JP2022546302A - ダンベル型ｄｎａベクターを作出するための方法 - Google Patents

Abstract

ダンベル型ＤＮＡ最小ベクターは、対象の遺伝子発現カセットおよび末端閉鎖ループ構造のみから構成される遺伝子ベクターである。小型ヘアピンＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ発現のためのダンベルベクターは極めて小型のサイズであり、それは、細胞送達および核拡散に関して有利である。小型ＲＮＡ発現ダンベルベクターを作出するための従来のストラテジーは、後にダンベル保護に使用されるそれぞれのプラスミドベクターのクローニングを要する。本明細書において、本発明者らは、小型ＲＮＡ発現ダンベルベクターを作出するための新規のクローニングフリーの方法を提示し、それはまた、いかなる制限エンドヌクレアーゼも要しない。方法は、対象の配列のセンスまたはアンチセンス鎖を含有するプライマーを使用したユニバーサルＤＮＡ鋳型のＰＣＲ増幅、増幅産物を変性およびリフォールディングしてステム－ループ構造を形成するステップ、ならびにＤＮＡリガーゼを使用して構造を共有結合的に閉じてダンベル構造を得るステップを含む。

Description

本開示は、宿主細胞に組み換えＤＮＡおよびＲＮＡを送達するためのダンベル型ＤＮＡベクターの低コストで効率的な合成を可能にする、新規のユニバーサル鋳型支援によるクローニングフリーの方法に関する。

遺伝性および後天性の遺伝性疾患の遺伝子療法、遺伝子ワクチン接種、幹細胞プログラミング、体細胞リプログラミング、免疫療法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性ゲノム編集、およびインビボでのタンパク質発現の操作等の方法の効率は、ノンコーディングＲＮＡまたはタンパク質の発現を誘発するための、エクスビボまたはインビボにおける初代細胞への組み換えＤＮＡの送達に依存している。

初代細胞において、組み換え外来エピソーム性ＤＮＡ（プラスミド等）の発現は、送達の経路とは無関係に、送達後２４時間以内にサイレンスされる。この効果の根底にあるメカニズムはほとんど理解されていない。初代細胞における中期および長期発現を誘発するために、レトロウイルス、レンチウイルス、およびＡＡＶベクター等の組み込み型ウイルス送達ベクターのみが使用に成功している。しかしながら、これらのベクターは、現行の医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（ｃｕｒｒｅｎｔ ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｓｅ）（ｃＧＭＰ）の生産規格を考慮するとコストがかかる。ｃＧＭＰ規格下でウイルスベクターを産生することは、等量の「裸の」遺伝物質を作出するよりも桁違いに高価であると考えられる。加えて、ウイルスベクターは、（ｉ）組み込みの座位における組み込まれた外来ＤＮＡの負の干渉（例えば、遺伝子機能および調節の分断）、および（ｉｉ）病原性ウイルスを起源とする構成要素の関与、に関連する安全性リスクおよび懸念を持つ。

これに代えて、初代細胞への機能的ＲＮＡの直接送達は、急速な分解をもたらし、短期効果しか提供しない。それゆえ、導入遺伝子サイレンシングを回避する新規の遺伝子ベクターの開発への強い要望がある。

プロモーター、コード遺伝子、およびＲＮＡ安定化配列を含む転写単位のみからなるＤＮＡミニサークルまたはダンベル型ベクター等の新規のベクターは、小型のサイズに起因して、細胞送達または核拡散の向上等のいくつかの利点を有する。さらに、これらの小型ベクターは、共有結合的に閉じた構造に起因してエキソヌクレアーゼに耐性があり、一方でプラスミドは、せん断力によって誘発される一本鎖断裂、いわゆるニックを持つことが多い。不要な細菌配列または耐性タンパク質がないことは、宿主における望まれない副作用を排除し、制御されたインビトロ合成、およびフルオロフォア、細胞透過性ペプチド、抗体、アプタマー、糖類、または免疫刺激性ペプチドをループ構造に化学的に連結する選択肢により、これらのベクターの容易な操作が可能となる。

上で記載されるように、プラスミドにおける導入遺伝子サイレンシングは頻繁である。導入遺伝子発現カセットの５’および３’末端間の遺伝子外スペーサーを欠くＤＮＡミニサークルは、マウスにおける持続的な導入遺伝子発現を可能にすることが示された。ミニサークルと比較した場合、ダンベル型ベクター、特に小型ノンコーディングＲＮＡの発現のためのものは、分子量が桁違いに小さくあり得る。国際公開第２０１２／０３２１１４号（特許文献１）は、黒色腫への注射後数日間発現を維持する、ダンベル型環状ベクターを含むＤＮＡ発現構築物を開示している。伝統的なベクターの産生と比較した場合、ダンベル型ベクターの合成は、複雑でかつコストがかかることが多い。最先端の技法は、典型的に酵素依存的であり、クローニングおよび化学合成を付加的に要する。ダンベルベクターを合成するためにＰＣＲベースの技法を利用した米国特許出願公開第２００８／０１５３７６３号（特許文献２）に開示されるもの等、方法論の向上がなされているものの、当該方法は、依然としてクローニングおよび制限酵素に大きく依存しており、ダンベル型ベクターの産生をコストがかかるものにしている。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、ほとんどの後生動物における遺伝子発現を転写後に調節する小型ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）である。それらは、ｍｉＲＮＡ遺伝子から一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）として転写され、それは、核においてヘアピン構造前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）にプロセシングされ、その後細胞質にエクスポートされ、それらはさらにプロセシングされて短い不完全に対合したＲＮＡ二重鎖（ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ）を形成する。小型のまたは短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を効率的に誘発するための、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを模倣し、組み換え遺伝子から内因的に転写され得る人工ヘアピン構造ＲＮＡである。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを含めたノンコーディングＲＮＡならびにコードＲＮＡ遺伝子送達のために、研究者は、ウイルス性または非ウイルス性送達ベクターを探求している。ウイルスベクターは、コストがかかり、免疫応答をしばしば誘発するまたはゲノムベクター組み込みのリスクをもたらす一方で、多くの非ウイルス性送達ベクターは、細胞に対して毒性があり得る非核酸ヘルパー機能を伴う^１、２。最もシンプルな非ウイルスベクターは、裸のＤＮＡベースのベクターシステムであり、その３つの異なるタイプ：プラスミド、ＤＮＡミニサークル、およびダンベル型ＤＮＡ最小ベクターがこれまでのところ記載されている。プラスミドベースの遺伝子発現は、初代細胞およびインビボにおいて急速にサイレンスされるのに対し、ミニサークルおよびダンベルベクターは、導入遺伝子サイレンシングを被らず、前臨床および臨床試験において有望な結果を示している^３～７。しかしながら、環状張力に起因して３００塩基対（ｂｐ）の最小サイズを要するミニサークルと比較して^８、ダンベルベクターは、下限サイズを有せず、事実上ｓｈＲＮＡ遺伝子と同じくらい短くあり得る。その線形構造と合わせた小型のダンベルサイズは、細胞送達、特に核ベクター拡散を促すことが示された^９。ダンベルベクターを発現するｓｈＲＮＡを作出するための４つの方法：第１に、ミスライゲートしたオフ経路産物のヌクレオチド鎖切断によって分子間ダンベルライゲーションが支持されるプロトコールである、ヌクレアーゼによって支援される酵素的ライゲーション（ＥＬＡＮ）^１０；第２に、発現カセットがＰＣＲによって増幅され、その後にニッキング酵素切断が続いて５’オーバーハングを産生し、それが次いで分子内ライゲーションにおいてダンベルループを形成するプロトコール^{１１、１２}；第３に、サイズ最小化ヘアピン鋳型転写ｓｈＲＮＡ発現ダンベルベクターを作出する最初の２つのプロトコールの特質を組み合わせる方法^９、１３；ならびに最後に、内部ループおよび向上した核標的化活性によって特徴付けられる優れたダンベルベクターを効率的に作出するために、化学修飾されたプライマーおよび分子内ライゲーションを採用するギャッププライマーＰＣＲベースの方法^１４、が報告されている。

国際公開第２０１２／０３２１１４号 米国特許出願公開第２００８／０１５３７６３号

一般的に、分子内ライゲーション反応の間にダンベル構造を形成するプロトコールは、最も高いベクター収率を呈する。新規のノンコーディングまたはコーディングＲＮＡの発現のためのダンベルベクターを作出するために、上記のプロトコールのすべては、クローニングステップに依存しかつ／またはエンドヌクレアーゼを要する。

開示される方法は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ ＲＮＡを含めたノンコーディングＲＮＡならびにコードＲＮＡ発現のための、ヘアピン鋳型転写ダンベル型ベクターのクローニングフリーの作出を可能にする。それは、ユニバーサル鋳型を使用し、それによって特異的ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、タンパク質、またはペプチドをコードする配列がＰＣＲプライマーによって導入される、ＰＣＲベースの方法を記載する。この新規のプロトコールは、サイズ最小化ヘアピン鋳型転写ダンベルを産生し、いかなる制限またはニッキングエンドヌクレアーゼも要せず、ハイスループット適合性である。開示される方法は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびコーディングＲＮＡを発現するダンベルベクターの作出を早めかつ価格を下げる。開示される方法は、機能的ゲノミクスおよびスクリーニング調査に要される高度に並列化されたダンベルベクター産生を可能にし、それは、前臨床および臨床適用に要される大規模なダンベル産生を可能にする。

発明の記述
本発明の一態様によれば、ダンベル型発現ベクターであって、前記ベクターは、
ｉ）それぞれが、発現されるべき核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含む、１つまたは複数の線形またはヘアピン型の転写カセット；
ｉｉ）前記転写カセットに作動可能に連結された、最小転写プロモーターヌクレオチド配列；
ｉｉｉ）ＤＮＡ核標的化配列を含むヌクレオチド配列；
ｉｖ）前記発現される核酸分子の発現を増強するための、エンハンサーヌクレオチド配列および任意選択的に前記エンハンサーヌクレオチド配列と結び付いた少なくとも１つのイントロンを含むヌクレオチド配列；
ｖ）転写後調節エレメントまたは構成的核輸送エレメントを含むヌクレオチド配列；ならびに
ｖｉ）ＲＮＡガイドによるゲノム編集のための、一本鎖または二本鎖のいずれかである修復鋳型として働き得る、哺乳類ゲノムの一部分との相同性を有する配列を含むヌクレオチド配列
を含む、ダンベル型発現ベクターが提供される。

本発明の好ましい実施形態において、前記最小転写プロモーター配列は、転写終結ヌクレオチド配列をさらに含み、転写開始および終結ヌクレオチド配列は作動的に共役されている。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記ベクターは、少なくとも１つの内部ループドメインを含む。好ましくは、前記ループドメインは、脱塩基部位またはヌクレオチドミスマッチを含む。

本発明の好ましい実施形態において、前記脱塩基部位は１つまたは複数を含む

本発明の好ましい実施形態において、前記脱塩基部位は、１つまたは複数の脱プリン／脱ピリミジン脱塩基部位を含む。

本発明の好ましい実施形態において、前記ヌクレオチドミスマッチは、脱塩基部位のテトラヒドロフランベースの模倣体を含む。

本発明の好ましい実施形態において、前記転写後調節エレメントはＷＰＲＥ［配列番号１１］である。

本発明の好ましい実施形態において、上のｉ）～ｖｉ）に記載の前記ベクター核酸分子は、一本鎖または二本鎖核酸である。

本発明の好ましい実施形態において、前記哺乳類ゲノムはヒトである。

本発明の好ましい実施形態において、発現されるべき前記核酸分子は、治療用タンパク質またはペプチドをコードする。

本発明の好ましい実施形態において、前記治療用タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ｎ、ｈＳｐＣａｓ９、またはｈＳｐＣａｓ９ｎである。

本発明の好ましい実施形態において、前記治療用タンパク質またはペプチドは死シグナルを誘発する。

細胞死シグナルを誘発するタンパク質またはペプチドの例は、当技術分野において公知である。例えば、コレラ毒素またはジフテリア毒素、アルファ毒素、炭疽毒素、外毒素、百日咳毒素、志賀毒素、志賀様毒素等の細菌毒素は、細胞死を誘導することが公知である。さらに、Ｆａｓ、ＴＮＦ、カスパーゼ（イニシエーターカスパーゼ、すなわちカスパーゼ２、８、９、１０、１１、１２、およびエフェクターカスパーゼ、すなわちカスパーゼ３、６、７）等、アポトーシスシグナル／タンパク質。加えて、非毒性薬物を毒性構成要素に変換し得る酵素：例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）は、かなり非毒性の薬物ガンシクロビル（ＧＣＶ）を毒性のトリホスフェートに変換する（ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶシステム）。さらなる例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）／フルダラビン自殺遺伝子システムである。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記治療用タンパク質またはペプチドはＨＳＶｔｋである。

本発明の代替的な好ましい実施形態において、前記発現される核酸分子は治療用核酸分子である。

本発明の好ましい実施形態において、前記治療用核酸は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。

本発明の代替的な好ましい実施形態において、前記治療用核酸分子は、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスｍｉＲＮＡである。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記治療用核酸分子はｍｉＲＮＡである。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記治療用核酸分子はトランススプライシングＲＮＡである。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記治療用核酸分子は、ガイドＲＮＡ、一本鎖ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡである。

本発明の好ましい実施形態において、前記治療用核酸分子はトランススプライシングＲＮＡである。

本発明の代替的な好ましい実施形態において、前記治療用核酸分子は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡである。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記最小転写プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに由来する。

本発明の好ましい実施形態において、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターはＵ６プロモーターであり、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む。

本発明の代替的な好ましい実施形態において、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むＨ１プロモーターである。

本発明の代替的な好ましい実施形態において、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む最小Ｈ１（ｍＨ１）プロモーターである。

本発明のさらに代替的な好ましい実施形態において、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位および／または配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む逆位ポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーターを含む、改変ｍＨ１プロモーターである。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記最小転写プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターに由来する。

本発明の好ましい実施形態において、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターであり、配列番号５に記載のヌクレオチド配列を含む。

本発明の好ましい実施形態において、前記転写ターミネーターヌクレオチド配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結配列である。

本発明の好ましい実施形態において、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結配列は、ヌクレオチド配列ＴＴＴＴＴを含む１つまたは複数のモチーフを含む。

本発明の好ましい実施形態において、前記ＤＮＡ核標的化配列は、配列番号６（ＤＴＳα）および／または配列番号７（ＤＴＳβ）に記載されるヌクレオチド配列を含む。

本発明の好ましい実施形態において、前記エンハンサーヌクレオチド配列は、配列番号８に記載されるヌクレオチド配列を含む（最小エンハンサー：ｍＳＶ４０ｅｎｈ）。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記エンハンサーヌクレオチド配列は、配列番号９に記載されるヌクレオチド配列を含む（全長エンハンサー：ｆＳＶ４０ｅｎｈ）。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記イントロンは、配列番号１０に記載されるヌクレオチド配列を含む。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記ベクターは、検出可能なマーカーをさらにコードする。

本発明の好ましい実施形態において、前記検出可能なマーカーは蛍光マーカーである。

本発明の好ましい実施形態において、前記蛍光マーカーは蛍光レポータータンパク質である。

組織におけるプロモーター活性の分析は、「レポーター」タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸にプロモーターを融合させることによって好都合にモニターされ得る。例は当技術分野において周知であり、βグルクロニダーゼ等の酵素を含む。タンパク質性フルオロフォアであるレポーターも、当技術分野において公知である。緑色蛍光タンパク質ＧＦＰは、太平洋クラゲのエクオリア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）等の腔腸動物から単離された自発蛍光タンパク質である。その役割は、別のタンパク質であるエクオリンの青色化学発光を緑色蛍光の光にエネルギー移動によって転換することである。ＧＦＰは、それが、多種多様なタンパク質へのＮおよびＣ末端融合を認容し、その多くは天然の機能を保持することが示されていることから、タンパク質タグとして機能し得る。ほとんどの場合、それは、コドン使用法がヒト暗号に適応されている増強ＧＦＰの形態で使用される。他のタンパク質性フルオロフォアには、黄色、赤色、および青色蛍光タンパク質が含まれる。これらは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ（ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ）から市販されている。なおさらなる例はホタルルシフェラーゼである。

本発明の好ましい実施形態において、哺乳類ゲノムの一部分との相同性を有する前記ヌクレオチド配列は、ダンベルベクターの二本鎖ＤＮＡ部分に取り入れられる。

本発明の代替的な好ましい実施形態において、哺乳類ゲノムの一部分との相同性を有する前記ヌクレオチド配列は、ダンベルベクターの一本鎖ループを含む。

本発明のさらなる態様によれば、本発明に従ったダンベル型ベクターを含む医薬組成物が提供される。

本発明のダンベル型ベクター組成物は、薬学的に許容可能な調製物で投与される。そのような調製物は、ルーチン的に、薬学的に許容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合する担体、および補足的治療剤を含有し得る。本発明のダンベル型ベクター組成物は、注射を含めた任意の従来的経路によって、または経時的な漸進的注入によって投与され得る。投与は、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、経皮的、経口的、局所的、気管内、経鼻、膣内、または経上皮的であり得る。これに代えて、本発明のダンベル型ベクターまたはベクター組成物は、限定されるものではないが、液体ジェットインジェクション、マイクロインジェクション、マイクロニードル、粉末粒子インジェクション、金粒子インジェクション、遺伝子銃、エレクトロポレーション、またはハイドロダイナミックインジェクションを含む、物理的方法によって送達される。

