変を必要とする対象（例えば、ＷＡＳを有するものと識別された対象）に導入可能な、幹細胞の改変に使用することができると考えられている。さらに、得られた細胞は、対象の健康の著しい改善を示すのに十分なトランスジェニックＷＡＳｐタンパク質を産生すると考えられている。ベクターを、対象に直接投与して、標的（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）のインビボ形質導入を実現することができ、これによって、治療を必要とする対象の治療に影響を及ぼすことができるともまた、考えられている。
上述のとおり、様々な実施形態では、本明細書に記載するＬＶは、様々な安全性特徴を含むことができる。例えば、ＨＩＶ ＬＴＲは、ＣＭＶプロモーターで置換されており、パッケージングの間にＨＩＶ ＴＡＴタンパク質を含めることなく、より高い力価ベクターが得られる。特定の実施形態では、インスレーター（例えば、ＦＢインスレーター）を、安全性のために３’ＬＴＲに導入することができる。ＬＴをまた構築して、効率的な形質導入、及び高い力価をもたらす。
前述のエレメントは例示的であり、限定を行う必要はないことが理解されよう。本明細書で提供する教示の観点から、これらのエレメントに対する好適な置換が当業者により認識され、本明細書で提供する教示の範囲内で想倒される。
ＷＡＳコドン最適化。
上述のとおり、様々な実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＷＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡを含むことができる。しかし、特定の実施形態では、ＷＡＳｐをコードする核酸はコドン最適化されている。コドン最適化の様々な方法は、当業者に既知である。例示的な一方法は、ＪＣａｔ（Ｊａｖａコドン適応ツール）である。ｊＣＡＴツールは、遺伝子コドンの使用法を、大部分の配列決定された原核生物、及び様々な真核細胞遺伝子宿主に適用する。多くのツールとは対照的に、ＪＣａｔは、非常に発現した遺伝子のマニュアル定義を必要とせず、それ故に、非常に迅速で容易な方法である。コドン適応のためのＪＣａｔのさらなるオプションとしては、制限酵素及びＲｈｏ独立転写ターミネーターに対する、不必要な切断部位の回避が挙げられる。ＪＣａｔの出力は共に図形によるものであり、入力配列、及び新規に適応した配列に対して、コドン適応指数（ＣＡＩ）値として与えられる。ＪＣａｔ最適化は、Ｇｒｏｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（ｓｕｐｐｌ ２）：Ｗ５２６－Ｗ５３１）により記載されており、ＪＣａｔツールは、ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅにてオンラインで利用可能である。
別のコドン最適化ツールは、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）製）により提供される。
さらに別のコドン最適化ツールはＩＤＴである。新しい生体での、各コドンの使用法の頻度に基づき、コドン使用法を再度割り当てることにより、発現のために、ある生体由来のＤＮＡまたはタンパク質配列を、別の生体に対して最適化するために、ＩＤＴコドン最適化ツールを開発した。例えば、バリンは、４つの異なるコドン（ＧＵＧ、ＧＵＵ、ＧＵＣ、及びＧＵＡ）によりコードされる。しかし、ヒト細胞株では、ＧＵＧコドンが優先的に使用される（４６％の使用、これに対してそれぞれ１８、２４、及び１２％）。コドン最適化ツールはこの情報を考慮して、バリンコドンを、これらと同一頻度で割り当てる。さらに、ツールのアルゴリズムは、コドンを１０％未満の頻度で取り除き、残りの頻度を１００％に再度正規化する。さらに、最適化ツールは、製造及び下流発現、例えば反復、ヘアピン、及び極度のＧＣ含有量と干渉する可能性がある複雑性を低下させる。ＩＤＴ最適化ツールは、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）から入手可能であり、ｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔで発見することができる。
他のコドン最適化ツールとしては、ｃｏｄｏｎｗ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで発見することができる、オープンソースのソフトウェアプログラムであるＣｏｄｏｎＷ、及び、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ製のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）アルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されない。
これらのコドン最適化は例示的であり、非限定的である。本明細書、及び実施例１で提供する教示を使用して、ＷＡＳコドンの使用法を、特定用途に対して速やかに最適化することができる。
ＴＡＴ独立及び自己不活型レンチウイルスベクター。
安全性をさらに改善するために、様々な実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクターは、ＴＡＴ独立自己不活型（ＳＩＮ）構成を含む。したがって、さまざまな実施形態では、本明細書に記載するＬＶ内で、野生型ＬＴＲと比較してプロモーター活性が低下したＬＴＲ領域を用いるのが望ましい。効果的に「自己不活型」（ＳＩＮ）であり、バイオセーフティの特徴をもたらす、このような構築物を提供することができる。ＳＩＮベクターは、形質導入した細胞内での、完全長ベクターＲＮＡの産生が大幅に減少している、または、完全になくなっているベクターである。この特徴は、複製能を有する組み換え物（ＲＣＲ）が出現するリスクを最小化する。さらに、この特徴は、ベクター組み込み部位に隣接して位置する細胞コード配列が、異常に発現するリスクを低下させる。
さらに、ＳＩＮの設計は、ＬＴＲと、導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターとが干渉する可能性を低下させる。ＳＩＮ ＬＶは多くの場合、内部プロモーターの完全な活性を可能にすることができる。
ＳＩＮの設計は、ＬＶのバイオセーフティを増加させる。ＨＩＶ ＬＴＲの大部分は、Ｕ３配列を含む。Ｕ３領域は、感染細胞内で、及び、細胞の活性化に応答して、ＨＩＶゲノムの基礎的な、及び誘発された発現を制御する、エンハンサー及びプロモーターエレメントを含有する。これらのプロモーターエレメントのいくつかは、ウイルス複製のために不可欠である。エンハンサーエレメントのいくつかは、ウイルス単離物の間で非常に保存され、ウイルス性病原体における、決定的な病原性因子であることが示唆されている。エンハンサーエレメントは、ウイルスの異なる細胞標的において、複製速度に影響を及ぼす可能性がある。
５’ＬＴＲのＵ３領域の３’末端にて、ウイルス転写が開始するため、これらの配列は、ウイルスｍＲＮＡの一部ではなく、３’ＬＴＲからのこのコピーは、組み込まれたプロウイルスの両方のＬＴＲを生成するためのテンプレートとして機能する。Ｕ３領域の３’複写がレトロウイルスベクター構築物に変更される場合、ベクターＲＮＡは依然として、プロデューサー細胞内のインタクトな５’ＬＴＲから産生されるが、標的細胞内では再生成することができない。このようなベクターを形質導入することにより、後代ウイルスにおいて、両方のＬＴＲの不活化がもたらされる。したがって、レトロウイルスは自己不活型（ＳＩＮ）であり、これらのベクターは、ＳＩＮ転写ベクターとして知られている。
特定の実施形態では、自己不活化は、ベクターＤＮＡ、即ち、ベクターＲＮＡを作製するために使用するＤＮＡの、３’ＬＴＲのＵ３領域における、欠失の導入により実現される。ＲＴの間、この欠失を、プロウイルスＤＮＡの５’ＬＴＲに移す。典型的には、十分なＵ３配列を取り除いて、ＬＴＲの転写活性を大幅に減少させる、または、完全になくし、これにより、形質導入細胞における完全長ベクターＲＮＡの産生を大幅に減少させる、または完全になくすのが望ましい。しかし、典型的にはＵ３、Ｒ、及びＵ５にわたり拡大する機能である、ウイルスＲＮＡのポリアデニル化に関与する、ＬＴＲのこれらのエレメントを保持するのが一般的に望ましい。したがって、特定の実施形態では、ポリアデニル化決定基を節約しながら、できるだけ多くの、ＬＴＲ由来の転写に重要なモチーフを取り除くのが望ましい。
ＳＩＮ設計は、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）： ９８７３－９８８０、及び、米国特許第５，９９４，１３６号に詳述されている。しかし、これらに記載されているように、３’ＬＴＲにおいて、欠失の程度が制限されている。まず、Ｕ３領域の５’末端は、ベクター移動における別の不可欠な機能を果たし、組み込み（末端ジヌクレオチド＋ａｔｔ配列）のために必要である。したがって、末端ジヌクレオチド及びａｔｔ配列は、欠失可能なＵ３配列の５’の境界を示し得る。さらに、いくつかの緩やかに定められた領域は、Ｒ領域内の下流ポリアデニル化部位の活性に影響を及ぼし得る。３’ＬＴＲから、Ｕ３配列が過度に欠失されることによって、ベクター転写物のポリアデニル化が低下し得、プロデューサー細胞内でのベクターの力価、及び、標的細胞内での導入遺伝子発現の両方において、逆の結果を伴う。
追加のＳＩＮ設計は、米国特許公開第２００３／００３９６３６号に記載されている。当該明細書に記載されているように、特定の実施形態では、ＬＴＲから取り除かれたレンチウイルス配列を、非レンチウイルスであるレトロウイルス由来の相当する配列で置き換えることにより、ハイブリッドＬＴＲを形成する。具体的には、ＬＴＲ内のレンチウイルスＲ領域を、非レンチウイルスであるレトロウイルス由来のＲ領域によって、全体で、または部分的に置き換えることができる。特定の実施形態では、ＴＡＴタンパク質と相互作用してウイルス複製を向上させる配列である、レンチウイルスＴＡＲ配列を、Ｒ領域から、好ましくは全て取り除く。次に、ＴＡＲ配列を、非レンチウイルスであるレトロウイルス由来のＲ領域の相当する部分で置き換えることによって、ハイブリッドＲ領域を形成する。ＬＴＲをさらに組み換え、レンチウイルスＵ３及びＵ５領域の全部分または一部を取り除くことができる、及び／または、当該部分を、非レンチウイルス配列で置き換えることができる。
したがって、特定の実施形態では、ＳＩＮ構成は、そのＴＡＲ配列の全部分または一部を欠くハイブリッドレンチウイルスＲ領域を含むレトロウイルス型ＬＴＲを提供し、これにより、ＴＡＴにより、任意の可能性のある活性化が取り除かれ、ここで、ＴＡＲ配列またはその一部は、非レンチウイルスであるレトロウイルス由来のＲ領域の相当する部分で置き換えられることにより、ハイブリッドＲ領域が形成される。特定の実施形態では、レトロウイルスＬＴＲはハイブリッドＲ領域を含み、ハイブリッドＲ領域は、ＴＡＲ配列を欠く、ＨＩＶ Ｒ領域の一部（例えば、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１０に示すヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる一部）、及び、ＨＩＶ Ｒ領域を欠くＴＡＲ配列に相当する、ＭｏＭＳＶ Ｒ領域の一部（例えば、２００３／００３９６３６において配列番号９に示すヌクレオチド配列を含む、またはこれからなる一部）を含む。別の特定の実施形態では、ハイブリッドＲ領域全体は、２００３／００３９６３６において配列番号１１に示すヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。
Ｒ領域が由来することができる好適なレンチウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ（ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２）、ＥＩＶ、ＳＩＶ、ならびにＦＩＶが挙げられる。非レンチウイルスである配列が由来することができる好適なレトロウイルスとしては、例えば、ＭｏＭＳＶ、ＭｏＭＬＶ、Ｆｒｉｅｎｔ、ＭＳＣＶ、ＲＳＶ、及びスプマウイルスが挙げられる。例示的な一実施形態では、レンチウイルスはＨＩＶであり、非レンチウイルスであるレトロウイルスはＭｏＭＳＶである。
ＵＳ２００３／００３９６３６に記載されている別の実施形態では、ハイブリッドＲ領域を含むＬＴＲは、左（５’）ＬＴＲであり、ハイブリッドＲ領域の上流にあるプロモーター配列をさらに含む。好ましいプロモーターは、由来が非レンチウイルスであり、例えば、非レンチウイルスであるレトロウイルス由来のＵ３領域（例えば、ＭｏＭＳＶのＵ３領域）が挙げられる。特定の一実施形態では、Ｕ３領域は、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１２に示すヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、左（５’）ＬＴＲは、ハイブリッドＲ領域の下流にあるレンチウイルスＵ５領域をさらに含む。一実施形態では、Ｕ５領域は、ゲノム組み込みに必要なＨＩＶａｔｔ部位を含む、ＨＩＶのＵ５領域である。別の実施形態では、Ｕ５領域は、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１３に示すヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態では、左（５’）ハイブリッドＬＴＲ全体は、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む。
別の例示的な実施形態では、ハイブリッドＲ領域を含むＬＴＲは、右（３’）ＬＴＲであり、ハイブリッドＲ領域の上流にある、改変（例えば、切頭）レンチウイルスＵ３領域をさらに含む。改変レンチウイルスＵ３領域はａｔｔ配列を含むことができるが、プロモーター活性を有する任意の配列を欠いていることで、ウイルス転写が、染色体組み込み後の第１ラウンドの複製を超えて進むことができないという点で、ベクターがＳＩＮとなることを引き起こす。特定の実施形態では、ハイブリッドＲ領域の上流にある改変レンチウイルスＵ３領域は、最大でレンチウイルスＵ３ａｔｔ部位までで、この部位を含む、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）Ｕ３領域の３’末端からなる。一実施形態では、Ｕ３領域は、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１５に示すヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、右（３’）ＬＴＲは、ハイブリッドＲ領域の下流にあるポリアデニル化配列をさらに含む。別の実施形態では、ポリアデニル化配列は、ＵＳ２００３／００３９６３６において配列番号１６に示すヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施形態では、右（５’）ＬＴＲ全体は、ＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号２または１７に示すヌクレオチド配列を含む。
したがって、ＨＩＶベースのＬＶの場合、このようなベクターは、ベクター力価が著しく低下することなく、ＬＴＲ ＴＡＴＡボックスの除去（例えば、－４１８～－１８の欠失）を含む、著しいＵ３の欠失を許容することが発見された。これらの欠失は、ＬＴＲの転写能力が約９０％以下まで低下するという点で、ＬＴＲ領域を実質的に転写不活性にする。
転写ベクター構築物中の上流ＬＴＲの一部が、恒常的活性型プロモーター配列により置き換えられる場合、Ｔａｔのｔｒａｎｓ作用機能は不必要となることもまた、示されている（例えば、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３－８４７１を参照されたい）。さらに、ｔｒａｎｓにおけるｒｅｖの発現によって、ｇａｇ及びｐｏｌのみを含有するパッケージング構築物からの、高力価のＨＩＶ由来ベクターストックを作製することが可能となることを示す。この設計により、プロデューサー細胞内でのみ利用可能な相補性を条件とした、パッケージング機能の発現がなされる。得られる遺伝子導入システムは、ＨＩＶ－１の９個の遺伝子のうち３つのみを保存し、形質導入粒子を産生するための、４つの個別の転写ユニットに左右される。
実施例１に示す一実施形態では、ＷＡＳｐをコードする核酸を発現するカセットは、５’ＬＴＲで置換されたＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含むＳＩＮベクターである。
ＣＭＶプロモーターは典型的には、高レベルの非組織特異性発現をもたらすことが理解されよう。同様の構成活性を有する他のプロモーターとしては、ＲＳＶプロモーター、及びＳＶ４０プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。βアクチンプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、伸長因子１αプロモーター、チューブリンプロモーターなどといった哺乳類プロモーターもまた、使用することができる。
前述のＳＩＮ構成は例示的なものであり、非限定的なものである。多数のＳＩＮ構成が、当業者に既知である。上述のように、特定の実施形態では、ＬＴＲ転写は、約９５％～約９９％低下する。特定の実施形態では、ＬＴＲは、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、転写不活性となり得る。
