JP2022552775A - 音響プロセスで使用する粒子 - Google Patents

Abstract

様々な構成で使用される様々な物質で作られたマイクロ粒子及びナノ粒子が開示されている。前記粒子は、脂質コーティングを施したパーフルオロカーボン液滴であってもよい。前記粒子は、音響細胞選択プロセスで使用してもよい。前記液滴は音響応答性が高く、音響場によって流体の流れに逆らって保持されることができる。このような粒子は、システムの分離、隔離、分化、改変又はろ過に使用することができる。

Description

背景
音響泳動とは、少なくとも部分的に、音響定在波や音響進行波などの音響を使用して物質を分離することをいう。音響コントラスト因子（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｆａｃｔｏｒ）としても知られている音響によって影響を受ける可能性のある密度及び／又は圧縮率を含むパラメータが、粒子と流体との間で差がある場合、定在波又は進行波を含む音響波は流体内の粒子に力を及ぼすことができる。定在波の圧力プロファイルには、定在波の節（ｎｏｄｅｓ）で圧力振幅が減少した領域と、定在波の腹（ａｎｔｉ－ｎｏｄｅｓ）で圧力振幅が増加した領域とを含む。粒子は、例えば、その密度及び圧縮率に応じて、定在波の節又は腹に駆動される。一般的に、音響定在波の周波数が高いほど、操作できる粒子は小さくなる。

マイクロスケールでは、例えばマイクロメートルのオーダーの構造寸法で、従来の音響泳動システムは、幅の寸法が半波長又は１／４波長の音響チャンバを使用する。これは、数メガヘルツの周波数では通常、厚さが１ミリメートル未満であり、非常に低い流量率（μＬ／ｍｉｎなど）で動作する。このようなシステムは、レイノルズ数が非常に低く、層流での動作であり、流体力学的最適化が最小限であるため、スケーラブルではない。

マクロスケールでは、平面音響定在波が分離プロセスで使用されてきた。しかしながら、単一の平面波は、粒子又は二次流体を捕捉する傾向があるため、一次流体からの分離は、平面定在波をオフにするか又は除去することによって達成される。平面波はまた、平面波の生成に関与する流体へのエネルギー散逸と平面波エネルギー自体によって、波が伝播する媒体を加熱する傾向がある。平面定在波の除去は、連続動作を妨げる可能性がある。また、音響平面定在波を生成するために使用される電力量は、廃棄エネルギーを通して一次流体を加熱する傾向があり、これは、処理される物質にとって不利になる可能性がある。

細胞の選択又は分離は、標的の細胞又は細胞物質に親和性のある機能化ビーズを提供することによって達成される。ビーズは、通常、他の細胞又は細胞物質を含む流体からの分離を可能にする特性を有する。１つのアプローチでは、磁場を使用してビーズを分離することができる強磁性特性を有するビーズを使用する。

生命科学の研究と治療では、細胞は分離又は単離などの目的で操作されることが求められる。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、特定の種類の癌の治療法として開発された。ＣＡＲ Ｔ－細胞療法は、磁力、電力、重力、微小流体技術などに基づく様々な技術を使用して、細胞集団から改変された細胞を単離する治療法として開発されてきた。一部の用途では、対象の細胞（ポジティブ選択）は、特定の細胞に親和性を持つ機能化されたビーズなどの粒子に結合される。細胞とビーズの複合体は、ビーズに影響を及ぼすことができる力にさらされる。例えば、細胞と磁性粒子の複合体は、その細胞と磁性粒子の複合体が混合される他の物質から複合体を分離できるように磁性粒子に影響を及ぼす磁力にさらすことができる。細胞のポジティブ選択の場合、細胞と磁性粒子の複合体又は標的物質は磁力によって保持されることができるが、他の非標的物質は保持されない。細胞のネガティブ選択の場合、標的細胞以外の物質はビーズに結合しているので、標的細胞は磁力によって保持されず、従って他の物質から分離することができる。

力のモダリティ（ｍｏｄａｌｉｔｙ）を使用して細胞物質を分離する目的は、高い純度を得て、所望の細胞の回収率を高めることである。利用可能な技術には、これらのプロセスをスケールアップすることが困難又は非現実的であるという課題がある。更に、いくつかの技術は、細胞の健全性に有害な影響を与えることが知られている。例えば、ある技術では、磁気ビーズを使用して、他の種類の細胞であることが多い他の物質から所望の細胞を分離する。この方法では、細胞と細胞磁気ビーズの複合体の混合物が、直径１ｍｍ未満の非常に狭いカラム又はチャネルを通過し、カラム内のビーズが強い磁場にさらされる。チャネルのサイズは比較的小さいため、自由に流れる細胞は非常に高いせん断力にさらされ、細胞に損傷を与えたり、細胞の健全性に悪影響を及ぼしたりする可能性がある。強い磁場にさらされることによってカラムの壁に保持される細胞及びビーズの複合体は、通常、カラム内の流れの方向に垂直な高い磁力のために、更に高いせん断応力にさらされる。このアプローチのもう１つの欠点は、流量率が大幅に制限されることであり、これにより、処理時間が長くなり、技術をスケールアップする能力が制限される。更に、そのような技術の１つは、ナノメートルサイズの磁気ビーズを使用するが、この磁気ビーズは、細胞に内在化される可能性があり、細胞治療処置に問題となる可能性がある。

本書の様々な例において、細胞物質に結合され、音響場によって影響を受けることができる音響応答性粒子についての物質及び方法が開示される。特定の細胞タイプ又は細胞物質に連結するように粒子を機能化することが例として挙げられる、粒子の製造のための物質及び方法が開示される。本書で使用される場合、「粒子」という用語は、一般に、「ビーズ」及び／又は「液滴」という用語と互換可能に使用されてもよい。粒子は音響泳動デバイス内に置かれ、超音波音響トランスデューサを使用して、必要に応じて粒子を阻止、集中、捕捉、移動、及び／又は、一般的に操作することができる音響場を生成する。

本書で説明するように、マイクロメートル又はナノメートルの範囲の粒子は、進行波及び／又は定在波を含む超音波音響波を介して生成されることができる音響場で操作される。音響場は粒子に影響を与え、阻止、捕捉、集中、輸送、及び／又は、音響場が粒子に課すことができる他の種類の操作を達成する。粒子に対する音響場の影響は、流体力学や素粒子物理学によって高められるようにしてもよい。例えば、音響場を使用して特定の領域に粒子を集中させ、圧力差が形成される境界条件を生成されるようにしてもよい。そのような圧力差は、音響場によって発生する集中又は分離の効果を高めることができる。

本書で説明する粒子は、細胞の単離に使用されてもよい。例えば、粒子は、ＣＡＲ Ｔ細胞治療用途のＴ細胞又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ－細胞の単離に使用されてもよい。粒子はまた、例えば、遺伝子組み換えされたＣＤ３４＋細胞治療など、他の種類の細胞及び遺伝子治療用途に使用されてもよい。

いくつかの実装例では、ビーズは、脂質コーティングを施したパーフルオロカーボン液滴で構成される。ビーズは、脂質化合物を調製し、パーフルオロカーボンを脂質化合物と組み合わせ、その組み合わせ物を攪拌することによって製造される。いくつかの例では、ビーズを得るために、前記組み合わせ物の遠心分離を用いた攪拌を行ってもよい。ビーズは、他の細胞又は細胞物質も引き入れられた流体の中で所望の細胞にビーズを結合することができる親和性又は結合を有するようにビーズを機能化することによって、当該ビーズを細胞選択プロセスで使用してもよい。ビーズと細胞の複合体が音響場にさらされることで、前記複合体が特定の領域に保持されるなど、前記複合体が操作される。

粒子は、液体コアと液体コアをカプセル化する脂質シェルとを含むように構成してもよい。液体コア内の液体は、パーフルオロカーボンで構成してもよい。パーフルオロカーボンは、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロオクタン、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロジクロロオクタン、又は、パーフルオロデカリンであってもよい。

脂質シェルは、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－パルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、脂質－ポリエチレングリコール結合体、又は、脂質とアルブミンとの複合体から形成できる。脂質シェルは、例えば、本書では部分的又は全体的にリンカーと総称される、ストレプトアビジン、ビオチン、アビジン、デスチオボチン、アプタマー、オリゴヌクレオチド及び／又は抗体で、機能化することができる。脂質シェルは、液体コアを完全に又は部分的にカプセル化してもよい。

音響液滴気化（ＡＤＶ）として知られるプロセスは、音響波を使用して、前述のような粒子の液体コアの液体から気体への相転移を生成するために使用することができる。液体の蒸気圧は温度の関数であり、必ずしも液体の化学的性質に基づくものではない。これらのプロセスには、体温付近又は体温以下の通常の沸点を有する液体であれば使用できる。パーフルオロカーボンは、毒性が低く、コントラスト因子が高いため、これらのプロセスで使用してもよい。

粒子とリンカーとの間に、スペーサを配置してもよい。スペーサは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子として実装できる。ＰＥＧ分子は、物質が粒子の表面の機能化分子に結合しているときに、粒子からの電荷干渉を少なくすることができる。

いくつかの実装例では、音響波を使用して細胞を単離するための音響応答性のビーズ／粒子／液滴が提供される。粒子は、ｎ－パーフルオロヘキサン／ｎ－パーフルオロペンタン／ｎ－パーフルオロヘプタン／パーフルオロ－オクチルブロミドなどのパーフルオロカーボン、又は、これらのパーフルオロカーボンの組み合わせで構成される、液体コアを有してもよい。液体コアは、全体的又は部分的に脂質化合物でカプセル化されている。脂質化合物は、細胞、抗体、ウイルス又はアプタマーを標的とすることができるリンカー又はリガンドを備えていてもよい。これらの脂質化合物は、例として、ＰＥＧ４０ステアリン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－パルミトイル－ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ＤＳＰＣ１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＳＰＣ、ＰＢＳ緩衝液、プロピレングリコール、グリセロール、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（２０００）１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）ビオチン１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［ビオチニル（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）デスチオビオチン１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［デスチオ－ビオチニル（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、ステアリン酸ポリオキシエチレン（４０）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）マレイミド１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）、又は、例として、本書ではＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００－ＢＩＯＴＩＮとされる機能化脂質－グリコール結合体のうちの１つ又は複数で構成されてもよい。リガンド又はリンカーは、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン（ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ）、ビオチン、デスチオボチン、アプタマー、オリゴヌクレオチドなどのオリゴマー及び／又は抗体のうちの１つ又は複数で構成されてもよい。