本発明のダンベル型ベクター組成物は、有効量で投与される。「有効量」とは、単独でまたはさらなる投薬とともに所望の応答をもたらす、ダンベル型ベクターの量である。疾患を治療する場合、所望の応答は、疾患の進行を阻害することである。これは、疾患の進行を一時的に単に遅らせることを伴い得る（より好ましくは、それは、疾患の進行を永久に食い止めることを伴うが）。これは、ルーチン的方法によってモニターされ得る。そのような量は、当然のことながら、治療されている特定の病状、病状の重症度、年齢、身体的条件、サイズおよび体重を含めた個々の患者パラメーター、治療の継続期間、併用療法の性質（もしあれば）、投与の具体的経路、ならびに保健関係者の知識および専門技能の範囲内にある同様の因子に依存する。これらの因子は当業者に周知であり、単なるルーチン的実験を用いて対処され得る。個々の構成要素またはその組み合わせの最大用量、つまり健全な医学的判断に従った最も高い安全用量が使用されることが一般的に好ましい。しかしながら、患者は、医学的理由、心理的理由、または事実上任意の他の理由で、より低い用量または耐容用量を要求し得ることは当業者によって理解される。

前述の方法において使用されるダンベル型ベクター組成物は、好ましくは無菌であり、患者への投与に適した重量または容量の単位で所望の応答をもたらすための、本発明に従った有効量のダンベル型ベクターを含有する。対象に投与されるベクターの用量は、種々のパラメーターに従って、特に使用される投与の様態および対象の状態に従って選定され得る。他の因子には、治療の所望の期間が含まれる。対象における応答が、適用された初回用量では不十分である場合、より高い用量（または、異なるより限局性の送達経路による効率的により高い用量）が、患者耐容性が許す程度まで採用され得る。投薬量、注射のスケジュール、注射の部位、投与の様態等が前述のものとは異なる、ベクター組成物の投与のための他のプロトコールは当業者に公知である。ヒト以外の哺乳類への組成物の投与（例えば、試験目的または獣医学的治療目的のための投与）は、上記と実質的に同じ条件下で行われる。本明細書において使用される対象とは、哺乳類、好ましくはヒトであり、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、または齧歯類を含む。

投与される場合、本発明のダンベル型ベクター組成物は、薬学的に許容可能な量でかつ薬学的に許容可能な組成物で適用される。「薬学的に許容可能な」という用語は、活性剤の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性の材料を意味する。そのような調製物は、ルーチン的に、塩、緩衝剤、防腐剤、適合する担体、および任意選択的に他の治療剤（例えば、具体的疾患兆候の治療において典型的に使用されるもの）を含有し得る。医学において使用される場合、塩は薬学的に許容可能であるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、その薬学的に許容可能な塩を調製するために好都合に使用され得、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的および薬学的に許容可能な塩には、限定されるものではないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等から調製されるものが含まれる。また、薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属として調製され得る。

本発明に従ったダンベル型ベクターを含有する医薬組成物は、塩の状態の酢酸；塩の状態のクエン酸；塩の状態のホウ酸；および塩の状態のリン酸を含めた、適切な緩衝剤を含有し得る。医薬組成物は、任意選択的に、塩化ベンザルコニウム；クロロブタノール；パラベン；およびチメロサール等の適切な防腐剤も含有し得る。

ダンベル型ベクター組成物は、単位剤形で好都合に提示され得、薬学の技術分野において周知の方法のいずれかによって調製され得る。すべての方法は、活性剤を、１種または複数種の補助的成分を構成するベクターと会合させるステップを含む。本発明に従ったベクターを含有する組成物は、エアロゾルとして投与され得、吸入され得る。非経口的投与に適した組成物は、レシピエントの血液と好ましくは等張である、ベクターの無菌の水性または非水性調製物を好都合に含む。この調製物は、適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、公知の方法に従って製剤化され得る。無菌の注射可能な調製物は、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液または懸濁液でもあり得る。採用され得る許容可能な溶媒には、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の固定油が、溶媒または懸濁化媒体として好都合に採用される。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含めた、任意の低刺激性（ｂｌａｎｄ）固定油が採用され得る。加えて、オレイン酸等の脂肪酸が、注射物質の調製において使用され得る。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適した担体製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡに見出され得る。

本発明の代替的な実施形態において、前記医薬組成物は、アジュバントおよび／または担体を含むＤＮＡワクチン組成物である。

本発明の一態様によれば、２つの発現カセットを含むダンベル型二重発現ベクターを作出する方法であって、前記ベクターは、
ｉ）５’末端配列に第１の転写プロモーターの逆相補体および３’末端配列に第２の転写ターミネーターの配列を含む標的核酸分子を含む、第１の一本鎖核酸鋳型を含む調製物を用意するステップ；
ｉｉ）前記一本鎖核酸鋳型の３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、５’－ホスフェートおよび３’－ヒドロキシル基を含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、前記第１の一本鎖核酸鋳型とを接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、転写されるべき対象の第１の配列を含み、かつ第１の転写ターミネーターの逆相補配列をさらに含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列の伸長を阻止する改変ヌクレオチド配列をさらに含む、ステップ；
ｉｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応構成要素、および３’アニールしたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させるプライマーを用意して、第２の鋳型を形成するステップ；
ｉｖ）前記第２の鋳型の３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、５’－ホスフェートおよび３’－ヒドロキシル基を含み、かつ第２の鋳型に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、前記第２の鋳型とを接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、転写されるべき対象の第２の配列を含み、かつ第２の転写ターミネーターの逆相補配列をさらに含み、かつ第２の鋳型に相補的でない５’ヌクレオチド配列の伸長を阻止する改変ヌクレオチド配列をさらに含む、ステップ；
ｖ）ポリメラーゼ連鎖反応構成要素、および３’アニールしたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させるプライマーを用意して、二本鎖核酸を形成するステップ；
ｖｉ）ポリメラーゼ連鎖により二本鎖核酸を増幅して鋳型ＤＮＡのプールを合成し、前記鋳型をアニールさせて、標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸を創出するステップ；ならびに
ｖｉｉ）アニールした鋳型核酸と５ＤＮＡリガーゼとを接触させて、非相補的５’ヌクレオチド配列の末端５’－ホスフェートを、前記増幅した鋳型核酸の３’－ＯＨに連結させて、末端ループ構造を創出するステップ
を含む方法が提供される。

本発明の好ましい方法において、前記標的核酸分子は、その３’末端ヌクレオチド配列に転写プロモーターの配列を含み、その５’末端ヌクレオチド配列に転写プロモーターの逆相補配列をさらに含む。

さらなる好ましい方法において、前記転写プロモーターはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩプロモーターはＵ６プロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩプロモーターはＨ１プロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは最小Ｈ１プロモーターである。

代替的な好ましい方法において、前記転写プロモーターはポリメラーゼＩＩプロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである。

本発明の好ましい方法において、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、前記標的核酸分子と非相補的であるが、ステムループ構造を形成するその長さの一部分にわたる内部相補性の領域を含む、ヌクレオチド配列を含む。

本発明の好ましい方法において、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、その長さの一部分にわたる回文型ヌクレオチド配列を含む。

本発明の好ましい方法において、前記オリゴヌクレオチドプライマー改変は、前記プライマーにおける、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長中に塩基対合のための鋳型として認識されない部位の内包である。

本発明の好ましい方法において、前記オリゴヌクレオチドプライマー改変は、前記プライマーにおける脱塩基部位の内包である。

脱塩基部位は、典型的にはＤＮＡ損傷によってまたは自然突然変異を通じて引き起こされて天然に存在しており、プリンもピリミジン塩基も有しないＤＮＡまたはＲＮＡにおける場所を規定する。該部位は、脱プリンまたは脱ピリミジン性と称される。

さらなる好ましい方法において、前記脱塩基部位は、脱プリン／脱ピリミジン部位である。

さらなる好ましい方法において、前記脱プリン／脱ピリミジン部位はテトラヒドロフランを含む。

さらなる好ましい方法において、前記脱塩基部位は、少なくとも１つまたは少なくとも３つの脱プリン／脱ピリミジン部位を含む。

さらなる好ましい方法において、前記脱塩基部位は、１つの脱プリン／脱ピリミジン部位を含有する。

本発明のさらなる好ましい方法において、前記脱塩基部位は、前記一本鎖核酸鋳型の３’末端ヌクレオチド配列に相補的な領域と、標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列とを分離する。

本発明の好ましい方法において、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、転写ターミネーターを含む非相補的ヌクレオチド配列を含む。

本発明のさらなる好ましい方法において、前記転写ターミネーターはポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーターは小型のポリチミジン（Ｔ）伸張（ｓｍａｌｌ ｐｏｌｙ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ （Ｔ） ｓｔｒｅｔｃｈ）である。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーターはＴ五量体である。

本発明の代替的な好ましい方法において、前記転写ターミネーターはポリメラーゼＩＩ転写ターミネーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩ転写ターミネーターはＳＶ４０ポリアデニル化部位である。

本発明の好ましい方法において、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、転写されるべき対象の配列を含む。

本発明のさらなる好ましい方法において、対象の前記配列は非タンパク質コード配列である。

本発明の代替的な好ましい方法において、対象の前記配列はタンパク質コード配列である。

本発明の好ましい方法において、前記ＤＮＡリガーゼは、ファージＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼである。

本発明の代替的な好ましい方法において、前記ＤＮＡリガーゼはｃｉｒｃｌｉｇａｓｅである。

本発明の一態様によれば、ヘアピン構造発現カセットを含むダンベル型ベクターを作出するためのクローニングフリーでかつエンドヌクレアーゼフリーの方法であって、
ｉ）２つの相補的配列セグメントを含む標的核酸分子を含む一本鎖核酸鋳型を含む調製物を用意するステップであって、各セグメントは転写プロモーター配列を含みかつ転写ターミネーターをさらに含み、前記２つの相補的配列セグメントは、第３の配列セグメントによって分離されている、ステップ；
ｉｉ）前記一本鎖核酸鋳型がステムを付加的に含む調製物を用意するステップ；
ｉｉｉ）前記一本鎖核酸鋳型の３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’－ヒドロキシル基を含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、前記一本鎖核酸鋳型とを接触させ、さらに、前記一本鎖核酸鋳型の５’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的である第１のブロッキングオリゴヌクレオチドと、前記一本鎖核酸鋳型とを接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、ヘアピン構造ＲＮＡの３’アームをコードする配列を含む、ステップ；
ｉｖ）ポリメラーゼ連鎖反応構成要素を用意して、３’アニールした第１のオリゴヌクレオチドプライマーをプライマー伸長させるステップ；
ｖ）前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’－ヒドロキシル基を含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させ、さらに、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的である第２のブロッキングオリゴヌクレオチドと、前記一本鎖核酸鋳型とを接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、ヘアピン構造ＲＮＡの３’アームをコードする配列を含む、ステップ；
ｖｉ）ポリメラーゼ連鎖により鋳型を増幅して鋳型ＤＮＡのプールを合成し、前記鋳型をアニールさせて二本鎖核酸を創出するステップであって、前記二本鎖核酸は、プラス鎖およびマイナス鎖の５’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの３’アームをコードする配列を含み、かつプラス鎖およびマイナス鎖の３’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの５’アームをコードする配列を含む、ステップ；
ｖｉｉ）前記二本鎖核酸を熱変性させ、次いで冷却して、結果として生じるプラス鎖およびマイナス鎖ＤＮＡの分子内リフォールディングを可能にして、プラスまたはマイナス鎖ＤＮＡから構成される予形成オリゴマーステム－ループ構造を創出するステップ；
ｖｉｉｉ）プラス鎖およびマイナス鎖ＤＮＡの前記予形成オリゴマーループ構造とＤＮＡリガーゼとを接触させて、末端５’－リン酸化５’オーバーハングを、分子内ライゲーションにおいて同じＤＮＡ鎖の３’オーバーハングの末端３’－ＯＨ基に連結させて、ヘアピン構造ＲＮＡの転写のためのヘアピン構造鋳型ＤＮＡを含む共有結合的に閉じたプラス鎖由来およびマイナス鎖由来ダンベル型ベクターＤＮＡを創出するステップ；
ｉｘ）前記ダンベル型ベクターＤＮＡとＤＮＡエキソヌクレアーゼとを接触させて、すべてのプライマー、ならびに５’および３’端を持つ共有結合的に閉じていないＤＮＡを除去するステップ
を含む、方法が提供される。

好ましい方法において、前記転写プロモーターはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩプロモーターはＵ６プロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩプロモーターはＨ１プロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは最小Ｈ１プロモーターである。

代替的な好ましい方法において、前記転写プロモーターはポリメラーゼＩＩプロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである。

好ましい方法において、前記転写ターミネーターはポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーターは小型のポリチミジン（Ｔ）伸張である。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーターはＴ五量体である。

代替的な好ましい方法において、前記転写ターミネーターはポリメラーゼＩＩ転写ターミネーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩ転写ターミネーターはＳＶ４０ポリアデニル化部位である。

好ましい方法において、前記ステムは人工ステムである。

さらなる好ましい方法において、前記ステムはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ステムである。

さらなる好ましい方法において、前記ｍｉＲＮＡステムはｍｉＲＮＡ－３０（ｍｉＲ－３０）ステムである。

好ましい方法において、前記第３の配列セグメントはオリゴマーＤＮＡ配列である。

さらなる好ましい方法において、前記第３の配列セグメントは四量体ＤＮＡ配列である。

さらなる好ましい方法において、前記第３の配列セグメントはＴ四量体である。

好ましい方法において、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは５’ホスフェートを含む。

好ましい方法において、前記ヘアピン構造ＲＮＡは小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）である。

さらなる好ましい方法において、前記ヘアピン構造ＲＮＡは前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）である。

好ましい方法において、前記第１のブロッキングオリゴヌクレオチドは、前記一本鎖核酸鋳型の完全な５’末端ヌクレオチド配列の約半分に相補的である。

好ましい方法において、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは５’ホスフェートを含む。

好ましい方法において、前記第２のブロッキングオリゴヌクレオチドは、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの完全な５’末端ヌクレオチド配列の約半分に相補的である。

好ましい方法において、前記熱変性は９６℃で５分間のインキュベーションを含む。

好ましい方法において、前記冷却は９６℃から室温への漸進的冷却を含む。

本発明の好ましい方法において、前記リガーゼは一本鎖ＤＮＡ特異的リガーゼである。

本発明のさらなる好ましい方法において、前記リガーゼはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅである。

本発明の好ましい方法において、前記エキソヌクレアーゼはＴ７ ＤＮＡポリメラーゼである。

本発明の一態様によれば、発現カセットを含むダンベル型ベクターを作出するためのクローニングフリーでかつエンドヌクレアーゼフリーの方法であって、
ｉ）２つの相補的配列セグメントを含む標的核酸分子を含む一本鎖核酸鋳型を含む調製物を用意するステップであって、各セグメントは転写プロモーター配列を含みかつ転写ターミネーターをさらに含み、前記２つの相補的配列セグメントは、第３の配列セグメントによって分離されている、ステップ；
ｉｉ）前記一本鎖核酸鋳型がステムを付加的に含む調製物を用意するステップ；
ｉｉｉ）前記一本鎖核酸鋳型の３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’－ヒドロキシル基を含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、前記一本鎖核酸鋳型とを接触させ、さらに、前記一本鎖核酸鋳型の５’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的である、１種、２種、３種、またはそれを上回る種類のオリゴヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドの第１のセットと、前記一本鎖核酸とを接触させるステップ；
ｉｖ）ポリメラーゼ連鎖反応構成要素を用意して、３’アニールした第１のオリゴヌクレオチドプライマーをプライマー伸長させるステップ；
ｖ）前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’－ヒドロキシル基を含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させ、さらに、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的である、１種、２種、３種、またはそれを上回る種類のオリゴヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドの第２のセットと、前記一本鎖核酸鋳型とを接触させるステップ；
ｖｉ）ポリメラーゼ連鎖により鋳型を増幅して、伸長したオリゴヌクレオチドプライマーのプールを合成する（ならびに、前記鋳型をアニールさせて、プラス鎖およびマイナス鎖の５’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの３’アームをコードする配列を含み、かつプラス鎖およびマイナス鎖の３’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの５’アームをコードする配列を含む二本鎖核酸を創出する）ステップ；
ｖｉｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーによって伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’ヒドロキシル基を含み、かつ前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーに相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第３のオリゴヌクレオチドプライマーと、伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの前記プールとを接触させ、さらに、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーによって伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’ヒドロキシル基を含み、かつ前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーに相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第４のオリゴヌクレオチドプライマーと、伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの前記プールとを接触させ、さらに、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーと、ブロッキングオリゴヌクレオチドの前記第１および第２のセットとを接触させるステップ；
ｖｉｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマーの第５および第６、第７および第８、またはそれを上回るペアを使用して、ステップｉｖ）およびｖｉｉ）を繰り返すステップであって、プライマーの最終セットは、３’ヒドロキシル基および５’ホスフェート基を含む、ステップ；
ｉｘ）ポリメラーゼ連鎖により鋳型を増幅して、伸長したオリゴヌクレオチドプライマーのプールを合成し、前記鋳型をアニールさせて二本鎖核酸を創出するステップであって、前記二本鎖核酸は、プラス鎖およびマイナス鎖の５’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの３’アームをコードする配列を含み、かつプラス鎖およびマイナス鎖の３’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの５’アームをコードする配列を含む、ステップ；
ｘ）前記二本鎖核酸を熱変性させ、次いで冷却して、結果として生じるプラス鎖およびマイナス鎖ＤＮＡの分子内リフォールディングを可能にして、プラスまたはマイナス鎖ＤＮＡから構成される予形成オリゴマーステム－ループ構造を創出するステップ；
ｘｉ）プラス鎖およびマイナス鎖ＤＮＡの前記予形成オリゴマーループ構造とＤＮＡリガーゼとを接触させて、末端５’－リン酸化５’オーバーハングを、分子内ライゲーションにおいて同じＤＮＡ鎖の３’オーバーハングの末端３’－ＯＨ基に連結させて、ヘアピン構造ＲＮＡの転写のためのヘアピン構造鋳型ＤＮＡを含む共有結合的に閉じたプラス鎖由来およびマイナス鎖由来ダンベル型ベクターＤＮＡを創出するステップ；
ｘｉｉ）前記ダンベル型ベクターＤＮＡとＤＮＡエキソヌクレアーゼとを接触させて、すべてのプライマー、ならびに５’および３’端を持つ共有結合的に閉じていないＤＮＡを除去するステップ
を含む、方法が提供される。

