JP2022553716A - 多特異性結合タンパク質において鎖誤対合を分析する方法 - Google Patents

多特異性結合タンパク質において鎖誤対合を分析する方法 Download PDF

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Abstract

本明細書は、細胞株による多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の産生をモニタリングする方法、ならびにそれに関連する産生およびスクリーニングの方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって、細胞培養培地中の多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量（例えば、相対量）を検出することを含む。一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質は、多特異性抗体、抗体断片またはＦｃ融合タンパク質である。【選択図】図１Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／９２６，３１３号、２０１９年１０月２５日出願およびＥＰ出願第ＥＰ２０３１５２７１．５号、２０２０年５月２８日出願に優先権を主張し、それぞれの開示はその全体を参照により本明細書に組み入れる。
ＡＳＣＩＩ ＴＥＸＴ ＦＩＬＥでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩ ｔｅｘｔ ｆｉｌｅでの以下の提出物の内容は、その全体を参照により本明細書に組み入れる：配列表のコンピューター可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１８３９５２０３２８４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、データ記録：２０２０年５月２９日、サイズ：２ＫＢ）。
分野
本開示は、宿主細胞による多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種（ｍｉｓｐａｉｒｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）の産生をモニタリングする方法、ならびにそれに関連する産生およびスクリーニングの方法に関する。本開示は、宿主細胞による抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種（ｗｅｉｇｈｔ ｖａｒｉａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ）の産生をモニタリングする方法、ならびにそれに関連する産生およびスクリーニングの方法にさらに関する。
同じまたは異なる抗原上の２つ以上の異なるエピトープに結合する多特異性抗体は、近年、がん免疫学（ｉｍｍｕｎｅ－ｏｎｃｏｌｏｇｙ）における魅力的な治療選択肢になった（非特許文献１）。マルチターゲットは、薬物特異性の増強を達成すること、またはシグナル伝達経路において天然リガンドを模倣すること、例えば、同じ細胞表面上の受容体対への同時結合を通じた血友病処置において（非特許文献２）などのさまざまな目的のために使用されている。有名な適用は、分子の一方のアームがＣＤ３／ＣＤ２８受容体結合を介してＴ細胞を活性化し、他方のアームが腫瘍死滅のための腫瘍抗原を標的化するＴ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）コンセプトである（非特許文献３；非特許文献４）。
ＩｇＧ様三重特異性抗体（ｔｓＡｂ）は、２本の異なる重鎖および２本の異なる軽鎖を含み、一般に単一の宿主細胞において発現され、細胞内鎖アセンブリが続く。この産生方法は、２つの別々の細胞株および精製工程を用いる必要性を省く一方で、望ましいｔｓＡｂに加えて望ましくない誤対合種を生成する可能性がある。合理的な設計の欠如およびサブユニットの無作為な会合で、正しく対合した種の理論的収率は、１２．５％しかない（図１Ｂ）。重鎖の強制的ヘテロ二量体化は、ノブと穴（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）設計（非特許文献５）などのタンパク質工学アプローチを通じて良好に達成された。しかし、軽鎖の正しい重鎖への同族対合は、ｔｓＡｂ産生における重要な課題のままである。
そのため、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の産生をモニタリングするまたは分析する方法の必要性が残っている。加えて、さまざまな分子量の複数の種（例えば、化学修飾されたシステインもしくは他の残基などのさまざまな化学修飾を有する、またはさまざまなグリコフォームを有する）を含む抗体または抗体派生体の産生をモニタリングするまたは分析する方法の必要性が残っている。
特許出願、特許公開およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号を含む本明細書に引用されるすべての参考文献は、個々の参考文献を参照により組み入れると具体的かつ個別に示されたのと同様に、その全体を参照により組み入れる。
Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．＆Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｃ．、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９，６９（１２）」、４９４１～４頁 Ｋｉｔａｚａｗａ，Ｔ．ら、「Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１２，１８（１０）」、１５７０～４頁 Ｋｒａｈ，Ｓ．ら、「Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１７，３９（Ｐｔ Ｂ）」、１６７～１７３頁 Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｃ．Ｅ．ら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１８，３２（５）」、１２３９～１２４３頁 Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９６，９（７）」、６１７～２１頁
これらおよび他の必要に応えるために、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の（例えば、細胞株による）産生をモニタリングする方法が本明細書で提供される。これらの方法は、鎖誤対合および他のＩｇＧ関連種の同定および相対的定量のための変性ＳＥＣ－ＬＣ－インタクトＭＳに基づくハイスループット分析プラットホームをとりわけ提供する。有利にはこれらの方法は、時間がかかり、費用がかかる精製（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー）および緩衝液交換ステップを迂回して、清澄化された細胞採取物から直接ｍＡｂ関連種（例えば、多特異性結合タンパク質、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、抗体断片など）のインタクトＭＳ分析を可能にする。そこでこれらの方法は、潜在的な産生細胞株について多数のクローンを迅速にスクリーニングするために使用できる。
一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の産生をモニタリングする方法であって、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｕｌｔｒａ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）および質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を含む細胞培養培地中の多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出することを含む方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質は、少なくとも第１のポリペプチド鎖および第１のポリペプチド鎖と異なる第２のポリペプチド鎖を含む２本以上のポリペプチド鎖の会合を含み、１つまたはそれ以上の誤対合種は、第１のおよび第２のポリペプチド鎖の少なくとも１本を多特異性結合タンパク質のもの以外の会合で含む２本以上のポリペプチド鎖を含む。
一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質は、第１の抗体重鎖、第１の抗体軽鎖、第１の抗体重鎖と異なる第２の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖と異なる第２の抗体軽鎖を含む多特異性抗体である。一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質は、二重特異性抗体、抗体断片またはＦｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質は、三重特異性抗体、抗体断片またはＦｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の誤対合種は：２本の第１の抗体重鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；２本の第２の抗体重鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；２本の第１の抗体軽鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；および２本の第２の抗体軽鎖を含む多特異性抗体の４本ポリペプチド鎖の会合、の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では多特異性結合タンパク質は、３個の抗原結合部位を形成する４本のポリペプチド鎖を含み、
結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
結合タンパク質の第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
によって表される構造を含み、
結合タンパク質の第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
によって表される構造を含み、
結合タンパク質の第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
によって表される構造を含み、
式中：
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジはＣＨ１とＣＨ２ドメインとを繋ぐ免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖重鎖対（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ－ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｐａｉｒ）を形成し、ＶＨ１およびＶＬ１は第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は第３の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の誤対合種は：式Ｉによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；式ＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；式ＩＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；および式ＩＶによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合、の１つまたはそれ以上を含む。
一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出することは、ＭＳによって得られた１つまたはそれ以上のＭＳスペクトルをデコンボリュートすることを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の誤対合種と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の個々の誤対合種の量と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される。一部の実施形態では、誤対合種の全体量と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される。一部の実施形態では方法は、検出に先立って、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を含む細胞培養培地を（例えば、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を産生する細胞株から）準備すること、または得ることをさらに含む。一部の実施形態では方法は、検出に先立って、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を産生する細胞株から細胞培養培地を分離することをさらに含む。一部の実施形態では、検出に先立って、細胞培養培地は、遠心分離によって細胞株から分離される。一部の実施形態では、細胞培養培地は、先行するクロマトグラフィー分離を用いずにＳＥ－ＵＰＬＣに供される。一部の実施形態では、細胞培養培地は、先行するプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いずにＳＥ－ＵＰＬＣに供される。一部の実施形態では、ＭＳはインタクトＭＳである。一部の実施形態では、ＭＳは四重極飛行時間型（ＱＴｏＦ）ＭＳである。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは変性ＳＥ－ＵＰＬＣである。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣはＭＳに直接連結されている。一部の実施形態では、方法は、ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳに先立って、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種をプロテアーゼに接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、プロテアーゼはＩｄｅＳまたはＩｄｅＺである。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは、約０．４ｍＬ／分未満の初期流速で実行される。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは、約０．ｌｍＬ／分の初期流速で実行される。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは、最初の２５分間は約０．ｌｍＬ／分の流速で、続いて約０．４ｍＬ／分の流速で（例えば、２５～３３分間）実行される。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは移動相を用いた均一濃度溶出を使用して実行される。一部の実施形態では、移動相は、３０：７０アセトニトリル：水を含む溶液を含む。一部の実施形態では、移動相は、ギ酸およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む。一部の実施形態では、移動相は、約０．０５％ギ酸および約０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む。一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出することは、約３３分間以内に達成される。一部の実施形態では、方法は、約３３分間以内に達成される。一部の実施形態では、ＭＳは、多特異性結合タンパク質と１つまたはそれ以上の誤対合種との間または２つの誤対合種間の約３００Ｄａの質量差を分解することができる。一部の実施形態では、ＭＳは、多特異性結合タンパク質または誤対合種と１つもしくはそれ以上のグリコフォームとの間の約１６２Ｄａの質量差を分解することができる。
一部の実施形態では、細胞株は哺乳動物細胞株である。一部の実施形態では、細胞株はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。一部の実施形態では、検出に先立って、細胞株は連続細胞培養、例えば撹拌タンクバイオリアクターで細胞培養培地を用いて培養される。一部の実施形態では、検出に先立って、細胞株はバッチ細胞培養で細胞培養培地を用いて培養される。
一部の実施形態では：（ａ）細胞株による多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の産生のために好適な条件下で細胞培養培地中で多特異性結合タンパク質をコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む細胞株を培養すること；（ｂ）細胞株から、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を含む細胞培養培地を分離すること；（ｃ）サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって、細胞培養培地中の多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出すること；ならびに（ｄ）細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質から１つもしくはそれ以上の誤対合種の少なくとも一部を除去すること、または細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の品質および純度の一方もしくは両方を決定すること；を含む、多特異性結合タンパク質を産生する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質は、少なくとも第１のポリペプチド鎖および第１のポリペプチド鎖と異なる第２のポリペプチド鎖を含む２本以上のポリペプチド鎖の会合を含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の誤対合種は、第１のおよび第２のポリペプチド鎖の少なくとも１本を多特異性結合タンパク質のもの以外の会合で含む２本以上のポリペプチド鎖を含む。
一部の実施形態では多特異性結合タンパク質は、第１の抗体重鎖、第１の抗体軽鎖、第１の抗体重鎖と異なる第２の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖と異なる第２の抗体軽鎖を含む多特異性抗体である。一部の実施形態では多特異性結合タンパク質は、二重特異性抗体またはＦｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質は、三重特異性抗体またはＦｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の誤対合種は：２本の第１の抗体重鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；２本の第２の抗体重鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；２本の第１の抗体軽鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；および２本の第２の抗体軽鎖を含む多特異性抗体の４本ポリペプチド鎖の会合、の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では多特異性結合タンパク質は、３個の抗原結合部位を形成する４本のポリペプチド鎖を含み、
結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
によって表される構造を含み、
結合タンパク質の第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
によって表される構造を含み、
結合タンパク質の第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
によって表される構造を含み、
結合タンパク質の第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
によって表される構造を含み、
式中：
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジはＣＨ１とＣＨ２ドメインとを繋ぐ免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖重鎖対を形成し、ＶＨ１およびＶＬ１は第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は第３の抗原結合部位を形成する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の誤対合種は：式Ｉによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；式ＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；式ＩＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；および式ＩＶによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合、の１つまたはそれ以上を含む。
一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出することは、ＭＳによって得られた１つまたはそれ以上のＭＳスペクトルをデコンボリュートすることを含む。一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を検出することは、細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の全体力価を評価することを含む。一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を検出することは、細胞株によって産生された誤対合種の全体力価を評価することを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の誤対合種と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の個々の誤対合種の量と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される。一部の実施形態では、誤対合種の全体量と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される。一部の実施形態では、細胞培養培地は、遠心分離によって細胞株から分離される。一部の実施形態では、細胞培養培地は、先行するクロマトグラフィー分離を用いずに（ｃ）においてＳＥ－ＵＰＬＣに供される。一部の実施形態では、細胞培養培地は、先行するプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いずに（ｃ）においてＳＥ－ＵＰＬＣに供される。一部の実施形態では、ＭＳはインタクトＭＳである。一部の実施形態では、ＭＳは四重極飛行時間型（ＱＴｏＦ）ＭＳである。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは変性ＳＥ－ＵＰＬＣである。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣはＭＳに直接連結されている。一部の実施形態では方法は、細胞株の培養後かつ検出に先立って、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種をプロテアーゼに接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、プロテアーゼはＩｄｅＳまたはＩｄｅＺである。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは、約０．４ｍＬ／分未満の初期流速で実行される。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは、約０．ｌｍＬ／分の初期流速で実行される。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは、最初の２５分間は約０．ｌｍＬ／分の流速で、続いて約０．４ｍＬ／分の流速で実行される。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは移動相を用いた均一濃度溶出を使用して実行される。一部の実施形態では、移動相は、３０：７０アセトニトリル：水を含む溶液を含む。一部の実施形態では、移動相は、ギ酸およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む。一部の実施形態では、移動相は、約０．０５％ギ酸および約０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む。一部の実施形態では、検出は約３３分間以内に達成される。一部の実施形態では方法は、約３３分間以内に達成される。一部の実施形態では、ＭＳは、多特異性結合タンパク質と１つまたはそれ以上の誤対合種との間または２つの誤対合種間の約３００Ｄａの質量差を分解することができる。一部の実施形態では、ＭＳは、多特異性結合タンパク質または誤対合種と１つもしくはそれ以上のグリコフォームとの間の約１６２Ｄａの質量差を分解することができる。
一部の実施形態では、細胞株は哺乳動物細胞株である。一部の実施形態では、細胞株はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。一部の実施形態では、細胞株は連続細胞培養（例えば、撹拌タンクバイオリアクター）で培養される。一部の実施形態では、細胞株はバッチ細胞培養で培養される。
一部の実施形態では、多特異性結合タンパク質の産生について複数の細胞株をスクリーニングする方法であって、上の実施形態のいずれか１つの方法により、複数の内の第１の細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の量を検出すること；および上の実施形態のいずれか１つの方法により、複数の内の第２の細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の量を検出することを含む、方法が本明細書で提供される。
一部の実施形態では、方法は：第１の細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の量を第２の細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の量と比較すること；および比較に基づいて、より多い量の多特異性結合タンパク質を産生した細胞株を選択することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は：上の実施形態のいずれか１つの方法により、第１の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出すること；および上の実施形態のいずれか１つの方法により、第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出すること、をさらに含む。一部の実施形態では、方法は：第１のおよび第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出した後に：第１の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の誤対合種の量を第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の誤対合種の量と比較すること；および比較に基づいて、１つまたはそれ以上の誤対合種に対して、より高い比で多特異性結合タンパク質を産生した細胞株を選択することをさらに含む。一部の実施形態では、細胞株は、１つまたはそれ以上の個々の誤対合種の量に対する多特異性結合タンパク質の比が高いことに基づいて選択される。一部の実施形態では、細胞株は、誤対合種の全体量に対する多特異性結合タンパク質の比が高いことに基づいて選択される。
