JP2022549344A - サイトカインプロドラッグおよびデュアルプロドラッグ - Google Patents

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Abstract

Figure 2022549344000001
本出願は、ＩＬ－１２の新規プロドラッグに関する。さらに本出願に含まれるのは、該新規プロドラッグを製造および使用する方法である。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月２８日出願の米国仮出願６２／９０７,６１５に基づく優先権を主張し、全体としてその内容を引用により本明細書に包含させる。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、全体として引用により本明細書に包含させる、配列表を含む。該ASCIIコピーは２０２０年９月２３日に作成され、025471_WO007_SL.txtなる名称であり、サイズ２８２,８５１バイトである。
発明の背景
インターロイキン１２(ＩＬ－１２)は免疫において重要な役割を果たす(Watford et al., Cytokine Growth Factor Rev. (2003) 14(5):361-8)。それはインターフェロンガンマ放出を刺激し、Ｔ細胞およびナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を活性化する(Del Vecchio, Clin Cancer Res. (2007) 13(16):4677-85)。ＩＬ－１２は、ｐ４０およびｐ３５の２個のサブユニットからなる。ＩＬ－１２受容体は、ＩＬ－１２受容体ベータ１(ＩＬ－１２Ｒβ１)およびベータ２(ＩＬ－１２Ｒβ２)の２個のサブユニットからなる。ＩＬ－１２Ｒβ１の欠乏はＩＬ－１２シグナル経路を障害し、細菌感染およびシェーグレン症候群などの自己免疫に至り得る(Sogkas et al., Front Immunol. (2017) 8:885)。ＩＬ－１２は、癌を治療する可能性について、以前に探索されている(Sogkas et al., Front Immunol. (2017) 8:885). IL-12 has previously been explored as a potential therapy to treat cancer (Colombo and Trinchieri, Cytokine Growth Factor Rev. (2002) 13(2):155-68; Del Vecchio, supra; Lasek et al., Cancer Immunol Immunother. (2014) 63(5):419-35)。ＩＬ－１２治療に対するいくつかの臨床試験は、おそらくその狭い治療指数のために、有効性が限定的であることを示した(Lasek et al., supra)。
ＩＬ－２は、もう一つの重要なサイトカインであり、リンパ球生成、生存および恒常性に中心的役割を有する。それは、１３３アミノ酸を有し、機能に不可欠な四次構造を形成する４個の逆平行、両親媒性アルファヘリックスからなる(Smith, Science (1988) 240:1169-76; Bazan, Science (1992) 257:410-13)。
ＩＬ－２は、３個までの独立したサブユニットからなるＩＬ－２受容体(ＩＬ－２Ｒ)への結合により作用する。α(ＣＤ２５)、β(ＣＤ１２２)およびγ(ＣＤ１３２)サブユニットの結合は、三量体、高親和性ＩＬ－２Ｒをもたらす。βおよびγサブユニットからなる二量体ＩＬ－２Ｒは、中間親和性ＩＬ－２Ｒと称される。αサブユニットは、単量体低親和性ＩＬ－２Ｒを形成する。二量体中間親和性ＩＬ－２受容体は、三量体高親和性受容体より約１００倍低い親和性でＩＬ－２に結合するが、二量体および三量体ＩＬ－２Ｒバリアントのいずれも、ＩＬ－２結合によりシグナルを伝達できる(Minami et al, Annu Rev Immunol. (1993) 11:245-68)。それ故に、αサブユニットはＩＬ－２シグナル伝達に必須ではないが、ＩＬ－２Ｒへの高親和性結合に寄与し、一方、βおよびγサブユニットは、シグナル伝達に重要である(Krieg et al., Proc Natl Acad Sci. (2010) 107:11906-11)。三量体ＩＬ－２Ｒは、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞により発現される。慣習的活性化Ｔ細胞によっても一過性に誘導されるが、休止状態では、これら細胞は二量体ＩＬ－２Ｒしか発現しない。Ｔｒｅｇ細胞は、インビボで一貫して最高レベルのＣＤ２５を発現する(Fontenot et al., Nature Immunol. (2005) 6:1142-51)。
ＩＬ－２のムテインが、ＩＬ－２の副作用を減少させるために作製されている。例えば、米国特許６,９５５,８０７および９,４２８,５６７およびＥＰ２６３９２４１Ｂ１参照。高親和性三量体ＩＬ－２Ｒへの親和性が減少したペグ化ＩＬ－２も開示されている(ＵＳ２０１４０３２８７９１)。さらに、ＩＬ－２ムテインは、ＰＤ－Ｌ１抗体(例えば、ＷＯ２０１７／２２０９８９)およびＣＥＡ抗体(例えば、Klein et al., Oncoimmunology (2017) 6(3):e1277306；米国特許９,２０６,２６０)などの抗体と融合されている。ＣＥＡ抗体は、元のマウスＣＥＡ抗体ＰＲ１Ａ３から成熟された(米国特許８,６４２,７４２)。該抗体は、ＩＬ－２ムテインを腫瘍部位に向けることができるが、腫瘍部位での抗体－ＩＬ－２融合体の量は投与された用量のほんの一部であり、投与された用量の大部分はなお循環にある可能性がある。循環ＩＬ－２は、免疫臓器、例えば、リンパ節および脾臓に局在化する免疫細胞のＩＬ－２Ｒなどのいわゆる「ＰＫシンカー」に結合する。それ故に、抗体の腫瘍ターゲティング特異性をもってしても、投与され得るＩＬ－２の量はなお限定的である。
ＩＬ－１５は、ＩＬ－２に構造が類似するサイトカインである。ＩＬ－１５は、ウイルス感染後単核食細胞および他の免疫細胞により分泌される。ＩＬ－１５はＮＫおよび他の免疫細胞の増殖を誘導し、ウイルスが感染した細胞および癌細胞の死滅に関与する。ＩＬ－２と同様、ＩＬ－１５は中間親和性受容体であるＩＬ－２Ｒβ／γ複合体に結合し、ＫＤは約１nMである(Giri et al., EMBO J. (1994) 13:2822-30)。ＩＬ－１５は、はるかに高い親和性(ＫＤ約０.０５nM)でＩＬ－１５受容体(ＩＬ－１５Ｒ)αに結合する。ＩＬ－１５ＲαはＩＬ－２Ｒβ／γ複合体と結合して、ＩＬ－１５特異的、機能的高親和性受容体(αβγ)を形成できる(Minami et al., Annu Rev Immunol. (1993) 11:245-67; Giri et al., J Leukoc Biol. (1995) 5745:763-6;およびLehours et al., Eur Cytokine Netw. (2000) 11:207-15)。ＩＬ－１５Ｒαの細胞外領域は、タンパク質－タンパク質相互作用における共通モチーフであるＳｕｓｈｉドメインを含む。最初の６５アミノ酸を有するＩＬ－１５Ｒαは部分的に活性であるが、最初の８５アミノ酸を有するフラグメントは完全に機能的であることが示されている(Wei et al., J Immunol. (2001) 167(1):277-82)。
残念ながら、現在のサイトカイン薬物候補の有害作用は顕著であり、このような薬物の投与量を制限する。さらに、これら薬物候補によるＴ、ＮＫおよび他の免疫細胞の活性化は部位特異的ではない。さらに、ムテインのサイトカイン受容体に対する親和性が顕著に減少されていても、同様にサイトカインムテインに対する「ＰＫシンカー」であると考えられる。サイトカインベースのタンパク質治療剤の産生には、また数多くの困難がある。
それ故に、改善された有効性を有しながら、より腫瘍部位選択的であり、ＰＫシンカーを回避し、かつ重度副作用が少ない、改善されたサイトカインベースの癌治療剤を開発する必要性がある。
発明の概要
本発明は、ＩＬ－１２サイトカイン部分、マスキング部分(Ｍ)、二量体担体部分(Ｃ)および少なくとも１個のペプチドリンカーを含むＩＬ－１２プロドラッグまたは(「プロドラッグ」)であって、ここで、ＩＬ－１２サイトカイン部分はＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット(ｐ４０)およびＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット(ｐ３５)を含み、マスキング部分はＩＬ－１２サイトカイン部分に結合し、かつＩＬ－１２サイトカイン部分の生物学的活性を阻害し、マスキング部分は、所望によりペプチドリンカーを介して二量体担体部分の一方のポリペプチド鎖に融合し、ＩＬ－１２サイトカイン部分は、所望によりペプチドリンカーを介して担体部分の他方のポリペプチド鎖に融合するかまたはｐ４０サブユニットは、所望によりペプチドリンカーを介して担体部分の一方のポリペプチド鎖に融合し、ｐ３５サブユニットは、所望によりペプチドリンカーを介して担体部分の他方のポリペプチド鎖に融合し、そしてマスキング部分は、所望によりペプチドリンカーを介してｐ４０サブユニットまたはｐ３５サブユニットのＣ末端に融合する、プロドラッグを提供する。
具体的実施態様において、ＩＬ－１２サブユニットｐ４０は、配列番号５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。具体的実施態様において、ＩＬ－１２サブユニットｐ３５は、配列番号６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、少なくとも１個のペプチドリンカーは開裂可能ペプチドリンカーである。他の実施態様において、少なくとも１個のペプチドリンカーは非開裂可能ペプチドリンカーである。
ある実施態様において、マスキング部分は、所望により開裂可能ペプチドリンカーを介して担体部分またはＩＬ－１２ ｐ４０もしくはｐ３５サブユニットに融合する第一マスキング部分(ＭＭ１)である。具体的実施態様において、第一マスキング部分(ＭＭ１)はＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットに結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２受容体β１(ＩＬ－１２Ｒβ１)への結合を低減または阻害する。ある実施態様において、マスキング部分は、ＩＬ－１２受容体β１の細胞外ドメイン(ＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤ)またはそのフラグメント、ペプチドライプラリーのスクリーニングにより発見されたｐ４０結合ペプチドおよびｐ４０に結合する抗体の一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)またはＦａｂドメインから選択される。他の実施態様において、マスキング部分はｐ４０に結合する抗体のｓｃＦｖまたはＦａｂドメインである。具体的実施態様において、マスキング部分はｐ４０に結合するｓｃＦｖを含み、ここで、ｓｃＦｖは配列番号７～１１および１２に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、プロドラッグは、さらに、所望により開裂可能ペプチドリンカーを介して担体部分またはＩＬ－１２ ｐ４０もしくはｐ３５サブユニットに融合した、第二マスキング部分(ＭＭ２)を含む。具体的実施態様において、第二マスキング部分(ＭＭ２)はｐ３５および／またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２受容体β２(ＩＬ－１２Ｒβ２)へのＩＬ－１２の結合を低減または阻害する。ある実施態様において、第二マスキング部分は、ＩＬ－１２受容体β２の細胞外ドメイン(ＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤ)またはそのフラグメント、ｐ３５またはペプチドライプラリーのスクリーニングにより発見されたｐ４０結合ペプチドおよびｐ３５またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２への結合を低減または阻害する抗体の一本鎖ＦｖまたはＦａｂドメインから選択される。具体的実施態様において、第二マスキング部分はＩＬ－１２受容体ベータ２(ＩＬ－１２Ｒβ２)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)またはそのフラグメントを含み、ここで、ＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤまたはそのフラグメントは配列番号１７、１８または１９に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、第二マスキング部分はｐ４０に結合する抗体の一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)またはＦａｂドメインを含み、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２への結合を低減または阻害し；ここで、該ｓｃＦｖまたはＦａｂは、ＩＬ－１２抗体ＰＭＡ２０４、抗体１、抗体５０、抗体６８、抗体８０または抗体１３６に由来するのと同じ軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む。
ある実施態様において、担体は癌細胞の表面に発現する標的に結合する抗体または抗原結合部分である。具体的実施態様において、抗体または抗原結合部分は、５Ｔ４、クローディン１８.２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲタイプIII、ＧＰＣ３、ＴＲＯＰ－２、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＣＭＥＴ、ＤＬＬ－３およびＢＣＭＡから選択される抗原に結合する。
ある実施態様において、担体部分はＦｃドメインおよび抗体から選択される。具体的実施態様において、担体部分は、第一および第二ポリペプチド鎖を含むＦｃドメインを含み、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｂ、Ｆ２－ＣＬ１－ＭＭ２－ＣＬ２－ＭＭ１；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＣＬ１－ＭＭ１－ＣＬ２－ＭＭ２；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬ１およびＣＬ２は開裂可能ペプチドリンカーであり；ＭＭ１は、ｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害する第一マスキング部分であり；ＭＭ２は、ｐ３５および／またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２１への結合を低減または阻害する第二マスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
具体的実施態様において、担体部分は、第一および第二ポリペプチド鎖を含むＦｃドメインを含み、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｂ、Ｆ２－ＰＬ３－ＭＭ２－ＣＬ－ＭＭ１；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＰＬ３－ＭＭ１－ＣＬ－ＭＭ２；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１、ＰＬ２およびＰＬ３はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能ペプチドリンカーであり；ＭＭ１は、ｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害する第一マスキング部分であり；ＭＭ２は、ｐ３５および／またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２１への結合を低減または阻害する第二マスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
具体的実施態様において、担体部分は、第一および第二ポリペプチド鎖を含むＦｃドメインを含み、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＣＬ１－ＭＭ２、Ｆ２－ＰＬ２－Ｂ－ＣＬ２－ＭＭ１；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＣＬ１－ＭＭ１、Ｆ２－ＰＬ２－Ｂ－ＣＬ２－ＭＭ２；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬ１およびＣＬ２は開裂可能ペプチドリンカーであり；ＭＭ１は、ｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害する第一マスキング部分であり；ＭＭ２は、ｐ３５および／またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２１への結合を低減または阻害する第二マスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
具体的実施態様において、担体部分は、第一および第二ポリペプチド鎖を含むＦｃドメインを含み、ここで、ポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＣＬ－ＭＭ２、Ｆ２－ＰＬ２－Ｂ－ＰＬ３－ＭＭ１；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－ＭＭ１、Ｆ２－ＰＬ３－Ｂ－ＣＬ－ＭＭ２；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１、ＰＬ２およびＰＬ３はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能ペプチドリンカーであり；ＭＭ１は、ｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害する第一マスキング部分であり；ＭＭ２は、ｐ３５および／またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２１への結合を低減または阻害する第二マスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
具体的実施態様において、担体部分は、第一および第二ポリペプチド鎖を含むＦｃドメインを含み、ここで、ポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｂ、Ｆ２－ＣＬ－Ｍ；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＣＬ－Ｍ；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能ペプチドリンカーであり；Ｍは、ｐ４０サブユニットに結合し、ＩＬ－１２の生物学的活性を阻害するマスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
具体的実施態様において、担体部分は、第一および第二ポリペプチド鎖を含むＦｃドメインを含み、ここで、ポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｍ、Ｆ２－ＰＬ３－Ｂ；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＰＬ３－Ｍ；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１、ＰＬ２およびＰＬ３はペプチドリンカーであり；Ｍは、ｐ４０サブユニットに結合し、ＩＬ－１２の生物学的活性を阻害するマスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
具体的実施態様において、担体部分は、第一および第二ポリペプチド鎖を含むＦｃドメインを含み、ここで、ポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｍ、Ｆ２－ＰＬ２－Ａ－ＳＳ－Ｂ；および
ｂ. Ｆ１－ＣＬ、Ｆ２－ＰＬ１－Ａ－ＳＳ－Ｂ；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；Ｍは、ｐ４０サブユニットに結合し、ＩＬ－１２の生物学的活性を阻害するマスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットであり；そしてＳＳはジスルフィド結合である。
ある実施態様において、非開裂可能ペプチドリンカーは配列番号２９～３３から選択されるアミノ酸配列を含み；開裂可能ペプチドリンカーは配列番号３４～５４から選択されるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、プロドラッグは２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖は配列番号２０に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖は配列番号２１～２８から選択されるものに少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、プロドラッグは２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖は配列番号５５に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖は配列番号５６～５９から選択されるものに少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、プロドラッグは２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖は配列番号６０に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖は配列番号６１～６４から選択されるものに少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、プロドラッグは２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖は配列番号６５に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖は配列番号６６～７３から選択されるものに少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、プロドラッグは２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖は配列番号２０に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖は配列番号７６～７９から選択されるものに少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、本発明は、本プロドラッグおよび薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物を提供する。
ある態様において、本発明は、本プロドラッグをコードする１以上のポリヌクレオチド、本ポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび発現ベクターを含む宿主細胞(例えば、ＣＨＯ、ＮＳ０細胞および２９３Ｔ細胞などの哺乳動物宿主細胞)を提供する。ある実施態様において、ここに記載する哺乳動物宿主細胞は、ノックアウトされたｕＰＡ、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９および／またはマトリプターゼをコードする１以上の遺伝子を有する。本発明は、宿主細胞をプロドラッグの発現を可能とする条件下で培養し、単離(精製も)することを含む、本プロドラッグを製造する方法も提供する。
本発明は、処置を必要とする患者における癌もしくは感染性疾患を処置するまたは免疫系を刺激する方法であって、患者に治療有効量の本発明のプロドラッグまたは医薬組成物を投与することを含む、方法も提供する。本発明は、癌患者に本発明のプロドラッグまたは医薬組成物を第二医薬組成物と組み合わせて投与することを含む、癌を処置する方法であって、ここで、第二医薬組成物がＩＬ－１２以外のサイトカインまたはその融合分子、ＰＤ－１に対する抗体、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体、ＣＴＬＡ－４に対する抗体、ＣＤ４７に対する抗体、ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２融合分子、ＰＤ－１－ＩＬ－７融合分子、ＰＤ－１抗体－ＩＬ－１５融合分子およびＰＤ－１－ＩＬ－２１融合分子から選択される活性成分を含む、方法も提供する。患者は、例えば、ウイルス感染(例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＰＶ感染)または脳癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌および胃癌からなる群から選択される癌を有し得る。
また提供されるのは、本方法において癌もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激に使用するためのプロドラッグ；本方法における癌もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激のための医薬の製造におけるＩＬ－１２プロドラッグの使用；および１以上の投与単位の本ＩＬ－１２プロドラッグを含む製品(例えば、キット)である。
図１Ａおよび１Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット(ｐ４０)、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット(ｐ３５)、第一マスキング部分(ＭＭ１；白抜き四角)、第二マスキング部分(ＭＭ２；黒塗り四角)、担体(Ｃ)および２個の開裂可能ペプチドリンカーを含むＩＬ－１２プロドラッグの構造の例を示す。図１ＡはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合したＩＬ－１２サブユニットｐ３５を示し、一方、ＩＬ－１２サブユニットｐ４０は非開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ３５のＣ末端に融合する。第二マスキング部分は、開裂可能リンカーを介して他のＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に融合し、第一マスキング部分は、開裂可能ペプチドリンカーを介して第二マスキング部分のＣ末端に融合する。図１ＢはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合したＩＬ－１２サブユニットｐ４０を示し、一方、ＩＬ－１２サブユニットｐ３５は非開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ４０のＣ末端に融合する。第一マスキング部分は、開裂可能リンカーを介して他のＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に融合し、第二マスキング部分は、開裂可能ペプチドリンカーを介して第一マスキング部分のＣ末端に融合する。