粒子は、脂質水溶液とパーフルオロカーボンとを組み合わせることによって製造してもよく、これを均質化／超音波処理／膜乳化／機械的攪拌（バイアル混合）して、（用途に基づいて）所望のサイズ分布を生成してもよい。下流の遠心分離は、粒子分布の幅サイズを狭めるための目的又は洗浄の目的で使用してもよい。粒子サイズ分布は、液滴／ビーズ／粒子を製造するために組み込まれる方法に依存する。製造された粒子サイズは、約４００ｎｍから約３００μｍの範囲であってもよい。

液滴／粒子／ビーズは、用途に応じて、ニュートラアビジン／ストレプトアビジン／キャプトアビジンなどの１つ又は複数の異なるタイプのリガンド又はリンカーとともに培養されてもよい。最終的な液滴／粒子／ビーズは、細胞の選択又は音響デバイスでの選別など、更なる用途に使用される。最終的な液滴／ビーズ／粒子の溶液は、その溶液の水性部分にＢＳＡ／ＨＳＡ又はいくつかの安定剤又は界面活性剤を含んでもよい。

液滴／粒子／ビーズは、細胞のポジティブ選択又はネガティブ選択に使用してもよい。いくつかの例では、カプセル化においてデスチオビオチンで機能化された液滴／粒子／ビーズは、細胞のポジティブ選択に使用される。液滴／粒子／ビーズは、ビオチン緩衝液の添加により複合体から溶出することができる。液滴／粒子／ビーズの機能化は、細胞と結合するための可逆的なリンクとして形成することができる。例えば、ビオチン－ニュートラアビジン結合を分離して、細胞から液滴／粒子／ビーズを分離することができる。

実装例において、脂質化合物を調製することと、パーフルオロカーボンを液体化合物と組み合わせることと、及び、その組み合わせを攪拌することとを含む、粒子を製造するための方法が提供される。前記攪拌は、遠心分離、超音波処理、均質化又は機械的攪拌の１つ又は複数の組み合わせによって達成してもよい。前記攪拌は、所定の粒子サイズ分布を達成するために実装されてもよい。粒子サイズ分布は、約４００ｎｍから約３００μｍの範囲であってもよい。粒子は、脂質溶媒を用いて溶液を調製し、溶液を加熱し、溶解性の順に異なる脂質を溶液に加えるなど、各脂質の特性に基づいて異なる脂質を順番に組み合わせることによって製造してもよい。

脂質化合物は、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＥＧ４０ステアリン酸、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（２０００）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）－ビオチン、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－５０００－ビオチン、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）－デスチオビオチン、ＰＢＳ緩衝液、グリセロール、プロピレングリコール、又はＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）－マレイミドのうちの１つ又は複数を含んでもよい。パーフルオロカーボンは、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロオクタン、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロジクロロオクタン、又はパーフルオロデカリンのうちの１つ又は複数であってもよい。前記粒子は、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン、ビオチン、デスチオビオチン、抗体、アプタマー、又はオリゴマーのうちの１つ又は複数を含む、可逆的リンカーなどのリンカーで機能化してもよい。前記粒子は安定剤又は界面活性剤を含んでもよく、これらは前記液体コア部分にあってもよい。

粒子は、標的粒子を流体から分離するための方法で使用してもよく、この方法は、チャンバ内の流体中の機能化粒子を受け取ることと、チャンバ内の標的粒子を受け取ることと、標的粒子が機能化粒子と結合することを可能にすることと、音響波によって収集又は阻止される機能化粒子に影響を与えるために音響波をチャンバに印加すること、とを含む。

前記開発された粒子は、細胞の非常に高い純度と回収率をもたらす。音響場の存在下での音響親和性粒子は、細胞の出力及び健全性を損なうことなく、妥当な時間内にすべてのスケールで良好に機能した。

本研究では、細胞を単離する目的で音響親和性粒子が開発された。細胞分離は音響力に基づいているため、パーフルオロヘキサン（ＰＦＨ）などの高圧縮性の生体適合性液体を粒子／液滴のコアとして選択した。リン脂質が乳化剤として使用された。細胞のターゲティングには、前記リン脂質の１つがビオチン化され、ビオチン－ニュートラアビジン相互作用が前記ターゲティングに使用される。パーフルオロヘキサン液滴からの細胞を溶出させたい用途では、カプセル化された通常のビオチン分子がデスチオボチンに置き換えられる。液滴の製造プロセスは、音響波に反応するとともに細胞との結合に十分な表面積を有するサイズ分布を達成できるように設計された。ＰＦＨ液滴を使用した細胞の結合及び分離は、ネガティブ選択及びポジティブ選択の両方の用途で調査研究された。テストケースでは、音響波の存在下でＰＦＨ液滴を使用することにより、標的細胞の高い純度と回収率が得られた。デスチオビオチンは液滴に結合させてもよい。細胞のポジティブ選択では、液滴は、細胞－抗体－液滴複合体から溶出するように改変され、その溶出の技術は、細胞に何ら悪影響を与えることなく高い溶出効率を実現した。

音響親和性粒子は、細胞を単離する目的で開発されている。パーフルオロヘキサン（ＰＦＨ）などの音響応答性の液体がコアとして使用され、リン脂質が乳化剤として使用される。液滴製造プロセスは、結合と良好な音響応答とに適したサイズ分布を実現するように設計された。ビオチン－ニュートラアビジン相互作用をターゲティングに使用した。溶出が望まれる細胞のポジティブ選択では、カプセル化における通常のビオチン分子がデスチオボチンに置き換えられる。音響波の存在下でネガティブ選択及びポジティブ選択の両方で細胞の単離が行われ、標的細胞の高い純度及び回収率が得られた。

開発された粒子は、様々なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療への適用、及び、遺伝子組み換えＣＤ３４＋細胞治療などの細胞及び遺伝子の治療への適用において、音響波を使用した細胞の単離に使用することを目的としている。

これらの特性及びその他の非限定的な特性について、以下でより具体的に説明する。

以下は、図面の簡単な説明であり、これらの図面は、本書に開示された例示的な実施形態を説明するために提示されるのであり、それと同じことを限定するためではない。

図１は、定在波場において粒子に加えられる力を示すグラフである。

図２は、進行波場において粒子に加えられる力を示すグラフである。

図３は、液体コア及び脂質シェルを含む粒子の概略図である。

図４は、粒子のサイズ分布を示すグラフである。 図５は、粒子のサイズ分布を示すグラフである。

図６は、粒子数に対する蛍光強度を示すグラフである。 図７は、粒子数に対する蛍光強度を示すグラフである。

本開示は、望ましい実施形態及びそこに含まれる実施例の以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解され得る。以下の明細書及び以下の特許請求の範囲では、以下の意味を持つように定義されるいくつかの用語が参照される。

以下の説明では、わかりやすくするために特定の用語を使用しているが、これらの用語は、図面で説明するために選択した実施形態の特定の構造のみを指すことを意図しており、開示の範囲を定義又は制限することを意図していない。以下の図面及び以下の説明において、同様の数値指定は同様の機能のコンポーネントを指すことを理解されたい。

単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数形の対象を含む。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「本質的に構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の実施形態を含んでもよい。「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、及び、本書で使用されるそれらの変形は、具体的に名付けられたもの以外の他の成分、コンポーネント及びステップの存在を可能にする、制限のない移行句、用語又は単語であることが意図されている。しかしながら、そのような説明は、組成物、物品又はプロセスを、列挙された成分、コンポーネント又はステップから「構成される」及び「本質的に構成される」としても説明するものとして解釈され得るべきであり、そのような解釈では、指定された成分、コンポーネント及びステップと、そこから生じる可能性のある不純物のみの存在が可能になり、他の成分、コンポーネント及びステップは除外される。

本出願の明細書及び特許請求の範囲における数値には、同じ数の有効数字に減らしたときに同じである数値、及び、数値を決定するために本出願で説明するタイプの従来の測定技術の実験誤差よりも小さい値だけ記載値と異なる数値を含むと、理解されるべきである。

本書に開示されるすべての範囲は、列挙された境界点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を含み、独立して組み合わせることができる（例えば、「２グラムから１０グラムまで」の範囲には、境界点の２グラム及び１０グラムと、すべての中間値が含まれる）。

「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、その値の基本機能を変更せずに変更できる任意の数値を含むために使用できる。範囲で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」は、２つの境界点の絶対値によって定義される範囲を開示する。例えば、「約２から約４まで」という表現は、「２から４まで」の範囲も開示している。「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、示された数のプラス又はマイナス１０％を指す場合がある。

値が第１の閾値を超える（又は以上）という記述は、その値が第１の閾値よりわずかに大きい第２の閾値を満たすか超え、例えば、第２の閾値は、関連するシステムの解像度で第１の閾値より１つ高い値である、という記述と同等である。値が第１の閾値よりも小さい（又はその第１の閾値内にある）という記述は、その値が第１の閾値よりわずかに低い第２の閾値以下であり、例えば、第２の閾値は、関連するシステムの解像度の第１の閾値より１つ低い値である、という記述と同等である。

本書で使用される用語の多くは相対的な用語であることに留意されたい。例えば、「上部（ｕｐｐｅｒ）」及び「下部（ｌｏｗｅｒ）」という用語は、位置において互いに相対的なものであり、例えば、上部のコンポーネントは所定の方向において下部のコンポーネントよりも高い位置にあるが、これらの用語は、デバイスが反転した場合に変更される可能性がある。「流入口（ｉｎｌｅｔ）」及び「流出口（ｏｕｔｌｅｔ）」という用語は、例えば、流体が流入口を通って構造物に流れ込み、流出口を通って構造物から流れ出すように、所定の構造物に関してそれらを流れる流体に対して相対的なものである。「上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）」及び「下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）」という用語は、例えば、下流のコンポーネントを流れる前に上流のコンポーネントを流れる流体のように、流体が様々なコンポーネントを通って流れる方向に関して相対的なものである。ループするものにおいては、第１のコンポーネントが第２のコンポーネントの上流側と下流側の両方であると説明され得ることに留意されたい。

「水平（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）」及び「垂直（ｖｅｒｔｉｃａｌ）」という用語は、例えば地面のレベルなどの絶対的な基準に対する相対的な方向を示すために使用される。しかしながら、これらの用語は、コンポーネントが互いに完全に平行又は完全に垂直であることを必要とすると解釈されるべきではない。例えば、第１の垂直コンポーネントと第２の垂直コンポーネントは、必ずしも互いに平行である必要はない。「上部（ｔｏｐ）」及び「下部（ｂｏｔｔｏｍ）」又は「底部（ｂａｓｅ）」という用語は、例えば地球の表面などの絶対的な基準に対して上部が常に下部又は底部よりも高い表面を指すために使用される。「上向き（ｕｐｗａｒｄｓ）」及び「下向き（ｄｏｗｎｗａｒｄｓ）」という用語もまた、絶対的な基準に対して相対的なものであり、上向きは常に地球の重力に逆らう。

