JP2022543367A - 結合メンバー - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｌｅｗｉｓ Ｙ（Ｌｅｙ）炭水化物に特異的に結合できる、抗体およびそのフラグメントなどの特異的な結合メンバーに関する。また本発明は、医薬における当該結合メンバーの使用および当該結合メンバーをコードする核酸に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、Ｌｅｗｉｓ Ｙ（Ｌｅ^ｙ）炭水化物に特異的に結合できる、抗体およびそのフラグメントなどの特異的な結合メンバーに関する。また本発明は、医薬における当該結合メンバーの使用および当該結合メンバーをコードする核酸に関する。

グリカン構造は、タンパク質および糖脂質の骨格の両方に存在し、グリコシルトランスフェラーゼの発現の変化によりがんにおいて著しく過剰発現され得る。糖脂質は、炭水化物の頭部を伴う脂質の尾からなり、外側の単層において５％の脂質分子を構成する。３つの主要な糖脂質のシリーズ、ｇｌｏｂｏ、ｎｅｏｌａｃｔｏ、およびｇａｎｇｌｉｏの脂質がある。糖脂質は、それらの高い表面密度、移動度、および膜のマイクロドメインとの関連（これらは全て強力な細胞の相互作用に寄与する）により、非常に良好な標的であると想定されている。しかしながら、抗糖脂質抗体の作製は、Ｔ細胞の支援がなく、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、通常、親和性が低く、ＩｇＭサブクラスであるため、困難なタスクである（Ｄｕｒｒａｎｔ， Ｎｏｂｌｅ ｅｔ ａｌ． ２０１２， Ｒａｂｕ， ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ． ２０１２）。タンパク質で発現されるグリカンに対するｍＡｂはこの問題を克服するが、ｍＡｂは小さなグリカンのみを見ることはほとんどなく、通常、特異的なタンパク質上のグリカンを認識し、非常に制限された発現を提供するため、これらは新たな課題を提供している。

限られた数の、グリカンを認識する抗体のみが記載されている。いくつかの抗Ｌｅｗｉｓ（Ｌｅ）炭水化物抗原のｍＡｂが今日までに作製されているが、これらは、多くの場合、正常な組織で発現されるある範囲のグリカンとの交差反応性を有する。Ｌｅｗｉｓ炭水化物抗原は、グリコシルトランスフェラーゼのセットの作用を介して糖タンパク質または糖脂質上のオリゴ糖前駆体の鎖上にフコースを逐次付加することにより形成される（Ｙｕｒｉｅｖ， Ｆａｒｒｕｇｉａ ｅｔ ａｌ． ２００５）。これらは、２つのグループの、Ｉ型（Ｌｅ^ａおよびＬｅ^ｂ）ならびにＩＩ型（Ｌｅ^ｘおよびＬｅ^ｙ）に分けることができる。Ｌｅ^ａおよびＬｅ^ｂの抗原は、血液グループの抗原とされており、Ｌｅ^ｘおよびＬｅ^ｙは、特定の上皮細胞でのみ発現することが報告されており（Ｓｃｏｔｔ， Ｇｅｌｅｉｃｋ ｅｔ ａｌ． ２０００）、腫瘍関連マーカーとみなされており（Ｓｏｅｊｉｍａ ａｎｄ Ｋｏｄａ ２００５）、抗体ベースの免疫療法を含むがんの処置にとって魅力的な標的を表す（Ｓｃｏｔｔ， Ｇｅｌｅｉｃｋ ｅｔ ａｌ． ２０００）。ほとんどの正常な組織は、胃腸管の上皮細胞を除き（しかしながらこれは非常低い密度である）、Ｌｅｗｉｓ Ｙを発現しない（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ． ２００５）。しかしながら、Ｌｅｗｉｓ Ｙ（Ｆｕｃａ１－２Ｇａｌｂ１－４（Ｆｕｃａ１－３）ＧｌｃＮＡｃ）は、ヒト上皮癌のほぼ７０％で高い密度で発現することが報告されており、よって、がんの免疫療法にとって魅力的な候補標的である。良好な治療上の標的としてのＬｅｗｉｓ Ｙの認識は、多くの抗Ｌｅ^ｙ抗体の産生をもたらしている。これら抗Ｌｅ^ｙ ｍＡｂのうちのいくつかは、他のＬｅｗｉｓ抗原、たとえばＬｅ^ｂ／ｙを認識するｍＡｂ ６９２／２９と交差反応し、異種移植片モデルにおいて結腸腫瘍に対する抗腫瘍応答を示している（Ｎｏｂｌｅ， Ｓｐｅｎｄｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。

Ｌｅ^ｙに結合するいくつかの他のｍＡｂが当該分野で知られているが、これらは、他の関連するＬｅｗｉｓ抗原と交差反応する。たとえば欧州特許公開公報第０２８５０５９号は、Ｌｅｗｉｓ^ｙおよびＢ－７－２の両方と反応する抗体のＢＲ－５５を開示する。Ｂ－７－２はまた、腫瘍細胞に関連することが示されている（欧州特許公開公報第０２８５０５９号）。米国特許第５８６９０４５号は、Ｌｅｗｉｓ^ｙおよびＬｅｗｉｓ^ｘのハプテンの両方に結合する抗体のＢＲ－９６を開示している。Ｌｅｗｉｓ^ｙおよびＬｅｗｉｓ^ｂの抗原の両方に結合する抗体が知られている。Ｃ１４モノクローナル抗体がＬｅｗｉｓ^ｙおよびＬｅｗｉｓ^ｂ（伸長した形態および伸長していない形態）の抗原の両方を認識し、これらに結合することが、試験から示されている（Ｄｕｒｒａｎｔ ａｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， １２， ６４７－６６０ （１９９６））。国際特許公開公報第０２／０９２１２６号は、Ｌｅｗｉｓ^ｙおよびＬｅｗｉｓ^ｂのハプテンの両方に結合するｍＡｂを開示している。

マウスまたはキメラの抗Ｌｅ^ｙ抗体を利用する多くの臨床試験が行われている（Ｓｃｏｔｔ， Ｇｅｌｅｉｃｋ ｅｔ ａｌ． ２０００）。残念なことに、多くの場合、抗Ｌｅ^ｙ ｍＡｂは、正常な組織でより一般的に発現されるＬｅｗｉｓ ＸおよびＨＩＩ型構造と交差反応する（Ｆｕｒｕｋａｗａ， Ｗｅｌｔ ｅｔ ａｌ． １９９０， Ｙｉｎ， Ｆｉｎｓｔａｄ ｅｔ ａｌ． １９９６）。ある範囲のＬｅ^ｙ抗体もまた同定されているが、これら抗体での一貫した問題は、Ｌｅ^ｘ、およびＨ２型構造との交差反応性の度合いであり、これは、赤血球の凝集および胃腸毒性を引き起こす（Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｓｔｏｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｐａｉ， Ｗｉｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９６， Ｔｏｌｃｈｅｒ， Ｓｕｇａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９９）。よって、抗Ｌｅ^ｙ抗体の微細な特異性が、臨床上の処置の成功に重要である。

第１の態様では、本発明は、Ｆｕｃａ１－２Ｇａｌｂ１－４（Ｆｕｃａ１－３）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅ^ｙ）に特異的に結合できる単離された特異的な結合メンバーを提供する。

本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を示す特異的な結合メンバーを提供した。本発明の特異的な結合メンバーは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介してｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト結腸がん細胞に対し強力な免疫が介在する細胞傷害活性を呈する。またこれらは、免疫エフェクター細胞を必要とすることなく細胞死を直接誘導する性質を有する。腫瘍の糖タンパク質または全細胞よりも糖脂質で免疫処置することにより、本発明者らは、他のいずれかのグリカンとも交差反応しない、超特異的な抗Ｌｅ^ｙ ｍＡｂを作製した。これらｍＡｂの例として、「ＦＧ２７．１０」として本明細書中知られているＩｇＧ３ｋマウスｍＡｂおよび「ＦＧ２７．１８」として本明細書中知られているＩｇＧ１ｋマウスｍＡｂ、キメラのｈＩｇＧ１（「ＣＨ２７」として知られている）およびヒト化されているｈＩｇＧ１（「Ｈｕ２７」として知られている）がある。

他のグリカンと交差反応する抗Ｌｅ^ｙ ｍＡｂを用いた以前の試験とは対照的に、本発明の特異的な結合メンバーは、非常に限定的な正規分布を有し、正常な胃、肺、扁桃腺、膵臓、および十二指腸の中の細胞の下位集団にのみ結合する。さらにこれらは、結腸、空腸、乳房、腎臓、または回腸を染色することができなかった。これらは、胃の腫瘍の８０％、結腸直腸腫瘍の１００％、卵巣腫瘍の９５％、および乳房の腫瘍の８５％を含む幅広い範囲の腫瘍に強力に結合する。本発明の特異的な結合メンバー、たとえばＦＧ２７．１０／１８は、Ｌｅ^ｙに対してのみ単一特異性を有する。本発明者らは、本発明に係る特異的な結合メンバーが、細胞株Ｃｏｌｏ２１に結合できなかったことを示した。対照的に、Ｌｅ^ｙ／ｘ ｍＡｂは強力に結合し、Ｌｅ^ｙ／ｂ ｍＡｂは中程度に結合した。これは、Ｃｏｌｏ２０１がＬｅ^ｘおよびＬｅ^ｂを発現するが、Ｌｅ^ｙを発現しないことを示しており、本発明の特異的な結合メンバーの特異性を確認している。この特異性は、ＦＧ２７可変重鎖領域および軽鎖領域の同様ではあるが別々の配列において反映されている（図１３ａ、ｂ）。ＦＧ２７は、他の交差反応性Ｌｅ^ｙ ｍａｂとの、重鎖の中のアミノ酸配列ＣＤＲの１６～６８％の差異、軽鎖の中のＣＤＲ配列のアミノ酸の差異の４．３～１６％の差異、重鎖の可変領域のアミノ酸配列の８．６～４９．５％の差異、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列の２～２４％の差異を示す（本明細書中の表４を参照）。ほとんどのバリエーションは、ＣＤＲＨ２の中にあり、８アミノ酸のうちの３～５つが異なるｍＡｂ間で変動している。

本発明の特異的な結合メンバーは、脂質またはタンパク質の骨格に結合し得る。タンパク質の骨格は、約５０～１５０ｋＤａの分子量を有し得、これは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定される。

本発明の特異的な結合メンバーは、好ましくは、図１ａまたは１ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５４～６５（ＣＤＲＨ２）、または１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に提示されるアミノ酸配列を有する結合ドメインから選択される１つ以上の結合ドメインを含む。特異的な結合メンバーは、図１ａまたは１ｂのアミノ酸配列の残基１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に提示されるアミノ酸配列を含む結合ドメインを含み得る。このような特異的な結合メンバーは、図１ａおよび１ｂに示されるアミノ酸配列の残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）および残基５６～６５（ＣＤＲＨ２）として実質的に提示されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうちの１つまたは両方、好ましくは両方をさらに含み得る。

結合メンバーは、図１ａまたは１ｂの１～１２７（ＶＨ）として実質的に提示されるアミノ酸配列を含み得る。

特異的な結合メンバーは、図１ｃの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）、または１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）のアミノ酸配列を有する結合ドメインから選択される１つ以上の結合ドメインを含み得る。結合メンバーは、図１ｃのアミノ酸配列の残基１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に提示されるアミノ酸配列を有する結合ドメインを含み得る。このような特異的な結合メンバーは、図１ｃに示されるアミノ酸配列の残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）および残基５６～６５（ＣＤＲＬ２）として実質的に提示されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうちの１つまたは両方、好ましくは両方をさらに含み得る。

同じもしくは異なる配列の複数の結合ドメインを含む特異的な結合メンバー、またはそれらの組み合わせは、本発明の範囲内に含まれる。少なくとも１つの結合ドメインは、ヒト抗体フレームワークにより担持され得る。たとえば、１つ以上の結合ドメインは、ヒト全抗体またはその可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）で置換され得る。

本発明の１つの単離された特異的な結合メンバーは、図１ｃに示されるアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に提示されるアミノ酸配列を含む。

本発明の単離された特異的な結合メンバーは、図１ｃの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）または１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に提示されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうちの１つ以上、好ましくは全てと組み合わせた、図１ａまたは１ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５４～６５（ＣＤＲＨ２）または１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に提示されるアミノ酸配列を有する結合ドメインのうちの１つ以上、好ましくは全てを含み得る。

結合メンバーは、図１ａまたは１ｂのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に提示されるアミノ酸配列と、図１ｃのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に提示されるアミノ酸配列とを含み得る。

本明細書中記載される望ましい特性を有する単一の原型のｍＡｂ、たとえばＦＧ２７ ｍＡｂが単離されているため、当該分野で知られている方法を使用することにより、同様の特性を有する他のｍＡｂを作製することは容易である。たとえば、Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４ （Ｊｅｓｐｅｒｓ， Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． １９９４）の方法は、同じエピトープ、よって、原型のｍＡｂと同様の特性を有するｍＡｂの選択を導くために使用され得る。ファージディスプレイを使用して、原型抗体の第１の重鎖が、グリカンと結合するｍＡｂを選択するために（好ましくはヒト）軽鎖のレパートリーと対形成され、次に新規の軽鎖が、原型のｍＡｂと同じエピトープを有する（好ましくはヒトの）グリカンと結合するｍＡｂを選択するために、（好ましくはヒト）重鎖のレパートリーと対形成される。

特異的な結合メンバーは、抗体または抗体フラグメント、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、またはジアボディであり得る。抗体は、ポリクローナル抗体であり得る。抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり得る。本発明の抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、もしくはベニヤ抗体であってよく、またはいずれかの種の非ヒト抗体であってもよい。

マウス抗体またはキメラ抗体は、患者に有害な抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応のリスクが高い（Ｓｃｈｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ． １９８５； Ａｚｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ． ２００６； Ｍｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ． １９９９； Ｄ’Ａｒｃｙ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｋ ２００１）。よって、大部分の承認されている治療用ｍＡｂは、ヒト化されているかまたは完全にヒトのＩｇＧ抗体である。

本発明の特異的な結合メンバーは、図２ａに実質的に提示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、図２ｂに実質的に提示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み得る。

本発明の特異的な結合メンバーは、図３ａに実質的に提示されるアミノ酸配列を有する重鎖と、図３ｂに実質的に提示されるアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み得る。

本発明の特異的な結合メンバーは、図３３に実質的に提示されるアミノ酸配列を有する重鎖および／または図３３に実質的に提示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含み得る。

さらに本発明は、図１ａまたは１ｂの残基１～１２７のアミノ酸配列を有するＶＨ鎖と、図１ｃの残基１～１２４のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖とを含む抗体と、Ｌｅ^ｙ含有グリカンに対する結合に関して競合する結合メンバーを提供する。

Ｌｅ^ｙに特異的に結合でき、図１、２、または３のＶＨまたはＶＬドメインとＶＨおよび／またはＶＬドメインにおいて少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である特異的な結合メンバーは、本発明に含まれる。Ｌｅ^ｙに特異的に結合でき、図３３の重鎖および／または軽鎖と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である特異的な結合メンバーは、本発明に含まれる。好ましくはこのような抗体は、少数の機能的に重要ではないアミノ酸の置換（たとえば保存的置換）、欠失、または挿入により、図１、２，または３の配列と異なる。

本発明の特異的な結合メンバーは、検出可能または機能的な標識を担持し得る。

さらなる態様では、本発明は、本発明の特異的な結合メンバーをコードする単離された核酸、および上記結合メンバーの発現をもたらす条件下で上記核酸を発現し、結合メンバーを回収することを含む、本発明の特異的な結合メンバーを調製する方法を提供する。Ｌｅ^ｙに特異的に結合でき、本明細書中提供される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である特異的な結合メンバーをコードする単離された核酸は、本発明に含まれる。

本発明の特異的な結合メンバーは、ヒトまたは動物の身体の処置または診断の方法、たとえば患者（好ましくはヒト）の腫瘍の処置方法であって、本発明の特異的な結合メンバーの有効量を上記患者に投与するステップを含む方法で、使用され得る。また本発明は、医薬に使用するため、好ましくは腫瘍の処置に使用するための本発明の特異的な結合メンバー、および腫瘍の診断または処置のための医薬の製造における本発明の特異的な結合メンバーの使用を提供する。この腫瘍は、胃、結腸直腸、膵臓、肺、卵巣、または乳房の腫瘍であり得る。

本明細書において、本発明の特異的な結合メンバーが結合する抗原が開示される。本発明の特異的な結合メンバーにより、好ましくは特異的に結合できるＬｅ^ｙが提供され得る。Ｌｅ^ｙは、単離された形態で提供されてもよく、それに対するさらなる特異的な結合メンバーを開発するためのスクリーニングに使用されてもよい。たとえば、化合物のライブラリーは、Ｌｅ^ｙに特異的に結合するライブラリーのメンバーについてスクリーニングされ得る。Ｌｅ^ｙは、脂質またはタンパク質の骨格の上にあり得る。タンパク質の骨格の上にある場合、これは約５０～１５０ｋＤａの分子量を有し得、この分子量はＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定される。

さらなる態様では、本発明は、胃、結腸直腸、膵臓、肺、卵巣、および乳房の腫瘍の診断または予後診断に使用するための、好ましくは本発明の第１の態様の、Ｌｅ^ｙ含有グリカンに結合できる単離された特異的な結合メンバーを提供する。

さらに本発明は、個体由来のサンプルでＬｅ^ｙ含有グリカンを検出するため本発明の特異的な結合メンバーを使用することを含む、がんの診断方法を提供する。この診断方法では、結合メンバーにより検出されるグリカンのパターンは、個体の治療の選択肢を階層化するために使用され得る。

本発明のこれらおよび他の態様を、以下にさらに詳述する。

本明細書中使用される場合、「特異的な結合メンバー」は、互いに対する結合特異性を有する分子の対のメンバーである。特異的な結合対のメンバーは、天然由来であってよく、または全体的にもしくは部分的に合成により作製されてもよい。分子の対の１つのメンバーは、分子の対の他のメンバーの特定の空間的かつ極性の組織に特異的に結合し、よってこれに対し相補的である、突起または空洞であり得るその表面上の領域を有する。よって、対のメンバーは、互いに特異的に結合する特性を有する。特異的な結合する対の種類の例として、抗原－抗体、ビオチン－アビジン、ホルモン－ホルモン受容体、５受容体－リガンド、酵素－基質がある。本発明は、全般的に、抗原－抗体の種類の反応に関するが、これはまた、本明細書中定義される抗原に結合する小分子にも関与する。

本明細書中使用される場合、「処置」は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳類に利益を与え得る全てのレジームを含む。処置は、既存の病態に関するものであってよく、または防止的（予防的な処置）であってもよい。

本明細書中使用される場合、「腫瘍」は、組織の異常な増殖である。これは、局在化されていてもよく（良性）、または近くの組織を浸潤してもよく（悪性）、または遠くの組織を浸潤してもよい（転移性）。腫瘍は、がんを引き起こす新生物の増殖を含み、ならびに食道、結腸直腸、胃、乳房、卵巣、および子宮内膜の腫瘍、ならびに限定するものではないが白血球細胞を含むがん性組織または細胞株を含む。本明細書中使用される場合、「腫瘍」はまた、その範囲内に子宮内膜症を含む。

用語「抗体」は、本明細書中使用される場合、天然であるかまたは部分的もしくは全体的に合成により作製されるかどうかに関わらず、イムノグロブリン分子およびイムノグロブリン分子の免疫学的に活性の部分、すなわち抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を表す。この用語はまた、抗体結合ドメインであるかまたは抗体結合ドメインと相同である結合ドメインを有する全てのポリペプチドまたはタンパク質を包有する。これらは、天然の供給源に由来してもよく、またはこれらは部分的もしくは全体的に合成により作製されてもよい。本発明の抗体の例として、イムノグロブリンのアイソタイプ（たとえばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ）、ならびにそれらのアイソタイプのサブクラス；抗原結合ドメインを含むフラグメント、たとえばＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ；ならびにジアボディがある。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。モノクローナル抗体は、「ｍＡｂ」と表され得る。

モノクローナル抗体および他の抗体を採取し、組み換えＤＮＡ技術を使用して元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生させることが可能である。このような技術は、イムノグロブリンの可変領域または抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なるイムノグロブリンの定常領域または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含み得る。たとえば、欧州特許公開公報第１８４１８７号、イギリス特許公開公報第２１８８６３８号、または欧州特許公開公報第２３９４００号を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、遺伝的変異または他の変化に供されてよく、これにより産生される抗体の結合特異性を変えてもよくまたは変えなくてもよい。