図２Ａおよび２Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット(ｐ４０)、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット(ｐ３５)、第一マスキング部分(ＭＭ１；白抜き四角)、第二マスキング部分(ＭＭ２；黒塗り四角)、担体(Ｃ)および１個の開裂可能ペプチドリンカーを含むＩＬ－１２プロドラッグの構造の例を示す。図２ＡはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合したＩＬ－１２サブユニットｐ３５を示し、一方、ＩＬ－１２サブユニットｐ４０は非開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ３５のＣ末端に融合する。第二マスキング部分は、非開裂可能リンカーを介して他のＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に融合し、第一マスキング部分は、開裂可能ペプチドリンカーを介して第二マスキング部分のＣ末端に融合する。図２ＢはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合したＩＬ－１２サブユニットｐ４０を示し、一方、ＩＬ－１２サブユニットｐ３５は非開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ４０のＣ末端に融合する。第一マスキング部分は、非開裂可能リンカーを介して他のＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に融合し、該第二マスキング部分は、開裂可能ペプチドリンカーを介して第一マスキング部分のＣ末端に融合する。
図３Ａおよび３Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット(ｐ４０)、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット(ｐ３５)、第一マスキング部分(ＭＭ１；白抜き四角)、第二マスキング部分(ＭＭ２；黒塗り四角)、担体(Ｃ)および２個の開裂可能ペプチドリンカーを含むＩＬ－１２プロドラッグの構造の例を示す。図３ＡはＩＬ－１２サブユニットｐ３５を示し、一方Ｆｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端はＣ末端のＩＬ－１２サブユニットｐ４０に融合し、いずれも他のＦｃドメインポリペプチドを介する。第二マスキング部分は開裂可能リンカーを介してｐ３５のＣ末端に融合し、一方第一マスキング部分は開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ４０のＣ末端に融合する。図３ＢはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合するＩＬ－１２サブユニットｐ３５を示し、一方、ＩＬ－１２サブユニットｐ４０は他のＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に融合し、両者とも非開裂可能ペプチドリンカーを介する。第二マスキング部分は開裂可能リンカーを介してｐ４０のＣ末端に融合し、一方第一マスキング部分は開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ３５のＣ末端に融合する。
図４Ａおよび４Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット(ｐ４０)、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット(ｐ３５)、第一マスキング部分(ＭＭ１；白抜き四角)、第二マスキング部分(ＭＭ２；黒塗り四角)、担体(Ｃ)および１個の開裂可能ペプチドリンカーを含むＩＬ－１２プロドラッグの構造の例を示す。図４ＡはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合したＩＬ－１２サブユニットｐ３５を示し、一方、ＩＬ－１２サブユニットｐ４０は他のＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に融合し、両者とも非開裂可能ペプチドリンカーを介する。第二マスキング部分は開裂可能リンカーを介してｐ３５のＣ末端に融合し、第一マスキング部分は非開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ４０のＣ末端に融合する。図４ＢはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合するＩＬ－１２サブユニットｐ３５を示し、一方、ＩＬ－１２サブユニットｐ４０は他のＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に融合し、両者とも非開裂可能ペプチドリンカーを介する。第二マスキング部分は開裂可能リンカーを介してｐ４０のＣ末端に融合し、第一マスキング部分は非開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ３５のＣ末端に融合する。
図５Ａおよび５Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット(ｐ４０)、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット(ｐ３５)、マスキング部分(ＭＭ)および１個の開裂可能ペプチドリンカーを含むＩＬ－１２プロドラッグの構造の例を示す。図５ＡはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合したＩＬ－１２サブユニットｐ３５を示し、一方、ＩＬ－１２サブユニットｐ４０はｐ３５のＣ末端に融合し、両者とも非開裂可能ペプチドリンカーを介する。さらに、マスキング部分は開裂可能リンカーを介して第二ＦｃのＣ末端に融合する。図５ＢはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合したＩＬ－１２サブユニットｐ４０を示し、一方、ＩＬ－１２サブユニットｐ３５はｐ４０のＣ末端に融合し、両者とも非開裂可能ペプチドリンカーを介する。さらに、マスキング部分は開裂可能リンカーを介して第二ＦｃのＣ末端に融合する。
図６Ａおよび６Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット(ｐ４０)、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット(ｐ３５)、マスキング部分(ＭＭ)、担体(Ｃ)およびｎｏ 開裂可能ペプチドリンカーを含むＩＬ－１２プロドラッグの構造の例を示す。図６ＡはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合したＩＬ－１２サブユニットｐ３５を示し、一方、ＩＬ－１２サブユニットｐ４０は他のＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に融合し、両者とも非開裂可能ペプチドリンカーを介する。さらに、マスキング部分は非開裂可能リンカーを介してｐ３５のＣ末端に融合する。図６ＢはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合したＩＬ－１２サブユニットｐ４０を示し、一方、ＩＬ－１２サブユニットｐ３５はｐ４０のＣ末端に融合し、両者とも非開裂可能ペプチドリンカーを介する。さらに、該マスキング部分は非開裂可能リンカーを介して第二ＦｃのＣ末端に融合する。
図７Ａおよび７Ｂは、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット(ｐ４０)、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット(ｐ３５)、マスキング部分(ＭＭ)および担体(Ｃ)を含む３個のポリペプチド鎖を含むＩＬ－１２プロドラッグの構造の例を示す。図７ＡはＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合したＩＬ－１２サブユニットｐ３５を示し、マスキング部分は他のＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に融合し、両方とも所望により非開裂可能リンカーを介する。ｐ４０は、ジスルフィド結合を介してｐ３５サブユニットに結合する第三ポリペプチド鎖である。図７Ｂは、所望により非開裂可能ペプチドリンカーを介してＦｃドメインポリペプチドの一方のＣ末端に融合したＩＬ－１２サブユニットｐ３５を示し、マスキング部分は他のＦｃドメインポリペプチドのＣ末端に開裂可能ペプチドリンカーを介して融合する。ｐ４０は、ジスルフィド結合を介してｐ３５サブユニットに結合する第三ポリペプチド鎖である。
図８Ａおよび８ＢはＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。図８Ａは、図５Ｂおよび表２に示す配列に示す構造を有するＩＬ－１２プロドラッグＪＲ３.１０５.２、ＪＲ３.１０５.３、ＪＲ３.１０５.４およびＪＲ３.１０５.５のプロテインＡ親和性クロマトグラフィープールサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。サンプルを、還元および非還元条件下で流した。サンプルは妥当な純度であったが、一定レベルのプロドラッグの活性化型が見える。図８Ｂは、プロドラッグを活性化するためのプロテアーゼ処理前後のプロドラッグＪＲ３.１０５.５サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。データは、プロドラッグサンプルの大部分が活性化されたことを示す。
図９は、プロテアーゼ処理前後のＩＬ－１２プロドラッグサンプルの細胞ベースの活性分析を示す。プロテアーゼで処理したプロドラッグはＪＲ３.１０５.２－Ｃｌｖ、ＪＲ３.１０５.３－Ｃｌｖ、ＪＲ３.１０５.４－ＣｌｖおよびＪＲ３.１０５.５－Ｃｌｖと表示する。顕著な活性化がプロテアーゼで処理後プロドラッグＪＲ３.１０５.５で観察された。
図１０は、図９に示すとおり細胞ベースのアッセイで試験したＩＬ－１２プロドラッグサンプルのＥＣ５０値を示す。プロドラッグＪＲ３.１０５.５のＥＣ５０値は、活性化前約０.９nであり、活性化後約０.０５nMであった。
発明の詳細な記載
ここでおよび添付する特許請求の範囲で使用する単数表現は、文脈から明らかに異なることが示されない限り、複数対象を含む。ここでの値またはパラメータについての「約」の記載は、その値またはパラメータ自体に関する変動を含む(および記載する)。例えば、「約Ｘ」に関する記載は、「Ｘ」を含む。さらに、何らかの一連の数値の前の「約」の使用は、その一連の数値で記載される各々の「約」を含む。例えば、「約Ｘ、ＹまたはＺ」の記載は、「約Ｘ、約Ｙまたは約Ｚ」の記載を含む。
用語「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合するポリペプチドまたは一組の相互作用ポリペプチドをいい、抗体(例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体、二重特異的または二特異的抗体、抗イディオタイプ抗体または二機能性ハイブリッド抗体)またはその抗原結合フラグメント(例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体(ｄＡｂ)または二重特異性抗体)、一本鎖抗体およびイムノアドヘシンなどのＦｃ含有ポリペプチドを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、抗体は、あらゆる重鎖アイソタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＤ)またはサブタイプ(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４)のものであり得る。ある実施態様において、抗体は、あらゆる軽鎖アイソタイプ(例えば、カッパまたはラムダ)のものであり得る。抗体は、ヒト、非ヒト(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギまたは他の非ヒト動物から)、キメラ(例えば、非ヒト可変領域およびヒト定常領域を有する)またはヒト化(例えば、非ヒトＣＤＲおよびヒトフレームワークおよび定常領域)であり得る。ある実施態様において、抗体は誘導体化抗体である。
用語「サイトカインアゴニストポリペプチド」または「サイトカイン部分」は、野生型サイトカインまたはそのアナログをいう。野生型サイトカインのアナログは、野生型サイトカインと同じ生物学的特異性を有するが(例えば、同じ受容体に結合し、同じ標的細胞を活性化する)、アナログの活性レベルは、野生型サイトカインと異なり得る。アナログは、例えば、野生型サイトカインのムテイン(すなわち、変異ポリペプチド)であり得て、野生型サイトカインに比して少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個の変異を含み得る。
用語「サイトカインマスク」または「マスキング部分」は、サイトカインに結合し、それにより、マスクに結合されている間、サイトカインが標的細胞表面のその受容体に結合するおよび／またはその生物学的機能を発揮することを阻害する部分(例えば、ポリペプチド)をいう。サイトカインマスクの例は、サイトカインと接触するサイトカインの天然受容体の細胞外ドメインに由来するポリペプチドを含むが、これに限定されない。
用語「有効量」または「治療有効量」は、特定の障害、状態または疾患の処置、例えば、その症状の１以上の軽減、緩和、低減および／または遅延に十分な化合物または組成物の量をいう。
用語「機能的アナログ」は、対照分子と同じ生物学的特異性(例えば、同じリガンドに結合)および／または活性(例えば、標的細胞の活性化または阻害)を有する分子をいう。
２個のポリペプチド配列に関していう「融合」または「融合体」なる用語は、主鎖ペプチド結合を介する２個のポリペプチド配列の結合をいう。２個のポリペプチドは直接または１以上のアミノ酸長のペプチドリンカーを介して融合し得る。融合ポリペプチドは、間のペプチドリンカーの配列を伴うまたは伴わない２個の融合パートナーの各コード配列を含むコード配列から、組み換えテクノロジーにより製造し得る。ある実施態様において、融合は、化学的コンジュゲーションを含む。
用語「薬学的に許容される添加物」は、組成物の成分をいうために使用されるとき、添加物がヒト対象を含む対象の処置に、対象への過度の有害な副作用なくかつ活性医薬成分(ＡＰＩ)の生物学的活性に影響することなく投与するために適することを意味する。
用語「対象」は哺乳動物をいい、ヒト、ペット(例えば、イヌまたはネコ)、家畜(例えば、ウシまたはウマ)、齧歯類または霊長類を含むが、これらに限定されない。
ここで使用する「処置」または「処置する」は、有益なまたは望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。有益なまたは望ましい臨床結果は、次の疾患に起因する１以上の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患状態の軽減、疾患安定化(例えば、疾患の悪化または進行の予防または遅延)、疾患拡散(例えば、転移)の予防または遅延、疾患再発の予防または遅延、疾患の一部または完全寛解の提供、疾患処置に必要な１以上の他の投薬の用量の減少、患者のクオリティ・オブ・ライフ向上および／または生存延長の１以上を含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、処置のこれら態様の何れか１以上を意図する。
ここに記載する種々の実施態様の性質の一つ、いくつかまたは全てを組み合わせて、本発明の他の実施態様を形成し得ることは理解される。本明細書のセクション表題は構成の目的のみであり、その下の主題を限定すると解釈してはならない。
Ｉ. ＩＬ－１２プロドラッグ
本発明は、インビボで代謝されて活性ＩＬ－１２治療剤となるＩＬ－１２プロドラッグを提供する。ＩＬ－１２プロドラッグは、先のＩＬ－１２治療剤と比較して、副作用が少なく、良好なインビボＰＫプロファイル(例えば、長い半減期)および良好な標的特異性を有し、より効果的である。本ＩＬ－１２プロドラッグは、ＩＬ－１２アゴニストポリペプチド、少なくとも１個のマスキング部分(Ｍ)、担体(Ｃ)およびマスキング部分をアゴニストポリペプチドまたは担体に結合する１以上の開裂可能または非開裂可能ペプチドリンカーを含む。ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグは、ＩＬ－１２アゴニストポリペプチド、第一マスキング部分(ＭＭ１)、第二マスキング部分(ＭＭ２)、担体(Ｃ)およびマスキング部分をアゴニストポリペプチドまたは担体に結合する１以上の開裂可能または非開裂可能ペプチドリンカーを含む。
ＩＬ－１２はサブユニットｐ４０およびｐ３５を含む。サブユニットｐ４０は配列番号５に示すアミノ酸を含み、ｐ３５は配列番号６に示すアミノ酸を含む。ある実施態様において、ＩＬ－１２アナログは、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸を有するサブユニットｐ４０を含む。他の実施態様において、ＩＬ－１２アナログは、配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸を有するサブユニットｐ３５を含む。
ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグは、少なくとも１個のマスキング部分を含む。マスキング部分は、ペプチドリンカーを介してサイトカイン部分または担体部分に結合し得る。ある実施態様において、ペプチドリンカーは開裂可能ペプチドリンカーである。ある実施態様において、開裂可能ペプチドリンカーは、概して腫瘍部位に見られるプロテアーゼの基質である１以上の開裂可能部分を含む。マスクは、マスクが結合している間、サイトカイン部分の生物学的機能を阻害する。特定の実施態様において、マスクはＩＬ－１２またはそのアナログの生物学的活性を阻害する。プロドラッグは、リンカーの切断および結果としてのプロドラッグからのサイトカインマスクの放出により患者の標的部位(例えば、腫瘍部位または周囲環境)で活性化され、先にマスクされていたサイトカイン部分を露出し、サイトカイン部分が標的細胞上のその受容体に結合し、標的細胞でその生物学的機能を発揮することを可能とする。
ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグの担体は、標的部位(例えば、腫瘍表面)で抗原に結合する抗原結合部分である。ある実施態様において、本ＩＬ－１２プロドラッグは、担体により標的化される標的部位で体内で活性となるように代謝される。さらなる実施態様において、プロドラッグにおける担体は、ＩＬ－１２プロドラッグが患者の腫瘍部位に送達され、サイトカインマスクを担体またはサイトカイン部分に連結するリンカーの切断を介して局所的に(例えば、腫瘍微小環境内または近辺で)代謝され、サイトカイン部分が標的細胞上のその受容体と相互作用し、局所的に標的免疫細胞を刺激できるように、腫瘍抗原をターゲティングする抗体である。
ある実施態様において、担体はアルブミン、Ｆｃフラグメント、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)または抗体もしくはその抗原結合フラグメントから選択される。
Ａ. ＩＬ－１２プロドラッグのマスキング部分
ある実施態様において、ＩＬ－１２に対するマスキング部分(Ｍ、ＭＭ１またはＭＭ２)は、ＩＬ－１２受容体ベータ１サブユニット細胞外ドメインまたはそのフラグメント、ＩＬ－１２受容体ベータ２サブユニット細胞外ドメインまたはそのフラグメントおよびｐ４０またはｐ３５に特異性を有するｓｃＦｖまたはＦａｂ由来である。ある実施態様において、マスキング部分は、ＩＬ－１２またはそのアナログの生物学的活性を阻害する。ある実施態様において、マスキング部分はｓｃＦｖを含み、ここで、ｓｃＦｖは配列番号７～１１および１２と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－１２受容体細胞外ドメイン(ＥＣＤ)またはその機能的アナログであり、ここで、ＩＬ－１２受容体はＩＬ－１２受容体ベータ１である。ある実施態様において、マスキング部分はＩＬ－１２受容体細胞外ドメイン(ＥＣＤ)、その機能的アナログまたはそのフラグメントであり、ここで、ＩＬ－１２受容体はＩＬ－１２受容体ベータ１である。ある実施態様において、ＩＬ－１２受容体ベータ１は配列番号１３７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、プロドラッグは２個のマスキング部分ＭＭ１およびＭＭ２を有し、ここで、マスキング部分の少なくとも１個は、ｐ４０またはｐ３５に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－１２Ｒβ２への結合を低減または阻害するｓｃＦｖまたはＦａｂを含む。ある実施態様においいて、ｓｃＦｖまたはＦａｂは、ＩＬ－１２抗体ブリアキヌマブまたはウステキヌマブと同じ軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む。ある実施態様において、ｓｃＦｖまたはＦａｂは、ＰＭＡ２０４、抗体１、抗体５０、抗体６８、抗体８０および抗体１３６から選択されるＩＬ－１２抗体と同じ軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む(米国特許８,５６３,６９７参照)。
ある実施態様において、両マスキング部分(ＭＭ１およびＭＭ２)はｓｃＦｖまたはＦａｂであり、ここで、第一マスキング部分はｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害し、第二マスキング部分はｐ４０またはｐ３５に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２への結合を低減または阻害する。ある実施態様において、第一マスキング部分は、ＩＬ－１２抗体ブリアキヌマブまたはウステキヌマブと同じ軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む。ある実施態様において、第二マスキング部分は、ＰＭＡ２０４、抗体１、抗体５０、抗体６８、抗体８０および抗体１３６から選択されるＩＬ－１２抗体と同じ軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む(米国特許８,５６３,６９７参照)。
Ｂ. プロドラッグの担体部分
本プロドラッグの担体部分は、抗原結合部分または抗原結合ではない部分であり得る。担体部分は、サイトカインアゴニストポリペプチドの血清半減期などのＰＫプロファイルを改善でき、またサイトカインアゴニストポリペプチドを腫瘍部位など体内の標的部位に向け得る。
１. 非抗原結合担体部分
非抗原結合担体部分を、本プロドラッグのために使用し得る。例えば、抗体Ｆｃドメイン(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ)、ポリマー(例えば、ＰＥＧ)、アルブミン(例えば、ヒトアルブミン)またはそのフラグメントまたはナノ粒子が使用され得る。
プロドラッグの担体部分は、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)またはそのフラグメントを含み得る。ある実施態様において、アルブミンまたはアルブミンフラグメントは、ヒト血清アルブミンまたはそのフラグメントと約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上、約９９.５％以上または約９９.８％以上同一である。
ある実施態様において、担体部分は、約１０またはそれ以上、２０またはそれ以上、３０またはそれ以上、４０またはそれ以上、５０またはそれ以上、６０またはそれ以上、７０またはそれ以上、８０またはそれ以上、９０またはそれ以上、１００またはそれ以上、１２０またはそれ以上、１４０またはそれ以上、１６０またはそれ以上、１８０またはそれ以上、２００またはそれ以上、２５０またはそれ以上、３００またはそれ以上、３５０またはそれ以上、４００またはそれ以上、４５０またはそれ以上、５００またはそれ以上または５５０またはそれ以上のアミノ酸長であるアルブミンフラグメント(例えば、ヒト血清アルブミンフラグメント)を含む。ある実施態様において、アルブミンフラグメントは、約１０アミノ酸～約５８４アミノ酸長(例えば約１０～約２０、約２０～約４０、約４０～約８０、約８０～約１６０、約１６０～約２５０、約２５０～約３５０、約３５０～約４５０または約４５０～約５５０アミノ酸長)である。ある実施態様において、アルブミンフラグメントは、Sudlow IドメインまたはそのフラグメントまたはSudlow IIドメインまたはフラグメントを含む。
ある実施態様において、担体は抗体Ｆｃフラグメントである。Ｆｃは、２個のＮ末端および２個のＣ末端を有する二量体分子である。ある実施態様において、サイトカイン部分は、二量体Ｆｃフラグメントの一方のＦｃポリペプチドに融合でき、マスキング部分は第二のＦｃポリペプチドに融合できる。好ましい実施態様において、サイトカイン部分およびマスキング部分両者は、二量体Ｆｃフラグメントの各ポリペプチド鎖のＣ末端に融合される。ある実施態様において、サイトカイン部分およびマスキング部分両方は、二量体Ｆｃフラグメントの各ポリペプチド鎖のＮ末端に融合される。いずれの場合も、マスキング部分の少なくとも１個は、Ｆｃポリペプチドに直接的にまたは開裂可能ペプチドリンカーを介して間接的に融合される。
ある実施態様において、担体部分は第一および第二ポリペプチド鎖(すなわち、２個の異なる重鎖)を含むＦｃドメインであり、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｂ、Ｆ２－ＣＬ１－ＭＭ２－ＣＬ２－ＭＭ１(図１Ａ)；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＣＬ１－ＭＭ１－ＣＬ２－ＭＭ２(図１Ｂ)；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬ１およびＣＬ２は開裂可能ペプチドリンカーであり；ＭＭ１は、ｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害する第一マスキング部分であり；ＭＭ２は、ｐ３５および／またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２１への結合を低減または阻害する第二マスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
