JP2022536476A - Ｚｉｐ６及び／又はｚｉｐ１０に対する抗体を含む抗有糸分裂組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つのＺＩＰ（Ｚｒｔ、Ｉｒｔ様タンパク質）輸送体タンパク質の細胞外ドメインを選択的に結合してその機能、特に有糸分裂を阻害する少なくとも１つの抗体又はそのエピトープを含む抗有糸分裂剤；該抗有糸分裂剤を含む組成物；及び癌を含む過剰増殖性障害を処置するための前記抗有糸分裂剤又は組成物の使用に関する。【選択図】図３Ｆ

Description

本発明は、少なくとも１つのＺＩＰ（Ｚｒｔ、Ｉｒｔ様タンパク質）輸送体タンパク質の細胞外ドメインを選択的に結合してその機能、特に有糸分裂を阻害する少なくとも１つの抗体又はその断片を含む抗有糸分裂剤；該抗有糸分裂剤を含む組成物；及び過剰増殖性障害を処置するための前記抗有糸分裂剤又は組成物の使用に関する。

細胞増殖は、あらゆる多細胞形態の生命体にとって必須である。したがって、細胞増殖、すなわち限られた数の細胞から始まる細胞数の増加は、あらゆる多細胞生物に関連する。細胞増殖は高度に調節された過程である。多細胞生物の生体量の単なる増加とは別に、多細胞生物は、高度に組織化された細胞間相互作用を維持するために細胞増殖を制御しなければならない。細胞増殖のあらゆる調節解除は、病的状態を呈する、又はもたらす。

病的症状及びより良性の症状を含む様々な疾患は、望ましくない細胞増殖、特に細胞の増加した増殖又は過剰増殖を特徴とする。これらの障害の多くは寿命を短縮させ、他の障害は生活の質を劇的に低下させる。

例えば、癌は、過剰増殖性疾患の最も有名な例の１つである。癌は、一群の細胞が制御されない成長を示し、隣接する組織の浸潤及び破壊をもたらす、大きく不均一な種類の疾患である。癌細胞はしばしば転移し、腫瘍細胞はリンパ系を介して又は血流を介して体内の他の場所に広がる。

多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）及び関連する嚢胞性腎疾患、過形成、化生及び異形成ならびにそれらの様々な形態、免疫系の増殖性障害（骨髄及びリンパ増殖性障害など）、前立腺肥大症、子宮内膜症、乾癬、組織修復及び創傷治癒及び線維症などの、但しこれらに限定されない他の形態の過剰増殖性疾患も存在する。

線維症は、器官又は組織における過剰な線維性結合組織の形成を伴い、広い範囲に広がり、侵襲性になると、組織又は器官の変性及び／又は機能の喪失をもたらし得る。さらに、線維症は、肺線維症、特発性肺線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、血管狭窄又は脊柱管狭窄、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性巨大線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド又は陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性硬化症、関節線維症及び癒着性関節包炎を含むがこれらに限定されない哺乳動物における多数の疾患状態において役割を果たす。

このような過剰増殖性疾患は数十年にわたって知られているが、効果的な処置は依然として困難である。数多くの抗増殖剤が過去１０年間にわたって報告されている。多くの抗増殖剤が研究されてきたが、顕著な臨床的進歩はほとんど遂げていない。

本明細書に記載されている細胞増殖性障害は、様々な理由で起こり得るが、一般に、異常な有糸分裂及び／又は望ましくない有糸分裂を伴う。

亜鉛は細胞における必須イオンであり、亜鉛がなければ、細胞は生命を維持することができない。亜鉛は、５０を超える異なる酵素クラスに相当し、細胞増殖に不可欠である３００を超える酵素の補因子である。亜鉛は、タンパク質、核酸、炭水化物及び脂質代謝、ならびに遺伝子転写、分化及び発達の制御に関与する。亜鉛欠乏は有害であり得、発育不全及び重篤な代謝障害を引き起こすが、一方で過剰な亜鉛は細胞に有毒であり得る。

亜鉛の生物学を調査するための新しい分子ツールの開発により、細胞における亜鉛の複数の生物学的機能が明らかにされ、亜鉛のシグナル伝達の多様性を実証することによって、亜鉛は「２１世紀のカルシウム」と称されている。亜鉛の細胞レベルは、特異的亜鉛輸送体タンパク質によって厳密に調節されており、それらのタンパク質には２つの公知のファミリーが存在する。これらの２つのファミリーは、亜鉛輸送に対して反対の作用を有する。亜鉛輸送体のＺｎＴファミリー（ＳＬＣ３０Ａ）（以前には、ｃａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ（カチオン拡散促進剤）を略してＣＤＦと呼ばれていた）は、亜鉛を細胞質から細胞外へ又は細胞内区画中に輸送するのに対して、亜鉛輸送体のＺＩＰファミリー（Ｚｒｔ様、Ｉｒｔ様タンパク質の略）（ＳＬＣ３９Ａ）は、細胞外又は細胞内区画のいずれかから細胞質中に亜鉛を輸送し、これらの輸送体のうちの２つ、ＺＩＰ６（ＳＬＣ３９Ａ６／ＬＩＶ－１）及びＺＩＰ１０（ＳＬＣ３９Ａ１０）は近縁の相同分子種である。増大する証拠によって、ＺＩＰ輸送体のＳＬＣ３９Ａファミリーの様々なメンバーが疾患状態に関与していることが示されている。

上記２つの相同分子種ＺＩＰ６：ＺＩＰ１０によって形成されたヘテロ二量体が有糸分裂を開始する上で重要な機能を有することが本明細書に開示されている。特定の細胞外ＺＩＰ６／ＺＩＰ１０ドメインを標的とすることによって、本発明者らは、このヘテロ二量体ＺＩＰ６：ＺＩＰ１０の阻害が有糸分裂を完全に防止し、したがって細胞増殖及び成長を防止することができることを実証した。この阻害は、有糸分裂を増加させる作用物質の存在下でさえ観察され、さらに阻害は用量依存的に起こった。

最も有利には、ＺＩＰ６及びＺＩＰ１０輸送体は、多量体複合体を形成し、細胞分裂を開始するために、有糸分裂の開始直前に細胞膜へと移行するに過ぎず、したがって、細胞が分裂しているとき又は転移するために円形化しているときにのみ存在し、これにより、選択的な治療標的を見事に提供することも見出された。

したがって、本発明者らの研究は、この過程において鍵となるタンパク質であるＺＩＰ６及びＺＩＰ１０、ならびにヘテロ二量体化し、有糸分裂を引き起こすために必要な亜鉛流入を媒介するそれらの能力を明らかにすることによって、増殖における亜鉛の長年確立された役割への分子的洞察を提供する。これらのタンパク質を阻害することにより、本発明者らは、癌などの細胞過剰増殖を特徴とする疾患において細胞分裂を防止する新しい方法を提供する。

本発明の第１の態様によれば、抗有糸分裂組成物であって、有糸分裂を防止することによる過剰増殖性障害の処置において使用するために、少なくとも１つのＺＩＰ（Ｚｒｔ、Ｉｒｔ様タンパク質）輸送体の細胞外ドメインを結合してその機能を阻害する少なくとも１つの抗体又はその断片を含み、前記ＺＩＰ輸送体は、ＺＩＰ６若しくはＺＩＰ１０のいずれか、又はその両方を含むヘテロ二量体である、抗有糸分裂組成物が提供される。

本明細書における抗体又はその断片への言及は、前記亜鉛輸送体の細胞外ドメインを結合し、最も理想的にはヘテロ二量体の形成を防止し、及び／（ａｎｄ ｓｏ）又は細胞の細胞質中への亜鉛の輸送を阻害する抗体の部分を指す。

より具体的には、前記断片は、ヘテロ二量体の一部、特にエピトープに対する、抗体若しくはその重要部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）又はアプタマーである。

本発明の好ましい実施形態において、前記組成物は、それぞれがＺＩＰ６：ＺＩＰ１０ヘテロ二量体の異なる部分を標的とする１つより多くの抗体を含む。理想的には、抗体の少なくとも１つがヘテロ二量体のＺＩＰ６輸送体部分を結合し、抗体の少なくとも１つがヘテロ二量体のＺＩＰ１０輸送体部分を結合する抗体の組み合わせが使用される。これに加えて又はこれに代えて、前記ヘテロ二量体の前記ＺＩＰ６輸送体及び前記ＺＩＰ１０輸送体隣接部分の両方を結合する少なくとも１つの抗体が使用される。

当業者によって理解されるように、抗体は、ポリクローナル抗体、又はより理想的にはモノクローナル抗体であり得、前記輸送体の細胞外ドメインの全体又は一部を結合することができる。

理想的には、抗体又は断片は、前記抗体の少なくとも（１又は複数の）相補性決定領域への言及を含む。

本明細書におけるＺＩＰ輸送体タンパク質への言及は、細胞外又は細胞内区画のいずれかから細胞の細胞質中に亜鉛を輸送する亜鉛輸送体のＳＬＣ３９Ａファミリーを指す。当業者に公知であるように、ＺＩＰファミリーは、１４個のヒト配列を含み、そのうちの９個は、主に細胞膜上に位置し、亜鉛を細胞内に輸送する８個の膜貫通ドメインタンパク質を有する高度に保存された群であるＬＩＶ－１サブファミリーに属する。特に、ＬＩＶ－１サブファミリーのヒトメンバーは、ＺＩＰ４、ＺＩＰ５、ＺＩＰ６、ＺＩＰ７、ＺＩＰ８、ＺＩＰ１０、ＺＩＰ１２、ＺＩＰ１３、ＺＩＰ１４を含む。

本発明の第１の態様の好ましい実施形態において、理想的には、前記抗体は、理想的には、輸送体のＮ末端全体に関して、すなわち切断事象より前に付番された以下の基準座標：
ＺＩＰ６についてはＮ末端１～３２５又は１～３５０及びＺＩＰ１０については１～４０７の間で；さらにより好ましくは、ＺＩＰ６についてはＮ末端３１～３２５又は３１～３４４及びＺＩＰ１０については３１～４０７の間で、前記ＺＩＰ６及び／又はＺＩＰ１０輸送体の（１又は複数の）細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を結合する。さらにより好ましくは、ＺＩＰ６についてはＮ末端アミノ酸９３～３５０及びＺＩＰ１０については４６～３９５の間で。さらにより理想的には、前記抗体は、ＺＩＰ６についてはアミノ酸２２０～３５０及びＺＩＰ１０についてはアミノ酸４６～３９５を結合する。さらにより理想的には、前記抗体は、ＺＩＰ６についてはアミノ酸２４６～２５９及びＺＩＰ１０についてはアミノ酸４６～５９を結合する。