好ましい方法において、前記転写プロモーターはポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩプロモーターはＵ６プロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩプロモーターはＨ１プロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは最小Ｈ１プロモーターである。

代替的な好ましい方法において、前記転写プロモーターはポリメラーゼＩＩプロモーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩプロモーターはＣＭＶプロモーターである。

好ましい方法において、前記ステムは人工ステムである。

さらなる好ましい方法において、前記ステムはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ステムである。

さらなる好ましい方法において、前記ｍｉＲＮＡステムはｍｉＲＮＡ－３０（ｍｉＲ－３０）ステムである。

好ましい方法において、前記第３の配列セグメントはオリゴマーＤＮＡ配列である。

さらなる好ましい方法において、前記第３の配列セグメントは四量体ＤＮＡ配列である。

さらなる好ましい方法において、前記第３の配列セグメントはＴ四量体である。

代替的な好ましい方法において、前記第１および前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸分子に相補的でないそれらの５’ヌクレオチド配列に、翻訳スタートコドンの逆相補配列ＣＡＴを含む。

さらなる好ましい方法において、プライマーの前記最終セットのプライマーは、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーに相補的でないそれらの５’ヌクレオチド配列に、翻訳ストップコドンの逆相補配列を含む。

さらなる好ましい方法において、前記翻訳ストップコドンは、ＴＡＧ、ＴＡＡまたはＴＧＡである。

代替的な好ましい方法において、プライマーの前記最終セットのプライマーは、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーに相補的でないそれらの５’ヌクレオチド配列に、転写ターミネーターの逆相補配列を含む。

好ましい方法において、前記転写ターミネーターはポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーターは小型のポリチミジン（Ｔ）伸張である。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーターはＴ五量体である。

代替的な好ましい方法において、前記転写ターミネーターはポリメラーゼＩＩ転写ターミネーターである。

さらなる好ましい方法において、前記ポリメラーゼＩＩ転写ターミネーターはＳＶ４０ポリアデニル化部位である。

代替的な好ましい方法において、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーは５’ホスフェートを含む。

好ましい方法において、前記ヘアピン構造ＲＮＡは小型ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。

さらなる好ましい方法において、前記ヘアピン構造ＲＮＡは前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）である。

好ましい方法において、前記第１のブロッキングオリゴヌクレオチドは、前記一本鎖核酸鋳型の完全な５’末端ヌクレオチド配列の約半分に相補的である。

好ましい方法において、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーは５’ホスフェートを含む。

好ましい方法において、前記第２のブロッキングオリゴヌクレオチドは、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの完全な５’末端ヌクレオチド配列の約半分に相補的である。

好ましい方法において、前記熱変性は９６℃で５分間のインキュベーションを含む。

好ましい方法において、前記冷却は９６℃から室温への漸進的冷却を含む。

本発明の好ましい方法において、前記リガーゼは一本鎖ＤＮＡ特異的リガーゼである。

本発明のさらなる好ましい方法において、前記リガーゼはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅである。

本発明の好ましい方法において、前記エキソヌクレアーゼはＴ７ ＤＮＡポリメラーゼである。

本発明の一態様によれば、本発明に従った方法によって合成されたダンベル型ベクターが提供される。

本発明のさらなる態様によれば、ヒト対象から単離された初代細胞のトランスフェクションのための方法であって、
ｉ）トランスフェクトされるべき細胞を含む単離されたサンプルを用意するステップ；
ｉｉ）前記単離された細胞サンプルを含む調製物を形成し、前記サンプルと本発明に従ったダンベル型ベクターとを接触させるステップ；
ｉｉｉ）前記初代細胞サンプルへの前記ダンベル型ベクターの導入、および前記ベクターに含まれる核酸分子の持続的発現を可能にする形質転換条件を提供するステップ
を含む、方法が提供される。

本発明のさらなる態様によれば、遺伝子療法から恩恵を受ける疾患に罹患した患者を治療するためのエクスビボ方法であって、
ｉ）トランスフェクトされるべき細胞を含む前記対象からサンプルを得るステップ；
ｉｉ）本発明に従ったダンベル型ベクターを含む細胞培養調製物を形成し、前記細胞に前記ベクターをトランスフェクトする条件を提供するステップ；および
ｉｉｉ）トランスフェクトされた細胞を前記対象に投与するステップ
を含む、方法が提供される。

本発明の好ましい方法において、前記単離されたサンプルは幹細胞を含む。

本発明の好ましい実施形態において、前記幹細胞は、多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、系列制限（ｌｉｎｅａｇｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）幹細胞からなる群から選択される。

「幹細胞」という用語は、分化した細胞および組織を形成する様々な潜在性を保持しながら、自己再生能を所有する未分化細胞の包括的な群を表す。幹細胞は、多能性または複能性であり得る。多能性幹細胞は、インタクトな生物を形成し得ないが、多能性幹細胞は、インタクトな生物に見出されるすべての組織を形成する能力を有する細胞である。複能性細胞は、分化した細胞および組織を形成する制限された能力を有する。典型的に、成体幹細胞は複能性幹細胞であり、一部の細胞または組織を形成するおよび老化したまたは損傷した細胞／組織を補充する能力を有する前駆体幹細胞または系列制限幹細胞である。複能性幹細胞の例には、間葉系幹細胞が含まれる。間葉系幹細胞またはＭＳＣは、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、およびニューロンを含む多様な細胞タイプに分化する。典型的に、ＭＳＣは骨髄から得られるが、脂肪組織等の他の供給源を起源とし得る。

本発明の好ましい方法において、前記細胞は末梢血単核細胞である。

本発明の好ましい方法において、前記末梢血単核細胞には、Ｔリンパ球［ＣＤ８_＋ Ｔリンパ球またはＣＤ４_＋ Ｔリンパ球のいずれかまたは両方］、Ｂリンパ球、樹状細胞、調節性Ｔ細胞、自然リンパ球、またはナチュラルキラー細胞［ＮＫ細胞］が含まれる。

「末梢血単核細胞」は、血液以外の供給源、例えばリンパ節および脾臓から単離され得、末梢血単核細胞への言及は、血液から単離されたそうした細胞に本発明を限定しないことは明白である。

本発明のさらなる態様によれば、一本鎖標的核酸鋳型の３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含むように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、標的にアニールした場合に、標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列の伸長を阻止する改変ヌクレオチド配列を含む、キットが提供される。

本発明の好ましい実施形態において、前記キットはポリメラーゼ連鎖反応構成要素も含む。

本発明の好ましい実施形態において、前記キットは、ポリメラーゼ連鎖増幅に要される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、および補因子を含む。

本発明の好ましい実施形態において、前記キットはＤＮＡリガーゼを含む。

本発明の好ましい実施形態において、前記キットは、細胞、好ましくはヒト細胞等の哺乳類細胞のトランスフェクションのための細胞トランスフェクション構成要素をさらに含む。

具体的な実施形態
治療用タンパク質およびペプチド
本発明は、「サイトカイン」等の薬学的タンパク質をコードする核酸を含むダンベル型ベクターを包含する。サイトカインは、数多くの多様な細胞機能に関与する。これらには、免疫系のモジュレーション、エネルギー代謝の調節、ならびに成長および発達の制御が含まれる。サイトカインは、標的細胞に対して、細胞表面に発現した受容体を介してそれらの効果を媒介する。サイトカインの例には、ＩＬ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、および３３等のインターロイキンが含まれる。他の例には、成長ホルモン、レプチン、エリスロポエチン、プロラクチン、腫瘍壊死因子［ＴＮＦ］、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カーディオトロフィン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）－１（ＣＴ－１）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、およびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンε、インターフェロンκ、およびωインターフェロンが含まれる。

薬学的に活性なペプチドの例には、ＧＬＰ－１、抗利尿ホルモン、オキシトシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、コルチコトロピン放出ホルモン；カルシトニン、グルカゴン、アミリン、Ａ型ナトリウム利尿ホルモン、Ｂ型ナトリウム利尿ホルモン、グレリン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＹＹ_３－３６、成長ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、またはそのホモログもしくは類似体が含まれる。

「ケモカイン」という用語は、細胞分裂活性、走化活性、または炎症活性を有する細胞によって分泌される構造関連低分子量因子の群を指す。それらは、４つの保存されたシステイン残基を共有する、７０～１００個のアミノ酸残基の主としてカチオン性のタンパク質である。これらのタンパク質は、２つのアミノ末端システインの間隔に基づいて２つの群に選別され得る。第１の群において、２つのシステインは単一の残基によって分離されており（Ｃ－ｘ－Ｃ）、一方、第２の群において、それらは隣接している（Ｃ－Ｃ）。「Ｃ－ｘ－Ｃ」ケモカインのメンバーの例には、限定されるものではないが、血小板因子４（ＰＦ４）、血小板塩基性タンパク質（ＰＢＰ）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、黒色腫成長刺激活性タンパク質（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症性タンパク質２（ＭＩＰ－２）、マウスＭｉｇ（ｍ１１９）、ニワトリ９Ｅ３（またはｐＣＥＦ－４）、ブタ肺胞マクロファージ走化因子ＩおよびＩＩ（ＡＭＣＦ－Ｉおよび－ＩＩ）、ｐｒｅ－Ｂ細胞成長刺激因子（ＰＢＳＦ）、ならびにＩＰ１０が含まれる。「Ｃ－Ｃ」群のメンバーの例には、限定されるものではないが、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）、単球走化性タンパク質２（ＭＣＰ－２）、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ－３）、単球走化性タンパク質４（ＭＣＰ－４）、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ－１－α）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ－１－β）、マクロファージ炎症性タンパク質１－γ（ＭＩＰ－１－γ）、マクロファージ炎症性タンパク質３α（ＭＩＰ－３－α）、マクロファージ炎症性タンパク質３β（ＭＩＰ－３－β）、ケモカイン（ＥＬＣ）、マクロファージ炎症性タンパク質－４（ＭＩＰ－４）、マクロファージ炎症性タンパク質５（ＭＩＰ－５）、ＬＤ７８ β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＩＳ－エプシロン（ｐ５００）、胸腺および活性化調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、Ｉ－３０９、ヒトタンパク質ＨＣＣ－１／ＮＣＣ－２、ヒトタンパク質ＨＣＣ－３が含まれる。

血管新生を受けるように内皮細胞を促進／活性化するいくつかの成長因子が同定されている。これらには、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ Ａ）；ＶＥＧＦ Ｂ、ＶＥＧＦ Ｃ、およびＶＥＧＦ Ｄ；形質転換成長因子（ＴＧＦｂ）；酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）；ならびに血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が含まれる。ＶＥＧＦは、作用、すなわち内皮細胞増殖、遊走、および分化の促進の非常に特異的な部位を有する、内皮細胞特異的成長因子である。ＶＥＧＦは、２つの同一の２３ｋＤポリペプチドを含む複合体である。ＶＥＧＦは、それぞれが、選択的にスプライスされたｍＲＮＡに由来する、異なる分子量の４種の個別のポリペプチドとして存在し得る。ｂＦＧＦは、線維芽細胞および内皮細胞の増殖を刺激するように機能する成長因子である。ｂＦＧＦは、１６．５Ｋｄの分子量を有する単一ポリペプチド鎖である。それらのアミノ末端領域における長さが異なる、いくつかの分子形態のｂＦＧＦが発見されている。しかしながら、様々な分子形態の生物学的機能は同じであるように見える。

プロドラッグ活性化ポリペプチドも本発明の範囲内にある。プロドラッグ活性化遺伝子という用語は、その発現が、非治療用化合物を治療用化合物に変換し得るタンパク質の産生をもたらし、それが、細胞を外部因子による殺傷に対して感受性にするまたは細胞において毒性条件を引き起こす、ヌクレオチド配列を指す。プロドラッグ活性化遺伝子の例は、シトシンデアミナーゼ遺伝子である。シトシンデアミナーゼは、５－フルオロシトシン（５ＦＣ）を、強力な抗腫瘍剤である５フルオロウラシル（５ＦＵ）に変換する。腫瘍細胞の溶解は、腫瘍の限局された地点で５ＦＣを５ＦＵに変換し得るシトシンデアミナーゼの限局性バーストを提供し、多くの周囲腫瘍細胞の殺傷をもたらす。付加的に、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビルの投与による選択的殺傷に対して感受性になる、ＴＫ遺伝子が採用され得る（米国特許第５，６３１，２３６号および米国特許第５，６０１，８１８号を参照されたい）。プロドラッグ活性化酵素の他の例は、ニトロレダクターゼおよびシトクロムｐ４５０（例えば、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｅ１、またはＣＹＰ３Ａ４）である。

治療用抗体
本発明に従ったダンベル型ベクターは、治療用抗体または抗体フラグメントを含む転写カセットを含み得る。

キメラ抗体とは、マウスまたはラット抗体のＶ領域のすべてがヒト抗体Ｃ領域と組み合わせられている組み換え抗体である。ヒト化抗体とは、齧歯類抗体Ｖ領域由来の相補性決定領域とヒト抗体Ｖ領域由来のフレームワーク領域とを融合する、組み換えハイブリッド抗体である。ヒト抗体由来のＣ領域も使用される。相補性決定領域（ＣＤＲ）とは、Ｖ領域の変動の大多数がそこに制限される、抗体の重鎖および軽鎖の両方のＮ末端ドメイン内の領域である。これらの領域は、抗体分子の表面でループを形成する。これらのループは、抗体と抗原との間に結合表面を提供する。非ヒト動物由来の抗体は、外来抗体に対する免疫応答および循環からのその除去を惹起する。キメラおよびヒト化抗体の両方とも、組み換えハイブリッド抗体内に低下した量の齧歯類（すなわち、外来）抗体があるため、ヒト対象に投与された場合に低下した抗原性を有するが、一方でヒト抗体領域は免疫応答を引き出さない。これは、より弱い免疫応答および抗体のクリアランスの減少をもたらす。このことは、ヒト疾患の治療において治療用抗体を使用する場合に明らかに望ましい。ヒト化抗体は、より少ない「外来の」抗体領域を有するように設計され、それゆえ、キメラ抗体よりも免疫原性が低いと考えられる。

抗体の様々なフラグメントが当技術分野において公知である。Ｆａｂフラグメントとは、共有結合で一緒に共役された、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的に活性な部分からなり、抗原に特異的に結合し得る多量体タンパク質である。Ｆａｂフラグメントは、インタクトな免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断（例えば、パパインを用いた）を介して作出される。Ｆａｂ_２フラグメントは、２つの接合したＦａｂフラグメントを含む。これら２つのフラグメントが免疫グロブリンヒンジ領域によって接合される場合、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントが生じる。Ｆｖフラグメントとは、共有結合で一緒に共役された、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域の免疫学的に活性な部分からなり、抗原に特異的に結合し得る多量体タンパク質である。フラグメントは、１つの軽鎖可変領域のみ、または結び付いた重鎖可変領域なしで軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するそのフラグメント、または結び付いた軽鎖部分なしで重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するそのフラグメント、を含有する単鎖ポリペプチド；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体でもあり得、これは、例えば米国特許第６，２４８，５１６号に記載されている。Ｆｖフラグメントまたは単一領域（ドメイン）フラグメントは、典型的に、関連する同定された領域の宿主細胞株における発現によって作出される。これらのおよび他の免疫グロブリンまたは抗体フラグメントは、本発明の範囲内にあり、Ｐａｕｌ， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１）またはＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（２）等の標準的な免疫学教科書に記載される。分子生物学により、現在、これらのフラグメントの直接合成（細胞における発現によりまたは化学的に）、ならびにその組み合わせの合成が可能となっている。抗体または免疫グロブリンのフラグメントは、上記されるように二重特異性機能も有し得る。

