JP2022554222A - ヒトオルニチンアミノトランスフェラーゼの不活性化剤としてのガンマアミノ酪酸（ｇａｂａ）のフッ素置換シクロヘキセン類似体 - Google Patents

Abstract

アミノフルオロ置換シクロヘキセンカルボン酸化合物が開示される。開示される化合物及びその組成物は、細胞増殖性疾患及び障害などのＯＡＴ活性又は発現に関連する疾患又は障害を治療するための方法を含む、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）活性を調節するための方法において使用することができる。

Description

関連する特許出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０１９年１０月２５日に出願された米国仮出願第６２／９２６，１２０号の優先権の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＤＡ０３０６０４の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有している。

オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）は、ピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素¹であり、ほとんどのヒト及び動物組織のミトコンドリアマトリックスに見られる²。ＯＡＴは、前半の反応でオルニチンからΔ１－ピロリン－５－カルボキシレート（Ｐ５Ｃ）への変換を触媒し、そして後半の反応でのα－ケトグルタル酸（α－ＫＧ）からグルタミン酸への変換を触媒する³。グルタミン酸は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ⁴（ＧＬＵＤ）によって分解されてα－ＫＧに戻るか、又はピロリン－５－カルボン酸合成酵素⁵（Ｐ５ＣＳ）によりＰ５Ｃに変換され；ＯＡＴ又はＰ５ＣＳ経路を介して生成されたＰ５Ｃは、ピロリン－５－カルボン酸リダクターゼ（ＰＹＣＲ）により媒介されてプロリンにさらに変換される可能性がある^6-7。プロリンは通常、遊離アミノ酸プールの代わりにコラーゲン中に沈着及び貯蔵されるため^7-8、ＯＡＴの活性はプロリン及びコラーゲンレベルと正の相関がある⁹。コラーゲンは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主成分であり¹⁰、コラーゲンの沈着又は分解の変化はＥＣＭホメオスタシスの喪失につながる可能性がある。過去数年間、ＥＣＭによって提示されるＥＣＭ動力学と化学的手がかりの調節異常は、発生と癌進行の両方の主要な推進力として認識されてきた¹¹。さらに、癌の代謝再プログラミングにおいて、プロリン代謝が重要な役割を果たすことがますます明らかになっている^12-13。プロリン合成の酵素は、よく知られている２つの腫瘍遺伝子、ｃ－ｍｙｃとホスホイノシチド３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）によって著しくアップレギュレートされ¹⁴、中央中間体としてＰ５Ｃのアップレギュレートされた合成をもたらした¹⁵。ＯＡＴによるオルニチンのアミノ転移は、プロリン代謝と尿素回路の間の重要な経路である。ＯＡＴは、ＰＫ／ｃ－ｍｙｃトランスジェニックマウスの肝腫瘍組織で強く活性化されることがわかっている¹⁶。肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞では、Ｗｎｔ／β－カテニン経路の不適切な活性化によってＯＡＴ遺伝子の過剰発現が誘導される^16-17。密接に関連するプロリン代謝経路は、ＨＣＣの低酸素微小環境によって活性化され、腫瘍の進行とソラフェニブ耐性を促進するヒドロキシプロリンの蓄積を特徴とする¹⁸。ＯＡＴの選択的阻害は、インビボでのＨＣＣ腫瘍増殖を効果的に阻害することが示されている¹⁹。最近、ＯＡＴのアップレギュレーションが非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞で見つけられ、これは、増殖、浸潤、遊走の促進、アポトーシスの阻害、細胞周期の変化に寄与している²⁰。さらにＯＡＴのノックダウンは、ＮＳＣＬＣ細胞のインビトロ増殖を阻害し、肺癌異種移植モデルにおけるインビボ腫瘍増殖を抑制した²⁰。特定のＯＡＴノックダウンは細胞分裂をブロックし、ヒト子宮頸癌及び骨肉腫細胞における細胞死を引き起こす²¹。従ってＯＡＴの選択的阻害は、癌治療の潜在的な治療戦略として役立つ可能性がある。

要約
オルニチンアミノトランスフェラーゼの選択的阻害のための化合物、組成物、及び関連する使用方法が開示される。開示される化合物、組成物、及び方法は、オルニチンアミノトランスフェラーゼ活性に関連する疾患及び障害を治療するために利用することができる。

開示される化合物は、置換シクロヘキセン化合物として記載することができる。特に、開示される化合物は、アミノフルオロ置換シクロヘキセンカルボン酸化合物として記載することができる。開示される化合物及びその組成物は、細胞増殖性疾患及び障害などのＯＡＴ活性又は発現に関連する疾患又は障害を治療するための方法を含む、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）活性を調節するための方法において使用することができる。

開示される化合物は、以下の式の化合物、又はその解離型、非プロトン化型、双性イオン型、若しくは塩：

（式中、二重結合はα炭素とζ炭素との間に存在するか、二重結合はα炭素とβ炭素との間に存在する）を対象とすることができ、及び化合物は以下の式：

又は

［式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれは、Ｈ又は脱離基（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩなどのハロゲン化物）から独立して選択されるが、但しＲ¹及びＲ²の少なくとも１つはＨではない］を有する。

いくつかの実施態様において、開示される化合物は、以下の式の化合物、又はその解離型、非プロトン化型、双性イオン型、若しくは塩：

［式中、二重結合は、α炭素とζ炭素との間、又はα炭素とβ炭素との間に存在し、
式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれは、Ｈ又は脱離基（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩなどのハロゲン化物）から独立して選択されるが、但しＲ¹及びＲ²の少なくとも１つはＨではない］に向けられ得る。

特定の実施態様において、化合物は、以下の式の化合物、又はその解離型、非プロトン化型、双性イオン型、若しくは塩：

（式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれは、Ｈ及びＦから独立して選択されるが、但しＲ¹及びＲ²の少なくとも１つはＦである）であるか、又はそのような化合物の塩である。

特定の実施態様において、化合物は、以下の式の化合物、又はその解離型、非プロトン化型、双性イオン型、若しくは塩：

（式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれは、Ｈ及びＦから独立して選択されるが、但しＲ¹及びＲ²の少なくとも１つはＦである）であるか、又はそのような化合物の塩である。

記載されているように、開示される化合物は、任意選択的に化合物が塩として存在する場合、例えばアンモニウム部分を形成するためにプロトン化され得る。例えば、カルボン酸部分がカルボキシレート部分から解離される場合、任意選択的に化合物が塩として存在する場合、開示される化合物は、また非プロトン化及び／又は解離され得る。化合物がプロトン化されたアンモニウム部分及び解離されたカルボキシレート部分を含む場合、任意選択的に化合物が塩として存在する場合、開示される化合物は双性イオン型であり得る。

開示される化合物及び組成物は、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）活性を調節するための方法において利用され得る。このような方法は、本明細書に開示される化合物、例えば以下の式の化合物、又はその解離型、双性イオン型、若しくはその塩などを提供すること、及びＯＡＴを化合物：

（式中、二重結合は、α炭素とζ炭素との間、又はα炭素とβ炭素との間に存在し、
式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれは、Ｈ及びＦから独立して選択されるが、ただしＲ¹及びＲ²の少なくとも１つは、Ｈではない）又はそのような化合物の塩に接触させることを含む。特定の実施態様において、二重結合はα炭素とζ炭素との間にある。特定の実施態様において、二重結合はα炭素とβ炭素との間にある。特定の実施態様において、Ｒ¹及びＲ²はＦである。

特定の実施態様において、開示される方法は、癌によって発現されるＯＡＴの活性を低下させることを対象とすることができ、この癌は、特に限定されるものではないが、肝細胞癌（ＨＣＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、又はＯＡＴを発現又は過剰発現する他の癌を含む。このような方法は、本明細書に開示される化合物、例えば以下の式の化合物、又はその解離型、非プロトン化型、双性イオン型、若しくは塩などを提供し、癌を化合物：

（式中、二重結合は、α炭素とζ炭素との間、又はα炭素とβ炭素との間に存在し、
式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれは、Ｈ及びＦから独立して選択されるが、ただしＲ¹及びＲ²の少なくとも１つは、Ｈではない）又はそのような化合物の塩に接触させることを含む。特定の実施態様において、二重結合はα炭素とζ炭素との間にある。特定の実施態様において、二重結合はα炭素とβ炭素との間にある。特定の実施態様において、Ｒ¹及びＲ²はＦである。

特定の実施態様において、開示される方法は、それを必要とする対象における細胞増殖性疾患又は障害を治療することを対象とすることができる。適切な細胞増殖性疾患及び障害には、特に限定されるものではないが、肝細胞癌（ＨＣＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などのＯＡＴを発現又は過剰発現する癌が含まれ得る。そのような方法は、それを必要とするそのような対象に、以下の式の化合物、又はその解離型、非プロトン化型、双性イオン型、若しくは塩：

（式中、二重結合は、α炭素とζ炭素との間、又はα炭素とβ炭素との間に存在し、
式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれは、Ｈ及びＦから独立して選択されるが、ただしＲ¹及びＲ²の少なくとも１つは、Ｈではない）又はそのような化合物の塩を投与することを含み得る。特定の実施態様において、二重結合はα炭素とζ炭素との間にある。特定の実施態様において、二重結合はα炭素とβ炭素との間にある。特定の実施態様において、Ｒ¹及びＲ²はＦである。

本明細書に開示される化合物は、立体化学的又は配置的制限がなく、かつ、立体化学的又は配置的制限が示されない限り、すべての立体化学的又は配置的異性体を包含する。以下に例示及び説明するように、そのような化合物及び／又はそれらの中間体は、単一の鏡像異性体、そこから異性体を分解できるラセミ混合物、又はそこから対応する鏡像異性体を分離できるジアステレオ異性体として利用可能である。従って、任意の立体中心は、他の任意の立体中心に関して（Ｓ）又は（Ｒ）である可能性がある。もう一つ別の考慮事項として、様々な化合物は酸又は塩基塩として存在することができ、例えばアミノ基で部分的又は完全にプロトン化されてアンモニウム部分を形成するか、及び／又は例えばカルボキシル基で部分的又は完全に解離されてカルボキシレート置換基又は部分を形成する。特定のそのような実施態様において、アンモニウム置換基又は部分に関して、対イオンはプロトン酸の共役塩基であり得る。特定のそのような又は他の実施態様において、カルボキシレート置換基又は部分に関して、対イオンはアルカリ性、アルカリ土類、又はアンモニウムカチオンであり得る。さらに、本明細書に開示される任意の１種以上の化合物が、治療方法又は薬剤と組み合わせて使用するための医薬的に許容可能な担体成分を含む医薬組成物の一部として提供され得ることを、当業者は理解するであろう。

特定の実施態様において、開示される方法は、ＯＡＴ活性及び／又は発現又は過剰発現に関連する癌などの細胞増殖性疾患及び障害を含む、ＯＡＴ活性及び／又は発現又は過剰発現に関連する疾患又は障害を対象とする。適切な疾患及び障害には、特に限定されるものではないが、細胞増殖性疾患及び障害が含まれ、これには、特に限定されるものではないが、そのような治療を必要とするヒト対象の肝細胞癌（ＨＣＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が含まれる。特定の実施態様において、そのような化合物は、医薬組成物の一部として提供され得る。

特定の実施態様において、開示された方法は、癌（例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））によって発現されるオルニチンアミノトランスフェラーゼの活性を低下又は調節することを対象とする。そのような方法は、上記又は本明細書の他の場所に記載の種類の化合物を提供し、そのような化合物に、オルニチンアミノトランスフェラーゼ活性を低下させるのに有効な量で、オルニチンアミノトランスフェラーゼを発現する癌を含む細胞媒体に接触させることを含み得る。特定の実施態様において、そのような化合物は、医薬組成物の一部として提供され得る。とにかく、そのような接触はインビトロ又はインビボであり得る。

より一般的には、開示される方法は、オルニチンアミノトランスフェラーゼを阻害又は不活性化することを対象とすることができる。そのような方法は、医薬組成物の一部であるかどうかにかかわらず、上記又は以下に記載される種類の化合物を提供すること、及びオルニチンアミノトランスフェラーゼと接触するための有効量のそのような化合物を投与することを含み得る。そのような接触は、当技術分野で理解されるように、実験目的及び／又は研究目的のためでも、又は１つ以上のインビボ又は生理学的状態をシミュレートするように設計されてもよい。そのような化合物には、特に限定されるものではないが、以下の実施例、参照図、組み込まれた参考文献、及び／又は付随する合成スキームによって示されるものが含まれ得る。特定のそのような実施態様において、そのような化合物及び／又はこれらの組み合わせは、ＯＡＴ、細胞増殖、及び／又は腫瘍増殖を阻害するのに少なくとも部分的に十分な量で存在することができる。

図１は、オルニチンの代謝経路を示す。

図２は、選択的ｈＯＡＴ不活性化剤７、及びフッ素置換シクロヘキセン類似体８～１１の構造。

図３は、８（左）及び９（右）によって不活性化されたｈＯＡＴの共結晶構造。

図４は、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）に対する９の阻害活性。

図５は、ガンマアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＡＢＡ－ＡＴ）に対する９の阻害活性。

図６は、アラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼに対する９の阻害活性。

図７は、８の濃度を変化させることによって部分的又は完全に阻害されたｈＯＡＴの時間依存性透析。

図８は、９の濃度を変化させることによって部分的又は完全に阻害されたｈＯＡＴの時間依存性透析。

図９は、機構に基づく酵素不活性化剤による酵素の力価測定。酵素活性の喪失は、不活性化と酵素濃度の比率の関数として測定される。曲線の線形部分で線形回帰が使用され、ターンオーバー数であるＸ切片が得られた（分配率＝ターンオーバー数－１）。８のターンオーバー数の決定。

図１０は、機構に基づく酵素不活性化剤による酵素の力価測定。酵素活性の喪失は、不活性化と酵素濃度の比率の関数として測定される。曲線の線形部分で線形回帰が使用され、ターンオーバー数であるＸ切片が得られた（分配率＝ターンオーバー数－１）。９のターンオーバー数の決定。

詳細な説明
開示される主題は、以下の定義及び用語を使用してさらに説明され得る。本明細書で使用される定義及び用語は、特定の実施態様を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではない。

本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が特に他に明記しない限り複数形を含む。例えば「置換基」という用語は、文脈が特に他に明記しない限り、「１つ以上の置換基」を意味すると解釈しなければならない。

本明細書で使用される「約」、「およそ」、「実質的に」、及び「顕著に」は、当業者によって理解されるものであり、それらが使用される文脈によってある程度変化する。それが使用される文脈を考えると、当業者には明らかでない用語の使用がある場合、「約」及び「およそ」は、特定の用語の最大で±１０％を意味し、「実質的に」及び「顕著に」とは、特定の用語の±１０％を超えることを意味する。

本明細書で使用される「含む（include）」及び「含んでいる（including）」という用語は、「含む（comprise）」及び「含んでいる（comprising）」という用語と同じ意味を有する。「含む（comprise）」及び「含んでいる（comprising）」という用語は、特許請求の範囲に記載された構成要素に加えて追加の構成要素を含めることを可能にする「開かれた」移行用語であると解釈されるべきである。「からなる（consist）」及び「からなる（consisting of）」という用語は、特許請求の範囲に記載された構成要素以外の追加の構成要素を含めることを許容しない「閉じた」移行用語として解釈されるべきである。「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語は、部分的に閉じられており、特許請求された主題の本質を根本的に変更しない追加の構成要素のみを含めることができると解釈されるべきである。

「などの（such as）」という句は、「例えば・・・を含む」と解釈されるべきである。さらに、特に限定されるものではないが、「などの」を含むあらゆる例示的な用語の使用は、単に特許請求された主題をより明確にすることを意図しており、特許請求された主題の範囲を制限するものではない。

さらに、「Ａ、Ｂ、及びＣなどの少なくとも１つ」に類似する慣習がある場合。一般に、そのような構成は、当技術分野で通常の技能を有する者がその慣習を理解するという意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つを有するシステム」は、システムＡのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢを一緒に、ＡとＣを一緒に、ＢとＣを一緒に、及び／又はＡ、Ｂ、Ｃを一緒に有する説明を含むが、これらに限定されない）。説明又は図のいずれかであるかどうかにかかわらず、２つ以上の代替用語を提示する事実上すべての分離語及び／又は句は、それらの用語の１つ、それらの用語のいずれか、又はそれらの用語の両方を含む可能性を企図すると理解されるべきであることは、当技術分野の人々によってさらに理解されるであろう。例えば、「Ａ又はＢ」という句は、「Ａ」又は「Ｂ」あるいは「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解される。