理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ＺＩＰ１０とのＺＩＰ６のヘテロ二量体の形成が小胞体中で起こり、ＺＩＰ６／ＺＩＰ１０ヘテロ二量体が細胞膜に移動して細胞の円形化を開始し、亜鉛を細胞中に運び入れて有糸分裂を開始するためにはＺＩＰ６のＮ末端切断が必要であると考えている。ヘテロ二量体の細胞外ドメイン、具体的にはＺＩＰ６の切断されたＮ末端及び／又はＺＩＰ１０のＮ末端の細胞外ドメイン（すなわち、転位のためのＥＲ中でのＮ末端切断後にタンパク質上に残存するもの）の優先的な標的化を通じて、ＺＩＰ６又はＺＩＰ１０抗体は、有糸分裂を防止するために、一方又は両方の輸送体のＮ末端を結合し、亜鉛流入を遮断するか、又はプロテアーゼ切断などの亜鉛活性化を妨害することによって、ＺＩＰ６／ＺＩＰ１０ヘテロ二量体を阻害することができる。

最も好ましくは、前記抗体は、輸送体のＮ末端全体に関して、すなわち切断事象より前に付番された以下の基準座標の間で、ＺＩＰ６の以下のＥＣＤの少なくとも１つを結合する。

Ｎ末端エピトープ（配列番号１ ９３－ＨＨＤＨＤＨＨＳＤＨＥＨＨＳＤ－１０７）；
Ｎ末端エピトープ（配列番号２ ２４６－ＥＰＲＫＧＦＭＹＳＲＮＴＮＥ－２５９）；
Ｎ末端及び膜貫通ドメイン１を含む（配列番号３ ３０１－ＲＳＣＬＩＨＴＳＥＫ ＫＡＥＩＰＰＫＴＹＳ ＬＱＩＡＷＶＧＧＦＩ ＡＩＳＩＩＳＦＬＳＬ ＬＧＶＩＬＶＰＬＭＮ－３５０）；
Ｎ末端（配列番号４ ３０３－ＣＬＩＨＴＳＥＫＫＡＥＩＰ－３１５）；
Ｎ末端、（配列番号５ １２９－ＨＳＨＨＮＨＡＡＳＧＫＮＫＲＫＡＬＣＰＤＨＤＳＤＳＳＧＫＤＰＲＮＳＱＧＫＧＡＨＲＰＥＨＡＳＧＲＲＮＶＫＤＳＶＳＡＳＥＶＴＳＴＶＹＮＴＶＳＥＧＴＨＦＬＥＴＩＥＴＰＲＰＧＫＬＦＰＫＤＶＳＳＳＴＰＰＳＶＴＳＫＳＲＶＳＲＬＡＧＲＫＴＮＥＳＶＳＥＰＲＫＧＦＭＹＳＲＮＴＮＥＮＰＱＥ－２６３）；
Ｎ末端、（配列番号６ ２８８－ＮＹＬＣＰＡＩＩＮＱＩＤＡＲＳＣＬＩＨＴＳＥＫＫＡＥＩＰＰＫＴＹＳＬＱＩＡＷＶＧＧＦＩＡＩＳＩＩＳＦ－３３７）；
細胞外ループＴＭ２－３（配列番号７ ３８２－ＡＳＨＨＨＳＨＳＨＥＥＰＡＭＥＭＫＲＧＰＬＦＳＨＬＳＳＱＮＩＥＥＳＡＹＦＤＳＴＷＫ－４２３）；
細胞外ループＴＭ４－５（配列番号８ ６１９－ＴＥＧＬＳＳＧ－６２５）；
細胞外ループＴＭ６－７（配列番号９ ６８０－ＨＹＡＥＮＶＳＭ－６８７）；
細胞外Ｃ末端（配列番号１０ ７４８－ＫＩＶＦＲＩＮＦ－７５５）；
最も好ましくは、前記抗体は、輸送体のＮ末端全体に関して、すなわち切断事象より前に付番された以下の基準座標の間で、ＺＩＰ１０の以下のＥＣＤの少なくとも１つを結合する。

Ｎ末端、（配列番号１１ ４６－ＬＥＰＳＫＦＳＫＱＡＡＥＮＥ－５９）；
Ｎ末端（配列番号１２ １６４－ＥＫＥＴＶＥＶＳＶＫＳＤＤＫＨＭＨＤＨＮＨＲＬＲＨＨＨＲＬＨＨＨＬＤＨＮＴＨＨＦＨＮＤＳＩＴＰＳＥＲＧＥＰＳＮＥＰＳＴＥＴＮＫＴＱＥＱＳＤＶＫＬＰＫＧＫＲＫＫＫＧＲＫＳＮＥＮＳＥＶＩＴＰＧＦＰ－２５３）；
Ｎ末端、（配列番号１３ ２９５－ＱＤＬＤＰＤＮＥＧＥＬＲＨＴＲＫＲＥＡＰＨＶＫＮＮＡＩＩＳＬＲ－３９５）
Ｎ末端、（配列番号１４ ３６－ＬＨＲＱＨＲＧＭＴＥＬＥＰＳＫＦＳＫＱＡＡＥＮＥＫＫＹＹＩＥＫＬＦＥＲＹＧＥＮＧＲＬＳＦＦＧＬＥＫＬ－８５）
細胞外ループＴＭ２－３（配列番号１５ ４６５－ＧＧＨＤＨＳＨＱＨＡＨＧＨＧＨＳＨＧＨＥＳＮＫＦＬＥＥＹＤＡＶＬＫ－４９７）；
細胞外ループＴＭ４－５（配列番号１６ ６９３－ＳＡＧＬＴＧＧ－６９９）；
細胞外ループＴＭ６－７（配列番号１７ ７５４－ＱＹＡＮＮＩＴＬＷＮ－７６２）；
細胞外ループＣ末端（配列番号１８ ８２４－ＫＩＶＦＤＩＱＦ－８３１）。

さらにより好ましくは、前記抗体は、表１に示されている、ＺＩＰ６Ｍ、ＺＩＰ６Ｙ、ＺＩＰ６ＡＭ、ＺＩＰ６Ｘ、ＺＩＰ６Ｒ、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ａ、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ｂ、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ｃ、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ｄ、ＬＩＶ－１／ＺＩＰ６抗体、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ｅ、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ｆ、ＺＩＰ６２－Ａ、ＺＩＰ１０、抗ＳＬＣ３９Ａ１０^ａ、抗ＳＬＣ３９Ａ１０^ｂ、ＳＬＣ３９Ａ１０^ａ、抗ＳＬＣ３９Ａ１０^ｃ及びＳＬＣ３９Ａ１０^ｂ抗体を含む群から選択される。最も好ましくは、前記抗体又はその断片は、ＺＩＰ６Ｙ、ＺＩＰ６ＡＭ、ＺＩＰ１０及び抗ＳＬＣ３９Ａ１０^ａを含む群から選択される。

本発明の第１の態様のさらに好ましい実施形態において、前記抗体又はその断片の少なくとも２つは組み合わせで使用され、この組み合わせにおいて、少なくとも１つはＺＩＰ６輸送体の少なくとも一部を結合し、１つはＺＩＰ１０輸送体の少なくとも一部を結合する；あるいは、ＺＩＰ６：ＺＩＰ１０ヘテロ二量体を結合してその機能を阻害する単一の抗体が使用される。

本明細書における過剰増殖性障害への言及は、良性であるか又は病的であるかを問わず、所与の細胞又は組織型に対して許容され得る又は正常なレベルと見なされるレベルと比較して異常に高いレベルの細胞増殖を特徴とし、当業者によって容易に認識及び理解されるであろう任意の障害を指す。過剰増殖性障害の例としては、癌及び固形腫瘍、リンパ腫又は白血病、乳癌、前立腺癌、結腸癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、腎臓癌；黒色腫などのその様々な形態；多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）及び関連する嚢胞性腎疾患；過形成、化生及び異形成ならびにそれらの様々な形態；免疫系の増殖性障害（骨髄及びリンパ増殖性障害など）；前立腺肥大症；子宮内膜症；乾癬；組織修復及び異常な創傷治癒；ならびに線維症、例えば、肺線維症、特発性肺線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、血管狭窄又は脊柱管狭窄、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性巨大線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド又は陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性硬化症、関節線維症及び癒着性関節包炎などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の好ましい実施形態において、前記過剰増殖性障害は癌である。最も好ましくは、本明細書において言及される癌には、以下の癌：鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリン産生腫瘍、褐色細胞腫、プロラクチン産生腫瘍、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル－リンダウ病、ゾリンジャー－エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、消化管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポシ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴン産生腫瘍、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛性癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌及び扁桃癌の任意の１つ又はそれより多くが含まれる。

好ましい実施形態において、前記癌は、固形腫瘍、リンパ腫又は白血病、食道癌、乳癌、前立腺癌、腎細胞癌腫、転移性乳癌及び胃癌、結腸癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌及び腎臓癌を含む又はこれらからなる群から選択される。

抗有糸分裂剤は、満たされていない臨床的ニーズを有する癌、又は臨床的予後／転帰が悪い癌の処置又は予防に特に有用である。これには、化学療法耐性癌、転移性癌、現在処置が困難な癌、例えば膵臓及び非小細胞肺癌腫、トリプルネガティブ乳癌、ホルモン耐性乳癌、黒色腫、特にＢ－ｒａｆ阻害剤に耐性のものが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の第２の態様によれば、本明細書で定義される抗有糸分裂剤を薬学的又は獣医学的に許容され得る賦形剤又は担体とともに含む、過剰増殖性障害、最も好ましくは癌の処置において使用するための薬学的組成物又は獣医学的組成物が提供される。