抗体は多くの方法で修飾され得るため、用語「抗体」は、必要とされる特異性を有する結合ドメインを有する全ての特異的な結合メンバーまたは物質を包有すると解釈されるべきである。よってこの用語は、天然であるかまたは全体的もしくは部分的に合成であるかどうかにかかわらず、イムノグロブリン結合ドメインを含む全てのポリペプチドを含む、抗体、ヒト化抗体の抗体フラグメント、誘導体、機能的な均等物、および相同体を含む。よって、別のポリペプチドに融合した、イムノグロブリン結合ドメインを含むキメラ分子または均等物が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、欧州特許公開公報第０１２０６９４号および同第０１２５０２３号に記載されている。ヒト化抗体は、非ヒト、たとえばマウスの抗体の可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する修飾された抗体であり得る。ヒト化抗体を作製するための方法は、たとえば米国特許第５２２５５３９号に記載されている。

全抗体のフラグメントが、抗原に結合する機能を行うことができることが示されている。結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ， Ｇｕｓｓｏｗ ｅｔ ａｌ． １９８９）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの結合したＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント；（ｖｉｉ）一本鎖のＦｖ分子（ｓｃＦｖ）（ここでＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインを結合させるペプチドリンカーにより結合することにより抗原結合部位を形成する）（Ｂｉｒｄ， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９８８， Ｈｕｓｔｏｎ， Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９８８）；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（国際特許公開公報第９２／０９９６５号）；ならびに（ｉｘ）「ジアボディ」、遺伝子融合により構築される多価または多重特異性フラグメント（国際特許公開公報第９４／１３８０４号；（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ｅｔ ａｌ． １９９３））がある。

ジアボディは、ポリペプチドの多量体であり、ここで各ポリペプチドは、イムノグロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインとイムノグロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含み、２つのドメインは（たとえばペプチドリンカーにより）結合しているが、抗原結合部位を形成するために互いに結合することはできない：抗原結合部位は、多量体の中の１つのポリペプチドの第１のドメインと多量体の中の別のポリペプチドの第２のドメインとの結合により形成される（国際特許公開公報第９４／１３８０４号）。

二重特異性抗体が使用される場合、これらは、様々な方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ １９９３）で製造され得る従来の二重特異性抗体であってよく、たとえば化学的にもしくはハイブリッドハイブリドーマから調製されてもよく、または上述の二重特異性抗体フラグメントのいずれかであってもよい。全抗体よりもｓｃＦｖ二量体またはジアボディを使用することが好ましい場合があり得る。ジアボディおよびｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用してＦｃ領域を伴わずに構築でき、恐らくは抗イディオタイプ反応の作用を低減する。二重特異性抗体の他の形態として、（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ， Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ． １９９１）に記載される一本鎖「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」が挙げられる。

また二重特異性ジアボディは、二重特異性全抗体とは対照的に、大腸菌で容易に構築および発現できるため有用であり得る。適切な結合特異性のジアボディ（および多くの他のポリペプチド、たとえば抗体フラグメント）は、ライブラリーからファージディスプレイ（国際特許公開公報第９４／１３８０４号）を使用して容易に選択され得る。ジアボディの１つのアームが、たとえば抗原Ｘに対する特異性を伴い一定であり続ける場合、これにより他のアームが変動するライブラリーを作製し、適切な特異性の抗体が選択され得る。

「結合ドメイン」は、抗原の一部または全てに特異的に結合しこれに対し相補的である領域を含む特異的な結合メンバーの一部である。結合メンバーが抗体またはその抗原結合フラグメントである場合、結合ドメインはＣＤＲであり得る。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の一部にのみ結合し得、この一部はエピトープと称される。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメインにより提供され得る。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得る。

「特異的な」は、全般的に、特異的な結合対の１つのメンバーがその特異的な結合パートナー以外の分子に対し有意な結合を全く示さず、たとえば他のいずれかの分子と約３０％未満、好ましくは２０％未満、１０％未満、または１％未満の交差反応性を有する状況を表すために使用される。またこの用語は、たとえば抗原結合ドメインが多くの抗原により担持される特定のエピトープに特異的である場合に適用可能であり、この場合抗原結合ドメインを担持する特異的な結合メンバーは、エピトープを担持する様々な抗原に結合できる。本発明の特異的な結合メンバーは、結合が本明細書中の実施例における「グライコーム分析」で提示されるプロトコルにより試験される場合、他のいずれの抗原（たとえば他のいずれのグリカン）に対する検出可能な結合がない状況で、Ｌｅ^ｙに特異的に結合できる場合がある。

「単離された」は、本発明の特異的な結合メンバーまたは当該結合メンバーをコードする核酸が、好ましくは本発明に係るものである状況を表す。全般的に、メンバーおよび核酸は、それらの天然の環境または調製（当該調製がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われる組み換えＤＮＡ技術によるものである場合の）される環境（たとえば細胞培養）で見出される他のポリペプチドまたは核酸などの本来関連する物質を含まないかまたは実質的に含まない。特異的な結合メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化されてよく、さらには実務的な目的のため単離され得る－たとえば、メンバーは、通常、イムノアッセイでの使用のためマイクロタイタープレートをコーティングするために使用される場合ゼラチンもしくは他の担体と混合され、または診断または治療に使用される場合は薬学的に許容される担体もしくは希釈剤と混合される。特異的な結合メンバーは、天然にもしくは異種性真核細胞の系によりグリコシル化されてよく、またはこれらは、（たとえば原核細胞での発現により産生される場合）非グリコシル化され得る。

「実質的に提示される（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ａｓ ｓｅｔ ｏｕｔ）」は、本発明のアミノ酸配列が、記載されるアミノ酸配列と同一であるかまたは著しく相同性であることを意味する。「著しく相同性」により、１～５、１～４、１～３、２または１の置換が配列でなされ得ることが企図される。

また本発明は、図１、２、または３に提示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、図１または２に提示される核酸配列を有するポリヌクレオチド、およびそれらと実質的な同一性、たとえばそれらと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を、その範囲内に含む。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性は、全般的に、最適な比較のため配列をアライメントし（たとえばギャップが、第２の配列との最良のアライメントで第１の配列に導入され得る）、対応する位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較することにより決定される。「最良のアライメント」は、最も高いパーセント同一性をもたらす２つの配列のアライメントである。パーセント同一性は、配列の中の同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を比較することにより決定される（すなわち％同一性＝同一な位置の数／位置の総数×１００）。

２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に知られている数学的なアルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列を比較するための数学的なアルゴリズムの一例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９３ （Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９３）のように改変した、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， １９９０ （Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ １９９０）のアルゴリズムである。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｇｉｓｈ ｅｔ ａｌ． １９９０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴのプログラムは、このようなアルゴリズムを組み込んでいる。ＢＬＡＳＴのヌクレオチドの検索は、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムで行われ得る（スコア＝１００、ワード長＝１２）。ＢＬＡＳＴのタンパク質の検索は、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムで行われ得る（スコア＝５０、ワード長＝３）。比較のためギャップのあるアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ． １９９７）に記載されるように利用され得る。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔが、分子間の遠い関係を検出する反復探索（ｉｔｅｒａｔｅｄ ｓｅａｒｃｈ）を行うために使用され得る（Ｉｄ．）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔのプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトのパラメータ（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列の比較のために利用される数学的なアルゴリズムの別の例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， １９８９ （Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ １９８９）のアルゴリズムである。ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は、このようなアルゴリズムを組み込んでいる。当該分野で知られている配列分析のための他のアルゴリズムとして、Ｔｏｒｅｌｌｉｓ ａｎｄ Ｒｏｂｏｔｔｉ， １９９４ （Ｔｏｒｅｌｌｉ ａｎｄ Ｒｏｂｏｔｔｉ １９９４）に記載されるＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ならびにＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８ （Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ １９８８）に記載されるＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡの中で、ｋｔｕｐは、検索の感度および速度を設定する制御オプションである。

本発明の単離された特異的な結合メンバーは、Ｌｅ^ｙ炭水化物に結合でき、これは、Ｌｅ^ｙセラミドであってもよくまたはタンパク質部分にあってもよい。図１ａおよび１ｂの残基１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）および図１ｃの１０５～１１３に実質的に提示されるアミノ酸配列を含む結合ドメインは、これら領域のＬｅ^ｙ炭水化物への結合を可能にする構造で担持され得る。

本発明の結合ドメインを担持するための構造は、全般的に、結合ドメインが、再配置されたイムノグロブリン遺伝子によりコードされる天然に存在するＶＨおよびＶＬの抗体可変ドメインのＣＤＲ３領域に対応する位置に位置している抗体の重鎖または軽鎖の配列またはその実質的な一部である。イムノグロブリンの可変ドメインの構造および位置は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／を参照することにより決定され得る。図１ａおよび１ｂの残基１０５～１１６に実質的に提示されるアミノ酸配列は、ヒト重鎖可変ドメインのＣＤＲ３またはその実質的な一部として担持されてもよく、図１ｃの残基１０５～１１３として実質的に提示されるアミノ酸配列は、ヒト軽鎖可変ドメインのＣＤＲ３またはその実質的な一部として担持されていてもよい。

可変ドメインは、いずれかの生殖系列もしくは再配置されたヒト可変ドメインに由来してもよく、または既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列に基づく合成可変ドメインであってもよい。本発明のＣＤＲ３由来の配列は、組み換えＤＮＡ技術を使用してＣＤＲ３領域を欠いている可変ドメインのレパートリーに導入され得る。たとえば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２ （Ｍａｒｋｓ， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ． １９９２）は、可変ドメイン領域の５’末端を対象とするかまたは５’末端に隣接するコンセンサスなプライマーがＣＤＲ３を欠いているＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供するためにヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対しコンセンサスなプライマーと併せて使用される抗体可変ドメインのレパートリーを産生する方法を記載している。さらにＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２ （Ｍａｒｋｓ， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ． １９９２）は、どのようにこのレパートリーが特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせられ得るかを記載している。同様の技術を使用して、本発明のＣＤＲ３由来の配列は、ＣＤＲ３を欠いているＶＨドメインまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフリングされてよく、シャッフリングされた完全なＶＨまたはＶＬドメインを同族のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて、本発明の特異的な結合メンバーを提供することが可能である。次に、このレパートリーは、国際特許公開公報第９２／０１０４７号のファージディスプレイシステムなどの適切な宿主系で提示され得、これにより適切な特異的な結合メンバーが選択され得る。レパートリーは、１０^４以上の個別のメンバー、たとえば１０^６～１０^８または１０^１０のメンバーからなり得る。

類似のシャッフリングまたはコンビナトリアルな技術もまた、Ｓｔｅｍｍｅｒ， １９９４ （Ｓｔｅｍｍｅｒ １９９４）により開示されており、Ｓｔｅｍｍｅｒはβ－ラクタマーゼ遺伝子に関連する技術を記載しているが、この手法が抗体の作製に使用され得ることを観察している。さらなる代替案は、全可変ドメインの中に変異を作製するために、たとえばＦＧ２７ＶＨまたはＶＬ遺伝子の、ランダムな変異誘発を使用して本発明のＣＤＲ３由来の配列を担持する新規のＶＨまたはＶＬ領域を作製することである。このような技術は、ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを使用したＧｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９２ （Ｇｒａｍ， Ｍａｒｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ． １９９２）により記載されている。

使用され得る別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対する変異誘発を生じさせることである。このような技術は、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４ （Ｂａｒｂａｓ， Ｈｕ ｅｔ ａｌ． １９９４）およびＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６ （Ｓｃｈｉｅｒ， ＭｃＣａｌｌ ｅｔ ａｌ． １９９６）により開示されている。イムノグロブリン可変ドメインの実質的な一部は、全般的に、それらに介入するフレームワーク領域と共に、少なくとも３つのＣＤＲ領域を含む。この部分はまた、第１および第４のフレームワーク領域のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含み得、この５０％は、第１のフレームワーク領域のＣ末端側の５０％および第４のフレームワーク領域のＮ末端側の５０％である。可変ドメインの実質的な部分のＮ末端またはＣ末端のさらなる残基は、天然に存在する可変ドメイン領域と通常関連しなくてもよい。たとえば、組み換えＤＮＡ技術によりなされる本発明の特異的な結合メンバーの構築は、以下により詳細に論述されるように、イムノグロブリンの重鎖、（たとえばジアボディの産生における）他の可変ドメインまたはタンパク質標識を含むさらなるタンパク質配列に本発明の可変ドメインを結合するためのリンカーの導入を含む、クローニングまたは他の操作ステップを容易にするために導入されるリンカーによりコードされたＮ末端またはＣ末端の残基の導入をもたらし得る。

本発明は、図１に実質的に提示されるＶＬ領域およびＶＨ領域のアミノ酸配列、すなわち図１ａまたは１ｂのアミノ酸１～１２７（ＶＨ）および図１ｃのアミノ酸１～１２４（ＶＬ）に基づく結合ドメインの対を含む特異的な結合メンバーを提供する。これら配列のいずれかに基づく単一の結合ドメインは、本発明のさらなる態様を形成する。図１ａおよび１ｂに実質的に提示されるＶＨ領域のアミノ酸配列に基づく結合ドメインの場合、このような結合ドメインは、イムノグロブリンＶＨドメインが特定の方法で標的の抗原に結合できることが知られているため、標的化作用物質として使用され得る。一本鎖の特異的な結合ドメインのいずれかの場合、これらドメインは、本明細書中開示されるＦＧ２７抗体と同じ程度良好であるかまたは同等のｉｎ ｖｉｖｏでの特性を有する２ドメインの特異的な結合メンバーを形成できる相補的なドメインに関してスクリーニングするために使用され得る。

これは、国際特許公開公報第９２／０１０４７号に開示されるいわゆる階層的なデュアルコンビナトリアルな手法（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｄｕａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用するファージディスプレイスクリーニング法（ここでＨ鎖またはＬ鎖のクローンのいずれかを含む個々のコロニーが、他の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーに感染させるために使用され、結果得られる二本鎖の特異的な結合メンバーが、この参照文献に開示されるものなどのファージディスプレイ技術により選択される）により、達成され得る。この技術はまた、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２ （Ｍａｒｋｓ， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ． １９９２）に開示されている。

本発明の特異的な結合メンバーは、抗体の定常領域またはその一部をさらに含み得る。たとえば、図１ｃに示されるＶＬ領域に基づく特異的な結合メンバーは、それらのＣ末端で抗体の軽鎖定常ドメインに結合し得る。同様に、図１ａおよび１ｂに示されるＶＨ領域に基づく特異的な結合メンバーは、それらのＣ末端で、いずれかの抗体のアイソタイプ、たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、ならびにアイソタイプのサブクラス、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４に由来するイムノグロブリン重鎖の全てまたは一部に結合し得る。

本発明の特異的な結合メンバーは、ヒトまたは動物の対象における腫瘍の診断および処置の方法に使用され得る。

診断に使用される場合、本発明の特異的な結合メンバーは、検出可能な標識、たとえば^１３１Ｉまたは^９９Ｔｃなどの放射性標識で標識されてよく、これは、抗体イメージングの分野で知られている従来の化学技術を使用して本発明の特異的な結合メンバーに結合され得る。また標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識を含む。さらに標識は、特定の同族の検出可能な部分、たとえば標識したアビジンへの結合を介して検出され得るビオチンなどの化学的な部分を含む。

本発明の特異的な結合メンバーはそれ自体ががん細胞の殺滅に有効であることが示されているが、これらはさらに、機能的な標識で標識され得る。機能的な標識は、がん細胞の破壊をもたらすために当該がんの部位を標的とするように設計されている物質を含む。このような機能的な標識は、リシンなどの毒素および細菌性カルボキシペプチダーゼまたはニトロレダクターゼなどの酵素を含み、これらは、プロドラッグを有効な薬物に変換できる。さらに、特異的な結合メンバーは、マイタンシン（ＤＭ１およびＤＭ４）、オニド（ｏｎｉｄｅ）、アウリスタチン、カリケアマイシン、デュオカマイシン（ｄｕｏｃａｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシンなどの化学療法剤もしくは細胞毒性剤、または^９０Ｙもしくは^１３１Ｉなどの放射性標識に結合し得るかまたは他の方法で関連し得る。

さらに、本発明の特異的な結合メンバーは、単独でか、または他の処置と組み合わせて処置される病態に応じて同時もしくは逐次的に投与され得る。よって本発明は、腫瘍の処置における同時使用、別々の使用、または逐次使用のための配合剤としての、本発明の特異的な結合メンバーと有効な作用物質とを含む製品をさらに提供する。有効な作用物質は、本発明の結合メンバーと相乗的に作用し得る、５－フルオロウラシル、シスプラチン、マイトマイシンＣ、オキサリプラチン、およびタモキシフェンを含む化学療法剤または細胞毒性剤を含み得る。他の有効な作用物質は、適切な用量の鎮痛剤、たとえば非ステロイド系抗炎症薬物（たとえばアスピリン、パラセタモール、イブプロフェン、もしくはケトプロフェン）もしくはオピエート（ｏｐｉｔａｔｅ）、たとえばモルヒネ、または鎮吐剤を含み得る。

理論により拘束されることを望むものではないが、腫瘍の殺滅を高めるために有効な作用物質と相乗的に作用する本発明の結合メンバーの特性は、免疫エフェクター機構によるものでなくてよく、むしろ細胞表面に結合したＬｅ^ｙグリカンに対する結合メンバーの結合の直接的な結果であり得る。免疫チェックポイント分子に対する抗体を含むがん免疫療法は、様々な悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｅ）に対して、異なる免疫－腫瘍学の処置形式と組み合わせて有効であることを示している。

本発明の特異的な結合メンバーは、通常医薬組成物の形態で投与され、これは、当該特異的な結合メンバーに加えて少なくとも１つの成分を含み得る。医薬組成物は、有効成分に加え、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、バッファー、安定化剤、または当業者によく知られている他の物質を含み得る。このような物質は、非毒性であるべきであり、有効成分の効力を妨げるべきではない。担体または他の物質の精確な性質は、経口であり得るかまたは注射、たとえば静脈内注射といった注射によるものであり得る投与経路に応じて変化する。注射は、組成物の治療上の投与のための主要な経路であるが、カテーテルまたは他の外科的なチューブを介した送達もまた使用されることが想定される。一部の適切な投与経路として、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、および筋肉内投与が挙げられる。液体製剤は、散剤の製剤から再構成した後に利用され得る。

静脈内注射または罹患部位での注射では、有効成分は、パイロジェンフリーであり、適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、たとえば塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液などの等張性ビヒクルを使用して適切な液剤を良好に調製できる。保存剤、安定化剤、バッファー、抗酸化剤、および／または他の添加剤が、必要に応じて含まれ得る。

経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、または液体の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンなどの固体の担体またはアジュバントを含み得る。液体の医薬組成物は、全般的に、水、石油、動物性または植物性油、鉱油、または合成油などの液体の担体を含む。生理食塩水、デキストロース、または他の糖溶液またはグリコール、たとえばエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールが含まれ得る。製剤が液体である場合、これは、たとえば、ｐＨ６．８～７．６の非リン酸バッファーを含む生理的な塩の溶液または凍結乾燥した粉末であってもよい。

また本組成物は、血液を含む特定の組織に置かれるミクロスフィア、リポソーム、他のマイクロ粒子送達システムまたは徐放製剤を介して投与され得る。徐放担体の適切な例として、たとえば坐薬またはマイクロカプセルといった共通の物品の形態における半透過性のポリマーマトリックスが挙げられる。埋め込み可能またはマイクロカプセル状の徐放マトリックスとして、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許公開公報第００５８４８１号）、Ｌ－グルタミン酸およびγエチル－Ｌ－グルタマートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ， Ｓｔｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ． １９８３）、ポリ（２－ヒドロキシエチルーメタクリラート）が挙げられる。ポリペプチドを含むリポソームは、よく知られている方法：ＤＥ ３，２１８， １２１Ａ；（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ， Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ． １９８５）；（Ｈｗａｎｇ， Ｌｕｋ ｅｔ ａｌ． １９８０）；欧州特許公開公報第００５２５２２号；欧州特許公開公報第００３６６７６号；欧州特許公開公報第００８８０４６号；欧州特許公開公報第０１４３９４９号；欧州特許公開公報第０１４２５４１号；特許公開公報第８３－１１８０８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号により調製されている。基本的に、リポソームは、小さな（約２００～８００オングストローム）の単層型であり、ここでの脂質の含有量は、約３０ｍｏｌ％超のコレステロールであり、選択された比率が、ポリペプチド漏出の最適な比率のため調節されている。本組成物は、腫瘍部位もしくは他の望ましい部位へ局在化した方法で投与されてもよく、または腫瘍もしくは他の細胞を標的とする方法で送達されてもよい。

本組成物は、好ましくは「治療上有効量」で個体に投与され、これは、個体に利点を示すために十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間過程は、処置されるものの性質および重症度に応じて変化する。処置の処方、たとえば用量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内にあり、通常、処置される障害、個別の患者の状態、送達部位、投与方法、および実務者に知られている他の要因を考慮する。本発明の組成物は、特に、既存の腫瘍、特にがんの処置、および最初の処置または外科手術の後の当該病態の再発の予防に関連している。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｌｏ， Ａ． （ｅｄ）， １９８０ （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ １９８０）で見出され得る。

