JP2022552903A

JP2022552903A - シロシビンおよび中間体または副産物の産生方法

Info

Publication number: JP2022552903A
Application number: JP2022524586A
Authority: JP
Inventors: ジョーンズ，ジェイ．アンドリュー; アダムス，アレキサンドラ; カプラン，ニコラス
Original assignee: Miami University
Current assignee: Miami University
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2022-12-20
Also published as: WO2021086513A1; KR20220109395A; AU2020374768A1; CN115052616A; EP4051312A4; BR112022007896A2; EP4051312A1; IL292590A; CA3158505A1; US20220372494A1; MX2022004976A

Abstract

シロシビンまたはその中間体もしくは副産物の産生のための方法、原核宿主細胞、発現ベクター、およびキットが提供される。ノルベオシスチンの産生のための方法、原核宿主細胞、発現ベクター、およびキットもまた提供される。特定の実施形態では、原核宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ１９１７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｌｙｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅからなる群から選択される。【選択図】図１Ａ

Description

概略的な本発明の概念は、医療治療の分野に関し、より具体的には、シロシビンおよび中間体または副産物の産生方法、ならびにノルベオシスチンの産生方法に関する。

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／９２６，８７５号および２０２０年３月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９９０，６３３号の優先権を有し、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出される配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。２０２０年９月１７日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは３１５６９１－００００２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇという名前で３９，６５４バイトのサイズである。

いくつかの不安および精神衛生関連疾患に対する治療の可能性があるため、シロシビンへの関心は顕著である。しかしながら、薬物標的（既知の生物学的供給源からの合成および／または抽出）を得る経路決定方法の障害のため、現在、大量の薬物標的は入手できない。

最近の臨床試験の結果、シロシビン（４－ホスホリロキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリプタミン）が医薬品市場で注目されている。シロシビンの有効性は、末期がん患者の不安の治療および心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）の症状の緩和のために実証されている。最近、ＦＤＡは、抗うつ薬および認知行動療法などの現在利用可能な介入では十分に制御されていないうつ病の治療としてのシロシビンの使用に関する最初の第ＩＩｂ相臨床試験を承認した。

シロシビンは、１９５８年にスイスの化学者、ＡｌｂｅｒｔＨｏｆｆｍａｎｎによってＰｓｉｌｏｃｙｂｅｍｅｘｉｃａｎａキノコから初めて精製された。シロシビンの完全な化学合成の最初の報告は１９５９年に発表されたが、大規模な合成方法は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｉｎＴｏｋｙｏにおいて、Ｓｈｉｒｏｔａおよび同僚による２０００年代初頭まで開発されなかった。初期の合成経路よりも大幅に改善されたにもかかわらず、現在の方法は、多数の中間分離および精製ステップを伴う、退屈であり、コストがかかり、４－ヒドロキシインドールからの全体収率が４９％となり、医薬品グレードのシロシビンについて、１ｍｇ当たり２米ドルの推定コストが生じる。

シロシビンへの関心の多くは、その生合成前駆体であるノルベオシスチンおよびベオシスチンに起因する。これらの化合物は、神経伝達物質であるセロトニンと構造的に類似しており、幻覚特性の背後にあるメカニズムを理解することに興味を持っていた研究者の関心を引き起こした。１９７０年の規制物質法の実施に伴い米国でスケジュールＩ化合物と命名された後、シロシビンを含む研究は他の規制の少ない生物活性分子のために放棄されたが、この分野の専門家は、将来シロシビン含有医薬品が承認される場合はスケジュールＩＶへの再分類が適切であると提案している。

治療抵抗性うつ病に罹患している個人を対象に、薬剤としてシロシビンを用いた臨床試験が進行中である。

依然として、シロシビンおよびその中間体または副産物の産生方法の必要性が存在する。

概略的な発明概念は、シロシビンまたはその中間体もしくは副産物を産生するための方法および組成物に関するものであり、それらを企図する。

シロシビンまたはその中間体もしくは副産物を産生するための方法であって、原核宿主細胞を１つ以上の発現ベクターと接触させることであって、それぞれの発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、接触させることと、宿主細胞を培養することと、を含む、方法が提供される。特定の実施形態では、原核宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ１９１７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｌｙｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、シロシビンの中間体または副産物は、ノルベオシスチン、ベオシスチン、４－ヒドロキシトリプトファン、４－ヒドロキシトリプタミン、アエルギナシン、シロシン、ノルシロシン、または４－ヒドロキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルトリプタモニウム（４－ＯＨ－ＴＭＴ）である。いくつかの実施形態では、シロシビンの中間体は、ノルベオシスチン、ベオシスチン、４－ヒドロキシトリプトファン、または４－ヒドロキシトリプタミンである。いくつかの実施形態では、シロシビンの副産物は、アエルギナシン、シロシン、ノルシロシン、または４－ヒドロキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルトリプタモニウム（４－ＯＨ－ＴＭＴ）である。

１つ以上の発現ベクターを含む、組換え原核細胞であって、それぞれの発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、組換え原核細胞も提供される。提供されるのは、シロシビン産生に関連する少なくとも１つの遺伝子を導入するためのベクターであり、遺伝子は、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭならびにそれらの組み合わせから選択され得る。本明細書に記載の発現ベクターを含むトランスフェクションキットも提供される。

ノルベオシスチンの産生するための方法であって、原核宿主細胞を１つ以上の発現ベクターと接触させることであって、それぞれの発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、接触させることと、宿主細胞を培養することと、を含む、方法が提供される。特定の実施形態では、発現ベクターのいずれも、ｐｓｉＭを含まない。特定の実施形態では、原核宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ１９１７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｌｙｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅからなる群から選択される。

１つ以上の発現ベクターを含む、組換え原核細胞であって、それぞれの発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、組換え原核細胞も提供される。提供されるのは、シロシビン産生に関連する少なくとも１つの遺伝子を導入するためのベクターであり、遺伝子は、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせから選択され得る。本明細書に記載の発現ベクターを含むトランスフェクションキットも提供される。