本出願では、「同じ桁（ｏｒｄｅｒ）の大きさ」について言及する。大きい方の数値を小さい方の数値で割った商が１以上１０未満の値である場合、２つの数値は同じ桁の大きさになる。

「ウイルス」という用語は、生きている細胞を用いてのみ複製できる感染性病原体（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ）を指し、それ以外の場合は、ＤＮＡ又はＲＮＡを取り囲んでそれらを含むキャプシドから形成されるビリオンの形態で存在する感染性病原体を指し、また場合によっては、キャプシドを取り囲む脂質エンベロープから形成されるビリオンの形態で存在する感染性病原体を指す。

「結晶」という用語は、圧電材料として使用される単結晶材料又は多結晶材料を指す。

本開示は「マイクロ粒子」について言及する。この用語は、平均粒子径が１マイクロメートル（μｍ）から１０００μｍの粒子を指す。

本開示は「ナノ粒子」に言及する。この用語は、平均粒子径が１ナノメートル（ｎｍ）から１０００ｎｍ未満の粒子を指す。

本書で説明される物質のいくつかは、平均粒子径を有すると記載されている。平均粒子径は、粒子の総数の累積割合が（体積で）５０％となる粒子径と定義される。言い換えると、５０％の粒子が平均粒子サイズよりも大きい直径を有し、５０％の粒子が平均粒子サイズよりも小さい直径を有する。粒子のサイズ分布は、ガウス分布が含まれていてもよく、そのガウス分布では、記載された平均粒子サイズの２５％及び７５％に上部四分位及び下部四分位を有し、すべての粒子は、記載された平均粒子サイズの１５０％未満である。他の種類の分布が提供され又は使用されてもよい。粒子は球形である必要はないことに留意されたい。非球形粒子の場合、粒子径は、非球形粒子と同じ体積を持つ球形粒子の直径である。

粒子は、本書において、「コア」構造及び「シェル」構造を有するものとして説明されてもよい。「粒子」という用語は、液体又は気体などの流体に懸濁されてもよく、任意の相、例えば、固体、液体又は気体及びそれらの組み合わせであってもよい、任意のタイプの個々の構造を指すことを意味する。

「有機」物質及び「無機」物質が、本書において言及されている。本開示の目的のために、「有機」物質は炭素原子（多くの場合他の原子を含む）で構成されているが、「無機」物質は炭素原子を含まない。

本開示は、特定のプロセスステップの温度に言及してもよい。本開示では、温度とは、通常、熱源（炉、オーブンなど）が設定される温度ではなく、参照される物質によって達成される温度を指す。「室温」という用語は、６８°Ｆ（２０℃）から７７°Ｆ（２５℃）の範囲を指す。

ＣＡＲ Ｔ細胞療法の開発に使用される可能性のある細胞処理では、いくつか例を挙げると、磁力、電気力、重力、又は、マイクロ流体工学に基づく様々な技術を使用して、所望の細胞が主要な集団から単離される。一部の用途では、所望の細胞（ポジティブ選択）は、抗体又はアプタマー又はオリゴマーを使用して粒子又はビーズに付着し、細胞とビーズとの複合体は、粒子の性質に基づく力にさらされた領域又はチャンバを通って流れる。例えば、細胞と磁性粒子との複合体は、磁力にさらされるチャンバ又はカラムを通過してもよい。細胞のポジティブ選択の場合、チャンバ内に保持されている細胞が所望の細胞であるのに対し、ネガティブ選択の場合、チャンバ内に保持されていない細胞が所望の細胞である。

音響細胞処理において、所望の細胞は、他の細胞物質又は細胞と一緒に、所望の細胞を単離又は分離しようとする流体中に取り込まれている。所望の細胞（ポジティブ選択）は、抗体、アプタマー、オリゴマー、又は、その他の任意の適切な細胞ビーズ結合メカニズムを含んでもよい結合メカニズムを使用して、音響応答性ビーズに付着又は結合する。細胞とビーズとの複合体は、ビーズに影響を与える音響場にさらされる領域又はチャンバを通って、それらが同伴される物質とともに流れる。細胞のポジティブ選択の場合、所望の細胞は（ビーズを介して）音響場によって保持されるが、ネガティブ選択の場合、所望の細胞は音響場によって保持されない。

本書で論じるビーズを使用する細胞の音響分離又は音響単離は、細胞の健全性及び完全性を維持しながら、所望の細胞の高い回収率だけでなく高純度の結果が得られるので、他の技術よりも有利である。更に、音響細胞処理は、細胞の健全性にほとんど又は全く悪影響を及ぼさずにスケールアップすることができる。例えば、細胞及び細胞とビーズとの複合体は、音響場による操作のために、追加のせん断応力をほとんど又は全く受けない。更に、本書で論じる音響細胞処理はマクロプロセスであるため、流量率が大幅に制限されることはなく、従来の技術よりもスループットが高く、処理時間を短くすることができる。更に、本書で論じるビーズは、人体に対して無毒であるため、従来の磁性ビーズよりも治療用製造プロセスでの使用に対してはるかに魅力的である。

本開示は、超音波トランスデューサを含む音響泳動デバイスと組み合わせて使用される粒子に関する。超音波トランスデューサは、様々な方法で粒子を操作するために使用できる音響波を生成する。例えば、音響波を使用して、粒子が特定の領域に移動するのを阻止したり、粒子を移動させたり、及び／又は、粒子を所望の位置又は軌道に保持したりすることができる。粒子は、必要に応じて、マイクロ粒子又はナノ粒子にすることができる。粒子は音響的に反応する。粒子は、ビーズ又は液滴と呼ばれてもよく、それぞれの用語は、本書では互換的に使用されてもよい。

上述したように、粒子は一般的にマイクロ粒子又はナノ粒子である。粒子は、形状が球形であってもよく、又は、例えば、粒子は、楕円形又は長手方向軸に沿って細長くてもよいなど、変化してもよい。例えば、複数の異なる層から粒子を作成することで、所望の密度と所望の音響コントラスト因子の両方を得ることができ、又は、粒子の所望の挙動若しくは相互作用を得ることができる。粒子は、音響応答性の高いパーフルオロカーボン（ＰＦＣ）で構成されていてもよい。

数式（１）は、平面定在波の流体懸濁液中の粒子に対する音響放射力Ｆ_Ｒの分析式を示している。ＰＦＣ液滴の音響コントラスト因子Ｘ（式２）は負である。これは、音響定在波場の圧力の節に移動する市販のほとんどのビーズとは異なり、圧力の腹に移動することを意味している。パーフルオロヘキサン（ＰＨＦ）、コスフェリック（Ｃｏｓｐｈｅｒｉｃ）ビーズ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ビーズ及びＰＬＧＡの音響コントラスト因子は、それぞれ－０．９７、０．１８、０．１８、及び０．３である。図１は、ＰＦＨ液滴に関する互いに異なる物質のビーズにかかる力の大きさの比較を示している。図１は、同じサイズ及び励起パラメータに対して、ＰＦＨ液滴が他の市販のビーズよりも音響的に応答性が高いことを示している。高い音響応答は、ＰＦＨの音速が遅いことに起因している可能性がある。

ここで、Ｐ_０は圧力振幅、Ｖ_ｐは粒子の体積、β_ｆは流体の圧縮率、λは波長、Ｋは波長、ρ_ｐは粒子の密度、ρ_ｆは流体の密度、Ｘは音響コントラスト因子である。

数式（３）は、平面進行波の流体懸濁液中の粒子にかかる音響放射力Ｆ_Ｒの解析式を示している。進行波では、力は波の伝播方向に沿って作用する。この式は、力が主に粒子の密度に依存することを示している。

図２は、音響進行波場におけるＰＦＨ液滴に正規化された、互いに異なる物質で作られたビーズに対する音響力の大きさの比較を示している。図２は、同じサイズ及び励起パラメータに対して、ＰＦＨ液滴が市販のビーズよりも音響的に応答性が高いことを示している。ここでの高い音響応答は、液体のパーフルオロヘキサンの密度が高いことに起因している可能性がある。

一般的に、本開示の粒子は、定在波又は進行波であり得る音響波で発生させることができる音響場で操作されてもよい。音響場は、粒子に対するバリアを形成する界面領域の近くに圧力上昇を形成するために発生させることができる。

本書で論じる音響デバイスは、マルチモード又は平面モードで動作してもよい。マルチモードとは、３次元で音響力を生成する音響トランスデューサによる音響波の生成を指す。超音波であってもよいマルチモード音響波は、１つ又は複数の音響トランスデューサによって生成され、本書では、複数次元又は３次元の音響定在波と呼ばれることがある。平面モードとは、例えば伝播の方向に沿って実質的に１次元で音響力を発生させる音響トランスデューサによる音響波の生成を指す。このような平面モードで発生する音響波（超音波であってもよい）は、本書では、一次元音響定在波と呼ばれることがある。

音響デバイスは、流体又は粒子混合物においてバルク音響波を生成するために使用されてもよい。バルク音響波は、流体のボリュームを伝播するものであり、トランスデューサの表面で動作する傾向がある、流体のボリュームを伝播しない弾性表面波とは異なる。

音響トランスデューサは、圧電材料で構成されていてもよい。このような音響トランスデューサは、電気的に励起されて、平面音響波又はマルチモード音響波を生成することができる。マルチモード音響波によって発生される３次元音響力には、音響波の伝播方向に向いていない半径方向又は横方向の力が含まれる。横方向の力は２次元で作用してもよい。横方向の力は、マルチモード音響波の軸方向の力に追加され、音響波の伝播方向と実質的に一致する。横方向の力は、そのようなマルチモード音響波の軸方向の力と同じオーダーの大きさである可能性がある。マルチモード動作で励起された音響トランスデューサは、その表面に定在波を示し、それによってマルチモード音響波を生成してもよい。トランスデューサの表面の定在波は、マルチモード音響波の動作モードに関連していてもよい。音響トランスデューサが電気的に励起されて平面音響波を生成する場合、トランスデューサの表面はピストンのような作用を示し、それによって１次元の音響定在波を生成してもよい。平面音響波と比較して、マルチモード音響波は、同じ入力パワーで連続的に著しく大きな粒子捕捉活性を示す。１つ又は複数の音響トランスデューサを使用して、平面及び／又は複数次元の音響定在波を生成してもよい。一部の動作モードでは、マルチモード音響波は、特定のサイズの粒子を引き止め又は保持できる界面効果を生成し、小さい粒子はマルチモード音響波を通って流れることができる。一部の動作モードでは、平面波を使用して、粒子サイズに特徴的な特定の角度で粒子を偏向させることができる。

