JP2022551658A

JP2022551658A - 改変された幹細胞およびその使用方法

Info

Publication number: JP2022551658A
Application number: JP2022521618A
Authority: JP
Inventors: ビャルキヨハネソン; ディープタバッタチャリャ; ハナピザト
Original assignee: ニューヨークステムセルファウンデーションインコーポレイテッド; アリゾナボードオブリージェンツオンビハーフオブザユニバーシティーオブアリゾナ
Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2020-10-09
Publication date: 2022-12-12
Also published as: WO2021072302A1; CN115135330A; CA3157358A1; AU2020364139A1; EP4041255A4; IL291982A; US20230235280A1; MX2022004373A; KR20220132521A; EP4041255A1

Abstract

本発明は、改変された幹細胞（SC）および疾患を処置するための前記SCの使用を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C. §119(e)の下で、2019年10月10日に出願された米国仮特許出願第62/913,568号の優先権の恩典を主張し、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。

政府の支援に関する言及
本発明は、国立衛生研究所により授与されたR21 AI132910の下で、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明に関して一定の権利を有している。

発明の分野
本発明は、概して、医療分野、より具体的には遺伝子改変された幹細胞（SC）、例えば、遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞（hESC）、および疾患を処置するためのそれらの使用に関する。

発明の背景
細胞移植の形式の再生医療は、難治性の医学的状態、例えば糖尿病、心疾患および神経変性疾患の処置における最も見込みのある治療アプローチの1つである。しかし、臨床での細胞移植の実施に向けての大きなハードルは、ドナー細胞の、特にこれらが外来宿主由来である場合の、免疫拒絶である。免疫抑制薬を投与することによって部分的に免疫拒絶に対処することは可能であるが、これらは典型的に重い有害な副作用を伴う。

臓器移植は、特定の疾患を有する人々を処置する機会を提供し、臓器レシピエントが生涯を全うすることを可能にし得る。例えば、末期段階の肝臓、肺および心疾患の場合、移植は、一般に、唯一の利用可能な治療上の選択肢である。免疫抑制薬および補助的ケアの改善により、短期的な患者および移植片の生存率は向上した。しかし、この成功は、様々な問題、例えば、乏しい長期的移植片生存率、継続的な免疫抑制薬投与の必要性および臓器の需要と供給の不一致により妨げられている。

同種移植は、ドナー組織の供給を増やすために開発された。しかし、同種反応を制限するのは、非常に困難なことである。同種移植は、レシピエントの免疫系が下方調節されない限り成功しない。現在の臨床標準は、全身免疫抑制薬投与の使用であるが、これは移植片の効果を減少させ、感染の危険を大きく増加させる。

免疫監視の理解および細胞、例えばSCを遺伝子改変する能力の進歩により、免疫拒絶を回避する細胞の作製が可能になっている。しかし、細胞移植療法のための改善された技術を開発することが今も必要とされている。

本発明は、遺伝子改変されたSC、ならびにそれらの作製方法および疾患、例えば1型糖尿病（T1D）を処置するための使用を提供する。

したがって、態様において、本発明は、遺伝子改変されたSCを作製する方法を提供する。1つの局面において、この方法は、a）HLA-I、HLA-IIまたはそれらの組み合わせの発現を野生型SCと比較して減少させるようSCを改変する工程、ならびにb）CR1および／またはCD24、ならびに任意でCD47、CD55、CD46、CD59および／またはHLA-E一本鎖三量体の1つまたは複数を含む免疫回避遺伝子を発現するよう外因性構築物を導入する工程を含む。

いくつかの局面において、免疫回避遺伝子は、CR1およびCD24、ならびに任意でCD47、CD55、CD46、CD59および／またはHLA-E一本鎖三量体の1つまたは複数を含む。

いくつかの局面において、SCは、PDL1および／またはHLA-G一本鎖三量体の1つまたは複数を発現するようさらに改変され得る。

いくつかの局面において、免疫回避遺伝子は、CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59およびHLA-E一本鎖三量体を含む。

別の態様において、本発明は、本発明の方法により作製される遺伝子改変されたSCを提供する。

さらに別の態様において、本発明は、（i）HLA-IおよびHLA-IIの発現が抑止される、ならびに（ii）SCが、CR1および／またはCD24、ならびに任意でCD47、CD55、CD46、CD59および／またはHLA-E一本鎖三量体の1つまたは複数を発現するよう遺伝子改変されている、改変されたSCを提供する。

さらに別の態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変されたSCに由来する細胞株を提供する。

別の態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変されたSCを分化させることにより生成される分化した細胞または組織を提供する。様々な局面において、細胞または組織は、ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統または血液細胞系統である。

別の態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変されたSCを分化させることにより生成されるβ細胞を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、その必要のある対象において本発明の遺伝子改変されたSCまたは遺伝子改変されたSCの子孫を用いて疾患または障害を処置する方法を提供する。

別の態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変されたSCまたはβ細胞を対象に投与し、それによって対象においてT1Dを処置することにより、対象においてT1Dを処置する方法を提供する。

図1Aは、HLA欠損hES細胞株の作製を示している。ゲノム編集のワークフローが示されている。Cas9およびHLA発現に必須の遺伝子に対してターゲティングされた3つのgRNAをH1 hES細胞にヌクレオフェクトした。2ラウンドのサブクローニングおよびMiSeq（商標）分析により、クローンの変異細胞株を得た。図1Bは、HLA欠損hES細胞株の作製を示している。標的とされた遺伝子のMiSeq（商標）分析の例が示されている。6つの対立遺伝子中の5つにフレームシフト変異を導入した。図1Cは、HLA欠損hES細胞株の作製を示している。IFNg処置ありまたはなしでHLA-I発現に関して染色されたWTまたはHLA-KO hES細胞のグラフデータが示されている。HLA-I発現は、b2mおよびTAP1欠損細胞において見られなかった。図2Aは、臍帯血ヒト化マウスが異種性奇形種を拒絶しないことを示すデータを示している。臍帯血CD34+細胞の移植から20週後のNSG-W41マウスの脾臓のキメラ性を示すデータが示されている。図2Bは、臍帯血ヒト化マウスが異種性奇形種を拒絶しないことを示すデータを示している。未改変またはHM-KO hES細胞の移植後のヒト化または対照NSG-41レシピエントにおいて成長させた奇形種のグラフデータが示されている。図3は、免疫回避遺伝子の発現により免疫応答性マウスにおいて奇形種が成長できるようになることを示す図である。HLAI/IIKO hES細胞に、列挙されているマウス免疫回避遺伝子をレンチウイルス形質導入した。およそ30％の細胞がいずれかの与えられたレンチウイルスに感染し、4つすべての遺伝子を発現する細胞は比較的低頻度であった。これらまたは対照細胞を、まとめて5匹のWT C57B16/Nマウスに移植し、8週間にわたって奇形種の成長を測定した。レンチウイルスを受け取った細胞のみが成長を示した。図4は、免疫回避遺伝子を発現するHM-KO細胞の選択に関するグラフ集である。最初に、HM-KO細胞を、Crry、mCD55、mCD59およびK^b一本鎖三量体をコードするレンチウイルスで形質導入した。次に、細胞を、それらがCrry、mCD59およびK^b一本鎖三量体を均一に発現するよう選別した。これらの細胞のおよそ60％は、mCD55も発現していた。これらの細胞を用いて、異種移植のためのβ細胞を生成した（左パネル、選別前）。これらの細胞を成長させ、mCD47でさらに形質導入し、ついでmCD55発現±CD47に関して選別した。これらは異種移植に使用される次世代の細胞である。選別前および選別後のフローサイトメトリープロフィールが示されている。図5は、実施例で使用した分化プロトコルのステージ4および7における、NKX6.1発現レベルにより測定されるWT、HM-KOおよびHM-KO-レンチECSの分化効率を示すグラフである。図6Aは、GFP IHCにより示される、移植1週間後の免疫応答性マウスにおいて生存しているHM-KO-レンチ幹細胞由来疑似膵島（pseudo-islet）移植片を示す画像集である。図6Bは、GFP IHCにより示される、移植2ヵ月後の免疫応答性マウスにおいて生存しているHM-KO-レンチ幹細胞由来疑似膵島移植片を示す画像集である。図7は、図6Aおよび6iBに示されるのと同じ切片由来のネイティブの乳腺の画像である。GFPの非存在は、図6Aおよび6Bにおけるシグナルの特異性を強調している。図8は、遺伝子改変された疑似膵島を移植されたマウスにおけるヒトC-ペプチドの血液レベルを示すグラフである。図9Aは、AAVSターゲティングの修正を示す画像である。示されているのは、アデノ随伴ウイルス組み込みの実際の部位と比較した、すべての現行のAAVSターゲティングベクターが標的とするよう設計されている遺伝子座の模式図である。図9Bは、AAVSターゲティングの修正を示す画像である。模式図には、マウス免疫回避遺伝子を実際のAAV組み込み部位にターゲティングするよう設計された例示的な改変ベクターが示されている。さらにサイレンシングの可能性を最小化するために、hEF1aプロモーターの上流に上流クロマチンオープニングエレメントを含めた。図9Cは、AAVSターゲティングの修正を示す画像である。mCD59、mCrry、mQa1-SCTおよびネオマイシン耐性をコードする元のまたは改変されたAAVSターゲティング構築物と共にCas9およびgRNASをトランスフェクトしたHM-KOまたはHUES2細胞に関するデータが示されている。細胞をネオマイシン中で2週間選択し、薬剤耐性細胞をmCD59発現について分析した。図9Dは、AAVS座の正確なターゲティングを示す画像である。増大のために単細胞選別されたmCD59陽性の細胞のデータが示されている。＞8週間の培養で再分析を行った。図10Aは、AAVS構築物が免疫回避を媒介することを示す画像である。ヒトCD55、CD46およびHLA-Eを発現するAAVSターゲティング構築物でトランスフェクトされたCHO細胞のデータが示されている。トランスフェクト体を、a-CHO抗体、ついでC7欠損ヒト血清で染色した。細胞を、C3c、C3dおよびC4c補体沈着について試験した。図10Bは、AAVS構築物が免疫回避を媒介することを示す画像である。一次ヒトNK細胞と共に培養された、図10Aと同じ構築物でトランスフェクトされた721.221細胞のデータが示されている。CD107a発現の関数としてNK細胞の脱顆粒化を測定した。図11Aは、複数回のラウンドの実験デザイン（DoE）最適化を通じてなされたβ細胞分化プロトコルの改善を示すデータを示している。図11Bは、複数回のラウンドのDoE最適化を通じてなされたβ細胞分化プロトコルの改善を示す画像である。図11Cは、複数回のラウンドのDoE最適化を通じてなされたβ細胞分化プロトコルの改善を示すデータを示している。図12は、回避遺伝子構築物の最適な組み合わせを決定し、WTおよびNODマウスにおいて実験を行い、AAVSターゲティングを通じて選択された回避遺伝子構築物を安定的に発現するHM-KO細胞株を作製する実験ワークフローを示す画像である。

発明の詳細な説明
本発明は、疾患の処置に有用な改変されたSCを作製するために使用され得る免疫回避因子の発見に基づいている。

本組成物および方法を説明する前に、本発明は本明細書に記載される特定の細胞、方法および／または実験条件に限定されず、そのような細胞、方法および条件は変更され得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明する目的しか有さず、限定を意図したものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲においてのみ限定され得ることも理解されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「一つの（a）」、「一つの（an）」および「その（the）」は、そうでないことを文脈が明確に示していない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「細胞（the cell）」の参照は、1つまたは複数の細胞を含み、「方法（the method）」の参照は、1つもしくは複数の方法、および／または本開示を読んだ当業者に明らかになるであろう本明細書に記載されるタイプの工程を含む、等である。

本発明は、少なくとも部分的に、改変されたSCを作製するために使用され得る免疫回避因子の発見に基づく。いくつかの局面において、本発明は、移植のための実質的に非免疫原性または最小限の免疫原性のSCを生成する変異を（例えば、CRISPR/Cas9を用いて）遺伝子内に含める、および補体沈着を防ぐ遺伝子を発現させて、免疫原性の主要な決定因子を排除する、SCの遺伝子操作に基づく。本発明の改変されたSCは、多くの疾患、例えば自己免疫障害、神経変性疾患、癌および感染疾患の処置のためのスケーラブルなオフ・ザ・シェルフ（off-the-shelf）治療、ならびに免疫拒絶を回避するよう変化させた細胞を用いるSCベースの治療の一般的用途を提供する。

したがって、態様において、本発明は、遺伝子改変されたSCを作製する方法を提供する。この方法は、a）HLA-I、HLA-IIまたはそれらの組み合わせの発現を野生型SCと比較して減少させるようSCを改変する工程、ならびにb）CR1および／またはCD24、ならびに任意でCD47、CD55、CD46、CD59および／またはHLA-E一本鎖三量体の1つまたは複数を含む免疫回避遺伝子を発現するよう外因性構築物を導入する工程を含む。

関連する態様において、本発明は、（i）HLA-IおよびHLA-IIの発現が抑止される、ならびに（ii）SCが、CR1および／またはCD24、ならびに任意でCD47、CD55、CD46、CD59および／またはHLA-E一本鎖三量体の1つまたは複数を発現するよう遺伝子改変された、改変されたSCを提供する。

本明細書に記載されるように、ヒトSCが免疫系の様々なアームの認識を回避するよう該ヒトSCを改変するために使用される方法および標的が開発された。本開示は、再生医療のための、ホストの免疫抑制なしで使用できる免疫原性が最小限のドナーSC株を作製する方法、およびそのような方法により作製される細胞を提供する。