ライブラリー構成および生合成経路の要約を示す。図１Ａは、高（Ｈ）、中（Ｍ）、および低（Ｌ）のコピー数を有する３つのプラスミドからなるコピー数ライブラリーを示す。図１Ｂは、高コピー数プラスミド上に単一の終結因子を有する、それぞれの遺伝子の前方のプロモーターからなる擬オペロンライブラリーを示す。図１Ｃは、高コピー数プラスミド上の３つすべての遺伝子の前に１つのプロモーターからなる基本オペロンライブラリーを示す。図１Ｄは、３つの異種酵素、ＰｓｉＤ、ＰｓｉＫ、およびＰｓｉＭからなるシロシビン生合成経路を示し、（実施例に記載されるように）セリンおよびメチオニンの黄色における培地補充物を強調する。ＰｓｉＤ：Ｌ－トリプトファンデカルボキシラーゼ；ＰｓｉＫ：キナーゼ；ＰｓｉＭ：Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）依存性Ｎ－メチルトランスフェラーゼ；ＴｒｐＢ：トリプトファンシンターゼベータサブユニット；Ｓｅｒ：セリン；Ｍｅｔ：メチオイニン；１：４－ヒドロキシインドール；２：４－ヒドロキシトリプトファン；３：４－ヒドロキシトリプタミン；４：ノルベオシスチン；５：ベオシスチン；６：シロシビン。生成を増加させるための遺伝子戦略の概要を示す。図２Ａ：定義されたコピー数ライブラリーのスクリーニング。生合成遺伝子ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭは、実施例に示されるように、高（Ｈ）、中（Ｍ）、または低（Ｌ）のいずれかのコピー数で発現された。図２Ｂ：擬オペロンライブラリーのスクリーニング。ライブラリーは、定義されたコピー数ライブラリーで以前に達成されたレベルを超えて、シロシビンを産生する能力を向上させたごく少数の変異体構築物を提供した。図２Ｃ：基本オペロンライブラリーのスクリーニング。擬オペロンライブラリーの下で、ライブラリー性能の有意な増強が観察された。図２Ｄ：オペロンライブラリーからのトップ変異体の追加のスクリーニング。オペロンライブラリー研究の上位１０個の変異体を、標準条件下で再クローニングおよび再スクリーニングに供した。オペロンライブラリークローン番号１３および番号１５（図２Ｄ）は、生成物力価の大幅な低減を示し、元のスクリーンにおいて偽陽性として識別された。オペロンクローン番号１６（ｐＰｓｉｌｏ１６、紫色）を、さらなる試験のために選択した。すべての組み合わせを、標準スクリーニング条件下で４８ウェルプレート中でスクリーニングし、ＨＰＬＣ分析を使用して定量化した。エラーバーは、複製試料の平均値から±１標準偏差を表す。＊シロシビンは検出されない。発酵条件最適化研究の要約を示す。図３Ａは、誘導点および温度スクリーニングを示す。ＩＰＴＧ誘導のタイミングは、接種後１～５時間で変化した。データは、誘導点に対する感受性の低下を示唆しているが、産生段階の温度に対する高感受性を示し、３７℃で生じる増大した産生を示している。図３Ｂは、培地、炭素源、および誘導体濃度スクリーニングを示す。グルコースを炭素源とするＡＭＭに対して有意な選好性が示された。図３Ｃは、培地の補充がシロシビン力価に及ぼす効果を示す。４－ヒドロキシインドール、セリン、メチオニンの補充物濃度の変化については、高感度が観察された。エラーバーは、複製試料の平均値から±１標準偏差を表す。スクリーニング評価およびバイオリアクタースケールアップを示す。図４Ａは、最適化の様々なステージにおける中間生成物力価および最終生成物力価の比較を示す。ステージ１－初期プルーフオブコンセプトオールハイコントロール、ステージ２－ｐＰｓｉｌｏ１６後遺伝子最適化、ステージ３－ｐＰｓｉｌｏ１６後遺伝子および発酵最適化。それぞれの追加のスクリーニングステージは、主に中間生成物の蓄積の低減を通じて、最終生成力価をさらに向上させた。４ＯＨＩｎｄ：４－ヒドロキシンドール、４ＯＨ－Ｔｒｐ：４－ヒドロキシトリプトファン、４ＯＨＴｒｍ：４－ヒドロキシトリプタミン。図４Ｂは、供給バッチバイオリアクターのスケールアップを示す。４－ヒドロキシインドール供給速度を注意深く監視することにより、すべての中間生成物の濃度を低く維持し、増殖およびシロシビン力価を改善することができる。エラーバーは、複製試料の平均値から±１標準偏差を表す。４８ウェルプレート中の初期ライブラリースクリーンからのノルベオシスチン産生を示すグラフである。非基質限定環境での生成を評価するための追加の４－ヒドロキシインドール曝露後のノルベオシスチン産生を示すグラフである。代謝産物定量に使用されるＨＰＬＣ標準曲線を示す：４－ヒドロキシインドール（図７Ａ）、５－ヒドロキシトリプトファン（図７Ｂ）、５－ヒドロキシトリプタミン（図７Ｃ）、シロシビン（図７Ｄ）。保持時間が列挙されたＨＰＬＣ法（１ｍＬ／分）の例示的なクロマトグラム（２８０ｎｍ）を示す。データは、すべての関連代謝産物の主要なピークを有するように選択された最適化されたシロシビン産生宿主からの無細胞ブロス上清の試料から得た。保持時間、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ断片化を示すＬＣ－ＭＳ法（０．２５ｍＬ／分）の例示的なクロマトグラム（２８０ｎｍ）を示す。データは、すべての関連代謝産物の主要なピークを有するように選択された最適化されたシロシビン産生宿主からの無細胞ブロス上清の試料から得た。コピー数ライブラリーにおける４－ヒドロキシトリプトファン分析を示す。４－ヒドロキシトリプトファンを５－ヒドロキシトリプトファンの標準曲線に基づいて定量化した。これは、商業的利用可能性が限定されており、真正な標準のコストが高いためである。エラーバーは、三重の試料の平均値から±１標準偏差を表す。擬オペロンライブラリーにおける４－ヒドロキシトリプトファン分析を示す。バリアントを、図２Ｂとの比較を可能にするために、シロシビン産生の減少の順序で提示する。４－ヒドロキシトリプトファンを５－ヒドロキシトリプトファンの標準曲線に基づいて定量化した。これは、商業的利用可能性が限定されており、真正な標準のコストが高いためである。基本オペロンライブラリーにおける４－ヒドロキシトリプトファン分析を示す。バリアントを、図２Ｃとの比較を可能にするために、シロシビン産生の減少の順序で提示する。４－ヒドロキシトリプトファンを５－ヒドロキシトリプトファンの標準曲線に基づいて定量化した。これは、商業的利用可能性が限定されており、真正な標準のコストが高いためである。３７℃、０～６時間におけるｐＰｓｉｌｏ１６の誘導感受性を示す。エラーバーは、二重の試料の平均値から±１標準偏差を表す。異なる誘導物質濃度でＡＭＭ－グルコース中で増殖するｐＰｓｉｌｏ１６の誘導点感受性分析を示す。エラーバーは、二重の試料の平均値から±１偏差を表す。異なる誘導物質濃度でＡＭＭ－グリセロール中で増殖するｐＰｓｉｌｏ１６の誘導点感受性分析を示す。エラーバーは、二重の試料の平均値から±１偏差を表す。異なる誘導物質濃度でＬＢ中で増殖するｐＰｓｉｌｏ１６の誘導点感受性分析を示す。エラーバーは、二重の試料の平均値から±１偏差を表す。供給バッチバイオリアクター研究のためのデータを示す。図１７Ａ：溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、温度、および攪拌速度の測定。図１７Ｂ：総累積グルコースおよび二塩基性リン酸アンモニウムを供給した。ＯＤ６００も参照用に示される。図１７Ｃ：バイオリアクタースケールアップ研究のための累積４－ヒドロキシインドール供給および４－ヒドロキシインドール供給速度の合計。供給速度は、供給された累積量の導関数を表す。図１７Ｄ：バイオリアクタースケールアップ研究のためのシロシビン産生と比較した累積４－ヒドロキシインドール供給総量。瞬間的な生成物モル収率は、約４８時間で最大モル収率６０％、スケールアップ試験の終了時に最終モル収率３８％を示す。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるノルベオシスチンの高レベル産生に関する供給バッチバイオリアクター研究のデータを示す。標的生成物、ノルベオシスチン、ならびに中間生成物、４－ヒドロキシトリプトファン、および出発基質、４－ヒドロキシインドールの瞬間的なデータを、３８時間の発酵プロセスについて示す。発酵中の４－ヒドロキシトリプトファンの蓄積を制限するために、シリンジポンプを使用して４－ヒドロキシインドールを連続的に提供した。Ｅ．ｃｏｌｉ発酵を介して産生されたノルベオシスチンの全質量スペクトルを示す。このデータは、正イオンモードでＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ質量分析計を使用して得た。測定された質量は、発酵ブロス中のノルベオシスチンの同一性をさらに確認する、５つの有意な数値に対するノルベオシスチンの実際の質量と一致する。

概略的な発明の概念は、多くの形態で実施形態の影響を受けやすいが、図面に示され、本明細書で詳細に説明されるが、本開示が概略的な発明の概念の原理の例示とみなされることを理解しながら、その特定の実施形態を説明する。したがって、概略的な発明の概念は、本明細書に例示される特定の実施形態に限定されるものではない。

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的な対象の、１または１を超えるもの（すなわち、少なくとも１）を指すために本明細書において使用される。例として、「細胞」は、１つの細胞または１つを超える細胞を意味する。

量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される「約」は、指定された値からの±５％、好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％の変動を、開示された方法を実行するためにそのような変動が適切であるときに包含することを意味する。

本明細書で使用される場合、「原核宿主細胞」という用語は、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などの影響を受けやすい原核細胞を意味する。「原核宿主細胞」という用語は、複製中に生じる変異に起因して同一ではない任意の子孫を包含する。

本明細書で使用される場合、「組換え細胞」または「組換え宿主」という用語は、細胞または宿主細胞に対して天然ではない核酸配列を含むように遺伝子改変または改変された細胞または宿主細胞を意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変は、宿主細胞のゲノム中にポリヌクレオチドを組み込むことを含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞において外因性である。

本明細書で使用される場合、シロシビンの「中間体」という用語は、シロシビンの産生または生合成における中間体、例えば、ノルベオシスチン、ベオシスチン、４－ヒドロキシトリプトファン、４－ヒドロキシトリプタミンを意味する。

本明細書で使用される場合、シロシビンの「副産物」という用語は、シロシビンの産生または生合成における副産物、例えば、アエルギナシン、シロシン、ノルシロシン、または４－ヒドロキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルトリプタモニウム（４－ＯＨ－ＴＭＴ）を意味する。

本明細書に記載される材料、組成物、および方法は、シロシビンおよび中間体または副産物の産生のための新規の経路、ならびにノルベオシスチンの産生のための方法を提供するために使用されることが意図される。

シロシビンの化学合成の進歩にもかかわらず、現在の方法論は、費用対効果の高い方法で十分な材料を提供することに苦労している。新しい進歩は、より費用対効果が高く、容易に操作された宿主を開発して、シロシビンの生合成産生へと本願出願人の興味を促進した。

Ｌ－トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＰｓｉＤ）、キナーゼ（ＰｓｉＫ）、およびＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）依存性Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（ＰｓｉＭ）をコードするＰ．ｃｕｂｅｎｓｉｓからの最近特定された遺伝子配列を、無差別の天然のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉトリプトファンシンターゼ（ＴｒｐＡＢ）とともに利用して、４－ヒドロキシインドールからのシロシビン産生が可能な生合成経路を、原核生物モデルのＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）（図１Ｄ）において発現させた。

シロシビンの大規模産生および単離のための満たされていないニーズがある。これらの制限に対処するために、以下を含む一連の３つの並列遺伝子スクリーニング方法を利用した：（１）定義された３レベルのコピー数ライブラリー、（２）ランダムな５のメンバーのオペロンライブラリー、および（３）ランダムな１２５のメンバーの擬オペロンライブラリー。転写最適化方法を使用した後、最良の株であるｐＰｓｉｌｏ１６は、発酵条件の徹底的な見直しおよび改訂を受け、４－ヒドロキシインドールから約１３９±２．７ｍｇ／Ｌのシロシビンの産生をもたらした。さらなる研究の結果、供給バッチバイオリアクターのスケールアップにより、組換え宿主からこれまでに報告された最高の力価である約１１６０ｍｇ／Ｌのシロシビンが産生された。したがって、概略的な発明の概念は、この手順による新規産生経路および新規細胞株に関する。

Ｉ．シロシビンまたはその中間体もしくは副産物の産生のための方法、ベクター、宿主細胞およびキット
方法
本明細書では、原核宿主を使用したインビボでのシロシビン産生の最初に知られている方法が提供される。さらに、概略的な発明の概念は、部分的に、高価値の化学製品のグラムスケールの産生に頂点に達する成功したスケールアップ研究を可能にするために必要な主要なプロセスパラメータを迅速に識別するために、遺伝的手段と発酵手段を介した生産の増加の間の驚くべき相乗効果に基づいている。

提供されるのは、シロシビンまたはその中間体もしくは副産物の産生方法である。方法は、宿主細胞を、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、ｐｓｉＭ、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのシロシビン産生遺伝子と接触させて、組換え細胞を形成することと、組換え細胞を培養することと、シロシビンを得ることとを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。特定の例示的な実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。

特定の実施形態では、ｐｓｉＤは、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｐｓｉＤは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＹ９８４１０１．１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｐｓｉＤは、配列番号５を含むヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列によってコードされる。