本書では、ＰＦＣビーズ、それらの製造プロセス、及び、ビーズを使用した細胞選択の方法について論じる。パーフルオロヘキサン（ＰＦＨ）ビーズを使用した例では、ビオチン－ニュートラアビジンの非共有相互作用を使用して達成される細胞標的の手法を紹介する。液体のパーフルオロヘキサン（ＰＦＨ）コア液滴は、ニュートラアビジンが結合したビオチン化脂質でカプセル化されている。図３は、パーフルオロヘキサンコア液滴の概略図を示している。

音響ベースの細胞選別は、リプキンスらに対する米国特許番号９，８２２，３３３におけるフロデザイン ソニックス， インク．によって開発された複数次元音響定在波技術などの音響定在波場で行われる。液滴のコアを合成するために使用されたＰＦＣ液体は、独特の物理的特性を有している。ＰＦＣ液体の顕著な特性としては、水よりも密度が高い、粘度が低い、表面張力が低い、酸素を吸収する能力が高い、水に対する音速が遅い、非常に化学的に不活性である、生体適合性がある、ことなどが挙げられる。表１は、液滴製造のために研究調査されたＰＦＣ液体の物理的特性及び音響的特性を示している。

パーフルオロカーボン（ＰＦＣ）液体は圧縮率が高いため、音響応答性粒子の設計に適した候補である。パーフルオロカーボン（ＰＦＣｓ）は化学的に不活性な化合物であり、複数の生物医学的用途がある。それらのエマルジョンは、人工血液代替物（バイロ、ブライス及びローセン、１９８７年；ムーア及びクラークジュニア、１９７８年；横山、山ノ内、村島及び津田、１９８１年）、分子イメージングの音響造影剤（ランバート及びジャブロンスキー、１９９７年）、及び、ＭＲＩ造影剤（ディアス－ロペス、タサピス及びファタル、２０１０年）などとして使用されている。フルオロカーボンの他の生物医学的用途としては、肺界面活性剤置換（クラークジュニア、１９９８年；セキンス、シェファー及びウルフソン、１９９６年）、及び眼科用補助剤（ヴィデネら、２０１８年）が挙げられる。パーフルオロカーボンは、細胞への呼吸ガス供給を促進するためにも使用されており（ゴー、グロス、シンプソン及びサムバニス、２０１０年；ジュ及びアーミジャー、１９９２年）、一部のシステムでは、バイオマス生産と商業的に重要な細胞製品の収量を改善するために使用されている。動物（ヒトを含む）及び植物細胞も、ＰＦＣ液体と水性培地の間の界面で培養されている。呼吸ガスを溶解するＰＦＣ液体の能力は、臨床医やバイオ技術者から多くの関心を集めている。

ＰＦＣのこれらの特性に基づく市販製品のいくつかは次のとおりである。フルオソル（Ｆｌｕｏｓｏｌ－ＤＡ、ミドリ十字社、大阪、日本、及びアルファ・セラプテック、米国カリフォルニア州ロサンゼルス）、オキシフェロール（Ｆｌｕｏｓｏｌ－４３、ミドリ十字社、及びアルファ・セラプテック）、パーフトラン（Ｆｔｏｒｏｓａｎ、ＯＪＣＳ ＳＰＦパーフトラン・ロシア、モスクワ、ロシア）、オキシジェン（ＡＦ０１４４、アライアンス・ファーマシューティカル社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）、オキシフロー（ＨｅｍａＧｅｎ／ＰＦＣ、米国ミズーリ州セントルイス）及びオキシサイト（オキシジェン・バイオセラピュテクス、インク、以前はシンセテック・ブラッド、Ｉｎｔ、米国カリフォルニア州コスタメサ）。デフィネトリ（ランセウス・メディカル・イメージング、Ｎ． ビレリカ、マサチューセッツ）は、脂質カプセル化とパーフルオロブタンガスコアを備えた米国食品医薬品局（ＦＤＡ）承認の超音波造影剤である。これは、米国で心臓血管イメージングに使用される。

いくつかの実装例では、粒子は、脂質シェルによってカプセル化された液体コアを備えたコアシェル構造である。例えば、液体コア内の液体はパーフルオロカーボン（ＰＦＣ）である。本開示で使用される「パーフルオロカーボン」という用語は、すべての水素原子がハロゲンで置き換えられ、ハロゲン原子の大部分がフッ素原子である分子を指す。本開示の目的のために、「ハロゲン」は、フッ素、塩素、及び臭素を指す。ＰＦＣの特定の例としては、パーフルオロペンタン（ＰＦＰ）、パーフルオロヘキサン（ＰＦＨ）、パーフルオロジクロロオクタン（ＰＦＤＣＯ、Ｃ８Ｆ１６Ｃｌ２）、パーフルオロオクタン（ＰＦＯ）、パーフルオロオクチルブロミド（ＰＦＯＢ、Ｃ８Ｆ１７Ｂｒ）、又はパーフルオロデカリン（ＰＦＤ、Ｃ１０Ｆ１８）が挙げられる。

これらのＰＦＣ液体には独自の特性がある。ＰＦＣ液体は水よりも密度が高く、表面張力が低く、粘度が低い。ＰＦＣ液体は、酸素と窒素を吸収する高い能力も備えている。パーフルオロカーボン液は音速が遅く、非常に化学的に不活性であり、生体適合性がある。以下の表２は、比較のために他のポリマーとともに、粒子に使用できる様々なＰＦＣ液体の様々な物理的特性及び音響的特性を示している。ＰＦＣ液体の圧縮率は、生体細胞と比較して非常に高いことに留意されたい。

脂質シェルを形成するために使用できる脂質の具体例には、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－パルミトイル－ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が含まれる。これらの脂質は、脂質－ポリエチレングリコール結合体、又は脂質とアルブミンの複合体（ウシ血清アルブミンやヒト血清アルブミンなど）でも使用できる。脂質シェルは、ストレプトアビジン、ビオチン、デスチオボチン、アビジン、抗体、アプタマー、オリゴヌクレオチド、及び／又は他の機能化部分で機能化することができる。脂質シェルは、粒子を別の分子に付着させるため、及び液体コアを保護するために使用される。

この構造は、図３に示されている。この例のパーフルオロヘキサンにおいて、粒子３００は、液体コア３０４を取り囲む脂質シェル３０２で作られている。シェルは、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ－ＲＥＧ２０００、又は、ここではＤＳＰＥ－ＰＥＧ５０００－ビオチンとされる機能化脂質－グリコール結合体で作ることができる。脂質シェルのビオチンに結合するアビジン誘導体３０６であるニュートラアビジンも示されている。

本書では、いくつかの製造技術又は合成技術が提示されている。一実装例によれば、脂質ブレンドが作成され、パーフルオロヘキサン（ＰＦＨ）液体は、用途に必要な液滴又はビーズのサイズに応じて、様々な方法でその中に分散される。脂質ブレンドには、ＤＳＰＣ、ＰＥＧ４０ステアリン酸、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ－２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００－ビオチン、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－５０００－ビオチン、ＰＢＳ緩衝液、プロピレングリコール及びグリセロールが含まれてもよい。ＰＦＨと脂質溶液とをホモジナイザを使用して混合し、液滴を生成する。均質化後に得られる液滴は、非常に多分散である。下流の遠心分離プロトコルを実行して、所望の液滴サイズを取得する。液滴が製造された後、それらは所望の量のニュートラアビジンとともに培養され、遊離のニュートラアビジンを除去するために２段階の洗浄が行われる。

他の実装例では、リン脂質が乳化剤又は界面活性剤として使用される。ここで使用される脂質製剤の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）値は１３．５３である。ＨＬＢ値は、ここで形成されるエマルジョンが水中油型エマルジョンであることを示している。液滴が細胞に付着するため、ビオチン化脂質が脂質製剤に含まれている。この例では、細胞への液滴の付着は、非共有結合したニュートラアビジンを使用して行われる。異なるサイズ範囲の液滴を作成するための他の方法及び技術が本書に記載されている。脂質の正確な組成と詳細を、以下の表３と表４に示す。所望の脂質ブレンドが作成され、ＰＦＣ液体は、用途に必要な液滴又はビーズのサイズに応じて、様々な方法で分散される。小さなサイズの液滴を作成するために、超音波攪拌が使用された。より大きな液滴を作成するために、ホモジナイザを使用して液体混合物を攪拌する。脂質溶液の調製は、合成プロセスの重要な部分である。

いくつかの例では、調達された脂質は、－２０℃で冷凍庫に保存される。液滴を合成するために、脂質を冷凍庫から取り出し、室温で２０分間放置する。脂質を固体凍結状態からゲル状態にするために、室温で２０分間の解凍が行われる。乳化プロセス中に脂質を液体状態にすることが推奨される。脂質は水に溶けないため、プロピレングリコールを使って脂質を溶かす。すべての脂質を一度にプロピレングリコールに溶解しないことが推奨される。すべての脂質を一度に組み合わせると、溶液中に白い塊が形成される可能性があり、溶解が困難になる可能性がある。脂質の溶解度の順序は、例えば、最も溶解度の低い脂質が最初にプロピレングリコールなどに溶解するために使用される。溶解度は溶液の温度の関数であることに注意されたい。溶液は、脂質の転移温度よりも高い温度に維持されることが望ましい。転移温度で、脂質相はゲルから液体状態に変化する。適切な量のプロピレングリコールを、脂質ブレンドの所望の転移温度、又は最大の転移温度まで加熱する。例えば、本製剤では、ＤＳＰＣは最も溶解性の低い脂質であり、最大転移温度は６０℃である（使用される脂質の中で最も高い）。最小の溶解度又は潜在的に最小の溶解度の脂質を最初に高温のプロピレングリコールに加え、ビーカーをバスソニケータに入れて穏やかに混合する。続いて、バスソニケータのビーカーに脂質を追加する。同時に、グリセロールと緩衝液の混合物を調製し、それを所望の転移温度又は潜在的に最大の転移温度まで加熱する。ソニケータでプロピレングリコール－脂質溶液が半透明（白い塊がない）になったら、それをグリセロール緩衝液と混合する。得られた溶液は、温度制御された水槽を備えた磁気プラットフォーム上で混合される。水槽の温度は、脂質の望ましい転移温度又は潜在的に最大の転移温度５℃を超えないことが好ましい。温度の上昇は膜の剛性に悪影響を及ぼす。脂質溶液は、体積で１５％のプロピレングリコール、５％のグリセロール、及び８０％のＰＢＳ緩衝液で構成されている。主な脂質に応じて、プロピレングリコールの量を増やすことができる。例えば、主な脂質がＤＰＰＣの場合、１０％のプロピレングリコール溶液でも脂質の溶解を達成できる。