「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などのすべての言語は、列挙された数を含み、後で範囲及び部分範囲に分解することができる範囲を指す。範囲には、個々のメンバーが含まれる。従って、例えば、１～３のメンバーを有する群は、１、２、又は３つのメンバーを有する群を指す。同様に、６つのメンバーを有する群は、１、２、３、４、又は６つのメンバーなどを有する群を指す。

法助動詞「may」(かもしれない)は、同じものに含まれるいくつかの記述された実施態様又は特徴の中の１つ以上のオプション又は選択肢の好ましい使用又は選択を指す。法助動詞「may」は、同じものに含まれる特定の実施態様又は特徴に関してオプション又は選択肢が開示されていない場合、法助動詞「may」は、同じものに含まれるいくつかの記述された実施態様又は特徴の態様の使用方法についての積極的行為と、又は同じものに含まれるいくつかの記述された実施態様又は特徴についての特定のスキルを使用するという断定的な決定を指す。この後者の文脈では、法助動詞「may」は助動詞「can」と同じ意味と意味を有する。

本明細書で使用される「それを必要とする対象」は、ヒト及び／又は非ヒト動物を含み得る。「それを必要とする対象」は、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）活性に関連する疾患又は障害を有する対象を含み得る。「それを必要とする対象」は、特に限定されるものではないが、肝細胞癌（ＨＣＣ）を含み得る細胞増殖性疾患又は障害を有する対象を含み得る。

化学物質

新規化学物質及び化学物質の用途が本明細書に開示されている。化学物質は、当技術分野で知られている用語を使用して説明することができ、以下でさらに説明される。

本明細書で使用されるダッシュ「－」、星印「＊」、又はプラス記号「＋」を使用して、任意のラジカル基又は置換基の結合点を指定することができる。

本明細書で企図される「アルキル」という用語は、１～１２、１～１０、又は１～６個の炭素原子の直鎖又は分岐基などのそのすべての異性体形態の直鎖又は分岐アルキルラジカルを含み、本明細書では、それぞれ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、及びＣ１～Ｃ６アルキルと呼ばれる。

「アルキレン」という用語は、直鎖又は分岐アルキル基のジラジカル（すなわち、直鎖又は分岐Ｃ１～Ｃ６アルキル基のジラジカル）を指す。例示的なアルキレン基には、特に限定されるものではないが、－ＣＨ₂－、－ＣＨ₂ＣＨ₂－、－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂－、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂－、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂－、－ＣＨ（ＣＨ₂ＣＨ₃）ＣＨ₂－などが含まれる。

「ハロ」という用語は、ハロゲン置換（例えば、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、又は－Ｉ）を指す。「ハロアルキル」という用語は、少なくとも１つのハロゲンで置換されているアルキル基を指す。例えば、－ＣＨ₂Ｆ、－ＣＨＦ₂、－ＣＦ₃、－ＣＨ₂ＣＦ₃、－ＣＦ₂ＣＦ₃などである。

本明細書で使用される「ヘテロアルキル」という用語は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、又はＳ原子）で置き換えられている「アルキル」基を指す。ヘテロアルキル基の１つのタイプは「アルコキシ」基である。

本明細書で使用される「アルケニル」という用語は、２～１２、２～１０、又は２～６個の炭素原子の直鎖又は分岐基など、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する不飽和の直鎖又は分岐炭化水素を指し、本明細書では、それぞれ、Ｃ２～Ｃ１２アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、及びＣ２～Ｃ６アルケニルと呼ばれる。

本明細書で使用される「アルキニル」という用語は、２～１２、２～１０、又は２～６個の炭素原子の直鎖又は分岐基など、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する不飽和の直鎖又は分岐炭化水素を指し、本明細書では、それぞれ、Ｃ２～Ｃ１２アルキニル、Ｃ２～Ｃ１０アルキニル、及びＣ２～Ｃ６アルキニルと呼ばれる。

「シクロアルキル」という用語は、３～１２、３～８、４～８、又は４～６個の炭素の一価の飽和環状、二環式、又は架橋環状（例えばアダマンチル）炭化水素基を指し、本明細書において、例えばシクロアルカンに由来して「Ｃ４～８シクロアルキル」と呼ばれる。特に他に明記しない限り、シクロアルキル基は、任意選択的に１つ以上の環位置で、例えばアルカノイル、アルコキシ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、又はカルボキシアミド、アミジノ、アミノ、アリール、アリールアルキル、アジド、カルバメート、カーボネート、カルボキシ、シアノ、シクロアルキル、エステル、エーテル、ホルミル、ハロ、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシル、イミノ、ケトン、ニトロ、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、サルフェート、スルフィド、スルホンアミド、スルホニル、又はチオカルボニルで置換される。特定の実施態様において、シクロアルキル基は置換されておらず、すなわち非置換である。

「シクロヘテロアルキル」という用語は、シクロアルカンの少なくとも１つの炭素が、例えば、Ｎ、Ｏ、及び／又はＳなどのヘテロ原子で置換されている、３～１２、３～８、４～８、又は４～６個の炭素の一価の飽和環状、二環式、又は架橋環状炭化水素基を指す。

「シクロアルキル」という用語は、１つ以上の環結合で不飽和であるシクロアルキル基を指す。

「部分的に不飽和のカルボシクリル」という用語は、カルボシクリルの少なくとも１つの環が芳香族ではない、環原子間に少なくとも１つの二重結合を含む一価の環状炭化水素を指す。部分的に不飽和のカルボシクリルは、炭素原子の数によって特徴付けることができる。例えば、部分的に不飽和のカルボシクリルは、５～１４、５～１２、５～８、又は５～６個の環炭素原子を含むことができ、従って、それぞれ５～１４、５～１２、５～８、又は５～６員の部分的に不飽和のカルボシクリルと呼ばれる。部分的に不飽和のカルボシクリルは、単環式炭素環、二環式炭素環、三環式炭素環、架橋炭素環、スピロ環式炭素環、又は他の炭素環系の形態であり得る。例示的な部分的に不飽和のカルボシクリル基には、部分的に不飽和のシクロアルケニル基及び二環式カルボシクリル基が含まれる。特に明記しない限り、部分的に不飽和のカルボシクリル基は、任意選択的に１つ以上の環位置で、例えば、アルカノイル、アルコキシ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、又はカルボキシアミド、アミジノ、アミノ、アリール、アリールアルキル、アジド、カルバメート、カーボネート、カルボキシ、シアノ、シクロアルキル、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヒドロキシル、イミノ、ケトン、ニトロ、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、サルフェート、スルフィド、スルホンアミド、スルホニル、又はチオカルボニルで置換される。特定の実施態様において、部分的に不飽和のカルボシクリルは置換されておらず、すなわち非置換である。

「アリール」という用語は当技術分野で認識されており、炭素環式及び／又は複素環式芳香族基を指す。代表的なアリール基には、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピリジニル、キノリニル、フラニル、チオニルなどが含まれる。「アリール」という用語は、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通である２つ以上の炭素環を有する多環式環系を含み（環は「縮合環」である）、ここで、環の少なくとも１つは芳香族であり、及び例えば他の環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、及び／又はアリールであり得る。特に他に明記しない限り、芳香環は、１つ以上の環位置で、例えばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、又はカルボキシアミド、カルボン酸、－Ｃ（Ｏ）アルキル、－ＣＯ₂アルキル、カルボニル、カルボキシル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド（sulfonamido）、スルホンアミド（sulfonamide）、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、アリール、又はヘテロアリール部分、－ＣＦ₃、－ＣＮなどで置換され得る。特定の実施態様において、芳香環は、１つ以上の環位置で、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシル、又はアルコキシルで置換される。特定の他の実施態様において、芳香環は置換されておらず、すなわち非置換である。特定の実施態様において、アリール基は６～１０員の環構造である。

「ヘテロシクリル」及び「複素環式基」という用語は、当技術分野で認識されており、飽和、部分的に不飽和、又は芳香族の３～１０員の環構造、あるいは３～７員の環を指し、その環構造は、１～４個のヘテロ原子、例えば窒素、酸素、硫黄を含む。ヘテロシクリル基の環原子の数は、５Ｃｘ～Ｃｘの命名法を使用して指定でき、ここで、ｘは環原子の数を指定する整数である。例えば、Ｃ３～Ｃ７ヘテロシクリル基は、窒素、酸素、硫黄などの１～４個のヘテロ原子を含む飽和又は部分的に不飽和の３～７員環構造を指す。「Ｃ３～Ｃ７」という呼称は、複素環が、環原子の位置を占める任意のヘテロ原子を含めて、合計３～７個の環原子を含むことを示す。

「アミン」及び「アミノ」という用語は当技術分野で認識されており、非置換及び置換アミン（例えば、一置換アミン又は二置換アミン）の両方を指し、ここで置換基は、例えばアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルケニル、及びアリールを含み得る。

「アルコキシ」又は「アルコキシル」という用語は、当技術分野で認識されており、上記したように、そこに結合している酸素ラジカルを有するアルキル基を指す。代表的なアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシなどが含まれる。

「エーテル」は、酸素によって共有結合された２つの炭化水素である。従って、そのアルキルをエーテルにするアルキルの置換基は、－Ｏ－アルキル、－Ｏ－アルケニル、－Ｏ－アルキニルなどのうちの１つによって表され得るようなアルコキシルであるか、又はそれに類似している。

本明細書で使用される「カルボニル」という用語は、ラジカル－Ｃ（Ｏ）－を指す。

「オキソ」という用語は、二価の酸素原子－Ｏ－を指す。

本明細書で使用される「カルボキシ」又は「カルボキシル」という用語は、ラジカル－ＣＯＯＨ又はその対応する塩、例えばラジカル－ＣＯＯＮａなどを指す。カルボキシアルキルエステルは、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒ部分（ここでＲはアルキルである）を有する化合物を指す。

本明細書で使用される「カルボキサミド」という用語は、ラジカル－Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’を指し、ここで、Ｒ及びＲ’は同じであっても異なっていてもよい。Ｒ及びＲ’は、例えば独立して、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり得る。

本明細書で使用される「アミド（amide）」又は「アミド（amido）」又は「アミジル」という用語は、－Ｒ¹Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ²）－、－Ｒ¹Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ²）Ｒ³－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ²Ｒ³、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂の形態のラジカルを指し、ここで、例えばＲ¹、Ｒ²、及びＲ³は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、アリール、アリールアルキル、カルバメート、シクロアルキル、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、水素、ヒドロキシル、ケトン、又はニトロである。

本開示の化合物は異性体であり得る。いくつかの実施態様において、開示される化合物は、異性体的に純粋でもよく、ここでその化合物は、化合物の異性体混合物内のすべての化合物の約９９％より多いことを表す。また本明細書では、異性体的に純粋な化合物を含むか、から本質的になるか、又はからなる組成物、及び／又は異性体に富む組成物を企図し、組成物は、特定の化合物の単一の異性体の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％を含むか、から本質的になるか、又はからなる。

本開示の化合物は、１つ以上のキラル中心及び／又は二重結合を含むことができ、従って、幾何異性体、鏡像異性体、又はジアステレオ異性体などの立体異性体として存在することができる。本明細書で使用される場合「立体異性体」という用語は、すべての幾何異性体、鏡像異性体、又はジアステレオ異性体からなる。これらの化合物は、キラル又は立体中心炭素原子の周りの置換基の配置及び／又は観察される旋光度に応じて、記号「Ｒ」若しくは「Ｓ」又は「＋」若しくは「－」で示され得る。開示される化合物は、様々な立体異性体及びそれらの混合物を包含する。立体異性体には、鏡像異性体とジアステレオ異性体が含まれる。鏡像異性体又はジアステレオ異性体の混合物は、命名法で（±）と指定することができるが、当業者は、構造がキラル中心を暗黙的に示す可能性があることを認識するであろう。化学構造、例えば一般的な化学構造のグラフ表示は、特に他に明記しない限り、特定の化合物のすべての立体異性体型を包含することが理解される。本明細書では、鏡像異性体を含むか、から本質的になるか、又はからなる組成物、及び／又は鏡像異性体に富む組成物が企図され、これらの組成物は、所定の化合物の単一の鏡像異性体の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（例えば、所定の化合物のＲ鏡像異性体の少なくとも約９５％）を含むか、から本質的になるか、又はからなる。

開示される化合物及び使用方法の様々な非限定的な実施態様は、ＯＡＴの触媒機構並びにＧＡＢＡ－ＡＴやＯＡＴの不活性化機構を理解することで検討することができる。いくつかの実施態様において、開示される主題は、本明細書において集合的に担体と呼ばれる１つ以上の生理学的に容認し得る又は許容し得る希釈剤、担体、補助剤、又はビヒクルと共に組成物に処方される、上記のような１つ以上のＯＡＴ阻害剤に関する。そのような接触又は投与に適した組成物は、無菌であるかどうかにかかわらず、生理学的に許容し得る水溶液又は非水溶液、分散液、懸濁液、又は乳濁液を含むことができる。得られる組成物は、本明細書に記載の様々な方法と組み合わせて、オルニチンアミノトランスフェラーゼの投与又は接触のためのものであり得る。医薬組成物と組み合わされているかどうかにかかわらず、「接触する」とは、オルニチンアミノトランスフェラーゼと１種以上の阻害剤化合物が、そのような阻害剤化合物を酵素に結合及び／又は複合体化する目的で一緒にされることを意味する。オルニチンアミノトランスフェラーゼを阻害するのに有効な化合物の量は、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当技術分野の技術の範囲内である。オルニチンアミノトランスフェラーゼ活性の阻害又はその他の影響には、ＯＡＴ活性、グルタミン酸産生、グルタミン合成、細胞増殖、及び／又は腫瘍増殖の低下、緩和、及び／又は調節、並びに排除が含まれる。

投薬量は、特定の阻害剤化合物の活性、病状、投与経路、治療期間、及び医学及び製薬分野でよく知られている同様の要因によって変化することは、当業者によって理解されている。一般に、適切な用量は、治療又は予防効果を生み出すのに有効な最低用量である量である。必要に応じて、そのような化合物、その医薬的に許容し得る塩、又は関連する組成物の有効用量を、適切な期間にわたって別々に投与される２つ以上の部分用量で投与することができる。

医薬製剤又は組成物を調製する方法は、阻害剤化合物を担体、及び任意選択的に１つ以上の追加の補助剤又は成分と一緒にする工程を含む。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. に記載されているものなどの標準的な製剤技術を使用することができる。

組成物か製剤であるかには無関係に、当業者は、そのような薬剤を投与に適したものにする際に考慮されるべき対応する因子及びパラメーターとともに、薬剤投与のための様々な手段を認識するであろう。従って、１つ以上の非限定的な実施態様に関して、開示された化合物は、ＯＡＴ活性、発現、又は過剰発現に関連する疾患又は障害の治療又は予防における治療的使用のための薬剤の製造用の阻害剤化合物として利用され得る。適切な疾患又は障害には、細胞増殖性疾患又は障害が含まれ得、これには、特に限定されるものではないが、肝細胞癌（ＨＣＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が含まれる。

一般に、様々な実施態様に関して、開示される主題は、病理学的増殖性障害の治療のための方法を対象とすることができる。本明細書で使用される「障害」という用語は、正常な機能の障害がある状態を指す。「病気」とは、影響を受ける人又はその人と接触する人に不快感、機能不全、又は苦痛を引き起こす身体又は心の異常な状態である。この用語は、怪我、障害、症候群、症状、逸脱した行動、及び構造と機能の異常な変化を含むために広く使用されることがあるが、他の文脈では、これらは区別可能なカテゴリと見なされる場合がある。「疾患」、「障害」、「症状」、及び「病気」という用語は、本明細書では等しく使用されることに留意されたい。