一部の実施形態では、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の産生をモニタリングする方法であって、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種を含む細胞培養培地中の抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出することを含み、抗体または抗体派生体と、１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、分子量が異なる、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では：（ａ）細胞株による抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の産生のために好適な条件下で細胞培養培地中で抗体または抗体派生体をコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む細胞株を培養すること；（ｂ）細胞株から、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種を含む細胞培養培地を分離すること；（ｃ）サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって、細胞培養培地中の抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出すること；ならびに（ｄ）細胞株によって産生された抗体または抗体派生体から１つもしくはそれ以上の重量バリアント種の少なくとも一部を除去すること、または細胞株によって産生された抗体または抗体派生体の品質および純度の一方もしくは両方を決定すること、を含む、抗体または抗体派生体を産生する方法が本明細書で提供される。
一部の実施形態では、上の実施形態のいずれか１つの方法により、複数の内の第１の細胞株によって産生された抗体または抗体派生体の量を検出すること；および上の実施形態のいずれか１つの方法により、複数の内の第２の細胞株によって産生された抗体または抗体派生体の量を検出することを含む、抗体または抗体派生体の産生について複数の細胞株をスクリーニングする方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は：第１の細胞株によって産生された抗体または抗体派生体の量を第２の細胞株によって産生された抗体または抗体派生体の量と比較すること；および比較に基づいて、より多い量の抗体または抗体派生体を産生した細胞株を選択することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は：上の実施形態のいずれか１つの方法により、第１の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出すること；および上の実施形態のいずれか１つの方法により第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出することをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、第１のおよび第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出した後に：第１の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量と比較すること；および比較に基づいて、１つもしくはそれ以上の重量バリアント種に対して、より高い比で抗体もしくは抗体派生体を産生した細胞株を選択することまたは、産生された抗体もしくは抗体派生体および１つもしくはそれ以上の重量バリアント種の全体量と比べて単一の重量バリアント種をより高い割合で産生した細胞株を選択することをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書のいずれかの実施形態による抗体もしくは抗体派生体および／または１つもしくはそれ以上の重量バリアント種の量は、相対量（例えば、１つもしくはそれ以上の他の種と比較した、または産生された抗体／種の全体量と比較した）を指す。
一部の実施形態では、抗体または抗体派生体は、２９３位にシステイン残基を含む（Ｃｙｓ２９３）。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、システイン化（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｅｄ）、Ｎ－アセチルシステイン化およびグルタチオン化（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌａｔｅｄ）されて、遊離システイン（例えば、抗体または抗体派生体の別のシステインとジスルフィド結合していない）を有する種を含む。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体はＮ－グリコシル化（例えば、抗体Ｆｃ領域において）されていない。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体は、Ｎ－グリコシル化を低下させるまたは除外する変異をＦｃ領域中に含む。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体は、Ｎ３００Ａ変異（ＥＵインデックス）を含む。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体はＮ－グリコシル化されており（例えば、抗体Ｆｃ領域において）、方法は（例えば、ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳに先立って）抗体Ｎ－グリコシル化を除去することさらに含む。一部の実施形態では、抗体Ｎ－グリコシル化を除去することは、抗体をペプチド：Ｎ－グリコシダーゼ酵素（例えば、ＰＮＧａｓｅ Ｆ）を用いて処置することを含む。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出することは、ＭＳによって得られた１つまたはそれ以上のＭＳスペクトルをデコンボリュートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、検出に先立って、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種を含む細胞培養培地を（例えば、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種を産生する細胞株から）準備すること、または得ることをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、検出に先立って、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種を産生する細胞株から細胞培養培地を分離することをさらに含む。一部の実施形態では、検出に先立って、細胞培養培地は、遠心分離によって細胞株から分離される。一部の実施形態では、細胞培養培地は、先行するクロマトグラフィー分離を用いずにＳＥ－ＵＰＬＣに供される。一部の実施形態では、細胞培養培地は、先行するプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いずにＳＥ－ＵＰＬＣに供される。一部の実施形態では、ＭＳはインタクトＭＳである。一部の実施形態では、ＭＳは四重極飛行時間型（ＱＴｏＦ）ＭＳである。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは変性ＳＥ－ＵＰＬＣである。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣはＭＳに直接連結されている。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、化学修飾されたシステイン残基を含む抗体または抗体派生体の種を表す。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、分子量において少なくとも１１９Ｄａ異なる。一部の実施形態では、ＭＳは、システイン化（１１９Ｄａ質量シフト）、Ｎ－アセチルシステイン化（１６１Ｄａ質量シフト）およびグルタチオン化（３０５Ｄａ質量シフト）種、分子量において少なくとも１６２Ｄａ異なる抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種における質量差を分解することができる。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体は、Ｎ－グリコシル化（例えば、抗体Ｆｃ領域において）されており、１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、抗体または抗体派生体のグリコフォームを示す。一部の実施形態では、ＭＳは、抗体または抗体派生体と、抗体または抗体派生体のグリコフォームを示す１つまたはそれ以上の重量バリアント種との間の約１６２Ｄａの質量差を分解することができる。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体は多特異性抗体である。
本明細書に記載の種々の実施形態の１つの、一部のまたはすべての特性は、本発明の他の実施形態を形成するように組み合わせられることは理解される。本発明のこれらのおよび他の態様は、当業者に明らかである。本発明のこれらのおよび他の実施形態は、続く詳細な記載によってさらに記載される。
３つの標的タンパク質ＣＤ２８、ＣＤ３およびＨＥＲ２に結合する３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含む三重特異性結合タンパク質の模式図を提供する図である。第１の対のポリペプチドは、ＣＤ３およびＣＤ２８を認識する２つの抗原結合性部位を形成する交差配向（ＶＨ１－ＶＨ２およびＶＬ２－ＶＬ１）を有する二重可変ドメインを有し（ＣＯＤＶ）、第２の対のポリペプチドは、ＨＥＲ２を認識する単一の抗原結合性部位を形成する単一の可変ドメイン（ＶＨ３およびＶＬ３）を有する（Ｆａｂ）。図１Ａに示す三重特異性結合タンパク質は「ノブ－イントゥ－ホール」突然変異を有する定常領域を使用し、ここでノブは単一の可変ドメインを有する第２の対のポリペプチドの上にある。 重鎖（左）または軽鎖（右）誤対合からもたらされる種を例示する図である。左側には、２つのＦａｂ重鎖（上側）または２つのＣＯＤＶ重鎖（下側）の誤対合からもたらされる種を示す。右側には、２つのＦａｂ軽鎖（左下）、２つのＣＯＤＶ軽鎖（右下）の誤対合、またはＦａｂおよびＣＯＤＶ軽鎖の間違った重鎖への誤対合（右上）からもたらされる種、ならびに正しく対になった三重特異性結合タンパク質（左上）を示す。 抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質のインタクトな（図２Ａ）およびＩｄｅＳ消化されたＦ（ａｂ’）２フラグメント（図２Ｂ）のデコンボリュートされた質量分析（ＭＳ）スペクトルを示す図であり、異なる種が表示される。表される種は、正しく対になった三重特異性結合タンパク質（Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ２）、２つのＦａｂ軽鎖（Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ１）の誤対合種、および２つのＣＯＤＶ軽鎖（Ｈ１Ｌ２／Ｈ２Ｌ２）の誤対合種を含む。アノテーションは、実験的質量対理論的質量（括弧内）を示す。 抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質のインタクトな（図２Ａ）およびＩｄｅＳ消化されたＦ（ａｂ’）２フラグメント（図２Ｂ）のデコンボリュートされた質量分析（ＭＳ）スペクトルを示す図であり、異なる種が表示される。表される種は、正しく対になった三重特異性結合タンパク質（Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ２）、２つのＦａｂ軽鎖（Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ１）の誤対合種、および２つのＣＯＤＶ軽鎖（Ｈ１Ｌ２／Ｈ２Ｌ２）の誤対合種を含む。アノテーションは、実験的質量対理論的質量（括弧内）を示す。 一連のクローンからの三重特異性結合タンパク質の生成を示す図である。図３Ａは、正しいｔｓＡｂ質量（純度）のパーセンテージによる、抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質産生クローンのランキングを示す。 一連のクローンからの三重特異性結合タンパク質の生成を示す図である。図３Ｂは、図３Ａに表すのと同じ順序（すなわち、純度によるランク付け）での各クローンの生産性（正規化した力価）を示す。 バッチ培養によって作製された抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質産生クローンのランダムに選択されたサブセットにおける、誤対合したおよび半抗体不純物、ならびに正しく対になった種の寄与を表す円グラフを示す図である。 ＳＥＣインタクトＭＳによる三重特異性結合タンパク質の分析を示す図である。図４Ａは、ｔｓＡｂ清浄化採取流体の変性ＳＥＣインタクトＭＳ分析の代表的な塩基ピーククロマトグラムを示す。 ＳＥＣインタクトＭＳによる三重特異性結合タンパク質の分析を示す図である。図４Ｂは、各クロマトグラフィーピークの下の複合スペクトルを示す。 ＳＥＣインタクトＭＳによる三重特異性結合タンパク質の分析を示す図である。図４Ｃは、Δ質量＝３０２Ｄａの２つの構築物からの抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質および抗ＨＥＲ２三重特異性結合タンパク質分解軽鎖誤対合種の混合物の、デコンボリュートされた質量スペクトルの拡大を示す。 抗ＨＥＲ２三重特異性結合タンパク質の場合は４．４～２１．８μｇからの、および抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質の場合は１１．０～５５．０μｇからの、異なるカラムロード（μｇタンパク質）のために得られた正しく対になったおよび誤対合した種の相対的定量化を示す図であり、低力価および高力価採取試料の分析のためのこの方法の頑健性および信頼性を実証する。抗ＨＥＲ２三重特異性結合タンパク質の場合、カラムロードは４．４μｇ、８．７μｇ、１３．１μｇ、１７．４μｇおよび２１．８μｇ（左から右に）として示される。抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質の場合、カラムロードは１１．０μｇ、２２．０μｇ、３３．０μｇ、４４．０μｇおよび５５．０μｇ（左から右に）として示される。 ２つの方法の比較を示す、清浄化採取（図５Ｂ）およびＰｒｏＡ精製（図５Ｃ）抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質のＳＥＣ－ＬＣ－ＭＳ分析によって得られた生の、またはデコンボリュートされた質量スペクトルを示す図である。デコンボリュートされたスペクトルの上のアノテーションは、各々の種の実験的質量および％強度を示す。 ２つの方法の比較を示す、清浄化採取（図５Ｂ）およびＰｒｏＡ精製（図５Ｃ）抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質のＳＥＣ－ＬＣ－ＭＳ分析によって得られた生の、またはデコンボリュートされた質量スペクトルを示す図である。デコンボリュートされたスペクトルの上のアノテーションは、各々の種の実験的質量および％強度を示す。 正しいｔｓＡｂ質量のパーセンテージ（純度）（図５Ｄ）および同じクローンの力価によって測定された生産性（図５Ｅ）に基づく抗ＨＥＲ２三重特異性結合タンパク質産生クローンのランキングを示す図である。 正しいｔｓＡｂ質量のパーセンテージ（純度）（図５Ｄ）および同じクローンの力価によって測定された生産性（図５Ｅ）に基づく抗ＨＥＲ２三重特異性結合タンパク質産生クローンのランキングを示す図である。 異なる細胞培養条件（示すようにａｍｂｒまたはバッチ）で増殖させた、抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質（図６Ａ）および抗ＨＥＲ２三重特異性結合タンパク質（図６Ｂ）の異なるクローンにおける正しいｔｓＡｂ質量の収量を示す図である。 異なる細胞培養条件（示すようにａｍｂｒまたはバッチ）で増殖させた、抗ＣＤ３８三重特異性結合タンパク質（図６Ａ）および抗ＨＥＲ２三重特異性結合タンパク質（図６Ｂ）の異なるクローンにおける正しいｔｓＡｂ質量の収量を示す図である。 ２つの異なるａｍｂｒ条件（図６Ｃと６Ｄ）およびバッチ培養条件（図６Ｅ）の下で増殖させた抗ＣＤ３８ ＴＣＥクローンにおける、鎖誤対合および半抗体レベルに及ぼす異なる増殖条件の影響を示す図である。 ２つの異なるａｍｂｒ条件（図６Ｃと６Ｄ）およびバッチ培養条件（図６Ｅ）の下で増殖させた抗ＣＤ３８ ＴＣＥクローンにおける、鎖誤対合および半抗体レベルに及ぼす異なる増殖条件の影響を示す図である。 ２つの異なるａｍｂｒ条件（図６Ｃと６Ｄ）およびバッチ培養条件（図６Ｅ）の下で増殖させた抗ＣＤ３８ ＴＣＥクローンにおける、鎖誤対合および半抗体レベルに及ぼす異なる増殖条件の影響を示す図である。 ａｍｂｒ（図６Ｆ）またはバッチ（図６Ｇ）培養条件の下で増殖させた抗ＨＥＲ２ ＴＣＥクローンにおける、鎖誤対合レベルに及ぼす異なる増殖条件の影響を示す図である。 ａｍｂｒ（図６Ｆ）またはバッチ（図６Ｇ）培養条件の下で増殖させた抗ＨＥＲ２ ＴＣＥクローンにおける、鎖誤対合レベルに及ぼす異なる増殖条件の影響を示す図である。 一部の実施形態によるハイスループットのインタクトＭＳのための例示的なワークフローを例示する図である。ハイスループット能力に加えて、さらなる利点には以下のものが含まれる：（１）プロテインＡ精製の必要性がなく、時間および費用を節約する；（２）遊離鎖、半抗体およびプロテインＡ精製を通過できない他の亜種の上の潜在的な浪費されたバイオマスに関する情報を提供することによる、細胞株性能へのより直接的な洞察；および（３）Ｆｃのないモダリティー、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖおよび他の抗体フラグメントへの適用性。 鎖誤対合の最高および最低レベルをそれぞれ有する抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３三重特異性抗体産生細胞クローンのために得られたデコンボリュートされたインタクト質量スペクトルを示す図である。 鎖誤対合の最高および最低レベルをそれぞれ有する抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３三重特異性抗体産生細胞クローンのために得られたデコンボリュートされたインタクト質量スペクトルを示す図である。 バッチ培養条件下で増殖させた抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３三重特異性を産生する５０個の細胞クローンの正しく対になった生成物の生産性（力価μｇ／ｍＬによって調査した；図９Ａ）および生産（％正しい質量；図９Ｂ）を示す図である。 バッチ培養条件下で増殖させた抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３三重特異性を産生する５０個の細胞クローンの正しく対になった生成物の生産性（力価μｇ／ｍＬによって調査した；図９Ａ）および生産（％正しい質量；図９Ｂ）を示す図である。 抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３三重特異性抗体を産生する選択されたクローンで参照質量（Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ２）のために得られた詳細なグリカンプロファイルを示す図である。クローンは２つの異なる条件下で培養した：スピン管（バッチ条件；図１０Ａ）およびａｍｂｒ１５バイオリアクター（流加条件；図１０Ｂ）。 抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３三重特異性抗体を産生する選択されたクローンで参照質量（Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ２）のために得られた詳細なグリカンプロファイルを示す図である。クローンは２つの異なる条件下で培養した：スピン管（バッチ条件；図１０Ａ）およびａｍｂｒ１５バイオリアクター（流加条件；図１０Ｂ）。 システインキャッピング状態のために工学操作されたシステイン（Ｃｙｓ２９３）を有する抗体の採取物のＭＳ分析を示す図である。図１１Ａは、直接インタクトＭＳ分析を使用した、種のＣｙｓ２９３キャッピング状態の特定を示す。この抗体は、Ｆｃ領域のＮ－グリコシル化を除去したＮ３００Ａ突然変異を含有した。図１１Ｂは、分析の前にＮ－グリカンを除去するためにＰＮＧａｓｅ Ｆで処理した抗体の直接インタクトＭＳ分析を使用した、Ｃｙｓ２９３キャッピング状態の特定を示す。 システインキャッピング状態のために工学操作されたシステイン（Ｃｙｓ２９３）を有する抗体の採取物のＭＳ分析を示す図である。図１１Ａは、直接インタクトＭＳ分析を使用した、種のＣｙｓ２９３キャッピング状態の特定を示す。この抗体は、Ｆｃ領域のＮ－グリコシル化を除去したＮ３００Ａ突然変異を含有した。図１１Ｂは、分析の前にＮ－グリカンを除去するためにＰＮＧａｓｅ Ｆで処理した抗体の直接インタクトＭＳ分析を使用した、Ｃｙｓ２９３キャッピング状態の特定を示す。
本開示は、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種、例えば、多特異性抗体、抗体断片、Ｆｃ融合タンパク質、または少なくとも第１のポリペプチド鎖および第１のポリペプチド鎖と異なる第２のポリペプチド鎖を含む２本以上のポリペプチド鎖の会合を含む他の多特異性結合タンパク質、ならびに第１のおよび第２のポリペプチド鎖の少なくとも１本を多特異性結合タンパク質のもの以外の会合で含む２本以上のポリペプチド鎖を含む１つまたはそれ以上の誤対合種の産生をモニタリングする方法をとりわけ提供する。同様の方法は、多特異性結合タンパク質の産生、多特異性結合タンパク質の産生について細胞株をスクリーニングすること、または抗体もしくはＦｃ融合タンパク質の産生、および抗体もしくは抗体派生体（例えば、１つまたはそれ以上の重量バリアント種と共に産生される）の産生または抗体もしくは抗体派生体の産生（例えば、１つまたはそれ以上の重量バリアント種と共に産生される）について細胞株をスクリーニングすることに適用され得る。有利には、これらの方法は、時間がかかり、費用がかかる精製（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー）および緩衝液交換ステップを迂回して、清澄化された採取物において直接ｍＡｂ関連種のインタクトＭＳ分析を可能にする。そこでこれらの方法は、潜在的な産生細胞株について多数のクローンを迅速にスクリーニングするために使用できる。
続く記載は、例示的方法、パラメーターなどを記載する。しかし、かかる記載は本開示の範囲への限定として意図されず、むしろ例示的実施形態の記載として提供されることは認識されるべきである。
定義
本開示により利用される場合、他に示されない限り以下の用語は、以下の意味を有すると理解される。文脈により他に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。
本明細書に記載の本開示の態様および実施形態が、態様および実施形態「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことを含むことは理解される。
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、長さ少なくとも１０ヌクレオチドの１本鎖または２本鎖核酸ポリマーを指す。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボ核酸またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態であり得る。そのような修飾は、ブロムウリジン（ｂｒｏｍｕｒｉｄｉｎｅ）などの塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’－ジデオキシリボースなどのリボース修飾ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）およびホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）などのヌクレオチド間連結修飾を含む。用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡの１本鎖および２本鎖形態を明確に含む。
「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成由来またはこれらのいくつかの組み合わせのポリヌクレオチドであり：（１）単離されたポリヌクレオチドが天然で見出されるポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合しておらず、（２）天然では連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、または（３）より長い配列の一部として天然で存在しない。
「単離されたポリペプチド」は：（１）それと共に通常見出される少なくともいくつかの他のポリペプチドを含まない、（２）同じ供給源由来、例えば、同じ種由来の他のポリペプチドを本質的に含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、（４）天然で会合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の材料の少なくとも約５０パーセントから分離されている、（５）「単離されたポリペプチド」が天然で会合しているポリペプチドの一部と（共有結合的もしくは非共有結合的相互作用によって）会合していない、（６）天然で会合していないポリペプチドと作動可能に（共有結合的もしくは非共有結合的相互作用によって）会合している、または（７）天然に存在しない、ものである。そのような単離されたポリペプチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは合成由来の他のＲＮＡまたはこれらの任意の組合せによってコードされ得る。好ましくは、単離されたポリペプチドはその天然環境で見出され、その使用（治療、診断、予防、研究またはその他）を妨害するポリペプチドまたは他の混入物を実質的に含まない。
天然に存在する抗体は、四量体を典型的には含む。そのような各四量体は、１本の全長「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）および１本の全長「重」鎖（典型的には、約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）を各対が有するポリペプチド鎖の２個の同一の対から典型的には構成される。本明細書において使用される場合、用語「重鎖」および「軽鎖」は、標的抗原に対する特異性を付与するために十分な可変ドメイン配列を有する任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に典型的には関与している約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを典型的には含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に関与する定常ドメインを典型的には明確にする。それにより、天然に存在する抗体では、全長重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＨ）および３個の定常ドメイン（ＣＨＩ、ＣＨ２およびＣＨ３）を含み、ここでＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインはカルボキシル末端にあり、全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、ここでＶＬドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＬドメインはカルボキシル末端にある。
ヒト軽鎖はカッパおよびラムダ軽鎖に典型的には分類され、ヒト重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンに典型的には分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを明確にする。ＩｇＧは、これだけに限らないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む数個のサブクラスを有する。ＩｇＭは、これだけに限らないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有する。ＩｇＡは、これだけに限らないが、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むサブクラスに同様に細分される。全長軽鎖および重鎖中で、可変および定常ドメインは、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含んで、典型的には約１２個またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって繋がれている、例えば、すべての目的のためにその全体を参照により組み入れる、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８９）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的には抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体の可変ドメインは、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される、３個の高頻度可変性領域によって繋がれた比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を典型的には示す。各対の２本の鎖由来のＣＤＲは、フレームワーク領域によって典型的には並べられ、特異的なエピトープへの結合を可能にする。アミノ末端からカルボキシル末端に、両方の軽鎖および重鎖可変ドメインは、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を典型的には含む。