特定の実施形態では、ｐｓｉＫは、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｐｓｉＫは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＹ９８４０９９．１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｐｓｉＫは、配列番号６を含むヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列によってコードされる。

特定の実施形態では、ｐｓｉＭは、配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｐｓｉＭは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＹ９８４１００．１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｐｓｉＭは、配列番号７を含むヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列によってコードされる。

特定の実施形態では、原核細胞を、すべてがオペロン構成内の単一のプロモーターの制御下にある、ｐｓｉＤ遺伝子、ｐｓｉＫ遺伝子、およびｐｓｉＭ遺伝子を含む発現ベクターと接触させる。特定の実施形態では、原核細胞を、ｐｓｉＤ遺伝子、ｐｓｉＫ遺伝子、およびｐｓｉＭ遺伝子を含む発現ベクターと接触させ、それぞれの遺伝子が、偽オペロン構成内の別個のプロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、それぞれの遺伝子は、モノシストロン構成であり、それぞれの遺伝子は、プロモーターおよびターミネーターを有する。プロモーターおよびターミネーターの任意の構成または配置が想定される。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される。

シロシビンの任意の中間生成物または副産物は、本明細書に記載される方法のいずれかによって産生され得ることが想定される。いくつかの実施形態では、シロシビンの中間体または副産物は、ノルベオシスチン、ベオシスチン、４－ヒドロキシトリプトファン、４－ヒドロキシトリプタミン、アエルギナシン、シロシン、ノルシロシン、または４－ヒドロキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルトリプタモニウム（４－ＯＨ－ＴＭＴ）である。いくつかの実施形態では、シロシビンの中間体は、ノルベオシスチン、ベオシスチン、４－ヒドロキシトリプトファン、または４－ヒドロキシトリプタミンである。いくつかの実施形態では、シロシビンの副産物は、アエルギナシン、シロシン、ノルシロシン、または４－ヒドロキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルトリプタモニウム（４－ＯＨ－ＴＭＴ）である。

特定の実施形態では、宿主細胞が、４－ヒドロキシインドール、セリン、メチオニン、４－ヒドロキシトリプトファン、４－ヒドロキシトリプタミン、およびそれらの組み合わせからなる群から独立して選択される補充物とともに培養される。特定の例示的な実施形態では、補充物は、宿主細胞に連続的に供給される。さらなる実施形態では、宿主細胞は、能動的に増殖する培養物中で増殖する。連続供給は、出口の流れがバイオリアクターに直接接続されている一連のシリンジおよび／または蠕動ポンプを使用することによって達成される。これらの補充物添加ポンプの設定点は、それぞれ、ＵＶ－ｖｉｓ吸収およびＨＰＬＣ分析を使用して、細胞バイオマスおよび特定の代謝レベルのリアルタイム測定に応答して調整される。供給バッチ発酵プロセスは、標的代謝産物の生合成に不可欠な主要な補助因子および前駆体を再生するために、能動的に増殖および複製する細胞培養の能力を利用することによって、標的代謝産物の産生を最大化することに焦点を当てている。このプロセスは、特に、初期バイオマスを構築するために使用されなかった、人工的により高い細胞密度および／または産生培地への細胞バイオマスの遠心濃度および再構築を伴わない。産生プロセスは、低い光学密度での一晩の予備培養からの反応器の接種、続いて、高細胞密度培養に至る、産生の供給バッチ相に入る指数関数的増殖を伴う。

シロシビンおよび中間体または副産物は、発酵ブロス内で細胞外に見出される。特定の実施形態では、シロシビンおよび中間生成物または副産物は単離される。これらの標的生成物は、遠心分離後に発酵ブロスを乾燥させて細胞バイオマスを除去することによって収集することができる。得られた乾燥生成物を抽出して、標的化合物をさらに精製することができる。代替的に、生成物は、水と不混和である溶媒を使用して液体細胞培養液から抽出し、シロシビンまたは中間体もしくは副産物のいずれかを有機相に分配することができる。さらに、発酵ブロスからの汚染物質は、抽出によって除去することができ、乾燥または結晶化手順後に収集するために、水相中に、シロシビンおよび／または中間生成物または副産物を残す。

特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、約０．５～約５０ｇ／Ｌのシロシビンの力価をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、約０．５～約１０ｇ／Ｌのシロシビンの力価をもたらす。なおもさらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、約０．５～約２ｇ／Ｌのシロシビンの力価をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、約１．０～約１．２ｇ／Ｌのシロシビンの力価をもたらす。さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、約１．１６ｇ／Ｌのシロシビンの力価をもたらす。

特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、約１０％～約１００％のシロシビンのモル収率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、約２０％～約８０％のシロシビンのモル収率をもたらす。なおもさらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、約３０％～約７０％のシロシビンのモル収率をもたらす。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、約４０％～約６０％のシロシビンのモル収率をもたらす。さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、約５０％のシロシビンのモル収率をもたらす。

シロシビンまたはその中間体もしくは副産物の産生のための組換え原核細胞
１つ以上の発現ベクターを含む、組換え原核細胞であって、それぞれの発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、組換え原核細胞が提供される。

特定の実施形態では、組換え原核細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ１９１７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｌｙｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅからなる群から選択される。

発現ベクター
提供されるのは、シロシビン産生に関連する少なくとも１つの遺伝子を導入するためのベクターであり、遺伝子は、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭならびにそれらの組み合わせから選択され得る。

特定の実施形態では、発現ベクターは、すべてがオペロン構成内の単一のプロモーターの制御下にある、ｐｓｉＤ遺伝子、ｐｓｉＫ遺伝子、およびｐｓｉＭ遺伝子を含む。特定の実施形態では、発現ベクターは、ｐｓｉＤ遺伝子、ｐｓｉＫ遺伝子、およびｐｓｉＭ遺伝子を含み、それぞれの遺伝子が、偽オペロン構成内の別個のプロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、それぞれの遺伝子は、モノシストロン構成であり、それぞれの遺伝子は、プロモーターおよびターミネーターを有する。プロモーターおよびターミネーターの任意の構成または配置が想定される。

特定の実施形態では、発現ベクターは、配列番号２２の核酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、ｐＰｓｉｌｏ１６、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するベクターである。

キット
本明細書に記載の発現ベクターを含むトランスフェクションキットが提供される。そのようなキットは、例えば、バイアルまたは試験管などの１つ以上の容器手段を密閉で受容するように区画化された担持手段を含んでもよい。そのような容器手段のそれぞれは、トランスフェクションを実行するために必要な成分または成分の混合物を含む。そのようなキットは、例えば、ベクター、細胞、試薬、脂質凝集体形成化合物、トランスフェクション促進剤、または生物学的に活性な分子から選択される１つ以上の成分を含み得る。

ＩＩ．ノルベオシスチンの産生のための方法、ベクター、宿主細胞、およびキット
方法
ノルベオシスチンの産生するための方法であって、原核宿主細胞を１つ以上の発現ベクターと接触させることであって、それぞれの発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、接触させることと、宿主細胞を培養することと、を含む、方法が提供される。特定の実施形態では、発現ベクターのいずれも、ｐｓｉＭを含まない。

特定の実施形態では、原核細胞を、すべてがオペロン構成内の単一のプロモーターの制御下にある、ｐｓｉＤ遺伝子、ｐｓｉＫ遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む発現ベクターと接触させる。特定の実施形態では、原核細胞を、ｐｓｉＤ遺伝子およびｐｓｉＫ遺伝子を含む発現ベクターと接触させ、それぞれの遺伝子が、偽オペロン構成内の別個のプロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、それぞれの遺伝子は、モノシストロン構成であり、それぞれの遺伝子は、プロモーターおよびターミネーターを有する。プロモーターおよびターミネーターの任意の構成または配置が想定される。特定の実施形態では、発現ベクターのいずれも、ｐｓｉＭ遺伝子を含まない。

ノルベオシスチンは発酵ブロス中で細胞外に見出される。特定の実施形態では、ノルベオシスチンは単離される。ノルベオシスチンは、遠心分離後に発酵ブロスを乾燥させて細胞バイオマスを除去することによって収集することができる。得られた乾燥生成物を抽出して、ノルベオシスチンをさらに精製することができる。代替的に、ノルベオシスチンは、水と不混和である溶媒を使用して液体細胞培養液から抽出し、ノルベオシスチンを有機相に分配することができる。さらに、発酵ブロスからの汚染物質は、抽出によって除去することができ、乾燥または結晶化手順後に収集するために、水相中に、ノルベオシスチンを残す。

特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、約０．１～約５０ｇ／Ｌのノルベオシスチンの力価をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、約０．１～約１０ｇ／Ｌのノルベオシスチンの力価をもたらす。なおもさらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、約０．１～約２ｇ／Ｌのノルベオシスチンの力価をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、約０．１～約１．０ｇ／Ｌのノルベオシスチンの力価をもたらす。さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、約０．４～約０．８ｇ／Ｌのノルベオシスチンの力価をもたらす。さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、約０．７ｇ／Ｌのノルベオシスチンの力価をもたらす。

特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、約１０％～約１００％のノルベオシスチンのモル収率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、約２０％～約８０％のノルベオシスチンのモル収率をもたらす。なおもさらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、約３０％～約７０％のノルベオシスチンのモル収率をもたらす。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、約４０％～約６０％のノルベオシスチンのモル収率をもたらす。さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法は、約５０％のノルベオシスチンのモル収率をもたらす。

ノルベオシスチン産生のための組換え原核細胞
１つ以上の発現ベクターを含む、組換え原核細胞であって、それぞれの発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、組換え原核細胞が提供される。特定の実施形態では、発現ベクターのいずれも、ｐｓｉＭを含まない。