インスレーターエレメント
特定の実施形態では、バイオセーフティをさらに高めるために、インスレーターを、本明細書に記載するレンチウイルスベクターに挿入する。インスレーターは、ゲノム全体に存在するＤＮＡ配列エレメントである。これらは、クロマチンを改変して局所的な遺伝子発現を変化させるタンパク質に結合する。本明細書に記載するベクターにインスレーターを配置することによって、とりわけ、１）染色体を隣接させることにより、ベクターを、発現の位置的な効果ふ入りを遮断すること（即ち、バリア活性）と；２）ベクターにより、染色体の、遺伝子発現の挿入性ｔｒａｎｓ活性化との隣接を遮断すること（エンハンサーブロッキング）と、を含む、様々な潜在的な利益がもたらされる。したがって、インスレーターは、その発現が、別の場合においては、ゲノムまたは遺伝のコンテクストでは制御シグナルにより影響を受け得る、ゲノムまたは遺伝コンテクストに埋め込まれる、遺伝子または転写ユニットの独立した機能を保存するのに役立つことができる（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ－Ｂｅｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１６４３３；及びＺｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照されたい）。本文脈では、インスレーターは、レンチウイルスが発現する配列を、組み込み部位の影響から保護するのに寄与し得、これは、ゲノムＤＮＡに存在する、ｃｉｓ作用エレメントにより媒介され得、移った配列の制御緩和された発現をもたらす。様々な実施形態では、インスレーター配列が、細胞ゲノムに組み込むベクターの、１つもしくは両方のＬＴＲ、または領域内の他の箇所に挿入されるＬＶが提供される。
第１の、及び、最も特性決定された脊椎動物クロマチンインスレーターは、ニワトリのβグロビン座位制御領域の中に存在する。ＤＮａｓｅ－Ｉ高感受性部位（ｃＨＳ４）を含有する本エレメントは、ニワトリβグロビン座位の５’境界を構成するようである（Ｐｒｉｏｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８：４０３５－４０４８）。ｃＨＳ４エレメントを含有する１．２ｋｂの断片は、細胞株（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ，７４：５０５－５１４）における、グロビン遺伝子プロモーターとエンハンサーとの相互作用を遮断する能力、ならびに、ショウジョウバエ（Ｉｄ．）、形質転換細胞（Ｐｉｋａａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：２８５２－２８６２）、及び、トランスジェニック哺乳類（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：２３９－２４３；Ｔａｂｏｉｔ－Ｄａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，８：２２３－２３５）において、発現カセットを位置効果から保護する能力を含む、典型的なインスレーター活性を示す。本活性の大部分は、２５０ｂｐの断片に含まれる。この伸長の中には、エンハンサー遮断アッセイ（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ，９８：３８７－３９６）で示唆される、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質ＣＴＣＦと相互作用する、４９ｂｐのｃＨＳ４コア（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４：５７５－５８０）が存在する。
例示的な１つの、かつ好適なインスレーターは、Ｒａｍｅｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２６：３２５７－３２６６により記載されている、ニワトリβグロビンの５’ＨＳ４インスレーターの最小ＣＴＣＦ結合部位エンハンサー遮断構成要素、及び、ヒトＴ細胞受容体のα／δ遮断エレメントα／δＩ（ＢＥＡＤ－Ｉ）インスレーター由来の相同領域を含有する、７７ｂｐのインスレーターエレメントであるＦＢ（ＦＩＩ／ＢＥＡＤ－Ａ）である。ＦＢ「合成」インスレーターは、完全なエンハンサー遮断活性を有する。本インスレーターは、例示的であり限定を行うものではない。例えば、完全長ニワトリβグロビンＨＳ４またはそのインスレーターサブ断片、アンキリン遺伝子インスレーター、及び、他の合成インスレーターエレメントを含む、他の好適なインスレーターを使用することができる。
パッケージングシグナル。
様々な実施形態では、本明細書に記載するベクターは、パッケージングシグナルをさらに含む。「パッケージングシグナル」、「パッケージング配列」、または「ＰＳＩ配列」は、配列がパッケージングシグナルを含む核酸の、レトロウイルス粒子へのパッケージングを指示するのに十分な、任意の核酸配列である。この用語は、自然に存在するパッケージング配列、及びまた、その組み換えられたバリアントを含む。レンチウイルスを含む、多数の異なるレトロウイルスのパッケージングシグナルが、当技術分野において既知である。非限定的な、例示的な１つのＰＳＩは、配列番号２１により提供される。
Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）。
特定の実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクターは、スプライシングされていないＲＮＡの核外搬出を向上させるための、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む。ＲＲＥは、当業者に周知である。例示的なＲＲＥとしては、ＨＩＶ ＮＬ４－３ゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００３８８７）の位置７６２２～８４５９）に位置するものなどのＲＲＥ、加えて、ＨＩＶの他の株または他のレトロウイルス由来のＲＲＥが挙げられるが、これらに限定されない。このような配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、または、ｈｉｖ－ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘのＵＲＬのデータベースから速やかに入手することができる。非限定的な例示的な１つのＲＲＥを、配列番号２２に示す。
ポリプリン帯（ｃＰＰＴ、３’ＰＰＴ）。
様々な実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクターは、ポリプリン帯（例えば、中央ポリプリン帯（ｃＰＰＴ）、３’ポリプリン帯（３’ＰＰＴ））をさらに含む。レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１）ベクター構築物に、３’ＰＰＴ（例えば、配列番号２４を参照されたい。）、または、中央ポリプリン帯（ｃＰＰＴ）を含有する断片を挿入することで、形質導入の効率が向上することが知られている。
発現刺激転写後制御エレメント（ＰＲＥ）
特定の実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、転写物内での存在が、タンパク質レベルでの異種核酸（例えば、ＷＡＳｐをコードする核酸）の発現を増加させる、様々な転写後制御エレメント（ＰＲＥ）のいずれかを含むことができる。ＰＲＥは特に、特定の実施形態、特に、適度なプロモーターを含むレンチウイルス構築物を伴う実施形態で有用であり得る。
ＰＲＥの一種は、遺伝子発現を発現することができる、発現カセット内に位置するイントロンである。しかし、イントロンは、レンチウイルスの生活環事象の間にスプライシングされることができる。故に、イントロンがＰＲＥとして使用される場合、イントロンは通常、ベクターゲノム転写物とは反対方向に配置される。
スプライシング事象に依存しない転写後制御エレメントは、ウイルスの生活環の間に取り除かれないという利点をもたらす。いくつかの例は、単純ヘルペスウイルスの転写後処理エレメント、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）及びウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）の転写後制御エレメントである。これらのうち、ＨＰＲＥでは見出されない、追加のｃｉｓ作用エレメントを含有するため、ＷＰＲＥが通常は好まれる。本制御エレメントは典型的には、ベクター内に配置され、導入遺伝子のＲＮＡ転写産物の中には含まれるが、導入遺伝子翻訳ユニットの終止コドンの外に位置する。
ＷＰＲＥは特性決定されており、米国特許第６，１３６，５９７号に記載されている。当該明細書に記載されているように、ＷＰＲＥは、ＲＮＡの、核から細胞質への効率的な輸送を媒介する、ＲＮＡエクスポートエレメントである。ＷＰＲＥは、エレメント及び導入遺伝子が単一の転写物に含有されるように、ｃｉｓ作用核酸配列を挿入することにより、導入遺伝子の発現を向上させる。センス方向にＷＰＲＥが存在することにより、導入遺伝子の発現が、最大７～１０倍増加することが示された。イントロンとしての、完全なイントロン含有遺伝子は一般的に、レトロウイルス粒子の形成をもたらす事象の配列の間にスプライシングされる代わりに、レトロウイルスベクターは、ｃＤＮＡの形態で配列を輸送する。イントロンは、一時転写物の、スプライシング機構との相互作用を媒介する。スプライシング機構によるＲＮＡの処理が、その細胞質エクスポートを容易にするため、スプライシングと輸送機構との結合により、ｃＤＮＡは多くの場合、発現が非効率的となる。したがって、ベクターにＷＰＲＥ（例えば、配列番号２３を参照されたい。）を含めることにより、導入遺伝子の発現の向上がもたらされる。
形質導入した宿主細胞、及び、細胞の形質導入方法。
組み換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）、及び、本明細書に記載する、得られるウイルスは、異種核酸配列（例えば、ＷＡＳｐをコードする核酸）を哺乳類細胞に輸送することが可能である。様々な実施形態では、細胞に送達するために、本明細書に記載するベクターは、好適なパッケージング細胞株と組み合わせて使用する、または、必要なレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇ及びｐｏｌ）を含有する他のベクタープラスミドと共に、細胞にインビトロで同時トランスフェクションして、本発明の細胞をパッケージングし、細胞を感染させることが可能な、複製能を有しないヴィリオンを形成するのが好ましい。
特定の実施形態では、ベクターは、トランスフェクションによりパッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ベクターゲノムを含有するウイルス粒子を作製する。トランスフェクションの方法は、当業者により周知である。パッケージングベクター及び転写ベクターをパッケージング細胞株に同時トランスフェクションした後で、組み換えウイルスを培養培地から回収し、当業者により使用される標準的な方法により滴定する。したがって、パッケージング構築物は、一般的に、ネオマイシン、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼなどの、優れた選択マーカーと共に、またはこれらなしで、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法を行い、続いて、適切な剤の存在下における選択、及びクローンの単離を行うことにより、ヒト細胞株に導入されることができる。特定の実施形態では、選択マーカーは、構築物中のパッケージング遺伝子に物理的に結合することができる。
パッケージング機能が、好適なパッケージング細胞により発現するように構成されている安定した細胞株が知られている（例えば、パッケージング細胞について記載している、米国特許第５，６８６，２７９号を参照されたい）。一般に、ウイルス粒子を作製するために、レンチウイルスＧａｇ及びＰｏｌ遺伝子の発現と適合性がある任意の細胞、または、このような発現を指示するために組み換え可能な任意の細胞を用いることができる。例えば、２９３Ｔ細胞及びＨＴ１０８０細胞などのプロデューサー細胞を使用することができる。
パッケージング細胞は、当該明細書に組み込まれているレンチウイルスベクターと共に、プロデューサー細胞を形成する。したがって、プロデューサー細胞は、対象となる治療用遺伝子（例えば、ＷＡＳｐをコードする核酸）を運搬するパッケージ化された感染性ウイルス粒子を、作製または放出可能な細胞または細胞株である。これらの細胞はさらに、アンカレッジ依存性であることができ、これは、これらの細胞が、ガラスまたはプラスチックなどの表面に付着した際に、最適に増殖、生残、または機能を維持することを意味する。ベクターが複製可能であるときに、レンチウイルスベクターパッケージング細胞株として使用される、アンカレッジ依存性細胞株のいくつかの例は、ＨｅＬａまたは２９３細胞、及びＰＥＲＣ．６細胞である。
したがって、特定の実施形態では、遺伝子を細胞に送達し、これを次に、当該細胞のゲノムに組み込む方法であって、当該細胞を、本明細書に記載するレンチウイルスベクターを含有するヴィリオンと接触させることを含む、上記方法を提供する。細胞（例えば、組織または器官の形態である）を、エクスビボでヴィリオンと接触（例えば、感染）させ、次に、遺伝子（例えば、ＷＡＳｐをコードする核酸）が発現する対象（例えば、哺乳類、動物、またはヒト）に送達することができる。様々な実施形態では、細胞は、対象に対して自己由来である（即ち、対象に由来する）ことができるか、または、対象に対して非自己である（即ち、同種異系もしくは異種である）ことができる。さらに、本明細書に記載するベクターは、分裂及び非分裂細胞の両方に送達可能であるために、細胞は、例えば、骨髄細胞、（例えば、脂肪組織から入手される）間葉幹細胞、ならびに、ヒト及び動物源に由来する他の一次細胞を含む、様々な種類から由来することができる。あるいは、ヴィリオンは、対象、または、対象の局在的な範囲（例えば、骨髄）に、インビボで直接投与することができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載するレンチベクターは特に、骨髄、末梢血、または臍帯血のいずれかから入手される、ヒト造血前駆細胞または造血幹細胞の形質導入、加えて、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、末梢血ＢまたはＴリンパ球細胞などの形質導入で有用である。特定の実施形態では、特に好ましい標的は、ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞である。
遺伝子療法。
さらに他の実施形態では、ヒト造血幹細胞を形質導入する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、造血幹細胞を含むヒト細胞の集団を、ベクターにより、上記集団においてヒト造血前駆細胞の形質導入をもたらす条件下において、前述のレンチベクターのうちの１つと接触させることを伴う。幹細胞は、最終用途に応じて、インビボまたはインビトロで形質導入することができる。ヒト幹細胞の遺伝子療法といった、ヒト遺伝子療法の文脈においても、幹細胞をインビボで、または、代替的に、インビトロで形質導入した後、形質導入した幹細胞をヒト対象に注入することができる。本実施形態の一態様では、ヒト幹細胞は、当業者に周知の方法を使用して、ヒト、例えば、ＷＡＳ患者から取り除くことができ、上述のとおりに形質導入することができる。形質導入した幹細胞を次に、同一または異なるヒトに再導入する。
幹細胞／前駆細胞の遺伝子療法。
様々な実施形態では、本明細書に記載するレンチベクターは、骨髄、末梢血、または臍帯血のいずれかから入手される、ヒト造血前駆細胞または造血幹細胞（ＨＳＣ）の形質導入、加えて、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、末梢血ＢまたはＴリンパ球細胞などの形質導入に特に有用である。特定の実施形態では、特に好ましい標的は、ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞である。
細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞、樹状細胞、末梢血細胞、または腫瘍細胞がエクスビボに形質導入されたときに、ベクター粒子は、一般的に、１０５ｃｅｌｌｓ当たりで、ウイルスベクターの１×１０５～５０×１０５個の形質導入ユニットにもまた対応する、１～５０の感染多重度（ＭＯＩ）のオーダーの用量で使用して細胞と共にインキュベートされる。これは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、及び５０ＭＯＩに対応するベクターの量を含むことができる。典型的には、ベクターの量は、ＨＴ－２９形質導入ユニット（ＴＵ）の観点で表現することができる。
特定の実施形態では、細胞ベースの療法は、幹細胞及び／または造血前駆体を提供することを伴い、細胞に、例えば、ＷＡＳｐをコードする核酸をコードするレンチウイルスを形質導入した後で、当該治療法を必要とする対象（例えば、ＷＡＳ遺伝子に変異を有する対象）に形質転換細胞を形質導入する。