用語「ＣＤＲセット」は、抗原に結合することができる単一可変領域に存在する３個のＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、さまざまなシステムにより異なって定められている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））によって記載されたシステムは、抗体の任意の可変領域に適用できる明確な残基番号付けシステムを提供しただけでなく、３個のＣＤＲを定める詳細な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと称される。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７～８３頁）は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内のある特定の部分が、アミノ酸配列のレベルでは大きな多様性を有するにも関わらず、ほとんど同一のペプチド骨格コンホメーションをとっていることを見出した。これらの副部分は、「Ｌ」および「Ｈ」が軽鎖および重鎖領域をそれぞれ指定して、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と名付けられた。これらの領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する境界を有してＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと称される場合がある。Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するＣＤＲを定める他の境界は、Ｐａｄｌａｎ，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３～３９頁；ＭａｃＣａｌｌｕｍ，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２（５）：７３２～４５頁；およびＬｅｆｒａｎｃ，２００３，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５～７７頁によって記載された。さらに、他のＣＤＲ境界定義は、本明細書のシステムの１つに厳密に従わない場合があり、特定の残基または残基の群またはさらにＣＤＲ全体が抗原結合に顕著に影響を与えないとの予測または実験的発見の観点からそれらは短縮または延長できるが、それでもＫａｂａｔ ＣＤＲと重なる。ある特定の実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａが定めたＣＤＲを使用するが、本明細書において使用される方法は、これらのシステムのいずれによって定められたＣＤＲも利用できる。アミノ酸配列を使用して予測されたＣＤＲの同定は、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ，” Ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２巻．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．，Ｄｕｂｅｌ Ｓ．，編 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，３３～５１頁（２０１０）においてなど、当技術分野において十分周知である。重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、他の従来の方法によって、例えば、配列超可変性の領域を決定するための他の重鎖および軽鎖可変領域の周知のアミノ酸配列との比較によって、ＣＤＲの配列を同定するためにも調査される。番号付けられた配列は、目測によって、またはＴｈｏｍｐｓｏｎ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３～８０頁に記載の一連のＣＬＵＳＴＡＬプログラムの１つなどのアライメントプログラムを使用することによってアラインされる。分子モデルは、フレームワークおよびＣＤＲ領域を正確に記述するために従来法で使用され、したがって配列に基づく割当を補正する。
本明細書において使用される場合、用語「Ｆｃ」は、単量体形態であるかまたは多量体形態であるかに関わらず、抗体の消化から生じるまたは他の手段によって産生される非抗原結合断片の配列を含む分子を指し、ヒンジ領域を含む場合がある。天然Ｆｃの元の免疫グロブリン供給源は、好ましくはヒト由来であり、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましいが、免疫グロブリンのいずれであってもよい。Ｆｃ分子は、共有（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有会合によって二量体または多量体形態に連結され得る単量体ポリペプチドから構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１およびＩｇＧＡ２）に応じて１から４個の範囲である。Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合された二量体である。本明細書において使用される場合、用語「天然Ｆｃ」は、単量体、二量体および多量体形態の総称である。
Ｆ（ａｂ）断片は、１本の軽鎖ならびに１本の重鎖のＶＨおよびＣＨ１ドメインを典型的には含み、ここでＦ（ａｂ）断片のＶＨ－ＣＨ１重鎖部分は、別の重鎖ポリペプチドとジスルフィド結合を形成できない。本明細書において使用される場合、Ｆ（ａｂ）断片は、アミノ酸リンカーによって分けられた２個の可変ドメインを含有する１本の軽鎖、ならびにアミノ酸リンカーによって分けられた２個の可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含有する１本の重鎖も含み得る。
Ｆ（ａｂ’）断片は１本の軽鎖、および鎖間ジスルフィド結合がＦ（ａｂ’）２分子を形成するように２本の重鎖間に形成され得るように定常領域（ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間）より多くを含有する１本の重鎖の一部を典型的には含む。
本明細書において使用される場合、用語「結合タンパク質」は、少なくとも１個の標的抗原に特異的に結合する天然に存在しない（または組換えもしくは操作された）分子を指す。一部の実施形態では、結合タンパク質は、２つ以上の抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、多特異性抗体、抗体断片またはＦｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、二重特異性抗体または抗体断片である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、三重特異性抗体または抗体断片である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、三重特異性結合タンパク質であり、例えば以下に記載の通り。一部の実施形態では、結合タンパク質は、１個、２個、３個もしくはそれ以上の抗原結合ドメインまたは他のポリペプチドに融合された１個または２個のＦｃ領域を含む（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）。一部の実施形態では、結合タンパク質は、二重（ｄｕａｌ）可変ドメイン（ＤＶＤ）免疫グロブリンであり、例えばＷＯ２０１２０６１５５８に記載の通り。一部の実施形態では、結合タンパク質は、交差方向性（ｃｒｏｓｓ ｏｖｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を有する二重（ｄｕａｌ）可変ドメインを含む、例えばＷＯ２０１２１３５３４５に記載の通り。一部の実施形態では、結合タンパク質は、４個の抗原結合部位を形成する４本のポリペプチド鎖を含み、２本のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
によって表される構造を有し、
および２本のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－Ｆｃ ［ＩＩ］
によって表される構造を有し、
式中：
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｆｃは免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは、交差軽鎖重鎖対を形成する。
本開示の三重特異性結合タンパク質は、他に規定のない限り、少なくとも３個の抗原結合部位を形成する４本のポリペプチド鎖を典型的には含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
によって表される構造を有し、
および第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
によって表される構造を有し、
および第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３－ＣＨ１ ［ＩＩＩ］
によって表される構造を有し、
および第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
によって表される構造を有し、
式中：
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ヒンジはＣＨ１とＣＨ２ドメインとを繋ぐ免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖重鎖対を形成する。
「組換え」分子は、組換え手段によって調製、発現、創出または単離されたものである。
本開示の一実施形態は、１から３個の間の標的抗原に生物学的および免疫学的特異性を有する結合タンパク質を提供する。本開示の別の実施形態は、そのような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本開示の別の実施形態は、そのような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本開示のさらに別の実施形態は、そのような結合タンパク質を発現する（すなわち、そのような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードする核酸分子またはベクターを含む）宿主細胞を提供する。
本明細書において使用される場合、用語「交換可能性（ｓｗａｐａｂｉｌｉｔｙ）」は、フォールディングおよび最終的な結合親和性の保持を伴う結合タンパク質フォーマット内の可変ドメインの互換性を指す。「完全交換性」は、結合親和性の保持によって証明される結合タンパク質の完全な機能を維持しながら、式Ｉのポリペプチド鎖または式ＩＩのポリペプチド鎖において、ＶＨ１およびＶＨ２ドメインの両方の順、したがってＶＬ１およびＶＬ２ドメインの順序を交換する（すなわち、順序を逆にする）能力を指す。さらに、名称ＶＨおよびＶＬが、最終的なフォーマット中の特定のタンパク質鎖でのドメインの位置だけを指すことは記されるべきである。例えば、ＶＨ１およびＶＨ２は、親抗体中のＶＬ１およびＶＬ２ドメイン由来でよく、結合タンパク質中の位置ＶＨ１およびＶＨ２に置かれる。同様に、ＶＬ１およびＶＬ２は、親抗体中のＶＨ１およびＶＨ２ドメイン由来でよく、結合タンパク質中の位置ＶＨ１およびＶＨ２に置かれる。それにより、ＶＨおよびＶＬの名称は、現在の位置を指し、親抗体での元の位置を指さない。ＶＨおよびＶＬドメインは、したがって「交換可能」である。
本明細書において使用される場合、用語「抗原」または「標的抗原」または「抗原標的」は、結合タンパク質によって結合され、加えてその抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するために動物において使用することができる分子または分子の一部を指す。標的抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有することができる。結合タンパク質によって認識される各標的抗原に関して、結合タンパク質は、標的抗原を認識するインタクト抗体と競合することができる。
用語「単一特異性結合タンパク質」は、１個の抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。
用語「一価結合タンパク質」は、１個の抗原結合部位を有する結合タンパク質を指す。
用語「二重特異性結合タンパク質」は、２個の異なる抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。
用語「二価結合タンパク質」は、２個の結合部位を有する結合タンパク質を指す。
用語「三重特異性結合タンパク質」は、３個の異なる抗原標的に特異的に結合する結合タンパク質を指す。
用語「三価結合タンパク質」は、３個の結合部位を有する結合タンパク質を指す。具体的な実施形態では、三価結合タンパク質は、１個の抗原標的に結合できる。他の実施形態では、三価結合タンパク質は、２個の抗原標的に結合できる。他の実施形態では、三価結合タンパク質は、３個の抗原標的に結合できる。
「単離された」結合タンパク質は、その天然環境の構成成分から同定され、分離され、および／または回収されたものである。その天然環境の混入物成分は、結合タンパク質について診断用または治療用使用を妨げる材料であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられる。一部の実施形態では、結合タンパク質は：（１）ローリー方法によって決定された場合に抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ）配列決定装置の使用によりＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、または（３）クーマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を使用する、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一にまで精製される。結合タンパク質の天然環境での構成成分の少なくとも１つが存在しないことから、単離された結合タンパク質は、組換え細胞内インサイツでの結合タンパク質を含む。
本明細書において使用される場合、用語「実質的に純粋」または「実質的に精製された」は、主に存在する種である化合物または種を指す（すなわち、モルベースで、それが組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富に存在する）。一部の実施形態では、実質的に精製された画分は、種が、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を構成する組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％超を構成する。さらに他の実施形態では、種は、本質的に均一性にまで精製され（混入種は、従来の検出方法によっては組成物中に検出されない）、組成物は単一の高分子種から本質的になる。
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意の決定因子、好ましくはポリペプチド決定因子を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定因子として、アミノ酸、糖側鎖、リン酸基またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基が挙げられ、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造的特徴および／または特定の電荷特徴を有する場合がある。エピトープは、抗体または結合タンパク質によって結合される抗原の領域である。ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合すると称される。一部の実施形態では、結合タンパク質は、平衡解離定数が≦１０－８Ｍである場合、より好ましくは平衡解離定数が≦１０－９Ｍである場合、最も好ましくは解離定数が≦１０－１０Ｍである場合に抗原に特異的に結合すると称される。
結合タンパク質の解離定数（ＫＤ）は、例えば表面プラズモン共鳴によって決定され得る。一般に、表面プラズモン共鳴分析は、ＢＩＡｃｏｒｅ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってリガンド（バイオセンサーマトリクス上の標的抗原）と分析物（溶液中の結合タンパク質）との間のリアルタイム結合相互作用を測定する。表面プラズモン分析は、分析物（バイオセンサーマトリクス上の結合タンパク質）を固定化すること、およびリガンド（標的抗原）を提示することによっても実施され得る。本明細書において使用される場合、用語「ＫＤ」は、特定の結合タンパク質と標的抗原との間の相互作用の解離定数を指す。
本明細書において使用される場合、用語「特異的に結合」は、少なくとも約１ｘ１０－６Ｍ、１ｘ１０－７Ｍ、１ｘ１０－８Ｍ、１ｘ１０－９Ｍ、１ｘ１０－１０Ｍ、１ｘ１０－１１Ｍ、１ｘ１０－１２Ｍもしくはそれ以上のＫｄでエピトープを含有する抗原に結合する、および／または非特異的抗原に対するその親和性より少なくとも２倍大きい親和性でエピトープに結合する結合タンパク質またはその抗原結合断片の能力を指す。
本明細書において使用される場合、用語「リンカー」は、交差二重（ｄｕａｌ）可変領域免疫グロブリンにフォールドするために、軽鎖および重鎖のドメインに十分な可動性を与えるように免疫グロブリンドメイン間に挿入された１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を指す。リンカーは、可変ドメイン間または可変ドメインと定常ドメインとの間の移行部にそれぞれ配列レベルで挿入される。ドメイン間の移行部は、免疫グロブリンドメインのおよそのサイズが十分理解されていることから同定できる。ドメイン移行部の正確な位置は、実験データによって実証されるベータシートもしくはアルファヘリックスなどの二次構造要素を形成しないペプチドストレッチを位置付けることによって決定され得る、またはモデリングもしくは二次構造予測の技術によって推測され得る。本明細書に記載のリンカーは、ＶＬ２のＣ末端とＶＬ１ドメインのＮ末端との間の軽鎖に位置付けられるＬ１；およびＶＬ１のＣ末端とＣＬドメインのＮ末端との間の軽鎖に位置付けられるＬ２と称される。重鎖リンカーは、ＶＨ１のＣ末端とＶＨ２ドメインのＮ末端との間に位置付けられるＬ３；およびＶＨ２のＣ末端とＣＨ１ドメインのＮ末端との間に位置付けられるＬ４として周知である。
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、コードされた情報を宿主細胞に移行するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）を指す。用語「ベクター」は、それに連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を含む。ベクターの１つの種類は、追加的なＤＮＡセグメントを挿入できる環状２本鎖ＤＮＡ分子を指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、追加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに挿入できるウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製することができる（例えば、細菌性複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入で宿主細胞のゲノムにインテグレーションされ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。加えて、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を方向付けることができる。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態にある。用語「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であって、本明細書において互換的に使用される。しかし本開示は、同じ機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態も含むことが意図される。
本明細書において使用される場合、句「組換え宿主細胞」（または「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。組換え宿主細胞または宿主細胞は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の後代も指すことが意図される。変異または環境の影響のいずれかによって、ある種の改変が続く世代において生じる可能性があることから、実際にはかかる後代は親細胞と同一でない場合があるが、そのような細胞は、本明細書において使用される場合、用語「宿主細胞」の範囲内にいまだ含まれる。細菌、酵母、バキュロウイルスおよび哺乳動物発現系（およびファージディスプレイ発現系）が挙げられる多種多様な宿主細胞発現系が、結合タンパク質を発現するために使用され得る。好適な細菌発現ベクターの例はｐＵＣ１９である。組換えによって結合タンパク質を発現するために、宿主細胞は、結合タンパク質のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ断片を保有する１つまたはそれ以上の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされ、それによりポリペプチド鎖が宿主細胞において発現され、好ましくは宿主細胞が培養される培地に分泌され、その培地から結合タンパク質を回収することできる。
本明細書において使用される場合、用語「形質転換」は、細胞の遺伝的特徴における変化を指し、新たなＤＮＡを含有するように改変されて、細胞は形質転換される。例えば、細胞はその天然の状態から遺伝的に改変されて形質転換される。形質転換に続いて、形質転換するＤＮＡは、細胞の染色体に物理的にインテグレーションすることによって細胞のＤＮＡを組み換える場合がある、または複製されないエピソームエレメントとして一過的に維持される場合がある、またはプラスミドとして非依存的に複製する場合がある。ＤＮＡが細胞の分裂と共に複製される場合に、細胞は安定に形質転換されたと見なされる。本明細書において使用される場合、用語「トランスフェクション」は、細胞による外来性または外因性ＤＮＡの取り込みを指し、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されて、細胞は「トランスフェクト」される。多数のトランスフェクション技術が当技術分野において十分周知である。かかる技術は、１つまたはそれ以上の外因性ＤＮＡ分子を好適な宿主細胞に導入するために使用される。
本明細書において使用され、対象物に適用される場合、用語「天然に存在する」は、対象物を天然で見出すことができる、ヒトによって操作されていないことを指す。例えば、生物（ウイルスを含む）において存在し、天然の供給源から単離でき、ヒトによって意図的に改変されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドは天然に存在する。同様に本明細書において使用される場合「天然に存在しない」は、天然に見出されない、またはヒトによって構造的に改変されたもしくは合成された対象物を指す。
本明細書において使用される場合、２０個の従来のアミノ酸およびそれらの略号は、従来の用法に従う。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）；非天然アミノ酸およびα－、α－ジ置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸などの類似体ならびに他の非定型アミノ酸も結合タンパク質のポリペプチド鎖のために好適な構成成分でもあり得る。非定型アミノ酸の例として：４－ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリジン、ε－Ｎ－アセチルリジン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリジン、σ－Ｎ－メチルアルギニンならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書において使用されるポリペプチド表示法では、標準的用法および慣習に従って左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシル末端方向である。
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてクラスに分けられる：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ；
（２）極性親水性：Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）脂肪族：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（４）脂肪族疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（５）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（６）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（７）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（８）鎖方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（９）芳香族：Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；および
（１０）芳香族疎水性：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ。
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つのメンバーの同じクラスの別のメンバーでの交換を含み得る。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーの別のクラスのメンバーへの交換を含み得る。
当業者は、周知の技術を使用して結合タンパク質のポリペプチド鎖の好適なバリアントを決定することができる。例えば、当業者は、活性のために重要であると考えられていない領域を標的化することによって活性を破壊することなく変更できるポリペプチド鎖の好適な領域を同定できる。代替的に当業者は、類似するポリペプチドにおいて保存されている残基および分子の部分を同定できる。加えて、生物学的活性のためにまたは構造のために重要である可能性がある領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を与えることなく保存的アミノ酸置換に供することができる。
方法
本開示のある特定の態様は、多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の生成をモニタリングするための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）の量を検出することを含む。一部の実施形態では、生成物および１つまたはそれ以上の誤対合種は、細胞培地で検出される。多重特異性結合タンパク質の例示的および非限定的な記載が本明細書で提供される。
本開示のある特定の態様は、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の生成をモニタリングするための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって生成物（例えば、抗体または抗体派生体の１つまたはそれ以上の重量バリアント種）の量を検出することを含む。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種は細胞培地で検出される。抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、例えば、分子量が異なる（例えば、異なる化学的改変で、例えば化学改変されたシステインまたは他の残基で、または異なるグリコ型で）複数の種を表すことができる。下の実施例で実証されるように、本明細書に記載される方法は、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の分析に関して、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の分析に適用することができる。
一部の実施形態では、細胞培地は清浄化された細胞培養採取物である。例えば、細胞培地は、細胞培養から採取され、接線流濾過（ＴＦＦ）、深層濾過および／または遠心分離によって清浄化されたものであってよい。一部の実施形態では、本方法は、生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）を産生する細胞株から細胞培地を分離するかまたは採取することをさらに含む。一部の実施形態では、細胞培地は遠心分離によって清浄化される。一部の実施形態では、細胞培地は事前のクロマトグラフィー分離なしでＳＥ－ＵＰＬＣに供される。すなわち、一部の実施形態では、細胞培地は事前のクロマトグラフィー分離に曝露させられていないものである。一部の実施形態では、細胞培地は事前のプロテインＡ親和性クロマトグラフィーなしでＳＥ－ＵＰＬＣに供される。すなわち、一部の実施形態では、細胞培地はプロテインＡに接触していないものである。