特定の実施形態では、原核細胞を、すべてがオペロン構成内の単一のプロモーターの制御下にある、ｐｓｉＤ遺伝子およびｐｓｉＫ遺伝子を含む発現ベクターと接触させる。特定の実施形態では、原核細胞を、ｐｓｉＤ遺伝子およびｐｓｉＫ遺伝子を含む発現ベクターと接触させ、それぞれの遺伝子が、偽オペロン構成内の別個のプロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、それぞれの遺伝子は、モノシストロン構成であり、それぞれの遺伝子は、プロモーターおよびターミネーターを有する。プロモーターおよびターミネーターの任意の構成または配置が想定される。特定の実施形態では、発現ベクターのいずれも、ｐｓｉＭ遺伝子を含まない。

発現ベクター
提供されるのは、シロシビン産生に関連する少なくとも１つの遺伝子を導入するためのベクターであり、遺伝子は、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせから選択され得る。

特定の実施形態では、発現ベクターは、配列番号２３の核酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、発現ベクターは、ｐＥＴＭ６－Ｃ４－ｐｓｉＤＫ、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するベクターである。

以下の実施例は、概略的な発明の概念に従って、シロシビンの産生を補助するための細胞の遺伝子改変のための種々の組成物および方法を記載する。

実施例１
材料および方法
細菌株、ベクター、および培地
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αを使用してすべてのプラスミドを増殖させ、ＢＬ２１ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）をすべての化学産生実験の宿主として使用した。プラスミド形質転換は、指定された標準的な電気的および化学的コンピテンシープロトコールを使用して完了した。別段の記載がない限り、Ａｎｄｒｅｗ’ｓＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（ＡＭＭ）を、一晩の増殖および産生培地の両方に使用し、一方、ルリアブロス（ＬＢ）を、クローニング中のプラスミド増殖に使用した。抗生物質のアンピシリン（８０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を、それぞれｐＥＴＭ６、ｐＡＣＭ４、およびｐＣＤＭ４由来のベクターを使用する場合に、それぞれの濃度で培地に添加した。プラスミドｐＪＦ２４、ｐＪＦ２３、およびｐＦＢ１３にそれぞれ含まれる酵素ＰｓｉＤ、ＰｓｉＫ、およびＰｓｉＭをコードする外因性経路遺伝子は、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ－ＳｃｈｉｌｌｅｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｉｎＪｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙのホフマイスターのグループから得た。

プラスミドの構築：元のｅＰａｔｈＢｒｉｃｋ発現ベクター番号４、番号５、および番号６（表２）を、プライマー１～４（表３）を用いた２ラウンドの部位特異的変異導入によって改変し、対応する「ＳＤＭ２ｘ」シリーズのベクター：番号７、番号８、および番号９（表２）を得た。この変異導入を行って、ベクター内のアイソコードマー制限酵素対ＸｍａＪＩ／ＸｂａＩの位置を入れ替えた。この変更により、費用のかかるＸｍａＪＩ制限酵素の使用を回避することによって、モノシストロン性および擬オペロン経路構成をよりコスト効率的に構築することが可能になる。次いで、この一連のベクターを使用して、定義されたコピー数ライブラリー研究番号１０～番号２７（表２）で使用されるベクターを構築した。

ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭをそれぞれ含む番号１～番号３のプラスミドを、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化をし、ゲルを抽出し、ｐＥＴＭ６－ＳＤＭ２ｘ（番号７、表２）プラスミド骨格にライゲーションし、番号１０、番号１１、および番号１２のプラスミドを得た（表２）。すべての多遺伝子発現プラスミドを、上記のように以前に発表されたｅＰａｔｈＢｒｉｃｋ方法の改変版を使用して、擬オペロン構成で構築した一方で、すべての転写ライブラリーを、標準的なｅＰａｔｈＯｐｔｉｍｉｚｅ方法を使用して構築した。

標準的なスクリーニング条件：標準的なスクリーニングは、２ｍＬの作業体積培養物中、４８ウェルプレート中で３７℃で実施した。特に明記されない限り、セリン（１ｇ／Ｌ）、４－ヒドロキシインドール（３５０ｍｇ／Ｌ）および適切な抗生物質を補充したＡＭＭを、使用した。適切な抗生物質および補充物を含むＡＭＭ中の寒天プレートまたは冷凍庫ストック培養のいずれかから、振盪３７℃インキュベーター中で１４～１６時間にわたって一晩培養した。別段の記載がない限り、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘導は、接種の４時間後に生じた。次いで、培養物を接種の２４時間後にサンプリングし、以下の分析方法に記載されるようにＨＰＬＣ分析に供した。

ライブラリーの構築：定義されたコピー数ライブラリーは、プラスミド番号７（高）、番号８（中）、および番号９（低）を使用して構築した。図２Ａに示すように、経路遺伝子は、高コピー数ベクター、中コピー数ベクター、および低コピー数ベクターのいずれかにおいて調節された。ＢＬ２１ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）産生宿主を、適切なプラスミドで形質転換し、それぞれの株が、一部が空であっても、すべての３つのベクターを有し、すべての定義されたライブラリーメンバーに同じ抗生物質耐性負荷が存在することを可能にした（図１Ａ）。複数の遺伝子が単一の発現レベルで存在した場合、プラスミドを上述のような擬オペロン構成で構築した。

５つの元の変異体Ｔ７プロモーター：Ｇ６、Ｈ９、Ｈ１０、Ｃ４、およびコンセンサスを用いて、標準的なｅＰａｔｈＯｐｔｉｍｉｚｅ方法を使用してランダムプロモーターライブラリーを組み立てた。ランダムライブラリーを、ライブラリーサイズを制限しないように、それぞれのクローニングステップで十分な数のコロニーを維持しながら、擬オペロン（図１Ｂ）および塩基性オペロン（図１Ｃ）形態で構築した。

発酵の最適化：遺伝的に優れた産生株、ｐＰｓｉｌｏ１６（番号２８、表２）が同定されると、発酵条件を最適化して、シロシビン産生をさらに増強した。様々な導入タイミングの効果を、まず標準スクリーニング条件下で調査し、次いで、細胞増殖速度に影響を及ぼすことが示されている他の条件下でさらに評価し、続いて、以下を含む最適な導入タイミングを評価した：１．基本培地同一性（ＡＭＭ、ＬＢ）、２．培地炭素源（グルコース、グリセロール）、３．産生温度（３０℃、３７℃、４０℃、４２℃）、４．誘導体濃度（１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．１ｍＭ）、５．培地補充物：セリンおよびメチオニンの濃度（０ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ）、ならびに６．４－ヒドロキシインドール基質の濃度（１５０ｍｇ／Ｌ、３５０ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ）。すべてのスクリーニングは、別段の記載がない限り、標準スクリーニング条件下で４８ウェルプレートで完了した。

スケールアップ研究：選択された生産宿主およびプロセスのスケーラビリティを実証するために、１．５Ｌ作業体積のＥｐｐｅｎｄｏｒｆＢｉｏＦｌｏ１２０バイオリアクターでスケールアップ研究を行った。円筒形容器は、液体表面下に等距離に配置された２つのラシュトン型羽根車を含む直接駆動軸によって混合された。ｐＰｓｉｌｏ１６の一晩培養物を、セリン（５ｇ／Ｌ）、メチオニン（５ｇ／Ｌ）および適切な抗生物質を補充したＡＭＭ中で３７℃で１４時間増殖させた。バイオリアクターを、２％ｖ／ｖで、約０．０９の初期ＯＤ_６００に接種した。バイオリアクターを、最初に、１５０ｍｇ／Ｌの４－ヒドロキシインドール、５ｇ／Ｌのセリン、および５ｇ／Ｌのメチオニンを補充したＡＭＭ培地（１．５Ｌ）で充填した。ヒートジャケットおよび再循環冷却水を用いて温度を３７℃で一定に保ち、１０ＭのＮａＯＨを添加してｐＨを６．５で自動的に制御し、攪拌カスケード制御（２５０～１０００ｒｐｍ）を通じて溶解酸素（ＤＯ）を飽和の２０％に維持した。完全な酸素飽和度を、３７℃、ｐＨ７．０、２５０ｒｐｍ攪拌、および標準空気３ｌｐｍの条件下で定義した。ゼロ酸素設定点は、窒素ガスフラッシュによって達成した。ＯＤ６００の測定および代謝産物分析のために定期的に試料を収集した。バイオリアクターを、接種から４時間後に１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。ＤＯスパイクによって同定されるとき、最初の２０ｇ／Ｌのグルコースが枯渇すると、５００ｇ／Ｌのグルコースと９０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）_２ＨＰＯ_４を、２．０～４．０ｍＬ／Ｌ／時の範囲の流量で供給した（図１７Ｂ）。接種から１２時間後に開始し、４－ヒドロキシインドールの連続供給を外部シリンジポンプによってバイオリアクターに供給した。４－ヒドロキシインドールの供給速度は、観察された主要な経路中間体４－ヒドロキシトリプトファンの蓄積に従って、１１～５３ｍｇ／Ｌ／時まで手動で変化させた（図１７Ｃ）。シロシビンおよびすべての中間化合物の濃度を、ＨＰＬＣを介して約４５分間の遅延で直ちに分析し、上述の供給戦略へのフィードバックとして使用した。