最適な用量は、たとえば年齢、性別、体重、処置される病態の重症度、投与される有効成分、および投与経路を含む多くのパラメータに基づき医師により決定され得る。一般的に、受容体の飽和を許容するポリペプチドおよび抗体の血清中濃度が望ましい。通常、約０．１ｎＭを超える濃度が十分である。たとえば、１００ｍｇ／ｍ^２の用量の抗体は、約８日間約２０ｎＭの血清中濃度を提供する。

おおよそのガイドラインとして、抗体の用量は、１０～３００ｍｇ／ｍ^２の量で毎週投与され得る。等しい用量の抗体フラグメントは、Ｌｅ^ｙ炭水化物の飽和を可能にする濃度を超える血清レベルを維持するためにより頻繁な間隔で使用される。本組成物の用量は、結合メンバーの特性、たとえばその結合活性およびｉｎ ｖｉｖｏでの血漿中半減期、製剤中のポリペプチドの濃度、投与経路、投与部位および速度、関与する患者の臨床的耐性、患者を苦しめる病態などに応じて変化し、これは医師の技能の範囲内にある。たとえば、投与あたり、患者あたり３００μｇの抗体の用量が好ましいが、用量は、投与あたり約１０μｇ～６ｍｇの範囲にあり得る。異なる用量が、一連の逐次接種の間利用される。実務者は、最初の接種を行い、次に、比較的少ない量の抗体でブーストを行うことが可能である。

また本発明は、がんに対する防御免疫応答を高めるために免疫処置のスケジュールを最適化することを対象とする。

本発明の結合メンバーは、全体または部分的に化学的な合成により作製され得る。結合メンバーは、良好に確立されている標準的な液相または好ましくは固相ペプチド合成法により容易に調製でき（この一般的な記載は、広く利用可能である（たとえばＪ．Ｍ． Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ． Ｙｏｕｎｇ， １９８４ （Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ １９８４）、Ｍ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ， １９８４ （Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ ａｎｄ Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ １９８４）を参照）、またはこれらは、溶液において、液相法または固相、液相、および溶液の化学技術のいずれかの組み合わせにより、たとえば最初に各ペプチド部分を完成させ、次に望ましくかつ適切である場合、存在する保護基を全て除去した後、各炭酸またはスルホン酸またはそれらの反応性の誘導体の反応により残基Ｘを導入することにより、調製され得る。

本発明に係る結合メンバーを生産する別の簡便な方法は、発現系において核酸を使用することにより、それをコードする核酸を発現することである。

さらに本発明は、本発明の特異的な結合メンバーをコードする単離された核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。好ましい態様では、本発明は、上記に定義される本発明の特異的な結合メンバーをコードする核酸を提供する。このような核酸の例は、図１および２に示されている。当業者は、本発明の特異的な結合メンバーを依然として提供する、当該核酸に対する置換、欠失、および／または付加を決定することができる。

また本発明は、上述の少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態のコンストラクトを提供する。また本発明は、上記の１つ以上のコンストラクトを含む組み換え宿主細胞を提供する。言及されるように、本発明の特異的な結合メンバーをコードする核酸は、コードした核酸からの発現を含む、特異的な結合メンバーの産生方法と同様に、本発明の一態様を形成する。発現は、核酸を含む組み換え宿主細胞を、適切な条件下で培養することにより簡便に達成され得る。発現による産生の後に、特異的な結合メンバーは、いずれかの適切な技術を使用して単離および／または精製されてよく、次に適宜使用され得る。

様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムは、よく知られている。適切な宿主細胞として、細菌、哺乳類細胞、酵母、およびバキュロウイルスの系が挙げられる。異種性ポリペプチドの発現のため当該分野で利用可能な哺乳類細胞株として、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞、および多くの他の細胞が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌である。大腸菌などの原核細胞での抗体および抗体フラグメントの発現は、当該分野で良好に確立されている。レビューとして、たとえばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， １９９１ （Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ １９９１）を参照されたい。培養物における真核細胞の発現はまた、特異的な結合メンバーの産生のための選択肢として当業者に利用可能である。近年のレビューとして、たとえばＲｅｆｆ， １９９３ （Ｒｅｆｆ １９９３）； Ｔｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５ （Ｔｒｉｌｌ， Ｓｈａｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９５）を参照されたい。

プロモーター配列、転写終結配列、ポリアデニル化配列、エンハーサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含む適切な制御配列を適宜含む適切なベクターが、選択または構築され得る。ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス、たとえばファージまたはファージミドであり得る。さらなる詳細に関しては、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ １９８９）を参照されたい。たとえば核酸コンストラクトの調製における核酸の操作、変異誘発、シーケンシング、ＤＮＡの細胞への導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析のための多くの知られている技術およびプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９２ （Ａｕｓｕｂｅｌ １９９２）に詳述されている。

よって、本発明のさらなる態様は、本明細書中開示される核酸を含む宿主細胞を提供する。さらなる態様は、当該核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。この導入は、いずれかの利用可能な技術を使用し得る。真核細胞では、適切な技術は、リン酸カルシウムのトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソームが介在するトランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のウイルス、たとえばワクシニアウイルス、もしくは昆虫細胞ではバキュロウイルスを使用する形質導入を含み得る。細菌細胞では、適切な技術は、塩化カルシウムによる形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを使用するトランスフェクションを含み得る。この導入を行った後に、たとえば宿主細胞を遺伝子発現のための条件下で培養することにより、核酸からの発現が引き起こされてもよくまたはこれが可能となり得る。

本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（たとえば染色体）に統合され得る。統合は、標準的な技術によるゲノムでの組み換えを促進する配列の包含により、促進され得る。

また本発明は、上述の特異的な結合メンバーまたはポリペプチドを発現するための発現系において上述のコンストラクトを使用することを含む方法を提供する。

本発明の各態様の好ましい特性は、必要な変更を加えた他の各態様と同様である。本明細書中言及される従来技術の文献は、法律により許容される最も完全な度合いまで組み込まれている。

予想外なことに、本発明者らは、Ｌｅ^ｙ含有グリカンを認識するｍＡｂのＦＧ２７ファミリーが、免疫エフェクター細胞を伴うことなく、非アポトーシス性の直接的な細胞死を誘導したことを見出した。本発明の一態様では、本発明は、Ｌｅ^ｙ含有グリカンに結合し、非アポトーシス性細胞死を誘導する薬物を提供する。

ＦＧ２７ ｍＡｂは、細胞へ膜損傷を誘導し、細胞の凝集、微絨毛の喪失、小分子量の色素の取り込みおよびポア形成をもたらした。経時的に細胞は大きなポアを発達させ、壊死と同様の機構で溶解した。これは、他のグリカンを認識する多くのｍＡｂと同様である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ， Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９０， Ｃｈｏｕ， Ｔａｋｅｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ． １９９８， Ｚｈｏｎｇ， Ｍａｎｚｉ ｅｔ ａｌ． ２００１， Ａｌｖａｒｅｚ－Ｒｕｅｄａ， Ｌｅｐｒｉｅｕｒ ｅｔ ａｌ． ２００７， Ｌｏｏ， Ｐｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００７， Ｚｈａｎｇ， Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。ＦＧ２７ ｍＡｂはまた、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを介してｉｎ ｖｉｔｒｏで強力な細胞傷害性活性を呈した。肝臓および腹膜腔において転移が確立しているマウスへのＦＧ２７の投与（９週間にわたり１週間に２回、０．１ｍｇの静脈内（ｉ．ｖ．））は、完全な腫瘍根絶およびマウスの約３０％の治癒をもたらした。同時に化学療法を用いることなく良好に確立された腫瘍の根絶におけるＦＧ２７ ｍＡｂの将来性は、Ｌｅ^ｙを発現するヒト固形腫瘍の処置のための単剤療法用の作用物質としてのそれらの将来性を表している。

ここで本発明を、以下の非限定的な実施例および添付の図面によりさらに説明する。

図１ａ：マウスＦＧ２７．１０ ＩｇＧ３重鎖の完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。番号は、抗体配列のナンバリングに関して標準化されたＩＭＧＴシステムを表す（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。図１ｂ：マウスＦＧ２７．１８ ＩｇＧ１重鎖の完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。番号は、抗体配列のナンバリングに関して標準化されたＩＭＧＴシステムを表す（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。図１ｃ：マウスＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８のカッパ鎖の完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。番号は、抗体配列のナンバリングに関して標準化されたＩＭＧＴシステムを表す（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。 同上。 同上。 図２ａ：ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域とのキメラ化を行ったマウスＦＧ２７重鎖可変領域の完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。番号は、抗体配列のナンバリングに関して標準化されたＩＭＧＴシステムを表す（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。図２ｂ：ヒトκ鎖定常領域とのキメラ化を行ったマウスＦＧ２７κ鎖可変領域の完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。番号は、抗体配列のナンバリングに関して標準化されたＩＭＧＴシステムを表す（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。 同上。 図３ａ：ヒト化ＦＧ２７重鎖可変領域の完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。番号は、抗体配列のナンバリングに関して標準化されたＩＭＧＴシステムを表す（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。図３ｂ：ヒト化ＦＧ２７κ鎖可変領域の完全なアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。番号は、抗体配列のナンバリングに関して標準化されたＩＭＧＴシステムを表す（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）。 同上。 図４：ＳＴ１６、ＨＵＶＥＣ、およびＰＢＭＣに対するＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８の結合。このアッセイの陰性対照は、ＳＴ１６およびＨＵＶＥＣではＮＳＯの上清であり、またはＰＢＭＣでは細胞単独であり、陽性対照は、ＨＬＡを認識する、抗シアリル－ジＬｅ^ａ ｍＡｂ、５０５／４、またはＷ６／３２であった。 図５：結腸直腸（Ｃ１７０）、卵巣（ＯＶＣＡＲ－３、ＯＶＣＡＲ－４、ＯＶＣＡ４３３、ＯＡＷ２８、ＯＡＷ４２）および胃細胞株（ＳＴ１６、ＭＫＮ４５、ＡＧＳ）由来の糖脂質抽出物に対するＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８の結合。ある範囲のがん細胞株から抽出した糖脂質は、ＥＬＩＳＡプレート上にプレーティングした。次に、細胞および糖脂質を、ＦＧ２７．１０またはＦＧ２７．１８の上清とインキュベートした。糖脂質に対する結合を、抗ＩｇＧ－ＨＲＰ／ＴＭＢでプロービングした。 図６：ＥＬＩＳＡにより評価した、ＨＳＡとカップリングしたＬｅｗｉｓ抗原（ａ、ｂ、ｘ、およびｙ）に対するＦＧ２７．１０の結合。５０５／４（抗シアリル－ジ－Ｌｅ^ａ）、ＦＧ８８．２（Ｌｅ^ａ－ｘ）、ＦＧ８８．７（Ｌｅ^ａ－ｘ）、および２２５－Ｌｅ（Ｌｅ^ｂ）を、陽性対照として含み、マウスＨＲＰＯは陰性対照として含めた。抗体活性は、４０５ｎｍでの吸光度により測定した。 図７：ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８の結合を、６１０の哺乳類のグリカン標的から構成されるＴｈｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓのグリカンアレイに対してスクリーニングした。ａ）ＦＧ２７．１０、ｂ）ＦＧ２７．１８、ｃ）６９２（Ｌｅ^ｙ／ｂ）、およびｄ）ＢＲ９６（Ｌｅ^ｙ／ｘ）の間の微細な特異性を比較した：ここで、ａ＝Ｌｅ^ａ、ｂ＝Ｌｅ^ｂ、ｙ＝Ｌｅ^ｙ、ｘ－Ｌｅ^ｘ、Ｄ－＝ジ、Ｔ－＝トリ、Ｓ－＝シアリル、Ｅｘ－＝伸長した（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）、φは、グリカンを含むマンノースを表し、ｙ－ｘ＝Ｌｅ^ｙ－Ｌｅ^ｘである。ｍＡｂがグリカンアレイの異なるバージョンでスクリーニングされているため、グリカン番号は、各ｍＡｂで同じではない場合があることに留意されたい。 同上。 図８：腫瘍細胞株のパネルから抽出した総タンパク質または脂質に結合したＬｅ^ｙに対するＦＧ２７の結合。腫瘍細胞株、ＡＧＳ細胞、ＨＣＴ１５細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、ＭＣＦ７細胞、およびＨ３２２細胞のライセート（１×１０^５個の細胞の均等物）から抽出した総糖タンパク質または糖脂質に関連するＬｅ^ｙに対するＦＧ２７の結合のウェスタンブロットによる検出。 図９：ある範囲の細胞株での抗Ｌｅ^ｙおよびＬｅ^ｂ ｍＡｂの比較。ＳＣ１０１（６９２／２９）およびＢＲ９６を、ある範囲の細胞株（ＳＴ１６、ＨＴ２９、Ｃ１７０、ＬｏＶｏ、Ｃｏｌｏ２０１、ＯＶＣＡＲ－３、ＡＧＳ）にわたり、０．１～３０μｇ／ｍｌで滴定し、ここでＦＧ２７の上清は、正味から１：３０に希釈した。結合を、抗ＩｇＧ－ＦＩＴＣでプロービングし、フローサイトメトリーにより分析した。 図１０：６９２／２９（Ｌｅ^ｙ／ｂ）、ＢＲ９６（Ｌｅ^ｙ／ｘ）、およびＦＧ２７（Ｌｅ^ｙ）で染色した正常な食道、胃、十二指腸、回腸、結腸、膵臓、肺、および腎臓の代表的なＩＨＣ画像。 図１１ａ：ＦＧ２７のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性。試験期間にわたる腫瘍増殖のパーセンテージは、ビヒクルのみの対照（ＰＢＳ）と比較したマウスＦＧ２７ ｍＡｂの抗腫瘍活性を評価するために使用されるＣ１７０ＨＭ２バイオルミネセンスマウス腫瘍モデルで示されている。このモデルでは、バイオルミネセンスは、バイアビリティを表す。グループｎ≧９；この試験は、３２日目に終了した。ＦＧ２７での処置は、ビヒクル対照と比較して試験の最終日までに生物発光腫瘍量の有意な低減をもたらした（ｐ＝０．０１４）。図１１ｂ：ＢＬＩにより評価される注射部位の腫瘍量は、ＦＧ２７処置での注射部位の腫瘍増殖の有意な低減を示している（ｐ＝０．０５）。 図１２：ＦＧ２７のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性。腫瘍増殖のパーセンテージが、陽性対照のｍＡｂおよびビヒクルのみの対照（ＰＢＳ）と比較したＦＧ２７の抗腫瘍活性を評価するために使用されるＣ１７０ＨＭ２バイオルミネセンスマウス腫瘍モデルで示されている。バイオルミネセンスは、このモデルでの腫瘍細胞のバイアビリティを表す。グループ ｎ≧８；ＦＧ２７での処置は、処置対照と比較して５１日目までに腫瘍増殖のパーセンテージの有意な低下をもたらした（ｐ＝０．００９）。図１２ｂ：ログランクＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定による分析は、ビヒクルのみの対照と比較してＦＧ２７処置グループの有意な生存を表している（ｐ＝０．０３５）。処置は、１２０日目に終了した。 図１３ａ：抗体配列のナンバリングに関して標準化されたＩＭＧＴシステム（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）を使用した、ＢＲ９６、Ｈ１８Ａ、Ｈｕ３Ｓ１９３、およびＳＣ１０１と比較したマウスＦＧ２７重鎖可変領域のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。図１３ｂ：抗体配列のナンバリングに関して標準化されたＩＭＧＴシステム（Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００９）を使用した、ＢＲ９６、ＳＣ１０１、Ｈ１８Ａ、Ｈｕ３Ｓ１９３と比較したマウスＦＧ２７κ鎖可変領域のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列。 同上。 同上。 同上。 図１４：Ｌｅ^ｙを発現する腫瘍細胞株のＡＧＳに対するキメラＩｇＧ１（５μｇ／ｍｌ）およびＩｇＧ２（５μｇ／ｍｌ）ｍＡｂの、間接的な免疫蛍光およびフローサイトメトリー分析により評価される結合を、抗体のＦＧ２７．１０（５μｇ／ｍｌ）およびＦＧ２７．１８（５μｇ／ｍｌ）のマウスのバージョンと比較した。抗ＨＬＡ ｍＡｂのＷ６／３２（１／１００）を、陽性対照として包含した。 図１５ａ：マウスＩｇＧ３ ｍＡｂ ＦＧ２７．１０が介在するＳＴ１６細胞のＰＩの取り込みは、４℃であっても強力なＰＩの取り込みを誘導したが、ＩｇＧ１バリアントのＦＧ２７．１８はこれを誘導しなかった。図１５ｂ：腫瘍細胞株のパネル（ＡＧＳ、Ｃｏｌｏ２０１、Ｃ１７０、Ｃ１７０ＨＭ２、ＭＣＦ７、ＯＶＣＡ４、ＬｏＶｏ、ＭＫＮ４５、７９１Ｔ、およびＳｋｏｖ３）でのＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８が介在するＰＩの取り込み。図１５ｃ：Ｃ１７０細胞でのＦＧ２７．１０、ＦＧ２７．１８、ＣＨ２７ ＩｇＧ２、ＣＨ２７ ＩｇＧ１が介在するＰＩの取り込み。 同上。 図１６：がん細胞株、ＡＧＳ、ＭＣＦ７、Ｈ３２２、およびＣ１７０のパネルでのある範囲の濃度（０．０１ｎＭ～３０ｎＭ）にわたるＦＧ２７．１０、ＦＧ２７．１８、およびＣＨ２７のインターナリゼーションのデータ。ｍＡｂの細胞でのインターナリゼーションを、サポリンがコンジュゲートしたマウスＩｇＧに対するヤギ抗体（ＡＴＳｂｉｏ， ＩＴ＃４８）またはサポリンがコンジュゲートしたヒトＩｇＧに対するヤギ抗体（ＺＡＰ）（Ｆ’ａｂフラグメント）７５ｎｇ／ウェルを使用して観察し、チミジンの取り込みの阻害により評価した（最後の２４時間のインキュベーションの間に添加した）。対照のウェルは、培養培地のみ、無関係の陽性対照ＩｇＧ３ ｍＡｂ ＦＧ８８、および二次コンジュゲートのみとインキュベートした細胞からなるものであった。 図１７ａ：ＡＤＣＣ／ＣＤＣを媒介するＦＧ２７．１０ ｍＩｇＧ３の例。標的細胞を、ＦＧ２７．１０の上清もしくは無関係なＩｇＧを伴いヒトの血液から単離したＰＢＭＣ（ＡＤＣＣ）また補体（ＣＤＣ）とインキュベートした。三連のウェルの標準偏差を表すエラーバーが存在するが、データ点により不明確な場合がある。図１７ｂ：ＦＧ２７．１０、ＦＧ２７．１８、６９２／２９、ＣＨ２７ ＩｇＧ１、およびＣＨ２７ ＩｇＧ２とのインキュベーションでのＭＣＦ７腫瘍細胞株のＡＤＣＣ。これらは、１つの実験からの結果であるが、２つの反復を表す。図１７ｃ：４時間後のヒト血清を伴うＦＧ２７．１０、ＦＧ２７．１８、６９２／２９、ＣＨ２７ ＩｇＧ１、およびＣＨ２７ ＩｇＧ２とのインキュベーション後のＳＴ１６腫瘍細胞株のＣＤＣによる平均殺滅パーセンテージ。対照としてハーセプチンを含めた。このアッセイは、段階希釈３、１、０．３、および０．１μｇ／ｍｌで行い、各希釈物は、三連でインキュベートした。図１７ｄ：４時間後のヒト血清を伴うＦＧ２７．１０、６９２／２９、ＣＨ２７ ＩｇＧ１、およびＣＨ２７ ＩｇＧ２とのインキュベーション後のＡＧＳ細胞のＣＤＣによる平均殺滅パーセンテージ。このアッセイは、段階希釈３、１、０．３、および０．１μｇ／ｍｌで行い、各希釈物は、三連でインキュベートした。 同上。 同上。 図１８：ＦＧ２７重鎖のＧｉｂｂｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉ：配列同一性。構造上重要な残基が強調されている：プロリン残基は白色で輪郭が付されており、システイン残基は黒色で輪郭が付されており、アスパラギン残基は灰色で輪郭が付されている。 図１９：ＦＧ２７重鎖のＧｉｂｂｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＩＩ：同一性および類似性のスコア、４Å近位残基およびＣＤＲのループ長。システイン残基は、白色で輪郭が付されている。 図２０：ヒト重鎖ドナー配列生殖系列の分析。 図２１：ＦＧ２７重鎖ヒト化戦略の構造上重要な残基が強調されている：プロリン残基は白色で輪郭が付されており、システイン残基は黒色で輪郭が付されており、アスパラギン残基は灰色で輪郭が付されている。灰色で輪郭が付されておりかつイタリック体の残基は、マウス残基への逆翻訳（ｂａｃｋ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を表す。 図２２：２７ κ軽鎖のＧｉｂｂｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉ：配列同一性。構造上重要な残基は強調されている：プロリン残基は白色で輪郭が付されており、システイン残基は黒色で輪郭が付されており、アスパラギン残基は灰色で輪郭が付されている。 図２３：ＦＧ２７ κ軽鎖のＧｉｂｂｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＩＩ：同一性および類似性のスコア、４Å近位残基およびＣＤＲのループ長。 図２４：ヒトκ軽鎖ドナー配列生殖系列の分析。 図２５：ＦＧ２７κ軽鎖ヒト化戦略。構造上重要な残基が強調されている：プロリン残基は白色で輪郭が付されており、システイン残基は黒色で輪郭が付されている。太字の残基は、マウス残基への逆翻訳を表す。 図２６：ｃＦＧ２７陽性対照抗体およびｃ１２１０陰性対照抗体を含む、ＬｅｗＲＨＡとＬｅｗＲＫＡ、ＬｅｗＲＫＢ、ＬｅｗＲＫＣ、またはＬｅｗＲＫＤ、およびＬｅｗＲＨＢとＬｅｗＲＫＡ、ＬｅｗＲＫＢ、ＬｅｗＲＫＣ、またはＬｅｗＲＫＤとして表される抗体の組み合わせでのＬｅｗｉｓＹ－ＨＳＡ抗原に対する抗体の結合の比較。 図２７。ｃＦＧ２７陽性対照抗体を含む、ＬｅｗＲＨＡとＬｅｗＲＫＡ、ＬｅｗＲＫＢ、ＬｅｗＲＫＣ、またはＬｅｗＲＫＤ、およびＬｅｗＲＨＢとＬｅｗＲＫＡ、ＬｅｗＲＫＢ、ＬｅｗＲＫＣ、またはＬｅｗＲＫＤの熱的安定性。 図２８。Ｌｅｗｉｓ^ｙ ＦＧ２７ヒト化バリアントｈＬｅｗＡＢ、ｈＬｅｗＡＣ、ｈＬｅｗＡＤ、ｈＬｅｗＢＣおよび対照マウスＦＧ２７のサーマルシフトの分析。 図２９。ＦＧ２７ヒト化バリアントｈＬｅｗＡＢ、ｈＬｅｗＡＣ、ｈＬｅｗＡＤ、ｈＬｅｗＢＣおよび対照マウスＦＧ２７の抗体の親和性のＢｉａＣｏｒｅ分析。 図３０。ＣＩＣ（Ｃｒｏｓｓ－Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により測定される、ＦＧ２７ヒト化バリアントｈＬｅｗＡＢ、ｈＬｅｗＡＣ、ｈＬｅｗＡＤ、ｈＬｅｗＢＣおよび対照マウスＦＧ２７での非特異的なタンパク質間相互作用。 図３１。細胞株のパネルに対するＦＧ２７．１０、ＦＧ２７．１８、ｃｈ２７ＩｇＧ１、およびヒト化バリアントｈＬｅｗＡＣの結合。 図３２：２７ｈＩｇＧ１と比較したｉ２７Ｇ１によるＭＣＦ７（パネルｉ）およびＡＧＳ（パネルｉｉ）での増殖阻害の有意な増大。２７ｈＩｇＧ１と比較したｉ２７Ｇ１による機能的な親和性の有意な増大（ＳＰＲ）（パネルｉｉｉ）。ｉ２７Ｇ１は、ＭＣＦ７で同等のＡＤＣＣの活性（パネルｉｖ）およびＣＤＣの活性（パネルｖ）を維持している。親のコンストラクトと比較した有意性を、多重比較のためダネットの補正を伴い２元ＡＮＯＶＡ（直接的な細胞傷害性）または１元ＡＮＯＶＡ（機能的な親和性）から推定した。 図３３：「ｉ２７Ｇ１」抗体の各軽鎖および重鎖のアミノ酸配列および核酸配列。