移植、特に様々な疾患に対するSCベースの免疫療法のための実質的にまたは最小限の免疫原性のSC（例えば、hESC）が、本明細書に記載される。移植のためのそのような細胞および細胞株の作製は、スケーラブルなオフ・ザ・シェルフ細胞療法を可能にする。これは、民間企業により開発されるほとんどのSCベースの治療に望ましい。そのような細胞はまた、自己免疫によって破壊された組織、例えばT1Dにおける膵β細胞および多発性硬化症におけるオリゴデンドロサイトの再生医療処置を促進し得る。

本明細書で議論され実施例で例示されるように、SCを、免疫系の様々なアームによる認識を回避するよう遺伝子改変した。本明細書に記載される改変を単独でまたは以前に記載されたものと組み合わせて含むSCは、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、NK細胞、補体または食細胞による認識を回避することができる。さらに、この細胞は、誘導性自殺遺伝子および薬剤耐性カセットを含み得る。これは、副作用が生じた際の移植片の選択的排除を可能にし、クローン細胞株を同定するための培養下での薬剤選択を容易にする。まとめると、本プロセスは、移植のための有意に減少した免疫原性を有するSCの作製を可能にする。

特定の免疫受容体を妨害すること、および特定の導入遺伝子を（例えば、遺伝子欠失および／または導入遺伝子（cDNA）挿入により改変された）SCに導入することにより、万人向けのドナーSCを得ることができる。いくつかの局面において、同種CD8+ T細胞による直接認識を防ぐようHLA-I発現が減少したもしくは排除された；および／またはHLA-II発現が排除され、それによってCD4+ T細胞による直接認識を回避する；および／またはNK細胞認識を回避するようNKG2Dリガンドをコードする遺伝子が遺伝子改変された、遺伝子操作されたSCが、本明細書に提供される。

いくつかの局面において、HLA-I発現を阻害または排除するよう、β2ミクログロブリンおよび／またはTAP1コードする遺伝子が遺伝子改変される。

いくつかの局面において、HLA-II発現を阻害または排除するよう、CD74および／またはCIITAをコードする遺伝子が遺伝子改変される。

いくつかの局面において、NK細胞認識を回避するよう、MICAおよび／またはMICBをコードする遺伝子が遺伝子改変される。

いくつかの局面において、HLA-IおよびHLA-II発現を阻害または排除するよう、β2ミクログロブリン、TAP1およびCD74が遺伝子改変される。

いくつかの局面において、HLA-IおよびHLA-II発現を阻害または排除するよう、β2ミクログロブリン、TAP1、CD74およびCIITAが遺伝子改変される。

いくつかの局面において、NK細胞認識を回避するために遺伝子改変されるNKG2Dリガンドをコードする遺伝子は、MICA、MICB、Raet1e、Raet1g、Raet11、Ulbp1、Ulbp2および／またはUlbp3の1つまたは複数を含む。いくつかの局面において、遺伝子改変されるNKG2Dリガンドをコードする遺伝子は、MICAもしくはMICB；またはMICAとMICBの組み合わせである。

以下の遺伝子（または免疫回避因子）：CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59、HLA-E一本鎖三量体、PDL1および／またはHLA-G一本鎖三量体の1つまたは複数を発現するようSC内のAAVS座に構築物を送達する工程を含む、遺伝子操作されたSCを作製する方法も、本明細書に提供される。これらの遺伝子の任意の組み合わせの発現がSC内で達成されるよう1つまたは複数の構築物が使用され得ることが理解されるであろう。1つの局面において、構築物は、CR1および／またはCD24を発現するよう設計され得る。1つの局面において、構築物は、CR1およびCD47を発現するよう設計され得る。1つの局面において、構築物は、CD24、CD46、CD55およびCD59を発現するよう設計され得る。1つの局面において、構築物は、CR1、CD24、HLA-E一本鎖三量体、PDL1およびHLA-G一本鎖三量体を発現するよう設計され得る。1つの局面において、構築物は、CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59、HLA-E一本鎖三量体およびPDL1を発現するよう設計され得る。1つの局面において、構築物は、CR1、CD47、HLA-E一本鎖三量体およびPDL1を発現するよう設計され得る。1つの局面において、構築物は、CD24、CD46、CD55、CD59、HLA-E一本鎖三量体およびPDL1を発現するよう設計され得る。1つの局面において、構築物は、CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59、HLA-E一本鎖三量体、PDL1およびHLA-G一本鎖三量体を発現するよう設計され得る。1つの局面において、構築物は、CR1および／またはCD24、ならびに任意でCD47、CD55、CD46、CD59および／またはHLA-E一本鎖三量体の1つまたは複数を発現するよう設計され得る。1つの局面において、構築物は、CR1および／またはCD24、ならびに任意でCD47、CD55、CD46、CD59、HLA-E一本鎖三量体、PDL1および／またはHLA-G一本鎖三量体の1つまたは複数を発現するよう設計され得る。

いくつかの局面において、本発明は、β2ミクログロブリンおよびTAP1をコードする遺伝子における遺伝子改変を提供する。これは、HLA-I発現を排除し、同種CD8+ T細胞による直接認識を防ぐ。本明細書に記載されるように、この遺伝子改変は、不活性化変異であり得る。

いくつかの局面において、本発明はさらに、CD74および任意でCIITAをコードする遺伝子における変異を提供する。これは、HLA-II発現を排除し、CD4+ T細胞による直接認識を回避する。

本明細書に記載されるように、不活性化変異は、HLA-IまたはHLA-IIの発現の減少または排除をもたらす遺伝子内の任意の変異であり得る。不活性化変異は、その読み取り枠を変化させ、機能性タンパク質の翻訳を妨げるヌクレオチド挿入または欠失を含み得る。

本開示の実施例はさらに、これらのHLA欠損細胞が、同種性のヒト免疫系により再構成されたゼノキメラ（xenochimeric）マウスにおいて奇形種を発生させることを示している。本明細書に示されるように、この細胞はHLA-IおよびHLA-IIの発現を欠くことが示された。本開示はさらに、AAVSターゲティング構築物が、すべての意図された遺伝子を適切に発現し、ナチュラルキラー細胞認識および補体沈着に対する耐性を付与することを示している。

本発明はさらに、SC内のAAVS座に送達される構築物の設計および検証を提供する。これらの構築物は、NK細胞認識および食作用の回避をもたらす遺伝子をコードする。これらの遺伝子の発現は、NK細胞活性化を実質的に減少させる。これらの構築物は同時に、誘導性自殺遺伝子および薬剤耐性カセットをコードする。これは、副作用が発生した際の移植片の選択的排除を可能にし、クローン細胞株を同定するための培養下での薬剤選択を容易にする。まとめると、本プロセスは、移植のための有意に減少した免疫原性を有するヒト多能性幹細胞の作製を可能にする。

本発明はさらに、補体固定の回避をもたらすSC内のAAVS座に送達される構築物の設計および検証を提供する。

以下の定義および方法は、本発明をより明確に定義するため、および本発明の実施の際に当業者を手引きするために提供される。それ以外のことが示されていない限り、用語は、関連分野の当業者による従来的用法にしたがい理解されるべきである。

「異種DNA配列」、「外因性DNAセグメント」または「異種核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、各々、特定の宿主細胞からみて外部の供給源を起源とする、または同じ供給源由来である場合は、その本来の形態から改変されている配列を表す。したがって、宿主細胞内の異種遺伝子は、特定の宿主細胞からみて内因性であるが、例えば、DNAシャッフリングの使用を通じて改変された遺伝子を含む。この用語はまた、天然には存在しない複数コピー数の天然に存在するDNA配列を含む。したがって、この用語は、その細胞からみて外来性であるもしくは異種性である、またはその細胞からみて相同であるがそのエレメントが通常見いだされない宿主核酸内の位置にあるDNAセグメントを表す。外因性DNAセグメントは、外因性ポリペプチドを生成するよう発現される。「相同な」DNA配列は、それが導入される宿主細胞に生来的に関連するDNA配列である。

発現ベクター、発現構築物、プラスミド、または組み換えDNA構築物は、概して、例えば宿主細胞における特定の核酸の転写または翻訳を可能にする特定の核酸エレメント群を含む、組み換え手段または直接的化学合成によるものを含むヒトの介入を通じて作製された核酸を表すと理解される。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部であり得る。典型的に、発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結された転写される核酸を含み得る。

「プロモーター」は、概して、核酸の転写を指示する核酸制御配列と理解される。誘導性プロモーターは、概して、特定の刺激または活性化物質に応答して機能的に連結された遺伝子の転写を媒介するプロモーター（例えば、デオキシサイクリン、またはテトラサイクリン誘導性プロモーター）と理解される。プロモーターは、転写開始部位の付近に必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼII型プロモーターの場合はTATAエレメント、を含み得る。プロモーターは、任意で、転写開始部位から数千塩基対に配置され得る、遠位エンハンサーまたはレプレッサーエレメントを含み得る。

「転写可能な核酸分子」は、本明細書で使用される場合、RNA分子に転写されることができる任意の核酸分子を表す。転写可能な核酸分子が機能的なmRNA分子に転写され、このmRNA分子が翻訳され、したがってタンパク質産物として発現される様式で細胞に構築物を導入する方法は公知である。構築物はまた、関心対象の特定のRNA分子の翻訳を阻害するために、アンチセンスRNA分子を発現することができるよう構築され得る。本開示の実施にあたって、構築物および宿主細胞を調製および使用するための従来的な組成物および方法は、当業者に周知である（例えば、Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717; Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929; Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773; Elhai, J. and Wolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754を参照のこと）。

「転写開始部位」または「開始部位」は、+1位としても定義される、転写される配列の一部である最初のヌクレオチド周囲の位置である。この部位に対して、遺伝子およびその制御領域のすべての他の配列が番号付けされ得る。下流配列（例えば、3'方向のさらなるタンパク質コード配列）は、正数で表示され得、上流配列（5'方向の制御領域の大部分）は負数で表示される。

「機能的に連結（operably-linked）」または「機能的に連結（functionally linked）」は、好ましくは、一方の機能が他方による影響を受けるような、単一の核酸フラグメント上での核酸配列間の関連付けを表す。例えば、調節DNA配列がコードDNA配列の発現に影響する（すなわち、コード配列または機能性RNAがプロモーターの転写制御下にある）状態に2つの配列が置かれるとき、調節DNA配列は、RNAまたはポリペプチドをコードするDNA配列に「機能的に連結」されているまたは「関連付け」られていると言われる。コード配列は、調節配列に対して、センス方向またはアンチセンス方向に機能的に連結され得る。2つの核酸分子は、単一の連続する核酸分子の一部であり得、かつ隣接し得る。例えば、プロモーターは、細胞内で関心対象の遺伝子の転写を調節または媒介する場合、関心対象の遺伝子に機能的に連結されている。

「構築物」は、概して、1つまたは複数の核酸分子が機能的に連結されている核酸分子を含む、ゲノム組み込みまたは自律複製が可能な、任意の供給源由来の、任意の組み換え核酸分子、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製性核酸分子、ファージ、または直鎖状もしくは環状一本鎖もしくは二本鎖DNAもしくはRNA核酸分子と理解される。

本開示の構築物は、3’転写終結核酸分子と機能的に連結された転写可能な核酸分子に機能的に連結されたプロモーターを含み得る。加えて、構築物は、例えば3’非翻訳領域（3’UTR）由来のさらなる調節核酸分子を含み得るがこれに限定されない。構築物は、転写の開始に関して重要な役割を果たし得、また発現構築物の1つの遺伝的要素であり得る、mRNA核酸分子の5’非翻訳領域（5’UTR）を含み得るがこれに限定されない。これらのさらなる上流および下流調節核酸分子は、プロモーター構築物に存在する他のエレメントに対してネイティブまたは異種である供給源由来であり得る。

「形質転換」という用語は、遺伝的に安定な継承物を生じる、宿主細胞のゲノムへの核酸フラグメントの移入を表す。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主細胞は「トランスジェニック」細胞と称され、トランスジェニック細胞を含む生物は「トランスジェニック生物」と称される。

「形質転換」、「トランスジェニック」および「組み換え」は、異種核酸分子が導入された宿主細胞または生物、例えば細菌、シアノバクテリア、動物または植物を表す。核酸分子は、当技術分野で一般的に公知であるようにしておよび開示されるようにして、ゲノムに安定的に組み込まれ得る（Sambrook 1989；Innis 1995；Gelfand 1995；Innis & Gelfand 1999）。公知のPCR法は、対になったプライマー、入れ子のプライマー、単独の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分不一致プライマー等を用いる方法を含むがこれらに限定されない。「未形質転換」という用語は、形質転換プロセスを経ていない通常の細胞を表す。

「野生型」は、いかなる既知の変異も有さない自然界で見出されるウイルスまたは生物を表す。

上記の必要とされるパーセント同一性を有し、かつ必要とされる発現されるタンパク質の活性を保持するバリアントヌクレオチドおよびそれにコードされるタンパク質の設計、作製および試験は、技術常識の範囲内で行われることである。例えば、有向性進化および変異体の高速単離は、Link et al. (2007) Nature Reviews 5(9), 680-688；Sanger et al. (1991) Gene 97(1), 119-123；Ghadessy et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(8) 4552-4557を含むがこれらに限定されない参考文献に記載される方法にしたがうものであり得る。したがって、当業者は、当該分野において従来的な方法にしたがい、例えば、本明細書に記載される参照配列に対して少なくとも95～99％の同一性を有する多数のヌクレオチドおよび／またはポリペプチドバリアントを作製し、所望の表現型についてそれらをスクリーニングすることができる。

ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の同一性パーセント（％）は、2つの配列をアラインメントさせたときに、候補配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸残基が参照配列と比較して同一となるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の比率と理解される。パーセント同一性を決定するために、配列がアラインメントされ、必要に応じて、最大のパーセント配列同一性を達成するようギャップが導入される。パーセント同一性を決定するための配列のアラインメント手順は、当業者に周知である。多くの場合、公衆利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばBLAST、BLAST2、ALIGN2またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアが、配列をアラインメントするために使用される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するために適したパラメータを決定することができる。配列をアラインメントする場合、ある配列Bに対するある配列Aのパーセント配列同一性（これは代替的に、ある配列Bに対して特定のパーセント配列同一性を有するまたは含むある配列Aと表現され得る）が計算され得る。

一般に、必要とされる活性が保持される限り、任意の位置で保存的置換がなされ得る。置き換えるアミノ酸が元のアミノ酸と類似の特性を有するいわゆる保存的交換、例えばAspによるGlu、AsnによるGln、IleによるVal、IleによるLeu、およびThrによるSerの交換が、行われ得る。例えば、類似の特性を有するアミノ酸は、脂肪族アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、ヒドロキシルもしくは硫黄／セレン含有アミノ酸（例えば、セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン）；環状アミノ酸（例えば、プロリン）；芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；塩基性アミノ酸（例えば、ヒスチジン、リジン、アルギニン）；または酸性およびそれらのアミド（例えば、アスパルテート、グルタメート、アスパラギン、グルタミン）であり得る。欠失は、直接結合によるアミノ酸の置換である。欠失位置は、ポリペプチドの末端および個々のタンパク質ドメイン間の連結部を含む。挿入は、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の導入であり、形式的には直接結合が1つまたは複数のアミノ酸によって置き換えられる。アミノ酸配列は、例えば活性が改善されたまたは調節性が変更されたポリペプチドを生成し得る当技術分野で公知のコンピュータシミュレーションプログラムの支援の下で調整され得る。この人工的に作製されたポリペプチド配列に基づき、そのような調整されたポリペプチドをコードする対応する核酸分子が、所望の宿主細胞の特定のコドン用法を用いてインビトロで合成され得る。

宿主細胞は、当技術分野で公知の様々な標準的技術を用いて形質転換され得る（例えば、Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717；Ausubel et al. (2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929；Sambrook and Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773；Elhai, J. and Wolk, C. P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754を参照のこと）。そのような技術は、ウイルス感染、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、マイクロプロジェクタイル媒介送達、受容体媒介取り込み、細胞融合、エレクトロポレーション等を含むがこれらに限定されない。トランスフェクトされた細胞は、宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれた発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を提供するよう選択および培養され得る。

宿主細胞に導入され得る例示的な核酸は、例えば、別の種由来のDNA配列もしくは遺伝子、またはさらに、同じ種を起源とするもしくは同じ種に存在するが、遺伝子操作法によりレシピエント細胞に組み込まれる遺伝子もしくは配列も含む。「外因性」という用語はまた、形質転換される細胞内に通常は存在しない、もしくは単に、形質転換するDNAセグメントもしくは遺伝子において見出されるような形態、構造等で存在しないにすぎない遺伝子、または通常存在するが、天然の発現パターンと異なる様式で発現させる、例えば過剰発現させることが望まれる遺伝子を表すことが意図されている。したがって、「外因性」遺伝子またはDNAという用語は、類似の遺伝子がそのような細胞内にすでに存在し得るかどうかにかかわらず、レシピエント細胞に導入される任意の遺伝子またはDNAセグメントを表すことが意図されている。外因性DNAに含まれるDNAのタイプは、その細胞内にすでに存在するDNA、同じタイプの生物の別個体由来のDNA、異なる生物由来のDNA、または外部で作製されるDNA、例えば、ある遺伝子のアンチセンスメッセージを含むDNA配列、またはある遺伝子の合成もしくは改変バージョンをコードするDNA配列を含み得る。

本明細書に記載されるアプローチにしたがい構築される宿主株は、当技術分野で公知の多くの手段により評価され得る（例えば、Studier (2005) Protein Expr Purif. 41(1), 207-234；Gellissen, ed. (2005) Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10: 3527310363；Baneyx (2004) Protein Expression Technologies, Taylor & Francis, ISBN-10: 0954523253を参照のこと）。

遺伝子を下方調節またはサイレンシングする方法は、当技術分野で公知である。例えば、発現されるタンパク質の活性は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質アプタマー、ヌクレオチドアプタマー、ならびにRNA干渉（RNAi）（例えば、低分子干渉RNA（siRNA）、ショートヘアピンRNA（shRNA）およびマイクロRNA（miRNA））を用いて下方調節または除去され得る（例えば、ハンマーヘッドリボザイムおよび小ヘアピンRNAを記載するFanning and Symonds (2006) Handb Exp Pharmacol. 173, 289-303G；Helene, C., et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36；デオキシリボヌクレオチド配列のターゲティングを記載するMaher (1992) Bioassays 14(12): 807-15；アプタマーを記載するLee et al. (2006) Curr Opin Chem Biol. 10, 1-8；RNAiを記載する Reynolds et al. (2004) Nature Biotechnology 22(3), 326-330；RNAiを記載するPushparaj and Melendez (2006) Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 33(5-6), 504-510；RNAiを記載するDillon et al. (2005) Annual Review of Physiology 67, 147-173；RNAiを記載するDykxhoorn and Lieberman (2005) Annual Review of Medicine 56, 401-423を参照のこと）。RNAi分子は、様々な業者（例えば、Ambion, TX; Sigma Aldrich, MO; Invitrogen）から市販されている。様々なアルゴリズムを用いる様々なsiRNA分子設計プログラムが当技術分野で公知である（例えば、Cenixアルゴリズム, Ambion; BLOCK-iT（商標）RNAi Designer, Invitrogen; siRNA Whitehead Institute Design Tools, Bioinofrmatics & Research Computingを参照のこと）。最適なsiRNA配列を定義する上で影響力のある特性は、siRNAの末端のG/C含量、siRNAの特定の内部ドメインのTm、siRNA長、CDS（コード領域）内の標的配列の位置、および3'オーバーハングのヌクレオチド内容を含む。

様々な局面において、本発明の改変されたSCは、人工多能性SC（iPSC）または胚性SCである。様々な局面において、SCは哺乳類、例えばヒトまたはマウスである。1つの局面において、SCは、処置される対象由来である。例えば、対象から体細胞が収集され、そしてiPSCを生成するよう再プログラムされ得、その後このiPSCが本発明の方法を用いて改変される。

本明細書で使用される場合、「成体」は、出生後の、例えば、新生児段階から生涯の最期までの生物を意味し、例えば、送達された胎盤組織、羊水および／または臍帯血から得られる細胞を含む。

本明細書で使用される場合、「成体分化細胞」は、本明細書に記載される自動化システムを用いてiPSCを生成することが可能な、成体生物から得られる幅広い範囲の分化した細胞型を含む。好ましくは、成体分化細胞は「線維芽細胞」である。それらの低活性形態では「線維細胞」とも呼ばれる線維芽細胞は、間葉から派生する。それらの機能は、例えばコラーゲンを含む、細胞外マトリクス成分の前駆体の分泌を含む。組織学的に、線維芽細胞は、高度に分枝した細胞であるが、線維細胞は一般により小さく、多くの場合、紡錘形状と表現される。任意の組織由来の線維芽細胞および線維細胞が、本発明の自動化ワークフローシステムにおける出発物質として使用され得る。

本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」またはiPSCという用語は、幹細胞が、中胚葉、内胚葉および外胚葉という3つすべての胚葉または皮層の組織に分化することができる細胞に誘導されたまたは変化させられた、例えば再プログラムされた、分化した成体細胞から生成されたことを意味する。生成されるiPSCは、自然状態で見いだされる細胞ではない。

「幹細胞」または「未分化細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、自己複製の特性を有し、かつ複数の細胞型に分化する発生能を有する未分化または部分的に分化した状態の細胞を表し、発生能に関する特定の意味（例えば、分化全能性（totipotent）、多能性（pluripotent）、および多分化能性（multipotent））を暗示するものではない。幹細胞は、その発生能を維持しつつ増殖し、より多くのそのような幹細胞を生じることができる。理論上、自己複製は、2つの主要機構のいずれかにより起こり得る。幹細胞は、一方の娘細胞が親幹細胞の発生能を維持し、他方の娘細胞が親細胞とは異なるいくつかの他の特定の機能、表現型および／または発生能を発現するよう、非対称的に分裂することができ、これは絶対的非対称分化（obligatory asymmetrical differentiation）として知られている。娘細胞自体も、親の発生能を有する1つまたは複数の細胞を維持しつつ、増殖し、その後に1つまたは複数の成熟細胞型に分化する子孫を生じるよう誘導され得る。分化した細胞は、多分化能性細胞から生じ得、その多分化能性細胞自体も多分化能性細胞から生じ、といった具合である。これらの多分化能性細胞は各々、幹細胞とみなされ得るが、各々のそのような幹細胞が生じることができる細胞型の範囲、例えばそれらの発生能は、大きく異なり得る。あるいは、集団内の幹細胞のいくつかは2つの幹細胞に対称的に分裂し得、これは確率論的分化（stochastic differentiation）として知られており、それによって集団全体で一定の幹細胞を維持し、一方、その集団内の他の細胞は分化した子孫のみを生じる。したがって、「幹細胞」という用語は、特定の環境下でより特化したまたは分化した表現型に分化する発生能を有し、かつ特定の環境下で実質的に分化せずに増殖する能力を維持している任意の細胞サブセットを表す。いくつかの態様において、幹細胞という用語は、概して、胚性細胞および組織の漸進的多様化において見られるように、その後代（子孫細胞）が分化により、例えば完全に個別の特徴を獲得することにより、しばしば異なる方向に特化する天然に存在する親細胞を表す。いくつかの分化した細胞はまた、より高い発生能を有する細胞を生じる能力を有する。そのような能力は、自然的であり得る、または様々な因子を用いた処理により人工的に誘導され得る。幹細胞として始まる細胞は、分化した表現型の方に進行し得るが、その後に「逆戻り」して幹細胞の表現型を再発現するよう誘導され得、これはしばしば当業者により「脱分化」または「再プログラム」または「逆分化」と呼ばれる用語である。

「分化した細胞」という用語は、その本来の形態で、本明細書で定義される意味での多能性でない任意の体細胞を含む。したがって、「分化した細胞」という用語はまた、部分的に分化した細胞、例えば多分化能性細胞、または部分的に再プログラムされた安定な非多能性の細胞、または本明細書に記載される組成物および方法のいずれかを用いて生成される、部分的に分化した細胞も含む。いくつかの態様において、分化した細胞は、安定な中間細胞、例えば非多能性の、部分的に再プログラムされた細胞である細胞である。分化した細胞（安定な、非多能性の部分的に再プログラムされた中間細胞を含む）から多能性への移行は、培養下に置かれたときに分化した特徴の部分的消失をもたらす刺激を超える、再プログラム刺激を必要とする。再プログラムされた、およびいくつかの態様において、部分的に再プログラムされた細胞はまた、通常培養下で限定的な回数のみの分裂を行う能力を有する、より低い発生能を有する親細胞と比較して、成長能を失うことなく延長された継代を受ける能力を有するという特徴を有する。いくつかの態様において、「分化した細胞」という用語はまた、その細胞が細胞分化プロセスを起こす、より特化していない細胞型（例えば、高い発生能）の細胞から（例えば、未分化細胞または再プログラムされた細胞から）生じた、より特化した細胞型（例えば、低下した発生能）の細胞を表す。

「再プログラム」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞または細胞集団（例えば、体細胞）の発生能を逆戻しするプロセスを表す。別の言葉で言うと、再プログラムは、細胞を、より高い発生能を有する状態に誘導する、例えば、より分化していない状態に戻すプロセスを表す。再プログラムされる細胞は、再プログラムの前に部分的に分化したものまたは最後まで分化したもののいずれかであり得る。本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、再プログラムは、分化状態の完全または部分的な逆戻し、例えば、細胞の発生能を、多能性状態を有する細胞のそれまで増加させること、を含む。いくつかの態様において、再プログラムは、体細胞を、胚性幹細胞の発生能、例えば胚性幹細胞の表現型を有するよう多能性状態に誘導することを含む。いくつかの態様において、再プログラムはまた、多分化能性状態への、細胞、例えば体細胞または単能性細胞の分化状態の部分的逆戻しまたはその発生能の部分的増加を含む。再プログラムはまた、さらなる操作、例えば本明細書に記載されるもの、に供された際の多能性状態への完全な再プログラムに細胞がより応じやすくなる状態までの、細胞の分化状態の部分的逆戻しを含む。そのような操作は、その発現が再プログラムに寄与するまたは再プログラムを維持する特定の遺伝子を、細胞により、またはその細胞の子孫により内因的に発現させるものであり得る。特定の態様において、合成性の改変されたRNAおよび本明細書に記載されるその方法を用いた細胞の再プログラムは、その細胞が、多分化能性状態である（例えば、多分化能性細胞である)と推定させる。いくつかの態様において、合成性の改変されたRNAおよび本明細書に記載されるその方法を用いた細胞（例えば、体細胞）の再プログラムは、細胞が、多能性様状態または胚性幹細胞表現型であると推定させる。得られる細胞は、本明細書で、「再プログラムされた細胞」、「多能性体細胞」、および「RNA誘導多能性体細胞」と称される。「部分的に再プログラムされた体細胞」という用語は、本明細書で参照される場合、本明細書に開示される方法により、より低い発生能を有する細胞から再プログラムされた細胞であって、その部分的に再プログラムされた細胞は、多能性状態に完全に再プログラムされておらず、非多能性の、安定な中間状態に再プログラムされたものを表す。そのような部分的に再プログラムされた細胞は、多能性細胞よりも低いが、本明細書で定義される意味での多分化能性細胞よりも高い発生能を有し得る。部分的に再プログラムされた細胞は、例えば、3つの胚葉の1つまたは複数に分化することができるが、3つの胚葉のすべてに分化することはできない。