適切な薬学的賦形剤は、当業者に周知である。薬学的組成物は、任意の適切な経路、例えば、経口、直腸、鼻、気管支（吸入）、局所（点眼剤、頬側及び舌下を含む）、膣又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）投与による投与のために製剤化され得、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。

組成物は、本明細書で定義された抗体を担体と混ぜることによって調製され得る。一般に、製剤は、抗体を液体担体又は細かく分割された固体担体又はその両方と均一かつ緊密に混ぜ、次いで、必要であれば生成物を成形することによって調製される。本発明は、本明細書で定義される抗体を、薬学的又は獣医学的に許容され得る、担体又はビヒクルと併せる又は混ぜることを含む、薬学的組成物を調製するための方法に及ぶ。

本発明における経口投与のための製剤は、それぞれが所定量の活性作用物質を含有するカプセル、サシェ若しくは錠剤などの個別の単位として；散剤又は粒剤として；水性液体若しくは非水性液体中の活性作用物質の溶液若しくは懸濁液として；又は水中油型液体エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョンとして；又はボーラスなどとして提示され得る。

経口投与用の組成物（例えば、錠剤及びカプセル）の場合、「許容され得る担体」という用語は、一般的な賦形剤、例えば結合剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース及びデンプンなどのビヒクル；充填剤及び担体、例えばコーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウム及びアルギン酸；ならびにステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム及びその他のステアリン酸金属塩、ステアリン酸グリセロール、ステアリン酸、シリコーン流体、タルクワックス、油及びコロイド状シリカなどの潤滑剤を含む。ペパーミントなどの香味剤、冬緑油、サクランボ香味剤なども使用することができる。剤形を容易に識別可能にするために着色剤を添加することが望ましいことがあり得る。錠剤はまた、当技術分野で周知の方法によってコーティングされ得る。

錠剤は、圧縮又は成形によって作製され得、１つ又はそれより多くの補助成分を含んでもよい。圧縮された錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤又は分散剤と混合されていてもよい散剤又は粒剤などの自由流動形態の活性作用物質を適切な機械中で圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末化された化合物の混合物を適切な機械中で成形することによって作製され得る。錠剤は、コーティングされてもよく又は刻み目が付けられてもよく、活性作用物質の徐放又は制御放出を提供するように製剤化され得る。

経口投与に適した他の製剤には、着香された基剤、通常はスクロース及びアラビアゴム又はトラガカント中に活性作用物質を含むロゼンジ；ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアラビアゴムなどの不活性基剤中に活性作用物質を含むトローチ；及び適切な液体担体中に活性作用物質を含む洗口剤が含まれる。

非経口製剤は一般に無菌である。

皮膚への局所適用のために、組成物は、クリーム、軟膏、ゼリー、溶液又は懸濁液などへ構成され得る。薬物に使用され得るクリーム又は軟膏製剤は、例えば、英国薬局方などの薬学の標準的な教科書に記載されているような当技術分野で周知の従来の製剤である。

治療上有効な本明細書で定義される組成物の正確な量、及びそのような化合物が最良に投与される経路は、当業者によって容易に決定される。そのような量は、当然のことながら、処置されている具体的な症状、症状の重症度、年齢、身体状態、サイズ及び体重を含む個々の患者パラメータ、処置の期間、併用療法の性質（もし存在すれば）、具体的な投与経路、ならびに医療従事者の知識及び専門知識に属する同様の要因に依存する。これらの要因は当業者に周知であり、日常的な実験のみで対処することができる。個々の成分又はそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、健全な医学的判断による最も高い安全用量が使用されることが一般に好ましい。しかしながら、医学的理由、心理学的理由、又は任意の他の理由のために、患者は、より低い用量又は耐容され得る用量を求め得ることが当業者によって理解されよう。他の要因には、所望の処置期間が含まれる。適用された初期用量において対象における応答が不十分である場合には、より高い用量（又は異なる、より局所的な送達経路による効果的により高い用量）が、患者の耐容性が許容する程度まで使用され得る。

本発明の第３の態様によれば、少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせて上記抗有糸分裂剤を含む、過剰増殖性障害の処置において使用するための併用治療薬が提供される。

限定されるものではないが、このような作用物質の例としては、原発性病変を標的とすること又は後期疾患進行を抑制することを目的とした第一選択の又は補助の、抗ホルモン、放射線又は化学療法剤；例えば、抗ＨＥＲ２剤、例えばトラスツズマブ及びペルツズマブ、ならびに標準的な補助療法レジメン、例えば５－フルオロウラシル、ドキソルビシン及びシクロホスファミド（ＦＡＣ）；５－フルオロウラシル、エピルビシン及びシクロホスファミド（ＦＥＣ）；及びドキソルビシン及びシクロホスファミド（ＡＣ）；シクロホスファミド、メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（ＣＭＦ）；及びドセタキセル、ドキソルビシン、シクロホスファミド（ＴＡＣ）が挙げられる。本発明の化合物と組み合わせて使用するための他の適切な作用物質は、ベバシズマブ（アバスチン）などの抗血管新生／抗転移剤である。

本発明のさらなる態様によれば、過剰増殖性障害を処置する方法であって、過剰増殖性障害を有する又は有することが疑われる対象に、本発明に記載の抗有糸分裂剤又は抗有糸分裂組成物又は併用治療薬が投与される、方法が提供される。

本発明のこの態様の好ましい実施形態において、前記対象は哺乳動物である。理想的には、前記哺乳動物は霊長類である。より理想的には、前記哺乳動物は、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、有蹄動物、又は任意の他の家庭用若しくは農業用の種である。最も理想的には、前記哺乳動物はヒトである。

当業者によって理解されるように、前記方法は、癌及び固形腫瘍、リンパ腫又は白血病、乳癌、前立腺癌、結腸癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌及び腎臓癌などのその様々な形態；多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）及び関連する嚢胞性腎疾患；黒色腫；過形成、化生及び異形成ならびにそれらの様々な形態；免疫系の増殖性障害（骨髄及びリンパ増殖性障害など）；前立腺肥大症；子宮内膜症；乾癬；組織修復及び異常な創傷治癒；ならびに線維症、例えば、肺線維症、特発性肺線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、血管狭窄又は脊柱管狭窄、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性巨大線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド又は陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性硬化症、関節線維症及び癒着性関節包炎などの、但しこれらに限定されない、疑われる又は診断された過剰増殖性障害が存在する多数の疾患状況において使用することができる。

本発明の好ましい実施形態において、前記過剰増殖性障害は癌である。最も好ましくは、本明細書において言及される癌には、以下の癌：鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリン産生腫瘍、褐色細胞腫、プロラクチン産生腫瘍、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル－リンダウ病、ゾリンジャー－エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、消化管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポシ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴン産生腫瘍、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛性癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌及び扁桃癌の任意の１つ又はそれより多くが含まれる。

本発明の好ましい方法において、前記癌は、食道癌、乳癌、前立腺癌、腎細胞癌腫、転移性乳癌及び胃癌を含む又はこれらからなる群から選択される。

抗有糸分裂剤は、満たされていない臨床的ニーズを有する癌、又は臨床的予後／転帰が悪い癌の処置又は予防に特に有用である。これには、化学療法耐性癌、転移性癌、現在処置が困難な癌、例えば膵臓及び非小細胞肺癌腫、トリプルネガティブ乳癌、ホルモン耐性乳癌、黒色腫、特にＢ－ｒａｆ阻害剤に耐性のものが含まれるが、これらに限定されない。

本発明のさらなる態様によれば、ＺＩＰ１０に対して特異的である抗体又はその断片であって、前記抗体は、ＺＩＰ１０輸送体のエピトープＮ末端４６～５９アミノ酸ＬＥＰＳＫＦＳＫＱＡＡＥＮＥ（配列番号１１）に対して特異的である、抗体又はその断片が提供される。

本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関連して説明されているとおりであり得る。

本明細書の説明及び特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語ならびにこれらの用語の変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味し、他の部分、添加剤、成分、整数又は工程を排除しない。本明細書の説明及び特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の必要がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈上別段の必要がない限り、本明細書は単数だけでなく複数も想定していると理解されるべきである。

本明細書で引用されている任意の特許又は特許出願を含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる参考文献も先行技術を構成することを認めるものではない。さらに、先行技術のいずれかが当技術分野における通常の一般的知識の一部を構成することを認めるものではない。

本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲及び図面を含む）に開示された特徴の任意の新規の１つ又は任意の新規の組み合わせに及ぶ。したがって、本発明の特定の態様、実施形態又は実施例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物又は化学部分は、これらと整合しない場合を除き、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態又は実施例に適用可能であると理解されるべきである。

さらに、特に明記しない限り、本明細書に開示される任意の特徴は、同一の又は同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられ得る。