ＲＮＡガイドによるゲノム編集
ＲＮＡガイドによるゲノム編集は、もともとは、短いＲＮＡを使用してウイルスまたはプラスミドを起源とする外来の侵入ＤＮＡの分解を指揮する、クラスター化した規則的にスペーサーが入った短い回文型リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムと称される、細菌および古細菌から進化したＲＮＡ媒介性の適応的防御システムに基づく。最もよく見られるシステムは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳＰ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムである。ヒト細胞におけるゲノムＤＮＡの編集に関しては、いくつかのシステム適応がなされた：１．酵素をＤＮＡ標的にガイドして切断を誘発するのに必要なＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる、もともとは個別の２種の短いＲＮＡ分子を融合して、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を形成した。以下Ｃａｓ相互作用ドメインと呼称される足場ｔｒａｃｒＲＮＡドメインは、以下ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）と呼称される任意のｃｒＲＮＡドメインに融合され得る。２．コドン最適化により、ＳＰＣａｓ９をｈＳＰＣａｓ９に変換した。３．オフターゲット編集を低下させるために、アスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）を導入して、ＤＮＡ二本鎖断裂（ＤＳＢ）誘発性ｈＳＰＣａｓ９をＤＮＡニッカーゼｈＳＰＣａｓ９ｎに変換した。ｇＲＮＡのＤＮＡ結合ドメイン（長さが２０～１７ｎｔ）は、ここで、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体を、以下ＤＮＡ標的部位と呼称されるプロトスペーサーと称される相補的な／相同なＤＮＡ部位にガイドし得、それは、本明細書に記載されるシステムに関しては５’－ＮＧＧであるＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）と呼ばれる第２の短い識別子が３’で後に続く必要がある。ｇＲＮＡのＢＤは、編集されるべき部位と重複し得る、またはそれに代えてこの部位に近接しているべきである。次いで、ｈＳＰＣａｓ９複合体はＤＳＢを誘発し、ｈＳＰＣａｓ９ｎ複合体はニックを誘発する。ダブルニックを誘発するには、異なるｇＲＮＡおよびシフトした標的部位を有する２種のｈＳＰＣａｓ９ｎ複合体が要される。Ｃａｓ９またはＣａｓ９ｎによって誘導されたダブルニックを含むＤＳＢは、次いで、２つの内因性修復メカニズムのうちの一方を活性化する：１．エラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路において、末端はプロセシングされかつ再接合されると考えられ、それは、ランダム挿入／欠失（インデル）変異をもたらし得る。２．これに代えて、プラスミド、ＰＣＲ産物、または一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド（以下においてオリゴヌクレオチドと称される）の形態の修復鋳型を供給して、高忠実度の精確な編集を誘発する相同性指向修復（ＨＤＲ）経路を利用し得る。シングルニックは、インタクトな鎖を鋳型として使用してＨＤＲを誘発する。

治療用核酸
本発明は、ＲＮＡアプタマー、トランススプライシングＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、およびアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）または小型のもしくは短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）またはアンチセンスｍｉＲＮＡ（ａｓ－ｍｉＲＮＡ）を含めた、遺伝子発現を取り除く細胞内の標的ｍＲＮＡ配列に相補的な阻害性ＲＮＡを含めた、ノンコーディングＲＮＡを発現するダンベル型ベクターを包含する。

アプタマー分子は、小分子、アミノ酸、補因子、ペプチド、タンパク質、糖類、脂質、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり得るリガンドへの結合を可能にする構造にフォールドする。

トランススプライシングＲＮＡ分子は、３つの機能的ＲＮＡ配列ドメイン；第１に、１種または複数種の標的前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）配列に相補的な１種または複数種のアンチセンスＲＮＡ配列を含む標的結合ドメイン；第２に、スプライスドナー配列またはこれに代えてスプライスアクセプター配列のいずれか、分岐点、およびポリピリミジントラクトを含むスプライシングドメイン；第３に、対象のペプチドまたはタンパク質をコードするコード配列ドメイン、を含む。トランススプライシングＲＮＡ分子は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ標的ＲＮＡに特異的に結合し得、トランススプライシングＲＮＡのコード配列ドメインが標的ｐｒｅ－ｍＲＮＡに向けて接合され、キメラＲＮＡの形成につながりかつコード配列ドメインの発現を可能にするトランススプライス反応を開始し得る。

ｓｈＲＮＡ分子は、第３の一続きのＲＮＡを介して連結されているＲＮＡの２本の完全なまたは部分的な相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含み、センスおよびアンチセンス鎖は互いにアニールして、完全にまたは部分的に塩基対合したステムおよび一本鎖ヘアピンループを含むヘアピン構造ＲＮＡを形成する。核転写の後、ｓｈＲＮＡは一次ｍｉＲＮＡ転写産物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）またはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを模倣し、ドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）によってまずプロセシングされる、またはエクスポーチン－５依存的核エクスポート経路を介して細胞の核から細胞質へ直接エクスポートされる。細胞質において、ｓｈＲＮＡはダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によってプロセシングされ、ガイドＲＮＡはＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に搭載され、それは、ガイドＲＮＡとの十分な程度の相補性を有するｍＲＮＡ標的を特異的に認識しかつ切断する。

ｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡ分子を形成するために互いにアニールしたＲＮＡの２本の相補鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む。ｓｉＲＮＡ分子は、典型的に、取り除かれるべき遺伝子のエクソンに由来する。多くの生物は、ｓｉＲＮＡの形成につながるカスケードを活性化することによって、二本鎖ＲＮＡの存在に応答する。二本鎖ＲＮＡの存在は、二本鎖ＲＮＡを、リボヌクレオタンパク質複合体の一部分になるより小さなフラグメント（ｓｉＲＮＡ、長さがおよそ２１～２９ヌクレオチド）にプロセシングするＲＮａｓｅＩＩＩを含むタンパク質複合体を活性化する。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ複合体のガイドとして作用し、それによってｍＲＮＡの破壊をもたらす。

ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ分子は、第３の一続きのＲＮＡを介して連結されているＲＮＡの２本の完全なまたは部分的な相補鎖（いずれか一方または両方が成熟ｍｉＲＮＡを含む５’アームおよび３’アーム）を含み、センスおよびアンチセンス鎖は互いにアニールして、完全にまたは部分的に塩基対合したステムおよび一本鎖ヘアピンループを含むヘアピン構造ＲＮＡを形成する。核転写の後、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ドローシャによってまずプロセシングされる、またはエクスポーチン－５依存的核エクスポート経路を介して細胞の核から細胞質へ直接エクスポートされる。細胞質において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡはダイサーによってプロセシングされ、成熟ｍｉＲＮＡはＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に搭載され、それは、成熟ｍｉＲＮＡのシード領域とも称される５’末端２～７または８位に相補的であるｍＲＮＡ標的を特異的に認識しかつ結合し、ｍＲＮＡ標的の翻訳ブロックまたは切断につながる。

本明細書において使用するとき、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」という用語は、特定の遺伝子を含むＤＮＡにまたはその遺伝子のｍＲＮＡ転写産物に生理学的条件下でハイブリダイズし、それによって、その遺伝子の転写および／またはそのｍＲＮＡの翻訳を阻害する、オリゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを記載する。アンチセンス分子は、標的遺伝子とのハイブリダイゼーションがあると、標的遺伝子の転写または翻訳に干渉するように設計される。当業者であれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよびその標的との相補性のその程度は、標的の配列およびその配列を含む特定の塩基を含めた、選択された具体的標的に依存することを認識する。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下で標的と選択的に結合するように、すなわち生理学的条件下で標的細胞における他の任意の配列よりも標的配列に実質的により多くハイブリダイズするように構築されかつ編成されることが好ましい。阻害に対して十分に選択的でありかつ強力であるために、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的に相補的である少なくとも７（３）個、より好ましくは少なくとも１５個の連続した塩基を含むべきである。最も好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０～３０塩基の相補的配列を含む。

ａｓ－ｍｉＲＮＡ分子は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ標的分子、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ標的分子、成熟ｍｉＲＮＡ標的、または成熟ｍｉＲＮＡ標的のシード領域に完全にまたは部分的に相補的であるａｓＲＮＡ相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）である。ａｓ－ｍｉＲＮＡ分子は、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ標的分子のダイサープロセシング部位に相補的であることが好ましい。

ＤＮＡワクチン／アジュバント
本発明は、疾患および病原性生物に対する免疫付与における抗原性ポリペプチドをコードするダンベル型ベクターを包含する。典型的に、ダンベル型ベクターを含むＤＮＡワクチンは、コードされる抗原に対する免疫応答を増大させるアジュバントおよび／または担体を含む。

アジュバント（免疫強化剤または免疫モジュレーター）は、ワクチン抗原に対する免疫応答を向上させるために何十年も使用されている。ワクチン製剤へのアジュバントの組み入れは、ワクチン抗原に対する特異的免疫応答を増強する、加速する、および引き延ばすことを目的としている。アジュバントの利点には、より弱い抗原の免疫原性の増強、免疫付与の成功に必要とされる抗原量の低下、必要とされるブースター免疫付与の頻度の低下、ならびに高齢者用および免疫不全用ワクチンにおける免疫応答の向上が含まれる。選択的に、アジュバントを採用して、例えば免疫グロブリンクラスに関する所望の免疫応答、および細胞傷害性またはヘルパーＴリンパ球応答の誘導を最適化もし得る。加えて、ある特定のアジュバントを使用して、粘膜表面における抗体応答を促進し得る。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムまたはカルシウムは、ヒトワクチンにおいてルーチン的に使用されている。より最近では、ＩＲＩＶ（免疫刺激性再構成インフルエンザビロソーム）に組み入れられた抗原、および乳濁液ベースのアジュバントＭＦ５９を含有するワクチンが、各国で認可されている。アジュバントは、それらの供給源、作用のメカニズム、および物理的または化学的特性に従って分類され得る。最もよく記載されるアジュバントクラスは、ゲルタイプ、微生物性、油乳濁液および乳化剤ベース、微粒子性、合成、ならびにサイトカインである。１種を上回る種類のアジュバントが、最終ワクチン産物に存在し得る。それらは、ワクチンに存在する単一の抗原もしくはすべての抗原と一緒に組み合わされ得る、または各アジュバントは、１種の特定の抗原と組み合わされ得る。現在使用されているまたは開発されているアジュバントの起源および性質は非常に多様である。例えば、アルミニウムベースのアジュバントは単純な無機化合物からなり、ＰＬＧはポリマー性炭水化物であり、ビロソームは異質なウイルス粒子に由来し得、ＭＤＰは細菌細胞壁に由来し；サポニンは植物起源であり、スクアレンはサメ肝臓に由来し、組み換えの内因性免疫モジュレーターは、組み換え細菌、酵母、または哺乳類細胞に由来する。

ヒト使用には反応性が高すぎる鉱油乳濁液等、獣医学用ワクチンに対して認可されたいくつかのアジュバントがある。同様に、完全フロイントアジュバントは、公知の最も強力なアジュバントの１つであるが、ヒト使用には適さない。

担体という用語は、以下のように解釈される。担体は、第２の分子に結合された場合、後者に対する免疫応答を増大させる免疫原性分子である。一部の抗原は、本来免疫原性ではないが、キーホールリンペットヘモシアニンまたは破傷風トキソイド等の外来タンパク質分子と結び付いた場合に抗体応答を生じさせる能力があり得る。そのような抗原は、Ｂ細胞エピトープを含有するが、Ｔ細胞エピトープを含有しない。そのようなコンジュゲート（「担体」タンパク質）のタンパク質部分はＴ細胞エピトープを提供し、それがヘルパーＴ細胞を刺激し、それが今度は、形質細胞に分化しかつ抗原に対する抗体を産生するように抗原特異的Ｂ細胞を刺激する。

本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という単語ならびにこれらの単語の変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがそれに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、構成要素、整数またはステップを除外することを意図しない（および除外しない）。「本質的になる」とは、本質的な要件を有するが、本質的な要件の機能に著しく影響を及ぼさない要件を含むことを意味する。

本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、単数形は、文脈上別様に要されない限り、複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈上別様に要されない限り、複数性ならびに単一性を企図すると理解されるべきである。

本発明の特定の態様、実施形態または例とともに記載される特質、整数、特徴、化合物、化学的部分または化学基は、それをもって不適合でない限り、本明細書に記載される他の任意の態様、実施形態または例に適用可能であると理解されるべきである。