一部の実施形態では、生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）の量を検出することは、ＭＳによって得られる１つまたはそれ以上のＭＳスペクトルをデコンボリュートすることを含む。ＭＳスペクトルのデコンボリューションのための方法は、当技術分野で公知である。デコンボリューションのために有益なソフトウェアの非限定的な例は、下に例示される。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質の相対量は、例えば、１つまたはそれ以上の誤対合種の量と比較して検出される。例えば、生成される多重特異性結合タンパク質の量は、１つまたはそれ以上の個々の誤対合種の量と、および／または誤対合種の全体量（例えば、全ての誤対合種またはそのある特定のサブセットの全体量）と比較することができる。
一部の実施形態では、ＭＳはインタクトＭＳである。一部の実施形態では、ＭＳは四重極飛行時間型（ＱＴｏＦ）のＭＳである。様々なＱＴｏＦ ＭＳ方法が当技術分野で公知である。ＱＴｏＦ ＭＳの例示的および非限定的なパラメーターは、下の実施例で記載される。
一部の実施形態では、ＭＳは約１０００Ｄａ以下、約９００Ｄａ以下、約８００Ｄａ以下、約７００Ｄａ以下、約６００Ｄａ以下、約５００Ｄａ以下、約４００Ｄａ以下、約３００Ｄａ以下、または約２００Ｄａ以下の質量差を分解することが可能である。一部の実施形態では、ＭＳは約３００Ｄａの質量差を分解することが可能である。例えば、一部の実施形態では、ＭＳは多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の間の、または２つの誤対合種の間の約３００Ｄａの質量差を分解することが可能である。一部の実施形態では、ＭＳは約１６２Ｄａの質量差を分解することが可能である。例えば、一部の実施形態では、ＭＳはグリコ型の間、例えば多重特異性結合タンパク質または誤対合種と１つまたはそれ以上のグリコ型の間の約１６２Ｄａの質量差を分解することが可能である。
一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは変性ＳＥ－ＵＰＬＣである。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣはＭＳに直接的に接続される。様々なＳＥ－ＵＰＬＣ方法が当技術分野で公知である。ＳＥ－ＵＰＬＣの例示的および非限定的な条件は、下の実施例で記載される。
一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣはより遅い初期の流速で実行され、より速い流速がその後続く。理論に縛られることを望むことなく、より遅い初期の流速は細胞培養採取成分のより効率的なサイズベースの分離を可能にするが、この初期の期間の後に流速を増加させることは本方法の全体速度を増強すると考えられる。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは約０．４ｍＬ／分未満の初期流速で実行され、その後約０．４ｍＬ／分以上の流速が続く。一部の実施形態では、初期流速は、約０．４ｍＬ／分未満、約０．３ｍＬ／分未満、約０．２ｍＬ／分未満または約０．１ｍＬ／分である。一部の実施形態では、初期流速は、ＳＥ－ＵＰＬＣの最初の１５、２０または２５分を指す。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは最初の２５分間は約０．４ｍＬ／分未満の流速で実行され、その後約０．４ｍＬ／分以上の流速が続く（例えば、２５～３３分から）。一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは最初の２５分間は約０．１ｍＬ／分の流速で実行され、その後約０．４ｍＬ／分の流速が続く（例えば、２５～３３分から）。
一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣはタンパク質溶出（例えば、０～１０分および／または２４～３３分）を無駄にせずに液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の流れの一部（複数可）を転換することによって実行され、それによってスクリーニングのためのより迅速な分析を提供し、ＭＳ供与源の汚染を回避する。
一部の実施形態では、ＳＥ－ＵＰＬＣは移動相で定組成溶離を使用して実行される。例えば、一部の実施形態では、移動相は３０：７０のアセトニトリル：水を含む溶液を含む。一部の実施形態では、移動相はギ酸（ＦＡ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む。理論に縛られることを望むことなく、ＴＦＡは液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離のために有益であるが、それはＭＳシグナルを抑制することができ、したがってＦＡおよびＴＦＡの混合物を含む移動相は、ＭＳ分析のために十分なシグナル対雑音比を維持しながら有効な液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離を可能にすることができると考えられる。一部の実施形態では、移動相は約０．０５％のギ酸および約０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む。
有利なことに、本明細書で提供される方法は、生成物の迅速分析を可能にし、それによってハイスループットスクリーニング（例えば、多数の潜在的生産者細胞株の）を可能にする。例えば、一部の実施形態では、検出は約３０分以下、約３３分以下、約３５分以下、約４０分以下、約４５分以下、または約６０分以下で達成される。
一部の実施形態では、本方法は、ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳの前に、生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）をプロテアーゼと接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、プロテアーゼは、例えば抗体フラグメントの分析ではＩｄｅＳまたはＩｄｅＺである。
一部の実施形態では、抗体または抗体派生体は２９３位にシステイン残基を含む（Ｃｙｓ２９３）。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、システイン化、Ｎ－アセチルシステイン化またはグルタチオン化された遊離システインの種（例えば、抗体または抗体派生体の別のシステインとジスルフィド結合していない）を含む。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体はＮ－グリコシル化されていない（例えば、抗体Ｆｃ領域で）。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体は、Ｎ－グリコシル化を低減または排除するＦｃ領域内の突然変異を含む。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体は、Ｎ３００Ａ突然変異（ＥＵインデックス）を含む。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体はＮ－グリコシル化されており（例えば、抗体Ｆｃ領域で）、本方法は（例えば、ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳの前に）抗体Ｎ－グリコシル化を除去することをさらに含む。一部の実施形態では、抗体Ｎ－グリコシル化を除去することは、抗体をペプチド：Ｎ－グリコシダーゼ酵素（例えば、ＰＮＧａｓｅ Ｆ）で処理することを含む。
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、化学改変されたシステイン残基を含む抗体または抗体派生体の種を表す。一部の実施形態では、ＭＳはシステイン化（１１９Ｄａの質量シフト）、Ｎ－アセチルシステイン化（１６１Ｄａの質量シフト）およびグルタチオン化（３０５Ｄａの質量シフト）の種の間の質量差を分解することが可能である。例えば、遊離システイン残基（例えば、抗体／抗体派生体の別のシステイン残基とジスルフィド結合していないシステイン）を含む抗体および抗体派生体、ならびに／または、そのＦｃ領域に組み入れられたさらなるシステイン残基を含む抗体および抗体派生体は、例えば、化合物（例えば、抗体薬コンジュゲートを形成するための細胞毒性薬）のコンジュゲーションのために有益である可能性がある。このさらなるシステインは対になってない（遊離）、すなわち、ｍＡｂ分子中の他のシステインとのジスルフィド結合にかかわっていない。以前の研究は、このさらなるシステイン（Ｃｙｓ２９３）が近くのシステイン残基と、「ジスルフィド結合スクランブリング」として別途知られている望ましくないジスルフィド結合を形成することができ、抗体の構造的不安定性に潜在的につながることを示していた。無制御のスルフヒドリル化学反応は、ＡＤＣを形成するプロセスの間にかなりの製造上のリスクももたらすことがあり、望ましくない薬物コンジュゲーションプロファイルにつながる。これらのリスクを回避するために、細胞培養条件を調整することによってシステイン化およびグルタチオン化などのジスルフィド結合改変でキャップされた遊離システインを有することが避けられない。これらの改変は、薬物コンジュゲーション工程の前に遊離システインを生成するように選択的に低減することができる。本明細書に記載される方法は、例えば、異なる重量バリアント種、例えば、システイン化およびグルタチオン化などのジスルフィド結合改変でキャップされたシステインのような化学改変システインを含む種を含む抗体または抗体派生体の生成を分析するのに使用することができる。
一部の実施形態では、抗体または抗体派生体はＮ－グリコシル化されており（例えば、抗体Ｆｃ領域で）、１つまたはそれ以上の重量バリアント種は抗体または抗体派生体のグリコ型を表す。一部の実施形態では、ＭＳは抗体または抗体派生体と抗体または抗体派生体のグリコ型を表す１つまたはそれ以上の重量バリアント種の間の約１６２Ｄａの質量差を分解することが可能である。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体は多重特異性抗体である。一部の実施形態では、抗体または抗体派生体はモノクローナル抗体である。
本開示の他の態様は、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質を生産するための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）をコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む細胞株を、細胞株による生成物の生成に好適な条件の下で培養すること；生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）を含む細胞培地を細胞株から分離すること；サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって細胞培地中の生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）の量を検出すること；ならびに細胞株によって産生される多重特異性結合タンパク質からの誤対合種の１つまたはそれ以上の少なくとも一部を除去することを含む。一部の実施形態では、本方法は、生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）をコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む細胞株を、細胞株による生成物の生成に好適な条件の下で培養すること；生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）を含む細胞培地を細胞株から分離すること；サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって細胞培地中の生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）の量を検出すること；ならびに、細胞株によって産生される多重特異性結合タンパク質の品質および純度の片方または両方を決定することを含む。一部の実施形態では、本方法は、生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）をコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む細胞株を、細胞株による生成物の生成に好適な条件の下で培養すること；生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）を含む細胞培地を細胞株から分離すること；サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって細胞培地中の生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）の量を検出すること；ならびに細胞株によって産生される多重特異性結合タンパク質の品質および純度の片方または両方を決定すること、および細胞株によって産生される多重特異性結合タンパク質からの誤対合種の１つまたはそれ以上の少なくとも一部を除去することを含む。本明細書に記載される例示的な生成物のいずれも、これらのおよび他の方法で有用である。
本開示の他の態様は、生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）の生成のために複数の細胞株をスクリーニングするための方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、第１の細胞株によって生成される（例えば、本明細書に記載される方法のいずれかを使用して）生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）の量を検出すること、ならびに例えば、第１の細胞株と異なる第２の細胞株によって生成される（例えば、本明細書に記載される方法のいずれかを使用して）生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）の量を検出することを含む。本明細書に記載される例示的な生成物のいずれも、これらのおよび他の方法で有用である。
一部の実施形態では、本方法は、第１の細胞株によって生成される生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）の量を、第２の細胞株によって生成される生成物（例えば、抗体、抗体フラグメント、Ｆｃ融合タンパク質または多重特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種）の量を比較すること；およびこの比較に基づいて、生成物のより多い量を生成した細胞株を選択することをさらに含む。一部の実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上または５０個以上の異なる細胞株がスクリーニングされる。有利なことに、本明細書に記載される方法は迅速であり、ハイスループットスクリーニングに適合する。
一部の実施形態では、本方法は、第１の細胞株によって生成される１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出すること、および第２の細胞株によって生成される１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、例えば、第１および第２の細胞株によって生成される１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出した後に、第１の細胞株によって生成された１つまたはそれ以上の誤対合種の量を、第２の細胞株によって生成された１つまたはそれ以上の誤対合種の量と比較することをさらに含む。一部の実施形態では、この比較に基づいて、１つまたはそれ以上の誤対合種に対する多重特異性結合タンパク質のより高い比をもたらした細胞株を選択する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の個々の誤対合種の量に対する多重特異性結合タンパク質のより高い比に基づいて、および／または誤対合種の全体量に対する多重特異性結合タンパク質のより高い比に基づいて細胞株が選択される。
一部の実施形態では、選択される細胞株は産生細胞株として選択される。
多重特異性結合タンパク質
本開示のある特定の態様は、多重特異性結合タンパク質に関する。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、少なくとも第１のポリペプチド鎖および第１のポリペプチド鎖と異なる第２のポリペプチド鎖を含む２本以上のポリペプチド鎖の会合を含む。例えば、一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は二重特異性抗体または二重特異性Ｆｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は三重特異性抗体または三重特異性Ｆｃ融合タンパク質である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の誤対合種は、多重特異性結合タンパク質のそれ以外の会合した第１および第２のポリペプチド鎖の少なくとも１本を含む２本以上のポリペプチド鎖を含む。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、第１の抗体重鎖、第１の抗体軽鎖、第１の抗体重鎖と異なる第２の抗体重鎖、および第１の抗体軽鎖と異なる第２の抗体軽鎖を含む多重特異性抗体である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の誤対合種は以下の１つまたはそれ以上を含む：第１の抗体重鎖の２本を含む多重特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；第２の抗体重鎖の２本を含む多重特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；第１の抗体軽鎖の２本を含む多重特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；および第２の抗体軽鎖の２本を含む多重特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の標的タンパク質に特異的に結合する３つの抗原結合性部位を形成する４本のポリペプチド鎖を含み、結合タンパク質を形成する第１の対のポリペプチドは交差配向を有する二重可変ドメインを有し、結合タンパク質を形成する第２の対のポリペプチドは単一の可変ドメインを有する。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、１、２、３またはそれより多くの抗原結合性ドメインまたは他のポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）に融合した１つまたは２つのＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、例えばＷＯ２０１２０６１５５８に記載される二重可変ドメイン（ＤＶＤ）免疫グロブリンである。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、例えばＷＯ２０１２１３５３４５に記載される交差配向を有する二重可変ドメインを含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、４つの抗原結合性部位を形成する４本のポリペプチド鎖を含み、ここで２本のポリペプチド鎖は以下の式によって表される構造を有し：
ＶＬ１－Ｌ１－ＶＬ２－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
２本のポリペプチド鎖は以下の式によって表される構造を有し：
ＶＨ２－Ｌ３－ＶＨ１－Ｌ４－ＣＨ１－Ｆｃ［ＩＩ］
式中：
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
Ｆｃは免疫グロブリンヒンジ領域およびＣＨ２、ＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成する。
一部の実施形態では、３つの抗原結合性部位の各々は異なる標的（例えば、ポリペプチド抗原）に結合する。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、３つの抗原結合性部位を形成する４本のポリペプチド鎖を含み、ここで第１のポリペプチド鎖は以下の式によって表される構造を含み：
ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ［Ｉ］
第２のポリペプチド鎖は以下の式によって表される構造を含み：
ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩ］
第３のポリペプチド鎖は以下の式によって表される構造を含み：
ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３［ＩＩＩ］
第４のポリペプチド鎖は以下の式によって表される構造を含み：
ＶＬ３－ＣＬ［ＩＶ］
式中：
ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジはＣＨ１およびＣＨ２ドメインを連結する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成する。
一部の実施形態では、式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１は第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は第３の抗原結合部位を形成する。
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の誤対合種は以下の１つまたはそれ以上を含む：式Ｉによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；式ＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；式ＩＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；および式ＩＶによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合。
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は三重特異性および／または三価である。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は二重特異性および／または二価である。
本明細書に記載される抗原結合性部位のいずれも本開示の三重特異性結合タンパク質で有用であると考えられ、例えば、上記の構造を有する４本のポリペプチド鎖を含む。例えば、一部の実施形態では、本開示の三重特異性結合タンパク質は第１の抗原結合性部位を形成するＶＨ１およびＶＬ１ドメイン対、第２の抗原結合性部位を形成するＶＨ２およびＶＬ２ドメイン対および第３の抗原結合性部位を形成するＶＨ３およびＶＬ３ドメイン対を含む。一部の実施形態では、本開示の三重特異性結合タンパク質は第１の抗原結合性部位を形成するＶＨ１およびＶＬ１ドメイン対、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合性部位を形成するＶＨ２およびＶＬ２ドメイン対および第３の抗原結合性部位を形成するＶＨ３およびＶＬ３ドメイン対を含む。一部の実施形態では、本開示の三重特異性結合タンパク質は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合性部位を形成するＶＨ１およびＶＬ１ドメイン対、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合性部位を形成するＶＨ２およびＶＬ２ドメイン対および第３の抗原結合性部位を形成するＶＨ３およびＶＬ３ドメイン対を含む。一部の実施形態では、本開示の三重特異性結合タンパク質は第１の抗原結合性部位を形成するＶＨ１およびＶＬ１ドメイン対、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合性部位を形成するＶＨ２およびＶＬ２ドメイン対および腫瘍標的タンパク質に結合する第３の抗原結合性部位を形成するＶＨ３およびＶＬ３ドメイン対を含む。一部の実施形態では、本開示の三重特異性結合タンパク質は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合性部位を形成するＶＨ１およびＶＬ１ドメイン対、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合性部位を形成するＶＨ２およびＶＬ２ドメイン対、およびＨＩＶ標的タンパク質に結合する第３の抗原結合性部位を形成するＶＨ３およびＶＬ３ドメイン対を含む。一部の実施形態では、本開示の三重特異性結合タンパク質は、ＨＩＶ標的タンパク質に結合する第１の抗原結合性部位を形成するＶＨ１およびＶＬ１ドメイン対、ＨＩＶ標的タンパク質に結合する第２の抗原結合性部位を形成するＶＨ２およびＶＬ２ドメイン対、およびＨＩＶ標的タンパク質に結合する第３の抗原結合性部位を形成するＶＨ３およびＶＬ３ドメイン対を含む。一部の実施形態では、本開示の三重特異性結合タンパク質は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合性部位を形成するＶＨ１およびＶＬ１ドメイン対、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合性部位を形成するＶＨ２およびＶＬ２ドメイン対、および腫瘍標的タンパク質に結合する第３の抗原結合性部位を形成するＶＨ３およびＶＬ３ドメイン対を含む。一部の実施形態では、本開示の三重特異性結合タンパク質は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合性部位を形成するＶＨ１およびＶＬ１ドメイン対、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合性部位を形成するＶＨ２およびＶＬ２ドメイン対、およびＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合性部位を形成するＶＨ３およびＶＬ３ドメイン対を含む。一部の実施形態では、本開示の三重特異性結合タンパク質は、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合性部位を形成するＶＨ１およびＶＬ１ドメイン対、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合性部位を形成するＶＨ２およびＶＬ２ドメイン対、およびＨＥＲ２ポリペプチドに結合する第３の抗原結合性部位を形成するＶＨ３およびＶＬ３ドメイン対を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、１つまたはそれ以上の腫瘍標的タンパク質および１つまたはそれ以上のＴ細胞標的タンパク質に結合する。一部の実施形態では、結合タンパク質は、１つの腫瘍標的タンパク質および単一のＴ細胞標的タンパク質の上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することが可能である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、１つの腫瘍標的タンパク質および２つの異なるＴ細胞標的タンパク質（例えば、ＣＤ２８およびＣＤ３）に特異的に結合することが可能である。一部の実施形態では、結合タンパク質の第１および第２のポリペプチド鎖は、２つのＴ細胞標的タンパク質を特異的に標的にする２つの抗原結合性部位を形成し、結合タンパク質の第３および第４のポリペプチド鎖は、腫瘍標的タンパク質に特異的に結合する抗原結合性部位を形成する。一部の実施形態では、標的タンパク質はＣＤ３８またはＨＥＲ２である。さらなる腫瘍標的タンパク質が下に提供される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＴ細胞標的タンパク質は、ＣＤ３およびＣＤ２８の１つまたはそれ以上である。
本開示の方法で使用することができる例示的な多重特異性結合タンパク質には、国際公開番号ＷＯ２０１７０７４８７８、ＷＯ２０１７１８０９１３、ＷＯ２０１８１５１８４１およびＷＯ２０１９０７４９７３に記載されるものも限定されずに含まれる。
一部の実施形態では、結合タンパク質は三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する抗原結合性部位、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する抗原結合性部位およびＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、３つの抗原結合性部位を含む４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質であり、ここで、式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対（例えば、本明細書に記載されるような）を形成する。一部の実施形態では、上記の抗ＣＤ３８抗原結合性部位のいずれかのＶＨおよびＶＬドメインはＶＨ３およびＶＬ３を表し、ＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合性部位を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１はＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２はＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３はＣＤ３８ポリペプチドに結合する第３の抗原結合性部位を形成する。