ある実施態様において、担体部分は第一および第二ポリペプチド鎖(すなわち、２個の異なる重鎖)を含むＦｃドメインであり、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｂ、Ｆ２－ＰＬ３－ＭＭ２－ＣＬ－ＭＭ１(図２Ａ)；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＰＬ３－ＭＭ１－ＣＬ－ＭＭ２(図２Ｂ)；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１、ＰＬ２およびＰＬ３はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能ペプチドリンカーであり；ＭＭ１は、ｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害する第一マスキング部分であり；ＭＭ２は、ｐ３５および／またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２１への結合を低減または阻害する第二マスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
ある実施態様において、担体部分は第一および第二ポリペプチド鎖(すなわち、２個の異なる重鎖)を含むＦｃドメインであり、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＣＬ１－ＭＭ２、Ｆ２－ＰＬ２－Ｂ－ＣＬ２－ＭＭ１(図３Ａ)；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＣＬ１－ＭＭ１、Ｆ２－ＰＬ２－Ｂ－ＣＬ２－ＭＭ２(図３Ｂ)；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬ１およびＣＬ２は開裂可能ペプチドリンカーであり；ＭＭ１は、ｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害する第一マスキング部分であり；ＭＭ２は、ｐ３５および／またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２１への結合を低減または阻害する第二マスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
ある実施態様において、担体部分は第一および第二ポリペプチド鎖(すなわち、２個の異なる重鎖)を含むＦｃドメインであり、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＣＬ－ＭＭ２、Ｆ２－ＰＬ２－Ｂ－ＰＬ３－ＭＭ１(図４Ａ)；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－ＭＭ１、Ｆ２－ＰＬ３－Ｂ－ＣＬ－ＭＭ２(図４Ｂ)；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１、ＰＬ２およびＰＬ３はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能ペプチドリンカーであり；ＭＭ１は、ｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害する第一マスキング部分であり；ＭＭ２は、ｐ３５および／またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２１への結合を低減または阻害する第二マスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
ある実施態様において、担体部分は第一および第二ポリペプチド鎖(すなわち、２個の異なる重鎖)を含むＦｃドメインであり、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｂ、Ｆ２－ＣＬ－Ｍ(図５Ａ)；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＣＬ－Ｍ(図５Ｂ)；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；ＣＬは開裂可能ペプチドリンカーであり；Ｍはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害するマスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
ある実施態様において、担体部分は第一および第二ポリペプチド鎖(すなわち、２個の異なる重鎖)を含むＦｃドメインであり、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－Ｍ、Ｆ２－ＰＬ３－Ｂ(図６Ａ)；および
ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－Ａ、Ｆ２－ＰＬ３－Ｍ(図６Ｂ)；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１、ＰＬ２およびＰＬ３はペプチドリンカーであり；Ｍはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害するマスキング部分であり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
ある実施態様において、担体部分は第一および第二ポリペプチド鎖(すなわち、２個の異なる重鎖)を含むＦｃドメインであり、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖は、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む。
ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｍ、Ｆ２－ＰＬ２－Ａ－ＳＳ－Ｂ(図７Ａ)；および
ｂ. Ｆ１－ＣＬ－Ｍ、Ｆ２－ＰＬ１－Ａ－ＳＳ－Ｂ(図７Ｂ)；
ここで、Ｆ１およびＦ２はヘテロ二量体を形成する担体部分(例えば、Ｆｃドメイン)のサブユニットであり；ＰＬ１およびＰＬ２はペプチドリンカーであり；Ｍはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ１への結合を低減または阻害するマスキング部分であり；ＣＬは開裂可能ペプチドリンカーであり；ＡはＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢはＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットであり；そしてＳＳはジスルフィド結合である。
２. 抗原結合担体部分
担体部分は、抗体またはその抗原結合フラグメントまたはイムノアドヘシンであり得る。ある実施態様において、抗原結合部分は、２個の重鎖および２個の軽鎖を有する完全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、ナノボディまたは一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある実施態様において、抗原結合部分は二特異的抗原結合部分であり、２個の異なる抗原または同じ抗原の２個の異なるエピトープに結合し得る。抗原結合部分は、サイトカインアゴニストポリペプチドにさらなるそしておそらく相乗的治療有効性を提供し得る。ある実施態様において、抗原結合部分は完全長抗体重鎖または完全長抗体軽鎖を含む。ある実施態様において、抗原結合部分は抗体重鎖フラグメントまたは抗体軽鎖フラグメントを含む。
ある実施態様において、サイトカイン部分は抗体の重鎖の一方のＣ末端に融合し、サイトカインのマスクはペプチドリンカー(所望により開裂可能リンカー)を介して抗体の他方の重鎖のＣ末端に融合し、ここで、２個の重鎖は、所望により２個の異なる重鎖の特異的対合を可能とする変異を含む。
Ｆｃ融合ポリペプチドのヘテロ二量体または二特異的抗体を形成する戦略は周知である(例えば、Spies et al., Mol Imm. (2015) 67(2)(A):95-106参照)。例えば、プロドラッグの２個の重鎖ポリペプチドは、「ノブ・イントゥ・ホール」変異を介して安定なヘテロ二量体を形成し得る。「ノブ・イントゥ・ホール」変異は抗体重鎖のヘテロ二量体の形成を促進するために形成され、二特異的抗体の形成に一般に使用される(例えば、米国特許８,６４２,７４５参照)。例えば、抗体のＦｃドメインは、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｗ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異を含み得る。ＣＨ３ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋も、例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異および「ホール鎖」のＣＨ３ドメインにＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ変異を導入することにより、使用できる(例えば、Merchant et al., Nature Biotech. (1998) 16:677-81参照)。他の実施態様において、抗体部分は、２個のＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異および他方のＣＨ３ドメインにＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異を含み得る。ある実施態様において、抗体部分は、２個のＣＨ３ドメインの一方にＹ３４９Ｃおよび／またはＴ３６６Ｗ変異および他方のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ(またはＥ３５６Ｃ)、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａおよび／またはＹ４０７Ｖ変異を含み得て、ＣＨ３ドメインの一方におけるＹ３４９Ｃ変異および他方のＣＨ３ドメインにおけるさらなるＥ３５６ＣまたはＳ３５４Ｃ変異を有し、鎖間ジスルフィド架橋を形成する(ナンバリングは常にKabatのＥＵインデックスに従う；Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されているような他のノブ・イントゥ・ホールテクノロジーを、これとは別にまたはこれに加えて使用し得る。また、抗体部分のノブ・イントゥ・ホール変異の他の例は、「ノブ鎖」にＣＨ３ドメインにＲ４０９Ｄ／Ｋ３７０Ｅ変異および「ホール鎖」にＣＨ３ドメインにＤ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ変異を持つものである(ＥＵナンバリング)。
ある実施態様において、プロドラッグにおける抗体部分は、そのＦｃドメインにＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(「ＬＡＬＡ」)変異を含む。ＬＡＬＡ変異は、補体結合および固定ならびにＦｃγ依存的ＡＤＣＣを排除する(例えば、Hezareh et al. J. Virol. (2001) 75(24):12161-8参照)。さらなる実施態様において、ＬＡＬＡ変異は、ノブ・イントゥ・ホール変異に加えて抗体部分に存在する。
ある実施態様において、抗体部分は、ＦｃドメインにＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ(「ＹＴＥ」)変異を含む。ＹＴＥ変異は、血清半減期、組織分布およびＩｇＧ１活性の同時調節を可能とする(Dall'Acqua et al., J Biol Chem. (2006) 281: 23514-24; and Robbie et al., Antimicrob Agents Chemother. (2013) 57(12):6147-53参照)。さらなる実施態様において、ＹＴＥ変異は、ノブ・イントゥ・ホール変異に加えて抗体部分に存在する。具体的実施態様において、抗体部分は、ＹＴＥ、ＬＡＬＡおよびノブ・イントゥ・ホール変異またはそれらの何れかの組み合わせを有する。
ある実施態様において、抗体はＰＤ－Ｌ１に結合する。ある実施態様において、抗体はＣＥＡに結合する。ある実施態様において、抗体は腫瘍細胞の抗原、例えば、５Ｔ４、ＦＡＰ、Ｔｒｏｐ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＨＥＲ－２、ＥＧＦＲ、クローディン１８.２、ＤＬＬ－３、ＧＣＰ３およびＣＥＡに結合する。抗体は抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性を有しても有していなくてもよい。抗体をさらに細胞毒性薬物ともコンジュゲートし得る。ある実施態様において、抗体、例えば、ＰＤ－１抗体、ＬＡＧ３抗体、ＴＩＧＩＴ抗体、ＴＧＦ－ベータ抗体およびＣＴＬＡ４抗体は免疫細胞表面の標的に結合し、該免疫細胞を活性化し、その抗癌活性を増強する能力を有する。
抗原結合部分は、癌細胞などの細胞の表面上の抗原に結合できる。ある実施態様において、抗原結合部分は二特異的抗原結合部分であり、２個の異なる抗原または同じ抗原の２個の異なるエピトープに結合できる。ある実施態様において、抗原結合部分はグアニル酸シクラーゼＣ(ＧＣＣ)、炭水化物抗原１９－９(ＣＡ１９－９)、糖タンパク質Ａ３３(ｇｐＡ３３)、ムチン１(ＭＵＣ１)、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、インシュリン様増殖因子１受容体(ＩＧＦ１－Ｒ)、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２(ＨＥＲ２)、ヒト上皮細胞増殖因子受容体３(ＨＥＲ３)、デルタ様タンパク質３(ＤＬＬ３)、デルタ様タンパク質４(ＤＬＬ４)、上皮細胞増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)、グリピカン－３(ＧＰＣ３)、ｃ－ＭＥＴ、血管内皮細胞増殖因子受容体１(ＶＥＧＦＲ１)、血管内皮細胞増殖因子受容体２(ＶＥＧＦＲ２)、ネクチン－４、Ｌｉｖ－１、糖タンパク質ＮＭＢ(ＧＰＮＭＢ)、前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)、Ｔｒｏｐ－２、炭酸脱水酵素IX(ＣＡ９)、エンドセリンＢ受容体(ＥＴＢＲ)、トムゼン・フリーデンライヒ抗原(ＴＦ)、ナトリウム依存的リン酸輸送タンパク質２Ｂ(ＮａＰｉ２ｂ)、前立腺の６膜貫通上皮抗原１(ＳＴＥＡＰ１)、葉酸受容体アルファ(ＦＲ－α)、ＳＬＩＴおよびＮＴＲＫ様タンパク質６(ＳＬＩＴＲＫ６)、炭酸脱水酵素VI(ＣＡ６)、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー３(ＥＮＰＰ３)、メソテリン、栄養芽細胞糖タンパク質(ＴＰＢＧ)、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ３５２、プログラム死リガンド１(ＰＤ－Ｌ１)、クローディン１８.２、クローディン６、ＰＳＭＡまたはＦＡＰ－アルファに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分はＤＬＬ３の上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)様ドメインに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分はＤＬＬ３のデルタ／セラート／Ｌａｇ２(ＤＳＬ)様ドメインに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＧＰＣ３の３７４番目のアミノ酸後に位置するエピトープに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＧＰＣ３のヘパリン硫酸グリカンに結合する。ある実施態様において、抗原結合部分はクローディン１８.２に結合し、クローディン１８.１に結合しない。ある実施態様において、抗原結合部分は、クローディン１８.２より少なくとも１０倍弱い結合親和性でクローディン１８.１に結合する。
抗原結合部分は、免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージなどの細胞表面の抗原に結合できる。ある実施態様において、抗原結合部分は二特異的抗原結合部分であり、２個の異なる抗原または同じ抗原の２個の異なるエピトープに結合できる。ある実施態様において、抗原結合部分は、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４またはＴＧＦ－ベータに結合する。
ある実施態様において、抗原結合部分(担体部分)は、ＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１とそのリガンド(ＰＤ－Ｌ１)の間の相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激することが当分野で知られる抗体またはそのフラグメントを含む。ある実施態様において、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－１に特異的に結合する。例えば、ＰＤ－１を標的とし、本発明において有用であり得る抗体は、ニボルマブ(BMS-936558、Bristol-Myers Squibb)、ペムブロリズマブ(ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５またはＭＫ－３４７５、Merck)、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１(ShangHai JunShi)、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２(Tesaro, Inc.)、ピディリズマブ(抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Medivation)、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７(BeiGene)および／または抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０(ShangHai HengRui)、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０(Regeneron)、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６(Bristol-Myers Squibb)および／またはヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１(Novartis)を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ＰＤ－１抗体は、クローン：ＲＭＰ１－１４(ラットＩｇＧ)－BioXcell cat# BP0146からである。他の適当な抗ＰＤ－１抗体は、米国特許８,００８,４４９に開示のものを含む。ある実施態様において、抗体またはその抗原結合部分はＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－１とのその相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激する当分野で知られるあらゆる抗体が、ここに開示する組み合わせ処置方法における使用に適する。例として、ＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体は、ＢＭＳ－９３６５５９(Bristol-Myers Squibb)およびＭＰＤＬ３２８０Ａ(Genetech；現在ヒトで治験中)を含む。他の適当なＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体は、米国特許７,９４３,７４３に開示される。ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を妨害し、抗腫瘍免疫応答を刺激するあらゆる抗体がここに開示する組み合わせ処置方法に適することは、当業者により理解される。
ある実施態様において、担体は、ＡＳＫＢ１２９６、アベルマブ、アテゾリズマブおよびデュルバルマブから選択されるヒトＰＤ－Ｌ１に対する抗体である。
抗原結合部分の例は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化型)、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化型)、抗ＦＡＰ－アルファ抗体シブロツズマブ(ＢＩＢＨ１)およびそのフラグメントを含む。ある実施態様において、抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブまたはパニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化型)、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化型)、シブロツズマブ(ＢＩＢＨ１)またはそのフラグメントに少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する。ある実施態様において、抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化型)、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化型)、シブロツズマブ(ＢＩＢＨ１)またはそのフラグメントの抗体重鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する抗体重鎖を有する。ある実施態様において、抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３(またはそのヒト化型)、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６(またはそのヒト化型)、シブロツズマブ(ＢＩＢＨ１)またはそのフラグメントの抗体軽鎖と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する抗体軽鎖を有する。
ある実施態様において、抗原結合部分は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＧＣ３３、抗ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６またはシブロツズマブ(ＢＩＢＨ１)の６個の相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。いくつかのＣＤＲ線引きが当分野で知られ、本明細書に包含させる。当業者は、重鎖または軽鎖可変領域の配列に基づき、ある線引きでのＣＤＲを容易に決定できる。「Kabat」相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列可変性に基づき、最も一般的に使用される(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。「Chothia」ＣＤＲは、構造ループの位置を参照する(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. (1987) 196:901-917)。「ＡｂＭ」ＣＤＲは、Kabat CDRとChothia構造ループの間の妥協点を表し、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアで使用される。「Contact」ＣＤＲは、入手可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらＣＤＲの各々からの残基を、一般的抗体ナンバリングスキームを参照して、下表１に示す。ここで特に断らない限り、抗体のアミノ酸番号は、ＣＤＲ線引きをKabat、Chothia、ＡｂＭまたはContactスキームを参照して行ったときを含み、Kabat et al., supraに記載されるKabatナンバリングスキームを参照する。このナンバリングシステムを使用して、実際の直線アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク領域(ＦＲ)またはＣＤＲの短縮または挿入に対応して、少ないまたは付加的アミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２後に一アミノ酸インサート(Kabatにより残基５２ａ)および重鎖ＦＲ残基８２後挿入残基(例えばKabatにより残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど)を含み得る。残基のKabatナンバリングは、ある抗体について「標準」Kabat番号付与配列を有する抗体の配列の相同性領域でのアラインメントにより決定され得る。
Figure 2022549344000002
ある実施態様において、ＣＤＲは「拡張ＣＤＲ」であり、異なるスキームで開始または終結する領域を含む。例えば、拡張ＣＤＲは次のとおりであり得る：Ｌ２４－Ｌ３６、Ｌ２６－Ｌ３４またはＬ２６－Ｌ３６(ＶＬ－ＣＤＲ１)；Ｌ４６－Ｌ５２、Ｌ４６－Ｌ５６またはＬ５０－Ｌ５５(ＶＬ－ＣＤＲ２)；Ｌ９１－Ｌ９７(ＶＬ－ＣＤＲ３)；Ｈ４７－Ｈ５５、Ｈ４７－Ｈ６５、Ｈ５０－Ｈ５５、Ｈ５３－Ｈ５８またはＨ５３－Ｈ６５(ＶＨ－ＣＤＲ２)；および／またはＨ９３－Ｈ１０２(ＶＨ－ＣＤＲ３)。
ある実施態様において、本発明のＩＬ－１２プロドラッグは抗原結合部分を含む担体を含み、ここで、抗原結合部分はＴｒｏｐ－２に結合する。ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグを、固形腫瘍を有する患者の処置に使用する。ある実施態様において、プロドラッグを、トリプルネガティブ乳癌、尿路上皮癌、小細胞肺癌、膵臓癌、肝門部胆管癌、子宮頸癌および胃癌の処置に使用する。
ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグは抗原結合部分を含む担体を含み、ここで、抗原結合部分は５Ｔ４に結合する。ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグを、固形腫瘍を有する患者の処置に使用する。ある実施態様において、プロドラッグを、トリプルネガティブ乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌および胃癌の処置に使用する。
ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグは抗原結合部分を含む担体を含み、ここで、該抗原結合部分はクローディン１８.２に結合する。ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグを、膵臓癌および胃癌を有する患者の処置に使用する。
ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグは抗原結合部分を含む担体を含み、ここで、該抗原結合部分はＥＧＦＲタイプIIIに結合する。ある実施態様において、該ＩＬ－１２プロドラッグを、神経膠芽腫および結腸癌を有する患者の処置に使用する。
ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグを、ＰＤ－１抗体またはＰＤ－１抗体そのフラグメントなどの免疫チェックポイント遮断と組み合わせて使用する。
Ｃ. プロドラッグのリンカー成分