特定の実施態様において、開示された方法は、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）を発現する悪性増殖性障害を含む、悪性増殖性障害の治療に特に適用可能であり得る。本明細書で使用される「癌」、「腫瘍」、及び「悪性腫瘍」はすべて、組織又は臓器の過形成に同等に関連している。組織がリンパ系又は免疫系の一部である場合、悪性細胞は循環細胞の非固形腫瘍を含む場合がある。他の組織や臓器の悪性腫瘍は固形腫瘍を引き起こす可能性がある。従って本明細書に開示された化合物、組成物、及び方法は、非固形及び固形腫瘍の治療に使用することができる。

本明細書で企図される悪性腫瘍は、ＯＡＴを発現する黒色腫、癌腫、白血病、リンパ腫、及び肉腫からなる群から選択され得る。ＯＡＴを発現する悪性腫瘍を含む、本明細書に開示の方法によって治療できる悪性腫瘍は、特に限定されるものではないが、血液系悪性腫瘍（白血病、リンパ腫、及び骨髄増殖性障害を含む）、低形成性及び再生不良性貧血（ウイルス誘発性及び特発性の両方を含む）、骨髄異形成性症候群、すべてのタイプの再生不良性症候群（免疫性及び特発性の両方）、及び固形腫瘍（膀胱、直腸、胃、子宮頸部、卵巣、腎臓、肺、肝臓、乳房、結腸、前立腺、消化管、膵臓、及びカポジを含む）を含み得る。より具体的には、特定の実施態様によれば、組み合わせて使用される化合物及び組成物は、非固形癌、例えばすべてのタイプの白血病などの造血系悪性腫瘍、例えば急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肥満細胞白血病、毛状細胞白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、及び多発性骨髄腫の治療又は阻害のための方法で、並びに固形癌、例えば唇及び口腔、咽頭、喉頭、副鼻腔、主要唾液腺、甲状腺、食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、肛門管、肝臓、胆嚢、腹腔外胆管、ファーター膨大部、外分泌性膵臓、肺、胸膜中皮腫、骨、軟組織肉腫、癌腫、及び皮膚の悪性黒色腫、乳房、外陰部、膣、子宮頸部、子宮体、卵巣、卵管、妊娠性栄養芽細胞性腫瘍、陰茎、前立腺、精巣、腎臓、腎盂、尿管、膀胱、尿道、まぶたの癌腫、結膜の癌腫、結膜の悪性黒色腫、悪性黒色腫、網膜芽細胞腫、涙腺癌、眼窩、脳、脊髄、血管系の肉腫、血管肉腫、及びカポジ肉腫の治療又は阻害のための方法で使用することができる。

本明細書に開示された化合物及び組成物は、当技術分野で知られている治療方法で投与することができる。従って、様々なそのような化合物及び組成物を、そのような方法と組み合わせて任意の適切な方法で投与することができる。例えば投与は、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸、又は皮下投与、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。

いくつかの実施態様によれば、治療される対象は哺乳類対象でもよい。本明細書に開示される方法は、特にヒトの増殖性障害の治療を目的としているが、他の哺乳動物も含まれる。非限定的な例として、哺乳動物の対象には、サル、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びブタが含まれる。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される「治療する、治療している、治療」という用語は、病理学的障害を有する対象における疾患活動の１つ以上の臨床的兆候を改善することを意味する。「治療」とは治療的処置を指す。治療を必要としているのは、何らかの病的障害に苦しんでいる哺乳類の対象である。「患者」又は「必要としている対象」とは、そのような苦痛を防止、克服、調節、又は減速するために、本明細書に記載の種類の化合物又は任意の医薬組成物の投与が望まれる任意の哺乳動物を意味する。「予防的（preventive）治療」又は「予防的（prophylactic）治療」を提供することは、何か、特に症状又は病気に対して防御又は予防するように、保護的に作用することである。

より一般的には、開示された方法は、ＯＡＴ活性に関連する悪性の病理学的増殖性障害の開始、進行、及び／又は転移（例えば、他の場所の肝臓から、又は他の任意の臓器若しくは組織から肝臓への）に影響を及ぼし、調節し、低減し、阻害し、及び／又は防止することを対象とし得る（例えば、Lucero OM, Dawson DW, Moon RT, et al. A re-evaluation of the "oncogenic" nature of Wnt/beta-catenin signaling in melanoma and other cancers. Curr Oncol Rep 2010, 12, 314-318; Liu Wei; Le Anne; Hancock Chad; Lane Andrew N; Dang Chi V; Fan Teresa W-M; Phang James M. Reprogramming of proline and glutamine metabolism contributes to the proliferative and metabolic responses regulated by oncogenic transcription factor c MYC. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109(23), 8983-8988; and Tong, Xuemei; Zhao, Fangping; Thompson, Craig B. The molecular determinants of de novo nucleotide biosynthesis in cancer cells. Curr. Opin. Genet. Devel. 2009, 19(1), 32-37を参照）。

例示的実施態様
以下の実施態様は例示的なものであり、特許請求された主題の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。

実施態様１．以下の式の化合物、又はその解離型、双性イオン型、若しくは塩：

（式中、二重結合は、α炭素とζ炭素との間、又はα炭素とβ炭素との間に存在し、及び
式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれは、Ｈ、又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩなどの脱離基から独立して選択されるが、但し、Ｒ¹及びＲ²の少なくとも１つはＨではない）。

実施態様２．アンモニウム部分及びカルボキシレート部分を含む、双性イオン型の、実施態様１に記載の化合物。

実施態様３．前記二重結合がα炭素とζ炭素との間にある、実施態様１又は２に記載の化合物。

実施態様４．前記二重結合がα炭素とβ炭素との間にある、実施態様１又は２に記載の化合物。

実施態様５．Ｒ¹及びＲ²の少なくとも１つがＦである、前述の実施態様のいずれかに記載の化合物。

実施態様６．前記化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びこれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、前述の実施態様のいずれかに記載の化合物。

実施態様７．前記アンモニウム塩が、プロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、実施態様６に記載の化合物。

実施態様８．医薬的に許容可能な担体成分を含む医薬組成物中の、前述の実施態様のいずれかに記載の化合物。

実施態様９．以下の式：

及び任意選択的に、

（式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれはＨ及びＦから独立して選択されるが、但しＲ¹及びＲ²の少なくとも１つはＦである）の前述の実施態様のいずれかの化合物、又はその塩であり、前記化合物は任意選択的に以下の式を有する：

又は

実施態様１０．Ｒ¹及びＲ²のそれぞれがＦである、実施態様９に記載の化合物。

実施態様１１．前記化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びこれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、実施態様９に記載に記載の化合物。

実施態様１２．前記アンモニウム塩が、プロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、実施態様１１に記載の化合物。

実施態様１３．医薬的に許容可能な担体成分を含む医薬組成物中の実施態様９に記載の化合物。

実施態様１４．以下の式：

（式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれはＨ及びＦから独立して選択されるが、但しＲ¹及びＲ²の少なくとも１つはＦである）の前述の実施態様のいずれかの化合物、又はその塩であり、及び前記化合物は任意選択的に以下の式を有する：

又は

実施態様１５．Ｒ¹及びＲ²のそれぞれがＦである、実施態様１４に記載の化合物。

実施態様１６．前記化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びこれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、実施態様１４に記載の化合物。

実施態様１７．前記アンモニウム塩が、プロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、実施態様１６に記載の化合物。

実施態様１８．医薬的に許容可能な担体成分を含む医薬組成物中の実施態様１４に記載の化合物。

実施態様１９．以下を含む医薬組成物：（ｉ）前述の実施態様のいずれかに記載の化合物；及び（ｉｉ）医薬的に適切な担体、希釈剤、又は賦形剤。

実施態様２０．以下を含む医薬組成物：（ｉ）実施態様９に記載の化合物；及び（ｉｉ）医薬的に適切な担体、希釈剤、又は賦形剤。

実施態様２１．以下を含む医薬組成物：（ｉ）実施態様１４に記載の化合物；及び（ｉｉ）医薬的に適切な担体、希釈剤、又は賦形剤。

実施態様２２．オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）活性を調節する方法であって、以下を含む方法：（ｉ）任意選択的に、請求項１～１８のいずれかに記載の化合物を提供すること；そして（ｉｉ）請求項１～１８のいずれかに記載の化合物を、ＯＡＴ活性を調節するのに十分な化合物の量で、ＯＡＴを含む媒体に接触させること。

実施態様２３．前記二重結合がα炭素とζ炭素との間にある、実施態様２２に記載の方法。

実施態様２４．前記二重結合がα炭素とβ炭素との間にある、実施態様２２に記載の方法。

実施態様２５．Ｒ¹及びＲ²の少なくとも１つがＦである、実施態様２２～２４のいずれかに記載の方法。

実施態様２６．前記化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びこれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、実施態様２２～２５のいずれかに記載の方法。

実施態様２７．前記アンモニウム塩が、プロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、実施態様２６に記載の方法。

実施態様２８．前記接触がインビボである、実施態様２２～２７のいずれかに記載の方法。

実施態様２９．ヒトの癌によって発現されるＯＡＴの活性を低下させる方法であって、以下を含む方法：（ｉ）任意選択的に、請求項１～１８のいずれに記載の化合物を提供すること；そして（ｉｉ）請求項１～１８のいずれかに記載の化合物を、ＯＡＴ活性を低下させるのに十分な化合物の量で、ＯＡＴを発現する癌を含む細胞媒体に接触させること。

実施態様３０．前記二重結合がα炭素とζ炭素との間にある、実施態様２９に記載の方法。

実施態様３１．前記二重結合がα炭素とβ炭素との間にある、実施態様２９に記載の方法。

実施態様３２．Ｒ¹及びＲ²の少なくとも１つがＦである、実施態様２９～３１のいずれかに記載の方法。

実施態様３３．前記化合物が医薬組成物で提供される、実施態様２９～３２のいずれかに記載の方法。

実施態様３４．前記接触がインビボである、実施態様２９～３３のいずれかに記載の方法。

実施態様３５．前記接触が、それを必要とするヒト対象との接触である、実施態様２９～３３のいずれかに記載の方法。

実施態様３６．それを必要とする対象の癌を治療するための方法であって、実施態様１～１８のいずれかに記載の化合物の治療有効量を対象に投与することを含む方法。

実施態様３７．前記二重結合がα炭素とζ炭素との間にある、実施態様３６に記載の方法。

実施態様３８．前記二重結合がα炭素とβ炭素との間にある、実施態様３６に記載の方法。

実施態様３９．Ｒ¹及びＲ²の少なくとも１つがＦである、実施態様３６～３８のいずれかに記載の方法。

実施態様４０．前記癌がオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）の発現又は過剰発現によって特徴付けられる、実施態様３６～３９のいずれかに記載の方法。

実施態様４１．癌前記が肝細胞癌（ＨＣＣ）である、実施態様３６～４０のいずれかに記載の方法。

実施態様４２．前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、実施態様３６～４１のいずれかに記載の方法。

以下の実施例は例示的なものであり、請求された主題の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。以下の非限定的な実施例及びデータは、開示された化合物、組成物、及び、例えば、特に限定されるものではないが、肝細胞癌（ＨＣＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む細胞増殖性疾患及び障害などの、ＯＡＴ活性、発現、又は過剰発現、及び／又はオルニチンアミノトランスフェラーゼ活性の低下に関連する疾患及び障害の治療を含む方法、に関連する様々な態様及び特徴を示す。本発明の有用性は、共に使用することができるいくつかの化合物及び組成物の使用によって示されるが、本発明の範囲に応じた種々の他の化合物で、匹敵する結果が得られることは、当業者に理解されるであろう。

実施例１ γ－アミノ酪酸の２つのシクロヘキセン類似体によるヒトオルニチンアミノトランスフェラーゼの不活性化の機構に、１つのフッ素原子が与える顕著な違い

原稿Zhu, Wei et al. “A Remarkable Difference That One Fluorine Atom Confers on the Mechanisms of Inactivation of Human Ornithine Aminotransferase by Two Cyclohexene Analogues of γ-Aminobutyric Acid.”J.Am.Chem.Soc. vol. 142,10: 4892-4903, March 1, 2020を参照されたい。その内容は参照によりその全体が組み込まれている。

要約

ピリドキサール５－リン酸依存性酵素であるヒトオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）は、肝細胞癌（ＨＣＣ）の進行において重要な役割を果たす。ｈＯＡＴの薬理学的選択的阻害は、ＨＣＣの潜在的な治療アプローチであることが示されている。非選択的アミノトランスフェラーゼ不活性化剤（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）－３－アミノ－４－フルオロシクロペンタン－１－カルボン酸（１）の発見に触発されて、この研究では、新規シリーズのフッ素置換シクロヘキセン類似体を、合理的に設計、合成、及び評価し、それにより８と９を新規の選択的ｈＯＡＴ時間依存性阻害剤として同定した。未変性のタンパク質質量分析及びタンパク質結晶解析は、８と９を新規選択的ｈＯＡＴの共有結合阻害剤として示し、これらは、単一のフッ素原子の違いに起因する２つの異なる不活性化機構を示す。興味深いことに、代謝物の質量分析ベースの分析とフッ化物イオン放出実験によると、これらは同様のターンオーバー機構を共有している。分子動力学（ＭＤ）シミュレーションと静電ポテンシャル（ＥＳＰ）電荷計算を実施すると、対応する中間体に対する１つのフッ素の違いの重要な影響が解明され、２つのまったく異なる不活性化経路がもたらされた。９の新規付加芳香族化不活性化機構は、他のアミノトランスフェラーゼよりも優れた選択性とともに、その顕著に増強された効力に貢献する。

緒言

原発性肝癌の９０％を占める肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界で２番目に多い癌死亡の原因である^1-4。ＨＣＣは通常、進行した病期で診断され、及び腫瘍は通常、標準治療である受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ソラフェニブ、及び放射線療法^5-8による全身治療に抵抗性であるため、今日まで、ＨＣＣの効果的な治療法はない。ヒトオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）は、ピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素⁹であり、先天性の代謝エラー¹⁰ 及び肝細胞癌（ＨＣＣ）の進行¹¹に関与する。機構的には、２つの結合した半反応物がｈＯＡＴのトランスアミノ化サイクルに関与している（図１）。前半の反応では、ｈＯＡＴは、ＰＬＰとオルニチンからピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）とグルタミル－５－セミアルデヒドへの変換を触媒し、これは自発的に環化してΔ１－ピロリン－５－カルボキシレート（Ｐ５Ｃ）になる¹²。生成されたＰ５Ｃは、さらにピロリン－５－カルボン酸リダクターゼ（ＰＹＣＲ）によってプロリンに変換される^13,14。後半の反応では、ＰＭＰとα－ケトグルタル酸（α－ＫＧ）がＰＬＰとＬ－グルタミン酸（Ｌ－Ｇｌｕ）に変換され、これはまた、ピロリン－５－カルボン酸シンターゼ（Ｐ５ＣＳ）によってＰ５Ｃに変換され得る。増大する証拠は、プロリン代謝が代謝再プログラミングにおいて重要な役割を果たして、中央の中間体としてのＰ５Ｃのアップレギュレートされた合成とともに、癌増殖を維持していることを示している^15-17。ＨＣＣにおける代謝再プログラミングは、プロリン／ヒドロキシプロリン代謝経路の活性化によって特徴付けられ、これが、ＨＩＦ１ａ依存性の腫瘍進行とソラフェニブ耐性を維持している¹⁸。さらに、ｈＯＡＴによって生成されたグルタミン酸は、同化及び増殖細胞プログラムを維持するグルタミン合成酵素（ＧＳ）によってグルタミンに変換できる¹⁹。異常な発癌性のＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達のために、ｈＯＡＴ及びグルタミン生成酵素はＨＣＣで強く活性化され、一般的に過剰発現されることが分かった^20,21。ｈＯＡＴの選択的阻害は、インビボでＨＣＣ腫瘍増殖を効果的に抑制することが証明されている¹¹。さらに最近は、ｈＯＡＴの特異的ノックダウンが、インビトロ及びインビボで非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の増殖を抑制することもわかっている²²。まとめると、ｈＯＡＴは、プロリン及びグルタミン代謝経路を介してＨＣＣの代謝再プログラミングにおいて重要な役割を果たし、ｈＯＡＴの選択的阻害は、ＨＣＣ及びその他の関連する癌の治療のための有望な治療戦略として機能する。１４の既知のアミノトランスフェラーゼの中で、ｈＯＡＴは、一次構造が類似しているため、γ－アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＡＢＡ－ＡＴ）と同じ亜群に属している²³。ｈＯＡＴとＧＡＢＡ－ＡＴは非常に類似した活性部位を有し²⁴、従って。ＧＡＢＡ－ＡＴのいくつかの強力な阻害剤がｈＯＡＴも阻害することは驚くべきことではない¹¹。長年にわたり、我々の研究室は、ＧＡＢＡ－ＡＴの機構ベースの不活性化因子（ＭＢＩ）の合理的な設計に焦点を当ててきた²⁵。ＭＢＩは、標的酵素の非反応性代替基質であり、これは、触媒部位の活性種に変換され、次に、酵素との共有結合、緊密な結合阻害、又は機能的に不可逆的な阻害機構を介して不活性化を引き起こす²⁶。例えば、（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）－３－アミノ－４－フルオロシクロペンタン－１－カルボン酸（１）は、スキーム１に示すように、同じエナミン機構を介してｈＯＡＴ²⁷とＧＡＢＡ－ＡＴ²⁸を不活性化することが報告されている。計画された不活性化機構はシッフ塩基２の形成によって開始され、これは律速的脱プロトン化とフッ化物イオンのインサイチュ脱離を受けて、中間体４が得られる。活性エナミン５がシッフ塩基交換反応によって形成され、次にＬｙｓ結合ＰＬＰ複合体への５の求核付加により、共有結合付加物６が生成される。