ここで、以下の実施例及び以下の図面を参照しながら、本発明を単に例として説明する。

図１Ａ～１Ｆは、有糸分裂のためにＺＩＰ６が必要であることを示す。細胞分裂周期を同期させるための１００ｎＭノコダゾールでの２０時間のＺＩＰ６－Ｙ抗体処理は、有糸分裂細胞（ｐＳ１０ヒストンＨ３陽性、赤色）の数を濃度依存的に有意に減少させる（図１Ａ）。 ＦＡＣＳ細胞周期分析により、ＺＩＰ６－Ｙ抗体（１：２０）で処理されたＭＣＦ－７細胞におけるＧ２／Ｍ集団の著しい減少が明らかとなっている。 ＭＤＡ－４３６細胞におけるＺＩＰ６－Ｙ抗体による１００ｎＭノコダゾールでの２０時間の処理が、有糸分裂細胞の数を有意に減少させることを示す（ｐＳ１０ヒストンＨ３陽性、赤色）。 ＭＤＡ－２３１細胞（Ｄ）におけるＺＩＰ６－Ｙ抗体による１００ｎＭノコダゾールでの２０時間の処理が、有糸分裂細胞の数を有意に減少させることを示す（ｐＳ１０ヒストンＨ３陽性、赤色）。 ２４時間の血清枯渇によって同期化されたＭＣＦ－７細胞を、同期化後に有糸分裂に入るために要する時間である血清置換の３０時間後に固定した。有糸分裂数、すなわちｐＳ１０ヒストンＨ３についての陽性（赤色）は、ＺＩＰ６－Ｙ抗体処理（１：１０）に起因する有糸分裂細胞の数の著しい減少を示す。 形質移入された細胞に対するＦＡＣＳ細胞周期分析は、ＺＩＰ６で形質移入されたときのＧ２／Ｍの著しい増加を示す。少なくとも３つの独立した実験の結果が、平均±標準偏差として示されている。図１Ａ、図１Ｃ及び図１Ｄについては、統計学的有意性はノコダゾール処理試料と比較されている。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー、２５μｍ。 図２Ａ～２Ｅは、有糸分裂のためにＺＩＰ６：ＺＩＰ１０ヘテロ二量体が必要であることを示す。ＦＡＣＳ細胞周期分析により、対照と比較して、ノコダゾール処理細胞におけるＧ２／Ｍ集団の増加が明らかとなっている（図２Ａ）。３つの独立した実験の結果が、平均±標準偏差として示されている。統計的有意性は、スチューデントのｔ検定によって決定される。＊＊＊ｐ＜０．００１。 ノコダゾール処理されたＭＣＦ－７細胞において本発明者らのＺＩＰ６－Ｙ又は本発明者らのＺＩＰ１０抗体のいずれかを単独で使用した対照ＰＬＡは、図３Ｄと比較して、有糸分裂細胞においてわずかな点しか生じない（矢印）。スケールバー、２０μｍ。 ＺＩＰ６野生型（ＷＴ）で形質移入された細胞におけるＶ５抗体での免疫沈降及びＺＩＰ１０についてのプロービングは、対照ＩｇＧレーンには存在しない組換えＺＩＰ６とＺＩＰ１０の結合を実証する。 ＦＡＣＳ細胞周期分析により、同じ皿からの接着細胞と比較して、有糸分裂シェイクオフ技術を使用して収集された非接着細胞におけるＧ２／Ｍ集団の増加が確認される。３つの独立した実験の結果が、平均±標準偏差として示されている。統計的有意性は、スチューデントのｔ検定によって決定される。＊＊＊ｐ＜０．００１。 ノコダゾールで処理されたＭＣＦ－７細胞において、ＺＩＰ６－ＳＣ及びｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３抗体を一緒に、ならびに個々の対照ＺＩＰ６－ＳＣ及びｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３抗体を使用したＰＬＡは、図５Ｆと比較してわずかな点しか生成しない。３つの独立した実験の結果が、平均±標準偏差として示されている。 図３Ａ～３Ｆは、有糸分裂に対するＺＩＰ６：ＺＩＰ１０ヘテロ二量体の必要性を示す。１００ｎＭノコダゾールでの２０時間のＺＩＰ１０抗体処理が、有糸分裂細胞（ｐＳ１０ヒストンＨ３陽性、赤色）の数を濃度依存的に有意に減少させている（図３Ａ）スケールバー、２５μｍ。 ＦＡＣＳ細胞周期分析により、ＺＩＰ１０抗体（１：２０）で処理されたＭＣＦ－７細胞におけるＧ２／Ｍ集団の著しい減少が明らかとなっている。 １００ｎＭのノコダゾールによる２０時間のＭＤＡ－４３６細胞におけるＺＩＰ１０抗体処理は、有糸分裂細胞（ｐＳ^１０ヒストンＨ３陽性、赤色）の数を濃度依存的に有意に減少させる。 １００ｎＭのノコダゾールによる２０時間のＭＤＡ－２３１細胞（Ｄ）におけるＺＩＰ１０抗体処理は、有糸分裂細胞（ｐＳ^１０ヒストンＨ３陽性、赤色）の数を濃度依存的に有意に減少させる。 ノコダゾール処理されたＭＣＦ－７細胞においてＺＩＰ６－Ｙ及びＺＩＰ１０抗体を使用する近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）は、非有糸分裂細胞と比較して有糸分裂細胞において増加した点を生成する（白い矢印）。スケールバー、１５μｍ。 細胞増殖は、本発明者らのＺＩＰ６－Ｙ又はＺＩＰ１０抗体のいずれかによる処理によって有意に抑制される。少なくとも３つの独立した実験の結果が、平均±標準偏差として示されている。図３Ａ、図３Ｃ及び図３Ｄについては、統計学的有意性はノコダゾール処理試料と比較されている。図３Ｆについては、統計学的有意性は対照（Ｃｏｎ）と比較されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図４Ａ～４Ｄは、有糸分裂におけるＳＴＡＴ３の関与を示す。ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３（緑色）、ｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３（緑色）、α－チューブリン（赤色）及びｐＳ^１０ヒストンＨ３（赤色）についてＴＡＭＲ細胞を免疫染色し、ＤＡＰＩ（青色）で対比染色した（図４Ａ）。上パネル：有糸分裂細胞（矢印）は、ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３について陽性である。中央パネル：矢印は、ｐＳ１０ヒストンＨ３について陰性であるが、依然としてｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３について陽性である細胞質分裂中の細胞を示す。下パネル：有糸分裂細胞は、ｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３について陰性である。矢印は、細胞膜上のｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３染色を示す。スケールバー、２０μｍ。 図６ＤからのＧＡＰＤＨ値に対して正規化されたｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３、ｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３及びｐＳ^１０ヒストンＨ３の濃度測定データが、平均±標準偏差として示されている。 蛍光顕微鏡法は、有糸分裂細胞周期期の間にｐＳ^３８ＳｔａｔｈｍｉｎとｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の共局在を示すが、間期には示さない。スケールバー、１０μｍ。 図６Ｆと比較して、ｐＳ^３８Ｓｔａｔｈｍｉｎ抗体のみを使用した対照ＰＬＡは、有糸分裂細胞においてわずかな点しか生じない（矢印）。スケールバー、１５μｍ。 図５Ａ～５Ｋは、ＺＩＰ６及びＺＩＰ１０が、有糸分裂において亜鉛によって引き起こされたｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３を結合することを示す。ＺＩＰ６－ＳＣ（赤色）、ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）について染色された、接着細胞の平坦な部分（ｐｌａｉｎ）の上にある有糸分裂ＭＣＦ－７細胞は、ＺＩＰ６及びｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３について濃縮されている（図５Ａ）。スケールバー、２０μｍ。 １００ｍＭノコダゾールで処理された有糸分裂ＭＣＦ－７細胞における、ＺＩＰ６－ＳＣ抗体を使用したｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３及びＺＩＰ６（６８ｋＤａバンド）の増加、ならびにｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３の減少（ｐＳ^１０ヒストンＨ３染色）。 無血清培地中２０μＭ亜鉛（Ｚｎ）及び１０μＭピリチオン（Ｐ）で２０分間処理されたＭＣＦ－７細胞は、ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の亜鉛依存性の著しい増加及びｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３の対応する減少を示す。 ５μＭフルオジン－３を負荷されたＭＣＦ－７細胞は、有糸分裂細胞中でのみ増加した緑色蛍光を有し（白い矢印）、総細胞蛍光は統計学的に有意な増加を確認する。スケールバー、１５μｍ。 接着性集団と非接着性集団に分離され、５μＭフルオジン－３を負荷されたノコダゾール処理ＭＣＦ－７細胞のＦＡＣＳ分析は、増加した緑色蛍光を示す。 ノコダゾール処理ＭＣＦ－７細胞においてＺＩＰ６－ＳＣとｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３抗体を使用するＰＬＡは、ＺＩＰ６－ＳＣとｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３抗体とは対照的に、有糸分裂細胞においてのみ有意に増加した数の点を生成する（白い矢印）。黄色の矢印は、細胞質分裂では点がより少ないことを示す。 ノコダゾール処理ＭＣＦ－７細胞においてＺＩＰ１０とｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３抗体を使用するＰＬＡは、有糸分裂細胞において増加した点（白い矢印）を生成する。スケールバー、１５μｍ。 異なる種におけるＺＩＰ６配列の模式図は、予測されるＳＴＡＴ３結合部位ＹＥＳＱ（緑色の枠）の保存を示す。 ＺＩＰ６中のＳＴＡＴ３結合部位付近の変異した残基の模式図。 全てＣ末端Ｖ５タグを有する、ＺＩＰ６野生型（ＷＴ）又は配列が検証された変異体で形質移入された細胞におけるＶ５抗体による免疫沈降は、Ｓ４７５Ａ及びＹ４７３Ａ変異体におけるｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３への結合の有意な減少を実証する。 異なる種におけるＺＩＰ１０配列の模式図は、予測されたＳＴＡＴ３結合部位ＹＫＱＱ（緑色の枠）の保存を実証する。少なくとも３つの独立した実験の結果が、平均±標準偏差として示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図６Ａ～６Ｆは、有糸分裂全体を通じてのｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の増加及びｐＳｔａｔｈｍｉｎへのその結合を示す。ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３（緑色）は、間期と比較して、ＤＡＰＩ（青色）及びα－チューブリン（赤色）で染色されたＴＡＭＲ細胞中の有糸分裂の全ての段階で増加している（図６Ａ）。スケールバー、１２μｍ。 乳癌組織の隣接するスライス片は、同じ有糸分裂細胞中でｐＳ^１０ヒストンＨ３及びｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の両方を示す。 ｐＳ^１０ヒストンＨ３及びｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の両方が、正常なマウス腸の陰窩内の有糸分裂細胞中に存在する。 ノコダゾールで１９時間前処理されたＴＡＭＲ細胞における１時間の亜鉛（亜鉛キレート剤ＴＰＥＮ）又はＳＴＡＴ３阻害剤の減少は効果を有さないが、亜鉛処理された試料はｐＳ^１０ヒストンＨ３及びｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３及び完全長ＳＴＡＴ３バンドを解く。 １００ｎＭのノコダゾールで１９時間に加えて１００μＭの亜鉛及び１０μＭのピリチオンで０～６０分間処理されたＴＡＭＲ細胞中で、有糸分裂の計数（ｐＳ^１０ヒストンＨ３について陽性）を実施した。１５分間の亜鉛処理は、有糸分裂を通じて進行するのに十分である。 ノコダゾールで処理されたＭＣＦ－７細胞においてｐＳ^３８Ｓｔａｔｈｍｉｎ及びｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３抗体を使用したＰＬＡは、有糸分裂細胞においてのみ点の増加を生じる（白い矢印）。スケールバー、２０μｍ。少なくとも３つの独立した実験の結果が、平均±標準偏差として示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図７Ａ～７Ｅは、有糸分裂中のＺＩＰ６のＮ末端切断を示す。図７Ａの模式図は、切断１（ＰＭ再配置）及び切断２（有糸分裂）後に得られたＺＩＰ６抗体エピトープ位置（Ｍ、Ｙ及びＳＣ）及びバンドサイズを示す。 ノコダゾールで処理された接着細胞及び非接着細胞は、増加したｐＳ^１０ヒストンＨ３、ならびに増加したＺＩＰ６バンド６８ｋＤａ（ＳＣ及びＹ抗体）、４８ｋＤａ（ＳＣ抗体）及び１５ｋＤａ（Ｙ抗体）を有する。 １００ｎＭのノコダゾールで２０時間処理され、１～２時間回復させたＭＣＦ－７細胞は、有糸分裂の進行を示し（ｐＳ^１０ヒストンＨ３について陽性）、１５ｋＤａ（ＺＩＰ６－Ｙ抗体）を含むＺＩＰ６バンドと酷似しており、切断２と合致する。 ｐＳ^１０ヒストンＨ３（緑色、矢印）、ＺＩＰ６－Ｙ（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）について染色されたＭＣＦ－７細胞は、分裂期前（パネル１～２）でのＺＩＰ６－Ｙの存在ならびに中期（パネル２）及び後期（パネル３）の両期でのＺＩＰ６－Ｙの非存在を実証する。スケールバー、２０μｍ。 亜鉛を細胞中に取り込み、有糸分裂を推進する（１，２）ＺＩＰ６：ＺＩＰ１０ヘテロ二量体のモデルを示す模式図。取り込まれた亜鉛は、ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の形成を引き起こし（３）、ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３は、ＺＩＰ６及びＺＩＰ１０（４）ならびにｐＳ^３８Ｓｔａｔｈｍｉｎ（５）を結合し、有糸分裂のために必要とされるｐＳ^３８Ｓｔａｔｈｍｉｎ駆動微小管再編成にｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３を連関させる。 Ｎ末端領域及び本発明による結合のための細胞外ループを示すＺＩＰ６タンパク質配列（配列番号１９）。 Ｎ末端領域及び本発明による結合のための細胞外ループを示すＺＩＰ１０タンパク質配列（配列番号２０）。 黒色腫細胞における有糸分裂のＺＩＰ６及びＺＩＰ１０抗体阻害。ＺＩＰ６Ｙ又はＺＩＰ１０抗体あり又はなしで、ＳＫ－ＭＥＬ－２９細胞を１５０ｎＭのノコダゾールで１８時間処理した。ｐＳ^１０ヒストンＨ３（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）について細胞を染色した。各集団の代表的な画像を示す。スケールバー：１０μｍ。グラフは、平均±標準誤差として表される有糸分裂中の細胞の百分率を示す（ｎ＝３）。統計的有意性は、ノコダゾール単独で処置された集団と比較して、ＡＮｏＶＡを用いて測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１； 前立腺癌細胞における有糸分裂のＺＩＰ６及びＺＩＰ１０抗体阻害。ＺＩＰ６Ｙ又はＺＩＰ１０抗体あり又はなしで、ＤＵ１４５細胞を１５０ｎＭノコダゾールで１８時間処理した。ｐＳ^１０ヒストンＨ３（赤色）及びＤＡＰＩ（青色）について細胞を染色した。各集団の代表的な画像を示す。スケールバー：２０μｍ。グラフは、平均±標準誤差として表される有糸分裂中の細胞の百分率を示す（ｎ＝３）。統計的有意性は、ノコダゾール単独で処置された集団と比較して、ＡＮｏＶＡを用いて測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１； 図１２Ａ～１２Ｃは、ＺＩＰ６Ｙ及びＺＩＰ１０抗体の両方を使用した、ＭＣＦ－７細胞における有糸分裂のＺＩＰ６及びＺＩＰ１０複合抗体阻害を示す。ＺＩＰ６抗体若しくはＺＩＰ１０抗体又はこれら２つの混合物あり又はなしで、ＭＣＦ７細胞を１５０ｎＭのノコダゾールで１８時間処理した（図１２Ａ）。 有糸分裂中の細胞の５０％の減少（ピンクの線）を与える用量から得られる有糸分裂中の細胞の観察された百分率から使用された各抗体の量を判断した。ｐＳ^１０ヒストンＨ３（赤）及びＤＡＰＩ（青）について細胞を染色した。各集団の代表的な画像を示す。角括弧は、２つの抗体の合計濃度を示す。スケールバー：１０μｍ。 有糸分裂中の細胞の百分率が平均±標準誤差として示されている（ｎ＝３）。統計的有意性は、両抗体で処置された集団と比較して、ＡＮｏＶＡを用いて測定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１； ２８日にわたるＭＣＦ－７細胞における細胞分裂のＺＩＰ６抗体阻害。週に２回、合計２８日間培地を交換した時点で、ＭＣＦ－７細胞をＺＩＰ６Ｙ抗体で処理した。コールターカウンターを用いて総細胞数を計数し、細胞を毎週採取した。グラフは平均±標準誤差を表す（ｎ＝３）。 ＺＩＰ６Ｙ抗体注射は、トリプルネガティブ乳癌腫瘍をインビボで５０％超遅延させる。ＭＤＡ２３１トリプルネガティブ乳癌細胞を注射されたマウスは腫瘍を発症し、その後、マウスに抗体又は対照を４日ごとに２０日間注射し、腫瘍体積を測定した。ＺＩＰ６処理された腫瘍の成長は、２０日間で、ＰＢＳ対照と比較して５０％減少し、非処置と比較して６６％減少した。