ＩＬ－１２アゴニストポリペプチドを、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに担体部分に融合し得る。ペプチドリンカーは非開裂可能であり得る。ある実施態様において、ペプチドリンカーは配列番号２９～３３から選択される。
ＩＬ－１２マスクは、非開裂可能リンカーまたは開裂可能リンカーを介して、サイトカイン部分、担体または他のマスクに融合され得る。開裂可能リンカーは、１以上の(例えば、２個または３個の)開裂可能部分(ＣＭ)を含み得る。各ＣＭは、レグマイン、プラスミン、ＴＭＰＲＳＳ－３／４、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＴ１－ＭＭＰ、カテプシン、カスパーゼ、ヒト好中球エラスターゼ、ベータ－セクレターゼ、ｕＰＡおよびＰＳＡから選択される酵素またはプロテアーゼの基質であり得る。開裂可能リンカーの例は、配列番号３４～５４から選択されるアミノ酸配列を含むものを含むが、これらに限定されない。
Ｄ. さらなるエフェクターポリペプチドを有するＩＬ－１２プロドラッグ
１. ＩＬ－２アゴニストポリペプチド
ある実施態様において、本発明のＩＬ－１２プロドラッグは、さらに他のサイトカインまたはエフェクター部分を含む。ある実施態様において、第二サイトカイン部分は、ＩＬ－２アゴニストポリペプチドを含む。
ある実施態様において、プロドラッグにおけるＩＬ－２アゴニストポリペプチドは、配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＩＬ－２アゴニストポリペプチドは、高親和性三量体ＩＬ－２受容体に対する親和性を顕著に低減させる変異を含む。高親和性三量体ＩＬ－２受容体はアルファ、ベータおよびガンマＩＬ－２受容体サブユニットを含む。所望により、ＩＬ－２アゴニストポリペプチドは、さらに、ＩＬ－２受容体ベータおよびガンマサブユニットを含む中間親和性ＩＬ－２受容体に対する結合親和性を顕著に低減させる変異を含む。ある実施態様において、ＩＬ－２アゴニストポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ－２のナンバリングに従い、残基Ｒ３８、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｌ７２およびＡ７３に１以上の変異を含む。ある実施態様において、ＩＬ－２アゴニストポリペプチドさらには、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ－２のナンバリングに従い、残基Ｄ２０、Ｎ８８、Ｎ９０およびＱ１２６に１以上の変異を含む。残基Ｔ３および／またはＣ１２５のさらなる変異は、所望により含まれる。
ある実施態様において、ＩＬ－２プロドラッグのＩＬ－２アゴニストポリペプチドは残基Ｆ４２Ｎ／Ｆ４４Ｔ、Ａ７３Ｔおよび／またはＮ９０Ｔに変異を含み、ここで、変異は配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ－２のナンバリングに従い記載する。
ある実施態様において、ＩＬ－２プロドラッグのＩＬ－２アゴニストポリペプチドは、次の組み合わせ
Ｔ３Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｉ、Ｙ４５Ｎ、Ｅ６２Ｌ、Ｅ６８Ｖ、Ｃ１２５Ｓ；
Ｔ３Ａ、Ｒ３８Ｋ、Ｆ４２Ｋ、Ｙ４５Ｒ、Ｅ６２Ｌ、Ｅ６８Ｖ、Ｃ１２５Ｓ；
Ｔ３Ａ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｃ１２５Ｓ；
Ｔ３Ａ、Ｒ３８Ｓ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｃ１２５Ｓ；または
Ｒ３８Ｓ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａ；および
の一つから選択される変異を含み、ここで、該変異は配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ－２のナンバリングに従い記載する。
ある実施態様において、ＩＬ－２アゴニストポリペプチドは、野生型ＩＬ－２と比較して、アルファ、ベータおよびガンマサブユニットを含む高親和性三量体ＩＬ－２受容体への結合の親和性が少なくとも３０倍低く；ここで、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ－２のナンバリングに従い、Ｒ３８、Ｆ４２、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｅ６８およびＬ７２に１以上の変異を含み、ここで、変異は配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ－２のナンバリングに従い記載する。ある実施態様において、ＩＬ－２のアゴニストポリペプチドは、さらに、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ－２のナンバリングに従い、残基Ａ３、Ｄ２０、Ｎ８８、Ｃ１２５および／またはＱ１２６に１以上の変異を含む。
ある実施態様において、ＩＬ－２アゴニストペプチドは配列番号７４および７５から選択されるアミノ酸配列を含む。
２. ＩＬ－１５アゴニストポリペプチド
ある実施態様において、本発明のＩＬ－１２プロドラッグは、さらに他のサイトカインまたはエフェクター部分を含む。ある実施態様において、第二サイトカイン部分はＩＬ－１５アゴニストポリペプチドを含む。ある実施態様において、ＩＬ－１５アゴニストポリペプチドは、所望によりＩＬ－１５受容体アルファサブユニットのＳｕｓｈｉドメインを含み得る。
ある実施態様において、ＩＬ－１５部分は、ヒトＩＬ－１５のＮ１、Ｎ４、Ｉ６、Ｓ７、Ｄ８、Ｋ１０、Ｋ１１、Ｅ４６、Ｄ６１、Ｔ６２、Ｅ６４、Ｎ６５、Ｉ６８、Ｌ６９、Ｎ７２、Ｖ６３、Ｌ６６、Ｉ６７、Ａ７０、Ｎ７１、Ｑ１０８、Ｎ１１２から選択される位置に少なくとも１、２、３、４または５変異含むＩＬ－１５ムテインである。ＩＬ－１５ムテインの例は、Ｎ１Ａ、Ｎ１Ｄ、Ｎ４Ａ、Ｎ４Ｄ、Ｉ６Ｔ、Ｓ７Ａ、Ｄ８Ａ、ＤＡＴ、Ｄ８Ｅ、Ｄ８Ｎ、Ｋ１０Ａ、Ｋ１０Ｄ、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｄ、Ｄ６１Ａ、Ｄ６１Ｎ、Ｔ６２Ｌ、Ｔ６２Ａ、Ｅ６４Ａ、Ｅ６４Ｌ、Ｅ６４Ｋ、Ｅ６４Ｑ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｌ、Ｎ６５Ｄ、Ｌ６６Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｉ６７Ｄ、Ｉ６７Ｅ、Ｉ６８Ｓ、Ｉ６８Ｅ、Ｌ６９Ｓ、Ｌ６９Ｅ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｄ、Ｖ６３Ｅ、Ｖ６３Ｄ、Ｌ６６Ｅ、Ｌ６６Ｄ、Ｉ６７Ｅ、Ｉ６７Ｄ、Ｑ１０８ＥおよびＮ１１２Ａから選択される１以上の変異を有するものである。ある実施態様において、ＩＬ－１５部分は、Ｅ４６、Ｖ４９、Ｌ４５、Ｓ５１およびＬ５２から選択される位置に変異を含む。特に断らない限り、ここに記載するＩＬ－１５およびＩＬ－１５ムテインの全残基番号は、配列番号４のナンバリングに従う。他の実施態様において、ＩＬ－１５部分は、配列番号４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
具体的実施態様において、ＩＬ－１５ムテインは、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ１Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ、Ｎ４Ｄ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ８Ｎ／Ｄ６１Ｎ、Ｄ８Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｄ３０Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅ、Ｎ１Ｄ／Ｎ４Ｄ／Ｄ８Ｎ、Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｎ６５Ｄ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ、Ｎ１Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８ＥおよびＮ４Ｄ／Ｄ６１Ｎ／Ｅ６４Ｑ／Ｑ１０８Ｅから選択される変異を含む。
ある実施態様において、本ＩＬ－１５プロドラッグは、ＩＬ－１５Ｒα Ｓｕｓｈｉドメインを含む。Ｓｕｓｈｉドメインは、担体に直接または所望によりリンカー(例えば、非開裂可能または開裂可能ペプチドリンカー)を介してＩＬ－１５サイトカイン部分に融合し得る。マスキング部分は、開裂可能または非開裂可能ペプチドリンカーを介してＳｕｓｈｉドメインまたは担体に融合し得る。特定の実施態様において、Ｓｕｓｈｉドメインは担体に融合し、サイトカイン部分はペプチドリンカーを介してＳｕｓｈｉドメインに融合する。
３. ＩＬ－２／ＩＬ－１５マスキング部分
ある実施態様において、ここに開示するさらなるサイトカイン部分のマスキング部分は、ＩＬ－２受容体ベータサブユニットの可溶性細胞外ドメイン、ＩＬ－２受容体ベータおよびガンマサブユニット融合体タンパク質もしくは複合体の可溶性細胞外ドメインのペプチド、単量体または二量体またはＩＬ－２またはＩＬ－１５に結合し、ＩＬ－２、ＩＬ－２ムテインまたはＩＬ－１５の二量体ＩＬ－２受容体への結合を妨害する抗体を含む。ある実施態様において、ＩＬ－２マスキング部分は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５の生物学的活性も阻害または低減する。ある実施態様において、ＩＬ－２マスキング部分は、スクリーニングを介してペプチドライプラリーから同定されたペプチドである。ある実施態様において、ＩＬ－２マスキング部分はＩＬ－２またはＩＬ－２変異体のＩＬ－２受容体への結合を遮断する抗体またはそのフラグメントである。ある実施態様において、ＩＬ－２マスキング部分は、ハイブリドーマクローン４Ｅ１２Ｂ２Ｄ１０、４Ｅ１２Ｂ２および４Ｅ１２から選択される抗体と同じＣＤＲドメイン配列を有するｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは一本鎖Ｆａｂである。
II. ＩＬ－１２プロドラッグの例
ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグは抗体またはＦｃドメインおよびＩＬ－１２アゴニストポリペプチドを含み、ここで、ＩＬ－１２アゴニストポリペプチドは、所望によりペプチドリンカーを介して抗体重鎖またはＦｃドメインのＦｃポリペプチド鎖の一方のＣ末端に融合し；ここで、該ＩＬ－１２マスキング部分は、開裂可能ペプチドリンカーを介して、第二重鎖またはＦｃポリペプチド鎖のＣ末端に融合する。プロドラッグの例は図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａおよび７Ｂに示される。全てのプロドラッグは、サイトカイン成分ｐ３５およびｐ４０ならびにＦｃドメインのＣ末端に位置するマスキング部分を有する。ある実施態様において、サイトカイン成分ｐ３５およびｐ４０およびマスキング部分はＦｃドメインのＮ末端に位置する。さらに、プロドラッグは、ＩＬ－１２およびＩＬ－２アゴニストポリペプチド両方またはＩＬ－１２およびＩＬ－１５アゴニストポリペプチド両方を含み得る。
例として、ＩＬ－１２プロドラッグは２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖は配列番号２０に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖は配列番号２１～２８から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
他の例として、ＩＬ－１２プロドラッグは２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖は配列番号５５に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして該第二ポリペプチド鎖は配列番号５６～５９から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
他の例として、ＩＬ－１２プロドラッグは２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖は配列番号６０に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖は配列番号６１～６４から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
他の例として、ＩＬ－１２プロドラッグは２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖は配列番号６５に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖は配列番号６６～７３から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
他の例として、ＩＬ－１２プロドラッグは２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖は配列番号２０に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖は配列番号７６～７９から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
第二サイトカインまたはエフェクター部分をさらに含むプロドラッグにおけるある実施態様において、第二サイトカイン部分は配列番号７４および７５から選択されるアミノ酸配列を有するもののようなＩＬ－２アゴニストポリペプチドである。例として、図１Ａ～７Ｂに示すとおり、第二サイトカインはＦｃドメインポリペプチドの一方のＮ末端に融合でき、一方ＩＬ－１２アゴニストポリペプチドおよびマスキング部分はＦｃドメインのＣ末端に融合する。ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグは、さらに第二サイトカインに結合し、生物学的活性を阻害する１以上のマスキング部分を含み得る。
III. 医薬組成物
プロドラッグの医薬組成物は、望ましい純度を有するここに開示するプロドラッグまたは抗体融合分子または抗体融合分子薬物コンジュゲートと、１以上の任意の薬学的に許容される担体の混合により、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製される(Osol, A. Ed. Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)参照)。薬学的に許容される担体は、一般に用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属錯体(例えばＺｎ－タンパク質錯体)；および／またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。
緩衝液は、特に安定性がｐＨ依存的であるとき、治療有効性を最適にする範囲にｐＨを制御するために使用する。緩衝液は、好ましくは約５０mM～約２５０mMの範囲の濃度で存在する。本発明で使用するのに適する緩衝剤は、有機および無機両方の酸およびその塩、例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩を含む。さらに、緩衝液はヒスチジンおよびＴｒｉｓなどのトリメチルアミン塩を含み得る。
防腐剤は微生物増殖を遅延するために加えられ、概して０.２％～１.０％(ｗ／ｖ)の範囲で存在する。本発明で使用するのに適する防腐剤は、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムハライド(例えば、クロライド、ブロマイド、アイオダイド)、ベンゼトニウムクロライド；チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノールおよびｍ－クレゾールを含む。
等張化剤は、「安定化剤」として知られることもあり、組成物の液体の張性を調節または維持するために存在する。タンパク質および抗体などの大型荷電生体分子と使用するとき、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより分子間および分子内相互作用の可能性を低減することができるため、しばしば「安定化剤」と称される。等張化剤は、他の成分の相対量を考慮して、０.１％～２５重量％またはそれ以上、好ましくは１％～５重量％の間の両で存在し得る。好ましい等張化剤は、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの多価糖アルコール、好ましくは三価または高級糖アルコールを含む。
非イオン性界面活性剤またはデタージェント(「湿潤剤としても知られる」)は、治療剤の可溶化を助け、治療タンパク質を撹拌誘導凝集から保護するために存在し、また、製剤が活性治療タンパク質または抗体の変性なく剪断表面応力に曝されることを可能とする。非イオン性界面活性剤は、約０.０５mg／ml～約１.０mg／ml、好ましくは約０.０７mg／ml～約０.２mg／mlの範囲で存在する。
適当な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート(２０、４０、６０、６５、８０など)、ポリオキサマー(１８４、１８８など)、プルロニック(登録商標)ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ(登録商標)、ポリオキシエチレンソルビタン物エーテル(ＴＷＥＥＮ(登録商標)－２０、ＴＷＥＥＮ(登録商標)－８０など)、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含む。使用できるイオン性界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルソジウムスルホスクシネートおよびジオクチルナトリウムスルホネートを含む。カチオン性界面活性剤は、塩化ベンザルコニウムまたはベンゼトニウムクロライドを含む。
医薬担体、添加物または希釈剤の選択は、意図する投与経路および標準薬務に関連して選択し得る。医薬組成物は、担体、添加物または希釈剤として － またはそれに加えて － あらゆる適当な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤または可溶化剤を含み得る。
異なる送達系に依存して、異なる組成物／製剤要件が存在し得る。例として、本発明において有用な医薬組成物は、ミニポンプを使用して、または粘膜経路により、例えば、経鼻スプレーまたは吸入用エアロゾルとしてまたは経口摂取可能溶液としてまたは組成物が、例えば、静脈内、筋肉内または皮下経路による送達のための注射形態で製剤化される、非経腸的に投与されるために製剤化され得る。あるいは、製剤は、多数の経路により投与されるように設計され得る。ある実施態様において、該製剤は直接１以上の腫瘍に投与さえる。
ある実施態様において、抗体またはタンパク質製剤は凍結乾燥製剤である。他の実施態様において、抗体またはタンパク質製剤は水性製剤である。
ある実施態様において、医薬組成物は、本発明のＩＬ－１２プロドラッグ、薬学的に許容される添加物およびＩＬ－１２以外のサイトカインまたはその融合分子、ＰＤ－１に対する抗体、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体、ＣＴＬＡ－４に対する抗体、ＣＤ４７に対する抗体、ＰＤ－１抗体－ＩＬ－１５融合分子、ＰＤ－１－ＩＬ－２融合分子およびＰＤ－１－ＩＬ－２１融合分子から選択される第二活性成分を含む、組み合わせ医薬組成物である。
IV. 処置方法
ここに開示するプロドラッグを、抗原結合ドメインにより結合される抗原に依存して、疾患の処置に使用し得る。ある実施態様において、ここに開示するプロドラッグは、癌の処置に使用される。ある実施態様において、プロドラッグは、例えば、薬物分子が抗細菌剤または抗ウイルス剤であるとき、感染の処置に使用される。
ある実施態様において、対象における疾患(例えば癌、ウイルス感染または細菌感染)を処置する方法は、対象に有効量のここに開示するプロドラッグを投与することを含む。
ある実施態様において、癌は固形癌である。ある実施態様において、癌は血液癌である。処置され得る癌の例は、白血病、リンパ腫、腎臓癌、膀胱癌、尿路癌、子宮頸癌、脳癌、頭頸部癌、皮膚癌、子宮癌、精巣癌、食道癌、肝臓癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、胆管癌、乳癌および卵巣癌を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、ここに開示するプロドラッグは、敗血症などの細菌感染の処置に使用される。ある実施態様において、細菌感染を引き起こす細菌は、薬物耐性細菌である。ある実施態様において、抗原結合部分は細菌抗原に結合する。
ある実施態様において、プロドラッグを、ウイルス感染の処置に使用する。ある実施態様において、ウイルス感染を引き起こすウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)である。ある実施態様において、抗原結合部分はウイルス抗原に結合する。
一般に、本医薬組成物の投与量および投与経路は、対象の体格および状態により、標準薬務に従い決定される。ある実施態様において、医薬組成物は、経口、経真皮、吸入、静脈内、動脈内、筋肉内、創傷部位への直接適用、手術部位への適用、腹腔内、坐薬、皮下、皮内、経皮、噴霧化、胸膜内、脳室内、関節内、眼内または髄腔内を含むあらゆる経路を介して対象に投与される。ある実施態様において、組成物は、対象に静脈内投与される。
ある実施態様において、プロドラッグを、それを必要とする対象に１回または反復投与で投与する。ある実施態様において、投与量を、対象に１日１回、１日２回、１日３回または１日４回またはそれ以上で投与する。ある実施態様において、週に約１回またはそれ以上(例えば約２回、３回、４回、５回、６回または７回またはそれ以上)投与する。ある実施態様において、薬物にコンジュゲートした抗体融合分子を、毎週、２週に１回、３週に１回、４週に１回、３週のうち２週は毎週または４週のうち３週は毎週で投与する。ある実施態様において、複数回を、数日、数週、数カ月または数年にわたり投与する。ある実施態様において、一連の処置は、約１回以上の投与である(例えば約２回、２回、３回、４回、５回、７回、１０回、１５回または２０回またはそれ以上)。
ある実施態様において、ＩＬ－１２プロドラッグを、第二医薬組成物と組み合わせて対象に投与し、ここで、第二医薬組成物は、ＩＬ－１２以外のサイトカインまたはその融合分子、ＰＤ－１に対する抗体、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体、ＣＴＬＡ－４に対する抗体、ＣＤ４７に対する抗体、ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２融合分子、ＰＤ－１－ＩＬ－７融合分子、ＰＤ－１抗体－ＩＬ－１５融合分子およびＰＤ－１－ＩＬ－２１融合分子から選択される活性成分を含む。
Ｖ. プロドラッグを製造する方法
ここに開示するプロドラッグを、組み換えＤＮＡ方法を使用して製造できる。該プロドラッグのポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸分子を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞における発現のための１以上のベクターに挿入し得る。このような核酸分子は、慣用法を使用して、容易に単離および配列決定できる。融合ポリペプチドベクターのクローニングまたは発現のための適当な宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞を含む。宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞またはヒト胚腎臓細胞(例えば、ＨＥＫ２９３)を含む。
発現宿主細は抗体融合分子を発現する。発現期間後、宿主細胞を溶解し、プロドラッグまたは抗体融合分子を精製できる。精製方法の例は、液体クロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー(例えばプロテインＡ親和性クロマトグラフィー)またはサイズ排除クロマトグラフィーを含む。
本明細書における態様は、特定の実施態様の言及により強調されるが、当業者はこれらの開示される実施態様がここに開示される主題の原則の単なる例示であることを容易に認識することが理解されるべきである。それ故に、開示される主題は、明示されない限り、特定の化合物、組成物、品物または方法に限定すると解釈されてはならない。さらに、ある変更、修飾、置き換え、改変、付加、減法およびそれらの下位の組み合わせを、本明細書の精神から逸脱することなくここでの教示に従いなし得ることを当業者は認識する。
特に断らない限り、本開示に関連して使用する科学的および技術的用語は、当業者により共通して理解される意味を有する。例示的方法および材料を下に記載するが、ここに記載されているものに類似するまたは同等な方法および材料も、本発明の実施または試験に使用できる。矛盾があるときは、定義を含む本明細書の記載が優先する。一般に、ここに記載する、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、医薬品化学および薬化学ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して使用する命名法および技術は、当分野で周知であり、一般に使用されるものである。酵素反応および精製技術は、当分野で一般に実施されるまたはここに記載するとおり、製造業者の仕様に従い実施する。さらに、文脈から他の解釈が必要ではない限り、単数表現は複数表現を含み、複数表現は単数表現を含む。本明細書および実施態様をとおして、用語「有する」および「含む」または「有し」、「含有し」、「含み」または「含んで」などのその変形は、記載する整数または整数群を含むが、あらゆる他の整数または整数の群を除外しないことを含意すると解釈される。ここに記載する本発明の態様およびバリエーションは、「からなる」および／または「本質的にからなる」態様およびバリエーションを含むと解釈される。ここに記載する全ての刊行物および他の引用は、全体として引用により本明細書に包含させる。多数の文献がここで引用されているが、これらの引用文献は、これらの文献の何れも当分野の共通する一般的知識の一部を形成することを認めるものではない。
VI. 例示的実施態様
本発明の非限定的例示的実施態様を下に記載する。
１. ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット(ｐ４０)、ＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット(ｐ３５)、第一マスキング部分(ＭＭ)、第二マスキング部分、担体(Ｃ)および少なくとも１個の開裂可能ペプチドリンカーを含むＩＬ－１２のプロドラッグであって、ここで、
ａ. 該ＩＬ－１２サブユニットｐ４０は配列番号５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し；
ｂ. 該ＩＬ－１２サブユニットｐ３５は配列番号６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し；