所望の温度での脂質溶液の混合は、１時間以上行ってもよい。その後、脂質溶液を槽から取り出すことにより室温に戻してもよい。溶液は、更に使用するために４℃で保存してもよい。

ホモジナイザを使用して、脂質－プロピレングリコール－グリセロール－緩衝液の混合物を混合することもできる。ホモジナイザは、例えば、３０００ｒｐｍで操作することができる。均質化は、脂質の所望の転移温度又は潜在的に最大の転移温度よりも高い温度に維持された状態で、１時間以上行われることが好ましい。

調製した脂質溶液を濾過して、ダスト粒子、溶解していない脂質の塊などを除去した。このプロセスには、親水性シリンジフィルタを使用した。フィルタは、使用前に同じ温度の槽に浸した。脂質溶液の濾過には、２μｍ、０．８μｍ、０．４５μｍのフィルタを順番に使用した。

脂質のコーティング／シェルの多くの製剤が開発された。いくつかの製剤では、ＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ－２０００がＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ－５０００に置き換えられ、それに応じて、ビオチン化脂質がＤＳＰＥ－ＰＥＧ－５０００－ビオチンに変更された。ＤＳＰＣはＤＰＰＣに置き換えることもできる。ビオチン化脂質の比率も変化させて、細胞との結合への影響を確認した。ある製剤では、ＤＳＰＣの一部がビオチン化され、ビオチンと細胞の間の結合を改善するためにスペーサも導入された。液滴に立体的な安定性を与えるために、ペグ化脂質が導入された。ＰＥＧ４０ステアリン酸のような乳化安定剤／共界面活性剤（ｃｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）も使用された。ここで使用されるすべての脂質は生体適合性があり、過去にＦＤＡが承認した様々なリポソームベースの薬剤に使用されてきた。

上述した製剤（表３）は、ビオチン－ニュートラアビジン非共有結合に基づいている。ニュートラアビジンが液滴表面に直接結合したいくつかの脂質製剤が開発された。このような製剤では、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００－ビオチンをＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００－マレイミドに置き換え、均質化後に製造された液滴には、更に結合させるためのマレイミドが含まれている。マレイミド含有液滴は、チオール化ニュートラアビジンと結合して、表面にニュートラアビジンとの安定したチオエーテル結合を生成する。好ましくはないが、マレイミドとチオール化ニュートラアビジンとの間の反応はまた、脂質調製段階でも行われてもよい。このアプローチでは、液滴の調整に使用される高せん断がニュートラアビジンを変性させる可能性がある。脂質マレイミドの加水分解を避けるために、ｐＨ～７を維持する必要がある。結合は、窒素又はアルゴンの雰囲気で行う必要がある。

他の例では、脂質製剤において、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００－ビオチンがＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００－デスチオビオチンに置き換えられた。この変更は、ポジティブ選択プロセスの最後に液滴を溶出できるようにするために実行された。

他の例では、ニュートラアビジンは、液滴製造においてストレプトアビジンに置き換えられた。ウェルプレート実験から、デスチオビオチン液滴がストレプトアビジンに非共有結合している場合、デスチオビオチン液滴はより速く溶出することが観察された。この変更により、溶出時間が大幅に短縮され、溶出効率が向上する可能性がある。

他の例では、ＤＯＴＡＰやＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質を脂質製剤に含めて、それをビオチン化されたｓｓ－ＤＮＡ又はｄｓ－ＤＮＡに非共有結合させて、ＤＮＡ又はＲＮＡの改変を伴う液滴を得ることができる。液滴におけるＤＮＡの改変は、ストランドディスプレーサ又はベンゾナーゼを使用して溶出目的で使用してもよい。

他の例では、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００－ビオチンはＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００－マレイミドに置き換えることができ、マレイミド脂質はチオール化ＤＮＡ鎖と結合させることができる。これにより、共有結合のＤＮＡ改変を持つ脂質が生成される可能性がある。液滴は、その後、好ましい混合方法によって調製することができる。

他の例では、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質を脂質製剤に含めることができ、これにより、細胞膜へのＤＮＡのトランスフェクションを必要とする用途でＰＦＨ液滴を使用できるようになる。

他の例では、液滴のコアは、異なるパーフルオロカーボン（ＰＦＣｓ）の混合物を持つことによって改変することができる。高分子量のＰＦＣを混合すると、ＰＦＣエマルジョンの貯蔵寿命が長くなる（デイビス及びウォットン、１９８９）。例えば、パーフルオロヘキサン（ＰＦＨ）をパーフルオロデカリン（ＰＦＤ）と９０：１０の比率で混合することができ、その混合物を液滴コアとして使用することができる。

他の例では、ＰＥＧ４０ステアリン酸などの乳化安定剤を大量に使用して、最終的な液滴溶液の粘度を上げることができる。溶液の粘度が高いと、溶液中の液滴の動きが減少し、次に合体の速度が低下する。この改変は、ＰＦＨ液滴の貯蔵寿命に大きなプラスの影響を与える可能性がある。

〔小さなサイズの液滴の調製〕
いくつかの例では、ＰＦＨ、ＰＦＯＢ、及びＰＦＤが液滴製造に使用された。ＰＦＨで作られた液滴の詳細な結果をここに示す。脂質溶液は、狭い容器内でＰＦＨ液体と混合される。密度の高いＰＦＨ液体は容器の下部に落ちる傾向があり、脂質溶液は上に上がる傾向がある。脂質溶液とＰＦＨ液体はどちらも透明であるが、シャープな界面が見られる。小さなサイズの液滴を作るために、容器内のＰＦＨ液体の量は、好ましくは、例えば、最小に制限される。脂質溶液の体積に対するＰＦＨの体積の比率が増加すると、例えば、特定の超音波処理能力がプラトー（ｐｌａｔｅａｕ）に達するまで、液滴のサイズが増加する。ＰＦＨ液体は表面張力値が低いため、強度が低くなる。従って、超音波処理の振幅は、表面張力の値を打ち勝つように適切に選択される。超音波音響波の入力は、パルスモードで提供することができる。いくつかの例では、超音波音響波の連続モードを回避してもよい。ホーンの先端は、ＰＦＨと脂質溶液との界面に配置してもよい。界面での先端の配置は、液滴のサイズ分布の一貫性に影響を与え、またいくつかの例では重要である。超音波処理に異なるサイズの容器を使用すると、サイズ分布が変わる可能性がある。気泡（ｂｕｂｂｌｅ）や泡（ｆｏａｍ）の形成を避けるために、ホーンは溶液の十分内側に配置される。この例では、気泡溶液ではなく液滴溶液を調製することを目的にしているため、狭い容器を透明な低温槽に沈めている。透明な低温槽は、塩の過飽和溶液を作り、その塩溶液を－２０℃の冷凍庫に保存することによって作られる。これらの実験で使用されたホーンソニケータの先端の直径は０．５インチである。
〔小さな液滴のプロトコル〕
１．脂質－ＰＦＨ溶液を超音波処理する。
ａ．ホーンソニケータ：０．５インチのプローブと７５０ワットの最大電力。
２．キュベットに、２ｍｌのパーフルオロヘキサンを注ぐ。
３．同じキュベットに４ｍｌの脂質溶液を注ぐ（使用する前に脂質溶液のストックを非常に穏やかに振る）。
４．ソニケータの先端をパーフルオロヘキサンと脂質溶液の界面に置く。
５．サンプルホルダの冷却には透明な低温槽を使用する。
６．超音波処理パラメータ（ＰＦＨ）：１３％振幅、２秒オン：８秒オフ、合計処理時間１０秒。
７．遠心分離（２％ＢＳＡを含む緩衝液を使用）。
〔大きな液滴のプロトコル〕
１．１５ｍｌの遠心分離管で、４ｍｌのＰＦＨと６ｍｌの脂質溶液を混合する。
２．穏やかに混合した後、３０ｍｌビーカーに溶液を注ぐ。
３．ホモジナイザ（ＩＫＡ Ｔ２５ ＵＬＴＲＡ ＴＵＲＲＡＸ）を１０，０００ｒｐｍで４５秒間使用する。
４．遠心分離（２％ＢＳＡを含む緩衝液を使用）。

液滴のサイズ測定は、ベックマンコールターマルチサイザを使用して行われた。小さな液滴の場合、２０μｍのアパーチャが使用されたが、大きな液滴の場合、５０μｍのアパーチャが使用された。小さな液滴のサイズ分布は、直径が約０．９μｍを超え、体積分率が約５０体積パーセントの粒子の濃度が２４×１０億／ｍｌである。大きな液滴のサイズ分布は、直径が約２μｍを超え、体積分率が約５０体積パーセントの粒子の濃度が１．２２×１０億／ｍｌである。

上記の例では、ＰＦＣ液体と脂質溶液を組み合わせて、脂質シェルを備えた液体コアを作成する。ＰＦＣ液体を別の溶液に分散させて液滴を形成する。液滴が合体するのを防ぐために、乳化剤を溶液に加えてもよい。いくつかの実施形態では、リン脂質が乳化剤又は界面活性剤として使用される。ＰＦＣ液体は、用途に必要な液滴のサイズに応じて、様々な方法で分散される。小さなナノメートルサイズの液滴を作成するには、超音波攪拌を使用してもよい。より大きな液滴を作成するには、バイアルシェーカを使用して液体混合物を攪拌してもよい。

いくつかの実施形態では、脂質溶液は、溶液中のいくつかの異なる脂質物質で構成されている。調達した脂質は約－２０℃の冷凍庫に保存される。この温度では、脂質は固体状態である。脂質は冷凍庫から取り出し、使用前に室温で約２０分間放置してもよい。これは脂質をゲル状態にするために行われる。脂質は一般に水に溶解しないため、プロピレングリコールを使用して脂質を溶解してもよい。すべての脂質を同時にプロピレングリコールに入れると、溶液中に白い塊が形成される可能性があるため、すべての脂質を一度にプロピレングリコールに溶解しないことが好ましい。各脂質物質の溶解度を比較し、溶解度が最大の脂質物質を最初にプロピレングリコールに溶解し、次に最も溶解性の高い脂質物質などを続けて溶解した。脂質の溶解度は溶液の温度の関数であるため、溶液は脂質の転移温度より高い温度に維持された。表５は脂質組成の一例である。

脂質溶液を作成するための例示的なプロセスは以下の通りである。プロピレングリコールは、混合のために脂質ブレンドの最大転移温度まで加熱される。溶解度が最大の脂質物質を加熱したプロピレングリコールに添加する。脂質物質とプロピレングリコールはバスソニケータで混合される。続いて、溶解度の低い脂質が、バスソニケータ内にある間にプロピレングリコール混合物に添加される。