表１．Ｎ末端ＺＩＰ６及びＺＩＰ１０抗体のリスト。

材料及び方法
材料、抗体及び処置
使用された抗体は、ＺＩＰ６－Ｙ及びＺＩＰ１０（自社）；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＺＩＰ６－ＳＣ（Ｅ－２０、ＳＣ－８４８７５）、ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３（ＳＣ－８００１－Ｒ及びＳＣ－１３６１９３）、ｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３（ＳＣ－７９９３－Ｒ）、総ＳＴＡＴ３（ＳＣ－８０１９）及びＧＡＰＤＨ（ＳＣ－３２２３３）；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのα－チューブリン（ＤＭ１Ａ、＃３８７３Ｓ）、ｐＳ^１０ヒストンＨ３（＃９７０６Ｓ及び＃３３７７）及びｐＳ^３８Ｓｔａｔｈｍｉｎ（＃４１９１）；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのマウスＶ５；ＡｂｃａｍからのウサギＶ５（Ａｂ９１１６）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈからのβ－アクチン（Ａ５３１６）であった。

使用された処理は、１００ｎｇ／ｍＬのノコダゾール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ１４０４）２０時間、２００μＭのＳＴＡＴ３阻害剤細胞透過性ペプチド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、５７３０９６）、及び１０μＭのピリチオンナトリウムを含む２０～１００μＭの亜鉛（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び２５又は５０μＭのＴＰＥＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。

細胞株及び免疫組織化学
ＭＣＦ－７細胞及びＭＣＦ－７細胞から発達させたタモキシフェン耐性細胞（ＴＡＭＲ）（１）を以前に記載されたとおりに（２）培養した。ホルマリン固定パラフィン包埋乳癌試料を脱脂し、再水和した後、ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３（ＳＣ－８００１－Ｒ、１／６５０）又はｐＳ^１０ヒストンＨ３（＃３３７７、１／３０）抗体とともに２時間インキュベートし、Ｄａｋｏ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＃Ｋ４０１１試薬で検出した。ＥＤＴＡを加えたＴｒｉｓ塩基中、ｐＨ９で２分間の加圧調理器を抗原賦活化のために使用した。使用した原乳癌材料は、適切な倫理的承認を有した（ＲＥＣ参照番号Ｃ２０２０３１３）。マウス腸組織の免疫組織化学は以前に記載されている（３）。

プラスミド及び形質移入
ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯを使用した、Ｃ末端Ｖ５タグを有するＺＩＰ６／ＬＩＶ－１／ＳＬＣ３９Ａ６（４）及びＺＩＰ７／ＨＫＥ４（５）のための組換え構築物の生成は、以前に記載されている。上記プラスミドからＺＩＰ６変異体（Ｙ４７３Ａ、Ｓ４７１Ａ、Ｓ４７５Ａ及びＳ４７８Ａ、Ｓ４７９Ａ）を生成し、配列決定によって確認した。記載されるように（６）、１６時間、リポフェクタミンー２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞を形質移入した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング及び免疫沈降。

細胞を採集し、ＰＢＳで洗浄し、哺乳動物細胞用のプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｎａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びホスファターゼ阻害剤（２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム及び５０ｍＭフッ化ナトリウム）を含む溶解緩衝液ｐＨ７．６（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＧＴＡ及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で４℃で１時間溶解した。タンパク質は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ／Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素－結合タンパク質マイクロアッセイを使用して測定した。３つの別々の実験からの４０μｇ／レーンのウェスタンブロット結果をＧＡＰＤＨ値に対して正規化した。免疫沈降のために、洗浄及びＳＤＳ－Ｐａｇｅより前に、５００μｇのタンパク質を５μｇの抗体とともに一晩、２０μｌのＥＺｖｉｅｗ Ｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）とともに４時間インキュベートした。

蛍光顕微鏡法及びＦＡＣＳ分析
形質移入の前に、厚さ０．１７ｍｍのカバーガラス上で１×１０^５個の細胞を５～７日間成長させた。カバーガラスを固定し、前述のように（７）処理した。亜鉛画像化のために、細胞に５μＭ Ｆｌｕｏｚｉｎ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３７℃で３０分間負荷した。Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅを用いたＦＡＣＳ分析では、有糸分裂シェイクオフによって回収された非接着細胞及びトリプシン処理によって採集された接着細胞に５μＭ Ｆｌｕｏｚｉｎ－３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３０分間負荷し、続いて培地中で３０分間回収した。細胞周期分析では、細胞を７０％エタノール中で一晩固定し、続いてＦＡＣＳ分析の前に、０．２μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ＲＮａｓｅＡを加えた２０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００による３７℃で２０分間のＤＮＡ染色を行い、Ｗａｔｓｏｎプラグマティックアルゴリズムを用いてＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１０で分析した。スケールバーは１０μｍである。