ｃ. 該第一マスキング部分はｐ４０に結合する結合部分を含み、該第二マスキング部分はｐ３５に結合する結合部分を含み；そして
ｄ. 該担体はアルブミンまたはアルブミンフラグメント、Ｆｃドメインおよび抗体から選択される、
プロドラッグ。
２. 該第一マスキング部分がＩＬ－１２受容体β１の細胞外ドメイン(ＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤ)またはそのフラグメント、ペプチドライプラリーのスクリーニングにより発見されたｐ４０結合ペプチドおよびｐ４０に結合する抗体の一本鎖ＦｖまたはＦａｂドメインから選択される、実施態様１のプロドラッグ。
３. 該第二マスキング部分がＩＬ－１２受容体β２の細胞外ドメイン(ＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤ)またはそのフラグメント、ｐ３５またはペプチドライプラリーのスクリーニングにより発見されたｐ４０結合ペプチドおよびｐ３５に結合する抗体の一本鎖ＦｖまたはＦａｂドメインから選択される、実施態様１または２のプロドラッグ。
４. 該第一マスキング部分がＩＬ－１２受容体ベータ１(ＩＬ－１２Ｒβ１)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)またはそのフラグメントを含み、ここで、該ＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤが配列番号１３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１～３の何れかのプロドラッグ。
５. 該第一マスキング部分がＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤのフラグメントを含み、ここで、該フラグメントが配列番号１４、１５または１６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１～３の何れかのプロドラッグ。
６. 該第二マスキング部分がＩＬ－１２受容体ベータ２(ＩＬ－１２Ｒβ２)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)またはそのフラグメントを含み、ここで、該ＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤが配列番号１７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１～３の何れかのプロドラッグ。
７. 該第二マスキング部分がＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤのフラグメントを含み、ここで、該フラグメントが配列番号１８または１９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１～３の何れかのプロドラッグ。
８. 該第一マスキング部分がｐ４０に結合するｓｃＦｖを含み、ここで、該ｓｃＦｖが配列番号７～１１および１２から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１～３の何れかのプロドラッグ。
９. 該第一マスキング部分が配列番号１３～１６から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤまたはそのフラグメントまたは配列番号７～１２から選択されるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖから選択され、ここで、該第二マスキング部分が配列番号１７～１９から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤまたはそのフラグメントを含む、実施態様１～３の何れかのプロドラッグ。
１０. 該第一マスキング部分が配列番号１３～１６から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤまたはそのフラグメントまたは配列番号７～１２から選択されるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖから選択され、ここで、該第二マスキング部分がｐ３５に結合するｓｃＦｖを含む、実施態様１～３の何れかのプロドラッグ。
１１. 該担体が免疫細胞または癌細胞の表面に発現される標的に結合する抗体である、実施態様１～１０の何れかのプロドラッグ。
１２. さらに他のサイトカインまたはエフェクター部分を含む、実施態様１～１０の何れかのプロドラッグ。
１３. 該サイトカイン部分が配列番号７４および７５から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ－２アゴニストポリペプチドを含む、実施態様１２のプロドラッグ。
１４. 該担体が第一ポリペプチド鎖Ｆ１および第二ポリペプチド鎖Ｆ２を含むＦｃドメインを含み、ここで、該Ｆ１およびＦ２がヘテロ二量体化を形成し；ここで、該ｐ４０またはそのアナログが所望により非開裂可能ペプチドリンカーを介してＦ１のＣ末端に融合し、該ｐ３５またはそのアナログが非開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ４０のＣ末端に融合し；ここで、該第一マスキング部分が開裂可能または非開裂可能ペプチドリンカーを介してＦ２のＣ末端に融合し、該第二マスキング部分が開裂可能ペプチドリンカーを介して該第一マスキング部分のＣ末端に融合する、実施態様１～１０の何れかのプロドラッグ。
１５. 該担体が第一ポリペプチド鎖Ｆ１および第二ポリペプチド鎖Ｆ２を含むＦｃドメインを含み、ここで、該Ｆ１およびＦ２がヘテロ二量体化を形成し；ここで、該ｐ４０が所望により非開裂可能ペプチドリンカーを介してＦ１のＣ末端に融合し、該第一マスキング部分が開裂可能または非開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ４０のＣ末端に融合し；ここで、該ｐ３５がＦ２のＣ末端に融合し、該第二マスキング部分が開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ３５のＣ末端に融合する、実施態様１～１０の何れかのプロドラッグ。
１６. 該担体が第一ポリペプチド鎖Ｆ１および第二ポリペプチド鎖Ｆ２を含むＦｃドメインを含み、ここで、該Ｆ１およびＦ２がヘテロ二量体化を形成し；ここで、該ｐ３５が所望により非開裂可能ペプチドリンカーを介してＦ１のＣ末端に融合し、該第一マスキング部分が開裂可能または非開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ３５のＣ末端に融合し；ここで、該ｐ４０がＦ２のＣ末端に融合し、該第二マスキング部分が開裂可能ペプチドリンカーを介してｐ４０のＣ末端に融合する、実施態様１～１０の何れかのプロドラッグ。
１７. 該非開裂可能ペプチドリンカーが配列番号２９～３３の何れかのアミノ酸配列を含み、該開裂可能ペプチドリンカーが配列番号３４～５４から選択されるアミノ酸配列を含む、実施態様１～１６の何れかのプロドラッグ。
１８. ２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、該第一ポリペプチド鎖が配列番号２０から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；該第二ポリペプチド鎖が配列番号２１～２８から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１のプロドラッグ。
１９. ２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、該第一ポリペプチド鎖が配列番号５５と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；該第二ポリペプチド鎖が配列番号５６～５９から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１のプロドラッグ。
２０. ２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、該第一ポリペプチド鎖が配列番号６０から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；該第二ポリペプチド鎖が配列番号６１～６４から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１のプロドラッグ。
２１. ２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、該第一ポリペプチド鎖が配列番号６５と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；該第二ポリペプチド鎖が配列番号６６～７３から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、実施態様１のプロドラッグ。
２２. 実施態様１～２１の何れかのプロドラッグおよび薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
２３. 実施態様１～２２の何れかのプロドラッグをコードする１以上のポリヌクレオチド。
２４. 実施態様２３の１以上のポリヌクレオチドを含む、１以上の発現ベクター。
２５. 実施態様２４のベクターを含む、宿主細胞。
２６. 該宿主細胞がノックアウトされたｕＰＡ、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９および／またはマトリプターゼをコードする１以上の遺伝子を有する、実施態様２５の宿主細胞。
２７. 請求項２５または２６の宿主細胞を、抗原結合分子を発現する条件下で培養し、抗原結合分子を単離することを含む、実施態様１～２１の何れかのプロドラッグを製造する方法。
２８. 実施態様２２の医薬組成物を投与することを含む、処置を必要とする患者における癌もしくは感染性疾患を処置するまたは免疫系を刺激する方法。
２９. 実施態様２８の方法における癌もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激に使用するための、プロドラッグ。
３０. 該癌が乳癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌および胃癌からなる群から選択される、実施態様２８の方法。
３１. 請求項２２の医薬組成物を１以上の腫瘍に直接投与することを含む、癌を有する患者を処置する方法。
本発明がよりよく理解され得るために、次の実施例を示す。これらの実施例は説明の目的のみであり、如何なる方法でも本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
実施例１：ＨＥＫ２９３細胞を使用するＩＬ－１２プロドラッグの一過性トランスフェクション
発現プラスミドを、ＰＥＩ(ポリエチレンイミン)を使用して約２.５μg／mlで約４×１０６細胞／ml freestyle HEK293細胞に共トランスフェクトした。ＦｃベースのＩＬ－１２プロドラッグについて、Ｆｃ－ＩＬ－１２融合ポリペプチドおよびＦｃ－マスキング部分融合ポリペプチドは１：２比であった。細胞培養物を９,０００rpmで４５分間の遠心分離、続く０.２２μM濾過により、トランスフェクション６日後収集した。多数のＩＬ－１２プロドラッグが発現された。配列番号を表２に列記する。
Figure 2022549344000003
実施例２：ＦｃベースのＩＬ－１２プロドラッグの精製
ＦｃベースのＩＬ－１２プロドラッグのタンパク質の精製を、プロテインＡ親和性を使用して実施した。簡潔には、一過性発現細胞培養物の上清を、サンプル適用前２５mM Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７.８(緩衝液Ａ)で平衡化したプロテインＡカラムに負荷した。カラムを５カラム体積の緩衝液Ａで洗浄し、結合タンパク質を５０mM 酢酸、ｐＨ３.６で溶出した。溶出タンパク質のｐＨを、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を使用して約５.２に調節した。サンプルを、下記のとおりＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
実施例３：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
１０μlの１０～２０μgの精製タンパク質サンプルを、還元剤存在下または非存在下でBoltTM LDSサンプル緩衝液(Novex)と混合した。サンプルを７０℃で３分間加熱し、次いで、NuPAGETM ４～１２％BisTris Gel(InvitrogenTM)に負荷した。ゲルをNuPAGETM MOPS SDS Running緩衝液(InvitrogenTM)で２００ボルトで４０分間流し、次いでクマシーで染色した。プロドラッグの精製サンプルを、図８Ａに示すとおりＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析で分析した。プロテアーゼＭＭＰ－２処理(下記参照)したＪＲ３.１０５.５(図５Ｂに示す構造)も、図８Ｂに示すとおりＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析で分析した。データは、プロドラのマスキング部分が大部分プロテアーゼ消化で除去され、活性化分子が予測された分子量で移動することを示す。さらに、プロテインＡカラムプールサンプルは、ＩＬ－１２プロドラッグの活性化型も含んだことを示す(図８Ｂ)。
実施例４：タンパク質分解処理
プロテアーゼ、ヒトＭＭＰ２、ヒトＭＭＰ９、マウスＭＭＰ２およびマウスＭＭＰ９をR&D systemsから購入した。プロテアーゼ消化を、１０μg～５０μgのプロドラッグと１μgのヒトＭＭＰ２、ヒトＭＭＰ９、マウスＭＭＰ２またはマウスＭＭＰ９を、２mM ＣａＣｌ２および１０μＭ ＺｎＣｌ２含有ＨＢＳ緩衝液(２０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ２、ｐＨ７.４)中、３７℃で１２時間インキュベートすることにより実施した。消化前後のプロドラッグＪＲ３.１０５.５をＳＤＳ－ＰＡＧＥ(図８Ｂ)および細胞ベースの活性アッセイ(下記参照)で分析した。
実施例５：細胞ベースのＩＬ－１２レポーターアッセイ
活性化前後のＩＬ－１２プロドラッグを、分泌型アルカリホスファターゼレポーター細胞株(HEK-Blue IL-12, InvivoGen catalog # hkb-il12)を使用して、生物学的活についてアッセイした。HEK-Blue IL-12細胞株は、ＨＥＫ ２９３細胞へのヒトＩＬ－１２受容体およびシグナル伝達経路の遺伝子の安定な導入により産生された。細胞は、ＳＴＡＴ４誘導型分泌型アルカリホスファターゼ(ＳＥＡＰ)レポーター遺伝子も発現する。試験品を、９６ウェル平底細胞培養プレート中１００μL／ウェル培養培地に希釈し、続いて１００μLで５０,０００細胞／ウェルでHEK-Blue IL-12細胞を加える。培養物を３７℃で一夜インキュベートする。２０μLの培養上清をＥＬＩＳＡプレートに移し、１８０μL Quanti-Blue(InvivoGen, Catalog #rep-qb1)を加える。ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で１時間インキュベートし、マイクロプレートリーダーでＯＤ６３０を測定する。データを図９および図１０に示す。結果は、ＪＲ３.１０５.５がＥＣ５０値に基づき、約１８倍活性化されたことを示す(図１０)。図８Ｂに示すとおり、ＩＬ－１２プロドラッグＪＲ３.１０５.５サンプルは、プロドラッグの小量の活性化型を含み得る。結果として、ＪＲ３.１０５.５のマスキング部分のマスキング効率は、図９および１０に示すより大きい可能性がある。
このＩＬ－１２プロドラッグＪＲ３.１０５.５は、他のサンプルと比較して、活性化も最高であった。ＩＬ－１２プロドラッグは全て同じＦｃ－ＩＬ－１２鎖(配列番号２０、表２)を有した。しかしながら、ＪＲ３.１０５.５のマスキング部分は、配列番号８０に示すとおり、そのＶＬとＶＨの間に(Ｇ４Ｓ)４を含む最長リンカーを有した。
実施例６：マウス腫瘍モデルを用いるインビボ有効性試験
本発明のＩＬ－１２－Ｆｃプロドラッグのインビボ抗腫瘍効果をマウスモデルで試験する。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ(ＮＳＧ)マウスに、右脇腹に３×１０６ ｐｐ－６５発現ＭＣＦ－７細胞を皮内移植する。腫瘍確立後、マウスに１.５×１０６ ヒトＰＢＭＣを腹腔内移植する。次いで、マウスを、ＩＬ－１２プロドラッグで週２回、毎週または２週毎に処置する。腫瘍体積および体重を隔日で測定する。マウスを試験終了時に屠殺し、血液サンプル、血清サンプルおよび組織(腫瘍ならびに肝臓および肺を含む主要臓器)を、ＰＫ、安全性、サイトカイン放出およびプロドラッグ活性化について試験する。
上記非限定的例は、本発明の主題のより完全な理解を促すために、説明の目的のみで提供される。これらの実施例は、抗体、医薬組成物または癌、神経変性または感染性疾患の処置のための方法および使用を含み、本明細書に記載する実施態様の何れかに限定されると解釈してはならない。
配列一覧
配列番号１ － ヒトＩＬ－２：
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
配列番号２ － ヒトＩＬ－２受容体ベータサブユニット細胞外ドメイン(https://www.uniprot.org/uniprot/P14784)
AVNGTSQFTC FYNSRANISC VWSQDGALQD TSCQVHAWPD RRRWNQTCEL LPVSQASWAC NLILGAPDSQ KLTTVDIVTL RVLCREGVRW RVMAIQDFKP FENLRLMAPI SLQVVHVETH RCNISWEISQ ASHYFERHLE FEARTLSPGH TWEEAPLLTL KQKQEWICLE TLTPDTQYEF QVRVKPLQGE FTTWSPWSQP LAFRTKPAAL GKDT
配列番号３ － ＩＬ１５受容体アルファサブユニットｓｕｓｈｉドメイン
ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKCIRDPALV HQRPAPP
配列番号４ － ヒトＩＬ１５
GIHVFILGCF SAGLPKTEAN WVNVISDLKK IEDLIQSMHI DATLYTESDV HPSCKVTAMK CFLLELQVIS LESGDASIHD TVENLIILAN NSLSSNGNVT ESGCKECEEL EEKNIKEFLQ SFVHIVQMFI NTS
配列番号５ － ヒトＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット
IWELKKDVYV VELDWYPDAP GEMVVLTCDT PEEDGITWTL DQSSEVLGSG KTLTIQVKEF GDAGQYTCHK GGEVLSHSLL LLHKKEDGIW STDILKDQKE PKNKTFLRCE AKNYSGRFTC WWLTTISTDL TFSVKSSRGS SDPQGVTCGA ATLSAERVRG DNKEYEYSVE CQEDSACPAA EESLPIEVMV DAVHKLKYEN YTSSFFIRDI IKPDPPKNLQ LKPLKNSRQV EVSWEYPDTW STPHSYFSLT FCVQVQGKSK REKKDRVFTD KTSATVICRK NASISVRAQD RYYSSSWSEW ASVPCS
配列番号６ － ヒトＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット
RNLPVATPDP GMFPCLHHSQ NLLRAVSNML QKARQTLEFY PCTSEEIDHE DITKDKTSTV EACLPLELTK NESCLNSRET SFITNGSCLA SRKTSFMMAL CLSSIYEDLK MYQVEFKTMN AKLLMDPKRQ IFLDQNMLAV IDELMQALNF NSETVPQKSS LEEPDFYKTK IKLCILLHAF RIRAVTIDRV MSYLNAS
配列番号７ － ＩＬ－１２に結合するｓｃＦｖ
EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT TYWLGWVRQM PGKGLDWIGI MSPVDSDIRY SPSFQGQVTM SVDKSITTAY LQWNSLKASD TAMYYCARRR PGQGYFDFWG QGTLVTVSSG GGGSGGGGSD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRASQGISS WLAWYQQKPE KAPKSLIYAA SSLQSGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQY NIYPYTFGQG TKLEIK
配列番号８ － ＩＬ－１２に結合するｓｃＦｖ
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNIYPYTFGQ GTKLEIKGGG GSGGGGSEVQ LVQSGAEVKK PGESLKISCK GSGYSFTTYW LGWVRQMPGK GLDWIGIMSP VDSDIRYSPS FQGQVTMSVD KSITTAYLQW NSLKASDTAM YYCARRRPGQ GYFDFWGQGT LVTVSS
配列番号９ － ＩＬ－１２に結合するｓｃＦｖ
EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT TYWLGWVRQM PGKGLDWIGI MSPVDSDIRY SPSFQGQVTM SVDKSITTAY LQWNSLKASD TAMYYCARRR PGQGYFDFWG QGTLVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCRAS QGISSWLAWY QQKPEKAPKS LIYAASSLQS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQYNIYPY TFGQGTKLEI K
配列番号１０ － ＩＬ－１２に結合するｓｃＦｖ
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNIYPYTFGQ GTKLEIKGGG GSGGGGSGGG GSEVQLVQSG AEVKKPGESL KISCKGSGYS FTTYWLGWVR QMPGKGLDWI GIMSPVDSDI RYSPSFQGQV TMSVDKSITT AYLQWNSLKA SDTAMYYCAR RRPGQGYFDF WGQGTLVTVS S
配列番号１１ － ＩＬ－１２に結合するｓｃＦｖ
EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT TYWLGWVRQM PGKGLDWIGI MSPVDSDIRY SPSFQGQVTM SVDKSITTAY LQWNSLKASD TAMYYCARRR PGQGYFDFWG QGTLVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSGGGGSD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRASQGISS WLAWYQQKPE KAPKSLIYAA SSLQSGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQY NIYPYTFGQG TKLEIK
配列番号１２ － ＩＬ－１２に結合するｓｃＦｖ
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNIYPYTFGQ GTKLEIKGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSEVQ LVQSGAEVKK PGESLKISCK GSGYSFTTYW LGWVRQMPGK GLDWIGIMSP VDSDIRYSPS FQGQVTMSVD KSITTAYLQW NSLKASDTAM YYCARRRPGQ GYFDFWGQGT LVTVSS
配列番号１３ － ＩＬ－１２受容体ベータ１細胞外ドメイン(ＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤ)
RTSECCFQDP PYPDADSGSA SGPRDLRCYR ISSDRYECSW QYEGPTAGVS HFLRCCLSSG
RCCYFAAGSA TRLQFSDQAG VSVLYTVTLW VESWARNQTE KSPEVTLQLY NSVKYEPPLG
DIKVSKLAGQ LRMEWETPDN QVGAEVQFRH RTPSSPWKLG DCGPQDDDTE SCLCPLEMNV
AQEFQLRRRQ LGSQGSSWSK WSSPVCVPPE NPPQPQVRFS VEQLGQDGRR RLTLKEQPTQ
LELPEGCQGL APGTEVTYRL QLHMLSCPCK AKATRTLHLG KMPYLSGAAY NVAVISSNQF
GPGLNQTWHI PADTHTEPVA LNISVGTNGT TMYWPARAQS MTYCIEWQPV GQDGGLATCS
LTAPQDPDPA GMATYSWSRE SGAMGQEKCY YITIFASAHP EKLTLWSTVL STYHFGGNAS
AAGTPHHVSV KNHSLDSVSV DWAPSLLSTC PGVLKEYVVR CRDEDSKQVS EHPVQPTETQ
VTLSGLRAGV AYTVQVRADT AWLRGVWSQP QRFSIEVQVS D
配列番号１４ － ＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤ Ｄ１－Ｄ５
RTSECCFQDP PYPDADSGSA SGPRDLRCYR ISSDRYECSW QYEGPTAGVS HFLRCCLSSG
RCCYFAAGSA TRLQFSDQAG VSVLYTVTLW VESWARNQTE KSPEVTLQLY NSVKYEPPLG
DIKVSKLAGQ LRMEWETPDN QVGAEVQFRH RTPSSPWKLG DCGPQDDDTE SCLCPLEMNV
AQEFQLRRRQ LGSQGSSWSK WSSPVCVPPE NPPQPQVRFS VEQLGQDGRR RLTLKEQPTQ
LELPEGCQGL APGTEVTYRL QLHMLSCPCK AKATRTLHLG KMPYLSGAAY NVAVISSNQF
GPGLNQTWHI PADTHTEPVA LNISVGTNGT TMYWPARAQS MTYCIEWQPV GQDGGLATCS
LTAPQDPDPA GMATYSWSRE SGAMGQEKCY YITIFASAHP EKLTLWSTVL STYHFGGNAS
AAGTPHHVSV KNHSLDSVSV DWAPSLLSTC PGVLKEYVVR CRDEDSKQVS EHPVQPTETQ
VTLSGLRAGV AYTVQVRADT AWLRGVWSQP QRFSIEVQVS D
配列番号１５ － ＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤ Ｄ１－Ｄ２
RTSECCFQDP PYPDADSGSA SGPRDLRCYR ISSDRYECSW QYEGPTAGVS HFLRCCLSSG