特定の実施形態では、方法は、対象由来の細胞、例えば、幹細胞の集団を単離することを伴い、任意選択的に、細胞を組織培地で増殖させ、細胞内で存在することにより、インビトロで細胞内での通常のＷＡＳｐの産生がもたらされるレンチウイルスベクターを投与する。次に、細胞を対象に戻し、ここで、例えば、細胞は、ＷＡＳｐを産生する赤血球細胞の集団をもたらし得る。
いくつかの例示的かつ非限定的実施形態では、細胞株由来の、または、対象以外の個体由来の細胞であり得る細胞の集団を使用することができる。幹細胞、免疫系細胞などを対象から単離し、当該対象にこれらの細胞を戻す方法は、当該技術分野において周知である。このような方法は、例えば、化学療法を受ける患者において、骨髄移植、末梢血幹細胞移植などのために使用される。
幹細胞が使用される予定の場合、このような細胞は、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）、動員末梢血幹細胞（ｍＰＢＳＣ）などを含む多数の源に由来することができることが理解されよう。特定の実施形態では、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の使用が想倒される。造血幹細胞（ＨＳＣ）を単離し、このような細胞を形質導入して哺乳類対象に導入する方法は、当業者に周知である。
特定の実施形態では、ＷＡＳｐをコードする核酸を、ＷＡＳを有する患者の骨髄幹細胞に導入した後、自己移植を行うことにより、ｍＣｉｔの代わりにＷＡＳｐをコードする核酸を含む、本明細書に記載するレンチウイルスベクター（例えば、図１８～２１を参照されたい。）を、ＷＡＳに対する幹細胞遺伝子療法で使用する。
ベクターの直接導入。
特定の実施形態では、本明細書に記載するベクター（複数可）の直接導入による、対象の直接治療が想倒される。レンチウイルス組成物は、非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、直腸、及び膣内を含むがこれらに限定されない、任意の利用可能な経路による送達のために製剤化することができる。一般に使用される送達経路としては、吸入、非経口、及び経粘膜が挙げられる。
様々な実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、ＬＶを含むことができる。本明細書で使用する場合、言葉「薬学的に許容される担体」としては、薬学的投与において適合性がある溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗カビ剤、等張化剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。補足的活性成分を組成物に組み込むこともできる。
いくつかの実施形態では、活性剤、即ち、本明細書に記載するレンチウイルス、及び／または、ベクターと共に投与可能な他の剤は、化合物が体から急速に取り除かれることを防ぐ担体、例えば、インプラント及びマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む制御放出製剤により調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような組成物の調製方法は、当業者には明白であろう。好適な材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から、商業的に入手することもまた可能である。リポソームもまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者に知られている方法に従い調製することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、特定の細胞型、または、ウイルスにより感染した細胞に対して標的化される。例えば、組成物は、細胞表面マーカー、例えば、内因性マーカーに対するモノクローナル抗体、または、感染した細胞の表面で発現するウイルス性抗原を使用して標的化することができる。
投与を容易にし、用量を均一にするために、単位剤形で組成物を製剤化するのが有利である。本明細書で使用される単位剤形は、対象を治療するための単位の投薬（ｕｎｉｔａｒｙ ｄｏｓａｇｅｓｓ）として適した、物理的に別々の単位を指し、各単位は、医薬担体に関連して所望の治療効果をもたらすように算出された、既定量のＬＶを含む。
単位用量は、単回注射として投与される必要はないものの、一連の時間にまたがる連続注入を含むことができる。本明細書に記載するＬＶの単位用量は、便利には、ＨｅＬａまたは２９３などの細胞株でベクターを滴定することで定義される、レンチベクターの形質導入単位（Ｔ．Ｕ．）の観点で記載するができる。特定の実施形態では、単位用量は、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３Ｔ．Ｕ．またはそれ以上の範囲であることができる。
医薬組成物は、様々な間隔で、及び、必要に応じて、異なる期間にわたり、例えば、約１～約１０週間；約２～約８週間；約３～約７週間；約４週間、約５週間、約６週間などで、１週間当たり１回、投与することができる。治療用組成物を無期限にわたり投与する必要がある場合がある。当業者は、病気または疾患の重症度、以前の治療、総体的な健康及び／または対象の年齢、ならびに存在する他の病気を含むがこれらに限定されない特定の因子が、対象を効果的に治療するのに必要な用量及びタイミングに影響を与え得ることを理解するであろう。ＬＶを有する対象の治療は、１回の治療を含むことができ、または、多くの場合において、一連の治療を含むことができる。
遺伝子療法ベクターを投与するための、例示的かつ非限定的な用量、及び、好適な用量を決定する方法は、当技術分野において既知である。ＬＶの適切な用量は、特定のレシピエント、及び投与方法に左右され得ることがさらに理解されている。任意の特定の対象に対する適切な用量レベルは、対象の年齢、体重、総体的な健康、性別、及び食事、投与時期、投与経路、排泄速度、投与される他の治療剤などを含む様々な因子に応じて変化し得る。
特定の実施形態では、本明細書に記載するレンチウイルス遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与、または、定位注射により、対象に送達することができる（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３０５４を参照されたい）。特定の実施形態では、ベクターは経口または吸入により送達可能であり、ベクターの分解を保護し、組織または細胞への取り込みを向上させるといったように、封入または別の方法で操作されることができる。医薬調製物は、許容される希釈剤にＬＶを含むことができるか、または、ＬＶが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、またはさらに、ベクターが、組み換え細胞からインタクトに作製可能な場合、本明細書に記載するレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターに対する場合におけるように、医薬調製物は、ベクターを作製する１つ以上の細胞を含むことができる。本明細書に記載するＬＶを含む医薬組成物を、任意選択的に、投与のための取扱説明書と共に、容器パックまたはディスペンサーに含めることができる。
前述の組成物、方法、及び使用は例示的なものであり、非限定的であることが意図される。本明細書で提供する教示を使用すると、組成物、方法、及び使用の他のバリエーションが、当業者には速やかに入手可能となるであろう。
実施例１
ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）の治療のためのレンチウイルスベクターの開発
後述する実験の目的は、ウィスコットアルドリッチ症候群を治療するための、ネイティブＷＡＳ遺伝子の内因性制御エレメントにより駆動される新規のレンチウイルスベクターを開発することであった。具体的には、巨核球で、現在のＷＡＳ１．６レンチウイルスベクターよりも高い発現を有し、結果的に、ＷＡＳ患者中で、通常のレベルまで血小板の数を回復することができるベクターを開発することが望まれた。加えて、他の全ての造血細胞株において、少なくとも同様の発現度合いを維持し、Ｔ、Ｂ及びＮＫ細胞の数、及び機能を回復することが望まれた。
（一般に利用可能なデータベース：Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｅｎｃｏｄｅ、Ｅｎｓｅｍｎｂｌ、ＦＡＮＴＯＭ、ＶＩＳＴＡ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｂｒｏｗｓｅｒ、ＧｅｎｅＨａｎｃｅｒを使用する）バイオインフォマティクス分析を利用して、ネイティブＷＡＳ遺伝子の内因性制御エレメントを明らかにした。
ＷＡＳ１．６ベクターは、転写開始部位のすぐに上流にある、１６００ｂｐのプロモーター断片により駆動される。我々は、本断片内でそれぞれ、サイズが４１７ｂｐ及び１９０ｂｐである２つの制御エレメント「ＨＳ１」及び「ＨＳ２」を識別した。したがって、我々は、１６３３ｂｐ断片で、１０２６ｐの不活性な配列を識別し、これを取り除くことで、プロモーターのサイズを低下させることができた。
１．６ｋｂのプロモーターは、巨核球中で野生型レベルの発現を駆動するには不十分であり、結果として、患者は微小血小板減少症を維持したままであることを記しておく。この観点から、追加の内因性エンハンサーエレメントが、巨核球における、野生型レベルのＷＡＳの発現を駆動するために必要であるという仮説を立てた。
ＷＡＳ遺伝子の近位分析により、巨核球ＤＮａｓｅＩ ＨＳ部位を含有し、エンハンサーとして機能して巨核球での発現を加速させる、新規のエンハンサーエレメント「ＨＳ４」及び「ＨＳ３」を識別した。これらの領域とレポーター遺伝子との様々な組み合わせを含有する、一連のレンチウイルスベクター（ＬＶ）を作製し、これらの制御エレメントの活性を評価した（例えば、図１Ａを参照されたい）。さらに、ヒトゲノムにて最も強力なエンハンサーのうちの１つであることが提示されている、Ｅ３エレメント（Ｔｈｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ，４８９：７５－８２）は、巨核球高感受性を有する。したがって、ベクターもまた構築して、本文脈においてＥ３エンハンサー活性を評価した（例えば、図１Ｂを参照されたい）。
新しく識別されたエンハンサーエレメントのいずれかが、巨核球リネージにて発現を増加させるか否かを測定するために、ＭＥＧ－０１細胞（巨核球細胞株）にＷＡＳベクターを形質導入した。細胞を１４日間培養し、発現（ｍＣｉｔｒｉｎｅ）及びＶＣＮ分析のためにフローサイトメトリーを行った。
図２に示すように、ＨＳ１の最小プロモーター（４１７ｂｐ）は、巨核球における１．６ｋｂのベクターの発現の、主たる駆動因子のようである。加えて、ＨＳ２は、巨核球細胞株内では不活性のようであるが、このエレメントは、他のリネージにおいてはエンハンサー活性を有し得る。ＨＳ３は、巨核球細胞株内での発現において、大きな加速を与えるようであり、ＨＳ４もまた、巨核球細胞株内での発現に加速を与えるようである。ＨＳ３とＨＳ４を組み合わせると効果があり、Ｅ３は、巨核球でもまた活性である、強力な非リネージ特異的エンハンサーである。
臨床用の１．６ｋｂベクターは、巨核球を除く全ての造血細胞株において、治癒効果のあるレベルで発現することが示されている（患者はもはや免疫不全ではないが、依然として血小板減少症である）。示すように、ＨＳ２－ＨＳ１は、ＷＡＳ１．６が有する調節領域全てを（１．０ｋｂの配列を節約しながら）含有しているため、例示的なスリム版のＷＡＳ１．６は、ＨＳ２－ＨＳ１であり、これは、ベクター主鎖として使用可能であることを示唆している。新規のＨＳ３及びＨＳ４断片は、巨核球における発現を加速することが示されており、このために、ＨＳ４－ＨＳ３－ＨＳ２－ＨＳ１は、造血細胞リネージ全てにおいて、治療レベルの発現を提供することができる。例示的な好適なベクターの１つ（ＨＳ４－ＨＳ３－ＨＳ２－ＨＳ１）は、ＷＡＳ１．６よりも１５５ｂｐ大きいだけであるが、巨核球において、約２倍高い発現を有することが示された。
しかし、ＨＳ２－ＨＳ１ｐｒｏが、他の細胞リネージ（Ｔ細胞及びＢ細胞）においても、ＷＡＳ１．６と同じように機能するか否かは、まだ測定されていない。加えて、ＨＳ３及びＨＳ４が、他の造血細胞リネージにおいてさらに発現を加速させるか否か、及び、ＨＳ２エンハンサーエレメントが必要であるか否かを測定したいという思いがあった。これに関しては、ＨＳ２エンハンサーは、他の細胞型においてエンハンサー機能を有し得るか、または完全に不活性であり得ると、我々は認識した。加えて、我々は、ＨＳ１ｐｒｏがＷＡＳ１．６と同じように機能するのか否か、及び、ＨＳ４及びＨＳ３をＨＳ２－ＨＳ１に添加することで、他の細胞型における発現に負の影響を及ぼすのか否かを測定したいと考えていた。
これらの問いに取り組むために、ＷＡＳベクターをＪｕｒｋａｔ（Ｔ細胞株）及びＲＡＭＯｓ（Ｂ細胞株）に形質導入した。細胞を１４日間培養し、フローサイトメトリー及びＶＣＮによって発現を分析した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞でのＷＡＳベクターの発現レベルを図３に示し、ＲＡＭＯｓ細胞での発現レベルを図４に示す。これらの図により示されるように、露出した最小プロモーターＨＳ１ｐｒｏ（配列番号１）は、全ての細胞株試（ＭＥＧ－０１、ＣＭＫ、Ｊｕｒｋａｔ及びＲＡＭＯｓ）におけるＷＡＳ１．６と同じように機能する。ＨＳ２エンハンサーは、それ自体が、比較的不活性（１９０ｂｐ）のようである。不活性の１ｋｂ配列、及び１９０ｂｐのＨＳ２配列を取り除くことで、約１．２ｋｂの配列を節約することができる。
ＨＳ３エンハンサーは、巨核球細胞株における発現を増加させるようであるが、Ｂ細胞及びＴ細胞では不活性である。ＨＳ４エンハンサーは、巨核球及びＢ細胞における発現を増加させるようであるが、Ｔ細胞では不活性である。Ｅ３エンハンサーは、巨核球における発現を増加させるようであるが、Ｂ及びＴ細胞（非内因性エレメント）では不活性である。
これらの発見の見地からは、好適なＷＡＳベクターは、ＨＳ４－ＨＳ３－ＨＳ２－ＨＳ１ｐｒｏを含む。このベクターは、唯一ＷＡＳ１．６より２００ｂｐ大きいが、巨核球及びＢ細胞において、ＷＡＳ１．６よりも高い発現、ならびに、Ｔ細胞においては、ＷＡＳ１．６と比較して同様の発現度合いをもたらす。
ＷＡＳ座位の再分析を徹底的に進め、ＷＡＳ遺伝子の上流８５０ｋｂ、及び下流２５０ｋｂにまたがる、１１０万個の塩基対ウィンドウの中に含有される、１３個の推定の内因性エンハンサーエレメントを識別した。エレメントのうちの３つは、ＷＡＳ座位の、我々の近位バイオインフォマティクス分析にて、以前に識別されていた。ＷＡＳ遺伝子を制御する、決定的なエンハンサーエレメントを実験で識別するために、推定の各エンハンサーエレメントを、内因性の最小ＷＡＳプロモーター（ＨＳ１ｐｒｏ）の上流でクローニングし、ｍＣｉｔｒｉｎｅの発現を駆動した（図５Ａを参照されたい）。これらのベクターの発現を、以前の対照で使用し、血小板の数を通常のレベルまで回復することができた、γレトロウイルスベクター（ＣＭＭＰ－ｍＣｉｔ、図５Ｂを参照されたい。）と比較した。
細胞にベクターを形質導入し、１４日間培養して、発現をフローサイトメトリー及びＶＣＮで再分析した。図６は、ＭＥＧ－０１（巨核芽球細胞株）に対するデータを示し、図７は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞株）に対するデータを示し、図８は、結果またはＲＡＭＯｓ細胞（Ｂ細胞株）を示す。これらの図に示すように、新たに識別した１０個のエンハンサーエレメント全てが、ＷＡＳ１．６ベクター、及び、我々の以前のレンチウイルスベクター（ＨＳ４、３、２、１）よりも高いレベルで、ＭＥＧ－０１細胞（巨核芽球細胞株）における発現を増加させる。エレメント１、３、７、８、及び９は、それぞれ独立して、以前の臨床γレトロウイルスＣＭＭＰ－ｍＣｉｔベクターよりも高く、発現を駆動する。ベクターは全て、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞株）では、γレトロウイルスベクターよりも高く、及び、ＷＡＳ１．６と同様のレベルで発現し、ベクターは全て、ＲＡＭＯＳ（Ｂ細胞株）では、γレトロウイルスベクターよりも高く、及び、ＷＡＳ１．６と同様のレベルで発現する。加えて、エレメント２は、ＷＡＳ１．６及びＣＭＭＰ－ｍＣｉｔと比較して、２倍の高さで発現を増加させる。
１０個のエレメントを、巨核球及び血小板に分化した臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋ＨＳＰＣで再びスクリーニングし、細胞株からの結果を確認した。図９～１１は、それぞれ、プロ巨核球、巨核球、及び血小板における、ＷＡＳベクターの発現レベルを示す。これらの図に示すように、ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球からのデータは、ＭＥＧ－０１細胞（巨核芽球細胞株）からのデータとは異なる。具体的には、エンハンサーエレメント２のみが、ＣＢ ＣＤ３４＋巨核球における発現を加速させるようである。本構築物は、ＷＡＳ１．６よりも２倍高く発現するものの、γレトロウイルス構築物と比較すると、発現は低い。