スキーム１．１によるｈＯＡＴ及びＧＡＢＡ－ＡＴの不作用の機構。

ＭＢＩは、それらが活性部位で活性化されるまで不活性であるため、望ましくないオフターゲット作用を大幅に減らすことができる。さらに重要なことに、これらの不活性化剤は、低用量でも従来の阻害剤よりも高い効力と選択性を示すことができる^11,29,30。２０１５年に、ＧＡＢＡ類似体７（図２）がｈＯＡＴの選択的ＭＢＩとして報告され、これは、α－フェトプロテインレベル（ＨＣＣのバイオマーカー）を劇的に低下させ、０．１及び１．０ｍｇ／ｋｇの用量でインビボのＨＣＣ腫瘍増殖を抑制した¹¹。ごく最近、７の不活性化機構も明らかになった³¹。

本発明者らは、新規の不活性化機構を有する強力かつ選択的なｈＯＡＴ不活性化剤を発見することに関心を抱いてきた。ここで本発明者らは、シクロペンタンベースの類似体１に基づいて、フッ素置換シクロヘキセンベースのＧＡＢＡ類似体８～１１（図２）を合理的に設計及び合成した。その中で、化合物（９）は、ｈＯＡＴの不活性化剤として７より２３倍効率的であり、他のアミノトランスフェラーゼ（ＧＡＢＡ－ＡＴなど）よりも優れた選択性を備えている。本発明者らはまた、質量分析、結晶解析、及びその他のさまざまな生化学的方法を通じて、８と９の不活性化及びターンオーバーの機構を解明し、単一のフッ素原子の違いが不活性化機構を劇的に変化させると結論付けることができる。

結果と考察

新規ＯＡＴ不活性化剤の設計。同じような結合ポケットがｈＯＡＴとＧＡＢＡ－ＡＴで観察され、これはリガンドのアンカーポイント間に実質的に同じ距離を生じさせる。興味深いことに、ｈＯＡＴのＴｙｒ５５は、ＧＡＢＡ－ＡＴのＰｈｅ３５１と同様の立体空間を部分的に占めている。より疎水性の高いＰｈｅ３５１残基がＧＡＢＡ－ＡＴの活性部位に侵入するため、より小さなＧＡＢＡ分子のみが適合する。ｈＯＡＴ触媒部位は、ＧＡＢＡより１炭素長いオルニチンを収容するために、より柔軟で大きくなっている³²。さらに、ユニークなＴｙｒ５５残基は、ｈＯＡＴの活性部位のより親水性の高い基質と、余分な水素結合を形成する可能性を提供する³¹。既に、シクロペンタンベースのＧＡＢＡ類似体１は、ｈＯＡＴとＧＡＢＡ－ＡＴに対する二重阻害剤として同定された。１の比較的小さいサイズのため、これはｈＯＡＴ及びＧＡＢＡ－ＡＴの触媒ポケットに収まり、その選択性が低いことと一致する²⁷。従って我々は、シクロヘキセン誘導体８～１１の比較的大きなサイズが、ＧＡＢＡ－ＡＴよりもｈＯＡＴの選択性を改善する可能性があると仮定した（図２）。さらに、α／β位（８／９）に二重結合を組み込むと、おそらくアミノ基に隣接するプロトンの酸性度が上がることにより、二重結合異性体１０／１１と比較して阻害活性³³が向上する可能性がある。

ＭＢＩは通常、最初に基質として作用し、続いて触媒部位に活性中間体が形成され、その後、これは異なる機構的経路を介して酵素を不活性化する。従って、不活性化機構の提唱は、潜在的なＭＢＩの合理的設計の初期段階で重要な役割を果たす。８／９について３つの可能な不活性化機構が、スキーム２で提唱されている。すべての機構はシッフ塩基形成（１２ａ／１２ｂ）によって開始され、その後のＨＦ除去により、１の既知の機構に基づいて、反応種１４ａ／１４ｂが生成される（スキーム１）。機構的経路ａは１の不活性化機構に類似しており、Ｌｙｓ２９２による１４ａ／１４ｂのイミノ転移後に、活性エナミン１５ａ／１５ｂが放出される可能性がある。その後のエナミンの添加は、付加物１６ａ／１６ｂの形成を伴う不活性化につながる可能性がある。付加物１６ｂの２番目のフッ化物イオンをさらに放出して芳香族付加物１７を得ることができる。機構的経路ｂは、１４ａ／１４ｂを直接芳香族化して、緊密な結合付加物２０ａ／２０ｂを生成し、これは、別のフッ素化シクロヘキセン類似体の不活性化機構と同様である³⁴。機構的経路ｃは、共役オレフィン１４ａ／１４ｂへのＬｙｓ２９２の求核付加を含み、付加物２１ａ／２１ｂを生成する。

２１ｂの場合、第２のフッ化物イオンの除去後に、より安定な共有結合芳香族付加物（２６）を生成することが可能である。

分子ドッキング。環のサイズ間の立体障害の違いをよりよく理解するために、１と８の分子ドッキング研究³⁵を使用してこれらの結合ポーズを、未変性の基質と比較して、ＧＡＢＡ－ＡＴとｈＯＡＴの活性部位で模倣した。分子ドッキング研究に基づくと、ＧＡＢＡはＧＡＢＡ－ＡＴの活性部位で結合し、残基Ａｒｇ１９２、Ｔｙｒ６９、及びＧｌｕ２７０と水素結合を確立する（データは示していない）。ＧＡＢＡのこの推定上の結合ポーズは、そのγ－アミノ基をＬｙｓ３２９－ＰＬＰ複合体の近くに配置し、その後のシッフ塩基交換を促進する。１の結合モデルは、これらの残基との同様の水素結合を示している（データは示していない）。ただし、分子ドッキングは、８がＨｉｓ２０６とより安定した水素結合を形成することにより、Ｌｙｓ３２９－ＰＬＰ複合体との最初の反応を妨げる可能性のある残基Ｐｈｅ３５１との衝突の可能性を回避していることを示している（データは示していない）。同様に、オルニチンとｈＯＡＴの結合モデルは、δ－アミノ基が活性部位に深く入り、Ｔｈｒ３２２と明確な水素結合を形成することを示しており（データは示していない）、こうして、これがＬｙｓ２９２－ＰＬＰ複合体の近くに配置される。ドッキングモデルでは、８のアミノ基がＴｈｒ３２２と同様の水素結合を形成し（データは示していない）、１のドッキングポーズは、代わりにＧｌｕ３２５と水素結合を形成することを示している（データは示していない）。これらのドッキング結果は、基質としてより大きなシクロヘキセン類似体はｈＯＡＴ活性部位では好ましいが、ＧＡＢＡＡＴ活性部位では１と比較して好ましくないことを示しており、これは、上記の我々の設計戦略と一致している。

ＭＢＩのγ位のキラリティーは、不活性化プロセスのための及びそれらの阻害活性を保持するために非常に重要であることが見出された²⁵。興味深いことに、８の鏡像異性体は、ｈＯＡＴの活性部位において同様の結合ポーズを示す（データは示していない）。γ位のＬｙｓ支援脱プロトン化は、初期の類似体の律速段階であることが分かった³⁶。従って、ｈＯＡＴの触媒ポケットにおける活性中間体１２ａ（データは示していない）とその鏡像異性体（データは示していない）の結合ポーズを予測するために、分子ドッキング研究も実施した。これらの中間体の両方のカルボキシレート部分は、Ｔｙｒ５５及びＡｒｇ１８０と水素結合を確立するが、１２ａ－鏡像異性体の異なるキラリティーは、そのγ－プロトンを反対側に向けさせ、これが、触媒性Ｌｙｓ２９２から離れるように向ける（３．０Å対５．３Å）。このドッキングシミュレーションはまた、以前の不活性化剤の観察とも一致しており、キラル的に純粋な類似体の合成を維持する。

フッ素置換シクロヘキセン類似体８～１１の合成。８～１１の合成経路をスキーム３に示す。ジ－ＰＭＢ中間体（２９）は、キラル的に純粋な出発物質２７から、３つの連続した工程（分子内環化、立体選択的エポキシド開環、及び過剰のアニスアルデヒドによる還元的アミノ化）によって得られた。得られた中間体（２９）をXtalFluor-M及び（ＨＦ）₃Ｅｔ₃Ｎで処理してトランス異性体３０のみが中程度の収率で生成され³⁷、ここで、アジリジニウム機構経路が関与している可能性がある。ジ－ＰＭＢ保護された中間体³⁰からＢｏｃ保護された中間体³¹への直接変換は、Ｂｏｃ₂Ｏの存在下でＰｄ（ＯＨ）₂触媒による水素化によって達成された。中間体３１をＰｈＳｅＣｌとＫＨＭＤＳで処理した後、ｍ－ＣＰＢＡで酸化的に除去して、オレフィン異性体３２ａと３２ｂを得て、これらをクロマトグラフィーで分離した後、それぞれ８と１０に脱保護した。以前の報告に基づいて、アルコール３３³⁸は、キラル的に純粋な２７から調製することができる。次に、３３をＰＣＣで酸化してケトン３４を得た。さまざまなフッ素化試薬と反応温度をスクリーニングした後、主要な中間体３５が中程度の収率で得られ、これは、モノフルオロアルケン不純物の生成を回避した³⁹。８と１０を作成するために用いたものと同じ方法を使用して、中間体３５をジフルオロオレフィン異性体３６ａ及び３６ｂに変換し、これらをさらにそれぞれ９と１１に脱保護した。

フッ素置換シクロヘキセン類似体の速度論的研究。インビトロ研究は、フッ素置換シクロヘキセン類似体８～１１が、ＧＡＢＡ－ＡＴよりも良好な選択性でｈＯＡＴを阻害することを示した（表１）。この結果は、６員環類似体が、はるかに大きいＫＩ値を有する１よりも、ＧＡＢＡ－ＡＴへの結合親和性が低く、これは、環サイズが大きいと、類似体と比較的小さくて硬い活性部位を有するＧＡＢＡ－ＡＴとの結合相互作用が妨げられる可能性があることを示している。選択性は、最初の設計戦略及び最初の結合工程のドッキング結果と一致している（データは示していない）。

α／β位での二重結合の導入又はδ位での別のフッ素の導入は、ｈＯＡＴ及びＧＡＢＡ－ＡＴの両方に対する不活性化効率を顕著に増強し、これは、おそらくγ位の酸性度の低下又は不活性化機構の変化に起因する可能性がある。これらの中で、最良の化合物（９、ｋ_inact／Ｋ_I＝２０．３３ｍｉｎ^-1ｍＭ^-1）は、強力なインビボ抗腫瘍効率を示した７（ｋ_inact／Ｋ_I＝０．８７ｍｉｎ^-1ｍＭ^-1）よりも、ｈＯＡＴの不活性化剤として２３倍効率的である。さらに９は、効率定数（ｐＨ８．０、ｋ_inact／Ｋ_I＝１．５２ｍｉｎ^-1ｍＭ^-1；ｐＨ６．５、ｋ_inact／Ｋ_I＝０．１８ｍｉｎ^-1ｍＭ^-1）がより低く、高濃度（５～２０ｍＭ、図４、５、及び６）でさえも、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｓｐ－ＡＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａｌａ－ＡＴ）に対する阻害活性がほとんど又はまったくないＧＡＢＡ－ＡＴよりも優れた選択性を示す。

アミノトランスフェラーゼの能力のより良い理解のために、及び新しい不活性化剤の将来の合理的な設計のために、８と９の不活性化機構を研究した。前述の機構（スキーム２）のいずれかが８と９によるｈＯＡＴの不活性化の原因であるかどうかを決定するために、透析及びフッ化物イオン放出研究を含む一連の実験を実施して、不活性化された酵素のタンパク質の質量スペクトル及び結晶構造を取得した。

透析。８と９は、共有結合又は緊密結合機構を介してｈＯＡＴを不活性化するように設計されているが、ｈＯＡＴの時間依存的な再活性化を実施して、不活性化中に可逆成分も関与しているかどうかを決定した³⁰。４～２５当量の８又は０．６～２．０当量の９により、ｈＯＡＴ活性を部分的又は完全になくした後、これらを透析し、異なる時間間隔でアリコートを収集し、酵素活性の回復についてアッセイした。４８時間の透析後に酵素活性は回復せず（図７及び８）、ｈＯＡＴの完全な不可逆的阻害を示していた。

８又は９によって改変されたｈＯＡＴの未変性タンパク質の質量分析。未変性のタンパク質質量分析法は、改変アミノトランスフェラーゼの共有付加物又は緊密な結合付加物を決定するための効率的なツールとして役立った^31,41。特に、イミン基の加水分解及びＰＬＰ又はＰＭＰの損失が共通して観察された³¹。未変性のｈＯＡＴ又は潜在的な共有付加物の既存の不安定な群を考慮して、理論上の質量差を表２に示すように計算した。ｈＯＡＴが８によって不活性化された場合、１つの改変種（４６５０６．０８±０．２１Ｄａ）が質量分析により観察された。＋３６９．２９Ｄａの質量シフトが観察された、これは、経路ａの付加物１６ａに対応する（スキーム２）。９の場合、質量分析によって検出された未変性の酵素（４６１３８．３２±０．１０Ｄａ）と１つの改変種（４６５０４．６６±０．１３Ｄａ）から＋３６６．３４Ｄａの質量シフトが観察された。この質量シフトは、経路ａの付加物１７又は経路ｃの付加物２６のいずれかに対応する（スキーム２）。

８又は９によって不活性化されたｈＯＡＴのＸ線結晶解析。８によって不活性化されたｈＯＡＴの未変性のタンパク質質量スペクトルにおいて、＋３６９．２９Ｄａの非常に正確な質量シフトが観察されたが、付加物１６ａと２２の間には１．０２Ｄａの差しかなかった。さらに、９によって不活性化されたｈＯＡＴの未変性のタンパク質質量分析によって、付加物１７と２６を区別することは困難である。８／９の不活性化機構をよりよく解釈するために、８／９によって不活性化されたｈＯＡＴのタンパク質結晶解析を実施して、それぞれ活性部位で形成された付加物を確認した。