分析方法：試料を、等量の１００％エタノールまたは１００％脱イオン水および発酵ブロスを添加し、短時間ボルテックスし、次いで１２０００×ｇで１０分間遠心分離することによって調製した。次いで、得られた上清２μＬをＨＰＬＣまたはＬＣ－ＭＳ分析のために注射した。ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）および屈折率検出器（ＲＩＤ）を備えたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＵｌｔｉｍａｔｅ３０００高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムで解析を行った。グルコース（Ｓｉｇｍａ）、シロシビン（Ｃｅｒｉｌｌｉａｎｔ）、および４－ヒドロキシインドール（ＢｉｏＳｙｎｔｈ）について真正な標準物質を購入した。ベオシスチン、ノルベオシスチン、４－ヒドロキシトリプタミン、および４－ヒドロキシトリプトファンの標準物質は、商業的利用可能性が限定され、および真正な標準物質の１ｍｇに対して約２０００米ドルという極めて高いコストのために、類似の類似体のための標準物質を使用して定量化された。シロシビン標準曲線上でベオシスチンおよびノルベオシスチンを定量化し、一方で、４－ヒドロキシトリプタミンおよび４－ヒドロキシトリプトファンは、それぞれ、５－ヒドロキシトリプタミン（ＡｌｆａＡｅｓａｒ，ＨａｖｅｒｈｉｌｌＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）および５－ヒドロキシトリプトファン（ＡｌｆａＡｅｓａｒ，ＨａｖｅｒｈｉｌｌＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の標準曲線上で定量化された（図７）。標的代謝産物の有意な細胞内蓄積は、細胞溶解と伴っても、伴わなくても分析時に観察されなかった。細胞膜を通過する輸送は受動的であると仮定したが、本研究ではこの現象については具体的な調査は行われなかった。

３０℃で維持したＡｍｉｎｅｘＨＰＸ－８７Ｈカラム、続いて３５℃で保持した屈折率検出器（ＲＩＤ）を使用して、グルコース分析を行った。移動相は、０．６ｍＬ／分の流量で水中で５ｍＭのＨ２ＳＯ４であった。グルコースを、保持時間８．８分の標準曲線を使用して定量化した。

２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を使用して、すべての芳香族化合物を定量化した。ＡｇｉｌｅｎｔＺＯＲＢＡＸＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ－Ｃ１８分析カラム（３．０ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して分析を行った。移動相は、１ｍＬ／分の流速のいずれも０．１％のギ酸を含む、アセトニトリル（Ａ）および水（Ｂ）であり、０分で５％Ａ，０．４３分で５％Ａ、５．１５分で１９％Ａ、６．４４分で１００％Ａ、７．７３分で１００％Ａ、７．７３分で５％Ａ、９．８７分で５％Ａであった。この方法は、以下の観察された保持時間をもたらした：シロシビン（２．２分）、ベオシスチン（１．９分）、ノルベオシスチン（１．７分）、４－ヒドロキシトリプタミン（３．４分）、４－ヒドロキシトリプトファン（３．６分）、および４－ヒドロキシインドール（６．６分）。高分解能液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）および質量分析－質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）データを、上述の同じ移動相およびカラムを使用して、ＩｏｎＭａｘＥＳＩ源を装備したＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＬＴＱＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ質量分析計で測定した。流量を０．２５０ｍＬ／分に調整し、以下の勾配を有する方法を得た：０分で５％Ａ；１分で５％Ａ；２４分で１９％Ａ；３０分で１００％Ａ；３６分で１００％Ａ；３６分で５％Ａ；４６分で５％Ａ。この方法は、以下の観察された保持時間をもたらした：シロシビン（８．７分）、ベオシスチン（７．６分）、ノルベオシスチン（６．４分）、４－ヒドロキシトリプタミン（１３．３分）、４－ヒドロキシトリプトファン（１４．２分）、および４－ヒドロキシインドール（２７分）。Ｏｒｂｉｔｒａｐは、チューニングパラメータの最適化と外部キャリブレーションのために、５μｌ／分のシリンジからの直接注入を使用してポジティブモードで操作した。５－ヒドロキシトリプタミン試料を、約０．１ｍｇ／ｍＬ（５７０ｕＭ）、５０％エタノール／５０％水中でチューニングするために調製した。ＰｉｅｒｃｅＬＴＱＥＳＩＰｏｓｉｔｉｖｅＩｏｎＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎを用いて外部キャリブレーションを行い、５ｐｐｍ未満の質量精度を可能にした。

ポジティブモードにおける質量分析パラメーターは、スプレー電圧３．５ｋＶ、キャピラリー温度２７５℃、キャピラリー電圧２３Ｖおよびチューブレンズ電圧８０Ｖ（５－ヒドロキシトリプタミン上でチューニングすることにより最適化）であり、窒素シース、補助、およびスイープガスは、１５、３０、１ａ．ｕ．、６０，０００の解像度でのフルスキャンモード（ｍ／ｚ１００－５００）、および１ｅ６のＡＧＣ標的であった。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータをデータ依存的取得モードで収集し、完全なＭＳスキャンの後に、より高いエネルギー衝突解離（ＨＣＤ）による３つの最も豊富なピークの断片化が続いた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスキャンの両方について、４０の正規化された衝突エネルギー、１のデフォルト充電状態、３０ｍｓの活性化時間、および２００ｍｓｅｃの最大注入時間を使用して、３０，０００の解像度での５０の最小ｍ／ｚ、１ｅ５のＡＧＣ標的、および２００Ｋの強度閾値でＯｒｂｉｔｒａｐ内でデータを収集した。すべてのデータは、Ｘｃａｌｉｂｕｒ／ＱｕａｌＢｒｏｗｓｅｒ２．１．０ＳＰ１ｂｕｉｌｄ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して処理した。ＭＳ／ＭＳ断片化データは、図９に示す。

結果
Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓからのシロシビン産生遺伝子（ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭ）は、強力なＴ７プロモーター系を用いてＥ．ｃｏｌｉに異種発現させた。ＩＰＴＧによる誘導により、２．１９±０．０２ｍｇ／Ｌのシロシビンの産生が可能となった。化合物の同一性を確認するために、シロシビン産生宿主由来の培地を、ＴｈｅｒｍｏＯｒｂｉｔｒａｐＸＬＬＣ－ＭＳシステム上で液体クロマトグラフィー－質量分析に供した。シロシビン、ならびに生合成経路におけるすべての前駆体化合物および中間体化合物は、５ｐｐｍの質量精度よりも優れていることが同定された。次いで、試料を追加のＭＳ／ＭＳ断片化分析に供し、すべてのインドール由来中間体および最終生成物の構造的同定をさらに支持した。それぞれの場合において、脱アミノ化、脱リン酸化（該当する場合）、および両方の官能基の損失に関する断片化生成物を観察し、５ｐｐｍ質量精度よりも優れた、シロシビン、およびその中間体である４－ヒドロキシトリプトファン、４－ヒドロキシトリプタミン、ノルベオシスチン、およびベオシスチンの同定を確認した。加えて、予想される保持時間および溶出順序は、以前に公表された試みと一致した。天然トリプトファンシンターゼ（ＴｒｐＡＢ）の過剰発現も、異種産生経路を通してフラックスを押し出そうと試みて実施した。天然発現レベルは、実施されたほぼすべての発酵研究において４－ヒドロキシトリプトファンの蓄積によって支持されるように、必要な経路流束を維持するのに十分であると判定された。

定義されたコピー数ライブラリー：３つの異なるコピー数プラスミド上でそれぞれ発現される３つの異種生合成遺伝子（ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭ）からなる定義された２７のメンバーのコピー数ライブラリーを構築し、図２Ａに示すように４８ウェルプレートでスクリーニングした。ライブラリーのそれぞれのメンバーは、低（ｐＡＣＭ４－ＳＤＭ２Ｘ）、中（ｐＣＤＭ４－ＳＤＭ２ｘ）、または高（ｐＥＴＭ６－ＳＤＭ２ｘ）コピー数プラスミドにわたって広がる３つの遺伝子のそれぞれを含有した（図１Ａ）。このライブラリーのスクリーニングは、元のオールハイ構築物（２．１９±０．０２ｍｇ／Ｌ）よりもわずかな改善を実現し、４．０±０．２ｍｇ／Ｌの最終力価は、ＢＬ２１ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）発現宿主内で、ｐＥＴＭ６－ＳＤＭ２ｘベクターから発現されるｐｓｉＫ、ｐＣＤＭ４－ＳＤＭ２ｘベクターから発現されるｐｓｉＤ、およびｐＡＣＭ４－ＳＤＭ２Ｘベクターから発現されるｐｓｉＭの組み合わせで達成された。

図２Ａ～図２Ｄは、生成を増加させるための遺伝子戦略の概要を示す。

疑オペロンライブラリー：３遺伝子合成オペロンの末端に単一の終結因子を有する一方で、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭという３つの酵素コード配列のそれぞれの前に異なる変異体プロモーターを有する擬オペロンライブラリーを構築した（図１Ｂ）。この構成は、それぞれのプロモーターが、経路酵素の１、２、または３のいずれかの翻訳をコードすることができる異なるｍＲＮＡをもたらす、幅広く可変の転写風景をもたらした。この構成では、１２５の経路構成の可能なライブラリーサイズが存在し、２３１のランダムなコロニーをスクリーニングした。バリアントの大多数は、低い（３０％）または産生なし（６５％）を示したが、変異体の少数の集団は、以前に定義されたライブラリースクリーン（図２Ａ）よりも、産生における有意な改善を示した（図２Ｂ）。ＨＰＬＣデータのさらなる分析により、中間体である４－ヒドロキシトリプトファンの著しい蓄積が明らかになり、ＰｓｉＤ酵素からの機能活性の低下が、擬オペロンライブラリー内の大部分のメンバーの性能低下をもたらしたことが示唆された。