提示される１つの誘導ベクトルは、ＸＸＸ－ＨＳ２－ＨＳ１－ＷＡＳｐ－ＷＰＲＥを含むはずであり、式中、ＸＸＸは、付加可能な追加のエンハンサーエレメントを表す。ＨＳ２－ＨＳ１構成成分は、ＷＡＳ１．６プロモーター内に２つの機能的エレメントを含み、式中、ＨＳ１がメインの駆動因子であり、ＨＳ２は余分な１９０ｂｐを提供する。これらのエレメント、及びエンハンサーエレメント１～１０を含む様々な構築物を構築し、プロ巨核球（図１２）、巨核球（図１３）、及び血小板（図１４）で評価した。
最適なベクターは、エンハンサー領域ＨＳ３、Ｅ２、Ｅ９、及びＥ１０のうちの１つ以上の、様々な構成成分を含むことができることが測定された。ＨＳ３は５３１ｂｐであり、Ｅ２は３６７８ｂｐであり、Ｅ９は５５５ｂｐであり、Ｅ１０は４５５ｂｐであることが確認できた。特に、エンハンサー領域Ｅ２の長さの観点から、これらの領域のより小さい効果的な断片を同定するのが望ましかった。エンハンサーエレメント２（ＷＡＳの下流２６０ｋｂ）を分析することで、約３．７ｋｂ前後の５つの断片を含有することが発見された。５つのＥ２断片、即ち、Ｅ２－１（コアサブエレメント１の最初の半分＋コアサブエレメント１の２つ目の半分、例えば、それぞれ、表１、配列番号３及び４を参照されたい。）、Ｅ２－２（例えば、表１、配列番号５を参照されたい。）、Ｅ２－３（例えば、表１、配列番号６を参照されたい。）、Ｅ２－４（例えば、表１、配列番号７を参照されたい。）、ならびに、Ｅ２－５（例えば、表１、配列番号８を参照されたい。）を、５つの異なるベクターにクローニングし、最も活性なＥ２の断片を、ベクターに含めるように識別可能とした。プロ巨核球（図１５）、巨核球（図１６）、及び血小板（図１７）におけるこれらのベクターの発現を測定した。図１５～１７に示すように、Ｅ２のいずれのエレメントも、発現の主要駆動因子ではないようであった。Ｅ２のサブエレメント２及び３は、単独で試験したときに、発現になんら影響を及ぼさないようである。Ｅ２は巨核球発現の駆動因子であるが、縮小可能であるのが望ましい。このエンハンサーは、血小板中でＷＡＳ１．６よりも３倍高い発現を、及び、巨核球中でＷＡＳ１．６よりも１．６倍高い発現をもたらす。しかし、Ｅ２エンハンサーは、γレトロウイルスベクターと比較して発現が低い。一方で、ＷＡＳ１．６と比較しての増加は、血小板の数を正常なレベルまで増加させるのに十分であり得る。エレメント１、２、３、７、８、及び９は、それぞれ独立して、ＭＥＧ－０１細胞における、以前の臨床γレトロウイルスＣＭＭＰ－ｍＣｉｔベクターよりも高い発現を駆動する一方で、ＣＢ ＣＤ３４＋巨核球中ではＣＭＭＰ－ｍＣｉｔと比較して発現が低くなるため、ＣＢ ＣＤ３４＋分化巨核球と巨核球細胞株（ＭＥＧ－０１細胞）との間には、エンハンサーエレメントの発現の矛盾が存在する。
これらの観察を鑑みると、ある特定の好適なベクターとしては、
１）Ｅ２（全てスリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（５．６ｋｂ）；
２）Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２（全てスリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（６．１ｋｂ）；
３）Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２の１，４，５（スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（５．６ｋｂ）；ならびに
４）Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２の１（スリム）の最初の半分及び５（スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（５．０ｋｂ）
が挙げられるが、これらに限定されない。
上記のサイズは、オープンリーディングフレームにおけるｍＣｉｔレポーターと一致する。サイズは、オープンリーディングフレーム内でＷＡＳＰをコードする核酸とは異なる。
上記ベクター（３）は、エンハンサーエレメント２内のサブエレメント２及び３を取り除いている一方で、上記ベクター（４）は、エンハンサーエレメント２のサブエレメント１の２つ目の半分、ならびにサブエレメント２、３、及び４を取り除いていることに注意されたい。
臨床的用途のために（例えば、ＷＡＳを治療するために）、ｍＣｉｔｒｉｎｅオープンリーディングフレームが、ＷＡＳｐタンパク質をコードする核酸で置き換えられることもまた理解されよう。例示的な核酸としては、ＷＡＳ ｃＤＮＡ、及び、コドン最適化ＷＡＳ核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
実施例２
リード候補ベクターの識別
上記実施例１は、４つのリード候補ベクター：１）Ｅ２（全てスリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＲＰＥ；２）Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２（全てスリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＲＰＥ；３）Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２の１，４，５（スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＲＰＥ；ならびに、４）Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２の１（スリム）の最初の半分及び５（スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＲＰＥの生成について記載した。
本実施例は、ＣＢ ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣ分化巨核球及び血小板において、これらのベクターをスクリーニングし、リード候補ベクターを決定することについて記載する。加えて、ＷＡＳｐのコドン最適化により、ｍＣｉｔｒｉｎｅのオープンリーディングフレームをＷＡＳｐで置き換え、実際の治療用タンパク質を発現させることを評価した。ＷＡＳ患者Ｔ及びＢ細胞株におけるＷＡＳｐ発現の修正もまた実証した。
リード候補ベクターを測定するために、健常なドナー（ＨＤ）臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＰＳＣ）から分化した巨核球及び血小板において、４つの候補ベクターをスクリーニングした。Ｅ２、Ｅ９、及びＨＳ３エレメントの改変境界及び断片を含有する単一のエレメントもまた含め、リード候補を作製するために使用した改変（サイズが小さいエレメント）が依然として、親エレメントの発現を保持するか否かを測定した。ＷＡＳ１．６（臨床試験を受けている現在のＷＡＳベクター）、及び、以前に使用したγレトロウイルスベクターもまた、発現を比較するために含める。
図２２に示すように、Ｅ９、ＨＳ３、及びＥ２の改変「スリム」版は、より大型の親エレメントの発現を維持する。加えて、１つのリード候補ベクターである、Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２の１，４，５（スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＲＰＥは、γレトロウイルスベクターと比較して同様の発現度合い、及び、ＣＢ ＣＤ３４＋ ＨＳＰＣ分化巨核球におけるＷＡＳ１．６よりも１．８倍高い発現を有する（図２２）。
Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２の１，４，５（スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＲＰＥが、γレトロウイルスベクターと同様に、及び、ＷＡＳ１．６よりも１．５倍高く発現する（例えば、図２３を参照されたい。）ため、ＣＢ ＣＤ３４＋分化血小板において、同様の結果が見られた。
これらのデータを考慮すると、１つのリード候補ベクターは、Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２の１，４，５（スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（ＷａｓＶｅｃ）であり、これは、
１）ＣＢ ＣＤ３４＋巨核球において、γレトロと等しく／またはこれよりも高く発現し、
２）ＷＡＳ１．６よりも１．８倍高く発現し、
オープンリーディングフレームで５．６ｋｂのｗ／ｍＣｉｔｒｉｎｅであり；
オープンリーディングフレームで６．４ｋｂのｗ／ＷＡＳｐである；
３）「血小板」においてＷＡＳ１．６よりも１．５倍発現する。
ＷＡＳｐの理想的なコドン最適化配列をスクリーニングして、発現をさらに改善するために、ＷＡＳ患者由来のＴ及びＢ細胞株を不死化して、細胞株を使用し、ＷＡＳＶｅｃ－（Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２の１，４，５（スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ＷＡＳｐ－ＷＰＲＥ）におけるＷＡＳｐオープンリーディングフレームの、異なるコドン最適化版をスクリーニングした。
ＷＡＳ Ｂ細胞及びＴ細胞株に、それぞれが、以下のとおり：
ｃＤＮＡ（対照としての未改変の、ネイティブｃＤＮＡ配列）；
ｊＣＡＴコドン最適化；
ＧｅｎｅＡｒｔコドン最適化；ＩＤＴコドン最適化；及び
ベンチリングコドン最適化の、ＷＡＳｐオープンリーディングフレーム
の異なるコドン最適化版をコードする、ＷＡＳＶｅｃの異なるバージョンを形質導入した。
図２４及び２５に示すように、ＷＡＳＶｅｃにおけるＷＡＳＰのｊＣＡＴコドン最適化は、それぞれ、非コドン最適化ネイティブｃＤＮＡと比較して、Ｂ細胞（図２４）及びＴ細胞（図２５）において、１．２９倍、及び１．４８倍の発現の増加をもたらした。ＧｅｎｅＡｒｔコドン最適化は、ネイティブｃＤＮＡと比較して、それぞれ、Ｂ及びＴ細胞において、１．１３倍、及び１．２０倍の発現の増加をもたらした一方で、ＩＤＴ及びベンチリングコドン最適化は、Ｂ細胞及びＴ細胞において発現の低下をもたらしたこともまた、図２４及び２５は示す。コドン最適化のいずれもが、力価に著しい影響を及ぼさないようである。加えて、ＣＡＴＧｅｎｅＡｒｔは、力価をわずかに増加させる可能性がある（図２６）。
これらの観察を考慮すると、１つのリード候補ベクターは、Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２（１，４，５スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ＷＡＳＰ（ｊＣＡＴコドン最適化）－ＷＰＲＥ、即ち、ＷＡＳＶｅｃである。本ベクターは、オープンリーディングフレーム内にＷＡＳｐを有し、６．４ｋｂである。
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、単に例示目的のためのものであること、ならびに、それらに照らした種々の修正または変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであると理解される。本明細書で引用された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
配列番号１ ＨＳ１ｐｒｏ（ＷＡＳ遺伝子の最小内因性プロモーター）
TCAGCCTCAGGCTACCTAGGTGCTTTAGAAAGGAGGCCACCCAGGCCCATGACTACTCCTTGCCACAGGGAGCCCTGCACACAGATGTGCTAAGCTCTCGCTGCCAGCCAGAGGGAGGAGGGTCTGAGCCAGTCAGAAGGAGATGGGCCCCAGAGAGTAAGAAAGGGGGAGGAGGACCCAAGCTGATCCAAAAGGTGGGTCTAAGCAGTCAAGTGGAGGAGGGTTCCAATCTGATGGCGGAGGGCCCAAGCTCAGCCTAACGAGGAGGCCAGGCCCACCAAGGGGCCCCTGGAGGACTTGTTTCCCTTGTCCCTTGTGGTTTTTTGCATTTCCTGTTCCCTTGCTGCTCATTGCGGAAGTTCCTCTTCTTACCCTGCACCCAGAGCCTCGCCAGAGAAGACAAGGGCAGAAAGCACC
配列番号２ エンハンサーエレメント２（スリム）
GACCTGAAGGGTAAGGGGGTGTGGAGGTTGTGAAGGCGGGAAGGGGGGTAGCCCCTTCACCAATGTAAACAAGGATGTGGGTTCTGCGGCCACACTCTCCCCCGCCCTCCCCAGCGGCATTTCCAGCAAGTCACATGTCCTGCGCACAGGCTGGGGGCCCCCTGCTGCTGCCTTTCTTAGAAGCCAGGACCACAGAGCCCGCACAGTGAGCTACTTGGGGAGCTATTTCTGTAGACTGAGCTTGGGGTACTGGGAGGCAGTGCTGTTGGCGATCTGGGGGAAAACCCCCTGAGGGTCCCATTTCTCTGCCACTGACCCCTTTGCCTGGCAGAAAGGCTCTGCTGCCTCCTAGCTGTGTAGCAATGGATAAGGCCTTTAACCTCTCTAAGCTGAAATGTCCTCATGCATAAGGTGGAGACAGTAACTCCTCTTCCATCTGCTGGGTGTTGTCAAAACTACACAGGAGGTTTGCCAAGCACCTAAGGCACAGTAGGTGGTCAAGAAACAGGAACACAATTTGTCATGACGACAATGATTCCTTCATATGCTAGTTACCCACGAGTCAGCCAGAATGTTGCCATAACCACTTATGAAGCCCTTCCTCATTTCTGTTGCAATTCCTCAGCCAGAGGAAAGCCCCACCACCTCTGTCCTCCAGAAAGCCCTCCTCTTCCCAGAAGGCTGGCACACAGGGCTGGGGGCCAGGCTTGACTTCCCTGTGGAGGGGTCTGAGGTTGGGGGGATGACCTGCAGAGGTAGGGGAATTCAGAGAACTTGTTTTGATAGAAACTGAAACTCCTCCTCTTGCTGACGCTGCACTTGTGGGCAATCTGCACCTGTTCTCCCCTCCCAGAGGCCAGCTGGAAGGGGGTCCCCCACCATTCTACCTCTGTTCCCATCTCAAACAGGGCTCAGAAATCCTCAGAGAGCCTGGATTATCTTCCTATAGGGTCCTACCATTTGCTTTAGAGACATCTGAGAACTGCCTACTCCCCAGGTAGCTGCCTGCCTCCCAGAAGAGCCACAGCAAGTTCCGCTAAGGGCAAAAAAGGAAGCTAGGTGTCTACAGGGAACCTAAAAACAAACCACACTAACGTGTGTACACACAGCTGCAGAGGGAGACAGGGACCTGGTCTGCTCACAGCCCTTGCCACTCCCCCATGGCCCATGTAGAAACAACCATGTGGCCTTCACTCTGCCCACAGAAGCTAGCACCAGGACCCTGGTCAGGGTTAGAGGTTTCTGCTGAGTCAAAGCCACATGGAGGGAGGGAGCAAGGGAGAGATGCAGAGTCATGTTTCCAGGAGGAGGTTATCTGAGCATAACAGGGACAGGGTGGGCCACAGGATACCTCTGAGGCTCAGGTTCCCACCTCCACTCCACCCTCCAACTCTCTGCTCCACGTTCCTTCCACTATTCAACACATGGCAGGAAGTCAGCCTGTAGGGCTTCACACTACAGTCTAAGCTGACTGCCATCTGTCCCCATCCAGGCGAGGCTGGAAACGGGGGCAGCAAAAAGCCCAGGGACAAAGTCCCCTTCCCAGGCACATGTATTATGCACTCTGCACCAAGGAAACCTCCAGATAAGGTCTAGAGACCAAGGGCCATGTACTTCGGGGGAGAGGCCAGAGGACTTCTGAGGTTTTACAGAGAAAAGCCAAAGGCAGCCCAGTCAGGGGAAATGTGTAGCCATAGTGCCGATAAGGAAAGGCCTTCAACCTGCCCTGGTCAGCTCTTCCTGTAAGTAGAGGCCCCTTACCGAAGGCCCCAGTGGGAGGAAGGGTCGGGAGTA
配列番号３ エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分
GACCTGAAGGGTAAGGGGGTGTGGAGGTTGTGAAGGCGGGAAGGGGGGTAGCCCCTTCACCAATGTAAACAAGGATGTGGGTTCTGCGGCCACACTCTCCCCCGCCCTCCCCAGCGGCATTTCCAGCAAGTCACATGTCCTGCGCACAGGCTGGGGGCCCCCTGCTGCTGCCTTTCTTAGAAGCCAGGACCACAGAGCCCGCACAGTGAGCTACTTGGGGAGCTATTTCTGTAGACTGAGCTTGGGGTACTGGGAGGCAGTGCTGTTGGC