「再プログラム因子」という用語は、本明細書で使用される場合、その発現が、より分化していないまたは未分化の状態への、例えば多能性状態または部分多能性状態の細胞への細胞、例えば体細胞の再プログラムに寄与する、本明細書で定義される意味での発生能変更因子、例えば遺伝子、タンパク質、RNA、DNAまたは低分子を表す。再プログラム因子は、例えば、細胞を多能性状態に再プログラムすることができる転写因子、例えばSOX2、OCT3/4、KLF4、NANOG、LIN-28、c-MYC等であり得、インビトロで細胞を再プログラムする方法においてこれらの1つまたは複数と置き換えることができる任意の遺伝子、タンパク質、RNAまたは低分子を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載される合成性の改変RNAおよびその方法を用いる再プログラム因子の外因性発現は、再プログラムされたまたは部分的に再プログラムされた状態での細胞の安定的維持のために1つまたは複数の再プログラム因子の外因性発現がもはや必要とされなくなる、1つまたは複数の再プログラム因子の内因性発現を含む。

本明細書で使用される場合、「分化因子」という用語は、細胞が所望の細胞型に分化するよう誘導する、本明細書で定義される意味での発生能変更因子、例えば遺伝子、タンパク質、RNAまたは低分子を表し、例えば、分化因子は、細胞の発生能を低下させる。いくつかの態様において、分化因子は、細胞型特異的ポリペプチドであり得るが、これは必須ではない。特定の細胞型への分化は、2つ以上の分化因子の同時および／または連続的発現を必要とし得る。本明細書に記載されるいくつかの局面において、細胞または細胞集団の発生能は、最初に、本明細書に記載される合成性改変RNAを用いた再プログラムまたは部分再プログラムを通じて増加され、その後に、そのような再プログラムにより生成された細胞またはその子孫細胞が、分化因子をコードする1つまたは複数の合成性改変RNAと接触させることにより、または合成性改変RNAを導入することにより、低下した発生能を有するように分化を起こすよう誘導される。

細胞の個体発生学の文脈で、「分化する（differentiate）」または「分化する（differentiating）」という用語は、ある細胞がその中間前駆細胞よりも発生経路のさらなる下流に進行する発生プロセスを表す相対的な用語である。したがって、いくつかの態様において、本明細書で定義される意味での再プログラムされた細胞は、系統的に制限された前駆細胞（例えば、中胚葉幹細胞）に分化し得、これはさらに、その経路のさらなる下流の他のタイプの前駆細胞（例えば、組織特異的前駆体、例えば、心筋細胞前駆体）に、ついで特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持している場合としていない場合がある最終段階に分化した細胞に分化し得る。

治療的応用および製剤
本明細書で議論されるように、本発明はさらに、対象において疾患または障害を処置する方法を提供する。いくつかの局面において、この方法は、本発明の遺伝子改変されたSCを対象に投与する工程を含む。いくつかの局面において、この方法は、本発明の遺伝子改変されたSCの子孫、例えば、部分分化または最終分化した細胞または組織を投与する工程を含む。1つの局面において、子孫は、本発明のSCから生成される前駆細胞である。前駆細胞は、SCと同様に、特定のタイプの細胞に分化する傾向を有するが、すでにSCよりも特化しており、その「標的」細胞に分化するよう推し進められている生物学的細胞である。例えば、前駆細胞は、血液生成性前駆細胞（例えば、血液生成性内皮細胞）または造血性前駆細胞であり得る。

本明細書に記載される薬剤および組成物は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences (A. R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)に記載される1つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤を用いて任意の従来的な方法により製剤化され得る。そのような製剤は、対象への適切な投与のための形態を提供するよう、適切な量の担体と共に、精製形態であり得る、治療有効量の本明細書に記載される生物学的に活性な薬剤を含み得る。

「製剤」という用語は、対象、例えばヒトへの投与に適した形態で薬物を調製することを表す。したがって、「製剤」は、希釈剤または担体を含む、薬学的に許容される賦形剤を含み得る。

「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、許容できない薬理学的活性の消失または許容できない有害な副作用をもたらさない物質または成分を表し得る。薬学的に許容される成分の例は、United States Pharmacopeia (USP 29)およびNational Formulary (NF 24), United States Pharmacopeial Convention, Inc, Rockville, Md., 2005 （「USP/NF」）、またはより最新版にモノグラフを有するもの、ならびに継続的に更新されているFDAのInactive Ingredient Searchオンラインデータベースに列挙されている成分であり得る。USP/NF等に記載されていない他の有用な成分も使用され得る。

「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤または吸収遅延剤を含み得る。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当業者に周知である（一般に、Remington's Pharmaceutical Sciences (A. R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)を参照のこと）。任意の従来的な媒体または薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物におけるその使用が想定されている。補助的活性成分もまた、組成物に組み込まれ得る。

「安定」な製剤または組成物は、商業的に妥当な期間、例えば少なくとも約1日、少なくとも約1週間、少なくとも約1ヶ月間、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約6ヶ月間、少なくとも約1年間、または少なくとも約2年間の、扱いやすい温度、例えば約0℃～約60℃での保管を可能にするのに十分な安定性を有する組成物を表し得る。

製剤は、投与様式に適するものであるべきである。本開示で使用される薬剤は、非経口、肺、経口、局所、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、眼、口腔内および直腸を含むがこれらに限定されない様々な経路を用いた対象への投与のために、公知の方法により製剤化され得る。個々の薬剤はまた、1つもしくは複数のさらなる薬剤と組み合わせてまたは他の生物学的に活性なもしくは生物学的に不活性な薬剤と共に投与され得る。そのような生物学的に活性なまたは不活性な薬剤は、これらの薬剤と流体的もしくは機械的連通下にあり得るまたはイオン、共有結合、ファンデルワールス、疎水性、親水性もしくは他の物理的な力によってこれらの薬剤に付加され得る。

制御放出（または持続放出）調製物は、薬剤の活性を延長し、投与頻度を減少させるよう製剤化され得る。制御放出調製物はまた、作用の発生の時期または他の特徴、例えば薬剤の血中レベルに影響し、その結果、副作用の発生に影響するよう使用され得る。制御放出調製物は、最初に所望の治療効果を生じる薬剤量を放出し、そして治療効果のレベルを長期間にわたって維持するための他の薬剤量を徐々におよび継続的に放出するよう設計され得る。血中でほぼ一定の薬剤レベルを維持するために、薬剤は、代謝されるまたは身体から排出される薬剤量と置き換わる速度で剤形から放出され得る。薬剤の制御放出は、様々な誘導因子、例えば、pHの変化、温度の変化、酵素、水、または他の生理学的条件もしくは分子により刺激され得る。

本明細書に記載される薬剤または組成物はまた、他の治療様式と組み合わせて使用され得る。したがって、本明細書に記載される治療法に加えて、疾患、障害または状態の処置に有効であることが知られている他の治療法も対象に提供され得る。

本明細書で議論されるように、本発明は、その必要のある対象において細胞ベースの治療（例えば、遺伝子操作された幹細胞の分化した子孫）により疾患（例えば、自己免疫疾患、自己免疫疾患により破壊される組織、病原体、癌、酵素欠損、または神経変性疾患）を処置するプロセス、およびナチュラルキラー細胞認識を回避しつつSCまたはその子孫により疾患を処置する、治療有効量の細胞ベースの治療の投与を提供する。

さらに、本発明の方法を用いて免疫拒絶を回避するよう改変された本発明のSCは、患者の治療に使用するために現在開発されている任意の他の細胞型を生成するために使用され得る。そのような分化した細胞は、減量された免疫抑制剤とともにまたは免疫抑制剤を必要とせずに、そのような細胞を必要とする患者に投与される。

本明細書に記載される方法は、通常、それを必要とする対象に対して実施される。本明細書に記載される治療法を必要とする対象は、疾患を有する、疾患を有すると診断された、疾患を有する疑いがある、または疾患を発症する危険がある対象であり得る。対象は、哺乳類、例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、マウス、ラット、サル、ハムスター、モルモット、およびニワトリ、ならびにヒトを含む動物対象であり得る。例えば、対象は、ヒト対象であり得る。

本明細書に記載される方法にしたがい、投与は、非経口、肺、経口、局所、皮内、小骨、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、眼、口腔内、または直腸投与であり得る。

任意の特定の対象に対する個々の治療有効用量レベルは、処置される障害および障害の重篤度、用いられる個々の化合物の活性；用いられる個々の組成物；対象の年齢、体重、全般的健康、性別および食事；投与期間；投与経路；用いられる組成物の排出率；処置期間；用いられる個々の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存し得る（例えば、Koda-Kimble et al. (2004) Applied Therapeutics: The Clinical Use of Drugs, Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781748453；Winter (2003) Basic Clinical Pharmacokinetics, 4.sup.th ed., Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781741475；Sharqel (2004) Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, McGraw-Hill/Appleton & Lange, ISBN 0071375503を参照のこと）。例えば、組成物の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルから開始し、そして所望の治療効果が達成されるまでその用量を徐々に増加させることは、十分に技術常識の範囲内である。望ましい場合、有効一日用量は、投与目的で複数の用量に分割され得る。その結果、単回用量組成物は、一日用量を構成するようそのような量またはその何分の一かの用量を含み得る。しかし、本開示の化合物および組成物の総一日使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医により決定され得ることが理解されるであろう。

いくつかの局面において、細胞、組織、組成物および方法は、神経変性疾患または障害を処置するために使用され得る。例えば、神経変性疾患または障害は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルパーズ・フッテンロッヒャー症候群、アルファ-メチルアシル-CoAラセマーゼ欠損症、アンデルマン症候群、アーツ（Arts）症候群、運動失調ニューロパチースペクトラム、（例えば、眼球運動失行、常染色体優性小脳性運動失調、難聴、およびナルコレプシーを伴う）運動失調、常染色体劣性シャルルヴォア・サグネ型痙性運動失調、バッテン病、ベータ・プロペラタンパク質関連神経変性症、脳・眼・顔・骨格症候群（COFS）、皮質基底核変性症、CLN1病、CLN10病、CLN2病、CLN3病、CLN4病、CLN6病、CLN7病、CLN8病、認知機能障害、先天性無痛無汗症、認知症、ニューロセルピン封入体を持つ家族性脳症、家族性英国型認知症、家族性デンマーク型認知症、脂肪酸ヒドロキシラーゼ関連神経変性症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、GM2ガングリオシドーシス（例えば、ABバリアント）、（例えば、網膜色素変性症を伴う）HMSN 7型、ハンチントン病、乳児神経軸索ジストロフィー、乳児期発症上行性遺伝性痙性対麻痺、ハンチントン病（HD）、乳児期発症脊髄小脳変性症、若年性原発性側索硬化症、ケネディ病、クールー病、リー病、マリネスコ・シェーグレン症候群、軽度認知障害（MCI）、ミトコンドリア膜タンパク質関連神経変性症、運動ニューロン病、一側筋萎縮症、運動ニューロン病（MND）、多系統萎縮症、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症（シャイ・ドレーガー症候群）、多発性硬化症、多系統萎縮症、ダウン症候群における神経変性症（NDS）、加齢神経変性症、脳内鉄分蓄積を伴う神経変性症、視神経脊髄炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、オプソクローヌス・ミオクローヌス、プリオン病、進行性多巣性白質脳症、パーキンソン病（PD）、PD関連障害、硬化性白質脳症を伴う多嚢胞性脂肪膜性骨異形成、プリオン病、進行性外眼筋麻痺、リボフラビントランスポーター欠損性ニューロパチー、サンドホフ病、脊髄性筋萎縮症（SMA）、脊髄小脳性運動失調（SCA）、線条体黒質変性症、伝達性海綿状脳症（プリオン病）、またはワーラー様変性であり得る。