ここで、例を挙げて、かつ以下の図を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。

ユニバーサル鋳型（ＵＴ）支援によるクローニングフリーのダンベル産生のための基本的スキーム。ユニバーサルＤＮＡ鋳型は、プロモーター、発現カセット、および転写ターミネーター等の対象のコーディングまたはノンコーディング遺伝子を発現させるために要されるすべての配列を含む逆位リピートを含む二本鎖ＤＮＡである。逆位リピートは、一続きのヌクレオチドによって分離されている。ダンベル作出および精製のためのプロトコールは、４つのステップを含む。ステップ１：両方とも、対象の配列のアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかを導入する、５’－リン酸化順方向（Ｆｗ）および／または逆方向（Ｒｖ）プライマーを使用したユニバーサル鋳型のＰＣＲ増幅；ブロッキングオリゴｂ１およびｂ２を反応に添加して、鋳型リフォールディングを抑制しかつプライマー結合を促す。点線は、ＵＴを越えたプラスミド配列を表す。ステップ２：ダンベル構造プレフォールディングのために、ＰＣＲ産物を希釈し、熱変性させ、室温までゆっくりと冷却する。ステップ３：ダンベル構造を、一本鎖ＤＮＡリガーゼを使用して共有結合的に閉じる。ステップ４：Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いた処理により、オリゴおよびライゲートしていないダンベルＤＮＡを除去し、共有結合的に閉じたダンベルベクターＤＮＡを産出する。点線の矢印は、転写される配列を示す。すべてのステップ：シアン：（＋）鎖ＵＴ ＤＮＡ；マゼンタ：（－）マイナス鎖ＵＴ ＤＮＡ；灰色：ブロッキングオリゴ；緑色：センス（ｓ）配列；黄色：アンチセンス（ａｓ）配列。 ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ発現ダンベルベクターのユニバーサル鋳型（ＵＴ）支援によるクローニングフリー産生のためのスキーム。ユニバーサルＤＮＡ鋳型は、９９ｂｐの最小Ｈ１プロモーター（ｍＨ１）、ポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーター（Ｔ_５）、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３０前駆体ステム、の逆位リピートを含む２６２ｂｐの二本鎖ＤＮＡである。逆位リピートは、４つのＴによって分離されている（プラス鎖）。ダンベル作出および精製のためのプロトコールは、４つのステップを含む。ステップ１：両方とも、ｓｈＲＮＡループ配列の半分と一緒にｓｈＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかを導入する、５’リン酸化順方向（Ｆｗ）および／または逆方向（Ｒｖ）プライマーを使用したユニバーサル鋳型のＰＣＲ増幅；ブロッキングオリゴｂ１およびｂ２を反応に添加して、鋳型リフォールディングを抑制しかつプライマー結合を促す。点線は、ＵＴを越えたプラスミド配列を表す。ステップ２：ダンベル構造プレフォールディングのために、ＰＣＲ産物を希釈し、熱変性させ、室温までゆっくりと冷却する。ステップ３：ダンベル構造を、一本鎖ＤＮＡリガーゼを使用して共有結合的に閉じる。ステップ４：Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いた処理により、オリゴおよびライゲートしていないダンベルＤＮＡを除去し、共有結合的に閉じたダンベルベクターＤＮＡを産出する。点線の矢印は、転写される配列を示す。すべてのステップ：シアン：（＋）鎖ＵＴ ＤＮＡ；マゼンタ：（－）マイナス鎖ＵＴ ＤＮＡ；灰色：ブロッキングオリゴ；緑色：ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡセンス（ｓ）配列；黄色：ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡアンチセンス（ａｓ）配列。 より長いダンベルベクターのユニバーサル鋳型（ＵＴ）支援によるクローニングフリー産生のためのスキーム。ユニバーサルＤＮＡ鋳型は、プロモーター、発現カセット、および転写ターミネーター等の対象のコーディングまたはノンコーディング遺伝子を発現させるために要されるすべての配列を含む逆位リピートを含む二本鎖ＤＮＡである。逆位リピートは、一続きのヌクレオチドによって分離されている。ダンベル作出および精製のためのプロトコールは、４つのステップを含む。ステップ１：それぞれの最も外側のプライマーは５’リン酸化されている、各セットの順方向（Ｆｗ）および／または逆方向（Ｒｖ）プライマーを使用したユニバーサル鋳型のＰＣＲ増幅であって、両セットとも、対象の配列のアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかを段階的に導入する、ＰＣＲ増幅；２セットのブロッキングオリゴｂ１_ｎ＋ｉおよびｂ２_ｎ＋ｉを反応に添加して、鋳型リフォールディングを抑制しかつプライマー結合を促す。点線は、ＵＴを越えたプラスミド配列を表す。ステップ２：ダンベル構造プレフォールディングのために、ＰＣＲ産物を希釈し、熱変性させ、室温までゆっくりと冷却する。ステップ３：ダンベル構造を、一本鎖ＤＮＡリガーゼを使用して共有結合的に閉じる。ステップ４：Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いた処理により、オリゴおよびライゲートしていないダンベルＤＮＡを除去し、共有結合的に閉じたダンベルベクターＤＮＡを産出する。点線の矢印は、転写される配列を示す。すべてのステップ：シアン：（＋）鎖ＵＴ ＤＮＡ；マゼンタ：（－）マイナス鎖ＵＴ ＤＮＡ；灰色：ブロッキングオリゴ；緑色：センス（ｓ）配列；黄色：アンチセンス（ａｓ）配列。 ノンコーディングＲＮＡ発現ダンベルベクターのユニバーサル鋳型（ＵＴ）支援によるクローニングフリー産生のためのスキーム。ユニバーサルＤＮＡ鋳型は、プロモーター、発現カセット、および転写ターミネーター等の対象のノンコーディング遺伝子を発現させるために要されるすべての配列を含む逆位リピートを含む二本鎖ＤＮＡである。逆位リピートは、一続きのヌクレオチドによって分離されている。ダンベル作出および精製のためのプロトコールは、４つのステップを含む。ステップ１：それぞれの最も外側のプライマーは５’リン酸化されており、かつ非回文型配列が発現される対象となる場合に転写ターミネーターの逆相補体を導入し得る、各セットの順方向（Ｆｗ）および／または逆方向（Ｒｖ）プライマーを使用したユニバーサル鋳型のＰＣＲ増幅であって、両セットとも、対象の配列のアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかを段階的に導入する、ＰＣＲ増幅；２セットのブロッキングオリゴを反応に添加して、鋳型リフォールディングを抑制しかつプライマー結合を促す。点線は、ＵＴを越えたプラスミド配列を表す。ステップ２：ダンベル構造プレフォールディングのために、ＰＣＲ産物を希釈し、熱変性させ、室温までゆっくりと冷却する。ステップ３：ダンベル構造を、一本鎖ＤＮＡリガーゼを使用して共有結合的に閉じる。ステップ４：Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いた処理により、オリゴおよびライゲートしていないダンベルＤＮＡを除去し、共有結合的に閉じたダンベルベクターＤＮＡを産出する。点線の矢印は、転写される配列を示す。すべてのステップ：シアン：（＋）鎖ＵＴ ＤＮＡ；マゼンタ：（－）マイナス鎖ＵＴ ＤＮＡ；灰色：ブロッキングオリゴ；緑色：センス（ｓ）配列；黄色：アンチセンス（ａｓ）配列。 コーディングＲＮＡ発現ダンベルベクターのユニバーサル鋳型（ＵＴ）支援によるクローニングフリー産生のためのスキーム。ユニバーサルＤＮＡ鋳型は、プロモーター、発現カセット、および転写ターミネーター等の対象のコーディング遺伝子を発現させるために要されるすべての配列を含む逆位リピートを含む二本鎖ＤＮＡである。逆位リピートは、一続きのヌクレオチドによって分離されている。ダンベル作出および精製のためのプロトコールは、４つのステップを含む。ステップ１：それぞれの最も内側のプライマーは翻訳スタートコドンの逆相補体（５’ＣＡＴ３’）を導入し、それぞれの最も外側のプライマーは５’リン酸化されており、翻訳ストップコドンの逆相補体を導入する、各セットの順方向（Ｆｗ）および／または逆方向（Ｒｖ）プライマーを使用したユニバーサル鋳型のＰＣＲ増幅であって、両セットとも、対象の配列のアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかを段階的に導入する、ＰＣＲ増幅；２セットのブロッキングオリゴｂ１_ｎ＋ｉおよびｂ２_ｎ＋ｉを反応に添加して、鋳型リフォールディングを抑制しかつプライマー結合を促す。点線は、ＵＴを越えたプラスミド配列を表す。ステップ２：ダンベル構造プレフォールディングのために、ＰＣＲ産物を希釈し、熱変性させ、室温までゆっくりと冷却する。ステップ３：ダンベル構造を、一本鎖ＤＮＡリガーゼを使用して共有結合的に閉じる。ステップ４：Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いた処理により、オリゴおよびライゲートしていないダンベルＤＮＡを除去し、共有結合的に閉じたダンベルベクターＤＮＡを産出する。点線の矢印は、転写される配列を示す。すべてのステップ：シアン：（＋）鎖ＵＴ ＤＮＡ；マゼンタ：（－）マイナス鎖ＵＴ ＤＮＡ；灰色：ブロッキングオリゴ；緑色：センス（ｓ）配列；黄色：アンチセンス（ａｓ）配列。 ダンベル型二重発現ベクターのユニバーサル鋳型（ＵＴ）支援によるクローニングフリーの作出のための基本的スキーム。ユニバーサルＤＮＡ鋳型は、各鎖に１つある、同一であるまたは異なる２つのプロモーター、および潜在的に他の調節配列を含む二本鎖ＤＮＡである。ダンベル作出および精製のためのプロトコールは、４つのステップを含む。ステップ１：両方とも、対象の配列（同じまたは異なる配列）、転写ターミネーターの逆相補体（同じまたは異なる）、１つまたは複数の脱塩基位（ギャップ）、およびヘアピン構造を形成し得る５’末端配列を導入する、５’リン酸化順方向（Ｆｗ）および／または逆方向（Ｒｖ）プライマーを使用したユニバーサル鋳型のＰＣＲ増幅；ブロッキングオリゴｂ１およびｂ２を反応に添加して、鋳型リフォールディングを抑制しかつプライマー結合を促す。点線は、ＵＴを越えたプラスミド配列を表す。ステップ２：ダンベル構造プレフォールディングのために、ＰＣＲ反応を室温まで冷却する。ステップ３：ダンベル構造を、二本鎖ＤＮＡリガーゼを使用して共有結合的に閉じる。ステップ４：Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いた処理により、オリゴおよびライゲートしていないダンベルＤＮＡを除去し、共有結合的に閉じたダンベルベクターＤＮＡを産出する。点線の矢印は、転写される配列を示す。すべてのステップ：シアン：ＵＴ ＤＮＡ；黄色および緑色：対象の配列；マゼンタ：脱塩基プライマー部位（ギャップ）；灰色：ブロッキングオリゴ。 ダンベル型二重発現ベクターのユニバーサル鋳型（ＵＴ）支援によるクローニングフリーの作出のための詳細なスキーム。ユニバーサルＤＮＡ鋳型は、各鎖に１つある、同一であるまたは異なる２つのプロモーターＰ１およびＰ２を含む二本鎖ＤＮＡである。ダンベル作出および精製のためのプロトコールは、４つのステップを含む。ステップ１：両方とも、対象の配列ＳＯＩ１およびＳＯＩ２（同じまたは異なる配列）、転写ターミネーターの逆相補体Ｔ１（－）（同じまたは異なる）、１つまたは複数の脱塩基位（ギャップ）、ならびにヘアピン構造を形成し得る５’末端配列を導入する、５’リン酸化順方向（Ｆｗ）および／または逆方向（Ｒｖ）プライマーを使用したユニバーサル鋳型のＰＣＲ増幅；ブロッキングオリゴｂ１およびｂ２を反応に添加して、鋳型リフォールディングを抑制しかつプライマー結合を促す。点線は、ＵＴを越えたプラスミド配列を表す。ステップ２：ダンベル構造プレフォールディングのために、ＰＣＲ反応を室温まで冷却する。ステップ３：ダンベル構造を、二本鎖ＤＮＡリガーゼを使用して共有結合的に閉じる。ステップ４：Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを用いた処理により、オリゴおよびライゲートしていないダンベルＤＮＡを除去し、対象の配列ＳＯＩ１およびＳＯＩ２の発現のための２つの発現カセットＰ１（＋）－ＳＯＩ１－Ｔ１（＋）およびＰ２（＋）－ＳＯＩ２－Ｔ２（＋）を含む共有結合的に閉じたダンベルベクターＤＮＡを産出する。点線の矢印は、転写される配列を示す。すべてのステップ：シアン：ＵＴ ＤＮＡ；黄色および緑色：対象の配列；マゼンタ：脱塩基プライマー部位（ギャップ）；灰色：ブロッキングオリゴ。 ユニバーサル鋳型（ＵＴ）の配列、クローニング、および検証。（Ａ）ＵＴプラス鎖配列。シアン：ｍｉＲ－３０ ５’および３’ステム；マゼンタ：転写ターミネーター（センスおよびアンチセンス）；オレンジ：ループ形成テトラヌクレオチド配列；黒色：ｍＨ１配列（センスおよびアンチセンス）。（Ｂ）ＵＴクローニングスキーム。５’リン酸化オリゴＯＤＮ２およびＯＤＮ３を、それぞれオリゴＯＤＮ１およびＯＤＮ４とアニールさせた。結果として生じた二重鎖をライゲートし、二本鎖ＵＴ配列を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を使用してｐＶａｘ１にクローニングした。シアン：ＵＴプラス鎖；マゼンタ：ＵＴマイナス鎖。（Ｃ）アニールしたオリゴペアＯＤＮ１／２およびＯＤＮ３／４、ならびにライゲートしたハイブリッドを示した分析的１％アガロースゲル電気泳動。（Ｄ）クローニングしたプラスミドｐＶａｘ１－ＵＴの分析的ＨｉｎｄＩＩＩおよび／またはＢａｍＨＩ消化、ならびに１％アガロースゲル電気泳動。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ二重消化は、２６２ｂｐのＵＴバンドを示す。（Ｅ）ｐＶａｘ１－ＵＴのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩクローニングサイトのシーケンシング。 ＰＣＲベースのユニバーサル鋳型（ＵＴ）支援によるダンベル産生。（Ａ）ＵＴのＰＣＲ増幅は、ブロッキングオリゴの添加に依存する。ブロッキングオリゴを添加しないと（－）、ＰＣＲ増幅は観察されず、１２６ｂｐのリフォールドしたＵＴ一本鎖のみが検出された。ブロッキングオリゴを添加した場合（＋）、ＰＣＲ増幅された二本鎖ダンベルＤＮＡ（３０３ｂｐ）およびリフォールドしたダンベル一本鎖（１４６ｂｐ）の両方が検出された。（Ｂ）ＰＣＲ条件の最適化。ＰＣＲ収率は、５２℃～６５℃の域内のアニーリング温度とは事実上無関係であった。５％ ＤＭＳＯの添加により、二本鎖ダンベルＤＮＡの収率が上昇した。（Ｃ）図１に規定されるステップ１～４を参照したＤＮＡ産物の査定。ステップ１：ＰＣＲ ＵＴ増幅により、二本鎖ダンベルＤＮＡ（３０３ｂｐ）およびリフォールドしたダンベル一本鎖（１４６ｂｐ）が産出される；ステップ２：熱変性およびリフォールディングにより、二本鎖ダンベルＤＮＡはダンベル一本鎖に変換される；ステップ３：５’リン酸化プライマーをＰＣＲに使用した場合、一本鎖ＤＮＡライゲーションにより、ダンベルベクターＤＮＡは共有結合的に閉じる；ステップ４：エキソヌクレアーゼ処理により、ライゲートしていないＤＮＡが除去され、共有結合的に閉じたダンベルベクター（１４６ｂｐ）が産出される。 完全なプラスおよびマイナス鎖由来ルシフェラーゼ標的化ダンベルベクターの配列および構造。ラミンＡ／Ｃ標的化ベクターは、同じダンベルコアを持つ。 ダンベルベクター作出。ＰＣＲ産物の５’リン酸化による（左側）、またはこれに代えてＰＣＲ反応に５’リン酸化プライマーを使用することによる（右側）、１４６ｂｐのダンベルベクターＤＮＡの作出。ステップは、図１に規定されるステップ１～４を参照している。 細胞内ＦＡＣＳを使用してモニターされた、プラス（＋）およびマイナス（－）鎖由来ラミン標的化（Ｌａｍ）ダンベル（ｄｂ）ベクターによる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるラミンＡ／Ｃのノックダウン。（Ａ）ダンベルベクターおよび転写されるラミンＡ／Ｃ標的化ｓｈＲＮＡの配列および構造。ｓｈＲＮＡ二次構造は、ｍｆｏｌｄおよびＲＮＡｆｏｌｄによる予測に従って描かれた。（Ｂ～Ｄ）１つの実験の代表的なヒストグラム重ね合わせ。（Ｂ）染色された（一次抗ラミンＡ＋Ｃ抗体、それに加えて二次ロバ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ）対染色されなかった（一次抗ラミンＡ＋Ｃ抗体のみ）トランスフェクトされなかった生細胞。（Ｃ）０．１、０．５、もしくは２．５ｐｍｏｌのプラス鎖由来抗ラミンＡ／Ｃ ｓｈＲＮＡ発現ｄｂベクター［Ｌａｍ（＋）ｄｂ］、または３ｐｍｏｌの抗ラミンＡ／Ｃ陽性対照ｓｉＲＮＡ（Ｌａｍ－ｓｉＲＮＡ）によって誘発されたノックダウン。（Ｄ）０．１、０．５、もしくは２．５ｐｍｏｌのマイナス鎖由来抗ラミンＡ／Ｃ ｓｈＲＮＡ発現ｄｂベクター［Ｌａｍ（－）ｄｂ］、または３ｐｍｏｌのＬａｍ－ｓｉＲＮＡによって誘発されたノックダウン。（Ｅ～Ｇ）ラミンＡ／Ｃ染色細胞の画分によって表されるトランスフェクトされなかった細胞（１００％）と比べた、染色されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるラミンＡ／Ｃのノックダウン（Ｅ）、ラミンＡ／Ｃ染色細胞の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）（Ｆ）、およびラミンＡ／Ｃ染色細胞の蛍光強度中央値（Ｇ）。対照ダンベル（対照ｄｂ）は、プラスおよびマイナス鎖由来ルシフェラーゼ標的化ダンベルＤＮＡの１：１ミックスであった。値は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。統計分析を、スチューデントｔ検定を使用して実施した。Ｐ値は、染色されたトランスフェクションなし対照に対する有意性を示す。（Ｂ～Ｇ）ＮＴＣ：トランスフェクションなし対照；ＤＮＡなし対照：バッファーをトランスフェクトされた細胞。 プラス（Ａ）およびマイナス（Ｂ）鎖由来ルシフェラーゼ標的化ダンベルに対する変換収率の判定。非リン酸化順方向および５’－リン酸化逆方向プライマーを使用してＰＣＲを実施した。６μｇのＰＣＲ産物を変性させ、リフォールドさせ、１００Ｕ ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅを使用して５０μｌ反応容積においてライゲートした。ライゲートしたリフォールドしたダンベルＤＮＡをエキソヌクレアーゼで処理し、エキソヌクレアーゼの前および後の直接比較可能なサンプルを、１％アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。ライゲーションに成功した共有結合的に閉じたダンベルＤＮＡのみが、エキソヌクレアーゼ処理に耐性を示す。ソフトウェアＩｍａｇｅＪ ｖ１．４８を使用してバンド強度を定量化することによって判定された、ライゲートしていない全体的ダンベルＤＮＡをライゲートした全体的ダンベルＤＮＡに変換する収率。プラスまたはマイナス鎖由来ダンベルＤＮＡのいずれかのみ、すなわち総ＤＮＡの５０％のみが、理論的に各反応においてライゲートされ得ることから、プラスまたはマイナス鎖由来ダンベルＤＮＡの実際の変換収率は、検出された全体的変換収率の２倍高い。 プラス（＋）およびマイナス（－）鎖由来ルシフェラーゼ標的化（Ｌｕｃ）ダンベル（ｄｂ）ベクターによる、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるホタルルシフェラーゼのノックダウン。（Ａ）ダンベルベクターおよび転写されるルシフェラーゼ標的化ｓｈＲＮＡの配列および構造。ｓｈＲＮＡ二次構造は、ｍｆｏｌｄおよびＲＮＡｆｏｌｄによる予測に従って描かれた。（Ｂ）リン酸化順方向（５’Ｐ－Ｆｗ）または逆方向（５’Ｐ－Ｒｖ）プライマーのいずれかを使用した、（＋）または（－）鎖由来ｄｂベクターの選択的作出。ステップは、図１に規定されるステップ１～４を参照している。（Ｃ、Ｄ）プラス（＋）および／またはマイナス（－）鎖由来ルシフェラーゼ標的化ｄｂベクターの機能的検証。細胞に、ホタルルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３および０．５または１．５ｐｍｏｌのダンベルベクターＤＮＡを共トランスフェクトした。ＮＴＣ：トランスフェクションなし対照。阻害されていない陰性対照に対するホタルルシフェラーゼｍＲＮＡ（Ｃ）または発現（Ｄ）レベルを、ＲＴ－ｑＰＣＲまたはルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、トランスフェクションの４８時間後に測定した。相対ＲＮＡレベルを倍変化（２^{－ΔΔＣｔ}）の観点から算出した。ここで、ΔＣｔ＝Ｃ_{ｔ ルシフェラーゼ}－Ｃ_{ｔ β－アクチン}。値は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。統計分析を、スチューデントｔ検定（Ｃ）またはテューキーの事後多重比較検定とともに反復一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｄ）を使用して実施した。 エキソヌクレアーゼ処理後のダンベルベクターの純度制御。（Ａ）プラス（＋）およびマイナス（－）鎖由来ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）およびラミンＡ／Ｃ（Ｌａｍ）標的化ダンベル（ｄｂ）ベクターの１％アガロースゲル電気泳動。（Ｂ）Ｌａｍ（－）ｄｂ ＤＮＡのキャピラリーゲル電気泳動（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ）。同定された１３６ｂｐのピークは、１４６ｂｐのダンベルベクターＤＮＡを指す。検出されたおよび予想されたベクターサイズの違いは、ダンベルベクターＤＮＡのゲル遅延度が、ＤＮＡラダーマーカーの二本鎖ＤＮＡフラグメントのものとわずかに異なるという事実を指す。 細胞内蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるラミンＡ／Ｃ発現のモニタリング。トランスフェクトされなかった細胞（ＮＴＣ）における細胞ラミンＡ／Ｃ発現を、抗ラミンＡ＋Ｃ一次抗体によって標識し（左のパネル：染色されなかった）、次いでロバ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ａ二次抗体で染色した（右のパネル：染色された）。生きたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲーティング（Ａ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ａ散布図（Ｂ）、およびヒストグラム（Ｃ）。