一部の実施形態では、ＨＥＲ２ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、単一特異性および／もしくは一価、二重特異性および／もしくは二価、三重特異性および／もしくは三価、または多重特異性および／もしくは多価である。一部の実施形態では、ＨＥＲ２ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、上記の３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質であり、ここで、ＶＨ３およびＶＬ３ドメイン対はＨＥＲ２ポリペプチドに結合する第３の抗原結合性部位を形成する。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、腫瘍標的タンパク質に結合する抗原結合性部位を含む。一部の実施形態では、腫瘍標的タンパク質はＣＤ３８ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ３８ポリペプチド）である。一部の実施形態では、腫瘍標的タンパク質はＨＥＲ２ポリペプチド（例えば、ヒトＨＥＲ２ポリペプチド）である。一部の実施形態では、本開示の腫瘍標的タンパク質には、限定されずに、Ａ２ＡＲ、ＡＰＲＩＬ、ＡＴＰＤａｓｅ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦＲ、ＢＣＭＡ、ＢｌｙＳ、ＢＴＫ、ＢＴＬＡ、Ｂ７ＤＣ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ４（別名ＶＴＣＮ１）、Ｂ７Ｈ５、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７－４、Ｃ３、Ｃ５、ＣＣＬ２（別名ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（別名ＭＩＰ－１ａ）、ＣＣＬ４（別名ＭＩＰ－１ｂ）、ＣＣＬ５（別名ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（別名ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（別名ｍｃｐ－２）、ＣＣＬ１１（別名エオタキシン）、ＣＣＬ１５（別名ＭＩＰ－１ｄ）、ＣＣＬ１７（別名ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（別名ＭＩＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２０（別名ＭＩＰ－３ａ）、ＣＣＬ２１（別名ＭＩＰ－２）、ＣＣＬ２４（別名ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（別名ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（別名エオタキシン－３）、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３（別名ＦＣＥＲ２、ＩｇＥの受容体）、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０（別名Ｂ７－１）、ＣＤ８６（別名Ｂ７－２）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７（別名４１ＢＢ）、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１５２（別名ＣＴＬＡ４）、ＣＤ１５４（別名ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３（別名ＰＤＬ２）、ＣＤ２７４（別名ＰＤＬ１）、ＣＤ２７５（別名Ｂ７Ｈ２）、ＣＤ２７６（別名Ｂ７Ｈ３）、ＣＤ２７８（別名ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（別名ＰＤ－１）、ＣＤＨ１（別名Ｅ－カドヘリン）、キチナーゼ、ＣＬＥＣ９、ＣＬＥＣ９１、ＣＲＴＨ２、ＣＳＦ－１（別名Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ－２（別名ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ－３（別名ＧＣＳＦ）、ＣＸ３ＣＬ１（別名ＳＣＹＤ１）、ＣＸＣＬ１２（別名ＳＤＦ１）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ３、ＤＮＧＲ－１、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＴＰＤ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ１、ＦＬＡＰ、ＦＯＬＨ１、Ｇｉ２４、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｈｅｒ２、ＨＨＬＡ２、ＨＭＧＢ１、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳＬＧ、ＩＤＯ、ＩＦＮα、ＩｇＥ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ１、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｆ１０、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ５、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０、ｒｈＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒａ１、ＩＬ１３Ｒａ２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｒｂ（ＩＬ２５の受容体としても知られる）、ＩＬ１８、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２７、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＴＧＢ４（別名ｂ４インテグリン）、ＩＴＫ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＬＡＭＰ１、レプチン、ＬＰＦＳ２、ＭＨＣクラスＩＩ、ＭＵＣ－１、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＴＰＤａｓｅ－１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＰＤ－１Ｈ、血小板受容体、ＰＲＯＭ１、Ｓ１５２、ＳＩＳＰ１、ＳＬＣ、ＳＰＧ６４、ＳＴ２（ＩＬ３３の受容体としても知られる）、ＳＴＥＡＰ２、Ｓｙｋキナーゼ、ＴＡＣＩ、ＴＤＯ、Ｔ１４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９、ＴＭＥＦ１、ＴＮＦａ、ＴＮＦＲＳＦ７、Ｔｐ５５、ＴＲＥＭ１、ＴＳＬＰ（ＩＬ７Ｒａの補助受容体としても知られる）、ＴＳＬＰＲ、ＴＷＥＡＫ、ＶＥＧＦ、ＶＩＳＴＡ、Ｖｓｔｍ３、ＷＵＣＡＭおよびＸＣＲ１（別名ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）が含まれる。一部の実施形態では、上の抗原標的の１つまたはそれ以上はヒト抗原標的である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質はＨＩＶ標的タンパク質に結合する抗原結合性部位を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ＨＩＶ標的タンパク質に各々結合する３つの抗原結合性部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＨＩＶ標的タンパク質（例えば、下に記載されるような）およびＴ細胞受容体複合体を含むＴ細胞の上の１つまたはそれ以上の標的タンパク質に特異的に結合する。Ｔ細胞の上の標的タンパク質の例には、限定されずにＣＤ３およびＣＤ２８が中でも含まれる。一部の実施形態では、ＨＩＶ標的タンパク質は、糖タンパク質１２０、糖タンパク質４１または糖タンパク質１６０である。一部の実施形態では、結合タンパク質は以下の１つまたはそれ以上に結合する：糖タンパク質１２０、糖タンパク質４１および糖タンパク質１６０。例示的なＨＩＶ標的タンパク質には、限定されずに、ＨＩＶ－１ｇｐ ４１タンパク質のＭＰＥＲ、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０タンパク質のＣＤ４結合部位、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０タンパク質のＶ３ループ中のグリカン、またはＨＩＶ－１ ｇｐ１２０タンパク質またはｇｐ１６０の三量体アペックスが含まれる。例えば、一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０タンパク質のＣＤ４結合部位に結合する抗原結合性部位を含む。本明細書での使用が企図されるＨＩＶ標的タンパク質に結合する例示的な抗原結合性部位には、限定されずに、国際公開番号ＷＯ２０１７／０７４８７８に記載されるもの、例えば、抗体ＣＤ４ＢＳ「ａ」、ＣＤ４ＢＳ「ｂ」、ＭＰＥＲ、ＭＰＥＲ＿１００Ｗ、Ｖ１／Ｖ２「ａ」、Ｖ１／Ｖ２「ｂ」またはＶ３からのものが含まれる。
一部の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、単一特異性および／もしくは一価、二重特異性および／もしくは二価、三重特異性および／もしくは三価、または多重特異性および／もしくは多価である。一部の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、その１つはＣＤ２８ポリペプチドに結合し、その１つはＣＤ３ポリペプチドに結合する３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、その１つはＣＤ２８ポリペプチドに結合し、その１つはＣＤ３ポリペプチドに結合し、その１つはＣＤ３８ポリペプチドに結合する３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、その１つはＣＤ２８ポリペプチドに結合し、その１つはＣＤ３ポリペプチドに結合し、その１つはＨＥＲ２ポリペプチドに結合する３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、その１つはＣＤ２８ポリペプチドに結合し、その１つはＣＤ３ポリペプチドに結合し、その１つは腫瘍標的タンパク質に結合する３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質である。
上の実施形態のいずれかの一部の実施形態では、結合タンパク質は三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、腫瘍標的タンパク質（ＣＤ３８またはＨＥＲ２を限定されずに含む）に結合する抗原結合性部位、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する抗原結合性部位およびＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は３つの抗原結合性部位を含む４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質であり、ここで、式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対（例えば、本明細書に記載されるような）を形成する。一部の実施形態では、上記の抗ＣＤ２８抗原結合性部位のいずれかのＶＨおよびＶＬドメインはＶＨ１およびＶＬ１を表し、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合性部位を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１はＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２はＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は腫瘍標的タンパク質（ＣＤ３８またはＨＥＲ２を限定されずに含む）に結合する第３の抗原結合性部位を形成する。
一部の実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、単一特異性および／もしくは一価、二重特異性および／もしくは二価、三重特異性および／もしくは三価、または多重特異性および／もしくは多価である。一部の実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、その１つはＣＤ２８ポリペプチドに結合し、その１つはＣＤ３ポリペプチドに結合する３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、その１つはＣＤ２８ポリペプチドに結合し、その１つはＣＤ３ポリペプチドに結合し、その１つはＣＤ３８ポリペプチドに結合する３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、その１つはＣＤ２８ポリペプチドに結合し、その１つはＣＤ３ポリペプチドに結合し、その１つはＨＥＲ２ポリペプチドに結合する３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、ＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む結合タンパク質は、その１つはＣＤ２８ポリペプチドに結合し、その１つはＣＤ３ポリペプチドに結合し、その１つは腫瘍標的タンパク質に結合する３つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質である。
一部の実施形態では、結合タンパク質は三重特異性結合タンパク質である。一部の実施形態では、三重特異性結合タンパク質は、腫瘍標的タンパク質（ＣＤ３８またはＨＥＲ２を限定されずに含む）に結合する抗原結合性部位、ＣＤ２８ポリペプチドに結合する抗原結合性部位およびＣＤ３ポリペプチドに結合する抗原結合性部位を含む。一部の実施形態では、結合タンパク質は３つの抗原結合性部位を含む４つのポリペプチドを含む三重特異性結合タンパク質であり、ここで、式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖－重鎖対（例えば、本明細書に記載されるような）を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ２およびＶＬ２は、ＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合性部位を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１およびＶＬ１はＣＤ２８ポリペプチドに結合する第１の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２はＣＤ３ポリペプチドに結合する第２の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は腫瘍標的タンパク質（ＣＤ３８またはＨＥＲ２を限定されずに含む）に結合する第３の抗原結合性部位を形成する。
リンカー
一部の実施形態では、リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は無アミノ酸（長さ＝０）から約１００アミノ酸の長さ、または１００未満、５０、４０、３０、２０もしくは１５アミノ酸以下である。リンカーは、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸の長さであってもよい。１つの結合タンパク質中のＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は同じアミノ酸配列を全て有することができるか、または異なるアミノ酸配列を全て有することができる。
好適なリンカーの例には、例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号３）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号４）、ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５）およびＤＫＴＨＴ（配列番号６）、ならびに国際公開番号ＷＯ２０１７／０７４８７８およびＷＯ２０１７／１８０９１３に開示されるものが含まれる。上に掲載される例は、本開示の範囲を全く限定するものでなく、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシンおよびプロリンからなる群から選択されるランダムに選択されたアミノ酸を含むリンカーが、結合タンパク質で好適であることが示された。
リンカー中のアミノ酸残基の同一性および配列は、リンカー中で達成するのに必要な二次構造エレメントのタイプによって異なることができる。例えば、グリシン、セリンおよびアラニンが最大の柔軟性を有するリンカーのために最良である。より強固で伸長したリンカーが必要である場合、グリシン、プロリン、トレオニンおよびセリンの一部の組合せが有益である。所望の特性によって必要に応じてより大きなペプチドリンカーを構築するために、任意のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基と組み合わせたリンカーとしてみなすことができる。
一部の実施形態では、Ｌ１の長さはＬ３の長さの少なくとも２倍である。一部の実施形態では、Ｌ２の長さはＬ４の長さの少なくとも２倍である。一部の実施形態では、Ｌ１の長さはＬ３の長さの少なくとも２倍であり、Ｌ２の長さはＬ４の長さの少なくとも２倍である。一部の実施形態では、Ｌ１は長さが３～１２アミノ酸残基であり、Ｌ２は長さが３～１４アミノ酸残基であり、Ｌ３は長さが１～８アミノ酸残基であり、Ｌ４は長さが１～３アミノ酸残基である。一部の実施形態では、Ｌ１は長さが５～１０アミノ酸残基であり、Ｌ２は長さが５～８アミノ酸残基であり、Ｌ３は長さが１～５アミノ酸残基であり、Ｌ４は長さが１～２アミノ酸残基である。一部の実施形態では、Ｌ１は長さが７アミノ酸残基であり、Ｌ２は長さが５アミノ酸残基であり、Ｌ３は長さが１アミノ酸残基であり、Ｌ４は長さが２アミノ酸残基である。
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は長さが各々独立してゼロアミノ酸であるか、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号３）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号４）およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５）からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は各々独立してＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）、Ｓ、ＲＴ、ＴＫＧＰＳ（配列番号３）、ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号４）およびＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号５）からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｌ１は配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号４）を含み、Ｌ２は配列ＴＫＧＰＳ（配列番号３）を含み、Ｌ３は配列Ｓを含み、Ｌ４は配列ＲＴを含む。
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４の少なくとも１つは、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号６）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は配列ＤＫＴＨＴ（配列番号６）を含む。
Ｆｃ領域および定常ドメイン
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ＣＨ１に連結したＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ＣＨ１に連結したＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、ＣＨ１に連結したＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖、ならびにＣＨ１に連結したＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、Ｆｃ領域を含む完全長抗体重鎖またはポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は抗体ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３および場合によりＣＨ４ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は下に記載される突然変異の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、表４に示される結合タンパク質の重鎖ポリペプチド（例えば、ポリペプチド２または３）の１つのＦｃ領域である。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、表４に示される結合タンパク質の重鎖ポリペプチド（例えば、ポリペプチド２または３）の１つの定常領域である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、表４に示される結合タンパク質の軽鎖ポリペプチド（例えば、ポリペプチド１または４）の１つの定常領域である。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は１つまたは２つのＦｃバリアントを含む。本明細書で使用される用語「Ｆｃバリアント」は、天然のＦｃから改変されているが、サルベージ受容体ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）のための結合部位をなお含む分子または配列を指す。例示的なＦｃバリアントおよびサルベージ受容体とのそれらの相互作用は、当技術分野で公知である。したがって、用語「Ｆｃバリアント」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化されている分子または配列を含むことができる。さらに、天然Ｆｃは、それらが本発明の抗体様結合タンパク質に必要とされない構造的な機能または生物活性を提供するので除去されてもよい領域を含む。したがって、用語「Ｆｃバリアント」は、１つまたはそれ以上の天然Ｆｃ部位もしくは残基を欠いているか、または：（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞での発現によるＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすかもしくはそれに関与している１つまたはそれ以上のＦｃ部位もしくは残基が改変されている分子または配列を含む。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質（例えば、三重特異性結合タンパク質）は、第２のポリペプチド鎖の上に「ノブ」突然変異を、および第３のポリペプチド鎖の上に「ホール」突然変異を含む。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、第３のポリペプチド鎖の上に「ノブ」突然変異を、および第２のポリペプチド鎖の上に「ホール」突然変異を含む。一部の実施形態では、「ノブ」突然変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３５４および／または３６６に対応する位置に置換（複数可）を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ、またはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｙである。一部の実施形態では、「ノブ」突然変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３５４および３６６に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。一部の実施形態では、「ホール」突然変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置４０７、ならびに場合により３４９、３６６および／または３６８に対応する位置に置換（複数可）を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＹ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔ、ならびに場合によりＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓおよび／またはＬ３６８Ａである。