配列番号４ エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の２つ目の半分GATCTGGGGGAAAACCCCCTGAGGGTCCCATTTCTCTGCCACTGACCCCTTTGCCTGGCAGAAAGGCTCTGCTGCCTCCTAGCTGTGTAGCAATGGATAAGGCCTTTAACCTCTCTAAGCTGAAATGTCCTCATGCATAAGGTGGAGACAGTAACTCCTCTTCCATCTGCTGGGTGTTGTCAAAACTACACAGGAGGTTTGCCAAGCACCTAAGGCACAGTAGGTGGTCAAGAAACAGGAACACAATTTGTCATGACGACAATGATTCCTTCATATGCTAGTTACCCACGAGTCAGCCAGAATGTTGCCATAACCACTTATGAAGCCCTTCCTCATTTCTGTTGCAATTCCTCAGCCAGAGGAAAGCCCCA
配列番号５ エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント２
CCACCTCTGTCCTCCAGAAAGCCCTCCTCTTCCCAGAAGGCTGGCACACAGGGCTGGGGGCCAGGCTTGACTTCCCTGTGGAGGGGTCTGAGGTTGGGGGGATGACCTGCAGAGGTAGGGGAATTCAGAGAACTTGTTTTGATAGAAACTGAAACTCCTCCTCTTGCTGACGCTGCACTTGTGGGCAATCTGCACCTGTTCTCCCCTCCCAGAGGCCAGCTGGAAGGGGGTCCCCCACCATTCTACCTCTGTTCCCATCTCAAACAGGGCTCAGAAATCCTCA
配列番号６ エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント３
GAGAGCCTGGATTATCTTCCTATAGGGTCCTACCATTTGCTTTAGAGACATCTGAGAACTGCCTACTCCCCAGGTAGCTGCCTGCCTCCCAGAAGAGCCACAGCAAGTTCCGCTAAGGGCAAAAAAGGAAGCTAGGTGTCTACAGGGAACCTAAAAACAAACCACACTAACGTGTGTACACACAGCTGCAGAGGGAGACAGGGACCTGGTCTGCT
配列番号７ エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４
CACAGCCCTTGCCACTCCCCCATGGCCCATGTAGAAACAACCATGTGGCCTTCACTCTGCCCACAGAAGCTAGCACCAGGACCCTGGTCAGGGTTAGAGGTTTCTGCTGAGTCAAAGCCACATGGAGGGAGGGAGCAAGGGAGAGATGCAGAGTCATGTTTCCAGGAGGAGGTTATCTGAGCATAACAGGGACAGGGTGGGCCACAGGATACCTCTGAGGCTCAGGTTCCCACCTCCACTCCACC
配列番号８ エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５
CTCCAACTCTCTGCTCCACGTTCCTTCCACTATTCAACACATGGCAGGAAGTCAGCCTGTAGGGCTTCACACTACAGTCTAAGCTGACTGCCATCTGTCCCCATCCAGGCGAGGCTGGAAACGGGGGCAGCAAAAAGCCCAGGGACAAAGTCCCCTTCCCAGGCACATGTATTATGCACTCTGCACCAAGGAAACCTCCAGATAAGGTCTAGAGACCAAGGGCCATGTACTTCGGGGGAGAGGCCAGAGGACTTCTGAGGTTTTACAGAGAAAAGCCAAAGGCAGCCCAGTCAGGGGAAATGTGTAGCCATAGTGCCGATAAGGAAAGGCCTTCAACCTGCCCTGGTCAGCTCTTCCTGTAAGTAGAGGCCCCTTACCGAAGGCCCCAGTGGGAGGAAGGGTCGGGAGTA
配列番号９ エンハンサーエレメントＨＳ３（完全）
Figure 2022554412000008
 配列番号１０ エンハンサーエレメントＨＳ３コア
CTAAAAGCCACCAAAACCAAGACAGCAATGAAAGTAACCTCTGGTCTTCCTAACTGCTCATTATACACTAATTATGATGCACTAGCATGCTAAGAGACACTTCCACCAGCGCCATGACAGTGCCATGGCAACATCAAGAAGTCACCCCACATGGTCTAAAAAGGGGAAGAACCTTCAGTTCCCGGAATTGCCCACCCCTTTCCTGGAAAACTCATGAATAATCCACCCCTTGTTTAGCATATAAT
配列番号１１ エンハンサーエレメントＥ９（完全）
GGGATCTGTGTGCAGATTTACCTCTACCTACACCTGGCTGGGGATCATAAAGAAAATCAAGGGATGCGCTACCTCCATGAATCCAGGTTTCAGCAGAGCTAAGGGAGTGAAATTTGGGGCCATTTTACTTGTCTCAAACCTTGTTATCTGAGAGAAAGCTAGAGCTTCCTTCTTTCAGCCCCCAGAGACAATGTGGCCAGGCTCCGGAGGGCTGGGAAGATGAGCAATGCTTGTGAGTCACCATGATAGGAAGCAGAAGGGTCAGGAAGTCCCTGGGAGCAAGGCTTAGGGTTAGGGTTAGGGAGAAAACACTTGGGCCTGGAGGCTCGGGGCAGGCTTCCTAGAGGGGAGGGGTAGGAAGAGGCAGTGACAGGGCCCACAGCAATGGAGAGGAGTTGGACTGCAGGGATGGGGTAGGGGGACAGACGACAAGGGACACTCAGAAGACTAATGTCTGGGAGTGGGAAAACAGTGTTTGCTCAGCCAGGAAGCTGCATCCAGCTCTTTTATCATTTGTAGAAGACCAAGTACCCAGGCCTGGGAGGAGCCCAGAGA
配列番号１２ エンハンサーエレメントＥ９コア
CAAACCTTGTTATCTGAGAGAAAGCTAGAGCTTCCTTCTTTCAGCCCCCAGAGACAATGTGGCCAGGCTCCGGAGGGCTGGGAAGATGAGCAATGCTTGTGAGTCACCATGATAGGAAGCAGAAGGGTCAGGAAGTCCCTGGGAGCAAGGCTTAGGGTTAGGGTTAGGGAGAAAACACTTGGGCCTGGAGGCTCGGGGCAGGCTTCCTAGAGGGGAGGGGTA
配列番号１３ ＷＡＳ ｃＤＮＡ
atgagtgggggcccaatgggaggaaggcccgggggccgaggagcaccagcggttcagcagaacataccctccaccctcctccaggaccacgagaaccagcgactctttgagatgcttggacgaaaatgcttgacgctggccactgcagttgttcagctgtacctggcgctgccccctggagctgagcactggaccaaggagcattgtggggctgtgtgcttcgtgaaggataacccccagaagtcctacttcatccgcctttacggccttcaggctggtcggctgctctgggaacaggagctgtactcacagcttgtctactccacccccacccccttcttccacaccttcgctggagatgactgccaagcggggctgaactttgcagacgaggacgaggcccaggccttccgggccctcgtgcaggagaagatacaaaaaaggaatcagaggcaaagtggagacagacgccagctacccccaccaccaacaccagccaatgaagagagaagaggagggctcccacccctgcccctgcatccaggtggagaccaaggaggccctccagtgggtccgctctccctggggctggcgacagtggacatccagaaccctgacatcacgagttcacgataccgtgggctcccagcacctggacctagcccagctgataagaaacgctcagggaagaagaagatcagcaaagctgatattggtgcacccagtggattcaagcatgtcagccacgtggggtgggacccccagaatggatttgacgtgaacaacctcgacccagatctgcggagtctgttctccagggcaggaatcagcgaggcccagctcaccgacgccgagacctctaaacttatctacgacttcattgaggaccagggtgggctggaggctgtgcggcaggagatgaggcgccaggagccacttccgccgcccccaccgccatctcgaggagggaaccagctcccccggccccctattgtggggggtaacaagggtcgttctggtccactgccccctgtacctttggggattgccccacccccaccaacaccccggggacccccacccccaggccgagggggccctccaccaccaccccctccagctactggacgttctggaccactgccccctccaccccctggagctggtgggccacccatgccaccaccaccgccaccaccgccaccgccgcccagctccgggaatggaccagcccctcccccactccctcctgctctggtgcctgccgggggcctggcccctggtgggggtcggggagcgcttttggatcaaatccggcagggaattcagctgaacaagacccctggggccccagagagctcagcgctgcagccaccacctcagagctcagagggactggtgggggccctgatgcacgtgatgcagaagagaagcagagccatccactcctccgacgaaggggaggaccaggctggcgatgaagatgaagatgatgaatgggatgactga
配列番号１４ コドン最適化ＷＡＳ
ATGAGCGGCGGCCCCATGGGCGGCCGCCCCGGCGGCCGCGGCGCCCCCGCCGTGCAGCAGAACATCCCCAGCACCCTGCTGCAGGACCACGAGAACCAGCGCCTGTTCGAGATGCTGGGCCGCAAGTGCCTGACCCTGGCCACCGCCGTGGTGCAGCTGTACCTGGCCCTGCCCCCCGGCGCCGAGCACTGGACCAAGGAGCACTGCGGCGCCGTGTGCTTCGTGAAGGACAACCCCCAGAAGAGCTACTTCATCCGCCTGTACGGCCTGCAGGCCGGCCGCCTGCTGTGGGAGCAGGAGCTGTACAGCCAGCTGGTGTACAGCACCCCCACCCCCTTCTTCCACACCTTCGCCGGCGACGACTGCCAGGCCGGCCTGAACTTCGCCGACGAGGACGAGGCCCAGGCCTTCCGCGCCCTGGTGCAGGAGAAGATCCAGAAGCGCAACCAGCGCCAGAGCGGCGACCGCCGCCAGCTGCCCCCCCCCCCCACCCCCGCCAACGAGGAGCGCCGCGGCGGCCTGCCCCCCCTGCCCCTGCACCCCGGCGGCGACCAGGGCGGCCCCCCCGTGGGCCCCCTGAGCCTGGGCCTGGCCACCGTGGACATCCAGAACCCCGACATCACCAGCAGCCGCTACCGCGGCCTGCCCGCCCCCGGCCCCAGCCCCGCCGACAAGAAGCGCAGCGGCAAGAAGAAGATCAGCAAGGCCGACATCGGCGCCCCCAGCGGCTTCAAGCACGTGAGCCACGTGGGCTGGGACCCCCAGAACGGCTTCGACGTGAACAACCTGGACCCCGACCTGCGCAGCCTGTTCAGCCGCGCCGGCATCAGCGAGGCCCAGCTGACCGACGCCGAGACCAGCAAGCTGATCTACGACTTCATCGAGGACCAGGGCGGCCTGGAGGCCGTGCGCCAGGAGATGCGCCGCCAGGAGCCCCTGCCCCCCCCCCCCCCCCCCAGCCGCGGCGGCAACCAGCTGCCCCGCCCCCCCATCGTGGGCGGCAACAAGGGCCGCAGCGGCCCCCTGCCCCCCGTGCCCCTGGGCATCGCCCCCCCCCCCCCCACCCCCCGCGGCCCCCCCCCCCCCGGCCGCGGCGGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGCCACCGGCCGCAGCGGCCCCCTGCCCCCCCCCCCCCCCGGCGCCGGCGGCCCCCCCATGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCAGCAGCGGCAACGGCCCCGCCCCCCCCCCCCTGCCCCCCGCCCTGGTGCCCGCCGGCGGCCTGGCCCCCGGCGGCGGCCGCGGCGCCCTGCTGGACCAGATCCGCCAGGGCATCCAGCTGAACAAGACCCCCGGCGCCCCCGAGAGCAGCGCCCTGCAGCCCCCCCCCCAGAGCAGCGAGGGCCTGGTGGGCGCCCTGATGCACGTGATGCAGAAGCGCAGCCGCGCCATCCACAGCAGCGACGAGGGCGAGGACCAGGCCGGCGACGAGGACGAGGACGACGAGTGGGACGACTAA
配列番号１５ Ｅ２（全てスリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ
時計回りの、ＣＭＶ由来の配列（図１８において赤矢印）：
AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagGACCTGAAGGGTAAGGGGGTGTGGAGGTTGTGAAGGCGGGAAGGGGGGTAGCCCCTTCACCAATGTAAACAAGGATGTGGGTTCTGCGGCCACACTCTCCCCCGCCCTCCCCAGCGGCATTTCCAGCAAGTCACATGTCCTGCGCACAGGCTGGGGGCCCCCTGCTGCTGCCTTTCTTAGAAGCCAGGACCACAGAGCCCGCACAGTGAGCTACTTGGGGAGCTATTTCTGTAGACTGAGCTTGGGGTACTGGGAGGCAGTGCTGTTGGCGATCTGGGGGAAAACCCCCTGAGGGTCCCATTTCTCTGCCACTGACCCCTTTGCCTGGCAGAAAGGCTCTGCTGCCTCCTAGCTGTGTAGCAATGGATAAGGCCTTTAACCTCTCTAAGCTGAAATGTCCTCATGCATAAGGTGGAGACAGTAACTCCTCTTCCATCTGCTGGGTGTTGTCAAAACTACACAGGAGGTTTGCCAAGCACCTAAGGCACAGTAGGTGGTCAAGAAACAGGAACACAATTTGTCATGACGACAATGATTCCTTCATATGCTAGTTACCCACGAGTCAGCCAGAATGTTGCCATAACCACTTATGAAGCCCTTCCTCATTTCTGTTGCAATTCCTCAGCCAGAGGAAAGCCCCACCACCTCTGTCCTCCAGAAAGCCCTCCTCTTCCCAGAAGGCTGGCACACAGGGCTGGGGGCCAGGCTTGACTTCCCTGTGGAGGGGTCTGAGGTTGGGGGGATGACCTGCAGAGGTAGGGGAATTCAGAGAACTTGTTTTGATAGAAACTGAAACTCCTCCTCTTGCTGACGCTGCACTTGTGGGCAATCTGCACCTGTTCTCCCCTCCCAGAGGCCAGCTGGAAGGGGGTCCCCCACCATTCTACCTCTGTTCCCATCTCAAACAGGGCTCAGAAATCCTCAGAGAGCCTGGATTATCTTCCTATAGGGTCCTACCATTTGCTTTAGAGACATCTGAGAACTGCCTACTCCCCAGGTAGCTGCCTGCCTCCCAGAAGAGCCACAGCAAGTTCCGCTAAGGGCAAAAAAGGAAGCTAGGTGTCTACAGGGAACCTAAAAACAAACCACACTAACGTGTGTACACACAGCTGCAGAGGGAGACAGGGACCTGGTCTGCTCACAGCCCTTGCCACTCCCCCATGGCCCATGTAGAAACAACCATGTGGCCTTCACTCTGCCCACAGAAGCTAGCACCAGGACCCTGGTCAGGGTTAGAGGTTTCTGCTGAGTCAAAGCCACATGGAGGGAGGGAGCAAGGGAGAGATGCAGAGTCATGTTTCCAGGAGGAGGTTATCTGAGCATAACAGGGACAGGGTGGGCCACAGGATACCTCTGAGGCTCAGGTTCCCACCTCCACTCCACCCTCCAACTCTCTGCTCCACGTTCCTTCCACTATTCAACACATGGCAGGAAGTCAGCCTGTAGGGCTTCACACTACAGTCTAAGCTGACTGCCATCTGTCCCCATCCAGGCGAGGCTGGAAACGGGGGCAGCAAAAAGCCCAGGGACAAAGTCCCCTTCCCAGGCACATGTATTATGCACTCTGCACCAAGGAAACCTCCAGATAAGGTCTAGAGACCAAGGGCCATGTACTTCGGGGGAGAGGCCAGAGGACTTCTGAGGTTTTACAGAGAAAAGCCAAAGGCAGCCCAGTCAGGGGAAATGTGTAGCCATAGTGCCGATAAGGAAAGGCCTTCAACCTGCCCTGGTCAGCTCTTCCTGTAAGTAGAGGCCCCTTACCGAAGGCCCCAGTGGGAGGAAGGGTCGGGAGTActcgagTCAGCCTCAGGCTACCTAGGTGCTTTAGAAAGGAGGCCACCCAGGCCCATGACTACTCCTTGCCACAGGGAGCCCTGCACACAGATGTGCTAAGCTCTCGCTGCCAGCCAGAGGGAGGAGGGTCTGAGCCAGTCAGAAGGAGATGGGCCCCAGAGAGTAAGAAAGGGGGAGGAGGACCCAAGCTGATCCAAAAGGTGGGTCTAAGCAGTCAAGTGGAGGAGGGTTCCAATCTGATGGCGGAGGGCCCAAGCTCAGCCTAACGAGGAGGCCAGGCCCACCAAGGGGCCCCTGGAGGACTTGTTTCCCTTGTCCCTTGTGGTTTTTTGCATTTCCTGTTCCCTTGCTGCTCATTGCGGAAGTTCCTCTTCTTACCCTGCACCCAGAGCCTCGCCAGAGAAGACAAGGGCAGAAAGCACCATGgtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcctgatgtgcttcgcccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagctaccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtgactgcaggaattcgagcatcttaccgccatttattcccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattcgagctcggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacctactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagggacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatagcacctagatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgaattattaacgcttacaatttcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaagggaacaaaagctggagctgcaagcttggccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatgg
配列番号１６ Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２（全てスリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（Ｅ９（スリム）及びＨＳ３（スリム）エレメントを添加）
図１９で時計回りの、ＣＭＶ由来の配列（赤い矢印）：
AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagCAAACCTTGTTATCTGAGAGAAAGCTAGAGCTTCCTTCTTTCAGCCCCCAGAGACAATGTGGCCAGGCTCCGGAGGGCTGGGAAGATGAGCAATGCTTGTGAGTCACCATGATAGGAAGCAGAAGGGTCAGGAAGTCCCTGGGAGCAAGGCTTAGGGTTAGGGTTAGGGAGAAAACACTTGGGCCTGGAGGCTCGGGGCAGGCTTCCTAGAGGGGAGGGGTACTAAAAGCCACCAAAACCAAGACAGCAATGAAAGTAACCTCTGGTCTTCCTAACTGCTCATTATACACTAATTATGATGCACTAGCATGCTAAGAGACACTTCCACCAGCGCCATGACAGTGCCATGGCAACATCAAGAAGTCACCCCACATGGTCTAAAAAGGGGAAGAACCTTCAGTTCCCGGAATTGCCCACCCCTTTCCTGGAAAACTCATGAATAATCCACCCCTTGTTTAGCATATAATGACCTGAAGGGTAAGGGGGTGTGGAGGTTGTGAAGGCGGGAAGGGGGGTAGCCCCTTCACCAATGTAAACAAGGATGTGGGTTCTGCGGCCACACTCTCCCCCGCCCTCCCCAGCGGCATTTCCAGCAAGTCACATGTCCTGCGCACAGGCTGGGGGCCCCCTGCTGCTGCCTTTCTTAGAAGCCAGGACCACAGAGCCCGCACAGTGAGCTACTTGGGGAGCTATTTCTGTAGACTGAGCTTGGGGTACTGGGAGGCAGTGCTGTTGGCGATCTGGGGGAAAACCCCCTGAGGGTCCCATTTCTCTGCCACTGACCCCTTTGCCTGGCAGAAAGGCTCTGCTGCCTCCTAGCTGTGTAGCAATGGATAAGGCCTTTAACCTCTCTAAGCTGAAATGTCCTCATGCATAAGGTGGAGACAGTAACTCCTCTTCCATCTGCTGGGTGTTGTCAAAACTACACAGGAGGTTTGCCAAGCACCTAAGGCACAGTAGGTGGTCAAGAAACAGGAACACAATTTGTCATGACGACAATGATTCCTTCATATGCTAGTTACCCACGAGTCAGCCAGAATGTTGCCATAACCACTTATGAAGCCCTTCCTCATTTCTGTTGCAATTCCTCAGCCAGAGGAAAGCCCCACCACCTCTGTCCTCCAGAAAGCCCTCCTCTTCCCAGAAGGCTGGCACACAGGGCTGGGGGCCAGGCTTGACTTCCCTGTGGAGGGGTCTGAGGTTGGGGGGATGACCTGCAGAGGTAGGGGAATTCAGAGAACTTGTTTTGATAGAAACTGAAACTCCTCCTCTTGCTGACGCTGCACTTGTGGGCAATCTGCACCTGTTCTCCCCTCCCAGAGGCCAGCTGGAAGGGGGTCCCCCACCATTCTACCTCTGTTCCCATCTCAAACAGGGCTCAGAAATCCTCAGAGAGCCTGGATTATCTTCCTATAGGGTCCTACCATTTGCTTTAGAGACATCTGAGAACTGCCTACTCCCCAGGTAGCTGCCTGCCTCCCAGAAGAGCCACAGCAAGTTCCGCTAAGGGCAAAAAAGGAAGCTAGGTGTCTACAGGGAACCTAAAAACAAACCACACTAACGTGTGTACACACAGCTGCAGAGGGAGACAGGGACCTGGTCTGCTCACAGCCCTTGCCACTCCCCCATGGCCCATGTAGAAACAACCATGTGGCCTTCACTCTGCCCACAGAAGCTAGCACCAGGACCCTGGTCAGGGTTAGAGGTTTCTGCTGAGTCAAAGCCACATGGAGGGAGGGAGCAAGGGAGAGATGCAGAGTCATGTTTCCAGGAGGAGGTTATCTGAGCATAACAGGGACAGGGTGGGCCACAGGATACCTCTGAGGCTCAGGTTCCCACCTCCACTCCACCCTCCAACTCTCTGCTCCACGTTCCTTCCACTATTCAACACATGGCAGGAAGTCAGCCTGTAGGGCTTCACACTACAGTCTAAGCTGACTGCCATCTGTCCCCATCCAGGCGAGGCTGGAAACGGGGGCAGCAAAAAGCCCAGGGACAAAGTCCCCTTCCCAGGCACATGTATTATGCACTCTGCACCAAGGAAACCTCCAGATAAGGTCTAGAGACCAAGGGCCATGTACTTCGGGGGAGAGGCCAGAGGACTTCTGAGGTTTTACAGAGAAAAGCCAAAGGCAGCCCAGTCAGGGGAAATGTGTAGCCATAGTGCCGATAAGGAAAGGCCTTCAACCTGCCCTGGTCAGCTCTTCCTGTAAGTAGAGGCCCCTTACCGAAGGCCCCAGTGGGAGGAAGGGTCGGGAGTActcgagTCAGCCTCAGGCTACCTAGGTGCTTTAGAAAGGAGGCCACCCAGGCCCATGACTACTCCTTGCCACAGGGAGCCCTGCACACAGATGTGCTAAGCTCTCGCTGCCAGCCAGAGGGAGGAGGGTCTGAGCCAGTCAGAAGGAGATGGGCCCCAGAGAGTAAGAAAGGGGGAGGAGGACCCAAGCTGATCCAAAAGGTGGGTCTAAGCAGTCAAGTGGAGGAGGGTTCCAATCTGATGGCGGAGGGCCCAAGCTCAGCCTAACGAGGAGGCCAGGCCCACCAAGGGGCCCCTGGAGGACTTGTTTCCCTTGTCCCTTGTGGTTTTTTGCATTTCCTGTTCCCTTGCTGCTCATTGCGGAAGTTCCTCTTCTTACCCTGCACCCAGAGCCTCGCCAGAGAAGACAAGGGCAGAAAGCACCATGgtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaa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配列番号１７ Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２（１，４，５スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（エレメント２のコアサブエレメント２、及びエレメント２のコアサブエレメント３が欠失）
図２０で時計回りの、ＣＭＶ由来の配列（赤い矢印）：
AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagCAAACCTTGTTATCTGAGAGAAAGCTAGAGCTTCCTTCTTTCAGCCCCCAGAGACAATGTGGCCAGGCTCCGGAGGGCTGGGAAGATGAGCAATGCTTGTGAGTCACCATGATAGGAAGCAGAAGGGTCAGGAAGTCCCTGGGAGCAAGGCTTAGGGTTAGGGTTAGGGAGAAAACACTTGGGCCTGGAGGCTCGGGGCAGGCTTCCTAGAGGGGAGGGGTACTAAAAGCCACCAAAACCAAGACAGCAATGAAAGTAACCTCTGGTCTTCCTAACTGCTCATTATACACTAATTATGATGCACTAGCATGCTAAGAGACACTTCCACCAGCGCCATGACAGTGCCATGGCAACATCAAGAAGTCACCCCACATGGTCTAAAAAGGGGAAGAACCTTCAGTTCCCGGAATTGCCCACCCCTTTCCTGGAAAACTCATGAATAATCCACCCCTTGTTTAGCATATAATGACCTGAAGGGTAAGGGGGTGTGGAGGTTGTGAAGGCGGGAAGGGGGGTAGCCCCTTCACCAATGTAAACAAGGATGTGGGTTCTGCGGCCACACTCTCCCCCGCCCTCCCCAGCGGCATTTCCAGCAAGTCACATGTCCTGCGCACAGGCTGGGGGCCCCCTGCTGCTGCCTTTCTTAGAAGCCAGGACCACAGAGCCCGCACAGTGAGCTACTTGGGGAGCTATTTCTGTAGACTGAGCTTGGGGTACTGGGAGGCAGTGCTGTTGGCGATCTGGGGGAAAACCCCCTGAGGGTCCCATTTCTCTGCCACTGACCCCTTTGCCTGGCAGAAAGGCTCTGCTGCCTCCTAGCTGTGTAGCAATGGATAAGGCCTTTAACCTCTCTAAGCTGAAATGTCCTCATGCATAAGGTGGAGACAGTAACTCCTCTTCCATCTGCTGGGTGTTGTCAAAACTACACAGGAGGTTTGCCAAGCACCTAAGGCACAGTAGGTGGTCAAGAAACAGGAACACAATTTGTCATGACGACAATGATTCCTTCATATGCTAGTTACCCACGAGTCAGCCAGAATGTTGCCATAACCACTTATGAAGCCCTTCCTCATTTCTGTTGCAATTCCTCAGCCAGAGGAAAGCCCCACACAGCCCTTGCCACTCCCCCATGGCCCATGTAGAAACAACCATGTGGCCTTCACTCTGCCCACAGAAGCTAGCACCAGGACCCTGGTCAGGGTTAGAGGTTTCTGCTGAGTCAAAGCCACATGGAGGGAGGGAGCAAGGGAGAGATGCAGAGTCATGTTTCCAGGAGGAGGTTATCTGAGCATAACAGGGACAGGGTGGGCCACAGGATACCTCTGAGGCTCAGGTTCCCACCTCCACTCCACCCTCCAACTCTCTGCTCCACGTTCCTTCCACTATTCAACACATGGCAGGAAGTCAGCCTGTAGGGCTTCACACTACAGTCTAAGCTGACTGCCATCTGTCCCCATCCAGGCGAGGCTGGAAACGGGGGCAGCAAAAAGCCCAGGGACAAAGTCCCCTTCCCAGGCACATGTATTATGCACTCTGCACCAAGGAAACCTCCAGATAAGGTCTAGAGACCAAGGGCCATGTACTTCGGGGGAGAGGCCAGAGGACTTCTGAGGTTTTACAGAGAAAAGCCAAAGGCAGCCCAGTCAGGGGAAATGTGTAGCCATAGTGCCGATAAGGAAAGGCCTTCAACCTGCCCTGGTCAGCTCTTCCTGTAAGTAGAGGCCCCTTACCGAAGGCCCCAGTGGGAGGAAGGGTCGGGAGTActcgagTCAGCCTCAGGCTACCTAGGTGCTTTAGAAAGGAGGCCACCCAGGCCCATGACTACTCCTTGCCACAGGGAGCCCTGCACACAGATGTGCTAAGCTCTCGCTGCCAGCCAGAGGGAGGAGGGTCTGAGCCAGTCAGAAGGAGATGGGCCCCAGAGAGTAAGAAAGGGGGAGGAGGACCCAAGCTGATCCAAAAGGTGGGTCTAAGCAGTCAAGTGGAGGAGGGTTCCAATCTGATGGCGGAGGGCCCAAGCTCAGCCTAACGAGGAGGCCAGGCCCACCAAGGGGCCCCTGGAGGACTTGTTTCCCTTGTCCCTTGTGGTTTTTTGCATTTCCTGTTCCCTTGCTGCTCATTGCGGAAGTTCCTCTTCTTACCCTGCACCCAGAGCCTCGCCAGAGAAGACAAGGGCAGAAAGCACCATGgtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcctgatgtgcttcgcccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcgg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配列番号１８ Ｅ９（スリム）－ＨＳ３（スリム）－Ｅ２（１の最初の半分及び５スリム）－ＨＳ１ｐｒｏ－ｍＣｉｔ－ＷＰＲＥ（エレメント２のコアサブエレメント１の２つ目の半分、及び、エレメント２のコアサブエレメント４が欠失）
図２１で時計回りの、ＣＭＶ由来の配列（赤い矢印）：
AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagCAAACCTTGTTATCTGAGAGAAAGCTAGAGCTTCCTTCTTTCAGCCCCCAGAGACAATGTGGCCAGGCTCCGGAGGGCTGGGAAGATGAGCAATGCTTGTGAGTCACCATGATAGGAAGCAGAAGGGTCAGGAAGTCCCTGGGAGCAAGGCTTAGGGTTAGGGTTAGGGAGAAAACACTTGGGCCTGGAGGCTCGGGGCAGGCTTCCTAGAGGGGAGGGGTACTAAAAGCCACCAAAACCAAGACAGCAATGAAAGTAACCTCTGGTCTTCCTAACTGCTCATTATACACTAATTATGATGCACTAGCATGCTAAGAGACACTTCCACCAGCGCCATGACAGTGCCATGGCAACATCAAGAAGTCACCCCACATGGTCTAAAAAGGGGAAGAACCTTCAGTTCCCGGAATTGCCCACCCCTTTCCTGGAAAACTCATGAATAATCCACCCCTTGTTTAGCATATAATGACCTGAAGGGTAAGGGGGTGTGGAGGTTGTGAAGGCGGGAAGGGGGGTAGCCCCTTCACCAATGTAAACAAGGATGTGGGTTCTGCGGCCACACTCTCCCCCGCCCTCCCCAGCGGCATTTCCAGCAAGTCACATGTCCTGCGCACAGGCTGGGGGCCCCCTGCTGCTGCCTTTCTTAGAAGCCAGGACCACAGAGCCCGCACAGTGAGCTACTTGGGGAGCTATTTCTGTAGACTGAGCTTGGGGTACTGGGAGGCAGTGCTGTTGGCCTCCAACTCTCTGCTCCACGTTCCTTCCACTATTCAACACATGGCAGGAAGTCAGCCTGTAGGGCTTCACACTACAGTCTAAGCTGACTGCCATCTGTCCCCATCCAGGCGAGGCTGGAAACGGGGGCAGCAAAAAGCCCAGGGACAAAGTCCCCTTCCCAGGCACATGTATTATGCACTCTGCACCAAGGAAACCTCCAGATAAGGTCTAGAGACCAAGGGCCATGTACTTCGGGGGAGAGGCCAGAGGACTTCTGAGGTTTTACAGAGAAAAGCCAAAGGCAGCCCAGTCAGGGGAAATGTGTAGCCATAGTGCCGATAAGGAAAGGCCTTCAACCTGCCCTGGTCAGCTCTTCCTGTAAGTAGAGGCCCCTTACCGAAGGCCCCAGTGGGAGGAAGGGTCGGGAGTActcgagTCAGCCTCAGGCTACCTAGGTGCTTTAGAAAGGAGGCCACCCAGGCCCATGACTACTCCTTGCCACAGGGAGCCCTGCACACAGATGTGCTAAGCTCTCGCTGCCAGCCAGAGGGAGGAGGGTCTGAGCCAGTCAGAAGGAGATGGGCCCCAGAGAGTAAGAAAGGGGGAGGAGGACCCAAGCTGATCCAAAAGGTGGGTCTAAGCAGTCAAGTGGAGGAGGGTTCCAATCTGATGGCGGAGGGCCCAAGCTCAGCCTAACGAGGAGGCCAGGCCCACCAAGGGGCCCCTGGAGGACTTGTTTCCCTTGTCCCTTGTGGTTTTTTGCATTTCCTGTTCCCTTGCTGCTCATTGCGGAAGTTCCTCTTCTTACCCTGCACCCAGAGCCTCGCCAGAGAAGACAAGGGCAGAAAGCACCATGgtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccttcggctacggcctgatgtgcttcgcccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagctaccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtgactgcaggaattcgagcatcttaccgccatttattcccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacc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配列番号１９ ＣＭＶ：
AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG
配列番号２０ ５’Ｒ／Ｕ５：
GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC
配列番号２１ ＰＳＩ：
Tcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggag
配列番号２２ ＲＲＥ：
Tccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacct
配列番号２３ ＷＰＲＥ：
Cccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctgga
配列番号２４ ３’ＰＰＴ：
tttttaaaagaaaaggggggac
配列番号２５ ３’データ Ｕ３／Ｒ／Ｕ５
tggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacctactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGC
配列番号２６ ＳＶ４０ｏｒｉ：
Atcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagg
配列番号２７ ＫＡＮｒ：
Attgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctga
配列番号２８ ＣＯＬＥ１：
agatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcg
配列番号２９ コドン最適化ＷＡＳｐオープンリーディングフレームを含む、ＷＡＳＶｅｃレンチウイルスベクター移動転写の完全配列（配列は、ＣＭＶから開始する）
AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcggttaacttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttatcgatcacgagactagcctcgagCAAACCTTGTTATCTGAGAGAAAGCTAGAGCTTCCTTCTTTCAGCCCCCAGAGACAATGTGGCCAGGCTCCGGAGGGCTGGGAAGATGAGCAATGCTTGTGAGTCACCATGATAGGAAGCAGAAGGGTCAGGAAGTCCCTGGGAGCAAGGCTTAGGGTTAGGGTTAGGGAGAAAACACTTGGGCCTGGAGGCTCGGGGCAGGCTTCCTAGAGGGGAGGGGTACTAAAAGCCACCAAAACCAAGACAGCAATGAAAGTAACCTCTGGTCTTCCTAACTGCTCATTATACACTAATTATGATGCACTAGCATGCTAAGAGACACTTCCACCAGCGCCATGACAGTGCCATGGCAACATCAAGAAGTCACCCCACATGGTCTAAAAAGGGGAAGAACCTTCAGTTCCCGGAATTGCCCACCCCTTTCCTGGAAAACTCATGAATAATCCACCCCTTGTTTAGCATATAATGACCTGAAGGGTAAGGGGGTGTGGAGGTTGTGAAGGCGGGAAGGGGGGTAGCCCCTTCACCAATGTAAACAAGGATGTGGGTTCTGCGGCCACACTCTCCCCCGCCCTCCCCAGCGGCATTTCCAGCAAGTCACATGTCCTGCGCACAGGCTGGGGGCCCCCTGCTGCTGCCTTTCTTAGAAGCCAGGACCACAGAGCCCGCACAGTGAGCTACTTGGGGAGCTATTTCTGTAGACTGAGCTTGGGGTACTGGGAGGCAGTGCTGTTGGCGATCTGGGGGAAAACCCCCTGAGGGTCCCATTTCTCTGCCACTGACCCCTTTGCCTGGCAGAAAGGCTCTGCTGCCTCCTAGCTGTGTAGCAATGGATAAGGCCTTTAACCTCTCTAAGCTGAAATGTCCTCATGCATAAGGTGGAGACAGTAACTCCTCTTCCATCTGCTGGGTGTTGTCAAAACTACACAGGAGGTTTGCCAAGCACCTAAGGCACAGTAGGTGGTCAAGAAACAGGAACACAATTTGTCATGACGACAATGATTCCTTCATATGCTAGTTACCCACGAGTCAGCCAGAATGTTGCCATAACCACTTATGAAGCCCTTCCTCATTTCTGTTGCAATTCCTCAGCCAGAGGAAAGCCCCACACAGCCCTTGCCACTCCCCCATGGCCCATGTAGAAACAACCATGTGGCCTTCACTCTGCCCACAGAAGCTAGCACCAGGACCCTGGTCAGGGTTAGAGGTTTCTGCTGAGTCAAAGCCACATGGAGGGAGGGAGCAAGGGAGAGATGCAGAGTCATGTTTCCAGGAGGAGGTTATCTGAGCATAACAGGGACAGGGTGGGCCACAGGATACCTCTGAGGCTCAGGTTCCCACCTCCACTCCACCCTCCAACTCTCTGCTCCACGTTCCTTCCACTATTCAACACATGGCAGGAAGTCAGCCTGTAGGGCTTCACACTACAGTCTAAGCTGACTGCCATCTGTCCCCATCCAGGCGAGGCTGGAAACGGGGGCAGCAAAAAGCCCAGGGACAAAGTCCCCTTCCCAGGCACATGTATTATGCACTCTGCACCAAGGAAACCTCCAGATAAGGTCTAGAGACCAAGGGCCATGTACTTCGGGGGAGAGGCCAGAGGACTTCTGAGGTTTTACAGAGAAAAGCCAAAGGCAGCCCAGTCAGGGGAAATGTGTAGCCATAGTGCCGATAAGGAAAGGCCTTCAACCTGCCCTGGTCAGCTCTTCCTGTAAGTAGAGGCCCCTTACCGAAGGCCCCAGTGGGAGGAAGGGTCGGGAGTActcgagTCAGCCTCAGGCTACCTAGGTGCTTTAGAAAGGAGGCCACCCAGGCCCATGACTACTCCTTGCCACAGGGAGCCCTGCACACAGATGTGCTAAGCTCTCGCTGCCAGCCAGAGGGAGGAGGGTCTGAGCCAGTCAGAAGGAGATGGGCCCCAGAGAGTAAGAAAGGGGGAGGAGGACCCAAGCTGATCCAAAAGGTGGGTCTAAGCAGTCAAGTGGAGGAGGGTTCCAATCTGATGGCGGAGGGCCCAAGCTCAGCCTAACGAGGAGGCCAGGCCCACCAAGGGGCCCCTGGAGGACTTGTTTCCCTTGTCCCTTGTGGTTTTTTGCATTTCCTGTTCCCTTGCTGCTCATTGCGGAAGTTCCTCTTCTTACCCTGCACCCAGAGCCTCGCCAGAGAAGACAAGGGCAGAAAGCACCATGTCTGGCGGACCTATGGGAGGTAGACCTGGTGGAAGAGGTGCCCCCGCCGTGCAGCAGAACATCCCCAGCACCCTGCTGCAGGACCACGAGAACCAGCGCCTGTTCGAGATGCTGGGCCGCAAGTGCCTGACCCTGGCCACCGCCGTGGTGCAGCTGTACCTGGCCCTGCCCCCCGGCGCCGAGCACTGGACCAAGGAGCACTGCGGCGCCGTGTGCTTCGTGAAGGACAACCCCCAGAAGAGCTACTTCATCCGCCTGTACGGCCTGCAGGCCGGCCGCCTGCTGTGGGAGCAGGAGCTGTACAGCCAGCTGGTGTACAGCACCCCCACCCCCTTCTTCCACACCTTCGCCGGCGACGACTGCCAGGCCGGCCTGAACTTCGCCGACGAGGACGAGGCCCAGGCCTTCCGCGCCCTGGTGCAGGAGAAGATCCAGAAGCGCAACCAGCGCCAGAGCGGCGACAGAAGGCAACTGCCTCCTCCACCTACACCAGCCAACGAGGAAAGAAGAGGCGGACTGCCCCCCCTGCCTCTTCATCCTGGCGGAGATCAAGGTGGACCTCCTGTGGGACCACTGTCTCTTGGCCTGGCCACCGTGGACATCCAGAACCCCGACATCACCAGCAGCCGCTACCGCGGCCTGCCCGCCCCCGGCCCCAGCCCCGCCGACAAGAAGCGCAGCGGCAAGAAGAAGATCAGCAAGGCCGACATCGGCGCCCCCAGCGGCTTCAAGCACGTGAGCCACGTGGGCTGGGACCCCCAGAACGGCTTCGACGTGAACAACCTGGACCCCGACCTGCGCAGCCTGTTCAGCCGCGCCGGCATCAGCGAGGCCCAGCTGACCGACGCCGAGACCAGCAAGCTGATCTACGACTTCATCGAGGACCAGGGCGGCCTGGAGGCCGTGCGCCAGGAGATGCGCCGCCAGGAGCCCCTGCCACCACCTCCACCTCCATCTAGAGGCGGCAACCAGCTGCCCCGCCCTCCTATCGTTGGCGGCAACAAGGGAAGATCTGGCCCTCTGCCTCCTGTGCCTCTGGGAATCGCTCCACCACCACCAACACCTAGAGGCCCGCCTCCACCAGGCAGAGGTGGTCCTCCGCCGCCACCTCCTCCAGCCACCGGCCGCAGCGGCCCCCTTCCTCCTCCACCACCTGGTGCTGGTGGACCTCCAATGCCACCGCCACCGCCTCCGCCACCTCCGCCTCCAAGTTCTGGAAATGGACCTGCTCCTCCTCCTTTGCCTCCTGCTTTGGTTCCTGCTGGCGGATTGGCTCCAGGCGGAGGAAGAGGCGCACTGCTGGACCAGATCCGCCAGGGCATCCAGCTGAACAAGACCCCTGGCGCTCCTGAGAGTTCTGCTCTGCAACCGCCACCACAGTCTAGCGAAGGACTTGTGGGAGCCCTGATGCACGTGATGCAGAAGCGCAGCCGCGCCATCCACAGCAGCGACGAGGGCGAGGACCAGGCCGGCGACGAGGACGAGGACGACGAGTGGGACGACTAActgcaggaattcgagcatcttaccgccatttattcccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattcgagctcggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacctactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctagggacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatagcacctagatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaa 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tttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatgg

Claims (71)

  1. ウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）の治療のための組み換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）であって、前記ベクターが、
    発現カセットであって、
    前記ＷＡＳ遺伝子の内因性プロモーターの効果的な断片をコードする核酸であって、前記プロモーターが、最大６００ｂｐの長さを有し、ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）を含有する、前記核酸と、
    前記ＷＡＳ遺伝子の前記内因性プロモーターの前記効果的な断片に作動可能に連結されたウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸と、
    を含む、前記発現カセットを含む、前記ベクター。
  2. 前記ＷＡＳ遺伝子の前記内因性プロモーターの前記効果的な断片の配列が、ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなる、請求項１に記載のベクター。
  3. 前記発現カセットが、スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）、またはその効果的な断片を含む、請求項１～２のいずれか１項に記載のベクター。
  4. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１（配列番号３＋配列番号４）、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれらからなる、請求項３に記載のベクター。
  5. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１（配列番号３＋配列番号４）、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）からなる、請求項４に記載のベクター。
  6. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれらからなる、請求項３に記載のベクター。
  7. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）からなる、請求項６に記載のベクター。
  8. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）を含むか、またはこれからなる、請求項３に記載のベクター。
  9. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の２つ目の半分（配列番号４）を含むか、またはこれからなる、請求項３及び８のいずれか１項に記載のベクター。
  10. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント２（配列番号５）を含むか、またはこれからなる、請求項３、及び８～９のいずれか１項に記載のベクター。
  11. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント３（配列番号６）を含むか、またはこれからなる、請求項３、及び８～１０のいずれか１項に記載のベクター。