８／９によって不活性化されたｈＯＡＴの構造は、すべての水分子及びリガンド原子が削除された後、過去に報告されたｈＯＡＴの構造（ＰＤＢコード１ＯＡＴ）からのモノマーを使用して分子置換によって解決された。ｈＯＡＴ－８の場合、空間群Ｃ１２１では、１つの非対称ユニットが３つのモノマーを含むことが分かった。非対称ユニット内の２つのモノマーは、ホモダイマーとして生物学的集合体を形成した。３つ目のモノマーは、別の非対称ユニットに存在する別のモノマーとホモダイマーを形成した。ｈＯＡＴ－９の場合、空間群Ｐ３１１２では、１つの非対称ユニットが３つのモノマーを含むことも分かった。生物学的集合体は、結晶解析的対称性によって観察することができる。ｈＯＡＴ－８とｈＯＡＴ－９の最終モデルは、それぞれ２．２０と１．９０Åの解像度まで精密化され、ＲＦｒｅｅ／Ｒｗｏｒｋ値はそれぞれ１５．７０％／１９．９０％と２７．４９％／２３．９８％であった。最終的な精密化統計値を例２、表３に示される。ＰＬＰ、リガンド、及びＬｙｓ２９２を省略して、各構造のポルダーマップ（polder map）⁴²が作成された（データは示していない）。ＰＬＰの密度は、両方の構造のポルダーマップで明確に表された。８と９の密度も観察され、最終的な付加物で予想されるように、環とカルボキシレート部分の存在を明確に示している。ｈＯＡＴ－８／９の解決された構造は、ＰＤＢバンクに登録されている（ＰＤＢコード：６Ｖ８Ｄ及び６Ｖ８Ｃ）。

ｈＯＡＴ－８及びｈＯＡＴ－９の両方の活性部位内で、三元付加物が観察された。不活性化されたｈＯＡＴ－８とｈＯＡＴ－９の活性部位の比較に基づいて、８と９は、異なる部位ではあるが、ＰＬＰとＬｙｓ２９２の両方と反応及び共有結合し、それぞれ三元付加物を形成する。ｈＯＡＴ－８結晶構造では、ＰＬＰとＬｙｓ２９２は中央の炭素原子で不活性化剤と結合しており、１６ａを生成する。この結果はＭＳデータと一致し、最終付加物として２２を除外し、ここでＰＬＰとＬｙｓ２９２は、異なる位置で不活性化剤と共有結合を形成する。従って、経路ａは、経路ｃではなく、８による不活性化の最も可能性の高い機構である（スキーム２）。ｈＯＡＴ－９結晶構造では、Ｌｙｓ２９２とＰＬＰが不活性化剤と共有結合を形成して２６を生成する。付加物にフッ素原子が残っていることを示唆する密度は観察されなかった。このように、フッ素の完全な喪失と付加物上の共有結合の存在により、未変性のタンパク質質量分析によって結論付けられたように、不活性化の可能性のある機構としての経路ｂ（スキーム２）が除外される。ｈＯＡＴ－９の活性部位の三元付加物は、１７のように中心原子ではなく、環に沿った２つの別々の位置で結合している。ポルダーマップ（Ｆｏ－Ｆｃ）によって生成される電子密度は、リシンとＰＬＰの間に形成されたＣ－Ｎ結合を完全に囲み、９が経路ｃを介してｈＯＡＴを２６に不活性化することを示唆している（スキーム２）。さらに、Ｔｈｒ３２２は６員環の中心に位置し、付加物と孤立電子対－芳香族相互作用⁴³（２．９Å）を形成しているように見え（データは示していない）、これは２６の形成を維持する。

図３（右）に示されるように、２６のカルボキシレート上の両方の酸素原子は、Ｔｙｒ５５と水素結合（２．７及び３．３Å）を確立するが、１６ａのカルボキシレート上の１つの酸素原子（図３、左）のみが、Ｔｙｒ５５と水素結合（２．７Å）に関わることが観察された。Ｔｙｒ５５との相互作用が優先され、不活性化されたｈＯＡＴ－７の結晶構造にも同様の相互作用がある³¹。１６ａと２６の両方のカルボキシレートは、Ｇｌｙ３２０のペプチド骨格とｎ－π^*相互作用（両方とも３．３Å）を形成することが観察されたが、未変性の基質認識に不可欠な⁴³Ａｒｇ１８０との相互作用はない。オルニチンのα－アミノ基と水素結合を形成すると想定されるＧＡＢＡ－ＡＴの活性部位^44,45と比較して、Ｔｙｒ５５はｈＯＡＴの活性部位にある独特の残基である。ＧＡＢＡ類似体８と９とＴｙｒ５５との相互作用は、天然の基質であるオルニチンより１炭素少ないにもかかわらず、高い効力に寄与する。

ターンオーバー機構。１がアミノトランスフェラーゼによって代謝物に変換され、ＰＬＰ又はＰＭＰが放出されることは、既にわかっていた²⁷。１と８／９との構造的類似性を考慮して、スキーム４に示されるように、２つの可能なターンオーバー経路が提唱されている。ＰＬＰと８／９によるシッフ塩基形成とそれに続くリジン支援脱プロトン化により中間体１３ａ／１３ｂが生成される。中間体１３ａ／１３ｂは、補酵素の直接プロトン化を介して中間体３７ａ／３７ｂに変換できる。形成されたイミンはさらに加水分解されて、ＰＭＰと代謝物３８ａ／３８ｂが放出される可能性がある。このＰＭＰターンオーバー機構は、ｈＯＡＴによるオルニチンの分解に似ている。中間体１３ａ／１３ｂはまた、フッ化物イオンの除去及びイミンの加水分解を受けて、エナミン１５ａ／１５ｂを放出することができ、これは加水分解されてケトン３９ａ／３９ｂが得られる。このＰＬＰターンオーバー機構では、再生されたＰＬＰは、α－ＫＧがない場合でも、不活性化剤とシッフ塩基をさらに形成するであろう。上記のターンオーバー機構のいずれかが８と９によるｈＯＡＴの不活性化プロセス中に関与しているかどうかを決定するために、我々は、これら２つの不活性化剤の代謝物について、分配比実験、フッ化物イオン放出の測定、及び質量分析を実施した。

分配比とフッ化物放出。分配比は、基質として作用する化合物と酵素を不活性化する化合物との比率である。理想的には、添加された化合物の当量に対する残存酵素活性のプロットは、１００～０％の残存酵素活性の直線を与える。ｘ軸の切片は、各酵素分子を不活性化するために必要な不活性化分子の数（ターンオーバー数）を示す。この数には、酵素を不活性化するために必要な不活性化剤の１分子が含まれる。従って、分配比はターンオーバー数から１を引いたものである（不活性化剤と酵素の化学量論が１：１であると仮定）。従って、８／９の分配比は、不活性化剤の当量を変化させ既知量のｈＯＡＴを用いて、酵素を力価測定することによって決定された（図９及び１０）。線形関係を外挿して、酵素を完全に不活性化するために必要な正確な当量が算出された。ここから、８の分配比が２２．０であり９の分配比が０．８であると決定した。

ＰＬＰ及びＰＭＰターンオーバー経路では、フッ化物イオンの異なる当量が放出され得る^29,31。α－ＫＧの非存在下では、ＰＭＰがターンオーバー機構で形成されると、これはＰＬＰに戻すことができず、その結果、放出されるフッ化物イオンが１当量未満になる。フッ化物イオンが放出された後、ターンオーバー機構中にＰＬＰが再生されると、複数当量のフッ化物イオンが放出される。酵素のターンオーバーごとに放出されるフッ化物イオンの数は、フッ化物イオン選択性電極を使用して検出することができる。α－ＫＧの非存在下で過剰の８を用いてｈＯＡＴが不活性化されると、１つの酵素活性部位あたり２２．７当量のフッ化物イオンが放出された（実施例２、表４）。９の場合、１つの酵素活性部位あたり２．９当量のフッ化物イオンが放出された（実施例２、表４）。これらの結果は、不活性化の前に追加当量のフッ化物イオンの放出を有するターンオーバー機構の一部として、８と９のターンオーバー機構がＰＬＰを再生する必要があり、これは、それぞれこれらの分配比に一致することを示している。

代謝物の質量分析に基づく分析。不活性化されたｈＯＡＴ試料８／９のサイズ排除ろ過後、濾液を非標的化メタボロミクス（±ＥＳＩＨＲＭＳ）により分析し、代謝物を検出した。ＰＬＰターンオーバー経路の代謝物３９ａ（ｍ／ｚ１３９．０３９３、［Ｍ－Ｈ］－１）及び３９ｂ（ｍ／ｚ１５７．０３０１、［Ｍ－Ｈ］－１）が検出され、それらの断片化スペクトルによって確認された（データは示していない）。ＰＬＰ及びＰＭＰの標準物質はＨＲＭＳによって追跡され、前駆体のＨＣＤベースの断片化を使用して、代謝物の検出と保持時間を確認した（データは示していない）。８と９の両方の試料で、質量分析によってＰＬＰのみが検出された（ｍ／ｚ２４８．０３１６、［Ｍ＋Ｈ］＋１）。ＰＭＰもＰＭＰの付加物も観察されなかった（データは示していない）。全体として、メタボロミクスの結果は、これら２つの化合物が、同様のＰＬＰ再生ターンオーバー機構を経ることを示している（スキーム４）。

ｈＯＡＴを用いた８と９の可能性の高い機構。上記の不活性化及びターンオーバー機構の研究に基づいて、不活性化剤８の改変された機構経路をスキーム５に示す。シッフ塩基１２ａが最初に形成され、続いて脱プロトン化されて中間体１３ａが得られる。フッ化物イオン放出実験とメタボロミクスの結果に基づいて、中間体１３ａは完全に中間体１４ａに変換される。次に、シッフ塩基１４ａは、共役オレフィン位置ではなくＰＬＰイミン位置でＬｙｓ２９２によって攻撃される。８の分配比によると、活性エナミン１５ａのわずか４％が不活性化のためにＬｙｓ－ＰＬＰ複合体を攻撃し（経路ａ）、その９６％が加水分解されて３９ａを与える（経路ｂ）。

スキーム６に示されるように、不活性化剤９のための改変された機構経路が提唱される。活性中間体１４ｂは、同様のフッ化物イオン放出プロセスを介して形成されるが、不活性化は、共役二重結合へのリジンの付加によって発生する。形成された付加物はさらに安定な芳香族付加物（２６；５６％、経路ａ）に変換され、中間体１４ｂの４４％が不活性エナミン１５ｂに変換され、これはＬｙｓ－ＰＬＰ複合体を攻撃せず、加水分解されて代わりに代謝物３９ｂを与える（経路ｂ）。

付加物１６ａ／２６の構造は、未変性のタンパク質のＭＳ及びその結晶構造複合体によって確認され、対応する代謝物３９ａ／３９ｂは、複数当量の放出されたフッ素イオンとともに、質量分析によって検出された。まとめると、単一のフッ素原子の違いにより、８（エナミン経路）と９（付加芳香族化経路）では異なる不活性化機構経路が生じるが、同じターンオーバー機構（ＰＬＰ経路）が生じる。

分子動力学（ＭＤ）シミュレーション及び静電ポテンシャル（ＥＳＰ）電荷計算。８と９による不活性化中に、非常によく似た中間体（１４ａ／１４ｂと１５ａ／１５ｂ）が形成されるが、結果として生じる共有結合付加物（それぞれ１６ａと２６）はまったく異なる。既に、フッ素の数が異なる結果として、アラニンラセマーゼ阻害剤の異なる不活性化機構は示されていた（１フッ素と３フッ素）⁴⁶。追加のフッ素原子がこれらの中間体に与える影響をよりよく理解するために、分子ドッキング／動力学とＥＳＰ電荷計算を実施して、ｈＯＡＴの触媒ポケットでの結合ポーズと、Ｌｙｓ２９２又はＬｙｓ２９２－ＰＬＰ複合体との反応親和性とを示した。

分子ドッキング研究に基づくと、１４ａと１４ｂのドッキングポーズはｈＯＡＴの活性部位においてほぼ同一であり、Ｌｙｓ２９２は、２つの潜在的な求電子部位の真ん中にある：ＰＬＰイミン部分の炭素（Ｃ_4’）と共役オレフィンの末端炭素（Ｃ_δ）（データは示していない）。分子動力学シミュレーションを実施して、求核性Ｌｙｓ２９２（Ｎ_Lys）の窒素と１４ａ／１４ｂのＣ_4’／Ｃ_δ位置との間の平均距離をそれぞれ計算した（データは示していない）。１４ａのＮ_Lys－Ｃ_4’（４．３Å）とＮ_Lys－Ｃ_δ（４．１Å）の平均距離は非常に似ているが、１４ｂのＣ_4’は、１４ｂのＣ_δ（６．６Å）よりもＮ_Lys（５．０Å）に近く、平均差は１．６Åである。分子動力学シミュレーション中に、シクロヘキサジエン環とピリジン環の間の平均二面角も追跡された（データは示していない）。１４ｂの平均二面角（－１４８．２６°）は、１４ａの平均二面角（－９１．６４°；直交であり、共役ではない）よりも－１８０°（完全に共役）にはるかに近く、１４ｂのオレフィンがピリジン環に共役する傾向が高いことを示している。中間体１４ａ／ｂと１５ａ／ｂのＥＳＰ電荷及び電子密度／静電ポテンシャルマップを計算して、追加のフッ素原子の影響を評価した（データは示していない）。追加のフッ素原子を導入したＣ_δ－１４ａ（－０．２８）とＣ_δ－１４ｂ（＋０．４９）の間、並びにＣ_δ－１５ａ（－０．７０）とＣ_δ－１５ｂ（＋０．０７）の間には有意差が示され、Ｃ_4’－１４ａ（＋０．４２）の電荷はＣ_4’－１４ｂ（＋０．４５）の電荷に近い。従って、分子動力学シミュレーション（データは示していない）から、Ｃ_δ－１４ａとＣ_4’－１４ａへのＬｙｓ２９２のアクセス可能性は類似しているが、二面角（－９１．６４°）及び炭素電荷（－０．２８対＋０．４２）は、１４ａのオレフィンに対するＬｙｓ２９２の求核攻撃が著しく劣っており、Ｃ_4’への攻撃はエナミン１５ａを与え、最終付加物１６ａにつながる（スキーム５）。１４ｂの場合、距離Ｎ_Lys－Ｃ_4’は、１４ｂのＣ_4’に対するＬｙｓの求核攻撃の方が、１４ｂのＣ_δに対するよりも有利である（５．０Å対６．６Å）が、１４ｂのＣ_δの求電子性は追加のフッ素原子により大きく上昇し、最終付加物２６と不活性なエナミン１５ｂが生成され、これはプロトン化及び加水分解されて３９ｂになる（スキーム６）。１５ｂの追加のフッ素原子はその求核性を大幅に低下させ、これが、付加物１６ｂと１７の形成を妨害する（スキーム２）。分子ドッキング／動力学とＥＳＰ電荷計算の両方は、８と９によるｈＯＡＴの不活性化中の我々の観察を明確に正当化している。

結論

過去数年にわたって、ヒトオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）の選択的阻害は、癌、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）の有望な治療法として徐々に認識されてきた¹¹。非選択的不活性化剤１³¹の既知の不活性化機構に基づいて、新規クラスのフッ素置換シクロヘキセン類似体（８～１１）が、分子動力学シミュレーションとドッキングの助けを借りて、合理的に設計、合成、及び評価された。中でも、類似体８と９は、１と比較して、ＧＡＢＡ－ＡＴよりも優れた選択性と共に、ｈＯＡＴに対して顕著に改善された阻害活性を示した（表１）。８と９の不活性化経路は、質量分析及び結晶解析、そして透析実験、総ターンオーバー、及びフッ化物イオン放出の測定の助けを借りて、解明された。モノフルオロ置換類似体８はエナミン経路（スキーム２、経路ａ）を介してｈＯＡＴを不活性化するが、ジフルオロ類似体９は新規の付加芳香族化機構（スキーム２、経路ｃ）を介してｈＯＡＴを不活性化し、その効力の大幅な向上に貢献する。特に、未変性のタンパク質の驚くほど正確な質量が、１Ｄａ未満の誤差で得られたため、結晶構造の前の付加物の質量測定が簡単になっている（表２）。興味深いことに、不活性化機構の違いにもかかわらず、ｈＯＡＴによる８と９のターンオーバー機構はほぼ同じであり（スキーム４、ＰＬＰ経路）、代謝物は標的化質量分析の助けを借りて同定された。分子動力学（ＭＤ）シミュレーションと静電ポテンシャル（ＥＳＰ）電荷計算の使用によって維持及び合理化された８と９の可能性の高い不活性化及びターンオーバー機構は、分子内の単一のフッ素原子の違いが酵素不活性化機構を制御できることを示している。