グリセロールと緩衝液の混合物を同時に調製してもよい。グリセロールと緩衝液を最大転移温度まで加熱する。ソニケータで脂質－プロピレングリコール溶液が半透明（白い塊がない）になったら、脂質－グリコール溶液をグリセロール緩衝液と混合する。得られた混合物を、３０００ｒｐｍで作動するホモジナイザで均質化する。均質化は、約１時間行われる。均質化処理中、温度は脂質の最大転移温度に維持される。

調製した脂質溶液をろ過して、ダスト、溶解していない脂質の塊などの汚染物質をすべて除去する。濾過プロセスは、親水性シリンジフィルタを用いて実施してもよい。フィルタは、使用前に同じ温度のバッチに浸される。いくつかの実施形態では、２．０μｍのフィルタが使用される。他の実施形態では、０．８μｍのフィルタが使用される。更に他の実施形態では、０．４５μｍのフィルタが使用される。いくつかの実施形態では、フィルタを組み合わせて使用してもよい。

脂質溶液は、狭い容器内でＰＦＣ液体と混合され、コアシェル粒子を生成する。ＰＦＣ液体を容器に入れ、脂質溶液を上に注ぐ。より小さなサイズの液滴を作るために、容器内のＰＦＣ液体の量を減らす。脂質溶液の体積に対するＰＦＣ液体の体積の比率が増加すると、形成された液滴のサイズは、所定の超音波処理力がプラトーに達するまで増加する。ＰＦＣ液体は、表面張力の値が低いため、強度が低くなる。従って、超音波処理の振幅を適切に選択し、超音波の入力を連続モードではなくパルスモードで行う必要がある。ホーンソニケータアセンブリの先端は、２つの液体溶液の界面に配置する必要がある。気泡や泡の形成を避けるために、ホーンは溶液の十分内側にある必要がある。ここでは、液滴溶液を調製することを目的としているため、狭い容器を透明な低温槽に沈める。透明な低温槽は、例えば、塩の過飽和溶液を作り、次に塩溶液を－２０℃の冷凍庫に保存することによって作られる。超音波処理により、より小さなビーズが生成される。

一例では、脂質溶液は、約１ｍｌのプロピレングリコール＋１ｍｌのグリセロール＋８ｍｌの緩衝液＋１０ｍｇの脂質ブレンドを含んでもよい。脂質－ＰＦＣ溶液は超音波処理されてもよい。０．５インチのプローブで７５０ワットのソニケータの場合、３０％ＰＦＰを使用するＰＦＣ溶液は、合計超音波処理時間が約１５秒に達するまで、約３秒間オンと約１０秒間オフで超音波処理される。４０％ＰＦＨを利用するＰＦＣ溶液は、約１５秒の合計超音波処理時間に達するまで、約３秒間オンと約１０秒間オフで超音波処理される。５０％ＰＦＯＢを利用するＰＦＣ溶液は、約１５秒の合計超音波処理時間に達するまで、約３秒間オンと約１０秒間オフで超音波処理される。超音波処理により、液滴溶液が生成される。

より大きなサイズの液滴を調製するために、ＰＦＣ液体の量を増やし、ソニケータの入力電力を大幅に減らす。別の非限定的な例示的な実施形態では、５００マイクロリットルのＰＦＣ及び２ｍＬの脂質溶液を３ｍＬのバイアルに入れてもよい。次に、バイアルをバイアルミキサで４８００ｒｐｍで３０秒間振ってもよい。調製された液滴懸濁液は、いくつかのマイクロバブルを有していてもよい。マイクロバブルが存在する場合、溶液を遠心分離してもよい。

〔実施例〕
〔実施例１〕ネガティブ選択に使用されるパーフルオロヘキサン液滴
小さな液滴の製造プロトコル（超音波処理）：脂質－ＰＦＨ溶液は、ホーンソニケータ（０．５インチプローブ、最大出力７５０ワット）を使用して超音波処理される。キュベットに、２ｍｌのパーフルオロヘキサンと４ｍｌの脂質溶液を注ぐ。ソニケータの先端は、パーフルオロヘキサンと脂質溶液の界面に配置された。サンプルホルダの冷却には、透明な低温槽を使用した。１３％の超音波処理振幅が使用され、パルスモードで動作した。２秒のオンと８秒のオフのパルス波を５回使用して、有効な超音波処理時間を１０秒とした。超音波処理により高度に多分散の集団が生成されるため、非常に小さな液滴を取り除くために複数回の遠心分離洗浄を実行した。遠心分離中の洗浄と希釈には２％ＢＳＡ－ＤＰＢＳ緩衝液を使用した。図４は、遠心分離ステップ後の最終的なサイズ分布を示している。サンプルのサイズ測定には、ベックマンコールターカウンタ（マルチサイザ）を使用した。

大きな液滴のプロトコル（均質化）：４ｍｌのＰＦＨと６ｍｌの脂質溶液を３０ｍｌビーカーに注ぎ、均質化を行った。ＩＫＡ Ｔ２５ ＵＬＴＲＡ ＴＵＲＲＡＸのホモジナイザを１０，０００ｒｐｍで４５秒間使用した。均質化した後、所望のサイズを達成するために複数回の遠心分離洗浄を行った。図５は、遠心分離ステップ後の最終的なサイズ分布を示している。

〔実施例２〕ポジティブ選択に使用されるパーフルオロヘキサン液滴
目的：ロイコパックからＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を単離する。

液滴製造：ＰＦＨ液滴は、ホモジナイザを使用して大量に調製された。プロセスは、工業規模で液滴を生成するように変更された。４８０ｍｌの脂質溶液を３２０ｍｌのパーフルオロヘキサン液体とビーカー内で２５０００ｒｐｍで４分間混合した。ビーカーは氷冷水で覆われていた。均質化は非常に多分散の集団をもたらし、所望の集団を達成するために遠心分離の複数のステップが行われた。目的は、直径５～８μｍの平均サイズを取得することであった。

遠心分離：目的は、非常に小さな液滴が所望の音響パワーでカラムに保持されない可能性があるため、それらを取り除くことである。遠心分離の目的で５００ｍｌの大きな遠心分離カップを使用した。この研究で使用されたすべての速度は、Ｒｍｉｎ＝１００ｍｍ及びＲｍａｘ＝２０５ｍｍの遠心分離機で計算された。以下は、各遠心分離ステップの詳細である。

Ｃ１：３００ｍｌの緩衝液を遠心分離カップに充填し、その後、２００ｍｌの最初の液滴溶液をカップに穏やかに注いだ。遠心分離は５００ｒｐｍで３分間行った。

Ｃ２：前のステップからの上澄みを除去し、ペレットをビーカーに集めた。カップを洗浄し、３００ｍｌの緩衝液で再度満たし、ペレット（２００ｍｌに再処方）を静かに注いだ。遠心分離は５００ｒｐｍで３分間行った。

Ｃ３：前のステップからの上澄みを除去し、ペレットをビーカーに集めた。カップを洗浄し、３００ｍｌの緩衝液で再度満たし、ペレット（２００ｍｌに再処方）を静かに注いだ。遠心分離は４５０ｒｐｍで３分間行った。

Ｃ４：前のステップからの上澄みを除去し、ペレットをビーカーに集めた。カップを洗浄し、２％ＢＳＡを含む３００ｍｌの緩衝液で再度満たし、ペレット（２００ｍｌに再処方）を静かに注いだ。遠心分離は４５０ｒｐｍで２分間行った。

Ｃ５：４ステップの遠心分離後にペレットを収集した。液滴溶液を十分な量のニュートラアビジンとともに４℃で１時間培養した。ニュートラアビジンの量は、４つの遠心分離のステップの後の液滴の平均サイズ及び溶液濃度に依存する。

Ｃ６：培養したニュートラアビジン液滴溶液を、２％ＢＳＡ溶液で満たされた５００ｍｌの遠心分離カップに注ぎ、結合していないニュートラアビジンを洗浄する。遠心分離は４５０ｒｐｍで３分間行った（ＢＳＡ溶液３００ｍｌ＋培養した液滴溶液２００ｍｌ）。

Ｃ７：前のステップからの上澄みを除去し、２００ｍｌに再処方し、２％ＢＳＡ溶液（３００ｍｌ）ですでに満たされた遠心分離カップに注ぐ。遠心分離は４５０ｒｐｍで２分間行った。

Ｃ８：遠心分離カップから上澄みを除去し、サイズ分布測定のために液滴サンプルをバイアルに収集する。

別の例として、粒子の外層は、粒子の生物学的相互作用又は反応を引き起こすのに役立ってもよい。例えば、外層は、粒子が親和性結合に使用されることを可能にしてもよい。

与えられたサイズと濃度に対するニュートラアビジンの量の計算：ＰＦＣ液滴はニュートラアビジンと結合して、ビオチン化抗体で生体機能化された細胞に結合できるようにする。液滴が合成され、遠心分離されて所望のサイズの母集団が得られたら、それらは十分な量のニュートラアビジン溶液と混合される。ニュートラアビジンの量は、シェル内にあるビオチン化脂質、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００－ビオチン又はＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００－デスチオビオチンの量に依存する。ニュートラアビジンは、液滴上のすべてのビオチン部位を覆うように、過剰に添加する必要がある。液滴溶液がニュートラアビジンで飽和していない場合、液滴間の架橋につながる可能性がある。ここでは、与えられた液滴サイズと濃度に対するニュートラアビジンの計算を示す。

計算では、すべてのビオチンが結合に利用可能であって、液滴の架橋がないことを前提としている。ニュートラアビジンの計算では、液滴集団の平均サイズが考慮される。各タイプの脂質の分子のモル比と表面積とに基づいて、利用可能なビオチン部位の数を、与えられたサイズの液滴で計算できる。ビオチン部位の数から、ニュートラアビジンの総質量を、与えられた液滴集団について計算することができる。表６は、すべての脂質の単一分子のトポロジー平面面積を示している。表７と表８は、それぞれ１ｍｌの小さな液滴と大きな液滴のニュートラアビジンの計算を示している。液滴は、ニュートラアビジン溶液とともに４℃で３０分間培養される。培養の後、液滴－ニュートラアビジン溶液を２回洗浄して、結合していないニュートラアビジンをすべて除去する必要がある。溶液中の非結合ニュートラアビジンは、培養中に細胞上の結合部位（ビオチン化抗体で生体機能化）をブロックする。

〔実施例３〕ポジティブ選択に使用され、溶出に適したパーフルオロヘキサン液滴
目的：ロイコパックからＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、細胞から液滴を溶出する。