いくつかの局面において、細胞、組織、組成物および方法は、癌を処置するために使用され得る。例えば、癌は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）；急性骨髄性白血病（AML）；副腎皮質癌；AIDS関連癌；カポジ肉腫（軟組織肉腫）；AIDS関連リンパ腫（リンパ腫）；原発性CNSリンパ腫（リンパ腫）；肛門癌；虫垂癌；胃腸カルチノイド腫瘍；星細胞腫；非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、小児、中枢神経系（脳癌）；皮膚基底細胞癌；胆管癌（Bile Duct Cancer）；膀胱癌；骨癌（ユーイング肉腫および骨肉腫および悪性線維性組織球腫を含む）；脳腫瘍；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍（胃腸）；小児カルチノイド腫瘍；心（心臓）腫瘍；中枢神経系癌；非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、小児（脳癌）；胎児性腫瘍、小児（脳癌）；胚細胞腫瘍、小児（脳癌）；原発性CNSリンパ腫；子宮頸癌；胆管癌（Cholangiocarcinoma）；胆管癌脊索腫；慢性リンパ性白血病（CLL）；慢性骨髄性白血病（CML）；慢性骨髄増殖性腫瘍；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫（脳癌）；皮膚T細胞；非浸潤性乳管癌（DCIS）；胎児性腫瘍、中枢神経系、小児（脳癌）；子宮内膜癌（子宮癌）；上衣腫、小児（脳癌）；食道癌；嗅神経芽細胞腫；ユーイング肉腫（骨癌）；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；眼癌；眼内黒色腫；眼内黒色腫；網膜芽腫；ファロピウス管癌；骨線維性組織球腫、悪性、もしくは骨肉腫；胆嚢癌；胃（Gastric）（胃（Stomach））癌；胃腸カルチノイド腫瘍；胃腸間質腫瘍（GIST）（軟組織肉腫）；胚細胞腫瘍；中枢神経系胚細胞腫瘍（脳癌）；小児頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；卵巣胚細胞腫瘍；精巣癌；妊娠性絨毛疾患；有毛細胞白血病；頭頸部癌；心臓腫瘍；肝細胞（肝臓）癌；組織球腫、ランゲルハンス細胞；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌（頭頸部癌）；眼内黒色腫；膵島細胞腫；膵神経内分泌腫瘍；カポジ肉腫（軟組織肉腫）；腎臓（腎細胞）癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌（頭頸部癌）；白血病；口唇および口腔（Oral Cavity）癌（頭頸部癌）；肝臓癌；肺癌（非小細胞および小細胞）；リンパ腫；男性乳癌；骨悪性線維性組織球腫もしくは骨肉腫；黒色腫；眼内（眼）；メルケル細胞癌（皮膚癌）；中皮種、悪性；転移癌；原発不明転移扁平上皮頸部癌（頭頸部癌）、NUT遺伝子関連正中線癌；口腔（Mouth）癌（頭頸部癌）；多発性内分泌腺腫症候群；多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍；菌状息肉症（リンパ腫）；骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍；骨髄性白血病、慢性（CML）；骨髄性白血病、急性（AML）；骨髄増殖性腫瘍；鼻腔および副鼻腔癌（頭頸部癌）；鼻咽頭癌（頭頸部癌）；神経芽腫；非ホジキンリンパ腫；小細胞肺癌；口腔（Oral）癌；口唇または口腔（Oral Cavity）癌；口腔咽頭癌（頭頸部癌）；骨肉腫および骨悪性線維性組織球腫；卵巣癌膵臓癌；膵神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）；乳頭腫症；傍神経節腫；副鼻腔および鼻腔癌（頭頸部癌）；副甲状腺癌；陰茎癌；咽頭癌（Pharyngeal Cancer）（頭頸部癌）；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；乳癌；原発性中枢神経系（CNS）リンパ腫；原発性腹膜癌；前立腺癌；直腸癌；再発癌腎細胞（腎臓）癌；網膜芽腫；横紋筋肉腫、小児（軟組織肉腫）；唾液腺癌（頭頸部癌）；肉腫；小児横紋筋肉腫（軟組織肉腫）；小児血管腫瘍（軟組織肉腫）；ユーイング肉腫（骨癌）；カポジ肉腫（軟組織肉腫）；骨肉腫（骨癌）；子宮肉腫；セザリー症候群（リンパ腫）；皮膚癌；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉腫；皮膚扁平上皮癌；原発不明扁平上皮頸部癌、転移（頭頸部癌）；胃（Stomach）（胃（Gastric））癌；T細胞リンパ腫、皮膚；リンパ腫；菌状息肉症およびセザリー症候群；精巣癌；咽頭癌（Throat Cancer）（頭頸部癌）；鼻咽頭癌；口腔咽頭癌；下咽頭癌；胸腺腫および胸腺癌；甲状腺癌；甲状腺腫瘍；腎盂および尿管の移行上皮癌（腎臓（腎細胞）癌）；尿管および腎盂；移行上皮癌（腎臓（腎細胞）癌）；尿道癌；子宮癌、子宮内膜；子宮肉腫；膣癌；血管腫瘍（軟組織肉腫）；外陰癌；またはウィルムス腫瘍であり得る。

いくつかの局面において、細胞、組織、組成物および方法は、自己免疫疾患または障害を処置するために使用され得る。例えば、自己免疫疾患または障害は、アカラシア；アジソン病；成人スチル病；無ガンマグロブリン血症；円形脱毛症；アミロイドーシス；強直性脊椎炎；抗GBM／抗TBM腎炎；抗リン脂質抗体症候群；自己免疫性血管性浮腫；自己免疫性自律神経不全；自己免疫性脳脊髄炎；自己免疫性肝炎；自己免疫性内耳疾患（AIED）；自己免疫性心筋炎；自己免疫性卵巣炎；自己免疫性精巣炎；自己免疫性膵炎；自己免疫性網膜症；自己免疫性蕁麻疹；軸索およびニューロンニューロパチー（Axonal & neuronal neuropathy）（AMAN）；バブ病（Bab disease）；ベーチェット病；良性粘膜類天疱瘡；水疱性類天疱瘡；キャッスルマン病（CD）；セリアック病；シャーガス病；慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（CIDP）；慢性再発性多発性骨髄炎（CRMO）；チャーグ・ストラウス症候群（CSS）または好酸球性肉芽腫症（EPGA）；瘢痕性類天疱瘡；コーガン症候群；寒冷凝集素症；先天性心臓ブロック；コクサッキー心筋炎；CREST症候群；クローン病；疱疹状皮膚炎；皮膚筋炎；デビック病（視神経脊髄炎）；円板状ループス；ドレスラー症候群；子宮内膜症；好酸球性食道炎（EoE）；好酸球性筋膜炎；結節性紅斑；本態性混合型クリオグロブリン血症；エバンス症候群；線維筋痛症；線維性肺胞炎；巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）；巨細胞性心筋炎；糸球体腎炎；グッドパスチャー症候群；多発血管炎性肉芽腫症；グレーブス病；ギラン・バレー症候群；橋本甲状腺炎；溶血性貧血；ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（HSP）；妊娠性疱疹もしくは妊娠性類天疱瘡（PG）；化膿性汗腺炎（HS）（反対型ざ瘡）；低ガンマグロブリン血症；IgA腎症；IgG4関連硬化症；免疫性血小板減少性紫斑病（ITP）；封入体筋炎（IBM）；間質性膀胱炎（IC）；若年性関節炎；若年性糖尿病（1型糖尿病）；若年性筋炎（JM）；川崎病；ランバート・イートン症候群；白血球破砕性血管炎；扁平苔癬；硬化性苔癬、木質結膜炎；線状IgA病（LAD）；ループス；慢性ライム病；メニエール病；顕微鏡的多発血管炎（MPA）；混合型結合組織病（MCTD）；モーレン潰瘍；ムッカ・ハーベルマン病；多巣性運動ニューロパチー（MMN）またはMMNCB、多発性硬化症；重症筋無力症；筋炎；ナルコレプシー；新生児ループス；視神経脊髄炎；好中球減少症；眼部瘢痕性類天疱瘡；視神経炎；回帰性リウマチ（PR）；PANDAS；傍腫瘍性小脳変性症（POD）；発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）；パリー・ロンベルグ症候群；扁平部炎（末梢ぶどう膜炎）；パーソネージ・ターナー症候群；天疱瘡；末梢ニューロパチー；静脈周囲性脳脊髄炎；悪性貧血（PA）；POEMS症候群；結節性多発動脈炎；多腺性症候群I、II、III型；リウマチ性多発筋痛症；多発性筋炎；心筋梗塞後症候群；心膜切開後症候群；原発性胆汁性肝硬変；原発性硬化性胆管炎；プロゲステロン皮膚炎；乾癬；乾癬性関節炎；赤芽球癆（PRCA）；壊疽性膿皮症；レイノー現象；反応性関節炎；反射性交感神経性ジストロフィー；再発性多発軟骨炎；レストレスレッグス症候群（RLS）；後腹膜線維症；リウマチ熱；関節リウマチ；サルコイドーシス；シュミット症候群；強膜炎；強皮症；シェーグレン症候群；精子および精巣自己免疫；スティッフパーソン症候群（SPS）；亜急性細菌性心内膜炎（SBE）；サザック症候群；交感性眼炎（SO）；高安動脈炎；側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎；血小板減少性紫斑病（TTP）；トロサ・ハント症候群（THS）；横断性脊髄炎；1型糖尿病；潰瘍性大腸炎（UC）；未分化結合組織病（UCTD）；ぶどう膜炎；血管炎；白斑；フォークト・小柳・原田病；またはウェゲナー肉芽腫症（もしくは多発血管炎性肉芽腫症（GPA））であり得る。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「一つの（a）」、「一つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、複数の参照を含む。「一つの（a）」（または「一つの（an）」）という用語、ならびに「1つまたは複数」および「少なくとも1つ」という用語は、言い換え可能に使用され得る。

さらに、「および／または」は、2つの示されている特徴または要素の各々の、他方を伴うまたは伴わない個別の開示と解釈されるべきである。したがって、「Aおよび／またはB」のようなフレーズで使用される場合、「および／または」という用語は、AおよびB、AまたはB、A（単独）、ならびにB（単独）を含むことが意図されている。同様に、「A、Bおよび／またはC」のようなフレーズで使用される場合、「および／または」という用語は、A、BおよびC；A、BまたはC；AまたはB；AまたはC；BまたはC；AおよびB；AおよびC；BおよびC；A（単独）；B（単独）；ならびにC（単独）を含むことが意図されている。

それ以外の定義がなされていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。例えば、The Dictionary of Cell and Molecular Biology (5th ed. J.M. Lackie ed., 2013)、the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (2d ed. R. Cammack et al. eds., 2008)、およびThe Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, P-S. Juo, (2d ed. 2002)は、本明細書で使用されるいくつかの用語の一般的定義を当業者に提供することができる。

単位、接頭辞および記号は、それらの国際単位系（SI）で認められた形式で記されている。数値範囲は、その範囲を定義する数値を包含する。本明細書に提供される見出しは、本発明の様々な局面または態様の限定ではなく、そのような限定は、本明細書を全体として参照することによりなされ得るものである。したがって、直下で定義される用語は、本明細書の全体を参照することにより、より十分に定義される。

「含む」という語を用いて態様が記載されている場合はいずれも、「からなる」および／または「から本質的になる」という観点で記載される他の類似の態様も含まれる。

以下の実施例は、本発明の利点および特徴をさらに例示するために提供されるが、それらは本発明の範囲を限定することは意図されていない。実施例は使用され得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順、方法または技術もそれに代えて使用され得る。

実施例I
改変された幹細胞の作製
H1ヒト胚性幹細胞（hESC）の一連の遺伝的バリアントを、CRISPRベースのターゲティングされた変異、および免疫回避カセットのレンチウイルス発現を通じて作製した。具体的には、ヒトES細胞においてターゲティングされた変異を生じるようワークフローを最適化した。Cas9発現構築物および最大3つの異なるgRNAコードベクターを、H1ヒトES細胞に共トランスフェクトする。個々のコロニーを、手作業でかきとり、標的とされた遺伝子のMiSeq（商標）分析に供して、非相同末端結合エラーにより導入されたフレームシフト変異を有するコロニーを同定する。ついで候補クローンを、蛍光活性化細胞選別（FACS）により正確に1細胞／ウェルとなるようプレーティングし、MiSeq（商標）分析を再度行って、変異およびモザイク現象の非存在を確認する（図1A）。次に、クローンを増大させ、核型を決定し、それらの分化能を確認する。CRISPR/Cas9ベースのターゲティングされた変異を通じて、HLA発現を欠く、核型的に正常なhES細胞株を作製した。標的とされた領域のMiSeq（商標）分析を通じて、β2mおよびTAP1の両方の対立遺伝子ならびにCD74の一方の対立遺伝子に不活性化変異を有する1つのクローンを同定した（図1B）。このクローンにおいては、インターフェロンガンマにより誘導されるHLA-I発現が完全に消失しており（図1C）、かつ正常な核型が確認された。このHLA-I欠損株由来の単球は、同種の一次CD8+ T細胞の増殖を刺激できなかった。その後、このHLA-I欠損株を、CD74の残りの対立遺伝子およびHLA-IIの発現に必要とされる転写因子であるCIITAの両方の対立遺伝子を分断するよう、CRISPRを用いて再度標的とした。このクローンもまた、正常な核型を有することが確認された。HLA-Iの非存在により標的細胞はNK細胞媒介細胞溶解を受けやすくなり得るので、本発明者らはまた、CRISPR/Cas9を通じてNKG2DリガンドであるMICAおよびMICBも標的とした。RNA-seq分析は、これらが膵臓β細胞により発現される2つのみのNKG2Dリガンドであることを示している。およそ400個のヌクレオフェクトされたクローンの配列決定は、MICAおよびMICBの4つすべての対立遺伝子にフレームシフト変異を有する1つの株を明らかにした。このクローンを、正常な核型およびMICA/MICB発現の欠如について検証した。HLA、MICA/B欠損hES細胞は、以降、HM-KO hESと称される。

実施例II
ヒト化マウスは正常な免疫拒絶反応を再現できない
この株による免疫回避をインビボで試験するため、2 x 10⁵個の臍帯血CD34+細胞を未馴化NSG W41マウスに移植することによりヒト化マウスアプローチを使用した。これらのマウスにおけるBおよびT細胞再構成はロバストであった（図2A）。しかし、これらのヒト化マウスに未改変WT H1 hES細胞（10⁶個）を皮下注射したときでさえ、奇形種の成長はロバストであり、対照の非ヒト化NSGマウスにおけるそれと同程度であった（図2B）。さらに、ヒト化NSG動物においてHM-KO細胞は未改変H1細胞と同様に成長した。したがって、これらの臍帯血ヒト化マウスは、異種奇形種を拒絶することができず、正常なヒト免疫応答の信頼できる代理ではない。未改変細胞でさえも拒絶できないことは、乏しい抗体応答、機能性のNK細胞の非存在、および胸腺由来T細胞とHLA不一致の抗原提示細胞が関係していると考えられる。