一部の実施形態では、「ホール」突然変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３４９、３６６、３６８および４０７に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３６６および場合により３５４に対応する位置にアミノ酸置換（複数可）を含み、ここでアミノ酸置換はＴ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙおよび場合によりＳ３５４Ｃであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置４０７、ならびに場合により３４９、３６６および／または３６８に対応する位置にアミノ酸置換（複数可）を含み、ここで、アミノ酸置換はＹ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔ、ならびに場合によりＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓおよび／またはＬ３６８Ａである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置４０７、ならびに場合により３４９、３６６および／または３６８に対応する位置にアミノ酸置換（複数可）を含み、ここで、アミノ酸置換はＹ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔ、ならびに場合によりＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓおよび／またはＬ３６８Ａであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３６６および場合により３５４に対応する位置にアミノ酸置換（複数可）を含み、ここで、アミノ酸置換はＴ３６６ＷまたはＴ３６６Ｙおよび場合によりＳ３５４Ｃである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３６６に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３６６、３６８および／または４０７に対応する位置にアミノ酸置換（複数可）を含み、ここで、アミノ酸置換はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３６６、３６８および／または４０７に対応する位置にアミノ酸置換（複数可）を含み、ここで、アミノ酸置換はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３６６に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＴ３６６Ｗである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３５４および３６６に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３４９、３６６、３６８および４０７に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３４９、３６６、３６８および４０７に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の位置３５４および３６６に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域はヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８、３５４、３６６および４０９に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＳ２２８Ｐ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６ＷおよびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８、３４９、３６６、３６８、４０７および４０９に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＳ２２８Ｐ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８、３４９、３６６、３６８、４０７および４０９に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＳ２２８Ｐ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８、３５４、３６６および４０９に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＳ２２８Ｐ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６ＷおよびＲ４０９Ｋである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２３４、２３５、３５４および３６６に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＦ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２３４、２３５、３４９、３６６、３６８および４０７に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＦ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２３４、２３５、３４９、３６６、３６８および４０７に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＦ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２３４、２３５、３５４および３６６に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＦ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、エフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体媒介抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を低減するために１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第１のＦｃ領域をさらに含み；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のＦｃ領域をさらに含み；第１および第２のＦｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり；第１および第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１の位置２３４および２３５に対応する位置にアミノ酸置換を各々含み、ここで、アミノ酸置換はＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＦｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、これらのＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１の位置２３４および２３５に対応する位置にアミノ酸置換を各々含み、ここで、アミノ酸置換はＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第１のＦｃ領域をさらに含み；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のＦｃ領域をさらに含み；第１および第２のＦｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり；第１および第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５および３２９に対応する位置にアミノ酸置換を各々含み、ここで、アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＦｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、これらのＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５および３２９に対応する位置にアミノ酸置換を各々含み、ここで、アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＦｃ領域はヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、これらのＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２３４および２３５に対応する位置にアミノ酸置換を各々含み、ここで、アミノ酸置換はＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖、ならびにＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖；を含み、ここで、第１および第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２３４および２３５に対応する位置にアミノ酸置換を各々含み、アミノ酸置換はＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８、２３４、２３５、３５４、３６６および４０９に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６ＷおよびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８、２３４、２３５、３４９、３６６、３６８、４０７および４０９に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域をさらに含み、第１のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第１のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８、２３４、２３５、３４９、３６６、３６８、４０７および４０９に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＲ４０９Ｋであり；第３のポリペプチド鎖はＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域をさらに含み、第２のＦｃ領域は免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８、２３４、２３５、３５４、３６６および４０９に対応する位置にアミノ酸置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６ＷおよびＲ４０９Ｋである。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＩおよび／またはＦｃγＩＩ結合を低減または排除する１つまたはそれ以上の突然変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＩおよび／またはＦｃγＩＩ結合を低減または排除するがＦｃＲｎ結合に影響しない１つまたはそれ以上の突然変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８および／または４０９に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＳ２２８Ｐおよび／またはＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２３４および／または２３５に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＦ２３４Ａおよび／またはＬ２３５Ａである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８、２３４、２３５および／または４０９に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａおよび／またはＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２３３～２３６に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＥ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａであり、および２３６位の欠失である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８、２３３～２３６および／または４０９に対応する置換のアミノ酸突然変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸突然変異は、Ｓ２２８Ｐ；Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａであり、および２３６位の欠失；および／またはＲ４０９Ｋである。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体結合および／またはＦｃ領域のエフェクター機能（例えば、Ｆｃ受容体媒介抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ））を低減または排除する１つまたはそれ以上の突然変異を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５および／または３２９に対応する位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａおよび／またはＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１の位置２９８、２９９および／または３００に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＳ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａおよび／またはＹ３００Ｓである。
一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、例えばＩｇＧ４のヒンジ領域および／または二量体界面の安定性を向上させる１つまたはそれ以上の突然変異を含む（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ、Ｃ．ら（２０１３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８号：２６５８３～２６５９３頁を参照する）。一部の実施形態では、突然変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８および４０９に対応する位置に置換を含み、ここで、アミノ酸置換はＳ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、結合タンパク質は、ＣＨ１に連結した第１のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第１のＦｃ領域をさらに含む第２のポリペプチド鎖、ならびに、ＣＨ１に連結した第２のＦｃ領域であって、免疫グロブリンヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む第２のＦｃ領域をさらに含む第３のポリペプチド鎖を含み；ここで、第１および第２のＦｃ領域はヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり；第１および第２のＦｃ領域はＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ４の位置２２８および４０９に対応する位置にアミノ酸置換を各々含み、ここで、アミノ酸置換はＳ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋである。一部の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、安定性を向上させるためにノブおよびホール突然変異ならびに１つまたはそれ以上の突然変異を含む。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域はヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５および／または３２９に対応する位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａおよび／またはＰ３２９Ａである。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１の位置２９８、２９９および／または３００に対応する位置にアミノ酸置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、アミノ酸置換はＳ２９８Ｎ、Ｔ２９９Ａおよび／またはＹ３００Ｓである。
核酸およびベクター
結合タンパク質を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築するために、これらのポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込むために、およびそのようなベクターを宿主細胞に導入するために、標準の組換えＤＮＡ方法が使用される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第３版）を参照する。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般的に達成されるように製造業者の仕様書によって、または本明細書に記載されるように実行することができる。具体的な定義が提供されない限り、本明細書に記載される分析化学、有機合成化学ならびに医薬および製薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその検査法および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。同様に、化学合成、化学分析、医薬製造、製剤、送達および患者の処置のために、従来の技術を使用することができる。
一部の実施形態では、単離された核酸は、結合タンパク質をコードする核酸配列の転写を導くために、異種プロモーターに作動可能に連結される。プロモーターは、核酸の転写を導く核酸制御配列を指すことができる。第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、第１のヌクレオチド配列は第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、そのプロモーターがそのコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは結合タンパク質のコード配列に作動可能に連結されている。プロモーターの例には、限定されずに、ウイルス（ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など）のゲノムから得られるプロモーター、異種の真核生物プロモーター（アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなど）、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ １０８（２）：１９３～９頁、１９９１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、テトラサイクリンで誘導可能なプロモーター（Ｍａｓｕｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３３：ｅ４３、２００５）、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージラムダの主オペレーターおよびプロモーター領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母アルファ－交配因子のプロモーターを含めることができる。本開示の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター、または本明細書に記載される任意の他の好適なプロモーターまたは当業者によって容易に認識される他の好適なプロモーターの支配下にあってよい。
一部の実施形態では、単離された核酸はベクターに組み込まれる。一部の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、発現されるポリヌクレオチドに作動可能に連結される１つまたはそれ以上の調節配列を含むことができる。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。好適なエンハンサーの例は、限定されずに、哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、インスリンなど）からのエンハンサー配列、および真核生物細胞ウイルスからのエンハンサー配列（例えば、複製起源の後期の側（ｂｐ１００～２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起源の後期の側のポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーなど）を含むことができる。好適なベクターの例は、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、トランスポゾンおよびウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、はしか、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター等）を含むことができる。発現ベクターは、宿主細胞、例えば細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞をトランスフェクトさせるために使用することができる。宿主で発現および複製が可能な生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは当技術分野で公知であり、目的の任意の細胞をトランスフェクトさせるために使用することができる。
宿主細胞
本開示の他の態様は、本明細書に記載される１つまたはそれ以上の単離されたポリヌクレオチド、ベクターおよび／またはベクター系を含む宿主細胞（例えば、単離された宿主細胞）に関する。例えば、宿主細胞または細胞株は、本開示の生成物を生成するために使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の単離された宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。一部の実施形態では、宿主細胞は細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は酵母細胞（例えば、酵母（S. cerevisiae）細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は昆虫細胞である。昆虫宿主細胞の例は、例えば、ショウジョウバエ属（Drosophila）の細胞（例えば、Ｓ２細胞）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）細胞（例えば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞）、およびスポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞（例えば、Ｓｆ２１またはＳｆ９細胞）を含むことができる。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物の宿主細胞の例は、例えば、ヒト胚性腎臓細胞（例えば、懸濁培養での増殖のためにサブクローニングした２９３または２９３細胞）、Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（例えば、ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝癌系（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）および骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０およびＳｐ２／０細胞）を含むことができる。
一部の実施形態では、本開示の宿主細胞または細胞株は、連続細胞培養で、例えば撹拌タンクバイオリアクターで培養される。一部の実施形態では、本開示の宿主細胞または細胞株はバッチ細胞培養で培養される。好適な撹拌タンクおよびバッチ細胞培養装置および技術は、当技術分野で公知である；例示的で非限定的な記載は、下の実施例で提供される。本明細書に記載される（例えば、上記の）宿主細胞または細胞株を使用した本明細書に記載される生成物のいずれかの生産に好適な例示的な条件および技術は、当技術分野で公知である。
本開示の他の態様は、本明細書に記載される結合タンパク質のいずれかの生産方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、ａ）単離された核酸、ベクターおよび／またはベクター系（例えば、本明細書に記載される単離された核酸、ベクターおよび／またはベクター系のいずれか）を含む宿主細胞（例えば、本明細書に記載される宿主細胞のいずれか）を、宿主細胞が結合タンパク質を発現するような条件の下で培養すること；およびｂ）結合タンパク質を宿主細胞から単離することを含む。タンパク質を発現する条件の下で宿主細胞を培養する方法は当業者に周知である。例えば、親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを含む２段階親和性クロマトグラフィーと続くサイズ排除クロマトグラフィー）によるものを含む、培養された宿主細胞からタンパク質を単離する方法は当業者に周知である。
以下の実施例は、本開示およびその様々な使用の具体的な実施形態を例示する。それらは説明だけが目的で示され、本発明の範囲を限定するものと決してみなすべきではない。
非対称の三重特異性結合タンパク質のための鎖誤対合の特定およびクローン変形形態
非対称構築物によるＩｇＧ様多重特異性抗体は、近年治療適用のための広く使用されるフォーマットになっている。このクラスの治療薬におけるサブユニットの正しいアセンブリは、生物活性に直接的な影響を及ぼす決定的品質属性（ＣＱＡ）である。したがって、タイムリーな意思決定およびリスク軽減を可能にするために、潜在的鎖誤対合に関する情報によって早期開発努力（例えば、クローン選択）が導かれなければならない。
誤対合した抗体は予想される生物活性の最適以下のレベルを有する可能性があり、生成物関連の不純物とみなされる。そのようなｍＡｂ関連の不純物の除去は、プロテインＡ（ＰｒｏＡ）カラムの後にさらなる精製工程を必要とし、プロセス開発の費用およびタイムラインを増加させる。したがって、いかなる潜在的鎖誤対合も、細胞株の開発から開始される初期開発の間に特定され、モニタリングされなければならない。このことは、多数の試料を速いターンアラウンド時間でミス誤対合レベルについてスクリーニングすることを可能にする、ハイスループット分析プラットホームを要求する。
二重特異性ＩｇＧにおける誤対合種の同定および相対定量化のために、インタクトタンパク質質量分析を使用した。変性および天然ＭＳ分析のための逆相分離またはサイズ排除液体クロマトグラフィーに基づくいくつかの異なるインタクトタンパク質ＭＳアプローチが報告されている（Ｗａｎｇ、Ｃ．らＭＡｂｓ ２０１８、１０（８）、１２２６～１２３５頁；Ｓｃｈａｅｆｅｒ、Ｗ．らＭＡｂｓ ２０１６、８（１）、４９～５５頁；Ｓｃｈａｃｈｎｅｒ、Ｌ．らＡｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１６、８８（２４）、１２１２２～１２１２７頁；Ｙｉｎ、Ｙ．らＭＡｂｓ ２０１６、８（８）、１４６７～１４７６頁）。これらのアプローチは、ＬＣ－ＭＳ分析の前に一般的にプロテインＡ親和性を通して抗体が精製されることを必要とする。
以下の実施例は、図１Ａに示される三重特異性結合タンパク質などのｍＡｂ種のインタクトＭＳ分析のためのＱＴｏＦ ＭＳに連結させた変性サイズ排除液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ）からなるハイスループット分析プラットホームを記載する。このインタクト質量方法は、事前の精製または試料調製なしで清浄化された採取流体の上で直接的に実行することができる。この方法は、細胞によって生成されるｍＡｂ関連種のタイプおよび分布に関する直接で不偏の情報を提供して、クローンの性能および特徴ならびに増殖条件に関する洞察を与えるために、プロテインＡ精製の前に細胞培養採取流体の上で直接的に実行することができる。この分析プラットホームは、異なるｔｓＡｂ構築物を発現する多数のＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞クローンの誤対合および半抗体レベルについてのスクリーニングを可能にした。特に開発初期におけるこのインタクト質量分析方法からの結果は、好適な生成物品質のｔｓＡｂを生成するＣＨＯクローンの選択を容易にする。
材料および方法
抗体発現および精製
三重特異性抗体（ｔｓＡｂ）は、遠心管でのバッチ培養またはａｍｂｒ（登録商標）バイオリアクタシステムでの流加プロセスを使用して、単一のＣＨＯ宿主細胞系における全ての４つのサブユニットの同時発現によって生成した。力価は、ＯｃｔｅｔをＰｒｏＡバイオセンサーと使用して採取流体で決定した。清浄化された細胞培養採取試料は、質量分析の前まで－８０℃で冷凍保存した。清浄化された細胞培養流体からのｔｓＡｂの精製は、Ｔｅｃａｎ液体ハンドリングシステムを使用した９６ウェルプレートフォーマットでプロテインＡ遠心カラムを使用し、続いてＯｃｔｅｔを使用した濃度測定によって実行した。
抗体のＩｄｅＳ消化
約２ｍｇ／ｍＬの濃度のｔｓＡｂの１０μＬ溶液に、２０μＬの２５ｍＭトリスバッファーｐＨ７．２を加えた。試料をＧｅｎｏｖｉｓ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）からのＩｄｅＳ酵素溶液（６６．６単位／μＬ）１．５μＬと混合し、続いて３７℃で２時間インキュベーションした。
質量分析（ＭＳ）のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
サイズ排除液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－クラス（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）によって制御されたＵＰＬＣ ＢＥＨ ＳＥＣカラム、１．７μｍ、２００Å、４．６×３００ｍｍ、を使用して実行した。ＰｒｏＡ精製抗体試料については、１５分間の０．２ｍＬ／分の流速の３０：７０のアセトニトリル：水の中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、清浄化された採取試料については、定組成モードの０．１ｍＬ／分（０から２５分）および０．４ｍｌ／分（２５から３３分）の流速の３０：７０のアセトニトリル：水の中の０．０５％ギ酸（ＦＡ）および０．０５％ＴＦＡを移動相として使用した。ＦＡおよびＴＦＡは、共にＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）からのＬＣ－ＭＳグレードであった。ＬＣ－ＭＳ水およびアセトニトリルは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）からであった。
質量分析
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、感受性モードおよび以下のソースパラメーターを使用した５００～４０００のｍ／ｚ範囲でのオンラインインタクトＭＳデータ取得のために、Ｘｅｖｏ Ｇ２ ＱＴｏＦ質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）に連結した：３ｋＶの毛細管電圧、４０Ｖのサンプリングコーン電圧、２．５Ｖの抽出コーン電圧、１５０℃のソース温度、５００℃脱溶媒和温度、５０Ｌ／時間のコーン気体流、８００Ｌ／時間の脱溶媒和気体流、６Ｖの衝突エネルギー。
データ分析
デコンボリューションおよび相対定量化のために、Ｂｙｏｓ（登録商標）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．）を使用して取得したＬＣ－ＭＳ生ファイルをバッチ処理した。
結果
三重特異性抗体における重鎖および軽鎖の誤対合は、正しく対合した種の予想される質量からの質量シフトをもたらし、それはインタクトタンパク質質量分析によって容易に検出可能である。唯一の例外は、正しく対合した構造と同じ質量を有し、したがって質量分析によって識別不能である潜在的な軽鎖スクランブル化分子である（図１Ｂ）。