近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）
８ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ、Ｆｉｓｈｅｒ）上の細胞を固定した後、以前に記載されたように（８）Ｄｕｏｌｉｎｋ ｒｅｄキット（Ｓｉｇｍａ）を使用してＰＬＡを行った。赤い蛍光の点は２分子結合を示す。少なくとも３つの異なる実験からの少なくとも１２の別個の画像を使用してＩｍａｇｅＴｏｏｌソフトウェア（Ｏｌｉｎｋ）によって細胞あたりのドットを決定し、平均値±標準誤差として提示した。

統計解析
統計解析は、スチューデントのｔ－検定、又は事後ダネット及びテイムヘイン検定を用いたＡＮＯＶＡのいずれかを使用して行った。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１として有意性を仮定した。エラーバーは、少なくとも３つの異なる実験による標準偏差（ＳＤ）である。

結果
有糸分裂のためのＺＩＰ６及びＺＩＰ１０の必要性。

本発明者らは、本発明者らのＺＩＰ６－Ｙ Ｎ末端抗体とともに細胞をインキュベートすることによって、有糸分裂開始におけるＺＩＰ６の役割を最初に発見した。微小管重合を遮断するノコダゾールで処理された細胞は、ｐＳ^１０ヒストンＨ３及びＤＡＰＩ染色によって判断されるように有糸分裂細胞の増加した百分率を有し（図１Ａ）、ＦＡＣＳ分析によってＧ２／Ｍ細胞の著しい増加を有する（図２）。本発明者らのＺＩＰ６－Ｙ抗体処理ありでのノコダゾールは、濃度依存的様式で有糸分裂を有意に減少させ（図１Ａ）、Ｇ２／Ｍ四倍体集団を減少させ（図１Ｂ）、ＺＩＰ６媒介性亜鉛流入の遮断を示唆した。

この効果は、２つのトリプルネガティブ（ＥＲ－、ＰＲ－及びＨｅｒ２－）乳癌細胞株（ＭＤＡ－４３６及びＭＤＡ－２３１；図１Ｃ及び図１Ｄ）、さらに黒色腫癌細胞株（ＳＫ－ＭＥＬ－２９；図１０）及び前立腺癌細胞株（ＤＵ１４５；図１１）において再現された。特に、この効果はインビボでも再現され、ＺＩＰ６阻害が、処置困難なトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）腫瘍の成長を対照と比較して５０％超遅延させることが実証された（図１３）。

微小管を安定化させ、これによって細胞がノコダゾール遮断を克服するのを補助することによってＺＩＰ６の遮断が機能したわけではないことを確認するために、本発明者らは、２４時間の血清枯渇による部分的な同期化の３０時間後に、細胞が有糸分裂に入る前にＺＩＰ６－Ｙ抗体を添加することによってノコダゾールなしでこの実験を繰り返したところ、有糸分裂を有意に減少させた（図１Ｅ）。さらに、ＬａｃＺ又はＺＩＰ７とは対照的に、ＺＩＰ６で形質移入された細胞は、接着細胞では２倍、非接着細胞では４倍、有糸分裂百分率を増加させ（図１Ｆ）、有糸分裂におけるＺＩＰ６の重要な役割をさらに確認した。

本発明者らは、ＺＩＰ６及びＺＩＰ１０がヘテロ二量体を形成することを示したので、本発明者らは、有糸分裂においてＺＩＰ１０がＺＩＰ６と同様に挙動するかどうかを試験した。本発明者らのＺＩＰ１０抗体とのノコダゾール処理された細胞のインキュベーションは、有糸分裂集団を同様に減少させ（図２Ａ）、ＦＡＣＳ分析によって確認され（図２Ｂ）、ＭＤＡ－４３６細胞（図２Ｃ）、ＭＤＡ－２３１細胞（図２Ｄ）、ＳＫ－ＭＥＬ－２９細胞（図１０）及びＤＵ１４５細胞（図１１）でも観察された。

ＺＩＰ６又はＺＩＰ１０阻害が有糸分裂を等しく防止したことに鑑みて、本発明者らは、近接ライゲーションアッセイを使用してＺＩＰ６及びＺＩＰ１０結合を試験したところ、有糸分裂細胞（図３Ｅ、４Ａ）における結合の濃縮が明らかにされ、続いてＺＩＰ１０についてプローブされたＺＩＰ６形質移入細胞におけるＶ５を用いた免疫沈降によってこの観察が確認された（図４Ｂ）。さらに、ＺＩＰ６－Ｙ又はＺＩＰ１０抗体による処理は、９６時間にわたって細胞増殖を有意に抑制し（図３Ｆ）、これらの亜鉛輸送体を遮断することが細胞分裂を防止することを実証し、これは最長２８日間でさえ当てはまることが示された（図１３）。

さらに、本発明者らは、組み合わせて使用されるブロッキングＺＩＰ６及びＺＩＰ１０の両方での処理を通じた、ＺＩＰ６／ＺＩＰ１０ヘテロ二量体の複合阻害の効果も調査した（図１２）。特に、併用処理は、いずれかの抗体単独と比較して有糸分裂のさらなる減少をもたらし、併用処理が腫瘍増殖の優れた阻害を提供し得ることを示唆している（図１２Ｃ）。

ＺＩＰ６及びＺＩＰ１０は、有糸分裂において亜鉛によって引き起こされるＰＳ^７２７ＳＴＡＴ３を結合する
ＺＩＰ６は、円形化した有糸分裂細胞中で濃縮されており（図５Ａ）、本発明者らは、これらの有糸分裂細胞がｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３も含むことを発見した。本発明者らは、Ｎ末端切断及び細胞膜転位と合致するｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３の同時減少（図５Ｂ）及び増加した６８ｋＤａ ＺＩＰ６バンドを伴うウェスタンブロットによって、有糸分裂において上昇したｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３を確認した（図５Ｂ）。さらに、亜鉛処理はＳＴＡＴ３のリン酸化状態をｐＹ７０５からｐＳ７２７に変化させ（図５Ｃ）、これまでに有糸分裂の状況では報告されたことがない相互関係を実証している。しかしながら、有糸分裂におけるｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３のこの検出は、有糸分裂全ゲノム質量分析スクリーニングにおいても観察された。興味深いことに、ｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３の喪失はＳＴＡＴ３の転写活性を終結させ、転写は有糸分裂中に停止することが知られている。

次に、本発明者らは、有糸分裂細胞における亜鉛の増加を確認し（図５Ｄ、Ｅ）、非接着細胞において３倍の増加を示した。接着細胞の４８％と比較して９０％が４Ｎ ＤＮＡ含有量を有したので（図４Ａ）、これらの非接着細胞は、有糸分裂細胞で濃縮されていた。他の者も、有糸分裂細胞における増加した亜鉛を観察しており、間期細胞と比較して有糸分裂細胞での亜鉛の３倍の増加を実証している。

近接ライゲーションアッセイを使用して、本発明者らは次に、専ら有糸分裂細胞において、別々にＺＩＰ６（図５Ｆ）及びＺＩＰ１０（図５Ｇ）の両方がｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３に有意な結合をすることを実証した。対照的に、ｐＳ^７０５ＳＴＡＴ３とＺＩＰ６又はＺＩＰ１０のいずれかとの間には検出可能な相互作用は存在しなかった（図４Ｂ）。興味深いことに、細胞質分裂後にはｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３に結合したＺＩＰ６はより少なかった（図５Ｆ、黄色の矢印）ことから、有糸分裂が停止した時点での解離が示唆される。これらのデータは、専ら有糸分裂中にＺＩＰ６及びＺＩＰ１０を結合するｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の亜鉛媒介性形成を実証する。

ＺＩＰ６タンパク質配列は、膜貫通ドメイン３～４の間の細胞質ループ（ＹＥＳＱ、残基４７３～４７６）上に予測されるＳＴＡＴ３結合部位を有し、これはＳＴＡＴ３結合部位ＹｘｘＱのコンセンサスモチーフに適合し、哺乳動物において高度に保存されている（図５Ｈ）。本発明者らは、ＳＴＡＴ３の結合に何らかの残基が関与しているかどうかを調べるために、ＺＩＰ６変異体を作製し（図５Ｉ）、これを免疫沈降によって試験した。ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３に対するプロービングは、野生型ＺＩＰ６ならびに変異体Ｓ４７１Ａ、Ｓ４７８Ａ及びＴ４７９Ａで形質移入された細胞の両方でＺＩＰ６を共沈殿させたが、Ｙ４７３Ａ又はＳ４７５Ａ変異体で形質移入された細胞ではＺＩＰ６を共沈殿させなかった（図５Ｊ）。これらのデータは、残基Ｙ４７３でのＳＴＡＴ３結合ＺＩＰ６と一致し、Ｓ４７５も重要である。これらの残基は、進化的に保存されたＺＩＰ６の配列中に存在する（図５Ｈ）。ＺＩＰ１０も、対応する領域中によく保存された予測されるＳＴＡＴ３結合部位ＹＫＱＱ（５１２～５２４）を有する（図５Ｋ）。

ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３は有糸分裂中にｐＳ^３８Ｓｔａｔｈｍｉｎを結合し、有糸分裂終了のために切断される
有糸分裂過程とのｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の時間的関連を分析するために、本発明者らは、有糸分裂中の細胞においてｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３を画像化した（図６Ａ）。これにより、全ての有糸分裂段階でのｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の存在が明らかになり、これは有糸分裂細胞におけるｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の存在及びｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３の非存在によって確認され、細胞質分裂を受けている細胞がなおｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３について陽性であるが、ｐＳ^１０ヒストンＨ３については陰性であったことに注目すると、有糸分裂を通じてｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３が長期間存在することを示している。さらに、本発明者らは、ヒト乳癌の隣接するスライス片を使用して同じ細胞中のｐＳ^１０ヒストンＨ３によって判断したところ、インビボで有糸分裂細胞中にｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３を検出した（図６Ｂ）。正常なマウス腸の有糸分裂細胞においてもｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３のさらなるインビボ染色が見られ（図６Ｃ）、正常な状態及び疾患状態を包含する有糸分裂中の一般的な過程であることが示唆された。