方法
腫瘍細胞株に対する結合：１×１０^５個のがん細胞を、５０μｌの一次抗体と４℃で１時間インキュベートした。細胞を、２００μｌのＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳ（ｎｅｗ ｂｏｒｎ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）（ＮＢＣＳ：Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ）で洗浄し、１，０００ｒｐｍで５分間回転させた。上清を廃棄し、５０μｌのＦＩＴＣがコンジュゲートした抗マウスＩｇＧのＦｃに特異的なｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ；ＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳにおいて１／１００）を、二次抗体として使用した。細胞を、暗室において４℃で１時間インキュベートし、次に、２００μｌのＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳで洗浄し、１，０００ｒｐｍで５分間回転させた。上清を廃棄した後、０．４％のホルムアルデヒドを使用して細胞を固定した。サンプルを、Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ ＦＣ－５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｈｉｇｈ Ｗｙｃｏｍｂｅ， ＵＫ）で分析した。生のデータを分析およびプロットするために、ＷｉｎＭＤＩ ２．９ソフトウェアを使用した。

血液に対する結合：５０μｌの健常なドナーの血液を、５０μｌの一次抗体と４℃で１時間インキュベートした。血液を、１５０μｌのＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳで洗浄し、１，０００ｒｐｍで５分間回転させた。上清を廃棄し、５０μｌのＦＩＴＣがコンジュゲートした抗マウスＩｇＧのＦｃに特異的なｍＡｂ（ＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳにおいて１／１００）を、二次抗体として使用した。細胞を、暗室において４℃で１時間インキュベートし、次に１５０μｌのＲＰＭＩ １０％のＮＢＣＳで洗浄し、１，０００ｒｐｍで５分間回転させた。上清を廃棄した後、５０μｌ／ウェルのＣａｌ－Ｌｙｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）を使用し、次に５００μｌ／ウェルの蒸留水を使用して、赤血球を溶解した。その後、この血液を、１，０００ｒｐｍで５分間回転させた。上清を廃棄し、０．４％のホルムアルデヒドを使用して細胞を固定した。サンプルを、ＦＣ－５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。生のデータを分析およびプロットするために、ＷｉｎＭＤＩ ２．９ソフトウェアを使用した。

細胞膜糖脂質の抽出：細胞のペレット（５×１０^７個の細胞）を、５００μｌのマンニトール／ＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭのマンニトール、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、両方ともＳｉｇｍａ）に再懸濁し、それぞれ３０パルスで３つの針（２３Ｇ、２５Ｇ、２７Ｇ）に通した。１ＭのＣａＣｌ_２５μｌを細胞に添加し、上記のようにそれぞれ３０パルスで３つの針に通した。剪断された細胞を氷上で２０分間インキュベートした後、３，０００ｇで１５分間、室温（ＲＴ）にて回転させた。上清を回収し、４８，０００ｇで３０分間、４℃で回転させ、上清を廃棄した。ペレットを１ｍｌのメタノールに再懸濁した後、１ｍｌのクロロホルムに再懸濁し、回転させながらＲＴで３０分間インキュベートした。次に、このサンプルを、１，２００ｇで１０分間回転させて沈殿したタンパク質を除去した。細胞膜糖脂質を含む上清を回収し、－２０℃で保存した。

グライコーム分析：ＦＧ２７ ｍＡｂの微細な特異性を明確にするために、抗体を、ＦＩＴＣ標識し、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｔａｔｉｃ／ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｒｅｈ８．ｓｈｔｍｌ］）へ送付した。ここで、これらは、６００以上の天然および合成のグリカンに対してスクリーニングされた。簡潔に述べると、アミノリンカーを伴う合成および哺乳類のグリカンが、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）により活性化されるガラスの顕微鏡スライド上にプリントされ、アミド結合を形成する。この作用は、エモリー大学のＣＦＧのＣｏｒｅ Ｈにより行われた。ＦＧ２７は、ＰＢＳにおいて１μｇ／ｍｌにて、室温で試験した。簡潔に述べると、抗体サンプルを、マイクロアレイのプリントした表面に適用し、湿潤したチャンバーにおいて１時間インキュベートした。次に、このスライドをＰＢＳで４回すすぎ、その後、蛍光標識した（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）抗ウサギＩｇＧを添加し、１時間インキュベートした。次に、このスライドをＰＢＳで４回すすぎ、蛍光を、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ＸＬ４０００スキャナで測定し、Ｉｍａｇｅｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して分析した。

使用したプロトコルのさらなる詳細を、以下に記載する。

標識されていないモノクローナル抗体を用いたグリカン結合アッセイ
１．イントロダクション：
１．１．Ｃｏｒｅ Ｈの主な目的は、プリントされたグリカンマイクロアレイを使用して研究者により提出されたグリカンが結合するタンパク質（Ｇｌｙｃａｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＢＰ）および様々な生物の結合特異性を決定することである。

２．参照アドレス：
２．１．ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ

３．必要とされる物質：
３．１．グリカンが、白くエッチングされたバーコードおよび黒色のマークを有するスライド面にプリントされているスライド（Ｃｏｒｅ Ｄ）－この領域には触れないこと。
３．２．カバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， １２－５４５Ｆ）
３．３．湿潤したスライド処理チャンバー（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＮＣ９０９１４１６）、またはペトリ皿を使用する自家製のシステム；ここでチャンバーの底に湿潤したペーパータオルを伴う。
３．４．スライドを洗浄するための１００ｍｌのＣｏｐｌｉｎジャー
３．５．Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＢＰ１５２－１）
３．６．ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓ２７１－３）
３．７．ＣａＣｌ２（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｃ７９－５００）
３．８．ＭｇＣｌ２（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＢＰ２１４－５００）
３．９．リン酸二水素カリウム（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐ２８５－３）
３．１０．ｄＨ２０
３．１１．シアニン５－ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ ４３－４３１６）
３．１２．適切な二次抗体、可能な場合は蛍光標識されている。
３．１３．ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｂｐ１６００－１００）
３．１４．Ｔｗｅｅｎ－２０（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ６５５２０５）
３．１５．アジ化ナトリウム（ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓ２２７－５００）
３．１６．ＰｒｏＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）

４．バッファー：
４．１．ＴＳＭ＝２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４ １５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２
４．２．ＴＳＭ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＳＭＷ）＝ＴＳＭ Ｂｕｆｆｅｒ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０
４．３．ＴＳＭ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＳＭＢＢ）＝ＴＳＭ ｂｕｆｆｅｒ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０＋１％のＢＳＡ

５．プロトコル：
５．１．洗浄バッファー（ＴＳＭ、ＴＳＭ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ、およびＨ２Ｏ）のワーキングストックを作製するか、または試薬を集めて、冷蔵庫にあった場合には室温へ戻す。
５．１．１．Ｂｕｆｆｅｒ（Ａ）ＴＳＭ－２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４ １５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２
５．１．２．Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ）ＴＳＭ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＳＭＷ）－ＴＳＭ Ｂｕｆｆｅｒ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０
５．１．３．Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃ）ＴＳＭ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＳＭＢＢ）－ＴＳＭ ｂｕｆｆｅｒ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０＋１％のＢＳＡ
５．１．４．ｄＨ２Ｏ
５．２．抗体の特性に基づきＴＳＭＢＢまたは適切な結合バッファーに抗体を最終濃度５～５０μｇ／ｍｌとなるまでまたは分析に必要とされる適切な濃度まで希釈することにより１００μｌのサンプルを調製。
５．３．デシケーターからスライドを取り出し、サンプル名を、スライドの黒色のマークの外側のバーコード近くに付ける。
５．４．１００ｍｌのＴＳＭＷを含むガラスのＣｏｐｌｉｎ染色ジャーに５分間置くことによりスライドを水和させる。
５．５．スライドを直立させて液体を排出することによりスライドから過剰な液体を除去する。
５．６．黒色のマークの間の左端のスライドの近くに７０μｌのサンプル（５．２参照）を注意深く適用。
５．７．スライドの上にカバーガラスをゆっくりと置き、カバーガラスの下のサンプルに泡が形成されないようにする。必要な場合はピペットチップでカバーガラスを優しくタッピングするかまたはカバーガラスの片側をゆっくりと持ち上げることにより泡を除去する。カバーガラスが黒色のマークの間にあることを確かめる。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析：簡潔に述べると、１０^５または１０^６個の細胞均等物（細胞ライセート、細胞膜脂質抽出物）を、ＦＧ２７の結合に関して分析した。腫瘍細胞の細胞膜脂質抽出物および細胞ライセートを、ジチオスレイトール（ＤＴＴ； Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ， ＵＫ）で還元し、ＮＯＶＥＸの４％～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、１×ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｘ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２０（ｖ／ｖ）％のメタノールを使用してＨｙｂｏｎｄ－Ｐ ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）に、３０Ｖで１時間移した。膜を、０．０５（ｖ／ｖ）％のＴｗｅｅｎ－ＰＢＳにおいて５（ｗ／ｖ）％の非脂肪ドライミルクで１時間ブロッキングし、次に、Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ、２％のＢＳＡで希釈した一次抗体で１時間プロービングした。一次抗体の結合を、ビオチンとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧのＦｃに特異的な二次抗体（Ｓｉｇｍａ；Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳにおいて１／２０００希釈、２％のＢＳＡ）を使用して１時間検出し、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジン（ＬＩＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＵＫ；Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ ２％のＢＳＡにおいて１／１０００）を使用して可視化した。

ＦＧ２７の免疫組織化学的検査の評価：ＦＧ２７の治療上の価値を決定するために、これを、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）により、胃、結腸直腸、卵巣、および乳房の腫瘍組織のマイクロアレイでスクリーニングした。

方法：免疫組織化学的検査を、標準的なアビジン－ビオチンペルオキシダーゼ（ａｖｉｄｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄｉｓｅ）の方法を使用して行った。パラフィン包埋組織切片を６０℃に熱したブロックに置き、パラフィンを融解させた。組織切片を、キシレンで脱パラフィン処理し（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｓｅ）、等級付けされたアルコールを介して再水和させた。次に、この切片を、５００ｍｌのクエン酸塩バッファー（ｐＨ６）に浸し、マイクロ波（Ｗｈｉｒｌｐｏｏｌ）で２０分間加熱して、抗原を回収した。内因性ペルオキシダーゼの活性を、内因性ペルオキシダーゼ溶液（Ｄａｋｏ Ｌｔｄ， Ｅｌｙ， ＵＫ）と組織切片を５分間インキュベートすることによりブロッキングした。正常なブタ血清（ＮＳＳ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， ＣＡ， ＵＳＡ； １／５０ ＰＢＳ）を各切片に２０分間添加し、非特異的な一次抗体の結合をブロッキングした。全ての切片をＡｖｉｄｉｎ Ｄ／Ｂｉｏｔｉｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）と１５分間インキュベートし、それぞれの、アビジンおよびビオチンの非特異的な結合をブロッキングした。切片をＮＳＳ（１／５０ ＰＢＳ）で５分間再度ブロッキングした。次に、組織切片を一次抗体とＲＴで１時間インキュベートし、抗β－２－ミクログロブリン（Ｄａｋｏ Ｌｔｄ；ＰＢＳにおいて１／１００）ｍＡｂおよびＰＢＳ単独を、それぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。組織切片をＰＢＳで洗浄し、ビオチン化ヤギ抗マウス／ウサギイムノグロブリン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ； １／５０ ｉｎ ＮＳＳ）とＲＴで３０分間インキュベートした。組織切片をＰＢＳで洗浄し、予め形成させた１／５０（ＰＢＳ）のストレプトアビジン－ビオチン／西洋ワサビペルオキシダーゼの複合体（Ｄａｋｏ Ｌｔｄ）とＲＴで３０分間インキュベートした。３，３’－ジアミノベンジジン・４塩酸塩（３，３’－Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ ｔｅｔｒａ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＤＡＢ）を、基質として使用した。各切片を、１００μｌのＤＡＢ溶液と２回、５分間インキュベートした。最後に、切片を、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｐｏｏｌｅ Ｄｏｒｓｅｔ， ＵＫ）で軽く対比染色した後、等級付けされたアルコールで脱水させ、キシレンに浸すことにより洗浄し、ＤＰＸ（Ｄｉｓｔｙｒｅｎｅ， ｐｌａｓｔｉｃｉｓｅｒ， ｘｙｌｅｎｅ）封入剤（Ｓｉｇｍａ）を用いてスライドを乗せた。

ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８の重鎖および軽鎖の可変領域の同定
細胞の供給源および総ＲＮＡの調製：ハイブリドーマＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８由来の約５×１０^６個の細胞を、組織培養物から採取し、ＰＢＳで１回洗浄し、細胞ペレットを、５００μｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処置した。細胞を試薬に分散させた後、これらを、ＲＮＡを製造社のプロトコルにより調製するまで－８０℃で保存した。ＲＮＡの濃度および純度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより決定した。ｃＤＮＡ合成の前に、ＲＮＡをＤＮａｓｅ Ｉで処置し、製造社の推奨にしたがい、ゲノムＤＮＡのコンタミネーションを取り除いた（ＤＮａｓｅ Ｉ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ， ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ， Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｂｕｒｇｅｓｓ Ｈｉｌｌ， ＵＫ）。

ｃＤＮＡの合成：第１の鎖のｃＤＮＡを、第１の鎖のｃＤＮＡ合成キットおよびＡＭＶ逆転写酵素を使用して、製造社のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）にしたがい、３μｇの総ＲＮＡから調製した。ｃＤＮＡ合成の後、逆転写酵素の活性を、９０℃で１０分間インキュベートすることにより破壊し、ｃＤＮＡを－２０℃で保存した。

ｃＤＮＡの質を評価するためのＧＡＰＤＨ ＰＣＲ：ＰＣＲを使用して、ｃＤＮＡの質を評価した；マウスＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に特異的なプライマー（５’－ＴＴＡＧＣＡＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧ－３’および５’－ＣＴＴＡＣＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧ－３’）を、ホットスタートＴａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ， Ｈｉｔｃｈｅｎ， ＵＫ）と共に３５サイクルで使用した（９５℃、３分間、次に９４℃／３０秒、５５℃／３０秒、７２℃／１分間の３５サイクル：７２℃で１０分間の最終的な仕上げのステップ）。増幅した産物を、アガロースゲル電気泳動により評価した。

ＦＧ２７可変領域のクローニングのためのＰＣＲプライマー設計：プライマーを、ＰＣＲ産物の配列データに基づき重鎖および軽鎖の可変領域を増幅するように設計した。プライマーを、ｈＩｇＧ１／κ二重発現ベクターｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１において固有の制限酵素部位の中への関連する鎖のクローニングを可能にするように設計した。各５’プライマーは、定義した可変領域の開始コドンおよびリーダーペプチドに対し標的化されており、開始コドンの５’のすぐ近くにコザックコンセンサス（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）を伴う。各３’プライマーは、抗体配列の結合領域に相補的であるように、鎖のクローニング後にリーディングフレームを維持するように、および通常結合領域／定常領域のジャンクションで見出されるアミノ酸配列を保存するように、設計された。全てのプライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧから購入した。

重鎖可変領域ＰＣＲ：イムノグロブリン重鎖可変領域の使用は、以前に公開されたプライマーのセット（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂｅｎｄｉｇ １９９１）を用いたＰＣＲを使用して決定した。マウスｍＡｂアイソタイピング試験キット（Ｓｅｒｏｔｅｃ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）を使用した以前の結果は、ＦＧ２７．１０がマウスＩｇＧ３抗体であり、ＦＧ２７．１８がマウスＩｇＧ１抗体であることを表している。よって、適切な定常領域のリバースプライマーを使用して、定常領域から増幅した。ＰＣＲの増幅は、３５サイクル（９４℃、５分間、次に９４℃／１分間、６０℃／１分間、７２℃／２分間の３５サイクル；７２℃で２０分間の最終的な仕上げステップ）で、ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いて以前に決定した抗体サブクラスに特異的な、１２のマウスＶＨ領域に特異的な５’プライマーおよび３’プライマーで行った。増幅した産物は、アガロースゲル電気泳動により評価した。正の増幅は、ＶＨ４プライマーでもたらされた。

軽（κ）鎖可変領域のＰＣＲ：イムノグロブリン軽鎖可変領域の使用を、以前に公開されたプライマーのセット（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂｅｎｄｉｇ １９９１）を用いたＰＣＲを使用して決定した。マウスｍＡｂアイソタイピング試験キットを使用した以前の結果は、ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８の両方がκ軽鎖を使用したことを表している。ＰＣＲの増幅は、３５サイクル（９４℃、５分間、次に９４℃／１分間、６０℃／１分間、７２℃／２分間の３５サイクル；７２℃で２０分間の最終的な仕上げステップ）で、ホットスタートＴａｑポリメラーゼを用いてマウスＶκ領域に特異的な５’および３’のマウスＣκに特異的なプライマーで行った。増幅産物は、アガロースゲル電気泳動により評価した。正の増幅は、ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８の両方でＶκ１およびＶκ２プライマーによってもたらされた。

ＰＣＲ産物の精製およびシーケンシング：ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｒａｗｌｅｙ， ＵＫ）を使用して精製した。得られたＤＮＡの濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより決定し、純度は、アガロースゲル電気泳動により評価した。ＰＣＲ産物を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｉｌｉｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ／ｄｎａ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐｘ）にて元の５’および３’のＰＣＲプライマーを使用してシーケンシングした。配列は、ＩＭＧＴデータベース検索施設（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｍｏｕｓｅＩｇ）を使用して分析した（Ｖ領域の同定、ジャンクションの分析）。シーケンシングは、ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８が、同一の重鎖および軽鎖の可変領域を共有することを示した。十分な残基の定常領域が、重鎖配列に存在し、ＦＧ２７．１０がｍＩｇＧ３のサブクラスでありＦＧ２７．１８がｍＩｇＧ１のサブクラスであり、この２つが単一の脾細胞のＮＳＯ融合イベントからもたらされていることが確認された。