細胞培養採取流体のインタクトＭＳ分析は複雑なマトリックスが課題であり、ＭＳ検出とオンラインでの有効なクロマトグラフィー分離を要求する。具体的には、ｔｓＡｂ種は、採取物中の遊離ＣＯＤＶ（約３６ｋＤａ）およびＦａｂ（約２３ｋＤａ）軽鎖の圧倒的量によるイオン抑制、ならびにそれらの大きなサイズ（一部の誤対合種の場合は最高２１０ｋＤａ）のためにそれらの本来的に低いイオン化効率を被る。したがって、試料調製なしで採取流体の直接注入から高品質ＭＳデータを得るために、ＳＥ－ＵＰＬＣ－インタクトＭＳ方法の開発の間に、流速、移動相調節剤およびその有機含有量、ＳＥＣカラム孔径ならびにカラムへのタンパク質ロードを含むクロマトグラフィーパラメーター、ならびにＭＳソースパラメーターの最適化に着手した。
初期のワークフローは、清浄化された採取物からのｔｓＡｂの自動化されたＰｒｏＡ精製、続いてインタクトＭＳデータ取得のためにＱＴｏＦ ＭＳに連結させた変性ＳＥＣ－ＬＣを含んでいた。変性ＳＥＣは、ｔｓＡｂの迅速で（１５分）効率的な脱塩ならびにｍＡｂとしばしば同時精製される過剰発現した軽鎖からの分離を可能にする。
図２ＡはＣＤ３８ＴＣＥｔｓＡｂのデコンボリュートされた質量スペクトルを示し、１７４１８８Ｄａの質量は所望のアセンブリ、Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ２に対応している。１６０６８３Ｄａおよび１８７６９２Ｄａで観察される２つの他の質量は、それぞれ軽鎖誤対合種Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ１およびＨ１Ｌ２／Ｈ２Ｌ２の理論的質量に一致する。種の構造的帰属をさらに検証するために、ヒンジ下の特異的部位で抗体を消化するシステインプロテアーゼＩｄｅＳでｔｓＡｂ試料を消化し、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ／２フラグメントのプールを生成した。図２Ｂに見られるように、インタクト分子で観察された同じ質量シフトパターンを有する３つの異なるＦａｂフラグメントがＩｄｅＳ消化の後に出現し、軽鎖誤対合帰属をさらに確認した。
抗体を含むタンパク質治療薬のための細胞株の開発は、初期開発の基盤である。主要な目標は、標的組換えタンパク質を多量に、およびグリコシル化、電荷不均一性等の所望の製品品質属性で一貫して発現することができる安定したモノクローナル細胞株（一般的にＣＨＯ細胞）を作製することである（Ｃｈｕｓａｉｎｏｗ、Ｊ．らＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００９、１０２（４）、１１８２～９６頁）。多重特異性抗体との関係で、サブユニットの潜在的誤対合は、プールおよび最終生産クローンの選択の間にモニタリングする必要がある決定的な品質属性（ＣＱＡ）である。
所望のｔｓＡｂ型と同時精製される誤対合鎖および半抗体を含む生成物関連の不純物のタイプおよび相対レベルを決定するために、変性ＳＥＣ－インタクトＭＳ方法を使用した抗ＣＤ３８ ＴＣＥを発現するＣＨＯ細胞の３８クローンからのＰｒｏＡ精製材料のインタクトＭＳ分析を企てた。ｔｓＡｂクロマトグラフィーのピークにわたって取得された合わせたＭＳスペクトルのデコンボリューションの後の質量強度に基づいて、異なる種の相対レベルを計算した。異なるＩｇＧ関連種は、完全なｔｓＡｂ構造と比較して質量が、特に半抗体で、したがってそれらのイオン化効率で広く異なることがあるが、種のＭＳをベースとした相対定量化は、それらの誤対合および１／２抗体レベルに基づいてクローンを比較し、ランクを付けるための有効なツールである。
図３Ａは、バッチＣＨＯ細胞培養を使用して増殖させた抗ＣＤ３８ ＴＣＥ構築物の異なるクローンにおける％純度（すなわち、正しい質量のパーセンテージ）を示す。９０％から１０％にわたる純度における高度な変動性が、クローンの間で観察された。さらに、図３Ｃに示すように、誤対合種および半抗体の相対レベルはクローン間で有意に異なった。さらに、純度結果を力価によって測定したクローンの生産性の値（図３Ｂ）と整列させることは、この２つの間の相関の不在を実証し、高生産性のクローンが高い程度の誤対合した、不完全にアセンブルされたｍＡｂ種を潜在的に与えることができることを意味する。
これらの結果は、ｔｓＡｂクローンを誤対合レベルについてスクリーニングすること、ならびに細胞株の開発および最良の生産クローンの選択のためにその情報を生産性および他の細胞培養パラメーターと合わせて使用することの重要性を示す。
清浄化された採取物の直接的インタクトＭＳ分析
クローンスクリーニングの費用およびリードタイムを減少させ、ワークフローを合理化するために、いかなる事前の精製または試料操作も迂回することによって、細胞株開発の間に作製されたｍＡｂ種の清浄化された細胞培養流体中での直接的なインタクトＭＳ測定を可能にするように、変性ＳＥＣ－ＭＳ方法パラメーターを最適化した。
細胞培養流体のインタクトＭＳ分析は、複雑なマトリックス、特に細胞を流体力学的傷害から保護するために培地に一般的に加えられるＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８などの非イオン性界面活性剤の存在が課題であり、それはＭＳ分析の間に同時溶出およびイオン抑制につながる可能性がある。さらに、ｔｓＡｂ種は、採取物中で過剰発現される遊離ＣＯＤＶ（約３６ｋＤａ）およびＦａｂ（約２３ｋＤａ）軽鎖の圧倒的量によるイオン抑制、ならびにそれらの大きなサイズ（一部の誤対合種の場合は最高２１０ｋＤａ）のためにｔｓＡｂの本来的に低いイオン化効率を被る。インタクトタンパク質ＭＳのために一般的に使用される逆相（ＲＰ）固定相の上での界面活性剤からのタンパク質のクロマトグラフィー分離は、両方のタイプの種の疎水性のために、不可能でないとしてもかなり難しくなることがある。さらに、所与のＲＰ－ＬＣ方法は、アミノ酸配列によって異なるｔｓＡｂに対して異なる選択性挙動を示し、三重特異性抗体の複数の構築物のためのプラットホーム方法として使用することができない。
この実施例では、変性条件下のＳＥＣ－ＬＣは、清浄化された細胞培養流体中の小分子および界面活性剤からの抗体種のサイズに基づく分離のために首尾よく用いられた。ＰｒｏＡ精製材料に同等の採取物中のｔｓＡｂ種に関する高品質ＭＳデータの取得のために、流速、移動相調節剤および有機含有量を含む液体クロマトグラフィーパラメーターならびにＭＳソースパラメーターを最適化した。図４Ａと４Ｂの塩基ピーククロマトグラムに見られるように、最適化された変性ＳＥＣ方法は、ｔｓＡｂを含むｍＡｂ関連種ならびに過剰発現されたＣＯＤＶ軽鎖およびＦａｂ軽鎖を互いから、および界面活性剤種から効率的に分離した。
ＭＳソースの混入を回避するためにクロマトグラムおよびフローで最後の界面活性剤溶出は廃棄した（図４Ａ）。このＳＥＣ－ＭＳ方法は、非生成物特異的プラットホームであり、異なるｔｓＡｂ構築物にわたる多数のクローンの迅速でハイスループットのスクリーニングを可能にする。さらに、開発された方法は、ｓｃＦｖ２およびＦａｂ融合タンパク質などの無Ｆｃ抗体フォーマットを含む他のｍＡｂ関連モダリティーに適用することができ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ、Ｕ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｒ．Ｅ．ＭＡｂ ２０１７、９（２）、１８２～２１２頁）、それらは自動化ＰｒｏＡ精製システムを使用して精製することができない。
抗ＣＤ３８ ＴＣＥ構築物中の２つの誤対合種の間の最小質量差は８１０Ｄａであり、抗ＨＥＲ２ ＴＣＥ構築物では１０９５Ｄａであり、本方法の質量分解能のかなり下である。誤対合種を質量でより詳細に分解する本方法の能力を実証するために、両方の構築物からの清浄化された採取試料を１：１の比で混合して誤対合種のより複雑な混合物を作製した。両方の試料は、ＣＤ３８ ＴＣＥおよび抗ＨＥＲ２ ＴＣＥの約３０２Ｄａの理論的質量値の差を有するＨ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ１種を含有した。図４Ｃに見られるように、採取物のオンラインＳＥＣ－ＭＳ分析はこれらの２つの種およびそれらのグリコ型を完全に分解し、＋１６２Ｄａの質量シフトによってマークされている。
次に、２つの異なるｔｓＡｂ構築物：４３５および１１００μｇ／ｍＬの力価をそれぞれ有する抗ＨＥＲ２ ＴＣＥ抗ＣＤ３８ ＴＣＥの清浄化された採取流体を使用して、ＭＳシグナルの反復性、信頼性および頑健性を評価した。図５Ａは、３つの異なるｔｓＡｂアセンブリの相対レベルは１０から５０μＬに注入量を増加させることによって達成される異なるカラムロードにわたって一貫していることを示す。これらの結果は、４～５５μｇの範囲のカラムロードにわたるＭＳ定量化の頑健性および信頼性を実証する。したがって、清浄化された採取物の固定注入量によるオンラインＳＥＣ－ＭＳは、低いおよび高い力価の、一般的に１００～１１００μｇ／ｍＬの範囲内のクローンのために使用することができる。図４Ａ～４Ｃの２つのｔｓＡｂ構築物にわたる各タンパク質ロードレベルでの３反復ＬＣ－ＭＳ分析によって評価した本方法の反復性は、１０％未満の％ＲＳＤ値を返した（表Ａ）。
Figure 2022553716000002
さらに、清浄化された採取物およびＰｒｏＡ精製材料のＳＥＣ－ＬＣ－インタクトＭＳ分析によって得られた誤対合定量化の結果の比較は２つの方法の間の接近した一致を示し、誤対合判定のための採取物の直接的インタクトＭＳ分析の適合性をさらに確認した（図５Ｂと５Ｃ）。
採取物のＳＥＣ－ＭＳ方法は、５０個の抗ＨＥＲ２ ＴＣＥクローンのハイスループットスクリーニングのために利用された。この試験では、正しくアセンブルされた分子（１７５５７６Ｄａ）は主要な形であることが見出されたが、軽鎖誤対合種Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ１（１６２１８７Ｄａ）およびＨ１Ｌ２／Ｈ２Ｌ２（１８８９６５Ｄａ）は全ての試験試料で様々なレベルで検出された。半抗体のゼロまたは非常に低いレベルが試験クローンで検出された。抗ＣＤ３８ ＴＣＥと同様に、誤対合レベルとクローン生産性の間に相関は観察されなかった。（図５Ｄと５Ｅ）。
細胞培養増殖条件の鎖誤対合への影響
ｔｓＡｂにおける鎖誤対合および半抗体形成に及ぼす細胞増殖条件の影響を調査するために、異なる２セットの試験を実行した。
第１の試験では、抗ＣＤ３８ＴＣＥのクローンは、ａ）バッチ培養で増殖させて１０日目に採取し、ｂ）およびｃ）ａｍｂｒ（登録商標）マイクロバイオリアクターの中で２つの異なる増殖条件で増殖させた。ＳＥＣ－インタクトＭＳ分析（ＰｒｏＡ精製材料）は、３つの異なる条件の下で増殖させた各クローンにおける誤対合および半抗体の分布における変動を示した（図６Ｃ～６Ｅ）。しかし、図６Ｃに見られるように、不純物の全レベルに基づくクローンランキングは、増殖条件に関係なく一般的に不変のままだった。
類似の所見が抗ＨＥＲ２ ＴＣＥの試験で見出され、ここでは、バッチ培養条件（１０日目に採取）の下で、およびａｍｂｒ（登録商標）マイクロバイオリアクターの中で増殖させた選択されたクローンからの清浄化採取流体を、それらの相対的誤対合レベルについてＳＥＣ－ＬＣインタクトＭＳによって分析した。各所与のクローンにおける誤対合種の分布はバッチ培養とａｍｂｒ条件の間で異なるが（図６Ｆと６Ｇ）、全誤対合に基づくクローンランキングは２つの増殖条件の間で一般的に類似していた（図６Ｂ）。これらの結果は、薬物開発の後期におけるプロセス条件の避けられない変更にもかかわらず、誤対合データに基づく初期クローン選択の重要性および正当性を鮮明に示す。
両試験で、バッチ培養と比較してａｍｂｒ（登録商標）で増殖させたクローンの間で正しく対合したｔｓＡｂの収量のより大きな変動があったことが注目に値する；このことはＣＤ３８ ＴＣＥでは１０～９０％対４７～８０％の、および抗ＨＥＲ２ ＴＣＥでは４６～７０％対４５～５８％の％純度範囲によって示される（図６Ａと６Ｂ）。興味深いことに、両方の場合で、１０～２０％より高い純度によって示唆されるように、バッチ培養よりａｍｂｒバイオリアクターにおいて上位のクローンはより優れているようだった。
結論
ミスアセンブルされた種は、多重特異性抗体の製造中に一般的に発生する生成物関連の不純物であり、それは、低下した生産収量につながり、高コストの精製工程ならびに初期モニタリングのための頑強な分析方法を必要とする。上の実施例では、鎖誤対合および他のＩｇＧ関連種の同定および相対的定量化のための変性ＳＥＣ－ＬＣ－インタクトＭＳに基づくハイスループット分析プラットホームが記載された。開発された方法は、時間がかかる高価なＰｒｏＡ精製および緩衝液交換工程を回避する、清浄化された採取物中でのｍＡｂ関連種の直接的インタクトＭＳ分析を可能にする（図７）。２つの異なるｔｓＡｂ構築物のインタクトＭＳ分析；ＣＨＯ細胞の異なるクローンからの抗ＣＤ３８ ＴＣＥおよび抗ＨＥＲ２ ＴＣＥは、クローン間の正しく対合したｔｓＡｂ収量のレベルにおける変動を示したが、クローンの生産性（力価）と誤対合の間の明らかな相関はなかった。さらに、異なる増殖条件は不純物のタイプおよび分布に影響を及ぼす可能性があるが、クローンの品質ランク付けに影響せず、薬物開発の後期におけるプロセス条件の避けられない変更にもかかわらず、誤対合データに基づく初期クローン選択の正当性を確認した。
三重特異性結合タンパク質のための採取物のインタクト質量分析
バイオ治療薬、それらのバリアントおよび生成物関連の不純物の同定および相対的定量化のために、インタクトタンパク質質量分析が過去に他の者によって使用されてきた。変性および天然ＭＳ分析のための逆相分離またはサイズ排除ＬＣに基づくいくつかの異なるインタクトタンパク質ＭＳアプローチが報告されている（Ｘｕ、Ｌ．ら（２０１７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８：８５～９０頁；Ｒｉｄｇｗａｙ、Ｊ．Ｂ．ら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：６１７～６２１頁；Ｗａｎｇ、Ｃ．ら（２０１８）ＭＡｂｓ １０：１２２６～１２３５頁；Ｓｃｈａｅｆｅｒ、Ｗ．ら（２０１６）ＭＡｂｓ ８：４９～５５頁）。これらのアプローチは、ＬＣ－ＭＳ分析の前に一般的にプロテインＡ親和性を通して抗体が精製されることを必要とする。
上の実施例は、三重特異性抗体（ｔｓＡｂ）における鎖誤対合のインタクトＭＳ分析のためのＱＴｏＦ質量分析に連結させた変性サイズ排除液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ）からなるハイスループット分析プラットホームを記載する。Ｔｏｕｓｉ、Ｆ．ら（２０２０）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．９２：２７６４～２７６９頁も参照する。このインタクト質量方法は、事前の精製または試料調製なしで清浄化された採取流体の上で直接的に実行することができる。この分析プラットホームは、異なるｔｓＡｂ構築物を発現する多数のＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞クローンの、誤対合種および半抗体のそれらのレベルについてのスクリーニングを可能にした。特に開発初期におけるこのインタクト質量分析方法からの結果は、許容される生成物品質のｔｓＡｂを産生するＣＨＯクローンの選択を容易にする。
実施例４および５は、異なるｍＡｂ関連構築物のためのクローン選択への同じ分析方法の適用を記載する：抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３三重特異性抗体（実施例４）およびシステインを工学操作されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（実施例５）。
材料および方法
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
サイズ排除ＬＣ分離を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－クラス（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）によって制御されたＵＰＬＣ ＢＥＨ ＳＥＣカラム、１．７μｍ、２００Å、４．６×３００ｍｍ、を使用して実行した。定組成モードの０．１ｍＬ／分（０から２５分）および０．４ｍｌ／分（２５から３３分）の流速の３０：７０のアセトニトリル：水の中の０．０５％ギ酸（ＦＡ）および０．０５％ＴＦＡの溶液を、移動相として使用した。４℃に設定したＡｃｑｕｉｔｙオートサンプラーを使用したＬＣ－ＭＳシステムに、清浄化された採取物の５０μＬ量を直接注入した。ＦＡおよびＴＦＡは、共にＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）からのＬＣ－ＭＳグレードであった。ＬＣ－ＭＳの水およびアセトニトリルは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）からであった。
質量分析（ＭＳ）
ＬＣは、感受性モードおよび５００～４０００のｍ／ｚ範囲でのオンラインインタクトＭＳデータ取得のために、Ｘｅｖｏ Ｇ２（またはＧ２ＸＳ）ＱＴｏＦ質量分析器（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）に連結した。Ｘｅｖｏ Ｇ２機器のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）パラメーターには、以下のものが含まれた：３ｋＶの毛細管電圧、４０Ｖのサンプリングコーン電圧、２．５Ｖの抽出コーン電圧、１５０℃のソース温度、５００℃脱溶媒和温度、５０Ｌ／時間のコーン気体流、８００Ｌ／時間の脱溶媒和気体流および６Ｖの衝突エネルギー。Ｘｅｖｏ Ｇ２ＸＳのＥＳＩパラメーターは、以下の通りであった：３ｋＶの毛細管電圧、２００Ｖのサンプリングコーン電圧、１５０℃のソース温度、１５０のソースオフセット、２５０℃脱溶媒和温度、５０Ｌ／時間のコーン気体流、８００Ｌ／時間の脱溶媒和気体流および６Ｖの衝突エネルギー。
データ分析
デコンボリューション、アノテーションおよび相対定量化のために、Ｂｙｏｓ（登録商標）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．）を使用して取得したＬＣ－ＭＳ生ファイルをバッチ処理した。
結果
抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３ ｔｓＡｂを発現するＣＨＯ細胞の５０クローンからの清浄化された細胞培養採取試料を、上記の変性ＳＥＣ－インタクトＭＳ方法を使用して分析した。取得したＭＳ生ファイルを分析した結果、誤対合のレベル（％）における、低くは１％から１００％の誤対合の高度の変動性が試験クローンの間で観察された。Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ１（１６５～１６７ｋＤａ）が優占する誤対合種であった。少数のクローンがＨ１Ｌ２／Ｈ２Ｌ２誤対合形を含有していた。Ｈ２Ｌ２／Ｈ２Ｌ２ホモダイマーは、２、３のクローンで検出された。低いレベルであったが、半抗体（Ｈ１Ｌ１およびＨ２Ｌ２）が一部のクローンに存在していた。前に試験した三重特異性抗体と異なり、Ｈ１Ｌ２／Ｈ２Ｌ２タイプの誤対合の有意な量はＨＩＶ ＴＣＥクローンで検出されなかった。図８Ａと８Ｂは、鎖誤対合の最高および最低レベルをそれぞれ有する抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３クローンのためのデコンボリュートされたインタクト質量スペクトルを示す。
図９Ａと９Ｂは、細胞株開発の一部としてクローン選択工程の間にバッチ培養条件の下で増殖させた抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３三重特異性を産生する５０細胞クローンのための、プロテインＡ力価および正しい質量の相対レベルによって測定されたクローンの生産性を示す。生産性データと合わせた誤対合分析の結果は、最高力価ならびに最低レベルの鎖誤対合を有するクローンの選択を可能にした。興味深いことに、比較的高い生産性を有するいくつかのクローンは、図９Ｂのカラムグラフの右端に見られるように０％の正しく対合したｔｓＡｂを示した。
高感度の質量分析器の利用と組み合わせた素晴らしいクロマトグラフィー分離は、通常の重鎖Ｆｃ Ｎ－グリカンに加えてＦａｂ ＬＣの上のシアル酸付加Ｎ－グリカンの存在による、インタクトレベルでの極めて不均一なグリカンプロファイルの解明を可能にした。これは、一般的に労働集約型で時間のかかる方法を使用してより綿密なグリカン分析を実行する必要性なしで、クローンのＮ－グリコシル化プロファイルを速やかにモニタリングすることを可能にする。例として、図１０Ａと１０Ｂは、２つの異なる条件：それぞれ１－遠心管（バッチ条件）および２－ａｍｂｒ１５バイオリアクター（流加条件）、で培養した抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３を産生する選択されたクローンにおける参照質量（Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ２）の詳細なグリカンプロファイルを示し、より高い質量値へのシフトから明白なようによりガラクトシル化およびシアル酸付加されたＮ－グリカンへのシフトを示している。軽鎖グリコシル化によって加えられた極度のグリカン不均一性のために、参照形（Ｈ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ２）およびＨ１Ｌ１／Ｈ２Ｌ１誤対合形の分子量は、それぞれ１０００Ｄａおよび２０００Ｄａの範囲に及ぶ。インタクトな抗ＨＩＶ／ＣＤ２８／ＣＤ３参照形のためのグリコ型帰属は、表１に詳細に記載される。
Figure 2022553716000003
システインを工学操作された抗体の採取物のインタクト質量分析
この生成物はｔｈｉｏｍＡｂ、すなわち、例えば化合物（例えば、抗体薬コンジュゲートを形成するための細胞毒性薬）のコンジュゲーションのために有益である、そのＦｃ領域に組み入れられたさらなるシステイン残基を含む抗体である。このさらなるシステインは対になってない（遊離）、すなわち、ｍＡｂ分子中の他のシステインとのジスルフィド結合にかかわっていない。以前の研究は、このさらなるシステイン（Ｃｙｓ２９３）が近くのシステイン残基と、「ジスルフィド結合スクランブリング」として別途知られている望ましくないジスルフィド結合を形成することができ、抗体の構造的不安定性に潜在的につながることを示した。無制御のスルフヒドリル化学反応は、ＡＤＣを形成するプロセスの間にかなりの製造上のリスクももたらすことがあり、望ましくない薬物コンジュゲーションプロファイルにつながる。これらのリスクを回避するために、細胞培養条件を調整することによってシステイン化およびグルタチオン化などのジスルフィド結合改変でキャップされた遊離システインを有することが避けられない。これらの改変は、薬物コンジュゲーション工程の前に遊離システインを生成するように選択的に低減することができる。
この実施例では、細胞培養採取物の開発された変性ＳＥＣ－インタクトＭＳは、細胞株開発の間にそれらのＣｙｓ２９３のキャッピング状態についてのクローンの迅速スクリーニングのために使用されている。試験した最初のｔｈｉｏｍＡｂ候補は、Ｆｃ領域にＦｃ Ｎ－グリコシル化を除去したＮ３００Ａ突然変異を有した。グリカンの不在は、いかなる試料操作の必要性なしで採取物の直接的なインタクトＭＳ分析によるＣｙｓ２９３キャッピングの同定を可能にした（図１１Ａ）。
しかし、一般的なＦｃＮ－グリコシル化プロファイルを有する第２のｔｈｉｏｍＡｂ候補は、Ｎ－グリカンへのヘキソース単糖残基の追加（＋１６２Ｄａ）のために質量シフトに干渉したＮ－アセチルシステイン化（＋１６１Ｄａ）を含む複数のキャッピング種の存在のために、インタクトＭＳデータにおいて高度に複雑なパターンを示した。この問題を回避してデータ解釈を容易にするために、第２の候補からの清浄化された採取物をＰＮＧａｓｅ Ｆで処理して、天然条件の下でＮ－グリカンを除去した。脱グリコシル化された採取物は、前の通りＳＥＣ－インタクトＭＳにその後供した。図１１Ｂは脱グリコシルの後に第２の候補で得られたデコンボリュートされたインタクト質量スペクトルを示し、３種類のキャッピング改変が特定される：＋１１９Ｄａの質量シフトを有するシステイン化（Ｃｙｓ）、＋１６１Ｄａの質量シフトを有するＮ－アセチルシステイン化（Ｎ－アセチルＣｙｓ）および＋３０５Ｄａの質量シフトを有するグルタチオン化（Ｇｌｕ）。この方法によるｔｈｉｏｍＡｂを発現するＣＨＯ細胞の２２クローンのスクリーニングは、全ての試験クローンで工学操作されたシステインの１００％のキャッピングを示した。

Claims (111)

  1. 多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の産生をモニタリングする方法であって、
    サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を含む細胞培養培地中の多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出し、それにより多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の産生をモニタリングすること
    を含み、
    多特異性結合タンパク質は、少なくとも第１のポリペプチド鎖および第１のポリペプチド鎖と異なる第２のポリペプチド鎖を含む２本以上のポリペプチド鎖の会合を含み；
    １つまたはそれ以上の誤対合種は、第１のおよび第２のポリペプチド鎖の少なくとも１本を多特異性結合タンパク質のもの以外の会合で含む２本以上のポリペプチド鎖を含む、前記方法。
  2. 多特異性結合タンパク質は、第１の抗体重鎖、第１の抗体軽鎖、第１の抗体重鎖と異なる第２の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖と異なる第２の抗体軽鎖を含む多特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
  3. １つまたはそれ以上の誤対合種は：
    （ｉ）２本の第１の抗体重鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；
    （ｉｉ）２本の第２の抗体重鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；
    （ｉｉｉ）２本の第１の抗体軽鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；および
    （ｉｖ）２本の第２の抗体軽鎖を含む多特異性抗体の４本ポリペプチド鎖の会合
    の１つまたはそれ以上を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 多特異性結合タンパク質は、３個の抗原結合部位を形成する４本のポリペプチド鎖を含み、
    結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
    によって表される構造を含み、
    結合タンパク質の第２のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
    によって表される構造を含み、
    結合タンパク質の第３のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
    によって表される構造を含み、
    結合タンパク質の第４のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
    によって表される構造を含み、
    式中：
    ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ３は第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ３は第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
    ヒンジはＣＨ１とＣＨ２ドメインとを繋ぐ免疫グロブリンヒンジ領域であり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり；
    式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖重鎖対を形成し、ＶＨ１およびＶＬ１は第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は第３の抗原結合部位を形成する、
    請求項１に記載の方法。
  5. １つまたはそれ以上の誤対合種は：
    （ｉ）式Ｉによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；
    （ｉｉ）式ＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；
    （ｉｉｉ）式ＩＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；および
    （ｉｖ）式ＩＶによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合
    の１つまたはそれ以上を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出することは、ＭＳによって得られた１つまたはそれ以上のＭＳスペクトルをデコンボリュートすることを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. １つまたはそれ以上の誤対合種と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. １つまたはそれ以上の個々の誤対合種の量と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される、請求項７に記載の方法。
  9. 誤対合種の全体量と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される、請求項７に記載の方法。