実施例III
異種免疫応答性マウスはHLA欠損移植片を拒絶する
よりストリンジェントなアッセイを用いて、インビボで細胞の免疫原性を試験した。異種応答は、移植物に対する最も激しい既知の免疫バリアである。免疫応答は、急性的な異物拒絶を媒介する異種反応性T細胞および事前形成された抗体の出現数の多さおよび効果の大きさに起因して極めて急速に起こる。もし細胞が異種反応に打ち勝てる場合、これらの細胞はT1D患者におけるβ細胞に対する同種反応および自己免疫にも打ち勝つことができるとの確信が得られるであろうと推論した。したがって、HLA-I-KO、HLA-I/II-KO、およびHM-KO細胞を完全免疫応答性C57Bl6/Jマウスに移植した。奇形種の成長は、いかなるレシピエントの、いかなる時点においても観察されなかった。したがって、HLAおよびNKG2Dリガンド欠損は、異種バリアを通過するのに不十分である。

実施例IV
HLA欠損移植片における免疫回避遺伝子の発現は奇形種の成長を可能にする
T細胞による直接認識以外にも、多くの他の因子が拒絶を媒介し得る。例えば、CD4+ T細胞は、外来移植片を飲み込んだ抗原提示細胞により間接的に刺激され得る。これらの間接的に刺激されたT細胞は、その後、B細胞が外来標的に対して抗体応答を生じるのを支援し得る。移植片反応性抗体は、その後、マクロファージの食作用、NK細胞の活性化、および補体の沈着を誘発し得、これらはすべて移植片のクリアランスをもたらし得る。これらの移植片拒絶機構の各々を緩和すると予想される遺伝子を発現させた。GFPマーカーならびにCrry、CD55、CD59およびK^b一本鎖三量体のマウスオルトログをコードする個別のレンチウイルス構築物を作製した。Crry、CD55、およびCD59は、補体の活性化および沈着を阻害し⁶、K^b一本鎖三量体は、NK細胞上の阻害性Ly49C受容体に結合する。HM-KO細胞に形質導入を行い、その約30％が任意の与えられたレンチウイルスに感染した。ついで、この細胞混合物を、完全免疫応答性C57B16/Jマウスに移植した。8週後、2/5匹のマウスが、小さいものの明確な奇形種を示した（図3）。数匹のマウスは、観察期間の間に一過的な成長も示した。これに対して、親HM-KO細胞を移植した場合、いかなる時点でも成長は検出できなかった。これらのデータによって、免疫回避遺伝子発現の組み合わせによりHM-KO細胞が異種レシピエントにおいて拒絶を回避し成長できるようになることが示唆された。HLA-I欠損細胞の同種移植のために十分であると考えられているCD47はこれらの実験には含まれず、したがって、それは奇形種成長に必要ではないことに注目されたい。

実施例V
免疫回避遺伝子発現は細胞分化に影響しない
これらの結果から発展させるために、本発明者らは、これらのレンチウイルス形質導入されたHM-KO細胞を、100％がCrry、CD59およびK^b一本鎖三量体を発現するよう選別した。これらの細胞のほぼ半分はCD55も発現し、さらなる形質導入の後、20％が、マクロファージ食作用を減少させるCD47を発現した（図4）。この細胞混合物をHM-KO-レンチ細胞と命名し、HM-KOおよびHM-KO-レンチ細胞を、自動化手順を用いて膵臓β細胞に分化させた。HM-KO遺伝子欠失はhESC H1の分化効率に影響しないことが以前に示されている。ここでは、マウス回避遺伝子のレンチウイルス過剰発現（HM-KO-レンチ）もまた分化効率に影響しないことがさらに示されている（図5）。

実施例VI
最小免疫原性ヒト幹細胞由来のβ細胞は野生型（WT）マウスにおいて維持される
完全免疫応答性WTマウスへのヒト細胞の移植は、そのような細胞が臨床下で移植片として生存可能であるかどうかを決定する、より妥当性がありかつよりストリンジェントな試験であると推論した。これらの異種バリアは、相当な難題であり、おそらくT1D患者においてβ細胞を置き換える上で遭遇する実際のバリアを超えるものである。したがって、細胞がこのバリアを通過することができる場合、それらは潜在的に、自己免疫および同種拒絶バリアの両方を有する患者に移植されたときにインビボで生存することができるであろうという仮説をたてた。実際、現在のヒト化マウスモデルの制約のために（上記参照）、この異種バリアは、これらの細胞の免疫回避能をインビボで試験することができる唯一の意味のある方法とみなされた。この実験では、HM-KOおよびHM-KO-レンチ細胞から得られた100個の幹細胞由来の疑似膵島を6～8週齢の雌マウス（n=4）に皮下移植した。陽性対照として、100個の疑似膵島を免疫不全NSGマウス（n=2）にも移植した。この疑似膵島の生存を評価するため、移植から1週間後に実験グループあたり1匹のマウスを屠殺した。HM-KO-レンチ由来疑似膵島を移植したマウスにおいて、移植片は、移植部位で明確に視認することができ（図6A）、抗GFP抗体染色は、免疫組織化学（IHC）を通じてそれらのヒト起源を確認した。移植から2カ月後に、残りのマウスを屠殺した。HM-KO細胞を移植されたマウスはいずれも視認可能な移植片を有していなかったが、3匹のHM-KO-レンチ細胞を移植されたマウスのうちの1匹は、小さいが明確に定義される移植片を有していた（図6B）。この組織のヒト幹細胞起源は、GFP IHCによっても確認された（図6B）。図7は、GFPについて陰性である隣接する乳腺の染色を示している。これらのデータは、上記の免疫回避遺伝子のいくつかの組み合わせの発現が異物拒絶の持続的回避を可能にすることを示している。本発明者らは、これまでにそのような結果を報告したいかなる先行文献も確認していない。

実施例VII
最小免疫原性ヒト幹細胞由来のβ細胞はインビボで機能的である
HM-KOおよびHM-KO-レンチ細胞を移植したNSGマウスは、それらの血液中に検出可能なヒトC-ペプチドを有しており、これによりこの遺伝子改変が細胞分化を妨げないことがさらに示された（図8）。いずれかのタイプの細胞を移植されたWTマウスは、試験された2つの比較的早期の時点で有意なヒトC-ペプチドレベルを有さなかった。これらの移植片がインスリンを発現することの確認は、NSGマウスに移植されたそれらの対応物におけるのと同様に確認される。WTマウスにおける検出可能なヒトC-ペプチドの非存在についての最も可能性のある説明は、これらの細胞移植片の免疫不全レシピエントと比較して疑似膵島の数が明らかに減少したということである。まとめると、データは、免疫回避遺伝子の特定の組み合わせにより移植片が免疫反応性異種レシピエントにおいて持続可能となり、他方、この理想的な組み合わせを欠く疑似膵島は依然として拒絶され得ることを示唆している。

実施例VIII
免疫回避および自殺遺伝子を発現する再設計されたサイレンシング耐性AAVS1ターゲティング構築物
上記のレンチウイルス研究は必須の免疫回避遺伝子の組み合わせを定義するのに有用であるが、これは臨床的には実行可能なアプローチではない。レンチウイルスの無作為組み込みは、発癌遺伝子を活性化させおよび／または発現を抑制し、それによって免疫回避の喪失および移植片の喪失をもたらし得る。誘導性自殺カセット、例えばmTKおよびiCasp9の組み込みは、そのような予期せぬ有害イベントが発生した場合に移植片の薬理学的排除を可能にする。さらに、必要な免疫回避および自殺遺伝子を発現する定義された遺伝子座は、無作為組み込みおよびサイレンシングによる問題を回避し得る。いくつかの研究は、PPPR12Cのイントロン領域内に位置する内因性AAV組み込み部位が、ヒト多能性幹細胞における内因性遺伝子の発現にとっての「セーフハーバー（safe harbor）」となることを報告している。しかし、すべての報告されているAAVS1構築物およびCas9/gRNAシステムは、サイレンシングから保護される内因性AAV組み込み部位ではなく、高度にメチル化され得る領域を標的とすることが示されている（図9A）。したがって、このより適切な部位を標的とする新しい免疫回避構築物を作製した（図9B）。これらのベクターにおいて、ガンシクロビルまたはAP1903に曝露されたときに細胞死を誘導する誘導性自殺遺伝子であるmTKまたはiCasp9が、ウイルスの2A配列を通じて免疫回避遺伝子および薬剤耐性カセットに連結されている。加えて、本発明者らは、転写サイレンシングの可能性を最小化するために、A2UCOEインシュレーターエレメントを含めた。ここでは、HM-KO細胞および強い内胚葉分化能を有する別のHES細胞株であるHUES2細胞を、これらの構築物でターゲティングした。結果は、新構築物を用いてターゲティングされた場合、以前の構築物と比較して、より高い割合の薬剤耐性hES細胞が免疫回避遺伝子を発現することを示している（図9C）。ネオマイシン耐性HM-KO細胞でさえも、以前のAAVS構築物でターゲティングされた場合はいかなる免疫回避遺伝子も検出可能に発現しなかったが、新構築物でトランスフェクトされた場合、これらの細胞の一部がmCD59発現を保持していた（図9C）。別のhES細胞株であるHUES2細胞は、HM-KO細胞よりも良好に免疫回避遺伝子の発現を保持していた（図9C）。さらにHUES2株においてさえ、新しいAAVSターゲティングカセットは、免疫回避遺伝子のより良好な発現をもたらした（図9C）。本発明者らは、薬剤耐性細胞を選択し、免疫回避カセットを発現するクローンを選別および増大させ、そしてそれらが数カ月にわたって導入遺伝子の安定的発現を維持することを確認した（図9D）。これらの免疫回避遺伝子のヒトホモログを安定的に発現するHM-KO細胞も選択および増大させた。ヒトCD55、CD46およびHLAE（Qa1のホモログ）一本鎖三量体を発現するこれらのAAVS構築物をCHOまたは721.221細胞にトランスフェクトすると、補体沈着およびNKG2A+NK細胞による脱顆粒化が顕著に減弱化され（図10Aおよび10B）、これによりこれらのターゲティング構築物の機能が確認された。

実施例IX
自動化β細胞分化プロトコルの最適化
本研究のために、データの直接比較を容易にするために以前に使用したのと同じ分化プロトコルを使用したが、それまでの間に、このβ細胞分化プロトコルに、90％超のNKX6.1発現および5つの細胞株で平均84％の効率を達成する有意な改善が加えられた（図11A）。代表的な疑似膵島のIHC染色は、有意なインスリン発現および散発的なグルカゴン発現を示した（図11B）。さらに、多大な実験設計（DoE）への取り組みにより、わずか10日間の成熟後にロバストなグルコース刺激インスリン分泌（GSIS）応答を示す疑似膵島を生成する成熟培地条件が特定され（図11C）。これにより、ゲノム編集された細胞株の詳細な機能的特徴づけおよび未改変細胞との比較が可能になるであろう。今後は、これらのプロトコルが適用される。

実施例X
改変された幹細胞を用いたT1Dの処置
本明細書で示された結果に基づき、本発明者らは、糖尿病細胞置換療法のための万人向けドナー細胞を開発することを試みた。これは、回避遺伝子構築物を生成しその使用を確認すること、WTおよびNODマウスにおいて前臨床的な原理証明実験を実施すること、ならびにAAVSターゲティングを通じて選択された回避遺伝子構築物を安定的に発現する新しいHM-KO細胞株を生成することにより達成される（図12）。

目的1. 免疫回避遺伝子発現がWTおよびNODマウスにおいてヒト幹細胞由来β細胞の拒絶を防ぐことを実証する
これは、免疫回避遺伝子を均一に発現する細胞をWTマウスに移植することにより達成される。残りの免疫バリアは、抗体枯渇実験を通じて定義する。その後、免疫回避遺伝子を均一に発現する細胞をNODマウスに移植する。

目的2. NODマウスにおいてヒト幹細胞由来細胞の拒絶を防ぐ遺伝子の最小の組み合わせを定義する
これは、インビボ選択アッセイを通じて免疫回避遺伝子の機能的に必須のカテゴリーを定義することによって達成される。免疫回避遺伝子の最小の組み合わせはまた、限定的レンチウイルス感染およびインビボ競合アッセイを通じて定義される。マウス免疫回避および誘導性自殺遺伝子の組み合わせを安定的に発現する新しいHM-KO細胞株を作製する。免疫原性は、ヒト免疫回避遺伝子を安定的に発現するHM-KO細胞のインビトロアッセイを通じて試験する。