RCCYFAAGSA TRLQFSDQAG VSVLYTVTLW VESWARNQTE KSPEVTLQLY NSVKYEPPLG
DIKVSKLAGQ LRMEWETPDN QVGAEVQFRH RTPSSPWKLG DCGPQDDDTE SCLCPLEMNV
AQEFQLRRRQ LGSQGSSWSK WSSPVCVPPE
配列番号１６ － ＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤ Ｄ１－Ｄ３
RTSECCFQDP PYPDADSGSA SGPRDLRCYR ISSDRYECSW QYEGPTAGVS HFLRCCLSSG
RCCYFAAGSA TRLQFSDQAG VSVLYTVTLW VESWARNQTE KSPEVTLQLY NSVKYEPPLG
DIKVSKLAGQ LRMEWETPDN QVGAEVQFRH RTPSSPWKLG DCGPQDDDTE SCLCPLEMNV
AQEFQLRRRQ LGSQGSSWSK WSSPVCVPPE NPPQPQVRFS VEQLGQDGRR RLTLKEQPTQ
LELPEGCQGL APGTEVTYRL QLHMLSCPCK AKATRTLHLG KMPYLSGAAY NVAVISSNQF
GPGLNQTWHI PA
配列番号１７ － ＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤ Ｄ１－Ｄ６
KIDACKRGDV TVKPSHVILL GSTVNITCSL KPRQGCFHYS RRNKLILYKF DRRINFHHGH
SLNSQVTGLP LGTTLFVCKL ACINSDEIQI CGAEIFVGVA PEQPQNLSCI QKGEQGTVAC
TWERGRDTHL YTEYTLQLSG PKNLTWQKQC KDIYCDYLDF GINLTPESPE SNFTAKVTAV
NSLGSSSSLP STFTFLDIVR PLPPWDIRIK FQKASVSRCT LYWRDEGLVL LNRLRYRPSN
SRLWNMVNVT KAKGRHDLLD LKPFTEYEFQ ISSKLHLYKG SWSDWSESLR AQTPEEEPTG
MLDVWYMKRH IDYSRQQISL FWKNLSVSEA RGKILHYQVT LQELTGGKAM TQNITGHTSW
TTVIPRTGNW AVAVSAANSK GSSLPTRINI MNLCEAGLLA PRQVSANSEG MDNILVTWQP
PRKDPSAVQE YVVEWRELHP GGDTQVPLNW LRSRPYNVSA LISENIKSYI CYEIRVYALS
GDQGGCSSIL GNSKHKAPLS GPHINAITEE KGSILISWNS IPVQEQMGCL LHYRIYWKER
DSNSQPQLCE IPYRVSQNSH PINSLQPRVT YVLWMTALTA AGESSHGNER EFCLQGKAN
配列番号１８ － ＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤ Ｄ１－Ｄ２
KIDACKRGDV TVKPSHVILL GSTVNITCSL KPRQGCFHYS RRNKLILYKF DRRINFHHGH
SLNSQVTGLP LGTTLFVCKL ACINSDEIQI CGAEIFVGVA PEQPQNLSCI QKGEQGTVAC
TWERGRDTHL YTEYTLQLSG PKNLTWQKQC KDIYCDYLDF GINLTPESPE SNFTAKVTAV
NSLGSSSSLP STFTFLDI
配列番号１９ － ＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤ Ｄ１－Ｄ３
KIDACKRGDV TVKPSHVILL GSTVNITCSL KPRQGCFHYS RRNKLILYKF DRRINFHHGH
SLNSQVTGLP LGTTLFVCKL ACINSDEIQI CGAEIFVGVA PEQPQNLSCI QKGEQGTVAC
TWERGRDTHL YTEYTLQLSG PKNLTWQKQC KDIYCDYLDF GINLTPESPE SNFTAKVTAV
NSLGSSSSLP STFTFLDIVR PLPPWDIRIK FQKASVSRCT LYWRDEGLVL LNRLRYRPSN
SRLWNMVNVT KAKGRHDLLD LKPFTEYEFQ ISSKLHLYKG SWSDWSESLR AQTPEEEPTG
配列番号２０ － Ｆｃ－ノブ変異を有するＩＬ－１２(Ｐ４０－Ｐ３５)
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYASTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGAGGG GSGGGGSGGG GSIWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCSGG GGSGGGGSGG GGSRNLPVAT PDPGMFPCLH HSQNLLRAVS NMLQKARQTL EFYPCTSEEI DHEDITKDKT STVEACLPLE LTKNESCLNS RETSFITNGS CLASRKTSFM MALCLSSIYE DLKMYQVEFK TMNAKLLMDP KRQIFLDQNM LAVIDELMQA LNFNSETVPQ KSSLEEPDFY KTKIKLCILL HAFRIRAVTI DRVMSYLNAS
配列番号２１ － ホール変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２Ｒβ１－Ｄ１Ｄ２／ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSGGGS RTSECCFQDP PYPDADSGSA SGPRDLRCYR ISSDRYECSW QYEGPTAGVS HFLRCCLSSG RCCYFAAGSA TRLQFSDQAG VSVLYTVTLW VESWARNQTE KSPEVTLQLY NSVKYEPPLG DIKVSKLAGQ LRMEWETPDN QVGAEVQFRH RTPSSPWKLG DCGPQDDDTE SCLCPLEMNV AQEFQLRRRQ LGSQGSSWSK WSSPVCVPPE (GGGGS)n1 V HMPLGFLGPR QARVVN(GGG GS)n2KIDAC KRGDVTVKPS HVILLGSTVN ITCSLKPRQG CFHYSRRNKL ILYKFDRRIN FHHGHSLNSQ VTGLPLGTTL FVCKLACINS DEIQICGAEI FVGVAPEQPQ NLSCIQKGEQ GTVACTWERG RDTHLYTEYT LQLSGPKNLT WQKQCKDIYC DYLDFGINLT PESPESNFTA KVTAVNSLGS SSSLPSTFTF LDI；ここで、ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号２２ － ホール変異を有するＦｃ ＩＬ－１２Ｒβ１－Ｄ１Ｄ２Ｄ３／ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSGGGS RTSECCFQDP PYPDADSGSA SGPRDLRCYR ISSDRYECSW QYEGPTAGVS HFLRCCLSSG RCCYFAAGSA TRLQFSDQAG VSVLYTVTLW VESWARNQTE KSPEVTLQLY NSVKYEPPLG DIKVSKLAGQ LRMEWETPDN QVGAEVQFRH RTPSSPWKLG DCGPQDDDTE SCLCPLEMNV AQEFQLRRRQ LGSQGSSWSK WSSPVCVPPE NPPQPQVRFS VEQLGQDGRR RLTLKEQPTQ LELPEGCQGL APGTEVTYRL QLHMLSCPCK AKATRTLHLG KMPYLSGAAY NVAVISSNQF GPGLNQTWHI PA(GGGGS)n1 VHMPLGFLGP RQARVVN(GG GGS)n2KIDA CKRGDVTVKP SHVILLGSTV NITCSLKPRQ GCFHYSRRNK LILYKFDRRI NFHHGHSLNS QVTGLPLGTT LFVCKLACIN SDEIQICGAE IFVGVAPEQP QNLSCIQKGE QGTVACTWER GRDTHLYTEY TLQLSGPKNL TWQKQCKDIY CDYLDFGINL TPESPESNFT AKVTAVNSLG SSSSLPSTFT FLDIVRPLPP WDIRIKFQKA SVSRCTLYWR DEGLVLLNRL RYRPSNSRLW NMVNVTKAKG RHDLLDLKPF TEYEFQISSK LHLYKGSWSD WSESLRAQTP EEEPTG; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号２３ － ホール変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２Ｒβ１－Ｄ１Ｄ２／ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２
ＤＫＴＨＴＣＰＰCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSTGRG PSWVGGGGSG GGSRTSECCF QDPPYPDADS GSASGPRDLR CYRISSDRYE CSWQYEGPTA GVSHFLRCCL SSGRCCYFAA GSATRLQFSD QAGVSVLYTV TLWVESWARN QTEKSPEVTL QLYNSVKYEP PLGDIKVSKL AGQLRMEWET PDNQVGAEVQ FRHRTPSSPW KLGDCGPQDD DTESCLCPLE MNVAQEFQLR RRQLGSQGSS WSKWSSPVCV PPE(GGGGS) n1 VHMPLGFL GPRQARVVN(GGGGS)n2KI DACKRGDVTV KPSHVILLGS TVNITCSLKP RQGCFHYSRR NKLILYKFDR RINFHHGHSL NSQVTGLPLG TTLFVCKLAC INSDEIQICG AEIFVGVAPE QPQNLSCIQK GEQGTVACTW ERGRDTHLYT EYTLQLSGPK NLTWQKQCKD IYCDYLDFGI NLTPESPESN FTAKVTAVNS LGSSSSLPST FTFLDI；ここで、ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号２４ － ホール変異を有するＦｃ ＩＬ－１２Ｒβ１－Ｄ１Ｄ２Ｄ３／ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSTGRG PSWVGGGGSG GGSRTSECCF QDPPYPDADS GSASGPRDLR CYRISSDRYE CSWQYEGPTA GVSHFLRCCL SSGRCCYFAA GSATRLQFSD QAGVSVLYTV TLWVESWARN QTEKSPEVTL QLYNSVKYEP PLGDIKVSKL AGQLRMEWET PDNQVGAEVQ FRHRTPSSPW KLGDCGPQDD DTESCLCPLE MNVAQEFQLR RRQLGSQGSS WSKWSSPVCV PPENPPQPQV RFSVEQLGQD GRRRLTLKEQ PTQLELPEGC QGLAPGTEVT YRLQLHMLSC PCKAKATRTL HLGKMPYLSG AAYNVAVISS NQFGPGLNQT WHIPA(GGGG S)n1 VHMPLG FLGPRQARVV N(GGGGS)n2 KIDACKRGDV TVKPSHVILL GSTVNITCSL KPRQGCFHYS RRNKLILYKF DRRINFHHGH SLNSQVTGLP LGTTLFVCKL ACINSDEIQI CGAEIFVGVA PEQPQNLSCI QKGEQGTVAC TWERGRDTHL YTEYTLQLSG PKNLTWQKQC KDIYCDYLDF GINLTPESPE SNFTAKVTAV NSLGSSSSLP STFTFLDIVR PLPPWDIRIK FQKASVSRCT LYWRDEGLVL LNRLRYRPSN SRLWNMVNVT KAKGRHDLLD LKPFTEYEFQ ISSKLHLYKG SWSDWSESLR AQTPEEEPTG; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号２５ － ホール変異を有するＦｃ ｓｃＦｖ／ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSGGGS DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNIYPYTFGQ GTKLEIKGGG GSGGGGSGGG GSEVQLVQSG AEVKKPGESL KISCKGSGYS FTTYWLGWVR QMPGKGLDWI GIMSPVDSDI RYSPSFQGQV TMSVDKSITT AYLQWNSLKA SDTAMYYCAR RRPGQGYFDF WGQGTLVTVS S(GGGGS)n1 VHMPLGFLGP RQARVVN(GG GGS)n2KIDA CKRGDVTVKP SHVILLGSTV NITCSLKPRQ GCFHYSRRNK LILYKFDRRI NFHHGHSLNS QVTGLPLGTT LFVCKLACIN SDEIQICGAE IFVGVAPEQP QNLSCIQKGE QGTVACTWER GRDTHLYTEY TLQLSGPKNL TWQKQCKDIY CDYLDFGINL TPESPESNFT AKVTAVNSLG SSSSLPSTFT FLDIVRPLPP WDIRIKFQKA SVSRCTLYWR DEGLVLLNRL RYRPSNSRLW NMVNVTKAKG RHDLLDLKPF TEYEFQISSK LHLYKGSWSD WSESLRAQTP EEEPTG; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号２６ － ホール変異を有するＦｃ ｓｃＦｖ／ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSTGRG PSWVGGGGSG GGSDIQMTQS PSSLSASVGD RVTITCRASQ GISSWLAWYQ QKPEKAPKSL IYAASSLQSG VPSRFSGSGS GTDFTLTISS LQPEDFATYY CQQYNIYPYT FGQGTKLEIK GGGGSGGGGS GGGGSEVQLV QSGAEVKKPG ESLKISCKGS GYSFTTYWLG WVRQMPGKGL DWIGIMSPVD SDIRYSPSFQ GQVTMSVDKS ITTAYLQWNS LKASDTAMYY CARRRPGQGY FDFWGQGTLV TVSS(GGGGS)n1 VHMPLGF LGPRQARVVN (GGGGS)n2K IDACKRGDVT VKPSHVILLG STVNITCSLK PRQGCFHYSR RNKLILYKFD RRINFHHGHS LNSQVTGLPL GTTLFVCKLA CINSDEIQIC GAEIFVGVAP EQPQNLSCIQ KGEQGTVACT WERGRDTHLY TEYTLQLSGP KNLTWQKQCK DIYCDYLDFG INLTPESPES NFTAKVTAVN SLGSSSSLPS TFTFLDIVRP LPPWDIRIKF QKASVSRCTL YWRDEGLVLL NRLRYRPSNS RLWNMVNVTK AKGRHDLLDL KPFTEYEFQI SSKLHLYKGS WSDWSESLRA QTPEEEPTG; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号２７ － ホール変異を有するＦｃ ｓｃＦｖ／ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSGGGS EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT TYWLGWVRQM PGKGLDWIGI MSPVDSDIRY SPSFQGQVTM SVDKSITTAY LQWNSLKASD TAMYYCARRR PGQGYFDFWG QGTLVTVSSG GGGSGGGGSG GGGSDIQMTQ SPSSLSASVG DRVTITCRAS QGISSWLAWY QQKPEKAPKS LIYAASSLQS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDFATY YCQQYNIYPY TFGQGTKLEI K(GGGGS)n1 VHMPLGFLGP RQARVVN(GG GGS)n2KIDA CKRGDVTVKP SHVILLGSTV NITCSLKPRQ GCFHYSRRNK LILYKFDRRI NFHHGHSLNS QVTGLPLGTT LFVCKLACIN SDEIQICGAE IFVGVAPEQP QNLSCIQKGE QGTVACTWER GRDTHLYTEY TLQLSGPKNL TWQKQCKDIY CDYLDFGINL TPESPESNFT AKVTAVNSLG SSSSLPSTFT FLDIVRPLPP WDIRIKFQKA SVSRCTLYWR DEGLVLLNRL RYRPSNSRLW NMVNVTKAKG RHDLLDLKPF TEYEFQISSK LHLYKGSWSD WSESLRAQTP EEEPTG; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号２８ － ホール変異を有するＦｃ ｓｃＦｖ／ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSTGRG PSWVGGGGSG GGSEVQLVQS GAEVKKPGES LKISCKGSGY SFTTYWLGWV RQMPGKGLDW IGIMSPVDSD IRYSPSFQGQ VTMSVDKSIT TAYLQWNSLK ASDTAMYYCA RRRPGQGYFD FWGQGTLVTV SSGGGGSGGG GSGGGGSDIQ MTQSPSSLSA SVGDRVTITC RASQGISSWL AWYQQKPEKA PKSLIYAASS LQSGVPSRFS GSGSGTDFTL TISSLQPEDF ATYYCQQYNI YPYTFGQGTK LEIK(GGGGS)n1 VHMPLGF LGPRQARVVN (GGGGS)n2K IDACKRGDVT VKPSHVILLG STVNITCSLK PRQGCFHYSR RNKLILYKFD RRINFHHGHS LNSQVTGLPL GTTLFVCKLA CINSDEIQIC GAEIFVGVAP EQPQNLSCIQ KGEQGTVACT WERGRDTHLY TEYTLQLSGP KNLTWQKQCK DIYCDYLDFG INLTPESPES NFTAKVTAVN SLGSSSSLPS TFTFLDIVRP LPPWDIRIKF QKASVSRCTL YWRDEGLVLL NRLRYRPSNS RLWNMVNVTK AKGRHDLLDL KPFTEYEFQI SSKLHLYKGS WSDWSESLRA QTPEEEPTG; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号２９～３３ ペプチドリンカー
GGGGS(配列番号２９)
GGGGSGGGGS(配列番号３０)
GGGGSGGGGS GGGGS(配列番号３１)
GGGGSGGGGX GGGGSGGGGS(配列番号３２)、Ｘ＝ＡまたはＮ
(GGGGSGGGGX1 GGGGX2GGGGS)n(配列番号３３)、Ｘ１＝Ｓ、ＡまたはＮ、Ｘ２＝ＡまたはＮおよびｎ＝１、２または３。
配列番号３４ － 開裂可能ペプチドリンカー
GGSLSGRSDN HGGGGS
配列番号３５ － 開裂可能ペプチドリンカー
GGSLSGRSDN HGS
配列番号３６ － 開裂可能リンカー
GGGGSGGGGS GGGGSISSGL LSSGGSGGSL SGRSDNHGGG GS
配列番号３７～４３ － ＭＭＰ－２／ＭＭＰ－９開裂可能ペプチドリンカー
GPLGVR(配列番号３７)
PLGMWSR(配列番号３８)
PLGLWAR(配列番号３９)
PQGIAGQR(配列番号４０)
PLGLAG(配列番号４１)
LALGPR(配列番号４２)
GGPLGMLSQS(配列番号４３)
配列番号４４～５２ － ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーター(ｕＰＡ)開裂可能ペプチドリンカー
GGGGRRGGS(配列番号４４)
TGRGPSWV(配列番号４５)
SARGPSRW(配列番号４６)
TARGPSFK(配列番号４７)
TARGPSW(配列番号４８)
GGWHTGRN(配列番号４９)
HTGRSGAL(配列番号５０)
PLTGRSGG(配列番号５１)
LTGRSGA(配列番号５２)
配列番号５３ － マトリプターゼ開裂可能ペプチドリンカー
RQARVVNG(配列番号５３)
配列番号５４ － マトリプターゼ－ＭＭＰ２／９デュアル開裂可能ペプチドリンカー
VHMPLGFLGP RQARVVNG(配列番号５４)。
配列番号５５ － ホール変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２ Ｐ３５－リンカー－ＩＬ－１２Ｒβ２フラグメント
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSGGGG SRNLPVATPD PGMFPCLHHS QNLLRAVSNM LQKARQTLEF YPCTSEEIDH EDITKDKTST VEACLPLELT KNESCLNSRE TSFITNGSCL ASRKTSFMMA LCLSSIYEDL KMYQVEFKTM NAKLLMDPKR QIFLDQNMLA VIDELMQALN FNSETVPQKS SLEEPDFYKT KIKLCILLHA FRIRAVTIDR VMSYLNAS(G GGGS)n1 VHM PLGFLGPRQA RVVN(GGGGS)n2KIDACKR GDVTVKPSHV ILLGSTVNIT CSLKPRQGCF HYSRRNKLIL YKFDRRINFH HGHSLNSQVT GLPLGTTLFV CKLACINSDE IQICGAEIFV GVAPEQPQNL SCIQKGEQGT VACTWERGRD THLYTEYTLQ LSGPKNLTWQ KQCKDIYCDY LDFGINLTPE SPESNFTAKV TAVNSLGSSS SLPSTFTFLD IVRPLPPWDI RIKFQKASVS RCTLYWRDEG LVLLNRLRYR PSNSRLWNMV NVTKAKGRHD LLDLKPFTEY EFQISSKLHL YKGSWSDWSE SLRAQTPEEE PTG; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号５６ － ノブ変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２ Ｐ４０－非開裂可能リンカー－ＩＬ－１２Ｒβ１フラグメント
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYASTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGAGGG GSGGGGSGGG GSIWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCSGG GGSGGGGSGG GGSRTSECCF QDPPYPDADS GSASGPRDLR CYRISSDRYE CSWQYEGPTA GVSHFLRCCL SSGRCCYFAA GSATRLQFSD QAGVSVLYTV TLWVESWARN QTEKSPEVTL QLYNSVKYEP PLGDIKVSKL AGQLRMEWET PDNQVGAEVQ FRHRTPSSPW KLGDCGPQDD DTESCLCPLE MNVAQEFQLR RRQLGSQGSS WSKWSSPVCV PPENPPQPQV RFSVEQLGQD GRRRLTLKEQ PTQLELPEGC QGLAPGTEVT YRLQLHMLSC PCKAKATRTL HLGKMPYLSG AAYNVAVISS NQFGPGLNQT WHIPA
配列番号５７ － ノブ変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２ Ｐ４０－開裂可能リンカー－ＩＬ－１２Ｒβ１フラグメント
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYASTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGAGGG GSGGGGSGGG GSIWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCSGG GGSGGGGSTG RGPSWVGGGG SGGGSRTSEC CFQDPPYPDA DSGSASGPRD LRCYRISSDR YECSWQYEGP TAGVSHFLRC CLSSGRCCYF AAGSATRLQF SDQAGVSVLY TVTLWVESWA RNQTEKSPEV TLQLYNSVKY EPPLGDIKVS KLAGQLRMEW ETPDNQVGAE VQFRHRTPSS PWKLGDCGPQ DDDTESCLCP LEMNVAQEFQ LRRRQLGSQG SSWSKWSSPV CVPPENPPQP QVRFSVEQLG QDGRRRLTLK EQPTQLELPE GCQGLAPGTE VTYRLQLHML SCPCKAKATR TLHLGKMPYL SGAAYNVAVI SSNQFGPGLN QTWHIPA
配列番号５８ － ノブ変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２ Ｐ４０－開裂可能リンカー－ｓｃＦｖ
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYASTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGAGGG GSGGGGSGGG GSIWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCSGG GGSGGGGSTG RGPSWVGGGG SGGGSEVQLV QSGAEVKKPG ESLKISCKGS GYSFTTYWLG WVRQMPGKGL DWIGIMSPVD SDIRYSPSFQ GQVTMSVDKS ITTAYLQWNS LKASDTAMYY CARRRPGQGY FDFWGQGTLV TVSSGGGGSG GGGSGGGGSD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRASQGISS WLAWYQQKPE KAPKSLIYAA SSLQSGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQY NIYPYTFGQG TKLEIK
配列番号５９ － ノブ変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２ Ｐ４０－開裂可能リンカー－ｓｃＦｖ