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実施例２ 実施例１の補足資料

一般的な合成方法

すべての化学物質は、Sigma Aldrich、Acros Organics、又は Combiblock から購入し、さらに精製することなく使用した。無水溶媒（ＴＨＦ）は、使用前に、活性アルミナと担持された銅酸化還元触媒で構成されるカラムを通過させることによって精製された。収率とは、クロマトグラフィーで均質な材料について言及される。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、Merck シリカゲル６０Å Ｆ－２５４プレコートプレート（厚さ０．２５ｍｍ）を使用して実施し、成分は紫外線（２５４ｎｍ）及び／又はモリブデン酸セリウムアンモニウム染色及び／又はニンヒドリン染色で可視化された。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、さまざまなTaledyneカートリッジ（４～８０ｇ、４０～６３μｍ、６０Å）を備えたTeledyne Combiflash（登録商標） Rf Plus自動フラッシュ精製システムを用いて実施した。特に記載がない限り、精製はヘキサンと酢酸エチルで行った。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Bruker Avance-III ＮＭＲ分光計で、それぞれ５００ＭＨｚ及び１２６ＭＨｚで、ＣＤＣｌ３、ＣＤ３ＯＤ、又はＤＭＳＯ－ｄ６中で記録された。化学シフトはｐｐｍで報告された。多重度は、ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｄｄ＝二重項の二重項、ｄｔ＝三重項の二重項、ｄｑ＝四重項の二重項、ｍ＝多重項共鳴で示される。結合定数「Ｊ」はＨｚで報告された。高分解能質量スペクトルデータは、陽イオンモードのAgilent 6210 LC-TOF分光計で、Agilent G1312A ＨＰＬＣポンプと Agilent G1367B オートインジェクターを用いて電子噴霧イオン化を使用して、Integrated Molecular Structure Education and Research Center (IMSERC), Northwestern University で得られた。分析用ＨＰＬＣは、Phenomenex Kintex Ｃ－１８カラム（５０×２．１ｍｍ、２．６μｍ）を備えた逆相 Agilent Infinity 1260 ＨＰＬＣを使用して実施し、２５４ｎｍのＵＶ吸光度で検出した。

（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヨード－６－オキサビシクロ［３．２．１］オクタン－７－オン（２８）。水（２００ｍＬ）中のＮａＨＣＯ３（１５．９８ｇ、１９０．７４ミリモル、３．０当量）の撹拌溶液に、（Ｒ）－シクロヘキセ－３－エン－１－カルボン酸２７（８ｇ、６３．４１ミリモル、１．０当量）を、氷浴中でゆっくり加えた。ＫＩ（５２．３６ｇ、３１７．０７ミリモル、５．０当量）及びＩ２（１７．７ｇ、６９．７６ミリモル、１．１当量）を少しずつ加えた。３０分後に氷浴を取り除き、室温で一晩撹拌した。反応を飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（水溶液、１５０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で３回抽出した。合わせた有機相を食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮して褐色の固体を得て、これをヘキサン（１００ｍＬ）に加え、３時間撹拌した。懸濁液を濾過して淡褐色の粉末（２９、１５．２ｇ、９５％）を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.82 (dd, J = 5.9, 4.2 Hz, 1H), 4.50 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 2.79 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 2.67 (s, 1H), 2.48 - 2.35 (m, 2H), 2.11 (dd, J = 16.5, 5.3 Hz, 1H), 1.90 (tdd, J = 13.0, 5.4, 2.1 Hz, 1H), 1.82 (dt, J = 12.8, 5.4 Hz, 1H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 177.9, 80.4, 38.7, 34.6, 29.9, 23.9, 23.3. LRMS (APCI) (M+H+): 252.85.

（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）－３－（ビス（４－メトキシベンジル）アミノ）－４－ヒドロキシシクロヘキサン－１－カルボン酸エチル（２９）。ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）中の２８（２８．７ｇ、１１８．９ミリモル、１．０当量）の懸濁液を氷浴中で撹拌した。ＮａＯＨの溶液（２Ｍ、６５ｍＬ、１３０．８ミリモル、１．１当量）を滴下して加えた。添加後、氷浴を取り除き、溶液を室温で４時間撹拌した。溶液を４０℃未満で濃縮し、水（１００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（２００ｍＬ）で３回抽出した。合わせた有機相を水（１００ｍＬ）及び食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮して、褐色の油状物（１５．３ｇ）を得た。ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）中の得られた褐色油状物（１０．５ｇ）溶液に、アンモニア水（２８～３０％、１００ｍＬ）を加えた。溶液を４５℃に加熱し、一晩撹拌した。反応の完了は、ＬＣ－ＭＳによって決定した。溶液を濃縮して、粗アミノアルコール中間体（１１．１ｇ）を得た。ＤＣＥ（２００ｍＬ）中の粗中間体（６．０ｇ、３２．０４ミリモル、１．０当量）の溶液に、４－アニスアルデヒド（１３．１ｇ、９６．１３ミリモル、３．０当量）及びＡｃＯＨ（５．７７ｇ、９６．１３ミリモル、３．０当量）を加えた。溶液を７５℃に加熱し、１時間撹拌した。この溶液に、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（２０．３７ｇ、９６．１３ミリモル、３．０当量）を２時間かけて少しずつ加えた。得られた混合物を７５℃で一晩撹拌した。反応の完了は、ＬＣ－ＭＳによって決定した。混合物を室温に冷却し、ＤＣＭ（２００ｍＬ）と水（２００ｍＬ）で希釈した。１０分間撹拌した後、有機相を分離し、次に水（２００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（水溶液２００ｍＬ）、及び食塩水（１００ｍＬ）で連続して洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の５０％ＥｔＯＡｃ）により精製して、白色の固体（２９、６．２９７ｇ、３工程で３５％）を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.17 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 6.84 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 4.17 (dq, J = 10.8, 7.1 Hz, 1H), 4.07 (dq, J = 10.8, 7.1 Hz, 1H), 3.79 (s, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.74 (d, J = 13.1 Hz, 2H), 3.63 (s, 1H), 3.47 (td, J = 10.4, 4.5 Hz, 1H), 3.31 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 2.80 (dp, J = 4.9, 2.2 Hz, 1H), 2.53 (ddd, J = 12.7, 9.8, 3.4 Hz, 1H), 2.47 (dq, J = 12.9, 2.7 Hz, 1H), 2.17 (dp, J = 14.0, 3.1 Hz, 1H), 1.97 (dq, J = 11.6, 3.4 Hz, 1H), 1.50 - 1.42 (m, 2H), 1.23 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 174.1, 158.8, 131.5, 130.3, 113.9, 68.7, 60.7, 60.3, 55.3, 52.6, 39.6, 30.1, 25.1, 23.5, 14.4. HRMS (ESI) C25H34NO5 (M+H+)の計算値: 428.2431, 実測値: 428.242.

（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）－３－（ビス（４－メトキシベンジル）アミノ）－４－フルオロシクロヘキサン－１－カルボン酸エチル（３０）。プラスチック容器中のＤＣＭ（１００ｍＬ）中のXtalFluor-M（７．６７ｇ、３１．６５ミリモル、１．５当量）の撹拌懸濁液に、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の２９（９．０ｇ、２１．０５ミリモル、１．０当量）及び（ＨＦ）３Ｅｔ３Ｎ（５．０９ｇ、３１．６５ミリモル、１．５当量）の溶液をＡｒ下でゆっくり加えた。添加が完了した後、混合物を室温で一晩撹拌した。反応の完了は、ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２：１）によって決定した。反応物をＤＣＭ（１００ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ）でクエンチした。有機相を分離し、次に水（１００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（水溶液、１００ｍＬ）、及び食塩水（１００ｍＬ）で順次洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の２５％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、無色の油状物（３０、６．８１ｇ、７５％）を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.30 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 6.84 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 4.62 (dtd, J = 50.5, 10.3, 4.8 Hz, 1H), 4.01 (dq, J = 10.8, 7.1 Hz, 1H), 3.91 (dq, J = 10.8, 7.1 Hz, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.73 (d, J = 13.6 Hz, 2H), 3.65 (d, J = 13.5 Hz, 2H), 2.85 (dddd, J = 12.3, 9.7, 8.4, 3.9 Hz, 1H), 2.66 (dh, J = 5.5, 2.8 Hz, 1H), 2.32 (ddq, J = 12.8, 6.2, 3.0 Hz, 1H), 2.19 - 2.10 (m, 1H), 2.03 (ddq, J = 12.3, 8.2, 4.1 Hz, 1H), 1.64 - 1.47 (m, 2H), 1.38 (tddd, J = 13.7, 5.1, 3.6, 1.4 Hz, 1H), 1.08 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 173.9 , 158.6 , 132.5 , 129.8 , 113.6 , 92.5 (d, J = 178.1 Hz), 60.6 , 57.8 (d, J = 16.1 Hz), 55.3 , 53.6 , 39.0 (d, J = 2.0 Hz), 29.2 (d, J = 18.7 Hz), 28.6 (d, J = 8.4 Hz), 24.9 (d, J = 11.2 Hz), 14.1. HRMS (ESI) C25H33FNO4 (M+H+)の計算値: 430.2388, 実測値: 430.238.

（１Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）－３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４－フルオロシクロヘキサン－１－カルボン酸エチル（３１）。ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中の３０（５．０ｇ、１７．４６ミリモル、１．０当量）の溶液に、Ｂｏｃ２Ｏ（３．８１ｇ、１１．６４ミリモル、１．０当量）及びＰｄ（ＯＨ）２（１．０ｇ、２０重量％）をＡｒ下で加えた。フラスコを排気してＡｒを除去し、Ｈ２バルーンで再充填した。混合物を室温で一晩撹拌した。反応の完了は、ＬＣ－ＭＳによって決定した。懸濁液をセライトパッドで濾過し、さらに１００ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、白色の固体（３１、２．７３ｇ、８１％）を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.55 (s, 1H), 4.47 (d, J = 39.7 Hz, 1H), 4.15 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.89 (s, 1H), 2.49 (s, 1H), 2.23 (ddt, J = 13.3, 8.5, 4.1 Hz, 1H), 2.00 - 1.76 (m, 3H), 1.76 - 1.64 (m, 2H), 1.44 (s, 10H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 174.3, 155.2, 90.589.8 (d, J = 173.2 Hz), 60.8, 49.3, 38.0, 29.8, 26.7 (d, J = 20.2 Hz), 23.4 (d, J = 5.4 Hz), 14.4. 19F NMR (564 MHz, CD3OD) δ -181.34 (d, J = 50.7 Hz). HRMS (ESI) C14H24FNNaO4 (M+Na+)の計算値: 312.158, 実測値: 312.1582.

（４Ｓ，５Ｓ）－５－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４－フルオロシクロヘキサ－１－エン－１－カルボン酸エチル（３２ｂ）及び（３Ｓ，４Ｓ）－３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル））アミノ）－４－フルオロシクロヘキサ－１－エン－１－カルボン酸エチル（３２ａ）。ＫＨＭＤＳの撹拌溶液（ＴＨＦ中１Ｍ、１０．８９ｍＬ、１０．８９ミリモル、２．１当量）に無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）をゆっくり加え、無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の３１（１．５ｇ、５．１８ミリモル、１．０当量）の溶液を－７８℃でＡｒ下で３０分かけて加えた。溶液を－７８℃でさらに３時間撹拌し、続いてＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＰｈＳｅＣｌ（１．０９ｍｇ、５．７０ミリモル、１．１当量）の溶液を加えた。次に、溶液をゆっくり室温まで温め、一晩撹拌した。飽和ＮＨ４Ｃｌ（２０ｍＬ）を加えて、反応をクエンチした。次に、溶液をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、有機相を分離した。水相をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で２回抽出した。合わせた有機層を食塩水（約３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮し、黄色の油状物を得た。ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の得られた油状物（１．５５ｇ、３．４９ミリモル、１．０当量）の撹拌溶液に、ｍ－ＣＰＢＡ（１．１７ｇ、５．２３ミリモル、１．５当量）を加えた。溶液を室温で３時間撹拌した。反応の完了は、ＬＣ－ＭＳによって決定した。反応をＮａ２Ｓ２Ｏ３（水溶液１０ｍＬ）でクエンチした。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液、１０ｍＬ）及び食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中５～１０％のＥｔＯＡｃ）及びＣ－１８クロマトグラフィーにより精製して、白色の固体（３２ｂ、９２ｍｇ、９％）を得た、1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.85 (tq, J = 3.5, 1.9 Hz, 1H), 4.75 (dq, J = 47.5, 4.9, 4.2 Hz, 1H), 4.52 (s, 1H), 4.20 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.07 (s, 1H), 2.83 (d, J = 17.9 Hz, 1H), 2.66 (t, J = 23.7 Hz, 1H), 2.53 (t, J = 19.4 Hz, 1H), 2.33 (ddq, J = 18.1, 5.5, 1.9 Hz, 1H), 1.44 (s, 9H), 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 166.1, 155.3, 134.5 (d, J = 4.2 Hz), 128.0, 87.1 (d, J = 176.2 Hz), 60.8, 47.7, 29.5 (d, J = 22.6 Hz), 28.3, 27.6 (d, J = 3.2 Hz), 14.2. HRMS (ESI) C14H22FNNaO4 (M+Na+)の計算値: 310.1425, 実測値: 310.1416.

別の白色固体（３２ａ、３６５ｍｇ、３６％）も得られた。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7.27 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.46 (s, 1H), 4.60 (dddd, J = 49.1, 9.3, 5.9, 3.1 Hz, 1H), 4.25 (ddq, J = 14.5, 9.0, 3.4, 2.9 Hz, 1H), 4.13 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.38 - 2.20 (m, 2H), 2.05 - 1.94 (m, 1H), 1.88 (dp, J = 14.1, 6.9 Hz, 1H), 1.40 (s, 9H), 1.22 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 165.5, 155.1, 136.2, 136.2, 130.7, 90.0 (d, J = 175.2 Hz), 78.4, 60.3, 50.4 (d, J = 25.0 Hz), 28.1, 25.3 (d, J = 19.4 Hz), 21.5 (d, J = 9.5 Hz), 14.1. HRMS (ESI) C14H22FNNaO4 (M+Na+)の計算値: 310.1425, 実測値: 310.1416.;及び分離されていない混合物（４２１ｍｇ、４２％）。

（１Ｒ，３Ｓ）－３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４－オキソシクロヘキサン－１－カルボン酸エチル（３３）。２８（１６ｇ、６３．４１ミリモル）の懸濁液をＥｔＯＨ（１００ｍＬ）に加え、氷浴中で撹拌した。ＮａＯＨの溶液（２Ｍ、３５ｍＬ、６９．７６ミリモル、１．１当量）を滴下して加えた。添加後、氷浴を取り除き、溶液を室温で４時間撹拌した。溶液を４０℃未満で濃縮し、水（１００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（２００ｍＬ）で３回抽出した。合わせた有機相を水（１００ｍＬ）及び食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮し、ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）及びアンモニア水溶液（２８～３０％、４０ｍＬ）で希釈した。溶液を４５℃に加熱し、一晩撹拌した。反応の完了は、ＬＣ－ＭＳによって決定した。溶液を濃縮し、ＥｔＯＨ（５０ｍＬ）で希釈した。溶液を濃縮し、ＥｔＯＨ（２００ｍＬ）で希釈し、氷浴中で撹拌した。Ｂｏｃ２Ｏ（１３．８４ｇ、６３．４１ミリモル、１．０当量）を少しずつ加えた。次に、溶液を室温まで温め、４時間撹拌した。溶液を濃縮して粗製３３を得た。（構造決定のための精製：1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.61 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.19 - 4.12 (m, 2H), 3.57 (s, 1H), 3.47 - 3.28 (m, 2H), 2.62 (p, J = 4.5 Hz, 1H), 2.35 - 2.26 (m, 1H), 2.15 - 2.07 (m, 1H), 1.90 - 1.84 (m, 1H), 1.55 - 1.48 (m, 2H), 1.44 (s, 10H), 1.25 (q, J = 7.0 Hz, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 174.2, 171.3, 80.2, 73.8, 60.8, 53.0, 38.9, 31.4, 30.1, 28.5, 24.8, 14.4.). HRMS (ESI) C14H25N NaO5 (M+Na+)の計算値: 310.1625, 実測値: 310.1618.