基本オペロンライブラリー：オペロン構成では、３遺伝子経路は、それぞれの遺伝子が同一のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を有する単一のプロモーターおよびターミネーターの制御下で、単一の高コピープラスミドから発現された（図１Ｃ）。ｅＰａｔｈＯｐｔｉｍｉｚｅアプローチを使用して、プロモーター配列を５つの変異Ｔ７プロモーター（Ｇ６、Ｈ９、Ｈ１０、Ｃ４、コンセンサス）のうちの１つにランダム化し、５つの潜在的なプロモーター組み合わせを含むライブラリーを得た（図２Ｃ）。５０倍近くのライブラリーサイズをスクリーニングした後、上位１０個のバリアントをさらなるスクリーニングのために選択した。これらの上位バリアントを、空のプラスミド骨格に再クローニングし、スプリアスプラスミドまたは株変異の可能性を排除するために形質転換した（図２Ｄ）。変異体番号１６（ｐＰｓｉｌｏ１６）は、その上位産生および複数の発酵にわたる高い再現性のためにさらなる調査のために選択された。配列決定結果は、ｐＰｓｉｌｏ１６が、コンセンサスＴ７配列の有効発現強度の４０％～７０％で、以前に中強度プロモーターとして特徴付けられたＨ１０変異体プロモーターを含んでいたことを明らかにした。基本的なオペロンスクリーンからの上位変異体は、定義されたコピー数ライブラリー研究からの最高の性能の変異体よりも、力価の１７倍の改善を示した。

発酵条件：ｐＰｓｉｌｏ１６を、最高のシロシビン産生、低い中間生成物の蓄積、および一貫した再現性に関して最良の株として特定した後、この株は、シロシビン産生のための最良の発酵条件を決定するための一連の実験を行った。すべての遺伝子最適化実験を、初期スクリーニングから決定した標準的な条件（材料および方法に記載されるように）下で行った。代謝工学文献における多くの研究は、Ｔ７－ｌａｃ誘導性プロモーターによって制御される経路について、誘導点における変化に対する高い感受性を示している。加えて、誘導タイミングは、細胞増殖全体に大きな影響を及ぼす可能性があり、スケールアップ時の再現可能な産生の達成に困難をもたらす可能性がある。ｐＰｓｉｌｏ１６の誘発感受性を評価すると、細胞は、誘導点に対する低感受性を示し、接種後３～４時間の誘導で最大産生を達成したことがわかった（図３Ａ）。非誘導対照において、シロシビン産生は観察されなかった。

図３Ａ～３Ｃは、発酵条件スクリーニング研究の概要を示す。

次に、基本培地、炭素源同一性、および誘導体濃度を評価した。これらの変数は、細胞増殖速度および対応する最適誘導点に影響を及し得るため、これらの変数のそれぞれを、１～６時間の誘導点の範囲にわたって評価した。図３Ｂに示すように、シロシビン産生は、培地および炭素源の選択の両方に対して非常に感受性があった（ｐ＜０．０５）。ＬＢなどのリッチ未定義培地での産生が試みられたとき、低いシロシビン産生とともに暗色の不溶性生成物が観察された。同様に、グリセロール上で増殖したときにも低生成が観察されたが、着色生成物は観察されなかった。ｐＰｓｉｌｏ１６は、ＩＰＴＧ濃度に対する中程度の感受性を示し、一連の誘導時間条件にわたって０．５および１．０ｍＭのより高い最終濃度が観察された（ｐ＜０．０５）（図３Ｂ）。この傾向は、１．０ｍＭのＩＰＴＧで実施した初期ライブラリースクリーニングに影響される可能性が高い。

また、３０℃、３７℃、４０℃、および４２℃の産生温度を、それらがシロシビン産生に及ぼす影響について評価した（図３Ａ）。誘導点の変更に対する影響を最小限に抑えるために、すべての発酵を、誘導の１時間前に産生温度にシフトされる前に、発酵の増殖段階を通して３７℃で開始した。増殖段階および産生段階の両方を通じて３７℃の等温発酵温度を維持するために有意な選好性（ｐ＜０．０５）が見られた（図３Ａ）。

発酵スクリーニングは、標的培地補充物：４－ヒドロキシインドール、セリン、およびメチオニンの効果を評価することによって完了した（図３Ｃ）。それぞれの培地補充物は、４－ヒドロキシインドール（１５０、３５０、および５００ｍｇ／Ｌ）、セリンおよびメチオニン（０、１、および５ｇ／Ｌ）の高レベル、中レベル、および低レベルで提供された。４－ヒドロキシインドールの高濃度では、細胞は、生産性の低下をもたらす細胞毒性の推定による顕著な増殖低下を示した。セリン添加は、シロシビン産生に対する最小限の効果を示したが、３５０ｍｇ／Ｌを超える４－ヒドロキシインドールの存在下でのメチオニン添加は、シロシビン力価の有意な増強をもたらした（ｐ＜０．０５）。同定された最適なスクリーニング条件下で、シロシビンは１３９±２．７ｍｇ／Ｌで産生され、遺伝的および発酵最適化の相乗的努力を通じて６３倍の改善を表した。

スケールアップ：ｐＰｓｉｌｏ１６株の好ましい産生条件を同定した後、材料および方法に記載されているように、供給バッチスケールアップ研究を完了した。この研究は、４８ウェルプレートにおける上位条件スクリーニングケースより８．３倍の改善、および元の構築物より５２８倍の改善を表す、１．１６ｇ／Ｌのシロシビンの産生をもたらした。前駆体および中間生成物の力価は、発酵全体を通して低いままであり、培養物が３５の最終的なＯＤ_６００を達成することを可能にした（図４Ｂ）。基質供給速度を試料採取から４５分以内に特定の経路ボトルネック流束に合わせることを可能にするＨＰＬＣ情報供給戦略を使用することによって、経路中間体濃度を低レベルに維持した。これにより、主要な経路中間体４－ヒドロキシトリプトファンの振動濃度プロファイルが得られた（図４Ｂ）。最初の２０ｇ／Ｌのグルコースを、２５時間後に培地から完全に消費し、次いで、培養物が、グルコースの生成物収率を最大化するために、培地中の低残存糖含有量で堅牢な増殖を維持するように、外部的に供給した。

高質量精度ＬＣ－ＭＳの使用により、シロシビンおよびすべての経路中間体の産生を確認した（図９）。不完全な経路（すなわち、ｐｓｉＤＭおよびｐｓｉＤＫ）を含む株からの発酵ブロスのＨＰＬＣ分析は、合成経路における特定の生合成ステップの順序を識別することを目的とした以前の研究の結論と一致した。

遺伝的に優れた変異体を同定するために、複数の遺伝子スクリーニング方法を並行して利用した。コピー数ベースのアプローチから始まり、３個の個別のコピー数でそれぞれ異なる３個の経路遺伝子の２７のメンバーのライブラリーを構築した（図２Ａ）。提示された３つの遺伝子最適化スクリーニングのうち、この方法は構築するのに最も面倒であり、それぞれのプラスミドを独立してクローニングし、スクリーニング前に検証する必要があった。この定義されたライブラリーアプローチはまた、最小生成物力価をもたらし、最良の変異体は、オールハイ初期構築物よりも小さいが統計学的に有意な改善を示した（ｐ＜０．０５）。理論に拘束されることを望むものではないが、このアプローチからの限られた力価改善は、３つの独立したプラスミドの選択および増殖に関連する代謝負荷の増加に起因し得る。

続いて、基本的なオペロン（図２Ｃ）および擬オペロン（図２Ｂ）構成における経路遺伝子を有する２つの独立した単一プラスミド転写多様性プロモーターライブラリーのスクリーニングにより、初期コピー数ライブラリーよりもかなり改善された結果が得られた。それぞれの場合において、ライブラリーを、中スループットＨＰＬＣベースのスクリーニングを使用してスクリーニングした。これらの転写的に変化するライブラリーのそれぞれを、高コピーｐＥＴＭ６プラスミドベクターを使用して構築した。これにより、広範囲の発現レベルをスクリーニングすることができ、結果として、シロシビン転写風景のカバレッジが大きくなった。擬オペロンライブラリースクリーニングは、変異体の大部分（約９５％）が、シロシビン産生が低いかまたは全く示さなかったことを実証した。この広範囲にわたる不十分な性能の理由は不明であるが、先行経路設計の現在の予測力がほとんどの用途でまだ不足しているため、遺伝的に優れた変異体を同定するためのバリアントスクリーニングと組み合わせたランダムライブラリーの使用を動機づけている。驚くべきことに、この研究において、単純な基本的なオペロン経路設計は、最高の力価のシロシビン産生をもたらした。これは、わずか５個の変異体の最小のライブラリーサイズと組み合わされ、理論的ライブラリーサイズの数倍迅速なスクリーニングを可能にし、結果として、完全な転写風景の完全なカバレッジの高い信頼性をもたらした。オペロンライブラリースクリーンから上位変異体を再クローニングおよび再スクリーニングすると、図２Ｄに示すように、いくつかの偽陽性が同定された。これらの偽陽性変異体のエラーの発生源は、偽陽性率が試験設計に許容可能なレベルにあったため、調査しなかった。

発酵条件の慎重な最適化によって、力価および収率のさらなる増加を達成した（図３Ａ～３Ｃ）。遺伝的に優れた株であるｐＰｓｉｌｏ１６は、他のアミノ酸由来の高価生成物と比較して誘導タイミングに対する感受性が低かったが、これは発酵培地に４－ヒドロキシインドールおよびセリンの両方を補充し、アミノ酸代謝による高い流束の必要性を低減したことにも起因する可能性がある。したがって、すべての追加の発酵最適化実験を、様々な誘導時間の範囲で行った。接種後４時間の最適誘導からの変動はほとんど観察されず、誘導タイミングに対する感受性の低下の観察を強化した。

シロシビン産生宿主は、培地組成物、炭素源の同一性、発酵温度、および誘導体濃度に対して高い感受性を示した（図３Ａ～３Ｂ）。それぞれの場合において、この好ましいレベルは、標準的なスクリーニング条件のものと同様であった。これは偶然ではない可能性が高い。なぜなら、いくつかの基本的な初期スクリーニングは、本発明者らの原理証明の株が最良のパフォーマンスを発揮する条件を特定するために実施されたからである。さらに、初期の遺伝子スクリーニング研究は、標準的なスクリーニング条件下で実施し、試験条件下では、最高の性能を有する変異体についても自己選択した。