クローニング戦略：ＰＣＲプライマーに組み込まれた制限部位を使用するｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１へのＰＣＲ産物の直接的なクローニングは、以前のＳｃａｎｃｅｌｌの経験から比較的非効率であることが知られていた。よって、デュアルクローニング戦略（ｄｕａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ）を採用した：プルーフリーディングポリメラーゼを使用して作製したＰＣＲ産物をｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１およびＴＡベクター（ｐＣＲ２．１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の両方へ同時にクローニングし、ここで、ＴＡベクターにクローニングした産物は、最初のｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１クローニングが失敗した場合の容易に増幅される物質のバックアップ供給源として機能した。

クローニングのためのＦＧ２７．１８重鎖／軽鎖ＰＣＲ：ＰＣＲの増幅を、３５サイクル（９８℃で３分間、次に９８℃／３０秒間、５８℃／３０秒間、７２℃／４５秒間の３５サイクル；７２℃、３分間の最終的な仕上げステップ）で前述のＦＧ２７．１８ ｃＤＮＡテンプレートを使用して上述のプルーフリーディングポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ；ＮＥＢ）およびクローニングプライマーを使用して行った。増幅の成功は、アガロースゲル電気泳動により確認した。

方法１－直接的な軽鎖クローニング：増幅したＦＧ２７．１８の軽鎖を、制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＢａｍＨＩを用いて製造社の指示（ＮＥＢ）にしたがい、逐次消化した。ベクター（以前にクローニングした抗体由来のＶ領域を含むｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１）を、同時に消化した。ベクターのＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してアガロースゲルにより精製し、インサートＤＮＡを、ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。ＮａｎｏｄｒｏｐによるＤＮＡの定量化の後、ベクターのＤＮＡを、製造社の推奨（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， ＮＥＢ）によりホスファターゼで処置し、軽鎖のインサートを、ベクター（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ， ＮＥＢ）の中にライゲートした。ライゲートしたＤＮＡを、化学的にコンピテントなＴＯＰ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中に形質転換し、３５μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｔｏｕｌｏｕｓｅ， Ｆｒａｎｃｅ）を補充したＬＢアガープレートに播き、次に３７℃で一晩インキュベートした。

方法２－ＴＯＰＯ軽鎖のクローニング：増幅したＦＧ２７．１８の軽鎖を、Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）で、７２℃で１５分間処置し、ＴＡクローニングと適合可能な「Ａ」のオーバーハングを添加した。処置したＰＣＲ産物をＴＯＰＯ ＴＡベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートし、製造社の指示に従い、化学的にコンピテントなＴＯＰ１０Ｆ’細胞の中に形質転換した。形質転換した細菌を、アンピシリン（８０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢアガープレートに播き、次に３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを液体培養液（８０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したＬＢ）において増殖させ、プラスミドＤＮＡを調製した（ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）。インサートの存在を、ＢｓｉＷＩおよびＢａｍＨＩでの逐次的な消化およびアガロースゲル電気泳動により確認した。Ｔ７およびＭ１３ｒｅｖプライマーを使用してコロニーからシーケンシングをｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡで行った。１つのこのようなコロニーに由来するＤＮＡインサートは、予測されるＦＧ２７．１８軽鎖配列を有しており；３００ｍｌの細菌のＬＢ／アンピシリン培養物を、一晩増殖させ、プラスミドＤＮＡを、ｍａｘｉｐｒｅｐ（ｐｌａｓｍｉｄ ｍａｘｉ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）により調製した。Ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡのインサートは、シーケンシングにより確認した。

ＴＯＰＯ重鎖のクローニング：増幅したＦＧ２７．１８重鎖を、Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて７２℃で１５分間処置し、「Ａ」のオーバーハングを添加した。処置したＰＣＲ産物をＴＯＰＯ ＴＡベクターｐＣＲ２．１とインキュベートし、上述の化学的にコンピテントなＴＯＰ１０Ｆ’細胞に形質転換した。形質転換した細菌を、アンピシリンを補充したＬＢアガープレートに播き、次に３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを液体培養液（ＬＢ／アンピシリン）で増殖させ、プラスミドＤＮＡを調製した（ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）。インサートの存在を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｅＩでの消化ならびにアガロースゲル電気泳動により確認した。シーケンシングは、Ｔ７およびＭ１３ｒｅｖプライマーを使用して多くのコロニーからｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡで行った。１つのこのようなコロニー由来のＤＮＡインサートは、予測したＦＧ２７．１８重鎖配列を有しており；３００ｍｌの細菌のＬＢ／アンピシリン培養物を一晩増殖させ、プラスミドＤＮＡを、ｍａｘｉｐｒｅｐ（ｐｌａｓｍｉｄ ｍａｘｉ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）により調製した。Ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡインサートを、シーケンシングにより確認した。

ｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１二重発現ベクターの軽鎖のクローニング：ＦＧ２７．１８軽鎖を、ＢｓｉＷＩおよびＢａｍＨＩで逐次消化することによりＴＯＰＯベクターｐＣＲ２．１から消化させ、４００ｂｐのインサートＤＮＡアガロースゲルを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造社の推奨に従い精製した。このインサートを、以前に調製したｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１ベクター（上記参照）にライゲートし、化学的にコンピテントなＴＯＰ１０Ｆ’細胞に形質転換した。形質転換を、３５μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを補充したＬＢアガープレートに播き、次に３７℃で一晩インキュベートした。

コロニーを、液体培養液（３５μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを補充したＬＢ）で増殖させ、プラスミドＤＮＡを調製した（ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）。シーケンシングを、ヒトκ定常領域に位置するＰ６シーケンシングプライマーを使用して全てのコロニー由来のｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡで行った。コロニー由来のＤＮＡインサートは、ｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１に正確に挿入された、予測したＦＧ２７．１８軽鎖配列を有しており；３００ｍｌの細菌性のＬＢ／ｚｅｏｃｉｎ培養物を、一晩増殖させ、プラスミドＤＮＡを、ｍａｘｉｐｒｅｐ（ｐｌａｓｍｉｄ ｍａｘｉ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）により調製した。

ｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１二重発現ベクター重鎖のクローニング：ＦＧ２７．１８重鎖インサートを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｅＩでの消化によりＴＯＰＯベクターｐＣＲ２．１から消化させた。ＦＧ２７．１８κ軽鎖（上記で調製）を含むベクター（ｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１－２７．１８ｋ）もまた、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｅＩで消化させた。次に、ベクターのＤＮＡを、製造社の推奨（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， ＮＥＢ）にしたがい、ホスファターゼで処置した。アガロースゲル電気泳動の後、６．５ｋｂのｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１ベクターのバンドおよび４００ｂｐのＦＧ２７．１８Ｈインサートバンドを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造社の推奨に従い使用して単離した。このインサートを、ｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１ベクターへライゲートし、化学的にコンピテントなＴＯＰ１０Ｆ’細胞へと形質転換した。形質転換物を、３５μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを補充したＬＢアガープレートに播き、次に３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを、液体培養液（３５μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを補充したＬＢ）で増殖させ、プラスミドＤＮＡを調製した（ｓｐｉｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）。インサートの存在は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｅＩでの消化ならびにアガロースゲル電気泳動により確認した。シーケンシングは、ヒトＩｇＧ１定常領域に位置するＰ３ｒｅｖシーケンシングプライマーを使用して多くのコロニーからのｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡで行った。コロニーのうちの１つに由来するＤＮＡインサートは、ｐＤＣＯｒｉｇ－ｈＩｇＧ１に正確にインサートされた予測したＦＧ２７．１８重鎖配列を有しており；３００ｍｌの細菌性ＬＢ／ｚｅｏｃｉｎ培養物を一晩増殖させ、プラスミドＤＮＡを、ｍａｘｉｐｒｅｐ（ｐｌａｓｍｉｄ ｍａｘｉ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ）により調製した。シーケンシングを使用して、重鎖および軽鎖の両方の位置を確認した。

キメラ抗体コンストラクトの発現、精製、および性質決定：本発明に記載のキメラ抗体の発現および精製のための方法は、当該分野でよく知られている方法を使用して達成できる。簡潔に述べると、抗体は、一時的にかまたはその後安定しているトランスフェクトされた細胞から回収した上清から、標準的なプロトコル、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ２００１）に基づくプロテインＡまたはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーにより、精製され得る。

ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
以下に記載のように反応を調製する：
５μｌの１０×反応バッファー
０．１２μｌ（２５ｎｇ）のＲＨＡまたはＲＫＡテンプレート
１．３μｌ（１２５ｎｇ）のオリゴヌクレオチド変異プライマーＦｏｒ
１．３μｌ（１２５ｎｇ）のオリゴヌクレオチド変異プライマーＲｅｖ １μｌのｄＮＴＰｍｉｘ
１．５μｌのＱｕｉｋＳｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ ｄｄＨ_２Ｏ（５０μｌの最終体積まで）
１μｌのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ

１．以下の表に概説されたサイクリングパラメータを使用して各反応を循環させる。

２．２μｌのＤｐｎ Ｉ制限酵素を添加する。
３．各反応物を優しく完全に混合し、手短に微量遠心機にかけ、直後に３７℃で５分間インキュベートして親のｄｓＤＮＡを消化させる。
４．各反応物由来のＤｐｎＩで処置したＤＮＡ２μｌを別々の４５μｌ（＋２μｌのβ－ＭＥ）のアリコートのＸＬ１０－Ｇｏｌｄウルトラコンピテントセルに形質転換する（ＴＯＰ１０（商標）Ｅ． ｃｏｌｉの形質転換を参照）。
５．Ｐｈｕｓｉｏｎ法、ｍｉｎｉｐｒｅｐ、および配列を使用してコロニーをスクリーニングし、正確な変異を確認する。

Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）：
１．薄壁ＰＣＲチューブで以下の試薬をアセンブリする。

サイクル

キナーゼ、リガーゼ、およびＤｐｎＩ（ＫＬＤ）処置
２．以下の試薬を添加し、ＲＴで５分間インキュベートする：１μｌのＰＣＲ産物
５μｌの２Ｘ ＫＬＤ反応バッファー １μｌ １０ＸＫＬＤ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ
３μｌのヌクレアーゼフリーの水
３．各反応由来のＫＤＬ混合物５μｌを別々の５０μｌのＮＥＢ ５－α Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉに形質転換する。チューブを注意深く４～５回軽くたたき混合する。ボルテックスにはかけない。
４．混合物を氷上に３０分間置く。
５．４２℃で３０秒間ヒートショックにかける。氷上に５分間おく。
６．９５０μｌのＲＴ ＳＯＣを混合物内へとピペッティングする。
７．振盪（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃で６０分間インキュベートする。
８．チューブを軽くたたき、反転させることにより細胞を完全に混合し、次に、５０μｌをカナマイシンプレートに播き、３７℃で一晩インキュベートする。
９．ＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ ｍｅｔｈｏｄ、ｍｉｎｉｐｒｅｐ、および配列を使用してコロニーをスクリーニングして、正確な変異を確認する。

ＩｇＧの定量化：
９６ウェルのイムノプレートの各ウェルを１００μｌのアリコートの０．４μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体でコーティングし、ＰＢＳで希釈し、４℃で一晩インキュベートする。（プレートは、この段階で１カ月間保存され得る）。同様に、別のブランクプレートを、ＢＳＡ／ＰＢＳブロッキング溶液でコーティングする。過剰なコーティング溶液を除去し、プレートを２００μｌ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄する。ブランクプレートの中に、列２行Ｂ～Ｇのウェルを除き、１２０μｌのＳＥＣバッファーを全てのウェルに分配する。ＳＥＣバッファーにおいて１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１／κ抗体の溶液を調製し、標準物質として扱う。列２行ＢおよびＣのウェルに２４０μｌ／ウェルをピペッティングする。トランスフェクトした細胞由来の培地を遠心し（２５０ｇ、５分間）、上清を保存する。「ＤＮＡのない」対照（ここでｃｏｓ細胞はＤＮＡの非存在下でトランスフェクトされた）由来の上清２４０μｌを、列２行Ｄのウェルにピペッティングする。２４０μｌ／ウェルの実験の上清を列２行Ｅ、Ｆ、およびＧのウェルにピペッティングする。列２、行Ｂ～Ｇのウェルの２４０μｌのアリコートを混合し、１２０μｌを、列３の隣のウェルに移す。標準物質、対照、および実験のサンプルの２倍希釈のシリーズを用いて列１１まで続ける。抗ＩｇＧでコーティングされたプレートの各ウェルから対応するウェルまで１００μｌを移す。３７℃で１時間インキュベートする。全てのウェルを洗浄バッファー（２００μｌ）で３回洗浄する。ヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲートをＳＥＣバッファーで５０００倍に希釈し、各ウェルに１００μｌを添加する。インキュベーションおよび洗浄ステップを反復する（ステップ９）。１５０μｌのＫ－ＢＬＵＥ基質を各ウェルに添加し、暗室にてＲＴで１０分間インキュベートする。５０μｌのＲＥＤ ＳＴＯＰ溶液を各ウェルに添加することにより反応を停止させる。６５５ｎｍにて光学密度を読み取る。

Ｌｅｗｉｓ^ｙ結合ＥＬＩＳＡ
９４ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）の各ウェルをＰＢＳにおいて１００ｎｇ／ウェルのＬｅｗｉｓ Ｙ ＨＳＡペプチドでコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳ－Ｔ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄する。未処置のプレートを、ウェルあたり２５０μｌのＰＢＳ／０．２％ ＢＳＡ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０でブロッキングし、ＲＴで１時間インキュベートする。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄する。２４０μｌの抗体（必要な場合はＰＢＳ／０．２％ ＢＳＡ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で希釈）を列１のウェルに添加し；１２０μｌのバッファー（ＰＢＳ／０．２％ ＢＳＡ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）を他のウェルに添加する。１２０μｌを列１から列２の隣のウェルへ移す。実験サンプルの２倍希釈のシリーズを用いて列１２まで続ける。希釈プレートから実験プレートへウェルあたり１００μｌを移す。ＲＴで１時間インキュベートする。ＰＢＳ－Ｔで３回ウェルを洗浄する。ヤギ抗ヒトＦｃペルオキシダーゼコンジュゲートをＰＢＳ／０．２％ ＢＳＡ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で１００００倍に希釈（または抗マウスを１００００倍に希釈）し、１００μｌを各ウェルに添加する。ＲＴで１時間インキュベートし、洗浄ステップを反復する。ウェルあたり１５０μｌの基質（Ｋ－Ｂｌｕｅ）を添加し、ＲＴで１５０分間インキュベートする。５０μｌのＲＥＤ ＳＴＯＰ溶液を各ウェルに添加することにより反応を停止させる。６５０ｎｍにて光学密度を読み取る。

熱的安定性
完全にヒト化した抗体およびキメラ対照をＴＢＳ／０．２％のＴｗｅｅｎで１μｇ／ｍｌに希釈し、ＰＣＲチューブの中にＥＣ８０濃度に適した容量でアリコートする。同じバッファーを用いて容量を最大１００μｌにする。各チューブを別々に３０℃～８５℃の間の温度で１０分間、５℃のインターバルを伴いながら加熱し、４℃に冷却する。１μｇ／ｍｌのストックを１時間凍結し、次に、ＥＣ８０濃度に希釈する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり各抗体１００μｌを使用してＬｅｗｉｓ Ｙ ＨＳＡペプチドに対する結合アッセイを行う（二連で各温度にてアッセイする）。

サーマルシフトの比較
最終容量２５μｌで９６ウェルプレートの白色ＰＣＲプレートにサンプルを直接調製する（１および２μＭの精製した抗体の最終濃度）。Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ－ＰＢＳバッファーで１：１００のストックを作製し、次に１：１０を最終的なサンプルに添加する（たとえば２５μｌに２．５μｌ）。ＭｘＰｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ， ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍｅｔｈｏｄ， （ｆｉｌｔｅｒ＝ＦＲＲＯＸ，参照色素なし）を使用してｑＰＣＲ機器に充填する。熱的プロファイルの設定－１℃の増大の７１サイクル。結果をプロットし、Ｔｍを決定する。

ヒト化ｍａｂの精製
機器：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ
ソフトウェア：ＵＮＩＣＯＲＮ
カラム：ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ， １ｍｌ；ＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ
移動相：ＩｇＧ溶出バッファー、ダルベッコ１×ＰＢＳ
サンプルプレップ：０．２２μｍを介して濾過
注入容量：ＤＰＢＳにおける２００ｍｌのＥｘｐｉ２９３条件付け培地（１：１）
流速：０．５ｍｌ／分のサンプルの充填；１．５ｍｌ／分でゲルろ過；
１ｍｌ／分で溶出

凝集の比較
機器：ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｔｅｄ ｃｏｌｕｍｎ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｗｎ Ｈｅｌｅｏｓ， Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｏｐｔｉｌａｂ ＴＲｅｘを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣシステム
分析ソフトウェア：Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｔｒａ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１．１．１７
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ， ４．６ ｘ １５０ｍｍ， １．７μｍ
移動相：０．０５％のアジ化ナトリウムを含むダルベッコ１×ＰＢＳ
サンプルプレップ：ＰＥＳ ０．２２μｍを介して濾過
サンプル濃度：様々な注入容量：２０μｌ
分析温度：３０℃
流速：０．４ｍｌ／分

ＣＩＣ（Ｃｒｏｓｓ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ＣＩＣ（Ｃｒｏｓｓ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析を行い、非特異的なタンパク質間相互作用に対する傾向を評価し、下流で製造問題をもたらし得る、何らかの溶解度の問題の同定を提供した。

サンプルを、２つの別々の２０μｌの注入（０．５ｍｇ／ｍｌ）により；最初に３０ｍｇのヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ １４５０６）とカップリングした１ｍｌのＮＨＳ活性化樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の上で、第２に対照のカラムとしてカップリングされた１ｍｌのＮＨＳ活性化樹脂のブランクの上で分析した。移動相は、０．０１％のアジ化ナトリウム（０．１ｍｌ／分）を含むダルベッコＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ｄ８５３７）からなり、全ての実験は、２５℃で行った。溶出したサンプルは、ＵＶ吸光度（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｔｅｄ ｃｏｌｕｍｎ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ）により検出し、データは、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＳＴＲＡソフトウェア（バージョン６．１．２．８３）を使用して分析し、サンプルピークの保持時間を決定した。次にこれらを使用して、保持因子ｋ’を計算した。

（式中、Ｔｒは、ポリＩｇＧのカラムでのサンプルの保持時間であり、Ｔｍは、モック（対照）カラム上の保持時間である。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：Ｌｅｗｉｓ Ｙ ＨＳＡコンジュゲートをＣＭ５チップにカップリングし、ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８ ｍＡｂ（０．０１μＭ～１μＭの範囲の濃度）を３０μｌ／分で注入した。結合データを、ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して異種性リガンドモデルに適合した。

抗体のインターナリゼーション：がん細胞を、２×１０^３個の細胞／ウェルの密度でプレーティングし、一晩接着させた。細胞は、９６ウェルプレートにて３７℃で７２時間培養し、指定の濃度のｍＡｂと、二次抗体：サポリンがコンジュゲートしたマウスＩｇＧに対するヤギ抗体（Ｆ’ａｂフラグメント）（ＡＴＳｂｉｏ， ＩＴ＃４８）またはサポリンがコンジュゲートしたヒトＩｇＧに対するヤギ抗体とを併せて用いて処置した。対照のウェルは、培養培地のみおよび二次コンジュゲートのみとインキュベートした細胞からなるものであった。ウェルあたりの二次抗体の量は７５ｎｇであり、一次抗体の濃度は、０．０１ｎＭ～３０ｎＭで変動した。サポリンのインターナリゼーションは、チミジンの取り込みの阻害を介して評価した（チミジンは、インキュベーションの最後の２４時間の間に添加した）。

ＡＤＣＣおよびＣＤＣ：細胞（５×１０^３）を１００μｌのＰＢＭＣ、１０％の自家性血清もしくは培地単独と、またはある濃度範囲のｍＡｂと同時にインキュベートした。自然に発生する最大の放出を、標識した細胞を培地単独または１０％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とそれぞれインキュベートした後に評価した。４時間のインキュベーションの後、各ウェル由来の上清５０μｌを９６ウェルプレートのｌｕｍａｐｌａｔｅに移した。プレートを一晩乾燥させ、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ ＮＸＴ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）で計測した。標的細胞の溶解パーセンテージの平均を、以下の式により計算した：