配列表
配列番号１：
５’－ＡＧＣＴＴＣＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＡＡＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＣＡＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＧＣＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＣＣＡＧＴＴ－３’
配列番号２：
５’Ｐ－ＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＡ－３’
配列番号３：
５’Ｐ－ＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧ－３’
配列番号４：
５’－ＧＡＴＣＣＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＡＡＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＣＡＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＧＣＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＣＣＡＧＡＡＡＡＣＴ－３’
配列番号５：
５’－ｔｇａａｇｇｃｔｃｃｔｃａｇａａａｃａｇｃｔｃＣＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴ－３’
配列番号６：
５’－ｔｇａａａｇｃｃｃａｇａｔｃｇｔｃａｃｃａｃｃｃｇｃＣＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴ－３’
配列番号７：
５’－ａｇａｇａｇｇｃｔｃｃｔｃａｇａａａｃａｇｃｔｃＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴ－３’
配列番号８：
５’－ａｇａｇａａｇｃｃｃａｇａｔｃｇｔｃａｃｃａｃｃｔｔＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴ－３’
配列番号９：
５’－ＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＡ－３’
配列番号１０：
５’－ＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧ－３’
配列番号１１：
５’－ＣＧＣＴＧＧＧＣＧＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＡ－３’
配列番号１２：
５’－ＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧ－３’
配列番号１３：
５’－ＧＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧＴＣＣＣＡＧＴ－３’
配列番号１４：
５’－ＧＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＴ－３’
配列番号１５：
５’－ＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＡＡＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＣＡＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＧＣＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＣＣＡＧ－３’
配列番号１６：
５’－ＣＵＵＣＵＣＡＧＵＧＡＧＣＧＣＧＧＡＧＣＵＧＵＵＵＣＵＧＡＧＧＡＧＣＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＵＣＣＵＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＵＣＵＵＵＧＣＣＵＡＣＵＧＡＧＡＡＧＡＵＵ－３’
配列番号１７：
５’－ＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＡＡＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＣＡＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＧＣＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＣＣＡＧ－３’
配列番号１８：
５’－ＣＵＵＣＵＣＡＧＵＧＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＣＵＧＵＵＵＣＵＧＡＧＧＡＧＣＣＵＣＵＣＵＵＧＡＡＧＧＣＵＣＣＵＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＵＣＣＧＣＧＣＵＣＵＡＣＵＧＡＧＡＡＧＡＵＵ－３’
配列番号１９：
５’－ＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＡＡＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＣＡＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＧＣＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＣＣＡＧ－３’
配列番号２０：
５’－ＣＵＵＣＵＣＡＧＵＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＡＧＡＵＣＧＵＣＡＣＣＡＣＣＵＵＣＡＡＧＡＧＡＧＧＵＧＧＵＧＡＣＧＡＵＣＵＧＧＧＣＵＵＵＵＧＣＣＵＡＣＵＧＡＧＡＡＧＡＵＵ－３’
配列番号２１：
５’－ＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＣＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＡＡＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＣＡＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＧＣＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＣＣＡＧ－３’
配列番号２２：
５’－ＣＵＵＣＵＣＡＧＵＧＡＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＣＡＧＡＵＣＧＵＣＡＣＣＡＣＣＣＵＣＵＵＧＡＡＧＧＵＧＧＵＧＡＣＧＡＵＣＵＧＧＧＣＵＣＧＣＧＣＵＣＡＣＵＧＡＧＡＡＧＡＵＵ－３’

配列番号２４：
５’－ＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＡＡＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＣＡＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＧＣＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＣＣＡＧ－３’
配列番号２５：
５’－ＴＴＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＡＡＣＡＧＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＣＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＡＡＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＴＴＣＡＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＴＡＧＣＧＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＣＣＡＧ－３’

材料および方法
オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）およびプライマー
ユニバーサル鋳型。内部自己相補性に起因して、ユニバーサル鋳型は、遺伝子合成によって作出され得ず、その代わりに２組のペアの相補的オリゴデオキシリボヌクレオチドから組み立てられた（ＩＤＴ、Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬ）（図Ｓ１Ａ、Ｂ）：オリゴＵＴ１：

；オリゴＵＴ２：５’Ｐ－ＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＡ－３’；オリゴＵＴ３：５’Ｐ－ＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧ－３’；オリゴＵＴ４：

。太字：ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ適合オーバーハング；下線：ダンベルループ形成テトラヌクレオチド。５’リン酸化オリゴＵＴ２およびＵＴ３を、それぞれ相補的オリゴＵＴ１およびＵＴ４とハイブリダイズさせた。結果として生じたＵＴ１／ＵＴ２およびＵＴ３／ＵＴ４二重鎖をライゲートして、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ適合５’オーバーハングを持するユニバーサル鋳型配列を形成し、その後それをｐＶａｘ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）にクローニングし、ユニバーサル鋳型ベクターｐＶａｘ１－ＵＴを産出した（図Ｓ１Ｂ）。クローニングに関しては、本発明者らは、ｒｅｃＡ欠損大腸菌系統Ｔｏｐ１０を使用した。ユニバーサル鋳型のクローニングを、ＰＣＲによっておよびＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）エンドヌクレアーゼ的切断によって確認し、その後に、２６２ｂｐの予想インサートサイズをもたらす分析的アガロースゲル電気泳動、およびライゲーション部位のシーケンシングが続いた（図Ｓ１Ｃ、Ｄ）。完全なユニバーサル鋳型のシーケンシングは、高度の自己相補性に起因して不成功に終わった。

ホタルルシフェラーゼまたはラミンＡ／Ｃ標的化ｓｈＲＮＡを発現するダンベルを産生するためのプライマー。ルシフェラーゼまたはラミンＡ／Ｃ特異的プライマーは、ＡＩＴｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）またはＩＤＴ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）によって合成された。大文字はユニバーサル鋳型結合部位を示し、小文字はｓｈＲＮＡコード配列を示し、ループ形成ヌクレオチドに下線が引かれている：順方向プライマー：ＦＰ＿ルシフェラーゼ５’－ｔｇａａｇｇｃｔｃｃｔｃａｇａａａｃａｇｃｔｃＣＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴ－３’；ＦＰ＿ラミン５’－ｔｇａａａｇｃｃｃａｇａｔｃｇｔｃａｃｃａｃｃｃｇｃＣＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴ－３’。逆方向プライマー：ＲＰ＿ルシフェラーゼ５’－ａｇａｇａｇｇｃｔｃｃｔｃａｇａａａｃａｇｃｔｃＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴ－３’。ＲＰ＿ラミン５’－ａｇａｇａａｇｃｃｃａｇａｔｃｇｔｃａｃｃａｃｃｔｔＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＴ－３’。

ブロッキングＯＤＮ：２種のブロッキングＯＤＮ（ＩＤＴ、Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬ）をＰＣＲに添加して、ユニバーサル鋳型鎖のリフォールディングおよび自己プライミングを抑制した。ブロック＿１：
５’－ＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＡ－３’；ブロック＿２：５’－ＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＡＧＧＣＡＡＡＧ－３’。

定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）のためのプライマー。ルシフェラーゼおよびβ－アクチンｍＲＮＡレベルを定量化するためのプライマーは、ＡＩＴｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）によって合成された。ＰＣＲ順方向プライマー：ｑＰＣＲ＿ＦＰ＿ルシフェラーゼ５’－ＣＧＣＴＧＧＧＣＧＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＡ－３’；ｑＰＣＲ＿ＲＰ＿β－アクチン５’－ＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧ－３’逆転写およびＰＣＲ逆方向プライマー：ｑＰＣＲ＿ＲＰ＿ルシフェラーゼ５’－ＧＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＧＴＣＣＣＡＧＴ－３’；ｑＰＣＲ＿ＲＰ＿β－アクチン５’－ＧＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＴ－３’。

プライマーリン酸化。鎖特異的ダンベルベクターの作出に関しては、順方向または逆方向プライマーのいずれかを５’－リン酸化した。各５０ｐｍｏｌのプライマーを、１ｍＭ ＡＴＰの存在下で１０Ｕ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）とともに３７℃で２０分間インキュベートし、その後に７５℃で１０分間の酵素の熱不活性化が続いた。

ダンベルベクター作出
ダンベルベクターＤＮＡのＰＣＲ増幅。ユニバーサル鋳型、およびｓｈＲＮＡコードＤＮＡの付属物のＰＣＲ増幅を、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中３０～５０μｌの反応容量で、１Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．０μＭの各プライマーおよびブロッキングＯＤＮ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＶａｘ１－ＵＴ、５％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して行った。ｐＶａｘ１－ＵＴの線形化は、通常ＰＣＲ収率を向上させるが、必須ではない。熱サイクルを以下のとおり行った：９６℃で５分間の初回変性；２７サイクルの変性（９５℃、３０秒間）、アニーリング（５９℃、３０秒間）、および伸長（７２℃、１分間）；ならびに７２℃で１０分間の最終伸長。５０μｌのＰＣＲ反応により、約１０μｇのＤＮＡが産出された。

鎖分離およびアニーリング。ＰＣＲ産物を、シリカ膜ベースのスピンカラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を通して精製した。精製された産物を、１×ハイブリダイゼーションバッファー（１Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中４００μｌに希釈し、９６℃で５分間熱変性させ、その後に室温への漸進的冷却が続いて、プラスおよび／またはマイナス鎖ダンベルベクターの分子内フォールディングを可能にした。結果として生じたＤＮＡを、エタノール沈殿を使用して濃縮し、遠心分離によってペレットにし、ヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。

一本鎖ループＤＮＡのライゲーション。１～６μｇ（約１０～６０ｐｍｏｌ）のＤＮＡを、１×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩ反応バッファー中、２．５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、１Ｍベタイン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、および５０～１００Ｕ ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅＩＩ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）とともに６０℃で１６時間インキュベートし、その後に８０℃で１０分間のリガーゼの熱不活性化が続いた。６μｇ ＤＮＡと１００Ｕ ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅとをライゲートした場合に、最も高い変換収率が観察された。

エキソヌクレアーゼ処理。ライゲーションの後、産物を１０ＵのＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて３７℃で１時間処理し、その後に８０℃で１０分間の熱不活性化が続いた。産物を１０％ネイティブポリアクリルアミドゲルまたは１％アガロースゲルで査定し、電気泳動後にエチジウムブロマイドで染色し、かつ／またはフェノール－クロロホルム－イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出（１×）、クロロホルム－イソアミルアルコール（２４：１）再抽出（３×）、およびエタノール沈殿を使用して精製した。

標的遺伝子ノックダウンアッセイ
ルシフェラーゼノックダウンアッセイ。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン抗生物質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）中で維持した。トランスフェクションの２４時間前に、２×１０^４個細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種した。細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）および１：２．５の試薬：ＤＮＡ比を使用して、１００ｎｇのルシフェラーゼ発現プラスミドｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および１．５ｐｍｏｌまたは０．５ｐｍｏｌのプラスまたはマイナス鎖ダンベルベクターＤＮＡのいずれかを共トランスフェクトした。陽性対照（ｐＧＬ３のみ）に関しては、空のｐＶａｘ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）をフィーダーＤＮＡとして使用して、すべての細胞が同量のＤＮＡを受けることを確保した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を無菌ＰＢＳで洗浄し、穏やかな振とうを採用して２０μｌ ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中で２０分間溶解した。１０μｌの溶解物を５０μｌのＬＡＲＩＩ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で処理し、発光をＢｉｏｔｅｋリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で定量化した。

細胞内蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるラミンＡ／Ｃノックダウンのモニタリング。上記されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養し、トランスフェクションの２４時間前に９６ウェルプレートに播種した。細胞に、メーカーのプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、０．１、０．５、もしくは２．５ｐｍｏｌのダンベルベクターＤＮＡまたは３ｐｍｏｌのｓｉＧＥＮＯＭＥＬａｍｉｎ Ａ／Ｃ対照ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に培地を変え、４８時間後に細胞を収穫した。ＦＡＣＳ分析に関しては、培地を吸引し、細胞を、５０μｌの１×トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いたトリプシン処理の前にＰＢＳで１回リンスした。トリプシン処理された細胞を、４２００ｒｐｍで６分間の遠心分離によって２００μｌ培地中に回収した。ペレットになった細胞を１００μＬ培地に再懸濁し、細胞内染色の前に、メーカーのプロトコールに従ってＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて固定しかつ透過処理した。ラミンＡ／Ｃノックダウンを査定するために、細胞ラミンＡ／Ｃを抗ラミンＡ＋Ｃ抗体（ａｂ１３３２５６）（１／２００）およびロバ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ ＡＦ６４７（ａｂ１５００７５）（１／２００）（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）によって染色した。ＦＡＣＳをＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞アナライザーで実施し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアｖ６．１．３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）をサンプルの取得に使用した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアＶ１０．５．２（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）をデータ分析に使用した。

コンピューターによる二次構造予測
ＤＮＡおよびＲＮＡの最小自由エネルギー二次構造を、ｍｆｏｌｄおよび／またはＲＮＡｆｏｌｄアルゴリズムを使用してフォールドした^{１７、１８}。

統計分析
図表は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。テューキーの事後多重比較検定とともに反復一元配置ＡＮＯＶＡを使用して（ルシフェラーゼノックダウンデータ）またはスチューデントｔ検定を使用して（ラミンＡ／Ｃノックダウンデータ）、統計分析を実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を統計分析に使用した。Ｐ値は示されるとおりである。

例：
ダンベル型ベクターを作出するための、ユニバーサル鋳型支援によるクローニング－およびエンドヌクレアーゼフリーの方法
最先端のプロトコールにおいて、あらゆる新しいダンベルベクターの作出は、プラスミドベクター内のダンベルに取り入れられるべき対象の配列を個々にクローニングすることから始まる。本発明の方法は、プロモーター、エンハンサー、ＤＮＡ核局在化シグナル、イントロン、転写ターミネーター、ＲＮＡ核エクスポートシグナル、ＷＰＲＥ、またはその他等の調節配列を含む１種のユニバーサル鋳型のみを調製することを要する。次いで、対象の配列は、化学合成されたＰＣＲプライマーにより導入され、さらなるクローニングもエンドヌクレアーゼも要されない（図１～７）。そのように作出されたダンベルは、分子デコイまたは発現ベクターとして機能し得る。発現ベクターは、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ、およびアンチセンスｍｉＲＮＡを含めたノンコーディングＲＮＡを発現し得（図１～４、６、７）、かつ／またはペプチドもしくはタンパク質コードＲＮＡを発現し得る（図５～７）。ｓｈＲＮＡおよびｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ等のヘアピン構造ＲＮＡに対する発現カセットは、ヘアピン鋳型転写発現カセットとして設計され得、発現カセットは、転写されたＲＮＡのヘアピン構造に似ている。これらのベクターにおいて、冗長な配列は排除され、転写は、ダンベルループの１つを周回する。ヘアピン鋳型転写ダンベルベクターは、本発明の方法を使用して作出され得る（図１～５）。

新しい方法は、ｓｈＲＮＡ発現に関しては、（ｉ）最小Ｈ１プロモーター^１５、（ｉｉ）ポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーター（Ｔ_５）、および（ｉｉｉ）ｈｓａ－ｍｉＲ－３０前駆体ステム、の逆位リピートを含む、ユニバーサルＤＮＡ鋳型のＰＣＲ増幅に基づく（図８Ａ）。ｈｓａ－ｍｉｒ－３０ステムは、ｓｈＲＮＡプロセシングを促すことが報告され、ダンベルベクター設計に上手く取り入れられている^{１３、１６}。いったん作出されると、ユニバーサル鋳型は、任意のｓｈＲＮＡ発現ダンベルベクターのクローニングフリーの作出に使用され得る。それぞれの小型ＲＮＡの発現をコードする配列を、ＰＣＲプライマーによってＰＣＲの間に導入する（ステップ１）。ＰＣＲプライマーの小型ＲＮＡ特異的５’部分に関係なく、それらはすべて同じ３’末端標的結合部位を持ち、それは並列化ＰＣＲ増幅を促す。ユニバーサルＤＮＡ鋳型の両鎖は高度の自己相補性を有し、その増幅を向上させるために、ブロッキングオリゴをＰＣＲ反応に添加して、変性したＤＮＡの分子内リフォールディングを抑制しかつプライマー結合を支持する。結果として生じた二本鎖ＰＣＲ産物の２本のＤＮＡ鎖（＋および－）のそれぞれは、希釈、熱変性、および分子内リフォールディングの後に、ぶら下がった５’および３’端を有する開いたダンベル足場を産出する（ステップ２）。次いで、これらの端を、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを使用してライゲートする（ステップ３）。５’または３’端を持つすべてのＤＮＡ分子を、エキソヌクレアーゼ消化によって除去し、混じりけがない共有結合的に閉じたダンベルベクターを産出する（ステップ４）。１種または２種の５’－リン酸化ＰＣＲプライマーのいずれかを使用するという決定をすると、プラス鎖、マイナス鎖、または両鎖によりダンベルベクターが産生される。

ユニバーサル鋳型の作出は、高度の自己相補性に起因して困難であり、遺伝子合成によってユニバーサル鋳型を作出するすべての試みが失敗した。その代わりに、ユニバーサル鋳型を、２組のペアの相補的オリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ）から組み立て、自己相補的配列部分を互いから分離した（図８Ａ～Ｃ）。相補的オリゴのペアをアニールさせ、それぞれは１つの相補的３’オーバーハングおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＢａｍＨＩ ５’オーバーハングのいずれかを形成した。次いで、アニールしたオリゴのペアを、粘着性３’端を使用してまずライゲートし、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩクローニングサイトを使用してクローニングベクターｐＶａｘ１に挿入し、ユニバーサル鋳型ベクターｐＶａｘ１－ＵＴを産出した。ユニバーサル鋳型のクローニングの成功を、分析的制限エンドヌクレアーゼ切断およびその後のフラグメントのゲル電気泳動によって、ならびにシーケンシングによって証明した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ二重消化により２６２ｂｐの予想インサートサイズが産出され；完全なインサートのシーケンシングは、インサート自己相補性に起因して不成功であったが、クローニング部位はシーケンシングされ得た（図８Ｄ、Ｅ）。