液滴の製造：ＰＦＨ液滴は、ビオチンニュートラアビジン結合を使用して細胞を標的にする。目的は細胞を単離することだけでなく、最終的に液滴を溶出することであるため、脂質調製物にビオチンの改変型を使用した。実施例２のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ビオチンをＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００－デスチオビオチンに置き換えて溶出を達成した。デスチオビオチン分子は、通常のビオチン分子の２つの環と比較して、１つの環しかなく、通常のビオチン液滴と比較して、ニュートラアビジンに対する親和性が低くなっている（ハーシュら、２００２）。デスチオビオチン脂質を用いて液滴を製造した後、液滴をニュートラアビジンとともに培養する。溶出を達成するために、デスチオビチン液滴細胞複合体を５０ｍＭのビオチン緩衝液中で３７℃で２時間培養した。緩衝液に存在する遊離ビオチンはニュートラアビジン又はストレプトアビジンに対してより親和性があるため、ニュートラアビジンに非共有結合したデスチオビオチン液滴を置き換える。液滴製造の他のステップは、実施例２に示されているように実行された。デスチオビオチン液滴のサイズ分布は、実施例２で製造された通常のビオチン液滴と同様である。

〔フローサイトメトリによる液滴のビオチン結合容量の測定〕
音響親和性セル選択（ＡＡＣＳ）に使用される液滴は、ストレプトアビジンの脱グリコシル化された形態であるニュートラアビジンでコーティングされている。ニュートラアビジンはビオチンに対して非常に高い親和性（ＫＤ＝１０－１５）を有している。液滴上のニュートラアビジンが単位表面積当たりに結合できるビオチンの量（ビオチン結合容量）は、ＡＡＣＳカラムでの結合の成功を改善するために計算される。蛍光ビオチン（ビオチン－ＡＰＣ結合体）は、ニュートラアビジンで液滴に標識されている。蛍光が較正され、ビオチン結合がフローサイトメトリを使用して測定される。図６は、通常のビオチン液滴に対するビオチン結合容量を示している。図７は、デスチオビオチン液滴の結合容量を示している。どちらのタイプの液滴も、同様のビオチン結合容量を有している。ビオチン結合容量は、液滴表面の６～１２ｐｍｏｌビオチン／ｃｍ２の間でバッチごとに異なる。図６及び図７は、ｙ軸にカウント数を示し、ｘ軸に平均蛍光強度を示している。デスチオビオチン液滴結合容量のプロットには、通常のビオチン液滴の単一プロットと比較して２つのピークがある。デスチオビオチン液滴のプロットの２番目のピークは、測定に使用されたビオチン－ＡＰＣの使用に起因する可能性がある。ビオチンＡＰＣがニュートラアビジンからのデスチオビオチン液滴を置き換えた可能性があり、２番目のピークはそのようなクラスタからのシグナルである可能性がある。

細胞選択の例では、液滴を使用して細胞単離試験を実施する。この試験では、液滴はデスチオビオチンで製造することができる。細胞（標的及び非標的）を抗ＣＤ４ビオチン抗体及び抗ＣＤ８ビオチン抗体と培養し、液滴を音響分離カラムに充填する。カラムに液滴が充填されると、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ緩衝液がカラムを通してフラッシュされ、音響がオンになる。数分で、液滴懸濁液のゾーンが、生成された音響場のエッジの下に形成される。安定したエッジが形成された後、細胞懸濁液がカラムに充填され、続いて抗体を含む細胞が液滴に付着する。フラッシュ緩衝液の流れは継続され、遊離した未結合の細胞を洗い流す。遊離した細胞がカラムを離れる時間が経過した後、溶出プロセスを実装できる。溶出プロセスは、細胞からデスチオビオチン液滴を溶出するために、ビオチン溶出緩衝液をカラムに供給することを含んでもよい。流れを再循環させてもよく、その間にカラムの温度を３７℃に上げてもよい。より高い温度とせん断により、溶出を加速させてもよい。溶出段階では、音響がオフになる。再循環の１時間後、音響がオンになり、フラッシュ緩衝液を使用して溶出した細胞を液滴から分離する。細胞はＰＦＨ液滴ほど音響的に応答しないため、音響によってカラムに保持されないが、ＰＦＨ液滴は音響エッジの下に保持される。この全体的なプロセスにより、高い溶出効率が得られる。

他の例では、細胞のポジティブ選択及びネガティブ選択は、パーフルオロヘキサン（ＰＦＨ）液滴を使用して実行され、標的細胞の高純度及び高回収率が達成された。比較のために、ＴＣＲ細胞のネガティブ選択を行い、ＰＦＨ液滴とプロメガビーズを使用した。ＰＦＨ液滴を使用したため、純度及び回収率はプロメガビーズよりも大幅に高くなっている。パーフルオロカーボンとリン脂質はどちらも生体適合性があり、過去にさまざまな薬剤に使用されてきた。パーフルオロヘキサンの液滴は、細胞の分離を促進するだけでなく、溶出を達成するために改変してもよい。液滴上に存在するビオチンをデスチオビオチンに改変し、遊離ビオチン分子を含む溶出緩衝液を使用して、細胞複合体からＰＦＨ液滴を溶出させてもよい。

ＰＦＨ液滴は、標的細胞のより高い純度と回収率をもたらす。ＰＦＨとリン脂質はどちらも生体適合性がある。それらは、ＦＤＡ承認薬で使用された確かな実績がある。

市販のプラットフォームは、ロイコパック（Ｌｅｕｋｏｐａｋ）などの複雑な入力を処理する規模と能力に制限があり、ほとんどのプラットフォームはＰＢＭＣを入力として使用するように設計されている。ＰＦＨ液滴は、細胞を単離するための連続プロセスを容易にする。プロセスをスケールアップするために、カラムの容量、音響入力、流量率、及びＰＦＨ液滴量を適宜変更できる。様々な音響カラムの容量とチャンバで数百万の細胞から数十億の細胞を処理することを実証した。

ＰＦＨ液滴を使用した全体的な細胞単離は、４時間未満で完了する。これは、最も近い競合他社が費やした時間よりも大幅に短い時間である。市販のミルテニー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）社の製品は、カラムの設計上の制限により、単一のカラムでより高い流量率で操作することはできない。それらは、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）間のチャネルの幅（リンパ球の約２０倍のサイズ）によって制限される。スフェロイドの境界近くに高強度の磁場が存在し、チャネルの大部分で磁場は低い強度である。幅を広げると、磁気ビーズに付着した細胞の捕捉が損なわれる可能性がある。ＰＦＨ液滴は、このような操作上の流量率制限によって制約されない。

ミルテニー社製のビーズのサイズは１００～２００ｎｍであるため、処理中に細胞に内在化する可能性がある。ここで使用されているＰＦＨビーズの平均サイズは５～７μｍであるため、細胞への内在化の可能性は最小限に抑えられる。

フッ素化された液滴はニュートラアビジンと結合して、ビオチン化抗体で生体機能化された細胞に結合できるようにする。液滴が合成され、遠心分離されて所望のサイズの集団が得られたら、それらは所望の量のニュートラアビジン溶液と混合される。ニュートラアビジンの量は、シェルにあるビオチン化脂質、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００－ビオチンの量に依存する。ニュートラアビジンは、液滴上のすべてのビオチン部位を覆うように、過剰に加えることができる。液滴溶液がニュートラアビジンで飽和していない場合、液滴間の架橋につながる可能性がある。ここでは、特定の液滴サイズと濃度に対するニュートラアビジンの計算を示す。

ロイコパックを適切な量の抗体とともに３０分間培養し、音響親和性カラムに充填した。細胞抗体と液滴との間の結合はカラムで起こる。非標的細胞は音響応答性がないため、音響チャンバを通過するが、標的細胞と液滴との複合体はカラムで引き止められる。カラムを緩衝液でフラッシュして、非標的細胞をカラムから除去した。一定時間後（細胞量、カラム容量によって異なる）、フラッシング処理を停止し、標的メカニズムの種類に基づく対応する溶出技術を使用して、液滴からの標的細胞の溶出を開始した。標的メカニズムは、抗体、アプタマー、又は抗体とオリゴの結合体に基づくことができた。標的細胞の純度（Ｐｕｒｉｔｙ）と回収率（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）は、式１と２を使用して計算した。次のセクションで示す純度と回収率は、溶出に基づくのではなく細胞数の保存に基づいていることに留意されたい。

カウント方法：血液分析装置のカウントにフローサイトメトリのパーセンテージを乗算した。

抗体：ＣＤ－４抗体は１００万個の標的細胞当たり１Ｋｄ量、ＣＤ８抗体は１００万個の標的細胞当たり１Ｋｄ量。

結果：細胞単離は、音響親和性流動床カラムで実行された。以下に報告する結果は、異なる３日の実験から収集されたもので、毎日同じ条件下で３つの異なるタイプの粒子をテストしている。テストされた粒子は、小さな液滴、大きな液滴、及びプロメガビーズであった。毎日、液滴を約２０％の固形分濃度で５ｍｌカラムに充填した。１億の総細胞の最初の１０ｍｌサンプルのシングルパスと３０ｍｌの緩衝液フラッシュとで構成されたカラムが実験中に冷却された。流量率はすべてのカラムで１ｍｌ／ｍｉｎで、出力は小さな液滴を含むカラムで１Ｗ、大きな液滴又はプロメガビーズを含むカラムで０．６Ｗであった。

各実験について、ＴＣＲ－細胞の純度と回収率を次の式を使用して計算した。

細胞のポジティブ選択及びネガティブ選択はまた、様々な粒子を使用して実行されてもよい。例えば、ＴＣＲポジティブＴ細胞のネガティブ選択は、機能化粒子がＴＣＲポジティブＴ細胞と結合し、ＴＣＲポジティブＴ細胞がシステムから除去される処理である。ＴＣＲポジティブＴ細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞治療（ＣＡＲ－Ｔ）などの処理に有害である。

ポジティブ選択処理はまた、細胞培養物から選別されて、その後細胞治療に利用されるように適切に機能化された粒子によって、改変されたＴ細胞が選択される特定の細胞に利用されてもよい。

以下に報告する結果は、異なる３日の実験から収集されたもので、毎日同じ操作条件下で３つの異なるタイプの粒子をテストしている。テストされた粒子は、小さな液滴、大きな液滴、及びプロメガビーズであった。毎日、液滴を約２０％の体積濃度で５ｍｌカラムに充填した。１億の総細胞の最初の１０ｍｌサンプルを使用したシングルパスと３０ｍｌの緩衝液フラッシュで構成されたカラムが実験中に冷却された。流量率はすべてのカラムで１ｍｌ／ｍｉｎで、出力は小さな液滴を含むカラムで１Ｗ、大きな液滴又はプロメガビーズを含むカラムで０．６Ｗであった。３日間の小さな違いの１つは、３日目に小径のチューブを使用したことである。この変更により、システムの滞留量（ｈｏｌｄｕｐ ｖｏｌｕｍｅ）が大幅に減少し、サンプルの希釈が少ないため、３日目の最初の流出サンプルの分析が可能になった。ただし、このレポートの目的上、分析はすべての日で一貫しているため、流出サンプルは分析に使用されない。