ＰＩの取り込みのアッセイ：ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８を、ＡＧＳ細胞とインキュベートし、様々な濃度で小分子量色素のヨウ化プロピジウム（ＰＩ， Ｓｉｇｍａ）の取り込みについて試験した。ＰＩ陽性細胞の数は死にかけている細胞／死細胞の数を表す。腫瘍細胞（５×１０^４個）を９６ウェルの丸底マイクロタイタープレート上にて５０μｌの一次抗体とＲＴで２時間インキュベートした。１μｇのＰＩを添加し、細胞をＲＴで３０分間インキュベートした。サンプルをＦＣ－５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。生のデータを分析およびプロットするために、ＷｉｎＭＤＩ ２．９ソフトウェアを使用した。比較のため、膜の損傷を誘導することが知られているｍＡｂ ＳＣ１０４および７９１Ｔ／３６もまた、実験の内部標準として含めた。

増殖阻害アッセイ：コンストラクトによる増殖阻害を、水溶性のテトラゾリウム塩ＷＳＴ－８（ＣＣＫ８ ｋｉｔ， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用することにより評価し、生細胞の数に直接比例する細胞のヒドロゲナーゼの活性を測定した。簡潔に述べると、がん細胞（２０００個の細胞／９０μｌ／ウェル）を一晩プレーティングした後、コンストラクトを、最終容量１０μｌ／ウェルで異なる濃度にて添加し、プレートを３７℃（５％のＣＯ２）で７２～９６時間インキュベートした。次に、ＷＳＴ－８試薬を添加し（１０μｌ／ウェル）、さらに３時間インキュベートした後、プレートを４５０ｎｍで読み取り（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５０）、阻害のパーセンテージを計算した。ＥＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｃ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いて非線形回帰を使用して決定した（カーブフィッティング）。

ｉｎ ｖｉｖｏでのモデル：この試験は、ＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｌｉｃｅｎｃｅの下で行った。また、がんの研究における動物の福祉および使用のＮＣＲＩガイドライン、ＬＡＳＡ ｇｏｏｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ、およびＦＥＬＡＳ ｗｏｒｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ ｏｎ ｐａｉｎ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓにも従った。エンドトキシンフリー（＜１０ＥＵ／ｍｌ）のＦＧ２７ ｍＡｂを、投与のため事前に製剤化したアリコートに供給し、使用するまで－２０℃で保存した。年齢が一致した雄性のＭＦ－１ヌードマウスは、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｉｃｈｅｓｔｅｒ， ＵＫ）から入手し、各グループは、ｎ≧８匹の動物からなる、ＦＧ２７、対照ｍＡｂまたはビヒクル対照であった。

マウスに、Ｃ１７０ＨＭ２ ＤＬｕＸ細胞を移植し、光学的なイメージングによりモニタリングして、腫瘍の確立および試験の中へ入るために適合性を決定した。マウスに、ＦＧ２７または陽性対照ｍＡｂ（適宜５０５／４、ＦＧ８８．２、またはＦＧ８８．７（１ｍｇ／ｍｌ））のいずれかを、終了するまで１００μｌを静脈内（ｉ．ｖ．）で毎週２回０．１ｍｇで投与するか、またはｍＡｂのビヒクル対照であるＰＢＳを、終了するまで毎週２回ｉ．ｖ．で１００μｌにて投与した。毎週全てのマウスで生物発光イメージングを行い、投与前および後の腫瘍の測定値を得た。この方法で、各マウスは、腫瘍増殖を比較できる投与前の対照の読み取りを提供した。

全ての測定および読み取りを、ＳＰＳＳ ｖ１６．０でのデータ処理のため元のディクテーション／ノーテーションからエクセル（タブ区切り）形式へと移した。データの完全性は、探索および記述の機能を使用して確認した。誤った点が同定される場合、元のデータに対し相互参照され、これにより補正された。このデータを、外れ値および分布プロファイルに関してスクリーニングし；９５％の信頼限界の外側にあるデータ点（外れ値）は分析から除外したが、参照のためデータシートは保存した。

以下のように試験期間にわたり、マウスの生物発光腫瘍量を毎週イメージングした（ＢＬＩ）：６０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリン基質を皮下（ｓ．ｃ．）投与し、マウスに麻酔をかけ、ＢＬＩの読み取りを、基質投与から１５分後に、オープンフィルターブロック（２Ｄ）および逐次発光フィルター（ＤＬＩＴでは３Ｄの再構成）で行った。腹側および背側のイメージングを行った：イメージングの最適な位置は、最上部の腹部であった。ＢＬＩを、存在する全ての病変を含む各マウスの１つの関心領域（ＲＯＩ）である、腹部全体にわたり測定した。各マウスは、経時的な腫瘍増殖のパーセンテージの計算を可能にするために撮影された投与前またはベースラインの画像を有していた；これらデータは、グループあたりで平均化した。またＢＬＩの読み取りも、ＰＭ組織で腫瘍を同定するために終了後に取得された。

実施例１－ＦＧ２７ ｍＡｂの作製および最初の性質決定
ＦＧ２７を、胃腫瘍細胞の糖脂質での免疫処置により作製した。
免疫処置に対する抗体応答の分析：抗体の力価を、最初に、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によりモニタリングした。その後、ＳＴ１６総脂質抽出物および細胞膜脂質抽出物を使用する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析、ＳＴ１６腫瘍細胞を使用するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、およびＳＴ１６全細胞抽出物、総脂質抽出物および細胞膜脂質抽出物を使用するウェスタンブロットを行った。マウスは、出血前の血清対照と比較して最良の応答を有するとみなされたマウスに、融合前に、ＳＴ１６細胞膜脂質抽出物を用いて静脈内（ｉ．ｖ．）にブーストした。

腫瘍細胞株のパネルに対するＦＧ２７ハイブリドーマの上清の結合を、直接的な免疫蛍光およびＦＡＣＳ分析により分析した。ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８は両方とも、陽性対照の抗ＨＬＡ ｍＡｂのＷ６／３２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）、および陰性対照と比較して、ＳＴ１６に結合したが、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）には結合しなかった（図４）。ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８の両方をクローニングした。ＦＧ２７．１０はＩｇＧ３κであり、ＦＧ２７．１８は、ＩｇＧ１κのサブクラスであった。両方のｍＡｂが糖脂質に結合したことを確かにするために、糖脂質をある範囲の細胞株から抽出し、ＥＬＩＳＡプレート上で乾燥させた後、ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８とインキュベートした。結合は、両方のｍＡｂを伴うＣ１７０、ＳＴ１６、およびＡＧＳに由来する糖脂質で見られたが、全細胞に対する結合の欠如を示した細胞株では見られなかった（ＭＫＮ－４５、ＯＡＷ２８、ＯＶＣＡＲ－３、ＯＶＣＡＲ－４、およびＯＡＷ４２；図５）。

実施例２－ＦＧ２７ ｍＡｂにより認識されるエピトープの定義
ＦＧ２７．１０の特異性の度合いを決定するために、最初に抗体を、ＨＳＡにカップリングしたＬｅ^ａ、Ｌｅ^ｂ、Ｌｅ^ｘ、およびＬｅ^ｙの抗原に対する結合についてＥＬＩＳＡにより評価した。ＦＧ２７．１０は、Ｌｅ^ａ、Ｌｅ^ａ－ｘ、またはＬｅ^ｂを認識しなかったが、Ｌｅ^ｙを強力に認識した（図６）。ＦＧ２７ ｍＡｂの微細な特異性をさらに明確にするために、これらのスクリーニングが、６００以上の天然および合成のグリカンに対してＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓにより行われた。グリカンアレイに対するＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８のｍＡｂの結合は、両方のｍＡｂがＬｅ^ｙに対し特異的に結合したことを示した（図７）。比較のため、６９２／２９の結合は、ｍＡｂがＬｅ^ｂ、Ｌｅ^ｂを含むグリカンに最も強力に結合し、同様にトリ－Ｌｅ^ｙおよびそのバリアントに結合することを示した。対照的に、ＢＲ９６は、Ｌｅ^ｙおよびある範囲のＬｅ^ｙバリアント（Ｌｅ^ｙ－ｘ、Ｌｅ^{ｙ－ｘ－ｘ}）に結合し、Ｌｅ^ｘにはこれより弱く結合することを示した。

またＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８は、糖タンパク質および糖脂質を認識するそれらの特性についてＳＤＳ／ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットにより腫瘍細胞株のパネルでスクリーニングした（図８）。結合する糖脂質に加え、ｄｙｅ ｆｒｏｎｔでの結合により証明されるように、両方のｍＡｂはまた、ある範囲の糖タンパク質を認識した。

ＦＧ２７はＬｅ^ｙに特異的であるため、その細胞株に対する結合（図９）を、Ｌｅ^ｙおよびＬｅ^ｘを認識するｍＡｂ ＢＲ９６ならびにＬｅ^ｙおよびＬｅ^ｂを認識するｍＡｂ ６９２／２９と比較した。３つ全てのｍＡｂはＣ１７０細胞およびＡＧＳ細胞に結合した。対照的に、ＢＲ９６はＣｏｌｏ２０１に強力に結合し、６９２／２９は中程度に結合したが、ＦＧ２７は結合しなかった（図９）。これは、この細胞株がＬｅ^ｙを発現しないが、恐らくはＬｅ^ｘおよびＬｅ^ｂを発現することを示しており、これは非特異的なｍＡｂを使用して結論付けることはできなかった。ＨＴ２９細胞はいずれのｍＡｂにも結合できなかったが、ＦＧ２７．１０は、最良にＯＶＣＡＲ３細胞およびＳＴ１６に細胞に結合し、および６９２／２９はＬｏＶｏ細胞に結合した。

実施例３－ＦＧ２７の免疫組織化学的検査の評価
正常なヒト組織に対するＦＧ２７の結合を評価するために、組織種のパネルでこれをスクリーニングした。Ｌｅ^ｙ／ｂ（６９２／２９）およびＬｅ^ｙ／ｘ（ＢＲ９６）と交差反応するｍＡｂとは対照的に、ＦＧ２７のみが、正常な胃、肺、扁桃腺、膵臓、および十二指腸の中で細胞の下位集団に結合した（表１）。さらに、他のＬｅ^ｙ交差反応性ｍＡｂとは対照的に、ＦＧ２７は、結腸、空腸、乳房、腎臓、または回腸を染色できなかった。食道、胃、十二指腸、回腸、結腸、膵臓、肺、および腎臓の正常な染色の代表的なＩＨＣ画像を、図１０に示す。

表１：免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）により評価した正常なヒト組織に対するＦＧ２７の結合。これら組織のマイクロアレイ（ＴＭＡ）の染色は、新規のｖｉｅｗｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ ２０１０を介して分析し、腫瘍組織の染色の強度により半定量的なスコアが提供された。強力な染色が、３のスコアで提供され、中程度の染色は２のスコアで提供され、弱い染色は１のスコアで提供され、負のスコアは０である。またこの結果は、これら組織の中の特異的な細胞種の差次的な染色を示している。

ＦＧ２７の治療上の価値を決定するために、これを、ＩＨＣによりヒトの胃、結腸直腸、卵巣、および乳房のＴＭＡでスクリーニングした。これは、異なる強度で、胃腫瘍組織の８０％（６９／８６）、結腸直腸腫瘍組織の１００％（５５／５５）、卵巣腫瘍組織の９５％（３６／３８）、および乳房腫瘍組織の８５％（３９／４６）を染色した（表２）。

表２．免疫組織化学的検査により評価されるヒトの胃、結腸直腸、卵巣、および乳房の腫瘍組織に対するＦＧ２７ ｍＡｂの結合。これら組織のマイクロアレイの染色は、新規のｖｉｅｗｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ ２０１０を介して分析し、腫瘍組織の染色の強度により半定量的なスコアが提供された。強力な染色は、３のスコアを提供し、中程度の染色は２のスコアを提供し、弱い染色は１のスコアを提供し、負のスコアは０を提供する。

スコア付けは、ＦＧ２７が、胃腫瘍に広く結合することを示しており、ここで腫瘍の５９％が正に染色され、腫瘍の１８％が強く染色された。腫瘍の１９％は、中程度に染色され、２２％は弱く染色された。結果は、ＦＧ２７が幅広い範囲の胃の腫瘍を標的とし、これらの１８％に強く結合する可能性を有することを示す。カプランマイヤー分析は、ＦＧ２７抗原の発現と生存との間の関連を明らかにしなかった（データ不図示）。しかしながら、ＦＧ２７抗原の発現とＭ３０（アポトーシス性マーカー）の発現との間には相関が存在した（ピアソンのカイ二乗、ｐ＝０．０４９）。また、ＦＧ２７抗原の発現と腫瘍部位との間にも相関があり（ピアソンのカイ二乗、ｐ＝０．００８）、ここで胃に特異的な腫瘍の６５％がＦＧ２７で染色され、２６％が強力に染色した。対照的に、胃－食道結合領域の腫瘍の５３％のみが染色されたが、これらのうち３７％が強力に染色された。食道の下部１／３の腫瘍の４６％がＦＧ２７で染色され、これらのうち５３％が強力に染色された。

卵巣がん細胞株とＦＧ２７の交差反応性により、これを、免疫組織化学的検査により３６０の腫瘍を伴う卵巣がんのＴＭＡに対しスクリーニングした。スコア付けは、ＦＧ２７．１８が卵巣腫瘍に不十分に結合し、腫瘍の８５％が負に染色されたことを示した。腫瘍の１５％のみが正に染色され、３％のみが強力に染色された。腫瘍の３％が中程度に染色され、９％が弱く染色された。

カプランマイヤーの生存率の分析は、腫瘍がＦＧ２７抗原を発現した患者が、発現を有さない患者よりも有意に良好な（ログランク、ｐ＝０．０４９）生存率を有したことを示した。ＦＧ２７抗原の発現とＦＩＧＯステージとの間に相関が存在した（ピアソンのカイ二乗、ｐ＝０．０２４）。また、ＦＧ２７抗原の発現と卵巣がんの種類との間にも相関が存在し（ピアソンのカイ二乗、ｐ＝０．０２４）、ＦＧ２７を発現する粘液性および類子宮内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｄ）腫瘍の１／３超、対して漿液性の透明な細胞および未分化の腫瘍のうちの１４％未満がこのｍＡｂで染色された。コックス多変量解析は、ＦＧ２７がＦＩＧＯステージ、残存疾患、および化学療法に対する応答にわたるさらなる予後の値を提供しなかったことを示した。

表３：Ｌｅｗｉｓ ｙに特異的なｍａｂ ＦＧ２７および他のＬｅｗｉｓｙ交差反応性ｍａｂ ＢＲ９６（Ｌｅｗｉｓｙ／ｘ）および６９２／２９（ｌｅｗｉｓｙ／ｂ）での腫瘍の染色の比較

単一特異性Ｌｅｗｉｓ ｙ ｍａｂ、ＦＧ２７．１０は、Ｌｅｗｉｓ ｙ／ｂ ６９２／２９ ｍａｂよりも３～３９％およびＬｅｗｉｓ ｙ／ｘ Ｂｒ９６ ｍａｂよりも６～４８％多く腫瘍を染色し、これらの結果は、ＦＧ２７．１０の固有の特異性を反映している。最も大きな変化は、卵巣および乳房の腫瘍で見られた。

２つのうちの１つのサンプルで正常な胃、膵臓、および十二指腸に対する中程度の結合、ならびに２つのサンプルのうちの１つで肺および扁桃腺に対する弱い結合のみを示したＦＧ２７とは異なり、ＢＲ９６は、食道、回腸、空腸、胃、乳房、肺、扁桃腺、膵臓、および十二指腸を含む多くの組織に対し強力な結合を示した。ＢＲ９６はまた、胎盤および胆嚢に対する中程度の結合ならびに直腸、腎臓、および結腸に対する弱い結合を示した。それに対して、６９２／２９は、空腸に強力に結合し、回腸、胃、および扁桃腺に中程度に結合し、胆嚢、胸腺、肺、結腸、膵臓、および十二指腸に弱く結合した（表１）。特に胃腸組織に関するＦＧ２７のこの限定された通常の結合プロファイルは、腫瘍組織に対する抗体の結合を軽減せず、胃腫瘍組織の８０％および結腸直腸腫瘍組織の１００％が抗原発現を示した。それに対して、６９２／２９およびＢＲ９６は、それぞれ８２％および９０％にて、結腸直腸腫瘍の結合において良好な分布を示し（Ｎｏｂｌｅ， Ｓｐｅｎｄｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ． ２０１３）、後者と同様の数字の、１５／１８のサンプル、すなわち８３％が、米国特許第５４９１０８８号でも報告されている。これら腫瘍の３９％および４９％は、ＦＧ２７での８５％と比較して中程度または強力に染色された。２－２５ ＬＥは、不十分な分布を示し、結腸直腸腫瘍の５２％のみに結合し、１９％が中程度に染色され、強力には染色されなかった（Ｎｏｂｌｅ， Ｓｐｅｎｄｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。

よって、ＦＧ２７が、特に胃腸組織において有意良好な通常の結合プロファイルを有しており、各Ｌｅ^ｙ ｍＡｂの間の差次的な結合は、本発明の明確に異なる性質を表していることが示される。

実施例４－確立された結腸直腸転移性異種移植片モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＦＧ２７の抗腫瘍活性
Ｃ１７０ＨＭ２ ＤＬｕＸヒト肝臓転移モデルにおけるｍＡｂ ＦＧ２７の治療効果の比較：マウスＣ１７０ＨＭ２ ＤＬｕＸヒト肝臓転移腫瘍モデルを使用して、マウスＦＧ２７ ｍＡｂの抗腫瘍活性を調査した。Ｃ１７０ＨＭ２ ＤＬｕＸ細胞株は、ｍＡｂ処置を開始する前に腹膜腔の中に移植され、肝臓に転移するように１０日間そのまま置かれる際に肝臓の実質を浸潤するように継代される肝臓に転移する結腸腫瘍細胞株の生物発光性バリアントである。このような標識した細胞および組織の増殖および分布／位置は、適切な光学イメージングシステムにおいてリアルタイムでおよび死後（ＰＭ）に切除した組織において非侵襲的に評価され得る。

抗腫瘍データ：１週間に２回のＦＧ２７投与（１００μｇ、ｉ．ｖ．）は、生物発光強度により比較される場合、ビヒクル対照と比較して腹膜腔および関連する腫瘍増殖を低減した（図１１ａ）。この試験は、３２日目に終了した。ＦＧ２７での処置は、ビヒクル対照と比較して試験の最終日までに生物発光腫瘍量の有意な低減をもたらした（ｐ＝０．０１４）。ＦＧ２７処置での注射部位における腫瘍増殖の有意な低減が存在した（ｐ＝０．０５；図１１ｂ）。

処置期間を延長したｉｎ ｖｉｖｏでの第２の試験では、ＦＧ２７は、処置対照グループと比較して５１日目までに腫瘍増殖のパーセンテージの有意な低減を示した（ｐ＝０．０１９）（図１２ａ）。ログランクＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定による分析は、ビヒクルのみの対照と比較してＦＧ２７処置グループ（ｐ＝０．０２５１）において有意に高い生存を示した（図１２ｂ）。

実施例５－キメラｍＡｂ
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列がマウス抗体に由来し定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域配列が１つの種に由来し定常領域配列が別の種に由来している抗体を表すように意図されている。本発明のキメラ（またはヒト化）抗体は、上述のように調製されたマウスｍＡｂの配列に基づき調製され得る。抗体の遺伝子およびアミノ酸配列が分析される場合、ＦＧ２７．１０（図１）およびＦＧ２７．１８（図２）は、同一の可変領域を有するが、それぞれ異なる定常領域ＩｇＧ３およびＩｇＧ１を有することが示された。これは、単一のＢ細胞が、サブクラスを転換させ、次に免疫処置プロトコルの間に増殖したこと、ならびにこれらクローンの両方がうまく融合したことを示唆していた。

最も近い生殖系列配列と比較して、ＦＧ２７は、その重鎖に７つの変異（全て非サイレント）およびその軽鎖に３つの変異（全て非サイレント）を含む。生殖系列に対する４つのアミノ酸の差異は、重鎖ＣＤＲにあり、３つはＦＲ３にある。ＣＤＲ１には、位置３６にＤからＨへのアミノ酸の変化が存在する。ＣＤＲ２には、位置５９および６３にＧからＤへのアミノ酸の変化、ならびに位置６４にＳからＮへのアミノ酸の変化がある（図２ａ）。軽鎖では、ＣＤＲ１生殖系列での２つのアミノ酸の差異、位置２８でのＳからＩおよび位置３２でのＳからＴがあり、固有であり１つの差異のＫ５１ＮがＦＲ２にある。

Ｌｅｗｉｓｙと結合するが、他の関連するＬｅｗｉｓ抗原と交差反応するいくつかの他のｍａｂが存在する。ＦＧ２７．１０／１８は、Ｌｅｗｉｓ ｙにのみ単一特異性を有する唯一の抗体である。これは、ＦＧ２７可変重鎖および軽鎖領域（ｒｅｇａｉｏｎ）の類似するが明確に異なる配列において反映される（図１３ａ、ｂ）。ＦＧ２７は、他の交差反応性ｌｅｗｉｓ ｙ ｍａｂとの、重鎖の中のアミノ酸配列ＣＤＲの１６～６８％の差異、軽鎖のＣＤＲ配列のアミノ酸の差異の４．３～１６％の差異、重鎖の可変領域のアミノ酸配列の８．６～４９．５％の差異、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列の２～２４％の差異を示している（表４）。ほとんどの変化は、ＣＤＲＨ２の中であり、８アミノ酸のうちの３～５つは、異なるｍａｂの間で変動している。