次に、本発明者らは、公開されたホタルルシフェラーゼ標的化ｓｈＲＮＡ^９をコードする配列を導入するプライマーを使用して、ユニバーサル鋳型をＰＣＲ増幅することを目指した。しかしながら、ユニバーサル鋳型の固有の自己相補性は、従来のＰＣＲ増幅を妨げており、それは、予想サイズのいかなる産物も産出しなかった。産物は、２種の長いブロッキングオリゴをＰＣＲ反応に添加した後に観察された（図９Ａ）。これらのブロッキングオリゴを、それらが、ユニバーサル鋳型のプラスまたはマイナス鎖のそれぞれの５’半分に相補的であり、ゆえに分子内鎖リフォールディングを抑制し、鋳型ＤＮＡの３’末端へのプライマー結合を促すように設計した（図２）。ブロッキングオリゴはユニバーサル鋳型配列に結合するため、それらは、このダンベル作出プロトコールの不変の標的－およびｓｈＲＮＡ非依存的構成要素である。得られたＰＣＲ産物は、サイズが二本鎖ユニバーサル鋳型（３０３ｂｐ）およびリフォールドした一本鎖（１４６ｂｐ）に相当した。ＰＣＲ反応への５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯの添加により、プライマー結合および伸長が一本鎖リフォールディングとより上手く競合したことから、より多くのより大きな産物を産出し、より効率的な増幅を示した（図９Ｂ）。次いで、精製されたＰＣＲ産物の熱変性およびリフォールディングにより、より多くのヘアピン構造一本鎖が産出された（図９Ｃ、レーン２）。予想どおり、ｓｓＤＮＡライゲーション（レーン３）および後続のエキソヌクレアーゼ消化（レーン４）は、５’－リン酸化プライマーをＰＣＲに使用した場合にのみ、エキソヌクレアーゼ耐性ダンベルベクターＤＮＡを産出した（図９Ｃ）。

５’－リン酸化順方向プライマー、５’－リン酸化逆方向プライマー、または２種のリン酸化プライマーのいずれかをＰＣＲに使用する決定をすると、（ｉ）プラス鎖由来ダンベル、または（ｉｉ）マイナス鎖由来ダンベル、または（ｉｉｉ）両方のミックスが作出され得る（図２および１０）。プラスおよびマイナス鎖由来ダンベルのミックスを得るために、ＰＣＲプライマーまたはこれに代えてＰＣＲ産物の５’端がリン酸化されるかどうかは違いを生じさせない（図１１）。この例において、プラスおよびマイナス鎖由来ダンベルならびに発現したｓｈＲＮＡは非常に類似しているが、それらは、ループにおけるおよびｈｓａ－ｍｉＲ－３０ステムにおける配列および構造に関して異なることから同一ではない（図１２Ａおよび１０）。ｍｉＲＮＡステム領域における非対称性は、部分的にミスマッチのｍｉＲＮＡ前駆体ＲＮＡの正しい転写は、ヘアピン鋳型転写ダンベルが、相当するミスマッチも持つ場合にのみ達成され得るという事実によるものである。その結果として、プラス鎖由来ダンベルのみが、元のｍｉＲ－３０ステムを有して伸長したｓｈＲＮＡを発現する（図１２Ａ）。マイナス鎖由来ダンベルから発現されるｓｈＲＮＡは、ｍｉＲ－３０のアンチセンス配列によって形成されるｍｉＲ様ステムを有して伸長され、プラス鎖由来ｓｈＲＮＡにおけるループの逆相補体であるループを担持する。観察された変換収率、すなわちライゲーションに成功しかつ後続のエキソヌクレアーゼ処理に耐性である、リフォールドした１４６ｂｐのダンベルベクターＤＮＡの画分は、プラスまたはマイナス鎖由来ルシフェラーゼ標的化ダンベルの産生に対して３４％または２８％であることが測定された（図１３）。１種のＰＣＲプライマーのみが、これらのダンベルの作出のためにリン酸化されること、およびその結果として、リフォールドしたＤＮＡの半分のみが理論的にライゲートされ得ることを考慮した場合には、ライゲート可能なプラスまたはマイナス鎖由来ダンベルＤＮＡの実際の変換収率は６８％または５６％である。これらの反応において、本発明者らは、１００ＵのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅを使用して６μｇのＤＮＡをライゲートした。

リン酸化された順方向または逆方向プライマーのいずれかを使用した上記プロトコールを採用して、本発明者らは、プラスおよびマイナス鎖由来ルシフェラーゼ－またはラミンＡ／Ｃ標的化ダンベルの両方を別個の反応において作出した（図１２および１４）。エキソヌクレアーゼ処理後のベクターの純度を、アガロースゲル電気泳動を使用して制御した（図１５Ａ）。付加的なキャピラリーゲル電気泳動により、マイナス鎖由来ラミンＡ／Ｃ標的化ダンベルの純度は８３％であることが判定された（図１５Ｂ）。ダンベルベクターにより誘発されるルシフェラーゼノックダウンを測定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を使用して、ルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３－Ｃｏｎｔｒｏｌおよび０．５または１．５ｐｍｏｌのプラスまたはマイナス鎖由来ダンベルベクターＤＮＡを共トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡおよび活性レベルを、ｐＧＬ３－Ｃｏｎｔｒｏｌベクターに対して定量化した（図１２Ｃ、Ｄ）。両方のダンベルとも有意な用量依存的ルシフェラーゼノックダウンを誘発し、それは驚くべきことに、マイナス鎖由来ダンベルベクターの場合においてより顕著であり、非天然ｍｉＲ様ステムが機能的であることを示した。それぞれｐＧＬ３陽性対照と比べて、プラス鎖由来ダンベルによって誘発されたノックダウンは、１．５または０．５ｐｍｏｌベクターＤＮＡで８５％（ｐ＜０．００１）または５０％（ｐ＜０．００１）であり、マイナス鎖由来ダンベルは、１．５または０．５ｐｍｏｌ ＤＮＡで９７％（ｐ＜０．００１）または７５％（ｐ＜０．００１）のノックダウンを誘発した。ラミンＡ／Ｃのノックダウンを検討するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を使用して、０．１、０．５、もしくは２．５ｐｍｏｌのプラスもしくはマイナス鎖由来ダンベルベクターＤＮＡ、またはこれに代えて３ｐｍｏｌ ｓｉＧＥＮＯＭＥＬａｍｉｎ Ａ／Ｃ陽性対照ｓｉＲＮＡ、または０．５ｐｍｏｌルシフェラーゼ標的化ダンベル対照ベクターＤＮＡ（プラスおよびマイナス鎖由来ダンベルの１：１ミックス）をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞内ラミンＡ／Ｃを、ウサギ抗ラミンＡ＋Ｃ一次抗体およびロバ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ ＡＦ６４７二次抗体を使用して染色し、ラミンＡ／Ｃノックダウンをフローサイトメトリー分析によってモニターした（図１４、１６）。プラス鎖由来ダンベルは、２．５または０．５ｐｍｏｌ ＤＮＡで有意な用量依存的ラミンＡ／Ｃノックダウンを誘発した一方で、マイナス鎖由来ダンベルに関して観察されたノックダウンはそれほど顕著ではなかった。

本明細書に記載されるプロトコールは、ダンベルベクター産生のための以前に報告されたプロトコールのすべての利点を組み合わせている。それは、（ｉｉ）いかなる制限またはニッキングエンドヌクレアーゼも伴わない（ｉ）クローニングフリーのプロトコールであり、それは、（ｉｉｉ）効率的な分子内ライゲーション反応を採用し、それは（ｉｖ）極めて小型のヘアピン鋳型転写ダンベルベクターの産生を可能にする。以前に記載されたギャッププライマーＰＣＲプロトコールも分子内ライゲーションを伴うが、あらゆる新しいベクターの作出にクローニングステップを要し、脱塩基配列箇所の存在に起因してヘアピン鋳型転写ベクターを作出するのに適さない^１４。逆に、Ｊｉａｎｇらによって記載される方法は、ヘアピン鋳型転写ダンベルを産生するのに適しているが、制限およびニッキングエンドヌクレアーゼを要し、あまり効率的でない分子間ライゲーション反応を伴う^９、１３。本明細書に報告されるプロトコールに使用されるＰＣＲプライマーは、常に、同じ３’末端鋳型結合部位、ならびに、それぞれの小型ＲＮＡに依存しかつそれによって変化するが、各それぞれのプライマーペア内でかなりの程度まで同一である５’末端配列を持つ。それゆえ、プライマーアニーリング温度は常に同じであり、プライマーダイマー形成は広範囲にわたって除外され得、その両方とも、単一のサイクルプログラムを使用した並列化ＰＣＲ反応を促す。後続のライゲーション反応は、分子間ループライゲーションを伴う代替プロトコールと比較して概してより効率的である分子内ライゲーションである。当然の結果として、本方法に関して観察される変換収率は、分子間ライゲーション反応を採用するプロトコールに関して報告されるものよりも高い。ギャッププライマーＰＣＲ法に関しては、二本鎖でニックの入ったダンベルＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用してライゲートした場合、最高９２％というより高い変換収率が観察された；しかしながら、ぶら下がった一本鎖５’端と塩基対合した３’端とをＣｉｒｃＬｉｇａｓｅを使用してライゲートした場合、７５％というほんのわずかに高い変換収率が、ギャッププライマーＰＣＲ法に関して観察された。本明細書に記載される方法を用いて産生されるダンベルＤＮＡの純度は、ギャッププライマーＰＣＲ法を用いて産生されるベクターの８２％～９４％の純度域内であった。将来の前臨床および臨床適用には、付加的な精製ステップが要されるであろう。

本発明者らは、この新しい方法が、部分的にミスマッチのｓｈＲＮＡ発現ダンベルベクターを作出し得るという原理証明を実証し、該技術はｍｉＲＮＡ発現ダンベルの作出をも探求され得ることを示す。ダンベルベクターにおけるミスマッチは以前に報告され、ベクター活性を損なわないことが実証された^１３。それどころか、末端の単一ヌクレオチドミスマッチは、ダンベル型発現ベクターの核標的化および活性を向上させることが見出された^１４。

本発明者らは、ルシフェラーゼ－またはラミンＡ／Ｃ標的化ダンベルの中で、マイナスまたはプラス鎖由来ダンベルが、それぞれより強い標的遺伝子ノックダウン活性を呈することを観察した。この違いは、ｓｈＲＮＡループおよびステムの配列および構造に依存するダイサーによる内因性ｓｈＲＮＡプロセシングの効率および精度に関する違いに起因し得る。ｍｉＲＮＡステムは、ほとんどの場合においてｓｈＲＮＡプロセシングおよびノックダウン活性を促すことが報告されたことから^１６、本明細書において、本発明者らはｈｓａ－ｍｉＲ－３０ステムを採用した。その結果として、それぞれのプラスおよびマイナス鎖由来ダンベルは、同一のガイド配列をコードするにもかからわらず、転写された小型ヘアピンＲＮＡは、上で強調されるように、異なるマイクロＲＮＡステムおよび異なるループを含む。それゆえ、ダイサープロセシングの違いは、異なるガイドＲＮＡレベルならびに／またはガイドＲＮＡ配列の正確な５’および３’終結に関する違いにつながり得る。これらの違いは、標的配列ならびに相当するガイドＲＮＡ配列および構造に応じて、プラスまたはマイナス鎖由来ダンベルのいずれかが、より強い標的遺伝子ノックダウンを誘発するという観察結果を説明し得る。しかしながら、ｍｉＲＮＡステムの内包を見送った場合、および回文型ループ配列を同時に考慮した場合、プラスおよびマイナス鎖由来ダンベルの両方は同一であると考えられ、単一の反応により、単一のベクターのみが作出される。

結論として、この新規の方法は、短期間にかつ低コストで、サイズ最小化ヘアピン鋳型転写ダンベルを効率的に作出し、機能的ゲノムスクリーニングまたは薬物開発のためのｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ発現ベクターの並列化産生を探求できる。

参考文献
１．Ｂｉａｓｃｏ， Ｌ．， Ｂａｒｉｃｏｒｄｉ， Ｃ． ａｎｄ Ａｉｕｔｉ， Ａ． （２０１２）． Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔｒｉａｌｓ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２０， ７０９－７１６．
２．Ｙｉｎ， Ｈ．， Ｋａｎａｓｔｙ， Ｒ．Ｌ．， Ｅｌｔｏｕｋｈｙ， Ａ．Ａ．， Ｖｅｇａｓ， Ａ．Ｊ．， Ｄｏｒｋｉｎ， Ｊ．Ｒ． ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ． （２０１４）． Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １５， ５４１－５５５．
３．Ｍｏｋ， Ｐ．Ｌ．， Ｃｈｅｏｎｇ， Ｓ．Ｋ．， Ｌｅｏｎｇ， Ｃ．Ｆ．， Ｃｈｕａ， Ｋ．Ｈ． ａｎｄ Ａｉｎｏｏｎ， Ｏ． （２０１２）． Ｅｘｔｅｎｄｅｄ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｉａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＩＤＧＥ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｉｎｔｏ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ６４， ２０３－２１６．
４．Ｋａｕｒ， Ｔ．， Ｓｌａｖｃｅｖ， Ｒ．Ａ． ａｎｄ Ｗｅｔｔｉｇ， Ｓ．Ｄ． （２００９）． Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ： Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９， ４３４－４５８．
５．Ｌｏｐｅｚ－Ｆｕｅｒｔｅｓ， Ｌ．， Ｐｅｒｅｚ－Ｊｉｍｅｎｅｚ， Ｅ．， Ｖｉｌａ－Ｃｏｒｏ， Ａ．Ｊ．， Ｓａｃｋ， Ｆ．， Ｍｏｒｅｎｏ， Ｓ．， Ｋｏｎｉｇ， Ｓ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． （２００２）． ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｉｎｅａｒ ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ （ＭＩＤＧＥ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｖａｃｃｉｎｅ． ２１， ２４７－２５７．
６．Ｓｃｈａｋｏｗｓｋｉ， Ｆ．， Ｇｏｒｓｃｈｌｕｅｔｅｒ， Ｍ．， Ｊｕｎｇｈａｎｓ， Ｃ．， Ｓｃｈｒｏｆｆ， Ｍ．， Ｂｕｔｔｇｅｒｅｉｔ， Ｐ．， Ｚｉｓｋｅ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ． （２００１）． Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｉｎｉｍａｌ－Ｓｉｚｅ Ｖｅｃｔｏｒ （ＭＩＤＧＥ） Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａｖｏｉｄｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｄｅｓｉｒｅｄ ＤＮＡ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ３， ７９３－８００．
７．Ｚａｎｔａ， Ｍ．Ａ．， Ｂｅｌｇｕｉｓｅ－Ｖａｌｌａｄｉｅｒ， Ｐ． ａｎｄ Ｂｅｈｒ， Ｊ．－Ｐ． （１９９９）． Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ａ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｓ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｃａｒｒｙ ＤＮＡ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｕｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６， ９１－９６．
８．Ｆｏｇｇ， Ｊ．Ｍ．， Ｋｏｌｍａｋｏｖａ， Ｎ．， Ｒｅｅｓ， Ｉ．， Ｍａｇｏｎｏｖ， Ｓ．， Ｈａｎｓｍａ， Ｈ．， Ｐｅｒｏｎａ， Ｊ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００６）． Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｗｒｉｔｈｅ ｉｎ ｓｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ ＤＮＡ． Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｏｎｄｅｎｓ Ｍａｔｔｅｒ １８： Ｓ１４５－Ｓ１５９．
９．Ｊｉａｎｇ， Ｘ．， Ｙｕ， Ｈ．， Ｔｅｏ， Ｃ．Ｒ．， Ｔａｎ， Ｇ．， Ｇｏｈ， Ｓ．Ｃ．， Ｐａｔｅｌ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｄｕｍｂｂｅｌｌ－ｓｈａｐｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｉｎｉｍａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２４（９）， １５８１－１５９１．
１０．Ｃｏｓｔ， Ｇ．Ｊ． （２００７）． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ： ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｏｒｄｅｒｅｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ． ２， ２１９８－２２０２．
１１．Ｔａｋｉ， Ｍ．， Ｋａｔｏ， Ｙ．， Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ， Ｍ．， Ｔａｋａｇｉ， Ｙ． ａｎｄ Ｔａｉｒａ， Ｋ． （２００４）． Ｓｍａｌｌ－Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ－ＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｄｕｍｂｂｅｌｌ－Ｓｈａｐｅｄ ＤＮＡ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．， Ｉｎｔ． Ｅｄ． ４３， ３１６０－３１６３．
１２．Ｔａｋｉ， Ｍ．， Ｋａｔｏ， Ｙ．， Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ， Ｍ．， Ｔａｋａｇｉ， Ｙ．， Ｓａｎｏ， Ｍ． ａｎｄ Ｔａｉｒａ， Ｋ． （２００３）． Ａ Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｕｍｂｅｌｌ－ｓｈａｐｅｄ ｌｉｎｅａｒ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ３， １９１－１９２．
１３．Ｊｉａｎｇ， Ｘ． ａｎｄ Ｐａｔｚｅｌ， Ｖ． （２０１７）． Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｍｉｓｅｄ Ｈａｉｒｐｉｎ Ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｄｕｍｂｂｅｌｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｂｉｏ－Ｐｒｏｔｏｃｏｌ． ７（１１）， １－１０．
１４．Ｙｕ， Ｈ．， Ｊｉａｎｇ， Ｘ．， Ｈａｎｇ， Ｌ．， Ｔａｎ， Ｋ．Ｔ． ａｎｄ Ｐａｔｚｅｌ， Ｖ． （２０１５）． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｄｕｍｂｂｅｌｌ－Ｓｈａｐｅｄ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｓｍａｌｌ Ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ４３（１８）， ｅ１２０．
１５．Ｍｙｓｌｉｎｓｋｉ， Ｅ．， Ａｍｅ， Ｊ．Ｃ．， Ｋｒｏｌ， Ａ． ａｎｄ Ｃａｒｂｏｎ， Ｐ． （２００１）． Ａｎ ｕｎｕｓｕａｌｌｙ ｃｏｍｐａｃｔ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｈ１ＲＮＡ ｇｅｎｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２９， ２５０２－２５０９．
１６．Ｚｅｎｇ， Ｙ．， Ｗａｇｎｅｒ， Ｅ．Ｊ． ａｎｄ Ｃｕｌｌｅｎ， Ｂ．Ｒ． （２００２）． Ｂｏｔｈ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｍｉｃｒｏ ＲＮＡｓ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｇｎａｔｅ ｍＲＮＡｓ ｗｈｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． ９， １３２７－１３３３．
１７．Ｚｕｋｅｒ， Ｍ． （２００３）． Ｍｆｏｌｄ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３１， ３４０６－３４１５．
１８．Ｈｏｆａｃｋｅｒ， Ｉ．Ｌ． （２００３）． Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｅｒｖｅｒ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３， ３４２９－３４３１．