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYASTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGAGGG GSGGGGSGGG GSIWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCSGG GGSGGGGSTG RGPSWVGGGG SGGGSDIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCRA SQGISSWLAW YQQKPEKAPK SLIYAASSLQ SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYCQQYNIYP YTFGQGTKLE IKGGGGSGGG GSGGGGSEVQ LVQSGAEVKK PGESLKISCK GSGYSFTTYW LGWVRQMPGK GLDWIGIMSP VDSDIRYSPS FQGQVTMSVD KSITTAYLQW NSLKASDTAM YYCARRRPGQ GYFDFWGQGT LVTVSS
配列番号６０ － ホール変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２ Ｐ４０－リンカー－ＩＬ－１２Ｒβ２フラグメント
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSGGGG SIWELKKDVY VVELDWYPDA PGEMVVLTCD TPEEDGITWT LDQSSEVLGS GKTLTIQVKE FGDAGQYTCH KGGEVLSHSL LLLHKKEDGI WSTDILKDQK EPKNKTFLRC EAKNYSGRFT CWWLTTISTD LTFSVKSSRG SSDPQGVTCG AATLSAERVR GDNKEYEYSV ECQEDSACPA AEESLPIEVM VDAVHKLKYE NYTSSFFIRD IIKPDPPKNL QLKPLKNSRQ VEVSWEYPDT WSTPHSYFSL TFCVQVQGKS KREKKDRVFT DKTSATVICR KNASISVRAQ DRYYSSSWSE WASVPCS(GG GGS)n1 VHMP LGFLGPRQAR VVN(GGGGS) n2KIDACKRG DVTVKPSHVI LLGSTVNITC SLKPRQGCFH YSRRNKLILY KFDRRINFHH GHSLNSQVTG LPLGTTLFVC KLACINSDEI QICGAEIFVG VAPEQPQNLS CIQKGEQGTV ACTWERGRDT HLYTEYTLQL SGPKNLTWQK QCKDIYCDYL DFGINLTPES PESNFTAKVT AVNSLGSSSS LPSTFTFLDI VRPLPPWDIR IKFQKASVSR CTLYWRDEGL VLLNRLRYRP SNSRLWNMVN VTKAKGRHDL LDLKPFTEYE FQISSKLHLY KGSWSDWSES LRAQTPEEEP TG; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号６１ － ノブ変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２ Ｐ３５－非開裂可能リンカー－ＩＬ－１２Ｒβ１フラグメント
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYASTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGAGGG GSGGGGSGGG GSRNLPVATP DPGMFPCLHH SQNLLRAVSN MLQKARQTLE FYPCTSEEID HEDITKDKTS TVEACLPLEL TKNESCLNSR ETSFITNGSC LASRKTSFMM ALCLSSIYED LKMYQVEFKT MNAKLLMDPK RQIFLDQNML AVIDELMQAL NFNSETVPQK SSLEEPDFYK TKIKLCILLH AFRIRAVTID RVMSYLNASG GGGSGGGGSG GGGSRTSECC FQDPPYPDAD SGSASGPRDL RCYRISSDRY ECSWQYEGPT AGVSHFLRCC LSSGRCCYFA AGSATRLQFS DQAGVSVLYT VTLWVESWAR NQTEKSPEVT LQLYNSVKYE PPLGDIKVSK LAGQLRMEWE TPDNQVGAEV QFRHRTPSSP WKLGDCGPQD DDTESCLCPL EMNVAQEFQL RRRQLGSQGS SWSKWSSPVC VPPENPPQPQ VRFSVEQLGQ DGRRRLTLKE QPTQLELPEG CQGLAPGTEV TYRLQLHMLS CPCKAKATRT LHLGKMPYLS GAAYNVAVIS SNQFGPGLNQ TWHIPA
配列番号６２ － ノブ変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２ Ｐ３５－開裂可能リンカー－ＩＬ－１２Ｒβ１フラグメント
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYASTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGAGGG GSGGGGSGGG GSRNLPVATP DPGMFPCLHH SQNLLRAVSN MLQKARQTLE FYPCTSEEID HEDITKDKTS TVEACLPLEL TKNESCLNSR ETSFITNGSC LASRKTSFMM ALCLSSIYED LKMYQVEFKT MNAKLLMDPK RQIFLDQNML AVIDELMQAL NFNSETVPQK SSLEEPDFYK TKIKLCILLH AFRIRAVTID RVMSYLNASG GGGSGGGGST GRGPSWVGGG GSGGGSRTSE CCFQDPPYPD ADSGSASGPR DLRCYRISSD RYECSWQYEG PTAGVSHFLR CCLSSGRCCY FAAGSATRLQ FSDQAGVSVL YTVTLWVESW ARNQTEKSPE VTLQLYNSVK YEPPLGDIKV SKLAGQLRME WETPDNQVGA EVQFRHRTPS SPWKLGDCGP QDDDTESCLC PLEMNVAQEF QLRRRQLGSQ GSSWSKWSSP VCVPPENPPQ PQVRFSVEQL GQDGRRRLTL KEQPTQLELP EGCQGLAPGT EVTYRLQLHM LSCPCKAKAT RTLHLGKMPY LSGAAYNVAV ISSNQFGPGL NQTWHIPA
配列番号６３ － ノブ変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２ Ｐ３５－開裂可能リンカー－ｓｃＦｖ
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYASTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGAGGG GSGGGGSGGG GSRNLPVATP DPGMFPCLHH SQNLLRAVSN MLQKARQTLE FYPCTSEEID HEDITKDKTS TVEACLPLEL TKNESCLNSR ETSFITNGSC LASRKTSFMM ALCLSSIYED LKMYQVEFKT MNAKLLMDPK RQIFLDQNML AVIDELMQAL NFNSETVPQK SSLEEPDFYK TKIKLCILLH AFRIRAVTID RVMSYLNASG GGGSGGGGST GRGPSWVGGG GSGGGSEVQL VQSGAEVKKP GESLKISCKG SGYSFTTYWL GWVRQMPGKG LDWIGIMSPV DSDIRYSPSF QGQVTMSVDK SITTAYLQWN SLKASDTAMY YCARRRPGQG YFDFWGQGTL VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SWLAWYQQKP EKAPKSLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNIYPYTFGQ GTKLEIK
配列番号６４ － ノブ変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２ Ｐ３５－開裂可能リンカー－ｓｃＦｖ
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYASTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGAGGG GSGGGGSGGG GSRNLPVATP DPGMFPCLHH SQNLLRAVSN MLQKARQTLE FYPCTSEEID HEDITKDKTS TVEACLPLEL TKNESCLNSR ETSFITNGSC LASRKTSFMM ALCLSSIYED LKMYQVEFKT MNAKLLMDPK RQIFLDQNML AVIDELMQAL NFNSETVPQK SSLEEPDFYK TKIKLCILLH AFRIRAVTID RVMSYLNASG GGGSGGGGST GRGPSWVGGG GSGGGSDIQM TQSPSSLSAS VGDRVTITCR ASQGISSWLA WYQQKPEKAP KSLIYAASSL QSGVPSRFSG SGSGTDFTLT ISSLQPEDFA TYYCQQYNIY PYTFGQGTKL EIKGGGGSGG GGSGGGGSEV QLVQSGAEVK KPGESLKISC KGSGYSFTTY WLGWVRQMPG KGLDWIGIMS PVDSDIRYSP SFQGQVTMSV DKSITTAYLQ WNSLKASDTA MYYCARRRPG QGYFDFWGQG TLVTVSS
配列番号６５ － Ｆｃ－ノブ変異を有するＩＬ－１２(Ｐ３５－Ｐ４０)
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYASTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPCRDELTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGA(GG GGS)n1RNLP VATPDPGMFP CLHHSQNLLR AVSNMLQKAR QTLEFYPCTS EEIDHEDITK DKTSTVEACL PLELTKNESC LNSRETSFIT NGSCLASRKT SFMMALCLSS IYEDLKMYQV EFKTMNAKLL MDPKRQIFLD QNMLAVIDEL MQALNFNSET VPQKSSLEEP DFYKTKIKLC ILLHAFRIRA VTIDRVMSYL NAS(GGGGS) n2IWELKKDV YVVELDWYPD APGEMVVLTC DTPEEDGITW TLDQSSEVLG SGKTLTIQVK EFGDAGQYTC HKGGEVLSHS LLLLHKKEDG IWSTDILKDQ KEPKNKTFLR CEAKNYSGRF TCWWLTTIST DLTFSVKSSR GSSDPQGVTC GAATLSAERV RGDNKEYEYS VECQEDSACP AAEESLPIEV MVDAVHKLKY ENYTSSFFIR DIIKPDPPKN LQLKPLKNSR QVEVSWEYPD TWSTPHSYFS LTFCVQVQGK SKREKKDRVF TDKTSATVIC RKNASISVRA QDRYYSSSWS EWASVPCS;ここで、ｎ１＝２、３、４または５；ここで、ｎ２＝２、３、４または５。
配列番号６６ － ホール変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２／ＩＬ－１２Ｒβ１－Ｄ１Ｄ２
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSGGGS KIDACKRGDV TVKPSHVILL GSTVNITCSL KPRQGCFHYS RRNKLILYKF DRRINFHHGH SLNSQVTGLP LGTTLFVCKL ACINSDEIQI CGAEIFVGVA PEQPQNLSCI QKGEQGTVAC TWERGRDTHL YTEYTLQLSG PKNLTWQKQC KDIYCDYLDF GINLTPESPE SNFTAKVTAV NSLGSSSSLP STFTFLDI(G GGGS)n1 VHM PLGFLGPRQA RVVN(GGGGS)n2RTSECCF QDPPYPDADS GSASGPRDLR CYRISSDRYE CSWQYEGPTA GVSHFLRCCL SSGRCCYFAA GSATRLQFSD QAGVSVLYTV TLWVESWARN QTEKSPEVTL QLYNSVKYEP PLGDIKVSKL AGQLRMEWET PDNQVGAEVQ FRHRTPSSPW KLGDCGPQDD DTESCLCPLE MNVAQEFQLR RRQLGSQGSS WSKWSSPVCV PPE;ここで、ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号６７ － ホール変異を有するＦｃ ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３／ＩＬ－１２Ｒβ１－Ｄ１Ｄ２Ｄ３
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSGGGS KIDACKRGDV TVKPSHVILL GSTVNITCSL KPRQGCFHYS RRNKLILYKF DRRINFHHGH SLNSQVTGLP LGTTLFVCKL ACINSDEIQI CGAEIFVGVA PEQPQNLSCI QKGEQGTVAC TWERGRDTHL YTEYTLQLSG PKNLTWQKQC KDIYCDYLDF GINLTPESPE SNFTAKVTAV NSLGSSSSLP STFTFLDIVR PLPPWDIRIK FQKASVSRCT LYWRDEGLVL LNRLRYRPSN SRLWNMVNVT KAKGRHDLLD LKPFTEYEFQ ISSKLHLYKG SWSDWSESLR AQTPEEEPTG (GGGGS)n1 V HMPLGFLGPR QARVVN(GGG GS)n2RTSEC CFQDPPYPDA DSGSASGPRD LRCYRISSDR YECSWQYEGP TAGVSHFLRC CLSSGRCCYF AAGSATRLQF SDQAGVSVLY TVTLWVESWA RNQTEKSPEV TLQLYNSVKY EPPLGDIKVS KLAGQLRMEW ETPDNQVGAE VQFRHRTPSS PWKLGDCGPQ DDDTESCLCP LEMNVAQEFQ LRRRQLGSQG SSWSKWSSPV CVPPENPPQP QVRFSVEQLG QDGRRRLTLK EQPTQLELPE GCQGLAPGTE VTYRLQLHML SCPCKAKATR TLHLGKMPYL SGAAYNVAVI SSNQFGPGLN QTWHIPA; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号６８ － ホール変異を有するＦｃ－ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２／ＩＬ－１２Ｒβ１－Ｄ１Ｄ２
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSTGRG PSWVGGGGSG GGSKIDACKR GDVTVKPSHV ILLGSTVNIT CSLKPRQGCF HYSRRNKLIL YKFDRRINFH HGHSLNSQVT GLPLGTTLFV CKLACINSDE IQICGAEIFV GVAPEQPQNL SCIQKGEQGT VACTWERGRD THLYTEYTLQ LSGPKNLTWQ KQCKDIYCDY LDFGINLTPE SPESNFTAKV TAVNSLGSSS SLPSTFTFLD I(GGGGS)n1 VHMPLGFLGP RQARVVN(GG GGS)n2RTSE CCFQDPPYPD ADSGSASGPR DLRCYRISSD RYECSWQYEG PTAGVSHFLR CCLSSGRCCY FAAGSATRLQ FSDQAGVSVL YTVTLWVESW ARNQTEKSPE VTLQLYNSVK YEPPLGDIKV SKLAGQLRME WETPDNQVGA EVQFRHRTPS SPWKLGDCGP QDDDTESCLC PLEMNVAQEF QLRRRQLGSQ GSSWSKWSSP VCVPPE; ここで、ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号６９ － ホール変異を有するＦｃ ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３／ＩＬ－１２Ｒβ１－Ｄ１Ｄ２Ｄ３
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSTGRG PSWVGGGGSG GGSKIDACKR GDVTVKPSHV ILLGSTVNIT CSLKPRQGCF HYSRRNKLIL YKFDRRINFH HGHSLNSQVT GLPLGTTLFV CKLACINSDE IQICGAEIFV GVAPEQPQNL SCIQKGEQGT VACTWERGRD THLYTEYTLQ LSGPKNLTWQ KQCKDIYCDY LDFGINLTPE SPESNFTAKV TAVNSLGSSS SLPSTFTFLD IVRPLPPWDI RIKFQKASVS RCTLYWRDEG LVLLNRLRYR PSNSRLWNMV NVTKAKGRHD LLDLKPFTEY EFQISSKLHL YKGSWSDWSE SLRAQTPEEE PTG(GGGGS) n1 VHMPLGFL GPRQARVVN(GGGGS)n2RT SECCFQDPPY PDADSGSASG PRDLRCYRIS SDRYECSWQY EGPTAGVSHF LRCCLSSGRC CYFAAGSATR LQFSDQAGVS VLYTVTLWVE SWARNQTEKS PEVTLQLYNS VKYEPPLGDI KVSKLAGQLR MEWETPDNQV GAEVQFRHRT PSSPWKLGDC GPQDDDTESC LCPLEMNVAQ EFQLRRRQLG SQGSSWSKWS SPVCVPPENP PQPQVRFSVE QLGQDGRRRL TLKEQPTQLE LPEGCQGLAP GTEVTYRLQL HMLSCPCKAK ATRTLHLGKM PYLSGAAYNV AVISSNQFGP GLNQTWHIPA; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号７０ － ホール変異を有するＦｃ ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３／ ｓｃＦｖ
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSGGGS KIDACKRGDV TVKPSHVILL GSTVNITCSL KPRQGCFHYS RRNKLILYKF DRRINFHHGH SLNSQVTGLP LGTTLFVCKL ACINSDEIQI CGAEIFVGVA PEQPQNLSCI QKGEQGTVAC TWERGRDTHL YTEYTLQLSG PKNLTWQKQC KDIYCDYLDF GINLTPESPE SNFTAKVTAV NSLGSSSSLP STFTFLDIVR PLPPWDIRIK FQKASVSRCT LYWRDEGLVL LNRLRYRPSN SRLWNMVNVT KAKGRHDLLD LKPFTEYEFQ ISSKLHLYKG SWSDWSESLR AQTPEEEPTG (GGGGS)n1 V HMPLGFLGPR QARVVN(GGG GS)n2DIQMT QSPSSLSASV GDRVTITCRA SQGISSWLAW YQQKPEKAPK SLIYAASSLQ SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YYCQQYNIYP YTFGQGTKLE IKGGGGSGGG GSGGGGSEVQ LVQSGAEVKK PGESLKISCK GSGYSFTTYW LGWVRQMPGK GLDWIGIMSP VDSDIRYSPS FQGQVTMSVD KSITTAYLQW NSLKASDTAM YYCARRRPGQ GYFDFWGQGT LVTVSS; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号７１ － ホール変異を有するＦｃ ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３／ｓｃＦｖ
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSTGRG PSWVGGGGSG GGSKIDACKR GDVTVKPSHV ILLGSTVNIT CSLKPRQGCF HYSRRNKLIL YKFDRRINFH HGHSLNSQVT GLPLGTTLFV CKLACINSDE IQICGAEIFV GVAPEQPQNL SCIQKGEQGT VACTWERGRD THLYTEYTLQ LSGPKNLTWQ KQCKDIYCDY LDFGINLTPE SPESNFTAKV TAVNSLGSSS SLPSTFTFLD IVRPLPPWDI RIKFQKASVS RCTLYWRDEG LVLLNRLRYR PSNSRLWNMV NVTKAKGRHD LLDLKPFTEY EFQISSKLHL YKGSWSDWSE SLRAQTPEEE PTG(GGGGS) n1 VHMPLGFL GPRQARVVN(GGGGS)n2DI QMTQSPSSLS ASVGDRVTIT CRASQGISSW LAWYQQKPEK APKSLIYAAS SLQSGVPSRF SGSGSGTDFT LTISSLQPED FATYYCQQYN IYPYTFGQGT KLEIKGGGGS GGGGSGGGGS EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT TYWLGWVRQM PGKGLDWIGI MSPVDSDIRY SPSFQGQVTM SVDKSITTAY LQWNSLKASD TAMYYCARRR PGQGYFDFWG QGTLVTVSS; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号７２ － ホール変異を有するＦｃ ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３ ｓｃＦｖ
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSGGGS KIDACKRGDV TVKPSHVILL GSTVNITCSL KPRQGCFHYS RRNKLILYKF DRRINFHHGH SLNSQVTGLP LGTTLFVCKL ACINSDEIQI CGAEIFVGVA PEQPQNLSCI QKGEQGTVAC TWERGRDTHL YTEYTLQLSG PKNLTWQKQC KDIYCDYLDF GINLTPESPE SNFTAKVTAV NSLGSSSSLP STFTFLDIVR PLPPWDIRIK FQKASVSRCT LYWRDEGLVL LNRLRYRPSN SRLWNMVNVT KAKGRHDLLD LKPFTEYEFQ ISSKLHLYKG SWSDWSESLR AQTPEEEPTG (GGGGS)n1 V HMPLGFLGPR QARVVN(GGG GS)n2EVQLV QSGAEVKKPG ESLKISCKGS GYSFTTYWLG WVRQMPGKGL DWIGIMSPVD SDIRYSPSFQ GQVTMSVDKS ITTAYLQWNS LKASDTAMYY CARRRPGQGY FDFWGQGTLV TVSSGGGGSG GGGSGGGGSD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRASQGISS WLAWYQQKPE KAPKSLIYAA SSLQSGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCQQY NIYPYTFGQG TKLEIK; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号７３ － ホール変異を有するＦｃ ＩＬ－１２Ｒβ２－Ｄ１Ｄ２Ｄ３／ｓｃＦｖ
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGGGGG SGGGGSTGRG PSWVGGGGSG GGSKIDACKR GDVTVKPSHV ILLGSTVNIT CSLKPRQGCF HYSRRNKLIL YKFDRRINFH HGHSLNSQVT GLPLGTTLFV CKLACINSDE IQICGAEIFV GVAPEQPQNL SCIQKGEQGT VACTWERGRD THLYTEYTLQ LSGPKNLTWQ KQCKDIYCDY LDFGINLTPE SPESNFTAKV TAVNSLGSSS SLPSTFTFLD IVRPLPPWDI RIKFQKASVS RCTLYWRDEG LVLLNRLRYR PSNSRLWNMV NVTKAKGRHD LLDLKPFTEY EFQISSKLHL YKGSWSDWSE SLRAQTPEEE PTG(GGGGS) n1 VHMPLGFL GPRQARVVN(GGGGS)n2EV QLVQSGAEVK KPGESLKISC KGSGYSFTTY WLGWVRQMPG KGLDWIGIMS PVDSDIRYSP SFQGQVTMSV DKSITTAYLQ WNSLKASDTA MYYCARRRPG QGYFDFWGQG TLVTVSSGGG GSGGGGSGGG GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSWLAWYQQ KPEKAPKSLI YAASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYNIYPYTF GQGTKLEIK; ｎ１＝１、２、３または４およびｎ２＝１、２、３または４。
配列番号７４ － ＩＬ－２アゴニストポリペプチド
APXaa3SSSTKKT QLQLEHLLL Xaa20 LQMILNGINN YKNPKLTRML TXaa42KFXaa45MPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NXaa72Xaa73QSKNFHL RPRDLISXaa88IXaa90 VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFXaa125Xaa126SIIS TLT