表４．抗ｌｅｗｉｓ ｙ交差反応性ｍａｂ由来のＦＧ２７の可変重鎖および軽鎖の領域のアミノ酸配列の差異

ＦＧ２７．１８の重鎖および軽鎖の可変領域をヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２の発現ベクターにクローニングした。これを、ＣＨＯ－Ｓ細胞にトランスフェクトし、ヒト抗体をプロテインＧで精製した。キメラｍＡｂは、胃細胞株のＡＧＳを含むＬｅ^ｙを発現する腫瘍細胞株に結合した（図１４）。

実施例６－直接的な細胞殺滅
多くの抗グリカンｍＡｂは、エフェクター細胞または補体を必要とせずに抗原陽性細胞株において直接的な細胞死を誘導することが示されている。これは、恐らくは、腫瘍が免疫を介在する細胞死を回避するための機構を発達させ得るため、ｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの効力を高め得る。この特性は、主に、ｍＩｇＧ３アイソタイプのグリカン結合ｍＡｂに関連しており、よってその特性は、キメラ化またはヒト化の後に失われる。

ＦＧ２７．１０およびＦＧ２７．１８が直接的な細胞死を引き起こす特性を有するかどうかを決定するために、ＳＴ１６細胞をＦＧ２７．１０、ＦＧ２７．１８、および抗シアリルＬｅ^ａ ｍＡｂ ＳＣ１０４とＲＴで２時間インキュベートした後、細胞死を、死細胞によってのみ取り込まれるＤＮＡ挿入剤であるヨウ化プロピジウムの取り込みにより、測定した（図１５ａ）。興味深いことに、同じ可変領域を有するにも関わらず、ＦＧ２７．１０のみが、直接的な細胞死を誘導でき、ＰＩの取り込みは、ＦＧ２７．１８では観察されなかった。図１５ｂは、ある範囲の抗原陽性（ＡＧＳ、Ｃｏｌｏ２０１、Ｃ１７０、Ｃ１７０ＨＭ、ＭＣＦ－７、ＯＶＣＡＲ４）細胞株の直接的な殺滅を示し、ここで２つのｍＡｂが、可変する殺滅の量を示している。どのｍＡｂも、抗原陰性細胞株（ＬｏＶｏ、ＭＫＮ４５、７９１Ｔ、ＳＫＯＶ３）の殺滅を示さなかった。

図１５ｃは、ある範囲のｍＡｂによる結腸直腸細胞株Ｃ１７０におけるＰＩの取り込みを示している。ＦＧ２７．１０および陽性対照の抗体ＳＣ１０１は、強力な滴定可能な殺滅を示した。ＦＧ２７．１８は、弱く滴定可能ではない殺滅を示した。キメラのヒトＩｇＧ１は、中程度の滴定可能な殺滅を示し、ＩｇＧ２バリアントはこれを示さなかった。

実施例６－インターナリゼーション
ＦＧ２７．１０、ＦＧ２７．１８、およびＣＨ２７の全てを、様々な腫瘍細胞株を使用してインターナリゼーションについて評価した（図１６）。ＦＧ２７．１８は、試験した最も高い濃度で６０％（Ｃ１７０）から７５％（ＭＣＦ７）および８５％（ＡＧＳ）までの範囲の細胞のバイアビリティの減少を伴い、試験した大部分の細胞株で用量依存的なインターナリゼーションを示した。ＦＧ２７．１０は、ＡＧＳ（最大５０％のバイアビリティの減少）およびＭＣＦ７（最大７０％のバイアビリティの減少）で最良のインターナリゼーションを示した。Ｈ３２２細胞株でのインターナリゼーションは、マウスｍＡｂの両方でより可変性であった。ＣＨ２７ ｍＡｂは、ＭＣＦ７により効率的にインターナリゼーションされ、ここで細胞のバイアビリティの最大７５％の低下が観察され、Ｈ３２２により約４０％の細胞のバイアビリティの低下が観察された。

実施例７－ＦＧ２７のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性
ＡＤＣＣおよびＣＤＣ：ＡＤＣＣを介して腫瘍細胞死を誘導するマウスおよびキメラのＦＧ２７ ｍＡｂの特性をスクリーニングした。ヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞の供給源として使用し、腫瘍細胞のパネルを標的細胞として扱った。最初に、ＡＤＣＣ分析を、ＦＧ２７．１０ ＩｇＧ３の上清で行った（図１７ａ）。みられるＡＤＣＣの度合いは、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原の発現に対応し、よって、ＳＴ１６およびＯＶＣＡＲ３で見られ、ここで低いレベルのみがＣ１７０で観察され、ＬｏＶｏ、ＨＴ２９、またはＣｏｌｏ２０１では単にバックグラウンドのみが観察された（図１７ａ）。マウスのＦＧ２７．１０（ｍＩｇＧ３）、ＦＧ２７．１８（ｍＩｇＧ１）、ＣＨ２７ ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２によるＡＤＣＣ ＭＣＦ７およびＯＶＣＡＲ３標的細胞殺滅の度合いを、３７℃で１８時間インキュベートした後に測定し、比較した；ＣＨ２７ ＩｇＧ１は、最も高いレベルの細胞株ＭＣＦ７およびＯＶＣＡＲ３の殺滅を提供した（図１７ｂ）。

ＣＤＣは、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の排除に関与する重要な機構であることが知られている。３７℃で１８時間、補体の供給源としてのヒト血清の存在下または非存在下でｍＡｂのＦＧ２７．１０、ＦＧ２７．１８、ＣＨ２７ ＩｇＧ１、およびＣＨ２７ ＩｇＧ２により誘導されるＣＤＣにより殺滅されるＳＴ１６細胞の特性をアッセイした。図１７ｃに示されるように、ＦＧ２７ ｍＡｂのうち、ＦＧ２７．１０（ｍＩｇＧ３）は、３μｇ／ｍｌで最も高いレベルの殺滅を提供し、対して、ＣＨ２７ ＩｇＧ２では有意なレベルは見られず、ＩｇＧ２抗体の性質を考慮すると、これは予想通りであった。同様に、ＡＧＳ細胞を使用する場合には、ＦＧ２７．１０が、最も高いレベルの殺滅を提供し、ＣＨ２７ ＩｇＧ１がこれに続いた。再び、ＣＨ２７ ＩｇＧ２では殺滅はみられなかった（図１７ｄ）。

まとめると、ＦＧ２７ ｍＡｂは、補体供給源としてのヒト血清を伴いエフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用してＡＤＣＣおよび有意なＣＤＣを強力に誘導した。

実施例９－ＦＧ２７抗体のヒト化バージョンの作製
ヒトＶＨおよびＶＫ ｃＤＮＡのデータベース
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ ２００９ （Ｌｅｆｒａｎｃ ３０７－１０）およびｔｈｅ Ｋａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ５ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ｌａｓｔ ｕｐｄａｔｅ １７－Ｎｏｖ－１９９９）（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． １－３２４２）由来のヒトおよびマウスのイムノグロブリンのタンパク質配列を使用して、Ｋａｂａｔアライメントのヒトイムノグロブリン配列のデータベースを編集した。本発明者らのデータベースは、１０，９０６のＶＨ配列および２，９１２のＶＫ配列を含んでいる。

ＦＧ２７ヒトフレームワークの選択
ヒト化は、適切なヒトＶ領域の同定を必要とする。配列分析プログラムのＧｉｂｂｓを使用して、様々な選択基準を使用しＦＧ２７ ＶＨおよびＶＫタンパク質配列を用いてヒトＶＨおよびＶＫのデータベースを検索した。プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を使用して、マウスＦＧ２７抗体の構造のＣＤＲ残基の４Å以内のＦＷ残基（Ｋａｂａｔの定義）を同定し、「４Å近位残基（４Å Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｒｅｓｉｄｕｅ）」と命名した。４Å近位残基のＦＧ２７ ＶＨと最も高い同一性を有するヒトＶＨ配列が、これらのエンベロープ残基およびＶＣＩのリスト、ならびにマウスの同等の位置と同一であるＦＷ、ＶＣＩ、または４Å近位残基の残基の数と共に、図１９に示されている。図１８は、図１９の全てのＶＨ配列のアライメントおよび残基の同一性を示す。最も同一のヒト生殖系列Ｖ遺伝子との比較により同定された、各ＦＷの明らかな体細胞変異の数が、図２０に示されている。

ヒト化配列、マウスの配列および不完全な配列は、この分析から除いた。配列ＡＪ５７９１１０を、この配列の高い配列同一性および類似性のため、ヒトドナー候補として選択した。これは、その生殖系列ＡＢＯ１９４３９またはＨＭ８５５４３６からの体細胞変異を有していない。

ＦＧ２７ ＲＨＡおよびＦＧ２７ ＲＨＢの設計
適切なヒトフレームワークが同定されたため、合成のタンパク質およびＤＮＡの配列が設計され得る。ＦＧ２７のヒト化バージョンの最初の設計は、ＦＧ２７ ＶＨ由来のＣＤＲ１、２、および３の、アクセプターであるＡＪ５７９１１０のＦＷへのグラフトである。Ｋａｂａｔ位置２４の１つのＶＣＩ＋４Å近位残基は、ＦＧ２７ ＲＨＡで保存されておらず、ヒト化バージョンのＦＧ２７ ＲＨＢを産生させるためにマウスの同等の残基に復帰変異される。図２１は、ＦＧ２７ ＶＨタンパク質配列のマウスバージョンおよびヒト化バージョンを比較している。

ＦＧ２７ ＲＫＡフレームワークの選択
軽鎖をヒト化するために、ヒトκ鎖を、重鎖と同様のプロセスで同定した。図２２、２３は、４Å近位残基、およびマウスの同等の位置と同一であるＦＷまたは４Å近位残基における残基の数、ＶＫ配列のアライメント、ならびにヒト生殖系列との比較を示す。最初の分析は、いくつかの可能性のあるドナー候補を見出したが、これら全ては、不十分な発現を示すヒトＶＫ４であることが証明された。１つ少ない残基を伴うＣＤＲ１を含むように分析を広げると、ＶＫ４候補よりも高いマウス抗体に対する配列相同性の度合いを示す単一の候補のＸ７２４４９がもたらされた。この候補は、ヒトＶＫ２生殖系列由来の単一の体細胞変異を有するが、ヒトＶＫ２Ｄ生殖系列由来の体細胞変異を有さなかった（図２４）。

ＦＧ２７ ＲＫＡおよびＦＧ２７ ＲＫＢの設計
Ｘ７２４４９由来のフレームワークを使用して、ヒト化コンストラクトのＤＮＡおよびタンパク質を設計した。ＦＧ２７ ＶＫ由来のＣＤＲ１、２、および３は、Ｘ７２４４９のアクセプターＦＷにグラフトされて、ヒト化ＦＧ２７の初期バージョンを産生することが示されている。ＦＧ２７ ＲＫＡでは、単一の一致しない４Å近位残基５が存在するが、バリアントＦＧ２７ ＲＫＢでは、この残基は、同等のマウス残基に復帰変異された（図２５）。

ＦＧ２７のヒト化バージョンの作製および性質
ＦＧ２７ヒト化抗体の作製
ＦＧ２７ ＲＨＡおよびＦＧ２７ ＲＫＣの遺伝子は、Ｇｅｎｅｗｉｚにより合成され、ヒト配列に関してコドンを最適化した（図３ａｂ）。天然のヒトフレームワーク配列のＭ６５０９２およびＸ７２４４９のそれぞれの重鎖および軽鎖、ならびに天然のマウスＣＤＲ配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏでアセンブリし、ＦＧ２７ ＲＨＡ～ＦＧ２７ ＲＨＢおよびＦＧ２７ ＲＫＡ～ＦＧ２７ ＲＫＤと命名した。Ｇｅｎｅｗｉｚ独自のソフトウェアアルゴリズムを使用して、配列をサイレント変異誘発により最適化し、ヒト細胞により優先的に利用され合成されるコドンを使用した。ＲＨＡ／ＢおよびＲＫＡ／Ｂのコンストラクトを、（キメラバージョンで前述されるように）発現ベクター＋インサートに特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、リガーゼとは無関係なクローニング反応においてｐＨｕＧ１およびｐＨｕＫへと挿入しＴＯＰ１０細菌を形質転換するために使用した。その後、ＲＫＡおよびＲＨＡを、ＰＣＲ変異誘発により修飾して、図２１および２５に表記される全てのヒトバリアントを得た。

クローンをシーケンシングし、発現プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＫｉｔまたはＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ ｋｉｔを使用して調製した。発現コンストラクト配列（ＲＨＡ、ＲＨＢ、ＲＫＡ、およびＲＫＢ）を、図２１および２５に示す。（ヒト化またはキメラ）ＶＨおよびＶＫをコードする発現プラスミド調製物を使用して、Ｅｘｐｉ２９３細胞をトランスフェクトし、血清フリー培地で１０日間培養し、その後分泌された抗体を含む条件付け培地を回収した。

抗体発現
Ｅｘｐｉ２９３細胞の条件付け培地におけるＩｇＧ１κ抗体の濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定し、表５に示す。大部分の抗体は、赤色で強調されたものを除き、十分なレベルで産生された。

表５．トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞の条件付け培地におけるＩｇＧのレベル

ＦＧ２７抗体によるＬｅｗｉｓＹ－ＨＳＡの結合
ＬｅｗｉｓＹ－ＨＳＡ抗原に対する結合活性を、結合ＥＬＩＳＡにより測定した。最初の実験は、マウスまたはキメラ抗体の結合効力の間に本質的に差異がないことを示した。この結果により本発明者らはヒト化プロセスの成功におけるいくらかの確信を持った。

図２６に示されるデータは、ヒト化ＦＧ２７の最初のバージョンの結合効力を示す。全てのバージョンがＬｅｗｉｓＹ－ＨＳＡに結合したが、ＲＨＡ／ＲＫＢ、ＲＨＡ／ＲＫＣ、ＲＨＡ／ＲＫＤ、およびＲＨＢ／ＲＫＣからなる抗体のバージョンを、可能なリード候補として選択した。

高温に至るまでのヒト化候補抗体の熱的安定性
この実験の目的は、ヒト化抗体の熱的安定性を比較することである。３０～８５℃で変動する高い温度に１０分間供される場合、４℃に冷却され、各候補のＥＣ８０濃度でＥＬＩＳＡアッセイに使用される。試験した全ての抗体は、等しく安定していると思われ（図２７）、全てが７２℃超で不活性となった。

ヒト化候補抗体Ｔｍの決定
キメラおよびヒト化されたリード抗体の融点を決定するために、ＲＨＡ／ＲＫＢ、ＲＨＡ／ＲＫＣ、ＲＨＡ／ＲＫＤ、およびＲＨＢ／ＲＫＣの全ての抗体を、２ステップのアフィニティクロマトグラフィーおよびゲル濾過システムで精製し、サーマルシフトアッセイで試験した。サンプルを、蛍光染料（Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ）と７１サイクルにて、サイクルあたり１℃増大させながらｑＰＣＲサーマルサイクラーでインキュベートした。キメラ抗体および４つのヒト化抗体のＴｍを、図２８に示す。候補抗体およびキメラ抗体の全てが、同じＴｍ（７２℃）を有する。

ヒト化候補抗体の親和性
ＳＰＲ分析を使用した抗体の親和性の決定を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ３０００を使用して行った。Ｌｅｗｉｓ Ｙ－ＨＳＡを、ＣＭ５チップ（Ｃａｔ：ＢＲ－１００５－３０）に、製造社の指示に従い共有結合により固定した。キメラのＦＧ２７、ＲＨＡ／ＲＫＢ、ＲＨＡ／ＲＫＣ、ＲＨＡ／ＲＫＤ、およびＲＨＢ／ＲＫＣ抗体を、２００ｎＭ～０．２７４ｎＭの範囲の濃度（３倍の段階希釈）にてバッファーで希釈し、次に、５０μｌ／分の流速で注入した。結合時間を１２０秒に設定し、解離時間を６００秒に設定した。

結合／解離の動態を、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００評価ソフトウェアパッケージを使用して異種性リガンドモデルに最良に適合することにより分析した。２００ｎＭ結合曲線のオーバーレイが、ｓｅｎｓｏｇｒａｍに示されている（図２９）。ＲＨＡ／ＲＫＢ、ＲＨＡ／ＲＫＣ、およびＲＨＢ／ＲＫＣは、キメラＦＧ２７と同様の親和性を示す（ＲＨＡ／ＲＫＢ＞ＲＨＡ／ＲＫＣ＞ＲＨＢ／ＲＫＣ＞＞ＲＨＡ／ＲＫＤ）。これら結果は、ヒト化が望ましいパラメータの範囲内で結合活性をうまく保持しており、ＲＨＡ／ＲＫＢまたはＲＨＡ／ＲＫＣが最も高い親和性を有することを示唆している。

ヒト化候補抗体の凝集
サンプルを、ＨＰＬＣシステムのサイズ排除カラムに０．４ｍｌ／分で注入し、多角度光散乱法により分析して、絶対モル質量を決定し凝集を確認した。全てのバリアントは、この分析の状況におけるＩｇＧモノマーの予測される範囲である、１４０．１９ｋＤａの範囲の平均モル分子量で凝集の徴候を示さない。全てのサンプルは、単分散されている（Ｍｗ／Ｍｎ＜１．０５）。質量の回収率（計算された質量／注入された質量）は、良好なタンパク質の回収を表し、サンプルがカラムに固着しないかまたはガードカラムにより保持される不溶性の凝集物を含まないように思われる１００％である。総合的なデータは、分析した抗ＦＧ２７抗体サンプルのいずれにも凝集の懸念はないことを示唆している。

非特異的なタンパク質間相互作用（ＣＩＣ）
バルクで精製されたヒトポリクローナルＩｇＧを使用したＣＩＣ（Ｃｒｏｓｓ－Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、非特異的なタンパク質間相互作用をモニタリングするための技術であり、可溶性抗体と不溶性抗体との間を区別するために使用され得る。高い保持指数（ｋ’）は、自己相互作用の傾向および低い溶解度を表す。ＲＨＡ／ＲＫＢ、ＲＨＡ／ＲＫＣ、ＲＨＢ／ＲＫＣ抗体は、０．０４４未満の保持指数を示し、非特異的な相互作用の傾向が低く、溶解度が良好であることを表している（図３０）。

抗体は、Ｌｅｗｉｓ Ｙ ＨＳＡ結合効力を失うことなく完全にヒト化された抗体として操作および発現されている（図２６および２９）。ヒト定常領域上のマウス可変領域からなるキメラ抗体での実験は、マウス抗体と同様のＬｅｗｉｓ Ｙ ＨＳＡ結合ＥＬＩＳＡの効力を示した。この結果は、ヒト化プロセスの正のアウトカムにいくらかの信頼をもたらす。

最初の実験は、完全にヒト化された重鎖および軽鎖、すなわちマウス４Å近位残基を導入するためのフレームワーク変異を含まない重鎖および軽鎖が、Ｌｅｗｉｓ Ｙ ＨＳＡペプチドに結合しないこと、ならびにキメラ陽性対照抗体であるが単一の復帰変異を含むバージョンがキメラ陽性対照と同等に結合することを示している。抗体の溶解度、熱的安定性、および凝集を測定するアッセイは、全てのヒト化候補が許容される生物物理学的な特徴を有することを示唆している。

本発明者らの観点では、優れた結合、発現、熱的安定性、親和性、および細胞結合の組み合わせは、ＲＫＣ軽鎖バージョンと組み合わせたＲＨＡ重鎖バージョンを、さらなる開発にとって最良の候補にさせている。

実施例１０－ＦＧ２７結合試験
ヒト化ｍＡｂ（ヒト化２７）およびキメラｍＡｂ（ＣＨ２７）は、がん細胞株での用量設定において同様の細胞結合パターンを示した（図３１）。平衡親和定数は、全体的に同じ桁にあるが、親のマウス抗体と比較してわずかに高く、ヒト化２７およびＣＨ２７の最大結合能は、マウスｍＡｂの値と比較して大きい。この結果は、ヒト化プロセスのアウトカムの成功を示唆している。

実施例１１－ヒト化ｍａｂの直接的な殺滅
ヒトＩｇＧ１ ２７キメラ（２７ｈＩｇＧ１）の直接的な細胞殺滅を高めるために、本発明者らは、選択したｍＩｇＧ３定常領域残基をｈＩｇＧ１ Ｆｃドメインに移すことにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの直接的な細胞殺滅能が改善している、改善された「ｉ２７Ｇ１」Ｌｅｗｉｓ^Ｙグリカン結合ｍＡｂを作製した。図３３は、「ｉ２７Ｇ１」抗体の各軽鎖および重鎖のアミノ酸配列および核酸配列を示す。この抗体は、本発明の別の態様を形成する。