粗製３３をＤＣＭ（３００ｍＬ）に溶解し、氷浴中で撹拌した。ＰＣＣ（２７．３４ｇ、１２６．８３ミリモル、２．０当量）を少しずつ加えた。混合物を室温に温め、一晩撹拌した。反応の完了は、ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２：１）によって決定した。混合物をシリカゲルの薄いパッドを通して濾過し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で３回溶出した。溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中４０％のＥｔＯＡｃ）で精製して、白色の固体（３４、１０．２ｇ、５６％）を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.36 (s, 1H), 4.48 (s, 1H), 4.25 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 2.99 - 2.91 (m, 1H), 2.87 (s, 1H), 2.70 (td, J = 13.7, 5.7 Hz, 1H), 2.46 (t, J = 14.1 Hz, 2H), 1.87 (tt, J = 14.3, 4.8 Hz, 1H), 1.62 (td, J = 12.8, 4.9 Hz, 1H), 1.43 (s, 9H), 1.32 (t, J = 7.1 Hz, 3H). HRMS (ESI) C14H23NNaO5 (M+Na+)の計算値: 308.1468, 実測値: 308.1459.

（１Ｒ，３Ｓ）－３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４，４－ジフルオロシクロヘキサン－１－カルボン酸エチル（３５）。プラスチック容器中のＤＣＭ（２０ｍＬ）中のXtalFluor-M（２．０４ｇ、８．４１ミリモル、２．０当量）の撹拌懸濁液に、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の３４（１．２ｇ、４．２１ミリモル、１．０当量）及び（ＨＦ）３Ｅｔ３Ｎ（１．３６ｇ、８．４１ミリモル、２．０当量）の溶液をＡｒ下でゆっくり加えた。添加が完了した後、混合物を室温で一晩撹拌した。反応の完了は、ＴＬＣ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２：１）によって決定した。反応物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で希釈し、水（１０ｍＬ）でクエンチした。有機相を分離し、次に水（１０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（水溶液、１０ｍＬ）、及び食塩水（１０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、白色の固体（３５、６２９ｍｇ、４８％）を得た。NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.68 (s, 1H), 4.18 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.12 (s, 1H), 2.71 (s, 1H), 2.31 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 2.14 - 1.90 (m, 3H), 1.81 - 1.72 (m, 1H), 1.71 - 1.65 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.28 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 173.5, 155.2, 121.6 (dd, J = 248.2, 242.0 Hz), 80.1, 61.1, 50.1 (dd, J = 25.0, 21.0 Hz), 37.9, 31.5, 30.4 (t, J = 23.3 Hz), 28.4, 23.8 (d, J = 7.9 Hz), 14.4. HRMS (ESI) C14H23F2NNaO4 (M+Na+)の計算値: 330.q1487, 実測値: 330.1479.

（Ｓ）－３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４，４－ジフルオロシクロヘキサ－１－エン－１－カルボン酸エチル（３６ａ）及び（Ｓ）－５－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４，４－ジフルオロシクロヘキサ－１－エン－１－カルボン酸エチル（３６ｂ）。ＫＨＭＤＳの撹拌溶液（ＴＨＦ中１Ｍ、７．１６ｍＬ、７．１６ミリモル、２．２当量）を無水ＴＨＦ（５ｍＬ）で希釈し、Ａｒ下で－７８℃に冷却し、次に、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の３５（１．０ｇ、３．２５ミリモル、１．０当量）の溶液を３０分かけてゆっくり加えた。溶液を－７８℃でさらに３時間撹拌し、続いてＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＰｈＳｅＣｌ（６８５ｍｇ、３．５８ミリモル、１．１当量）の溶液を加えた。次に、溶液をゆっくり室温まで温め、一晩撹拌した。飽和ＮＨ４Ｃｌ（２０ｍＬ）を加えることにより、反応をクエンチした。次に、溶液をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、有機相を分離した。水相をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で２回抽出した。合わせた有機相を食塩水（約３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮して黄色の油状物を得た。ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の油状物の撹拌溶液に、ｍ－ＣＰＢＡ（５５５ｍｇ、２．４８ミリモル、１．５当量）を加えた。溶液を室温で３時間撹拌した。反応の完了は、ＬＣ－ＭＳによって決定した。反応をＮａ２Ｓ２Ｏ３（水溶液、１０ｍＬ）でクエンチした。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液、１０ｍＬ）及び食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中５～１０％のＥｔＯＡｃ）で精製して、白色の固体（３６ａ、２５８ｍｇ、５１％）を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.59 (ddt, J = 5.2, 2.6, 1.3 Hz, 1H), 4.90 - 4.I68 (m, 2H), 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.70 - 2.57 (m, 1H), 2.57 - 2.43 (m, 1H), 2.28 (tdd, J = 16.6, 8.6, 4.5 Hz, 1H), 2.17 - 1.97 (m, 1H), 1.47 (s, 9H), 1.30 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 165.8, 155.4, 135.6, 131.9, 120.2 (dd, J = 247.1, 241.3 Hz), 80.7, 61.2, 51.4 (t, J = 26.8, 22.4 Hz), 29.5 (t, J = 23.5 Hz), 28.4, 22.8 (dd, J = 7.6, 2.9 Hz), 14.3. 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -105.13 (d, J = 239.4 Hz), -115.81 (d, J = 239.3 Hz), HRMS (ESI) C14H21F2NNaO4 (M+Na+)の計算値: 328.1331, 実測値: 328.1324.

別の白色固体（３６ｂ、６２ｍｇ、１２％）も得られた。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.76 (s, 1H), 4.83 - 4.67 (m, 1H), 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.18 - 4.14 (m, 1H), 2.95 (d, J = 17.5 Hz, 1H), 2.90 - 2.70 (m, 2H), 2.40 - 2.28 (m, 1H), 1.46 (s, 9H), 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 3H).13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 165.6, 155.4, 132.8 (d, J = 9.1 Hz), 129.0, 120.5 (dd, J = 246.9, 242.0 Hz), 80.4, 61.1, 49.5 (t, J = 21.5 Hz), 34.8 (t, J = 28.1 Hz), 30.3 (t, J = 3.6 Hz), 28.4, 14.3., HRMS (ESI) C14H21F2NNaO4 (M+Na+)の計算値: 328.1331, 実測値: 328.1324.; 及びand unseparated mixture of 36a and 36bの分離されていない混合物 (94 mg, 19%).

一般的な脱保護手順Ａ．塩酸（４Ｍ、１．５ｍＬ）とＡｃＯＨ（１．５ｍＬ）の溶液に、エステル中間体をＡｒ下で加えた。溶液を密封し、８０℃に加熱し、一晩撹拌した。反応の完了は、ＬＣ－ＭＳによって決定した。溶液を濃縮し、Ｃ－１８クロマトグラフィーにより精製して、生成物を得た。

（３Ｓ，４Ｓ）－３－アミノ－４－フルオロシクロヘキサ－１－エン－１－カルボン酸塩酸塩（８）。３２ａ（１５０ｍｇ、０．５２２ミリモル）を手順Ａによって脱保護して、白色の固体（８、９４ｍｇ、９２％）を得た。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 6.67 (dt, J = 5.1, 2.5 Hz, 1H), 4.78 (dddd, J = 50.5, 11.6, 7.8, 4.0 Hz, 1H), 4.27 - 4.13 (m, 1H), 2.65 (d, J = 20.3 Hz, 1H), 2.50 - 2.39 (m, 1H), 2.33 - 2.23 (m, 1H), 1.98 (ddq, J = 17.5, 11.9, 6.0 Hz, 1H). 13C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 168.2, 137.2 (d, J = 2.4 Hz), 130.5 (d, J = 7.0 Hz), 90.9 (d, J = 177.6 Hz), 53.6 (d, J = 23.2 Hz), 27.3 (d, J = 18.7 Hz), 24.4 (d, J = 11.2 Hz). 13C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 168.4, 136.3 (d, J = 11.1 Hz), 128.4, 89.8 (d, J = 177.5 Hz), 51.7 (d, J = 18.1 Hz), 31.8 (d, J = 21.7 Hz), 29.2 (d, J = 6.1 Hz). HRMS (ESI) C7H11FNO2 (M+H+)の計算値: 160.0768, 実測値: 160.0765.

（Ｓ）－３－アミノ－４，４－ジフルオロシクロヘキサ－１－エン－１－カルボン酸塩酸塩（９）。３６ａ（１０５ｍｇ、０．３４ミリモル）を手順Ａによって脱保護して、白色の固体（９、５６ｍｇ、７６％）を得た。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 6.72 (s, 1H), 4.65 - 4.52 (m, 1H), 2.71 (ddd, J = 18.9, 6.2, 3.0 Hz, 1H), 2.55 (dtd, J = 19.0, 6.4, 3.1 Hz, 1H), 2.47 - 2.22 (m, 2H). 13C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 167.9, 136.8, 129.62 (d, J = 5.9 Hz), 121.05 (t, J = 246.2 Hz), 52.27 (dd, J = 29.1, 22.2 Hz), 29.24 (t, J = 22.7 Hz), 23.76 (dd, J = 7.7, 2.9 Hz). 19F NMR (376 MHz, CD3OD) δ -108.4 (dp, J = 240.6, 5.8, 5.3 Hz), -114.2 (dq, J = 240.7, 23.2 Hz). HRMS (ESI) C7H10F2NO2(M+H+)の計算値: 178.0674, 実測値: 178.0672.

（４Ｓ，５Ｓ）－５－アミノ－４－フルオロシクロヘキサ－１－エン－１－カルボン酸塩酸塩（１０）。３２ｂ（８０ｍｇ、０．２７８ミリモル）を手順Ａによって脱保護して、白色の固体（１０、４９ｍｇ、９０％）を得た。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 6.89 (s, 1H), 5.02 - 4.95 (m, 1H), 3.65 (tt, J = 10.6, 6.2 Hz, 1H), 3.03 (dt, J = 17.3, 5.8 Hz, 1H), 2.93 (d, J = 18.5 Hz, 1H), 2.65 - 2.51 (m, 1H), 2.51 - 2.38 (m, 1H). 13C NMR (126 MHz, CD3OD) δ168.4, 136.3 (d, J = 11.1 Hz), 128.4, 89.8 (d, J = 177.5 Hz), 51.7 (d, J = 18.1 Hz), 31.8 (d, J = 21.7 Hz), 29.2 (d, J = 6.1 Hz). HRMS (ESI) C7H11FNO2 (M+H+)の計算値: 160.0768, 実測値: 160.0762.

（Ｓ）－５－アミノ－４，４－ジフルオロシクロヘキサ－１－エン－１－カルボン酸塩酸塩（１１）。３６ｂ（３０ｍｇ、０．１０ミリモル）を手順Ａによって脱保護して、白色の固体（１１、１４ｍｇ、６６％）を得た。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 6.87 (p, J = 3.9 Hz, 1H), 4.06 - 3.95 (m, 1H), 3.15 - 3.06 (m, 1H), 3.00 (dp, J = 21.4, 4.1, 3.2 Hz, 2H), 2.53 (ddd, J = 17.1, 10.6, 2.8 Hz, 1H). 13C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 167.9, 134.4 (d, J = 10.3 Hz), 128.3, 121.1 (dd, J = 245.6, 243.5 Hz), 50.9 (t, J = 22.5 Hz), 34.9 (t, J = 25.6 Hz), 28.6. HRMS (ESI) C7H10F2NO2(M+H+)の計算値: 178.0674, 実測値: 178.0675.

ドッキングシミュレーション

ＧＡＢＡ－ＡＴ又はＯＡＴに結合したリガンドのドッキングモデルは、分子操作環境（Molecular Operating Environment：ＭＯＥ）計算スイートのBuilderユーティリティを使用して開発された^1-3。リガンドのエネルギー最小化は、気相で力場ＭＭＦＦ９４Ｘを使用して行い、続いてコンフォメーション検索プロトコールにより、構造－コンフォメーションデータベースを生成した。未変性のＧＡＢＡ－ＡＴ（ＰＤＢ：１ＯＨＶ）、未変性のｈＯＡＴ（１ＯＡＴ）、不活性化ＧＡＢＡ－ＡＴ（４Ｙ０Ｉ）、不活性化ｈＯＡＴ（１ＧＢＮ）のＸ線結晶構造をそれぞれＭＯＥにアップロードし、次に受容体を調製した。５ＶＷＯ及び４Ｙ０Ｉのアクティブポケット内の緊密結合生成物が削除され、触媒性Ｌｙｓが中和された。ドッキング部位は、触媒性Ｌｙｓ原子で特定された。リガンドドッキングは、準備されたアミノトランスフェラーゼ酵素モデルで、無関係の基質と不活性化した溶媒原子を用いて実施された。リガンドの配置は、Affinity dG スコア化を用いる Alpha Triangle 法を使用して３００のデータポイントを生成し、これらを、ＧＢＶＩ／ＷＳＡｄＧスコア化を使用した誘導適合法を使用してさらに精密化し上位５０のドッキング結果を得た。各リガンドのドッキング結果は、スコアと報告されたＸ線構造に基づいて、最適なドッキングポーズを選択するために分析された。その後、ＰｙＭＯＬですべてのレンダリングを行なった。

酵素アッセイ

ｈＯＡＴ及びＰＹＣＲ１は、文献の手順^4,5に従って発現、増加、及び精製された。ＧＡＢＡ－ＡＴは、ブタの脳から単離され、文献の手順⁶に従って精製された。ＧＡＢＡ－ＡＴ、ｈＯＡＴ、Ａｌａ－ＡＴ、及びＡｓｐ－ＡＴの結合酵素アッセイは、以前の手順^7,8に従って実施された。

透析アッセイ

透析実験は、以前のプロトコール^7、9、10を使用して実施された。

分配比実験

分配比は、以前のプロトコール^7、9、10を使用して計算された。

フッ化物イオン放出

フッ化物イオン放出アッセイは、以前のプロトコール⁷を使用して実施された。試料中のｈＯＡＴの最終濃度は、ＢＳＡアッセイ及び希釈の計算により、１６．９±０．０４μｇ／ｍＬ（モノマー、０．３７±０．０１μＭ）であると決定された。電圧（Ｖ、ｍＶ）の検量線は、ＮａＦ（Ｆ、μＭ）のさまざまな濃度から生成され、以下の式が得られた：Ｆ－＝１０＾（（Ｖ－１８１．９）／－５３．１８）。フッ化物イオン濃度を正確に検出するために、２．０μＭのフッ化物イオンを各対照と試料に添加した。活性部位あたり放出されたフッ化物イオンの数は、フッ化物イオン放出濃度とｈＯＡＴ濃度の比率によって計算された。

未変性のタンパク質及び小分子質量分析

組換え及び処理されたｈＯＡＴを、Amicon Ultra ３０ｋＤａ分子量スピンフィルター（Millipore）上で、水で１０回脱塩した。ｈＯＡＴをクロマトグラフィーで分離するために、Dionex Ultimate 3000 液体クロマトグラフィーシステム（Thermo Fisher）を使用して、０．５μｇのｈＯＡＴを３ｃｍのＰＬＲＰ－Ｓ（Agilent）トラップカラムにロードした。タンパク質分析物を、１０％溶媒Ｂ（９５％ＭｅＣＮ／５％Ｈ２Ｏ／０．２％ＦＡ）及び９０％溶媒Ａ（５％ＭｅＣＮ／９５％Ｈ２Ｏ／０．２％ＦＡ）の１０分間の等溶媒濃度勾配（isocratic gradient）で洗浄した。ｈＯＡＴは、ＰＬＲＰ－Ｓ樹脂（Agilent）を充填した自社製７５μｍＩＤ×１５ｃｍ長のナノポアキャピラリカラムで分離された。ＬＣシステムは、３００ｎＬ／分の流量で以下の勾配で操作した：０～１０分、１０％溶媒Ｂ；１０～１２分、４０％溶媒Ｂへ；１２～２２分、９０％溶媒Ｂへ；２２～２４分、９０％溶媒Ｂで；２４～２６分、１０％溶媒Ｂへ；２６～３０分、１０％溶媒Ｂの等溶媒濃度で。低圧のタンパク質モード、［Ｍ＋２４Ｈ＋］＋２４デフォルト荷電状態で動作するFusion Lumos Tribrid 質量分析計（Thermo Fisher）のOrbitrap 質量分析計を使用して、正のフルプロファイルＥＳＩデータが取得された。カスタムナノ電子噴霧イオン化源を静的スプレー電圧１７００Ｖで使用した。データは５００～２，０００ｍ／ｚのウィンドウで収集され、（２００ｍ／ｚ）の７，５００の分解能でスキャンイベントごとに平均２０マイクロスキャンで、最大注入時間は５０ミリ秒、自動ゲイン制御（ＡＧＣ）の目標値は５ｅ６チャージであった。平均化された合計スキャンは、中性質量を生成するために手動でデコンボリューションされた。小分子及び代謝物の質量は、前述のようにQ-Exactive Orbitrap 質量分析計の高分解能ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって特定され、特性評価された⁹。