この研究の発酵最適化態様における最大の利得は、培地補充研究を通じて達成された（図３Ｃ）。この研究では、４－ヒドロキシインドール、セリン、およびメチオニンの濃度を変化させた。これらの補充物は、シロシビン産生経路に対する直接的効果のために特異的に選択された（図１Ｄ）。４－ヒドロキシインドールおよびセリンは、経路の第１の専用ステップにおいてＴｒｐＡＢによって縮合されて、中間体４－ヒドロキシトリプトファンを形成する。Ｅ．ｃｏｌｉは天然にセリンおよびインドールを産生することができるが、インドールを４－ヒドロキシインドールに酸化するＰ４５０ヒドロキシラーゼを発現する能力を欠く。さらに、本発明者らの操作された経路を通る高い流束では、セリンの細胞供給が速やかに枯渇し、経路流束を制限しないための追加の補充が必要であるという仮説が立てられた。最後に、メチオニンを補充して、活性化されたメチルドナーであるＳＡＭの細胞間プールを増強した。最後の２つの生合成ステップは、いずれもＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼ（ＰｓｉＭ）によって触媒される。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳＡＭ依存性メチル化を用いた以前の研究では、最終生成物へのＳＡＭ制限流束が記録されている。

中間生成物濃度の分析を実施して、それぞれの研究の成功を評価した。初期の原理証明の「オールハイ」株（ステージ１）と、遺伝子最適化後（ステージ２）および遺伝子および発酵最適化後（ステージ３）との両方の上位産生株との間の比較を提示する（図４Ａ）。それぞれの追加の最適化ステージは、中間生成物濃度の低減によって達成された、さらなる増強されたシロシビン力価、および最終生成物への一般的に増強された流束をもたらした。

遺伝子および発酵最適化研究から得られた情報は、供給バッチバイオリアクターにおけるシロシビンの産生のためのスケールアップ研究に適用された。この研究では、温度、誘導体濃度、および誘導タイミングなどの最適化パラメーターの多くは、以前に最適化されたように適用された。補充物添加研究からの情報を使用したが、２ｍＬのバッチ研究からの修正を加えて適用した。供給バッチ研究では、増強された細胞増殖に起因するより高い細胞需要を考慮して、セリンおよびメチオニンの両方を５ｇ／Ｌの高レベルで補充した。さらに、小規模研究では、４－ヒドロキシインドールおよび４－ヒドロキシトリプトファンのより高い濃度で増殖欠損が観察された。これに対抗するために、低量の４－ヒドロキシインドール（１５０ｍｇ／Ｌ）を最初に培地に添加し、４０ｍｇ／ｍＬの４－ヒドロキシインドール溶液を含む低流量のシリンジポンプを接続して、ゆっくりと外部補充した。最適な供給速度を決定するために、発酵ブロスの頻繁なＨＰＬＣ分析によって、ボトルネック点であるＰｓｉＤを通る経路流束を推定した。４－ヒドロキシトリプトファン力価が低下するにつれて、４－ヒドロキシインドールの流束を増加させて、高い流束需要を満たし、逆も同様であった。この戦略は、４－ヒドロキシトリプトファンの振動濃度プロファイルをもたらし、すべての中間体を低レベルで維持し、堅牢かつ伸長した増殖およびシロシビン産生を可能にした（図４Ｂ）。

小規模なバッチ発酵研究では、上に提示された作業は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ宿主において以前に提示されたものと同様の力価のシロシビンをもたらした。これは、細菌宿主および真菌宿主の両方が、この重要な化学物質の生産プラットフォームとしての可能性を示すことを示す。しかしながら、供給バッチ反応器にスケールアップすると、本発明者らの細菌宿主は、大幅に増強されたシロシビン産生を示し、以前に発表された結果よりも１０倍の増強をもたらした。

原核生物における効果的なシロシビン産生の最初の例、および任意の界由来の組換え宿主からのこれまでの最高のシロシビン力価が提供される。これは、小規模での遺伝子産生および発酵産生の増加の組み合わせ、および独自のＨＰＬＣ情報基質供給戦略を利用したスケールアップされた供給バッチ研究によって達成された。供給バッチ研究は、４－ヒドロキシインドール基質からの最大モル収率および最終モル収率がそれぞれ０．６０および０．３８ｍｏｌ／ｍｏｌで、１．１６ｇ／Ｌのシロシビン力価をもたらした（図１７Ｄ）。

実施例２：ノルベオシスチンの産生
材料および方法
様々な強度の５つのＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーター変異体（Ｇ６、Ｈ９、Ｈ１０、Ｃ４、およびコンセンサス）からなる転写ライブラリーを、ノルベオシスチン産生が可能な２つの独立してプールされたライブラリー：ｐＥＴＭ６－ｘｘ５－ｐｓｉＤＫ（オペロン形態、５メンバー）およびｐＥＴＭ６－ｘｘ５－ｐｓｉＤ－ｘｘ５－ｐｓｉＤＫ（偽オペロン形態、２５メンバー）を構築するために使用した。これらのライブラリーを、上で考察したシロシビン産生プラスミドライブラリーの構築に使用したものに類似した標準的な分子クローニングおよびｅＰａｔｈＯｐｔｉｍｉｚｅ技法を使用して構築した。次いで、プラスミドＤＮＡライブラリーを産生宿主株ＢＬ２１Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）に形質転換し、４８ウェルプレート中の培地スループット発酵アッセイでスクリーニングした。２０ｇ／Ｌのグルコース、３５０ｍｇ／Ｌの４－ヒドロキシインドール、および１ｇ／Ｌのセリンを補充したＡｎｄｒｅｗ’ｓＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（ＡＭＭ）を微生物増殖培地として使用し、本明細書の他の箇所に記載されるように発酵スクリーニングおよびＨＰＬＣ試料調製を行った。Ａｎｄｒｅｗ’ｓＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（ＡＭＭ）は、３．５ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、５．０ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、３．５ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、２ｇ／Ｌのカサミノ酸、１００ｍＬの１０×ＭＯＰＳＭｉｘ、１ｍＬの１ＭのＭｇＳＯ_４、０．１ｍＬの１ＭのＣａＣｌ_２、１ｍＬの０．５ｇ／ＬのチアミンＨＣＬを含む、２０ｇ／Ｌグルコースを補充した、リッチな半定義培地である。１０×ＭＯＰＳＭｉｘは、８３．７２ｇ／ＬのＭＯＰＳ、７．１７ｇ／Ｌのトリシン、２８ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２９．２ｇ／ＬのＮａＣｌ、５．１ｇ／ＬのＮＨ_４Ｃｌ、１．１ｇ／ＬのＭｇＣｌ_２、０．４８ｇ／ＬのＫ_２ＳＯ_４、０．２ｍＬの微量栄養素ストックから構成された。微量栄養ストックは、０．１８ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２４、１．２４ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３、０．１２ｇ／ＬのＣｕＳＯ_４、０．８ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２、０．１４ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４からなった。

すべてのノルベオシスチン力価は、市販されている分析標準物質が不足しているため、シロシビン標準曲線を使用して定量化された。

オペロンおよび擬オペロンライブラリーの両方からの上位変異体の同定に際して、プラスミドを精製し、プラスミド貯蔵株であるＤＨ５α中で再形質転換した。単一のＤＨ５αコロニーを一晩増殖させ、プラスミドを精製し、ＢＬ２１Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）に再形質転換して追加のスクリーニングを行い、外因性経路遺伝子、ｐｓｉＤおよびｐｓｉＫの転写を制御する変異体プロモーターを識別するために配列決定した。再形質転換した産生株を、初期スクリーニングのものと同一の追加のスクリーニングに供し、接種の約２４時間後に追加の３５０ｍｇ／Ｌの４－ヒドロキシインドールを添加した。ＨＰＬＣ分析のための最終試料を接種から４８時間後に採取した。

結果
最初のスクリーニングは、オペロンおよび擬オペロンの両方のライブラリーにおける様々な産生レベルをもたらした。オペロンからの４７個のランダム変異体および擬オペロンライブラリーからの１４３個のランダム変異体をスクリーニングした。これは、それぞれのライブラリーサイズの９．４倍および５．７倍を表す。両方のライブラリーからの上位変異体は、４－ヒドロキシインドールの完全な消費、４－ヒドロキシトリプトファンのエンドポイントの蓄積なしを示し、約４００ｍｇ／Ｌのノルベオシスチンを産生した（図５）。これは、上位変異体におけるノルベオシスチンの産生が、同様の条件下で最適化されたｐＰｓｉｌｏ１６変異体からのシロシビンの産生よりも約４００％高いため、有意な観察である。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、メチルドナーであるＳＡＭの再生が、シロシビン産生事例において制限される可能性が高いことを示し、このボトルネックを緩和することを目的としたさらなる研究の必要性を支持する。

追加の試験および配列決定のために、この初期スクリーニングから、様々な産生レベルの７つの変異体を選択した（表１）。配列決定結果は、オペロンおよび擬オペロンライブラリーに由来する上位産生変異体の両方において、強い変異体プロモーターであるＣ４によって制御される外因性経路を有する上位産生株の興味深い傾向を明らかにした。データはまた、ノルベオシスチン産生の低下をもたらす強度低下プロモーターの傾向を支持する。これは、同様に実施したシロシビン産生作業とは対照的であり、中程度の強度の変異体プロモーターであるＨ１０からの最高の性能をもたらした。さらに、別のトリプトファン誘導化合物であるビオラシンの産生は、弱化プロモーターが強力なプロモーターよりも有意に多くの生成物を産生することを発見した。総合すると、このデータは、ノルベオシスチンの生物学的産生のための自明ではない興味深い解決策の発見を支持する。