実験ごとに、３つの測定基準が計算され、粒子のタイプを相互に比較するために使用される。総純度（Ｔｏｔａｌ Ｐｕｒｉｔｙ）、ＴＣＲ－細胞の回収効率（ＴＣＲ^－ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ）及びＴＣＲ^＋細胞の除去効率（ＴＣＲ^＋ｃｅｌｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）はすべて、次の式を用いて計算される。

〔試験１〕

〔試験２〕

〔試験３〕

結合と溶出の例（デスチオビオチン液滴を含むニュートラアビジン）：ロイコパックを適切な量の抗体と培養し、３０分後に音響親和性カラムに充填した。細胞抗体と液滴との間の結合はカラムで起こる。非標的細胞は音響応答性がないため、音響チャンバを通過するが、標的細胞と液滴の複合体はカラムで引き止められる。カラムを緩衝液でフラッシュして、非標的細胞をカラムから除去した。一定時間後（細胞量によって異なる）、フラッシング処理を停止し、５０ｍＭのビオチン緩衝液をカラムに流すことにより、液滴からの標的細胞の溶出を開始した。ビオチン緩衝液をより高い流量率で再循環させて、高剪断を作り出した。高剪断下では、デスチオビオチンとニュートラアビジンの相互作用が大幅に減少し、これにより全体的な溶出時間が短縮され、溶出効率が向上する可能性がある。ビオチン緩衝液を１時間再循環させた後、流量率を減らし、音響の境界にエッジを形成する。エッジの形成により、溶出したＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞のフラッシュアウトが容易になるが、裸の液滴は引き止められる。結合は、１×１インチサイズの音響チャンバを備えた５０ｍｌカラムで行った。液滴と細胞抗体の複合体との間の結合は室温で行われ、流量率は１２．５ｍｌ／ｍｉｎであった。カラムには、１５体積パーセントの液滴が充填された。３５ｍｌのロイコパックを使用したところ、２４億個のＴ細胞が得られた。音響チャンバに不要な細胞がトラッピングされないように、この流量率では電力を１４Ｗに維持した。溶出メカニズムは、デスチオビオチン液滴に基づいていた。溶出を考慮に入れると、純度と回収率の式が変わる。

結合と溶出の例（デスチオビオチン液滴を含むストレプトアビジン）：ロイコパックを適切な量の抗体と培養し、３０分後に音響親和性カラムに充填した。細胞抗体と液滴との間の結合はカラムで起こる。非標的細胞は音響応答性がないため、音響チャンバを通過するが、標的細胞と液滴の複合体はカラムに引き止められる。カラムを緩衝液でフラッシュして、非標的細胞をカラムから除去した。一定時間後（細胞量によって異なる）、フラッシング処理を停止し、１００ｍＭのビオチン緩衝液をカラムに流すことにより、液滴からの標的細胞の溶出を開始した。ビオチン緩衝液は、振動流を使用して再循環された。振動流は混合を促進し、溶出部位へのビオチンの拡散を増加させ、それによって溶出時間と溶出効率を低下させる可能性がある。ビオチン緩衝液を１時間再循環させた後、流量率を減らし、音響の境界にエッジを形成する。エッジの形成により、溶出したＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞のフラッシュアウトが容易になるが、裸の液滴は引き止められる。結合は、１．５×１．５インチサイズの音響チャンバを備えた５０ｍｌカラムで行った。液滴と細胞抗体の複合体との間の結合は室温で行われ、流量率は２０ｍｌ／ｍｉｎであった。カラムには、１５体積パーセントの液滴が充填された。３５ｍｌのロイコパックを使用したところ、４４．５億個のＴ細胞が得られた。音響チャンバに不要な細胞がトラッピングされないように、この流量率では電力を２０Ｗに維持した。溶出メカニズムは、デスチオビオチン液滴に基づいていた。溶出を考慮に入れると、純度と回収率の式が変わる。

この例では、回収率＝溶出生成物中のＣＤ４／供給中のＣＤ４である。純度＝（ＣＤ４＋ＣＤ８）／ＣＤ４５である。効率=（溶出中のＣＤ４＋ＣＤ８）／（カラム中のＣＤ４＋ＣＤ８）である。回収率＝（溶出中のＣＤ４＋ＣＤ８）／（供給中のＣＤ４＋ＣＤ８）である。ポジティブ選択におけるＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の純度と回収率は、数の維持と溶出に基づいている。溶出効率のプロセスは、温度、培養時間、遊離ビオチン緩衝液濃度を最適化することで向上させることができる。

上記の方法、システム、及びデバイスは例である。様々な構成では、必要に応じて、いろいろな手順又はコンポーネントを省略、置換、又は追加してもよい。例えば、代替構成では、これらの方法は、記載されている順序とは異なる順序で実行してもよく、いろいろなステップを追加、省略、又は組み合わせてもよい。また、特定の構成に関して説明された機能は、他の様々な構成で組み合わせてもよい。構成の異なる態様及び要素は、同様の方法で組み合わせてもよい。また、技術は進化しているため、要素の多くは例であり、開示又はクレームの範囲を制限するものではない。

構成例（実装を含む）を完全に理解できるように、具体的な詳細が説明に記載されている。ただし、構成はこれらの具体的な詳細なしで実行されてもよい。例えば、よく知られているプロセス、構造、及び手法は、構成が不明瞭になるのを避けるために、不必要な詳細なしで示されている。この説明は、構成例のみを提供し、特許請求の範囲、適用可能性、又は構成を制限するものではない。むしろ、構成の前述の説明は、説明された技法を実装するための説明を提供する。本開示の趣旨又は範囲から逸脱することなく、要素の機能及び配置に様々な変更を加えることができる。

また、構成は、フロー図又はブロック図として示されるプロセスとして説明されてもよい。それぞれが操作を順次プロセスとして説明してもよいが、操作の多くは並行して実行することも、同時に実行することもできる。また、操作の順序を変更してもよい。プロセスには、図に含まれていない追加のステージ又は機能が含まれてもよい。

いくつかの例示的な構成を説明したが、本開示の精神から逸脱することなく、様々な修正、代替構造、及び同等物を使用してもよい。例えば、上記の要素は、より大きなシステムのコンポーネントであってもよく、他の構造又はプロセスが、本発明の適用よりも優先されるか、さもなければ修正されてもよい。また、上記の要素が考慮される前、最中、又は後に、多くの操作が行われてもよい。従って、上記の説明は、特許請求の範囲を拘束するものではない。

Claims (21)

1. 粒子を製造するための方法であって、
   脂質化合物を調製することと、
   パーフルオロカーボンを前記液体化合物と組み合わせることと、
   前記組み合せを撹拌することと、を含む、方法。
2. 請求項１の方法において、
   遠心分離、超音波処理、均質化又は機械的攪拌のうちの１つ又は複数によって前記組み合わせを攪拌することを更に含む、方法。
3. 請求項１の方法において、
   所定の粒子サイズ分布を達成するために前記組み合わせを攪拌することを更に含む、方法。
4. 請求項３の方法において、
   前記粒子サイズ分布は、約４００ｎｍから約３００μｍの範囲にある、方法。
5. 請求項１の方法において、
   各脂質の特性に基づいた順序で、互いに異なる脂質を組み合わせて前記脂質化合物を調製することを更に含む、方法。
6. 請求項５の方法において、
   脂質溶媒で溶液を調製することと、
   前記溶液を加熱することと、
   溶解性の順に、互いに異なる前記脂質を前記溶液に加えることと、を更に含む、方法。
7. 請求項１の方法において、
   前記脂質化合物は、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＥＧ４０ステアリン酸、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（２０００）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）－ビオチン、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－５０００－ビオチン、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）－デスチオビオチン、ＰＢＳ緩衝液、グリセロール、プロピレングリコール又はＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）－マレイミドの１つ又は複数を含む、方法。
8. 請求項１の方法において、
   前記パーフルオロカーボンは、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロオクタン、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロジクロロオクタン又はパーフルオロデカリンのうちの１つ又は複数である、方法。
9. 請求項１の方法において、
   リンカーで前記粒子を機能化することを更に含む、方法。
10. 請求項９の方法において、
    前記リンカーは可逆的である、方法。
11. 請求項９の方法において、
    前記リンカーは、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン、ビオチン、デスチオビオチン、抗体、アプタマー又はオリゴマーのうちの１つ又は複数を含む、方法。
12. 請求項１の方法において、
    安定剤又は界面活性剤を前記粒子に適用することを更に含む、方法。
13. 請求項１乃至１２のいずれかの方法によって製造された粒子。
14. 細胞選択に使用するための粒子であって、
    パーフルオロカーボンのコアと、
    前記コアの少なくとも一部を覆う脂質のシェルと、を有し、
    前記脂質のシェルはリンカーで機能化されている、粒子。
15. 請求項１４の粒子において、
    複数の粒子を更に有し、
    前記粒子の粒子サイズ分布は、約４００ｎｍから約３００μｍの範囲にある、粒子。
16. 請求項１４の粒子において、
    前記脂質のシェルは、互いに異なる脂質の組み合わせを更に有する、粒子。
17. 請求項１６の粒子において、
    前記脂質のシェルは、ＤＰＰＡ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＰＥＧ４０ステアリン酸、ＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（２０００）、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）－ビオチン、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－５０００－ビオチン、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）－デスチオビオチン、ＰＢＳ緩衝液、グリセロール、プロピレングリコール又はＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）－マレイミドの１つ又は複数を含む、粒子。
18. 請求項１４の粒子において、
    前記パーフルオロカーボンのコアは、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロオクタン、パーフルオロオクチルブロミド、パーフルオロジクロロオクタン又はパーフルオロデカリンのうちの１つ又は複数を含む、粒子。
19. 請求項１４の粒子において、
    前記リンカーは、アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン、ビオチン、デスチオビオチン、抗体、アプタマー又はオリゴマーのうちの１つ又は複数を含む、粒子。
20. 請求項１４の粒子において、
    安定剤又は界面活性剤を更に有する、粒子。
21. 流体から標的粒子を分離するための方法であって、
    チャンバ内の流体における請求項１４の機能化された粒子を受けることと、
    前記チャンバ内の標的粒子を受けることと、
    前記標的粒子が前記機能化された粒子と結合できるようにすることと、
    音響波を前記チャンバに印加して、前記音響波によって収集又は阻止されるように前記機能化された粒子に影響を与えることと、を含む、方法。

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