図３２は、改善されたｉ２７Ｇ１の直接的な細胞殺滅、機能的な親和性、およびエフェクター機能を示す。ｍＩｇＧ３ ２７抗体は、Ｌｅｗｉｓ^ｙを発現するＡＧＳ細胞株（ｉ）およびＭＣＦ７細胞株（ｉｉ）において直接的な細胞殺滅能を有するが、キメラ２７ｈＩｇＧ１はこれを有さない。選択されたｍＩｇＧ３定常領域の残基を含む本発明者らのｉ２７Ｇ１は、ＡＧＳ（ｉ）およびＭＣＦ７（ｉｉ）の両方で、２７ｍＧ３ ｍＡｂと同等の、２７ｈＩｇＧ１と比較して有意に改善された直接的な細胞殺滅を呈する。さらに、ｉ２７Ｇ１は、２７ｈＩｇＧ１（ｉｉｉ）と比較して有意に改善された機能的なＬｅｗｉｓ^ｙ親和性を呈する。重要なことに、ｉ２７Ｇ１のエフェクター機能、ＡＤＣＣ、およびＣＤＣは全て、ＭＣＦ７で２７ｈＩｇＧ１の値と同等であった（ｉｖおよびｖ）。まとめると、これら結果は、ｍＩｇＧ３定常領域から２７ｈＩｇＧ１骨格への選択された領域の移動は、直接的な細胞殺滅能、増大した機能的な親和性、および強力な免疫エフェクター機能を有するハイブリッドｍＡｂをもたらしたことを表している。

参照文献
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Ｂｕｒｔｏｎ （１９９４）． ”Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｂｒｏａｄｅｎ ｓｔｒａｉｎ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９１（９）： ３８０９－３８１３．
Ｂｉｒｄ， Ｒ． Ｅ．， Ｋ． Ｄ． Ｈａｒｄｍａｎ， Ｊ． Ｗ． Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｓ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｂ． Ｍ． Ｋａｕｆｍａｎ， Ｓ． Ｍ． Ｌｅｅ， Ｔ． Ｌｅｅ， Ｓ． Ｈ． Ｐｏｐｅ， Ｇ． Ｓ． Ｒｉｏｒｄａｎ ａｎｄ Ｍ． Ｗｈｉｔｌｏｗ （１９８８）． ”Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２（４８７７）： ４２３－４２６．
Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ， Ｍ． ａｎｄ Ａ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ （１９８４）． Ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ．
Ｃｈｏｕ， Ｈ． Ｈ．， Ｈ． Ｔａｋｅｍａｔｓｕ， Ｓ． Ｄｉａｚ， Ｊ． Ｉｂｅｒ， Ｅ． Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｋ． Ｌ． Ｗｒｉｇｈｔ， Ｅ． Ａ． Ｍｕｃｈｍｏｒｅ， Ｄ． Ｌ． Ｎｅｌｓｏｎ， Ｓ． Ｔ． Ｗａｒｒｅｎ ａｎｄ Ａ． Ｖａｒｋｉ （１９９８）． ”Ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＣＭＰ－ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ Ｈｏｍｏ－Ｐａｎ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９５（２０）： １１７５１－１１７５６．
Ｄ’Ａｒｃｙ， Ｃ． Ａ．， ａｎｄ Ｍ． Ｍａｎｎｉｋ． ２００１． ’Ｓｅｒｕｍ ｓｉｃｋｎｅｓｓ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ－ｈｕｍａｎ
ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＩＤＥＣ－Ｃ２Ｂ８ （ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）’， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ， ４４： １７１７－８．
Ｄｕｒｒａｎｔ， Ｌ． Ｇ．， Ｐ． Ｎｏｂｌｅ ａｎｄ Ｉ． Ｓｐｅｎｄｌｏｖｅ （２０１２）． ”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｓｅｒｉｅｓ； ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｃａｎｃｅｒ： ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．” Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７（２）： ２０６－２１５．
Ｅｐｐｓｔｅｉｎ， Ｄ． Ａ．， Ｙ． Ｖ． Ｍａｒｓｈ， Ｍ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｐａｓ， Ｐ． Ｌ． Ｆｅｌｇｎｅｒ ａｎｄ Ａ． Ｂ． Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ （１９８５）． ”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８２（１１）： ３６８８－３６９２．
Ｆｕｒｕｋａｗａ， Ｋ．， Ｓ． Ｗｅｌｔ， Ｂ． Ｗ． Ｙｉｎ， Ｈ． Ｊ． Ｆｅｉｃｋｅｒｔ， Ｔ． Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｒ． Ｕｅｄａ ａｎｄ Ｋ． Ｏ． Ｌｌｏｙｄ （１９９０）． ”Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ １１ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ．” Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７（８）： ７２３－７３２．
Ｇｒａｍ， Ｈ．， Ｌ． Ａ． Ｍａｒｃｏｎｉ， Ｃ． Ｆ． Ｂａｒｂａｓ， ３ｒｄ， Ｔ． Ａ． Ｃｏｌｌｅｔ， Ｒ． Ａ． Ｌｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ａ． Ｓ． Ｋａｎｇ （１９９２）． ”Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎａｉｖｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌｉｂｒａｒｙ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８９（８）： ３５７６－３５８０．
Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ， Ｉ．， Ｈ． Ｊ． Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ， Ｕ． Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ ａｎｄ Ｋ． Ｅ． Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ （１９９０）． ”Ｈｉｇｈｌｙ ｔｕｍｏｒ－ｒｅａｃｔｉｖｅ， ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ， ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｌｅ（ｙ）－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ．” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０（７）： ２１８３－２１９０．
Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ．， Ｔ． Ｐｒｏｓｐｅｒｏ ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ （１９９３）． ”“Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ”： ｓｍａｌｌ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９０（１４）： ６４４４－６４４８．
Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｐ． ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ （１９９３）． ”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．” Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４（４）： ４４６－４４９．
Ｈｕｓｔｏｎ， Ｊ． Ｓ．， Ｄ． Ｌｅｖｉｎｓｏｎ， Ｍ． Ｍｕｄｇｅｔｔ－Ｈｕｎｔｅｒ， Ｍ． Ｓ． Ｔａｉ， Ｊ． Ｎｏｖｏｔｎｙ， Ｍ． Ｎ． Ｍａｒｇｏｌｉｅｓ， Ｒ． Ｊ． Ｒｉｄｇｅ， Ｒ． Ｅ． Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ， Ｅ． Ｈａｂｅｒ， Ｒ． Ｃｒｅａ ａｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８）． ”Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ： ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ ａｎｔｉ－ｄｉｇｏｘｉｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎａｌｏｇｕｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８５（１６）： ５８７９－５８８３．
Ｈｗａｎｇ， Ｋ． Ｊ．， Ｋ． Ｆ． Ｌｕｋ ａｎｄ Ｐ． Ｌ． Ｂｅａｕｍｉｅｒ （１９８０）． ”Ｈｅｐａｔｉｃ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： ａ ｋｉｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ７７（７）： ４０３０－４０３４．
Ｊｅｓｐｅｒｓ， Ｌ． Ｓ．， Ａ． Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｓ． Ｍ． Ｍａｈｌｅｒ， Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈ． Ｒ． Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ （１９９４）． ”Ｇｕｉｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｔｏ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ．” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ） １２（９）： ８９９－９０３．
Ｊｏｎｅｓ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｍ． Ｍ． Ｂｅｎｄｉｇ （１９９１）． ”Ｒａｐｉｄ ＰＣＲ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ．” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ） ９（１）： ８８－８９．
Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ． ａｎｄ Ｓ． Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９０）． ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅｓ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８７（６）： ２２６４－２２６８．
Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ． ａｎｄ Ｓ． Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３）． ”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ－ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９０（１２）： ５８７３－５８７７．
Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｋ．， Ｅ． Ｓｔｏｃｋｅｒｔ， Ｐ． Ｇａｒｉｎ－Ｃｈｅｓａ， Ｓ． Ｗｅｌｔ， Ｋ． Ｏ． Ｌｌｏｙｄ， Ｋ． Ｌ． Ａｒｍｏｕｒ， Ｔ． Ｐ． Ｗａｌｌａｃｅ， Ｗ． Ｊ． Ｈａｒｒｉｓ， Ｆ． Ｊ． Ｃａｒｒ ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｏｌｄ （１９９４）． ”Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ Ｌｅｗｉｓ－ｙ （Ｌｅ（ｙ）） ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄａｇａｉｎｓｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌ Ｌｅ（ｙ） ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９１（２６）： １２９５７－１２９６１．
Ｌｅｆｒａｎｃ， Ｍ． Ｐ．， Ｖ． Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ， Ｃ． Ｇｉｎｅｓｔｏｕｘ， Ｊ． Ｊａｂａｄｏ－Ｍｉｃｈａｌｏｕｄ， Ｇ． Ｆｏｌｃｈ， Ｆ． Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ， Ｙ． Ｗｕ， Ｅ． Ｇｅｍｒｏｔ， Ｘ． Ｂｒｏｃｈｅｔ， Ｊ． Ｌａｎｅ， Ｌ． Ｒｅｇｎｉｅｒ， Ｆ． Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ， Ｇ． Ｌｅｆｒａｎｃ ａｎｄ Ｐ． Ｄｕｒｏｕｘ （２００９）． ”ＩＭＧＴ， ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３７（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）： Ｄ１００６－１０１２．
Ｌｏｏ， Ｄ．， Ｎ． Ｐｒｙｅｒ， Ｐ． Ｙｏｕｎｇ， Ｔ． Ｌｉａｎｇ， Ｓ． Ｃｏｂｅｒｌｙ， Ｋ． Ｌ． Ｋｉｎｇ， Ｋ． Ｋａｎｇ， Ｐ． Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｍ． Ｔｓａｏ， Ｘ． Ｘｕ， Ｂ． Ｐｏｔｔｓ ａｎｄ Ｊ． Ｐ． Ｍａｔｈｅｒ （２００７）． ”Ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＡＶ１２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｏｎｃｏｓｉｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｈａｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．” Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ６（３）： ８５６－８６５．
Ｍａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ．， Ａ． Ｄ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｍ． Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ， Ｔ． Ｐ． Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｊ． Ｍ． Ｂｙｅ ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ （１９９２）． ”Ｂｙ－ｐａｓｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ： ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ） １０（７）： ７７９－７８３．
Ｍｉｏｔｔｉ， Ｓ．， Ｄ． Ｒ． Ｎｅｇｒｉ， Ｏ． Ｖａｌｏｔａ， Ｍ． Ｃａｌａｂｒｅｓｅ， Ｒ． Ｌ． Ｂｏｌｈｕｉｓ， Ｊ． Ｗ． Ｇｒａｔａｍａ， Ｍ． Ｉ． Ｃｏｌｎａｇｈｉ， ａｎｄ
Ｓ． Ｃａｎｅｖａｒｉ． １９９９． ’Ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
ａｎｔｉｂｏｄｙ ＯＣ／ＴＲ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ－ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇｅｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ’， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ８４：
６２－８．
Ｍｙｅｒｓ， Ｅ． Ｗ． ａｎｄ Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ （１９８９）． ”Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ．” Ｂｕｌｌ Ｍａｔｈ Ｂｉｏｌ ５１（１）： ５－３７．
Ｎｏｂｌｅ， Ｐ．， Ｉ． Ｓｐｅｎｄｌｏｖｅ， Ｓ． Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｔ． Ｐａｒｓｏｎｓ ａｎｄ Ｌ． Ｇ． Ｄｕｒｒａｎｔ （２０１３）． ”Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｅｗｉｓ（ｙ） ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ（ｂ） ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ６９２／２９．” ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（２）： ｅ５４８９２．
Ｐａｉ， Ｌ． Ｈ．， Ｒ． Ｗｉｔｔｅｓ， Ａ． Ｓｅｔｓｅｒ， Ｍ． Ｃ． Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｉ． Ｐａｓｔａｎ （１９９６）． ”Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ＬＭＢ－１： ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ．” Ｎａｔ Ｍｅｄ ２（３）： ３５０－３５３．
Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｗ． Ｒ． ａｎｄ Ｄ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ （１９８８）． ”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８５（８）： ２４４４－２４４８．
Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ． （１９９１）． ”Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： ａｄｖａｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ．” Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ） ９（６）： ５４５－５５１．
Ｒａｂｕ， Ｃ．， Ｒ． ＭｃＩｎｔｏｓｈ， Ｚ． Ｊｕｒａｓｏｖａ ａｎｄ Ｌ． Ｄｕｒｒａｎｔ （２０１２）． ”Ｇｌｙｃａｎｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．” Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ ８（８）： ９４３－９６０．
Ｒｅｆｆ， Ｍ． Ｅ． （１９９３）． ”Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．” Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４（５）： ５７３－５７６．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｒ． （１９８０）． Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． （１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ａｎｄ Ｄ． Ｒｕｓｓｅｌｌ （２００１）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．
Ｓｃｈｉｅｒ， Ｒ．， Ａ． ＭｃＣａｌｌ， Ｇ． Ｐ． Ａｄａｍｓ， Ｋ． Ｗ． Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｈ． Ｍｅｒｒｉｔｔ， Ｍ． Ｙｉｍ， Ｒ． Ｓ． Ｃｒａｗｆｏｒｄ， Ｌ． Ｍ． Ｗｅｉｎｅｒ， Ｃ． Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｊ． Ｄ． Ｍａｒｋｓ （１９９６）． ”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｃｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉ－ｃ－ｅｒｂＢ－２ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ．” Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６３（４）： ５５１－５６７．
Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｍ．， Ｐ． Ｕｍａｎａ， Ｃ． Ｆｅｒｒａｒａ， Ｐ． Ｂｒｕｎｋｅｒ， Ｃ． Ｇｅｒｄｅｓ， Ｇ． Ｗａｘｅｎｅｃｋｅｒ， Ｓ． Ｗｉｅｄｅｒｋｕｍ， Ｃ． Ｓｃｈｗａｇｅｒ， Ｈ． Ｌｏｉｂｎｅｒ， Ｇ． Ｈｉｍｍｌｅｒ ａｎｄ Ｇ． Ｃ． Ｍｕｄｄｅ （２００５）． ”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｌｅｗｉｓ Ｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５（１７）： ７９３４－７９４１．
Ｓｃｏｔｔ， Ａ． Ｍ．， Ｄ． Ｇｅｌｅｉｃｋ， Ｍ． Ｒｕｂｉｒａ， Ｋ． Ｃｌａｒｋｅ， Ｅ． Ｃ． Ｎｉｃｅ， Ｆ． Ｅ． Ｓｍｙｔｈ， Ｅ． Ｓｔｏｃｋｅｒｔ， Ｅ． Ｃ． Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｆ． Ｊ． Ｃａｒｒ， Ｗ． Ｊ． Ｈａｒｒｉｓ， Ｋ． Ｌ． Ａｒｍｏｕｒ， Ｊ． Ｒｏｏｄ， Ａ． Ｋｙｐｒｉｄｉｓ， Ｖ． Ｋｒｏｎｉｎａ， Ｒ． Ｍｕｒｐｈｙ， Ｆ． Ｔ． Ｌｅｅ， Ｚ． Ｌｉｕ， Ｋ． Ｋｉｔａｍｕｒａ， Ｇ． Ｒｉｔｔｅｒ， Ｋ． Ｌａｕｇｈｔｏｎ， Ｅ． Ｈｏｆｆｍａｎ， Ａ． Ｗ． Ｂｕｒｇｅｓｓ ａｎｄ Ｌ． Ｊ． Ｏｌｄ （２０００）． ”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ， ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ－Ｌｅｗｉｓ Ｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ３Ｓ１９３ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０（１２）： ３２５４－３２６１．
Ｓｉｄｍａｎ， Ｋ． Ｒ．， Ｗ． Ｄ． Ｓｔｅｂｅｒ， Ａ． Ｄ． Ｓｃｈｗｏｐｅ ａｎｄ Ｇ． Ｒ． Ｓｃｈｎａｐｅｒ （１９８３）． ”Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ．” Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２（１）： ５４７－５５６．
Ｓｃｈｒｏｆｆ， Ｒ． Ｗ．， Ｋ． Ａ． Ｆｏｏｎ， Ｓ． Ｍ． Ｂｅａｔｔｙ， Ｒ． Ｋ． Ｏｌｄｈａｍ， ａｎｄ Ａ． Ｃ． Ｍｏｒｇａｎ， Ｊｒ． １９８５． ’Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ
ｍｕｒｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ’， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，
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Ｚｈａｎｇ， Ｇ．， Ｈ． Ｚｈａｎｇ， Ｑ． Ｗａｎｇ， Ｐ． Ｌａｌ， Ａ． Ｍ． Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｍ． ｄｅ ｌａ Ｌｌｅｒａ－Ｍｏｙａ， Ｘ． Ｘｕ ａｎｄ Ｍ． Ｉ． Ｇｒｅｅｎｅ （２０１０）． ”Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆ７７ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ ｍａｒｋｅｒ．” Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０７（２）： ７３２－７３７．
Ｚｈｏｎｇ， Ｌ． Ｔ．， Ａ． Ｍａｎｚｉ， Ｅ． Ｓｋｏｗｒｏｎｓｋｉ， Ｌ． Ｎｏｔｔｅｒｐｅｋ， Ａ． Ｌ． Ｆｌｕｈａｒｔｙ， Ｋ． Ｆ． Ｆａｕｌｌ， Ｉ． Ｍａｓａｄａ， Ｓ． Ｒａｂｉｚａｄｅｈ， Ｍ． Ｖａｒｓａｎｙｉ－Ｎａｇｙ， Ｙ． Ｒｕａｎ， Ｊ． Ｄ． Ｏｈ， Ｌ． Ｌ． Ｂｕｔｃｈｅｒ ａｎｄ Ｄ． Ｅ． Ｂｒｅｄｅｓｅｎ （２００１）． ”Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｉｎｄｓ ａ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｍａｒｋｅｒ．” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１（１５）： ５７４１－５７４８．

Claims (21)

1. Ｆｕｃａ１－２Ｇａｌｂ１－４（Ｆｕｃａ１－３）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅ^ｙ）に特異的に結合できる単離された特異的結合メンバー。
2. 図１ａまたは１ｂの残基２７～３８（ＣＤＲＨ１）、５６～６５（ＣＤＲＨ２）、または１０５～１１６（ＣＤＲＨ３）として実質的に提示されるアミノ酸配列を有する結合ドメインから選択される１つ以上の結合ドメインを含む、請求項１に記載の結合メンバー。
3. 図１ａまたは１ｂの残基１～１２７（ＶＨ）として実質的に提示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の結合メンバー。
4. 図１ｃの残基２７～３８（ＣＤＲＬ１）、５６～６５（ＣＤＲＬ２）、または１０５～１１３（ＣＤＲＬ３）として実質的に提示されるアミノ酸配列を有する結合ドメインから選択される１つ以上の結合ドメインを含む、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
5. 図１ｃの残基１～１２４（ＶＬ）として実質的に提示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の結合メンバー。
6. 図１ａまたは１ｂのアミノ酸配列の残基１～１２７（ＶＨ）と、図１ｃのアミノ酸配列の残基１～１２４（ＶＬ）とを含む、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
7. 少なくとも１つの結合ドメインが、ヒト抗体フレームワークにより担持されている、請求項２または４に記載の結合メンバー。
8. ヒト定常領域をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
9. 前記結合メンバーが、抗体または抗体フラグメントである、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
10. 図２ａに実質的に提示される重鎖アミノ酸配列と、図２ｂに実質的に提示される軽鎖アミノ酸配列とを含む、請求項８または９に記載の結合メンバー。
11. 図３ａに実質的に提示される重鎖アミノ酸配列と、図３ｂに実質的に提示される軽鎖アミノ酸配列とを含む、請求項１、２、または４に記載の結合メンバー。
12. 請求項２～１１のいずれか１項に記載の単離された特異的な結合メンバーと競合する、Ｆｕｃａ１－２Ｇａｌｂ１－４（Ｆｕｃａ１－３）ＧｌｃＮＡｃ（Ｌｅ^ｙ）に特異的に結合できる単離された特異的な結合メンバー。
13. 化学療法剤または細胞毒性剤に結合しているかまたは他の方法で関連している、先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバー。
14. 先行する請求項のいずれかに記載の結合メンバーと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体、バッファー、または安定化剤とを含む医薬組成物。
15. 医薬で使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の結合メンバー。
16. 腫瘍を処置または予防する方法で使用するための、請求項１～１２のいずれか１項に記載の結合メンバー。
17. 腫瘍の処置における同時使用、別々の使用、または逐次使用のための配合剤としての、請求項１～１２のいずれか１項に記載の特異的な結合メンバーと有効な作用物質とを含む製品。
18. 前記腫瘍が、結腸直腸、胃、膵臓、肺、卵巣、または乳房の腫瘍である、請求項１４もしくは１５に記載の使用のための結合メンバーまたは請求項１６に記載の製品。
19. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の結合メンバーをコードする核酸。
20. 図３３に実質的に提示されるアミノ酸配列を有する重鎖および／または図３３に実質的に提示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、結合メンバー。
21. 図３３に実質的に提示される核酸配列によりコードされる重鎖および／または図３３に実質的に提示される核酸配列によりコードされる軽鎖を含む、請求項２０に記載の結合メンバー。

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