ｈＯＡＴ結晶化

結晶構造の成長。新たに調製した酵素（２００μｇ）を、ｐＨ８．０の５ｍＭ α－ケトグルタル酸を含む５０ｍＭ ピロリン酸カリウムで透析した。化合物８／９（０．５ｍｇ）を添加し、ホイルで覆われたバイアル内で酵素を１２時間不活性化した。結合酵素アッセイは、活性を示さなかった。ｈＯＡＴ活性を完全に不活性化した後、酵素試料を５０ｍＭトリシンｐＨ７．８でタンパク質濃度６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。結晶化は、ハンギングドロップ蒸気拡散法によって最適化され、ＰＥＧ１０００（１０～２０％）、ＮａＣｌ（１００～２５０ｍＭ）、グリセロール（２０％～３０％）を変化させ、緩衝液として５０ｍＭトリシンｐＨ７．８を一定に維持することによって設定された。各ウェルについて、ウェルの液滴：タンパク質溶液を１：１の比率に設定した。データ収集に最適な形態とサイズの結晶は、１６．５％ＰＥＧ１０００、２４０ｍＭ ＮａＣｌ、２５％グリセロールを含むウェルで成長した。結晶を凍結防止剤溶液（３０％グリセロールを補足したウェル溶液）に移してから、液体窒素で瞬間凍結した。

データ収集及び処理。単色データは、Argonne National Laboratory (ANL)のAdvanced Photon Source (APS)のＬＳ－ＣＡＴビームライン２１－ＩＤ－Ｄで収集された。回折データは、Dectris Eiger 9M検出器を使用して、１００Ｋで０．９８Åの波長で収集された。データセットは、HKL200011 スイートを使用してインデックス付け及び統合された。データ統計値は表３にまとめられている。

モデルの構築と精密化。ｈＯＡＴ構造は、Phenix ソフトウェアスイートの PHASEER を使用する分子置換法によって解決された¹²。最初の検索モデルは、過去に公開されたｈＯＡＴの構造（ＰＤＢコード：１ＯＡＴ）に基づく。このモデルはCOOTを使用して再構築され¹³、Phenixを使用して精密化され、そしてCOOT及びUSCF Chimeraで分析された¹⁴。最終的な精密化統計値は表３に報告されている。構造図はUSCF Chimeraで作成された。

分子動力学シミュレーション

ドッキングプロトコールを使用して、古典的なＭＤシミュレーションのための１４ａと１４ｂに対応する初期ｈＯＡＴ複合体を生成した。この研究のために選択されたタンパク質構造は、２．３Åの分解能を有する不活性化ｈＯＡＴ（ＰＤＢ ＩＤ：１ＧＢＮ）のＸ線結晶構造であった。アミノ酸残基のプロトン化状態は、Ｈ＋＋サーバーを使用して決定された。１４ａと１４ｂの構造は、理論のＨＦ／６－３１＋（Ｇ）レベルで Gausian09 ソフトウェアを使用して最適化された¹⁵。阻害剤及びタンパク質の構造は、MGLTools ソフトウェアパッケージで利用可能なAutoDockTools-1.5.6を使用してさらに精密化された¹⁶。精密化された阻害剤の構造は、Autodock 4.2 ソフトウェアを使用してＯＡＴ活性部位にドッキングされた。活性部位を中心とするグリッドボックスは、０．３７５Åのグリッド間隔とｘ、ｙ、ｚ軸に沿った５５×５５×５５ポイントの寸法で Autogrid 4.2 ソフトウェアを使用して生成された。ラマルク遺伝的アルゴリズム（Lamarckian genetic algorithm；ＧＡ）は、ＧＡ母集団サイズが１５０、評価の最大数が２，５００，０００で、コンフォメーション検索に使用された。生成された１００のポーズは、それらのｒｍｓｄ値（１．５Åカットオフ）に従ってクラスター化され、ＭＤシミュレーションのために、最良のクラスターの最低エネルギー配置が選択された。幾何学的に最適化された阻害剤（ＨＦ／６－３１＋Ｇ）の静電ポテンシャルエネルギー（ＥＳＰ）は、理論のＨＦ／６－３１＋Ｇレベルで計算された。次に、これらのエネルギーを使用して、Amber12 プログラムで利用可能なアンテチャンバー（antechamber）モジュールで採用されている静電ポテンシャル二乗フィット（ＥＳＰ）法を使用して、阻害剤の部分原子電荷を得た¹⁷。これは、元の Amber力場の部分原子電荷を得るために使用される方法である。阻害剤原子は一般的な Amber力場（ＧＡＦＦ）で処理され、自動的に割り当てられたＧＡＦＦ原子タイプは、それらの化学環境を正確に表すように用手的に調整された後、パラメーターを得た。パラメーターとトポロジーファイルは、Amber 12プログラムのtLEaPモジュールとアンテチャンバーモジュールを使用して生成された。次に、これらのパラメーターとトポロジーファイルは、ACPYPE を使用して GROMACS 互換形式に変換された¹⁸。共有結合したＰＬＰの力場パラメーターとトポロジーも同様に得られた。共有結合したＰＬＰのパラメーターを有する改変Amberff99SB-ILDN力場を使用して、タンパク質をシミュレートした。ＯＡＴダイマーのパラメーターは、GROMACS5.1.2 ソフトウェアパッケージで利用可能な PDB2gmx モジュールを使用して得られた。すべてのＭＤシミュレーションは、GROMACS5.1.2ソフトウェアを使用して実施された¹⁹。TIP3P モデルが水モデルとして使用された。タンパク質－阻害剤複合体を、TIP3P 水で満たされた十二面体ボックスに浸した。ここで、境界はタンパク質の端から全方向に少なくとも１．８ｎｍ伸びている。次に、ＮａＣｌを最大０．１５Ｍ（生理学的ＮａＣｌ濃度）の濃度までシステムに添加して、システムの電荷を中和した。溶媒和されたシステムは、５００ＫＪｍｏｌ－１ｎｍ－１以下の最大力で収束するまで、最急降下法（steepest descent method）とそれに続く共役勾配法（conjugate gradient method）によりエネルギーが最小化された。

得られたエネルギー最小化周期システムは、究極科学工学発見環境（Extreme Science and Engineering Discovery Environment：ＸＳＥＤＥ）の助けを借りて実施されたＭＤシミュレーションの開始構成であった²⁰。実動ＭＤシミュレーションの前に、システムは２つの工程で平衡化された。最初に、これは一定のＮＶＴ（粒子数、体積、及び温度）アンサンブルで１ｎｓの間平衡化された。次に、得られたシステムは一定のＮＰＴ（粒子数、圧力、及び温度）アンサンブルで３ｎｓ平衡化された。温度と圧力は、Ｖ－リスケールサーモスタット（時定数０．４ｐｓ）と、パリネロ・ラーマン定圧法（Parrinello-Rahmanbarostat）（時定数２ｐｓ）によって、それぞれ３１０Ｋと１ｂａｒで制御された。両方の平衡化工程で、１０００ＫＪｍｏｌ－１ｎｍ－２の力定数を適用することにより、重原子の位置を拘束した。その後、位置の拘束は、５００から１００ＫＪｍｏｌ－１ｎｍ－２へ２回の実施（各１ｎｓ）で徐々に減少させた。最後に、平衡化されたシステムの実動ＭＤシミュレーションを、１５ｎｓ（２ｆｓのタイムステップ）のＮＰＴ条件下で位置の拘束なしで実施した。ＮＰＴの平衡化中に、Ｖ－リスケールサーモスタットは、最も正確なNose-Hooverサーモスタットに置き換えられ、残りのシミュレーションプロトコールに使用された。長距離静電相互作用は粒子メッシュEwald（ＰＭＥ）法で処理され、クーロンとファンデルワールス相互作用は１．２ｎｍでカットオフされた。原子の結合長は、線形制約ソルバー（Linear Constraint Solver：ＬＩＮＣＳ）アルゴリズムを使用して拘束された。

重要な距離及び二面角の測定値は、GROMACS ソフトウェアパッケージで利用可能な距離、マインドリスト、及び角度ツールを使用して得られた。

静電ポテンシャル（ＥＳＰ）電荷計算

気相中の静電ポテンシャル（ＥＳＰ）エネルギー及び幾何学的に最適化された阻害剤（１４ａと１４ｂ）（ＨＦ／６－３１＋Ｇ）の電荷は、理論のＨＦ／６－３１＋Ｇレベルで計算された。Gaussain09 プログラムの Cubegen ユーティリティを使用して、電子密度と静電ポテンシャルマップを作成し、VMD 1.9.2 分子視覚化プログラムを使用して視覚化した。

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15. Gaussian 09, Revision A.02, M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A. Robb, J. R. Cheeseman, G. Scalmani, V. Barone, G. A. Petersson, H. Nakatsuji, X. Li, M. Caricato, A. Marenich, J. Bloino, B. G. Janesko, R. Gomperts, B. Mennucci, H. P. Hratchian, J. V. Ortiz, A. F. Izmaylov, J. L. Sonnenberg, D. Williams-Young, F. Ding, F. Lipparini, F. Egidi, J. Goings, B. Peng, A. Petrone, T. Henderson, D. Ranasinghe, V. G. Zakrzewski, J. Gao, N. Rega, G. Zheng, W. Liang, M. Hada, M. Ehara, K. Toyota, R. Fukuda, J. Hasegawa, M. Ishida, T. Nakajima, Y. Honda, O. Kitao, H. Nakai, T. Vreven, K. Throssell, J. A. Montgomery, Jr., J. E. Peralta, F. Ogliaro, M. Bearpark, J. J. Heyd, E. Brothers, K. N. Kudin, V. N. Staroverov, T. Keith, R. Kobayashi, J. Normand, K. Raghavachari, A. Rendell, J. C. Burant, S. S. Iyengar, J. Tomasi, M. Cossi, J. M. Millam, M. Klene, C. Adamo, R. Cammi, J. W. Ochterski, R. L. Martin, K. Morokuma, O. Farkas, J. B. Foresman, and D. J. Fox, Gaussian, Inc., Wallingford CT, 2016.

16. Morris, G. M.; Huey, R.; Lindstrom, W.; Sanner, M. F.; Belew, R. K.; Goodsell, D. S.; Olson, A. J., AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated Docking with Selective Receptor Flexibility. J. Comput. Chem. 2009, 30, 2785-2791.

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本開示によれば、当業者に公知で理解されており、かつ本発明により認識されたような改変などの、組み込まれた合成手順及び技術又はその直接的な改変により、構造的、立体化学的、及び／又はコンフォメーション的に変化した様々な他の化合物が利用可能であり、そのような手順、技術、及び改変は、任意の対応する試薬又は出発物質の商業的又は合成的な入手可能性によってのみ制限される。

Claims (45)

1. 以下の式の化合物：
   

   

   （式中、二重結合は、α炭素とζ炭素との間、又はα炭素とβ炭素との間に存在し、かつ
   式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれは、Ｈ、又はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩなどの脱離基から独立して選択されるが、但し、Ｒ¹及びＲ²の少なくとも１つはＨではない）、又はその解離型、非プロトン化型、双性イオン型、若しくは塩。
2. アンモニウム部分及びカルボキシレート部分を含む、双性イオン型の請求項１に記載の化合物。
3. 前記二重結合がα炭素とζ炭素との間にある、請求項１に記載の化合物。
4. 前記二重結合がα炭素とβ炭素との間にある、請求項１に記載の化合物。
5. Ｒ¹及びＲ²の少なくとも１つがＦである、請求項１に記載の化合物。
6. 前記化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びこれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項５に記載の化合物。
7. アンモニウム塩が、プロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項６に記載の化合物。
8. 医薬的に許容可能な担体成分を含む医薬組成物中の請求項１に記載の化合物。
9. 以下の式の請求項１に記載の化合物：
   

   

   （式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれはＨ及びＦから選択されるが、但しＲ¹及びＲ²の少なくとも１つはＦである）。
10. Ｒ¹及びＲ²のそれぞれがＦである、請求項９に記載の化合物。
11. 以下の式の請求項１に記載の化合物：
    

    
12. 以下の式の請求項１に記載の化合物：
    

    
13. 前記化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びこれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項９に記載の化合物。
14. アンモニウム塩が、プロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項１３に記載の化合物。
15. 医薬的に許容可能な担体成分を含む医薬組成物中の請求項９に記載の化合物。
16. 前記化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びこれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項１１又は１２に記載の化合物。
17. アンモニウム塩が、プロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項１６に記載の化合物。
18. 医薬的に許容可能な担体成分を含む医薬組成物中の請求項１１又は１２に記載の化合物。
19. 以下を含む医薬組成物：（ｉ）請求項１に記載の化合物、及び（ｉｉ）医薬的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤。
20. 以下を含む医薬組成物：（ｉ）請求項９に記載の化合物、及び（ｉｉ）医薬的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤。
21. 以下を含む医薬組成物：（ｉ）請求項１１又は１２に記載の化合物、及び（ｉｉ）医薬的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤。
22. オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）活性を調節する方法であって、前記方法は、請求項１に記載の化合物をＯＡＴを含む媒体に接触させることを含み、ここで前記化合物がＯＡＴ活性を調節するのに十分な量で存在する、方法。
23. 前記二重結合がα炭素とζ炭素との間にある、請求項２２に記載の方法。
24. 前記二重結合がα炭素とβ炭素との間にある、請求項２２に記載の方法。
25. Ｒ¹及びＲ²の少なくとも１つがＦである、請求項２２に記載の方法。
26. 前記化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びこれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項２２に記載の方法。
27. アンモニウム塩が、プロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項２６に記載の方法。
28. 前記接触がインビボである、請求項２２に記載の方法。
29. ヒトの癌によって発現されるＯＡＴの活性を低下させる方法であって、前記方法は請求項１に記載の化合物をＯＡＴを発現する癌に接触させることを含み、ここで前記化合物がＯＡＴ活性を低下させるのに有効な量で存在する、方法。
30. 前記二重結合がα炭素とζ炭素との間にある、請求項２９に記載の方法。
31. 前記二重結合がα炭素とβ炭素との間にある、請求項２９に記載の方法。
32. Ｒ¹及びＲ²の少なくとも１つがＦである、請求項２９に記載の方法。
33. 前記化合物が医薬組成物で提供される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記接触がインビボである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記接触が、それを必要とするヒト対象とのものである、請求項３４に記載の方法。
36. それを必要とする対象の癌を治療するための方法であって、前記方法は請求項１に記載の化合物の治療有効量を対象に投与することを含む方法。
37. 前記二重結合がα炭素とζ炭素との間にある、請求項３６に記載の方法。
38. 前記二重結合がα炭素とβ炭素との間にある、請求項３６に記載の方法。
39. Ｒ¹及びＲ²の少なくとも１つがＦである、請求項３６に記載の方法。
40. 前記化合物が以下の式の化合物である、請求項３６に記載の方法：
    

    
41. 前記化合物が以下の式の化合物である、請求項３６に記載の方法：
    

    

    （式中、Ｒ¹及びＲ²のそれぞれはＨ及びＦから独立して選択されるが、但しＲ¹及びＲ²の少なくとも１つはＦ又はその塩である）。
42. Ｒ¹及びＲ²のそれぞれがＦである、請求項３６に記載の方法。
43. 前記癌が、オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）の発現又は過剰発現を特徴とする、請求項３６に記載の方法。
44. 前記癌が肝細胞癌（ＨＣＣ）である、請求項３６に記載の方法。
45. 前記癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項３６に記載の方法。

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