原理
T1Dは、複雑な自己免疫反応によって引き起こされる。T1Dは、ランゲルハンス島においてT細胞がインスリン産生性膵臓β細胞を排除する自己免疫障害である。ヒト遺伝学、移植、死体研究およびT1Dのロバストなマウスモデルの組み合わせを通じて、現在ではβ細胞の自己免疫破壊の背後にある機構に関して多くのことが判明している。HLA-DQβの特定の対立遺伝子がT1Dの原因となることは、疾患発症におけるCD4+ T細胞を強く示唆している。I-A^g7という類似のMHC II対立遺伝子を有するマウスもまた、自然発生的なT1Dを発症し、HLA-DQと同じペプチドの多くを示し、ヒト疾患の鍵となる局面を模倣する。ヒトT1Dにおいて、多くの膵臓リンパ節T細胞が、インスリン自体に対して反応性である。NODマウスにおいて、T1Dは、MHC II上に抗原性ペプチドが提示できないようにするインスリンの変異により防がれる。最初のインスリン反応性CD4+ T細胞は、膵臓および流入領域リンパ節に浸潤し、特化したマクロファージ集団および抗原性インスリンペプチドを提示する交差提示性樹状細胞と相互作用する。これらのCD4+ T細胞が局所的に活性化されると、自己免疫応答が徐々により複雑になる。CD4+ T細胞浸潤の後に、自己反応性CD8+ T細胞が続き、これにインスリン反応性Β細胞および抗体が付随する。インスリン反応性細胞が主であるが、CD4+およびCD8+ T細胞により認識される自己抗原の数は増え始め、最終的に数百の自己ペプチドを含むようになる。これらの自己反応性リンパ球および抗体は、膵臓β細胞の破壊後も、長期にわたり持続し、非糖尿病の同一背景の双生児由来の膵島移植さえも拒絶する。したがって、すでに存在するβ細胞に対する免疫応答は、極めて複雑であり、多能性幹細胞（PSC）ベースの置換療法に対する大きな障壁となる。

多能性幹細胞は、移植可能なβ細胞のスケーラブルな供給源である。T1Dの管理に関しては（毎日のインスリン注射を通じた）標準治療が確立されているが、治癒法は現時点で開発されていない。死後提供膵島の移植はレシピエントにおいてβ細胞機能を回復させ、T1Dを好転させることが、画期的研究により証明された。免疫抑制療法が抱える副作用に加えて、膵臓の臓器提供の不足のために、β細胞を代替のかつスケーラブルな供給源から作製することに対して多大な努力がなされている。ヒトPSCの誘導分化は、これらの細胞を培養下で無限に増大させることができ、それによって多数人に移植できるβ細胞の信頼性の高い供給源を提供することができることから、これらのアプローチの中で最もすぐれたものである。現在、ヒトPSCから多数のβ細胞を発生させるいくつかのロバストなプロトコルが存在する。重要なことに、これらの細胞は、糖尿病の動物モデルにおいて正常な血糖レベルを回復させることが示されている。しかし、移植片に対する自己免疫および同種免疫バリアならびにT1D患者における移植されたβ細胞の持続性に関しては、未解決のままである。そのような手順の候補患者が彼ら自身のβ細胞を必ず拒絶するならば、多能性幹細胞由来の置換用移植片が同様の免疫学的クリアランスを回避することができる戦略を開発しなければならない。全身免疫抑制療法は、大部分のT1D患者に許容可能であるとは考え難いので、代替のアプローチは、宿主免疫応答を回避するよう移植片を遺伝子改変することである。このアプローチの追加の利点は、細胞置換療法の費用を大幅に減少させる、「万人向け」のドナー細胞株の作製であろう。

T1D免疫バリアを克服する上での前例のない進歩。最近の研究は、遺伝子改変を通じてヒトES細胞の免疫原性を低下させることを報告した。しかしこれらの試みは主としてHLA-I発現に焦点を当てた比較的少数の免疫認識経路に限定されている。これらの試みは、移植がすでに行われたT1Dにおける広範囲の応答をカバーしていない可能性がある。これらの研究の1つは、非多形・非古典的HLA-I分子であるHLA-Eを発現させることによりさらなる改変を行った。HLA-Eは、NK細胞上の抑制性NKG2Aと相互作用し、したがって魅力的な初めてのアプローチである。しかし、典型的に、NK細胞のおよそ20～50％しかNKG2Aを発現しない。したがって、HLA-Eの発現は、HLA I欠損細胞のさらなる免疫バリアを克服しない可能性が高い。第2の研究は、ES細胞におけるCD47の過剰発現がHLA欠損ヒト化マウスモデルにおいて同種バリアを克服するのに十分であることを報告した。興味深いものであるが、CD47の過剰発現が免疫回避を媒介する機構は不明である。ナチュラルキラー（NK）細胞回避が提案されたが、NK細胞は移植片拒絶に不必要であり、CD47のリガンドであるSirpaを発現しない。第3の研究は、HLA-GおよびPD-L1を含むより広範囲の分子を試験したが、得られた細胞は、正常な免疫応答を反映するそれらの能力に関して非常に限定的であることが示されたヒト化マウスモデルにおいて試験されたのみであった。まとめると、これらの試みは、多能性幹細胞ベースの置換療法に対するT1D免疫バリアを定義するのに不十分であるようである。代わりに、直接的T細胞認識、食作用および間接的抗原提示、抗体エフェクター機能、ならびにNK細胞認識を含む、免疫応答の複数の局面をより包括的に取り除くことが、より明るい見込みを提供する。実際、細胞および移植片のサブセットが異種レシピエントにおいて生存可能であるという本明細書に記載される観察は、前例のないことである。

幹細胞の遺伝子操作は、T1D免疫バリアの安全かつ持続可能な突破を可能にする。その予備的データが予測するように、NODマウスにおいて異種および自己免疫バリアの両方を克服した後、次のステップは、これらのバリアを克服するための最小必須要素を定義することであろう。これについては様々な理由がある。第1に、免疫回避遺伝子の過剰な発現は、日和見病原体による感染または免疫監視の欠如を通じた腫瘍形成に対して移植片を脆弱化させ得る。さらに、抗食作用遺伝子の過剰発現は、死んだ細胞の正常なクリアランスを制限し得、それによって傍観者炎症および免疫病理をもたらし得る。第2に、これらの非免疫原性細胞および移植戦略が臨床に到達した場合、発現させる必須遺伝子の最小の組み合わせの定義は、その規制上の承認プロセスを容易にし得る。H1 hES細胞に関して上記されたように、ターゲティングされた変異を生成するためにCRISPRゲノム編集が使用される。加えて、有害な変異が生じていないことを確実にするために、各ラウンド間で全ゲノム配列決定が行われる。レンチウイルスは継代および分化を通じてサイレンシングされ得るので、かつこれらのベクターはプロト癌遺伝子内に組み込まれ得るので、免疫回避遺伝子は定義された遺伝子座で発現される。目的2で定義される免疫回避遺伝子の最小の組み合わせは、したがって、サイレンシング耐性AAVS1ターゲティングカセットにおいて誘導性自殺遺伝子と共に発現される。これらの自殺遺伝子は、予期せぬ有害イベントが起こった場合に移植片を排除するために重要となり得る。

研究デザインおよび方法
目的1. 免疫回避遺伝子発現がWTおよびNODマウスにおいてヒト幹細胞由来β細胞の拒絶を防ぐことを実証する

免疫回避遺伝子を均一に発現するβ細胞のWTマウスへの移植
本明細書のデータは、HM-KO-レンチ細胞における免疫回避遺伝子発現が少なくとも部分的に異種移植片拒絶を回避することができることを示唆している。上記のように、移植された細胞の半分のみがCD55を発現し、これらの20％のみがCD47を発現した（図4）。したがって、移植片が一部のみ持続したことの考えられる理由は、投入HM-KO-レンチ細胞の約10％のみが5つすべての免疫回避遺伝子を発現していたということである。さらに、ES細胞の継代および分化の間の、一定程度のレンチウイルスのサイレンシングが不可避である。本発明者らは、したがって、Crry、CD59、およびK^b一本鎖三量体に加えてCD55およびCD47を発現するものについてのHM-KO-レンチ細胞の選別を始めた。これらの細胞および対照HM-KOをβ細胞に分化させ、免疫応答性C57Bl6/Jおよび免疫不全NSGマウスに並行して移植する。ヒトC-ペプチドの血清レベルを、8～12週の期間にわたって定量する。最後の週に、マウスを耐糖能試験に供し、屠殺し、疑似膵島を切除する。残りの移植片においてGFPおよびインスリン発現を定量し、移植片への宿主由来細胞の浸潤をIHCにより評価する。各分化の後、HM-KO-レンチおよび未改変対照疑似膵島を詳細な機能および組成評価に供して、遺伝子改変がβ細胞機能に対して悪影響を有さないことを確認する。

抗体枯渇実験を通じた残りの免疫バリアの定義
NSGレシピエントと比較してC57B16/Jレシピエントにおいてより少ない疑似膵島およびヒトC-ペプチドが観察される場合、本発明者らは、残りの免疫バリアを定義するために抗体枯渇および遺伝子実験を実施する。HM-KO-レンチ細胞の移植の1日前に、C57B16/Jレシピエントを、T細胞を除去するためのCD4およびCD8に対する枯渇抗体、NK細胞を取り除くためのNK1.1抗体、β細胞を枯渇させるためのCD20抗体、またはマクロファージおよび単球を取り除くためのCSF1ブロッキング抗体で処理する。並行して、C3^-/-補体欠損レシピエントにHM-KO-レンチ由来β細胞を移植する。上記のように、血清C-ペプチドレベルを経時的に測定し、疑似膵島の持続を定量する。移植片の持続を可能にするためにT細胞および／またはCSF1枯渇が必要となる場合、本発明者らはさらに、PDL1およびCD24をコードするウイルスを用いてHM-KO-レンチ細胞に形質導入を行う。T細胞の直接阻害とは別に、PDL1もまたマクロファージによる食作用およびT細胞に対する抗原提示を防ぎ、CD24も同様の効果を発揮する。移植片拒絶にNK細胞が必要とされる場合、本発明者らはNK細胞上の抑制性NKG2A受容体に結合するQa1一本鎖三量体を発現させる。さらに、本発明者らは、NK細胞活性化をさらに弱めるために、NKG2DリガンドのULBPファミリーを取り除く。最後に、CD20の取り除きおよび／またはC3の欠損が移植片の受け入れを可能にする場合、本発明者らは、HM-KO-レンチ細胞においてCR1を発現させる。CR1は、補体活性化の極めて強力な阻害剤であり、Crry、CD55およびCD59よりも高い効率および速い速度論を示す。これらの抗体枯渇実験により手引きされる追加の免疫回避遺伝子の発現の後、C57B16/Jマウスにおいて上記のようにしてβ細胞移植実験を実施する。

免疫回避遺伝子を均一に発現するβ細胞のNODマウスへの移植
免疫応答性マウスにおける生着が最大化された後、本発明者らは、アッセイの生物学的ストリンジェンシーを高める。臨床状況において、β細胞移植片は活動性のT1Dを有するものに対してのみ与える。この状況下では、事前形成されたβ細胞反応性抗体、記憶T細胞、および付随する炎症条件が、移植片以前に存在し得る。マウスにおいて、この状況は、NODマウスにおいて最もよく模倣される。自己抗原、例えばインスリンそれ自体は、マウスとヒトの間で高度に保存されており、そのためNODマウス内の抗体はヒトβ細胞移植片と交差反応すると考えられる。さらに、移植片由来抗原の間接的提示は、さらなるT細胞活性化、炎症および移植片喪失をもたらし得る。これらの可能性を試験するため、本発明者らは、β細胞を作製するために上で定義されたHM-KO-レンチ細胞の最適な組み合わせを使用する。これらの細胞を、Jackson Labsから入手した8週齢の雌NODマウスに移植する。これらのマウスは、4週という早期に膵臓への免疫浸潤およびインスリン抗体を示し、30週齢までにT1Dを確実に発症する。移植後、血清ヒトC-ペプチドおよびグルコースレベルを観察する。HM-KO-レンチ由来移植片は持続し、ヒトインスリンを産生し、T1Dを防ぐと予想される。

予想される結果
CR1、CD55、CD47、CD59、Crry、Qa1およびK^b一本鎖三量体、PDL1、ならびにCD24を発現するHM-KO由来β細胞は、C57B16/JおよびNODマウスにおいて効果的に生着し、持続すると予想される。これらの移植片は、NODマウスにおける自己免疫拒絶に耐性があり、したがってこれらの移植片のレシピエントはT1Dを発症しないと予想される。

目的2. NODマウスにおいてヒト幹細胞由来β細胞の拒絶を防ぐ遺伝子の最小の組み合わせを定義する

インビボ選択アッセイを通じて免疫回避遺伝子の機能的に必須のカテゴリーを定義する
本発明者らは、非必須免疫回避遺伝子を同定および除外するために体系的アプローチをとる。本発明者らは最初に、遺伝子を、表1に示されるように機能的に異なるカテゴリーに分類する。H1 hES細胞、HLA-I欠損細胞、HLA-I/II欠損細胞、およびHM-KO細胞を、1つの機能カテゴリーを除外したこれらの遺伝子の特定の組み合わせにより形質導入する。例えば、食作用を防ぐ重要性を決定するために、HM-KO細胞を、CD47、PDL1およびCD24を除く上記のすべての免疫回避遺伝子により形質導入する。他の多能性幹細胞を、NK細胞媒介拒絶の重要性を試験するために、Qa1およびK^b一本鎖三量体を除くすべての免疫回避遺伝子により形質導入する。これらの細胞のプールを混合してひとまとめにし、β細胞に分化させる。少量の疑似膵島サンプルを分離し、各細胞プールの相対的寄与に関してフローサイトメトリーにより試験する。残りの疑似膵島をNODマウスに移植する。移植後8週で、移植片を回収し、各レンチウイルスプールの細胞の存在を、移植前の数に対して定量する。これらのアッセイを通じて、移植片の持続および免疫回避に必須の遺伝子のカテゴリーを定義する。