  10. 細胞培養培地は細胞培養採取物である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 検出に先立って、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を産生する細胞株から細胞培養培地を分離することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. （ａ）に先立って、細胞培養培地は、遠心分離によって細胞株から分離される、請求項１１に記載の方法。
  13. 細胞培養培地は、先行するクロマトグラフィー分離を用いずにＳＥ－ＵＰＬＣに供される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 細胞培養培地は、先行するプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いずにＳＥ－ＵＰＬＣに供される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  15. ＭＳはインタクトＭＳである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. ＭＳは四重極飛行時間型（ＱＴｏＦ）ＭＳである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. ＳＥ－ＵＰＬＣは変性ＳＥ－ＵＰＬＣである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. ＳＥ－ＵＰＬＣはＭＳに直接連結されている、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. ＳＥ－ＵＰＬＣは、約０．４ｍＬ／分未満の初期流速で実行される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. ＳＥ－ＵＰＬＣは、約０．ｌｍＬ／分の初期流速で実行される、請求項１９に記載の方法。
  21. ＳＥ－ＵＰＬＣは、最初の２５分間は約０．ｌｍＬ／分の流速で、続いて約０．４ｍＬ／分の流速で実行される、請求項２０に記載の方法。
  22. ＳＥ－ＵＰＬＣは、移動相を用いた均一濃度溶出を使用して実行される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 移動相は、３０：７０アセトニトリル：水を含む溶液を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 移動相は、ギ酸およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
  25. 移動相は、約０．０５％ギ酸および約０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 検出は約３３分間以内に達成される、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. ＭＳは、多特異性結合タンパク質と１つまたはそれ以上の誤対合種との間または２つの誤対合種間の約３００Ｄａの質量差を分解することができる、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. ＭＳは、多特異性結合タンパク質または誤対合種と１つもしくはそれ以上のグリコフォームとの間の約１６２Ｄａの質量差を分解することができる、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 細胞株は哺乳動物細胞株である、請求項１１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 哺乳動物細胞株はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項２９に記載の方法。
  31. 検出に先立って、細胞株は、連続、撹拌タンクバイオリアクター培養で細胞培養培地を用いて培養される、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 検出に先立って、細胞株はバッチ細胞培養で細胞培養培地を用いて培養される、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  33. 多特異性結合タンパク質を産生する方法であって、
    （ａ）細胞株による多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の産生のために好適な条件下、細胞培養培地中で多特異性結合タンパク質をコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む細胞株を培養すること；
    （ｂ）細胞株から、多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を含む細胞培養培地を分離すること；
    （ｃ）サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって、細胞培養培地中の多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出すること；ならびに
    （ｄ）細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質から１つもしくはそれ以上の誤対合種の少なくとも一部を除去すること、または細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の品質および純度の一方もしくは両方を決定すること
    を含み、
    多特異性結合タンパク質は、少なくとも第１のポリペプチド鎖および第１のポリペプチド鎖と異なる第２のポリペプチド鎖を含む２本以上のポリペプチド鎖の会合を含み；
    １つまたはそれ以上の誤対合種は、第１のおよび第２のポリペプチド鎖の少なくとも１本を多特異性結合タンパク質のもの以外の会合で含む２本以上のポリペプチド鎖を含む、前記方法。
  34. 多特異性結合タンパク質は、第１の抗体重鎖、第１の抗体軽鎖、第１の抗体重鎖と異なる第２の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖と異なる第２の抗体軽鎖を含む多特異性抗体である、請求項３３に記載の方法。
  35. １つまたはそれ以上の誤対合種は：
    （ｉ）２本の第１の抗体重鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；
    （ｉｉ）２本の第２の抗体重鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；
    （ｉｉｉ）２本の第１の抗体軽鎖を含む多特異性抗体の４本のポリペプチド鎖の会合；および
    （ｉｖ）２本の第２の抗体軽鎖を含む多特異性抗体の４本ポリペプチド鎖の会合
    の１つまたはそれ以上を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 多特異性結合タンパク質は、３個の抗原結合部位を形成する４本のポリペプチド鎖を含み、
    結合タンパク質の第１のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ２－Ｌ１－ＶＬ１－Ｌ２－ＣＬ ［Ｉ］
    によって表される構造を含み、
    結合タンパク質の第２のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ１－Ｌ３－ＶＨ２－Ｌ４－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩ］
    によって表される構造を含み、
    結合タンパク質の第３のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＨ３－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ ［ＩＩＩ］
    によって表される構造を含み、
    結合タンパク質の第４のポリペプチド鎖は、式：
    ＶＬ３－ＣＬ ［ＩＶ］
    によって表される構造を含み、
    式中：
    ＶＬ１は第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ２は第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＬ３は第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ１は第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ２は第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＶＨ３は第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
    ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ１は免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ２は免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
    ＣＨ３は免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
    ヒンジはＣＨ１とＣＨ２ドメインとを繋ぐ免疫グロブリンヒンジ領域であり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４はアミノ酸リンカーであり；
    式Ｉのポリペプチドおよび式ＩＩのポリペプチドは交差軽鎖重鎖対を形成し、ＶＨ１およびＶＬ１は第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は第２の抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は第３の抗原結合部位を形成する、
    請求項３３に記載の方法。
  37. １つまたはそれ以上の誤対合種は：
    （ｉ）式Ｉによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；
    （ｉｉ）式ＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；
    （ｉｉｉ）式ＩＩＩによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合；および
    （ｉｖ）式ＩＶによる２本のポリペプチド鎖を含む結合タンパク質の４本のポリペプチド鎖の会合
    の１つまたはそれ以上を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出することは、ＭＳによって得られた１つまたはそれ以上のＭＳスペクトルをデコンボリュートすることを含む、請求項３３～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を検出することは、細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の全体力価を評価することを含む、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 多特異性結合タンパク質および１つまたはそれ以上の誤対合種を検出することは、細胞株によって産生された誤対合種の全体力価を評価することを含む、請求項３３～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. １つまたはそれ以上の誤対合種と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される、請求項３３～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. １つまたはそれ以上の個々の誤対合種の量と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される、請求項４１に記載の方法。
  43. 誤対合種の全体量と比較した多特異性結合タンパク質の相対量が検出される、請求項４１に記載の方法。
  44. 細胞培養培地は、遠心分離によって細胞株から分離される、請求項３３～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 細胞培養培地は、先行するクロマトグラフィー分離を用いずに（ｃ）においてＳＥ－ＵＰＬＣに供される、請求項３３～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 細胞培養培地は、先行するプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いずに（ｃ）においてＳＥ－ＵＰＬＣに供される、請求項３３～４４のいずれか１項に記載の方法。
  47. ＭＳはインタクトＭＳである、請求項３３～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. ＭＳは四重極飛行時間型（ＱＴｏＦ）ＭＳである、請求項３３～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. ＳＥ－ＵＰＬＣは変性ＳＥ－ＵＰＬＣである、請求項３３～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. ＳＥ－ＵＰＬＣはＭＳに直接連結されている、請求項３３～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. ＳＥ－ＵＰＬＣは、約０．４ｍＬ／分未満の初期流速で実行される、請求項３３～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. ＳＥ－ＵＰＬＣは、約０．ｌｍＬ／分の初期流速で実行される、請求項５１に記載の方法。
  53. ＳＥ－ＵＰＬＣは、最初の２５分間は約０．ｌｍＬ／分の流速で、続いて約０．４ｍＬ／分の流速で実行される、請求項５２に記載の方法。
  54. ＳＥ－ＵＰＬＣは、移動相を用いた均一濃度溶出を使用して実行される、請求項３３～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 移動相は３０：７０アセトニトリル：水を含む溶液を含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 移動相はギ酸およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む、請求項５４または請求項５５に記載の方法。
  57. 移動相は、約０．０５％ギ酸および約０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む、請求項５６に記載の方法。
  58. （ｃ）は約３３分間以内に達成される、請求項３３～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. ＭＳは、多特異性結合タンパク質と１つまたはそれ以上の誤対合種との間または２つの誤対合種間の約３００Ｄａの質量差を分解することができる、請求項３３～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. ＭＳは、多特異性結合タンパク質または誤対合種と１つもしくはそれ以上のグリコフォームとの間の約１６２Ｄａの質量差を分解することができる、請求項３３～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 細胞株は哺乳動物細胞株である、請求項３３～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 哺乳動物細胞株はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項６１に記載の方法。
  63. 細胞株は（ａ）において、連続、撹拌タンクバイオリアクター培養で培養される、請求項３３～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 細胞株は（ａ）においてバッチ細胞培養で培養される、請求項３３～６２のいずれか１項に記載の方法。
  65. 多特異性結合タンパク質の産生について複数の細胞株をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項３３～６４のいずれか１項に記載の方法により、複数の内の第１の細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の量を検出すること；および
    （ｂ）請求項３３～６４のいずれか１項に記載の方法により、複数の内の第２の細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の量を検出すること
    を含む、前記方法。
  66. （ａ）および（ｂ）の後に：
    （ｃ）第１の細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の量を第２の細胞株によって産生された多特異性結合タンパク質の量と比較すること；および
    （ｄ）比較に基づいて、より多い量の多特異性結合タンパク質を産生した細胞株を選択すること
    をさらに含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 請求項３３～６４のいずれか１項に記載の方法により、第１の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出すること；および請求項３３～６４のいずれか１項に記載の方法により、第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出することをさらに含む、請求項６５または請求項６６に記載の方法。
  68. 第１のおよび第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の誤対合種の量を検出した後に：第１の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の誤対合種の量を第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の誤対合種の量を比較すること；および比較に基づいて、１つまたはそれ以上の誤対合種に対して、より高い比で多特異性結合タンパク質を産生した細胞株を選択することをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 細胞株は、１つまたはそれ以上の個々の誤対合種の量に対する多特異性結合タンパク質の比が高いことに基づいて選択される、請求項６８に記載の方法。
  70. 細胞株は、誤対合種の全体量に対する多特異性結合タンパク質の比が高いことに基づいて選択される、請求項６８に記載の方法。
  71. 抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の産生をモニタリングする方法であって、
    サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種を含む細胞培養培地中の抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出し、それにより抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の産生をモニタリングすること
    を含み、
    抗体または抗体派生体と、１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、分子量が異なる、前記方法。
  72. 多特異性結合タンパク質を産生する方法であって、
    （ａ）細胞株による抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の産生のために好適な条件下、細胞培養培地中で抗体または抗体派生体をコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを含む細胞株を培養すること；
    （ｂ）細胞株から、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種を含む細胞培養培地を分離すること；
    （ｃ）サイズ排除超高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳ）によって、細胞培養培地中の抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出すること；ならびに
    （ｄ）細胞株によって産生された抗体または抗体派生体から１つもしくはそれ以上の重量バリアント種の少なくとも一部を除去すること、または細胞株によって産生された抗体または抗体派生体の品質および純度の一方もしくは両方を決定すること
    を含み、
    抗体または抗体派生体と、１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、分子量が異なる、前記方法。
  73. 抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、システイン化、Ｎ－アセチルシステイン化およびグルタチオン化されて、遊離システインを有する種を含む、請求項７１または請求項７２に記載の方法。
  74. 抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、化学修飾されたシステイン残基を含む種を含む、請求項７１または請求項７２に記載の方法。
  75. 抗体または抗体派生体は、ＥＵインデックスによる番号付けで２９３位にシステイン残基を含む、請求項７１～７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 抗体または抗体派生体はＦｃ領域においてＮ－グリコシル化されていない、請求項７１～７５のいずれか１項に記載の方法。
  77. 抗体または抗体派生体は、Ｆｃ領域におけるＮ－グリコシル化を除く変異をＦｃ領域に含む、請求項７１～７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. 抗体または抗体派生体は、ＥＵインデックスによる番号付けでＮ３００Ａ変異を含む、請求項７７に記載の方法。
  79. ＳＥ－ＵＰＬＣ－ＭＳを介する検出に先立って、Ｆｃ領域におけるＮ－グリコシル化を除去することをさらに含む、請求項７１～７６のいずれか１項に記載の方法。
  80. Ｎ－グリコシル化を除去することは、抗体または抗体派生体をペプチド：Ｎ－グリコシダーゼ酵素を用いて処置することを含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 抗体または抗体派生体と、１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、分子量が少なくとも１１９Ｄａ異なる、請求項７１～８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. システイン化、Ｎ－アセチルシステイン化およびグルタチオン化種における質量差を分解することができる、請求項７１～８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、抗体または抗体派生体のグリコフォームを含む、請求項７１または請求項７２に記載の方法。
  84. 抗体または抗体派生体と、１つまたはそれ以上の重量バリアント種は、分子量が少なくとも１６２Ｄａ異なる、請求項７１～８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. 抗体または抗体派生体と、抗体または抗体派生体のグリコフォームを示す１つまたはそれ以上の重量バリアント種との間の質量差を分解することができる、請求項７１～８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. 抗体または抗体派生体はモノクローナル抗体である、請求項７１～８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 抗体または抗体派生体は多特異性抗体または結合タンパク質である、請求項７１～８５のいずれか１項に記載の方法。
  88. 抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出することは、ＭＳによって得られた１つまたはそれ以上のＭＳスペクトルをデコンボリュートすることを含む、請求項７１～８７のいずれか１項に記載の方法。
  89. １つまたはそれ以上の重量バリアント種と比較した抗体または抗体派生体の相対量が検出される、請求項７１～８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. １つまたはそれ以上の個々の重量バリアントの量と比較した抗体または抗体派生体の相対量が検出される、請求項８９に記載の方法。
  91. 重量バリアント種の全体量と比較した抗体または抗体派生体の相対量が検出される、請求項８９に記載の方法。
  92. 細胞培養培地は細胞培養採取物である、請求項７１に記載の方法。
  93. 検出に先立って、抗体または抗体派生体および１つまたはそれ以上の重量バリアント種を産生する細胞株から細胞培養培地を分離することをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
  94. （ａ）に先立って、細胞培養培地は、遠心分離によって細胞株から分離される、請求項９３に記載の方法。
  95. 細胞培養培地は、遠心分離によって細胞株から分離される、請求項７２に記載の方法。
  96. 細胞培養培地は、先行するクロマトグラフィー分離を用いずにＳＥ－ＵＰＬＣに供される、請求項７１～９５のいずれか１項に記載の方法。
  97. 細胞培養培地は、先行するプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いずにＳＥ－ＵＰＬＣに供される、請求項７１～９５のいずれか１項に記載の方法。
  98. ＭＳはインタクトＭＳである、請求項７１～９７のいずれか１項に記載の方法。
  99. ＭＳは四重極飛行時間型（ＱＴｏＦ）ＭＳである、請求項７１～９８のいずれか１項に記載の方法。
  100. ＳＥ－ＵＰＬＣは変性ＳＥ－ＵＰＬＣである、請求項７１～９９のいずれか１項に記載の方法。
  101. ＳＥ－ＵＰＬＣはＭＳに直接連結されている、請求項７１～１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. 細胞株は哺乳動物細胞株である、請求項７１～１０１のいずれか１項に記載の方法。
  103. 哺乳動物細胞株はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１０２に記載の方法。
  104. 細胞株は連続、撹拌タンクバイオリアクター培養で培養される、請求項７２～１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. 細胞株はバッチ細胞培養で培養される、請求項７２～１０３のいずれか１項に記載の方法。
  106. 抗体または抗体派生体の産生について複数の細胞株をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）請求項７２～１０５のいずれか１項に記載の方法により、複数の内の第１の細胞株によって産生された抗体または抗体派生体の量を検出すること；および
    （ｂ）請求項７２～１０５のいずれか１項に記載の方法により、複数の内の第２の細胞株によって産生された抗体または抗体派生体の量を検出すること
    を含む、前記方法。
  107. （ａ）および（ｂ）の後に：
    （ｃ）第１の細胞株によって産生された抗体または抗体派生体の量を第２の細胞株によって産生された抗体または抗体派生体の量と比較すること；および
    （ｄ）比較に基づいて、より多い量の抗体または抗体派生体を産生した細胞株を選択すること
    をさらに含む、請求項１０６に記載の方法。
  108. 請求項７２～１０５のいずれか１項に記載の方法により、第１の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出すること；および請求項７２～１０５のいずれか１項に記載の方法により第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出することをさらに含む、請求項１０６または請求項１０７に記載の方法。
  109. 第１のおよび第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を検出した後に：第１の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量を第２の細胞株によって産生された１つまたはそれ以上の重量バリアント種の量と比較すること；および比較に基づいて、１つまたはそれ以上の重量バリアント種に対して、より高い比で抗体または抗体派生体を産生した細胞株を選択することをさらに含む、請求項１０８に記載の方法。
  110. 細胞株は、１つまたはそれ以上の個々の重量バリアント種の量に対する抗体または抗体派生体の比が高いことに基づいて選択される、請求項１０９に記載の方法。
  111. 細胞株は、重量バリアント種の全体量に対する抗体または抗体派生体の比が高いことに基づいて選択される、請求項１０９に記載の方法。
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