選択した変異体を、プラスミド再形質転換後にさらにスクリーニングして、ノルベオシスチン産生能力を確認した。加えて、すべての選択された変異体に、非基質限定環境におけるそれらの産生をさらに評価するための追加の４－ヒドロキシインドールを与えた（図６、右）。再スクリーニング時に、変異体は、上位変異体であるＯ－Ｈ１との高力価産生を維持し、産生が４００ｍｇ／Ｌ未満であることを示した。接種約２４時間後に４－ヒドロキシインドール基質を追加で３５０ｍｇ／Ｌ添加すると、４８ウェルプレート発酵アッセイにおいて、最良の産生変異体Ｏ－Ｈ１の全体的な力価が０．５ｇ／Ｌを超えるノルベオシスチンに有意に（ｐ＜０．０５）増強された。

実施例３：ノルベオシスチンの産生の最適化
材料および方法
ライブラリースクリーニングから同定した上位のノルベオシスチン産生株、Ｏ－Ｈ１（表１）を、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＢｉｏＦＬＯ１２０システムによって制御される１．５Ｌの作業容量のバイオリアクターにおいてスケールアップスクリーニングに供した。このバイオリアクターシステムを、上述のように、シロシビンスケールアップスタディについて操作した（実施例１）。

ノルベオシスチンを、市販の分析標準物質が不足しているため、シロシビン標準曲線を用いて上述のように定量化した。ノルベオシスチン同一性を、正確な質量のＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ分光計を使用して検証した（図１９）。測定された質量は、６．２ｐｐｍの許容誤差をもたらした。

結果
供給バッチバイオリアクター研究の経過にわたって、シロシビンおよび他の主要な中間体の濃度を追跡した。このＨＰＬＣ分析の結果を図１８に示す。図は、中間生成物、４－ヒドロキシトリプトファン、および４－ヒドロキシインドール基質が、発酵を通じて阻害レベル未満に維持されたことを示す。これは、頻繁なサンプリングおよび分析と組み合わせたＨＰＬＣ情報提供戦略を使用することによって達成した。この研究は、３２時間にわたって７００ｍｇ／Ｌのノルベオシスチンの産生をもたらした。これは、原核宿主からのノルベオシスチン産生の最初の報告例である。

参考文献
Ｆｒｉｃｋｅ，Ｊ．，Ｂｌｅｉ，Ｆ．，Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ，Ｄ．，２０１７．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｓｉｌｏｃｙｂｉｎ．Ａｎｇｅｗ．ＣｈｅｍｉｅＩｎｔ．Ｅｄ．５６，１２３５２－１２３５５．（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ａｎｉｅ．２０１７０５４８９）

Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ａｎｄｒｅｗ，Ｖｅｒｎａｃｃｈｉｏ，Ｖ．Ｒ．，Ｌａｃｈａｎｃｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｌｅｂｏｖｉｃｈ，Ｍ．，Ｆｕ，Ｌ．，Ｓｈｉｒｋｅ，Ａ．Ｎ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｖ．Ｌ．，Ｃｒｅｓｓ，Ｂ．，Ｌｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．，Ｋｏｆｆａｓ，Ｍ．Ａ．Ｇ．，２０１５．ｅＰａｔｈＯｐｔｉｍｉｚｅ：ａｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｂａｌａｎｃｉｎｇｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｓ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５，１１３０１（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓｒｅｐ１１３０１）

Ｘｕ，Ｐ．，Ｖａｎｓｉｒｉ，Ａ．，Ｂｈａｎ，Ｎ．，Ｋｏｆｆａｓ，Ｍ．Ａ．Ｇ．，２０１２．ｅＰａｔｈＢｒｉｃｋ：ＡｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｌｏｇｙｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｓｉｎＥ．ｃｏｌｉ．Ｂｉｏｌ１，２５６－２６６．（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｓｂ３０００１６ｂ）

本明細書において参照されるすべての刊行物および特許は、参照により援用される。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、記載される対象の様々な修正および変形は、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求される本発明は、これらの実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための様々な修正は、当業者には明らかであり、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims

シロシビンまたはその中間体もしくは副産物の産生方法であって、
原核宿主細胞を１つ以上の発現ベクターと接触させることであって、それぞれの発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、接触させることと、
前記宿主細胞を培養することと、を含む、方法。
前記ｐｓｉＤが、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記ｐｓｉＫが、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記ｐｓｉＭが、配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記原核細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ１９１７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｌｙｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記原核細胞を、すべてがオペロン構成内の単一のプロモーターの制御下にある、ｐｓｉＤ遺伝子、ｐｓｉＫ遺伝子、およびｐｓｉＭ遺伝子を含む発現ベクターと接触させる、請求項１に記載の方法。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
前記原核細胞を、ｐｓｉＤ遺伝子、ｐｓｉＫ遺伝子、およびｐｓｉＭ遺伝子を含む発現ベクターと接触させ、それぞれの遺伝子が、偽オペロン構成内の別個のプロモーターの制御下にある、請求項１に記載の方法。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
前記シロシビンの中間体または副産物が、ノルベオシスチン、ベオシスチン、４－ヒドロキシトリプトファン、４－ヒドロキシトリプタミン、アエルギナシン、シロシン、ノルシロシン、または４－ヒドロキシ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルトリプタモニウム（４－ＯＨ－ＴＭＴ）である、請求項１に記載の方法。
前記宿主細胞が、４－ヒドロキシインドール、セリン、メチオニン、およびそれらの組み合わせからなる群から独立して選択される補充物とともに培養される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記補充物が、前記宿主細胞に連続的に供給される、請求項１１に記載の方法。
前記宿主細胞が、活発に増殖する培養物中で増殖する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
１つ以上の発現ベクターを含む、組換え原核細胞であって、それぞれの発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびｐｓｉＭ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、組換え原核細胞。
前記ｐｓｉＤが、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１４に記載の組換え原核細胞。
前記ｐｓｉＫが、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１４に記載の組換え原核細胞。
前記ｐｓｉＭが、配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１４に記載の組換え原核細胞。
前記原核細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ１９１７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｌｙｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅからなる群から選択される、請求項１４に記載の組換え原核細胞。
前記発現ベクターが、すべてがオペロン構成内の単一のプロモーターの制御下にある、ｐｓｉＤ遺伝子、ｐｓｉＫ遺伝子、およびｐｓｉＭ遺伝子を含む、請求項１４に記載の組換え原核細胞。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項１９に記載の組換え原核細胞。
前記発現ベクターが、ｐｓｉＤ遺伝子、ｐｓｉＫ遺伝子、およびｐｓｉＭ遺伝子を含み、それぞれの遺伝子が、偽オペロン構成内の別個のプロモーターの制御下にある、請求項１４に記載の組換え原核細胞。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項２１に記載の組換え原核細胞。
すべてがオペロン構成内の単一のプロモーターの制御下にある、ｐｓｉＤ遺伝子、ｐｓｉＫ遺伝子、およびｐｓｉＭ遺伝子を含む発現ベクター。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項２３に記載の発現ベクター。
ｐｓｉＤ遺伝子、ｐｓｉＫ遺伝子、およびｐｓｉＭ遺伝子を含む発現ベクターであって、それぞれの遺伝子が、偽オペロン構成内の別個のプロモーターの制御下にある、発現ベクター。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項２３に記載の発現ベクター。
請求項２３に記載の発現ベクターを含む、トランスフェクションキット。
ノルベオシスチンの産生方法であって、
原核宿主細胞を１つ以上の発現ベクターと接触させることであって、それぞれの発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、接触させることと、
前記宿主細胞を培養することと、を含む、方法。
前記ｐｓｉＤが、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２８に記載の方法。
前記ｐｓｉＫが、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２８に記載の方法。
前記原核細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ１９１７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｌｙｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
前記原核細胞を、すべてがオペロン構成内の単一のプロモーターの制御下にある、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む発現ベクターと接触させる、請求項２８に記載の方法。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
前記原核細胞を、ｐｓｉＤ遺伝子およびｐｓｉＫ遺伝子を含む発現ベクターと接触させ、それぞれの遺伝子が、偽オペロン構成内の別個のプロモーターの制御下にある、請求項２８に記載の方法。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
前記宿主細胞が、４－ヒドロキシインドール、セリン、メチオニン、およびそれらの組み合わせからなる群から独立して選択される補充物とともに培養される、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の方法。
前記補充物が、前記宿主細胞に連続的に供給される、請求項３６に記載の方法。
前記宿主細胞が、活発に増殖する培養物中で増殖する、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の方法。
１つ以上の発現ベクターを含む、組換え原核細胞であって、それぞれの発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、組換え原核細胞。
前記ｐｓｉＤが、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３９に記載の組換え原核細胞。
前記ｐｓｉＫが、配列番号９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３９に記載の組換え原核細胞。
前記原核細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ１９１７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｌｙｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｅｎｅｚｕｅｌａｅからなる群から選択される、請求項３９に記載の組換え原核細胞。
前記発現ベクターが、すべてがオペロン構成内の単一のプロモーターの制御下にある、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、請求項３９に記載の組換え原核細胞。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項４３に記載の組換え原核細胞。
前記発現ベクターが、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含み、それぞれの遺伝子が、偽オペロン構成内の別個のプロモーターの制御下にある、請求項３９に記載の組換え原核細胞。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項４５に記載の組換え原核細胞。
すべてがオペロン構成内の単一のプロモーターの制御下にある、ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含む、発現ベクター。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項４７に記載の発現ベクター。
ｐｓｉＤ、ｐｓｉＫ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるシロシビン産生遺伝子を含み、それぞれの遺伝子が、偽オペロン構成内の別個のプロモーターの制御下にある、発現ベクター。
前記プロモーターが、Ｇ６変異体Ｔ７、Ｈ９変異体Ｔ７、Ｈ１０変異体Ｔ７、Ｃ４変異体Ｔ７、コンセンサスＴ７、Ｌａｃ、ＬａｃＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、ＧＡＰ、およびｘｙｌＡプロモーターからなる群から選択される、請求項４９に記載の発現ベクター。
請求項４９に記載の発現ベクターを含む、トランスフェクションキット。