Claims (41)

1. ヘアピン構造発現カセットを含むダンベル型ベクターを作出するためのクローニングフリーでかつエンドヌクレアーゼフリーの方法であって、
   ｉ）２つの相補的配列セグメントを含む標的核酸分子を含む一本鎖核酸鋳型を含む調製物を用意するステップであって、各セグメントは転写プロモーター配列を含みかつ転写ターミネーターをさらに含み、前記２つの相補的配列セグメントは、第３の配列セグメントによって分離されている、ステップ；
   ｉｉ）前記一本鎖核酸鋳型がステムを付加的に含む調製物を用意するステップ；
   ｉｉｉ）前記一本鎖核酸鋳型を、前記一本鎖核酸鋳型の３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’－ヒドロキシル基を含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、ただし、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、ヘアピン構造ＲＮＡの３’アームをコードする配列を含み、およびさらに、前記一本鎖核酸鋳型を、前記一本鎖核酸鋳型の５’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的である第１のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させるステップ；
   ｉｖ）ポリメラーゼ連鎖反応構成要素を用意して、３’アニールした第１のオリゴヌクレオチドプライマーをプライマー伸長させるステップ；
   ｖ）前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーを、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’－ヒドロキシル基を含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、ただし、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、ヘアピン構造ＲＮＡの３’アームをコードする配列を含み、およびさらに、前記一本鎖核酸鋳型を、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的である第２のブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させるステップ；
   ｖｉ）ポリメラーゼ連鎖により鋳型を増幅して鋳型ＤＮＡのプールを合成し、前記鋳型をアニールさせて、プラス鎖およびマイナス鎖の５’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの３’アームをコードする配列を含み、かつプラス鎖およびマイナス鎖の３’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの５’アームをコードする配列を含む二本鎖核酸を創出するステップ；
   ｖｉｉ）前記二本鎖核酸を熱変性させ、次いで冷却して、結果として生じるプラス鎖およびマイナス鎖ＤＮＡの分子内リフォールディングを可能にして、プラスまたはマイナス鎖ＤＮＡから構成される予形成オリゴマーステム－ループ構造を創出するステップ；
   ｖｉｉｉ）プラス鎖およびマイナス鎖ＤＮＡの前記予形成オリゴマーループ構造を、一本鎖特異的ＤＮＡリガーゼとを接触させて、末端５’－リン酸化５’オーバーハングを、分子内ライゲーションにおいて同じＤＮＡ鎖の３’オーバーハングの末端３’－ＯＨ基に連結させて、ヘアピン構造ＲＮＡの転写のためのヘアピン構造鋳型ＤＮＡを含む共有結合的に閉じたプラス鎖由来およびマイナス鎖由来ダンベル型ベクターＤＮＡを創出するステップ；
   ｉｘ）前記ダンベル型ベクターＤＮＡをＤＮＡエキソヌクレアーゼと接触させて、すべてのプライマー、ならびに５’および３’端を持つ共有結合的に閉じていないＤＮＡを除去するステップ
   を含む、方法。
2. 発現カセットを含むダンベル型ベクターを作出するためのクローニングフリーでかつ制限エンドヌクレアーゼフリーの方法であって、
   ｉ）２つの相補的配列セグメントを含む標的核酸分子を含む一本鎖核酸鋳型を含む調製物を用意するステップであって、各セグメントは転写プロモーター配列を含みかつ転写ターミネーターをさらに含み、前記２つの相補的配列セグメントは、第３の配列セグメントによって分離されている、ステップ；
   ｉｉ）前記一本鎖核酸鋳型がステムを付加的に含む調製物を用意するステップ；
   ｉｉｉ）前記一本鎖核酸鋳型を、前記一本鎖核酸鋳型の３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’－ヒドロキシル基を含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、さらに、前記一本鎖核酸を、前記一本鎖核酸鋳型の５’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的である、１種、２種、３種またはそれを上回る種類のオリゴヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドの第１のセットと接触させるステップ；
   ｉｖ）ポリメラーゼ連鎖反応構成要素を用意して、３’アニールした第１のオリゴヌクレオチドプライマーをプライマー伸長させるステップ；
   ｖ）前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーを、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’－ヒドロキシル基を含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、さらに、前記一本鎖核酸鋳型を、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的である、１種、２種、３種またはそれを上回る種類のオリゴヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドの第２のセットと接触させるステップ；
   ｖｉ）ポリメラーゼ連鎖により鋳型を増幅して、伸長したオリゴヌクレオチドプライマーのプールを合成する（ならびに、前記鋳型をアニールさせて、プラス鎖およびマイナス鎖の５’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの３’アームをコードする配列を含み、かつプラス鎖およびマイナス鎖の３’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの５’アームをコードする配列を含む二本鎖核酸を創出する）ステップ；
   ｖｉｉ）伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの前記プールを、前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーによって伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’ヒドロキシル基を含み、かつ前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーに相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第３のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、さらに、伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの前記プールを、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーによって伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、３’ヒドロキシル基を含み、かつ前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーに相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第４のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、さらに、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーを、ブロッキングオリゴヌクレオチドの前記第１および第２のセットと接触させるステップ；
   ｖｉｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマーの第５および第６、第７および第８、またはそれを上回るペアを使用して、ステップｉｖ）およびｖｉｉ）を繰り返すステップであって、プライマーの最終セットは、３’ヒドロキシル基および５’ホスフェート基を含む、ステップ；
   ｉｘ）ポリメラーゼ連鎖により鋳型を増幅して、伸長したオリゴヌクレオチドプライマーのプールを合成し、前記鋳型をアニールさせて、プラス鎖およびマイナス鎖の５’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの３’アームをコードする配列を含み、かつプラス鎖およびマイナス鎖の３’ヌクレオチド配列にヘアピン構造ＲＮＡの５’アームをコードする配列を含む二本鎖核酸を創出するステップ；
   ｘ）前記二本鎖核酸を熱変性させ、次いで冷却して、結果として生じるプラス鎖およびマイナス鎖ＤＮＡの分子内リフォールディングを可能にして、プラスまたはマイナス鎖ＤＮＡから構成される予形成オリゴマーステム－ループ構造を創出するステップ；
   ｘｉ）プラス鎖およびマイナス鎖ＤＮＡの前記予形成オリゴマーループ構造を一本鎖特異的ＤＮＡリガーゼと接触させて、末端５’－リン酸化５’オーバーハングを、分子内ライゲーションにおいて同じＤＮＡ鎖の３’オーバーハングの末端３’－ＯＨ基に連結させて、ヘアピン構造ＲＮＡの転写のためのヘアピン構造鋳型ＤＮＡを含む共有結合的に閉じたプラス鎖由来およびマイナス鎖由来ダンベル型ベクターＤＮＡを創出するステップ；
   ｘｉｉ）前記ダンベル型ベクターＤＮＡをＤＮＡエキソヌクレアーゼと接触させて、すべてのプライマー、ならびに５’および３’端を持つ共有結合的に閉じていないＤＮＡを除去するステップ
   を含む、方法。
3. ２つの発現カセットを含むダンベル型二重発現ベクターを作出するためのクローニングフリーでかつ制限エンドヌクレアーゼフリーの方法であって、前記ベクターは、
   ｉ）５’末端配列に第１の転写プロモーターの逆相補体および３’末端配列に第２の転写ターミネーターの配列を含む標的核酸分子を含む、第１の一本鎖核酸鋳型を含む調製物を用意するステップ；
   ｉｉ）前記第１の一本鎖核酸鋳型を、前記一本鎖核酸鋳型の３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、５’－ホスフェートおよび３’－ヒドロキシル基を含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、転写されるべき対象の第１の配列を含み、かつ第１の転写ターミネーターの逆相補配列をさらに含み、かつ標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列の伸長を阻止する改変ヌクレオチド配列をさらに含む、ステップ；
   ｉｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応構成要素、および３’アニールしたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させるプライマーを用意して、第２の鋳型を形成するステップ；
   ｉｖ）前記第２の鋳型を、前記第２の鋳型の３’末端ヌクレオチド配列の少なくとも一部分に相補的であり、５’－ホスフェートおよび３’－ヒドロキシル基を含み、かつ第２の鋳型に相補的でない５’ヌクレオチド配列をさらに含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、転写されるべき対象の第２の配列を含み、かつ第２の転写ターミネーターの逆相補配列をさらに含み、かつ第２の鋳型に相補的でない５’ヌクレオチド配列の伸長を阻止する改変ヌクレオチド配列をさらに含む、ステップ；
   ｖ）ポリメラーゼ連鎖反応構成要素、および３’アニールしたオリゴヌクレオチドプライマーを伸長させるプライマーを用意して、二本鎖核酸を形成するステップ；
   ｖｉ）ポリメラーゼ連鎖により二本鎖核酸を増幅して鋳型ＤＮＡのプールを合成し、前記鋳型をアニールさせて、標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸を創出するステップ；ならびに
   ｖｉｉ）アニールした鋳型核酸を５ＤＮＡリガーゼと接触させて、非相補的５’ヌクレオチド配列の末端５’－ホスフェートを、前記増幅した鋳型核酸の３’－ＯＨに連結させて、末端ループ構造を創出するステップ
   を含む、方法。
4. 前記転写プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターに由来する、請求項１～３のいずれか一つに記載の方法。
5. 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、
   ｉ）Ｕ６プロモーター；または
   ｉｉ）Ｈ１プロモーター；または
   ｉｉｉ）逆位ポリメラーゼＩＩＩ転写ターミネーターを含む最小Ｈ１プロモーター
   である、請求項４に記載の方法。
6. 前記転写プロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターに由来する、請求項１～５のいずれか一つに記載の方法。
7. 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項６に記載の方法。
8. 前記転写ターミネーターヌクレオチド配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結配列である、請求項１～７のいずれか一つに記載の方法。
9. 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結配列が、ヌクレオチド配列ＴＴＴＴＴを含む１つまたは複数のモチーフを含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記ステムが、
    ｉ）人工配列；または
    ｉｉ）マイクロＲＮＡステム；または
    ｉｉｉ）マイクロＲＮＡ－３０ステム
    に由来する、請求項１～９のいずれか一つに記載の方法。
11. 前記第３の配列セグメントが、
    ｉ）オリゴマーＤＮＡ配列；または
    ｉｉ）四量体ＤＮＡ配列；または
    ｉｉｉ）配列ＴＴＴＴを含む
    に由来するオリゴマーＤＮＡ配列である、請求項１～１０のいずれか一つに記載の方法。
12. 前記ベクターが、転写されるべき核酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一つに記載の方法。
13. 前記転写されるべき核酸配列が治療用核酸分子である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記治療用分子が、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスｍｉＲＮＡ、アプタマー、トランススプライシングＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、一本鎖ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍＲＮＡの群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記転写されるべき核酸配列が、治療用タンパク質またはペプチドをコードする、請求項１２に記載の方法。
16. 前記治療用タンパク質またはペプチドが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ｎ、ｈＳｐＣａｓ９、ｈＳｐＣａｓ９ｎ、ＨＳＶｔｋ、細胞死誘発タンパク質（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｔｒｉｇｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、コレラ毒素、ジフテリア毒素、アルファ毒素、炭疽菌５毒素、外毒素、百日咳毒素、志賀毒素、志賀様毒素、Ｆａｓ、ＴＮＦ、カスパーゼ、イニシエーターカスパーゼであるカスパーゼ２、８、９、１０、１１、１２、およびエフェクターカスパーゼであるカスパーゼ３、６、７、ならびにプリンヌクレオシドホスホリラーゼの群から選択される、請求項１３に記載の方法。
17. 前記第１および前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが５’ホスフェートを含む、請求項１～１６のいずれか一つに記載の方法。
18. 前記ヘアピン構造ＲＮＡ配列が、小型ヘアピンＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ前駆体である、請求項１～１７のいずれか一つに記載の方法。
19. 前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記一本鎖核酸鋳型または前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーの完全な５’末端ヌクレオチド配列の半分に相補的である、請求項１～１８のいずれか一つに記載の方法。
20. 前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、配列番号９および配列番号１０に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記熱変性が９６℃で５分間のインキュベーションを含む、請求項１～２０のいずれか一つに記載の方法。
22. 前記冷却が９６℃から室温への漸進的冷却を含む、請求項１～２１のいずれか一つに記載の方法。
23. 前記ＤＮＡリガーゼが、一本鎖特異的または二本鎖特異的ＤＮＡリガーゼである、請求項１～２２のいずれか一つに記載の方法。
24. 前記一本鎖特異的ＤＮＡリガーゼがＣｉｒｃＬｉｇａｓｅである、請求項１～２３のいずれか一つに記載の方法。
25. 前記エキソヌクレアーゼがＴ７ ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～２４のいずれか一つに記載の方法。
26. 前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーが、標的核酸分子に相補的でないそれらの５’ヌクレオチド配列に、翻訳スタートコドンの逆相補配列ＣＡＴを含む、請求項１～２５のいずれか一つに記載の方法。
27. プライマーの前記最終セットのプライマーが、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーに相補的でないそれらの５’ヌクレオチド配列に、翻訳ストップコドンＴＡＧ、ＴＡＡまたはＴＧＡの逆相補配列ＣＴＡ、ＴＴＡまたはＴＣＡを含む、請求項１～２６のいずれか一つに記載の方法。
28. プライマーの前記最終セットのプライマーが、前記伸長したオリゴヌクレオチドプライマーに相補的でないそれらの５’ヌクレオチド配列に、転写ターミネーターの逆相補配列を含む、請求項１～２７のいずれか一つに記載の方法。
29. 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記標的核酸分子と非相補的であるが、ステムループ構造を形成するその長さの一部分にわたる内部相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含む、請求項３～２８のいずれか一つに記載の方法。
30. 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、その長さの一部分にわたる回文型ヌクレオチド配列を含む、請求項３～２９のいずれか一つに記載の方法。
31. 前記オリゴヌクレオチドプライマー改変が、前記プライマーにおける、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長中に塩基対合のための鋳型として認識されない部位の内包である、請求項３～３０のいずれか一つに記載の方法。
32. 前記オリゴヌクレオチドプライマー改変が、前記プライマーにおける脱塩基部位の内包である、請求項３～３１のいずれか一つに記載の方法。
33. 前記脱塩基部位が、脱プリン／脱ピリミジン部位である、請求項３～３２のいずれか一つに記載の方法。
34. 前記脱プリン／脱ピリミジン部位がテトラヒドロフランを含む、請求項３～３３のいずれか一つに記載の方法。
35. 前記脱塩基部位が、少なくとも１つまたは少なくとも３つの脱プリン／脱ピリミジン部位を含む、請求項３～３４のいずれか一つに記載の方法。
36. 前記脱塩基部位が、前記一本鎖核酸鋳型の３’末端ヌクレオチド配列に相補的な領域と、標的核酸分子に相補的でない５’ヌクレオチド配列とを分離する、請求項３～３５のいずれか一つに記載の方法。
37. 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、転写ターミネーターを含む非相補的ヌクレオチド配列を含む、請求項３～３６のいずれか一つに記載の方法。
38. ヒト対象から単離された初代細胞のトランスフェクションのための方法であって、
    ｉ）トランスフェクトされるべき細胞を含む単離されたサンプルを用意するステップ；
    ｉｉ）前記単離された細胞サンプルを含む調製物を形成し、前記サンプルと請求項１～３７のいずれか一つに記載の方法を使用して調製されたダンベル型ベクターとを接触させるステップ；
    ｉｉｉ）前記初代細胞サンプルへの前記ダンベル型ベクターの導入、および前記ベクターに含まれる核酸分子の持続的発現を可能にする形質転換条件を提供するステップ
    を含む、方法。
39. 遺伝子療法から恩恵を受ける疾患に罹患した患者を治療するためのエクスビボ方法であって、
    ｉ）トランスフェクトされるべき細胞を含む前記対象からサンプルを得るステップ；
    ｉｉ）請求項１～３７のいずれか一つに記載の方法を使用して調製されたダンベル型ベクターを含む細胞培養調製物を形成し、前記細胞に前記ベクターをトランスフェクトする条件を提供するステップ；および
    ｉｉｉ）トランスフェクトされた細胞を前記対象に投与するステップ
    を含む、方法。
40. 配列番号２３に記載の核酸配列。
41. 配列番号２３に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクター。

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