  12. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）を含むか、またはこれからなる、請求項３、及び８～１１のいずれか１項に記載のベクター。
  13. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメント２の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれからなる、請求項３、及び８～１２のいずれか１項に記載のベクター。
  14. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメントＨＳ３（配列番号９）、またはその効果的な断片を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のベクター。
  15. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメントＨＳ３の効果的な断片を含み、前記断片が、ＨＳ３コア配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなる、請求項１４に記載のベクター。
  16. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメントＨＳ３の効果的な断片を含み、前記断片が、ＨＳ３コア配列（配列番号１０）からなる、請求項１５に記載のベクター。
  17. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメントＥ９（配列番号１１）、またはその効果的な断片を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載のベクター。
  18. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメントＥ９の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメントＥ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなる、請求項１７に記載のベクター。
  19. 前記発現カセットが、エンハンサーエレメントＥ９の効果的な断片を含み、前記断片が、エンハンサーエレメントＥ９コア配列（配列番号１２）からなる、請求項１８に記載のベクター。
  20. 前記発現カセットが、
    スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）；及び
    ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなる前記ＷＡＳ遺伝子の前記内因性プロモーターの断片
    を含む、請求項１～２のいずれか１項に記載のベクター。
  21. 前記ベクターが、図１８に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、請求項２０に記載のベクター。
  22. 前記ベクターが、配列番号１５に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、請求項２０に記載のベクター。
  23. 前記発現カセットが、
    Ｅ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＥ９配列；
    ＨＳ３コア配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＨＳ３配列；
    スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）；及び
    ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなる前記ＷＡＳ遺伝子の前記内因性プロモーターの断片を含む、請求項１～２のいずれか１項に記載のベクター。
  24. 前記ベクターが、図１９に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、請求項２３に記載のベクター。
  25. 前記ベクターが、配列番号１６に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、請求項２３に記載のベクター。
  26. 前記ベクターが配列番号２９に示す配列を含む、請求項２５に記載のベクター。
  27. 前記発現カセットが、
    Ｅ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＥ９配列；
    ＨＳ３コア配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＨＳ３配列；
    エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１（配列番号３＋配列番号４）、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）；ならびに
    ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなる前記ＷＡＳ遺伝子の前記内因性プロモーターの断片を含む、請求項１～２のいずれか１項に記載のベクター。
  28. 前記ベクターが、図２０に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、請求項２７に記載のベクター。
  29. 前記ベクターが、配列番号１７に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、請求項２７に記載のベクター。
  30. 前記発現カセットが、
    Ｅ９コア配列（配列番号１２）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＥ９配列；
    ＨＳ３コア配列（配列番号１０）を含むか、またはこれからなるエンハンサーエレメントＨＳ３配列；
    エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）、及び、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）；ならびに
    ＨＳ１ｐｒｏの配列（配列番号１）からなる前記ＷＡＳ遺伝子の前記内因性プロモーターの断片を含む、請求項１～２のいずれか１項に記載のベクター。
  31. 前記ベクターが、図２１に示す特徴を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、請求項３０に記載のベクター。
  32. 前記ベクターが、配列番号１８に示す配列を含み、ｍＣｉｔｒｉｎｅをコードする配列が、ウィスコットアルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする核酸で置き換えられる、請求項３０に記載のベクター。
  33. ＷＡＳｐタンパク質をコードする核酸をコードする前記核酸が、ＷＡＳ ｃＤＮＡ、またはコドン最適化ＷＡＳ遺伝子である、請求項１～３２のいずれか１項に記載のベクター。
  34. ＷＡＳｐタンパク質をコードする核酸をコードする前記核酸が、ＷＡＳ ｃＤＮＡ（配列番号１３）である、請求項３３に記載のベクター。
  35. ＷＡＳｐタンパク質をコードする核酸をコードする前記核酸が、コドン最適化ＷＡＳである、請求項３３に記載のベクター。
  36. ＷＡＳＰをコードする前記核酸の配列が、ｊＣＡＴコドン最適化ＷＡＳ、ＧｅｎｅＡｒｔ最適化ＷＡＳ、及びＩＤＴ最適化ＷＡＳからなる群から選択される、コドン最適化ＷＡＳである、請求項３５に記載のベクター。
  37. 前記ベクターが、Ψ領域ベクターゲノムパッケージングシグナルを含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載のベクター。
  38. 前記ベクターが、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む５’ＬＴＲを含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載のベクター。
  39. 前記ベクターが、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載のベクター。
  40. 前記ベクターが中央ポリプリン帯を含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載のベクター。
  41. 前記ベクターが、翻訳後制御エレメントを含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載のベクター。
  42. 前記翻訳後制御エレメントが、修飾されたウッドチャック転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項４１に記載のベクター。
  43. 前記ベクターが、組み換えにより、野生型レンチウイルスを再構成することができない、請求項１～４２のいずれか１項に記載のベクター。
  44. 前記ベクターが、巨核球中で高い発現を示す、請求項１～４３のいずれか１項に記載のベクター。
  45. ＷＡＳを有する哺乳類に投与されたときに、前記ベクターが、Ｔ、Ｂ、及びＮＫ細胞の数、及び機能を回復させる、請求項１～４４のいずれか１項に記載のベクター。
  46. 請求項１～４５のいずれか１項に記載のベクターを形質導入した宿主細胞。
  47. 前記細胞が幹細胞である、請求項４６に記載の宿主細胞。
  48. 前記細胞が、骨髄由来の、及び／または臍帯血液由来の、及び／または末梢血由来の幹細胞である、請求項４７に記載の宿主細胞。
  49. 前記細胞がヒト造血前駆細胞である、請求項４６に記載の宿主細胞。
  50. 前記ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項４９に記載の宿主細胞。
  51. 対象におけるウィスコットアルドリッチ症候群（ＷＡＳ）の治療方法であって、前記方法が、
    前記対象由来の幹細胞及び／または前駆細胞に、請求項１～４５のいずれか１項に記載のベクターを形質導入することと、
    前記対象由来の前記形質導入細胞（複数可）を前記対象に移植することであって、前記対象由来の細胞または誘導体が、前記ＷＡＳｐタンパク質を発現する、前記移植することと、
    を含む、前記方法。
  52. 前記細胞が幹細胞である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記細胞が、骨髄由来の幹細胞である、請求項５１に記載の宿主細胞。
  54. 前記細胞がヒト造血幹細胞及びヒト造血前駆細胞である、請求項５１に記載の方法。
  55. 前記ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項５４に記載の方法。
  56. 以下のうちの１つ以上を含む、組み換え核酸：
    ＷＡＳ遺伝子の最小内因性プロモーターを含む、もしくはこれからなる核酸配列であって、前記最小内因性プロモーターが、ＨＳ１ｐｒｏ（配列番号１）を含むか、もしくはこれからなる、前記配列；及び／または
    スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）、もしくはその効果的な断片を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；
    エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
    エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の２つ目の半分（配列番号４）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
    エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント２（配列番号５）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
    エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント３（配列番号６）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
    エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
    エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
    エンハンサーエレメントＨＳ３（完全）（配列番号９）もしくはその効果的な断片を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
    エンハンサーエレメントＨＳ３コア（配列番号１０）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
    エンハンサーエレメントＥ９（完全）（配列番号１１）もしくはその効果的な断片を含むか、もしくはこれからなる核酸配列；及び／または
    エンハンサーエレメントＥ９コア（配列番号１２）を含むか、もしくはこれからなる核酸配列。
  57. 前記核酸が、ＷＡＳ遺伝子の最小内因性プロモーターを含む、またはこれからなる核酸配列であって、前記最小内因性プロモーターが、ＨＳ１ｐｒｏ（配列番号１）を含むか、またはこれからなる、前記配列を含む、請求項５６に記載の核酸。
  58. 前記核酸が、スリムエンハンサーエレメント２（配列番号２＝配列番号３～８）、またはその効果的な断片を含むか、またこれからなる核酸配列を含む、請求項５６に記載の核酸。
  59. 前記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の最初の半分（配列番号３）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、請求項５６に記載の核酸。
  60. 前記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント１の２つ目の半分（配列番号４）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、請求項５６及び５９のいずれか１項に記載の核酸。
  61. 前記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント２（配列番号５）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、請求項５６、及び５９～６０のいずれか１項に記載の核酸。
  62. 前記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント３（配列番号６）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、請求項５６、及び５９～６１のいずれか１項に記載の核酸。
  63. 前記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント４（配列番号７）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、請求項５６、及び５９～６２のいずれか１項に記載の核酸。
  64. 前記核酸が、エンハンサーエレメント２のコアサブエレメント５（配列番号８）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、請求項５６、及び５９～６３のいずれか１項に記載の核酸。
  65. 前記核酸が、エンハンサーエレメントＨＳ３（完全）（配列番号９）またはその効果的な断片を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、請求項５６、及び５９～６４のいずれか１項に記載の核酸。
  66. 前記核酸が、エンハンサーエレメントＨＳ３コア（配列番号１０）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、請求項５６、及び５９～６５のいずれか１項に記載の核酸。
  67. 前記核酸が、エンハンサーエレメントＥ９（完全）（配列番号１１）またはその効果的な断片を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、請求項５６、及び５９～６６のいずれか１項に記載の核酸。
  68. 前記核酸が、エンハンサーエレメントＥ９コア（配列番号１２）を含むか、またはこれからなる核酸配列を含む、請求項５６、及び５９～６７のいずれか１項に記載の核酸。
  69. 前記核酸が発現カセットを含む、請求項５６～６８のいずれか１項に記載の核酸。
  70. 前記発現カセットが、哺乳類細胞に形質導入されたときにＷＡＳｐを発現するのに効果的である、請求項６９に記載の核酸。
  71. 前記核酸が、請求項１～４５のいずれか１項に記載のベクターを含む、請求項５６に記載の核酸。
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