ここで、Ｘａａ３はＮまたはＡであり；ここで、Ｘａａ１２５はＣまたはＳであり；ここで、Ｘａａ２０はＤ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＶおよびＹから選択され；ここで、Ｘａａ４２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｄ、ＲおよびＫから選択され；ここで、Ｘａａ４５はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｄ、ＲおよびＫから選択され；ここで、Ｘａａ７２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｄ、ＲおよびＫから選択され；ここで、Ｘａａ７３はＡであり；ここで、Ｘａａ８８はＮ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；ここで、Ｘａａ９０はＮまたはＴであり；ここで、Ｘａａ１２６はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択され；ここで、Ｘａａ２０、Ｘａａ８８、Ｘａａ９０およびＸａａ１２６の少なくとも１個は変異される。
配列番号７５ － ＩＬ－２アゴニストポリペプチド
APXaa3SSSTKKT QLQLEHLLL Xaa20 LQMILNGINN YKNPKLTXaa38ML TXaa42KFXaa45MPKKA TELKHLQCLE EXaa62LKPLEXaa68VL NLXaa73QSKNFHL RPRDLISXaa88IXaa90 VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFXaa125Xaa126SIIS TLT
ここで、Ｘａａ３はＮまたはＡであり；ここで、Ｘａａ１２５はＣまたはＳであり；ここで、Ｘａａ２０はＤ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＶおよびＹから選択され；ここで、Ｘａａ３８はＡ、ＫおよびＳから選択され；ここで、Ｘａａ４２はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｄ、ＲおよびＫから選択され；ここで、Ｘａａ４５はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｄ、ＲおよびＫから選択され；ここで、Ｘａａ６２はＥ、Ｌ、ＡおよびＩから選択され；ここで、Ｘａａ６８はＥまたはＶから選択され；ここで、Ｘａａ７３はＡまたはＴであり；ここで、Ｘａａ８８はＮ、Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹから選択され；ここで、Ｘａａ９０はＮまたはＴであり；ここで、Ｘａａ１２６はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、ＷおよびＹから選択され；ここで、Ｘａａ２０、Ｘａａ８８、Ｘａａ９０およびＸａａ１２６の少なくとも１個は変異される。
配列番号７６ － ＩＬ－１２に結合するｓｃＦｖ－ＶＨ－ＶＬ－２リンカー
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKGGG GSGGGGSGPL GVRGGGGSEV QLVQSGAEVK KPGESLKISC KGSGYSFTTY WLGWVRQMPG KGLDWIGIMS PVDSDIRYSP SFQGQVTMSV DKSITTAYLQ WNSLKASDTA MYYCARRRPG QGYFDFWGQG TLVTVSSGGG GSGGGGSDIQ MTQSPSSLSA SVGDRVTITC RASQGISSWL AWYQQKPEKA PKSLIYAASS LQSGVPSRFS GSGSGTDFTL TISSLQPEDF ATYYCQQYNI YPYTFGQGTK LEIK
配列番号７７ － ＩＬ－１２に結合するｓｃＦｖ－ＶＨ－ＶＬ－３リンカー
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKGGG GSGGGGSGPL GVRGGGGSEV QLVQSGAEVK KPGESLKISC KGSGYSFTTY WLGWVRQMPG KGLDWIGIMS PVDSDIRYSP SFQGQVTMSV DKSITTAYLQ WNSLKASDTA MYYCARRRPG QGYFDFWGQG TLVTVSSGGG GSGGGGSGGG GSDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSWLAWYQQ KPEKAPKSLI YAASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYNIYPYTF GQGTKLEIK
配列番号７８ － ＩＬ－１２に結合するｓｃＦｖ－ＶＬ－ＶＨ－３リンカー
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKGGG GSGGGGSGPL GVRGGGGSDI QMTQSPSSLS ASVGDRVTIT CRASQGISSW LAWYQQKPEK APKSLIYAAS SLQSGVPSRF SGSGSGTDFT LTISSLQPED FATYYCQQYN IYPYTFGQGT KLEIKGGGGS GGGGSGGGGS EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT TYWLGWVRQM PGKGLDWIGI MSPVDSDIRY SPSFQGQVTM SVDKSITTAY LQWNSLKASD TAMYYCARRR PGQGYFDFWG QGTLVTVSS
配列番号７９ － ＩＬ－１２に結合するｓｃＦｖ－ＶＬ－ＶＨ－４リンカー
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVCT LPPSRDELTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKGGG GSGGGGSGPL GVRGGGGSDI QMTQSPSSLS ASVGDRVTIT CRASQGISSW LAWYQQKPEK APKSLIYAAS SLQSGVPSRF SGSGSGTDFT LTISSLQPED FATYYCQQYN IYPYTFGQGT KLEIKGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSEVQLV QSGAEVKKPG ESLKISCKGS GYSFTTYWLG WVRQMPGKGL DWIGIMSPVD SDIRYSPSFQ GQVTMSVDKS ITTAYLQWNS LKASDTAMYY CARRRPGQGY FDFWGQGTLV TVSS
配列番号８０ － Ｇ４Ｓ４リンカー
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS

Claims (49)

  1. ＩＬ－１２サイトカイン部分、マスキング部分(Ｍ)、二量体担体部分(Ｃ)および少なくとも１個のペプチドリンカーを含むヘテロ二量体プロドラッグであって、
    ｉ)ＩＬ－１２サイトカイン部分がＩＬ－１２ ｐ４０サブユニット(ｐ４０)およびＩＬ－１２ ｐ３５サブユニット(ｐ３５)を含み；
    ii)マスキング部分がＩＬ－１２サイトカイン部分に結合し、ＩＬ－１２サイトカイン部分の生物学的活性を阻害し；そして
    iii)マスキング部分が、所望によりペプチドリンカーを介して二量体担体部分の一方のポリペプチド鎖に融合し、ＩＬ－１２サイトカイン部分が所望によりペプチドリンカーを介して担体部分の他方のポリペプチド鎖に融合するか、または
    ｐ４０サブユニットが、所望によりペプチドリンカーを介して担体部分の一方のポリペプチド鎖に融合し、ｐ３５サブユニットが所望によりペプチドリンカーを介して担体部分の他方のポリペプチド鎖に融合しおよびマスキング部分が所望によりペプチドリンカーを介してｐ４０サブユニットまたはｐ３５サブユニットのＣ末端に融合するものである、
    プロドラッグ。
  2. 該少なくとも１個のペプチドリンカーが開裂可能ペプチドリンカーである、請求項１のプロドラッグ。
  3. 該少なくとも１個のペプチドリンカーが非開裂可能ペプチドリンカーである、請求項１または２のプロドラッグ。
  4. 該マスキング部分が所望により開裂可能ペプチドリンカーを介して担体部分またはＩＬ－１２ ｐ４０もしくはｐ３５サブユニットに融合する第一マスキング部分(ＭＭ１)である、請求項１～３の何れかのプロドラッグ。
  5. 該第一マスキング部分(ＭＭ１)がＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットに結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２受容体β１(ＩＬ－１２Ｒβ１)への結合を低減または阻害する、請求項４のプロドラッグ。
  6. 該第一マスキング部分ｉがＩＬ－１２受容体β１の細胞外ドメイン(ＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤ)またはそのフラグメント、ｐ４０結合ペプチドおよびｐ４０に結合する抗体の一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)またはＦａｂドメインから選択される、請求項４または５のプロドラッグ。
  7. 該第一マスキング部分がｐ４０に結合する抗体のｓｃＦｖまたはＦａｂドメインである、請求項４～６の何れかのプロドラッグ。
  8. 該第一マスキング部分がｐ４０に結合するｓｃＦｖを含み、ここで、ｓｃＦｖが配列番号７～１１および１２の一つに少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７のプロドラッグ。
  9. 該プロドラッグが、さらに、所望により開裂可能ペプチドリンカーを介して担体部分またはＩＬ－１２ ｐ４０もしくはｐ３５サブユニットに融合した、第二マスキング部分(ＭＭ２)を含む、請求項１～８の何れかのプロドラッグ。
  10. 該第二マスキング部分(ＭＭ２)がｐ３５および／またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２への結合を阻害する、請求項９のプロドラッグ。
  11. 該第二マスキング部分が、ＩＬ－１２受容体β２の細胞外ドメイン(ＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤ)またはそのフラグメント、ｐ３５またはペプチドライプラリーのスクリーニングにより発見されたｐ４０結合ペプチドおよびｐ３５またはｐ４０に結合し、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２への結合を低減または阻害する抗体の一本鎖ＦｖまたはＦａｂドメインから選択される、請求項９または１０のプロドラッグ。
  12. 該第二マスキング部分がＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤまたはそのフラグメントを含み、ここで、ＩＬ－１２Ｒβ２ ＥＣＤまたはそのフラグメントが配列番号１７、１８または１９に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９～１１の何れかのプロドラッグ。
  13. 該第二マスキング部分がｐ４０に結合する抗体の一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)またはＦａｂドメインを含み、ＩＬ－１２のＩＬ－１２Ｒβ２への結合を低減または阻害し；ここで、Ｆａｂの該ｓｃＦｖが、ＩＬ－１２抗体ＰＭＡ２０４、抗体１、抗体５０、抗体６８、抗体８０または抗体１３６に由来するのと同じ軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含む、請求項９～１１の何れかのプロドラッグ。
  14. 該担体部分がＦｃドメインおよび抗体から選択される、請求項１～１３の何れかのプロドラッグ。
  15. 該担体部分が第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖が、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む、請求項１４のプロドラッグ：
    ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－ＢおよびＦ２－ＣＬ１－ＭＭ２－ＣＬ２－ＭＭ１；および
    ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－ＡおよびＦ２－ＣＬ１－ＭＭ１－ＣＬ２－ＭＭ２；
    ここで、Ｆ１およびＦ２がＦｃドメインの第一および第二ポリペプチド鎖であり；ＰＬ１およびＰＬ２がペプチドリンカーであり；ＣＬ１およびＣＬ２が開裂可能ペプチドリンカーであり；ＡがＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢがＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
  16. 該担体部分が第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖が次のペアから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む、請求項１４のプロドラッグ：
    ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－ＢおよびＦ２－ＰＬ３－ＭＭ２－ＣＬ－ＭＭ１；および
    ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－ＡおよびＦ２－ＰＬ３－ＭＭ１－ＣＬ－ＭＭ２；
    ここで、Ｆ１およびＦ２がＦｃドメインの第一および第二ポリペプチド鎖であり；ＰＬ１、ＰＬ２およびＰＬ３がペプチドリンカーであり；ＣＬが開裂可能ペプチドリンカーであり；ＡがＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢがＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
  17. 該担体部分が第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ここで、プロドラッグのポリペプチド鎖が、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む、請求項１４のプロドラッグ：
    ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＣＬ１－ＭＭ２およびＦ２－ＰＬ２－Ｂ－ＣＬ２－ＭＭ１；および
    ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＣＬ１－ＭＭ１およびＦ２－ＰＬ２－Ｂ－ＣＬ２－ＭＭ２；
    ここで、Ｆ１およびＦ２がＦｃドメインの第一および第二ポリペプチド鎖であり；ＰＬ１およびＰＬ２がペプチドリンカーであり；ＣＬ１およびＣＬ２が開裂可能ペプチドリンカーであり；ＡがＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢがＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
  18. 該担体部分が第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ここで、ポリペプチド鎖が、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む、請求項１４のプロドラッグ：
    ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＣＬ－ＭＭ２およびＦ２－ＰＬ２－Ｂ－ＰＬ３－ＭＭ１；および
    ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－ＭＭ１およびＦ２－ＰＬ３－Ｂ－ＣＬ－ＭＭ２；
    ここで、Ｆ１およびＦ２がＦｃドメインの第一および第二ポリペプチド鎖であり；ＰＬ１、ＰＬ２およびＰＬ３がペプチドリンカーであり；ＣＬが開裂可能ペプチドリンカーであり；ＡがＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢがＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
  19. 該担体部分が第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ここで、ポリペプチド鎖が、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む、請求項１～３の何れかのプロドラッグ：
    ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－ＢおよびＦ２－ＣＬ－Ｍ；および
    ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－ＡおよびＦ２－ＣＬ－Ｍ；
    ここで、Ｆ１およびＦ２がＦｃドメインの第一および第二ポリペプチド鎖であり；ＰＬ１およびＰＬ２がペプチドリンカーであり；ＣＬが開裂可能ペプチドリンカーであり；Ｍが、ｐ４０サブユニットに結合し、ＩＬ－１２の生物学的活性を阻害するマスキング部分であり；ＡがＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢがＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
  20. 該担体部分が第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ここで、ポリペプチド鎖が、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む、請求項１～３の何れかのプロドラッグ：
    ａ. Ｆ１－ＰＬ１－Ａ－ＰＬ２－ＭおよびＦ２－ＰＬ３－Ｂ；および
    ｂ. Ｆ１－ＰＬ１－Ｂ－ＰＬ２－ＡおよびＦ２－ＰＬ３－Ｍ；
    ここで、Ｆ１およびＦ２がＦｃドメインの第一および第二ポリペプチド鎖であり；ＰＬ１、ＰＬ２およびＰＬ３がペプチドリンカーであり；Ｍが、ｐ４０サブユニットに結合し、ＩＬ－１２の生物学的活性を阻害するマスキング部分であり；ＡがＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢがＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットである。
  21. 該担体部分が第一ポリペプチド鎖および第二ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体Ｆｃドメインを含み、ここで、ポリペプチド鎖が、次のペアの一つから選択される分子式(Ｎ末端からＣ末端方向で)を含む、請求項１～３の何れかのプロドラッグ：
    ａ. Ｆ１－ＰＬ１－ＭおよびＦ２－ＰＬ２－Ａ－ＳＳ－Ｂ；および
    ｂ. Ｆ１－ＣＬおよびＦ２－ＰＬ１－Ａ－ＳＳ－Ｂ；
    ここで、Ｆ１およびＦ２がＦｃドメインの第一および第二ポリペプチド鎖であり；ＰＬ１およびＰＬ２がペプチドリンカーであり；Ｍが、ｐ４０サブユニットに結合し、ＩＬ－１２の生物学的活性を阻害するマスキング部分であり；ＡがＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり；そしてＢがＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットであり；そしてＳＳがジスルフィド結合である。
  22. 該マスキング部分がＩＬ－１２Ｒβ１ ＥＣＤまたはそのフラグメント、ペプチドライプラリーのスクリーニングにより発見されたｐ４０結合ペプチドおよびｐ４０に結合する抗体の一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)またはＦａｂドメインから選択される、請求項１９～２１の何れかのプロドラッグ。
  23. 該マスキング部分がｐ４０に結合する抗体のｓｃＦｖまたはＦａｂドメインである、請求項１９～２２の何れかのプロドラッグ。
  24. 該マスキング部分がｐ４０に結合するｓｃＦｖを含み、ここで、ｓｃＦｖが配列番号７～１１および１２に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２３のプロドラッグ。
  25. 該担体が癌細胞の表面に発現する標的に結合する抗体または抗原結合部分である、請求項１～２４の何れかのプロドラッグ。
  26. 該抗体または抗原結合部分が、５Ｔ４、クローディン１８.２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲタイプIII、ＧＰＣ３、ＴＲＯＰ－２、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＣＭＥＴ、ＤＬＬ－３およびＢＣＭＡから選択される抗原に結合する、請求項２５のプロドラッグ。
  27. 該ＩＬ－１２サブユニットｐ４０が、配列番号５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１～２６の何れかのプロドラッグ。
  28. 該ＩＬ－１２サブユニットｐ３５が、配列番号６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１～２７の何れかのプロドラッグ。
  29. 該非開裂可能ペプチドリンカーが配列番号２９～３３から選択されるアミノ酸配列を含み；開裂可能ペプチドリンカーが配列番号３４～５４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２～２８の何れかのプロドラッグ。
  30. 該プロドラッグが２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖が配列番号２０に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖が配列番号２１～２８から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１のプロドラッグ。
  31. 該プロドラッグが２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖が配列番号５５に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖が配列番号５６～５９から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１のプロドラッグ。
  32. 該プロドラッグが２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖が配列番号６０に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖が配列番号６１～６４から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１のプロドラッグ。
  33. 該プロドラッグが２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖が配列番号６５に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして第二ポリペプチド鎖が配列番号６６～７３から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１のプロドラッグ。
  34. 該プロドラッグが２個のポリペプチド鎖を含み、ここで、第一ポリペプチド鎖が配列番号２０に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み；そして該第二ポリペプチド鎖が配列番号７６～７９から選択されるものと少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１のプロドラッグ。
  35. 請求項１～３４の何れかのプロドラッグおよび薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。
  36. 請求項１～３４の何れかのプロドラッグをコードする１以上のポリヌクレオチド。
  37. 請求項３６の１以上のポリヌクレオチドを含む、１以上の発現ベクター。
  38. 請求項３７のベクターを含む、宿主細胞。
  39. ｕＰＡ、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９および／またはマトリプターゼをコードする遺伝子が細胞においてノックアウトされる、請求項３８の宿主細胞。
  40. 請求項１～３４のいずれかのプロドラッグを製造する方法であって、
    請求項３８または３９の宿主細胞をプロドラッグの発現を可能とする条件下で培養し、そして
    プロドラッグを単離する
    ことを含む、方法。
  41. 処置を必要とする患者における癌もしくは感染性疾患を処置するまたは免疫系を刺激する方法であって、治療有効量の請求項３５の医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。
  42. 請求項４１の方法における癌もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激に使用するための、請求項１～３４の何れかのプロドラッグ。
  43. 請求項４１の方法における癌もしくは感染性疾患の処置または免疫系の刺激のための医薬の製造における、請求項１～３４の何れかのプロドラッグの使用。
  44. 該癌が脳癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、結腸直腸癌および胃癌からなる群から選択される、請求項４１の方法、請求項４２のプロドラッグまたは請求項４３の使用。
  45. 癌を処置する方法であって、
    それを必要とする癌患者に請求項３５の医薬組成物を第二医薬組成物と組み合わせて投与することを含み、
    ここで、第二医薬組成物がＩＬ－１２以外のサイトカインまたはその融合分子、ＰＤ－１に対する抗体、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体、ＣＴＬＡ－４に対する抗体、ＣＤ４７に対する抗体、ＰＤ－１抗体－ＩＬ－２融合分子、ＰＤ－１－ＩＬ－７融合分子、ＰＤ－１抗体－ＩＬ－１５融合分子およびＰＤ－１－ＩＬ－２１融合分子から選択される活性成分を含むものである、
    方法。
  46. 請求項４５の方法における癌の処置に使用するための、請求項１～３４の何れかのプロドラッグ。
  47. 請求項４５の方法における癌の処置のための医薬の製造のための、請求項１～３４の何れかのプロドラッグの使用。
  48. 該癌が神経膠芽腫(ＧＢＭ)、結腸癌、小細胞肺癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、肝臓癌、トリプルネガティブ乳癌および多発性骨髄腫から選択される、請求項４５の方法、請求項４６のプロドラッグまたは請求項４７の使用。
  49. 請求項１～３４の何れかのプロドラッグ、薬学的に許容される添加物ならびにＩＬ－１２以外のサイトカインまたはそれからの誘導体、ＰＤ－１に対する抗体、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体、ＣＴＬＡ－４に対する抗体、ＣＤ４７に対する抗体、ＰＤ－１抗体－ＩＬ－１５融合分子、ＰＤ－１－ＩＬ－２融合分子およびＰＤ－１－ＩＬ－２１融合分子から選択される第二活性成分を含む、医薬組成物。
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