ノコダゾール処理の最後の１時間、亜鉛キレート剤又はＳＴＡＴ３阻害剤のいずれかでの処理によって、有糸分裂進行に対する亜鉛の効果を調べた。ｐＳ^１０ヒストンＨ３又はＳＴＡＴ３リン酸化状態に対して影響を及ぼさず（図６Ｄ）、このことは、細胞が有糸分裂に達する前にＳＴＡＴ３と亜鉛の両方が必要であることを確証した。興味深いことに、５０μＭ又は１００μＭの亜鉛との１時間のインキュベーションは、ｐＳ^１０ヒストンＨ３の喪失及びｐＹ^７０５ＳＴＡＴ３へのｐＹ^７２７ＳＴＡＴ３の復帰によって判断されるように、もはや有糸分裂していない細胞と一致する効果を有した（図６Ｄ）。本発明者らは、減少した亜鉛曝露時間を使用した蛍光イメージングによって、これらの細胞が有糸分裂を経て進行したことを確認し（図６Ｅ）、有糸分裂細胞数の減少を早くも１５分で観察した。重要なことに、有糸分裂を終了したこれらの亜鉛処理細胞は通常の完全長ＳＴＡＴ３バンドを失っており（図６Ｄ）、ＳＴＡＴ３のＣ末端切断形態のみを示し、したがって残基Ｓ７２７を除去していた。有糸分裂終了時のＳＴＡＴ３のこの切断、Ｓ７２７の除去は、Ｙ７０５がリン酸化された活性転写因子型のＳＴＡＴ３を回復させることを可能にし、それにより、転写能力を再確立し、有糸分裂を終了するための明確な手段を提供する。

本発明者らは、ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３のｐＳ^３８スタスミンとの相互作用を実証することによって、ＺＩＰ６：ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３複合体を確立された有糸分裂カスケードの中に統合した。この形態のスタスミンは、有糸分裂微小管の再編成を可能にするだけでなく、有糸分裂紡錘体の集合及び有糸分裂開始の両方にも不可欠である。したがって、専ら有糸分裂細胞中でｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の存在及びｐＳ^３８スタスミンとの結合が確立されたこと（図６Ｆ）は、有糸分裂の最中にスタスミンを安定化する上でのｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の役割を裏付ける。

有糸分裂中のＺＩＰ６のＮ末端切断
本発明者らは以前に、予想ＰＥＳＴ部位における細胞膜への再転位のための必要条件としてＺＩＰ６のＮ末端切断を確立しており［７］、これらはしばしば細胞周期によって調節された様式でプロセシングされるので、本発明者らは、異なるエピトープを有するＺＩＰ６抗体を使用して有糸分裂中のいずれかのさらなる切断を調べた（図７Ａ）。

ノコダゾール処理細胞は、Ｎ末端ＺＩＰ６－Ｙ抗体と細胞質ループＺＩＰ６－ＳＣ抗体の両方によって認識されるＺＩＰ６の６８ｋＤａバンド（図７Ａ、切断１）の大幅な増加を示した（図７Ｂ）。本発明者らはまた、いずれもノコダゾール処理において増加した２つのより短いバンドをＺＩＰ６について検出した。これらは、ＺＩＰ６－Ｙ抗体での１５ｋＤａのバンド及びＺＩＰ６－ＳＣ抗体での４８ｋＤａのバンドに対応し（図７Ｂ）、さらなるＮ末端切断（図７Ａ、切断２）及び残存ＺＩＰ６細胞外Ｎ末端の細胞外ドメインシェディングを意味する。ＺＩＰ６及びＺＩＰ１０をともに含むＺＩＰチャネルのＬＩＶ－１サブファミリーに由来するプリオンタンパク質は、ＺＩＰチャネルと同様のＮ末端を有し、機能的制御の手段として細胞外ドメインシェディングを受ける。興味深いことに、亜鉛輸送体のＬＩＶ－１ファミリーの２つのメンバーであるＺＩＰ１０及びＺＩＰ４の両方の適切な亜鉛輸送機能のために、Ｎ末端切断が必要とされる。これらの事実は、本発明者らのデータと合わせると、Ｎ末端ＺＩＰ６及び／又はＺＩＰ１０の細胞外切断が、ＺＩＰ６：ＺＩＰ１０ヘテロ二量体機能及び有糸分裂の開始を引き起こす能力を調節するために及び必要であり得るという新たな証拠を提供する。

有糸分裂進行とのＺＩＰ６切断２の正確な関係を調べるために、本発明者らは、ノコダゾール処置後の１～２時間の回復中にＺＩＰ６切断を調べ、ｐＳ^１０ヒストンＨ３の減少で確認されるように有糸分裂を経た進行を可能にした（図７Ｃ）。これらの条件において、本発明者らは、有糸分裂におけるその出現と一致する（図７Ｃ）、ｐＳ^１０ヒストンＨ３の活性化と並行したＺＩＰ６の１５ｋＤａバンドの増加、その後の、細胞が有糸分裂から脱出するにつれての減少を観察した。さらに、ＺＩＰ６－ＳＣ抗体の６８ｋＤａのバンドが減少し、４８ｋＤａのバンドが出現したが（図７Ｃ）、これは、ＺＩＰ６切断２の発生と一致する（図７Ａ）。さらに、免疫蛍光によってＺＩＰ６について有糸分裂細胞を画像化すると、本発明者らは、前期中にＺＩＰ６－Ｙ陽性有糸分裂細胞を観察することが可能であったに過ぎず（図７Ｄ、パネル１及び２）、有糸分裂の後続の段階の細胞は常にＺＩＰ６－Ｙについて陰性であり（図７Ｄ、パネル２及び３）、有糸分裂開始後のＺＩＰ６のＮ末端の除去を確認した。これらのデータを合わせると、有糸分裂が前期で開始された後に、ＺＩＰ６は、ＺＩＰ６－Ｙ抗体エピトープの下流のＮ末端においてさらに切断されることが確認される（図７Ａ）。ＺＩＰ６の第２のＮ末端切断がＳＴＡＴ３のリン酸化状態の亜鉛依存的変化の後にのみ生じることも注目に値し、この第２の切断がＺＩＰ６：ＺＩＰ１０ヘテロ二量体を不活性化し得ることを示唆している。

これらのデータは全て、有糸分裂における亜鉛のこれまで不明であった役割に対する新たな機序を考案することを可能にする。本発明者らは、スタスミン依存性微小管再編成及びヒストンＨ３活性化などの公知の有糸分裂経路に合流する有糸分裂複合体（ＺＩＰ６、ＺＩＰ１０、ｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３及びｐＳ^３８スタスミン）の形成を含むモデルを提案する（図７Ｅ）。ＺＩＰ６Ｎ末端切断によって活性化されたＺＩＰ６：ＺＩＰ１０ヘテロ二量体は、細胞膜に移動して亜鉛を細胞中に取り込み、有糸分裂を開始する。この取り込まれた亜鉛は、有糸分裂全体を通じて残存するｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３の形成を引き起こし、ＳＴＡＴ３転写活性を妨げる。このｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３は、ＺＩＰ６及びＺＩＰ１０の両方ならびにｐＳ３８スタスミンも結合し、有糸分裂のために必要とされるｐ３８スタスミン駆動の微小管再編成にｐＳ^７２７ＳＴＡＴ３を結び付ける複合体を形成する。

まとめ
本発明者らは、有糸分裂経路が活性化され得る前の、ＺＩＰ６／ＺＩＰ１０ヘテロ二量体を介した亜鉛流入の必要性を示してきたが、これは、亜鉛が細胞増殖のために不可欠とされてきた理由、さらには、亜鉛欠乏が非常に有害であり得る理由を説明する。ＺＩＰ６又はＺＩＰ１０抗体、特にこれらの輸送体のＮ末端を結合する抗体により有糸分裂を阻害する能力は、現在、癌及び線維症などの増殖性疾患を阻害するための新しい治療機会を提供する。

参考文献
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２．Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＺＩＰ７－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ａｂｅｒｒａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ａｎｔｉｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４９，４９１２－４９２０（２００８）。

３．Ｇｅｉｓｅｒ，Ｊ．，Ｖｅｎｋｅｎ，Ｋ．Ｊ．，Ｄｅ Ｌｉｓｌｅ，Ｒ．Ｃ．＆Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｇ．Ｋ．Ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｃｒｏｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｉｃａ：ｌｏｓｓ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＺＩＰ４（Ｓｌｃ３９ａ４）ｄｉｓｒｕｐｔｓ ｔｈｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｎｉｃｈｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．ＰＬｏＳ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８，ｅ１００２７６６（２０１２）。

５．Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｈ．Ｅ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．，Ｈａｄｌｅｙ，Ｌ．Ｊ．＆Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｒ．Ｉ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＬＩＶ－１，ｔｈｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ａ ｎｅｗ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ３７５，５１－５９（２００３）。

６．Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｈ．Ｅ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．＆Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｒ．Ｉ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＫＥ４，ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗ ＬＩＶ－１ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ３７７，１３１－１３９（２００４）。

７．Ｈｏｇｓｔｒａｎｄ，Ｃ．，Ｋｉｌｌｅ，Ｐ．，Ａｃｋｌａｎｄ，Ｍ．Ｌ．，Ｈｉｓｃｏｘ，Ｓ．＆Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．Ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｏｉｋｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｚｉｎｃ ｃｈａｎｎｅｌ ＺＩＰ６ ａｎｄ ＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ４５５，２２９－２３７（２０１３）。

８．Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｈｉｓｃｏｘ，Ｓ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｒ．Ｉ．，Ｈｏｇｓｔｒａｎｄ，Ｃ．＆Ｋｉｌｌｅ，Ｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＣＫ２ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｚｉｎｃ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｚｉｎｃ ｃｈａｎｎｅｌ ＺＩＰ７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ５，ｒａ１１（２０１２）。