（表１）免疫回避経路および遺伝子

限定的レンチウイルス感染およびインビボ競合アッセイを通じて免疫回避遺伝子の最小の組み合わせを定義する
本発明者らは、異種拒絶を回避するのに必須の遺伝子の機能カテゴリーを定義した後、そのカテゴリー内で必須遺伝子を定義する。例えば、生着および持続に補体回避が必須であることが見出された場合、本発明者らは最初に、CR1、Crry、CD55およびCD59を除くすべての免疫回避遺伝子をレンチウイルス発現させる。その後、これらの細胞を、約30％が感染するよう各々の個々の補体回避遺伝子により形質導入する。この細胞プールを細胞に分化させ、これらの補体回避遺伝子の発現についてフローサイトメトリーにより分析し、移植する。上記のように、本発明者らは、これらの補体回避因子を発現する細胞の増加および減少を定量する。例えば、移植後にCR1を発現する細胞が投入細胞に対して増加するが、Crryを発現する細胞はそうでない場合、CR1は必須であり、Crryはそうでないと結論づけられる。この反復プロセスを通じて、本発明者らは、移植片を持続可能なようにするために発現させる免疫回避遺伝子の最小の組み合わせおよび変異させるHLA/NKG2Dリガンド遺伝子を定義する。

AAVSターゲティングを通じてマウス免疫回避および誘導性自殺遺伝子の最適な組み合わせを安定的に発現する新しいHM-KO細胞株を作製する
上で議論されたように、免疫回避または自殺遺伝子を発現させるためのレンチウイルス過剰発現は、臨床的に実行可能な手段ではない。それに代えて、これらのレンチウイルス実験からの情報を用いて、本発明者らは、CRISPRゲノム編集を使用して、すべてがリボソームスキップウイルス2A配列を用いて一つに連結された、マウス免疫回避遺伝子、ネオマイシン耐性カセット、およびHSVチミジンキナーゼまたはiCasp9のいずれかの誘導性自殺遺伝子の最小の組み合わせを発現する図9に示されるようなAAVS1ターゲティング構築物を作製する。図9に示されるように、これらのターゲティング構築物を、Cas9および適切なAAVS座を標的とするgRNAと共にHM-KO細胞にトランスフェクトする。ネオマイシン耐性細胞を選択し、マウス免疫回避遺伝子を安定的に発現する細胞をクローン選別し、増大させる。発癌性変異の非存在を確認するための核型決定およびエキソーム配列決定の後、本発明者らは、これらの多能性幹細胞を細胞に分化させ、8週齢のNOD雌マウスに移植する。グルコースおよびヒトC-ペプチドの血清レベルを経時的に測定し、AAVSターゲティングされた細胞がレンチウイルスにより形質導入された細胞と同様の挙動を示すことを確認する。

ヒト免疫回避遺伝子の最適な組み合わせを安定的に発現するHM-KO細胞のインビトロアッセイを通じて免疫原性を試験する
ここまで、すべてのアッセイは、免疫回避のインビボ手段として、マウス異種移植に着目していた。しかしそのバリアは、実際の同種移植の臨床状況では異なる可能性がある。これを完全にモデル化することは困難であるが、その戦略においてさらなる信頼性を獲得するために、関連するインビトロアッセイ群を使用することができる。必須免疫回避遺伝子のヒトホモログを発現するHM-KO細胞を、AAVS1ターゲティングを通じて作製する。これらの細胞を細胞に分化させ、インビトロ免疫認識アッセイに使用する。

予想される結果
免疫回避の各機能カテゴリーの1～2つの遺伝子が移植片の持続に必要となることが予想される。本発明者らは、これらの遺伝子および誘導性自殺遺カセットがAAVS1ターゲティングを通じて安定的には発現され、これによりインビボおよびインビトロの両方で免疫認識を防ぐと考える。さらに、免疫認識のインビボ尺度が、ヒト免疫回避遺伝子を発現するHM-KO細胞において顕著に減少すると予想される。

実施例XI
幹細胞および様々な派生組織において免疫回避を改善するCR1および／またはCD24の能力
目的
HLA-IおよびHLA-IIを減少させ、CD47、CD55、CD46、CD59およびHLA-E一本鎖三量体の発現を増加させた、幹細胞および様々な派生組織（ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統、血液細胞系統を含むがこれらに限定されない）において免疫回避を改善するCR1および／またはCD24の能力を試験する。

実験1
HLA-IおよびHLA-IIを減少させ、CD47、CD55、CD46、CD59およびHLA-E一本鎖三量体の発現を増加させた、幹細胞および様々な派生組織（ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統、血液細胞系統を含むがこれらに限定されない）において、CR1および／CD24の発現を増加させる。古典的抗体依存経路を通じた補体沈着を減少させるCR1の能力およびマクロファージによる抗体被覆細胞の食作用を減少させるCD24の能力を評価するインビトロアッセイを行う。

実験2
HLA-IおよびHLA-IIを減少させ、CD47、CD55、CD46（Crry）、CD59およびHLA-E一本鎖三量体（Qa1）のマウスホモログの発現を増加させた、幹細胞および様々な派生組織（ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統、血液細胞系統を含むがこれらに限定されない）において、CR1および／CD24の発現を増加させる。マウス実験の場合、HLA-G一本鎖三量体（Kb一本鎖三量体）を含める。免疫応答性WT C57BL6マウスへの移植後のこれらの細胞の生存ならびに各組織の生存および機能に対してCR1および／またはCD24が有する効果を評価する。

予想される結果
CR1および／またはCD24は、免疫回避能を、したがって異種移植組織の生存を向上させる。インビトロアッセイを繰り返す。

実施例XII
免疫因子を置き換えるCR1および／またはCD24の能力
目的
HLA-IおよびHLA-II発現を減少させた、幹細胞および様々な派生組織（ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統、血液細胞系統を含むがこれらに限定されない）において、免疫応答性WT C57BL6マウスへのインビボ移植後の生存および機能を維持または改善しつつ、以下の因子CD47、CD55、CD46、CD59およびHLA-E一本鎖三量体のいずれかと置き換わるCR1および／またはCD24の能力を試験する。

実験1
HLA-IおよびHLA-IIを減少させ、CD55、CD46（Crry）、CD59およびHLA-E一本鎖三量体（Qa1）（CD47なし - 食作用）のマウスホモログの発現を増加させた、幹細胞および様々な派生組織（ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統、血液細胞系統を含むがこれらに限定されない）において、CD24の発現を増加させ、そして免疫応答性WT C57BL6マウスへの移植後のこれらの細胞の生存ならびに各組織の生存および機能に対してCR1および／またはCD24が有する効果を評価する。

実験2
HLA-IおよびHLA-IIを減少させ、CD47、CD46（Crry）およびHLA-E一本鎖三量体（Qa1）（CD55、CD59なし - 補体）のマウスホモログの発現を増加させた、幹細胞および様々な派生組織（ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統、血液細胞系統を含むがこれらに限定されない）において、CR1の発現を増加させ、そして免疫応答性WT C57BL6マウスへの移植後のこれらの細胞の生存ならびに各組織の生存および機能に対してCR1および／またはCD24が有する効果を評価する。

予想される結果
CR1および／またはCD24は、これらの因子CD47、CD55、CD46、CD59およびHLA-E一本鎖三量体の異なる組み合わせの非存在下で、幹細胞および様々な派生組織（ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統、血液細胞系統を含むがこれらに限定されない）において免疫回避を誘導することができる。とりわけ、本発明者らは特に、CR1が因子CD55、CD46および／またはCD59と置き換わることができ、CD24がCD47と置き換わることができると考える。インビトロアッセイを繰り返す。

実験XIII
免疫因子を置き換えるCR1および／またはCD24の能力
目的
HLA-IおよびHLA-II発現を減少させた、幹細胞および様々な派生組織（ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統、血液細胞系統を含むがこれらに限定されない）において、インビトロ補体沈着および食作用アッセイ後に生存および機能を維持または改善しつつ、以下の因子CD47、CD55、CD46、CD59およびHLA-E一本鎖三量体のいずれかと置き換わるCR1および／またはCD24の能力を試験する。

実験1
HLA-IおよびHLA-IIを減少させ、CD55、CD46（Crry）、CD59およびHLA-E一本鎖三量体（Qa1）（CD47なし - 食作用）のマウスホモログの発現を増加させた、幹細胞および様々な派生組織（ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統、血液細胞系統を含むがこれらに限定されない）において、CD24の発現を増加させる。マクロファージによる抗体被覆細胞の食作用を減少させるCD24の能力を評価するインビトロアッセイを行う。

実験2
HLA-IおよびHLA-IIを減少させ、CD47、CD46（Crry）およびHLA-E一本鎖三量体（Qa1）（CD55、CD59なし - 補体）のマウスホモログの発現を増加させた、幹細胞および様々な派生組織（ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統、血液細胞系統を含むがこれらに限定されない）において、CR1の発現を増加させる。古典的抗体依存経路を通じた補体沈着を減少させるCR1の能力を評価するインビトロアッセイを行う。

予想される結果
CR1および／またはCD24は、これらの因子CD47、CD55、CD46、CD59およびHLA-E一本鎖三量体の異なる組み合わせの非存在下で、幹細胞および様々な派生組織（ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統、血液細胞系統を含むがこれらに限定されない）において免疫回避を誘導することができる。とりわけ、本発明者らは、CR1が因子CD55、CD46および／CD59と置き換わることができ、CD24がCD47と置き換わることができると考える。インビトロアッセイを繰り返す。

本発明は上記実施例を参照して説明されているが、その改変物および派生物も本発明の精神および範囲内に包含されることが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims

幹細胞（SC）を作製する方法であって、
a）HLA-I、HLA-IIまたはそれらの組み合わせの発現を野生型SCと比較して減少させるようSCを改変する工程、ならびに
b）CR1および／またはCD24、ならびに任意でCD47、CD55、CD46、CD59およびHLA-E一本鎖三量体の1つまたは複数を含む免疫回避遺伝子を発現するよう外因性構築物を導入する工程
を含む、方法。
免疫回避遺伝子が、CR1およびCD24を含む、請求項1記載の方法。
免疫回避遺伝子が、CR1、CD24、ならびにCD46、CD47、CD55、CD59およびHLA-E一本鎖三量体の1つまたは複数を含む、請求項1記載の方法。
免疫回避遺伝子が、CR1、CD24、CD47、CD55、CD46、CD59および任意でHLA-E一本鎖三量体を含む、請求項1記載の方法。
PDL1およびHLA-G一本鎖三量体の1つまたは複数を発現するよう外因性構築物を導入する工程をさらに含む、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
HLA-Iの発現が、TAP1またはβ2Mの発現を抑止することによって減少させられる、請求項1記載の方法。
HLA-IIの発現が、CD74およびCIITAの発現を抑止することによって減少させられる、請求項1記載の方法。
改変する工程が、CRISPR/Cas9によりターゲティングされる変異を用いたゲノム編集を含む、請求項1記載の方法。
外因性構築物を導入する工程が、レンチウイルス形質導入により行われる、請求項1記載の方法。
外因性構築物を導入する工程が、アデノ随伴ウイルス（AAV）構築物を用いて行われる、請求項1記載の方法。
AAV構築物が、PPPR12Cのイントロン領域内に位置する内因性AAV組み込み部位を標的とする改変されたAAVS構築物である、請求項10記載の方法。
SCをβ細胞に分化させる工程をさらに含む、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
請求項1～11のいずれか一項記載の方法によって生成される幹細胞（SC）。
（i）HLA-IおよびHLA-IIの発現が抑止される、ならびに
（ii）SCが、CR1および／またはCD24、ならびに任意でCD47、CD55、CD46、CD59およびHLA-E一本鎖三量体の1つまたは複数を発現する、
請求項13記載のSC。
PDL1およびHLA-G一本鎖三量体をさらに発現する、請求項14記載のSC。
マウスまたはヒトSCである、請求項13～15のいずれか一項記載のSC。
胚性SCまたは人工多能性SCである、請求項16記載のSC。
その必要のある対象において、請求項13～17のいずれか一項記載のSCまたは請求項13～17のいずれか一項記載のSCの子孫を用いて疾患または障害を処置する方法。
疾患または障害が、自己免疫疾患または神経変性疾患である、請求項18記載の方法。
疾患または障害が癌である、請求項18記載の方法。
疾患または障害がI型糖尿病である、請求項18記載の方法。
請求項12記載の方法により生成されるβ細胞。
対象においてI型糖尿病（T1D）を処置する方法であって、請求項22記載のβ細胞を対象に投与し、それによって対象においてT1Dを処置する工程を含む、方法。
（i）HLA-IおよびHLA-IIの発現が抑止される、ならびに
（ii）SCが、CR1および／またはCD24、ならびに任意でCD47、CD55、CD46、CD59およびHLA-E一本鎖三量体の1つまたは複数を発現するよう遺伝子改変されている、
幹細胞（SC）。
PDL1およびHLA-G一本鎖三量体を発現するようさらに遺伝子改変される、請求項24記載のSC。
マウスまたはヒトSCである、請求項24～25のいずれか一項記載のSC。
胚性SCまたは人工多能性SCである、請求項26記載のSC。
請求項24～27のいずれか一項記載のSCに由来する細胞株。
SCを分化させ、分化した細胞または組織を生成する工程をさらに含む、請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
前記細胞または組織が、ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統および血液細胞系統からなる群より選択される、請求項29記載の方法。
請求項29記載の方法により生成される細胞または組織。
ミクログリア、網膜色素上皮、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、肝細胞、ポドサイト、ケラチノサイト、心筋細胞、ドパミン作動性ニューロン、皮質ニューロン、感覚ニューロン、NGN2指向性ニューロン、介在ニューロン、前脳基底部コリン作動性ニューロン、膵臓ベータ細胞、神経幹細胞、ナチュラルキラー細胞、制御性T細胞、肺細胞系統、腎臓細胞系統および血液細胞系統からなる群より選択される、請求項31記載の細胞または組織。