Claims (21)

1. 抗有糸分裂組成物であって、有糸分裂を防止することによる過剰増殖性障害の処置において使用するために、少なくとも１つのＺＩＰ（Ｚｒｔ、Ｉｒｔ様タンパク質）輸送体の細胞外ドメインを選択的に結合してその機能を阻害する少なくとも１つの抗体又はその断片を含み、前記ＺＩＰ輸送体は、ＺＩＰ６若しくはＺＩＰ１０のいずれか、又はその両方を含むヘテロ二量体である、抗有糸分裂組成物。
2. 前記断片が、前記抗体の少なくとも（１又は複数の）相補性決定領域を含む、請求項１に記載の抗有糸分裂組成物。
3. 前記断片がアプタマーである、請求項１に記載の抗有糸分裂組成物。
4. ＺＩＰ６についてはＮ末端１～３２５若しくは１～３５０及びＺＩＰ１０については１～４０７の間で、またＺＩＰ６についてはＮ末端３１～３２５若しくは３１～３５０及びＺＩＰ１０については３１～４０７の間で、前記抗体が前記ＺＩＰ６及び／又はＺＩＰ１０輸送体の細胞外ドメインを結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗有糸分裂組成物。
5. 前記抗体が、ＺＩＰ６についてはＮ末端アミノ酸９３～３５０及びＺＩＰ１０については４６～３９５の間で結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗有糸分裂組成物。
6. 前記抗体が、ＺＩＰ６についてはＮ末端アミノ酸２２０～３５０及びＺＩＰ１０については４６～３９５の間で結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗有糸分裂組成物。
7. 前記抗体が、ＺＩＰ６の以下のＥＣＤ：
   Ｎ末端エピトープ（配列番号１ ９３－ＨＨＤＨＤＨＨＳＤＨＥＨＨＳＤ－１０７）；
   Ｎ末端エピトープ（配列番号２ ２４６－ＥＰＲＫＧＦＭＹＳＲＮＴＮＥ－２５９）；
   Ｎ末端及び膜貫通ドメイン１を含む（配列番号３ ３０１－ＲＳＣＬＩＨＴＳＥＫ ＫＡＥＩＰＰＫＴＹＳ ＬＱＩＡＷＶＧＧＦＩ ＡＩＳＩＩＳＦＬＳＬ ＬＧＶＩＬＶＰＬＭＮ－３５０）；
   Ｎ末端（配列番号４ ３０３－ＣＬＩＨＴＳＥＫＫＡＥＩＰ－３１５）；
   Ｎ末端、（配列番号５ １２９－ＨＳＨＨＮＨＡＡＳＧＫＮＫＲＫＡＬＣＰＤＨＤＳＤＳＳＧＫＤＰＲＮＳＱＧＫＧＡＨＲＰＥＨＡＳＧＲＲＮＶＫＤＳＶＳＡＳＥＶＴＳＴＶＹＮＴＶＳＥＧＴＨＦＬＥＴＩＥＴＰＲＰＧＫＬＦＰＫＤＶＳＳＳＴＰＰＳＶＴＳＫＳＲＶＳＲＬＡＧＲＫＴＮＥＳＶＳＥＰＲＫＧＦＭＹＳＲＮＴＮＥＮＰＱＥ－２６３）；
   Ｎ末端、（配列番号６ ２８８－ＮＹＬＣＰＡＩＩＮＱＩＤＡＲＳＣＬＩＨＴＳＥＫＫＡＥＩＰＰＫＴＹＳＬＱＩＡＷＶＧＧＦＩＡＩＳＩＩＳＦ－３３７）；
   の１つ内に、又は
   ＺＩＰ１０の以下のＥＣＤ：
   Ｎ末端、（配列番号１１ ４６－ＬＥＰＳＫＦＳＫＱＡＡＥＮＥ－５９）；
   Ｎ末端（配列番号１２ １６４－ＥＫＥＴＶＥＶＳＶＫＳＤＤＫＨＭＨＤＨＮＨＲＬＲＨＨＨＲＬＨＨＨＬＤＨＮＴＨＨＦＨＮＤＳＩＴＰＳＥＲＧＥＰＳＮＥＰＳＴＥＴＮＫＴＱＥＱＳＤＶＫＬＰＫＧＫＲＫＫＫＧＲＫＳＮＥＮＳＥＶＩＴＰＧＦＰ－２５３）；
   Ｎ末端、（配列番号１３ ２９５－ＱＤＬＤＰＤＮＥＧＥＬＲＨＴＲＫＲＥＡＰＨＶＫＮＮＡＩＩＳＬＲ－３９５）
   Ｎ末端、（配列番号１４ ３６－ＬＨＲＱＨＲＧＭＴＥＬＥＰＳＫＦＳＫＱＡＡＥＮＥＫＫＹＹＩＥＫＬＦＥＲＹＧＥＮＧＲＬＳＦＦＧＬＥＫＬ－８５）
   の１つ内に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗有糸分裂組成物。
8. 前記抗体が、ＺＩＰ６Ｍ、ＺＩＰ６Ｙ、ＺＩＰ６ＡＭ、ＺＩＰ６Ｘ、ＺＩＰ６Ｒ、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ａ、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ｂ、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ｃ、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ｄ、ＬＩＶ－１／ＺＩＰ６抗体、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ｅ、抗ＳＬＣ３９Ａ６^ｆ、ＺＩＰ６２－Ａ、ＺＩＰ１０、抗ＳＬＣ３９Ａ１０^ａ、抗ＳＬＣ３９Ａ１０^ｂ、ＳＬＣ３９Ａ１０^ａ、抗ＳＬＣ３９Ａ１０^ｃ及びＳＬＣ３９Ａ１０^ｂを含む群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗有糸分裂組成物。
9. 前記抗体が、ＺＩＰ６Ｙ、ＺＩＰ６ＡＭ、ＺＩＰ１０及び抗ＳＬＣ３９Ａ１０^ａを含む群から選択される、請求項８に記載の抗有糸分裂組成物。
10. 前記抗体が、ＺＩＰ６の以下の細胞外ループ：
    細胞外ループＴＭ２－３（配列番号７ ３８２－ＡＳＨＨＨＳＨＳＨＥＥＰＡＭＥＭＫＲＧＰＬＦＳＨＬＳＳＱＮＩＥＥＳＡＹＦＤＳＴＷＫ－４２３）；
    細胞外ループＴＭ４－５（配列番号８ ６１９－ＴＥＧＬＳＳＧ－６２５）；
    細胞外ループＴＭ６－７（配列番号９ ６８０－ＨＹＡＥＮＶＳＭ－６８７）；
    細胞外Ｃ末端（配列番号１０ ７４８－ＫＩＶＦＲＩＮＦ－７５５）；
    の少なくとも１つに結合する、
    又は前記抗体が、ＺＩＰ１０の以下の細胞外ループ：
    細胞外ループＴＭ２－３（配列番号１５ ４６５－ＧＧＨＤＨＳＨＱＨＡＨＧＨＧＨＳＨＧＨＥＳＮＫＦＬＥＥＹＤＡＶＬＫ－４９７）；
    細胞外ループＴＭ４－５（配列番号１６ ６９３－ＳＡＧＬＴＧＧ－６９９）；
    細胞外ループＴＭ６－７（配列番号１７ ７５４－ＱＹＡＮＮＩＴＬＷＮ－７６２）；
    細胞外ループＣ末端（配列番号１８ ８２４－ＫＩＶＦＤＩＱＦ－８３１）
    の少なくとも１つに結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗有糸分裂組成物。
11. 少なくとも２つの抗体又はその断片が組み合わせて使用される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗有糸分裂組成物。
12. 少なくとも１つの抗体が前記ＺＩＰ６輸送体の少なくとも一部を結合し、１つの抗体が前記ＺＩＰ１０輸送体の少なくとも一部を結合する、請求項１１に記載の抗有糸分裂組成物。
13. 単一の抗体が、前記ＺＩＰ６：ＺＩＰ１０ヘテロ二量体を結合してその機能を阻害する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗有糸分裂剤。
14. 前記過剰増殖性障害が、癌及び固形腫瘍、リンパ腫又は白血病、乳癌、前立腺癌、結腸癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌及び腎臓癌などのその様々な形態；多発性嚢胞腎疾患（ＰＫＤ）及び関連する嚢胞性腎疾患；黒色腫；過形成、化生及び異形成ならびにそれらの様々な形態；免疫系の増殖性障害（骨髄及びリンパ増殖性障害など）；前立腺肥大症；子宮内膜症；乾癬；組織修復及び異常な創傷治癒；ならびに線維症、例えば、肺線維症、特発性肺線維症、肝硬変、心内膜心筋線維症、血管狭窄又は脊柱管狭窄、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性巨大線維症、腎性全身性線維症、クローン病、ケロイド又は陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性硬化症、関節線維症及び癒着性関節包炎などを含む群から選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗有糸分裂剤。
15. 癌が、固形腫瘍、リンパ腫又は白血病、乳癌、前立腺癌、結腸癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、食道癌及び腎臓癌から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗有糸分裂組成物。
16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗有糸分裂組成物を薬学的に又は獣医学的に許容され得る賦形剤又は担体と一緒に含む、癌の処置において使用するための薬学的組成物又は獣医学的組成物。
17. 少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせた請求項１～１５に記載の抗有糸分裂組成物を含む、過剰増殖性障害の処置において使用するための併用治療薬。
18. 過剰増殖性障害を処置する方法であって、過剰増殖性障害を有する又は有することが疑われる対象に、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗有糸分裂組成物又は併用治療薬が投与される、方法。
19. 前記対象が哺乳動物である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記哺乳動物が、ヒト、霊長類 ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、有蹄動物、又は任意の他の家庭用若しくは農業用の種である、請求項１９に記載の方法。
21. ＺＩＰ１０に対して特異的である抗体又はその断片であって、前記抗体は、ＺＩＰ１０輸送体のエピトープＮ末端４６～５９アミノ酸配列番号１１ ＬＥＰＳＫＦＳＫＱＡＡＥＮＥに対して特異的である、抗体又はその断片。

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